RU2807543C2 - Получение и хранение липосомных препаратов рнк, пригодных для терапии - Google Patents
Получение и хранение липосомных препаратов рнк, пригодных для терапии Download PDFInfo
- Publication number
- RU2807543C2 RU2807543C2 RU2021132037A RU2021132037A RU2807543C2 RU 2807543 C2 RU2807543 C2 RU 2807543C2 RU 2021132037 A RU2021132037 A RU 2021132037A RU 2021132037 A RU2021132037 A RU 2021132037A RU 2807543 C2 RU2807543 C2 RU 2807543C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rna
- concentration
- composition
- paragraphs
- composition according
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 98
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 471
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 378
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 342
- 239000002479 lipoplex Substances 0.000 claims abstract description 311
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 165
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 138
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims abstract description 112
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 82
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 claims abstract description 71
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 57
- MWRBNPKJOOWZPW-NYVOMTAGSA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine zwitterion Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-NYVOMTAGSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 17
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 202
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 claims description 99
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 71
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical group OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 67
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 64
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 61
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 59
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 59
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical group OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 53
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 52
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 41
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 24
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 22
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 claims description 18
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 15
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 12
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 10
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 7
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 claims description 7
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- IRHWMYKYLWNHTL-UHFFFAOYSA-M sodium 2-(N-morpholino)ethanesulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCN1CCOCC1 IRHWMYKYLWNHTL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 27
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 24
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 23
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 793
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 199
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 187
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 160
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 104
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 98
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 97
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 97
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 95
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 73
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 63
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 56
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 56
- 229940074410 trehalose Drugs 0.000 description 56
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 52
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 52
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 49
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 42
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 42
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 42
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 39
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 38
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 37
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 36
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 33
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 33
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 32
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 32
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 27
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 27
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 26
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 24
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 24
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 24
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- KWVJHCQQUFDPLU-YEUCEMRASA-N 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KWVJHCQQUFDPLU-YEUCEMRASA-N 0.000 description 22
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 22
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 21
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 21
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 20
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 20
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 19
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 18
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 17
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 17
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 17
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 16
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 16
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 16
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 16
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 16
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 15
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 15
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 14
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 13
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 13
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 13
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 13
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 12
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 12
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 12
- 229940107161 cholesterol Drugs 0.000 description 12
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 12
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 11
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- DPVHGFAJLZWDOC-PVXXTIHASA-N (2r,3s,4s,5r,6r)-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-3,4,5-triol;dihydrate Chemical compound O.O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DPVHGFAJLZWDOC-PVXXTIHASA-N 0.000 description 10
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 10
- 229940074409 trehalose dihydrate Drugs 0.000 description 10
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 10
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 9
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 9
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 9
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 9
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 8
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 238000000235 small-angle X-ray scattering Methods 0.000 description 8
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 8
- 239000012601 sub-visual particle Substances 0.000 description 8
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 7
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 7
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 7
- 101100407308 Mus musculus Pdcd1lg2 gene Proteins 0.000 description 7
- 108700030875 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Proteins 0.000 description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 7
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 7
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 7
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 6
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 6
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 6
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 6
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 6
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 6
- 238000001139 pH measurement Methods 0.000 description 6
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical group O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 5
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 5
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 5
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 5
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 5
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 238000000333 X-ray scattering Methods 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 5
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 5
- 238000001825 field-flow fractionation Methods 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 5
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 5
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 5
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 5
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 4
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 229940041984 dextran 1 Drugs 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005339 levitation Methods 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 4
- 125000000647 trehalose group Chemical group 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical class C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000610604 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Proteins 0.000 description 3
- 108010031794 IGF Type 1 Receptor Proteins 0.000 description 3
- 102000038455 IGF Type 1 Receptor Human genes 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 3
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 3
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100040112 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Human genes 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 229960003852 atezolizumab Drugs 0.000 description 3
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 3
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 description 3
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 3
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- REZZEXDLIUJMMS-UHFFFAOYSA-M dimethyldioctadecylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC REZZEXDLIUJMMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 description 3
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 3-(n-morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN1CCOCC1 NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C=C(N)N=C2C LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 3-[6-[4-(trifluoromethoxy)anilino]-4-pyrimidinyl]benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC(C=2N=CN=C(NC=3C=CC(OC(F)(F)F)=CC=3)C=2)=C1 WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 229920001450 Alpha-Cyclodextrin Polymers 0.000 description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 2
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 2
- 108700012439 CA9 Proteins 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 102000002029 Claudin Human genes 0.000 description 2
- 108050009302 Claudin Proteins 0.000 description 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N DOSPA trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N 0.000 description 2
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 2
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 2
- 101001117312 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 2
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 2
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 description 2
- 101710093778 L-dopachrome tautomerase Proteins 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 2
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 2
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 2
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000021839 RNA stabilization Effects 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 101710173694 Short transient receptor potential channel 2 Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- HFHDHCJBZVLPGP-RWMJIURBSA-N alpha-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO HFHDHCJBZVLPGP-RWMJIURBSA-N 0.000 description 2
- 229940043377 alpha-cyclodextrin Drugs 0.000 description 2
- 229950001537 amatuximab Drugs 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000012865 aseptic processing Methods 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 2
- 125000004989 dicarbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- OGGXGZAMXPVRFZ-UHFFFAOYSA-N dimethylarsinic acid Chemical compound C[As](C)(O)=O OGGXGZAMXPVRFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 229950009791 durvalumab Drugs 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 2
- 229950010640 ensituximab Drugs 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- GDSRMADSINPKSL-HSEONFRVSA-N gamma-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO GDSRMADSINPKSL-HSEONFRVSA-N 0.000 description 2
- 229940080345 gamma-cyclodextrin Drugs 0.000 description 2
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- JJTUDXZGHPGLLC-UHFFFAOYSA-N lactide Chemical compound CC1OC(=O)C(C)OC1=O JJTUDXZGHPGLLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- VZUGBLTVBZJZOE-KRWDZBQOSA-N n-[3-[(4s)-2-amino-1,4-dimethyl-6-oxo-5h-pyrimidin-4-yl]phenyl]-5-chloropyrimidine-2-carboxamide Chemical compound N1=C(N)N(C)C(=O)C[C@@]1(C)C1=CC=CC(NC(=O)C=2N=CC(Cl)=CN=2)=C1 VZUGBLTVBZJZOE-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 229950003709 oxelumab Drugs 0.000 description 2
- 229940067082 pentetate Drugs 0.000 description 2
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 2
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000010963 scalable process Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 210000001845 splenic macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 2
- XUFXOAAUWZOOIT-SXARVLRPSA-N (2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4-dihydroxy-6-methyl-5-[[(1S,4R,5S,6S)-4,5,6-trihydroxy-3-(hydroxymethyl)-1-cyclohex-2-enyl]amino]-2-oxanyl]oxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-2-oxanyl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4-triol Chemical compound O([C@H]1O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@H]1O)N[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)C(CO)=C1)O)C)[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O XUFXOAAUWZOOIT-SXARVLRPSA-N 0.000 description 1
- MFZSNESUTRVBQX-XEURHVNRSA-N (2S)-2-amino-6-[4-[[3-[[(2S)-1-[[(1S,2R,3S,5S,6S,16E,18E,20R,21S)-11-chloro-21-hydroxy-12,20-dimethoxy-2,5,9,16-tetramethyl-8,23-dioxo-4,24-dioxa-9,22-diazatetracyclo[19.3.1.110,14.03,5]hexacosa-10,12,14(26),16,18-pentaen-6-yl]oxy]-1-oxopropan-2-yl]-methylamino]-3-oxopropyl]disulfanyl]pentanoylamino]hexanoic acid Chemical compound CO[C@@H]1\C=C\C=C(C)\Cc2cc(OC)c(Cl)c(c2)N(C)C(=O)C[C@H](OC(=O)[C@H](C)N(C)C(=O)CCSSC(C)CCC(=O)NCCCC[C@H](N)C(O)=O)[C@]2(C)O[C@H]2[C@H](C)[C@@H]2C[C@@]1(O)NC(=O)O2 MFZSNESUTRVBQX-XEURHVNRSA-N 0.000 description 1
- JSPNNZKWADNWHI-PNANGNLXSA-N (2r)-2-hydroxy-n-[(2s,3r,4e,8e)-3-hydroxy-9-methyl-1-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoctadeca-4,8-dien-2-yl]heptadecanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)C(=O)N[C@H]([C@H](O)\C=C\CC\C=C(/C)CCCCCCCCC)CO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O JSPNNZKWADNWHI-PNANGNLXSA-N 0.000 description 1
- LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-5-amino-2-(aminomethyl)-6-[(2r,3s,4r,5s)-5-[(1r,2r,3s,5r,6s)-3,5-diamino-2-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-hydroxycyclohexyl]oxy-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl]oxyoxane-3,4-diol;sulfuric ac Chemical compound OS(O)(=O)=O.N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N 0.000 description 1
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 1
- SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N (4S)-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[(2S)-2-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(1S)-4-carbamimidamido-1-carboxybutyl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- WEYNBWVKOYCCQT-UHFFFAOYSA-N 1-(3-chloro-4-methylphenyl)-3-{2-[({5-[(dimethylamino)methyl]-2-furyl}methyl)thio]ethyl}urea Chemical compound O1C(CN(C)C)=CC=C1CSCCNC(=O)NC1=CC=C(C)C(Cl)=C1 WEYNBWVKOYCCQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XAEIGPYNMXSHAA-UHFFFAOYSA-N 1-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]amino]propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCC(S(O)(=O)=O)NC(CO)(CO)CO XAEIGPYNMXSHAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VILCJCGEZXAXTO-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-tetramine Chemical compound NCCNCCNCCN VILCJCGEZXAXTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZLHBUQJHDTDRD-UHFFFAOYSA-N 2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCO)OCCCCCCCCCCCCCC UZLHBUQJHDTDRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTQWWZBSTRGEAV-PKHIMPSTSA-N 2-[[(2s)-2-[bis(carboxymethyl)amino]-3-[4-(methylcarbamoylamino)phenyl]propyl]-[2-[bis(carboxymethyl)amino]propyl]amino]acetic acid Chemical compound CNC(=O)NC1=CC=C(C[C@@H](CN(CC(C)N(CC(O)=O)CC(O)=O)CC(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)C=C1 RTQWWZBSTRGEAV-PKHIMPSTSA-N 0.000 description 1
- CFWRDBDJAOHXSH-SECBINFHSA-N 2-azaniumylethyl [(2r)-2,3-diacetyloxypropyl] phosphate Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](OC(C)=O)COP(O)(=O)OCCN CFWRDBDJAOHXSH-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- RZQXOGQSPBYUKH-UHFFFAOYSA-N 3-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound OCC(CO)(CO)NCC(O)CS(O)(=O)=O RZQXOGQSPBYUKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 32-alpha-galactosyl-3-alpha-galactosyl-galactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(CO)OC(O)C2O)O)OC(CO)C1O DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytidine Natural products O=C1N=C(N)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 101710137115 Adenylyl cyclase-associated protein 1 Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 206010061424 Anal cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000052587 Anaphase-Promoting Complex-Cyclosome Apc3 Subunit Human genes 0.000 description 1
- 108700004606 Anaphase-Promoting Complex-Cyclosome Apc3 Subunit Proteins 0.000 description 1
- 102100023003 Ankyrin repeat domain-containing protein 30A Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- 102100022977 Antithrombin-III Human genes 0.000 description 1
- 208000007860 Anus Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101000719121 Arabidopsis thaliana Protein MEI2-like 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700016232 Arg(2)-Sar(4)- dermorphin (1-4) Proteins 0.000 description 1
- 102000014654 Aromatase Human genes 0.000 description 1
- 108010078554 Aromatase Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100035526 B melanoma antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 1
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 1
- 102100023995 Beta-nerve growth factor Human genes 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710149863 C-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 description 1
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 description 1
- 102100032976 CCR4-NOT transcription complex subunit 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150108242 CDC27 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710156847 CTD small phosphatase-like protein Proteins 0.000 description 1
- 102100027674 CTD small phosphatase-like protein Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100039510 Cancer/testis antigen 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102100027668 Carboxy-terminal domain RNA polymerase II polypeptide A small phosphatase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710134395 Carboxy-terminal domain RNA polymerase II polypeptide A small phosphatase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100027667 Carboxy-terminal domain RNA polymerase II polypeptide A small phosphatase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710134389 Carboxy-terminal domain RNA polymerase II polypeptide A small phosphatase 2 Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 1
- 102100026548 Caspase-8 Human genes 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 102100039518 Claudin-12 Human genes 0.000 description 1
- 101710197000 Claudin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102100038449 Claudin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090000229 Claudin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100040501 Contactin-associated protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 229940046168 CpG oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- 102000013701 Cyclin-Dependent Kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N D-maltotriose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWIZNVHXZXRPDR-UHFFFAOYSA-N D-melezitose Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(O)C1OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O QWIZNVHXZXRPDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 101100216227 Dictyostelium discoideum anapc3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037070 Doublecortin domain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical group [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940126626 Ektomab Drugs 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 1
- 102100039328 Endoplasmin Human genes 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229940126611 FBTA05 Drugs 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 102100028043 Fibroblast growth factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000010451 Folate receptor alpha Human genes 0.000 description 1
- 108050001931 Folate receptor alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010078321 Guanylate Cyclase Proteins 0.000 description 1
- 102000014469 Guanylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 102100030595 HLA class II histocompatibility antigen gamma chain Human genes 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101000773083 Homo sapiens 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000757191 Homo sapiens Ankyrin repeat domain-containing protein 30A Proteins 0.000 description 1
- 101000874316 Homo sapiens B melanoma antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000889345 Homo sapiens Cancer/testis antigen 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 1
- 101000954709 Homo sapiens Doublecortin domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000812663 Homo sapiens Endoplasmin Proteins 0.000 description 1
- 101001082627 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen gamma chain Proteins 0.000 description 1
- 101000985516 Homo sapiens Hermansky-Pudlak syndrome 5 protein Proteins 0.000 description 1
- 101001078143 Homo sapiens Integrin alpha-IIb Proteins 0.000 description 1
- 101001046677 Homo sapiens Integrin alpha-V Proteins 0.000 description 1
- 101000614481 Homo sapiens Kidney-associated antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001051093 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001134060 Homo sapiens Melanocyte-stimulating hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000615488 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000874141 Homo sapiens Probable ATP-dependent RNA helicase DDX43 Proteins 0.000 description 1
- 101000880770 Homo sapiens Protein SSX2 Proteins 0.000 description 1
- 101000679365 Homo sapiens Putative tyrosine-protein phosphatase TPTE Proteins 0.000 description 1
- 101001109419 Homo sapiens RNA-binding protein NOB1 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000857677 Homo sapiens Runt-related transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000633784 Homo sapiens SLAM family member 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000821981 Homo sapiens Sarcoma antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000665137 Homo sapiens Scm-like with four MBT domains protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000739178 Homo sapiens Secretoglobin family 3A member 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000874179 Homo sapiens Syndecan-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000648075 Homo sapiens Trafficking protein particle complex subunit 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000904724 Homo sapiens Transmembrane glycoprotein NMB Proteins 0.000 description 1
- 101000610605 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A Proteins 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000026633 IL6 Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 108050002021 Integrator complex subunit 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100025306 Integrin alpha-IIb Human genes 0.000 description 1
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 1
- 206010061252 Intraocular melanoma Diseases 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010092694 L-Selectin Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100026238 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010010995 MART-1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102100034216 Melanocyte-stimulating hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010057081 Merozoite Surface Protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 102100021299 Methyl-CpG-binding domain protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010050619 Monokines Proteins 0.000 description 1
- 102000013967 Monokines Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N N-[1-oxo-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propan-2-yl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(C(C)NC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 description 1
- UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N N-benzoyl-Ferrioxamine B Chemical compound CC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCN UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010084333 N-palmitoyl-S-(2,3-bis(palmitoyloxy)propyl)cysteinyl-seryl-lysyl-lysyl-lysyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 102000007530 Neurofibromin 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010085793 Neurofibromin 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102400000050 Oxytocin Human genes 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N Oxytocin Natural products N1C(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108060006580 PRAME Proteins 0.000 description 1
- 102000036673 PRAME Human genes 0.000 description 1
- 102100034640 PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Human genes 0.000 description 1
- 108050007154 PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Proteins 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000000821 Parathyroid Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 208000007913 Pituitary Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102100035724 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX43 Human genes 0.000 description 1
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102100037686 Protein SSX2 Human genes 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022578 Putative tyrosine-protein phosphatase TPTE Human genes 0.000 description 1
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 description 1
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102100022491 RNA-binding protein NOB1 Human genes 0.000 description 1
- 101900083372 Rabies virus Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101150066717 Rara gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 1
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 102100025373 Runt-related transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100029198 SLAM family member 7 Human genes 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 102100021466 Sarcoma antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100038689 Scm-like with four MBT domains protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100037269 Secretoglobin family 3A member 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000019802 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 description 1
- 101710173693 Short transient receptor potential channel 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000032023 Signs and Symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- IOEJYZSZYUROLN-UHFFFAOYSA-M Sodium diethyldithiocarbamate Chemical compound [Na+].CCN(CC)C([S-])=S IOEJYZSZYUROLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 108010017622 Somatomedin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004584 Somatomedin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 102100035748 Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710185775 Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3 Proteins 0.000 description 1
- UQZIYBXSHAGNOE-USOSMYMVSA-N Stachyose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]2[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O2)O1 UQZIYBXSHAGNOE-USOSMYMVSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 description 1
- 102100035721 Syndecan-1 Human genes 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108700019889 TEL-AML1 fusion Proteins 0.000 description 1
- 102100033082 TNF receptor-associated factor 3 Human genes 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 description 1
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical class IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 102100025256 Trafficking protein particle complex subunit 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100040113 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A Human genes 0.000 description 1
- 208000034953 Twin anemia-polycythemia sequence Diseases 0.000 description 1
- 102100027244 U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710155955 U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 201000005969 Uveal melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 108010053096 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100039037 Vascular endothelial growth factor A Human genes 0.000 description 1
- 102100033178 Vascular endothelial growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 102100035071 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001441550 Zeiformes Species 0.000 description 1
- XYVNHPYNSPGYLI-UUOKFMHZSA-N [(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)-4-hydroxy-2-(phosphonooxymethyl)oxolan-3-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H]1O XYVNHPYNSPGYLI-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- NYDLOCKCVISJKK-WRBBJXAJSA-N [3-(dimethylamino)-2-[(z)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(CN(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC NYDLOCKCVISJKK-WRBBJXAJSA-N 0.000 description 1
- LDGWQMRUWMSZIU-YKBXHWKCSA-M [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOC[C@@H](C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOC[C@@H](C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-YKBXHWKCSA-M 0.000 description 1
- 229950005186 abagovomab Drugs 0.000 description 1
- 229960000446 abciximab Drugs 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002632 acarbose Drugs 0.000 description 1
- XUFXOAAUWZOOIT-UHFFFAOYSA-N acarviostatin I01 Natural products OC1C(O)C(NC2C(C(O)C(O)C(CO)=C2)O)C(C)OC1OC(C(C1O)O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(O)C(O)C1O XUFXOAAUWZOOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229950009084 adecatumumab Drugs 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 201000005188 adrenal gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024447 adrenal gland neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229950008459 alacizumab pegol Drugs 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229950006061 anatumomab mafenatox Drugs 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 201000011165 anus cancer Diseases 0.000 description 1
- 229950003145 apolizumab Drugs 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950005725 arcitumomab Drugs 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 229950002916 avelumab Drugs 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 229950007843 bavituximab Drugs 0.000 description 1
- 229950003269 bectumomab Drugs 0.000 description 1
- 229960003270 belimumab Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-TXICZTDVSA-N beta-D-ribose Chemical group OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-TXICZTDVSA-N 0.000 description 1
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 229960005522 bivatuzumab mertansine Drugs 0.000 description 1
- 201000000053 blastoma Diseases 0.000 description 1
- 229960003008 blinatumomab Drugs 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 229960000455 brentuximab vedotin Drugs 0.000 description 1
- 229950004243 cacodylic acid Drugs 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 229950007296 cantuzumab mertansine Drugs 0.000 description 1
- 229950011547 cantuzumab ravtansine Drugs 0.000 description 1
- 229940034605 capromab pendetide Drugs 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229950000771 carlumab Drugs 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 229960000419 catumaxomab Drugs 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 1
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930183167 cerebroside Natural products 0.000 description 1
- RIZIAUKTHDLMQX-UHFFFAOYSA-N cerebroside D Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC)COC1OC(CO)C(O)C(O)C1O RIZIAUKTHDLMQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 229950006647 cixutumumab Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 229950007276 conatumumab Drugs 0.000 description 1
- 238000011970 concomitant therapy Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000030381 cutaneous melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- 229950007409 dacetuzumab Drugs 0.000 description 1
- 229960002482 dalotuzumab Drugs 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 229960001251 denosumab Drugs 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 229950008962 detumomab Drugs 0.000 description 1
- 229940119744 dextran 40 Drugs 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- UMGXUWVIJIQANV-UHFFFAOYSA-M didecyl(dimethyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCC UMGXUWVIJIQANV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N dimethyl(dioctadecyl)azanium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 125000000600 disaccharide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229950000006 ecromeximab Drugs 0.000 description 1
- 229960001776 edrecolomab Drugs 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960004137 elotuzumab Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 201000008184 embryoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 229950003048 enavatuzumab Drugs 0.000 description 1
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003386 epithelial cell of thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 229950009760 epratuzumab Drugs 0.000 description 1
- 229950008579 ertumaxomab Drugs 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 229950009569 etaracizumab Drugs 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 1
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 1
- 229950009929 farletuzumab Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229950002846 ficlatuzumab Drugs 0.000 description 1
- 229950008085 figitumumab Drugs 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 229950010320 flanvotumab Drugs 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 229950004003 fresolimumab Drugs 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 229950001109 galiximab Drugs 0.000 description 1
- 229950004896 ganitumab Drugs 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960003297 gemtuzumab ozogamicin Drugs 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 229950003717 gevokizumab Drugs 0.000 description 1
- 229950002026 girentuximab Drugs 0.000 description 1
- 229950009672 glembatumumab vedotin Drugs 0.000 description 1
- 229960005150 glycerol Drugs 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 1
- 208000001786 gonorrhea Diseases 0.000 description 1
- 102000028718 growth factor binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091009353 growth factor binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- VDEGQTCMQUFPFH-UHFFFAOYSA-N hydroxy-dimethyl-arsine Natural products C[As](C)O VDEGQTCMQUFPFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 229960001001 ibritumomab tiuxetan Drugs 0.000 description 1
- 229950006359 icrucumab Drugs 0.000 description 1
- 229950002200 igovomab Drugs 0.000 description 1
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229950011428 indatuximab ravtansine Drugs 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 229950004101 inotuzumab ozogamicin Drugs 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229950001014 intetumumab Drugs 0.000 description 1
- 150000008040 ionic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229960005386 ipilimumab Drugs 0.000 description 1
- 229950010939 iratumumab Drugs 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 229950000518 labetuzumab Drugs 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 239000000832 lactitol Substances 0.000 description 1
- 235000010448 lactitol Nutrition 0.000 description 1
- VQHSOMBJVWLPSR-JVCRWLNRSA-N lactitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VQHSOMBJVWLPSR-JVCRWLNRSA-N 0.000 description 1
- 229960003451 lactitol Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229950002884 lexatumumab Drugs 0.000 description 1
- 229950005173 libivirumab Drugs 0.000 description 1
- 229950002950 lintuzumab Drugs 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229950003526 lorvotuzumab mertansine Drugs 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 229950004563 lucatumumab Drugs 0.000 description 1
- 229950000128 lumiliximab Drugs 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H magnesium phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000004137 magnesium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960002261 magnesium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000157 magnesium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010994 magnesium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000026037 malignant tumor of neck Diseases 0.000 description 1
- 208000026045 malignant tumor of parathyroid gland Diseases 0.000 description 1
- VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N maltitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N 0.000 description 1
- 239000000845 maltitol Substances 0.000 description 1
- 235000010449 maltitol Nutrition 0.000 description 1
- 229940035436 maltitol Drugs 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 229960001855 mannitol Drugs 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950001869 mapatumumab Drugs 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 229950008001 matuzumab Drugs 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- QWIZNVHXZXRPDR-WSCXOGSTSA-N melezitose Chemical compound O([C@@]1(O[C@@H]([C@H]([C@@H]1O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O)CO)CO)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O QWIZNVHXZXRPDR-WSCXOGSTSA-N 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960005108 mepolizumab Drugs 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013586 microbial product Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229950003734 milatuzumab Drugs 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 229950003063 mitumomab Drugs 0.000 description 1
- 229950007699 mogamulizumab Drugs 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229950000720 moxetumomab pasudotox Drugs 0.000 description 1
- PUPNJSIFIXXJCH-UHFFFAOYSA-N n-(4-hydroxyphenyl)-2-(1,1,3-trioxo-1,2-benzothiazol-2-yl)acetamide Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1NC(=O)CN1S(=O)(=O)C2=CC=CC=C2C1=O PUPNJSIFIXXJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950003027 nacolomab tafenatox Drugs 0.000 description 1
- 150000002790 naphthalenes Chemical class 0.000 description 1
- 229950009793 naptumomab estafenatox Drugs 0.000 description 1
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 229960000513 necitumumab Drugs 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950010203 nimotuzumab Drugs 0.000 description 1
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003347 obinutuzumab Drugs 0.000 description 1
- 201000002575 ocular melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229960002450 ofatumumab Drugs 0.000 description 1
- 229950008516 olaratumab Drugs 0.000 description 1
- 229950000846 onartuzumab Drugs 0.000 description 1
- 229950009057 oportuzumab monatox Drugs 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229950007283 oregovomab Drugs 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 229960001723 oxytocin Drugs 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229950010966 patritumab Drugs 0.000 description 1
- 229960005570 pemtumomab Drugs 0.000 description 1
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- 229960002087 pertuzumab Drugs 0.000 description 1
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229940126620 pintumomab Drugs 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 229950009904 pritumumab Drugs 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 1
- 229950011613 racotumomab Drugs 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 229950011639 radretumab Drugs 0.000 description 1
- 229950002786 rafivirumab Drugs 0.000 description 1
- 229960002633 ramucirumab Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229950003238 rilotumumab Drugs 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 229950001808 robatumumab Drugs 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 229950000106 samalizumab Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229950008684 sibrotuzumab Drugs 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229960003323 siltuximab Drugs 0.000 description 1
- 235000021309 simple sugar Nutrition 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000003708 skin melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012607 small angle X-ray scattering experiment Methods 0.000 description 1
- 201000002314 small intestine cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 108010033419 somatotropin-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 229950007213 spartalizumab Drugs 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 201000010132 spinal cord glioma Diseases 0.000 description 1
- 206010062261 spinal cord neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005565 spinal meningioma Diseases 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- UQZIYBXSHAGNOE-XNSRJBNMSA-N stachyose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)O2)O)O1 UQZIYBXSHAGNOE-XNSRJBNMSA-N 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 108020003113 steroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005969 steroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000000365 steroidogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- ACTRVOBWPAIOHC-XIXRPRMCSA-N succimer Chemical compound OC(=O)[C@@H](S)[C@@H](S)C(O)=O ACTRVOBWPAIOHC-XIXRPRMCSA-N 0.000 description 1
- 229960005346 succimer Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000034223 susceptibility to 2 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229950010265 tabalumab Drugs 0.000 description 1
- 101150047061 tag-72 gene Proteins 0.000 description 1
- 229950001603 taplitumomab paptox Drugs 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229950001289 tenatumomab Drugs 0.000 description 1
- 229950010259 teprotumumab Drugs 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 239000012749 thinning agent Substances 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 229950004742 tigatuzumab Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 229960005267 tositumomab Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N trappsol cyclo Chemical compound CC(O)COC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)COCC(O)C)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1COCC(C)O ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- 229950007217 tremelimumab Drugs 0.000 description 1
- 229960001124 trientine Drugs 0.000 description 1
- 150000004072 triols Chemical class 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 229950003364 tucotuzumab celmoleukin Drugs 0.000 description 1
- 108700008509 tucotuzumab celmoleukin Proteins 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 239000000225 tumor suppressor protein Substances 0.000 description 1
- 230000029069 type 2 immune response Effects 0.000 description 1
- 229950004593 ublituximab Drugs 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229950005972 urelumab Drugs 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 229950001212 volociximab Drugs 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- 229950003511 votumumab Drugs 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- 229950008250 zalutumumab Drugs 0.000 description 1
- 229950009002 zanolimumab Drugs 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N β-1,4-galactotrioside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N 0.000 description 1
Abstract
Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины. 1 и 2 объекты представляют собой композицию для доставки РНК, содержащую РНК-липоплексные частицы, включающие РНК и 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA) и 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), хлорид натрия, стабилизатор и буфер. 3 и 4 объекты – жидкую композицию для доставки РНК, содержащую РНК-липоплексные частицы, получаемую путем оттаивания замороженной композиции или растворения обезвоженной композиции. 5 и 6 объекты – способ получения жидкой композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, для непосредственного введения субъекту, включающий оттаивание замороженной композиции или растворение обезвоженной композиции. Технический результат заключается в стабильности композиции при хранении в течение длительного периода времени и возможности вводить парентерально. 6 н. и 29 з.п. ф-лы, 71 ил., 10 табл., 28 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение касается способов получения РНК-липоплексных частиц для доставки РНК в целевые ткани после парентерального введения, в частности, после внутривенного введения, и композиций, содержащих такие РНК-липоплексные частицы (РНК-липоплексы). Настоящее изобретение также касается способов, позволяющих получать РНК-липоплексные частицы промышленным способом, соответствующим GMP. Кроме того, настоящее изобретение касается способов и композиций для хранения РНК-липоплексных частиц без существенной потери качества продукта, в частности, без существенной потери активности РНК. Описанные здесь препараты РНК-липоплексных частиц можно замораживать или дегидратировать методом лиофилизации, распылительной сушки или другим родственным методом, позволяющим продлевать срок хранения продуктов по сравнению с хранением в жидком состоянии. В одном воплощении РНК-липоплексные частицы содержат одноцепочечную РНК типа мРНК, которая кодирует представляющий интерес пептид или белок типа фармацевтически активного пептида или белка. РНК захватывается клетками целевой ткани, а затем транслируется в кодируемый пептид или белок, который может проявлять свою физиологическую активность. Представляющим интерес пептидом или белком может быть пептид или белок, содержащий один или несколько эпитопов для запуска или усиления иммунного ответа, направленного против одного или нескольких эпитопов. Описанные здесь способы и композиции подходят для применения таким образом, который соответствует требованиям к фармацевтическим продуктам, более конкретно таким, который соответствует требованиям для производства по GMP и требованиям к качеству фармацевтических препаратов для парентерального применения.
Уровень техники
Применение РНК для доставки чужеродной генетической информации в целевые клетки составляет привлекательную альтернативу ДНК. Преимущества применения РНК включают кратковременную экспрессию и нетрансформирующий характер. РНК не требуется проникать в ядро, чтобы экспрессироваться, более того, она не может встраиваться в геном хозяина, тем самым устраняя риск онкогенеза.
РНК можно доставлять при помощи так называемых липоплексных препаратов, в которых РНК связана с липосомами, состоящими из смеси катионного липида и вспомогательного липида, образуя препараты наночастиц для инъекций. Однако разработка препаратов для доставки биологически активной РНК в целевые ткани даже после хранения препаратов остается неудовлетворительной. Кроме того, все еще остается неудовлетворительной разработка методов производства препаратов РНК-липоплексных частиц для инъекций согласно GMP, обеспечивающих длительный срок хранения.
Таким образом, существует потребность в получении препаратов для доставки биологически активной РНК в целевые ткани, где введенная РНК эффективно транслируется в пептид или белок, который она кодирует. Кроме того, существует потребность в получении таких препаратов, которые сами по себе стабильны при хранении без существенной потери качества продукта, в частности, без существенной потери биологической активности РНК.
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что препараты РНК-липоплексных частиц, описанные здесь, удовлетворяют вышеприведенным требованиям.
Сущность изобретения
I. Способы получения РНК-липоплексных частиц, РНК-липоплексные частицы и композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы
В первом аспекте настоящего изобретения предусмотрены способы получения РНК-липоплексных частиц с улучшенной биологической активностью, РНК-липоплексные частицы, полученные по изобретению, и композиции, содержащие такие РНК-липоплексные частицы. РНК-липоплексные частицы и композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, применимы для доставки РНК в целевые ткани после парентерального введения, в частности, после внутривенного введения. РНК-липоплексные частицы получают с помощью липосом, которые получают путем впрыскивания в воду или подходящую водную фазу сильно концентрированного раствора липидов в этаноле. В одном воплощении препараты РНК-липоплексов характеризуются специфическим профилем рассеяния рентгеновских лучей, где наблюдается единственный пик Брэгга примерно при 1 нм−1, а ширина пика составляет менее 0,2 нм−1.
В одном воплощении липосомы и РНК-липоплексные частицы содержат 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA) и 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE). Концентрация DOPE в смеси липидов выше, чем равновесная растворимость DOPE в одном этаноле. При комнатной температуре растворимость самого DOPE составляет около 50 мМ, а вместе с DOTMA его растворимость составляет 100 мМ или выше. Липидные растворы для образования липосом, из которых получаются высокоактивные липоплексы, могут иметь общую концентрацию липидов 270 мМ и выше (например, DOPE при 90 мМ или выше). При повышении температуры можно получить растворы с еще большей концентрацией в этаноле. Липосомы, полученные из липидных растворов, в которых концентрация DOPE выше равновесной растворимости, значительно крупнее, чем липосомы из липидных растворов, в которых концентрация DOPE на уровне равновесной растворимости и ниже. Размер липосом монотонно возрастает с повышением концентрации в этаноле.
Липосомы, полученные согласно изобретению, можно использовать для получения РНК-липоплексных частиц путем смешивания липосом с РНК. В одном воплощении РНК перед смешиванием инкубируют с NaCl с тем, чтобы достичь определенной ионной силы, которая требуется для повышения активности липоплексов. Липоплексы, которые образуются из этих более крупных липосом, обладают значительно большей биологической активностью, как показали эксперименты in vitro и in vivo. Такие липоплексы с большей активностью можно четко отличить от липоплексов с меньшей активностью по определенным физико-химическим параметрам, к примеру: (i) меньшей ширине пика Брэгга и (ii) другому профилю разделения в дисперсионных аналитических методах измерения размеров типа фракционирования поле-поток. Липоплексы с меньшей активностью в среднем более мелкие. Кроме того, у них также и другой профиль элюции, который, вероятно, связан с такими параметрами, как молекулярная конформация, форма и взаимодействия с объемной фазой.
Соответственно, в этом аспекте изобретения предусмотрен способ получения липосомного коллоида, включающий впрыскивание в водную фазу раствора липидов в этаноле, получая липосомный коллоид, причем концентрация по меньшей мере одного из липидов в липидном растворе соответствует или превышает равновесную растворимость этого по меньшей мере одного липида в этаноле.
В одном воплощении способ включает нагревание раствора липидов для повышения концентрации липидов в липидном растворе. В одном воплощении раствор липидов нагревают до температуры по меньшей мере 40°C или по меньшей мере 60°C.
В одном воплощении раствор липидов представляет собой раствор смеси из двух или нескольких различных липидов.
В одном воплощении концентрация одного липида в липидном растворе соответствует или превышает равновесную растворимость этого липида в этаноле.
В одном воплощении общая концентрация липидов в липидном растворе составляет от 180 мМ до 600 мМ, от 300 мМ до 600 мМ или же 330 мМ.
В одном воплощении раствор липидов содержит по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
В одном воплощении концентрация дополнительного липида в растворе липидов соответствует или превышает равновесную растворимость дополнительного липида в этаноле.
В одном воплощении такой по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан(DOTMA) и/или 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP).
В одном воплощении такой по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), холестерин (Chol) и/или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC).
В одном воплощении такой по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA), а такой по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE).
В одном воплощении молярное отношение такого по меньшей мере одного катионного липида к такому по меньшей мере одному дополнительному липиду составляет от 10:0 до 1:9, от 4:1 до 1:2, от 3:1 до 1:1 или же 2:1.
В одном воплощении раствор липидов содержит DOTMA и DOPE в молярном соотношении от 10:0 до 1:9, от 4:1 до 1:2, от 3:1 до 1:1 или же 2:1.
В одном воплощении концентрация DOPE в растворе липидов составляет по меньшей мере 60 мМ или по меньшей мере 90 мМ.
В одном воплощении раствор липидов впрыскивают в водную фазу при скорости перемешивания водной фазы от 50 об/мин до 150 об/мин.
В одном воплощении водной фазой является вода.
В одном воплощении водная фаза имеет кислый pH. В одном воплощении водная фаза содержит уксусную кислоту, например, в количестве 5 мМ.
В одном воплощении способ дополнительно включает перемешивание липосомного коллоида.
В одном воплощении липосомный коллоид перемешивают от 15 мин до 60 мин или же 30 мин.
Изобретением также предусмотрен способ получения липосомного коллоида, включающий впрыскивание в воду раствора липидов в этаноле, содержащего DOTMA и DOPE в молярном соотношении 2:1, с перемешиванием со скоростью 150 об/мин, получая липосомный коллоид, причем концентрация DOTMA и DOPE в растворе липидов составляет 330 мМ.
В одном воплощении способ получения липосом не включает стадию экструдирования липосом.
Изобретением также предусмотрен липосомный коллоид, получаемый способом получения липосом.
В одном воплощении липосомы имеют средний диаметр по меньшей мере 250 нм.
В одном воплощении липосомы имеют средний диаметр, составляющий от 250 нм до 800 нм.
В одном воплощении липосомы имеют индекс полидисперсности менее 0,5, менее 0,4 или менее 0,3.
В одном воплощении липосомы представляют собой катионные липосомы.
В одном воплощении липосомы содержат по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
В одном воплощении такой по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан(DOTMA) и/или 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP).
В одном воплощении такой по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), холестерин (Chol) и/или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC).
В одном воплощении такой по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA), а такой по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE).
В одном воплощении молярное отношение такого по меньшей мере одного катионного липида к такому по меньшей мере одному дополнительному липиду составляет от 10:0 до 1:9, от 4:1 до 1:2, от 3:1 до 1:1 или же 2:1.
В одном воплощении липосомы содержат DOTMA и DOPE в молярном соотношении от 10:0 до 1:9, от 4:1 до 1:2, от 3:1 до 1:1 или же 2:1.
Изобретением также предусмотрен способ получения РНК-липоплексных частиц, включающий добавление вышеприведенного липосомного коллоида в раствор, содержащий РНК.
В одном воплощении профиль рассеяния рентгеновских лучей у РНК-липоплексов характеризуется единственным пиком Брэгга примерно при 1 нм−1, а ширина пика составляет менее 0,2 нм−1.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр, составляющий от 200 до 800 нм, от 250 до 700 нм, от 400 до 600 нм, от 300 нм до 500 нм или от 350 нм до 400 нм.
Изобретением также предусмотрены композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, получаемые, как описано выше.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы содержат по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
В одном воплощении РНК кодирует пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, причем отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах составляет от 1:2 до 1,9:2 или же 1,3:2,0.
Изобретением также предусмотрены композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, включающие:
РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, и
по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид,
причем отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах составляет от 1:2 до 1,9:2 или же 1,3:2,0,
а РНК-липоплексные частицы характеризуются единственным пиком Брэгга примерно при 1 нм−1, причем ширина пика составляет менее 0,2 нм−1.
В одном воплощении композиции также содержат хлорид натрия в концентрации от 10 мМ до 300 мМ, от 45 мМ до 300 мМ, от 10 мМ до 50 мМ или от 80 мМ до 150 мМ.
В одном воплощении композиции дополнительно содержат буфер.
В одном воплощении композиции дополнительно содержат хелатор.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы, описанные в этом аспекте раздела I, имеют средний диаметр, составляющий от 200 до 800 нм, от 250 до 700 нм, от 400 до 600 нм, от 300 нм до 500 нм или от 350 нм до 400 нм.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы имеют индекс полидисперсности менее 0,5, менее 0,4 или менее 0,3.
В одном воплощении данный по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA) и/или 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP).
В одном воплощении данный по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), холестерин (Chol) и/или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC).
В одном воплощении данный по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA), а данный по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE).
В одном воплощении молярное отношение данного по меньшей мере одного катионного липида к данному по меньшей мере одному дополнительному липиду составляет от 10:0 до 1:9, от 4:1 до 1:2, от 3:1 до 1:1 или же 2:1.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы содержат DOTMA и DOPE в молярном соотношении от 10:0 до 1:9, от 4:1 до 1:2, от 3:1 до 1:1 или же 2:1, причем соотношение положительных зарядов в DOTMA к отрицательным зарядам в РНК составляет от 1:2 до 1,9:2.
В одном воплощении хелатором является этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA).
В одном воплощении EDTA находится в концентрации от 0,25 мМ до 5 мМ или же 2,5 мМ.
В одном воплощении композиции дополнительно содержат адъювант.
В одном воплощении композиции составлены для системного введения.
В одном воплощении системное введение осуществляется путем внутривенного введения.
Изобретением также предусмотрены композиции, как описано, для терапевтического применения.
II. Способы получения РНК-липоплексных частиц промышленным способом, соответствующим GMP
Во втором аспекте настоящего изобретения предусмотрены способы, позволяющие получать РНК-липоплексные частицы промышленным способом, соответствующим GMP.
В одном воплощении изобретения для GMP-производства фармацевтических препаратов РНК-липоплексных частиц применяется система жидкостных каналов, которая позволяет точно контролировать соотношение РНК к липосомам при смешивании, что важно для качества продукта. В одном воплощении путь прохождения жидкости включает смешивание раствора липосом и раствора РНК в соотношении 1:1 (об/об), причем концентрации компонентов выбираются так, чтобы в точности поддерживалось намеченное соотношение зарядов. В одном воплощении РНК перед смешиванием инкубируют с NaCl с тем, чтобы достичь определенной ионной силы, которая требуется для активности липоплексов. В одном воплощении реализована смесительная установка Y-типа, полностью на основе одноразовых материалов. Динамика жидкостей оптимизирована для сохранения характеристик частиц и предотвращения засорения. Напротив, при использовании коммерчески доступных микрофлюидных устройств через некоторое время происходит засорение, что делает невозможным применение по GMP.
В одном воплощении липоплексы производятся путем инкубации РНК с катионными липосомами, причем соотношение при смешивании и условия смешивания точно контролируются при помощи шприцевого насоса (перфузора), причем в шприцевый насос вставляются два шприца, из которых один содержит липосомы, а другой – РНК, предпочтительно параллельно в один и тот же насос. Поршни обоих насосов перемещаются вперед одним и тем же приводом, тем самым точно контролируя относительные объемы при смешивании. При выбранных условиях процесса используются одинаковые шприцы для обоих растворов, что обеспечивает точное смешивание их один к одному (об/об). Регулируя концентрации двух растворов перед смешиванием, можно точно контролировать соотношение между РНК и липосомами (катионными липидами).
Соответственно, в этом аспекте изобретения предусмотрен способ непрерывного поточного производства РНК-липоплексных частиц, включающий смешивание раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего катионные липосомы, при контролируемых условиях смешивания РНК и катионных липосом.
В одном воплощении раствор, содержащий катионные липосомы, представляет собой липосомный коллоид, как описано выше.
В одном воплощении раствор, содержащий РНК, и раствор, содержащий катионные липосомы, являются водными растворами.
В одном воплощении используется такая скорость потока, которая позволяет смешивать раствор, содержащий РНК, и раствор, содержащий катионные липосомы.
В одном воплощении поток характеризуется числом Рейнольдса более 300 или от 500 до 2100.
В одном воплощении контролируемые условия смешивания включают контролирование соотношения при смешивании раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего катионные липосомы.
В одном воплощении контролируемые условия смешивания включают контролирование относительного объема раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего катионные липосомы, при смешивании.
В одном воплощении соотношение при смешивании РНК и катионных липосом контролируется путем смешивания одинаковых объемов (об/об) раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего катионные липосомы, и регулирования концентраций РНК и катионных липосом в соответствующих растворах.
В одном воплощении контролируемые условия смешивания выбирают так, чтобы сохранялись характеристики РНК-липоплексных частиц, избегая при этом закупоривания.
В одном воплощении способ включает использование смесительного элемента Y-типа или T-типа.
В одном воплощении смесительный элемент Y-типа или T-типа имеет диаметр от 1,2 мм до 50 мм.
В одном воплощении способ включает использование такого смесительного элемента, например, смесительного элемента Y-типа или T-типа, в котором жидкости из двух трубок или шлангов собираются вместе, но отсутствуют внутренние статические смесительные элементы, такие, например, как расщепление и воссоединение, ступенчатая “ёлочка”, зигзагообразные или скрученные каналы либо трехмерный змеевик. Смесительные элементы могут иметь диаметр от 1,2 до 50,0 мм.
В одном воплощении способ включает использование устройства, в котором два шприца, из которых один содержит раствор, содержащий катионные липосомы, а другой – раствор, содержащий РНК, вставляются параллельно в один или два держателя, а поршни устройства выдвигаются одним или двумя прецизионными механизмами. В одном воплощении способ включает использование шприцевого насоса, в котором параллельно в один и тот же насос вставляются два шприца, из которых один содержит раствор, содержащий катионные липосомы, а другой – раствор, содержащий РНК.
В одном воплощении способ включает использование нагнетательного сосуда, мембранного насоса, зубчатого насоса, насоса с магнитной левитацией, перистальтического насоса, насоса для HPLC/FPLC или любого другого поршневого насоса, необязательно в сочетании с датчиками расхода, необязательно с контуром обратной связи для онлайн-контроля и регулирования расхода в реальном времени.
В одном воплощении смесь из раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего липосомы, содержит хлорид натрия в концентрации от 45 мМ до 300 мМ или имеет ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации от 45 мМ до 300 мМ.
В одном воплощении раствор РНК содержит хлорид натрия в концентрации от 90 мМ до 600 мМ либо имеет ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации от 90 мМ до 600 мМ.
В одном воплощении смесь из раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего липосомы, имеет ионную силу по меньшей мере 50 мМ.
В одном воплощении профиль рассеяния рентгеновских лучей у РНК-липоплексов характеризуется единственным пиком Брэгга примерно при 1 нм−1, а ширина пика составляет менее 0,2 нм−1.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр, составляющий от 200 до 800 нм, от 250 до 700 нм, от 400 до 600 нм, от 300 нм до 500 нм или от 350 нм до 400 нм.
Изобретением также предусмотрены композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, получаемые, как описано выше.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы содержат по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
В одном воплощении РНК кодирует пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, причем отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах составляет от 1:2 до 1,9:2 или же 1,3:2,0.
Изобретением также предусмотрены композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, включающие:
РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, и
по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид,
причем отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах составляет от 1:2 до 1,9:2 или же 1,3:2,0,
а РНК-липоплексные частицы характеризуются единственным пиком Брэгга примерно при 1 нм−1, причем ширина пика составляет менее 0,2 нм−1.
В одном воплощении композиции также содержат хлорид натрия в концентрации от 10 мМ до 300 мМ, от 45 мМ до 300 мМ, от 10 мМ до 50 мМ или от 80 мМ до 150 мМ.
В одном воплощении композиции дополнительно содержат буфер.
В одном воплощении композиции дополнительно содержат хелатор.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы, описанные в этом аспекте раздела II, имеют средний диаметр, составляющий от 200 до 800 нм, от 250 до 700 нм, от 400 до 600 нм, от 300 нм до 500 нм или от 350 нм до 400 нм.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы имеют индекс полидисперсности менее 0,5, менее 0,4 или менее 0,3.
В одном воплощении данный по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA) и/или 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP).
В одном воплощении данный по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), холестерин (Chol) и/или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC).
В одном воплощении данный по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA), а данный по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE).
В одном воплощении молярное отношение данного по меньшей мере одного катионного липида к данному по меньшей мере одному дополнительному липиду составляет от 10:0 до 1:9, от 4:1 до 1:2, от 3:1 до 1:1 или же 2:1.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы содержат DOTMA и DOPE в молярном соотношении от 10:0 до 1:9, от 4:1 до 1:2, от 3:1 до 1:1 или же 2:1, причем отношение положительных зарядов в DOTMA к отрицательным зарядам в РНК составляет от 1:2 до 1,9:2.
В одном воплощении хелатором является этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA).
В одном воплощении EDTA находится в концентрации от 0,25 мМ до 5 мМ или же 2,5 мМ.
В одном воплощении композиции дополнительно содержат адъювант.
В одном воплощении композиции составлены для системного введения.
В одном воплощении системное введение осуществляется путем внутривенного введения.
Изобретением также предусмотрены композиции, как описано, для терапевтического применения.
III. Способы и композиции для хранения РНК-липоплексных частиц
В третьем аспекте настоящего изобретения предусмотрены способы и композиции для хранения РНК-липоплексных частиц без существенной потери качества продукта, в частности, без существенной потери активности РНК. В частности, настоящим изобретением предусмотрены составы, которые позволяют замораживать, лиофилизировать или высушивать распылением РНК-липоплексные частицы без существенной потери качества РНК-липоплексных частиц, в частности, без существенной потери активности РНК.
Описанные здесь препараты РНК-липоплексных частиц можно замораживать или обезвоживать методом лиофилизации, распылительной сушки или другим родственным методом, позволяющим продлевать срок хранения продуктов по сравнению с хранением в жидком состоянии.
Для того, чтобы обеспечить замораживание, добавляется стабилизатор (криопротектор). В одном воплощении липоплексы разбавляют стабилизатором (криопротектором) после изготовления, что позволяет регулировать ионную силу, предпочтительно снижать ионную силу, и регулировать надлежащую концентрацию стабилизатора. При замораживании препарата концентрация стабилизатора может превышать значение, необходимое для обеспечения физиологической осмоляльности. В этом случае препарат при введении разбавляют подходящей водной фазой (например, водой для инъекций, солевым раствором) с тем, чтобы довести его до требуемой осмоляльности и ионной силы. В качестве стабилизатора можно использовать такие сахара, как глюкоза, сахароза или трегалоза, а также и другие соединения типа декстрана.
Вне ожидания, оказалось, что препараты РНК-липоплексов по изобретению, содержащие стабилизаторы, как описано здесь, также можно лиофилизировать. Для лиофилизации необходимая концентрация стабилизатора (лиопротектора) может быть ниже, чем для замораживания, а допустимая концентрация NaCl (ионная сила) может быть выше, чем для замораживания. Препараты также можно подвергать распылительной сушке, если требуется экономичное обезвоживание в больших масштабах.
Значения pH некоторых препаратов РНК-липоплексов доводят до значений, которые ниже обычного физиологического диапазона и обычного оптимума pH для хранения РНК в общей фазе. Оптимальный pH составляет 6,2, а подходящий диапазон – от 5,7 до 6,7. Для других составов идеальный pH может быть еще ниже. Предполагается, что локальный pH внутри РНК-липоплексов выше, чем pH основной фазы из-за положительных зарядов катионного липида.
В тех воплощениях изобретения, в которых композиции РНК-липоплексов замораживают для хранения, эти композиции можно оттаивать и необязательно доводить осмоляльность, ионную силу и/или pH композиций путем добавления водной жидкости. Полученные композиции можно вводить субъектам.
В тех воплощениях изобретения, в которых композиции РНК-липоплексов лиофилизируют или высушивают замораживанием для хранения, эти композиции можно восстанавливать добавлением водной жидкости и необязательно доводить осмоляльность, ионную силу и/или pH композиций путем добавления водной жидкости. Полученные композиции можно вводить субъектам.
Соответственно, в этом аспекте изобретения предусмотрен способ получения замороженных композиций, содержащих РНК-липоплексные частицы, включающий (i) получение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, и (ii) замораживание композиции.
В одном воплощении замораживание проводится при температуре от -15°C до -40°C или при -30°C.
В одном воплощении композиции хранятся, к примеру, при температуре хранения от -15°C до -40°C или при -20°C.
В одном воплощении стабилизатором является углевод, выбранный из моносахаридов, дисахаридов, трисахаридов, сахароспиртов, олигосахаридов или соответствующих им сахароспиртов и неразветвленных полиспиртов.
В одном воплощении получение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, включает получение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, и добавление стабилизатора в водную композицию, содержащую РНК-липоплексные частицы.
В одном воплощении добавление стабилизатора в водную композицию, содержащую РНК-липоплексные частицы, снижает ионную силу водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы.
В одном воплощении концентрация стабилизатора в водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, превышает значение, необходимое для физиологической осмоляльности.
В одном воплощении концентрация стабилизатора в водной композиции, содержащей РНК-липоплексы и стабилизатор, достаточна для поддержания качества РНК-липоплексных частиц, в частности, для предотвращения существенной потери активности РНК после хранения композиции при температуре от -15°C до -40°C в течение по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев или по меньшей мере 36 месяцев.
В одном воплощении концентрация стабилизатора в водной композиции, содержащей РНК-липоплексы и стабилизатор, составляет от 5% до 35,0% (мас./об), от 10% до 30,0% (мас./об), от 12,5% до 25,0% (мас./об) или же 22,0% (мас./об).
В одном воплощении pH водной композиции, содержащей РНК-липоплексы и стабилизатор, меньше обычного pH-оптимума для хранения РНК.
В одном воплощении водная композиция, содержащая РНК-липоплексы и стабилизатор, включает хлорид натрия в концентрации от 10 мМ до 50 мМ или имеет ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации от 10 мМ до 50 мМ.
В одном воплощении водная композиция, содержащая РНК-липоплексы и стабилизатор, имеет ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации 20 мМ.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы получают способом, описанным выше в разделах I и II.
В одном воплощении способ получения замороженных композиций дополнительно включает хранение замороженной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы. Композиции могут храниться при температуре, которая соответствует или практически соответствует температуре замерзания, либо при температуре, которая выше или ниже температуры замерзания. Обычно композиции хранятся при температуре от -15°C до -40°C, например, при -20°C.
Изобретением также предусмотрены композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, которые получают вышеизложенным способом получения замороженных композиций. Изобретением также предусмотрены композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, которые получают вышеизложенным способом получения композиций для замораживания.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы содержат по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
В одном воплощении РНК кодирует пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, причем отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах составляет от 1:2 до 1,9:2 или же 1,3:2,0.
В одном воплощении композиции также содержат хлорид натрия в концентрации от 10 мМ до 50 мМ.
Изобретением также предусмотрены композиции, содержащие:
РНК-липоплексные частицы, включающие:
РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, и
по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид,
причем отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах составляет от 1:2 до 1,9:2 или же 1,3:2,0,
хлорид натрия в концентрации от 0 мМ до 40 мМ и
стабилизатор.
В одном воплощении композиции также содержат буфер.
В одном воплощении количество РНК в композиции составляет от 0,01 мг/мл до 1 мг/мл, от 0,05 мг/мл до 0,5 мг/мл или же 0,05 мг/мл.
В одном воплощении хлорид натрия находится в концентрации от 20 мМ до 30 мМ.
В одном воплощении хлорид натрия находится в концентрации 20 мМ.
В одном воплощении хлорид натрия находится в концентрации 30 мМ.
В одном воплощении концентрация стабилизатора в композиции превышает значение, необходимое для физиологической осмоляльности.
В одном воплощении концентрация стабилизатора в композиции составляет от 5% до 35,0% (мас./об) или от 12,5% до 25,0% (мас./об).
В одном воплощении стабилизатором является углевод, выбранный из моносахаридов, дисахаридов, трисахаридов, сахароспиртов, олигосахаридов или соответствующих им сахароспиртов и неразветвленных полиспиртов.
В одном воплощении стабилизатором является сахароза в концентрации от 5% до 25% (мас./об).
В одном воплощении сахароза находится в концентрации от 15% (мас./об) до 25% (мас./об).
В одном воплощении сахароза находится в концентрации от 20% (мас./об) до 25% (мас./об).
В одном воплощении сахароза находится в концентрации 22% (мас./об).
В одном воплощении сахароза находится в концентрации 20% (мас./об).
В одном воплощении композиции имеют pH ниже обычного pH-оптимума для хранения РНК.
В одном воплощении композиции имеют pH от 5,7 до 6,7 или же 6,2.
В одном воплощении буфером является 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновая кислота (HEPES).
В одном воплощении HEPES находится в концентрации от 2,5 мМ до 10 мМ или же 7,5 мМ.
В одном воплощении композиции дополнительно содержат хелатор.
Изобретением также предусмотрены композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы и включающие:
РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, в концентрации 0,05 мг/мл,
DOTMA и DOPE в молярном соотношении 2:1,
причем отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах составляет 1,3:2,0,
хлорид натрия в концентрации 20 мМ,
сахарозу в концентрации 22% (мас./об),
HEPES в концентрации 7,5 мМ при pH 6,2 и
EDTA в концентрации 2,5 мМ.
В одном воплощении композиции находятся в жидком или замороженном состоянии.
В одном воплощении замороженные композиции стабильны при температуре от -15°C до -40°C в течение по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев или по меньшей мере 36 месяцев.
В одном воплощении замороженные композиции стабильны при температуре -15°C в течение по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев или по меньшей мере 36 месяцев.
В одном воплощении замороженные композиции стабильны при температуре -15°C в течение по меньшей мере 2 месяцев.
В одном воплощении замороженные композиции стабильны при температуре -20°C в течение по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев или по меньшей мере 36 месяцев.
В одном воплощении замороженные композиции стабильны при температуре -20°C в течение по меньшей мере 2 месяцев.
В одном воплощении замороженные композиции стабильны при температуре -30°C в течение по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев или по меньшей мере 36 месяцев.
В одном воплощении замороженные композиции стабильны при температуре -30°C в течение по меньшей мере 2 месяцев.
Изобретением также предусмотрены водные композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, получаемые путем оттаивания вышеприведенных замороженных композиций и необязательно доведения осмоляльности и ионной силы добавлением водной жидкости.
В одном воплощении осмоляльность композиций составляет от 200 мОсмоль/кг до 450 мОсмоль/кг.
В одном воплощении композиции содержат хлорид натрия в концентрации от 80 мМ до 150 мМ.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы получают способом, описанным выше в разделах I и II.
Изобретением также предусмотрен способ получения обезвоженных, например, лиофилизованных или высушенных распылением композиций, содержащих РНК-липоплексные частицы, включающий (i) получение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, и (ii) обезвоживание, например, лиофилизацию или распылительную сушку композиции.
В одном воплощении стабилизатором является углевод, выбранный из моносахаридов, дисахаридов, трисахаридов, сахароспиртов, олигосахаридов или соответствующих им сахароспиртов и неразветвленных полиспиртов.
В одном воплощении получение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, включает получение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, и добавление стабилизатора в водную композицию, содержащую РНК-липоплексные частицы. Соответственно, способ получения композиций для обезвоживания, например, лиофилизации или распылительной сушки, включает получение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, и добавление стабилизатора в водную композицию, содержащую РНК-липоплексные частицы.
В одном воплощении добавление стабилизатора в водную композицию, содержащую РНК-липоплексные частицы, снижает ионную силу водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы.
В одном воплощении концентрация стабилизатора в водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, превышает значение, необходимое для физиологической осмоляльности.
В одном воплощении концентрация стабилизатора в водной композиции, содержащей РНК-липоплексы и стабилизатор, достаточна для поддержания качества РНК-липоплексных частиц, в частности, для предотвращения существенной потери активности РНК после хранения композиции в течение по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 24 месяца или по меньшей мере 36 месяцев.
В одном воплощении концентрация стабилизатора в водной композиции, содержащей РНК-липоплексы и стабилизатор, составляет от 5% до 35,0% (мас./об), от 10% до 30,0% (мас./об), от 12,5% до 25,0% (мас./об) или же 22,0% (мас./об).
В одном воплощении pH водной композиции, содержащей РНК-липоплексы и стабилизатор, меньше обычного pH-оптимума для хранения РНК.
В одном воплощении водная композиция, содержащая РНК-липоплексы и стабилизатор, включает хлорид натрия в концентрации от 10 мМ до 80 мМ или от 10 мМ до 50 мМ либо имеет ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации от 10 мМ до 80 мМ или от 10 мМ до 50 мМ.
В одном воплощении водная композиция, содержащая РНК-липоплексы и стабилизатор, имеет ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации 20 мМ, или 40 мМ, или 60 мМ, или 80 мМ.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы получают способом, описанным выше в разделах I и II.
В одном воплощении способ получения обезвоженных, например, лиофилизированных или высушенных распылением композиций дополнительно включает хранение лиофилизированных или высушенных распылением композиций, содержащих РНК-липоплексные частицы. Обычно композиции хранятся при температуре от -15°C до -40°C, например, при -20°C. В некоторых воплощениях композиции хранятся при температуре выше 0°C, например, при 25°C или 4°C или, к примеру, при комнатной температуре.
Изобретением также предусмотрены композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, которые получают вышеизложенным способом получения обезвоженных, например, лиофилизованных или высушенных распылением композиций. Изобретением также предусмотрены композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, которые получают вышеизложенным способом получения композиций для обезвоживания, например, лиофилизации или распылительной сушки.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы содержат по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
В одном воплощении РНК кодирует пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, причем отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах составляет от 1:2 до 1,9:2 или же 1,3:2,0.
В одном воплощении композиции также содержат хлорид натрия в концентрации от 10 мМ до 80 мМ или от 10 мМ до 50 мМ.
Изобретением также предусмотрены композиции, содержащие:
РНК-липоплексные частицы, включающие:
РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, и
по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид,
причем отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах составляет от 1:2 до 1,9:2 или же 1,3:2,0,
хлорид натрия в концентрации от 0 мМ до 40 мМ и
стабилизатор.
В одном воплощении композиции также содержат буфер.
В одном воплощении количество РНК в композиции составляет от 0,01 мг/мл до 1 мг/мл, от 0,05 мг/мл до 0,5 мг/мл или же 0,05 мг/мл.
В одном воплощении хлорид натрия находится в концентрации от 20 мМ до 30 мМ.
В одном воплощении хлорид натрия находится в концентрации 20 мМ.
В одном воплощении хлорид натрия находится в концентрации 30 мМ.
В одном воплощении концентрация стабилизатора в композиции превышает значение, необходимое для физиологической осмоляльности.
В одном воплощении концентрация стабилизатора в композиции составляет от 5% до 35% (мас./об) или от 10% до 25% (мас./об).
В одном воплощении стабилизатором является углевод, выбранный из моносахаридов, дисахаридов, трисахаридов, сахароспиртов, олигосахаридов или соответствующих им сахароспиртов и неразветвленных полиспиртов.
В одном воплощении стабилизатором является трегалоза в концентрации от 5% до 35% (мас./об).
В одном воплощении трегалоза находится в концентрации от 5% (мас./об) до 25% (мас./об).
В одном воплощении трегалоза находится в концентрации от 10% (мас./об) до 25% (мас./об).
В одном воплощении трегалоза находится в концентрации 10% (мас./об).
В одном воплощении трегалоза находится в концентрации 15% (мас./об).
В одном воплощении композиции имеют pH ниже обычного pH-оптимума для хранения РНК.
В одном воплощении композиции имеют pH от 5,7 до 6,7 или же 6,2.
В одном воплощении буфером является 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновая кислота (HEPES).
В одном воплощении HEPES находится в концентрации от 2,5 мМ до 10 мМ или же 7,5 мМ.
В одном воплощении композиции дополнительно содержат хелатор.
Изобретением также предусмотрены композиции, содержащие:
РНК-липоплексные частицы, включающие:
РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, в концентрации 0,05 мг/мл, и
DOTMA и DOPE в молярном соотношении 2:1,
причем отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах составляет 1,3:2,0,
хлорид натрия в концентрации 20 мМ,
трегалозу в концентрации 10% (мас./об),
HEPES в концентрации 7,5 мМ при pH 6,2 и
EDTA в концентрации 2,5 мМ.
В одном воплощении композиции находятся в жидком или обезвоженном, например, лиофилизованном или высушенном замораживанием состоянии.
В одном воплощении обезвоженные, например, лиофилизированные или высушенные замораживанием композиции стабильны в течение по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев или по меньшей мере 36 месяцев. В одном воплощении композиции хранятся при температуре выше 0°C, например, при 25°C или 4°C или, к примеру, при комнатной температуре.
В одном воплощении обезвоженные, например, лиофилизированные или высушенные замораживанием композиции стабильны в течение по меньшей мере 1 месяца.
В одном воплощении обезвоженные, например, лиофилизированные или высушенные замораживанием композиции стабильны в течение по меньшей мере 2 месяцев.
Изобретением также предусмотрены водные композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, которые получают путем восстановления вышеуказанных обезвоженных, например, лиофилизированных или высушенных замораживанием композиций и необязательно доведения осмоляльности и ионной силы добавлением водной жидкости.
В одном воплощении осмоляльность композиций составляет от 150 мОсмоль/кг до 450 мОсмоль/кг.
В одном воплощении композиции содержат хлорид натрия в концентрации от 80 мМ до 150 мМ.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы получают способом, описанным выше в разделах I и II.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы, описанные в этом аспекте раздела III, характеризуются единственным пиком Брэгга примерно при 1 нм−1, причем ширина пика составляет менее 0,2 нм−1.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы, описанные в этом аспекте раздела III, имеют средний диаметр, составляющий от 200 до 800 нм, от 250 до 700 нм, от 400 до 600 нм, от 300 нм до 500 нм или от 350 нм до 400 нм.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы имеют индекс полидисперсности менее 0,5, менее 0,4 или менее 0,3.
В одном воплощении данный по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA) и/или 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP).
В одном воплощении данный по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), холестерин (Chol) и/или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC).
В одном воплощении данный по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA), а данный по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE).
В одном воплощении молярное отношение данного по меньшей мере одного катионного липида к данному по меньшей мере одному дополнительному липиду составляет от 10:0 до 1:9, от 4:1 до 1:2, от 3:1 до 1:1 или же 2:1.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы содержат DOTMA и DOPE в молярном соотношении от 10:0 до 1:9, от 4:1 до 1:2, от 3:1 до 1:1 или же 2:1, причем отношение положительных зарядов в DOTMA к отрицательным зарядам в РНК составляет от 1:2 до 1,9:2.
В одном воплощении хелатором является этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA).
В одном воплощении EDTA находится в концентрации от 0,25 мМ до 5 мМ или же 2,5 мМ.
В одном воплощении композиции дополнительно содержат адъювант.
В одном воплощении композиции составлены для системного введения.
В одном воплощении системное введение осуществляется путем внутривенного введения.
Изобретением также предусмотрены композиции, как описано, для терапевтического применения.
Изобретением также предусмотрен способ получения водных композиций, содержащих РНК-липоплексные частицы, включающий оттаивание замороженной композиции, описанной выше, или восстановление лиофилизированной или высушенной распылением композиции, описанной выше, и необязательно доведение осмоляльности и ионной силы путем добавления водной жидкости.
В одном воплощении водная жидкость добавляется до получения осмоляльности композиции от 200 мОсмоль/кг до 450 мОсмоль/кг.
В одном воплощении водная жидкость добавляется до получения концентрации хлорида натрия от 80 мМ до 150 мМ.
Некоторые описанные здесь составы РНК-липоплексов, которые подходят для хранения РНК-липоплексных частиц без существенных потерь качества продукта, в частности, без существенных потерь активности РНК, не требуют модификации продукта, в частности, разбавления продукта водной фазой (например, водой для инъекций, солевым раствором) для доведения до требуемой осмоляльности и ионной силы перед введением. Такие препараты РНК-липоплексов можно вводить непосредственно после хранения и необязательно после размораживания или восстановления продукта. В тех воплощениях изобретения, в которых композиции РНК-липоплексов замораживают для хранения, эти композиции можно оттаивать и вводить без необходимости в доведении осмоляльности, ионной силы и/или pH композиции.
Соответственно, изобретением предусмотрены композиции, содержащие:
РНК-липоплексные частицы, включающие:
РНК и
по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид,
хлорид натрия в концентрации 10 мМ или меньше,
стабилизатор в концентрации 10% (мас./об) или меньше и
буфер.
В одном воплощении хлорид натрия находится в концентрации от 5 мМ до 10 мМ. В одном воплощении хлорид натрия находится в концентрации 7,5 мМ или меньше типа от 5 мМ до 7,5 мМ. В одном воплощении хлорид натрия находится в концентрации 6,5 мМ или 7,5 мМ.
В одном воплощении концентрация соли и/или стабилизатора в композиции примерно равна значению, необходимому для физиологической осмоляльности. В одном воплощении осмоляльность, возникающая от растворенных компонентов, включая ионные
и неионные компоненты, примерно равна значению, необходимому для физиологической осмоляльности.
и неионные компоненты, примерно равна значению, необходимому для физиологической осмоляльности.
В одном воплощении концентрация стабилизатора в композиции составляет от 5% до 10% (мас./об). В одном воплощении концентрация стабилизатора в композиции составляет от 5% до 7,5% (мас./об). В одном воплощении концентрация стабилизатора в композиции составляет от 7,5% до 10% (мас./об).
В одном воплощении стабилизатором является углевод, выбранный из моносахаридов, дисахаридов, трисахаридов, сахароспиртов, олигосахаридов или соответствующих им сахароспиртов и неразветвленных полиспиртов.
В одном воплощении стабилизатором является сахароза или трегалоза. В одном воплощении стабилизатором является сахароза в концентрации от 5% до 10% (мас./об). В одном воплощении сахароза находится в концентрации 10% (мас./об). В одном воплощении стабилизатором является трегалоза в концентрации от 5% до 10% (мас./об). В одном воплощении трегалоза находится в концентрации 10% (мас./об).
В одном воплощении буфер выбран из группы, состоящей из 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновой кислоты (HEPES), гистидина, уксусной кислоты/ацетата натрия и MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты). В одном воплощении буфером является HEPES, гистидин или MES. В одном воплощении буфером является HEPES или MES. В одном воплощении буфером является HEPES.
В одном воплощении композиции имеют pH от 6,0 до 7,2, от 6,0 до 7,0, от 6,2 до 7,0, от 6,5 до 7,0 или от 6,5 до 6,7. В одном воплощении композиции имеют pH 6,5 или 6,7.
В одном воплощении буфер присутствует в концентрации от 2,5 мМ до 10 мМ. В одном воплощении буфер присутствует в концентрации от 2,5 мМ до 5 мМ. В одном воплощении буфер присутствует в концентрации от 5 мМ до 10 мМ. В одном воплощении буфер присутствует в концентрации от 5 мМ до 7,5 мМ. В одном воплощении буфер присутствует в концентрации от 7,5 мМ до 10 мМ. В одном воплощении буфер присутствует в концентрации 7,5 мМ.
В одном воплощении буфером является HEPES в концентрации 7,5 мМ или меньше, например, от 2,5 мМ до 7,5 мМ или от 5 мМ до 7,5 мМ, при pH 6,5 или 6,7.
В одном воплощении данный по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA) и/или 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP). В одном воплощении данный по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), холестерин (Chol) и/или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC). В одном воплощении данный по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA), а данный по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE).
В одном воплощении молярное отношение данного по меньшей мере одного катионного липида к данному по меньшей мере одному дополнительному липиду составляет от 10:0 до 1:9, от 4:1 до 1:2, от 3:1 до 1:1 или же 2:1.
В одном воплощении РНК-липоплексные частицы содержат DOTMA и DOPE в молярном соотношении от 10:0 до 1:9, от 4:1 до 1:2, от 3:1 до 1:1 или же 2:1.
В одном воплощении композиции дополнительно содержат хелатор. В одном воплощении хелатором является этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA). В одном воплощении EDTA находится в концентрации 3,5 мМ или менее, или от 0,25 мМ до 3,5 мМ или от 0,25 мМ до 2,5 мМ.
В одном воплощении описанных здесь композиций РНК кодирует пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, причем отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в композициях составляет от 1:2 до 1,9:2 или же 1,3:2,0.
Изобретением также предусмотрены композиции, содержащие:
РНК-липоплексные частицы, включающие:
РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, и
DOTMA и DOPE в молярном соотношении 2:1,
причем отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в композиции составляет 1,3:2,0,
хлорид натрия в концентрации 7,5 мМ,
сахарозу в концентрации 10% (мас./об),
HEPES в концентрации 7,5 мМ при pH 6,5 или 6,7 и
EDTA в концентрации 2,5 мМ.
В одном воплощении описанных здесь композиций РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр, составляющий от 200 до 800 нм, от 250 до 700 нм, от 400 до 600 нм, от 300 нм до 500 нм или от 350 нм до 400 нм.
В одном воплощении описанных здесь композиций количество РНК в композиции составляет от 0,01 мг/мл до 1 мг/мл, от 0,05 мг/мл до 0,5 мг/мл, примерно 0,05 мг/мл или 0,02 мг/мл.
В одном воплощении описанных здесь композиций они дополнительно содержат адъювант.
В одном воплощении описанных здесь композиций они находятся в жидком, замороженном или обезвоженном состоянии.
В одном воплощении композиции представляют собой замороженные композиции и стабильны при температуре -15°C в течение по меньшей мере одного месяца. В одном воплощении композиции представляют собой замороженные композиции и стабильны при температуре -15°C в течение по меньшей мере двух месяцев. В одном воплощении композиции представляют собой замороженные композиции и стабильны при температуре -15°C в течение по меньшей мере 4 месяцев. В одном воплощении композиции представляют собой замороженные композиции и стабильны при температуре -15°C в течение по меньшей мере 6 месяцев.
Изобретением также предусмотрены жидкие композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, получаемые при оттаивании описанных здесь замороженных композиций. В одном воплощении жидкие композиции имеют состав, как описано выше.
Изобретением также предусмотрены жидкие композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, получаемые при растворении описанных здесь обезвоженных композиций. В одном воплощении жидкие композиции имеют состав, как описано выше.
В одном воплощении описанные здесь жидкие композиции представляют собой водные композиции.
В одном воплощении композиции, в частности, описанные здесь жидкие композиции, можно вводить непосредственно субъектам.
В одном воплощении описанные здесь композиции представляют собой фармацевтические композиции.
В одном воплощении описанные здесь композиции находятся в форме для системного введения.
В одном воплощении системное введение осуществляется путем внутривенного введения.
Изобретением также предусмотрены композиции, описанные здесь, для терапевтического применения.
Изобретением также предусмотрен способ получения жидких композиций, содержащих РНК-липоплексные частицы, для непосредственного введения субъектам, включающий оттаивание описанных здесь замороженных композиций. Изобретением также предусмотрен способ получения жидких композиций, содержащих РНК-липоплексные частицы, для непосредственного введения субъектам, включающий растворение описанных здесь обезвоженных композиций. В одном воплощении описанных здесь способов жидкие композиции представляют собой водные композиции. В одном воплощении жидкие композиции имеют состав, как описано выше. Для терапевтического применения, как описано здесь, жидкие композиции, описанные здесь, вводятся субъектам.
Далее приведены следующие воплощения изобретения.
1. Способ получения липосомного коллоида, включающий впрыскивание в водную фазу раствора липидов в этаноле для получения липосомного коллоида, причем концентрация по меньшей мере одного из липидов в липидном растворе соответствует или превышает равновесную растворимость этого по меньшей мере одного липида в этаноле.
2. Способ по п. 1, при этом раствор липидов представляет собой раствор смеси из двух или нескольких различных липидов.
3. Способ по любому из пп. 1 или 2, при этом концентрация одного из липидов в липидном растворе соответствует или превышает равновесную растворимость этого липида в этаноле при комнатной температуре.
4. Способ по любому из пп. 1-3, при этом общая концентрация липидов в растворе липидов составляет от 180 мМ до 600 мМ, от 300 мМ до 600 мМ или же 330 мМ.
5. Способ по любому из пп. 1-4, при этом раствор липидов содержит по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
6. Способ по любому из пп. 1-5, при этом концентрация дополнительного липида в растворе липидов соответствует или превышает равновесную растворимость дополнительного липида в этаноле.
7. Способ по любому из пп. 5 или 6, при этом такой по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан(DOTMA) и/или 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP).
8. Способ по любому из пп. 5-7, при этом такой по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), холестерин (Chol) и/или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC).
9. Способ по любому из пп. 5-8, при этом такой по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA), а такой по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE).
10. Способ по любому из пп. 5-9, при этом молярное отношение данного по меньшей мере одного катионного липида к данному по меньшей мере одному дополнительному липиду составляет от 10:0 до 1:9, от 4:1 до 1:2, от 3:1 до 1:1 или же 2:1.
11. Способ по любому из пп. 1-10, при этом раствор липидов содержит DOTMA и DOPE в молярном соотношении от 10:0 до 1:9, от 4:1 до 1:2, от 3:1 до 1:1 или же 2:1.
12. Способ по любому из пп. 8-11, при этом концентрация DOPE в растворе липидов составляет по меньшей мере 60 мМ или по меньшей мере 90 мМ.
13. Способ по любому из пп. 1-12, при этом раствор липидов впрыскивают в водную фазу при скорости перемешивания водной фазы от 50 об/мин до 150 об/мин.
14. Способ по любому из пп. 1-13, при этом водной фазой является вода.
15. Способ по любому из пп. 1-14, при этом способ дополнительно включает перемешивание липосомного коллоида.
16. Способ по любому из пп. 1-15, при этом липосомный коллоид перемешивают от 15 мин до 60 мин или же 30 мин.
17. Способ получения липосомного коллоида, включающий впрыскивание в воду раствора липидов в этаноле, содержащего DOTMA и DOPE в молярном соотношении 2:1, с перемешиванием со скоростью 150 об/мин для получения липосомного коллоида, причем концентрация DOTMA и DOPE в растворе липидов составляет 330 мМ.
18. Липосомный коллоид, получаемый способом по любому из пп. 1-17.
19. Липосомный коллоид по п. 18, при этом липосомы имеют средний диаметр по меньшей мере 250 нм.
20. Липосомный коллоид по любому из пп. 18 или 19, при этом липосомы имеют средний диаметр, оставляющий от 250 нм до 800 нм.
21. Липосомный коллоид по любому из пп. 18-20, при этом липосомы представляют собой катионные липосомы.
22. Липосомный коллоид по любому из пп. 18-21, при этом липосомы содержат по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
23. Липосомный коллоид по п. 22, при этом такой по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан(DOTMA) и/или 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP).
24. Липосомный коллоид по любому из пп. 22 или 23, при этом такой по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), холестерин (Chol) и/или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC).
25. Липосомный коллоид по любому из пп. 22-24, при этом такой по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA), а такой по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE).
26. Липосомный коллоид по любому из пп. 22-25, при этом молярное отношение данного по меньшей мере одного катионного липида к данному по меньшей мере одному дополнительному липиду составляет от 10:0 до 1:9, от 4:1 до 1:2, от 3:1 до 1:1 или же 2:1.
27. Липосомный коллоид по любому из пп. 18-26, при этом липосомы содержат DOTMA и DOPE в молярном соотношении от 10:0 до 1:9, от 4:1 до 1:2, от 3:1 до 1:1 или же 2:1.
28. Способ получения РНК-липоплексных частиц, включающий добавление липосомного коллоида по любому из пп. 18-27 в раствор, содержащий РНК.
29. Способ непрерывного поточного производства РНК-липоплексных частиц, включающий смешивание раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего катионные липосомы, при контролируемых условиях смешивания РНК и катионных липосом.
30. Способ по п. 29, при этом раствор, содержащий катионные липосомы, представляет собой липосомный коллоид по любому из пп. 18-27.
31. Способ по любому из пп. 29 или 30, при этом раствор, содержащий РНК, и раствор, содержащий катионные липосомы, являются водными растворами.
32. Способ по любому из пп. 29-31, в котором используется такая скорость потока, которая позволяет смешивать раствор, содержащий РНК, и раствор, содержащий катионные липосомы.
33. Способ по любому из пп. 29-32, при этом поток характеризуется числом Рейнольдса более 300 или от 500 до 2100.
34. Способ по любому из пп. 29-33, при этом контролируемые условия смешивания включают контролирование соотношения при смешивании раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего катионные липосомы.
35. Способ по любому из пп. 29-34, при этом контролируемые условия смешивания включают контролирование относительного объема раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего катионные липосомы, при смешивании.
36. Способ по любому из пп. 29-35, при этом соотношение при смешивании РНК и катионных липосом контролируется путем смешивания одинаковых объемов (об/об) раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего катионные липосомы, и регулирования концентраций РНК и катионных липосом в соответствующих растворах.
37. Способ по любому из пп. 29-36, при этом контролируемые условия смешивания выбирают так, чтобы сохранялись характеристики РНК-липоплексных частиц, избегая при этом закупоривания.
38. Способ по любому из пп. 29-37, при этом способ включает использование смесительного элемента Y-типа или T-типа.
39. Способ по любому из пп. 29-38, при этом смесительный элемент Y-типа или T-типа имеет диаметр от 1,2 мм до 50 мм.
40. Способ по любому из пп. 29-39, при этом способ включает использование шприцевого насоса, в котором параллельно в один и тот же насос вставляют два шприца, один из которых содержит раствор, содержащий катионные липосомы, а другой – раствор, содержащий РНК.
41. Способ по любому из пп. 29-40, при этом способ включает использование нагнетательного сосуда, мембранного насоса, зубчатого насоса, насоса с магнитной левитацией или перистальтического насоса в сочетании с датчиками расхода, необязательно с контуром обратной связи для онлайн-контроля и регулирования расхода в реальном времени.
42. Способ по любому из пп. 29-41, при этом смесь из раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего липосомы, содержит хлорид натрия в концентрации от 45 мМ до 300 мМ либо имеет ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации от 45 мМ до 300 мМ.
43. Способ по любому из пп. 29-42, при этом смесь из раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего липосомы, имеет ионную силу по меньшей мере 50 мМ.
44. Способ по любому из пп. 28-43, при этом профиль рассеяния рентгеновских лучей у РНК-липоплексов характеризуется единственным пиком Брэгга примерно при 1 нм−1, а ширина пика составляет менее 0,2 нм−1.
45. Способ по любому из пп. 28-44, при этом РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр, составляющий от 200 до 800 нм, от 250 до 700 нм, от 400 до 600 нм, от 300 нм до 500 нм или от 350 нм до 400 нм.
46. Способ получения замороженной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, включающий (i) получение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, и (ii) замораживание композиции.
47. Способ по п. 46, при этом замораживание проводят при температуре от -15°C до -40°C или при -30°C.
48. Способ по п. 47, при этом стабилизатором является углевод, выбранный из моносахаридов, дисахаридов, трисахаридов, сахароспиртов, олигосахаридов или соответствующих им сахароспиртов и неразветвленных полиспиртов.
49. Способ по любому из пп. 46-48, при этом получение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, включает получение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, и добавление стабилизатора в водную композицию, содержащую РНК-липоплексные частицы.
50. Способ по любому из пп. 46-49, при этом добавление стабилизатора
в водную композицию, содержащую РНК-липоплексные частицы, снижает ионную силу водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы.
в водную композицию, содержащую РНК-липоплексные частицы, снижает ионную силу водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы.
51. Способ по любому из пп. 46-50, при этом концентрация стабилизатора в водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, превышает значение, необходимое для физиологической осмоляльности.
52. Способ по любому из пп. 46-51, при этом концентрация стабилизатора в водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, достаточна для поддержания качества РНК-липоплексных частиц, в частности, для предотвращения существенной потери активности РНК после хранения композиции при температуре от -15°C до -40°C в течение по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев или по меньшей мере 36 месяцев.
53. Способ по любому из пп. 46-52, при этом pH водной композиции, содержащей РНК-липоплексы и стабилизатор, меньше обычного pH-оптимума для хранения РНК.
54. Способ по любому из пп. 46-53, при этом водная композиция, содержащая РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, включает хлорид натрия в концентрации от 10 мМ до 50 мМ или имеет ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации от 10 мМ до 50 мМ.
55. Способ по любому из пп. 46-54, при этом водная композиция, содержащая РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, имеет ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации 20 мМ.
56. Способ по любому из пп. 46-55, при этом РНК-липоплексные частицы получают способом по любому из пп. 28-44.
57. Композиция, содержащая РНК-липоплексные частицы, которые получены способом по любому из пп. 28-45.
58. Композиция по п. 57, при этом РНК-липоплексные частицы содержат по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
59. Композиция по любому из пп. 57 или 58, при этом РНК кодирует пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, причем отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах составляет от 1:2 до 1,9:2 или же 1,3:2,0.
60. Композиция, содержащая РНК-липоплексные частицы, включающие:
РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, и
по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид,
причем отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах составляет от 1:2 до 1,9:2 или же 1,3:2,0,
а РНК-липоплексные частицы характеризуются единственным пиком Брэгга примерно при 1 нм−1, причем ширина пика составляет менее 0,2 нм−1.
61. Композиция по любому из пп. 57-60, при этом композиция также содержит хлорид натрия в концентрации от 10 мМ до 300 мМ, от 45 мМ до 300 мМ, от 10 мМ до 50 мМ или от 80 мМ до 150 мМ.
62. Композиция по любому из пп. 57-61, при этом композиция дополнительно содержит буфер.
63. Композиция по любому из пп. 57-62, при этом композиция дополнительно содержит хелатор.
64. Композиция, содержащая РНК-липоплексные частицы, которые получены способом по любому из пп. 46-56.
65. Композиция по п. 64, при этом РНК-липоплексные частицы содержат по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
66. Композиция по любому из пп. 64 или 65, при этом РНК кодирует пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, причем отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах составляет от 1:2 до 1,9:2 или же 1,3:2,0.
67. Композиция по любому из пп. 64-66, при этом композиция также содержит хлорид натрия в концентрации от 10 мМ до 50 мМ.
68. Композиция, содержащая:
РНК-липоплексные частицы, включающие:
РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, и
по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид,
причем отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах составляет от 1:2 до 1,9:2 или же 1,3:2,0,
хлорид натрия в концентрации от 0 мМ до 40 мМ и
стабилизатор.
69. Композиция по любому из пп. 64-68, при этом композиция дополнительно содержит буфер.
70. Композиция по любому из пп. 64-69, при этом количество РНК в композиции составляет от 0,01 мг/мл до 1 мг/мл, от 0,05 мг/мл до 0,5 мг/мл или же 0,05 мг/мл.
71. Композиция по любому из пп. 67-70, при этом хлорид натрия находится в концентрации от 20 мМ до 30 мМ.
72. Композиция по любому из пп. 67-71, при этом хлорид натрия находится в концентрации 20 мМ.
73. Композиция по любому из пп. 67-71, при этом хлорид натрия находится в концентрации 30 мМ.
74. Композиция по любому из пп. 64-73, при этом концентрация стабилизатора в композиции превышает значение, необходимое для физиологической осмоляльности.
75. Композиция по любому из пп. 64-74, при этом концентрация стабилизатора в композиции составляет от 5% до 35% (мас./об) или от 12,5% до 25% (мас./об).
76. Композиция по любому из пп. 64-75, при этом стабилизатором является углевод, выбранный из моносахаридов, дисахаридов, трисахаридов, сахароспиртов, олигосахаридов или соответствующих им сахароспиртов и неразветвленных полиспиртов.
77. Композиция по любому из пп. 64-76, при этом стабилизатором является сахароза в концентрации от 5% до 25% (мас./об).
78. Композиция по п. 77, при этом сахароза находится в концентрации от 15% (мас./об) до 25% (мас./об).
79. Композиция по п. 77, при этом сахароза находится в концентрации от 20% (мас./об) до 25% (мас./об).
80. Композиция по п. 77, при этом сахароза находится в концентрации 22% (мас./об).
81. Композиция по п. 77, при этом сахароза находится в концентрации 20% (мас./об).
82. Композиция по любому из пп. 64-81, при этом композиция имеет pH ниже обычного pH-оптимума для хранения РНК.
83. Композиция по любому из пп. 64-82, при этом композиция имеет pH от 5,7 до 6,7 или же 6,2.
84. Композиция по любому из пп. 68-83, при этом буфером является 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновая кислота (HEPES).
85. Композиция по п. 84, при этом HEPES находится в концентрации от 2,5 мМ до 10 мМ или же 7,5 мМ.
86. Композиция по любому из пп. 64-85, при этом композиция дополнительно содержит хелатор.
87. Композиция, содержащая:
РНК-липоплексные частицы, включающие:
РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, в концентрации 0,05 мг/мл, и
DOTMA и DOPE в молярном соотношении 2:1,
причем отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах составляет 1,3:2,0,
хлорид натрия в концентрации 20 мМ,
сахарозу в концентрации 22% (мас./об),
HEPES в концентрации 7,5 мМ при pH 6,2 и
EDTA в концентрации 2,5 мМ.
88. Композиция по любому из пп. 64-87, при этом композиция находится в жидком или замороженном состоянии.
89. Замороженная композиция по п. 88, при этом композиция стабильна при температуре от -15°C до -40°C в течение по меньшей мере 1 месяца.
90. Замороженная композиция по п. 88, при этом композиция стабильна при температуре -15°C в течение по меньшей мере 1 месяца.
91. Замороженная композиция по п. 88, при этом композиция стабильна при температуре -15°C в течение по меньшей мере 2 месяцев.
92. Замороженная композиция по п. 88, при этом композиция стабильна при температуре -20°C в течение по меньшей мере 1 месяца.
93. Замороженная композиция по п. 88, при этом композиция стабильна при температуре -20°C в течение по меньшей мере 2 месяцев.
94. Замороженная композиция по п. 88, при этом композиция стабильна при температуре -30°C в течение по меньшей мере 1 месяца.
95. Замороженная композиция по п. 88, при этом композиция стабильна при температуре -30°C в течение по меньшей мере 2 месяцев.
96. Водная композиция, содержащая РНК-липоплексные частицы, получаемая путем оттаивания замороженной композиции по любому из пп. 88-95 и необязательно доведения осмоляльности и ионной силы добавлением водной жидкости.
97. Композиция по п. 96, при этом осмоляльность композиции составляет от 200 мОсмоль/кг до 450 мОсмоль/кг.
98. Композиция по любому из пп. 96 или 97, при этом композиция содержит хлорид натрия в концентрации от 80 мМ до 150 мМ.
99. Композиция по любому из пп. 64-98, при этом РНК-липоплексные частицы получены способом по любому из пп. 28-45.
100. Композиция по любому из пп. 64-99, при этом РНК-липоплексные частицы характеризуются единственным пиком Брэгга примерно при 1 нм−1, причем ширина пика составляет менее 0,2 нм−1.
101. Композиция по любому из пп. 57-100, при этом РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр, составляющий от 200 до 800 нм, от 250 до 700 нм, от 400 до 600 нм, от 300 нм до 500 нм или от 350 нм до 400 нм.
102. Композиция по любому из пп. 58-63, 65-86 и 88-101, при этом данный по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA) и/или 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP).
103. Композиция по любому из пп. 58-63, 65-86 и 88-102, при этом данный по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), холестерин (Chol) и/или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC).
104. Композиция по любому из пп. 58-63, 65-86 и 88-103, при этом данный по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA), а данный по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE).
105. Композиция по любому из пп. 58-63, 65-86 и 88-104, при этом молярное отношение данного по меньшей мере одного катионного липида к данному по меньшей мере одному дополнительному липиду составляет от 10:0 до 1:9, от 4:1 до 1:2, от 3:1 до 1:1 или же 2:1.
106. Композиция по любому из пп. 58-63, 65-86 и 88-105, при этом РНК-липоплексные частицы содержат DOTMA и DOPE в молярном соотношении от 10:0 до 1:9, от 4:1 до 1:2, от 3:1 до 1:1 или же 2:1, причем отношение положительных зарядов в DOTMA к отрицательным зарядам в РНК составляет от 1:2 до 1,9:2.
107. Композиция по любому из пп. 63, 86 и 88-106, при этом хелатором является этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA).
108. Композиция по п. 107, при этом EDTA находится в концентрации от 0,25 мМ до 5 мМ или же 2,5 мМ.
109. Композиция по любому из пп. 57-108, дополнительно содержащая адъювант.
110. Композиция по любому из пп. 57-109, которая находится в форме для системного введения.
111. Композиция по п. 110, при этом системное введение осуществляют путем внутривенного введения.
112. Композиция по любому из пп. 57-111 для терапевтического применения.
113. Способ получения водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, включающий оттаивание замороженной композиции по любому из пп. 88-112 и необязательно доведение осмоляльности и ионной силы добавлением водной жидкости.
114. Способ по п. 113, при этом водную жидкость добавляют до получения осмоляльности композиции от 200 мОсмоль/кг до 450 мОсмоль/кг.
115. Способ по любому из пп. 113 или 114, при этом водную жидкость добавляют до получения концентрации хлорида натрия от 80 мМ до 150 мМ.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлена корреляция между концентрацией липидов в исходном растворе липидов и размером липосом. Липосомы получали путем впрыскивания раствора липидов в этаноле в воду (без процесса фильтрования после впрыскивания). Размер липосом возрастает с повышением концентрации липидов в этаноле. Данный пример: смесь липидов DOTMA/DOPE в молярном соотношении 66:33.
На фиг. 2 представлено количество частиц в препаратах липосом DOTMA/DOPE, полученных из различных растворов липидов при различных концентрациях.
На фиг. 3 представлено влияние размера предшественника липосом (нефильтрованного липосомного коллоида) на размер РНК-липоплексов. Получали мелкие РНК-липоплексы при использовании небольших липосом для их образования. Не отмечалось четкой корреляции между размером липосом и размером РНК-липоплексов у всех РНК-липоплексов, полученных из более крупных липосом.
На фиг. 4 представлено количество частиц в препаратах РНК-липоплексов, полученных с различными предшественниками липосом (нефильтрованными липосомами). Количество частиц в 0,5 мкм возрастает в препаратах РНК-липоплексов, полученных из более крупных липосом. Липосомы получали путем впрыскивания раствора липидов в этаноле, используя различные исходные растворы липидов при различных концентрациях.
На фиг. 5 представлены дифракционные кривые, полученные при измерении SAXS для РНК-липоплексов, сформировавшихся с липосомами, полученными при соотношении зарядов 4:1 (вверху) и при соотношении зарядов 1,3:2, причем липосомы для образования липоплексов получали из исходных растворов липидов в этаноле 400 мМ, 300 мМ и 100 мМ.
На фиг. 6 представлена корреляционная длина и эффективность трансфекции in vitro (дендритные клетки человека) различных РНК-липоплексов, полученных с различными предшественниками липосом. Биологическая активность (трансфекция РНК in vitro) монотонно возрастает с повышением длины РНК-липоплексов. Липосомы получали путем впрыскивания раствора липидов в этаноле, используя различные исходные растворы липидов при различных концентрациях.
На фиг. 7 представлены измерения при AF4 у липоплексов из двух разных типов липосом, полученных либо из 150 мМ исходного раствора в этаноле, либо из 400 мМ исходного раствора в этаноле.
На фиг. 8 представлена эффективность трансфекции in vitro у различных РНК-липоплексов в дендритных клетках. Сигнал люциферазы монотонно возрастает с повышением размера липосом, используемых для образования РНК-липоплексов.
На фиг. 9 представлена эффективность трансфекции in vitro у различных РНК-липоплексов в дендритных клетках. Сигнал люциферазы монотонно возрастает с повышением размера липосом.
На фиг. 10 представлена эффективность трансфекции in vivo у препаратов РНК-липоплексов через 6 ч после введения. РНК-липоплексы получали с мелкими или с крупными липосомами (нефильтрованные липосомы). РНК-липоплексы, полученные с крупными липосомами, дают более высокую экспрессию люциферазы.
На фиг. 11 представлена визуализация РНК-липоплексов in vivo через 6 ч после введения. РНК-липоплексы получали с мелкими или с крупными липосомами. A) РНК-липоплексы, полученные с мелкими липосомами из исходного коллоида. B) РНК-липоплексы, полученные с крупными липосомами из исходного коллоида. C) РНК-липоплексы, полученные с мелкими отфильтрованными липосомами. D) РНК-липоплексы, полученные с крупными отфильтрованными липосомами. Более высокие сигналы биолюминесценции получали с РНК-липоплексами, полученными с более крупными липосомами.
На фиг. 12 представлена общая процедура автоматизированного поточного производства РНК-липоплексов.
На фиг. 13 представлен z-средний диаметр и полидисперсность РНК-липоплексов, полученных с использованием смесительного элемента Y-типа с внутренним диаметром 3,2 мм при различных скоростях потока.
На фиг. 14 представлен z-средний диаметр и полидисперсность РНК-липоплексов, полученных с использованием смесительного элемента Y-типа с внутренним диаметром 2,4 мм при различных скоростях потока.
На фиг. 15 представлена корреляция между размером частиц и концентрацией РНК при формировании липоплексов. Измерение PCS проводили перед замораживанием.
На фиг. 16 представлена корреляция между характеристиками частиц и концентрацией РНК при формировании липоплексов после 3 циклов замораживания-оттаивания.
На фиг. 17 представлена корреляция между характеристиками частиц и соотношением зарядов (положительные: отрицательные) в пределах от 1,0:2,0 до 2,1:2,0.
На фиг. 18 представлена корреляция между характеристиками частиц и соотношением зарядов (положительные: отрицательные) в пределах от 2,0:1,0 до 5,0:1,0.
На фиг. 19 представлена корреляция между характеристиками частиц и концентрацией NaCl при формировании липоплексов.
На фиг. 20 представлена корреляция между биоактивностью и концентрацией NaCl при формировании липоплексов.
На фиг. 21 представлены измерения целостности РНК в композициях РНК(LIP) без криопротектора при использовании различных буферных веществ (HEPES; Na-ацетат; Na-фосфат; Na-карбонат) при нескольких значениях pH после хранения при +40°C, ускоряющего разрушение частиц. Различные столбики означают увеличение срока хранения слева (3 дня) направо (21 день).
На фиг. 22 представлены измерения целостности РНК в препаратах РНК-липоплексов с сахарозой в качестве криопротектора при использовании HEPES в качестве буферного вещества при нескольких значениях pH после хранения при +40°C, ускоряющего разрушение частиц. Различные столбики означают увеличение срока хранения слева (1 день) направо (21 день).
На фиг. 23 представлена целостность РНК в липоплексах, хранившихся при +40°C с различным содержанием EDTA.
На фиг. 24 представлена общая диаграмма, показывающая, что концентрации NaCl и криопротектора оптимизировали на каждой стадии.
На фиг. 25 представлен z-средний диаметр и полидисперсность РНК-липоплексов, замороженных при возрастающих количествах альтернативных криопротекторов.
На фиг. 26 представлено количество субвизуальных частиц ≥ 10 мкм в препаратах РНК-липоплексов, замороженных при возрастающих количествах альтернативных криопротекторов.
На фиг. 27 представлены измерения размера частиц в препаратах РНК-липоплексов, содержащих 5-20% мас./об сахарозы (по оси x) и различные низкие концентрации NaCl, до и после замораживания при -30°C.
На фиг. 28 представлены измерения размера частиц в препаратах РНК-липоплексов, содержащих 5-20% мас./об трегалозы дигидрата (по оси x) и различные низкие концентрации NaCl, до и после замораживания при -30°C.
На фиг. 29 представлены измерения размера частиц в препаратах РНК-липоплексов, содержащих 50 мМ NaCl и различные количества (% мас./об) трегалозы дигидрата, после нескольких циклов замораживания-оттаивания.
На фиг. 30 представлены измерения размера частиц в препаратах РНК-липоплексов, содержащих 70 мМ NaCl и различные количества (% мас./об) трегалозы дигидрата, после нескольких циклов замораживания-оттаивания.
На фиг. 30 представлены измерения размера частиц в препаратах РНК-липоплексов, содержащих 90 мМ NaCl и различные количества (% мас./об) трегалозы дигидрата, после нескольких циклов замораживания-оттаивания.
На фиг. 32 представлены измерения размера частиц в препаратах РНК-липоплексов, содержащих 5-20% мас./об сахарозы и различные низкие концентрации NaCl, после хранения при -15°C в течение 8 месяцев. Различные столбики означают увеличение срока хранения слева (0 мес) направо (8 мес). При комбинациях сахароза/NaCl с количеством столбиков менее 8 размер частиц в двух следующих временных точках превышал спецификации, и анализ прекращали.
На фиг. 33 представлены измерения размера частиц в препаратах РНК-липоплексов, содержащих 5-20% мас./об сахарозы и различные низкие концентрации NaCl, после хранения при -30°C в течение 8 месяцев. Различные столбики означают увеличение срока хранения слева (0 мес) направо (8 мес). При комбинациях сахароза/NaCl с количеством столбиков менее 8 размер частиц в двух следующих временных точках превышал спецификации, и анализ прекращали.
На фиг. 34 представлены измерения размера частиц в препаратах РНК-липоплексов, содержащих 5-20% мас./об трегалозы дигидрата и различные низкие концентрации NaCl, после хранения при -15°C в течение 8 месяцев. Различные столбики означают увеличение срока хранения слева (0 мес) направо (8 мес). При комбинациях трегалоза/NaCl с количеством столбиков менее 8 размер частиц в двух следующих временных точках превышал спецификации, и анализ прекращали.
На фиг. 35 представлены измерения размера частиц в препаратах РНК-липоплексов, содержащих 5-20% мас./об трегалозы дигидрата и различные низкие концентрации NaCl, после хранения при -30°C в течение 8 месяцев. Различные столбики означают увеличение срока хранения слева (0 мес) направо (8 мес). При комбинациях трегалоза/NaCl с количеством столбиков менее 8 размер частиц в двух следующих временных точках превышал спецификации, и анализ прекращали.
На фиг. 36 представлены измерения размера частиц в препаратах РНК-липоплексов, содержащих 22% мас./об сахарозы и различные низкие концентрации NaCl, после хранения при -20°C.
На фиг. 37 представлены измерения размера частиц в препаратах РНК-липоплексов, содержащих 22% мас./об трегалозы дигидрата и различные низкие концентрации NaCl, после хранения при -20°C.
На фиг. 38 представлены измерения размера частиц в препаратах РНК-липоплексов, содержащих 22% мас./об глюкозы и различные низкие концентрации NaCl, после хранения при -20°C.
На фиг. 39 представлены измерения размера частиц в препаратах РНК-липоплексов, содержащих 22% мас./об сахарозы и 20 мМ NaCl, после замораживания и хранения при температуре от -15°C до -40°C.
На фиг. 40 представлены измерения размера частиц РНК-липоплексов в замороженных композициях, содержащих комбинации криопротекторов, приведенных в табл. 10, после хранения при -20°C.
На фиг. 41 представлен эффект концентрации трегалозы в препаратах РНК-липоплексов [РНК(LIP)] после замораживания-оттаивания или после лиофилизации и восстановления.
На фиг. 42 представлены изменения размера частиц в лиофилизованных препаратах РНК(LIP), приготовленных в 22% трегалозе, после восстановления 0,9% раствором NaCl или WFI (водой для инъекций).
На фиг. 43 представлена трансфекция Luc-РНК in vitro из лиофилизованных препаратов РНК-липоплексов [РНК(LIP)], приготовленных в 22% трегалозе, при различных концентрациях NaCl. Лиофилизованные образцы восстанавливали 0,9% раствором NaCl (текстурированный столбик: контрольная жидкость).
На фиг. 44 представлен z-средний диаметр в лиофилизованных препаратах РНК-липоплексов [РНК(LIP)], приготовленных при различных соотношениях трегалоза/NaCl и хранившихся при 2-8°C или 25°C, после восстановления 0,9% раствором NaCl. Препараты восстанавливали в первоначальном объеме после лиофилизации.
На фиг. 45 представлена целостность РНК (% от полного размера РНК) в лиофилизованных препаратах РНК(LIP), приготовленных при различных соотношениях трегалоза/NaCl, после восстановления 0,9% раствором NaCl и хранения при 2-8°C или 25°C. Препараты восстанавливали в первоначальном объеме после лиофилизации и разбавляли 1:1 с 0,9% раствором NaCl для экспериментов с культурами клеток (0,01 мг/мл РНК).
На фиг. 46 представлены измерения размера частиц РНК-липоплексов в композициях, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения в условиях, ускоряющих разрушение частиц (+25°C). Пунктирными линиями представлены ожидаемые допустимые пределы для размера частиц (верхний предел: 700 нм, нижний предел: 250 нм).
На фиг. 47 представлены измерения полидисперсности РНК-липоплексов в композициях, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения в условиях, ускоряющих разрушение частиц (+25°C). Пунктирной линией представлен ожидаемый допустимый предел для индекса полидисперсности, равный 0,5.
На фиг. 48 представлены измерения pH в композициях РНК-липоплексов, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения в условиях, ускоряющих разрушение частиц (+25°C).
На фиг. 49 представлены измерения целостности РНК в композициях РНК-липоплексов, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения в условиях, ускоряющих разрушение частиц (+25°C). Пунктирной линией представлен ожидаемый допустимый предел, составляющий ≥ 80% целостной полноразмерной РНК.
На фиг. 50 представлены измерения размера частиц РНК-липоплексов в композициях, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения при -15°C. Пунктирными линиями представлены ожидаемые допустимые пределы для размера частиц (верхний предел: 700 нм, нижний предел: 250 нм).
На фиг. 51 представлены измерения полидисперсности РНК-липоплексов в композициях, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения при -15°C. Пунктирной линией представлен ожидаемый допустимый предел для индекса полидисперсности, равный 0,5. Кроме того, видно, что при низких концентрациях NaCl низкие концентрации сахарозы достаточны для эффективной стабилизации коллоидных свойств РНК-липоплексов в замороженном состоянии.
На фиг. 52 представлены измерения pH в композициях РНК-липоплексов, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения при -15°C.
На фиг. 53 представлены измерения целостности РНК в композициях РНК-липоплексов, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения при -15°C. Пунктирной линией представлен ожидаемый допустимый предел, составляющий ≥ 80% целостной полноразмерной РНК.
На фиг. 54 представлены измерения размера частиц РНК-липоплексов в композициях, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения в условиях, ускоряющих разрушение частиц (+25°C). Пунктирными линиями представлены ожидаемые допустимые пределы для размера частиц (верхний предел: 700 нм, нижний предел: 250 нм).
На фиг. 55 представлены измерения индекса полидисперсности РНК-липоплексов
в композициях, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения в условиях, ускоряющих разрушение частиц (+25°C). Пунктирной линией представлен ожидаемый допустимый предел для индекса полидисперсности, равный 0,5.
в композициях, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения в условиях, ускоряющих разрушение частиц (+25°C). Пунктирной линией представлен ожидаемый допустимый предел для индекса полидисперсности, равный 0,5.
На фиг. 56 представлены измерения pH в композициях РНК-липоплексов, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения в условиях, ускоряющих разрушение частиц (+25°C).
На фиг. 57 представлены измерения целостности РНК в композициях РНК-липоплексов, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения в условиях, ускоряющих разрушение частиц (+25°C). Пунктирной линией представлен допустимый предел, составляющий ≥ 80% целостной полноразмерной РНК.
На фиг. 58 представлены изменения размера частиц РНК-липоплексов в композициях, содержащих различные буферные вещества при различных pH, до и после замораживания. Пунктирными линиями представлены ожидаемые допустимые пределы для размера частиц (верхний предел: 700 нм, нижний предел: 250 нм).
На фиг. 59 представлены измерения размера частиц РНК-липоплексов в композициях, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения при -15°C. Пунктирными линиями представлены ожидаемые допустимые пределы для размера частиц (верхний предел: 700 нм, нижний предел: 250 нм).
На фиг. 60 представлены измерения полидисперсности РНК-липоплексов в композициях, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения при -15°C. Пунктирной линией представлен ожидаемый допустимый предел для индекса полидисперсности, равный 0,5.
На фиг. 61 представлены измерения pH в композициях РНК-липоплексов, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения при -15°C.
На фиг. 62 представлены измерения целостности РНК в композициях РНК-липоплексов, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения при -15°C. Пунктирной линией представлен ожидаемый допустимый предел, составляющий ≥ 80% целостной полноразмерной РНК.
На фиг. 63 представлены измерения размера частиц РНК-липоплексов в композициях, содержащих различные концентрации буфера HEPES при различных pH, после хранения в условиях, ускоряющих разрушение частиц (+25°C). Пунктирными линиями представлены ожидаемые допустимые пределы для размера частиц (верхний предел: 700 нм, нижний предел: 250 нм). Размер частиц при измерении через 50 дней считается выбросом.
На фиг. 64 представлены измерения индекса полидисперсности РНК-липоплексов
в композициях, содержащих различные концентрации буфера HEPES при различных pH, после хранения в условиях, ускоряющих разрушение частиц (+25°C). Пунктирной линией представлен допустимый предел для индекса полидисперсности, равный 0,5.
в композициях, содержащих различные концентрации буфера HEPES при различных pH, после хранения в условиях, ускоряющих разрушение частиц (+25°C). Пунктирной линией представлен допустимый предел для индекса полидисперсности, равный 0,5.
На фиг. 65 представлены измерения pH в композициях РНК-липоплексов, содержащих различные концентрации буфера HEPES при различных pH, после хранения в условиях, ускоряющих разрушение частиц (+25°C).
На фиг. 66 представлены измерения целостности РНК в композициях РНК-липоплексов, содержащих различные концентрации буфера HEPES при различных pH, после хранения в условиях, ускоряющих разрушение частиц (+25°C). Пунктирной линией представлен допустимый предел, составляющий ≥ 80% целостной полноразмерной РНК.
На фиг. 67 представлены измерения размера частиц РНК-липоплексов в композициях, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения в условиях, ускоряющих разрушение частиц (+25°C). Пунктирными линиями представлены ожидаемые допустимые пределы для размера частиц (верхний предел: 700 нм, нижний предел: 250 нм).
На фиг. 68 представлены измерения индекса полидисперсности РНК-липоплексов
в композициях, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения в условиях, ускоряющих разрушение частиц (+25°C). Пунктирной линией представлен ожидаемый допустимый предел для индекса полидисперсности, равный 0,5.
в композициях, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения в условиях, ускоряющих разрушение частиц (+25°C). Пунктирной линией представлен ожидаемый допустимый предел для индекса полидисперсности, равный 0,5.
На фиг. 69 представлены измерения pH в композициях РНК-липоплексов, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения в условиях, ускоряющих разрушение частиц (+25°C).
На фиг. 70 представлены измерения целостности РНК в композициях РНК-липоплексов, содержащих различные буферные вещества при различных pH, после хранения в условиях, ускоряющих разрушение частиц (+25°C). Пунктирной линией представлен ожидаемый допустимый предел, составляющий ≥ 80% целостной полноразмерной РНК.
На фиг. 71 представлены изменения размера частиц РНК-липоплексов в композициях, содержащих пониженные концентрации сахарозы и NaCl, до и после замораживания. Пунктирными линиями представлены ожидаемые допустимые пределы для размера частиц (верхний предел: 700 нм, нижний предел: 250 нм).
Раскрытие сущности изобретения
Хотя настоящее изобретение подробно раскрыто ниже, однако следует иметь в виду, что оно не ограничивается конкретными методологиями, методиками и реагентами, описанными здесь, так как они могут варьировать. Также следует иметь в виду, что используемая здесь терминология предназначена только для описания конкретных воплощений и не должна ограничивать объем настоящего изобретения, которое должно ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, все используемые здесь технические и научные термины имеют те значения, которые обычно понимаются средними специалистами в данной области.
Предпочтительно используемые здесь термины определяются так, как описано в
“A multilingual glossary of biotechnological terms (IUPAC Recommendations)”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995).
“A multilingual glossary of biotechnological terms (IUPAC Recommendations)”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995).
В практике настоящего изобретения будут применяться, если не указано иначе, стандартные методы химии, биохимии, клеточной биологии, иммунологии и методы рекомбинантной ДНК, которые изложены в литературе в данной области (например, см. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989).
В дальнейшем будут описаны элементы настоящего изобретения. Эти элементы приводятся с конкретными воплощениями, однако следует понимать, что они могут комбинироваться любым способом и в любом количестве с получением дополнительных воплощений. Различные описанные примеры и воплощения не следует рассматривать как ограничивающие настоящее изобретение только явно описанными воплощениями. Следует иметь в виду, что это описание раскрывает и охватывает воплощения, в которых сочетаются описанные непосредственно воплощения с любым количеством раскрытых элементов. Кроме того, любые перестановки и комбинации всех описанных элементов следует рассматривать как раскрытые в этом описании, если из контекста не следует иное.
Термин “примерно” означает приблизительно или почти, а в контексте числовых значений или диапазонов, приведенных в раскрытых воплощениях, означает ± 20%, ± 10%, ± 5% или ± 3% от указанного или заявленного числового значения или диапазона.
Формы единственного числа при описании изобретения (особенно формулы изобретения) следует рассматривать как охватывающие значения как единственного, так и множественного числа, если здесь не указано иное или же изложенное явно противоречит контексту. Указание диапазонов значений просто служит сокращенным способом индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в этот диапазон. Если не указано иное, каждое индивидуальное значение включено в описание, как если бы оно при этом было указано отдельно. Все описанные здесь способы могут выполняться в любом подходящем порядке, если здесь не указано иное или же изложенное явно противоречит контексту. Использование всевозможных примеров или типичных выражений (например, “таких как”) здесь служит просто для лучшей иллюстрации изобретения и не налагает ограничений на объем формулы изобретения. Никакие языковые формулировки в описании не следует рассматривать как указывающие на какие-нибудь не заявленные элементы, существенные для практического осуществления изобретения.
Если прямо не указано иное, термин “включающий” применяется в настоящем описании для обозначения того, что в дополнение к элементам списка, определяемым через слово “включающий”, необязательно могут присутствовать и другие элементы. Однако в качестве особого воплощения настоящего изобретения предусматривается, что термин “включающий” охватывает и возможность отсутствия других элементов, то есть для целей этого воплощения “включающий” следует понимать, как имеющий значение “состоящий из”.
В тексте данного описания цитируется несколько документов. Каждый из процитированных здесь документов (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т.п.), выше или ниже, включен в описание в качестве ссылки во всей полноте. Ничто не должно рассматриваться как признание того, что настоящее изобретение не может предшествовать таким документам.
Определения
Далее будут представлены определения, которые применимы ко всем аспектам настоящего изобретения. Следующие термины имеют следующие значения, если не указано иное. Любые неопределенные термины имеют свои общепризнанные значения.
Термины “снижать” или “ингибировать” в настоящем изобретении означают способность вызывать общее снижение уровня, к примеру, на 5% или больше, на 10% или больше, на 20% или больше, на 50% или больше либо на 75% или больше. Термин “ингибировать” и аналогичные выражения включает полное или практически полное ингибирование, то есть снижение до нуля или практически до нуля.
Термины “повышать” или “усиливать” в одном воплощении означают повышение или усиление по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 100%.
“Физиологический pH” в настоящем изобретении означает pH 7,5.
В настоящем изобретении “% мас./об” означает процент массы по объему, который является единицей концентрации как меры количества растворенного вещества в граммах (г), выраженной в виде процента от общего объема раствора в миллилитрах (мл).
Термин “ионная сила” относится к математической зависимости между количеством различных типов ионов в определенном растворе и соответствующими им зарядами. Так, ионная сила I математически выражается формулой:
где c – молярная концентрация определенного вида иона, а z - абсолютное значение его заряда. Сумма Σ берется по всем различным видам ионов (i) в растворе.
Согласно изобретению, термин “ионная сила” в одном воплощении относится к наличию одновалентных ионов. Что касается наличия двухвалентных ионов, в частности двухвалентных катионов, то вследствие присутствия хелаторов их концентрация или эффективная концентрация (наличие свободных ионов) в одном воплощении будет достаточно низкой с тем, чтобы предотвратить деградацию РНК. В одном воплощении концентрация или эффективная концентрация двухвалентных ионов ниже каталитического уровня для гидролиза фосфодиэфирных связей между нуклеотидами РНК. В одном воплощении концентрация свободных двухвалентных ионов составляет 20 мкМ или меньше. В одном воплощении свободные двухвалентные ионы отсутствуют или практически отсутствуют.
“Осмоляльность” означает концентрацию определенного растворенного вещества, выраженную в виде количества осмолей этого вещества на килограмм растворителя.
Число Рейнольдса – безразмерное число, которое можно рассчитать по следующей формуле:
где ρ – плотность жидкости, v – скорость жидкости, l – характерная длина (здесь это внутренний диаметр смесительного элемента), а η – вязкость.
Термин “замораживание” означает затвердевание жидкости, обычно с отводом тепла.
Термин “лиофилизация” или “лиофилизирование” означает замораживание с высушиванием вещества путем его замораживания, а затем снижения давления окружающей среды, что позволяет замороженной среде в веществе сублимироваться прямо из твердой фазы в газовую фазу.
Термин “распылительная сушка” означает высушивание вещества распылением путем смешивания (нагретого) газа с жидкостью, которая пульверизируется (распыляется) в сосуде (распылительной сушке), где растворитель испаряется из образовавшихся капель, оставляя сухой порошок.
Термин “криопротектор” означает вещество, которое добавляют в состав для защиты активных ингредиентов на стадии замораживания.
Термин “лиопротектор” означает вещество, которое добавляют в состав для защиты активных ингредиентов на стадии сушки.
Термин “восстановление” означает добавление растворителя типа воды к высушенному продукту, чтобы вернуть его в жидкое состояние, такок как исходное жидкое состояние.
Термин “рекомбинантный” в настоящем изобретении означает “полученный посредством генной инженерии”. В одном воплощении “рекомбинантный объект” в контексте настоящего изобретения не встречается в природе.
Термин “встречающийся в природе” в настоящем изобретении означает то, что объект может встречаться в природе. Например, пептид или нуклеиновая кислота, которые присутствуют в организме (включая вирусы) и могут быть выделены из природного источника, а также не были намеренно модифицированы человеком в лаборатории, являются природными. Термин “встречается в природе” означает “присутствует в природе” и включает как известные объекты, так и объекты, которые еще не были открыты и/или выделены из природного окружения, но могут быть открыты и/или выделены в будущем из природного источника.
Термин “равновесная растворимость” означает такую концентрацию растворенного вещества, при которой скорость растворения вещества и скорость осаждения вещества из раствора одинаковы. В одном воплощении этот термин относится к соответствующей концентрации при комнатной температуре.
В настоящем изобретении термин “комнатная температура” означает температуру более 4°C, предпочтительно от 15°C до 40°C, от 15°C до 30°C, от 15°C до 24°C или от 16°C до 21°C. Такие температуры будут включать 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C и 22°C.
В настоящем изобретении термин “частицы” означает структурированные объекты, образованные молекулами или комплексами молекул. В одном воплощении термин “частицы” означает структуры микро- или наноразмеров, например, компактные структуры микро- или наноразмеров.
В настоящем изобретении термин “РНК-липоплексные частицы” (“РНК-липоплексы”) означает такие частицы, которые содержат липид, в частности катионный липид, и РНК. Электростатические взаимодействия между положительно заряженными липосомами и отрицательно заряженной РНК приводят к образованию комплексов и спонтанному образованию РНК-липоплексных частиц. Положительно заряженные липосомы обычно получают, используя катионные липиды типа DOTMA и дополнительные липиды типа DOPE. В одном воплощении РНК-липоплексные частицы представляет собой наночастицы.
В настоящем изобретении “наночастицы” означают частицы, содержащие РНК и по меньшей мере один катионный липид, которые имеют средний диаметр, подходящий для внутривенного введения.
Термин “средний диаметр” означает средний гидродинамический диаметр частиц при измерении методом динамического рассеяния света (DLS) с анализом данных по так называемому кумулянтному алгоритму, который выдает результаты в виде так называемого z-среднего с размерностью длины и индекса полидисперсности (PI), который является безразмерным (Koppel D., J. Chem. Phys. 57, 1972, pp. 4814-4820, ISO 13321). При этом “средний диаметр”, “диаметр” или “размер” частиц применяются как синонимы этой z-средней величины.
Термин “индекс полидисперсности” применяется здесь в качестве меры распределения по размерам ансамбля частиц, например, наночастиц. Индекс полидисперсности рассчитывается по измерениям динамического светорассеяния методом так называемого кумулянтного анализа.
В настоящем изобретении термин “субвизуальные частицы” означает частицы со средним диаметром менее 100 микрометров (мкм). Количество субвизуальных частиц можно измерить по затемнению света, показывающему степень агрегации РНК-липоплексных частиц в настоящем изобретении. В некоторых воплощениях измеряется количество субвизуальных частиц со средним диаметром, большим или равным 10 мкм. В других воплощениях измеряется количество субвизуальных частиц со средним диаметром, большим или равным 25 мкм.
Термин “метод впрыскивания раствора липидов в этаноле” означает процесс, в котором раствор липидов в этаноле быстро впрыскивается в водный раствор через иглу. При этом липиды диспергируются по всему раствору, что способствует образованию липидных структур, например, образованию липидных пузырьков, например, липосом. Обычно РНК-липоплексные частицы, описанные здесь, получают путем добавления РНК в коллоидную липосомную дисперсию. В одном воплощении такая коллоидная липосомная дисперсия по методу впрыскивания липидов в этаноле формируется следующим образом: раствор липидов типа катионных липидов, например, DOTMA и дополнительных липидов в этаноле впрыскивают в водный раствор с перемешиванием. В одном воплощении описанные здесь РНК-липоплексные частицы получают без стадии экструзии.
Термин “экструзия” или “экструдирование” относится к получению частиц с фиксированным профилем поперечного сечения. В частности, это означает уменьшение размера частиц при пропускании их через фильтры с заданными порами.
Термин “трегалоза” всегда означает как ангидрат трегалозы, так и дигидрат трегалозы. Все концентрации трегалозы приводятся по дигидрату трегалозы.
Термин “EDTA” относится к двунатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты. Все концентрации приводятся по двунатриевой соли EDTA.
Диаметр РНК-липоплексных частиц
РНК-липоплексные частицы, описанные здесь, имеют средний диаметр, который в одном воплощении составляет от 200 нм до 1000 нм, от 200 нм до 800 нм, от 250 до 700 нм, от 400 до 600 нм, от 300 нм до 500 нм или от 350 нм до 400 нм. В определенных воплощениях РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр примерно 200 нм или 225 нм или 250 нм или 275 нм или 300 нм или 325 нм или 350 нм или 375 нм или 400 нм или 425 нм или 450 нм или 475 нм или 500 нм или 525 нм или 550 нм или 575 нм или 600 нм или 625 нм или 650 нм или 700 нм или 725 нм или 750 нм или 775 нм или 800 нм или 825 нм или 850 нм или 875 нм или 900 нм или 925 нм или 950 нм или 975 нм или или 1000 нм. В одном воплощении РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр, который составляет от 250 нм до 700 нм. В другом воплощении РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр, который составляет от 300 нм до 500 нм. В типичном воплощении РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр примерно 400 нм.
РНК-липоплексные частицы, описанные здесь, например, полученные описанным в заявке способом, имеют индекс полидисперсности менее 0,5, менее 0,4 или менее 0,3. В качестве примера РНК-липоплексные частицы могут иметь индекс полидисперсности в пределах от 0,1 до 0,3.
Липиды
В одном воплощении растворы липидов, липосомы и РНК-липоплексные частицы, описанные здесь, включают катионный липид. В настоящем изобретении “катионный липид” означает липид, имеющий суммарный положительный заряд. Катионные липиды связываются с отрицательно заряженной РНК посредством электростатического взаимодействия с липидным матриксом. Обычно катионные липиды содержат липофильную группировку типа стерольной, ацильной или диацильной цепи, а головная группа липида обычно несет положительный заряд. Примеры катионных липидов включают, без ограничения, 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA); диметилдиоктадециламмоний (DDAB); 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP); 1,2-диолеоил-3-диметиламмонийпропан (DODAP); 1,2-диацилокси-3-диметиламмонийпропан; 1,2-диалкилокси-3-диметиламмонийпропан; диоктадецилдиметиламмонийхлорид (DODAC), 2,3-ди(тетрадекокси)пропил-(2-гидроксиэтил)диметилазаний (DMRIE), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (DMEPC), 1,2-димиристоил-3-триметиламмонийпропан (DMTAP), 1,2-диолеилоксипропил-3-диметил-гидроксиэтиламмоний бромид (DORIE) и 2,3-диолеоилокси-N-[2(сперминкарбоксамид)этил]-N,N-диметил-трифторацетат-1-пропанамий (DOSPA). Предпочтительны DOTMA, DOTAP, DODAC и DOSPA. В определенных воплощениях по меньшей мере один катионный липид представлен DOTMA и/или DOTAP. В одном воплощении по меньшей мере один катионный липид представлен DOTMA, в частности, (R)-DOTMA.
Можно включать в частицы дополнительный липид для регулирования общего соотношения положительных и отрицательных зарядов и физической стабильности РНК-липоплексных частиц. В некоторых воплощениях дополнительный липид представляет собой нейтральный липид. В настоящем изобретении “нейтральный липид” означает липид с суммарным зарядом, равным нулю. Примеры нейтральных липидов включают, без ограничения, 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC), диацилфосфатидилхолин, диацилфосфатидилэтаноламин, церамид, сфингомиелин, цефалин, холестерин и цереброзид. В определенных воплощениях вторым липидом является DOPE, холестерол и/или DOPC.
В некоторых воплощениях РНК-липоплексные частицы содержат и катионный липид, и дополнительный липид. В типичном воплощении катионный липид представлен DOTMA, а дополнительный липид представлен DOPE. Не придерживаясь какой-либо теории, количество по меньшей мере одного катионного липида по сравнению с количеством по меньшей мере одного дополнительного липида может повлиять на такие важные характеристики РНК-липоплексных частиц, как заряд, размер частиц, стабильность, тканеселективность и биоактивность РНК. Соответственно, в некоторых воплощениях молярное отношение такого по меньшей мере одного катионного липида к такому по меньшей мере одному дополнительному липиду составляет от 10:0 до 1:9, от 4:1 до 1:2 или от 3:1 до 1:1. В определенных воплощениях молярное отношение такого по меньшей мере одного катионного липида к такому по меньшей мере одному дополнительному липиду составляет 3:1 или 2,75:1 или 2,5:1 или 2,25:1 или 2:1 или 1,75:1 или 1,5:1 или 1,25:1 или 1:1. В типичном воплощении молярное отношение такого по меньшей мере одного катионного липида к такому по меньшей мере одному дополнительному липиду составляет 2:1.
РНК
В настоящем изобретении термин “РНК” означает молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие остатки рибонуклеотидов. В предпочтительных воплощениях РНК содержит все или большинство остатков рибонуклеотидов. В настоящем изобретении “рибонуклеотид” означает нуклеотид с гидроксильной группой в 2′-положении β-D-рибофуранозильной группы. РНК охватывает, без ограничения, двухцепочечную РНК, одноцепочечную РНК, выделенную РНК типа частично очищенной РНК, практически чистую РНК, синтетическую РНК, полученную рекомбинантно РНК, а также модифицированную РНК, отличающуюся от природной РНК добавлением, делецией, заменой и/или изменением одного или нескольких нуклеотидов. Такие изменения могут означать добавление ненуклеотидного материала к внутренним нуклеотидам РНК или к концам РНК. При этом также предусматривается, что нуклеотиды в РНК могут быть нестандартными нуклеотидами типа химически синтезированных нуклеотидов или дезоксинуклеотидов. В настоящем изобретении такие измененные РНК считаются аналогами природной РНК.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения РНК представляет собой матричную РНК (мРНК), что означает РНК-транскрипт, кодирующий пептид или белок. Как установлено в данной области, мРНК обычно содержит 5′-нетранслируемую область (5′-UTR), кодирующую пептид область и 3′-нетранслируемую область (3′-UTR). В некоторых воплощениях РНК получают посредством транскрипции или химического синтеза in vitro. В одном воплощении мРНК получают посредством транскрипции in vitro с использованием ДНК-матрицы, где ДНК означает нуклеиновую кислоту, содержащую дезоксирибонуклеотиды.
В одном воплощении РНК представляет собой транскрибированную in vitro РНК (IVT-РНК) и может быть получена при транскрипции in vitro соответствующей ДНК-матрицы. Промотором для контроля транскрипции может быть любой промотор любой РНК-полимеразы. ДНК-матрица для транскрипции in vitro может быть получена путем клонирования нуклеиновой кислоты, в частности кДНК, и введения её в соответствующий вектор для транскрипции in vitro. кДНК может быть получена посредством обратной транскрипции РНК.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения РНК в описанных здесь композициях РНК-липоплексов находится в концентрации от 0,01 мг/мл до 1 мг/мл или от 0,05 мг/мл до 0,5 мг/мл. В определенных воплощениях РНК находится в концентрации 0,01 мг/мл или 0,02 мг/мл или 0,03 мг/мл или 0,04 мг/мл или 0,05 мг/мл или 0,06 мг/мл или 0,07 мг/мл или 0,08 мг/мл или 0,09 мг/мл или 0,10 мг/мл или 0,11 мг/мл или 0,12 мг/мл или 0,13 мг/мл или 0,14 мг/мл или 0,15 мг/мл или 0,16 мг/мл или 0,17 мг/мл или 0,18 мг/мл или 0,19 мг/мл или 0,20 мг/мл или 0,21 мг/мл или 0,22 мг/мл или 0,23 мг/мл или 0,24 мг/мл или 0,25 мг/мл или 0,26 мг/мл или 0,27 мг/мл или 0,28 мг/мл или 0,29 мг/мл или 0,30 мг/мл или 0,31 мг/мл или 0,32 мг/мл или 0,33 мг/мл или 0,34 мг/мл или 0,35 мг/мл или 0,36 мг/мл или 0,37 мг/мл или 0,38 мг/мл или 0,39 мг/мл или 0,40 мг/мл или 0,41 мг/мл или 0,42 мг/мл или 0,43 мг/мл или 0,44 мг/мл или 0,45 мг/мл или 0,46 мг/мл или 0,47 мг/мл или 0,48 мг/мл или 0,49 мг/мл или 0,50 мг/мл.
В одном воплощении РНК может содержать модифицированные рибонуклеотиды. Примеры модифицированных рибонуклеотидов включают, без ограничения, 5-метилцитидин и псевдоуридин.
В некоторых воплощении РНК по настоящему изобретению содержит 5′-кэп. В одном воплощении РНК по настоящему изобретению не содержит некэппированных 5′-трифосфатов. В одном воплощении РНК может быть модифицирована аналогом 5′-кэпа. Термин “5′-кэп” относится к структуре, которая находится на 5′-конце молекулы мРНК и обычно состоит из гуанозинового нуклеотида, соединенного с мРНК через 5′-5′-трифосфатную связь. В одном воплощении этот гуанозин метилирован по 7-положению. Получение РНК с 5′-кэпом или с аналогом 5′-кэпа может осуществляться посредством транскрипции in vitro, при которой 5′-кэп экспрессируется при транскрипции в нити РНК, или же он может присоединяться к РНК после транскрипции с помощью кэппирующих ферментов.
В некоторых воплощении РНК по настоящему изобретению содержит 5′-UTR и/или 3′-UTR. Термин “нетранслируемая область” или “UTR” означает такую область в молекуле ДНК, которая транскрибируется, но не транслируется в аминокислотную последовательность, или соответствующую область в молекуле РНК, например, молекуле мРНК. Нетранслируемая область (UTR) может находится с 5′-стороны (выше) от открытой рамки считывания (5′-UTR) и/или с 3′-стороны (ниже) от открытой рамки считывания (3′-UTR). 5′-UTR, если она есть, располагается на 5′-конце перед стартовым кодоном кодирующей белок области. 5′-UTR находится после 5′-кэпа (если он есть), например, непосредственно примыкает к 5′-кэпу. 3′-UTR, если она есть, располагается на 3′-конце после кодона терминации кодирующей белок области, но термин “3′-UTR” предпочтительно не включает хвост поли(A). Таким образом, 3′-UTR находится перед последовательностью поли(A) (если она есть), например, непосредственно примыкает к последовательности поли(A).
В некоторых воплощении РНК по настоящему изобретению содержит 3′-последовательность поли(A). Термин “последовательность поли(A)” обозначает последовательность остатков аденила (A), которая обычно располагается на 3′-конце молекулы РНК. Согласно изобретению, в одном воплощении последовательность поли(A) включает по меньшей мере 20, по меньшей мере 40, по меньшей мере 80 или по меньшей мере 100 и вплоть до 500, до 400, до 300, до 200 или до 150 нуклеотидов A, в частности, примерно 120 нуклеотидов A.
В настоящем изобретении термин “транскрипция” обозначает процесс, в котором генетический код в последовательности ДНК транскрибируется в РНК. Впоследствии РНК может транслироваться в пептид или белок.
В отношении РНК термин “экспрессия” или “трансляция” обозначает процесс в рибосомах клетки, посредством которого нить мРНК направляет сборку последовательности аминокислот с образованием пептида или белка.
В одном воплощении после введения описанных здесь РНК-липоплексных частиц по крайней мере часть РНК попадает в клетки-мишени. В одном воплощении по крайней мере часть РНК попадает в цитозоль клеток-мишеней. В одном воплощении РНК представляет собой РНК, кодирующую пептид или белок, причем РНК транслируется в клетках-мишенях с образованием пептида или белка. В одном воплощении клетками- мишенями являются клетки селезенки. В одном воплощении клетками-мишенями являются антигенпрезентирующие клетки типа профессиональных антигенпрезентирующих клеток в селезенке. В одном воплощении клетками-мишенями являются дендритные клетки селезенке. Таким образом, описанные здесь РНК-липоплексные частицы можно использовать для доставки РНК в такие клетки-мишени. Соответственно, настоящим изобретением также предусмотрен способ доставки РНК в клетки-мишени у субъектов, включающий введение субъектам описанных здесь РНК-липоплексных частиц. В одном воплощении РНК попадает в цитозоль клеток-мишеней. В одном воплощении РНК представляет собой РНК, кодирующую пептид или белок, причем РНК транслируется в клетках-мишенях с образованием пептида или белка.
В одном воплощении РНК кодирует фармацевтически активный пептид или белок.
Согласно изобретению, термин “РНК кодирует” означает то, что РНК, если она находится в соответствующем окружении, например, внутри клеток ткани-мишени, может направлять сборку аминокислот с образованием кодируемого ею пептида или белка в процессе трансляции. В одном воплощении РНК способна взаимодействовать с клеточным аппаратом трансляции, обеспечивающим трансляцию пептида или белка. Клетка может продуцировать кодируемый пептид или белок внутриклеточно (например, в цитоплазме и/или в ядре), может секретировать кодируемый пептид или белок или же экспонировать его на поверхности.
Согласно изобретению, термин “пептид” включает олиго- и полипептиды и обозначает вещества, которые содержат два или больше, 3 или больше, 4 или больше, 6 или больше, 8 или больше, 10 или больше, 13 или больше, 16 или больше, 20 или больше и вплоть до 50, 100 или 150 последовательных аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями. Термин “белок” относится к большим пептидам, в частности пептидам, содержащим по меньшей мере 151 аминокислоту, но термины “пептид” и “белок” обычно применяются здесь как синонимы.
“Фармацевтически активный пептид или белок” оказывает положительное или благоприятное действие на состояние или заболевание у субъекта при введении субъекту в терапевтически эффективном количестве. В одном воплощении фармацевтически активный пептид или белок обладает лечебными или паллиативными свойствами и может вводиться для облегчения, ослабления, уменьшения, регрессии, замедления возникновения или снижения тяжести одного или нескольких симптомов заболевания или расстройства. Фармацевтически активный пептид или белок может обладать профилактическими свойствами и может применяться для замедления возникновения заболевания либо для снижения тяжести такого заболевания или патологического состояния. Термин “фармацевтически активный пептид или белок” охватывает целые белки или полипептиды, а также их фармацевтически активные фрагменты. Он также может включать и фармацевтически активные аналоги пептида или белка.
Примеры фармацевтически активных белков включают, без ограничения, цитокины и белки иммунной системы типа иммунологически активных соединений (например, интерлейкины, колониестимулирующий фактор (CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), эритропоэтин, фактор некроза опухолей (TNF), интерфероны, интегрины, адрессины, селетины, хоминг-рецепторы, T-клеточные рецепторы, иммуноглобулины, растворимые антигены главного комплекса гистосовместимости, иммунологически активные антигены типа бактериальных, паразитарных или вирусных антигенов, аллергены, аутоантигены, антитела), гормоны (инсулин, тиреоидный гормон, катехоламины, гонадотропины, трофические гормоны, пролактин, окситоцин, дофамин, бычий соматотропин, лептины и т.п.), гормоны роста (например, гормон роста человека), факторы роста (например, эпидермальный фактор роста, фактор роста нервов, инсулиноподобный фактор роста и т.п.), рецепторы факторов роста, ферменты (тканевой активатор плазминогена, стрептокиназа, ферменты биосинтеза или деградации холестерина, стероидогенные ферменты, киназы, фосфодиэстеразы, метилазы, деметилазы, дегидрогеназы, целлюлазы, протеазы, липазы, фосфолипазы, ароматазы, цитохромы, аденилат- или гуанилатциклазы, нейраминидазы и т.п.), рецепторы (рецепторы стероидных гормонов, рецепторы пептидов), связывающие белки (белки, связывающие гормон роста или фактор роста и др.), факторы транскрипции и трансляции, белки, подавляющие рост опухолей (например, белки, ингибирующие ангиогенез), структурные белки (как-то коллаген, фиброин, фибриноген, эластин, тубулин, актин и миозин), белки крови (тромбин, сывороточный альбумин, фактор VII, фактор VIII, инсулин, фактор IX, фактор X, тканевой активатор плазминогена, протеин C, фактор фон Вилебранда, антитромбин III, глюкоцереброзидаза, эритропоэтин, колониестимулирующий фактор гранулоцитов (GCSF) или модифицированный фактор VIII, антикоагулянты и др.).
Термин “иммунологически активное соединение” относится к любым соединениям, изменяющим иммунный ответ, к примеру, путем индуцирования и/или подавления созревания иммунных клеток, индуцирования и/или подавления биосинтеза цитокинов и/или изменения гуморального иммунитета путем стимулирования продукции антител
B-клетками. Иммунологически активные соединения обладают сильным иммуностимулирующим действием, включая, без ограничения, противовирусное и противоопухолевое действие, а также могут подавлять и другие аспекты иммунного ответа, например, переключать иммунный ответ с иммунного ответа TH2, что полезно для лечения широкого спектра заболеваний, опосредованных TH2. Иммунологически активные соединения могут быть полезными в качестве вакцинных адъювантов.
B-клетками. Иммунологически активные соединения обладают сильным иммуностимулирующим действием, включая, без ограничения, противовирусное и противоопухолевое действие, а также могут подавлять и другие аспекты иммунного ответа, например, переключать иммунный ответ с иммунного ответа TH2, что полезно для лечения широкого спектра заболеваний, опосредованных TH2. Иммунологически активные соединения могут быть полезными в качестве вакцинных адъювантов.
В одном воплощении фармацевтически активный пептид или белок содержит один или несколько антигенов либо один или несколько эпитопов, т.е. введение пептида или белка субъекту вызывает иммунный ответ против одного или нескольких антигенов либо одного или нескольких эпитопов у субъекта, который может быть терапевтическим либо частично или полностью защитным.
Термин “антиген” означает вещество, содержащее эпитоп, против которого может вырабатываться иммунный ответ. Термин “антиген” включает, в частности, белки и пептиды. В одном воплощении антиген презентируется клетками иммунной системы типа антигенпрезентирующих клеток типа дендритных клеток или макрофагов. В одном воплощении антиген или продукт его процессинга типа T-клеточного эпитопа связывается с Т- или B-клеточным рецептором либо молекулой иммуноглобулина типа антитела. Соответственно, антиген или продукт его процессинга может специфически реагировать с антителами или T-лимфоцитами (T-клетками). В одном воплощении антиген представляет собой связанный с заболеванием антиген типа опухолевого антигена, вирусного антигена либо бактериального антигена, а эпитоп происходит из такого антигена.
Термин “связанный с заболеванием антиген” применяется в самом широком смысле для обозначения любых антигенов, связанных с заболеваниями. Связанный с заболеванием антиген – это молекула, содержащая эпитопы, которые будут стимулировать иммунную систему хозяина для выработки антигенспецифичного клеточного иммунного ответа и/или гуморального антительного ответа против заболевания. Следовательно, связанный с заболеванием антиген либо его эпитоп можно использовать в терапевтических целях. Связанные с заболеванием антигены могут быть связаны с вызванными микробами инфекциями, обычно это микробные антигены, или связаны с раком, обычно с опухолями.
Термин “опухолевый антиген” означает такой компонент раковых клеток, который может происходить из цитоплазмы, поверхности клетки или ядра клетки. В частности, это такие антигены, которые вырабатываются внутри клетки или в виде поверхностных антигенов на опухолевых клетках.
Термин “вирусный антиген” означает такой вирусный компонент, который обладает антигенными свойствами, то есть способный вызвать иммунный ответ у индивида. Вирусным антигеном может быть вирусный рибонуклеопротеин или белок оболочки.
Термин “бактериальный антиген” означает такой бактериальный компонент, который обладает антигенными свойствами, то есть способный вызвать иммунный ответ у индивида. Бактериальный антиген может происходить из клеточной стенки или цитоплазматической мембраны бактерий.
Термин “эпитоп” означает такую часть или фрагмент молекулы типа антигена, которая распознается иммунной системой. Например, эпитоп может распознаваться T-клетками, B-клетками или антителами. Эпитоп антигена может включать непрерывную или прерывистую часть антигена и может быть длиной от 5 до 100 аминокислот. В одном воплощении эпитоп имеет длину от 10 до 25 аминокислот. Термин “эпитоп” включает и T-клеточные эпитопы.
Термин “T-клеточный эпитоп” означает такую часть или фрагмент белка, которая распознается T-клетками при презентации их молекулами MHC. Термин “главный комплекс гистосовместимости” и его аббревиатура “MHC” включает молекулы MHC класса I и MHC класса II и обозначает комплекс генов, который присутствует у всех позвоночных. Белки или молекулы MHC важны для передачи сигналов между лимфоцитами и антиген-презентирующими клетками или больными клетками в иммунных реакциях, причем белки или молекулы MHC связывают пептидные эпитопы и представляют их для распознавания T-клеточными рецепторами на T-клетках. Белки, кодируемые MHC, экспрессируются на поверхности клеток и представляют как собственные антигены (пептидные фрагменты из самой клетки), так и чужие антигены (например, фрагменты вторгающихся микроорганизмов) T-клеткам. В случае комплексов пептид/МНС класса I связывающие пептиды обычно имеют длину от 8 до 10 аминокислот, хотя и более длинные или более короткие пептиды могут быть эффективными. В случае комплексов пептид/МНС класса II связывающие пептиды обычно имеют длину от 10 до 25 аминокислот и в особенности от 13 до 18 аминокислот, хотя и более длинные или более короткие пептиды могут быть эффективными.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения РНК кодирует по меньшей мере один эпитоп. В некоторых воплощениях эпитоп происходит из опухолевого антигена. Опухолевый антиген может быть “стандартным” антигеном, который обычно экспрессируется при различных формах рака. Опухолевый антиген может быть “неоантигеном”, который специфичен для индивидуальной опухоли и ранее не распознавался иммунной системой. Неоантигены или неоэпитопы могут быть результатом одной или нескольких специфичных для рака мутаций в геноме раковых клеток, вызывающих изменения аминокислот. Примеры опухолевых антигенов включают, без ограничения, p53, ART-4, BAGE, β-катенин/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, белки клеточной поверхности из семейства клаудинов типа CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 и CLAUDIN-12, c-myc, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap 100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (или hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, предпочтительно MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 или MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/мелан-A, MC1R, миозин/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 minor BCR-abL, Pml/RARa, PRAME, протеиназа 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 или RU2, SAGE, SART-1 или SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, сурвивин, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE, WT и WT-1.
Раковые мутации различаются у каждого индивида. Поэтому раковые мутации, кодирующие новые эпитопы (неоэпитопы), являются привлекательными мишенями для разработки вакцинных композиций и иммунотерапевтических средств. Эффективность иммунотерапии опухолей зависит от выбора специфичных для рака антигенов и эпитопов, способных вызвать сильный иммунный ответ у хозяина. Для доставки пациентам специфичных для пациента опухолевых эпитопов может использоваться РНК. Особый интерес для экспрессии РНК иммуногенных эпитопов или антигенов типа опухолевых эпитопов представляют дендритные клетки (DC) – антиген-презентирующие клетки, находящиеся в селезенке. Терапевтической эффективности композиций противоопухолевых вакцин способствует использование множественных эпитопов. Быстрое секвенирование мутанома опухолей может обеспечить множественные эпитопы для индивидуализированных вакцин, которые могут кодироваться описанной здесь РНК, например, в виде единого полипептида, в котором эпитопы необязательно разделены линкерами. В некоторых воплощениях настоящего изобретения РНК кодирует по меньшей мере один эпитоп, по меньшей мере два эпитопа, по меньшей мере три эпитопа, по меньшей мере 4 эпитопа, по меньшей мере 5 эпитопов, по меньшей мере 6 эпитопов, по меньшей мере 7 эпитопов, по меньшей мере 8 эпитопов, по меньшей мере 9 эпитопов или по меньшей мере 10 эпитопов. Типичные воплощения включают РНК, кодирующую по меньшей мере 5 эпитопов (которая именуется “пентатопной”), и РНК, кодирующую по меньшей мере 10 эпитопов (которая именуется “декатопной”).
Отношение зарядов
Электрический заряд РНК-липоплексных частиц по настоящему изобретению является суммой электрических зарядов по меньшей мере одного катионного липида и электрических зарядов в РНК. Отношение зарядов – это отношение положительных зарядов по меньшей мере одного катионного липида к отрицательным зарядам в РНК. Отношение положительных зарядов по меньшей мере одного катионного липида к отрицательным зарядам в РНК рассчитывается по следующему уравнению: отношение зарядов = [(концентрация катионного липида (моль)) × (общее число положительных зарядов у катионного липида)] / [(концентрация РНК (моль)) × общее число отрицательных зарядов в РНК)]. Специалисты в данной области смогут определить концентрацию РНК и количество по меньшей мере одного катионного липида обычными методами.
В первом воплощении при физиологическом pH отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах составляет от 1,9:2 до 1:2. В определенных воплощениях отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах при физиологическом pH составляет примерно 1,9:2,0 или 1,8:2,0 или 1,7:2,0 или 1,6:2,0 или 1,5:2,0 или 1,4:2,0 или 1,3:2,0 или 1,2:2,0 или 1,1:2,0 или 1:2,0. В одном воплощении отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах при физиологическом pH составляет 1,3:2,0. В другом воплощении описанные здесь РНК-липоплексные частицы могут иметь равное количество положительных и отрицательных зарядов при физиологическом pH, что обеспечивает РНК-липоплексные частицы с суммарным нейтральным соотношением зарядов.
Во втором воплощении при физиологическом pH отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах составляет от 6:1 до 1,5:1. В определенных воплощениях отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах при физиологическом pH составляет примерно 6,0:1,0 или 5,9:1,0 или 5,8:1,0 или 5,7:1,0 или 5,6:1,0 или 5,5:1,0 или 5,4:1,0 или 5,3:1,0 или 5,2:1,0 или 5,1:1,0 или 5,0:1,0 или 4,9:1,0 или 4,8:1,0 или 4,7:1,0 или 4,6:1,0 или 4,5:1,0 или 4,4:1,0 или 4,3:1,0 или 4,2:1,0 или 4,1:1,0 или 4,0:1,0 или 3,9:1,0 или 3,8:1,0 или 3,7:1,0 или 3,6:1,0 или 3,5:1,0 или 3,4:1,0 или 3,3:1,0 или 3,2:1,0 или 3,1:1,0 или 3,0:1,0 или 2,9:1,0 или 2,8:1,0 или 2,7:1,0 или 2,6:1,0 или 2,5:1,0 или 2,4:1,0 или 2,3:1,0 или 2,2:1,0 или 2,1:1,0 или 2,0:1,0 или 1,9:1,0 или 1,8:1,0 или 1,7:1,0 или 1,6:1,0 или 1,5:1,0.
Для иммунотерапии на основе РНК необходимо нацеливаться на конкретные органы типа селезенки, чтобы избежать аутоиммунного ответа в других органах и потенциальной токсичности. Согласно изобретению, РНК может быть нацелена на различные клетки, ткани или органы.
Было обнаружено, что РНК-липоплексные частицы с отношением зарядов согласно первому воплощению могут применяться для преимущественного нацеливания на ткань селезенки или клетки селезенки типа антиген-презентирующих клеток, в частности на дендритные клетки. Соответственно, в одном воплощении после введения РНК-липоплексных частиц происходит накопление РНК и/или экспрессия РНК в селезенке. Таким образом, РНК-липоплексные частицы по изобретению могут применяться для экспрессии РНК в селезенке. В одном воплощении после введения РНК-липоплексных частиц совсем или почти не происходит накопления РНК и/или экспрессии РНК в легких и/или печени. В одном воплощении после введения РНК-липоплексных частиц происходит накопление РНК и/или экспрессия РНК в антиген-презентирующих клетках типа профессиональных антиген-презентирующих клеток в селезенке. Таким образом, РНК-липоплексные частицы по изобретению могут применяться для экспрессии РНК в таких антиген-презентирующих клетках. В одном воплощении антиген-презентирующие клетки представляют собой дендритные клетки и/или макрофаги.
Было обнаружено, что РНК-липоплексные частицы с отношением зарядов согласно второму воплощению могут применяться для преимущественного нацеливания на ткань легких или клетки легких. Соответственно, в одном воплощении после введения РНК-липоплексных частиц происходит накопление РНК и/или экспрессия РНК в легких. Таким образом, РНК-липоплексные частицы по изобретению могут применяться для экспрессии РНК в легких. Соответственно, если требуется экспрессия РНК в другой ткани, чем селезенка, то в воплощениях, описанных здесь в связи с соотношением зарядов согласно первому воплощению, например, соотношением зарядов от 1:2 до 1,9:2, можно использовать соотношение зарядов согласно второму воплощению, например, соотношение зарядов от 6:1 до 1,5:1, вместо соотношения зарядов согласно первому воплощению. В этих и других воплощениях, описанных здесь, можно использовать другую РНК, чем РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, например, РНК, кодирующую фармацевтически активный пептид или белок, как описано здесь. В одном воплощении фармацевтически активный пептид или белок представляет собой цитокин и/или предназначен для лечения рака легких.
Композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы
A. Соль и ионная сила
Согласно настоящему изобретению, описанные здесь композиции могут содержать соли типа хлорида натрия. Не придерживаясь какой-либо теории, хлорид натрия действует как средство ионной осмоляльности для предварительной обработки РНК перед смешиванием по меньшей мере с одним катионным липидом. В некоторых воплощениях настоящего изобретения предусмотрены альтернативные хлориду натрия органические или неорганические соли. Альтернативные соли включают, без ограничения, хлорид калия, дикалийфосфат, монокалийфосфат, ацетат калия, бикарбонат калия, сульфат калия, ацетат калия, динатрийфосфат, мононатрийфосфат, ацетат натрия, бикарбонат натрия, сульфат натрия, ацетат натрия, хлорид лития, хлорид магния, фосфат магния, хлорид кальция и натриевые соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA).
Обычно композиции, содержащие описанные здесь РНК-липоплексные частицы, содержат хлорид натрия в концентрации, предпочтительно составляющей от 0 мМ до 500 мМ, от 5 мМ до 400 мМ или от 10 мМ до 300 мМ. В одном воплощении композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, имеют ионную силу, соответствующую таким концентрациям хлорида натрия.
Обычно композиции для получения РНК-липоплексных частиц из РНК и липосом типа описанных здесь и получаемые в результате содержат высокие концентрации хлорида натрия либо имеют высокую ионную силу. В одном воплощении хлорид натрия находится в концентрации по меньшей мере 45 мМ. В одном воплощении хлорид натрия находится в концентрации от 45 мМ до 300 мМ или от 50 мМ до 150 мМ. В одном воплощении композиции имеют ионную силу, соответствующую таким концентрациям хлорида натрия.
Обычно композиции для хранения РНК-липоплексных частиц, например, для замораживания РНК-липоплексных частиц типа описанных здесь содержат низкие концентрации хлорида натрия или имеют низкую ионную силу. В одном воплощении хлорид натрия находится в концентрации от 0 мМ до 50 мМ, от 0 мМ до 40 мМ или от 10 мМ до 50 мМ. В определенных воплощениях хлорид натрия находится в концентрации примерно 1 мМ или 2 мМ или 3 мМ или 4 мМ или 5 мМ или 6 мМ или 7 мМ или 8 мМ или 9 мМ или 10 мМ или 11 мМ или 12 мМ или 13 мМ или 14 мМ или 15 мМ или 16 мМ или 17 мМ или 18 мМ или 19 мМ или 20 мМ или 21 мМ или 22 мМ или 23 мМ или 24 мМ или 25 мМ или 26 мМ или 27 мМ или 28 мМ или 29 мМ или 30 мМ или 31 мМ или 32 мМ или 33 мМ или 34 мМ или 35 мМ или 36 мМ или 37 мМ или 38 мМ или 39 мМ или 40 мМ или 41 мМ или 42 мМ или 43 мМ или 44 мМ или 45 мМ или 46 мМ или 47 мМ или 48 мМ или 49 мМ или 50 мМ. В предпочтительных воплощениях хлорид натрия находится в концентрации 20 мМ, или 30 мМ, или 40 мМ. В одном типичном воплощении хлорид натрия находится в концентрации 20 мМ. В другом типичном воплощении хлорид натрия находится в концентрации 30 мМ. В одном воплощении композиции имеют ионную силу, соответствующую таким концентрациям хлорида натрия.
Обычно композиции, получаемые при оттаивании замороженных композиций РНК-липоплексных частиц и необязательного доведении осмоляльности и ионной силы добавлением водной жидкости, содержат высокие концентрации хлорида натрия либо имеют высокую ионную силу. В одном воплощении хлорид натрия находится в концентрации от 50 мМ до 300 мМ или от 80 мМ до 150 мМ. В одном воплощении композиции имеют ионную силу, соответствующую таким концентрациям хлорида натрия.
B. Стабилизаторы
Описанные здесь композиции могут содержать стабилизаторы, чтобы избежать существенной потери качества продукта, в частности, существенной потери активности РНК при замораживании, лиофилизации или распылительной сушке и хранении замороженных, лиофилизованных или высушенных распылением композиций. Такие композиции также именуются здесь стабильными. Обычно стабилизатор присутствует до замораживания, лиофилизации или распылительной сушки и сохраняется в полученном замороженном, лиофилизованном или высушенном распылением препарате. Он может использоваться для защиты РНК-липоплексных частиц при замораживании, лиофилизации или распылительной сушке и хранении замороженных, лиофилизованных или высушенных распылением препаратов, например, для уменьшения или предотвращения агрегации, разрушения частиц, деградации РНК и/или других типов повреждений.
В одном воплощении стабилизатором является углевод. Термин “углевод” в настоящем изобретении означает и охватывает моносахариды, дисахариды, трисахариды, олигосахариды и полисахариды.
В одном воплощении стабилизатором является моносахарид. Термин “моносахарид” в настоящем изобретении означает одно углеводное звено (например, простой сахарид), которое не может гидролизироваться до более простых углеводных звеньев. Типичными моносахаридными стабилизаторами являются глюкоза, фруктоза, галактоза, ксилоза, рибоза и др.
В одном воплощении стабилизатором является дисахарид. Термин “дисахарид” в настоящем изобретении означает соединение или химическую группировку, состоящую из 2 моносахаридных звеньев, соединенных гликозидной связью, к примеру, 1-4-связью или 1-6-связью. Дисахарид может гидролизироваться до двух моносахаридов. Примеры дисахаридных стабилизаторов включают сахарозу, трегалозу, лактозу, мальтозу и др.
Термин “трисахарид” означает три сахара, соединенных вместе с образованием одной молекулы. Примеры трисахаридов включают раффинозу и мелецитозу.
В одном воплощении стабилизатором является олигосахарид. Термин “олигосахарид” в настоящем изобретении означает соединение или химическую группу, состоящую из 3-15, предпочтительно 3-10 моносахаридных звеньев, соединенных гликозидными связями, к примеру, 1-4-связями или 1-6-связями, образуя линейную, разветвленную или циклическую структуру. Типичными олигосахаридными стабилизаторами являются циклодекстрины, раффиноза, мелезитоза, мальтотриоза, стахиоза, акарбоза и др. Олигосахариды могут быть окисленными или восстановленными.
В одном воплощении стабилизатором является циклический олигосахарид. Термин “циклический олигосахарид” в настоящем изобретении означает соединение или химическую группировку, состоящую из 3-15, предпочтительно 6, 7, 8, 9 или 10 моносахаридных звеньев, соединенных гликозидными связями, к примеру, 1-4-связями или 1-6-связями, образуя циклическую структуру. Типичными циклическими олигосахаридными стабилизаторами являются циклические олигосахариды, представляющие собой дискретные соединения типа α-циклодекстрина, β-циклодекстрина или γ-циклодекстрина.
Другие типичные циклические олигосахаридные стабилизаторы включают соединения, которые содержат фрагменты циклодекстрина в составе более крупной молекулярной структуры типа полимера, содержащего фрагменты циклических олигосахаридов. Циклические олигосахариды могут быть окисленными или восстановленными, к примеру, окисленными до дикарбонильных форм. Термин “фрагмент циклодекстрина” в настоящем изобретении означает радикал циклодекстрина (например, α-, β- или γ-циклодекстрина), который входит в состав более крупной молекулярной структуры типа полимера. Фрагмент циклодекстрина может быть связан с одним или несколькими другими фрагментами напрямую или необязательно через линкер. Фрагменты циклодекстрина могут быть окисленными или восстановленными, к примеру, окисленными до дикарбонильных форм.
Углеводными стабилизаторами, например, циклическими олигосахаридными стабилизаторами, могут быть дериватизированные углеводы. Например, в одном воплощении стабилизатором является дериватизированный циклический олигосахарид, например, дериватизированный циклодекстрин, например, 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин, например, частично этерифицированный циклодекстрин (например, частично этерифицированный β-циклодекстрин).
Типичными стабилизаторами являются полисахариды. Термин “полисахарид” в настоящем изобретении означает соединение или химическую группировку, состоящую по меньшей мере из 16 моносахаридных звеньев, соединенных гликозидными связями, к примеру, 1-4-связями или 1-6-связями, образуя линейную, разветвленную или циклическую структуру, и включает полимеры, содержащие полисахариды в составе структуры своего каркаса. Каркасы полисахаридов могут быть линейными или циклическими. Типичными полисахаридными стабилизаторами являются гликоген, амилоза, целлюлоза, декстран, мальтодекстрин и др.
В одном воплощении стабилизатором является сахароспирт. В настоящем изобретении термин “сахароспирт” относится к продуктам восстановления “сахаров” и означает, что все атомы кислорода в молекуле простого сахароспирта присутствуют в виде гидроксильных групп. Сахароспирты являются “полиолами”. Этот термин относится к химическим соединениям, содержащим три или несколько гидроксильных групп, и является синонимом другого привычного термина – многоатомный спирт. Примеры сахароспиртов включают, без ограничения, сорбитол, маннитол, мальтитол, лактитол, эритритол, глицерол, ксилитол или инозитол.
В соответствии с настоящим изобретением предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие в качестве стабилизатора сахарозу. Не придерживаясь какой-либо теории, сахароза действует в качестве криопротектора композиций и тем самым предотвращает агрегацию РНК-липоплексных частиц и поддерживает химическую и физическую стабильность композиций. В некоторых воплощениях настоящего изобретения предусмотрены альтернативные сахарозе стабилизаторы. Альтернативными стабилизаторами являются, без ограничения, трегалоза, глюкоза, фруктоза, аргинин, глицерин, маннитол, пролин, сорбитол, глицин, бетаин и декстран. В одном конкретном воплощении альтернативным сахарозе стабилизатором является трегалоза.
В одном воплощении стабилизатор находится в концентрации от 5% (мас./об) до 35% (мас./об) или от 10% (мас./об) до 25% (мас./об). В определенных воплощениях стабилизатор находится в концентрации примерно 10% (мас./об), 11% (мас./об), 12% (мас./об), 13% (мас./об), 14%. (мас./об), 15% (мас./об), 16% (мас./об), 17% (мас./об), 18% (мас./об), 19% (мас./об), 20% (мас./об), 21% (мас./об), 22% (мас./об), 23% (мас./об), 24% (мас./об) или 25% (мас./об). В одном предпочтительном воплощении стабилизатор находится в концентрации от 15% (мас./об) до 25% (мас./об). В другом предпочтительном воплощении стабилизатор находится в концентрации от 20% (мас./об) до 25% (мас./об). В одном типичном воплощении стабилизатор находится в концентрации 25% (мас./об). В другом типичном воплощении стабилизатор находится в концентрации 22% (мас./об). В различных воплощениях изобретения стабилизатором является сахароза или трегалоза. В одном воплощении изобретения стабилизатором является сахароза. В одном воплощении изобретения стабилизатором является трегалоза.
В соответствии с настоящим изобретением описанные здесь композиции РНК-липоплексных частиц содержат стабилизаторы в концентрации, подходящей для стабилизации композиции, в частности, для стабилизации РНК-липоплексных частиц и стабилизации РНК.
C. pH и буферы
В соответствии с настоящим изобретением описанные здесь композиции РНК-липоплексных частиц имеют значения pH, подходящие для стабилизации РНК-липоплексных частиц, в частности, для стабилизации РНК. В одном воплощении описанные здесь композиции РНК-липоплексных частиц имеют pH от 5,7 до 6,7. В определенных воплощениях композиции имеют pH примерно 5,7 или 5,8 или 5,9 или 6,0 или 6,1 или 6,2 или 6,3 или 6,4 или 6,5 или 6,6 или 6,7.
В соответствии с настоящим изобретением предусмотрены композиции, содержащие буферы. Не придерживаясь какой-либо теории, с помощью буфера поддерживается pH композиций при их производстве, хранении и применении. В некоторых воплощениях настоящего изобретения буфером может быть бикарбонат натрия, мононатрийфосфат, динатрийфосфат, монокалийфосфат, дикалийфосфат, [трис(гидроксиметил)метиламино]пропансульфоновая кислота (TAPS), 2-(бис(2-гидроксиэтил)амино))уксусная кислота (бицин), 2-амино-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол (трис), N-(2-гидрокси-1,1-бис(гидроксиметил)этил)глицин (трицин), 3-[[1,3-дигидрокси-(гидроксиметил)пропан-2-ил]амино]-2-гидроксипропан-1-сульфоновая кислота (TAPSO), 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновая кислота (HEPES), 2-[[1,3-дигидрокси-2-(гидроксиметил)пропан-2-ил]амино]этансульфоновая кислота (TES), 1,4-пиперазиндиэтансульфоновая кислота (PIPES), диметиларсиновая кислота, 2-морфолин-4-илэтансульфоновая кислота (MES), 3-морфолино-2-гидроксипропансульфоновая кислота (MOPSO) или фосфатно-солевой буфер (PBS). Другие подходящие буферы: смесь уксусной кислоты и её соли, лимонной кислоты и её соли, борной кислоты и её соли и фосфорной кислоты и её соли.
В некоторых воплощениях буфер имеет pH от 5,7 до 6,7. В определенных воплощениях буфер имеет pH примерно 5,7 или 5,8 или 5,9 или 6,0 или 6,1 или 6,2 или 6,3 или 6,4 или 6,5 или 6,6 или 6,7. В одном воплощении буфером является HEPES. В предпочтительном воплощении HEPES имеет pH от 5,7 до 6,7. В определенных воплощениях HEPES имеет pH примерно 5,7 или 5,8 или 5,9 или 6,0 или 6,1 или 6,2 или 6,3 или 6,4 или 6,5 или 6,6 или 6,7. В типичном воплощении HEPES имеет pH 6,2.
В следующем воплощении буфер имеет концентрацию от 2,5 мМ до 10 мМ. В определенных воплощениях, в которых буфером является HEPES, концентрация HEPES составляет примерно 2,5 мМ или 2,75 мМ, или 3,0 мМ или 3,25 мМ или 3,5 мМ или 3,75 мМ или 4,0 мМ или 4,25 мМ или 4,5 мМ или 4,75 мМ или 5,0 мМ или 5,25 мМ или 5,5 мМ или 5,75 мМ или 6,0 мМ или 6,25 мМ или 6,5 мМ или 6,75 мМ или 7,0 мМ или 7,25 мМ или 7,5 мМ или 7,75 мМ или 8,0 мМ или 8,25 мМ или 8,5 мМ или 8,75 мМ или 9,0 мМ или 9,25 мМ или 9,5 мМ или 9,75 мМ или 10,0 мМ. В предпочтительном воплощении HEPES находится в концентрации 7,5 мМ.
D. Хелаторы
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предусмотрено использование хелаторов. Хелаторы – химические соединения, способные образовывать по крайней мере две координационные ковалентные связи с ионом металла, образуя при этом стабильный водорастворимый комплекс. Не придерживаясь какой-либо теории, хелаторы в настоящем изобретении снижают концентрацию свободных двухвалентных ионов, которые в противном случае могут вызвать ускоренную деградацию РНК. Примеры подходящих хелаторов включают, без ограничения, этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), соли EDTA, десферриоксамин B, деферроксамин, дитиокарб натрия, пеницилламин, пентетат кальция, натриевую соль пентетиновой кислоты, сукцимер, триентин, нитрилотриуксусную кислоту, транс-диаминоциклогексантетрауксусную кислоту (DCTA), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), бис(аминоэтил)гликолевый эфир N,N,N′,N′-тетрауксусной кислоты, иминодиуксусную кислоту, лимонную кислоту, винную кислоту, фумаровую кислоту либо их соли. В некоторых воплощениях хелатором является EDTA или соль EDTA. В типичном воплощении хелатором является дигидрат динатриевой соли EDTA.
В некоторых воплощениях EDTA находится в концентрации от 0,25 мМ до 5 мМ. В определенных воплощениях EDTA находится в концентрации примерно 0,25 мМ или 0,3 мМ или 0,4 мМ или 0,5 мМ или 0,6 мМ или 0,7 мМ или 0,8 мМ или 0,9 мМ или 1,0 мМ или 1,1 мМ или 1,2 мМ или 1,3 мМ или 1,4 мМ или 1,5 мМ или 1,6 мМ или 1,7 мМ или 1,8 мМ или 1,9 мМ или 2,0 мМ или 2,1 мМ или 2,2 мМ или 2,3 мМ или 2,4 мМ или 2,5 мМ или 2,6 мМ или 2,7 мМ или 2,8 мМ или 2,9 мМ или 3,0 мМ или 3,1 мМ или 3,2 мМ или 3,3 мМ или 3,4 мМ или 3,5 мМ или 3,6 мМ или 3,7 мМ или 3,8 мМ или 3,9 мМ или 4,0 мМ или 4,1 мМ или 4,2 мМ или 4,3 мМ или 4,4 мМ или 4,5 мМ или 4,6 мМ или 4,7 мМ или 4,8 мМ или 4,9 мМ или 5,0 мМ. В предпочтительном воплощении EDTA находится в концентрации 2,5 мМ.
E. Типичные композиции по изобретению
В одном типичном воплощении композиции РНК-липоплексных частиц включают DOTMA и DOPE в молярном соотношении от 2:1 до 1:1 и РНК в концентрации 0,05 мг/мл, которая кодирует по меньшей мере один эпитоп, причем при физиологическом pH отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах составляет 1,3:2,0; хлорид натрия в концентрации 20 мМ; сахарозу в концентрации 22% (мас./об); HEPES в концентрации 7,5 мМ при pH 6,2; и EDTA в концентрации 2,5 мМ. В других конкретных воплощениях РНК кодирует пять эпитопов или 10 эпитопов.
В другом типичном воплощении композиции РНК-липоплексных частиц включают DOTMA и DOPE в молярном соотношении от 2:1 до 1:1 и РНК в концентрации 0,05 мг/мл, которая кодирует по меньшей мере один эпитоп, причем при физиологическом pH отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в РНК-липоплексных частицах составляет 1,3:2,0; хлорид натрия в концентрации 30 мМ; сахарозу в концентрации 20% (мас./об); HEPES в концентрации 7,5 мМ при pH 6,2; и EDTA в концентрации 2,5 мМ. В других конкретных воплощениях РНК кодирует пять эпитопов или 10 эпитопов.
F. Стабильность композиций по изобретению
В настоящем изобретении “стабильные” означает такие композиции, в которых измеренные значения различных физико-химических параметров находятся в пределах заданного диапазона. В одном воплощении композиции подвергаются анализу на стабильность по различным параметрам. Согласно настоящему изобретению, параметры стабильности включают, без ограничения, средний диаметр РНК-липоплексных частиц, индекс полидисперсности, целостность РНК, содержание РНК, pH, осмоляльность и количество субвизуальных частиц. Специалисты в данной области смогут измерить такие параметры с помощью обычных лабораторных методов и приборов. Например, параметры стабильности можно определять методами динамического рассеяния света (DLS), затемнения света, спектрометрии, электрофореза в агарозном геле, на биоанализатора или любым другим подходящим методом. В одном воплощении биоанализатором служит Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies), способный измерять как целостность РНК, так и содержание РНК. В одном воплощении биоанализатором служит Fragment Analyzer фирмы Advanced Analytical.
Не придерживаясь какой-либо теории, измерения DLS применимы для анализа параметров, связанных с РНК-липоплексными частицами по настоящему изобретению. В одном воплощении DLS может применяться для определения среднего диаметра РНК-липоплексных частиц, который выражается в виде z-среднего (меры среднего размера частиц). В другом воплощении DLS может применяться для определения индекса полидисперсности РНК-липоплексных частиц, который показывает распределение РНК-липоплексных частиц по размерам и массе.
В некоторых воплощениях композиции стабильны, если измерения параметров стабильности находятся в пределах заданного диапазона. В одном воплощении стабильных композиций РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр, который отличается от исходного среднего диаметра (т.е. среднего диаметра до замораживания, лиофилизации или распылительной сушки и оттаивания или восстановления) не более чем на ± 20%, ± 10%, ± 5% или ± 3% после хранения, например, после хранения при температуре от -15°C до -40°C. В другом воплощении стабильных композиций РНК-липоплексные частицы имеют индекс полидисперсности, который отличается от исходного индекса полидисперсности (т.е. индекса полидисперсности до замораживания, лиофилизации или распылительной сушки и оттаивания или восстановления) не более чем на ± 20%, ± 10%, ± 5% или ± 3% после хранения, например, после хранения при температуре от -15°C до -40°C. В одном воплощении стабильные композиции содержат не более 6000 субвизуальных частиц с диаметром, большим или равным 10 мкм после хранения, например, после хранения при температуре от -15°C до -40°C. В одном воплощении стабильные композиции содержат не более 600 субвизуальных частиц с диаметром, большим или равным 25 мкм после хранения, например, после хранения при температуре от -15°C до -40°C.
В одном воплощении стабильных композиций целостность РНК составляет не менее 80 процентов после хранения, например, после хранения при температуре от -15°C до -40°C.
В одном воплощении композиции стабильны при температуре хранения от -15°C до -40°C. В определенных воплощениях композиции стабильны при температуре около -15°C или -16°C или -17°C или -18°C или -19°C или -20°C или -21°C или -22°C или -23°C или -24°C или -25°C или -26°C или -27°C или -28°C или -29°C или -30°C или -31°C или -32°C или -33°C или -34°C или -35°C или -36°C или -37°C или -38°C или -39°C или -40°C. В предпочтительном воплощении композиции стабильны при температуре около -15°C или -20°C или -30°C или -40°C.
В одном воплощении композиции стабильны при температуре от -15°C до -40°C, если эти фармацевтические композиции защищены от света. В предпочтительном воплощении композиции стабильны при температуре от -15°C до -25°C, если они защищены от света.
В одном воплощении композиции стабильны при температуре от -15°C до -40°C в течение по меньшей мере 1 месяца и вплоть до 24 месяцев. В определенных воплощениях композиции стабильны при температуре от -15°C до -40°C в течение по меньшей мере 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 13 месяцев, 14 месяцев, 15 месяцев, 16 месяцев, 17 месяцев, 18 месяцев, 19 месяцев, 20 месяцев, 21 месяца, 22 месяцев, 23 месяцев, 24 месяцев, 25 месяцев, 26 месяцев, 27 месяцев, 28 месяцев, 29 месяцев, 30 месяцев, 31 месяца, 32 месяцев, 33 месяцев, 34 месяцев, 35 месяцев или 36 месяцев.
В одном предпочтительном воплощении композиции стабильны при температуре -15°C в течение по меньшей мере 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев или 6 месяцев.
В другом предпочтительном воплощении композиции стабильны при температуре -20°C в течение по меньшей мере 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев или 6 месяцев.
В следующем предпочтительном воплощении композиции стабильны при температуре -30°C в течение по меньшей мере 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев или 6 месяцев.
В одном воплощении композиции стабильны после замораживания при температуре от -15°C до -40°C и оттаивания до температуры от 4°C до 25°C (до окружающей температуры). В другом воплощении композиции стабильны после замораживания при температуре от -15°C до -40°C и оттаивания до температуры от 4°C до 25°C (до окружающей температуры) при множественных циклах замораживания-оттаивания.
G. Физическое состояние композиций по изобретению
В различных воплощениях композиции по настоящему изобретению представля
ют собой жидкости или твердые вещества. Неограничительные примеры твердых веществ включают замороженные формы или лиофилизированные формы. В предпочтительном воплощении композиции представляют собой жидкости.
ют собой жидкости или твердые вещества. Неограничительные примеры твердых веществ включают замороженные формы или лиофилизированные формы. В предпочтительном воплощении композиции представляют собой жидкости.
Фармацевтические композиции по изобретению
Композиции, содержащие описанные здесь РНК-липоплексные частицы, применимы в качестве или для получения фармацевтических композиций или лекарственных средств для терапевтического или профилактического лечения.
Частицы по настоящему изобретению можно вводить в виде любых подходящих фармацевтических композиций.
Термин “фармацевтическая композиция” относится к препаратам, содержащим терапевтически эффективные средства, предпочтительно вместе с фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и/или эксципиентами. Такие фармацевтические композиции применимы для лечения, предотвращения или уменьшения тяжести заболеваний или расстройств путем введения данных фармацевтических композиций субъектам. Фармацевтические композиции также известны в данной области как лекарственные формы. В контексте настоящего изобретения фармацевтические композиции содержат РНК-липоплексные частицы, как описано здесь.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению предпочтительно содержат один или несколько адъювантов либо могут вводиться вместе с одним или несколькими адъювантами. Термин “адъювант” относится к соединениям, которые продлевают, усиливают или ускоряют иммунный ответ. Адъюванты составляют гетерогенную группу соединений типа масляных эмульсий (например, адъюванты Фрейнда), минеральных соединений (типа квасцов), бактериальных продуктов (типа токсина Bordetella pertussis) или иммуностимулирующих комплексов. Примеры адъювантов включают, без ограничения, LPS, GP96, CpG-олигодезоксинуклеотиды, факторы роста и такие цитокины, как монокины, лимфокины, интерлейкины, хемокины. Хемокины могут быть IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, INF-α, INF-γ, GM-CSF, LT-α. Другие известные адъюванты – гидроксид алюминия, адъювант Фрейнда или масло типа Montanide® ISA51. Другие подходящие адъюванты для применения в настоящем изобретении – липопептиды типа Pam3Cys.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению обычно применяются в “фармацевтически эффективном количестве” и в виде “фармацевтически приемлемых препаратов”.
Термин “фармацевтически приемлемый” означает нетоксичность материала, который не мешает действию активного компонента фармацевтической композиции.
Термин “фармацевтически эффективное количество” означает такое количество, которое обеспечивает требуемую реакцию или нужный эффект по отдельности или вместе с дополнительными дозами. В случае лечения конкретного заболевания требуемая реакция предпочтительно означает торможение течения заболевания. Это включает замедление развития заболевания, в частности, прерывание или регрессию развития заболевания. Требуемая реакция при лечении заболевания также может означать замедление возникновения или предотвращение возникновения данного заболевания или данного состояния. Эффективное количество частиц или композиций, описанных здесь, будет зависеть от подлежащего лечению заболевания, тяжести заболевания, индивидуальных параметров пациента, включая возраст, физиологическое состояние, размер и вес, продолжительности лечения, типа сопутствующей терапии (при её наличии), конкретного способа введения и подобных факторов. Соответственно, вводимые дозы частиц или композиций, описанных здесь, могут зависеть от различий в таких параметрах. В случае, если реакция пациента на начальную дозу недостаточна, можно использовать большие дозы (или эффективно большие дозы при другом, более локализованном способе введения).
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать соли, буферы, консерванты и необязательно другие терапевтические средства. В одном воплощении фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и/или эксципиентов.
Подходящими консервантами для применения в фармацевтических композициях по настоящему изобретению являются, без ограничения, бензалконий хлорид, хлорбутанол, парабен и тимеросал.
Термин “эксципиент” в настоящем изобретении означает такое вещество, которое может присутствовать в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, но не является активным ингредиентом. Примеры эксципиентов включают, без ограничения, носители, связующие, разбавители, смазывающие вещества, загустители, поверхностно-активные вещества, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, буферы, ароматизаторы или красители.
Термин “разбавитель” означает разбавляющее и/или разжижающее вещество. Кроме того, термин “разбавитель” включает одну или несколько сред из числа текучих, жидких или твердых суспензионных и/или смешивающих сред. Примеры подходящих разбавителей включают этанол, глицерол и воду.
Термин “носитель” означает такой компонент, который может быть природным, синтетическим, органическим, неорганическим, в котором содержится активный компонент для облегчения, усиления или обеспечения введения фармацевтической композиции. В настоящем изобретении носителем может быть один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей, разбавителей или инкапсулирующих веществ, которые подходят для введения субъектам. Подходящими носителями являются, без ограничения, стерильная вода, раствор Рингера, раствор Рингера с лактатом, стерильный раствор хлорида натрия, изотонический солевой раствор, полиалкиленгликоли, гидрогенизированные нафталины, в частности, биосовместимые лактидные полимеры, лактидные/гликолидные сополимеры или сополимеры полиоксиэтилена/полиоксипропилена. В одном воплощении фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат изотонический солевой раствор.
Фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или разбавители для терапевтического применения хорошо известны в области фармацевтики и описаны, к примеру, в Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R Gennaro, edit. 1985).
Фармацевтические носители, эксципиенты или разбавители можно выбирать с учетом предлагаемого способа введения и стандартной фармацевтической практики.
Способы введения фармацевтических композиций по изобретению
В одном воплощении описанные здесь фармацевтические композиции можно вводить внутривенно, внутриартериально, подкожно, внутрикожно или внутримышечно. В некоторых воплощениях фармацевтические композиции предназначены для местного введения или системного введения. Системное введение может включать энтеральное введение, которое включает всасывание через желудочно-кишечный тракт, или парентеральное введение. В настоящем изобретении “парентеральное введение” означает введение другим способом, чем через желудочно-кишечный тракт, типа внутривенного введения. В одном предпочтительном воплощении фармацевтические композиции предназначены для системного введения. В другом предпочтительном воплощении системное введение осуществляется путем внутривенного введения.
Промышленные изделия
В одном аспекте описанные здесь РНК-липоплексные частицы находятся в фармацевтических композициях. В другом аспекте описанные здесь композиции представляют собой фармацевтические композиции.
В одном аспекте изобретения предусмотрены флаконы, содержащие описанные здесь фармацевтические композиции. В другом аспекте изобретения предусмотрены шприцы, содержащие описанные здесь фармацевтические композиции.
Применение фармацевтических композиций по изобретению
РНК-липоплексные частицы, описанные здесь, могут применяться при терапевтическом или профилактическом лечении различных заболеваний, в частности заболеваний, при которых введение пептида или белка субъектам дает терапевтический или профилактический эффект. Например, введение антигена или эпитопа, происходящего из вируса, может быть полезным при лечении вирусного заболевания, вызванного данным вирусом. Введение опухолевого антигена или эпитопа может быть полезным при лечении ракового заболевания, при котором раковые клетки экспрессируют данный опухолевый антиген.
Термин “заболевание” означает такое аномальное состояние, которое поражает организм индивида. Заболевание часто рассматривается как медицинское состояние, связанное с определенными симптомами и признаками. Заболевание может быть вызвано факторами, происходящими из внешнего источника, типа инфекционных заболеваний, или же оно может быть вызвано внутренними дисфункциями, типа аутоиммунных заболеваний. У людей термин “заболевание” часто применяется в более широком смысле для обозначения любых состояний, вызывающих боль, дисфункцию, недомогание, социальные проблемы или смерть страдающего им индивида, или аналогичные проблемы для тех, кто находится в контакте с этим индивидом. В таком более широком смысле он иногда включает травмы, инвалидность, расстройства, синдромы, инфекции, отдельные симптомы, девиантное поведение и атипичные варианты структуры и функции, тогда как в других контекстах и для других целей их можно рассматривать как отдельные категории. Заболевания обычно поражают людей не только физически, но и эмоционально, так как появление многих болезней и жизнь с ними может изменить взгляды на жизнь и личность человека.
В настоящем изобретении термин “лечение”, “лечить” или “терапевтическое вмешательство” означает мониторинг субъекта и уход за ним с целью борьбы с заболеванием, например, болезнью или расстройством. Термин служит для обозначения полного спектра терапии для того заболевания, которым страдает субъект, в том числе введения терапевтически эффективного соединения для ослабления симптомов или осложнений, для замедления развития болезни, расстройства или заболевания, для ослабления или снятия симптомов или осложнений и/или для излечения или устранения болезни, расстройства или заболевания, а также для профилактики заболеваний, причем профилактику следует понимать как мониторинг индивида и уход за ним с целью борьбы с болезнью, заболеванием или расстройством, что включает введение активных соединений для предотвращения появления симптомов или осложнений.
Термин “терапевтическое лечение” означает такое лечение, которое улучшает состояние здоровья и/или продлевает (увеличивает) продолжительность жизни индивида. Такое лечение может устранить заболевание у индивида, остановить или замедлить развитие заболевания у индивида, подавить или замедлить развитие заболевания у индивида, уменьшить частоту или тяжесть симптомов у индивида и/или уменьшить рецидивы у индивида, у которого в настоящее время есть или ранее было заболевание.
Термин “профилактическое лечение” или “превентивное лечение” означает такое лечение, которое предназначено для предотвращения возникновения заболевания у индивида. Термины “профилактическое лечение” или “превентивное лечение” применяются здесь взаимозаменяемым образом.
Термины “индивид” и “субъект” применяются здесь взаимозаменяемо. Они относятся к людям или другим млекопитающим (например, мышам, крысам, кроликам, собакам, кошкам, крупному рогатому скоту, свиньям, овцам, лошадям или приматам), которые могут быть поражены или быть подвержены заболеванию или расстройству (например, раку), но у них может и не быть заболевания или расстройства. Во многих воплощениях индивидом является человек. Если не указано иное, термины “индивид” и “субъект” не обозначают конкретный возраст, поэтому они охватывают взрослых, пожилых, детей и новорожденных. В воплощениях настоящего изобретения “индивид” или “субъект” является “пациентом”.
Термин “пациент” обозначает индивида или субъекта, подлежащего лечению, в частности, больного индивида или субъекта.
В одном воплощении задача изобретения состоит в том, чтобы обеспечить иммунный ответ против больных клеток, экспрессирующих антиген, типа раковых клеток, экспрессирующих опухолевый антиген, и лечение заболеваний типа раковых заболеваний с участием клеток, экспрессирующих антиген типа опухолевого антигена.
Фармацевтические композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, как описано здесь, содержащие РНК, кодирующую пептид или белок, который содержит один или несколько антигенов либо один или несколько эпитопов, могут вводиться субъектам для запуска иммунного ответа против одного или нескольких антигенов либо одного или нескольких эпитопов у субъекта, который может быть терапевтическим либо частично или полностью защитным. Специалистам в данной области должно быть известно, что один из принципов иммунотерапии и вакцинации основан на том, что иммунозащитная реакция на заболевание вырабатывается при иммунизации субъекта таким антигеном или эпитопом, который иммунологически релевантен в отношении подлежащего лечению заболевания. Соответственно, описанные здесь фармацевтические композиции применимы для запуска или усиления иммунного ответа. Таким образом, описанные здесь фармацевтические композиции применимы для профилактического и/или терапевтического лечения заболеваний с участием антигенов или эпитопов.
В настоящем изобретении “иммунный ответ” означает всеобъемлющий ответ организма на антиген или клетки, экспрессирующие антиген, и означает клеточный иммунитет и/или гуморальный иммунитет. Клеточный иммунитет включает, без ограничения, клеточный ответ, направленный на клетки, экспрессирующие антиген, и характеризуется презентацией антигена с молекулами MHC класса I или класса II. Клеточный ответ относится к T-лимфоцитам, которые можно классифицировать как T-хелперы (они также именуются T-клетками CD4+), которые играют главную роль, регулируя иммунный ответ, и клетки-киллеры (также именуются цитотоксическими T-клетками, T-клетками CD8+ или CTLs), которые вызывают апоптоз в инфицированных клетках или раковых клетках. В одном воплощении введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению включает стимуляцию противоопухолевого ответа T-клеток CD8+ против раковых клеток, экспрессирующих один или несколько опухолевых антигенов. В одном конкретном воплощении опухолевые антигены презентируются с молекулами MHC класса I.
В настоящем изобретении предусмотрены иммунные ответы, которые могут быть защитными, превентивными, профилактическими и/или терапевтическими. В настоящем изобретении “вызывает [или индуцирует] иммунный ответ” может означать то, что иммунного ответа против определенного антигена не было до индукции, или же то, что был базовый уровень иммунного ответа против определенного антигена, который усиливался после индукции. Следовательно, “вызывает [или индуцирует] иммунный ответ” включает и “усиливает [или повышает] иммунный ответ”.
Термин “иммунотерапия” означает лечение болезни или заболевания путем запуска или усиления иммунного ответа. Термин “иммунотерапия” включает иммунизацию антигеном или вакцинацию антигеном.
Термины “иммунизация” или “вакцинация” описывают процесс введения антигена индивидам с целью запруска иммунного ответа, к примеру, в терапевтических или профилактических целях.
В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрены воплощения, в которых вводятся описанные здесь РНК-липоплексные частицы, нацеленные на ткань селезенки. РНК кодирует пептид или белок, содержащий антиген или эпитоп, как описано здесь, к примеру. РНК захватывается антиген-презентирующими клетками селезенки типа дендритных клеток для экспрессии пептида или белка. После необязательного процессинга и презентации антиген-презентирующими клетками может вырабатываться иммунный ответ против антигена или эпитопа, ведущий к профилактическому и/или терапевтическому лечению заболевания с участием этого антигена или эпитопа. В одном воплощении иммунный ответ, индуцируемый описанными здесь РНК-липоплексными частицами, включает презентацию антигена или его фрагмента типа эпитопа антигенпрезентирующими клетками типа дендритных клеток и/или макрофагов и активацию цитотоксических T-клеток вследствие этой презентации. Например, пептиды или белки, кодируемые РНК или продуктами её обработки, могут презентироваться белками главного комплекса гистосовместимости (MHC), экспрессированными на антигенпрезентирующих клетках. Затем комплекс MHC-пептид может распознаваться иммунными клетками типа T-клеток или B-клеток, что ведет к их активации.
Так, в одном воплощении РНК в РНК-липоплексных частицах, описанных здесь, после введения доставляется в селезенку и/или экспрессируется в селезенке. В одном воплощении РНК-липоплексные частицы попадают в селезенку для активации антигенпрезентирующих клеток селезенки. Так, в одном воплощении после введения РНК-липоплексных частиц происходит доставка РНК и/или экспрессия РНК в антигенпрезентирующих клетках. Антигенпрезентирующие клетки могут быть профессиональными антигенпрезентирующими клетками или непрофессиональными антигенпрезентирующими клетками. Профессиональными антигенпрезентирующими клетками могут быть дендритные клетки и/или макрофаги, еще более предпочтительно дендритные клетки селезенки и/или макрофаги селезенки.
Соответственно, настоящим изобретением предусмотрены РНК-липоплексные частицы или фармацевтические композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, как описано здесь, для запуска или усиления иммунного ответа, предпочтительно иммунного ответа против рака.
В другом воплощении настоящего изобретения предусмотрены РНК-липоплексные частицы или фармацевтические композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, как описано здесь, для применения при профилактическом и/или терапевтическом лечении заболеваний с участием антигенов, предпочтительно раковых заболеваний.
В следующем воплощении настоящего изобретения предусмотрен способ доставки антигена или эпитопа антигена в антигенпрезентирующие клетки типа профессиональных антигенпрезентирующих клеток в селезенке либо экспрессии антигена или эпитопа антигена в антигенпрезентирующих клетках типа профессиональных антигенпрезентирующих клеток в селезенке, включающий введение субъектам РНК-липоплексных частиц или фармацевтических композиций, содержащих РНК-липоплексные частицы, как описано здесь. В одном воплощении антиген представляет собой опухолевый антиген. В этом аспекте антиген или эпитоп антигена предпочтительно кодируется РНК в РНК-липоплексных частицах.
В одном воплощении системное введение РНК-липоплексных частиц или фармацевтических композиций, содержащих РНК-липоплексные частицы, как описано здесь, приводит к наведению и/или накоплению РНК-липоплексных частиц или РНК в селезенке, а не в легких и/или печени. В одном воплощении РНК-липоплексные частицы высвобождают РНК в селезенке и/или проникают в клетки селезенки. В одном воплощении при системном введении РНК-липоплексных частиц или фармацевтических композиций, содержащих РНК-липоплексные частицы, как описано здесь, РНК попадает в антигенпрезентирующие клетки селезенки. В одном конкретном воплощении антигенпрезентирующие клетки в селезенке представляют собой дендритные клетки или макрофаги.
В другом воплощении настоящего изобретения предусмотрен способ запуска или усиления иммунного ответа у субъектов, включающий введение субъектам РНК-липоплексных частиц или фармацевтических композиций, содержащих РНК-липоплексные частицы, как описано здесь. В типичном воплощении иммунный ответ направлен против рака.
Термин “макрофаги” относится к подгруппе фагоцитарных клеток, образующихся при дифференцировке моноцитов. Макрофаги, которые активируются при воспалении или иммунными цитокинами либо микробными продуктами, неспецифически поглощают и уничтожают чужеродные патогены внутри макрофагов путем гидролитической и окислительной атаки, вызывающей разрушение патогена. Пептиды из расщепленных белков экспонируются на клеточной поверхности макрофагов, где они могут распознаваться T-клетками, а также могут напрямую взаимодействовать с антителами на поверхности B-клеток, вызывая активацию T- и B-клеток и дальнейшую стимуляцию иммунного ответа. Макрофаги принадлежат к классу антигенпрезентирующих клеток. В одном воплощении макрофаги представлены макрофагами селезенки.
Термин “дендритные клетки” (DC) относится к другому подтипу фагоцитарных клеток, принадлежащих к классу антигенпрезентирующих клеток. В одном воплощении дендритные клетки происходят из предшественников кроветворных клеток костного мозга. Эти клетки-предшественники сначала превращаются в незрелые дендритные клетки. Эти незрелые клетки характеризуются высокой фагоцитарной активностью и низким потенциалом активации T-клеток. Незрелые дендритные клетки постоянно проверяют окружающую среду на наличие патогенов типа вирусов и бактерий. Как только они вступают в контакт с презентируемым антигеном, они активируются и превращаются в зрелые дендритные клетки, которые начинают мигрировать в селезенку или лимфатические узлы. Незрелые дендритные клетки фагоцитируют патогены и расщепляют их белки на мелкие фрагменты, а после созревания презентируют эти фрагменты на своей клеточной поверхности с помощью молекул MHC. Одновременно у них повышается уровень рецепторов на клеточной поверхности, действующих в качестве корецепторов при активации T-клеток типа CD80, CD86 и CD40, значительно повышая их способность активировать T-клетки. Также у них повышается уровень хемотаксических рецепторов CCR7, побуждающих дендритные клетки перемещаться через кровоток в селезенку либо через лимфатическую систему в лимфатические узлы. Здесь они действуют в качестве антигенпрезентирующих клеток и активируют T-клетки-хелперы и T-клетки-киллеры, а также B-клетки путем презентации им антигенов наряду с неспецифичными для антигенов костимулирующими сигналами. Таким образом, дендритные клетки могут активно индуцировать связанный с T-клетками или B-клетками иммунный ответ. В одном воплощении дендритные клетки представлены дендритными клетками селезенки.
Термин “антигенпрезентирующие клетки” (APC) означает клетки такой разновидности, которая способна отображать, приобретать и/или презентировать по меньшей мере один антиген или антигенный фрагмент на своей клеточной поверхности. Антигенпрезентирующие клетки подразделяются на профессиональные антигенпрезентирующие клетки и непрофессиональные антигенпрезентирующие клетки.
Термин “профессиональные антигенпрезентирующие клетки” означает такие антигенпрезентирующие клетки, которые конститутивно экспрессируют молекулы главного комплекса гистосовместимости класса II (МНС класса II), необходимые для взаимодействия с наивными T-клетками. Если T-клетки взаимодействуют с комплексом молекул MHC класса II на мембране антигенпрезентирующих клеток, то антигенпрезентирующие клетки вырабатывают костимулирующие молекулы, вызывающие активацию T-клеток. Профессиональные антигенпрезентирующие клетки включают дендритные клетки и макрофаги.
Термин “непрофессиональные антигенпрезентирующие клетки” означает такие антигенпрезентирующие клетки, которые экспрессируют молекулы МНС класса II не конститутивно, а только при стимуляции определенными цитокинами типа γ-интерферона. Примеры непрофессиональных антигенпрезентирующих клеток включают фибробласты, эпителиальные клетки тимуса, эпителиальные клетки щитовидной железы, глиальные клетки, β-клетки поджелудочной железы или эндотелиальные клетки сосудов.
“Процессинг антигена” означает расщепление антигена на продукты процессинга, которые являются фрагментами данного антигена (например, расщепление белка на пептиды), и ассоциацию одного или нескольких из этих фрагментов (например, посредством связывания) с молекулами MHC для презентации их клетками типа антигенпрезентирующих клеток специфичным T-клеткам.
Термин “заболевание с участием антигена” или “заболевание с участием эпитопа” означает такое заболевание, которое связано с антигеном или эпитопом, например, заболевание, которое характеризуется наличием антигена или эпитопа. Заболевание с участием антигена или эпитопа может представлять собой инфекционное заболевание, или раковое заболевание, или просто рак. Как указано выше, антиген может представлять собой связанный с заболеванием антиген типа связанного с опухолью антигена, вирусный антиген или бактериальный антиген, а эпитоп может происходить из такого антигена.
Термин “инфекционное заболевание” означает такое заболевание, которое может передаваться от человека к человеку или от организма к организму и вызвано микробным агентом (например, простуду). Инфекционные заболевания известны в данной области и включают, к примеру, вирусные заболевания, бактериальные заболевания или паразитарные заболевания, которые вызывают вирусы, бактерии или паразиты, соответственно. При этом инфекционным заболеванием может быть, к примеру, гепатит, заболевание, передающееся половым путем (например, хламидиоз или гонорея), туберкулез, ВИЧ/синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), дифтерия, гепатит B, гепатит C, холера, тяжелый острый респираторный синдром (SARS), птичий грипп и грипп.
Термины “раковое заболевание” или “рак” означают или описывают физиологическое состояние индивида, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примерами раковых заболеваний являются, без ограничения, карцинома, лимфома, бластома, саркома и лейкемия. Более конкретно, примеры таких раковых заболеваний включают рак костей, рак крови, рак легких, рак печени, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или внутриглазную меланому, рак матки, рак яичников, рак прямой кишки, рак анального канала, рак желудка, рак толстой кишки, рак груди, рак простаты, рак матки, карциномы половых и репродуктивных органов, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркомы мягких тканей, рак мочевого пузыря, рак почек, почечно-клеточный рак, карциномы почечной лоханки, неоплазии центральной нервной системы (ЦНС), нейроэктодермальный рак, опухоли спинного мозга, глиомы, менингиомы и аденомы гипофиза. Термин “рак”, согласно изобретени, также включает раковые метастазы.
При лечении рака могут потребоваться комбинированные стратегии вследствие результирующего синергического эффекта, который может быть значительно сильнее, чем воздействие при монотерапии. В одном воплощении фармацевтические композиции вводятся вместе с иммунотерапевтическим средством. В настоящем изобретении “иммунотерапевтическое средство” означает такое средство, которое может участвовать в активации специфического иммунного ответа и/или иммуноэффекторной функции. Настоящим изобретением предусмотрено применение антител в качестве иммунотерапевтических средств. Не придерживаясь какой-либо теории, антитела способны обеспечивать терапевтические эффекты против раковых клеток с помощью различных механизмов, включая индуцирование апоптоза, блокировку компонентов путей передачи сигналов или ингибирование пролиферации опухолевых клеток. В некоторых воплощениях антитела представляют собой моноклональные антитела. Моноклональные антитела могут вызывать гибель клеток посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или связываться с белками комплемента, что ведет к прямой токсичности для клеток, известной как комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC). Неограничивающие примеры противораковых антител и потенциальных мишеней антител (в скобках), которые можно использовать в комбинации с настоящим изобретением, включают: абаговомаб (CA-125), абциксимаб (CD41), адекатумумаб (EpCAM), афутузумаб (CD20), алацизумаб-пегол (VEGFR2), альтумомаб-пентетат (CEA), аматуксимаб (MORAb-009), анатумомаб-мафенатокс (TAG-72), аполизумаб (HLA-DR), арцитумомаб (CEA), атезолизумаб (PD-L1), бавитуксимаб (фосфатидилсерин), бектумомаб (CD22), белимумаб (BAFF), бевацизумаб (VEGF-A), биватузумаб-мертансин (CD44 v6), блинатумомаб (CD19), брентуксимаб-ведотин (CD30 TNFRSF8), кантузумабмертансин (CanAg муцина), кантузумаб-равтансин (MUC1), капромаб пендетид (клетки карциномы простаты), карлумаб (CNT0888), катумаксомаб (EpCAM, CD3), цетуксимаб (EGFR), цитатузумаб-богатокс (EpCAM), циксутумумаб (рецептор IGF-1), клаудиксимаб (клаудин), кливатузумаб-тетраксетан (MUC1), конатумумаб (TRAIL-R2), дацетузумаб (CD40), далотузумаб (рецептор инсулиноподобного фактора роста I), деносумаб (RANKL), детумомаб (клетки B-лимфомы), дрозитумаб (DR5), экромексимаб (ганглиозид GD3), эдреколомаб (EpCAM), элотузумаб (SLAMF7), энаватузумаб (PDL192), энситуксимаб (NPC-1C), эпратузумаб (CD22), эртумаксомаб (HER2/neu, CD3), этарацизумаб (интегрин ανβ3), фарлетузумаб (рецептор фолата 1), FBTA05 (CD20), фиклатузумаб (SCH 900105), фигитумумаб (рецептор IGF-1), фланвотумаб (гликопротеин 75), фрезолимумаб (TGF-β), галиксимаб (CD80), ганитумаб (IGF-I), гемтузумаб-озогамицин (CD33), гевокизумаб (IL1β), гирентуксимаб (карбоангидраза 9 (CA-IX)), глембатумумабведотин (GPNMB), ибритумомаб-тиуксетан (CD20), икрукумаб (VEGFR-1), иговомаб (CA-125), индатуксимаб-равтансин (SDC1), интетумумаб (CD51), инотузумаб-озогамицин (CD22), ипилимумаб (CD152), иратумумаб (CD30), лабетузумаб CEA), лексатумумаб (TRAIL-R2), либивирумаб (поверхностный антиген гепатита B), линтузумаб (CD33), лорвотузумаб-мертансин (CD56), лукатумумаб (CD40), лумиликсимаб (CD23), мапатумумаб (TRAIL-R1), матузумаб (EGFR), меполизумаб (IL5), милатузумаб (CD74), митумомаб (ганглиозид GD3), могамулизумаб (CCR4), моксетумомаб-пасудотокс (CD22), наколомаб-тафенатокс (антиген C242), наптумомаб-эстафенатокс (5T4), наматумаб (RON), нецитумумаб (EGFR), нимотузумаб (EGFR), ниволумаб (IgG4), офатумумаб (CD20), оларатумаб (PDGF-Ra), онартузумаб (киназа рецептора человеческого фактора рассеяния), опортузумаб-монатокс (EpCAM), ореговомаб (CA-125), окселумаб (OX-40), панитумумаб (EGFR), патритумаб (HER3), пемтумомаб (MUC1), пертузумаб (HER2/neu), пинтумомаб (антиген аденокарциномы), притумумаб (виментин), ракотумомаб (N-гликозилнейраминовая кислота), радретумаб (экстрадомен-B фибронектина), рафивирумаб (гликопротеин вируса бешенства), рамуцирумаб (VEGFR2), рилотумумаб (HGF), ритуксимаб (CD20), робатумумаб (рецептор IGF-1), самализумаб (CD200), сибротузумаб (FAP), силтуксимаб (IL6), табалумаб (BAFF), такатузумаб-тетраксетан (α-фетопротеин), таплитумомаб-паптокс (CD19), тенатумомаб (тенасцин C), тепротумумаб (CD221), тицилимумаб (CTLA-4), тигатузумаб (TRAIL-R2), TNX-650 (IL13), тоситумомаб (CD20), трастузумаб (HER2/neu), TRBS07 (GD2), тремелимумаб (CTLA-4), тукотузумаб-целмолейкин (EpCAM), ублитуксимаб (MS4A1), урелумаб (4-1BB), волоциксимаб (интегрин α5β1), вотумумаб (опухолевый антиген CTAA 16.88), залутумумаб (EGFR) и занолимумаб (CD4).
В одном воплощении иммунотерапевтическим средством является антагонист связывания оси PD-1. Антагонисты связывания оси PD-1 включают, без ограничения, антагонисты связывания PD-1, антагонисты связывания PD-L1 и антагонисты связывания PD-L2. Альтернативные названия для “PD-1” включают CD279 и SLEB2. Альтернативные названия для “PD-L1” включают B7-H1, B7-4, CD274 и B7-H. Альтернативные названия для “PD-L2” включают B7-DC, Btdc и CD273. В некоторых воплощениях антагонистами связывания PD-1 являются молекулы, которые ингибируют связывание PD-1 с его партнерами по связыванию лиганда. В одном конкретном аспекте партнерами по связыванию лиганда PD-1 являются PD-L1 и/или PD-L2. В другом воплощении антагонистами связывания PD-L1 являются молекулы, которые ингибируют связывание PD-L1 с его партнерами по связыванию. В одном конкретном воплощении партнерами по связыванию PD-L1 являются PD-1 и/или B7-1. В другом воплощении антагонистами связывания PD-L2 являются молекулы, которые ингибируют связывание PD-L2 с его партнерами по связыванию. В одном конкретном воплощении партнером по связыванию PD-L1 является PD-1. Антагонистами связывания PD-1 могут быть антитела, их антиген-связывающие фрагменты, иммуноадгезины, слитые белки или олигопептиды. В некоторых воплощениях антагонистами связывания PD-1 являются антитела против PD-1 (например, человеческие антитела, гуманизованные антитела или химерные антитела). Примеры антител против PD-1 включают, без ограничения, MDX-1106 (ниволумаб, OPDIVO), Merck 3475 (MK-3475, пембролизумаб, KEYTRUDA), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001, REGN2810, BGB-108 и BGB-A317.
В одном воплощении антагонистами связывания PD-1 являются иммуноадгезины, которые содержат внеклеточную или связывающую PD-1 часть PD-L1 или PD-L2, слитую с константной областью. В одном воплощении антагонистом связывания PD-1 является AMP-224 (также известный как B7-DCIg, то есть PD-L2-Fc), который представляет собой растворимый слитый рецептор, описанный в WO 2010/027827 и WO 2011/066342.
В одном воплощении антагонистами связывания PD-1 являются антитела против PD-L1, включая, без ограничения, YW243.55.S70, MPDL3280A (атезолизумаб), MEDI4736 (дурвалумаб), MDX-1105 и MSB0010718C (авелумаб).
В одном воплощении иммунотерапевтическим средством является антагонист связывания PD-1. В другом воплощении антагонистом связывания PD-1 является антитело против PD-L1. В типичном воплощении антителом против PD-L1 является атезолизумаб.
Цитирование приведенных здесь документов и исследований не означает признания того, что что-нибудь из вышеизложенного является соответствующим уровню техники. Все утверждения насчет содержания этих документов основываются на информации, доступной заявителям, и не означают признания правильности содержания этих документов.
Следующее описание представлено для того, чтобы средние специалисты в данной области могли создавать и применять различные воплощения изобретения. Описание конкретных устройств, методов и приложений приводится только в качестве примеров. Средним специалистам в данной области должны быть очевидны различные модификации описанных здесь примеров, а определенные здесь общие принципы могут применяться к другим примерам и приложениям, не выходя за рамки сущности и объема различных воплощений. Таким образом, различные воплощения не должны ограничиваться описанными и представленными примерами, а должны соответствовать объему соответствующей формулы изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Материалы
Для описанных далее экспериментов использовались следующие известные материалы.
Материал | Компания, № изделия |
R-DOTMA | Merck & Cie, 5000249.2900-10G |
DOPE | CordenPharma, LP-04-069 |
Абс. этанол | VWR Chemicals, 20821.365 |
Вода | Aqua B.Braun, 0082479E |
Minisart 0,45 мкм | Sartorius Stedim., 16555-K |
Minisart 0,8 мкм | Sartorius Stedim., 17593-K |
Minisart 1,2 мкм | Sartorius Stedim., 17593-K |
Minisart 5 мкм | Sartorius Stedim., 17594-K |
Microlance 3, 0,9×40 мм | BD, 301300 |
Injekt-F, 1 мл | B. Braun, 9166017V |
5М раствор NaCl | Ambion, AM9760G |
Luc-RNA | РНК, кодирующая люциферазу; получена из Biontech RNA Pharmaceuticals |
Пример 2. Получение липидных смесей
Получали смесь липидов DOTMA/DOPE при различных концентрациях липидов в этаноле с молярным соотношением липидов 2:1, соответственно. Раствор готовится следующим образом:
– сделать навеску липида DOPE;
– рассчитать количество DOTMA для поддержания молярного соотношения DOTMA/DOPE = 2:1;
– сделать навеску липида DOTMA;
– рассчитать количество абсолютного этанола, необходимое для растворения липидов;
– сделать навеску абс. этанола;
– растворить липиды в этаноле на водяной бане при 37°C.
Растворимость DOPE и DOPE/DOTMA в этаноле исследовали, получая растворы 300 мМ DOPE или 330 мМ DOPE/DOTMA (66:33) в этаноле. Липиды растворяли, инкубируя растворы липидов при 37°C в течение 20 мин. Растворы DOPE центрифугировали при 17000 g в течение 1 ч и измеряли концентрацию DOPE в супернатанте методом HPLC. Растворы DOTMA/DOPE фильтровали через шприц-фильтр PES на 0,22 мкм и измеряли концентрацию липидов в фильтрате методом HPLC.
Можно приготовить и другие липидные смеси таким же образом, выполняя основные операции, описанные в этом примере, если использовать другие липиды в качестве исходных материалов и/или рассчитывать другие молярные соотношения.
Пример 3. Получение липосом
Липосомы получали впрыскиванием раствора липидов в этаноле следующим образом. Впрыскивали 0,2 мл DOTM/DOPE или другого раствора липидов в этаноле с помощью шприца на 1 мл, снабженного иглой 0,9×40 мм, в 9,8 мл воды с перемешиванием при 120 об/мин. Липосомный коллоид перемешивали в течение 30 мин. Липосомы фильтровали через шприц-фильтры CA на 0,45 или 1,2 или 5 мкм или же не фильтровали. Липосомные коллоиды хранили при 4-8°C. Растворы липидов DOTMA/DOPE получали при молярном соотношении 66:33 при различных общих концентрациях липидов от 100 до 400 мМ с промежуточными стадиями в 50 мМ.
Пример 4. Получение РНК-липоплексов
Препараты РНК-липоплексов получали следующим образом. Сначала смешивали раствор РНК (например, раствор luc-РНК) с раствором NaCl для предварительной конденсации luc-РНК. После этого смешивали липосомный коллоид и раствор luc-РНК-NaCl для формирования РНК-липоплексов. Препарат РНК-липоплексов инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин и хранили при 4-8°C. Готовили различные препараты РНК-липоплексов, например, при соотношении N/P = 0,65. Концентрация РНК в этих различных препаратах РНК-липоплексов составляла 0,1 мг/мл, а концентрация NaCl составляла 50 мМ. Для получения РНК-липоплексов использовали различные предшественники липосом (разного размера).
Пример 5. Динамическое рассеяние света
Измеряли размеры липосом и РНК-липоплексов известным методом динамического рассеяния света (DLS) с помощью прибора Nicomp (PSS, Santa Barbara, США). Образцы липосом разбавляли водой до общей концентрации липидов 1 мМ. Образцы РНК-липоплексов разбавляли 1:5 0,9%-ым раствором NaCl. Образцы замеряли в культуральных пробирках 5×50 мм (Kimble, США).
Пример 6. Затемнение света – динамическое рассеяние света
Проводили подсчет/измерение частиц из различных препаратов липосом и РНК-липоплексов в диапазоне размеров от 0,5 до 5 мкм с помощью прибора Accusizer A7000 (PSS, Santa Barbara, США). Проводили три измерения в объеме 5 мл (2,5 мкл образца/20 мл свободной от частиц воды). Полученные результаты представляют среднее значение количества частиц по трем измерениям.
Пример 7. Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей
Измеряли параметры внутренней структуры различных препаратов РНК-липоплексов, полученных с различными предшественниками липосом, методом малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS). SAXS – это метод, при помощи которого можно определять различия в плотности наноразмеров в образцах, анализируя поведение упругого рассеяния рентгеновских лучей при прохождении через материал, регистрируя их рассеяние под небольшими углами. Для каждого исследуемого препарата РНК рассчитывали параметры корреляционной длины и d-интервала. Препараты РНК-липоплексов готовили при соотношении N/P = 0,65, 0,1 мг/мл РНК и 112 мМ NaCl.
Пример 8. Электрофорез в агарозном геле
Измеряли содержание свободной РНК в различных препаратах РНК-липоплексов методом гель-электрофореза. Для проведения измерений использовали 1%-й агарозный гель, содержащий гипохлорит натрия. Образцы РНК-липоплексов разводили 1:6 раствором красителя для нанесения ДНК. В агарозный гель осторожно вносили по 12 мкл разведенных образцов РНК-липоплексов. Проводили электрофорез при 80 В с рабочим циклом 40 мин.
Пример 9. HPLC
Концентрации липидов в различных препаратах липосом измеряли методом HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, США) на колонке Sunfire C18 2,5 мкм размером 4,6×75 мм (Waters, Massachusetts, США) при длине волны 205 нм. Подвижная фаза A: смесь 70% метанола/30% изопропанола/0,1% TFA; подвижная фаза B: смесь 55% метанола/15% изопропанола/30% воды/0,1% TFA. Образцы липосом разбавляли водой до общей концентрации липидов 3 мМ или не разбавляли.
Пример 10. Культура клеток: трансфекция РНК в дендритные клетки in vitro
Готовили препараты РНК-липоплексов с различными предшественниками липосом и luc-РНК. Для экспериментов с культурами клеток РНК-липоплексы разводили до 0,01 мг/мл РНК 0,9%-ым раствором NaCl. Исследовали эффективность трансфекции РНК из различных препаратов РНК-липоплексов на дендритных клетках человека при посеве в среду или цельную кровь.
Пример 11. Модель на животных: доставка в селезенку и трансфекция РНК в дендритные клетки
Исследовали эффективность трансфекции у различных препаратов РНК-липоплексов на мышах BALB/c. Вводили 20 мкг препаратов РНК-липоплексов посредством ретроорбитальной инъекции и через 6 часов измеряли экспрессию люциферазы в дендритных клетках (мишень в селезенке). РНК-липоплексы получали с luc-РНК и различными предшественниками липосом, мелкими или крупными липосомами, полученными из исходных коллоидов, и мелкими и крупными липосомами после фильтрования при 0,45 мкм, соотношении N/P = 0,65 и 112 мМ NaCl.
Пример 12. Испытание на растворимость
Проверяли, можно ли приготовить содержащие DOPE растворы с более высокой концентрацией (в перенасыщенном состоянии) и использовать их для впрыскивания раствора липидов в этаноле для получения липосом (следующий раздел). Результаты, полученные в этой серии испытаний на растворимость, представлены в табл. 1 и 2.
Таблица 1. Растворимость в этаноле липида DOPE, полученного от различных поставщиков
Растворимость DOPE в этаноле | ||
Поставщик | № партии | мМ |
Corden Pharma | F0624 | 56 |
Corden Pharma | W0650 | 59 |
NOF | 14099612 | 63 |
Merck | MK2885-C | 59 |
Таблица 2. Повышение растворимости липида DOPE в смеси липидов DOTMA/DOPE с молярным соотношением 66:33, приготовленной в абс. этаноле
Растворимость DOPE в этаноле, содержащем 220 мМ DOTMA | ||
Поставщик | № партии | мМ |
Corden Pharma | F0624 | 93 |
Corden Pharma | W0650 | 106 |
NOF | 14099612 | 103 |
Merck | MK2885-C | 94 |
Согласно этим результатам, липид DOPE, приобретенный у разных поставщиков, имеет равновесную растворимость в этаноле от 50 до 60 мМ (при комнатной температуре). Однако, если приготовить раствор вместе с катионным липидом DOTMA, то равновесная растворимость значительно возрастает, к примеру, до 90 - 100 мМ при использовании раствора DOTMA/DOPE с молярным соотношением 66:33.
Пример 13. Получение липосом различного размера
Липосомы получали путем впрыскивания раствора липидов в этаноле по методике, описанной в примере 3. После впрыскивания не проводили процесса фильтрации. Концентрацию липидов в этаноле варьировали, а все остальные параметры оставались фиксированными. Размер и количество липосом измеряли методом динамического рассеяния света (DLS), как описано в примерах 5 и 6.
В качестве примера в табл. 3 (ниже) и на фиг. 1 и 2 представлены результаты, относящиеся к липосомам, полученным из смеси DOTMA/DOPE с молярным соотношением 66:33.
Таблица 3. Зависимость размера липосом от различных концентраций липидов в исходном растворе
Исходный раствор липидов (мМ) | Размер липосом (нм) из исходного коллоида |
Статистика по размерам |
|||
1 | 2 | 3 | Ẋ | σ | |
100 | 28 | 32 | 30 | 2,83 | |
150 | 36 | 35 | 34 | 35 | 1,00 |
200 | 82 | 76 | 74 | 76 | 4,16 |
250 | 202 | 195 | 194 | 195 | 4,36 |
300 | 371 | 220 | 369 | 369 | 86,61 |
350 | 620 | 644 | 652 | 644 | 16,65 |
400 | 665 | 665 | 740 | 665 | 43,30 |
450 | 721 | 783 | 723 | 723 | 35,23 |
500 | 739 | 767 | 766 | 766 | 15,89 |
550 | 770 | 754 | 656 | 754 | 61,72 |
Как можно видеть, полученные размеры (z-среднее) липосом возрастают с повышением концентрации липидов в этанольном растворе, используемом для впрыскивания. Таким образом, концентрацию липидов в этаноле можно эффективно использовать для контролирования размера липосом. Интересно, что изменения размера были наиболее заметными, если концентрация DOPE была ниже или выше равновесной растворимости DOPE в самом этаноле. Если концентрация DOPE была выше 50 мМ (общая концентрация липидов 150 мМ), то размер полученных липосом резко возрастал, с <50 нм до более 500 нм (фиг. 1). Однако и выше предела растворимости размер липосом тоже монотонно возрастал с повышением концентрации липидов.
Во всех препаратах липосом присутствовала фракция липосом размером 0,5 мкм, причем эта фракция липосом была выше в липосомах, полученных из раствора с концентрацией липидов 300 мМ, и уменьшалась в липосомах, полученных при меньших и больших концентрациях липидов. Кроме того, в препаратах липосом, полученных при больших концентрациях липидов, были отмечены фракции липосом размером 0,6 мкм и 0,7 мкм (фиг. 2). После впрыскивания более концентрированного раствора липидов в этаноле образовывались липосомы большего размера. Общее количество образовавшихся липосом было ниже в сравнении с препаратами липосом, полученными при низкой концентрации липидов в растворе этанола. Полученные результаты представляют средние значения количества частиц по трем измерениям.
Пример 14. Получение РНК-липоплексов из липосом различного размера
РНК-липоплексы получали, как описано в Примере 4, используя различные предшественники липосом, причем размер липосом для их формирования варьировал, а все остальные параметры оставались фиксированными. В ходе экспериментов определяли размеры липосом (z-средний диаметр) и индексы полидисперсности (PDI) по динамическому рассеянию света (DLS), как описано в примерах 5 и 6.
В табл. 4 (ниже) и на соответствующих фиг. 3 и 4 представлены результаты, относящиеся к влиянию концентрации липидов для получения липосом (а тем самым и на размеры предшественников липосом) на размеры РНК-липоплексов.
Таблица 4. Количество частиц, присутствующих в препаратах РНК-липоплексов, полученных с различными предшественниками липосом (нефильтрованными липосомами). Количество частиц в 0,5 мкм возрастает в препаратах РНК-липоплексов, полученных с более крупными липосомами. Липосомы получали путем впрыскивания раствора липидов в этаноле, используя различные исходные растворы липидов в различных концентрациях. Размеры липосом возрастают с повышением концентрации липидов в исходном растворе.
Раствор липидов (мМ) | Z-средний диаметр (нм) | PDI | Статистика по z-средн. (нм) | Статистика по PDI | ||||||
1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | Ẋ | SD | Ẋ | SD | |
100 | 196 | 200 | 190 | 0,136 | 0,171 | 0,186 | 195,07 | 4,82 | 0,16 | 0,03 |
150 | 208 | 220 | 187 | 0,300 | 0,165 | 0,170 | 205,03 | 17,04 | 0,21 | 0,08 |
200 | 189 | 207 | 212 | 0,093 | 0,125 | 0,140 | 202,43 | 11,81 | 0,12 | 0,02 |
250 | 208 | 282 | 270 | 0,300 | 0,203 | 0,202 | 253,17 | 39,61 | 0,24 | 0,06 |
300 | 473 | 476 | 475 | 0,432 | 0,372 | 0,356 | 474,70 | 1,41 | 0,39 | 0,04 |
350 | 448 | 479 | 485 | 0,294 | 0,407 | 0,402 | 470,83 | 19,99 | 0,37 | 0,06 |
400 | 465 | 447 | 415 | 0,424 | 0,295 | 0,292 | 442,03 | 25,29 | 0,34 | 0,08 |
450 | 412 | 447 | 434 | 0,338 | 0,312 | 0,311 | 431,20 | 17,66 | 0,32 | 0,02 |
500 | 448 | 443 | 419 | 0,401 | 0,312 | 0,333 | 436,73 | 15,62 | 0,35 | 0,05 |
550 | 434 | 470 | 417 | 0,316 | 0,460 | 0,294 | 440,43 | 27,29 | 0,36 | 0,09 |
Согласно этой серии испытаний, РНК-липоплексы, полученные из мелких липосом, были мельче, чем полученные из крупных липосом. РНК-липоплексы, полученные из липосом, приготовленных из раствора с концентрацией липидов 300 мМ и выше, были примерно в два раза крупнее, чем полученные из липосом, приготовленных из исходного раствора с концентрацией липидов 150 мМ. Не было корреляции между размером липосом и размером РНК-липоплексов у всех РНК-липоплексов, полученных с крупными липосомами (фиг. 3).
Количество полученных РНК-липоплексов возрастало с повышением размера липосом, используемых для их формирования. Большее количество крупных РНК-липоплексных частиц отмечалось в препаратах, полученных с крупными липосомами, подтверждая данные, полученные на основе измерений динамического рассеяния света (фиг. 4). Полученные результаты представляют средние значения количества частиц по трем измерениям.
Пример 15. Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) у различных липоплексов
Эксперименты по малоугловому рассеянию рентгеновских лучей проводили, как описано, с РНК-липоплексами, полученными с липосомами из исходных растворов с различной концентрацией липидов. Например, получали РНК-липоплексы из липосом DOTMA/DOPE 2:1 (моль/моль) и РНК при соотношении зарядов 1,3:2. Липосомы получали путем впрыскивания раствора липидов в этаноле как описано, при концентрации липидов в этаноле 100 мМ, 300 мМ и 400 мМ.
На фиг. 5 представлены дифракционные кривые, полученные при измерении малоуглового рассеяния рентгеновских лучей у РНК-липоплексов, образовавшихся с липосомами, полученными при соотношении зарядов 4:1 (наверху) и при соотношении зарядов 1,3:2, причем липосомы для образования липоплексов получали из исходных растворов липидов в этаноле с концентрацией 400 мМ, 300 мМ и 100 мМ.
Профили рассеяния содержат единственный пик Брэгга примерно при 1 нм−1. Это типичный профиль дифракции для нацеленных на селезенку липоплексов, где для формирования липоплексов использовался избыток (отрицательно заряженной) РНК. Если липоплексы не заряжены отрицательно, то профиль рассеяния будет совершенно другим. В качестве примера проводили измерения РНК-липоплексов при соотношении +/- зарядов 4:1, где выявляются гораздо менее выраженные пики, а также различим пик второго порядка (хотя и слабой интенсивности). В самом деле, общая особенность профилей рассеяния рентгеновских лучей у липоплексов состоит в том, что имеется несколько пиков, которые могут быть равноудаленными или могут иметь другие интервалы, в зависимости от фазового состояния. А здесь, напротив, определяется только один единственный пик. Кроме того, ширина пика меняется в зависимости от концентрации исходного раствора, который изначально использовался для получения липосом. Если концентрация липидов в этаноле повышалась, то ширина пика уменьшалась. Пик Брэгга означает, что липоплексы регулярно упорядочены, причем повторяющееся расстояние (d-интервал) задается от положения пика как:
(1)
где q – перенос импульса, причем , а n – порядок и qmax – положение максимума соответствующего пика Брэгга, λ – длина волны и θ – угол. Расстояние d, которое может быть получено из пиков Брэгга, составляет порядка 6,5 нм.
Ширина пика Δq уменьшается с возрастанием числа повторяющихся звеньев в стопке. Для жидкокристаллической матрицы корреляционная длина может быть представлена как:
(2)
Для представленных здесь липоплексных препаратов отмечается четкая корреляция профиля рассеяния с вышеупомянутой концентрацией липидов в этаноле для получения липосом и биологической активностью. Хотя положение пика остается неизменным, но ширина пика монотонно изменяется в зависимости от концентрации липидов в этаноле. Повышение концентрации липидов в этаноле (что ведет к возрастанию размера липосом) соответствует уменьшению ширины пика и тем самым увеличению корреляционной длины. В то же время биологическая активность возрастает с увеличением корреляционной длины. Таким образом, описанные липоплексы с улучшенной активностью, полученные из липосом, для приготовления которых использовался более концентрированный исходный раствор липидов в этаноле, можно отличить по четкой структурной особенности. Кроме того, описанные липоплексы с улучшенной активностью можно отличить от липоплексов с меньшей активностью также и другими методами типа асимметрического фракционирования поле-поток (AF4).
Пример 16. Эффективность трансфекции РНК-липоплексов в дендритные клетки человека
Получали липоплексы с Luc-РНК, как здесь описано, используя различные предшественники липосом, причем размер липосом для их формирования варьировал (изменяли исходную концентрацию липидов для их формирования), а все остальные параметры оставались фиксированными. После этого исследовали эффективность трансфекции РНК из различных препаратов РНК-липоплексов на дендритных клетках человека при посеве в среду или цельную кровь.
Результаты, показывающие эффективность трансфекции in vitro (дендритные клетки человека) при определении по измерению экспрессии люциферазы и соответствующей биологической активности различных РНК-липоплексов, полученных с различными предшественниками липосом, представлены на фиг. 6.
Биологическая активность (трансфекция РНК in vitro) монотонно возрастает с повышением корреляционной длины РНК-липоплексов. Повышение корреляционной длины указывает на более однородную популяцию липидных бислоев в РНК-липоплексах.
Пример 17. Асимметрическое фракционирование типа поле-поток различных липоплексов
Для определения других отличий РНК-липоплексов использовали асимметрическое фракционирование типа поле-поток (AF4), которое сейчас является распространенным и передовым методом фракционирования и разделения частиц в суспензии. Согласно теории AF4, частицы с близкими свойствами и одинаковым размером должны элюироваться одновременно.
На фиг. 7 представлены некоторые результаты по измерению методом AF4 липоплексов из двух разных типов липосом, полученных либо из исходного раствора с концентрацией липидов 150 мМ в этаноле, либо из исходного раствора с концентрацией липидов 40 мМ в этаноле.
Итак, измерения при фракционировании типа поле-поток свидетельствуют, что липоплексы из липосом при концентрации липидов 150 мМ в этаноле качественно и количественно отличаются от таковых при концентрации липидов 400 мМ. Полученные из 150 мМ раствора липидов в этаноле липоплексы мельче, но, вопреки интуиции, элюируются позже, поэтому между двумя типами должно быть качественное отличие (по форме, взаимодействию со средой, заряду). РНК-липоплексы из 150 мМ раствора липидов в этаноле элюируются позже, хотя они меньше по размеру. Это значит, что РНК-липоплексы из липосом, при получении которых использовался 150 мМ раствор липидов в этаноле, в среднем мельче, чем, когда использовался 400 мМ раствор липидов в этаноле. Даже при одинаковых размерах полученные при 150 мМ липоплексы имеют другие физико-химические свойства, чем липоплексы, полученные при 400 мМ. Эти различия в размерах и физико-химических свойствах коррелируют с более высокой биологической активностью полученных при 400 мМ РНК-липоплексов.
Пример 18. Биологическая активность РНК-липоплексов in vitro
Как установлено в экспериментах по трансфекции культур клеток (дендритные клетки) с кодирующими люциферазу РНК-липоплексами различного размера, полученными из липосом из различных исходных растворов липидов и/или при различных концентрациях липидов, как описано, сигналы люциферазы, а тем самым и биологические активности монотонно возрастают с повышением исходной концентрации липидов, а тем самым и размера липосом, используемых для формирования РНК-липоплексов. Соответствующие результаты представлены на фиг. 6, 8 и 9.
Итак, РНК-липоплексы, полученные при большей концентрации липидов для получения липосом, проявляют значительно более высокую активность in vitro.
Пример 19. Биологическая активность РНК-липоплексов in vivo
Как установлено в экспериментах по трансфекции культур клеток (дендритные клетки) с кодирующими люциферазу РНК-липоплексами, полученными из липосом различного размера, РНК-липоплексы, полученные с крупными липосомами, обнаруживают значительно большую экспрессию люциферазы и соответствующую биологическую активность.
Неограничивающие примеры этой серии испытаний представлены на фиг. 10 и 11. РНК-липоплексы, полученные при использовании крупных липосом из исходного коллоида с концентрацией липидов 360 мМ, дают значительно большие сигналы экспрессии in vivo, чем мелкие РНК-липоплексы, полученные из исходного коллоида с концентрацией липидов 200 мМ.
Пример 20. Автоматизированное производство РНК-липоплексов
Для автоматизированного серийного производства РНК-липоплексов была разработана общеприменимая процедура, которая представлена на фиг. 12. Все операции проводятся с использованием предварительно стерилизованного одноразового жидкостного канала, обеспечивающего безопасную асептическую обработку материалов. Сначала концентрация РНК доводится до концентрации липосом и добавляется NaCl для конденсации РНК. При этом раствор РНК доводится до концентрации РНК, позволяющей смешивать идентичные объемы РНК и липосом. Растворы РНК и липосом переносят в шприцы большого объема, и оба шприца устанавливаются на один шприцевый насос, приводящий в действие одновременно оба поршня шприцов. После формирования РНК-липоплексов добавляется раствор криопротектора и доводится конечная концентрация лекарственного продукта. После заполнения лекарственным продуктом стеклянных флаконов его замораживают в виде концентрата для длительного хранения.
Важнейшим показателем качества РНК-липоплексов является соотношение зарядов, которое регулируется соотношением между РНК и липосомами при смешивании. Был разработан автоматизируемый и масштабируемый процесс промышленного производства РНК-липоплексов, позволяющий эффективно контролировать соотношение при смешивании. При производстве в небольшом масштабе (≤ 10 литров) контроль за смешиванием идентичных объемов двух водных растворов, содержащих липосомы и РНК, осуществляется при помощи единого насоса-перфузора, приводящего в действие одновременно два шприца большого объема, заполненных РНК или липосомами. Для эквивалентной подачи больших объемов (≥ 10 литров) применяются насосные установки типа нагнетательных сосудов, мембранных насосов, зубчатых насосов, насосов с магнитной левитацией или перистальтических насосов в сочетании с датчиками расхода с контуром обратной связи для онлайн-контроля и регулирования скорости потока в реальном времени.
Для автоматизированного производства РНК-липоплексов необходим статический смесительный элемент, обеспечивающий эффективное перемешивание водных растворов, содержащих РНК и липосомы. Было обнаружено, что коммерчески доступные микрожидкостные смесительные элементы, содержащие змеевики и встроенные структуры для усиления перемешивания, а также образцы смесительных элементов со сравнимой архитектурой забиваются во время производства. Поэтому эти смесительные элементы не годятся для автоматизированного производства РНК-липоплексов. Было обнаружено, что для автоматизированного производства РНК-липоплексов подходят смесительные элементы Y-типа и T-типа диаметром от 1,2 до 50,0 мм.
Метод. РНК-липоплексы получали при помощи различных смесительных элементов (табл. 1). Во время производства липоплексов оператор наблюдал за смесительными элементами и документировал отложение материала или засорение.
Результаты. При использовании коммерчески доступного микрожидкостного устройства (NanoAssemblr™, Precision Nanosystems, Vancouver, Канада) наблюдалось засорение после получения 3 мл РНК-липоплексов. Такие же факты отмечались при тестировании и других образцов микрожидкостных смесительных элементов (табл. 5). В то время, как у всех (микро)жидкостных смесительных элементов с архитектурой, сравнимой с коммерчески доступными смесительными элементами, отмечались отложения и особенно закупоривание элементов, этого не наблюдалось при использовании смесительных элементов Y-типа или T-типа. Помимо описанного смесительного элемента Y-типа диаметром 2,4 мм, тестировали и смесительные элементы большего диаметра. Поскольку не было обнаружено ограничений на диаметр смесительных элементов Y-типа, то полагаем, что описанный способ подходит для получения РНК-липоплексов при диаметре смесительных элементов Y-типа вплоть до 50 мм.
Таблица 5. Засорение микрожидкостных устройств
Смесительный элемент | Толщина канала (мм) | Размер частиц РНК-липоплексов (нм) | Отложения или засорение |
NanoAssemblr™ | ок. 0,2 мм | 374 | засорение после 3 мл |
Образец 1 | ок. 0,3 мм | 337 | засорение после 34 мл |
Образец 2 | ок. 0,3 мм | 372 | засорение после 88 мл |
Образец 3 | ок. 0,4 мм | 336 | отложения без засорения вплоть до 120 мл |
Образец 4 | ок. 1,0 мм | 326 | отложения без засорения вплоть до 180 мл |
Смесительный элемент Y-типа | 2,4 мм | 348 | нет отложений, нет засорения до 200 мл |
При использовании смесительных элементов Y-типа или T-типа необходима минимальная скорость потока для достаточного перемешивания. Получение РНК-липоплексов может проводиться путем смешивания двух водных растворов, содержащих РНК и липосомы, при помощи смесительного элемента Y-типа или T-типа с внутренним диаметром от 1,6 до 50 мм. Для эффективного перемешивания число Рейнольдса, рассчитанное по скорости потока при смешивании, должно быть не меньше 300. И соотношение скорости потока к диаметру смесительного элемента должно быть не меньше 150 для эффективного перемешивания. Числа Рейнольдса вплоть до 2100 подвергались экспериментальной проверке и оказались пригодными для автоматизированного производства. Данные подтверждают, что возможны и более высокие скорости потока. При этом исходили из того, что при числе Рейнольдса = 2100 условия уже были в турбулентном режиме, поэтому при еще более высоких скоростях следует ожидать аналогичных условий перемешивания.
Метод. РНК-липоплексы получали при подаче раствора РНК и раствора липосом с помощью единого насоса-перфузора. Формирование РНК-липоплексов проводили с помощью типичных смесительных элементов Y-типа с внутренним диаметром 2,4 и 3,2 мм. Размеры частиц и полидисперсность РНК-липолексов анализировали методом фотонной корреляционной спектроскопии (PCS). Числа Рейнольдса, вытекающие из исследуемого сочетания скорости потока и диаметра смесительных элементов, рассчитывали теоретически по уравнению (фиг. 13). Соотношение скорости потока к диаметру смесительного элемента рассчитывали путем деления скорости потока (см3/мин) на диаметр смесительного элемента (см). Коэффициент представлен в виде безразмерного числа.
Результаты. При получении РНК-липолексов с комбинациями скорости потока и смесительного элемента, дающими теоретически рассчитанные числа Рейнольдса менее 300, образуются РНК-липоплексы с повышенным размером частиц и полидисперсностью (фиг. 13 и табл. 6). Для того, чтобы обеспечить воспроизводимое получение РНК-липоплексов с требуемыми характеристиками частиц, теоретически число Рейнольдса должно быть не менее 300 (фиг. 13 и 14 и табл. 6), а соотношение скорости потока к диаметру смесительного элемента должно быть не менее 150. Смесительный элемент диаметром 2,4 мм обеспечивал эффективное и воспроизводимое смешивание РНК и липосом в широком диапазоне скоростей потока (от 60 до 240 мл/мин). Поскольку при этих исследованиях не было обнаружено верхнего предела, то не ожидается никаких верхних ограничений числа Рейнольдса или соотношения скорости потока к диаметру смесительного элемента.
Таблица 6. Расчетные числа Рейнольдса и соотношения скорости потока к диаметру смесительного элемента
Диаметр смесительного элемента (мм) | Скорость потока (мл/мин) | Расчетное число Рейнольдсаa | Соотношение скорости потока к диаметру смесительного элементаb |
3,2 | 20 | 132 | 63 |
3,2 | 40 | 265 | 125 |
3,2 | 80 | 530 | 250 |
2,4 | 60 | 531 | 250 |
2,4 | 80 | 707 | 333 |
2,4 | 220 | 1945 | 917 |
2,4 | 240 | 2122 | 1000 |
a Для расчета числа Рейнольдса использовали вязкость (0,001 Па·с) и плотность (1000 кг/м3) воды.
b Коэффициент рассчитывали путем деления скорости потока (см3/мин) на диаметр смесительного элемента (см). Коэффициент представлен в виде безразмерного числа.
Пример 21. Влияние концентрации РНК
Получали РНК-липоплексы с помощью смесительного элемента Y-типа с типичными размерами (2,4 мм). Для того, чтобы определить диапазон концентраций, в котором могут быть получены РНК-липоплексы на данной установке, систематически варьировали концентрацию РНК от 0,05 мг/мл до 0,5 мг/мл. Для исследования стабильности полученных липоплексов конечный препарат доводили до 0,05 мг/мл РНК, 22% сахарозы и 20 мМ NaCl и трижды замораживали препараты.
Формирование РНК-липоплексов при концентрациях РНК от 0,1 до 0,5 мг/мл во время образования РНК-липоплексов дает сравнимые характеристики частиц (фиг. 15). Такие характеристики частиц сохраняются и после трехкратного замораживания, что свидетельствует о большой надежности процесса производства в отношении изменений концентрации РНК (фиг. 16). Поскольку нет никаких признаков ограничения концентрации РНК при получении РНК-липоплексов, то считаем, что описанная установка подходит для получения РНК-липоплексов при концентрации РНК вплоть до 5 мг/мл.
Описанный процесс автоматизированного производства РНК-липоплексов позволяет воспроизводимо получать стабильные РНК-липоплексы с различным соотношением зарядов.
Метод. Для проверки надежности полуавтоматического получения РНК-липоплексов по соотношению зарядов этот параметр систематически изменяли от 1,0:2,0 до 2,1:2,0 и от 2,0:1,0 до 5,0:1,0. Размеры частиц и полидисперсность РНК-липолексов анализировали методом фотонной корреляционной спектроскопии (PCS).
Результаты. Не обнаружено влияния изменений соотношения зарядов на размер и полидисперсность РНК-липолексов при соотношении зарядов от 1,0:2,0 до 2,1:2,0 (фиг. 17). Поэтому считаем, что диапазон от 1,0:2,0 до 2,1:2,0 дает препараты РНК-липоплексов эквивалентного качества. Кроме того, стабильные частицы с заданным размером и полидисперсностью образовывались при соотношении зарядов от 3,0:1,0 до 5,0:1,0 (фиг. 18).
Пример 22. Концентрация соли при формировании РНК-липоплексов
Для автоматизированного производства РНК-липоплексов с высокой биологической активностью необходимо контролировать ионные условия при формировании РНК-липоплексов. Для обеспечения биологической активности формирования РНК-липоплексов нужно проводить в присутствии от 45 до 300 мМ NaCl. Другие ионные соединения, такие, например, как EDTA, HEPES и др., вносят вклад в ионную силу и могут снижать требуемую минимальную концентрацию NaCl.
Метод. РНК-липоплексы получали автоматически при различных концентрациях NaCl во время формирования РНК-липоплексов. Анализировали размеры частиц и полидисперсность РНК-липолексов методом фотонной корреляционной спектроскопии (PCS). Кроме того, исследовали биоактивность липоплексов путем измерения сигнала люциферазы in vitro.
Результаты. Характеристики частиц можно контролировать путем регулирования ионной силы. Повышение концентрации соли во время производства вызывало небольшое повышение размера частиц (фиг. 19). Было обнаружено, что концентрация соли влияет на биологическую активность. Повышение концентрации соли во время производства вызывало повышение биоактивности (фиг. 20). Поэтому концентрация NaCl при формировании РНК-липоплексов должна быть не менее 45 мМ NaCl.
Пример 23. Стабилизация РНК-липоплексов
Для стабилизации РНК в РНК-липоплексах можно использовать такие буферные системы, как HEPES, уксусная кислота/ацетат натрия и фосфат натрия в диапазоне рН от 5,5 до 6,7 как в присутствии, так и в отсутствие криопротектора. Было обнаружено, что система карбоната натрия не дает сопоставимой эффективности стабилизации.
Метод. Для исследования оптимального диапазона pH и проверки пригодности различных буферных веществ, охватывающих различные диапазоны pH (HEPES: pH 6,8-8,2, уксусная кислота/ацетат натрия: pH 3,7-5,6, фосфат натрия: pH 5,8-8,0 и карбонат натрия: pH 6,2-8,6). РНК-липоплексы сначала инкубировали в стрессовых условиях (40°C) в отсутствие криопротектора. Анализировали целостность РНК методом капиллярного электрофореза на протяжении 21 дня. Для исследования оптимального диапазона pH в присутствии типичного криопротектора РНК-липоплексы инкубировали в присутствии HEPES и сахарозы при 40°C и анализировали целостность РНК на протяжении 21 дня.
Результаты. Хотя для буферных систем HEPES, уксусная кислота/ацетат натрия и фосфат натрия были получены сопоставимые результаты, однако карбонатная система не давала сравнимой стабилизации РНК (фиг. 21). Целостность РНК зависит от значения pH препарата. Оптимальный диапазон pH был установлен в пределах pH от 5,5 до 7,4. В присутствии типичного криопротектора сахарозы был установлен диапазон pH от 5,5 до 8,0, который давал наилучшую стабилизацию РНК (фиг. 22).
Ионы двухвалентных металлов могут попадать в процесс синтеза РНК, из эксципиентов препаратов или стеклянных контейнеров и могут влиять на стабильность РНК. Двунатриевая соль EDTA образует устойчивые водорастворимые комплексы с ионами щелочноземельных и тяжелых металлов. Двунатриевая соль EDTA вносит вклад в концентрацию ионов, присутствующих при формировании РНК-липоплексов, и тем самым снижает концентрацию NaCl, необходимую для получения биоактивных РНК-липоплексов. Образование РНК-липоплексов возможно в присутствии EDTA (от 0 до 20 мМ) при описанном процессе.
Метод. РНК-липоплексы получали в присутствии возрастающих концентраций EDTA (вплоть до 18 мМ), а после разбавления инкубировали при пониженном содержании EDTA (от 0,1 мМ до 5,4 мМ) при 40°C. Анализировали целостность РНК в качестве ключевого физико-химического параметра на протяжении 21 дня.
Результаты. Формирование РНК-липоплексов в присутствии высоких концентраций EDTA (вплоть до 18 мМ) давало такие же характеристики частиц, как и у препаратов в присутствии низких концентраций. Не было значительных отличий между различными группами, содержащими от 0,01% (мас./об) (0,26 мМ) до 0,2% (мас./об) (5,2 мМ) EDTA (фиг. 23) при хранении. Поскольку динатриевая соль EDTA вносит вклад в концентрацию ионов, присутствующих при образовании РНК-липоплексов, и может работать как ловушка ионов двухвалентных металлов, потенциально снижающих целостность РНК, то полагается, что присутствие EDTA в концентрации вплоть до 20 мМ при образовании РНК-липоплексов будет полезным.
Пример 24. Оптимизация содержания NaCl и криопротектора
Необходимо регулировать ионные условия при получении, длительном хранении и применении на пациентах РНК-липоплексов (фиг. 24). Концентрация NaCl может составлять от 45 до 300 мМ при формировании РНК-липоплексов; от 10 до 50 мМ при длительном хранении РНК-липоплексов в замороженном состоянии; и от 80 до 150 мМ после оттаивания и разбавления солевым раствором.
Для каждой концентрации NaCl ≤ 70 мМ было обнаружено соответствующее содержание криопротектора, которое не следует уменьшать, чтобы обеспечить стабилизацию характеристик частиц при многократном замораживании. В качестве криопротектора можно использовать моно- и бимолекулярные сахара типа глюкозы, сахарозы, маннита, трегалозы, сорбита, триоли типа глицерина и их смеси в концентрациях от 12,5 до 35,0% (мас./об). У сорбита эффективность стабилизации ниже по сравнению с другими соединениями, а аргинин не может эффективно стабилизировать РНК-липоплексы при замораживании.
Таблица 7. Комбинации концентраций NaCl и содержания криопротектора при исследовании после однократного замораживания
Криопротектор (% мас./об) | ||||
NaCl (мМ) | 5 | 10 | 15 | 20 |
0 | X | X | X | X |
20 | X | X | X | X |
40 | X | X | X | X |
60 | X | X | X | X |
Таблица 8. Комбинации концентраций NaCl и содержания криопротектора при исследовании после 1, 2, 3, 5 и 10-кратного замораживания
Криопротектор (% мас./об) | ||||||||
NaCl (мM) | 10,0 | 12,5 | 15,0 | 17,5 | 20,0 | 22,5 | 25,0 | 27,5 |
50 | X | X | X | X | X | X | X | X |
70 | X | X | X | X | X | X | X | X |
90 | X | X | X | X | X | X | X | X |
Методы. Исследовали различные соединения, представляющие моносахариды (глюкоза и сорбитол), дисахариды (сахароза и трегалоза), аминокислоты (аргинин, пролин), триоли (глицерин), а также системы криопротекторов, содержащие смеси различных сахаров (маннит и сахароза), чтобы установить подходящие криопротекторы (фиг. 25 и 26). При этом РНК-липоплексы замораживали в присутствии возрастающих концентраций этих соединений. Для того, чтобы установить минимальное содержание криопротектора при определенной концентрации NaCl, РНК-липоплексы замораживали в присутствии возрастающих количеств сахарозы или трегалозы в качестве типичных криопротекторов (табл. 7). Образцы сначала замораживали один раз, чтобы определить диапазон концентраций криопротектора для дальнейшего исследования. В третьем эксперименте эффективность стабилизации размера частиц проверяли, замораживая РНК-липоплексы вплоть до 10 раз в присутствии криопротектора трегалозы (табл. 8).
Результаты. Хотя аргинин явно дестабилизирует РНК-липоплексы, однако другие криопротекторы в общем применимы для стабилизации РНК-липоплексов при замораживании (фиг. 25 и 26). Глицерин, маннит и сахарозу (1:1, вес:вес), пролин и сорбитол можно использовать в качестве криопротекторов для РНК-липоплексов. Кроме аргинина, подходят все другие исследованные стабилизаторы, что означает, что для стабилизации РНК-липоплексов при замораживании подходит широкий спектр аминокислот, сахаров и смесей таких соединений. У сорбитола ффективность стабилизации ниже по сравнению с другими соединениями.
При подробном исследовании необходимого количества криопротектора при каждой концентрации NaCl (табл. 8) обнаружилась прямая корреляция между концентрацией NaCl и необходимой концентрацией криопротектора после однократного замораживания (фиг. 27 и 28). Хотя после однократного замораживания отмечалась приемлемая сохранность размера частиц от 0 до 60 мМ NaCl при 20% (мас./об) сахарозы или дигидрата трегалозы, однако при меньшем содержании криопротектора (например, ≤ 15% для 60 мМ NaCl; ≤ 10% для 40 мМ NaCl; ≤ 5% для 20 мМ NaCl) отмечалась недостаточная стабилизация. В исследованном диапазоне не было никаких отличий между сахарозой и трегалозой.
При анализе размера частиц у РНК-липоплексов после 1, 2, 3, 5 и 10-кратного замораживания в присутствии комбинаций NaCl и трегалозы, приведенных в табл. 8, были получены следующие результаты. Хотя при концентрации 50 мМ NaCl было достаточно ≥ 12,5% трегалозы для стабилизации характеристик частиц РНК-липоплексов даже после 10-кратного замораживания (фиг. 29), однако при 70 мМ NaCl требовалось ≥ 12,5% для минимальной стабилизации и ≥ 22,5% для точного сохранения размера частиц (фиг. 30). При 90 мМ NaCl требовалось ≥ 15,0% трегалозы для минимальной стабилизации, а точная сохранность размера частиц не достигалась даже при самой высокой исследованной концентрации в 27,5% (фиг. 31).
Пример 25. Комбинации соли и криопротектора для длительного хранения
Для длительного хранения при заданной температуре следует использовать комбинации NaCl и криопротектора, приведенные в табл. 9.
Методы. Для того, чтобы исследовать минимальное содержание криопротекторов для длительного хранения при -15°C или -30°C и определенной концентрации NaCl, РНК-липоплексы замораживали в присутствии комбинаций NaCl и сахарозы либо трегалозы. Образцы замораживали при -30°C, а затем переносили на соответствующую температуру для длительного хранения (-15°C либо -30°C). После определенного времени хранения проводили анализ образцов на сохранение коллоидной стабильности по измерениям размера частиц методом PCS. Эти эксперименты проводились при общей концентрации РНК 0,05 мг/мл.
Результаты. Хотя характеристики частиц у РНК-липоплексов сохранялись при замораживании в присутствии NaCl вплоть до 70 мМ, но в этих экспериментах наблюдался и другой эффект, способствующий дестабилизации коллоидной стабильности. Так, отмечалась приемлемая стабилизация характеристик частиц после замораживания, например, при комбинации 60 мМ NaCl и 20% сахарозы, однако со временем размер частиц этих препаратов значительно возрастал (фиг. 32 и 33) при температуре хранения -15°C. Этот эффект замедлялся при хранении при -30°C (фиг. 34 и 35).
Стабильность РНК-липоплексов при заданном содержании NaCl зависит от количества криопротектора. Количество криопротектора, необходимое для стабилизации, возрастает с повышением содержания соли в растворе для хранения. Этот эффект не зависит от типа сахара, используемого в качестве криопротектора. Композиции РНК-липоплексов для длительного хранения в замороженном состоянии при -15°C или -30°C должны иметь содержание криопротектора, приведенное в табл. 9.
Таблица 9. Максимально допустимые концентрации NaCl в сочетании с содержанием криопротектора (сахарозы либо трегалозы) для хранения при -15°C и -30°C.
Криопротектор (% мас./об) | ||
NaCl (мМ) | Хранение при -15°C | Хранение при -30°C |
0 | ≥ 5 | ≥ 5 |
20 | ≥ 15 | ≥ 10 |
40 | ≥ 20 | ≥ 15 |
60 | недостаточная стабилизация | ≥ 20 |
Пример 26. Длительное хранение с различными криопротекторами
Стабилизация возможна на протяжении 9 месяцев в присутствии 22% (мас./об) моно- или бимолекулярных сахаров при 10-40 мМ NaCl. Эти препараты можно замораживать при температуре от -15°C до -40°C и хранить при соответствующей температуре для длительного хранения. Допустимо хранение в присутствии от 12,6% до 16,8% (мас./об) декстрана и 10-30 мМ NaCl. Эти эксперименты проводились при общей концентрации РНК 0,05 мг/мл.
Метод. Для того, чтобы исследовать минимальное содержание криопротекторов типа сахарозы, трегалозы, глюкозы и их смесей с декстраном, необходимое для длительного хранения при -20°C, РНК-липоплексы замораживали при фиксированном содержании криопротектора в сочетании с различными концентрациями NaCl. Для мономолекулярных или димолекулярных криопротекторов типа глюкозы, сахарозы и трегалозы доводили концентрацию до 22% (мас./об). Эти препараты замораживали и хранили при температуре от -15 до -40°C и исследовали долгосрочную стабильность путем измерения размера частиц методом PCS после определенного времени хранения.
Для препаратов, содержащих смеси с полимерным декстраном, использовали составы, приведенные в табл. 10. Образцы замораживали и хранили при -20°C. После определенного времени хранения проводили анализ образцов на сохранение коллоидной стабильности по измерениям размера частиц.
Результаты. Для всех исследованных мономолекулярных или димолекулярных криопротекторов была обнаружена максимальная концентрация NaCl, которую нельзя превышать, чтобы обеспечить длительную стабилизацию РНК-липоплексов в замороженном состоянии. Хотя при 60 и 80 мМ NaCl наблюдалась быстрая дестабилизация липоплексов, однако коллоидные свойства сохранялись как минимум 9 месяцев при концентрации NaCl ≤ 40 мМ при хранении при -20°C (табл. 10 и фиг. 36-38). Не обнаружено отличий по эффективности стабилизации для сахарозы, трегалозы и глюкозы. Для препаратов, содержащих 20 мМ NaCl, не обнаружено отличий по долгосрочной стабильности, когда образцы замораживали и хранили при температуре от -15 до -40°C (фиг. 39).
При исследовании содержащих декстран препаратов с меньшим содержанием криопротекторов (от 12,6% до 16,8% мас./об) эффективность стабилизации была сравнима или даже лучше по сравнению с моно- или бимолекулярными сахарами (фиг. 40).
Таблица 10. Состав препаратов 1-7, содержащих декстраны (см. фиг. 40).
Препарат | Конц. NaCl (мM) | Декстран 40 (% мас./об) | Второй стабилизатор | Содержание второго стабилизатора (% мас./об) |
Препарат 1 | 90 | 10,0 | декстран 1 | 4,4 |
Препарат 2 | 90 | 10,0 | трегалоза | 2,6 |
Препарат 3 | 70 | 10,0 | декстран 1 | 6,3 |
Препарат 4 | 70 | 10,0 | трегалоза | 3,1 |
Препарат 5 | 50 | 8,0 | декстран 1 | 8,8 |
Препарат 6 | 50 | 8,0 | трегалоза | 4,7 |
Препарат 7 | 40 | 0 | декстран 1 | 12,9 |
Пример 27. Замораживание и лиофилизация
a) Замораживание и оттаивание
Для того чтобы определить наиболее эффективные концентрации крио/лиопротекторов, проводили исследования по замораживанию и оттаиванию. Препараты РНК-липоплексов замораживали и оттаивали в 5 мМ HEPES, 80 мМ NaCl, 2,6 мМ EDTA с добавлением 10%, 15%, 20%, 25% и 30% трегалозы. Определяли размеры частиц до и после хранения при -20°C. В препаратах, замороженных в отсутствие трегалозы, наблюдалась агрегация частиц, поэтому в них не определяли размер частиц. Согласно фиг. 41, препараты, замороженные с крио/лиопротектором, проявляли зависимую от концентрации криозащиту, а размер частиц повышался при снижении концентрации лио/криопротектора. При 22% мас./об трегалозы наблюдалось лишь минимальное повышение размера частиц со значением Sf/Si (Sf = конечный размер, Si = начальный размер) в 1,04, что меньше 1,3 и все еще считается приемлемым. При снижении концентрации трегалозы повышалось соотношение Sf/Si. Соотношения Sf/Si, полученные при исследовании замораживания и оттаивания, коррелировали с соотношениями Sf/Si, полученными для тех же препаратов после лиофилизации и восстановления.
b) Восстановление и стабильность частиц
Препараты РНК-липоплексов, полученные в 5 мМ HEPES, 2,6 мМ EDTA, при концентрации NaCl от 0 до 80 мМ и концентрации трегалозы 10% или 22%, подвергали лиофилизации. Все лиофилизированные образцы имели хороший вид типа лепешек. Образцы восстанавливали до исходного объема 0,9% раствором NaCl. Все лиофилизованные препараты РНК-липоплексов мгновенно растворялись при восстановлении 0,9% раствором NaCl или водой для инъекций. В лиофилизованных препаратах РНК-липоплексов с 22% трегалозы после восстановления 0,9% раствором NaCl или водой определяли изменения размера частиц.
Согласно фиг. 42, размер частиц оставался примерно стабильным во всех лиофилизованных препаратах РНК-липоплексов, содержащих трегалозу, после лиофилизации и восстановления. Отмечалось лишь небольшое уменьшение размера РНК-липоплексов при восстановлении лиофилизированных образцов с помощью 0,9% NaCl по сравнению с восстановлением их водой. Наблюдалась корреляция между соотношением NaCl и трегалозы и стабильностью частиц. Размер частиц РНК-липоплексов повышался в препаратах, полученных при меньших концентрациях трегалозы и больших концентрациях NaCl.
c) Эксперименты на культурах клеток с лиофилизированными препаратами РНК-липоплексов
Проводили эксперименты по трансфекции in vitro кодирующих люциферазу препаратов РНК-липоплексов, приготовленных с 22% трегалозы и различными концентрациями NaCl. Лиофилизированные образцы восстанавливали 0,9% раствором NaCl.
Согласно фиг. 43, лиофилизированные препараты РНК-липоплексов, полученные с 22% трегалозы при различных концентрациях NaCl, проявляли близкие уровни трансфекции luc-РНК в дендритных клетках. Не обнаружено корреляции между концентрацией NaCl в препаратах РНК-липоплексов и трансфекцией РНК in vitro. Лиофилизированные образцы проявляли близкие или даже лучшие уровни трансфекции luc-РНК по сравнению со свежими контрольными РНК-липоплексами.
d) Исследования по стабильности
Лиофилизованные препараты РНК-липоплексов, содержащие 10% трегалозы, 22% трегалозы и 0 мМ, 20 мМ, 40 мМ, 60 мМ и 80 мМ NaCl, подвергали исследованию на стабильность при 4°C, 25°C и 40°C (1 месяц и 6 мес.). После восстановления до исходного объема 0,9% раствором NaCl образцы исследовали на размер частиц и целостность РНК (% полноразмерной РНК).
Согласно фиг. 44 и 45, размеры различных РНК-липоплексов не проявляли значительных изменений по времени независимо от состава или температуры хранения. Интересно, что меньшие количества криопротектора (например, 10%) достаточны для поддержания стабильности частиц в лиофилизированных препаратах, тогда как в случае замороженных препаратов требуется большее количество (например, 22%). Целостность РНК (% полноразмерной РНК) в лиофилизированных образцах после 6 месяцев хранения при 4°C варьировала от 94% до 100%, а у препаратов РНК(LIP), хранившихся при 25°C, она составляла от 85% до 94%. Однако не было обнаружено никаких корреляций с соотношением концентраций трегалозы и NaCl или временем хранения.
Пример 28. Получение и тестирование РНК-липоплексных частиц
Получение РНК-липоплексов
При автоматизированном серийном производстве РНК-липоплексов все операции проводятся с использованием предварительно стерилизованного одноразового жидкостного канала, обеспечивающего безопасную асептическую обработку материалов. Сначала концентрация РНК доводится до концентрации липосом и добавляется NaCl для конденсации РНК. При этом раствор РНК доводится до концентрации РНК, позволяющей смешивать идентичные объемы РНК и липосом. Растворы РНК и липосом переносят в шприцы большого объема, и оба шприца устанавливаются на один шприцевый насос, приводящий в действие одновременно оба поршня шприцов. После формирования РНК-липоплексов добавляется раствор криопротектора и доводится конечная концентрация лекарственного продукта. После заполнения лекарственным продуктом стеклянных флаконов его замораживают в виде концентрата для длительного хранения.
Важнейшим показателем качества РНК-липоплексов является соотношение зарядов, которое регулируется соотношением между РНК и липосомами при смешивании. Был разработан автоматизируемый и масштабируемый процесс промышленного производства РНК-липоплексов, позволяющий эффективно контролировать соотношение при смешивании. При производстве в небольшом масштабе (≤ 10 литров) контроль за смешиванием идентичных объемов двух водных растворов, содержащих липосомы и РНК, осуществляется при помощи единого насоса-перфузора, приводящего в действие одновременно два шприца большого объема, заполненных РНК или липосомами. Для эквивалентной подачи больших объемов (≥ 10 литров) применяются насосные установки типа нагнетательных сосудов, мембранных насосов, зубчатых насосов, насосов с магнитной левитацией или перистальтических насосов в сочетании с датчиками расхода с контуром обратной связи для онлайн-контроля и регулирования скорости потока в реальном времени.
Для автоматизированного производства РНК-липоплексов необходим смесительный элемент, обеспечивающий эффективное перемешивание водных растворов, содержащих РНК и липосомы. Было обнаружено, что коммерчески доступные микрожидкостные смесительные элементы, содержащие змеевики и встроенные структуры для усиления перемешивания, а также образцы смесительных элементов со сравнимой архитектурой забиваются во время производства. Поэтому эти смесительные элементы не годятся для автоматизированного производства РНК-липоплексов. Было обнаружено, что для автоматизированного производства РНК-липоплексов подходят смесительные элементы Y-типа и T-типа диаметром от 1,2 до 50,0 мм.
1. Примеры композиций
1.1. Состав лекарственного продукта
В состав препарата 1 входят:
• примерно (не более) 10% трегалозы/сахарозы
• ≤ 10 мМ NaCl
• ≤ 7,5 мМ HEPES (или гистидина в качестве замены)
• pH 6,5 или pH 6,7
• ≤ 3,5 мМ EDTA.
Состав препарата 1 позволяет замораживать РНК-липоплексы в буферных условиях, что дает возможность прямого парентерального введения пациентам без дальнейшего разбавления или других операций. Снижение содержания соли не ведет к снижению активности. Осмоляльность препарата подходит для прямого внутривенного введения.
Лекарственный продукт получают при смешивании идентичных объемов раствора РНК и раствора липосом в установке с жидкостным каналом, причем концентрации и буферные условия были оптимизированы. Концентрации катионного липида в липосомах и РНК находятся в точно определенном молярном соотношении (соотношении зарядов), равном 1,3:2. Растворы липосом и РНК получают в следующих условиях.
1.2. Состав раствора РНК
• РНК в концентрации около 0,3 мг/мл (но в точном молярном соотношении с катионным липидом в липосомах)
• 18 мМ HEPES
• 18 мМ EDTA·Na2·2H2O
• pH от 6,2 до 7,0.
Для того, чтобы компенсировать сдвиг pH, вызванный уксусной кислотой, присутствующей в липосомах, pH буфера лекарственного вещества РНК доводят до pH 7,0.
Концентрация РНК доводится до концентрации DOTMA в липосомах путем разбавления (нормальным) солевым раствором.
1.3. Состав раствора липосом
• от 0,5 до 0,7 мМ DOTMA
• от 0,2 до 0,4 мМ DOPE
• ≤ 5 мМ уксусной кислоты (предпочтительно 2 мМ).
Добавление уксусной кислоты повышает срок хранения липосом.
2. Примеры других подходящих буферных веществ и оптимального диапазона pH
Для стабилизации РНК в РНК-липоплексах можно использовать такие буферные системы, как HEPES, гистидин и уксусная кислота/ацетат натрия в диапазоне pH от 5,5 до 7,0 как в присутствии, так и в отсутствие криопротектора.
Метод. Для исследования оптимального диапазона pH и испытания пригодности различных буферных веществ тестировали буферные вещества, охватывающие различные диапазоны pH (HEPES pH 6,0-7,2, гистидин pH 5,8-7,0, ацетат pH 5,5-5,8, MES pH 6,0-7,0). РНК-липоплексы инкубировали в ускоренных условиях (25°C) в присутствии типичного криопротектора. Анализировали целостность РНК методом капиллярного электрофореза на протяжении 60 дней. Кроме того, РНК-липоплексы инкубировали в предполагаемых условиях хранения (-15°C) в присутствии типичного криопротектора вплоть до двух лет. Анализировали целостность РНК методом капиллярного электрофореза.
Результаты. Для буферных систем HEPES, гистидина, ацетата и MES были получены сравнимые результаты по сохранности размера частиц и полидисперсности РНК-липоплексов в сочетании со снижением количества сахарозы и NaCl как в жидком (фиг. 46, 47 и фиг. 54, 55), так и в замороженном состоянии (фиг. 50, 51 и фиг. 58-60). Целостность РНК зависит от значения pH препарата. Было установлено, что оптимальный диапазон pH находится в пределах от pH 6,5 до 7,0 (фиг. 48, 49, 53, 57 и 62). Все исследованные типы буферов эффективно сохраняли доведенное значение pH (фиг. 52, 56 и 61).
2.1. HEPES, гистидин и ацетат подходят для стабилизации РНК-липоплексов
В следующем исследовании изучали три буферные системы (HEPES, гистидин и ацетат) на их способность стабилизировать РНК-липоплексы, полученные с липосомами, содержащими 5 мМ уксусной кислоты. Соответствующие РНК-липоплексы исследовали в условиях, ускоряющих разрушение частиц (25°C) и в замороженном состоянии (-15°C). Проверяли диапазон pH от pH 5,5 до 7,0, в котором соответствующими буферными системами были охвачены различные диапазоны pH (HEPES pH 6,2-7,0, гистидин pH 5,8-7,0 и ацетат pH 5,5-5,8).
Группа | pH | Буферная система | Конц. бу- фера [мМ] |
NaCl [мМ] | Сахароза [% вес/об] |
EDTA [мМ] | РНК [мг/мл] |
BM 1 | 6,2 | HEPES | 7,5 | 20 | 22 | 2,5 | 0,05 |
1 | 6,2 | HEPES | 7,5 | 6,45 | 10 | 2,5 | 0,02 |
2 | 6,4 | HEPES | 7,5 | 6,45 | 10 | 2,5 | 0,02 |
3 | 6,7 | HEPES | 7,5 | 6,45 | 10 | 2,5 | 0,02 |
4 | 7,0 | HEPES | 7,5 | 6,45 | 10 | 2,5 | 0,02 |
5 | 5,8 | гистидин | 20 | 6,45 | 10 | 2,5 | 0,02 |
6 | 6,2 | гистидин | 20 | 6,45 | 10 | 2,5 | 0,02 |
7 | 6,4 | гистидин | 20 | 6,45 | 10 | 2,5 | 0,02 |
8* | 6,7 | гистидин | 20 | 6,45 | 10 | 2,5 | 0,02 |
9* | 7,0 | гистидин | 20 | 6,45 | 10 | 2,5 | 0,02 |
10 | 5,5 | Na-ацетат | 20 | 6,45 | 10 | 2,5 | 0,02 |
11 | 5,8 | Na-ацетат | 20 | 6,45 | 10 | 2,5 | 0,02 |
* Только ускоренное исследование
Хранение в жидком состоянии при 25°C (условия, обеспечивающие ускоренное разрушение частиц)
Из фиг. 46 и 47 видно, что в присутствии всех буферных систем размер частиц и полидисперсность хорошо сохраняются при всех системах при хранении в условиях, ускоряющих разрушение частиц.
Из фиг. 48 видно, что в присутствии всех буферных систем доведенное значение pH хорошо сохраняется при всех системах при хранении в условиях, ускоряющих разрушение частиц.
Из фиг. 49 видно, что в условиях, ускоряющих разрушение частиц (25°C), наибольшая стабильность обнаружена для образцов, содержащих буфер HEPES, тогда как с гистидиновым и ацетатным буфером отмечалась меньшая стабильность РНК в РНК-липоплексах.
Для буферной системы HEPES при значениях pH выше 6,2 проявляется заметное улучшение стабильности по сравнению с меньшими значениями. Наибольшая стабильность отмечена при pH от 6,5 до 7,0.
Для гистидина отмечается аналогичная зависимость от pH. Однако общая стабильность была ниже в сравнении с препаратами с буфером HEPES. Ацетат в целом проявляет меньшую целостность, чем обе другие системы, а при pH 5,8 отмечается большая стабильность, чем при pH 5,5.
Хранение в замороженном состоянии (-15°C)
На фиг. 50 и 51 представлена коллоидная стабильность образцов с теми же буферными системами, которые исследовались ранее в жидком состоянии при 25°C. Из фиг. 50 и 51 видно, что HEPES, гистидин и ацетат одинаково подходят для сохранения размера частиц и полидисперсности РНК-липоплексов в замороженном состоянии (-15°C). Также видно, что при низких концентрациях NaCl достаточны меньшие концентрации сахарозы для эффективного сохранения полидисперсности РНК-липоплексов в замороженном состоянии.
На фиг. 52 представлены значения pH в образцах с теми же буферными системами, которые исследовались ранее в жидком состоянии при 25°C. Из нее видно, что все буферные системы (HEPES, гистидин и ацетат) способны поддерживать pH в заданном диапазоне в замороженном состоянии (-15°C).
На фиг. 53 представлена стабильность образцов с теми же буферными системами, которые исследовались ранее в жидком состоянии при 25°C. В целом нет никакой четкой тенденции в отношении сохранения целостности РНК в замороженном состоянии (-15°C). Некоторые отклонения могли быть вызваны ошибками, возникающими при таких экспериментальных условиях. Несколько меньшая целостность при буферной системе HEPES при pH 7,0 могла быть связана с таким экспериментальным артефактом, так как и при этой системе не наблюдается ухудшения с течением времени.
2.2. MES также подходит для стабилизации РНК-липоплексов
В следующем исследовании сравнивали две наиболее подходящие буферные системы (HEPES и гистидин), установленные в предыдущих исследованиях, с другой буферной системой (MES). РНК-липоплексы формировали с липосомами, содержащими 2 мМ уксусной кислоты. Соответствующие РНК-липоплексы исследовали в условиях, ускоряющих разрушение частиц (25°C), и в замороженном состоянии (-15°C). При этом основное внимание уделялось диапазону pH от 6,0 до 7,0, который оказался оптимальным диапазоном в предыдущих исследованиях.
Группа | pH | Буферная система | Конц. буфера [мМ] | NaCl [мМ] | Сахароза [% вес/об] |
EDTA [мМ] | РНК [мг/мл] |
РНК | Уксусная к-та в липосомах [мМ] |
1 | 6,0 | HEPES | 5 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 | декатопная | 2 |
2 | 6,5 | HEPES | 5 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 | декатопная | 2 |
3 | 7,0 | HEPES | 5 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 | декатопная | 2 |
4 | 6,0 | гистидин | 5 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 | декатопная | 2 |
5 | 6,5 | гистидин | 5 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 | декатопная | 2 |
6 | 7,0 | гистидин | 5 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 | декатопная | 2 |
7 | 6,0 | MES | 5 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 | декатопная | 2 |
8 | 6,5 | MES | 5 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 | декатопная | 2 |
9 | 7,0 | MES | 5 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 | декатопная | 2 |
Исследование в реальном времени при -15°C: свежие, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 24, 36 мес.
Ускоренное исследование при +25°C: 9 недель с отбором 1-2 проб в неделю.
Хранение в жидком состоянии при 25°C (условия, ускоряющие разрушение частиц)
Как видно из фиг. 55, и в этом новом исследовании не было обнаружено отличий между буферными системами по полидисперсности и размерам частиц при хранении в условиях, ускоряющих разрушение частиц. MES проявлял действие, сравнимое с гистидином и HEPES.
Как видно из фиг. 56, все буферные системы способны поддерживать доведенное значение pH при хранении в условиях, ускоряющих разрушение частиц. Поэтому MES, так же как HEPES и гистидин, подходит для поддержания соответствующего pH в препаратах РНК-липоплексов.
На фиг. 57 представлены данные по стабильности для различных буферных систем при хранении в условиях, ускоряющих разрушение частиц (25°C). HEPES и MES проявляют сравнимую стабилизацию целостности РНК, тогда как гистидин проявляет небольшое снижение стабильности. Оптимальный pH для буферов HEPES, MES или гистидин находится при pH от 6,5 до 7,0.
Хранение в замороженном состоянии(-15°C)
Из фиг. 58 видно, что при всех буферных системах размер частиц и полидисперсность хорошо сохраняются при замораживании препаратов, а при низких концентрациях NaCl достаточны меньшие концентрации сахарозы для эффективной стабилизации размера частиц РНК-липоплексов при замораживании.
Из фиг. 59 и 60 видно, что при всех буферных системах размер частиц и полидисперсность хорошо сохраняются при хранении в замороженном состоянии. Также видно, что при низких концентрациях NaCl достаточны меньшие концентрации сахарозы для эффективной стабилизации коллоидных свойств РНК-липоплексов в замороженном состоянии.
Из фиг. 61 видно, что все исследованные буферные системы (HEPES, гистидин, MES) способны поддерживать доведенное значение pH в замороженном состоянии.
На фиг. 62 представлены данные по стабильности различных буферных систем в замороженном состоянии. Все исследованные буферные системы (HEPES, MES или гистидин) проявляют сравнимую стабилизацию целостности РНК и нет никакой четкой тенденции к смещению pH-оптимума в исследованном, предварительно оптимизированном диапазоне pH.
3. Примеры других подходящих концентраций буфера
Для долговременной стабилизации РНК-липоплексов как в жидком, так и в замороженном состоянии проводили оптимизацию концентрации буфера, необходимой как для стабилизации доведенного значения pH, так и для сохранения целостности РНК. Для обеспечения стабилизации pH и целостности РНК получали РНК-липоплексы при 10% (мас./об) сахарозы и 6,5 мМ NaCl. Образцы хранили в условиях, ускоряющих разрушение частиц, в присутствии типичной буферной системы HEPES при следующих концентрациях:
• 2,5 мМ HEPES
• 5,0 мМ HEPES
• 7,5 мМ HEPES
• 10,0 мМ HEPES.
Исследовали эффективность стабилизации при следующих типичных значениях pH:
• pH 6,2
• pH 6,7
• pH 7,2.
Метод. Все РНК-липоплексы получали автоматически в одной партии, а различные концентрации HEPES доводили путем добавления раствора криопротектора, содержащего различные количества HEPES. Анализировали размеры частиц и полидисперсность РНК-липолексов методом фотонной корреляционной спектроскопии (PCS). Кроме того, анализировали целостность РНК методом капиллярного электрофореза и измеряли pH.
Результаты. При всех исследованных концентрациях буфера эффективно сохранялись размеры частиц и полидисперсность РНК-липоплексов в жидком состоянии (фиг. 63, 64). Кроме того, эффективно поддерживалось значение pH (фиг. 65), а поддержание целостности РНК в зависимости от pH не зависело от концентрации соответствующего буфера (фиг. 66). Итак, было обнаружено, что концентрации буфера от 2,5 мМ до 10,0 мМ одинаково эффективно стабилизируют целостность РНК в препаратах липоплексов. Оптимум pH находится в пределах от pH 6,7 до 7,2.
В следующем исследовании изучали, какая концентрация HEPES необходима для стабилизации pH у РНК-липоплексов. РНК-липоплексы формировали с липосомами, содержащими 5 мМ уксусной кислоты, доводили до различных концентраций HEPES с помощью различных растворов криопротекторов и исследовали соответствующие РНК-липоплексы в условиях, ускоряющих разрушение частиц (25°C). Проверяли диапазон pH от pH 6,2 до 7,2.
Группа | pH | Буферная система | Конц. бу- фера [мМ] |
NaCl [мМ] | Сахароза [% вес/об] |
EDTA [мМ] | РНК [мг/мл] |
BM 1 | 6,2 | HEPES | 7,5 | 20 | 22 | 2,5 | 0,05 |
1 | 6,2 | HEPES | 2,5 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 |
2 | 6,7 | HEPES | 2,5 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 |
3 | 7,2 | HEPES | 2,5 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 |
4 | 6,2 | HEPES | 5,0 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 |
5 | 6,7 | HEPES | 5,0 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 |
6 | 7,2 | HEPES | 5,0 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 |
7 | 6,2 | HEPES | 7,5 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 |
8 | 6,7 | HEPES | 7,5 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 |
9 | 7,2 | HEPES | 7,5 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 |
10 | 6,2 | HEPES | 10 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 |
11 | 6,7 | HEPES | 10 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 |
12 | 7,2 | HEPES | 10 | 6,5 | 10 | 2,5 | 0,02 |
Хранение в условиях, ускоряющих разрушение частиц при +25°C: 8 недель с отбором 1-2 проб в неделю.
Хранение в жидком состоянии при 25°C (условия, ускоряющие разрушение частиц)
Из фиг. 63 и 64 видно, что размер частиц и полидисперсность РНК-липоплексов сохраняются при всех исследованных концентрациях буфера при соответствующих значениях pH при хранении в условиях, ускоряющих разрушение частиц (25°C).
На фиг. 65 представлены измеренные значения pH у РНК-липоплексов. Образцы хранили в присутствии от 2,5 мМ до 10,0 мМ HEPES. Концентрации HEPES всего 2,5 мМ достаточно для стабилизации доведенных значений pH.
На фиг. 66 представлены данные по стабильности при различных концентрациях буфера. В условиях, ускоряющих разрушение частиц, все исследованные концентрации буфера одинаково стабилизируют целостность РНК. Наилучшая стабилизация целостности РНК оказалась при pH от 6,7 до 7,2. При хранении РНК-липоплексов при pH 6,2 отмечалось небольшое снижение целостности РНК.
4. Примеры других подходящих концентраций NaCl и криопротектора
Далее представлены примеры, в которых заданные ионные условия при длительном хранения и введении РНК-липоплексов пациентам могут быть идентичными. Для получения препарата для инъекций не требуется разбавление или другие модификации препарата после оттаивания. Помимо уже исследованного диапазона концентраций NaCl при хранении, для длительного хранения подходят и меньшие концентрации NaCl (от 5 до 10 мМ). Такие РНК-липоплексы можно вводить сразу после оттаивания, и они не требуют дополнительных операций разбавления.
Для концентраций NaCl ≤ 10 мМ было обнаружено соответствующее содержание криопротектора от 6,0 до 16,0% (мас./об), которое не следует уменьшать, чтобы обеспечить стабилизацию характеристик частиц при многократном замораживании.
Методы. В качестве репрезентативного криопротектора исследовали сахарозу в концентрации 10% (мас./об). Подробное описание экспериментов приведено в разделе 2.
Результаты. При анализе размера частиц РНК-липоплексов при хранении в замороженном состоянии типичная концентрация сахарозы 10% (мас./об) в сочетании с концентрацией NaCl ≤ 10,0 мМ оказалась достаточной для эффективной длительной стабилизации РНК-липоплексов. Коллоидная стабильность в замороженном состоянии (фиг. 50, 51, 58-60 и 71), а также скорость деградации РНК в РНК-липоплексах, стабилизированных указанным составом, подтвердилась при проверке стабильности в условиях, ускоряющих разрушение частиц (фиг. 49, 57, 66, 70) и в замороженном состоянии (фиг. 53, 62). Снижение содержания сахара и использование гистидина в качестве буферного вещества в сочетании со снижением содержания NaCl дает результаты, сравнимые с текущим составом (22% сахарозы и 20 мМ NaCl).
4.1. Стабилизации РНК-липоплексов при пониженной концентрации сахарозы и NaCl
В следующем исследовании изучали долгосрочную стабильность РНК-липоплексов в замороженном состоянии при сочетании пониженной концентрации NaCl и сахарозы в присутствии HEPES или гистидина в качестве буферного вещества при pH 6,5.
Группа | Формат РНК | РНК (мг/мл) |
NaCl (мМ) | Буфер | Конц. бу- фера (мМ) |
Сахароза (% вес/об) |
EDTA (мМ) | pH |
BM 1 | декатопная | 0,05 | 20 | HEPES | 7,4 | 22 | 2,5 | 6,2 |
1 | декатопная | 0,02 | 7,1 | HEPES | 5,0 | 10 | 2,5 | 6,5 |
3 | декатопная | 0,02 | 7,1 | гистидин | 5,0 | 10 | 2,5 | 6,5 |
Исследование в реальном времени при -15°C: свежие, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 24, 36 мес.
Хранение в условиях, ускоряющих разрушение частиц при +25°C: 9 недель с отбором 1-2 проб в неделю.
Хранение в жидком состоянии при 25°C (условия, ускоряющие разрушение частиц)
Из фиг. 67 и 68 видно, что в системах с пониженным содержанием NaCl и сахарозы размер частиц и полидисперсность хорошо сохраняются при хранении в условиях, ускоряющих разрушение частиц. Размер частиц и полидисперсность сравнимы с текущим составом, содержащим 22% сахарозы и 20 мМ NaCl.
Из фиг. 69 видно, что указанные системы способны поддерживать доведенное значение pH при хранении в условиях, ускоряющих разрушение частиц. Небольшое повышение pH при измерении объясняется установленной неисправностью pH-метра.
На фиг. 70 представлены данные по стабильности препаратов с пониженными концентрациями сахарозы и NaCl. По сравнению с текущим составом, содержащим 20 мМ NaCl и 22% сахарозы, новые препараты проявляют улучшение целостности РНК. В соответствии с предыдущими исследованиями, такое улучшение стабилизации может объясняться лучшим значением pH 6,5. В соответствии с предыдущими исследованиями, целостность РНК лучше сохраняется при использовании HEPES по сравнению с гистидином.
Хранение в замороженном состоянии (-15°C)
Из фиг. 71 видно, что описанные системы могут стабилизировать коллоидные свойства типа размера частиц в препаратах. Все препараты можно замораживать с минимальными изменениями размера частиц.
Claims (51)
1. Композиция для доставки РНК, содержащая:
РНК-липоплексные частицы, включающие:
РНК и
по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид,
хлорид натрия в концентрации от примерно 5 мМ до примерно 7,5 мМ,
стабилизатор в концентрации 10% процентов массы по объему, мас./об, или менее и
буфер,
где по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA), а по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), и
где стабилизатором является сахароза в концентрации от примерно 5% до примерно 10% мас./об.
2. Композиция по п. 1, при этом хлорид натрия находится в концентрации примерно 6,5 мМ или примерно 7,5 мМ.
3. Композиция по п. 1 или 2, при этом сахароза находится в концентрации примерно 10% мас./об.
4. Композиция по любому из пп. 1-3, при этом буфер выбран из группы, состоящей из 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновой кислоты (HEPES), гистидина, уксусной кислоты/ацетата натрия и MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты).
5. Композиция по любому из пп. 1-4, при этом буфером является HEPES, гистидин или MES.
6. Композиция по любому из пп. 1-5, при этом буфером является HEPES или MES.
7. Композиция по любому из пп. 1-6, при этом буфером является HEPES.
8. Композиция по любому из пп. 1-7, при этом композиция имеет pH от 6,0 до 7,2, от 6,0 до 7,0, от 6,2 до 7,0, от 6,5 до 7,0 или 6,5 до 6,7.
9. Композиция по любому из пп. 1-8, при этом композиция имеет pH около 6,5 или 6,7.
10. Композиция по любому из пп. 1-9, при этом буфер присутствует в концентрации от 2,5 мМ до 10 мМ.
11. Композиция по любому из пп. 1-10, при этом буфер присутствует в концентрации примерно 7,5 мМ.
12. Композиция по любому из пп. 1-11, при этом буфером является HEPES в концентрации от примерно 7,5 мМ или меньше при pH около 6,5 или 6,7.
13. Композиция по любому из пп. 1-12, при этом молярное отношение данного по меньшей мере одного катионного липида к данному по меньшей мере одному дополнительному липиду составляет от примерно 4:1 до примерно 1:2, от примерно 3:1 до примерно 1:1 или же примерно 2:1.
14. Композиция по любому из пп. 1-13, при этом РНК-липоплексные частицы содержат DOTMA и DOPE в молярном соотношении от примерно 4:1 до примерно 1:2, от примерно 3:1 до примерно 1:1 или же примерно 2:1.
15. Композиция по любому из пп. 1-14, при этом композиция дополнительно содержит хелатор.
16. Композиция по п. 15, при этом хелатором является этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA).
17. Композиция по п. 16, при этом EDTA находится в концентрации 3,5 мМ или меньше либо от примерно 0,25 мМ до примерно 3,5 мМ или от примерно 0,25 мМ до примерно 2,5 мМ.
18. Композиция по любому из пп. 1-17, при этом РНК кодирует пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, причем соотношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в композиции составляет от примерно 1:2 до примерно 1,9:2 или же примерно 1,3:2,0.
19. Композиция для доставки РНК, содержащая:
РНК-липоплексные частицы, включающие:
РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, и
DOTMA и DOPE в молярном соотношении 2:1,
причем отношение положительных зарядов к отрицательным зарядам в композиции составляет 1,3:2,0,
хлорид натрия в концентрации примерно 7,5 мМ,
сахарозу в концентрации примерно 10% мас./об,
HEPES в концентрации примерно 7,5 мМ при pH около 6,5 или 6,7 и
EDTA в концентрации примерно 2,5 мМ.
20. Композиция по любому из пп. 1-19, при этом РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр, составляющий от примерно 200 до примерно 800 нм, от примерно 250 до примерно 700 нм, от примерно 400 до примерно 600 нм, от примерно 300 нм до примерно 500 нм или от примерно 350 нм до примерно 400 нм.
21. Композиция по любому из пп. 1-20, при этом количество РНК в композиции составляет от примерно 0,01 мг/мл до примерно 1 мг/мл, от примерно 0,05 мг/мл до примерно 0,5 мг/мл, примерно 0,05 мг/мл или примерно 0,02 мг/мл.
22. Композиция по любому из пп. 1-21, дополнительно содержащая адъювант.
23. Композиция по любому из пп. 1-22, при этом композиция находится в жидком или замороженном состоянии.
24. Композиция по п. 23, которая является жидкой композицией, предпочтительно водной композицией.
25. Жидкая композиция для доставки РНК, содержащая РНК-липоплексные частицы, получаемая путем оттаивания замороженной композиции, полученной из композиции согласно любому из пп. 1-23.
26. Жидкая композиция для доставки РНК, содержащая РНК-липоплексные частицы, получаемая путем растворения обезвоженной композиции, полученной из композиции согласно любому из пп. 1-22.
27. Жидкая композиция по п. 25 или 26, которая представляет собой водную композицию.
28. Композиция по п. 27, которая может вводиться непосредственно субъекту.
29. Композиция по любому из пп. 1-28, которая представляет собой фармацевтическую композицию.
30. Композиция по любому из пп. 1-29, которая предназначена для системного введения.
31. Композиция по п. 30, при этом системное введение осуществляется путем внутривенного введения.
32. Композиция по любому из пп. 1-31 для терапевтического применения.
33. Способ получения жидкой композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, для непосредственного введения субъекту, включающий оттаивание замороженной композиции, полученной из композиции согласно любому из пп. 1-23.
34. Способ получения жидкой композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, для непосредственного введения субъекту, включающий растворение обезвоженной композиции, полученной из композиции по любому из пп. 1-22.
35. Способ по п. 33 или 34, при этом жидкая композиция представляет собой водную композицию.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EPPCT/EP2019/058635 | 2019-04-05 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2021132037A RU2021132037A (ru) | 2023-05-11 |
RU2807543C2 true RU2807543C2 (ru) | 2023-11-16 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6013786A (en) * | 1997-08-22 | 2000-01-11 | Hybridon, Inc. | MDM2-specific antisense oligonucleotides |
WO2016045732A1 (en) * | 2014-09-25 | 2016-03-31 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Stable formulations of lipids and liposomes |
WO2016075154A1 (en) * | 2014-11-10 | 2016-05-19 | Ethris Gmbh | Induction of osteogenesis by delivering bmp encoding rna |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6013786A (en) * | 1997-08-22 | 2000-01-11 | Hybridon, Inc. | MDM2-specific antisense oligonucleotides |
WO2016045732A1 (en) * | 2014-09-25 | 2016-03-31 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Stable formulations of lipids and liposomes |
WO2016075154A1 (en) * | 2014-11-10 | 2016-05-19 | Ethris Gmbh | Induction of osteogenesis by delivering bmp encoding rna |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MADDEN T. D., REDELMEIER T. E. Transmembrane distribution of lipophilic cations in response to an electrochemical potential in reconstituted cytochromec oxidase vesicles and in vesicles exhibiting a potassium ion diffusion potential // Journal of bioenergetics and biomembranes. - 1994. - Vol. 26. - No. 2. - P. 221-230. * |
ZELPHATI O. et al. Stable and monodisperse lipoplex formulations for gene delivery // Gene therapy. - 1998. - Vol. 5. - P. 1272-1282. HIRSCH-LERNER D. et al. Effect of "helper lipid" on lipoplex electrostatics // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. - 2005. - Vol. 1714. - No. 2. - P. 71-84. SIMBERG D. et al. The role of organ vascularization and lipoplex-serum initial contact in intravenous murine lipofection // Journal of biological chemistry. - 2003. - Vol. 278. - No. 41. - P. 39858-39865. KAWAKAMI S. et al. Enhanced gene expression in lung by a stabilized lipoplex using sodium chloride for complex formation // The Journal of Gene Medicine: A cross‐disciplinary journal for research on the science of gene transfer and its clinical applications. - 2005. - Vol. 7. - No. 12. - P. 1526-1533. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20210161818A1 (en) | Preparation and storage of liposomal rna formulations suitable for therapy | |
US20220143069A1 (en) | Preparation and storage of liposomal rna formulations suitable for therapy | |
US11224665B2 (en) | Mitochondrial antiviral signaling (MAVS) protein compositions and methods of using the same | |
US20230114808A1 (en) | Therapeutic rna for prostate cancer | |
RU2807543C2 (ru) | Получение и хранение липосомных препаратов рнк, пригодных для терапии | |
US20230145774A1 (en) | Treatment involving non-immunogenic rna for antigen vaccination | |
RU2784928C2 (ru) | Изготовление и хранение липосомальных РНК-составов, подходящих для терапии | |
JP2023544343A (ja) | 治療に適したリポソームrna製剤の調製および保存 | |
WO2023052531A1 (en) | Treatment involving non-immunogenic rna for antigen vaccination and pd-1 axis binding antagonists | |
JP2023554154A (ja) | サイトカインタンパク質の治療スケジュール |