KR20200100619A

KR20200100619A - 치료법에 적합한 리포조말 rna 제형의 제조 및 저장

Info

Publication number: KR20200100619A
Application number: KR1020207014348A
Authority: KR
Inventors: 하인리히 하아스; 세바스티안 외르너; 아이작 에르난 에스파르자 보르케스; 토마스 마이클 힐러; 페르디아 바테스
Original assignee: 비온테크 알엔에이 파마슈티컬스 게엠베하
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2018-10-18
Publication date: 2020-08-26
Also published as: CN114344486A; CN114392233A; RU2022103533A; AU2018350846B2; RU2020113577A3; US11395799B2; AR113782A1; AR127361A2; WO2019077053A1; AU2023201185A1; EP3697384A1; RU2020113577A; JP2023052184A; CA3078292A1; US20200246267A1; ZA202001675B; MX2020003413A; TW201927288A; AU2018350846A1; TW202146031A

Abstract

본 명세서는 비경구 투여 후, 특히 정맥 내 투여 후, 표적 조직으로 RNA를 전달하기 위한 RNA 리포플렉스 입자를 제조하는 방법 및 이러한 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 명세서는 또한 산업 GMP-규격 방식으로 RNA 리포플렉스 입자를 제조할 수 있도록 하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 명세서는 산물 품질의 실질적인 손실없이, 특히 RNA 활성의 실질적인 손실없이 RNA 리포플렉스 입자를 저장하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

치료법에 적합한 리포조말 RNA 제형의 제조 및 저장

본 명세서는 비경구 투여 후, 특히 정맥 내 투여 후, 표적 조직으로 RNA를 전달하기 위한 RNA 리포플렉스 입자 (RNA lipoplex particles)를 제조하는 방법 및 이러한 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 명세서는 또한 산업 GMP-규격 방식으로 RNA 리포플렉스 입자를 제조할 수 있도록 하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 명세서는 산물 품질의 실질적인 손실없이, 특히 RNA 활성의 실질적인 손실없이 RNA 리포플렉스 입자를 저장하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본원에 기재된 RNA 리포플렉스 입자 제형은 동결-건조, 분무-건조 또는 관련 방법에 의해 동결 또는 탈수될 수 있어서, 액체 저장과 비교하여 산물의 저장-수명 연장을 획득할 수 있다. 한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 약학적으로 활성인 펩타이드 또는 단백질과 같은 관심 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함한다. RNA는 표적 조직의 세포에 의해 흡수되고, 그 RNA는 그의 생리학적 활성을 나타낼 수 있는 인코딩된 펩타이드 또는 단백질로 번역된다. 관심 펩타이드 또는 단백질은 하나 이상의 에피토프에 대한 면역 반응을 유도하거나 증강시키기 위한 상기 하나 이상의 에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질일 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은, 약학 제품에 대한 요건을 준수하는, 보다 구체적으로 GMP 제조용 요건 및 비경구 적용을 위한 약학 제품의 품질에 대한 요건을 준수하는 방식으로 사용하기에 적합하다.

외래 유전자 정보를 표적 세포로 전달하기 위한 RNA의 사용은 DNA에 대한 매력적인 대안을 제공한다. RNA 사용의 장점은 일시적 발현 및 비-형질전환 특성을 포함한다. RNA는 발현되기 위해 핵으로 들어갈 필요가 없으며, 또한 숙주 게놈 내로 통합될 수 없고, 그에 의하여 종양 형성의 위험을 제거한다.

RNA는 소위 리포플렉스 제형에 의해 전달될 수 있으며, 여기서 RNA는 양이온 성 지질 및 헬퍼 지질의 혼합물로 구성된 리포좀에 결합되어 주사용 나노입자 제형을 형성한다. 그러나, 제형의 저장 이후에도 생물학적으로 활성인 RNA를 표적 조직으로 전달하기 위한 제형의 개발은 아직 충족되지 않은 요구이다. 또한, 긴 저장-수명이 제공되는 주사용 RNA 리포플렉스 입자 제형의 GMP-준수 제조 방법의 개발은 여전히 충족되지 않은 요구이다.

따라서, 전달된 RNA가 그것이 코딩하는 펩타이드 또는 단백질로 효율적으로 번역되는, 표적 조직으로 생물학적으로 활성인 RNA를 전달하기 위한 제형을 제공할 필요가 있다. 또한, 산물 품질의 실질적인 손실없이, 특히 RNA의 생물학적 활성의 실질적인 손실없이 저장-안정성인 이러한 제형을 제공할 필요가 있다.

본 발명의 발명자들은 놀랍게도 본원에 기재된 RNA 리포플렉스 입자 제형이 상기 언급된 요건을 충족시킨다는 것을 알아내었다.

요약

I. RNA 리포플렉스 입자의 제조 방법, RNA 리포플렉스 입자 및 RNA 리포플 렉스 입자를 포함하는 조성물

제1 측면에서, 본 명세서는 향상된 생물학적 활성을 갖는 RNA 리포플렉스 입자를 제조하는 방법, 본 명세서에 따라 제조된 RNA 리포플렉스 입자 및 그러한 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. RNA 리포플렉스 입자 및 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 조성물은 비경 구 투여 후, 특히 정맥 내 투여 후 표적 조직으로 RNA의 전달에 유용하다. RNA 리포플렉스 입자는 에탄올 중에 고도로 농축된 지질 용액을 물 또는 적합한 수성 상에 주입함으로써 수득되는 리포좀을 사용하여 제조된다. 한 구체예에서, RNA 리포플렉스 산물은 x-선 산란에서의 특정 패턴을 특징으로 하며, 여기서 약 1 nm^-1에서 단일 Bragg 피크가 관찰되고, 피크 폭은 0.2 nm^-1보다 작다.

한 구체예에서, 리포좀 및 RNA 리포플렉스 입자는 1,2-디-O-옥타데세닐-3- 트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA) 및 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스 포에탄올아민 (DOPE)을 포함한다. 지질 혼합물에서 DOPE의 농도는 에탄올 단독에서 DOPE의 평형 용해도보다 높다. 실온에서, DOPE 단독은 약 50 mM의 용해도를 가지며, DOTMA와 함께 100 mM 이상의 용해도를 갖는다. 고도로 활성 리포플렉스가 수득되는 리포좀을 형성하기 위한 지질 용액은 총 지질 농도 270 mM 이상 (예를 들어, 90 mM 이상의 DOPE)을 가질 수 있다. 온도를 높이면 농도가 훨씬 더 높은 에탄올 용액을 얻을 수 있다. DOPE의 농도가 평형 용해도를 초과하는 지질 용액으로부터 얻은 리포좀은, DOPE의 농도가 평형 용해도 또는 그 아래인 지질 용액으로부터의 리포좀보다 유의하게 더 크다. 리포좀 크기는 에탄올 중 농도에 따라 단조롭게 증가한다.

본 명세서에 따라 제조된 리포좀은 리포좀을 RNA와 혼합함으로써 RNA 리포플렉스 입자를 제조하는데 사용될 수 있다. 한 구체예에서, RNA는, 리포플렉스의 활성 증가에 요구되는 특정 이온 강도를 조정하기 위하여 혼합 전에 NaCl과 반응된다. 이들 더 큰 리포좀으로부터 형성된 리포플렉스는, 시험관내 및 생체내 실험에 의하여 입증되는 바와 같이 생물학적 활성이 상당히 더 높다. 더 높은 활성을 갖는 이러한 리포플렉스는 특정 물리 화학적 파라미터, 예컨대 (i) 더 낮은 Bragg 피크의 피크 폭 및 (ii) 필드-흐름 분별과 같은 크기 측정을 위한 분산 분석 방법에서의 서로 다른 분리 프로파일에 의해 낮은 활성을 갖는 것들과 명확하게 구별될 수 있다. 더 낮은 활성을 갖는 리포플렉스는 평균적으로 더 작다. 또한, 이들은 용출 프로파일도 다른데, 이는 분자 구조, 모양 및 벌크 상과의 상호 작용과 같은 파라미터와 관련이 있다.

따라서, 이 측면에서, 본 명세서는 에탄올 중의 지질 용액을 수성 상으로 주입하여 리포좀 콜로이드를 제조하는 단계를 포함하는 리포좀 콜로이드를 제조하는 방법에 관한 것으로, 지질 용액 중 1종 이상의 지질의 농도는 에탄올에서 상기 1종 이상의 지질의 평형 용해도에 상응하거나 또는 그보다 높다.

한 구체예에서, 상기 방법은 지질 용액을 가열하여 지질 용액 중 지질의 농도를 증가시키는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 지질 용액은 약 40℃ 이상, 또는 약 60℃ 이상의 온도로 가열된다.

한 구체예에서, 지질 용액은 2 이상의 상이한 지질의 혼합물의 용액이다.

한 구체예에서, 지질 용액 중 한 가지 지질의 농도는 에탄올에서 그 지질의 평형 용해도에 상응하거나 또는 그보다 높다.

한 구체예에서, 지질 용액 중 총 지질 농도는 약 180 mM 내지 약 600 mM, 약 300 mM 내지 약 600 mM, 또는 약 330mM이다.

한 구체예에서, 지질 용액은 1종 이상의 양이온성 지질 및 1종 이상의 추가적인 지질을 포함한다.

한 구체예에서, 지질 용액에서 추가적인 지질의 농도는 에탄올에서 상기 추가적인 지질의 평형 용해도에 상응하거나 또는 그보다 높다.

한 구체예에서, 1종 이상의 양이온성 지질은 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA) 및/또는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP)을 포함한다.

한 구체예에서, 1종 이상의 추가적인 지질은 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 콜레스테롤 (Chol) 및/또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC)을 포함한다.

한 구체예에서, 1종 이상의 양이온성 지질은 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA)을 포함하고, 1종 이상의 추가적인 지질은 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)을 포함한다.

한 구체예에서, 1종 이상의 양이온성 지질 대 1종 이상의 추가적인 지질의 몰비는 약 10:0 내지 약 1:9, 약 4:1 내지 약 1:2, 약 3:1 내지 약 1:1 또는 약 2:1이다.

한 구체예에서, 지질 용액은 약 10:0 내지 약 1:9, 약 4:1 내지 약 1:2, 약 3:1 내지 약 1:1, 또는 약 2:1의 몰비로 DOTMA 및 DOPE를 포함한다.

한 구체예에서, 지질 용액 중 DOPE의 농도는 약 60 mM 이상, 또는 약 90 mM 이상이다.

한 구체예에서, 지질 용액은 약 50 rpm 내지 약 150 rpm의 수성 상의 교반 속도로 수성 상에 주입된다.

한 구체예에서, 수성 상은 물이다.

한 구체예에서, 수성 상은 산성 pH를 갖는다. 한 구체예에서, 수성 상은 아세트산을, 예를 들어 약 5 mM의 양으로 포함한다.

한 구체예에서, 상기 방법은 리포좀 콜로이드를 교반하는 단계를 더 포함한다.

한 구체예에서, 리포좀 콜로이드는 약 15 분 내지 약 60 분간, 또는 약 30 분간 교반된다.

본 명세서는 또한, 약 150 rpm의 교반 속도로 교반되는 물에 에탄올 중 약 2:1의 몰비로 DOTMA 및 DOPE를 포함하는 지질 용액을 주입하여 리포좀 콜리이드를 제조하는 단계를 포함하는 리포좀 콜로이드를 제조하는 방법에 관한 것으로, 여기서 지질 용액 중 DOTMA 및 DOPE의 농도는 약 330mM이다.

한 구체예에서, 리포좀을 제조하는 방법은 리포좀을 압출하는 단계를 포함하지 않는다.

본 명세서는 또한, 상기 리포좀을 제조하는 방법에 의해 얻을 수 있는 리포좀 콜로이드에 관한 것이다.

한 구체예에서, 리포좀은 약 250 nm 이상의 평균 직경을 갖는다.

한 구체예에서, 리포좀은 약 250 nm 내지 약 800 nm 범위인 평균 직경을 갖는다.

한 구체예에서, 리포좀은 약 0.5 미만, 약 0.4 미만 또는 약 0.3 미만의 다분산 지수를 갖는다.

한 구체예에서, 리포좀은 양이온성 리포좀이다.

한 구체예에서, 리포좀은 1종 이상의 양이온성 지질 및 1종 이상의 추가적인 지질을 포함한다.

한 구체예에서, 1종 이상의 양이온성 지질은 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA)을 포함하고 1종 이상의 추가적인 지질은 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)을 포함한다.

한 구체예에서, 리포좀은 약 10:0 내지 약 1:9, 약 4:1 내지 약 1:2, 약 3:1 내지 약 1:1, 또는 약 2:1의 몰비로 DOTMA 및 DOPE를 포함한다.

본 명세서는 또한, 상기 리포좀 콜로이드를 RNA를 포함하는 용액에 첨가하는 단계를 포함하는 RNA 리포플렉스 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.

한 구체예에서, X-선 산란 패턴에서 RNA 리포플렉스는 약 1 nm^-1에서의 단일 Bragg 피크를 특징으로 하며, 여기서 피크 폭은 0.2 nm^-1보다 작다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 약 200 내지 약 800 nm, 약 250 내지 약 700 nm, 약 400 내지 약 600 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 350 nm 내지 약 400 nm 범위인 평균 직경을 갖는다.

본 명세서는 또한, 상기한 바와 같이 수득 가능한 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 1종 이상의 양이온성 지질 및 1종 이상의 추가적인 지질을 포함한다.

한 구체예에서, RNA는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하며, 여기서 RNA 리포플렉스 입자에서 양전하 대 음전하의 비는 약 1:2 내지 약 1.9:2 또는 약 1.3:2.0이다.

본 명세서는 또한, 다음을 포함하는 조성물에 관한 것이다:

다음을 포함하는 RNA 리포플렉스 입자:

하나 이상의 에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA, 및

1종 이상의 양이온성 지질 및 1종 이상의 추가적인 지질,

여기서, RNA 리포플렉스 입자에서 양전하 대 음전하의 비는 약 1:2 내지 약 1.9:2, 또는 약 1.3:2.0이고,

여기서, RNA 리포플렉스 입자는 약 1 nm^-1에서 단일 Bragg 피크를 특징으로 하며, 여기서 피크 폭은 0.2 nm^-1보다 작다.

한 구체예에서, 조성물은 약 10 mM 내지 약 300 mM, 약 45 mM 내지 약 300 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 또는 약 80 mM 내지 약 150 mM의 농도로 소듐 클로라이드를 더 포함한다.

한 구체예에서, 조성물은 완충제를 더 포함한다.

한 구체예에서, 조성물은 킬레이트제를 더 포함한다.

한 구체예에서, I.하에 이러한 측면에서 기술된 RNA 리포플렉스 입자는 약 200 내지 약 800 nm, 약 250 내지 약 700 nm, 약 400 내지 약 600 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 350 nm 내지 약 400 nm 범위인 평균 직경을 갖는다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 약 0.5 미만, 약 0.4 미만 또는 약 0.3 미만의 다분산 지수를 갖는다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 약 10:0 내지 1:9, 약 4:1 내지 1:2, 약 3:1 내지 약 1:1, 또는 약 2:1의 몰비로 DOTMA 및 DOPE를 포함하고, DOTMA의 양전하 대 RNA의 음전하의 전하비는 약 1:2 내지 1.9:2이다.

한 구체예에서, 킬레이트제는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)이다.

한 구체예에서, EDTA는 약 0.25 mM 내지 약 5 mM, 또는 약 2.5 mM의 농도이다.

한 구체예에서, 조성물은 아쥬반트를 더 포함한다.

한 구체예에서, 조성물은 전신 투여를 위해 제형화된다.

한 구체예에서, 전신 투여는 정맥 내 투여에 의한다.

본 명세서는 또한, 치료적 사용을 위하여 기재된 바와 같은 조성물에 관한 것이다.

II. 산업 GMP -규격 방식으로 RNA 리포플렉스 입자를 제조하는 방법

제2 측면에서, 본 명세서는 산업 GMP-규격 방식으로 RNA 리포플렉스 입자를 제조하도록 하는 방법에 관한 것이다.

본 명세서의 한 구체예에서, 유체 경로 시스템은 약학적 RNA 리포플렉스 입자 산물의 GMP-제조에 사용되며, 이는 RNA 대 리포좀의 혼합 비의 정확한 제어를 가능하게 하고, 이는 산물 품질에 중요하다. 한 구체예에서, 유체 경로는 리포좀 용액과 RNA 용액을 1:1 (부피/부피) 방식으로 혼합하는 것을 포함하고, 여기서 의도된 전하 비율을 정확하게 유지하기 위해 성분의 농도가 선택된다. 한 구체예에서, RNA는, 리포플렉스의 활성에 필요한 특정 이온 강도를 조정하기 위해 혼합 전에 NaCl과 함께 반응된다. 한 구체예에서, Y-타입 혼합 셋업이 실현되며, 이는 완전히 일회용 재료에 기초한다. 유체 역학은 입자 특성을 유지하고 막힘 (clogging)을 방지하도록 최적화된다. 반대로, 시판되는 미세 유체 장치를 사용하는 경우 일정 시간이 지나면 막힘이 발생하여, GMP 적용을 불가능하게 만든다.

한 구체예에서, 리포플렉스는 RNA를 양이온성 리포좀과 반응시킴으로써 제조되며, 여기서 혼합비 및 혼합 조건은 시린지 펌프 (퍼퓨저 펌프)를 사용하여 정확하게 제어되고, 여기서 2 개의 시린지, 리포좀을 포함하는 하나 및 RNA를 포함하는 하나의 시린지가 시린지 펌프에 삽입되는데, 우선적으로는 동일한 펌프에 병렬로 삽입된다. 두 펌프 (poth pump)의 피스톤은 동일한 드라이버에 의해 앞으로 이동하므로 혼합되는 상대적인 볼루미나 (volumina)를 정확하게 제어한다. 선택된 공정 조건에서 동일한 시린지가 두 용액에 모두 사용되므로 정확한 1:1 (v/v) 혼합 조건이 가능하다. 혼합 전에 두 용액의 농도를 조정함으로써 RNA와 리포좀 (양이온성 지질) 사이의 비는 정확하게 제어된다.

따라서, 이 측면에서, 본 명세서는 RNA를 포함하는 용액 및 양이온성 리포좀을 포함하는 용액을 RNA 및 양이온성 리포좀에 대한 제어된 혼합 조건하에 혼합하는 단계를 포함하는, RNA 리포플렉스 입자의 연속 유동 제조 방법에 관한 것이다.

한 구체예에서, 양이온성 리포좀을 포함하는 용액은 전술한 리포좀 콜로이드이다.

한 구체예에서, RNA를 포함하는 용액 및 양이온성 리포좀을 포함하는 용액은 수용액이다.

한 구체예에서, RNA를 포함하는 용액 및 양이온성 리포좀을 포함하는 용액의 혼합을 허용하는 유량 (flow rate)이 사용된다.

한 구체예에서, 유동 (flow)은 300보다 큰, 또는 약 500 내지 약 2100의 레이놀즈 수를 특징으로 한다.

한 구체예에서, 제어된 혼합 조건은 RNA를 포함하는 용액 및 양이온성 리포좀을 포함하는 용액의 혼합 비를 제어하는 것을 포함한다.

한 구체예에서, 제어된 혼합 조건은, 혼합될 RNA를 포함하는 용액 및 양이온성 리포좀을 포함하는 용액의 상대 부피를 제어하는 것을 포함한다.

한 구체예에서, RNA 및 양이온성 리포좀의 혼합 비는 RNA를 포함하는 용액 및 양이온성 리포좀을 포함하는 용액의 동일한 혼합 부피 (v/v)를 사용하고 각각의 용액에서 RNA 및 양이온성 리포좀의 농도를 조정함으로써 제어된다.

한 구체예에서, 제어된 혼합 조건은 막힘을 피하면서 RNA 리포플렉스 입자의 특성을 유지하도록 선택된다.

한 구체예에서, 상기 방법은 Y-타입 또는 T-타입 혼합 요소를 사용하는 것을 포함한다.

한 구체예에서, Y-타입 또는 T-타입 혼합 요소는 약 1.2 mm 내지 약 50 mm의 직경을 갖는다.

한 구체예에서, 상기 방법은 예를 들어 혼합 요소, 예컨대 Y-타입 또는 T-타입 혼합 요소를 사용하는 것을 포함하는데, 여기서 2 개의 튜브 또는 호스로부터의 유체는 함께 모이고, 여기서 예컨대, 분할 및 재결합, 교차 헤링본, 지그재그 또는 트위스트 채널 또는 3-차원 사행 채널과 같은 어떠한 내부 정적 혼합 요소는 존재치 않는다. 혼합 요소는 1.2 내지 50.0 mm 사이의 직경을 가질 수 있다.

한 구체예에서, 상기 방법은 장치를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 하나는 양이온성 리포좀을 포함하는 용액을 포함하고 다른 하나는 RNA를 포함하는 용액을 포함하는 2 개의 시린지는 상기 장치 또는 2 개의 홀더 내로 병렬로 삽입되고, 장치의 피스톤은 하나 또는 2 개의 정밀한 액추에이터에 의하여 돌출된다. 한 구체예에서, 상기 방법은 시린지 펌프를 사용하는 단계를 포함하며, 여기서 하나는 양이온성 리포좀을 포함하는 용액을 포함하고 다른 하나는 RNA를 포함하는 용액을 포함하는 2 개의 시린지가 동일한 펌프 내로 병렬로 삽입된다.

한 구체예에서, 상기 방법은, 임의로 유량을 온라인으로 제어하고 실시간으로 조정할 수 있는 피드백-루프를 갖는 유량 센서와 임의로 조합하여, 압력 용기, 멤브레인 펌프, 기어 펌프, 자기 부상 펌프, 연동 펌프, HPLC/FPLC 펌프 또는 임의의 다른 피스톤 펌프를 사용하는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, RNA를 포함하는 용액 및 리포좀을 포함하는 용액의 혼합물은 약 45 mM 내지 약 300 mM의 농도로 소듐 클로라이드를 포함하거나, 약 45 mM 내지 약 300 mM의 농도의 소듐 클로라이드에 상응하는 이온 강도를 포함한다.

한 구체예에서, RNA 용액은 약 90 mM 내지 약 600 mM의 농도로 소듐 클로라이드를 포함하거나, 약 90 mM 내지 약 600 mM의 농도의 소듐 클로라이드에 상응하는 이온 강도를 포함한다.

한 구체예에서, RNA를 포함하는 용액 및 리포좀을 포함하는 용액의 혼합물은 약 50 mM 이상의 이온 강도를 갖는다.

한 구체예에서, X-선 산란 패턴에서, RNA 리포플렉스는 약 1 nm^-1에서 단일 Bragg 피크를 특징으로 하며, 여기서 피크 폭은 0.2 nm^-1보다 작다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 약 200 내지 약 800 nm, 약 250 내지 약 700 nm, 약 400 내지 약 600 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 또는 350 nm 내지 약 400 nm 범위인 평균 직경을 갖는다.

본 명세서는 또한, 전술한 바와 같이 수득 가능한 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 명세서는 또한, 다음을 포함하는 조성물에 관한 것이다:

다음을 포함하는 RNA 리포플렉스 입자:

1종 이상의 양이온성 지질 및 1종 이상의 추가적인 지질,

여기서 RNA 리포플렉스 입자에서 양전하 대 음전하의 비는 약 1:2 내지 약 1.9:2, 또는 약 1.3:2.0이고,

여기서 RNA 리포플렉스 입자는 약 1 nm^-1에서 단일 Bragg 피크를 특징으로 하며, 여기서 피크 폭은 0.2 nm^-1보다 작다.

한 구체예에서, 상기 조성물은 약 10 내지 약 300 mM, 약 45 mM 내지 약 300 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 또는 약 80 mM 내지 약 150 mM의 농도로 소듐 클로라이드를 더 포함한다.

한 구체예에서, 상기 조성물은 완충제를 더 포함한다.

한 구체예에서, 상기 조성물은 킬레이트제를 더 포함한다.

한 구체예에서, II.하의 이러한 측면에서 기술된 RNA 리포플렉스 입자는 약 200 내지 약 800 nm, 약 250 내지 약 700 nm, 약 400 내지 약 600 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 350 nm 내지 약 400 nm 범위인 평균 직경을 갖는다.

한 구체예에서, 1종 이상의 양이온성 지질은 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA) 및/또는 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP)을 포함한다.

한 구체예에서, 1종 이상의 추가적인 지질은 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 콜레스테롤 (Chol) 및/또는 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC)을 포함한다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 약 10:0 내지 1:9, 약 4:1 내지 1:2, 약 3:1 내지 약 1:1, 또는 약 2:1의 몰비로 DOTMA 및 DOPE를 포함하고, 여기서 DOTMA의 양전하 대 RNA의 음전하의 전하 비는 약 1:2 내지 1.9:2이다.

한 구체예에서, 조성물은 아쥬반트를 더 포함한다.

한 구체예에서, 조성물은 전신 투여를 위해 제형화된다.

한 구체예에서, 전신 투여는 정맥 내 투여에 의한다.

본 명세서는 또한, 치료 용도로 기재된 바와 같은 조성물에 관한 것이다.

III. RNA 리포플렉스 입자를 저장하기 위한 방법 및 조성물

제3 측면에서, 본 명세서는 산물 품질의 실질적인 손실없이, 특히 RNA 활성의 실질적인 손실없이 RNA 리포플렉스 입자를 저장하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 명세서는 RNA 리포플렉스 입자의 품질의 실질적인 손실없이, 특히 RNA 활성의 실질적인 손실없이 RNA 리포플렉스 입자의 동결, 동결 건조 또는 분무-건조를 가능케 하는 제형에 관한 것이다.

본원에 기재된 RNA 리포플렉스 입자 제형은 동결 건조, 분무-건조 또는 관련 방법에 의해 동결 또는 탈수될 수 있어서, 액체 저장과 비교하여 산물의 저장-수명연장을 얻을 수 있다.

동결을 가능케 하기 위해 안정화제 (동결방지제)가 첨가된다. 한 구체예에서, 리포플렉스는 제조 후 안정화제 (동결방지제)로 희석되어, 이온 강도를 조절, 우선적으로는 이온 강도를 감소시키고 안정화제의 적절한 농도를 조절할 수 있다. 산물의 동결을 위해, 안정화제 농도는 생리학적 삼투질 농도 (osmolality)를 얻는 값보다 높을 수 있다. 이 경우, 투여를 위해, 원하는 삼투질 농도 및 이온 강도를 조정하기 위해 산물은 적합한 수성 상 (예를 들어, 주사용수, 식염수)로 희석된다. 글루코오스, 수크로오스 또는 트레할로스와 같은 안정화제 당 뿐만 아니라 덱스트란과 같은 다른 화합물도 사용될 수 있다.

놀랍게도, 본원에 기재된 안정화제를 포함하는 RNA 리포플렉스 제형 또한 동결 건조될 수 있음이 본 명세서에 따라 밝혀졌다. 동결 건조의 경우, 요구되는 안정화제 (동결건조방지제) 농도는 동결용보다 낮을 수 있고, 내성 (tolerated) NaCl 농도 (이온 강도)는 동결용보다 높을 수 있다. 대규모의 경제적인 탈수가 필요한 경우, 산물은 분무-건조될 수 있다.

일부 RNA 리포플렉스 제형의 pH는 통상적인 생리학적 범위 및 벌크 상에서 RNA 저장에 최적인 일반적인 pH보다 낮은 값으로 조정된다. 최적 pH는 약 6.2이고, 적합한 범위는 약 5.7 내지 약 6.7이다. 다른 제형의 경우, 이상적인 pH는 훨씬 더 낮을 수 있다. RNA 리포플렉스 내부의 국소 pH는 양이온성 지질의 양전하로 인해 벌크 상 pH보다 높다고 가정된다.

RNA 리포플렉스 조성물이 저장을 위해 동결되는, 본 명세서의 이러한 구체예에서, 조성물은 해동될 수 있고, 수성 액체를 첨가함으로써 임의로 조성물의 삼투질 농도, 이온 강도 및/또는 pH를 조정할 수 있다. 결과물인 조성물은 대상체에게 투여될 수 있다.

RNA 리포플렉스 조성물이 저장을 위해 동결 건조되거나 (lyophilized) 동결 건조되는 (freeze-dried) 본 명세서의 이러한 구체예에서, 조성물은 수성 액체를 첨가함으로써 재구성될 수 있고, 수성 액체를 첨가함으로써 임의로 조성물의 삼투질 농도, 이온 강도 및/또는 pH를 조정할 수 있다. 결과물인 조성물은 대상체에게 투여될 수 있다.

따라서, 이 측면에서, 본 명세서는,

(i) RNA 리포플렉스 입자 및 안정화제를 포함하는 수성 조성물을 제공하는 단계 및

(ii) 상기 조성물을 동결시키는 단계를 포함하는,

RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 동결 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

한 구체예에서, 동결은 약 -15℃ 내지 약 -40℃, 또는 약 -30℃의 온도에서 이루어진다.

한 구체예에서, 조성물은 예를 들어 약 -15℃ 내지 약 -40℃, 또는 약 -20℃의 저장 온도에서 저장된다.

한 구체예에서, 안정화제는 단당류, 이당류, 삼당류, 당 알코올, 올리고당 또는 그의 상응하는 당 알코올, 및 직쇄 폴리알코올 중에서 선택된 탄수화물이다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자 및 안정화제를 포함하는 수성 조성물을 제공하는 단계는, RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물을 제공하는 단계 및 안정화제를 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물에 첨가하는 단계를 포함한다. 따라서, 동결용 조성물을 제조하는 방법은, RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물을 제공하는 단계 및 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물에 안정화제를 첨가하는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물에 안정화제를 첨가하는 것은 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물의 이온 강도가 감소시킨다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자 및 안정화제를 포함하는 수성 조성물에서 안정화제의 농도는 생리학적 삼투질 농도에 필요한 값보다 높다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 및 안정화제를 포함하는 수성 조성물에서 안정화제의 농도는 RNA 리포플렉스 입자의 품질을 유지하고, 특히 약 -15℃ 내지 약 -40℃의 온도에서 1 개월 이상, 6 개월 이상, 12 개월 이상, 24 개월 이상, 또는 36 개월 이상 동안 상기 조성물의 저장 후 RNA 활성의 실질적인 손실을 피하기에 충분하다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 및 안정화제를 포함하는 수성 조성물에서 안정화제의 농도는 약 5% 내지 약 35.0% (w/v), 약 10% 내지 약 30.0% (w/v), 약 12.5% 내지 약 25.0% (w/v), 또는 약 22.0% (w/v)이다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 및 안정화제를 포함하는 수성 조성물에서 pH는 RNA 저장에 최적인 통상적인 pH보다 낮다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 및 안정화제를 포함하는 수성 조성물은 약 10 mM 내지 약 50 mM 농도로 소듐 클로라이드를 포함하거나, 약 10 mM 내지 약 50 mM 농도의 소듐 클로라이드에 상응하는 이온 강도를 포함한다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 및 안정화제를 포함하는 수성 조성물은 약 20 mM 농도의 소듐 클로라이드에 상응하는 이온 강도를 갖는다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 I. 및 II.하에 기술된 방법에 의해 얻을 수 있다.

한 구체예에서, 동결 조성물을 제조하는 방법은 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 동결 조성물을 저장하는 단계를 더 포함한다. 조성물은 동결 온도에 상응하거나 본질적으로 상응하는 온도, 또는 상기 동결 온도보다 더 높거나 더 낮은 온도에서 저장될 수 있다. 일반적으로, 조성물은 약 -15℃ 내지 약 -40℃의 온도, 예를 들어 약 -20℃ 온도에서 저장된다.

본 명세서는 또한, 상기 동결 조성물의 제조 방법에 의해 수득 가능한 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 명세서는 또한, 동결용 조성물을 제조하는 상기 방법에 의해 수득 가능한 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

한 구체예에서, 조성물은 약 10 mM 내지 약 50 mM의 농도로 소듐 클로라이드를 더 포함한다.

본 명세서는 또한, 다음을 포함하는 조성물에 관한 것이다:

- 다음을 포함하는 RNA 리포플렉스 입자:

하나 이상의 에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA,

1종 이상의 양이온성 지질 및 1종 이상의 추가적인 지질,

- 0 mM 내지 약 40 mM 농도로 소듐 클로라이드, 및

- 안정화제.

한 구체예에서, 조성물은 완충제를 더 포함한다.

한 구체예에서, 조성물 중 RNA의 양은 약 0.01 mg/mL 내지 약 1 mg/mL, 약 0.05 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL, 또는 약 0.05 mg/mL이다.

한 구체예에서, 소듐 클로라이드는 약 20 mM 내지 약 30 mM의 농도로 존재한다.

한 구체예에서, 소듐 클로라이드는 약 20 mM의 농도로 존재한다.

한 구체예에서, 소듐 클로라이드는 약 30 mM의 농도로 존재한다.

한 구체예에서, 조성물 중 안정화제의 농도는 생리학적 삼투질 농도에 필요한 값보다 높다.

한 구체예에서, 조성물 중 안정화제의 농도는 약 5 내지 약 35% (% w/v), 또는 약 12.5 내지 약 25% (% w/v)이다.

한 구체예에서, 안정화제는 단당류, 이당류, 삼당류, 당 알코올, 올리고당 또는 그의 상응하는 당 알코올, 및 직쇄 폴리 알코올 중에서 선택되는 탄수화물이다.

한 구체예에서, 안정화제는 약 5 내지 약 25% (% w/v) 농도의 수크로오스이다.

한 구체예에서, 수크로오스는 약 15% (w/v) 내지 약 25% (w/v)의 농도로 존재한다.

한 구체예에서, 수크로오스는 약 20% (w/v) 내지 약 25% (w/v)의 농도로 존재한다.

한 구체예에서, 수크로오스는 약 22% (w/v)의 농도로 존재한다.

한 구체예에서, 수크로오스는 약 20% (w/v)의 농도로 존재한다.

한 구체예에서, 조성물은 RNA 저장을 위해 최적의 통상적인 pH보다 낮은 pH를 갖는다.

한 구체예에서, 조성물은 약 5.7 내지 약 6.7, 또는 약 6.2의 pH를 갖는다.

한 구체예에서, 완충제는 2-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]에탄술폰산 (HEPES)이다.

한 구체예에서, HEPES는 약 2.5 mM 내지 약 10 mM, 또는 약 7.5 mM의 농도이다.

한 구체예에서, 조성물은 킬레이트제를 더 포함한다.

본 명세서는 또한 다음을 포함하는 조성물에 관한 것이다:

- 다음을 포함하는 RNA 리포플렉스 입자:

약 0.05 mg/mL의 농도로 하나 이상의 에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA, 및

약 2:1의 몰비로 DOTMA 및 DOPE,

여기서, RNA 리포플렉스 입자에서 양전하 대 음전하의 비는 약 1.3:2.0이고,

- 약 20 mM 농도의 소듐 클로라이드,

- 약 22% (w/v) 농도의 수크로오스,

- 약 6.2의 pH를 갖는 약 7.5 mM 농도의 HEPES, 및

- 약 2.5 mM의 농도의 EDTA.

한 구체예에서, 조성물은 액체 또는 동결 상태에 있다.

한 구체예에서, 동결 조성물은 약 -15℃ 내지 약 -40℃의 온도에서 1 개월 이상, 6 개월 이상, 12 개월 이상, 24 개월 이상, 또는 36 개월 이상 동안 안정하다.

한 구체예에서, 동결 조성물은 약 -15℃의 온도에서 1 개월 이상, 6 개월 이상, 12 개월 이상, 24 개월 이상, 또는 36 개월 이상 동안 안정하다.

한 구체예에서, 동결 조성물은 약 -15℃의 온도에서 2 개월 이상 동안 안정하다.

한 구체예에서, 동결 조성물은 약 -20℃의 온도에서 1 개월 이상, 6 개월 이상, 12 개월 이상, 24 개월 이상, 또는 36 개월 이상 동안 안정하다.

한 구체예에서, 동결 조성물은 약 -20℃의 온도에서 2 개월 이상 동안 안정하다.

한 구체예에서, 동결 조성물은 약 -30℃의 온도에서 1 개월 이상, 6 개월 이상, 12 개월 이상, 24 개월 이상, 또는 36 개월 이상 동안 안정하다.

한 구체예에서, 동결 조성물은 약 -30℃의 온도에서 2 개월 이상 동안 안정하다.

본 명세서는 또한, 상기 동결된 조성물을 해동하고, 임의로, 수성 액체를 첨가함으로써 삼투질 농도 및 이온 강도를 조절함으로써 수득 가능한 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물에 관한 것이다.

한 구체예에서, 조성물의 삼투질 농도는 약 200 mOsmol 내지 약 450 mOsmol이다.

한 구체예에서, 조성물은 약 80 mM 내지 약 150 mM의 농도로 소듐 클로라이드를 포함한다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 I. 및 II.하에 상기 기술된 방법에 의해 얻을 수 있다.

본 명세서는 또한,

(ii) 상기 조성물을 탈수하는 단계, 예컨대 동결 건조 또는 분무-건조하는 단계

를 포함하는, RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 탈수된, 예컨대 동결 건조된 또는 분무-건조된 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

한 구체예에서, 안정화제는 단당류, 이당류, 삼당류, 당 알코올, 올리고당 또는 그의 상응하는 당 알코올, 및 직쇄 폴리알코올 중에서 선택되는 탄수화물이다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자 및 안정화제를 포함하는 수성 조성물을 제공하는 단계는, RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물을 제공하는 단계 및 안정화제를 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물에 첨가하는 단계를 포함한다. 따라서, 탈수용, 예컨대 동결 건조 또는 분무-건조용 조성물을 제조하는 방법은, RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물을 제공하는 단계 및 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물에 안정화제를 첨가하는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물에 안정화제를 첨가하는 것은 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물의 이온 강도를 감소시킨다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 및 안정화제를 포함하는 수성 조성물에서 안정화제의 농도는 RNA 리포플렉스 입자의 품질을 유지하고, 특히 1 개월 이상, 6 개월 이상, 12 개월 이상, 24 개월 이상, 또는 36 개월 이상 동안 조성물의 저장 후 RNA 활성의 실질적인 손실을 피하기에 충분하다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 및 안정화제를 포함하는 수성 조성물은 약 10 mM 내지 약 80 mM 또는 약 10 mM 내지 약 50 mM의 농도로 소듐 클로라이드를 포함하거나, 또는 약 10 mM 내지 약 80 mM 또는 약 10 mM 내지 약 50 mM 농도의 소듐 클로라이드에 상응하는 이온 강도를 포함한다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 및 안정화제를 포함하는 수성 조성물은 약 20 mM, 약 40 mM, 약 60 mM, 또는 약 80 mM의 농도의 소듐 클로라이드에 상응하는 이온 강도를 갖는다.

한 구체예에서, 탈수된, 예를 들어 동결 건조된 또는 분무-건조된 조성물을 제조하는 방법은 또한, RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 동결 건조된 또는 분무-건조된 조성물을 저장하는 단계를 더 포함한다. 일반적으로, 조성물은 약 -15℃ 내지 약 -40℃의 온도, 예를 들어 약 -20℃의 온도에서 저장된다. 특정 구체예에서, 조성물은 0℃보다 높은 온도에서, 예를 들어 약 25℃ 또는 약 4℃에서, 또는 예를 들어 실온에서 저장된다.

본 명세서는 또한, 탈수된, 예를 들어 동결 건조된 또는 분무-건조된 조성물을 제조하는 상기 방법에 의해 수득될 수 있는 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 명세서는 또한, 탈수용, 예컨대 동결 건조 또는 분무-건조용 조성물을 제조하는 상기 방법에 의해 수득될 수 있는 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

한 구체예에서, 조성물은 약 10 mM 내지 약 80 mM 또는 약 10 mM 내지 약 50 mM의 농도로 소듐 클로라이드를 더 포함한다.

본 명세서는 또한, 다음을 포함하는 조성물에 관한 것이다:

- 다음을 포함하는 RNA 리포플렉스 입자:

1종 이상의 양이온성 지질 및 1종 이상의 추가적인 지질,

여기서, RNA 리포플렉스 입자에서 양전하 대 음전하의 비는 약 1:2 내지 약 1.9:2, 또는 약 1.3:2.0이며,

- 10 mM 내지 약 80 mM 농도의 소듐 클로라이드, 및

- 안정화제.

한 구체예에서, 조성물은 완충제를 더 포함한다.

한 구체예에서, 조성물 중 안정화제의 농도는 약 5 내지 약 35% (% w/v), 또는 약 10 내지 약 25% (% w/v)이다.

한 구체예에서, 안정화제는 약 5 내지 약 35% (% w/v) 농도의 트레할로스이다.

한 구체예에서, 트레할로스는 약 5% (w/v) 내지 약 25% (w/v)의 농도이다.

한 구체예에서, 트레할로스는 약 10% (w/v) 내지 약 25% (w/v)의 농도이다.

한 구체예에서, 트레할로스는 약 10% (w/v)의 농도이다.

한 구체예에서, 트레할로스는 약 15% (w/v)의 농도이다.

한 구체예에서, 조성물은 RNA 저장을 위해 최적인 통상적인 pH보다 낮은 pH를 갖는다.

한 구체예에서, 조성물은 킬레이트제를 더 포함한다.

본 명세서는 또한, 다음을 포함하는 조성물에 관한 것이다:

- 다음을 포함하는 RNA 리포플렉스 입자:

약 2:1의 몰비의 DOTMA 및 DOPE,

여기서, RNA 리포플렉스 입자에서 양전하 대 음전하의 비는 약 1.3:2.0이며,

- 약 20 mM 농도의 소듐 클로라이드,

- 약 10% (w/v) 농도의 트레할로스,

- 약 6.2의 pH에서 약 7.5 mM의 농도의 HEPES, 및

- 약 2.5 mM의 농도의 EDTA.

한 구체예에서, 조성물은 액체 또는 탈수된 상태, 예를 들어 동결 건조되거나 (lyophilized) 동결-건조된 (freeze-dried) 상태에 있다.

한 구체예에서, 탈수된, 예를 들어 동결 건조되거나 (lyophilized) 동결-건조된 (freeze-dried) 조성물은 1 개월 이상, 6 개월 이상, 12 개월 이상, 24 개월 이상, 또는 36 개월 이상 동안 안정하다. 한 구체예에서, 조성물은 0℃보다 높은 온도, 예를 들어 약 25℃ 또는 약 4℃, 또는 예를 들어 실온에서 저장된다.

한 구체예에서, 탈수된, 예를 들어 동결 건조되거나 (lyophilized) 동결-건조된 (freeze-dried) 조성물은 1 개월 이상 동안 안정하다.

한 구체예에서, 탈수된, 예를 들어 동결 건조되거나 (lyophilized) 동결-건조된 (freeze-dried) 조성물은 2 개월 이상 동안 안정하다.

본 명세서는 또한, 탈수된, 예를 들어 동결 건조되거나 (lyophilized) 동결-건조된 (freeze-dried) 상기 조성물을 재구성하는 단계 및 임의로 수성 액체를 첨가함으로써 삼투질 농도 및 이온 강도를 조절하는 단계에 의하여 수득 가능한 RNA 리포플렉스를 포함하는 수성 조성물에 관한 것이다.

한 구체예에서, 조성물의 삼투질 농도는 약 150 mOsmol 내지 약 450 mOsmol이다.

한 구체예에서, 조성물은 약 80 mM 내지 약 150 mM의 농도의 소듐 클로라이드를 포함한다.

한 구체예에서, III.하의 이러한 측면에서 기술된 RNA 리포플렉스 입자는 약 1 nm^-1에서 단일 Bragg 피크를 특징으로 하며, 여기서 피크 폭은 0.2 nm^-1보다 작다.

한 구체예에서, III.하의 이러한 측면에서 기술된 RNA 리포플렉스 입자는 약 200 내지 약 800 nm, 약 250 내지 약 700 nm, 약 400 내지 약 600 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 350 nm 내지 약 400 nm의 평균 직경을 갖는다.

한 구체예에서, 1종 이상의 양이온성 지질은 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA)을 포함하고, 1종 이상의 추가적인 지질은 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)를 포함한다.

한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 약 10:0 내지 1:9, 약 4:1 내지 1:2, 약 3:1 내지 약 1:1, 또는 약 2:1의 몰비로 DOTMA 및 DOPE를 포함하고, RNA의 음전하 대 DOTMA의 양전하의 전하 비는 약 1:2 내지 1.9:2이다.

한 구체예에서, 조성물은 아쥬반트를 더 포함한다.

한 구체예에서, 조성물은 전신 투여를 위해 제형화된다.

한 구체예에서, 전신 투여는 정맥 내 투여에 의한다.

본 명세서는 또한, 치료적 용도로 기재된 바와 같은 조성물에 관한 것이다.

본 명세서는 또한, 상기 기재된 동결 조성물을 해동시키거나 상기 기재된 동결 건조된 또는 분무-건조된 조성물을 재구성하는 단계 및 임의로 수성 액체를 첨가하여 삼투질 농도 및 이온 강도를 조절하는 단계를 포함하는, RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

한 구체예에서, 수성 액체는 첨가되어 조성물의 삼투질 농도 약 200 mOsmol 내지 약 450 mOsmol를 얻는다.

한 구체예에서, 수성 액체는 첨가되어 약 80 mM 내지 약 150 mM의 농도의 소듐 클로라이드를 얻는다.

도면의 간단한 설명

도 1은 지질 스톡 용액 중의 지질 농도와 리포좀 크기의 상관 관계를 보여준다. 리포좀은 수중에서의 에탄올 주입에 의해 제조되었다 (에탄올 주입 후 여과 과정이 수행되지 않음). 리포좀의 크기는 에탄올 내 지질 농도에 따라 증가한다. 본 실시예: 66:33의 % 몰비를 갖는 지질 혼합물 DOTMA/DOPE.

도 2는 여러 가지 농도로 여러 지질 용액으로 제조된 DOTMA/DOPE 리포좀 제형에 존재하는 입자의 양을 보여준다.

도 3은 RNA-리포플렉스 크기에 대한 리포좀 전구체 크기 (사용된 비-여과된 리포좀 콜로이드)의 영향을 보여준다. 그 형성에 작은 리포좀이 사용된 경우, 작은 RNA-리포플렉스가 얻어졌다. 더 큰 리포좀으로 제조된 모든 RNA-리포플렉스에서는 리포좀 크기와 RNA-리포플렉스 크기 사이의 명확한 상관 관계가 발견되지 않았다.

도 4는 여러 가지 리포좀 전구체 (비-여과된 리포좀)로 제조된 RNA-리포플렉스 제형에 존재하는 입자의 양을 보여준다. 0.5 μm 입자의 양은 더 큰 리포좀으로 제조된 RNA-리포플렉스 제형에서 증가한다. 리포좀은 여러 농도의 여러 가지 지질 스톡 용액을 사용하여 에탄올 주사에 의해 제조되었다.

도 5는 전하 비 4/1 (최상단) 및 전하 비 1.3/2로 제조된 리포좀으로 형성된 RNA-리포플렉스로부터의 SAXS 측정으로부터 얻어진 회절 곡선을 도시하며, 여기서 리포플렉스 형성을 위한 리포좀은 400 mM, 300 mM 및 100 mM의 에탄올 중 mM 지질 스톡 용액을 이용하여 수득되었다.

도 6은 여러 가지 리포좀 전구체로 제조된 여러 RNA-리포플렉스의 시험관내 (인간 수지상 세포) 상관 길이 및 형질 감염 효율을 보여준다. 생물학적 활성 (시험관내 RNA 형질 감염)은 RNA-리포플렉스의 상관 길이와 함께 단조롭게 증가한다. 리포좀은 에탄올 주입 및 여러 가지 지질 농도로 제조된 여러 지질 스톡 용액에 의해 제조되었다.

도 7은 각각 에탄올 중 150 mM 스톡 용액으로부터 또는 에탄올 중 400 mM 스톡 용액으로부터 제조된 2 가지 상이한 유형의 리포좀으로부터의 리포플렉스의 AF4 측정을 나타낸다.

도 8은 수지상 세포에서 여러 가지 RNA-리포플렉스의 시험관내 형질 감염 효율을 보여준다. 루시퍼라아제 신호는 RNA-리포플렉스 형성에 사용된 리포좀 크기에 따라 단조롭게 증가한다.

도 9는 수지상 세포에서 여러 가지 RNA-리포플렉스의 시험관내 형질 감염 효율을 보여준다. 루시퍼라아제 신호는 리포좀 크기에 따라 단조롭게 증가한다.

도 10은 적용 6 시간 후 RNA-리포플렉스 제형의 생체내 형질 감염 효율을 나타낸다. RNA-리포플렉스는 작고 큰 리포좀들 (비-여과된 리포좀)으로 제조되었다. 더 큰 리포좀으로 제조된 RNA-리포플렉스는 더 높은 루시퍼라아제 발현을 결과한다.

도 11은 적용 6 시간 후 RNA-리포플렉스의 생체내 영상화를 보여준다. 작고 큰 리포좀들로 RNA-리포플렉스를 제조하였다. A) 생 (raw) 콜로이드로부터 작은 리포좀으로 제조된 RNA-리포플렉스. B) 생 콜로이드로부터 더 큰 리포좀으로 제조된 RNA-리포플렉스. C) 작은 여과된 리포좀으로 제조된 RNA-리포 플렉스. D) 큰 여과 된 리포좀으로 제조된 RNA-리포플렉스. 더 큰 리포좀으로 제조된 RNA-리포플렉스로 더 높은 생물 발광 신호를 얻음.

도 12는 RNA 리포플렉스의 자동화된 뱃치 제조를 위한 일반적인 절차를 보여준다.

도 13은 여러 유량에서 내부 직경 3.2 mm인 Y-타입 혼합 요소를 사용하여 제조된 RNA 리포플렉스의 Z-평균 및 다분산도를 도시한다.

도 14는 여러 유량에서 내부 직경 2.4 mm인 Y-타입 혼합 요소를 사용하여 제조된 RNA 리포플렉스의 Z-평균 및 다분산도를 도시한다.

도 15는 리포플렉스 형성에서 입자 크기와 RNA 농도의 상관 관계를 보여준다. 동결 전에 PCS 측정을 수행하였다.

도 16은 3 회의 동결 해동 사이클 후 리포플렉스 형성에서 입자 특성과 RNA 농도의 상관 관계를 보여준다.

도 17은 입자 특성과 1.0:2.0 내지 2.1:2.0 범위의 전하 비 (양:음)의 상관 관계를 보여준다.

도 18은 입자 특성과 2.0:1.0 내지 5.0:1.0의 범위의 전하 비 (양:음)의 상관 관계를 보여준다.

도 19는 리포플렉스 형성에서 입자 특성과 NaCl 농도의 상관 관계를 보여준다.

도 20은 리포플렉스 형성에서 생체 활성과 NaCl 농도의 상관 관계를 보여준다.

도 21은 + 40℃에서 가속 저장 후 몇몇 pH-값에서 여러 가지 완충 물질 (HEPES; Na-아세테이트; Na-포스페이트; Na-카보네이트)을 사용하여 동결방지제 없는 RNA_(LIP) 조성물에서 RNA 완전성에 대한 측정을 보여준다. 여러 막대는 저장 기간이 왼쪽 (3 일)에서 오른쪽 (21 일)으로 증가함을 나타낸다.

도 22는 + 40℃에서 가속 저장 후 몇몇 pH-값에서 HEPES를 완충 물질로서 사용하여 동결방지제로서 수크로오스를 포함하는 RNA 리포플렉스 제형에서 RNA 완전성에 대한 측정을 보여준다. 여러 막대는 저장 기간이 왼쪽 (1 일)에서 오른쪽 (21 일)으로 증가함을 나타낸다.

도 23은 여러 가지 함량의 EDTA로 40℃에 저장된 리포플렉스에서 RNA의 완전성을 보여준다.

도 24는 NaCl 및 동결방지제의 농도가 각 단계에서 최적화되었음을 나타내는 일반적인 다이어그램이다.

도 25는 대안의 동결방지제의 증량시 동결된 RNA 리포플렉스의 Z-평균 및 다분산도를 도시한다.

도 26은 대안의 동결방지제의 증량시 동결된 RNA 리포플렉스 제형에서 ≥10 μm인 현미경으로 식별되는 (subvisible) 입자의 수를 보여준다.

도 27은 -30℃에서 동결 전후에 5-20% w/v 수크로오스 (X-축) 및 다양한 NaCl 저농도를 함유하는 RNA 리포플렉스 제형에서 입자 크기의 측정을 나타낸다.

도 28은 -30℃에서 동결 전후에 5-20% w/v 트레할로스 2수화물 (x-축) 및 다양한 NaCl 저농도를 함유하는 RNA 리포플렉스 제형에서 입자 크기의 측정을 나타낸다.

도 29는 다수의 동결 해동 사이클 후 50 mM NaCl 및 다양한 양 (% w:v)의 트레할로스 2수화물을 함유하는 RNA 리포플렉스 제형에서 입자 크기의 측정을 나타낸다.

도 30은 다수의 동결 해동 사이클 후 70 mM NaCl 및 다양한 양 (% w/v)의 트레할로스 2수화물을 함유하는 RNA 리포플렉스 제형에서 입자 크기의 측정을 나타낸다.

도 31은 다수의 동결 해동 사이클 후 90 mM NaCl 및 다양한 양 (% w/v)의 트레할로스 2수화물을 함유하는 RNA 리포플렉스 제형에서 입자 크기의 측정을 나타낸다.

도 32는 -15℃에서 8 개월 동안 저장한 후 5-20% w/v 수크로오스 및 다양한 NaCl 저농도를 함유하는 RNA 리포플렉스 제형에서 입자 크기의 측정을 나타낸다. 여러 막대는 저장 기간이 왼쪽 (0 개월)에서 오른쪽 (8 개월)으로 증가함을 나타낸다. 8 개 미만의 막대를 갖는 수크로오스/NaCl 조합에서, 입자 크기는 2 개의 후속 시점에서 사양 (specification)을 초과하여 분석을 중단하였다.

도 33은 -30℃에서 8 개월 동안 저장한 후 5-20% w/v 수크로오스 및 다양한 NaCl 저농도를 함유하는 RNA 리포플렉스 제형에서 입자 크기의 측정을 나타낸다. 여러 막대는 저장 기간이 왼쪽 (0 개월)에서 오른쪽 (8 개월)으로 증가함을 나타낸다. 8 개 미만의 막대를 갖는 수크로오스/NaCl 조합에서, 입자 크기는 2 개의 후속시점에서 사양을 초과하여 분석을 중단하였다.

도 34는 -15℃에서 8 개월 동안 저장한 후 5-20% w/v 트레할로스 2수화물 및 다양한 NaCl 저농도를 함유하는 RNA 리포플렉스 제형에서 입자 크기의 측정을 나타낸다. 여러 막대는 저장 기간이 왼쪽 (0 개월)에서 오른쪽 (8 개월)으로 증가함을 나타낸다. 8 개 미만의 막대를 갖는 트레할로스/NaCl 조합에서, 입자 크기는 2 개의 후속 시점에서 사양을 초과하여 분석을 중단하였다.

도 35는 -30℃에서 8 개월 동안 저장한 후 5-20% w/v 트레할로스 2수화물 및 다양한 NaCl 저농도를 함유하는 RNA 리포플렉스 제형에서 입자 크기의 측정을 나타낸다. 여러 막대는 저장 기간이 왼쪽 (0 개월)에서 오른쪽 (8 개월)으로 증가함을 나타낸다. 8 개 미만의 막대를 갖는 트레할로스/NaCl 조합에서, 입자 크기는 2 개의 후속 시점에서 사양을 초과하여 분석을 중단하였다.

도 36은 -20℃에서 저장한 후 22% w/v 수크로오스 및 다양한 NaCl 저농도를 함유하는 RNA 리포플렉스 제형에서 입자 크기의 측정을 보여준다.

도 37은 -20℃에서 저장한 후 22% w/v 트레할로스 2수화물 및 다양한 NaCl 저농도를 함유하는 RNA 리포플렉스 제형에서 입자 크기의 측정을 보여준다.

도 38은 -20℃에서 저장한 후 22% w/v 글루코오스 및 다양한 NaCl 저농도를 함유하는 RNA 리포플렉스 제형에서 입자 크기의 측정을 보여준다.

도 39는 - 15 내지 -40℃에서 동결되고 저장된, 22% w/v 글루코오스 및 20 mM NaCl을 함유하는 RNA 리포플렉스 제형에서 입자 크기의 측정을 보여준다.

도 40은 -20℃에서 저장한 후 표 10에 열거된 동결방지제의 조합을 함유하는 조성물에서 동결된 RNA 리포플렉스의 입자 크기의 측정을 보여준다.

도 41은 동결-해동 후 또는 동결-건조 및 재구성 후 RNA 리포플렉스 제형 [RNA (lip)] 제형에서 트레할로스 농도의 효과를 보여준다.

도 42는 0.9% NaCl 용액 또는 WFI (water for injection)(주입 용수)로 재구성 후 22% 트레할로스 내에서 제조된 동결-건조 RNA(lip) 제형의 입자 크기 변화를 보여준다.

도 43은 여러 NaCl 농도에서 22% 트레할로스 내에서 제조된 동결-건조 RNA 리포플렉스 제형 [RNA(lip)]의 Luc-RNA 시험관내 형질 감염을 보여준다. 동결-건조된 샘플은 0.9% NaCl 용액으로 재구성되었다. (텍스쳐라이즈드 컬럼: 액체 컨트롤).

도 44는 0.9% NaCl 용액으로 재구성 후 2-8℃ 또는 25℃에 저장된 여러 트레할로스/NaCl 비로 제제화된 동결-건조 RNA 리포플렉스 제형 [RNA(lip)]의 Z-평균 직경을 나타낸다. 동결 건조 후 제형은 원래 부피로 재구성되었다.

도 45는 0.9% NaCl 용액으로 재구성 후 여러 가지 트레할로스/NaCl 비로 제형화되고 2-8℃ 또는 25℃에서 저장된 동결-건조 RNA(lip)의 RNA 완전성 (% 전장 RNA)을 보여준다. 제형은 동결-건조 후 원래 부피로 재구성되고 세포 배양 실험을 위해 0.9% NaCl 용액으로 1:1 희석되었다 (0.01 mg/mL RNA).

상세한 설명

본 명세서는 하기에서 상세하게 설명되지만, 본 개시는 여기에 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 하는데, 이들은 변할 수 있기 때문이다. 또한, 여기에서 사용된 용어는 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적만을 위한 것이며, 첨부된 청구 범위에 의해서만 제한될 본 명세서의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 여기서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.

바람직하게는, 여기서 사용되는 용어는 ["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)]에 기술되는 바와 같이 정의된다.

본 명세서의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 당해 분야의 문헌에 설명되는 화학, 생화학, 세포 생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기법에 관한 종래의 방법을 사용할 것이다 (예를 들어, [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989] 참고).

이하, 본 명세서의 요소들이 기술될 것이다. 이들 요소는 구체예와 함께 열거되지만, 추가적인 구체예를 생성하기 위해 임의의 방식으로 그리고 임의의 수로 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 다양하게 기술된 실시예 및 구체예는 본 명세서를 명시적으로 기술된 구체예로만 제한하도록 해석되어서는 안된다. 본 설명은 명시적으로 기술된 구체예들을 임의 숫자의 개시된 요소들과 조합하는 구체예들을 개시하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 문맥상 달리 지시하지 않는 한, 모든 기술된 요소의 임의의 순열 및 조합이 본 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.

"약"이라는 용어는 대략 또는 거의를 의미하며, 일 구체예에서 여기에 기술된 수치 또는 범위의 맥락에서, 인용되거나 청구된 수치 또는 범위의 ± 20%, ± 10%, ± 5%, 또는 ± 3%를 의미한다.

본 명세서를 설명하는 맥락에서 (특히 청구항의 맥락에서) 사용되는 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 언급은, 달리 지시되지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 단수 및 복수를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 값의 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 독립적인 값을 개별적으로 지칭하는 빠른 방법으로서 작용하도록 의도된다. 본 명세서에서 달리 지시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 마치 본 명세서에서 개별적으로 언급된 것처럼 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 기술된 모든 방법은 본 명세서에서 달리 지시되거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공되는, 임의의 그리고 모든 예시 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "와 같은")의 사용은 오로지 본 명세서를 더 잘 기술하기 위한 것이며 청구 범위에 제한을 가하지 않는다. 본 명세서의 어떠한 언어도 본 명세서의 실시에 필수적인 임의의 비-청구 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.

달리 명시되지 않는 한, "포함하는 (comprising)"이라는 용어는 본 문서의 맥락상 "포함하는"에 의해 도입되는 리스트의 구성원 외에 추가의 구성원이 필요에 따라 존재할 수 있음을 나타내기 위해 사용된다. 그러나, "포함하는"이라는 용어는 어떠한 추가적인 구성원이 존재하지 않을 가능성을 포함하는 것으로, 즉 이 구체예 "포함하는"은 "구성되는 (consisting of)"의 의미를 갖는 것으로 이해되어야 하는 목적인, 본 명세서의 특정한 구체예로서 고려된다.

본 명세서의 텍스트 전체에 걸쳐 몇몇 문서가 인용되어 있다. 본 명세서에 인용된 각각의 문헌 (모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업체 사양, 지침 등을 포함)은, 앞에서든 뒤에서든, 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다. 본 명세서의 어떤 것도 본 개시가 그러한 개시보다 선행할 자격이 없다고 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

정의

이하, 본 명세서의 모든 측면에 적용되는 정의가 제공될 것이다. 달리 표시되지 않는 한, 다음 용어는 다음 의미를 갖는다. 정의되지 않은 용어는 해당 기술에서 인식되는 의미를 갖는다.

여기서 사용되는 "감소하다" 또는 "억제하다"와 같은 용어는, 그 수준에 있어서 예를 들어 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 50% 이상, 또는 약 75% 이상의 총 감소를 야기하는 능력을 의미한다. 용어 "억제하다" 또는 유사한 문구는 완전전 또는 본질적으로 완전한 억제, 즉, 0으로의 감소 또는 본질적으로 0으로의 감소를 포함한다.

한 구체예에서 "증가하다" 또는 "향상되다"와 같은 용어는 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 80% 이상 또는 약 100% 이상으로 증가 또는 향상에 관한 것이다.

여기서 사용되는 "생리학적 pH"는 약 7.5의 pH를 지칭한다.

여기서 사용되는 "% w/v"는 부피에 의한 중량 백분율을 의미하며, 이는 밀리리터 (mL)의 총 용액 부피에 대한 백분율로 표현된 그램 (g)의 용질의 양을 측정하는 농도의 단위이다.

용어 "이온 강도"는 특정 용액에서 여러 종류의 이온 종의 수와 그들 각각의 전하 사이의 수학적 관계를 지칭한다. 따라서, 이온 강도 I는, c는 특정 이온 종의 몰 농도이고 z는 그 전하의 절대 값인, 식:

에 의해 수학적으로 표시된다. 합 (Σ)은 용액 내의 모든 다른 종류의 이온들 (i)에 대하여 취해진다.

본 명세서에 따르면, 한 구체예에서 용어 "이온 강도"는 1가 이온의 존재에 관한 것이다. 2가 이온, 특히 2가 양이온의 존재와 관련하여, 킬레이트제의 존재로 인한 그들의 농도 또는 유효 농도 (유리 이온의 존재)는 한 구체예에서, RNA의 분해를 방지하기에 충분히 낮다. 한 구체예에서, 2가 이온의 농도 또는 유효 농도는 RNA 뉴클레오타이드 사이의 포스포디에스테르 결합의 가수 분해에 대한 촉매 수준 미만이다. 한 구체예에서, 유리 2가 이온의 농도는 20 μM 이하이다. 한 구체예에서, 유리 2가 이온은 존재하지 않거나 본질적으로 존재하지 않는다.

"삼투질 농도"는 용매 킬로그램당 용질의 오스몰 수로 표현되는 특정 용질의 농도를 지칭한다.

레이놀즈 수는 무차원의 (dimensionless) 수이며, 이는 다음 식을 사용하여 계산할 수 있고:

여기서 ρ는 유체의 밀도, υ는 유체의 속도, l은 특징적 길이 (여기서는 혼합 요소의 내경), 및 η는 점도이다.

"동결"이라는 용어는 일반적으로, 열의 제거를 수반하는 액체의 응고에 관한 것이다.

용어 "동결 건조하는" 또는 "동결 건조"는 물질을 동결시킨 다음 주변 압력을 감소시켜 물질 내의 동결된 매질이 고체 상에서 기체 상으로 직접 승화될 수 있도록 하는 물질의 동결-건조를 지칭한다.

"분무-건조"라는 용어는 용기 (스프레이 건조기) 내에서 (가열된) 기체를 원자화된 (분무된) 유체와 혼합함으로써 물질을 분무-건조하는 것을 말하며, 여기서 형성된 소적으로부터의 용매는 증발하여 건조 분말이 된다.

용어 "동결방지제"는 동결 단계 동안 활성 성분을 보호하기 위해 제형에 첨가되는 물질에 관한 것이다.

용어 "동결건조방지제"는 건조 단계 동안 활성 성분을 보호하기 위해 제형에 첨가되는 물질에 관한 것이다.

용어 "재구성"은 건조된 생성물에 물과 같은 용매를 첨가하여 이를 원래의 액체 상태와 같은 액체 상태로 되돌리는 것에 관한 것이다.

본 명세서의 맥락에서 용어 "재조합"은 "유전자 공학을 통해 만들어진"을 의미한다. 한 구체예에서, 본 명세서의 맥락에서 "재조합 객체"는 자연적으로 발생하지 않는다.

여기서 사용된 용어 "자연적으로 발생하는"은 객체가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 유기체 (바이러스 포함)에 존재하고 자연의 원으로부터 분리될 수 있고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 펩타이드 또는 핵산은 자연적으로 발생하는 것이다. "자연에서 발견된다"라는 용어는 "자연에 존재하는"을 의미하고, 알려진 객체뿐만 아니라 아직 자연으로부터 발견 및/또는 분리되지 않았지만, 미래에 자연적 원으로부터 발견 및/또는 분리될 수 있는 객체를 포함한다.

"평형 용해도"라는 용어는 용질이 용해되는 속도 및 용질이 용액으로부터 석출되는 속도가 동일한 용질의 농도를 의미한다. 한 구체예에서, 상기 용어는 실온에서의 각 농도에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "실온"은 4℃ 초과의 온도, 바람직하게는 약 15℃ 내지 약 40℃, 약 15℃ 내지 약 30℃, 약 15℃ 내지 약 24℃, 또는 약 16℃ 내지 약 21℃의 온도를 지칭한다. 이러한 온도는 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃ 및 22℃를 포함할 것이다.

본 명세서의 맥락에서, 용어 "입자"는 분자 또는 분자 복합체에 의해 형성된 구조화된 실체에 관한 것이다. 한 구체예에서, 용어 "입자"는 마이크로- 또는 나노-크기의 압축된 구조물과 같은 마이크로- 또는 나노-크기의 구조물에 관한 것이다.

본 명세서의 맥락에서, 용어 "RNA 리포플렉스 입자"는 지질, 특히 양이온성 지질 및 RNA를 함유하는 입자에 관한 것이다. 양으로 하전된 리포좀과 음으로 하전된 RNA 사이의 정전기적 상호 작용은 RNA 리포플렉스 입자의 복합화 및 자발적인 형성을 결과한다. 양으로 하전된 리포좀은 일반적으로 DOTMA와 같은 양이온성 지질 및 DOPE와 같은 추가적인 지질을 사용하여 합성될 수 있다. 한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 나노입자이다.

본 명세서에 사용되는 바, "나노입자"는 RNA 및 1종 이상의 양이온성 지질을 포함하고 정맥 내 투여에 적합한 평균 직경을 갖는 입자를 지칭한다.

"평균 직경"이라는 용어는 소위 누적 알고리즘을 사용하여 데이터 분석으로 동적 광산란 (DLS)에 의해 측정된 입자의 평균 유체 역학적 직경을 말하며, 이는, 결과로서, 길이의 치수를 갖는 소위 Z_average, 및 무차원인 다분산 지수 (PI)를 제공한다 (Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, pp 4814-4820, ISO 13321). 여기서 입자의 "평균 직경", "직경" 또는 "크기"는 Z_average의 이러한 값과 동의어로 사용된다.

용어 "다분산 지수"는 여기서 입자, 예를 들어 나노입자 총체의 크기 분포의 척도로서 사용된다. 다분산 지수는 소위 누적 분석에 의한 동적 광산란 측정에 기초하여 계산된다.

여기서 사용되는 바, "현미경으로 식별되는 입자"는 100 마이크로미터 (μm) 미만의 평균 직경을 갖는 입자를 지칭한다. 본 명세서에서 RNA 리포플렉스 입자의 응집 정도를 나타내기 위해 광-가시화를 사용하여 현미경으로 식별되는 입자의 수를 측정할 수 있다. 일부 구체예에서, 평균 직경이 10 ㎛ 이상인 현미경으로 식별되는 입자의 수를 측정한다. 다른 구체예에서, 평균 직경이 25 ㎛ 이상인 현미경으로 식별되는 입자의 수를 측정한다.

용어 "에탄올 주입 기술"은 지질을 포함하는 에탄올 용액이 바늘을 통해 수용액에 신속하게 주입되는 방법을 지칭한다. 이러한 작용은 용액 전체에 지질을 분산시키고 지질 구조 형성, 예를 들어 리포좀 형성과 같은 지질 소포 형성을 촉진한다. 일반적으로, 본원에 기술된 RNA 리포플렉스 입자는 콜로이드 리포좀 분산액에 RNA를 첨가함으로써 얻을 수 있다. 에탄올 주입 기술을 사용하여, 이러한 콜로이드 리포좀 분산액은, 한 구체예에서, 다음과 같이 형성된다: 지질, 예컨대 DOTMA와 같은 양이온성 지질 및 추가적인 지질을 포함하는 에탄올 용액이 교반 하에 수용액에 주입된다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 RNA 리포플렉스 입자는 압출 단계 없이 얻을 수 있다.

"압출하는" 또는 "압출"이라는 용어는 고정된 단면 프로파일을 갖는 입자의 생성을 지칭한다. 특히, 이는 입자의 소형화를 말하며, 이에 의해 입자는 미세한 기공을 갖는 필터를 통하게 된다.

RNA 리포플렉스 입자 직경

본원에 기술된 RNA 리포플렉스 입자는, 한 구체예에서, 약 200 nm 내지 약 1000 nm, 약 200 nm 내지 약 800 nm, 약 250 내지 약 700 nm, 약 400 내지 약 600 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 350 nm 내지 약 400 nm 범위인 평균 직경을 갖는다. 특정 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 약 200 nm, 약 225 nm, 약 250 nm, 약 275 nm, 약 300 nm, 약 325 nm, 약 350 nm, 약 375 nm, 약 400 nm, 약 425 nm, 약 450 nm, 약 475 nm, 약 500 nm, 약 525 nm, 약 550 nm, 약 575 nm, 약 600 nm, 약 625 nm, 약 650 nm, 약 700 nm, 약 725 nm, 약 750 nm, 약 775 nm, 약 800 nm, 약 825 nm, 약 850 nm, 약 875 nm, 약 900 nm, 약 925 nm, 약 950 nm, 약 975 nm, 또는 약 1000 nm의 평균 직경을 갖는다. 한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 약 250 nm 내지 약 700 nm 범위인 평균 직경을 갖는다. 다른 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 약 300 nm 내지 약 500 nm 범위인 평균 직경을 갖는다. 예시적인 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 약 400 nm의 평균 직경을 갖는다.

예를 들어 본원에 기술된 방법에 의해 생성된, 본원에 기재된 RNA 리포플렉스 입자는 다분산 지수 약 0.5 미만, 약 0.4 미만 또는 약 0.3 미만을 나타낸다. 예로서, RNA 리포플렉스 입자는 약 0.1 내지 약 0.3 범위의 다분산 지수를 나타낼 수 있다.

지질

한 구체예에서, 본원에 기술된 지질 용액, 리포좀 및 RNA 리포플렉스 입자는 양이온성 지질을 포함한다. 본원에 사용된 바, "양이온성 지질"은 순 양전하를 갖는 지질을 지칭한다. 양이온성 지질은 지질 매트릭스에 대한 정전기적 상호 작용에 의해, 음으로 하전된 RNA에 결합한다. 일반적으로, 양이온성 지질은 스테롤, 아실 또는 디아실 사슬과 같은 친유성 모이어티를 가지며, 지질의 헤드 그룹은 전형적으로 양전하를 띤다. 양이온성 지질의 예는 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA), 디메틸디옥타데실암모늄 (DDAB); 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP); 1,2-디올레일-3-디메틸암모늄-프로판 (DODAP); 1,2-디아실옥시-3-디메틸암모늄 프로판; 1,2-디알킬옥시-3- 디메틸암모늄 프로판; 디옥타데실디메틸 암모늄 클로라이드 (DODAC), 2,3-디(테트라데콕시)프로필-(2-하이드록시에틸)-디메틸아자늄 (DMRIE), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DMEPC), l,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DMTAP), 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DORIE), 및 2,3-디올레일옥시- N-[2(스퍼민 카복사마이드)에틸]-N,N-디메틸-l-프로파나뮴 트리플루오로아세테이트 (DOSPA)를 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다. DOTMA, DOTAP, DODAC 및 DOSPA가 바람직하다. 특정 구체예에서, 1종 이상의 양이온성 지질은 DOTMA 및/또는 DOTAP이다.

RNA 리포플렉스 입자의 총 양전하 대 음전하 비 및 물리적 안정성을 조정하기 위해 추가적인 지질이 포함될 수 있다. 특정 구체예에서, 추가적인 지질은 중성 지질이다. 본원에 사용된 바, "중성 지질"은 순 전하가 0인 지질을 지칭한다. 중성 지질의 예는 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 디아실포스파티딜 콜린, 디아실포스파티딜 에탄올 아민, 세라마이드, 스핑고미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 및 세레브로사이드를 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다. 특정 구체예에서, 제2 지질은 DOPE, 콜레스테롤 및/또는 DOPC이다.

특정 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 양이온성 지질 및 추가적인 지질 양자 모두를 포함한다. 예시적인 구체예에서, 양이온성 지질은 DOTMA이고 추가적인 지질은 DOPE이다. 이론에 구속되지 않고, 1종 이상의 추가적인 지질의 양과 비교한 1종 이상의 양이온성 지질의 양은 RNA 리포플렉스 입자의 중요한 특성, 예컨대 전하, 입자 크기, 안정성, 조직 선택성 및 RNA의 생체 활성에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 1종 이상의 양이온성 지질 대 1종 이상의 추가적인 지질의 몰비는 약 10:0 내지 약 1:9, 약 4:1 내지 약 1:2, 또는 약 3:1 내지 약 1:1이다. 특정 구체예에서, 몰비는 약 3:1, 약 2.75:1, 약 2.5:1, 약 2.25:1, 약 2:1, 약 1.75:1, 약 1.5:1, 약 1.25:1, 또는 약 1:1일 수 있다. 예시적인 구체예에서, 1종 이상의 양이온성 지질 대 1종 이상의 추가적인 지질의 몰비는 약 2:1이다.

RNA

본 명세서에서, 용어 "RNA"는 리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, RNA는 모든 또는 대부분의 리보뉴클레오타이드 잔기를 함유한다. 본원에 사용되는 바, "리보뉴클레오타이드"는 β-D-리보푸라노실기의 2'-위치에 하이드록시기를 갖는 뉴클레오타이드를 지칭한다. RNA는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 단리된 RNA, 예컨대 부분 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생성된 RNA, 및 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 결실, 치환에 의해 자연 발생 RNA와 다른 변형된 RNA를 제한없이 포함한다. 이러한 변경은 RNA 뉴클레오타이드 내부 또는 RNA의 말단(들)에 비-뉴클레오타이드 물질의 첨가를 지칭할 수 있다. RNA에서 뉴클레오타이드는 화학적으로 합성된 뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드와 같은 비-표준 뉴클레오타이드일 수 있음이 또한 고려된다. 본 명세서의 경우, 이러한 변형된 RNA는 자연 발생 RNA의 유사체로 간주된다.

본 명세서의 특정 구체예에서, RNA는 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA 전사체에 관한 메신저 RNA (mRNA)이다. 당업계에 확립된 바와 같이, mRNA는 일반적으로 5' 비번역 영역 (5'-UTR), 펩타이드 코딩 영역 및 3 '비번역 영역 (3'-UTR)을 함유한다. 일부 구체예에서, RNA는 시험관내 전사 또는 화학적 합성에 의해 생성된다. 한 구체예에서, mRNA는 DNA 주형을 사용하는 시험관내 전사에 의해 생성되며, 여기서 DNA는 데옥시리보뉴클레오타이드를 함유하는 핵산을 지칭한다.

한 구체예에서, RNA는 시험관내 전사된 RNA (IVT-RNA)이고 적절한 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 수득될 수 있다. 전사를 제어하기 위한 프로모터는 임의의 RNA 폴리머라아제에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. 시험관내 전사를 위한 DNA 주형은 핵산, 특히 cDNA의 클로닝 및 그것을 시험관내 전사를 위한 적절한 벡터 내로 도입함으로써 수득될 수 있다. cDNA는 RNA의 역전사에 의해 수득될 수 있다.

본 명세서의 특정 구체예에서, 본원에 기술되는 RNA 리포플렉스 조성물 내 RNA는 약 0.01 mg/mL 내지 1 mg/mL, 또는 약 0.05 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL의 농도이다. 특정 구체예에서, RNA는 약 0.05 mg/mL, 약 0.06 mg/mL, 약 0.07 mg/mL, 약 0.08 mg/mL, 약 0.09 mg/mL, 약 0.10 mg/mL, 약 0.11 mg/mL, 약 0.12 mg/mL, 약 0.13 mg/mL, 약 0.14 mg/mL, 약 0.15 mg/mL, 약 0.16 mg/mL, 약 0.17 mg/mL, 약 0.18 mg/mL, 약 0.19 mg/mL, 약 0.20 mg/mL, 약 0.21 mg/mL, 약 0.22 mg/mL, 약 0.23 mg/mL, 약 0.24 mg/mL, 약 0.25 mg/mL, 약 0.26 mg/mL, 약 0.27 mg/mL, 약 0.28 mg/mL, 약 0.29 mg/mL, 약 0.30 mg/mL, 약 0.31 mg/mL, 약 0.32 mg/mL, 약 0.33 mg/mL, 약 0.34 mg/mL, 약 0.35 mg/mL, 약 0.36 mg/mL, 약 0.37 mg/mL, 약 0.38 mg/mL, 약 0.39 mg/mL, 약 0.40 mg/mL, 약 0.41 mg/mL, 약 0.42 mg/mL, 약 0.43 mg/mL, 약 0.44 mg/mL, 약 0.45 mg/mL, 약 0.46 mg/mL, 약 0.47 mg/mL, 약 0.48 mg/mL, 약 0.49 mg/mL, 또는 약 0.50 mg/mL의 농도이다. 예시적 구체예에서, RNA는 0.05 mg/mL의 농도이다.

한 구체예에서, RNA는 변형된 리보뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 변형된 리보뉴클레오타이드의 예는, 제한없이 5-메틸시티딘 및 수도유리딘을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 명세서에 따른 RNA는 5'-캡을 포함한다. 한 구체예에서, 본 명세서의 RNA는 캡이 없는 (uncapped) 5'-트리포스페이트를 갖지 않는다. 한 구체예에서, RNA는 5'-캡 유사체에 의해 변형될 수 있다. 용어 "5'-캡"은 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 구조를 말하며, 일반적으로 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오타이드로 구성된다. 한 구체예에서, 이 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 갖는 RNA를 제공하는 것은 5'-캡이 RNA 가닥 내로 공동-전사적으로 발현되는 시험관내 전사에 의해 달성될 수 있거나, 또는 캡핑 효소를 이용하여 전사-후에 RNA에 부착될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 명세서에 따른 RNA는 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 포함한다. "비번역 영역" 또는 "UTR"이라는 용어는, 전사되지만 아미노산 서열로 번역되지 않는 DNA 분자의 영역, 또는 mRNA 분자와 같은 RNA 분자의 해당 영역을 의미한다. 비번역 영역 (UTR)은 오픈 리딩 프레임의 5' (상류)(5'-UTR) 및/또는 오픈 리딩 프레임의 3' (하류)(3'-UTR)에 존재할 수 있다. 존재하는 경우, 5'-UTR은 5' 말단, 단백질 인코딩 영역의 개시 코돈의 상류에 위치한다. 5'-UTR은 5'-캡 (존재한다면)의 하류, 즉 5'-캡에 바로 인접해 있다. 존재하는 경우, 3'-UTR은 3' 말단에, 단백질-인코딩 영역의 종결 코돈의 하류에 위치하지만, 용어 "3'-UTR"은 바람직하게는 폴리(A) 테일을 포함하지 않는다. 따라서, 3'-UTR은 폴리(A) 서열 (존재한다면)의 상류에, 예컨대 폴리(A) 서열에 직접 인접하여 있다.

일부 구체예에서, 본 명세서에 따른 RNA는 3'-폴리(A) 서열을 포함한다. "폴리 (A) 서열"이라는 용어는 전형적으로 RNA 분자의 3'-말단에 위치하는 아데닐 (A) 잔기들로 이루어지는 서열에 관한 것이다. 본 명세서에 따르면, 한 구체예에서, 폴리(A) 서열은 약 20 이상, 약 40 이상, 약 80 이상, 또는 약 100 이상이고, 약 500 이하, 약 400 이하, 약 300 이하, 약 200 이하 또는 약 150 이하의 A 뉴클레오타이드, 특히 약 120 A 뉴클레오타이드를 포함한다.

본 명세서의 맥락에서, 용어 "전사"는 DNA 서열 내 유전자 코드가 RNA로 전사되는 공정에 관한 것이다. 이어서, RNA는 펩타이드 또는 단백질로 번역될 수 있다.

RNA와 관련하여, 용어 "발현" 또는 "번역"은, 그에 의하여 mRNA 가닥이 펩타이드 또는 단백질을 만드는, 아미노산 서열의 어셈블리를 지시하는, 세포의 리보솜에서의 과정에 관한 것이다.

한 구체예에서, 본원에 기술된 RNA 리포플렉스 입자의 투여 후, RNA의 적어도 일부는 표적 세포로 전달된다. 한 구체예에서, RNA의 적어도 일부는 표적 세포의 세포질로 전달된다. 한 구체예에서, RNA는 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA이고, RNA는 표적 세포에 의해 번역되어 펩타이드 또는 단백질을 생성한다. 한 구체예에서, 표적 세포는 비장 세포이다. 한 구체예에서, 표적 세포는 항원 제시 세포, 예컨대 비장에서의 전문적 항원 제시 세포이다. 한 구체예에서, 표적 세포는 비장의 수지상 세포이다. 따라서, 본원에 기술된 RNA 리포플렉스 입자는 RNA를 이러한 표적 세포로 전달하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 RNA 리포플렉스 입자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 표적 세포로 RNA를 전달하는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에서, RNA는 표적 세포의 세포질로 전달된다. 한 구체예에서, RNA는 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA이고, RNA는 표적 세포에 의해 번역되어 펩타이드 또는 단백질을 생성한다.

한 구체예에서, RNA는 약학적 활성 펩타이드 또는 단백질을 인코딩한다.

본 명세서에 따르면, 용어 "RNA 인코딩"은, RNA가, 표적 조직의 세포와 같은 적절한 환경에 존재하는 경우, 아미노산 조립을 지시하여 번역하는 과정 동안 그가 인코딩하는 펩타이드 또는 단백질을 생성할 수 있다는 것을 의미한다. 한 구체예에서, RNA는 펩타이드 또는 단백질의 번역을 허용하는 세포 번역 기구와 상호 작용할 수 있다. 세포는, 인코딩된 펩타이드 또는 단백질을 세포 내적으로 (예를 들어, 세포질 및/또는 핵에서) 생성하거나, 인코딩된 펩타이드 또는 단백질을 분비할 수 있거나, 또는 표면에서 이를 생성할 수 있다.

본 명세서에 따르면, 용어 "펩타이드"는 올리고- 및 폴리펩타이드를 포함하고 펩타이드 결합을 통해 서로 연결된 약 2 개 이상, 약 3 개 이상, 약 4 개 이상, 약 6 개 이상, 약 8 개 이상, 약 10 개 이상, 약 13 개 이상, 약 16 개 이상, 약 20 개 이상이고, 약 50 개, 약 100 개 또는 약 150 개 이하의 연속적인 아미노산을 포함하는 물질을 지칭한다. 용어 "단백질"은 거대 펩타이드, 특히 약 151 개 이상의 아미노산을 갖는 펩타이드를 지칭하지만, "펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어는 여기서 일반적으로 동의어로 사용된다.

"약학적으로 활성인 펩타이드 또는 단백질"은 치료적 유효량으로 대상체에게 제공될 때 대상체의 상태 또는 질환 상태에 대해 긍정적이거나 유리한 효과를 갖는다. 한 구체예에서, 약학적 활성 펩타이드 또는 단백질은 근치적 또는 고식적 특성을 가지며, 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상의 중증도를 개선, 완화, 경감, 역전, 개시 지연 또는 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 약학적으로 활성인 펩타이드 또는 단백질은 예방적 특성을 가질 수 있고, 질병의 발병을 지연시키거나 그러한 질병 또는 병리학적 상태의 중증도를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 용어 "약학 적 활성 펩타이드 또는 단백질"은 전체 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하고, 또한 이의 약학적 활성 단편을 지칭할 수 있다. 또한 펩타이드 또는 단백질의 약학적 활성 유사체를 포함할 수 있다.

약학적 활성 단백질의 예는 사이토카인 및 면역계 단백질, 예컨대 면역학적 활성 화합물 (예컨대, 인터류킨, 콜로니 자극 인자 (CSF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 에리트로포이에틴, 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론, 인테그린, 어드레신, 셀레틴, 귀환 수용체, T 세포 수용체, 면역글로불린, 가용성 주요 조직 적합성 복합체 항원, 면역학적 활성 항원, 예컨대 박테리아 항원, 기생충 항원 또는 바이러스 항원, 알레르겐, 자가 항원, 항체), 호르몬 (인슐린, 갑상선 호르몬, 카테콜아민, 고나도트로핀, 영양 호르몬, 프로락틴, 옥시토신, 도파민, 소 소마토트로핀, 렙틴 등등), 성장 호르몬 (예컨대: 인간 성장 호르몬), 성장 인자 (예컨대: 표피 성장 인자, 신경 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 등등), 성장 인자 수용체, 효소 (조직 플라스미노겐 활성화제, 스트렙토키나아제, 콜레스테롤 생합성 또는 분해성의 스테로이드 산생성 효소, 키나아제, 포스포디에스테라아제, 메틸라아제, 디-메틸라아제, 탈수소 효소, 셀룰라아제, 프로테아제, 리파아제, 포스포리파아제, 아로마타아제, 시토크롬, 아데닐레이트 또는 구아닐레이트 시클라아제, 뉴라미다아제 등등), 수용체 (스테로이드 호르몬 수용체, 펩타이드 수용체), 결합 단백질 (성장 호르몬 또는 성장 인자 결합 단백질 등등), 전사 및 번역 인자, 종양 성장 억제 단백질 (예컨대: 혈관 신생을 억제하는 단백질), 구조 단백질 (예컨대: 콜라겐, 피브로인, 피브리노겐, 엘라스틴, 튜불린, 액틴 및 미오신), 혈액 단백질 (트롬빈, 혈청 알부민, 인자 VII, 인자 VIII, 인슐린, 인자 IX, 인자 X, 조직 플라스미노겐 활성화제, 단백질 C, 폰 와일브란트 인자, 안티트롬빈 III, 글루코세레브로시다아제, 에리스로포이에틴 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF) 또는 변형 인자 VIII, 항응고제 등등을 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다.

용어 "면역학적으로 활성인 화합물"은 예를 들어 면역 세포의 성숙을 유도 및/또는 억제, 사이토카인 생합성을 유도 및/또는 억제하고 및/또는 B 세포에 의한 항체 생산을 자극함으로써 체액 면역을 변경시킴으로써 면역 반응을 변경시키는 임의의 화합물에 관한 것이다. 면역학적 활성 화합물은 항바이러스 및 항종양 활성을 포함하나 이에 제한되지 않는 강력한 면역자극 활성을 가지며, 또한 면역 반응의 다른 측면을 하향-조절할 수 있는데, 예를 들어 면역 반응을, TH2 면역 반응으로부터 멀어지게 할 수 있고, 이는 광범위한 TH2 매개 질환을 치료하는데 유용하다. 면역학적 활성 화합물은 백신 아쥬반트로서 유용할 수 있다.

한 구체예에서, 약학적 활성 펩타이드 또는 단백질은 하나 이상의 항원 또는 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 즉, 대상체로의 펩타이드 또는 단백질의 투여는, 치료적이거나 부분적으로 또는 완전히 방어적일 수 있는, 대상체에서의 하나 이상의 항원 또는 하나 이상의 에피토프에 대한 면역 반응을 유발한다.

용어 "항원"은 면역 반응이 생성될 수 있는 에피토프를 포함하는 제제에 관한 것이다. "항원"이라는 용어는 특히 단백질 및 펩타이드를 포함한다. 한 구체예에서, 항원은 수지상 세포 또는 대식세포와 같은 항원 제시 세포 등의 면역계 세포에 의해 제시된다. 항원 또는 이의 가공 생성물, 예컨대 T 세포 에피토프는 한 구체예에서 T 또는 B 세포 수용체 또는 항체와 같은 면역글로불린 분자에 의해 결합된다. 따라서, 항원 또는 이의 가공 생성물은 항체 또는 T- 림프구 (T-세포)와 특이적으로 반응할 수 있다. 한 구체예에서, 항원은 질병 항원, 예컨대 종양 항원, 바이러스 항원 또는 박테리아 항원이고, 에피토프는 이러한 항원으로부터 유래된다.

용어 "질환-관련 항원"은 질환과 관련된 임의의 항원을 지칭하기 위해 가장 넓은 의미로 사용된다. 질환-관련 항원은 숙주의 면역계를 자극하여 그 질환에 대한 세포성 항원-특이적 면역 반응 및/또는 체액성 항체 반응을 일으키는 에피토프를 함유하는 분자이다. 따라서 질환-관련 항원 또는 이의 에피토프는 치료 목적으로 사용될 수 있다. 질환-관련 항원은 미생물, 전형적으로 미생물 항원에 의한 감염과 관련되거나 암, 전형적으로 종양과 관련될 수 있다.

용어 "종양 항원"은 세포질, 세포 표면 및 세포 핵으로부터 유래될 수 있는 암 세포의 성분을 지칭한다. 특히, 이는 세포 내적으로 또는 종양 세포에서 표면 항원으로서 생성되는 항원을 지칭한다.

용어 "바이러스 항원"은 항원 특성을 갖는, 즉 개체에서 면역 반응을 유발할 수 있는 임의의 바이러스 성분을 지칭한다. 바이러스 항원은 바이러스 리보뉴클레오단백질 또는 외피 단백질일 수 있다.

용어 "박테리아 항원"은 항원 특성을 갖는, 즉 개체에서 면역 반응을 유발할 수 있는 임의의 박테리아 성분을 지칭한다. 박테리아 항원은 박테리아의 세포벽 또는 세포질 막으로부터 유래될 수 있다.

용어 "에피토프"는 면역계에 의해 인식되는 항원과 같은 분자의 일부 또는 단편을 지칭한다. 예를 들어, 에피토프는 T 세포, B 세포 또는 항체에 의해 인식될 수 있다. 항원의 에피토프는 항원의 연속적 또는 불연속적 부분을 포함할 수 있고 길이가 약 5 내지 약 100 개의 아미노산일 수 있다. 한 구체예에서, 에피토프는 약 10 내지 약 25 개의 아미노산 길이이다. 용어 "에피토프"는 T 세포 에피토프를 포함한다.

용어 "T 세포 에피토프"는 MHC 분자와 관련하여 제시될 때 T 세포에 의해 인식되는 단백질의 일부 또는 단편을 지칭한다. 용어 "주 조직적합성 복합체" 및 약어 "MHC"는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하고, 모든 척추 동물에 존재하는 유전자의 복합체에 관한 것이다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구와 항원 제시 세포 또는 질환에 걸린 세포 사이의 신호 전달에 중요하며, 여기서 MHC 단백질 또는 분자는 펩타이드 에피토프에 결합하여 이들을 T 세포상의 T 세포 수용체에 의해 인식되도록 제시한다. MHC에 의해 인코딩된 단백질은 세포의 표면에서 발현되고, 자기-항원 (세포 자체로부터의 펩타이드 단편) 및 비(非)-자기-항원 (예를 들어, 침입 미생물의 단편) 양자 모두를 T 세포에 표시한다. 클래스 I MHC/펩타이드 복합체의 경우, 결합 펩타이드는, 더 길거나 더 짧은 펩타이드가 효과적일 수 있지만, 전형적으로 약 8 개 내지 약 10 개 아미노산 길이이다. 클래스 II MHC/펩타이드 복합체의 경우, 결합 펩타이드는 전형적으로 약 10 개 내지 약 25 개 아미노산 길이이고, 특히 약 13 개 내지 약 18 개 아미노산 길이이지만, 더 길고 더 짧은 펩타이드가 효과적일 수 있다.

본 명세의 특정 구체예에서, RNA는 하나 이상의 에피토프를 인코딩한다. 특정 구체예에서, 에피토프는 종양 항원으로부터 유래된다. 종양 항원은 "표준" 항원일 수 있으며, 이는 일반적으로 다양한 암에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 종양 항원은 또한 "신생-항원 (neo-antigen)"일 수 있으며, 이는 개체의 종양에 특이적이고 면역계에 의해 이전에 인식된 적 없는 것이다. 신생-항원 또는 신생-에피토프는 암 세포의 게놈에서 하나 이상의 암-특이적 돌연변이로 인해 아미노산 변화를 초래할 수 있다. 종양 항원의 예는, 제한없이, p53, ART-4, BAGE, 베타-카테닌/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, 클라우딘 패밀리의 세포 표면 단백질, 예컨대 CLAUD ΓΝ-6, CLAUDIN-18.2 및 CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap 100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (또는 hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, 바람직하게는 MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 또는 MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, pl90 마이너 BCR-abL, Pml/RARa, PRAME, 프로티나아제 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1 또는 SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE, WT 및 WT-1을 포함한다.

암 돌연변이는 개체마다 다르다. 따라서, 신규한 에피토프 (신생-에피토프)를 인코딩하는 암 돌연변이는 백신 조성물 및 면역 요법의 개발에서 매력적인 표적을 대표한다. 종양 면역 요법의 효능은 숙주 내에서 강력한 면역 반응을 유도할 수있는 암-특이적 항원 및 에피토프의 선택에 의존한다. RNA는 환자-특이적 종양 에피토프를 환자에게 전달하는데 사용될 수 있다. 비장에 상주하는 수지상 세포 (DC)는 면역원성 에피토프 또는 종양 에피토프와 같은 항원의 RNA 발현을 특히 대상으로 하는 항원-제시 세포를 대표한다. 다중 에피토프의 사용은 종양 백신 조성물에서 치료 효능을 증진시키는 것으로 나타났다. 종양 뮤타놈 (mutanome)의 신속한 시퀀싱은 본원에 기재된 RNA에 의해 인코딩될 수 있는 개인화된 백신에 대한 다중 에피토프를 제공할 수 있는데, 예를 들어 그 에피토프들이 필요에 따라 링커에 의해 분리된 단일 폴리펩타이드로서이다. 본 명세서의 특정 구체예에서, RNA는 하나 이상의 에피토프, 2 개 이상의 에피토프, 3 개 이상의 에피토프, 4 개 이상의 에피토프, 5 개 이상의 에피토프, 6 개 이상의 에피토프, 7 개 이상의 에피토프, 8 개 이상의 에피토프, 9 개 이상의 에피토프 또는 10 개 이상의 에피토프를 인코딩한다. 예시적인 구체예는 5 개 이상의 에피토프를 인코딩하는 RNA ("펜타토프"라고 함) 및 10 개 이상의 에피토프를 인코딩하는 RNA ("데카토프"라 함)를 포함한다.

전하 비

본 명세서의 RNA 리포플렉스 입자의 전기적 전하는 1종 이상의 양이온성 지질에 존재하는 전기적 전하와 RNA에 존재하는 전기적 전하의 합이다. 전하 비는 RNA에 존재하는 음전하에 대한 1종 이상의 양이온성 지질에 존재하는 양전하의 비이다. RNA에 존재하는 음전하에 대한 1종 이상의 양이온성 지질에 존재하는 양전하의 전하 비는 하기 식에 의해 계산된다: 전하 비 = [(양이온성 지질 농도 (mol)) * (양이온성 지질에서 양전하의 총 수)] / [(RNA 농도 (mol)) * (RNA에서 음전하의 총 수)]. RNA의 농도 및 1종 이상의 양이온성 지질량은 당업자에 의해 통상적인 방법을 사용하여 결정될 수 있다.

제1 구체예에서, 생리학적 pH에서 RNA 리포플렉스 입자 내 양전하 대 음전하의 전하 비는 약 1.9:2 내지 약 1:2이다. 특정 구체예에서, 생리적 pH에서 RNA 리포플렉스 입자 내 양전하 대 음전하의 전하 비는 약 1.9:2.0, 약 1.8:2.0, 약 1.7:2.0, 약 1.6:2.0, 약 1.5:2.0, 약 1.4:2.0, 약 1.3:2.0, 약 1.2:2.0, 약 1.1:2.0 또는 약 1:2.0이다. 한 구체예에서, 생리학적 pH에서 RNA 리포플렉스 입자 내 양전하 대 음전하의 전하 비는 1.3:2.0이다. 다른 구체예에서, 본원에 기재된 RNA 리포플렉스 입자는 생리학적 pH에서 동일한 수의 양전하 및 음전하를 가질 수 있고, 알짜 중성 전하 비를 갖는 RNA 리포플렉스 입자를 생성한다.

제2 구체예에서, 생리학적 pH에서 RNA 리포플렉스 입자 내 양전하 대 음전하의 전하 비는 약 6:1 내지 약 1.5:1이다. 특정 구체예에서, 생리학적 pH에서 RNA 리포플렉스 입자 내 양전하 대 음전하의 전하 비는 약 6.0:1.0, 약 5.9:1.0, 약 5.8:1.0, 약 5.7:1.0, 약 5.6:1.0, 약 5.5:1.0, 약 5.4:1.0, 약 5.3:1.0, 약 5.2:1.0, 약 5.1:1.0, 약 5.0:1.0, 약 4.9:1.0, 약 4.8:1.0, 약 4.7:1.0, 약 4.6:1.0, 약 4.5:1.0, 약 4.4:1.0, 약 4.3:1.0, 약 4.2:1.0, 약 4.1:1.0, 약 4.0:1.0, 약 3.9:1.0, 약 3.8:1.0, 약 3.7:1.0, 약 3.6:1.0, 약 3.5:1.0, 약 3.4:1.0, 약 3.3:1.0, 약 3.2:1.0, 약 3.1:1.0, 약 3.0:1.0, 약 2.9:1.0, 약 2.8:1.0, 약 2.7:1.0, 약 2.6:1.0, 약 2.5:1.0, 약 2.4:1.0, 약 2.3:1.0, 약 2.2:1.0, 약 2.1:1.0, 약 2.0:1.0, 약 1.9:1.0, 약 1.8:1.0, 약 1.7:1.0, 약 1.6:1.0, 또는 약 1.5:1.0이다.

RNA 기반 면역 요법의 경우, 다른 기관에서의 자가 면역 반응 및 잠재적 독성을 피하기 위해 비장과 같은 정확한 기관을 표적화하는 것이 필요하다. 본 명세서에 따르면, RNA는 상이한 세포, 조직 또는 기관을 표적으로 할 수 있다.

제1 구체예에 따른 전하 비를 갖는 RNA 리포플렉스 입자가 비장 조직 또는 비장 세포, 예컨대 항원-제시 세포, 특히 수지상 세포를 우선적으로 표적화하는데 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자의 투여 후, 비장에서의 RNA 축적 및/또는 RNA 발현이 발생한다. 따라서, 본 발명의 RNA 리포플렉스 입자는 비장에서 RNA를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자의 투여 후, 폐 및/또는 간에서 어떠한 RNA 축적 및/또는 RNA 발현도 발생하지 않거나 본질적으로 발생하지 않는다. 한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자의 투여 후, 비장에서 전문적 항원 제시 세포와 같은 항원 제시 세포에서의 RNA 축적 및/또는 RNA 발현이 발생한다. 따라서, 본 발명의 RNA 리포플렉스 입자는 이러한 항원 제시 세포에서 RNA를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포 및/또는 대식세포이다.

제2 구체예에 따른 전하 비를 갖는 RNA 리포플렉스 입자가 폐 조직 또는 폐 세포를 우선적으로 표적화하는데 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자의 투여 후, 폐에서의 RNA 축적 및/또는 RNA 발현이 발생한다. 따라서, 본 발명의 RNA 리포플렉스 입자는 폐에서 RNA를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 비장 이외의 조직에서 RNA의 발현이 요구되는 경우, 제1 구체예에 따른 전하 비, 예를 들어 약 1:2 내지 약 1.9:2의 전하 비와 관련한 본원에 기재된 구체예에서, 제2 구체예에 따른 전하 비, 예를 들어 약 6:1 내지 약 1.5:1의 전하 비가 제1 구체예에 따른 전하 비 대신 사용될 수 있다. 본원에 기술된 이들 및 다른 구체예에서, 하나 이상의 에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA 이외의 RNA, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 약학적으로 활성인 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA가 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 약학적 활성 펩타이드 또는 단백질은 사이토카인이고 및/또는 폐암의 치료가 의도된다.

RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 조성물

A. 염 및 이온 강도

본 명세서에 따르면, 본원에 기술된 조성물은 소듐 클로라이드와 같은 염을 포함할 수 있다. 이론에 구속되지 않고, 소듐 클로라이드는 1종 이상의 양이온성 지질과 혼합하기 전에 RNA를 전처리하기 위한 이온성 삼투질 농도 제제 (ionic osmolality agent)로서 기능한다. 특정 구체예는 본 명세서에서 소듐 클로라이드에 대한 대안적인 유기 또는 무기염을 고려한다. 대안적인 염은, 제한없이, 포타슘 클로라이드, 디포타슘 포스페이트, 모노포타슘 포스페이트, 포타슘 아세테이트, 포타슘 바이카보네이트, 포타슘 술페이트, 포타슘 아세테이트, 디소듐 포스페이트, 모노소듐 포스페이트, 소듐 아세테이트, 소듐 바이카보네이트, 소듐 술페이트, 소듐 아세테이트, 리튬 클로라이드, 마그네슘 클로라이드, 마그네슘 포스페이트, 칼슘 클로라이드, 및 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)의 소듐염을 포함한다.

일반적으로, 본원에 기재된 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 조성물은, 바람직하게는 0 mM 내지 약 500 mM, 약 5 mM 내지 약 400 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 300 mM 범위인 농도로 소듐 클로라이드를 포함한다. 한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 조성물은 이러한 소듐 클로라이드 농도에 상응하는 이온 강도를 포함한다.

일반적으로, RNA 및 리포좀, 예컨대 본원에 기재된 것들로부터 RNA 리포플렉스 입자를 형성하기 위한, 및 그로부터 결과하는 조성물은 높은 소듐 클로라이드 농도를 포함하거나, 높은 이온 강도를 포함한다. 한 구체예에서, 소듐 클로라이드 농도는 45 mM 이상의 농도이다. 한 구체예에서, 소듐 클로라이드 농도는 약 45 mM 내지 약 300 mM, 또는 약 50 mM 내지 약 150 mM의 농도이다. 한 구체예에서, 조성물은 이러한 소듐 클로라이드 농도에 상응하는 이온 강도를 포함한다.

일반적으로, RNA 리포플렉스 입자를 저장하기 위한, 예컨대 본원에 기재된 것과 같은 RNA 리포플렉스 입자의 동결을 위한 조성물은 낮은 소듐 클로라이드 농도를 포함하거나 낮은 이온 강도를 포함한다. 한 구체예에서, 소듐 클로라이드 농도는 0 mM 내지 약 50 mM, 0 mM 내지 약 40 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재한다. 특정 구체예에서, 소듐 클로라이드 농도는 약 1 mM, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM, 약 21 mM, 약 22 mM, 약 23 mM, 약 24 mM, 약 25 mM, 약 26 mM, 약 27 mM, 약 28 mM, 약 29 mM, 약 30 mM, 약 31 mM, 약 32 mM, 약 33 mM, 약 34 mM, 약 35 mM, 약 36 mM, 약 37 mM, 약 38 mM, 약 39 mM, 약 40 mM, 약 41 mM, 약 42 mM, 약 43 mM, 약 44 mM, 약 45 mM, 약 46 mM, 약 47 mM, 약 48 mM, 약 49 mM, 또는 약 50 mM이다. 바람직한 구체예에서, 소듐 클로라이드 농도는 약 20 mM, 약 30 mM 또는 약 40 mM의 농도이다. 예시적인 한 구체예에서, 소듐 클로라이드 농도는 20 mM의 농도이다. 다른 예시적인 구체예에서, 소듐 클로라이드 농도는 30 mM의 농도이다. 한 구체예에서, 조성물은 이러한 소듐 클로라이드 농도에 상응하는 이온 강도를 포함한다.

일반적으로, 동결된 RNA 리포플렉스 입자 조성물을 해동시키고 임의로 수성 액체를 첨가함으로써 삼투질 농도 및 이온 강도를 조절하여 생성된 조성물은 높은 소듐 클로라이드 농도를 포함하거나 높은 이온 강도를 포함한다. 한 구체예에서, 소듐 클로라이드 농도는 약 50 mM 내지 약 300 mM, 또는 약 80 mM 내지 약 150 mM이다. 한 구체예에서, 조성물은 이러한 소듐 클로라이드 농도에 상응하는 이온 강도를 포함한다.

B. 안정화제

본원에 기재된 조성물은 동결, 동결 건조 또는 분무-건조 및 동결된, 동결 건조된 또는 분무-건조된 조성물의 저장 중에 생성물 품질의 실질적인 손실, 특히 RNA 활성의 실질적 손실을 피하기 위한 안정화제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 안정한 것으로 본원에서 지칭된다. 전형적으로, 안정화제는 동결, 동결 건조 또는 분무-건조 공정에 앞서 존재하며, 생성된 동결된, 동결 건조된 또는 동결-건조된 제제에서 지속된다. 이것은, 예를 들어 응집, 입자 붕괴, RNA 분해 및/또는 다른 유형의 손상을 줄이거나 방지하기 위해, 동결, 동결 건조 또는 분무-건조 및 동결된, 동결 건조된 또는 동결-건조된 제제의 보관 중에 RNA 리포플렉스 입자를 보호하는데 사용될 수 있다.

한 구체예에서, 안정화제는 탄수화물이다. 본원에 사용되는 바, 용어 "탄수화물"은 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류 및 다당류를 지칭하고 포함한다.

한 구체예에서, 안정화제는 단당류이다. 본원에 사용되는 바, 용어 "단당류"는 더 단순한 탄수화물 단위로 가수 분해될 수 없는 단일 탄수화물 단위 (예를 들어, 단순당)를 지칭한다. 예시적인 단당류 안정화제는 포도당, 과당, 갈락토오스, 자일호오스, 리보오스 등등을 포함한다.

한 구체예에서, 안정화제는 이당류이다. 본원에 사용되는 바, 용어 "이당류"는 글리코시드 결합, 예를 들어 1-4 연결 또는 1-6 연결을 통해 함께 결합된 2 개의 단당류 단위에 의해 형성된 화합물 또는 화학적 모이어티를 지칭한다. 이당류는 2 개의 단당류로 가수 분해될 수 있다. 예시적인 이당류 안정화제는 수크로오스, 트레할로스, 락토오스, 말토오스 등등을 포함한다.

용어 "삼당류"는 하나의 분자를 형성하기 위해 서로 연결된 3 개의 당을 의미한다. 삼당류의 예는 라피노오스 및 멜레지토오스를 포함한다.

한 구체예에서, 안정화제는 올리고당류이다. 본원에 사용되는 바, 용어 "올리고당류"는, 선형, 부지형 또는 환형 구조를 형성하기 위하여, 글리코시드 결합, 예를 들어 1-4 연결 또는 1-6 연결을 통해 함께 결합된, 3 개 내지 약 15 개, 바람직하게는 3 개 내지 약 10 개의 단당류 단위로 형성된 화합물 또는 화학적 모이어티를 지칭한다. 예시적인 올리고당 안정화제는 시클로덱스트린, 라피노오스, 멜레지토오스, 말토트리오스, 스타키오스, 아카보오스 등등을 포함한다. 올리고당은 산화 또는 환원될 수 있다.

한 구체예에서, 안정화제는 시클릭 올리고당이다. 본원에 사용된 바, 용어 "시클릭 올리고당"은, 환형 구조를 형성하기 위하여, 글리코시드 결합, 예를 들어 1-4 연결 또는 1-6 연결을 통해 함께 결합된 3 개 내지 약 15 개, 바람직하게는 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 단당류 단위에 의해 형성된 화합물 또는 화학적 모이어티를 지칭한다. 예시적인 시클릭 올리고당 안정화제는 α 시클로덱스트린, β 시클로덱스트린 또는 γ 시클로덱스트린과 같은 별개의 화합물인 시클릭 올리고당을 포함한다.

다른 예시적인 시클릭 올리고당 안정화제는 보다 큰 분자 구조에서 시클로덱스트린 모이어티를 포함하는 화합물, 예를 들어 시클릭 올리고당 모이어티를 함유하는 중합체를 포함한다. 시클릭 올리고당은 산화 또는 환원될 수 있는데, 예를 들어 디카보닐 형태로 산화될 수 있다. 본원에 사용되는 바, 용어 "시클로덱스트린 모이어티"는 더 큰 분자 구조, 예를 들어 중합체 내로 혼입되거나 또는 그의 부분인 시클로덱스트린 (예를 들어, α, β 또는 γ 시클로덱스트린) 라디칼을 지칭한다. 시클로덱스트린 모이어티는 하나 이상의 다른 모이어티에 직접적으로, 또는 임의의 링커를 통해 결합될 수 있다. 시클로덱스트린 모이어티는 산화 또는 환원될 수 있는데, 예를 들어 디카보닐 형태로 산화될 수 있다.

탄수화물 안정화제, 예를 들어 시클릭 올리고당 안정화제는 유도체화된 탄수화물일 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서, 안정화제는 유도체화된 시클릭 올리고당, 예를 들어 유도체화된 시클로 덱스트린, 예를 들어 2- 하이드록시프로필-β-시클로덱스트린, 예를 들어 부분적으로 에테르화된 시클로덱스트린 (예를 들어, 부분적으로 에테르화된 β 시클로덱스트린)이다.

예시적인 안정화제는 다당류이다. 본원에 사용되는 바, 용어 "다당류"는, 선형, 분지형 또는 환형 구조를 형성하기 위하여, 글리코시드 결합, 예를 들어 1-4 연결 또는 1-6 연결을 통해 함께 결합되는 16 개 이상의 단당류 단위에 의해 형성된 화합물 또는 화학적 모이어티를 지칭하고, 그의 백본 구조의 일부로서 다당류를 포함하는 중합체를 포함한다. 백본에서, 다당류는 선형 또는 환형일 수 있다. 예시적인 다당류 안정화제는 글리코겐, 아밀라아제, 셀룰로오스, 덱스트란, 말토덱스트린 등등을 포함한다.

한 구체예에서, 안정화제는 당 알코올이다. 본원에 사용된 바, 용어 "당 알코올"은 "당"의 환원 생성물을 지칭하고, 단순당 알코올 분자 내의 모든 산소 원자가 하이드록시기 형태로 존재함을 나타낸다. 당 알코올은 "폴리올"이다. 이 용어는 3 개 이상의 하이드록시기를 함유하는 화학 화합물을 말하며, 다른 관용어인 다가 알코올과 동의어이다. 당 알코올의 예는 소르비톨, 만니톨, 말티톨, 락티톨, 에리스리톨, 글리세린, 자일리톨 또는 이노시톨을 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다.

본 명세서에 따르면, 안정화제로서 수크로오스를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 이론에 구속되지 않고 수크로오스는 조성물의 동결 방지를 촉진하여, 그로써 RNA 리포플렉스 입자 응집을 방지하고 조성물의 화학적 및 물리적 안정성을 유지하는 기능을 한다. 본 명세서에서 특정 구체예는 수크로오스에 대한 대안의 안정화제를 고려한다. 대안의 안정화제는 트레할로스, 글루코오스, 프럭토오스, 아르기닌, 글리세린, 만니톨, 프롤린, 소르비톨, 글리신 베타인 및 덱스트란을 포함하나, 이에 국한되지는 않는다. 특정 구체예에서, 수크로오스에 대한 대안의 안정화제는 트레할로스이다.

한 구체예에서, 안정화제는 약 5% (w/v) 내지 약 35% (w/v), 또는 약 10% (w/v) 내지 약 25% (w/v) 농도로 존재한다. 특정 구체예에 있어서, 안정화제는 약 10% (w/v), 약 11% (w/v), 약 12% (w/v), 약 13% (w/v), 약 14% (w/v), 약 15% (w/v), 약 16% (w/v), 약 17% (w/v), 약 18% (w/v), 약 19% (w/v), 약 20% (w/v), 약 21% (w/v), 약 22% (w/v), 약 23% (w/v), 약 24% (w/v), 또는 약 25% (w/v) 농도로 존재한다. 바람직한 한 구체예에서, 안정화제는 약 15% (w/v) 내지 약 25% (w/v)의 농도로 존재한다. 다른 바람직한 구체예에서, 안정화제는 약 20% (w/v) 내지 약 25% (w/v)의 농도로 존재한다. 예시적인 한 구체예에서, 안정화제는 약 25% (w/v)의 농도로 존재한다. 다른 예시적인 구체예에서, 안정화제는 약 22% (w/v)의 농도로 존재한다. 본 명세서의 구체예에서, 안정화제는 수크로오스 또는 트레할로스이다. 본 명세서의 한 구체예에서, 안정화제는 수크로오스이다. 본 명세서의 한구체예에서, 안정화제는 트레할로스이다.

본 명세서에 따르면, 본원에 기술된 RNA 리포플렉스 입자 조성물은 조성물의 안정성, 특히 RNA 리포플렉스 입자의 안정성 및 RNA의 안정성에 적합한 안정화제 농도를 갖는다.

C. pH 및 완충제

본 명세서에 따르면, 본원에 기술된 RNA 리포플렉스 입자 조성물은 RNA 리포플렉스 입자의 안정성, 특히 RNA의 안정성에 적합한 pH를 갖는다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 RNA 리포플렉스 입자 조성물은 약 5.7 내지 약 6.7의 pH를 갖는다. 특정 구체예에서, 조성물은 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6 또는 약 6.7의 pH를 갖는다.

본 명세서에 따르면, 완충제를 포함하는 조성물이 제공된다. 이론에 구속되지 않고, 완충제의 사용은 조성물의 제조, 저장 및 사용 중 조성물의 pH를 유지한다. 본 명세서의 특정 구체예에서, 완충제는 소듐 바이카보네이트, 모노소듐 포스페이트, 디소듐 포스페이트, 모노포타슘 포스페이트, 디포타슘 포스페이트, [트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]프로판술폰산 (TAPS), 2-(비스(2-하이드록시에틸)아미노)아세트산 (Bicine), 2-아미노-2-(하이드록시메틸)프로판-1,3-디올 (트리스), N-(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)글리신 (Tricine), 3-[[1,3-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]-2-하이드록시프로판-1-술폰산 (TAPSO), 2-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]에탄술폰산 (HEPES), 2-[[1,3-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]에탄술폰산 (TES), 1,4-피페라진디에탄술폰산 (PIPES), 디메틸아신산 (dimethylarsinic acid), 2-모르폴린-4-일에탄술폰산 (MES), 3-모르폴리노-2-하이드록시프로판술폰산 (MOPSO), 또는 포스페이트 완충 염용액 (PBS)일 수 있다. 다른 적합한 완충제는 염으로의 아세트산, 염으로의 시트르산, 염으로의 붕산 및 염으로의 인산일 수 있다.

일부 구체예에서, 완충제는 약 5.7 내지 약 6.7의 pH를 갖는다. 특정 구체예에서, 완충제는 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6 또는 약 6.7의 pH를 갖는다. 한 구체예에서, 완충제는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, HEPES는 약 5.7 내지 약 6.7의 pH를 갖는다. 특정 구체예에서, HEPES는 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6 또는 약 6.7의 pH를 갖는다. 예시적 구체예에서, HEPES는 약 6.2의 pH를 갖는다.

또 다른 구체예에서, 완충제는 약 2.5 mM 내지 약 10 mM의 농도를 갖는다. HEPES가 완충제인 특정 구체예에서, HEPES의 농도는 약 2.5 mM, 약 2.75 mM, 3.0 mM, 약 3.25 mM, 약 3.5 mM, 약 3.75 mM, 약 4.0 mM, 약 4.25 mM, 약 4.5 mM, 약 4.75 mM, 약 5.0 mM, 약 5.25 mM, 약 5.5 mM, 약 5.75 mM, 약 6.0 mM, 약 6.25 mM, 약 6.5 mM, 약 6.75 mM, 약 7.0 mM, 약 7.25 mM, 약 7.5 mM, 약 7.75 mM, 약 8.0 mM, 약 8.25 mM, 약 8.5 mM, 약 8.75 mM, 약 9.0 mM, 약 9.25 mM, 약 9.5 mM, 약 9.75 mM, 또는 약 10.0 mM이다. 바람직한 구체예에서, HEPES는 약 7.5 mM의 농도이다.

D. 킬레이트 제제

본 명세서의 특정 구체예는 킬레이트 제제의 사용을 고려한다. 킬레이트 제제는 금속 이온과 2 개 이상의 배위 공유 결합을 형성하여, 그로써 안정한 수용성 복합체를 생성할 수 있는 화학 화합물을 의미한다. 이론에 구속되지 않고, 킬레이트 제제는 유리 2가 이온의 농도를 감소시키며, 다르게는, 본 명세서에서 가속화된 RNA 분해를 유도할 수 있다. 적합한 킬레이트 제제의 예는, 제한없이, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), EDTA의 염, 데스페리옥사민 B, 데페록사민, 디티오카브 소듐, 페니실라민, 펜테테이트 칼슘, 펜테틴산의 소듐 염, 숙시머, 트리엔틴, 니트릴로트리아세트산, 트랜스-디아미노시클로헥산테트라아세트산 (DCTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 비스(아미노에틸)글리콜에테르-N,N,N',N'-테트라아세트산, 이미노디아세트산, 시트르산, 타르타르산, 푸마르산 또는 이들의 염을 포함한다. 특정 구체예에서, 킬레이트 제제는 EDTA 또는 EDTA의 염이다. 예시적인 구체예에서, 킬레이트 제제는 EDTA 디소듐 이수화물이다.

일부 구체예에서, EDTA는 약 0.25 mM 내지 약 5 mM의 농도이다. 특정 구체예에서, EDTA의 농도는 약 0.25 mM, 약 0.3 mM, 약 0.4 mM, 약 0.5 mM, 약 0.6 mM, 약 0.7 mM, 약 0.8 mM, 약 0.9 mM, 약 1.0 mM, 약 1.1 mM, 약 1.2 mM, 약 1.3 mM, 약 1.4 mM, 약 1.5 mM, 약 1.6 mM, 약 1.7 mM, 약 1.8 mM, 약 1.9 mM, 약 2.0 mM, 약 2.1 mM, 약 2.2 mM, 약 2.3 mM. 약 2.4 mM, 약 2.5 mM, 약 2.6 mM, 약 2.7 mM, 약 2.8 mM, 약 2.9 mM, 약 3.0 mM, 약 3.1 mM, 약 3.2 mM, 약 3.3 mM, 약 3.4 mM, 약 3.5 mM, 약 3.6 mM, 약 3.7 mM, 약 3.8 mM, 약 3.9 mM, 약 4.0 mM, 약 4.1 mM, 약 4.2 mM, 약 4.3 mM, 약 4.4 mM, 약 4.5 mM, 약 4.6 mM, 약 4.7 mM, 약 4.8 mM, 약 4.9 mM, 또는 약 5.0 mM의 농도이다. 바람직한 구체예에서, EDTA는 약 2.5 mM의 농도이다.

E. 본 명세서의 예시적인 조성물

예시적인 한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자의 조성물은, 약 2:1 내지 약 1:1의 몰비의 DOTMA 및 DOPE, 및 하나 이상의 에피토프를 인코딩하는 약 0.05 mg/mL 농도의 RNA를 포함하고, 여기서, 생리학적 pH에서 RNA 리포플렉스 입자 내 양전하 대 음전하의 전하 비는 약 1.3:2.0이고; 소듐 클로라이드 약 20 mM 농도; 수크로오스 약 22% (w/v) 농도; 약 6.2의 pH로 HEPES 약 7.5 mM 농도; 및 EDTA 약 2.5 mM 농도이다. 추가의 특정 구체예에서, RNA는 5 개의 에피토프 또는 10 개의 에피토프를 인코딩한다.

다른 예시적인 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자의 조성물은, 약 2:1 내지 약 1:1의 몰비의 DOTMA 및 DOPE, 및 하나 이상의 에피토프를 인코딩하는 약 0.05 mg/mL의 농도의 RNA를 포함하고, 여기서, 생리학적 pH에서 RNA 리포플렉스 입자 내 양전하 대 음전하의 전하 비는 약 1.3:2.0이고; 소듐 클로라이드 약 30 mM 농도; 수크로오스 약 20% (w/v) 농도; 약 6.2의 pH로 HEPES 약 7.5 mM 농도; 및 EDTA 약 2.5 mM 농도이다. 추가의 특정 구체예에서, RNA는 5 개의 에피토프 또는 10 개의 에피토프를 인코딩한다.

F. 본 명세서의 조성물의 안정성

본원에 사용되는 바, "안정한"은 다양한 물리 화학적 파라미터에 대해 측정된 값이 정의된 범위 내에 있는 조성물을 지칭한다. 한 구체예에서, 조성물은 분석되어 다양한 파라미터에 따른 안정성을 평가한다. 본 명세서에 따르면, 안정성 파라미터는, 제한없이, RNA 리포플렉스 입자의 평균 직경, 다분산 지수, RNA의 완전성, RNA 함량, pH, 삼투질 농도 및 현미경으로 식별되는 입자의 수를 포함한다. 당업자는 일상적인 실험실 기술 및 기기를 사용하여 이러한 파라미터를 측정할 수있을 것이다. 예를 들어, 안정성 파라미터는 동적 광산란 (DLS), 광 가리기, 분광법, 아가로오스 겔 전기영동, 바이오 분석기 또는 다른 임의의 다른 적절한 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 한 구체예에서, 바이오 분석기는 RNA의 완전성 및 RNA 함량을 측정할 수 있는 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)이다. 한 구체예에서, 바이오 분석기는 Advanced Analytical의 Fragment Analyzer이다.

이론에 구속되지 않고, DLS 측정은 본 명세서의 RNA 리포플렉스 입자와 관련된 파라미터를 분석하는데 유용하다. 한 구체예에서, DLS는 Z-avg (평균 입자 크기의 측정치)로 표현되는 RNA 리포플렉스 입자의 평균 직경을 결정하는데 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, DLS는 RNA 리포플렉스 입자의 다분산 지수를 결정하는데 사용될 수 있으며, 이는 RNA 리포플렉스 입자의 크기 및 중량 분포를 나타낸다.

특정 구체예에서, 조성물은 안정성 파라미터에 대한 측정치가 정의된 범위 내에 있을 때 안정적이다. 안정한 조성물의 한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는, 저장 후, 예컨대 약 -15℃ 내지 약 -40℃ 온도에서 저장 후, 원래 평균 직경 (즉, 동결, 동결-건조, 또는 분무-건조 및 해동 또는 재구성 전의 평균 직경)과의 차이가 ± 20%, ± 10%, ± 5% 또는 ± 3% 이하인 평균 직경을 갖는다. 안정한 조성물의 한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는, 저장 후, 예컨대 약 -15℃ 내지 약 -40℃ 온도에서 저장 후, 원래 평균 직경 (즉, 동결, 동결-건조, 또는 분무-건조 및 해동 또는 재구성 전의 평균 직경)에 비해 20%, 10%, 5% 또는 3% 이하인 평균 직경을 갖는다. 안정한 조성물의 다른 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는, 저장 후, 예컨대 약 -15℃ 내지 약 -40℃ 온도에서 저장 후, 원래 다분산 지수 (즉, 동결, 동결-건조, 또는 분무-건조 및 해동 또는 재구성 전의 다분산 지수)와의 차이가 ± 20%, ± 10%, ± 5% 또는 ± 3% 이하인 다분산 지수를 갖는다. 한 구체예에서, 안정한 조성물은, 저장 후, 예컨대 약 -15℃ 내지 약 -40℃ 온도에서 저장 후 직경이 10 μm 이상인 현미경으로 식별되는 입자 6,000 개 이하를 갖는다. 한 구체예에서, 안정한 조성물은, 저장 후, 예컨대 약 -15℃ 내지 약 -40℃ 온도에서 저장 후 직경이 25 μm 이상인 현미경으로 식별되는 입자 600 개 이하를 갖는다.

안정한 조성물의 한 구체예에서, RNA 완전성은, 저장 후, 예컨대 약 -15℃ 내지 약 -40℃ 온도에서 저장 후 80% 이상이다.

한 구체예에서, 조성물은 약 -15℃ 내지 약-40℃의 저장 온도에서 안정하다. 특정 구체예에서, 조성물은 약 -15℃, 약 -16℃, 약 -17℃, 약 -18℃, 약 -19℃, 약 -20℃, 약 -21℃, 약 -22℃, 약 -23℃, 약 -24℃, 약 -25℃, 약 -26℃, 약 -27℃, 약 -28℃, 약 -29℃, 약 -30℃, 약 -31℃, 약 -32℃, 약 -33℃, 약 -34℃, 약 -35℃, 약 -36℃, 약 -37℃, 약 -38℃, 약 -39℃, 또는 약 -40℃의 온도에서 안정하다. 바람직한 구체예에서, 조성물은 약 -15℃, 약 -20℃, 약 -30℃ 또는 약 -40℃의 온도에서 안정하다.

한 구체예에서, 조성물은, 약학적 조성물이 빛으로부터 보호되는 경우, 약 -15℃ 내지 약 -40℃의 온도에서 안정하다. 바람직한 구체예에서, 조성물은, 빛으로부터 보호되는 경우, 약 -15℃ 내지 약 -25℃의 온도에서 안정하다.

한 구체예에서, 조성물은 약 -15℃ 내지 약 -40℃의 온도에서 1 개월 이상 약 24 개월까지 안정하다. 특정 구체예에서, 조성물은 약 -15℃ 내지 약 -40℃의 온도에서 1 개월 이상, 2 개월 이상, 3 개월 이상, 4 개월 이상, 5 개월 이상, 6 개월 이상, 7 개월 이상, 8 개월 이상, 9 개월 이상, 10 개월 이상, 11 개월 이상, 12 개월 이상, 13 개월 이상, 14 개월 이상, 15 개월 이상 16 개월 이상, 17 개월 이상, 18 개월 이상, 19 개월 이상, 20 개월 이상, 21 개월 이상, 22 개월 이상, 23 개월 이상, 24 개월 이상, 25 개월 이상 26 개월 이상, 27 개월 이상, 28 개월 이상, 29 개월 이상, 30 개월 이상, 31 개월 이상, 32 개월 이상, 33 개월 이상, 34 개월 이상, 35 개월 이상, 또는 36 개월 이상 안정하다.

바람직한 구체예에서, 조성물은 약 -15℃의 온도에서 1 개월 이상, 2 개월 이상, 3 개월 이상, 4 개월 이상, 5 개월 이상 또는 6 개월 이상 안정하다.

다른 바람직한 구체예에서, 조성물은 약 -20℃의 온도에서 1 개월 이상, 2 개월 이상, 3 개월 이상, 4 개월 이상, 5 개월 이상 또는 6 개월 이상 안정하다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 조성물은 약 -30℃의 온도에서 1 개월 이상, 2 개월 이상, 3 개월 이상, 4 개월 이상, 5 개월 이상 또는 6 개월 이상 안정하다.

한 구체예에서, 조성물은 약 -15℃ 내지 약 -40℃의 온도에서 동결 및 약 4℃ 내지 약 25℃의 온도 (주변 온도)로 해동 후에 안정하다. 다른 구체예에서, 조성물은 다수의 동결-해동 사이클에서 약 -15℃ 내지 약 -40℃의 온도에서 동결 및 약 4℃ 내지 약 25℃의 온도 (주변 온도)로 해동 후에 안정하다.

G. 본 명세서의 조성물의 물리적 상태

구체예들에서, 본 명세서의 조성물은 액체 또는 고체이다. 고체의 비제한적 예시는 동결된 형태 또는 동결 건조된 형태를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 조성물은 액체이다.

본 명세서의 약학적 조성물

본원에 기재된 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 조성물은 치료적 또는 예방적 처치를 위한 약학적 조성물 또는 약제로서 또는 이를 제조하는데 유용하다.

본 명세서의 입자는 임의의 적합한 약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다.

용어 "약학적 조성물"은 바람직하게는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 치료적으로 유효한 제제를 포함하는 제형에 관한 것이다. 상기 약학적 조성물은 상기 약학적 조성물을 대상체에게 투여함으로써 질환 또는 장애의 증증도를 치료, 예방 또는 감소시키는 데 유용하다. 약학적 조성물은 또한 당 업계에 약학적 제형으로 알려져있다. 본 명세서의 맥락에서, 약학적 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 RNA 리포플렉스 입자를 포함한다.

본 명세서의 약학적 조성물은 바람직하게는 하나 이상의 아쥬반트를 포함하거나, 하나 이상의 아쥬반트와 함께 투여될 수 있다. 용어 "아쥬반트"는 면역 반응을 연장, 강화 또는 가속화시키는 화합물에 관한 것이다. 아쥬반트는 오일 에멀젼 (예를 들어, Freund's adjuvant), 미네랄 화합물 (예컨대, 명반), 박테리아 생성물 (예컨대, 보르데텔라 퍼투시스 (Bordetella pertussis) 독소) 또는 면역 자극 복합체와 같은 이종 화합물 군을 포함한다. 아쥬반트의 예는 LPS, GP96, CpG 올리고데 옥시뉴클레오타이드, 성장 인자 및 사이토카인, 예컨대 모노카인, 림포카인, 인터류킨, 케모카인을 포함하나, 이에 국한되지는 않는다. 케모카인은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, INFa, INF-γ, GM-CSF, LT-a일 수 있다. 추가적인 공지의 아쥬반트는 알루미늄 하이드록사이드, Freund 아쥬반트 또는 Montanide® ISA51과 같은 오일이다. 본 명세서에 사용하기에 적합한 다른 아쥬반트는 Pam3Cys와 같은 리포펩타이드를 포함한다.

본 명세서에 따른 약학적 조성물은 일반적으로 "약학적 유효량" 및 "약학적으로 허용되는 제제"로 적용된다.

용어 "약학적으로 허용되는"은 약학적 조성물의 활성 성분의 작용과 상호 작용하지 않는 물질의 비-독성을 지칭한다.

용어 "약학적 유효량"은 단독으로 또는 추가적인 투여와 함께 원하는 반응 또는 원하는 효과를 달성하는 양을 지칭한다. 특정 질환의 치료의 경우, 원하는 반응은 바람직하게는 질환 경과의 억제에 관한 것이다. 이는 질환의 진행을 늦추고, 특히 질환의 진행을 중단시키거나 역전시키는 것을 포함한다. 질환의 치료에서 원하는 반응은 또한 상기 질환 또는 상기 상태의 발병 지연 또는 발병의 예방일 수 있다. 본원에 기재된 입자 또는 조성물의 유효량은 치료될 상태, 질환의 중증도, 환자의 개별 파라미터, 예컨대 연령, 생리학적 조건, 크기 및 체중, 치료 기간, 동반 요법 (존재한다면)의 유형, 특정 투여 경로 및 유사한 요인에 따를 것이다. 따라서, 본원에 기재된 입자 또는 조성물의 투여량은 다양한 이러한 파라미터에 따라 달라질 수 있다. 환자의 반응이 초기 용량으로 불충분한 경우, 더 높은 용량 (또는 다른, 더욱 국소화된 투여 경로에 의해 달성되는 효과적으로 더 높은 용량)이 사용될 수 있다.

본 명세서의 약학적 조성물은 염, 완충제, 보존제 및 임의로 다른 치료 제제를 함유할 수 있다. 한 구체예에서, 본 명세서의 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다.

본 명세서의 약학적 조성물에 사용하기에 적합한 보존제는 벤잘코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살을 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다.

본원에 사용되는 바, 용어 "부형제"는 본 명세서의 약학적 조성물에 존재할 수 있지만 활성 성분이 아닌 물질을 지칭한다. 부형제의 예는, 제한없이, 담체, 결합제, 희석제, 윤활제, 증점제, 계면 활성제, 방부제, 안정화제, 유화제, 완충제, 향미제 또는 착색제를 포함한다.

용어 "희석제"는 희석 및/또는 감점 (thinning) 제제에 관한 것이다. 또한, 용어 "희석제"는 유체, 액체 또는 고체 현탁액 및/또는 혼합 매질 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 적합한 희석제의 예는 에탄올, 글리세롤 및 물을 포함한다.

용어 "담체"는 약학적 조성물의 투여를 촉진, 강화 또는 가능하게 하기 위해 활성 성분이 조합된 천연, 합성, 유기, 무기일 수 있는 성분을 지칭한다. 본원에 사용된 담체는 대상체에게 투여하기에 적합한 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질일 수 있다. 적합한 담체는, 제한없이, 멸균수, 링거, 링거 락테이트, 멸균 소듐 클로라이드 용액, 등장 식염수, 폴리알킬렌 글리콜, 수소화 나프탈렌, 및 특히 생체적합성 락타이드 중합체, 락타이드/글리콜라이드 공중합체 또는 폴리에틸렌/폴리옥시-플필렌 공중합체를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 등장 식염수를 포함한다.

치료 용도를 위한 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제는 약학 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 [Remington 's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit.1985)]에 기재되어 있다.

약학적 담체, 부형제 또는 희석제는 의도된 투여 경로 및 표준 약학적 실시와 관련하여 선택될 수 있다.

본 명세서의 약학적 조성물의 투여 경로

한 구체예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 정맥 내, 동맥 내, 피하, 피내 또는 근육 내 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 약학적 조성물은 국소 투여 또는 전신 투여를 위해 제형화된다. 전신 투여는 위장관을 통한 흡수를 포함하는 장 투여 또는 비경구 투여를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바, "비경구 투여"는 정맥 내 주사와 같은 위장관을 통하는 것 이외의 임의의 방식으로의 투여를 지칭한다. 바람직한 구체예에서, 약학적 조성물은 전신 투여를 위해 제형화된다. 다른 바람직한 구체예에서, 전신 투여는 정맥 내 투여에 의한 것이다.

제조 물품

일 측면에서, 본원에 기술된 RNA 리포플렉스 입자는 약학적 조성물에 존재한다. 다른 측면에서, 본원에 기재된 조성물은 약학적 조성물이다.

일 측면에서, 본 명세서는 본원에 기술된 약학적 조성물을 함유하는 바이알에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 명세서는 본원에 기재된 약학적 조성물을 함유하는 시린지에 관한 것이다.

본 명세서의 약학적 조성물의 이용

본원에 기재된 RNA 리포플렉스 입자는 다양한 질환, 특히 대상체에게 펩타이드 또는 단백질을 제공하여 치료적 또는 예방적 효과를 결과하는 질환의 치료적 또는 예방적 처치에 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스로부터 유래된 항원 또는 에피토프를 제공하는 것은 상기 바이러스에 의해 유발된 바이러스성 질환의 치료에 유용할 수 있다. 종양 항원 또는 에피토프의 제공은 암 세포가 상기 종양 항원을 발현하는 암 질환의 치료에 유용할 수 있다.

"질환"이라는 용어는 개체의 신체에 영향을 미치는 비정상적인 상태를 지칭한다. 질환은 종종 특정 증상 및 징후와 관련된 의학적 상태로 해석된다. 질환은 감염 질환과 같은 외부 원으로부터의 인자에서 유래되어 원인이 되거나, 또는 자가 면역 질환과 같은 내부 기능 장애가 원인이 될 수 있다. 인간에서, "질환"은 종종 고통받는 개체에 대한 통증, 기능 장애, 고통, 사회적 문제, 또는 사망, 또는 그 개체와 접촉하는 사람들에게서 유사한 문제를 야기하는 임의의 상태를 지칭하기 위해 보다 광범위하게 사용된다. 이러한 넓은 의미에서, 그것은 때때로 부상, 불기능, 장애, 증후군, 감염, 분리된 증상, 변형된 행동 및 비정형적 구조 및 기능 변형을 포함하지만, 다른 문맥상 및 다른 목적을 위하여 이들은 구별 가능한 범주로 간주될 수 있다. 많은 질환을 앓고 그와 함께 생활하는 것은 삶에 대한 시각 및 성격을 변화시킬 수 있기 때문에, 질환은 대개 신체적으로뿐만 아니라 감정적으로도 개체에게 영향을 미친다.

본원의 맥락에서, 용어 "치료", "치료하는" 또는 "치료적 중재"는 질환 또는 장애와 같은 상태를 퇴치하는 목적의, 대상체의 관리 및 돌봄에 관한 것이다. 상기 용어는 증상 또는 합병증을 완화하기 위한, 질환, 장애 또는 질병 상태의 진행을 지연하기 위한, 상기 증상 또는 합병증을 완화 또는 경감을 위한, 및/또는 상기 질환, 장애 또는 질병 상태의 치유 또는 제거 및 상기 질병 상태를 예방하기 위한, 예컨대 치료적으로 유효한 화합물의 투여와 같은, 대상체가 앓고 있는 주어진 상태에 대한 전체 스펙트럼 치료를 포함하도록 의도되며, 여기서 예방은 상기 질환, 질병 상태 또는 장애와 싸울 목적으로 개체에 대한 관리 및 돌봄으로서 이해되고 상기 증상 또는 합병증의 개시를 예방하기 위한 활성 화합물의 투여를 포함한다.

"치료적 처치"라는 용어는 개체의 건강 상태를 개선 및/또는 수명을 연장 (증가)시키는 임의의 치료에 관한 것이다. 상기 치료는 개체에서 질환을 제거하고, 개체에서 질환의 발병을 정지시키거나 늦추고, 개체에서 질환의 발병을 억제 또는 늦추거나, 개체에서 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키고 및/또는 현재 질환을 앓고 있는 또는 이전에 질환을 앓았던 개체의 재발을 감소시킬 수 있다.

"예방적 처치" 또는 "방지적 처치"라는 용어는 질환이 개체에게 발생하는 것을 방지하기 위한 임의의 치료에 관한 것이다. "예방적 처치" 또는 "방지적 처치"라는 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.

"개체" 및 "대상체"라는 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 이들은 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)에 걸리거나 걸릴 수 있지만 그 질환이나 장애를 갖거나 갖지 않을 수 있는 인간 또는 기타 포유 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)을 지칭한다. 많은 구체예에서, 개체는 인간이다. 달리 언급되지 않는 한, "개체" 및 "대상체"라는 용어는 특정 연령을 나타내지 않으므로 성인, 노인, 어린이 및 신생아를 포함한다. 본 명세서의 구체예에서, "개체"또는 "대상체"는 "환자"이다.

"환자"라는 용어는 치료를 위한 개체 또는 대상체, 특히 병에 걸린 개체 또는 대상체를 의미한다.

본 명세서의 한 구체예에서, 목적은 항원을 발현하는 질환 세포, 예컨대 종양 항원을 발현하는 암 세포에 대한 면역 반응을 제공하고, 종양 항원과 같은 항원을 발현하는 세포를 포함하는 암 질환과 같은 질환을 치료하기 위한 것이다.

하나 이상의 항원 또는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA를 포함하는 본원에 기술된 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 약학적 조성물은, 치료적이거나, 부분적으로 또는 완전히 방어적일 수 있는, 대상체의 하나 이상의 항원 또는 하나 이상의 에피토프에 대한 면역 반응을 이끌어 내기 위하여 대상체에게 투여될 수 있다. 당업자는 면역 요법 및 백신 접종의 원리 중 하나가 질환에 대한 면역 보호 반응이 대상체를 상기 치료할 질환에 관한 면역 학적 관련 항원 또는 에피토프로 면역화함으로써 생성된다는 사실에 기초한다는 것을 알 것이다. 따라서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 면역 반응을 유도 또는 강화하는데 적용 가능하다. 따라서 본원에 기술된 약학적 조성물은 항원 또는 에피토프와 관련된 질환의 예방 및/또는 치료에 유용하다.

본원에 사용된 바, "면역 반응"은 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 대한 통합된 신체 반응을 지칭하고, 세포성 면역 반응 및/또는 체액성 면역 반응을 지칭한다. 세포성 면역 반응은, 제한없이, 항원을 발현하고 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자를 갖는 항원의 제시를 특징으로 하는 세포에 대한 세포 반응을 포함한다. 세포성 반응은 감염된 세포 또는 암 세포에서 세포 자멸사를 유도하는 면역 반응 또는 살해 세포 (세포 독성 T 세포, CD8+ T 세포 또는 CTL이라고도 함)를 조절함으로써 중추적 역할을 하는 헬퍼 T 세포 (CD4+ T 세포라고도 함)로 분류될 수 있는 T 림프구와 관련이 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 것은 하나 이상의 종양 항원을 발현하는 암 세포에 대한 항-종양 CD8+ T 세포 반응의 자극을 포함한다. 특정 구체예에서, 종양 항원은 클래스 I MHC 분자로 제공된다.

본 명세서는 보호적, 방지적, 예방적 및/또는 치료적일 수 있는 면역 반응을 고려한다. 본원에 사용된 바, "면역 반응을 유도하다 (또는 유도하는)"는 유도 전에 특정 항원에 대한 면역 반응이 전혀 존재하지 않았음을 나타내거나, 유도 전에 특정 항원에 대한 기저 수준의 면역 반응이 있었고, 이것이 유도 후에 강화되었음을 나타낼 수 있다. 따라서, "면역 반응을 유도하다 (또는 유도하는)"는 "면역 반응을 강화하다 (또는 강화하는)"를 포함한다.

용어 "면역 요법"은 면역 반응을 유도하거나 강화시킴에 의한 질환 또는 질병 상태의 치료에 관한 것이다. 용어 "면역 요법"은 항원 면역화 또는 항원 백신 접종을 포함한다.

"면역화" 또는 "백신 접종"이라는 용어는, 예를 들어 치료적 또는 예방적 이유로 면역 반응을 유도할 목적으로 개체에 항원을 투여하는 과정을 설명한다.

한 구체예에서, 본 발명은 비장 조직을 표적으로 하는 본원에 기술된 RNA 리포플렉스 입자가 투여되는 구체예를 구현한다. RNA는 예를 들어 본원에 기재된 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 인코딩한다. RNA는, 펩타이드 또는 단백질을 발현하기 위해, 수지상 세포와 같은 비장의 항원-제시 세포에 의해 흡수된다. 항원-제시 세포에 의한 선택적인 처리 및 제시 후, 면역 반응은 항원 또는 에피토프에 대해 발생, 그 항원 또는 에피토프를 수반하는 질환의 예방적 및/또는 치료적 처치를 결과할 수 있다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 RNA 리포플렉스 입자에 의해 유도된 면역 반응은 수지상 세포 및/또는 대식세포와 같은 항원 제시 세포에 의한 항원 또는 이의 단편, 예컨대 에피토프의 제시 및 이러한 제시에 기한 세포 독성 T 세포의 활성화를 포함한다. 예를 들어, RNA에 의해 인코딩된 펩타이드 또는 단백질 또는 이의 가공 생성물은 항원 제시 세포 상에서 발현되는 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 단백질에 의해 제시될 수 있다. MHC 펩타이드 복합체는 그 후, 그들의 활성화를 유도하는 T 세포 또는 B 세포와 같은 면역 세포에 의해 인식될 수 있다.

따라서, 한 구체예에서, 본원에 기재된 RNA 리포플렉스 입자 중의 RNA는, 투여 후, 비장으로 전달되고 및/또는 비장에서 발현된다. 한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 비장 항원 제시 세포를 활성화시키기 위해 비장으로 전달된다. 따라서, 한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자의 투여 후, 항원 제시 세포에서 RNA 전달 및/또는 RNA 발현이 발생한다. 항원 제시 세포는 전문적 항원 제시 세포 또는 비-전문적 항원 제시 세포일 수 있다. 전문적 항원 제시 세포는 수지상 세포 및/또는 대식세포, 더욱 바람직하게는 비장 수지상 세포 및/또는 비장 대식세포일 수 있다.

따라서, 본 발명은, 면역 반응, 바람직하게는 암에 대한 면역 반응을 유도 또는 강화하기 위한, 본원에 기재된 RNA 리포플렉스 입자 또는 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은, 항원을 포함하는 질환, 바람직하게는 암 질환의 예방적 및/또는 치료적 처치에 사용하기 위한 본원에 기재된 RNA 리포플렉스 입자 또는 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은, 본원에 기재된 RNA 리포플렉스 입자 또는 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 비장에서 전문적 항원 제시 세포와 같은 항원 제시 세포에 항원 또는 항원의 에피토프를 전달하거나, 비장의 전문적 항원 제시 세포와 같은 항원 제시 세포에서 항원 또는 항원의 에피토프를 발현시키는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에서, 항원은 종양 항원이다. 이러한 측면에서, 항원 또는 항원의 에피토프는 바람직하게는 RNA 리포플렉스 입자 내 RNA에 의해 인코딩된다.

한 구체예에서, 본원에 기재된 RNA 리포플렉스 입자 또는 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 약학적 조성물을 전신 투여하는 것은, 폐 및/또는 간이 아닌, 비장에서의 RNA 리포플렉스 입자 또는 RNA의 표적화 및/또는 축적을 결과한다. 한 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 비장에서 RNA를 방출하고 및/또는 비장에서 세포로 들어간다. 한 구체예에서, 본원에 기재된 RNA 리포플렉스 입자 또는 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 약학적 조성물을 전신 투여하는 것은, RNA를 비장의 항원 제시 세포에 전달한다. 특정 구체예에서, 비장에서 항원 제시 세포는 수지상 세포 또는 대식세포이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 대상체에게 본원에 기재된 RNA 리포플렉스 입자 또는 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도 또는 강화시키는 방법에 관한 것이다. 예시적 구체예에서, 면역 반응은 암에 대한 것이다.

용어 "대식세포"는 단핵구의 분화에 의해 생성된 식세포의 하위 군을 지칭한다. 염증, 면역 사이토카인 또는 미생물 산물에 의해 활성화되는 대식세포는 병원체의 분해를 결과하는 가수 분해 및 산화성 공격에 의해 대식세포 내 외래 병원체를 비특이적으로 삼켜 사멸시킨다. 분해된 단백질로부터의 펩타이드는 T 세포에 의해 인식될 수 있는 대식세포 세포 표면에 표시되고, 그들은 B 세포 표면의 항체와 직접 상호 작용하여 T 및 B 세포 활성화 및 면역 반응의 추가 자극을 결과할 수 있다. 대식세포는 항원 제시 세포의 부류에 속한다. 한 구체예에서, 대식세포는 비장 대식세포이다.

용어 "수지상 세포" (DC)는 항원 제시 세포 부류에 속하는 또 다른 서브 타입의 식세포를 지칭한다. 한 구체예에서, 수지상 세포는 조혈 골수 전구 세포로부터 유래된다. 이들 전구 세포는 처음에는 미성숙 수지상 세포로 변형된다. 이들 미성숙 세포는 높은 식세포 활성 및 낮은 T 세포 활성화 잠재력을 특징으로 한다. 미성숙 수지상 세포는 바이러스 및 박테리아와 같은 병원체에 대한 주변 환경을 지속적으로 샘플링한다. 일단 이들이 제시 가능한 항원과 접촉하게 되면, 이들은 성숙한 수지상 세포로 활성화되어 비장 또는 림프절로 이동하기 시작한다. 미성숙 수지상 세포는 병원체를 식균하고 이들의 단백질을 작은 조각으로 분해하고 성숙시 MHC 분자를 사용하여 세포 표면에 이들 단편을 제시한다. 동시에, 이들은 CD80, CD86 및 CD40과 같은 T 세포 활성화에서 공동-수용체로서 작용하는 세포-표면 수용체를 상향 조절하여 T 세포를 활성화시키는 그들의 능력을 크게 향상시킨다. 이들은 또한 수지상 세포가 혈류를 통해 비장으로 또는 림프계를 통해 림프절로 이동하도록하는 화학 주성 수용체인 CCR7을 상향 조절한다. 여기서 이들은 항원-제시 세포로서 작용하고, 비-항원 특이적 공동-자극 신호와 함께 그들에게 항원을 제시함으로써 B 세포뿐만 아니라 헬퍼 T 세포 및 킬러 T 세포를 활성화시킨다. 따라서, 수지상 세포는 T 세포- 또는 B 세포-관련 면역 반응을 능동적으로 유도할 수 있다. 한 구체예에서, 수지상 세포는 비장 수지상 세포이다.

용어 "항원 제시 세포" (APC)는 그의 세포 표면 상에 (또는 표면에) 적어도 하나의 항원 또는 항원 단편을 표시, 획득 및/또는 제시할 수 있는 다양한 세포들 중 하나의 세포이다. 항원-제시 세포는 전문적 항원 제시 세포 및 비-전문적 항원 제시 세포로 구별될 수 있다.

용어 "전문적 항원 제시 세포"는 나이브 T 세포와의 상호 작용에 필요한 주요 조직 적합성 복합체 클래스 II (MHC 클래스 II) 분자를 구성적으로 발현하는 항원 제시 세포에 관한 것이다. T 세포가 항원 제시 세포의 막에서 MHC 클래스 II 분자 복합체와 상호 작용하면, 항원 제시 세포는 T 세포의 활성화를 유도하는 공동 자극 분자를 생성한다. 전문적 항원 제시 세포는 수지상 세포 및 대식세포를 포함한다.

용어 "비전문적 항원 제시 세포"는 MHC 클래스 II 분자를 구성적으로 발현하지는 않지만 인터페론-감마와 같은 특정 사이토카인에 의한 자극시 이들을 발현하는 항원 제시 세포에 관한 것이다. 예시적인 비전문적 항원 제시 세포는 섬유 아세포, 흉선 상피 세포, 갑상선 상피 세포, 아교 세포, 췌장 베타 세포 또는 혈관 내피 세포를 포함한다.

"항원 처리"는 항원의 가공 산물로의 분해를 지칭하는데, 가공 산물은 상기 항원의 단편 (예를 들어, 단백질의 펩타이드로의 분해) 및 하나 이상의 이들 단편의 항원 제시 세포와 같은 세포에 의해 특정 T 세포에 제시하기 위한 MHC 분자와의 회합 (예를 들어, 결합을 통해)이다.

용어 "항원 관련 질환" 또는 "에피토프 관련 질환"은 항원 또는 에피토프와 연루된 임의의 질환, 예를 들어 항원 또는 에피토프의 존재를 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 항원 또는 에피토프를 수반하는 질환은 감염성 질환, 또는 암 질환 또는 단순히 암일 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 항원은 질환-관련 항원, 예컨대 종양-관련 항원, 바이러스 항원 또는 박테리아 항원일 수 있고 에피토프는 이러한 항원으로부터 유래될 수 있다.

용어 "감염성 질환"은 개체에서 개체로 또는 유기체에서 유기체로 전염될 수 있고 미생물 제제에 의해 야기되는 임의의 질환을 지칭한다 (예를 들어, 일반적인 감기). 감염성 질환은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 바이러스성 질환, 박테리아성 질환 또는 기생충성 질환을 포함하며, 이들 질환은 각각 바이러스, 박테리아 및 기생충에 의해 야기된다. 이와 관련하여, 감염성 질환은 예를 들어, 간염, 성병 (예컨대, 클라미디아 또는 임질), 결핵, HIV/후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS), 디프테리아, B형 간염, C형 간염, 콜레라, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS), 조류 독감 및 인플루엔자일 수 있다.

"암 질환" 또는 "암"이라는 용어는 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 개체의 생리학적 상태를 지칭하거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다. 보다 구체적으로, 이러한 암의 예는 골암, 혈액암 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 대장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 성 및 생식 기관의 암종, 호지킨 병, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신샘암, 연조직 육종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신우 암종, 중추 신경계 (CNS) 신생물, 신경외배엽 암, 척추 축 종양, 신경 교종, 수막종 및 뇌하수체 선종을 포함한다. 본 명세서에 따른 용어 "암"은 또한 암 전이를 포함한다.

암 치료에서의 조합 전략은 결과적인 시너지 효과로 인해 바람직할 수 있으며, 이는 단일 치료 접근법의 결과보다 상당히 더 강력할 수 있다. 한 구체예에서, 약학적 조성물은 면역치료 제제와 함께 투여된다. 본원에 사용되는 바, "면역치료 제제"는 특정 면역 반응 및/또는 면역 효과기 기능(들)의 활성화에 관여할 수 있는 임의의 제제에 관한 것이다. 본 명세서는 면역치료 제제로서 항체의 사용을 고려한다. 이론에 구속되지 않고, 항체는 세포자멸사 유도, 신호 전달 경로의 차단 성분 또는 종양 세포의 증식 억제를 포함하는 다양한 메커니즘을 통해 암 세포에 대한 치료적 효과를 달성할 수 있다. 특정 구체예에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는 항체-의존적 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 통해 세포 사멸을 유도하거나, 보체 단백질에 결합하여 보체 의존성 세포독성 (CDC)으로 알려진 직접적인 세포 독성을 유발할 수 있다. 본 발명과 조합하여 사용될 수 있는 항-암 항체 및 잠재적인 항체 표적 (괄호 안)의 비-제한적 예시는 다음을 포함한다: Abagovomab (CA-125), Abciximab (CD41), Adecatumumab (EpCAM), Afutuzumab (CD20), Alacizumab pegol (VEGFR2), Altumomab pentetate (CEA), Amatuximab (MORAb- 009), Anatumomab mafenatox (TAG-72), Apolizumab (HLA-DR), Arcitumomab (CEA), Atezolizumab (PD-L1), Bavituximab (포스파티딜세린), Bectumomab (CD22), Belimumab (BAFF), Bevacizumab (VEGF-A), Bivatuzumab mertansine (CD44 v6), Blinatumomab (CD 19), Brentuximab vedotin (CD30 TNFRSF8), Cantuzumab mertansin (mucin CanAg), Cantuzumab ravtansine (MUC1), Capromab pendetide (전립선암 세포), Carlumab (CNT0888), Catumaxomab (EpCAM, CD3), Cetuximab (EGFR), Citatuzumab bogatox (EpCAM), Cixutumumab (IGF-1 수용체), Claudiximab (Claudin), Clivatuzumab tetraxetan (MUC1), Conatumumab (TRAIL-R2), Dacetuzumab (CD40), Dalotuzumab (인슐린-유사 성장 인자 I 수용체), Denosumab (RANKL), Detumomab (B-림프종 세포), Drozitumab (DR5), Ecromeximab (GD3 갱글리오사이드), Edrecolomab (EpCAM), Elotuzumab (SLAMF7), Enavatuzumab (PDL192), Ensituximab (NPC-1C), Epratuzumab (CD22), Ertumaxomab (HER2/neu, CD3), Etaracizumab (인테그린 ανβ3), Farletuzumab (폴레이트 수용체 1), FBTA05 (CD20), Ficlatuzumab (SCH 900105), Figitumumab (IGF-1 수용체), Flanvotumab (당단백질 75), Fresolimumab (TGF-β), Galiximab (CD80), Ganitumab (IGF-I), Gemtuzumab ozogamicin (CD33), Gevokizumab (IL-Iβ), Girentuximab (탄산 무수화 효소 9 (CA-IX)), Glembatumumab vedotin (GPNMB), Ibritumomab tiuxetan (CD20), Icrucumab (VEGFR-1 ), Igovoma (CA-125), Indatuximab ravtansine (SDC1), Intetumumab (CD51), Inotuzumab ozogamicin (CD22), Ipilimumab (CD 152), Iratumumab (CD30), Labetuzumab (CEA), Lexatumumab (TRAIL-R2), Libivirumab (헤파티티스 B 표면 항원), Lintuzumab (CD33), Lorvotuzumab mertansine (CD56), Lucatumumab (CD40), Lumiliximab (CD23), Mapatumumab (TRAIL-R1), Matuzumab (EGFR), Mepolizumab (IL-5), Milatuzumab (CD74), Mitumomab (GD3 갱글리오사이드), Mogamulizumab (CCR4), Moxetumomab pasudotox (CD22), Nacolomab tafenatox (C242 항원), Naptumomab estafenatox (5T4), Namatumab (RON), Necitumumab (EGFR), Nimotuzumab (EGFR), Nivolumab (IgG4), Ofatumumab (CD20), Olaratumab (PDGF-R a), Onartuzumab (인간 산란 인자 수용체 키나아제), Oportuzumab monatox (EpCAM), Oregovomab (CA-125), Oxelumab (OX-40), Panitumumab (EGFR), Patritumab (HER3), Pemtumoma (MUC1), Pertuzuma (HER2/neu), Pintumomab (선암종 항원), Pritumumab (비멘틴), Racotumomab (N-글리콜릴뉴라민산), Radretumab (피브로넥틴 엑스트라 도메인-B), Rafivirumab (광견병 바이러스 당단백질), Ramucirumab (VEGFR2), Rilotumumab (HGF), Rituximab (CD20), Robatumumab (IGF-1 수용체), Samalizumab (CD200), Sibrotuzumab (FAP), Siltuximab (IL-6), Tabalumab (BAFF), Tacatuzumab tetraxetan (알파-태아단백질), Taplitumomab paptox (CD 19), Tenatumomab (테나신 C), Teprotumumab (CD221), Ticilimumab (CTLA- 4), Tigatuzumab (TRAIL-R2), TNX-650 (IL-13), Tositumomab (CD20), Trastuzumab (HER2/neu), TRBS07 (GD2), Tremelimumab (CTLA-4), Tucotuzumab celmoleukin (EpCAM), Ublituximab (MS4A1), Urelumab (4-1 BB), Volociximab (인테그린 α5β1), Votumumab (종양 항원 CTAA 16.88), Zalutumumab (EGFR), 및 Zanolimumab (CD4).

한 구체예에서, 면역치료 제제는 PD-1 축 결합 길항제이다. PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제 및 PD-L2 결합 길항제를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. "PD-1"의 대체명에는 CD279 및 SLEB2가 포함된다. "PD-L1"의 대체명은 B7-H1, B7-4, CD274 및 B7-H를 포함한다. "PD-L2"의 대체명에는 B7-DC, Btdc 및 CD273이 포함된다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1의 리간드 결합 파트너에 대한 결합을 억제하는 분자이다. 특정 측면에서, PD-1 리간드 결합 파트너는 PD-L1 및/또는 PD-L2이다. 다른 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1의 결합 파트너에 대한 결합을 억제하는 분자이다. 특정 구체예에서, PD-L1 결합 파트너는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 다른 구체예에서, PD-L2 결합 길항제는 PD-L2의 결합 파트너에 대한 결합을 억제하는 분자이다. 특정 구체예에서, PD-L2 결합 파트너는 PD-1이다. PD-1 결합 길항제는 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역접합체, 융합 단백질 또는 올리고펩타이드일 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체 (예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체)이다. 항-PD-1 항체의 예는, 제한없이, MDX-1106 (Nivolumab, OPDIVO), Merck 3475 (MK-3475, Pembrolizumab, KEYTRUDA), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001, REGN2810, BGB-108 및 BGB-A317을 포함한다.

한 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 불변 영역에 융합된 PD-L1 또는 PD-L2의 세포 외 부분 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역접합체이다. 한 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 WO2010/027827 및 WO2011/066342에 기재된 융합 가용성 수용체 인 AMP-224 (B7-DCIg로도 알려져 있으며 PD-L2-Fc임)이다.

한 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-L1 항체이고, 제한없이 YW243.55.S70, MPDL3280A (Atezolizumab), MEDI4736 (Durvalumab), MDX-1105, 및 MSB0010718C (Avelumab)를 포함한다.

한 구체예에서, 면역치료 제제는 PD-1 결합 길항제이다. 다른 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-L1 항체이다. 예시적인 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 Atezolizumab이다.

본원에 언급된 문헌 및 연구에 대한 인용은 전술한 것들 중 어느 것이라도 관련 선행 기술이라는 인정하는 것으로 의도된 것은 아니다. 이 문서의 내용에 대한 모든 진술은 출원인이 이용할 수 있는 정보를 기반으로 하며 이 문서의 내용이 정확하다는 것을 인정하는 것은 아니다.

이하의 설명은 당업자가 다양한 구체예를 만들고 사용할 수 있도록 제시된다. 특정 장치, 기술 및 응용법에 대한 설명은 예시로서만 제공된다. 여기에 설명 된 실시예에 대한 다양한 변형이 당업자에게 명백할 것이며, 여기에 정의된 일반적인 원리는 다양한 실시예의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다른 예 및 응용법에 적용될 수 있다. 따라서, 다양한 구체예는 본 명세서에 기술되고 도시된 실시예에 한정되는 것이 아니라 청구 범위와 일치하는 범위에 따라야 한다.

실시예

실시예 1: 재료

이하 기술되는 실험에 사용된 주요 재료는 다음과 같다:

실시예 2: 지질 혼합물의 제조

각각 2:1의 지질 몰비를 갖는 여러 지질 농도로 에탄올 중 DOTMA/DOPE 지질 혼합물이 제조된다. 용액은 다음과 같이 제조된다:

- DOPE 지질 칭량.

- 2:1 DOTMA/DOPE의 % 몰 비를 유지하기 위해 DOTMA의 양을 계산.

- DOTMA 지질 칭량.

- 지질 용해에 필요한 에탄올 절대량을 계산.

- 에탄올 abs. 칭량.

- 37℃에서 워터 배드를 이용하여 에탄올에 지질을 용해.

에탄올 중 300 mM DOPE 또는 330 mM DOPE/DOTMA (66:33) 용액을 제조하여, 에탄올에서의 DOPE 및 DOPE/DOTMA 용해도를 조사하였다. 지질 용액을 37℃에서 20 분 동안 인큐베이션함으로써 지질을 용해시켰다. DOPE 용액을 17000 G에서 1 시간 동안 원심 분리하고, HPLC로 상청액에서 DOPE 농도를 측정하였다. DOTMA/DOPE 용액을 0.22 μm PES 시린지 필터를 통해 여과하고 여과액에서 지질 농도를 HPLC로 측정하였다.

다른 지질이 출발 물질로서 사용되고 및/또는 다른 몰비가 계산된다면, 본 실시예에 기재된 기본적인 단계에 따름으로써 추가적인 지질 혼합물이 유사하게 제조될 수 있다.

실시예 3: 리포좀의 제조

리포좀은 다음과 같이 에탄올 주입에 의해 제조되었다: 에탄올 중의 0.2 mL DOTM/DOPE 또는 (다른 지질 용액)을 0.9 x 40 mm 바늘이 장착된 1 mL 시린지를 사용하여, 120 rpm에서 교반하면서 9.8 mL 물에 주입하였다. 리포좀 콜로이드를 30 분 동안 교반하였다. 리포좀은 0.45 또는 1.2 또는 5 μm CA 시린지 필터를 통해 여과되거나 여과되지 않았다. 리포좀 콜로이드를 4-8℃에서 보관하였다. 50 mM을 중간 단계로 하여, 100 내지 400 mM의, 여러 가지 총 지질 농도로 66:33 % 몰 비의 DOTMA/DOPE 지질 용액을 제조하였다.

실시예 4: RNA 리포플렉스의 제조

RNA 리포플렉스 제형은 먼저 RNA 용액 (예를 들어, luc-RNA 용액)을 NaCl 용액과 혼합하여 luc-RNA를 예비-축합함으로써 다음과 같이 제조되었다. 그 후, 리포좀 콜로이드 및 luc-RNA-NaCl 용액을 혼합하여 RNA 리포플렉스를 형성하였다. RNA 리포플렉스 제형을 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하고 4-8℃에서 저장하였다. 여러 RNA 리포플렉스 제형은 예를 들어 0.65의 N/P 비로 제조하였다. 이들 여러 RNA 리포플렉스 제형에서 RNA 농도는 0.1 mg/mL이고 NaCl 농도는 50 mM이었다. RNA 리포플렉스의 제조를 위해 여러 리포좀 전구체 (다른 크기)를 사용하였다.

실시예 5: 동적 광산란

리포좀 크기 및 RNA 리포플렉스 크기는 Nicomp 기기 (PSS. Santa Barbara. USA)를 사용하여 공지된 DLS (Dynamic Light Scattering) 방법에 의해 측정되었다. 물로 리포좀 샘플을 1 mM 총 지질 농도로 희석시켰다. RNA 리포플렉스 샘플을, 0.9 % NaCl 용액으로 1 내지 5 희석하였다. 샘플을 5x50 mm 배양 튜브 (Kimble. USA)에서 측정하였다.

실시예 6: 광 차단-동적 광산란

Accusizer A7000 기기 (PSS. Santa Barbara. USA)를 사용하여 0.5 내지 5 μm의 크기 범위에서 여러 가지 리포좀 및 RNA 리포플렉스 제형으로부터의 입자 계수/측정을 수행하였다. 5 mL 부피 (2.5 μL 샘플/ 20 mL 자유 입자 수)의 3 회 측정을 수행하였다. 얻어진 결과는 3 회 측정한 입자량의 평균값을 나타냈다.

실시예 7: 소각 X-선 산란

여러 리포좀 전구체로 제조된 여러 RNA 리포플렉스 제형의 내부 구조 파라미터를 SAXS (Small Angel X-ray Scattering)에 의해 측정하였다. SAXS는 물질을 통과할 때 X-선의 탄성 산란 거동을 분석하여 산란을 작은 각도로 기록함으로써 샘플의 나노스케일 밀도 차이를 정량화할 수 있는 기술이다. 상관 길이 및 d-스페이싱 파라미터가 시험된 모든 RNA-제형에 대해 계산되었다. RNA 리포플렉스 제형은 0.65의 N/P 비, 0.1 mg/mL RNA 및 112 mM NaCl로 제조되었다.

실시예 8: 아가로오스 겔 전기 영동

여러 RNA 리포플렉스 샘플 내 유리 RNA의 양을 겔 전기 영동에 의해 측정하였다. 소듐 하이포클로라이드를 함유하는 1% 아가로오스 겔을 사용하여 측정을 수행하였다. RNA 리포플렉스 샘플을 DNA 로딩 염료로 1:6 희석하였다. 12 ㎕의 희석 된 RNA 리포플렉스 샘플을 아가로오스 겔에 조심스럽게 로딩하였다. 40 분의 러닝 타임으로 80 V에서 전기 영동을 수행하였다.

실시예 9: HPLC

여러 리포좀 제형에서의 지질 농도는 Sunfire C18 2.5 μm 4.6 x 75 mm 컬럼 (Waters. Massachusetts. USA) 및 파장 205 nm를 사용하여 HPLC (Agilent Technologies. Santa Clara. USA)로 측정되었다. 이동상 A는 70% 메탄올/30% 이소프로판올/0.1% TFA의 혼합물이고, 이동상 B는 55% 메탄올/15% 이소프로판올/30% 물/0.1% TFA의 혼합물이었다. 리포좀 샘플을 3 mM 총 지질 농도로 물로 희석하거나 희석하지 않았다.

실시예 10: 세포 배양: 시험관내 수지상 세포에서의 RNA 형질 감염

RNA 리포플렉스 제형은 여러 가지 리포좀 전구체 및 luc-RNA로 제조되었다. 세포 배양 실험을 위해 RNA 리포플렉스를 0.9% NaCl 용액으로 0.01 mg/mL RNA로 희석하였다. 여러 RNA 리포플렉스 제형의 RNA 형질 감염 효율을 배지 또는 전혈에 씨딩된 인간 수지상 세포에서 조사하였다.

실시예 11: 동물 모델: 수지상 세포에서 비장 표적화 및 RNA 형질 감염

여러 가지 RNA 리포플렉스 제형의 형질 감염 효율을 BALB/c 마우스에서 조사하였다. 20 ㎍ 제형화된 RNA 리포플렉스를 레트로-오비탈 주입하고 수지상 세포에서 루시퍼라아제 발현 (비장 표적)을 6 시간 후에 측정하였다. RNA 리포플렉스는 luc-RNA 및 상이한 리포좀 전구체, 생 콜로이드로부터 얻어지는 작거나 큰 리포좀과 0.45 μm 여과 후 작고 큰 리포좀, N/P 비 0.65 및 112 mM NaCl로 제조되었다.

실시예 12: 용해도 시험

더 높은 농도의 DOPE-함유 용액이 (과포화 상태에서) 제조될 수 있고 리포좀 제조를 위한 에탄올 주입에 사용될 수 있는지 (다음 섹션) 시험되었다. 이 용해도 시험 시리즈에서 얻어진 결과는 표 1 및 2에 제시되어 있다:

이 결과에 따르면, 여러 공급자로부터 구입한 DOPE는 에탄올 중 평형 용해도가 약 50 내지 60 mM (실온)이다. 그러나, 양이온성 지질 DOTMA와의 공-용액을 제조하면, 66:33의 몰비를 갖는 DOTMA/DOPE 공-용액이 사용되는 경우, 평형 용해도가, 예를 들어 약 90 내지 100 mM로 크게 증가한다.

실시예 13: 여러 크기의 리포좀 제조

리포좀은 실시예 3에 기술된 프로토콜을 사용하여 에탄올 주입에 의해 제조되었다. 에탄올 주입 후에 여과 공정이 수행되지 않았다. 에탄올 중 지질 농도는 다양하였고, 다른 모든 파라미터는 고정되어 있었다. 리포좀 크기는 실시예 5 및 6에서 동적 광산란 (DLS)에 의해 기재된 바와 같이 측정되었다.

예로서, % 몰 비 66:33을 갖는 DOTMA/DOPE 혼합물로부터 얻어진 리포좀에 관한 결과는 표 3 (아래) 및 도 1 및 2에 제시되어 있다.

볼 수 있듯이, 얻어진 리포좀의 크기 (Z-평균)는 에탄올 주입에 사용된 에탄올 용액의 지질 농도에 따라 증가한다. 따라서, 에탄올 중의 지질 농도는 리포좀의 크기를 제어하기 위해 효율적으로 사용될 수 있다. 흥미롭게도, DOPE 농도가 에탄올 단독에서 DOPE의 평형 용해도 아래 또는 위인 경우에 크기 변화가 가장 두드러졌다. DOPE 농도가 50 mM (150 mM 총 지질 농도) 위인 경우, 얻어진 리포좀 크기는 <50 nm에서 500 nm 이상으로 급격히 증가하였다 (도 1). 그러나, 또한 용해도 한계를 넘어서도 리포좀 크기는 지질 농도가 증가함에 따라 단조 증가하였다.

0.5 μm 리포좀 분획이 모든 리포좀 제형에 존재하였고, 이 리포좀 분획은 300 mM 지질 용액으로 제조된 리포좀에서 더 높았고, 더 낮고 더 높은 지질 농도에서 제조된 리포좀에서 감소하였다. 또한, 0.6 μm 및 0.7 μm의 리포좀 분획을 보다 높은 지질 농도에서 제조된 리포좀 제형에서 측정하였다 (도 2). 고농축 지질 용액의 에탄올 주힙 후, 더 큰 리포좀이 형성되었다. 형성된 리포좀의 총량은 지질 용액에서 낮은 지질 농도로 제조된 리포좀 제형과 비교하여 더 낮았다. 얻어진 결과는 3 회 측정한 입자량의 평균값을 나타냈다.

실시예 14: 여러 크기의 리포좀으로부터 RNA 리포플렉스의 제조

RNA 리포플렉스는 여러 가지 리포좀 전구체를 사용하여 실시예 4에 기술된 바와 같이 제조되었고, 여기서 그 형성을 위한 리포좀의 크기는 다양했으며, 다른 모든 파라미터는 고정되었다. 리포좀 크기 (z-평균) 및 다분산 지수 (PDI)는 실시 예 5 및 6에 기술된 바와 같이 동적 광산란 (DLS) 실험 과정에서 결정되었다.

RNA 리포플렉스 크기 (Z-평균)에 대한 리포좀 제조 (및 따라서 리포좀 전구체 크기)에 대한 지질 농도의 영향과 관련된 결과는 표 4 (아래) 및 상응하는 도 3 및 4에 제시되어 있다.

이 시험 시리즈에 따르면, 작은 리포좀에서 얻은 RNA 리포플렉스는 큰 리포좀에서 얻은 것보다 작다. 300 mM 이상의 용액으로 제조된 리포좀으로부터 얻어진 RNA 리포플렉스는 150 mM 스톡 용액으로부터 얻은 리포좀으로부터의 RNA 리포플렉스보다 약 2 배 더 크다. 더 큰 리포좀으로 제조된 모든 RNA 리포플렉스에서 리포좀 크기와 RNA 리포플렉스 크기 사이의 상관 관계는 발견되지 않았다 (도 3).

RNA-리포플렉스의 수득량은 그 형성에 사용된 리포좀의 크기에 따라 증가하였다. 더 큰 RNA-리포플렉스 입자량이 더 큰 리포좀으로 제조된 제형에서 더욱 높게 측정되어, 동적 광산란 측정으로부터 얻은 데이터를 확인해 주었다 (도 4). 얻어진 결과는 3 회 측정한 입자량의 평균값을 나타냈다.

실시예 15: 여러 리포플렉스로부터의 소각 X-선 산란 ( SAXS )

여러 가지로 농축된 스톡 용액으로부터의 리포좀으로부터 얻어진 RNA 리포플렉스로, 기술된 바와 같이 소각 X-선 산란 실험을 수행하였다. 예를 들어, RNA 리포플렉스는 DOTMA/DOPE 2/1 (mol/mol) 리포좀 및 1.3 내지 2의 전하 비의 RNA로부터 형성되었다. 리포솜은 100 mM, 300 mM 및 400 mM의 에탄올 중 지질 농도로부터, 기술된 바와 같이 에탄올 주입에 의해 제조되었다.

리포플렉스 형성을 위한 리포좀은 400 mM, 300 mM 및 100 mM의 에탄올 중 mM 지질 스톡 용액으로 얻어진, 충전 비 4/1로 (상단) 및 충전 비 1.3/2로 제조된 리포좀으로 형성된 RNA 리포플렉스로부터 소각 X-선 산란 측정으로부터 얻어진 회절 곡선이 도 5에 도시되어 있다.

산란 패턴은 약 1 nm^-1에서 단일 Bragg 피크를 포함한다. 이것은 과잉의 (음으로 하전된) RNA가 리포플렉스 형성에 사용되는 경우 비장 표적화 리포플렉스에 대한 전형적인 회절 패턴이다. 리포플렉스가 음으로 하전되지 않으면, 산란 프로파일은 완전히 다르다. 예로서, 훨씬 덜 두드러지는 피크가 발견된 경우, +/- 4/1 전하 비의 RNA 리포플렉스가 측정되었다, 또한 2 차 피크도 (강도는 낮지만) 식별할 수 있다. 실제로, 리포플렉스의 x-선 산란 프로파일의 일반적인 특징은 상의 상태에 따라 등거리를 갖고 다른 간격을 가질 수 있는 몇 개의 피크가 있다는 것이다. 반대로, 단 하나의 피크만 결정된다. 또한, 피크 폭은 리포좀 제조에 원래 사용된 스톡 용액의 농도에 따라 변한다. 에탄올 중의 농도가 높으면 피크 폭이 더 작다. Bragg 피크는 리포플렉스가 규칙적으로 정렬됨을 나타내며, 반복 거리 (d-스페이싱)는 피크 위치로부터 다음과 같이 주어지는데:

(1)

여기서, q는

로, 운동량 전이이고, n은 차수, q_max는 각각의 Bragg 피크의 최대 위치, λ는 파장, θ는 각도이다. Bragg 피크로부터 유도될 수있는 d-스페이싱은 6.5 nm 정도이다.

피크 폭, Δq는 스택의 반복 단위 수가 증가하면 감소한다. 액정 배열의 경우 상관 길이는 다음과 같이 주어질 수 있고:

(2)

여기서 리포플렉스 생성물의 경우, 산란 패턴과 상기 언급된 리포좀 제조를 위한 에탄올 중 지질 농도 및 생물학적 활성의 명확한 상관 관계가 유도될 수 있다. 피크 위치는 변하지 않지만, 피크 폭은 적용된 에탄올 중 지질 농도에 따라 단조롭게 변한다. 에탄올 중 지질 농도 증가 (리포좀 크기 증가로 이어짐)는 피크 폭 감소와 따라서 상관 길이 증가에 상응한다. 동시에, 생물학적 활성은 상관 길이가 증가함에 따라 증가한다. 따라서, 에탄올 중의 고농축 지질 스톡 용액이 제조에 사용된 리포좀으로부터 제조된, 개선된 활성을 갖는 기술된 리포플렉스는 명확한 구조적 특징에 의해 식별될 수 있다. 또한, 비대칭 장 유동 분별 (AF4)와 같은 다른 방법에 의해, 활성이 개선된 기술된 리포플렉스는 활성이 낮은 것으로부터 식별될 수 있다.

실시예 16: 인간 수지상 세포에서 RNA 리포플렉스의 형질 감염 효율

Luc-RNA 리포플렉스는 여러 리포좀 전구체를 사용하여 기술된 바와 같이 제조되었으며, 여기서 이들의 형성을 위한 리포좀의 크기는 다양하였고 (그 형성을 위한 출발 지질 농도를 변화시킴으로써), 다른 모든 파라미터는 고정되었다. 그 후, 여러 RNA 리포플렉스 제형의 RNA 형질 감염 효율을 배지 또는 전혈에 씨딩된 인간 수지상 세포에서 조사하였다.

루시퍼라아제 발현 및 여러 리포좀 전구체로 제조된 여러 RNA 리포플렉스의 상응하는 생물학적 활성을 측정함으로써 결정된 시험관내 형질 감염 효율 (인간 수지상 세포)을 나타내는 결과가 도 6에 도시되어 있다.

생물학적 활성 (시험관내 RNA 형질 감염)은 RNA 리포플렉스의 상관 길이와 함께 단조롭게 증가한다. 더 높은 상관 길이는 RNA 리포플렉스에서 보다 균일한 지질 이중층 군을 나타낸다.

실시예 17: 여러 리포플렉스의 비대칭 유동장 유동 분별

오늘날 현탁액에서 입자의 분별 및 분리를위한 일반적이고 최신의 방법인, 비대칭 유동장 유동 분별 (AF4)을 사용하여 RNA 리포플렉스의 추가적인 차이를 측정하였다. AF4 이론에 따르면, 비슷한 특성과 동일한 크기를 갖는 입자는 동시에 용출되어야 한다.

에탄올 중 150 mM 스톡 용액 또는 에탄올 중 400 mM 스톡 용액으로부터 제조된 두 가지 다른 유형의 리포좀으로부터의 리포플렉스의 AF4 측정과 관련된 일부 결과가 도 7에 도시되어 있다.

요약하면, 장-유동-분별 측정은 에탄올 중 150 mM 지질 농도의 리포좀으로부터의 리포플렉스가 400 mM 지질 농도로부터의 그것과는 질적 및 양적으로 다르다는 것을 입증한다. 150 mM 유래 리포플렉스는 더 작지만, 직관적으로, 나중에 용리되므로, 두 모이어티 사이에 질적 차이 (형태, 중간 상호 작용, 전하)가 있어야 한다. 150 mM 에탄올 용액으로부터의 RNA 리포플렉스는 비록 크기는 작지만 나중에 용리된다. 이는 에탄올 중 150 mM 지질 용액이 사용된 리포좀으로부터 제조된 리포좀으로부터의 RNA 리포플렉스가 에탄올 중 400 mM 지질로부터의 것보다 평균적으로 더 작다는 것을 나타낸다. 동일한 크기 일지라도 150 mm 유래 리포플렉스는 400 mM 유래된 것들과는 다른 물리화학적 특성을 갖는다. 이러한 크기 및 물리화학적 특성의 차이는 400 mM 유래 RNA 리포플렉스의 높은 생물학적 활성과 관련이 있다.

실시예 18: 시험관내 RNA 리포플렉스의 생물학적 활성

기술하였듯이 리포좀, 여러 지질 스톡 용액 및/또는 여러 지질 농도로부터 제조된 여러 크기의 루시퍼라아제-인코딩 RNA 리포플렉스를 이용한 세포 배양 형질 감염 실험 (수지상 세포)에 의하여 결정되듯이, 루시퍼라아제 신호 및 따라서 생물학적 활성은 지질 출발 농도에 따라 단조롭게 증가하고 따라서 RNA 리포플렉스 형성에 사용되는 리포좀 크기와 함께 단조롭게 증가한다. 해당 결과는 도 6, 8 및 9에 나와 있다.

요약하면, 리포좀 제조를 위해 더 높은 지질 농도로부터 생성된 RNA 리포플렉스는 시험관내에서 상당히 더 높은 활성을 나타낸다.

실시예 19: 생체내 RNA 리포플렉스의 생물학적 활성

여러 크기의 리포좀으로부터 제조된 루시퍼라아제-인코딩 RNA 리포플렉스를 사용한 세포 배양 형질 감염 실험 (수지상 세포)에 의해 결정되듯이, 더 큰 리포좀으로 제조된 RNA 리포플렉스는 현저히 높은 루시퍼라아제 발현 및 상응하는 생물학적 활성을 결과한다.

이 시험 시리즈의 비-제한적인 예시가 도 10 및 11에 도시되어 있다. 360 mM 생 콜로이드로부터의 더 큰 리포좀으로 제조된 RNA 리포플렉스는 200 mM 생 콜로이드로부터의 작은 RNA 리포플렉스보다 상당한 생체내 발현 신호를 유발시킨다.

실시예 20: RNA 리포플렉스의 자동화 제조

RNA 리포플렉스의 자동 뱃치 제조를 위해, 일반적으로 적용 가능한 절차가 개발되었으며, 이는 도 12에 도시되어 있다. 모든 단계는 사전-멸균된 단일 사용 유체 경로를 사용하여 수행되며, 물질의 안전한 무균 처리가 가능하다. 먼저, RNA의 농도를 리포좀 농도로 조정하고 RNA의 축합을 위해 NaCl을 첨가한다. 이에 의해, RNA 용액은 동일한 부피의 RNA 및 리포좀의 혼합을 허용하는 RNA 농도로 조정된다. RNA와 리포좀 용액은 대량-부피의 시린지로 옮겨지고 두 시린지는 시린지의 두 피스톤을 동시에 구동하는 단일 시린지 펌프에 장착됩니다. RNA 리포플렉스 형성 후, 동결방지제 용액을 첨가하고 약물 생성물의 최종 농도를 조정한다. 유리병에 약물 생성물을 충전한 후, 약물 생성물은 장기 저장을 위한 농축물로서 동결된다.

RNA 리포플렉스의 중요한 품질 속성은 RNA와 리포좀의 혼합 비에 의해 조정 된 전하 비이다. 혼합비의 효율적인 제어를 가능하게 하는 RNA 리포플렉스에 대한 자동화 및 확장 가능한 산업적 제조 공정이 개발되었다. 소규모 (≤ 10 리터)의 제조 공정에서, 리포좀 및 RNA를 함유하는 동일한 부피의 2 개의 수용액의 혼합 제어는 RNA 또는 리포좀으로 채워진 2 개의 대용량 시린지를 동시에 구동하는, 단일 퍼퓨저 펌프를 사용함으로써 달성된다. 가압 용기, 멤브레인 펌프, 기어 펌프, 자기 부상 펌프 또는 연동 펌프와 같은 대용량 (≥ 10 리터) 펌핑 시스템의 동등한 펌핑은 유량의 온라인-제어 및 실시간 조정을 위한 피드백-루프를 갖는 유량 센서와 함께 사용된다.

자동화된 RNA 리포플렉스 제조를 위해, RNA 및 리포좀을 함유하는 수용액의 효율적인 혼합을 보장하는 정적 혼합 요소가 필요하다. 서펜타인 (serpentine) 및 혼합 향상을 위한 내장 구조를 포함하는 상업적으로 이용 가능한 미세 유체 혼합 요소 및 비슷한 구조의 프로토타입 혼합 요소는 제조 과정에서 차단하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이들 혼합 요소는 RNA 리포플렉스의 자동화된 제조에 적합하지 않다. 1.2 내지 50.0 mm의 직경을 갖는 Y-형 및 T-형 혼합 요소가 RNA 리포플렉스의 자동화된 제조에 적합한 것으로 밝혀졌다.

방법: 여러 가지 혼합 요소 (표 1)를 사용하여 RNA 리포플렉스를 제조하였다. 리포플렉스의 제조 동안, 혼합 요소는 조작자에 의해 관찰되었고 재료의 침착 또는 막힘이 기록되었다.

결과: 시판되는 미세유동 칩 (NanoAssemblr^TM, Precision Nanosystems, Canada, Canada)으로는, 3 mL의 RNA 리포플렉스를 제조한 후 막힘이 관찰되었다. 또 다른 프로토타입 미세유동 혼합 요소의 시험 중에도 유사한 관찰이 이루어졌다 (표 5). 상업적으로 이용 가능한 혼합 요소와 비슷한 구조를 포함하는 모든 (미세) 유동 혼합 요소에 대하여 침착 및 특히 요소의 차단이 관찰될 수 있었던 반면에, Y-형 또는 T-형 혼합 요소를 사용할 때 이러한 어떠한 관찰도 없었다. 직경이 2.4 mm 인 설명된 y-형 혼합 요소 이외에, 더 큰 직경을 갖는 혼합 요소가 시험되었다. Y-타입 혼합 요소의 직경에 대한 제한이 발견되지 않았기 때문에, 설명된 방법은 y-타입 혼합 요소의 직경이 최대 50 mm인 RNA 리포플렉스의 제조에 적합한 것으로 생각된다.

Y-형 또는 T-형 혼합 요소를 사용하는 경우, 충분한 혼합을 달성하기 위해 최소 유량이 요구된다. RNA 리포플렉스 제조는 내경이 1.6 내지 50 mm 인 Y-형 또는 T-형 혼합 요소를 사용하여 RNA 및 리포좀을 함유하는 2 개의 수용액을 혼합함으로써 수행될 수 있다. 혼합을 위한 유량으로부터 결과하는 레이놀즈 수는 효율적인 혼합을 보장하기 위해 약 300보다 낮아서는 아니된다. 유량 대 혼합 요소의 직경 비는 효율적인 혼합을 보장하기 위해 약 150보다 낮아서는 아니된다. 최대 약 2100의 레이놀즈 수를 실험적으로 테스트했으며 자동화된 제조에 적합한 것으로 밝혀졌다. 데이터는 더 높은 유량도 가능함을 지원한다. 이는, 레이놀즈 수 2100에서 조건이 이미 난류 모드에 있었으며 따라서 더 높은 유량에서도 유사한 혼합 조건이 예상된다는 사실에서 비롯된다.

방법: 단일 퍼퓨저 펌프를 사용하여 RNA 용액 및 리포좀 용액을 펌핑함으로써 RNA 리포플렉스를 제조하였다. RNA 리포플렉스 형성은 2.4 및 3.2 mm의 내경을 포함하는 대표적인 Y-형 혼합 요소로 수행되었다. RNA 리포플렉스의 입자 크기와 다분산도는 광자 상관 분광학 (PCS) 측정에 의해 분석되었다. 조사된 유량과 혼합 요소의 직경의 조합으로부터 결과하는 레이놀즈 수는 이론적으로 식 (도 13)을 사용하여 계산되었다. 유량 대 혼합 요소의 직경 비는 유량 (cm³/분)을 혼합 요소의 직경 (cm)으로 나눔으로써 계산되었다. 인자는 차원이 없는 수로 주어진다.

결과: 이론적으로 계산된 레이놀즈 수 약 300 미만을 결과하는 유량 및 혼합 요소 조합으로 RNA 리포플렉스를 제조할 때, 증가된 입자 크기 및 다분산도를 갖는 RNA 리포플렉스가 형성된다 (도 13 및 표 6). 원하는 입자 특성으로 RNA 리포플렉스의 재현 가능한 형성을 보장하기 위해, 이론적으로 레이놀즈 수는 최소 약 300이어야 하고 (도 13 및 14 및 표 6)과 유량 대 혼합 요소 직경 비는 최소 약 150이어야 한다. 2.4 mm 혼합 요소는 광범위한 유량 (60 내지 240 mL/분)에서 RNA 및 리포좀의 효율적이고 재현 가능한 혼합을 가능하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이들 연구 중 상한이 발견되지 않았으므로, 레이놀즈 수, 또는 유량 대 혼합 요소의 직경 비의 상한은 예상되지 않는다.

실시예 21: RNA 농도의 영향

RNA 리포플렉스는 대표적인 수치 (2.4 mm)를 갖는 y-형 혼합 요소로 제조되었다. 현재 셋업에서 RNA 리포플렉스가 제조될 수 있는 농도 범위를 확인하기 위해, RNA 농도를 0.05 mg/mL 내지 0.5 mg/mL로 체계적으로 변화시켰다. 형성된 리포플렉스의 안정성을 조사하기 위해, 최종 제형을 0.05 mg/mL RNA, 22% 수크로오스 및 20 mM NaCl로 조정하고 제형을 3 회 동결시켰다.

RNA 리포플렉스 형성 중 0.1 내지 0.5 mg/mL의 RNA 농도에서의 RNA 리포플렉스 형성은 유사한 입자 특성을 결과한다 (도 15). 이러한 입자의 입자 특성은 또한 3 회 동결시에도 보존되어 RNA 농도의 변화와 관련하여 매우 강인한 (robust) 제조 공정을 나타낸다 (도 16). RNA 리포플렉스 제조 중 RNA 농도의 한계에 대한 힌트가 없기 때문에, 기술된 셋업은 최대 5 mg/mL의 RNA 농도에서 RNA 리포플렉스 제조에 적합한 것으로 간주된다.

RNA 리포플렉스의 자동화된 제조를 위한 기술된 공정은 여러 전하 비를 갖는 안정한 RNA 리포플렉스의 재현 가능한 제조를 가능하게 한다.

방법: 전하 비와 관련하여 RNA 리포플렉스의 반자동 제조의 강인함을 입증하기 위해, 이 파라미터를 1.0:2.0 내지 2.1:2.0 및 2.0:1.0 내지 5.0:1.0으로 체계적으로 변화시켰다. RNA 리포플렉스의 입자 크기와 다분산도는 광자 상관 분광학 (PCS) 측정에 의해 분석되었다.

결과: RNA 리포플렉스 크기와 다분산도에 대한 전하 비 변화의 영향은 1.0:2.0과 2.1:2.0의 전하 비 간에는 발견되지 않았다 (도 17). 따라서, 1.0:2.0 내지 2.1:2.0 사이의 범위는 동등한 품질을 갖는 RNA 리포플렉스 제제를 생성하는 것으로 간주된다. 또한, 정교한 크기 및 다분산도를 갖는 안정한 입자가 3.0:1.0 내지 5.0:1.0의 전하 비 사이에서 형성되었다 (도 18).

실시예 22: RNA 리포플렉스 형성 중 염 농도

높은 생물학적 활성을 포함하는 RNA 리포플렉스의 자동화된 제조를 위해, RNA 리포플렉스 형성 중 제어된 이온 조건이 요구된다. 생물학적 활성을 보장하기 위해, 45 내지 300 mM NaCl의 존재하에 RNA 리포플렉스 형성이 수행되어야 한다. 다른 이온성 화합물 예컨대 EDTA, HEPES 등은 이온 강도에 영향을 미치고 NaCl의 최소 필요 농도를 감소시킬 수 있다.

방법: RNA 리포플렉스 형성 중 여러 농도의 NaCl로 RNA 리포플렉스를 자동화 제조하였다. RNA 리포플렉스의 입자 크기와 다분산도는 광자 상관 분광학 (PCS) 측정에 의해 분석되었다. 또한, 시험관내에서 루시퍼라아제 신호를 측정함으로써 리포플렉스의 생체 활성을 조사하였다.

결과: 이온 특성을 조정하여 입자 특성을 제어할 수 있다. 제조 중 염 농도가 증가하면 약간의 입자 크기 증가를 유도하였다 (도 19). 염 농도는 생물 활성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 제조 과정 중 염 농도가 증가하면 생물 활성 증가를 유도하였다 (도 20). 따라서, RNA 리포플렉스 형성 중 NaCl 농도는 45 mM NaCl보다 낮아서는 아니된다.

실시예 23: RNA 리포플렉스의 안정화

pH 5.5 내지 6.7의 pH 범위에서 리포플렉스 내 RNA 안정화를 위한 HEPES, 아세트산/소듐 아세테이트 및 소듐 포스페이트와 같은 완충제 시스템이 동결방지제의 존재 및 부재 하에서 RNA 리포플렉스 내 RNA의 안정화를 위해 사용될 수 있다. 소듐 카보네이트 시스템은 비슷한 안정화 효능을 나타내지 않는 것으로 밝혀졌다.

방법: 최적 pH 범위 조사 및 여러 pH-범위를 아우르는 여러 가지 완충 제제 (HEPES pH 6.8-8.2, 아세트산/소듐 아세테이트 pH 3.7-5.6, 소듐 포스페이트 pH 5.8-8.0 및 소듐 카보네이트 pH 6.2-8.6)의 적합성 시험. RNA 리포플렉스는 처음에는 동결방지제가 없는 스트레스 조건 (40℃) 하에 배양된다. RNA 완전성은 21 일에 걸쳐 모세관 전기 영동에 의해 분석되었다. 예시적인 동결방지제의 존재하에서 최적의 pH 범위를 조사하기 위해, RNA 리포플렉스를 HEPES 및 수크로오스의 존재하에 40℃에서 인큐베이션하고 RNA 완전성을 21 일 동안 분석하였다.

결과: 완충 시스템 HEPES, 아세트산/소듐 아세테이트 및 소듐 포스페이트에 대해 비슷한 결과가 얻어졌지만, 카보네이트 시스템은 RNA의 비슷한 안정화를 결과하지 않았다 (도 21). RNA 완전성은 제형의 pH 값에 의존한다. 최적 pH 범위는 pH 5.5 내지 7.4 사이인 것으로 확인되었다. 예시적인 동결방지제 수크로오스의 존재하에, RNA의 최상의 안정화를 결과하는 pH 5.5 내지 8.0의 pH 범위가 확인되었다 (도 22).

2가 금속 이온은 RNA 합성 공정, 제형 부형제 또는 유리 용기에서 발생할 수 있으며 RNA 안정성에 영향을 줄 수 있다. EDTA 디소듐 염은 알칼리 토금속 이온 및 중금속 이온과 안정적인 수용성 복합체를 형성한다. EDTA 디소듐 염은 RNA 리포플렉스 형성 중 존재하는 이온의 농도에 기여하며, 이에 의해 생활성 RNA 리포플렉스의 제조에 필요한 NaCl의 농도를 감소시킨다. EDTA (0 내지 20 mM)의 존재하에 RNA 리포플렉스 형성은 기술된 방법으로 가능하다.

방법: 증가하는 EDTA 농도 (최대 18 mM)의 존재하에 RNA 리포플렉스를 형성하였고, 감소된 EDTA 함량 (0.1 mM 내지 5.4 mM)으로 희석하여 40℃에서 인큐베이션하였다. RNA 완전성은 주요 물리화학적 파라미터로서 21 일에 걸쳐 분석되었다.

결과: 고농도의 EDTA (최대 18mM)의 존재하에 RNA 리포플렉스의 형성은 더 낮은 농도의 존재하의 제조와 동등한 입자 특성을 결과하는 것으로 밝혀졌다. 저장 중에 0.01% (w:v) (0.1 mM) 내지 0.2% (w:v) (5.4 mM) EDTA를 함유하는 여러 그룹들 간에 유의한 차이는 밝혀지지 않았다. EDTA 디소듐 염이 RNA 리포플렉스 형성중에 존재하는 이온의 농도에 기여하고 RNA 완전성을 잠재적으로 감소시키는 2가 금속 이온에 대한 제거제로서 작용할 수 있기 때문에, RNA 리포플렉스 형성 중에 최대 20 mM의 EDTA 농도의 존재가 유리한 것으로 간주된다.

실시예 24: NaCl 및 동결방지제 함량의 최적화

조정된 이온 조건은 RNA 리포플렉스 제조, 장기 보관 및 환자에게 적용하는 중에 조정될 필요가 있다 (도 24). NaCl의 농도는 RNA 리포플렉스의 형성 중에 45 내지 300 mM일 수 있으며; 동결된 상태에서 RNA 리포플렉스를 장기간 저장하는 동안 10 내지 50 mM; 및 해동 및 염 용액으로 희석 후 80 내지 150 mM일 수 있다.

≤70 mM의 각 NaCl 농도에 대해, 다수의 동결시 입자 특성의 안정화를 보장하기 위하여 그 이하여서는 아니되는 각각의 동결방지제 함량이 밝혀졌다. 동결방지제는 12.5 내지 35.0% (w:v) 농도로 모노- 및 2 분자 당, 예컨대 글루코오스, 수크로오스, 만니톨, 트레할로스, 소르비톨, 글리세린으로서의 트리올 및 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 소르비톨의 안정화 효능은 후자의 화합물과 비교할 때 낮고 아르기닌은 동결 중에 RNA 리포플렉스를 효과적으로 안정화시키지 못한다.

방법: 적합한 동결방지제를 식별하기 위해 단당류 (포도당 및 소르비톨), 이당류 (수크로오스 및 트레할로스), 아미노산 (아르기닌, 프롤린), 트리올 (글리세린)을 대표하는 여러 화합물들 뿐만 아니라 다른 당 (만니톨 및 수크로오스)의 혼합물을 함유하는 동결방지제 시스템을 조사하였다 (도 25 및 26). 따라서, RNA 리포플렉스는 이들 화합물의 농도를 증가시키며 동결되었다. NaCl 특정 농도에서 동결방지제의 최소 함량을 확인하기 위해, 대표적인 동결방지제로서 수크로오스 또는 트레할로스의 양을 증가시키며 RNA 리포플렉스를 동결시켰다 (표 7). 조사될 동결방지제의 농도 범위를 자세히 결정하기 위해 샘플을 초기에 1 회 동결시켰다. 세 번째 실험에서, 동결방지제 트레할로스의 존재하에서 RNA 리포플렉스를 10 배까지 동결시킴으로써 입자 크기의 안정화 효능에 도전하였다 (표 8).

결과: 아르기닌이 RNA 리포플렉스를 명확하게 불안정화시키는 반면, 다른 동결방지제는 일반적으로 동결 중에 RNA 리포플렉스의 안정화에 적용 가능하다 (도 25 및 26). 글리세린, 만니톨 및 수크로오스 (1:1, w:w), 프롤린 및 소르비톨은 RNA 리포플렉스에 대한 동결방지제로 사용될 수 있다. 아르기닌 이외에, 추가로 시험된 모든 안정화제는 적합한 것으로 보이며, 광범위한 아미노산, 당 및 이러한 화합물의 혼합물이 동결 중에 RNA 리포플렉스의 안정화에 적합하다는 것을 나타낸다. 소르비톨의 안정화 효능은 후자의 화합물과 비교할 때 더 낮다.

각 NaCl 농도에서 동결방지제의 필요량을 자세히 조사할 때 (표 8), 단일 동결 단계 후에, NaCl 농도와 동결방지제의 필요한 농도 사이의 직접적인 상관 관계가 밝혀졌다 (도 27 및 28). 20% (w:v) 수크로오스 또는 트레할로스 이수화물로 0 내지 60 mM의 NaCl의 단일 동결 단계 후에, 용인되는 입자 크기의 보존이 밝혀졌지만, 낮은 동결방지제 %에서 불충분한 안정화가 밝혀졌다 (예를 들어, 60 mM NaCl의 경우 ≤15%; 40 mM NaCl의 경우 ≤10%; 20 mM NaCl의 경우 ≤5%). 조사된 범위 내에서 수쿠로오스와 트레할로스 사이에는 차이가 없었다.

표 9.3.2에 나타낸 NaCl 및 트레할로스의 조합의 존재하에 1, 2, 3, 5 및 10 회 동결 후 RNA 리포플렉스의 입자 크기를 분석할 때, 다음 결과가 얻어졌다. 50 mM NaCl 농도에서, ≥12.5% 트레할로스는 10 회 동결 후에도 RNA 리포플렉스 입자 특성을 안정화하기에 충분했지만 (도 29), NaCl 70mM에서, 최소 안정화를 위해 ≥12.5%이 필요했고, ≥22.5% 이상이 입자 크기를 정확하게 보존하는데 필요하였다 (도 30). 90 mM NaCl에서 최소 안정화를 위해서는 ≥15.0%의 트레할로스가 필요했으며, 최고 조사 농도 27.5%에서도 입자 크기를 정확하게 보존할 수 없었다 (도 31).

실시예 25: 장기간 저장을 위한 염 및 동결방지제의 조합

주어진 온도에서 장기간 보관을 위하여, 표 9에 나열된 NaCl과 동결방지제의 조합이 사용되어야 한다.

방법:

NaCl 특정 농도에서 -15 내지 -30℃에서 장기 저장을 위한 동결방지제의 최소 함량을 조사하기 위해, RNA 리포플렉스를 NaCl과 수크로오스 또는 트레할로스 둘 중 하나의 조합의 존재하에 동결시켰다. 샘플을 -30℃에서 동결시킨 다음 장기간 보관을 위하여 각각의 온도로 옮겼다 (-15 또는 -30℃). 정의된 저장 시간 후, 샘플을 분석하고 PCS를 사용하여 입자 크기를 측정함으로써 콜로이드 안정성의 보존을 분석하였다.

결과: RNA 리포플렉스의 입자 특성이 최대 70 mM NaCl의 존재하에 동결 중에 보존될 수 있는 반면, 콜로이드 안정성의 불안정화의 원인이 되는 추가적인 효과는 이들 실험에서 관찰될 수 있다. 예컨대 60 mM NaCl 및 20% 수크로오스의 조합에 대해 동결 후, 용인되는 입자 특성의 안정화 또한 확인되었고, 시간이 지남에 따라 이들 제형의 입자 크기는 -15℃의 저장 온도에서 상당히 증가하였다 (도 32 및 33). 이러한 효과는 -30℃에서 보관할 때 감소하였다 (도 34 및 35).

주어진 NaCl 함량에서 RNA 리포플렉스의 안정성은 동결방지제의 양에 의존한다. 저장 용액 내 염 함량이 증가함에 따라 안정화에 필요한 동결방지제의 양이 증가한다. 이 효과는 동결방지제로 사용되는 당 유형과 무관하다. -15 또는 -30℃에서 동결 상태로 장기간 보관하기 위한 RNA 리포플렉스의 조성은 표 9에 나열된 동결방지제 함량을 포함해야 한다.

실시예 26: 여러 가지 동결방지제를 사용한 장기 저장

22% (w:v) 모노- 또는 이분자 당의 존재하에서 9 개월 이상의 안정화는 10 내지 40 mM NaCl로 가능하다. 이들 제형은 -15 내지 -40℃에서 동결될 수 있으며 장기 보관을 위해 각 온도에서 유지될 수 있다. 12.6 내지 16.8% (w:v) 덱스트란의 존재하에, 10 내지 30 mM NaCl이 가능하다.

방법: -20℃에서 장기 보관에 필요한 대표적인 동결방지제, 예컨대 수크로오스, 트레할로스, 글루코오스 및 덱스트란을 포함하는 혼합물의 최소 함량을 조사하기 위해, RNA 리포플렉스를 다양한 NaCl 농도와 조합하여 고정된 동결방지제 함량으로 동결시켰다. 단량체 또는 이량체 분자 동결방지제, 예컨대 글루코오스, 수크로오스 및 트레할로스에 대해 22% (w:v)의 농도가 조정되었다. 이들 제형을 동결시키고 -15 내지 -40℃에서 보관하고, 정의된 저장 시간 후 PCS를 사용하여 입자 크기를 측정함으로써 장기 안정성을 조사하였다.

중합체 덱스트란의 혼합물을 함유하는 제형의 경우, 표 9.5.1에 열거된 조성을 조정하였다. 샘플을 동결시키고 -20℃에서 보관하였다. 정의된 저장 시간 후, 샘플을 분석하고 입자 크기를 측정함으로써 콜로이드 안정성의 보존을 분석하였다.

결과: 모든 조사된 단량체 또는 이량체 분자 동결방지제에 대해, 동결된 상태에서 RNA 리포플렉스의 장기간 안정화를 보장하기 위해 초과해서는 아니되는 최대 NaCl 농도가 밝혀졌다. 60 및 80 mM의 NaCl이 리포플렉스의 빠른 불안정화를 초래한 반면, -20℃에서 저장시 NaCl 농도가 ≤40 mM인 경우 콜로이드 특성은 최소 9 개월 동안 보존될 수 있었다 (표 10 및 도 36 내지 38). 수크로오스, 트레할로스 및 글루코오스에 대한 안정화 효능의 차이는 발견되지 않았다. 20 mM NaCl을 포함하는 제형의 경우, 샘플이 동결되고 -15 내지 -40℃에서 보관될 때 장기간 안정성의 차이는 발견되지 않았다 (도 39).

덱스트란을 함유한 제형이 더 낮은 동결방지제 함량 (12.6 내지 16.8% (w:v))으로 조사되었을 때, 안정화 효능은 모노- 또는 이분자 당과 비교할 때 비슷하거나 더 우수하다 (도 40).

실시예 27: 동결-건조

a) 동결 해동

가장 효과적인 동결/동결방지제 농도를 결정하기 위해 동결-해동 연구가 수행되었다. RNA 리포플렉스 제형을, 10%, 15%, 20%, 25% 및 30% 트레할로스를 첨가하며 5 mM HEPES, 80 mM NaCl, 2.6 mM EDTA에서 동결-해동시켰다. -20℃에서 보관 전후에 입자 크기를 측정하였다. 트레할로스가 없는 동결 제형에서 입자 응집이 관찰되었으며, 그들의 입자 크기는 측정되지 않았다. 도 41에 따르면, 동결방지제/동결건조방지제로 동결된 제형은 농도 의존적 동결방지를 나타냈으며, 입자 크기는 동결건조방지제/동결방지제 농도가 낮을수록 증가하였다. 22% w/v 트레할로스에서, Sf/Si (Sf = 최종 크기, Si = 최초 크기) 1.04로, 입자 크기의 최소 증가만이 관찰되었으며, 1.3 미만인 것은 여전히 허용 가능한 것으로 간주된다. 더 낮은 트레할로스 농도에서, Sf/Si 비는 더 높았다. 동결-해동 연구로부터 얻어진 Sf/Si 비는 동결-건조 및 재구성 후 동일한 제형으로부터 얻어진 Sf/Si 비와 상관 관계가 있었다.

b) 재구성 및 입자 안정성

5 mM HEPES, 2.6 mM EDTA, 0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 80 mM NaCl 및 5%, 10%, 15% 및 22% 트레할로스에서 제조된 RNA 리포플렉스 제형이 동결-건조되었다. 동결-건조된 모든 샘플은 양호한 케이크 외관을 나타냈다. 샘플을 0.9% NaCl 용액을 사용하여 원래 부피로 재구성하였다. 모든 동결-건조된 RNA 리포플렉스 제형은 0.9% NaCl 용액 또는 WFI로 재구성시 즉시 용해되었다. 0.9% NaCl 용액 또는 물로 재구성한 후 22% 트레할로스에서 제조된 동결-건조된 RNA 리포플렉스 제형의 입자 크기 변화를 측정하였다.

도 42에 따르면, 입자 크기는, 동결-건조 및 재구성 후, 트레할로스를 함유하는 모든 동결-건조된 RNA 리포플렉스 제형에서 안정적으로 유지되었다. 물로 재구성된 동결-건조된 샘플과 비교하여, 동결-건조된 샘플을 0.9% NaCl로 재구성할 때 RNA 리포플렉스의 크기가 약간 감소하는 것이 관찰되었다. NaCl 대 트레할로스 비율과 입자 안정성 사이의 상관 관계가 관찰되었다. 더 낮은 농도의 트레할로스 및 더 높은 NaCl 농도에서 제조된 제형에서 RNA 리포플렉스 입자의 크기는 증가하였다.

c) 동결-건조된 RNA 리포플렉스 제형을 이용한 세포 배양 실험

여러 NaCl 농도에서 22% 트레할로스로 제조된 동결-건조된 루시퍼라아제-인코딩 RNA 리포플렉스 제형의 시험관내 형질 감염 실험을 수행하였다. 동결-건조된 샘플을 0.9% NaCl 용액으로 재구성하였다.

도 43에 따르면, 22% 트레할로스 및 여러 가지 NaCl 농도에서 제조된 동결-건조된 RNA 리포플렉스 제형은 수지상 세포에서 유사한 luc-RNA 형질 감염 수준을 나타냈다. RNA 리포플렉스 제형에 존재하는 NaCl 농도와 시험관내 RNA 형질 감염 사이의 상관 관계는 발견되지 않았다. 동결-건조된 샘플은 새로운 RNA 리포플렉스 대조군과 비교하여 유사하거나 심지어 더 우수한 luc-RNA 형질 감염을 나타냈다.

d) 안정성 연구

10% 트레할로스, 22% 트레할로스 및 0 mM, 20 mM, 40 mM, 60 mM 및 80 mM NaCl을 함유하는 동결-건조된 RNA 리포플렉스 제형을 4℃, 25℃ 및 40℃에서의 안정성 연구로 조사하였다 (1 개월 내지 6 개월). 0.9% NaCl 용액을 이용하여 원래 부피로 재구성한 후, 샘플은 입자 크기 및 RNA 완전성 (% 전장 RNA)에 대해 특징화되었다.

도 44 및 45에 따르면, 여러 RNA 리포플렉스의 크기는 제형 또는 저장 온도와 독립적으로 시간에 따라 크게 변하지 않았다. 흥미롭게도, 동결-건조된 제형에서 입자 안정성을 유지하기 위해서는 더 적은 양의 동결방지제 (예를 들어, 10%)가 충분하지만, 동결된 제형의 경우에는 더 많은 양 (예를 들어, 22%)이 필요하다. 4℃에서 6 개월 저장 후 동결-건조된 샘플에서 RNA 완전성 (% 전장 RNA)은 94%와 100% 사이에서 변화하였고, 25℃에서 저장된 RNA(lip) 제형의 경우 85%와 94% 사이에서 변화하였다. 그러나, 트레할로스 대 NaCl 농도 비 또는 저장 시간과의 상관 관계는 확인되지 않았다.

Claims

에탄올 중의 지질 용액을 수성 상으로 주입하여 리포좀 콜로이드를 제조하는 단계를 포함하는 리포좀 콜로이드를 제조하는 방법으로서,
지질 용액 내 지질 중 하나 이상의 농도는 에탄올 중의 하나 이상의 지질의 평형 용해도에 대응하거나 그보다 높은 방법.
제1항에 있어서, 지질 용액은 2 이상의 상이한 지질로 이루어진 혼합물의 용액인 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 지질 용액 내 하나의 지질의 농도는 실온에서 에탄올 중의 지질의 평형 용해도에 대응하거나 그보다 높은 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 지질 용액 내 총 지질 농도는 약 180 mM 내지 약 600 mM, 약 300 mM 내지 약 600 mM, 또는 약 330 mM인 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 지질 용액은 1종 이상의 양이온성 지질 및 1종 이상의 추가적인 지질을 포함하는 것인 방법.
제5항에 있어서, 지질 용액 내 추가적인 지질의 농도는 에탄올 중 추가적인 지질의 평형 용해도에 대응하거나 그보다 높은 것인 방법.
제5항 또는 제6항에 있어서, 1종 이상의 양이온성 지질은 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA) 및/또는 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP)을 포함하는 것인 방법.
제5항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1종 이상의 추가적인 지질은 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 콜레스테롤 (Chol) 및/또는 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC)을 포함하는 것인 방법.
제5항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1종 이상의 양이온성 지질은 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA)을 포함하고, 1종 이상의 추가적인 지질은 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)을 포함하는 것인 방법.
제5항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1종 이상의 양이온성 지질 대 1종 이상의 추가적인 지질의 몰 비는 약 10:0 내지 약 1:9, 약 4:1 내지 약 1:2, 약 3:1 내지 1:1, 또는 약 2:1인 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 지질 용액은 DOTMA 및 DOPE를 약 10:0 내지 약 1:9, 약 4:1 내지 약 1:2, 약 3:1 내지 약 1:1, 또는 약 2:1의 몰 비로 포함하는 것인 방법.
제8항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 지질 용액 내 DOPE의 농도는 약 60 mM 이상, 또는 약 90 mM 이상인 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 지질 용액은 약 50 rpm 내지 약 150 rpm의 수성 상의 교반 속도로 수성 상으로 주입되는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 수성 상은 물인 것인 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 리포좀 콜로이드를 교반하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리포좀 콜로이드는 약 15 분 내지 약 60 분, 또는 약 30 분 동안 교반되는 것인 방법.
에탄올 중 DOTMA 및 DOPE를 약 2:1의 몰 비로 포함하는 지질 용액을 약 150 rpm의 교반 속도로 교반되는 물로 주입하여 리포좀 콜로이드를 제조하는 리포좀 콜로이드를 제조하는 방법으로서,
지질 용액 내 DOTMA 및 DOPE의 농도는 약 330 mM인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의하여 얻을 수 있는 리포좀 콜로이드.
제18항에 있어서, 리포좀은 약 250 nm 이상의 평균 직경을 갖는 것인 리포좀 콜로이드.
제18항 또는 제19항에 있어서, 리포좀은 약 250 nm 내지 약 800 nm 범위인 평균 직경을 갖는 것인 리포좀 콜로이드.
제18항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리포좀은 양이온성 리포좀인 것인 리포좀 콜로이드.
제18항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리포좀은 1종 이상의 양이온성 지질 및 1종 이상의 추가적인 지질을 포함하는 것인 리포좀 콜로이드.
제22항에 있어서, 1종 이상의 양이온성 지질은 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA) 및/또는 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP)을 포함하는 것인 리포좀 콜로이드.
제22항 또는 제23항에 있어서, 1종 이상의 추가적인 지질은 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 콜레스테롤 (Chol) 및/또는 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC)을 포함하는 것인 리포좀 콜로이드.
제22항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1종 이상의 양이온성 지질은 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA)을 포함하고, 1종 이상의 추가적인 지질은 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)을 포함하는 것인 리포좀 콜로이드.
제22항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1종 이상의 양이온성 지질 대 1종 이상의 추가적인 지질의 몰 비는 약 10:0 내지 약 1:9, 약 4:1 내지 약 1:2, 약 3:1 내지 약 1:1, 또는 약 2:1인 것인 리포좀 콜로이드.
제18항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리포좀은 DOTMA 및 DOPE를 약 10:0 내지 약 1:9, 약 4:1 내지 약 1:2, 약 3:1 내지 약 1:1, 또는 약 2:1의 몰 비로 포함하는 것인 리포좀 콜로이드.
제18항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 기재된 리포좀 콜로이드를 RNA를 포함하는 용액에 첨가하는 단계를 포함하는 RNA 리포플렉스 입자를 제조하는 방법.
RNA 및 양이온성 리포좀의 제어된 혼합 조건 하에서,
RNA를 포함하는 용액 및
양이온성 리포좀을 포함하는 용액을 혼합하는 단계를 포함하는 RNA 리포플렉스 입자의 연속적 유동 제조 방법.
제29항에 있어서, 양이온성 리포좀을 포함하는 용액은 제18항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 기재된 리포좀 콜로이드인 것인 방법.
제29항 또는 제30항에 있어서, RNA를 포함하는 용액 및 양이온성 리포좀을 포함하는 용액은 수성 용액인 것인 방법.
제29항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, RNA를 포함하는 용액 및 양이온성 리포좀을 포함하는 용액의 혼합을 허용하는 유량이 사용되는 것인 방법.
제29항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 흐름은 300보다 큰, 또는 약 500 내지 약 2200의 레이놀즈 수 (Reynolds number)를 특징으로 하는 것인 방법.
제9항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제어된 혼합 조건은 RNA를 포함하는 용액 및 양이온성 리포좀을 포함하는 용액의 혼합 비를 조절하는 것을 포함하는 것인 방법.
제29항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제어된 혼합 조건은, 혼합될 RNA를 포함하는 용액 및 양이온성 리포좀을 포함하는 용액의 상대적인 부피를 조절하는 것을 포함하는 것인 방법.
제29항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, RNA 및 양이온성 리포좀의 혼합 비는 RNA를 포함하는 용액 및 양이온성 리포좀을 포함하는 용액의 동일한 혼합 부피 (v/v)를 이용하고, 각각의 용액 내 RNA 및 양이온성 리포좀의 농도를 조정하는 것에 의하여 조절되는 것인 방법.
제29항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제어된 혼합 조건은, 막힘 (clogging)을 회피하면서 RNA 리포플렉스 입자의 특징을 유지하도록 선택되는 것인 방법.
제29항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 Y-형 또는 T-형 혼합 요소를 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.
제29항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, Y-형 또는 T-형 혼합 요소는 약 1.2 mm 내지 약 50 mm의 직경을 갖는 것인 방법.
제29항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은, 하나는 양이온성 리포좀을 포함하는 용액을 포함하고 하나는 RNA를 포함하는 용액을 포함하는 2 개의 시린지가 동일한 펌프 내로 병렬적으로 삽입된 시린지 펌프를 이용하는 것을 포함하는 것인 방법.
제29항 내지 제40항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은, 임의로 유량의 온라인-제어 및 실시간 조정을 위한 피드백-루프를 갖는 유량 센서와 함께 가압 용기, 멤브레인 펌프, 기어 펌프, 자기 부상 펌프 또는 연동 펌프를 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.
제29항 내지 제41항 중 어느 하나의 항에 있어서, RNA를 포함하는 용액 및 리포좀을 포함하는 용액의 혼합물은 소듐 클로라이드를 약 45 mM 내지 약 300 mM 농도로 포함하거나, 또는 약 45 mM 내지 약 300 mM 농도의 소듐 클로라이드에 대응하는 이온 강도로 포함하는 것인 방법.
제29항 내지 제42항 중 어느 하나의 항에 있어서, RNA를 포함하는 용액 및 리포좀을 포함하는 용액의 혼합물은 약 50 mM 이상의 이온 강도를 갖는 것인 방법.
제28항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 있어서, X-선 산란 패턴에 있어서 RNA 리포플렉스는 약 1 nm^-1에서 단일 Bragg 피크로 특징지어 지고, 피크 폭은 0.2 nm^-1보다 작은 것인 방법.
제28항 내지 제44항 중 어느 하나의 항에 있어서, RNA 리포플렉스 입자는 약 200 내지 약 800 nm, 약 250 내지 약 700 nm, 약 400 내지 약 600 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 350 nm 내지 400 nm 범위인 평균 직경을 갖는 것인 방법.
(i) RNA 리포플렉스 입자 및 안정화제를 포함하는 수성 조성물을 제공하는 단계 및
(ii) 조성물을 동결하는 단계
를 포함하는 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 동결된 조성물을 제조하는 방법.
제46항에 있어서, 동결은 약 -15℃ 내지 약 -40℃, 또는 약 -30℃ 온도에서인 것인 방법.
제47항에 있어서, 안정화제는 단당류, 이당류, 삼당류, 당 알코올, 올리고당류 또는 그의 대응하는 당 알코올, 및 직쇄 폴리알코올 중에서 선택되는 탄수화물인 것인 방법.
제46항 내지 제48항 중 어느 하나의 항에 있어서, RNA 리포플렉스 입자 및 안정화제를 포함하는 수성 조성물을 제공하는 단계는 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물을 제공하고 안정화제를 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물에 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
제46항 내지 제49항 중 어느 하나의 항에 있어서, RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물에 안정화제를 첨가하는 것은 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물의 이온 상도를 감소시키는 것인 방법.
제46항 내지 제50항 중 어느 하나의 항에 있어서, RNA 리포플렉스 입자 및 안정화제를 포함하는 수성 조성물 내 안정화제의 농도는 생리학적 삼투질 농도에 필요한 값보다 높은 것인 방법.
제46항 내지 제51항 중 어느 하나의 항에 있어서, RNA 리포플렉스 및 안정화제를 포함하는 수성 조성물 내 안정화제의 농도는 RNA 리포플렉스 입자의 품질을 유지하고, 특히 약 -15℃ 내지 약 -40℃의 온도에서 약 1 개월 이상, 약 6 개월 이상, 약 12 개월 이상, 약 24 개월 이상 또는 약 36 개월 이상 동안 조성물의 보관 후 RNA 활성의 실질적 손실을 회피하기에 충분한 것인 방법.
제46항 내지 제52항 중 어느 하나의 항에 있어서, RNA 리포플렉스 및 안정화제를 포함하는 수성 조성물 내 pH는 RNA 보관에 최적인 통상의 pH보다 낮은 것인 방법.
제46항 내지 제53항 중 어느 하나의 항에 있어서, RNA 리포플렉스 및 안정화제를 포함하는 수성 조성물은 소듐 클로라이드를 약 10 mM 내지 약 50 mM 농도로 포함하거나, 약 10 mM 내지 약 50 mM 농도의 소듐 클로라이드에 대응하는 이온 강도를 포함하는 것인 방법.
제46항 내지 제54항 중 어느 하나의 항에 있어서, RNA 리포플렉스 및 안정화제를 포함하는 수성 조성물은 약 20 mM 농도의 소듐 클로라이드에 대응하는 이온 강도를 갖는 것인 방법.
제46항 내지 제55항 중 어느 하나의 항에 있어서, RNA 리포플렉스 입자는 제28항 내지 제44항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의하여 수득 가능한 것인 방법.
제28항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의하여 수득 가능한 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 조성물.
제57항에 있어서, RNA 리포플렉스 입자는 1종 이상의 양이온성 지질 및 1종 이상의 추가적인 지질을 포함하는 것인 조성물.
제57항 또는 제58항에 있어서, RNA는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하고, RNA 리포플렉스 입자 내 양전하 대 음전하의 비는 약 1:2 내지 약 1.9:2, 또는 약 1.3:2.0인 것인 조성물.
다음을 포함하는 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 조성물:
하나 이상의 에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA, 및
1종 이상의 양이온성 지질 및 1종 이상의 추가적인 지질,
여기서, RNA 리포플렉스 입자에서 양전하 대 음전하의 비는 약 1:2 내지 약 1.9:2, 또는 약 1.3:2.0이고,
여기서, RNA 리포플렉스 입자는 약 1 nm^-1에서 단일 Bragg 피크를 특징으로 하며, 여기서 피크 폭은 0.2 nm^-1보다 작다.
제57항 내지 제60항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물은 소듐 클로라이드를 약 10 내지 약 300 mM, 약 45 mM 내지 약 300 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 또는 약 80 mM 내지 약 150 mM 농도로 더 포함하는 것인 조성물.
제57항 내지 제61항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물은 완충제를 더 포함하는 것인 조성물.
제57항 내지 제62항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물은 킬레이팅 제제를 더 포함하는 것인 조성물.
제46항 내지 제56항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의하여 수득 가능한 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 조성물.
제64항에 있어서, RNA 리포플렉스 입자는 1 종 이상의 양이온성 지질 및 1 종 이상의 추가적인 지질을 포함하는 것인 조성물.
제64항 또는 제65항에 있어서, RNA는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하고, RNA 리포플렉스 입자 내 양 전하 대 음전하의 비는 약 1:2 내지 약 1.9:2, 또는 약 1.3:2.0인 것인 조성물.
제64항 내지 제66항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물은 소듐 클로라이드를 약 10 mM 내지 약 50 mM 농도로 더 포함하는 것인 조성물.
조성물로서,
다음을 포함하는 RNA 리포플렉스 입자:
하나 이상의 에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA,
1종 이상의 양이온성 지질 및 1종 이상의 추가적인 지질,
여기서, RNA 리포플렉스 입자에서 양전하 대 음전하의 비는 약 1:2 내지 약 1.9:2, 또는 약 1.3:2.0이고,
0 mM 내지 약 40 mM 농도의 소듐 클로라이드, 및
안정화제를 포함하는 조성물.
제64항 내지 제68항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물은 완충제를 더 포함하는 것인 조성물.
제64항 내지 제69항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물 내 RNA의 양은 약 0.01 mg/mL 내지 약 1 mg/mL, 약 0.05 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL, 또는 0.05 mg/mL인 것인 조성물.
제67항 내지 제70항 중 어느 하나의 항에 있어서, 소듐 클로라이드는 약 20 mM 내지 약 30 mM 농도로 존재하는 것인 조성물.
제67항 내지 제71항 중 어느 하나의 항에 있어서, 소듐 클로라이드는 약 20 mM 농도로 존재하는 것인 조성물.
제67항 내지 제71항 중 어느 하나의 항에 있어서, 소듐 클로라이드는 약 30 mM 농도로 존재하는 것인 조성물.
제64항 내지 제73항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물 내 안정화제의 농도는 생리학적 삼투질 농도에 필요한 값보다 높은 것인 조성물.
제64항 내지 제74항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물 내 안정화제의 농도는 약 5 내지 약 35% w/v, 또는 약 12.5 내지 약 25% w/v인 것인 조성물.
제64항 내지 제75항 중 어느 하나의 항에 있어서, 안정화제는 단당류, 이당류, 삼당류, 당 알코올, 올리고당류 또는 그의 대응하는 당 알코올, 및 직쇄 폴리알코올 중에서 선택되는 탄수화물인 것인 조성물.
제64항 내지 제76항 중 어느 하나의 항에 있어서, 안정화제는 약 5 내지 25% w/v 농도의 수크로오스인 것인 조성물.
제77항에 있어서, 수크로오스는 약 15% (w/v) 내지 약 25% (w/v) 농도로 존재하는 것인 조성물.
제77항에 있어서, 수크로오스는 약 20% (w/v) 내지 약 25% (w/v) 농도로 존재하는 것인 조성물.
제77항에 있어서, 수크로오스는 약 22% (w/v) 농도로 존재하는 것인 조성물.
제77항에 있어서, 수크로오스는 약 20% (w/v) 농도로 존재하는 것인 조성물.
제64항 내지 제81항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물은 RNA 보관에 최적인 통상의 pH보다 낮은 pH를 갖는 것인 조성물.
제64항 내지 제82항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물은 약 5.7 내지 약 6.7, 또는 약 6.2의 pH를 갖는 것인 조성물.
제68항 내지 제83항 중 어느 하나의 항에 있어서, 완충제는 2-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]에탄술폰산 (HEPES)인 것인 조성물.
제84항에 있어서, HEPES는 약 2,5 mM 내지 약 10 mM, 또는 약 7.5 mM 농도로 존재하는 것인 조성물.
제64항 내지 제85항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물은 킬레이팅 제제를 더 포함하는 것인 조성물.
조성물로서,
다음을 포함하는 RNA 리포플렉스 입자:
약 0.05 mg/mL 농도의, 하나 이상의 에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA,
몰 비 약 2:1로 DOTMA 및 DOPE,
여기서, RNA 리포플렉스 입자에서 양전하 대 음전하의 비는 약 1.3:2.0이고,
약 20 mM 농도의 소듐 클로라이드,
약 22% (w/v) 농도의 수크로오스,
약 6.2의 pH를 갖는 약 7.5 mM 농도의 HEPES, 및
약 2.5 mM 농도의 EDTA를 포함하는 조성물.
제64항 내지 제87항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물은 액체 또는 동결된 상태로 존재하는 것인 조성물.
제88항에 있어서, 조성물은 1 개월 이상 동안 약 -15℃ 내지 약 -40℃ 온도에서 안정한 것인 동결된 조성물.
제88항에 있어서, 조성물은 1 개월 이상 동안 약 -15℃ 온도에서 안정한 것인 동결된 조성물.
제88항에 있어서, 조성물은 2 개월 이상 동안 약 -15℃ 온도에서 안정한 것인 동결된 조성물.
제88항에 있어서, 조성물은 1 개월 이상 동안 약 -20℃ 온도에서 안정한 것인 동결된 조성물.
제88항에 있어서, 조성물은 2 개월 이상 동안 약 -20℃ 온도에서 안정한 것인 동결된 조성물.
제88항에 있어서, 조성물은 1 개월 이상 동안 약 -30℃ 온도에서 안정한 것인 동결된 조성물.
제88항에 있어서, 조성물은 2 개월 이상 동안 약 -30℃ 온도에서 안정한 것인 동결된 조성물.
제88항 내지 제95항 중 어느 하나의 항에 기재된 동결된 조성물을 해동시키고, 임의로 수성 액체를 첨가하여 삼투질 농도 및 이온 간도를 조정함으로써 수득 가능한, RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물.
제96항에 있어서, 조성물의 삼투질 농도는 약 200 mOsmol 내지 약 450 mOsmol인 것인 조성물.
제96항 또는 97항에 있어서, 조성물은 소듐 클로라이드를 약 80 mM 내지 약 150 mM 농도로 포함하는 것인 조성물.
제64항 내지 제98항 중 어느 하나의 항에 있어서, RNA 리포플렉스 입자는 제28항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의하여 수득 가능한 것인 조성물.
제64항 내지 제99항 중 어느 하나의 항에 있어서, RNA 리포플렉스 입자는 약 1 nm^-1에서 단일 Bragg 피크로 특징지어 지고, 피크 폭은 0.2 nm^-1보다 작은 것인 조성물.
제57항 내지 제100항 중 어느 하나의 항에 있어서, RNA 리포플렉스 입자는 약 200 내지 약 800 nm, 약 250 내지 약 700 nm, 약 400 내지 약 600 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 350 nm 내지 약 400 nm 범위인 평균 직경을 갖는 것인 조성물.
제58항 내지 제63항, 제65항 내지 제86항, 및 제88항 내지 제101항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1종 이상의 양이온성 지질은 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA) 및/또는 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP)을 포함하는 것인 조성물.
제58항 내지 제63항, 제65항 내지 제86항, 및 제88항 내지 제102항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1종 이상의 추가적인 지질은 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 콜레스테롤 (Chol) 및/또는 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC)을 포함하는 것인 조성물.
제58항 내지 제63항, 제65항 내지 제86항, 및 제88항 내지 제103항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1종 이상의 양이온성 지질은 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA)를 포함하고, 1종 이상의 추가적인 지질은 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)를 포함하는 것인 조성물.
제58항 내지 제63항, 제65항 내지 제86항, 및 제88항 내지 제104항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1종 이상의 양이온성 지질 대 1종 이상의 추가적인 지질의 몰 비는 약 10:0 내지 약 1:9, 약 4:1 내지 약 1:2, 약 3:1 내지 약 1:1, 또는 약 2:1인 것인 조성물.
제58항 내지 제63항, 제65항 내지 제86항, 및 제88항 내지 제105항 중 어느 하나의 항에 있어서, RNA 리포플렉스 입자는 DOTMA 및 DOPE를 약 10:0 내지 1:9, 약 4:1 내지 1:2, 약 3:1 내지 약 1:1, 또는 약 2:1의 몰 비로 포함하고, DOTMA 내 양전하 대 RNA 내 음전하의 전하 비는 약 1:2 내지 1.9:2인 것인 조성물.
제63항, 제86항, 및 제88항 내지 제106항 중 어느 하나의 항에 있어서, 킬레이팅 제제는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)인 것인 조성물.
제107항에 있어서, EDTA는 약 0.25 mM 내지 약 5 mM, 또는 약 2.5 mM 농도로 존재하는 것인 조성물.
제57항 내지 제108항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아쥬반트를 더 포함하는 것인 조성물.
제57항 내지 제109항 중 어느 하나의 항에 있어서, 전신 투여를 위하여 제형화된 것인 조성물.
제110항에 있어서, 전신 투여는 정맥 내 투여인 것인 조성물.
제57항 내지 제111항 중 어느 하나의 항에 있어서, 치료적 용도를 위한 것인 조성물.
제88항 내지 제112항 중 어느 하나의 항에 기재된 동결된 조성물을 해동시키는 단계 및 임의로 수성 액체를 첨가함으로써 삼투질 농도 및 이온 강도를 조정하는 단계를 포함하는, RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 수성 조성물을 제조하는 방법.
제113항에 있어서, 수성 액체는 조성물의 삼투질 농도 약 200 mOsmol 내지 약 450 mOsmol를 얻기 위하여 첨가되는 것인 방법.
제113항 또는 제114항에 있어서, 수성 액체는 약 80 mM 내지 약 150 mM 농도의 소듐 클로라이드를 얻기 위하여 첨가되는 것인 방법.