KR20240022610A - 다가 인플루엔자 백신 - Google Patents

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KR20240022610A
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mrna
influenza
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lnp
lipid
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티모시 알레판티스
수드하 치부쿨라
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사노피
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Abstract

8개의 mRNA를 포함하는 8가 인플루엔자 백신 조성물이 제공되며, 각각의 mRNA는 상이한 인플루엔자 항원을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 또한, 상기 mRNA를 전달하기 위한 지질 나노입자(LNP)가 제공된다.

Description

다가 인플루엔자 백신
[관련 출원]
본 출원은 2021년 6월 18일자로 출원된 미국 가출원 제63/212,523호; 2021년 11월 5일자로 출원된 미국 가출원 제63/276,243호; 2021년 11월 5일자로 출원된 PCT 국제 출원 제PCT/US2021/058250호; 및 2021년 10월 13일자로 출원된 유럽 특허 출원 제21315198.8호의 이익을 청구하며, 이들은 본원에 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
메신저 RNA(mRNA) 기반 백신은 병원체에서 유래된 항원성 단백질을 함유하는 전통적인 서브유닛 백신에 대한 유망한 대안을 제공한다. 항원 단백질은 일반적으로 재조합으로 제조되며, 복잡한 정제뿐만 아니라 박테리아 발효 및/또는 세포 배양을 필요로 한다. mRNA에 기반한 백신은 백신접종 대상체에서 복잡한 항원의 새로운 발현을 가능하게 하며, 이는 차례로 번역 후 적절한 변형 및 그의 천연 형태의 항원 제시를 가능하게 한다. 전통적인 기술과 달리, mRNA 백신 제조에는 복잡하고 비용이 많이 드는 박테리아 발효, 조직 배양 및 정제 공정이 필요하지 않는다. 또한, mRNA 백신 제조 공정이 확립되면 다양한 항원에 사용될 수 있어, mRNA 백신의 신속한 개발 및 보급이 가능하다. 또한, mRNA 백신은 일시적으로만 항원을 발현하고 숙주 게놈에 통합되지 않기 때문에 본질적으로 안전한 전달 벡터이다. mRNA에 의해 암호화되는 항원은 백신접종을 받은 개체의 생체 내에서 생산되기 때문에, mRNA 백신은 특히 체액성 면역과 T 세포 매개 면역 모두를 유도하는 데 효과적이다.
현재 승인된 인플루엔자 백신은 생약독화 인플루엔자 백신 또는 불활성화 인플루엔자 백신이며, 이는 종종 세포 배양이나 달걀에서 생산된다. 더욱이, 매년 여러 인플루엔자 균주가 집단 내에서 순환할 수 있으므로 단일 인플루엔자 백신이 여러 균주에 대해 강력한 보호를 제공하기가 어렵다. 따라서, 여러 인플루엔자 균주를 표적으로 하는 다가 mRNA 기반 인플루엔자 백신을 포함한 mRNA 기반 인플루엔자 백신에 대한 필요성이 존재한다.
본 개시내용은 8개의 메신저 RNA(mRNA)를 포함하는 인플루엔자 백신 조성물을 제공하며, 각각의 mRNA는 상이한 인플루엔자 항원을 암호화하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 (i) 하나 이상의 헤마글루티닌(HA) 항원, (ii) 하나 이상의 뉴라미니다제(NA) 항원, 또는 (iii) 적어도 하나의 HA 항원 및 적어도 하나의 NA 항원을 암호화하는 8개의 mRNA를 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 인플루엔자 A, B 및/또는 C 바이러스들의 항원을 암호화하는 하나 이상의 mRNA를 포함한다.
특정 구현예에서, 항원은 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스들의 HA 및/또는 NA 항원이다.
특정 구현예에서, 인플루엔자 A 바이러스들의 NA 항원은 아형 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, N10, 및 N11로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 인플루엔자 B 바이러스들의 HA 및 NA 항원은 인플루엔자 B/야마가타 계통 또는 인플루엔자 B/빅토리아 계통에서 유래한다.
특정 구현예에서, HA 항원 및 NA 항원은 H1N1, H3N2, H2N2, H5N1, H7N9, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H5N2, 및 H10N7 아형 및/또는 B/야마가타 및 B/빅토리아 계통으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 조성물은 H3 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, H1 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, 인플루엔자 B/야마가타 계통으로부터의 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, 및 인플루엔자 B/빅토리아 계통으로부터의 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA를 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 H3 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, N2 NA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, H1 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, N1 NA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, 인플루엔자 B/야마가타 계통으로부터의 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, 인플루엔자 B/야마가타 계통으로부터의 NA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, 인플루엔자 B/빅토리아 계통으로부터의 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, 및 인플루엔자 B/빅토리아 계통으로부터의 NA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA를 포함한다.
특정 구현예에서, ORF는 코돈 최적화된다.
특정 구현예에서, mRNA 분자는 적어도 하나의 5’ 비번역 영역(5’ UTR), 적어도 하나의 3’ 비번역 영역(3’ UTR), 및 적어도 하나의 폴리아데닐화(폴리(A)) 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, mRNA는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함한다.
특정 구현예에서, mRNA에서 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%가 화학적으로 변형된다.
특정 구현예에서, ORF에서 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%가 화학적으로 변형된다.
특정 구현예에서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4’-티오우리딘, 5-메틸시토신, 2-티오-l-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-l-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-l-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 및 2’-O-메틸 우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 5-메틸시토신, 5-메톡시우리딘, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 화학적 변형은 N1-메틸슈도우리딘이다.
특정 구현예에서, mRNA는 지질 나노입자(LNP)에 제형화된다.
특정 구현예에서, LNP는 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함한다.
특정 구현예에서, 양이온성 지질은 생분해성이다. 특정 구현예에서, 양이온성 지질은 생분해성이 아니다.
특정 구현예에서, 양이온성 지질은 절단 가능하다. 특정 구현예에서, 양이온성 지질은 절단 가능하지 않다.
특정 구현예에서, 양이온성 지질은 OF-02, cKK-E10, GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1, GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10, 및 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, LNP는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 공액 (PEG화된) 지질, 콜레스테롤계 지질 및 헬퍼 지질을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는
35% 내지 55%의 몰비율의 양이온성 지질;
0.25% 내지 2.75%의 몰비율의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 공액 (PEG화된) 지질;
20% 내지 45%의 몰비율의 콜레스테롤계 지질; 및
5% 내지 35%의 몰비율의 헬퍼 지질을 포함하며,
여기서 모든 몰비율은 LNP의 총 지질 함량에 상대적이다.
특정 구현예에서, LNP는
40%의 몰비율의 양이온성 지질;
1.5%의 몰비율의 PEG화된 지질;
28.5%의 몰비율의 콜레스테롤계 지질; 및
30%의 몰비율의 헬퍼 지질을 포함한다.
특정 구현예에서, PEG화된 지질은 디미리스토일-PEG2000(DMG-PEG2000) 또는 2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드(ALC-0159)이다.
특정 구현예에서, 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤이다.
특정 구현예에서, 헬퍼 지질은 1,2-디올레오일-SN-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다.
특정 구현예에서, LNP는
40%의 몰비율의, OF-02, cKK-E10, GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1, GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10, 및 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14로 이루어진 군으로부터 선택되는 양이온성 지질;
1.5%의 몰비율의 DMG-PEG2000;
28.5%의 몰비율의 콜레스테롤; 및
30%의 몰비율의 DOPE를 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 30 nm 내지 200 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 80 nm 내지 150 nm의 평균 직경을 갖는다.
특정 구현예에서, 인플루엔자 백신 조성물은 1 mg/mL 내지 10 mg/mL의 LNP를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 1 내지 20개의 mRNA 분자를 포함한다. 특정 구현예에서, LNP는 5~10개 또는 6~8개의 mRNA 분자를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 2개 이상의 mRNA를 포함하며, 각각의 mRNA는 상이한 인플루엔자 항원을 암호화한다.
특정 구현예에서, 조성물은 8개의 LNP를 포함하며, 각각의 LNP는 상이한 인플루엔자 항원을 암호화하는 mRNA를 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 근육내 주사용으로 제형화된다.
특정 구현예에서, 조성물은 인산염 완충 식염수를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 면역 반응 유도를 필요로 하는 대상체에게, 선택적으로 근육내로, 비강내로, 정맥내로, 피하로 또는 피내로, 전술한 인플루엔자 백신 조성물의 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 인플루엔자 감염을 예방하거나 인플루엔자 감염의 하나 이상의 증상을 감소시키는 방법으로서, 선택적으로 근육내로, 비강내로, 정맥내로, 피하로, 또는 피내로, 전술한 인플루엔자 백신 조성물의 예방적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 인플루엔자 백신 조성물은 하나 이상의 계절성 및/또는 유행성 인플루엔자 균주에 대한 면역 반응을 유도한다.
특정 구현예에서, 방법은 대상체에게 1회 이상의 용량의 인플루엔자 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 각 용량은 약 1 μg 내지 약 250 μg의 mRNA를 포함한다.
특정 구현예에서, 방법은 대상체에게 1회 이상의 용량의 인플루엔자 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 각 용량은 약 2.5, 5, 15, 45, 또는 135 μg의 mRNA를 포함한다.
특정 구현예에서, 방법은 대상체에게 2~6주, 선택적으로 4주의 간격으로 2회 용량의 인플루엔자 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 전술한 인플루엔자 백신 조성물의 용도를 제공한다.
특정 구현예에서, 인플루엔자 백신 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 1회용 또는 다회용 투여량을 포함하는 용기를 포함하는 키트를 제공하며, 선택적으로 용기는 바이알 또는 사전충전형 주사기 또는 주입기이다.
특정 구현예에서, 인플루엔자 항원은 기계 학습 모델로부터 식별되거나 설계된 분자 서열을 갖는 인플루엔자 바이러스 HA 항원 및/또는 인플루엔자 바이러스 NA 항원을 포함한다.
도 1a는 hEPO mRNA의 다양한 LNP 제형으로 처리된 마우스에서 인간 에리트로포이에틴(hEPO)의 발현을 나타내는 한 쌍의 그래프이다. 패널 a): MC3와 비교되는 LNP 제형 “지질 A” 및 “지질 B”. 막대는 평균과 표준 편차를 나타낸다. 패널 b): 양이온성 지질 OF-02로 제조된 제형. PEG: DMG-PEG2000. Cholest: 콜레스테롤. “지질 A”: 달리 명시되지 않는 한, 순서대로 40:1.5:28.5:30의 몰비율의 OF-02, DMG-PEG2000, 콜레스테롤, 및 DOPE를 함유하는 LNP 조성물. “지질 B”: 순서대로 40:1.5:28.5:30의 몰비율의 cKK-E10, DMG-PEG2000, 콜레스테롤, 및 DOPE를 함유하는 LNP 조성물.
도 1b는 LNP 제형 지질 A 및 지질 B를 사용하여 마우스 및 비인간 영장류(NHP)에서 hEPO의 발현을 나타내는 한 쌍의 그래프이다.
도 2a 및 2b는 균주 A/California/7/2009(H1N1)(CA09)의 헤마글루티닌(HA)을 암호화하는 mRNA를 갖는 지질 A 및 지질 B LNP 제형이 강력한 기능성 항체를 유도하고(도 2a) 인플루엔자 바이러스의 팬데믹 균주로 감염되었을 때 사망 또는 심각한 체중감소(20% 초과)에 대해 마우스를 보호하였음(도 2b)을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 헤마글루티닌 억제(HAI) 역가는 연구 0일, 14일, 28일, 42일, 56일, 92일 및 107일에 채취한 혈청 샘플에 대해 log10으로 보고된다. 막대는 기하 평균 및 기하 표준 편차이다. 일일 체중은 A/Belgium/2009 (H1N1)(Belgium09)의 4LD50으로 비강내 시험접종(93일) 후 측정되었다. 체중은 시험접종일로부터 감소된 체중의 백분율로 표시된다. 안락사는 시작 체중의 20% 초과가 감소된 마우스와 감염 후 14일(107일)에 모든 마우스에게 발생했다. rHA: 재조합 헤마글루티닌. AF03: 수중유형 에멀젼 아쥬반트. 희석제 = PBS. LLOQ = 정량하한. 1/40 = 1/40 최소 목표, 건강한 성인의 인플루엔자 감염 또는 질환 위험의 50% 감소와 관련된 HAI 항체 역가를 나타냄(문헌[Coudeville et al., BMC Med Res Methodol. (2010) 10:18]). 도 2b의 점선 = 시험접종 당일 체중과 관련된 20% 체중 감소 컷오프.
도 3a 및 3b는 지질 A LNP로 제형화된 A/Michigan/45/2015(Mich15) 뉴라미니다제(NA) mRNA가 강력한 기능성 항체를 유도하고(도 3a) 인플루엔자 바이러스의 팬데믹 균주로 시험접종되었을 때 체중 감소 및 사망에 대해 마우스를 보호하였음(도 3b)을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 뉴라미니다제 억제(NAI) 역가는 연구 14일, 28일, 42일, 56일, 88일 및 114일에 채취한 혈청 샘플에 대해 log10으로 보고된다. Belgium09의 4LD50으로 비강내 시험접종 후 일일 체중을 관찰했다(1회 용량 그룹의 경우 89일 또는 2회 용량 그룹의 경우 117일). 체중은 시험접종일로부터 감소된 체중의 백분율로 표시된다. 안락사는 시작 체중의 20% 초과가 감소된 마우스와 감염 후 14일(1회 용량 그룹의 경우 103일 또는 2회 용량 그룹의 경우 131일)에 모든 마우스에게 발생했다. 막대는 평균과 표준 편차이다. 도 3a의 상부 점선 = 정량 상한. 도 3a의 하부 점선 = 정량 하한. 도 3b의 점선 = 시험접종 당일 체중과 관련된 20% 체중 감소 컷오프. 투여된 mRNA: Mich15 NA를 암호화하는 0.4 또는 0.016 μg mRNA. 대조군: hEPO 또는 희석제(PBS)를 암호화하는 0.6 μg mRNA.
도 4는 CA09 HA mRNA(10 μg)를 갖는 지질 A 및 지질 B LNP 제형이 사이노몰구스 마카크 원숭이에서 강력한 기능성 항체를 유도함을 보여주는 그래프이다. HAI 역가는 연구 0일, 14일, 28일, 42일, 및 56일에 채취한 혈청 샘플에 대해 log2로 보고된다.
도 5a~5c는 인플루엔자 바이러스 A/Singapore/ INFIMH160019/2016(Sing16; H3N2) HA 헤마글루티닌을 암호화하는 MRT1400 mRNA를 나타낸다. 도 5a: HA 항원에 대한 야생형(WT) 유전자 및 코돈-최적화 유전자(MRT10279)의 정렬. 도 5b: mRNA의 구조. 도 5c: mRNA의 서열.
도 6은 MRT1400 또는 NA mRNA를 갖는 지질 A 및 지질 B LNP 제형이 마우스에서 강력한 기능성 항체를 유도함을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 첫 번째 주사는 연구 0일에 제공되었고 두 번째 주사는 연구 28일에 제공되었다. 왼쪽 패널: HAI 역가는 연구 14일, 28일, 42일, 및 56일에 채취한 혈청 샘플에 대해 log10으로 보고된다. 오른쪽 패널: NAI 역가는 연구 14일, 28일, 42일, 및 56일에 채취한 혈청 샘플에 대해 log10으로 보고된다. 막대는 기하 평균 및 기하 표준 편차이다. 점선 = 정량 하한.
도 7a는 MRT 1400을 갖는 지질 A 및 지질 B LNP 제형이 NHP에서 강력한 기능성 항체를 유도함을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. HAI 역가는 연구 0일, 14일, 28일, 42일, 및 56일에 채취한 혈청 샘플에 대해 log2로 보고된다. 첫 번째 주사는 연구 0일에 제공되었고 두 번째 주사는 연구 28일에 제공되었다. 막대는 평균과 표준 편차이다. 상부 점선 = 1/40 최소 목표. 하부 점선 = 검출 하한.
도 7b 및 7c는 MRT1400 mRNA를 함유하는 지질 A LNP 제형(MRT5400)이 기능성 항체를 유도하고(도 7b) 4가지 용량 수준: 15, 45, 135 및 250 μg의 mRNA에서 사이노몰구스 마카크 원숭이에서 강력한 ELISA 역가(도 7c)를 유도함을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. HAI 및 ELISA 역가는 연구 0일, 14일, 28일, 42일, 및 56일에 채취한 혈청 샘플에 대해 log2로 보고된다. 첫 번째 주사는 연구 0일에 제공되었고 두 번째 주사는 연구 28일에 제공되었다. 막대는 평균과 표준 편차이다. 점선 = 1/40 최소 목표.
도 8a 및 8b는 3개의 용량 수준 그룹(250 μg, 135 μg, 및 45 μg의 mRNA)에서 지질 A LNP 제형 MRT5400으로 2차 백신접종후 사이노몰구스 마카크의 T 세포 사이토카인 반응을 나타내는 그래프 패널이다. 재조합 HA(rHA) 단백질(왼쪽 패널) 또는 풀링된 펩티드(오른쪽 패널)에 의한 재자극으로 유도된 IFN-γ 및 IL-13은 ELISPOT 분석으로 42일째에 말초 혈액 단핵 세포(PMBC)에서 평가했다. IFN-γ(도 8a) 또는 IL-13(도 8b)을 분비하는 PBMC의 빈도는 백만 개의 PBMC당 스폿 형성 세포(SFC)로 계산되었다. 각 기호는 개별 샘플을 나타내고, 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 9a는 변형 및 비변형 CA09 HA mRNA를 함유하는 지질 A LNP 제형이, 백신접종된 마우스에서 HAI 역가에 의해 표시된 바와 유사함을 나타내는 한 쌍의 그래프이다. HAI 역가는 연구 14일, 28일, 42일, 및 56일에 채취한 혈청 샘플에 대해 log2으로 보고된다. 첫 번째 주사는 연구 0일에 제공되었고 두 번째 주사는 연구 28일에 제공되었다. 막대는 평균과 표준 편차이다. 상부 점선 = 1/40 최소 목표. 하부 점선 = 정량 하한.
도 9b는 변형 및 비변형 CA09 HA mRNA를 함유하는 지질 A LNP 제형이 마우스에서 ELISA 역가에 의해 표시된 바와 유사함을 나타내는 한 쌍의 그래프이다. 총 IgG ELISA 역가는 연구 14일, 28일, 42일, 및 56일에 채취한 혈청 샘플에 대해 log10으로 보고된다. 첫 번째 주사는 연구 0일에 제공되었고 두 번째 주사는 연구 28일에 제공되었다. 점선 = 정량 하한.
도 10a 및 10b는 CA09 HA mRNA 및 Sing16 HA mRNA를 갖는 2가 지질 A LNP 제형이 0.4 μg의 총 mRNA의 용량으로 Balb/c 마우스에서 HAI 역가(CA09 (도 10a) 및 Sing16(도 10b))로 평가된 바와 같이, 강력한 기능성 항체를 유도함을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 0.4 μg mRNA가 공동-캡슐화된 mRNA-LNP 제형으로 투여되거나, 또는 각각의 HA mRNA가 각 다리에 0.2 μg씩 개별적으로 투여되었다. 각각의 HA mRNA는 또한 LNP로의 전체 mRNA 패킹을 제어하기 위해 비암호화 mRNA와 함께 제형으로 공동-캡슐화되었다. 희석제 그룹은 mRNA-LNP 희석제 완충액을 받았다. HAI 역가는 연구 -2일(기준선) 14일, 28일, 및 42일에 채취한 혈청 샘플에 대해 보고된다. 도 10b는 단지 연구일 -2(풀링된 혈청으로부터의 기준선) 및 42일을 보여준다. 첫 번째 주사는 연구 0일에 제공되었고 두 번째 주사는 연구 28일에 제공되었다. 막대는 기하 평균 및 기하 표준 편차이다. 점선 = 정량 하한.
도 11은 mRNA-LNP 제형의 기능적 검증을 보여준다. 패널 (a)는 BALB/c 마우스에서 반딧불이(FF) 루시페라아제의 발현을 나타내는 그래프이다: 단일 용량의 루시페라제 FF mRNA-LNP(5, 1, 0.1, 0.05 μg)가 마우스(n=4)에 IM 경로로 주사되었다. 루시페린(3 mg)은 생물발광 강도를 기록하는 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)의 IVIS 스펙트럼을 사용하여 전체 동물 영상화 시점에 주사되었다. 주사 후 6, 24, 48 및 72시간에 전체 동물 평균 광도의 이미지를 얻었다. Luc mRNA-LNP의 1, 0.5, 0.1 및 0.05 μg 용량 투여에 대해 기록된 광도를 그래프에 나타내었다. 패널 (b)는 6 내지 72시간에 총 발광 플럭스를 나타내는 전체 동물 이미지를 나타낸다. 0.1 μg 용량의 FF-LNP를 받은 마우스 그룹(n=4)의 총 발광 플럭스가 표시된다. 패널 (c)는 BALB/c 마우스에서 hEPO의 발현을 보여준다. 단일 용량의 hEPO mRNA-LNP(0.1 μg)를 IM 경로로 BALB/c 마우스에 주사하였다. ELISA를 사용하여 투여 후 6시간 및 24시간에 혈청에서 hEPO 발현을 정량화하였다. 막대는 평균과 표준 편차를 나타낸다. 패널 (d)는 NHP에서 hEPO의 발현을 보여준다. 단일 용량의 hEPO mRNA-LNP(10 μg)를 IM 경로로 사이노몰구스 마카크에 주사하였다. ELISA를 사용하여 투여 후 6시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 혈청에서 hEPO 발현을 정량화하였다. 막대는 평균과 표준 편차를 나타낸다.
도 12는 마우스에서 HA mRNA-LNP 백신의 혈청학적 평가를 보여준다. BALB/c 마우스(그룹당 n=8)가 2, 0.4, 0.08, 및 0.016 μg의 Cal09 HA mRNA-LNP 또는 Sing16 HA mRNA-LNP로 4주 간격으로 IM으로 2회 면역화되었다. CA09 (Cal09) H1N1 인플루엔자 바이러스 재조합 HA (왼쪽 패널) 및 Sing16 H3N2 인플루엔자 바이러스 재조합 HA (오른쪽 패널)에 대해 14, 28, 42, 56일에 수집된 혈청에 대해 기록된 ELISA 역가가 표시된다.
도 13은 마우스에서 HA mRNA-LNP 백신의 혈청학적 평가를 보여준다. BALB/c 마우스(그룹당 n=8)가 2, 0.4, 0.08 및 0.016 μg의 CA09 HA mRNA-LNP 또는 Sing16 HA mRNA-LNP로 4주 간격으로 IM으로 2회 면역화되었다. CA09 H1N1 인플루엔자 바이러스(왼쪽 패널) 및 Sing16 H3N2 인플루엔자 바이러스(오른쪽 패널)에 대해 기록된 Log10 HAI 역가가 표시된다.
도 14는 마우스에서 NA mRNA-LNP 백신의 혈청학적 평가를 보여준다. BALB/c 마우스(그룹당 n=8)가 2, 0.4, 0.08, 및 0.016 μg의 Mich15 NA mRNA-LNP 또는 Sing16 NA mRNA-LNP로 4주 간격으로 IM으로 2회 면역화되었다. Mich15 N1 인플루엔자 바이러스 재조합 NA (왼쪽 패널) 및 Sing16 N2 바이러스 재조합 NA (오른쪽 패널)에 대해 0, 14, 28, 42, 56일에 수집된 혈청에 대해 기록된 총 IgG 역가가 표시된다.
도 15는 마우스에서 NA mRNA-LNP 백신의 혈청학적 평가를 보여준다. BALB/c 마우스(그룹당 n=8)가 2, 0.4, 0.08 및 0.016 μg의 Mich15 NA mRNA-LNP 또는 Sing16 NA mRNA-LNP로 4주 간격으로 IM으로 2회 면역화되었다. Mich2015 (N1): A/Mallard/Sweden/2002 (H6) 키메라 인플루엔자 바이러스(왼쪽 패널) 및 Sing16 (N2): A/Mallard/Sweden/2002 (H6) 키메라 바이러스(오른쪽 패널)에 대한 혈청에 대해 기록된 Log10 NAI (ELLA) 역가가 표시된다.
도 16a 및 16b는 치명적인 A/Belgium/2009 H1N1 바이러스 시험접종 후 마우스에서 CA09 HA mRNA-LNP 백신의 보호 효능을 보여준다. 마우스(n=8)는 0일 및 28일에 CA09 HA mRNA-LNP(각각 0.4 μg)의 2회 IM 용량을 받았다. 대조군 동물은 0일 및 28일에 2회 IM 용량의 희석제를 받았다. 도 16a는 연구 0, 14, 28, 42, 56, 92, 및 107일에 채취한 혈청 샘플에 대해 Log10으로 보고된 HAI 역가를 보여준다. 도 16b는 A/Belgium/2009 H1N1 균주의 4LD50으로 93일째에 비강내 시험접종 후 일일 중량을 나타낸다. 체중은 시험접종일로부터 감소된 체중의 백분율로 표시된다. 개별 선은 각 동물을 나타낸다.
도 17a~b는 치명적인 A/Belgium/2009 H1N1 바이러스 시험접종 후 마우스에서 변형되지 않은 Mich15 NA mRNA-LNP의 단일 용량의 보호 효능을 보여준다. 마우스(n=16)에 0.4 μg 또는 0.016 μg의 Mich15 NA mRNA-LNP를 IM 경로로 주사하였다. 마우스의 절반은 연구 0일에 1회 주사(1회 용량)만을 받은 반면, 나머지 절반은 연구 0일과 28일에 2회 주사(2회 용량)를 받았다. 대조군 동물은 0일 및 28일에 hEPO mRNA-LNP(0.6 μg)의 2회 IM 용량을 받았다. 도 17a는 연구 0, 14, 28, 42, 56, 88, 및 114일에 채취한 혈청 샘플에 대해 Log10으로 보고된 NAI 역가를 보여준다. 도 17b는 Belgium09 H1N1의 4LD50에 의한 단일 용량 그룹의 경우 89일 및 2회 용량 그룹의 경우 117일(2차 투여 후 89일)에 비강내 시험접종 후 일일 체중 변화를 나타낸다. 체중은 시험접종일로부터 감소된 체중의 백분율로 표시된다. 개별 선은 각 동물을 나타낸다.
도 18은 NHP에서 HA Sing16 HA mRNA-LNP 백신의 혈청학적 평가를 보여준다. 사이노몰구스 마카크(그룹당 n=6)에 15, 45 또는 135 μg의 Sing16 HA mRNA-LNP를 IM 경로로 4주 간격으로 2회 주사했다. 혈청 샘플은 -6, 14, 28, 42, 및 56일에 수집되었다. Sing16 바이러스의 재조합 HA 단백질에 대한 Log10 IgG 역가가 표시된다.
도 19a 및 19b는 NHP에서 HA Sing16 HA mRNA-LNP 백신의 혈청학적 평가를 보여준다. 사이노몰구스 마카크(그룹당 n=6)에 15, 45 또는 135 μg의 Sing16 HA mRNA-LNP를 IM 경로로 4주 간격으로 2회 주사했다. 혈청 샘플은 0, 14, 28, 42, 및 56일에 수집되었다. Sing2016 바이러스에 대한 Log10 HAI 역가(도 19a) 및 Log10 미세-중화(MN) 역가(도 19b)를 나타낸다.
도 20a 및 20b는 Sing16 HA mRNA-LNP 백신으로 백신접종된 NHP에서의 T 세포 반응을 나타낸다. 사이노몰구스 마카크(그룹당 n=6)에 45, 135 또는 250 μg의 Sing16 HA mRNA-LNP를 IM 경로로 4주 간격으로 2회 주사했다. 전체 HA 오픈 리딩 프레임을 나타내는 펩티드 풀로 시험관내 자극된 PBMC에서 42일에 ELISPOT에 의해 T 세포가 결정되었다. 백만개의 PBMC당 스폿 형성 세포(SFC)로 계산된 PBMC 분비 IFN-γ(도 20a) 또는 IL-13(도 20b)의 반응이 표시된다. 각 기호는 개별 샘플을 나타내고, 막대는 그룹의 기하 평균을 나타낸다.
도 21은 Sing16 HA mRNA-LNP 백신으로 백신접종된 NHP에서 180일째에 기억 B 세포에 의한 Sing16 H3-특이적 IgG의 분비를 나타낸다. 사이노몰구스 마카크(그룹당 n=6)에 15 또는 45 μg의 Sing16 HA mRNA-LNP를 IM 경로로 4주 간격으로 2회 주사했다. 인간 IgG 단색 기억 B 세포 ELISPOT 키트(CAT# NC1911372, CTL)를 사용하여 Sing16/H3-특이적 및 전체 IgG+ 항체-분비 세포(ASC)를 측정하였다. MBC에서 ASC로의 분화는 키트에서 제공하는 자극 칵테일을 사용하여 180일에 수집된 PBMC에서 수행되었다. IgG+의 수와 Sing16/H3-특이적 ASC의 수는 각 동물에 대한 백만 개의 PBMC당 계산되었으며, 항원-특이적 ASC의 빈도가 표시된다.
도 22는 마우스에서 인플루엔자 백신의 2가 조합의 전달을 나타낸다. BALB/c 마우스(그룹당 n=8)를 4주 간격으로 총 0.4 μg의 2가 조합 동시-캡슐화 mRNA 전사물(1:1 wt/wt, 각 다리당 부피 절반) 또는 별도로 제형화되고 상이한 다리를 면역화한 0.2 μg의 각 1가로 2회 IM 면역화하였다. CA09 HA mRNA-LNP, Sing16 HA mRNA-LNP를 구성하는 H1H3 콤보; Sing16 HA mRNA-LNP 및 Sing16 NA mRNA-LNP의 H3N2 콤보 및 Mich15 NA mRNA-LNP 및 Perth09 NA mRNA-LNP의 N1N2 콤보는 해당 바이러스에 대해 0, 14, 28, 42일에 수집된 혈청에서 테스트되었다. 패널 (a)는 CA09 H1N1 인플루엔자 바이러스 및 Sing2016 H3N2에 대해 기록된 HAI 역가를 보여준다. 패널 (b)는 Sing2016 H3N2 및 A/Mallard/Sweden/2002 (H6) 키메라 인플루엔자 바이러스 및 H6N2 A/Perth/09 바이러스 F1919D (N2) 바이러스에 대해 각각 기록된 HAI 및 NAI 역가를 보여준다. 패널 (c)는 Mich15 (N1): A/Mallard/Sweden/2002 (H6) 키메라 인플루엔자 바이러스 및 H6N2 A/Perth/09 바이러스 F1919D (N2) 바이러스에 대해 기록된 NAI 역가를 보여준다.
도 23은 NHP에서 인플루엔자 백신의 4가 조합의 전달을 나타낸다. 사이노몰구스 마카크(그룹당 n=6)를 총 10 μg의 동시-캡슐화 mRNA 전사물의 4가 조합(1:1:1:1 wt/wt)으로 4주 간격으로 2회 IM으로 면역화하였다. CA09 HA mRNA, Sing16 HA mRNA, Mich15 NA mRNA, 및 Perth09 NA mRNA로 구성된 H2H3N1N2 콤보. CA09 HA mRNA, Sing16 HA mRNA 및 2x 비-암호화 mRNA(ncmRNA)로 구성된 H1H3 콤보; Sing16 HA mRNA 및 Perth09 NA mRNA 및 2x 비-암호화 mRNA의 H3N2 콤보. Mich15 NA mRNA, Perth09 NA mRNA-LNP, 및 2x 비-암호화 mRNA의 N1N2 콤보. CA09 HA mRNA 및 3x 비-암호화 mRNA로 구성된 H1. Sing16 HA mRNA 및 3x 비-암호화 mRNA로 구성된 H3. Mich15 NA mRNA 및 3x 비-암호화 mRNA로 구성된 N1. Perth09 NA mRNA 및 3x 비-암호화 mRNA로 구성된 N2. 억제 역가는 상응하는 바이러스에 대해 0일, 14일, 28일, 42일에 수집된 혈청에서 테스트되었다. 패널 (a)는 CA09 H1N1 인플루엔자 바이러스 및 Sing16 H3N2에 대해 기록된 HAI 역가를 보여준다. 패널 (b)는 Mich15 (N1): A/Mallard/Sweden/2002 (H6) 키메라 인플루엔자 바이러스 및 H6N2 Perth/09 바이러스 F1919D (N2) 바이러스에 대해 기록된 NAI 역가를 보여준다.
도 24는 hEPO mRNA의 다양한 LNP 제형으로 처리된 마우스에서 인간 에리트로포이에틴(hEPO)의 발현을 나타내는 그래프를 도시한다. LNP 제형 “지질 A,” “지질 B,” “지질 C,” “지질 D,” 및 “지질 E”가 표시된다. 막대는 평균과 표준 편차를 나타낸다. LNP 조성물은 순서대로 40:1.5:28.5:30의 몰비율의 양이온성 지질, DMG-PEG2000, 콜레스테롤, 및 DOPE를 함유한다.
도 25는 hEPO mRNA의 다양한 LNP 제형으로 처리된 비-인간 영장류(NHP)에서 hEPO의 발현을 나타내는 그래프를 도시한다. LNP 제형 “지질 A,” “지질 B,” “지질 C,” “지질 D,” 및 “지질 E”가 표시된다. 막대는 평균과 표준 편차를 나타낸다. LNP 조성물은 순서대로 40:1.5:28.5:30의 몰비율의 양이온성 지질, DMG-PEG2000, 콜레스테롤, 및 DOPE를 함유한다.
도 26은 HA mRNA의 다양한 LNP 제형을 주사한 후 28일 및 42일에 HAI 역가를 나타내는 그래프를 도시한다. LNP 제형 “지질 A,” “지질 B,” “지질 C,” “지질 D,” 및 “지질 E”가 표시된다. 막대는 평균과 표준 편차를 나타낸다. LNP 조성물은 순서대로 40:1.5:28.5:30의 몰비율의 양이온성 지질, DMG-PEG2000, 콜레스테롤, 및 DOPE를 함유한다.
도 27은 HA mRNA의 다양한 LNP 제형을 주사한 후 28일 및 42일에 Cal09 H1 HAI 역가를 나타내는 그래프를 도시한다. LNP 제형 “지질 A,” “지질 B,” “지질 C,” “지질 D,” 및 “지질 E”가 표시된다. 막대는 평균과 표준 편차를 나타낸다. LNP 조성물은 순서대로 40:1.5:28.5:30의 몰비율의 양이온성 지질, DMG-PEG2000, 콜레스테롤, 및 DOPE를 함유한다.
도 28은 HA mRNA의 다양한 LNP 제형을 주사한 후 28일 및 42일에 Sing16 H3 HAI 역가를 나타내는 그래프를 도시한다. LNP 제형 “지질 A,” “지질 B,” “지질 C,” “지질 D,” 및 “지질 E”가 표시된다. 막대는 평균과 표준 편차를 나타낸다. LNP 조성물은 순서대로 40:1.5:28.5:30의 몰비율의 양이온성 지질, DMG-PEG2000, 콜레스테롤, 및 DOPE를 함유한다.
도 29는 4개의 상이한 인플루엔자 균주에 대해 마우스에 투여된 4가 및 8가 mRNA-LNP 백신에 대한 HAI 역가를 도시한다.
도 30은 4개의 상이한 인플루엔자 균주에 대해 흰담비에 투여된 4가 및 8가 mRNA-LNP 백신에 대한 HINT 값을 도시한다.
도 31은 4개의 상이한 인플루엔자 균주에 대해 마우스에 투여된 4가 및 8가 mRNA-LNP 백신에 대한 NAI 역가를 도시한다.
도 32는 4개의 상이한 인플루엔자 균주에 대해 흰담비에 투여된 4가 및 8가 mRNA-LNP 백신에 대한 NAI 역가를 도시한다. 백신의 두 번째 투여 후 20일(D20)에 샘플을 얻었다.
도 33은 4개의 상이한 인플루엔자 균주에 대해 흰담비에 투여된 4가 및 8가 mRNA-LNP 백신에 대한 NAI 역가를 도시한다. 백신의 두 번째 투여 후 42일(D42)에 샘플을 얻었다.
본 개시내용은 mRNA 백신을 생체내 전달하기 위한 신규 지질 나노입자(LNP) 제형 및 백신 제조 방법을 제공한다. LNP는 4가지 지질의 혼합물로 제조된다: 양이온성 지질, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-공액 지질, 콜레스테롤계 지질, 및 헬퍼 지질. LNP는 mRNA 분자를 캡슐화한다. 캡슐화된 mRNA 분자는 천연-발생 리보뉴클레오티드, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있고, 하나 이상의 단백질을 각각 또는 집합적으로 암호화할 수 있다.
본 발명자들은 지질 성분의 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 본 제형을 발견하였다. 본 LNP는 분해로부터 mRNA 페이로드를 캡슐화 및 보호하고, 캡슐화된 mRNA의 세포 흡수를 용이하게 한다. 본원에 기재된 LNP는 개선된 형질감염 효율을 갖고, mRNA의 엔도솜 탈출을 촉진하며, 결과적으로, 문헌에 기술된 산업적 제형과 비교할 때 생체내 및 시험관내 향상된 발현에 의해 입증된 바와 같이 개선된 효능을 갖는다. 예를 들어, 본원에 개시된 LNP는 공지된 LNP, 예를 들어, 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3로도 공지됨; Semple et al., Nat Biotechnol. (2010) 28:172-6) 또는 디((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시) 헵타데칸디오에이트(L319로도 공지됨; Maier et al., Mol Ther. (2013) 21(8):1570-8)와 비교하여 우수한 안정성 및/또는 효능 프로필을 갖는다. 하기에 추가로 기재된 바와 같이, hEPO를 암호화하는 mRNA를 캡슐화하는 본 제형은, 생체내 전달될 때 산업 표준, MC3 LNP 제형에 비해 최대 12배 증가하여 6시간 및 24시간에 혈액에서 순환하는 에리스로포이에틴의 높은 수준을 유도하였다. 유사하게, 뮤린 및 비인간 영장류 모델 모두에서 인플루엔자 항원을 암호화하는 것과 같은 다른 mRNA에서 높은 효능이 발견되었다.
본원에서 제형화된 mRNA 백신은 세포성 및 체액성 면역 모두를 포함하는 균형된 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 본 LNP 제형의 이점은 서열-특이적이지 않기 때문에, 이러한 제형은 다양한 항원을 암호화하는 mRNA를 전달하는 데 사용될 수 있어, 전염병 또는 팬데믹 상황에서 신속하게 배치할 수 있다. 또한, 본 LNP-제형화된 mRNA 백신은 매우 면역원성이고, 따라서 상당한 용량 절약 가능성을 제공한다.
I. 지질 나노입자(LNP)
본 개시내용의 LNP는 4가지 범주의 지질을 포함한다: (i) 이온화가능한 지질(예를 들어, 양이온성 지질); (ii) PEG화된 지질; (iii) 콜레스테롤계 지질, 및 (iv) 헬퍼 지질.
A. 이온화가능한 지질
이온화가능한 지질은 mRNA 캡슐화를 촉진하고, 양이온성 지질일 수 있다. 양이온성 지질은 낮은 pH에서 양전하 환경을 제공하여 음전하 mRNA 약물 물질의 효율적인 캡슐화를 용이하게 한다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 OF-02이다:
[화학식 I]
OF-02는 OF-Deg-Lin의 비분해성 구조적 유사체이다. OF-Deg-Lin은 디케토피페라진 코어와 이중-불포화 테일을 부착하기 위한 분해가능한 에스테르 결합을 함유하는 반면, OF-02는 동일한 디케토피페라진 코어와 이중-불포화 테일을 부착하기 위한 비분해성 1,2-아미노-알코올 결합을 함유한다(Fenton et al., Adv Mater. (2016) 28:2939; 미국 특허 제10,201,618호). 본원의 예시적인 LNP 제형인, 지질 A는 OF-2를 함유한다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 cKK-E10이다(Dong et al., PNAS (2014) 111(11):3955-60; 미국 특허 제9,512,073호):
cKK-E10
[화학식 II]
본원의 예시적인 LNP 제형인, 지질 B는 cKK-E10을 함유한다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1 (2-(4-(2-((3-(비스((Z)-2-하이드록시옥타덱-9-엔-1-일)아미노)프로필)디설파네일)에틸)피페라진-1-일)에틸 4-(비스(2-하이드록시데실)아미노)부타노에이트)이며, 이는 화학식 III을 갖는 피페라진 코어를 갖는 HEPES-기반 디설파이드 양이온성 지질이다:
[화학식 III]
본원의 예시적인 LNP 제형인, 지질 C는 GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1을 함유한다. 지질 C는 지질 A 또는 지질 B와 동일한 조성을 갖지만, 양이온성 지질의 차이가 있다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10 (2-(4-(2-((4-(비스(2-하이드록시데실)아미노)부틸)디설파네일)에틸)피페라진-1-일)에틸 4-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)부타노에이트)이며, 이는 화학식 IV를 갖는 피페라진 코어를 갖는 HEPES-기반 디설파이드 양이온성 지질이다:
[화학식 IV]
본원의 예시적인 LNP 제형인, 지질 D는 GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10을 함유한다. 지질 D는 지질 A 또는 지질 B와 동일한 조성을 갖지만, 양이온성 지질의 차이가 있다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14 (2-(4-(2-((3-(비스(2-하이드록시테트라데실)아미노)프로필)디설파네일)에틸)피페라진-1-일)에틸 4-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)부타노에이트)이며, 이는 화학식 V를 갖는 피페라진 코어를 갖는 HEPES-기반 디설파이드 양이온성 지질이다:
[화학식 V]
본원의 예시적인 LNP 제형인, 지질 E는 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14를 함유한다. 지질 E는 지질 A 또는 지질 B와 동일한 조성을 갖지만, 양이온성 지질의 차이가 있다.
양이온성 지질 GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1(III), GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10(IV), 및 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14(V)는 반응식 1에 제시된 일반 절차에 따라 합성될 수 있다:
반응식 1: 화학식 III, IV, 및 V의 지질에 대한 일반 합성 반응식
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 화학식 VI을 갖는 MC3이다:
[화학식 VI]
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 화학식 VII을 갖는 SM-102(9-헵타데카닐 8-{(2-하이드록시에틸)[6-옥소-6-(운데실옥시)헥실]아미노}옥타노에이트)이다:
[화학식 VII]
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 화학식 VIII을 갖는 ALC-0315[(4-하이드록시부틸)아잔디일]디(헥산-6,1-디일) 비스(2-헥실데카노에이트)이다:
[화학식 VIII]
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 [ckkE10]/[OF-02], [(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일] 4-(디메틸아미노)부타노에이트(D-Lin-MC3-DMA); 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA); 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLin-DMA); 디((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L319); 9-헵타데카닐 8-{(2-하이드록시에틸)[6-옥소-6-(운데실옥시)헥실]아미노}옥타노에이트(SM-102); [(4-하이드록시부틸)아잔디일]디(헥산-6,1-디일) 비스(2-헥실데카노에이트)(ALC-0315); [3-(디메틸아미노)-2-[(Z)-옥타덱-9-에노일]옥시프로필] (Z)-옥타덱-9-에노에이트(DODAP); 2,5-비스(3-아미노프로필아미노)-N-[2-[디(헵타데실)아미노]-2-옥소에틸]펜탄아미드(DOGS); [(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-[(2R)-6-메틸헵탄-2-일]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-도데카하이드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일] N-[2-(디메틸아미노)에틸]카르바메이트(DC-Chol); 테트라키스(8-메틸노닐) 3,3',3",3"'-(((메틸아잔디일) 비스(프로판-3,1 디일))비스 (아잔트리일))테트라프로피오네이트(306Oi10); 데실 (2-(디옥틸암모니오)에틸) 포스페이트(9A1P9); 에틸 5,5-디((Z)-헵타덱-8-엔-1-일)-1-(3-(피롤리딘-1-일)프로필)-2,5-디하이드로-1H-이미다졸-2-카르복실레이트(A2-Iso5-2DC18); 비스(2-(도데실디술파닐)에틸) 3,3'-((3-메틸-9-옥소-10-옥사-13,14-디티아-3,6-디아자헥사코실)아잔디일)디프로피오네이트(BAME-O16B); 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸) (2-하이드록시도데실)아미노)에틸) 피페라진-1-일)에틸)아잔디일) 비스(도데칸-2-올)(C12-200); 3,6-비스(4-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)부틸)피페라진-2,5-디온(cKK-E12); 헥사(옥탄-3-일) 9,9',9",9"',9"",9"'"-((((벤젠-1,3,5-트리카르보닐)이리스(아잔디일)) 트리스(프로판-3,1-디일)) 트리스(아잔트리일))헥사노나노에이트(FTT5); (((3,6-디옥소피페라진-2,5-디일)비스(부탄-4,1-디일))비스(아잔트리일))테트라키스(에탄-2,1-디일)(9Z,9'Z,9"Z,9"'Z,12Z,12'Z,12"Z,12"'Z)-테트라키스 (옥타데카-9,12-디에노에이트)(OF-Deg-Lin); TT3; N1,N3,N5-트리스(3-(디도데실아미노)프로필)벤젠-1,3,5-트리카르복사미드; N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노프로필)아미노]부틸카르복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤즈아미드(MVL5); 헵타데칸-9-일 8-((2-하이드록시에틸)(8-(노닐옥시)-8-옥소옥틸)아미노)옥타노에이트(지질 5); 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 생분해성이다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 생분해성이 아니다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 절단 가능하다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 절단 가능하지 않다.
양이온성 지질은 문헌[Dong et al. (PNAS. 111(11):3955-60. 2014)]; 문헌[Fenton et al. (Adv Mater. 28:2939. 2016)]; 미국 특허 제9,512,073호; 및 미국 특허 제10,201,618호에 더 상세하게 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
B. PEG화된 지질
PEG화된 지질 성분은 나노입자의 입자 크기 및 안정성에 대한 제어를 제공한다. 그러한 성분의 첨가는 복잡한 응집을 방지할 수 있고, 순환 수명을 증가시키고 표적 조직으로의 지질-핵산 약제학적 조성물의 전달을 증가시키는 수단을 제공할 수 있다(문헌[Klibanov et al. FEBS Letters 268(1):235-7. 1990]). 이들 성분은 생체내에서 약제학적 조성물로부터 빠르게 교환되도록 선택될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,885,613호 참조).
고려되는 PEG화된 지질은 C6-C20 (예를 들어, C8, C10, C12, C14, C16, 또는 C18) 길이의 알킬 사슬(들)을 갖는 지질에 공유 부착된 최대 5 kDa 길이의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 사슬, 예컨대 유도체화된 세라마이드(예를 들어, N-옥타노일-스핑고신-1-[숙시닐(메톡시폴리에틸렌 글리콜)] (C8 PEG 세라마이드))를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, PEG화된 지질은 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜(DSPE-PEG); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜(DLPE-PEG); 또는 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-폴리에틸렌 글리콜(DSG-PEG), PEG-DAG; PEG-PE; PEG-S-DAG; PEG-S-DMG; PEG-cer; PEG-디알콕시프로필카르바메이트; 2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드(ALC-0159); 및 이들의 조합이다.
특정 구현예에서, PEG는 고분자량, 예를 들어, 2000~2400 g/mol을 갖는다. 특정 구현예에서, PEG는 PEG2000(또는 PEG-2K)이다. 특정 구현예에서, 본원의 PEG화된 지질은 DMG-PEG2000, DSPE-PEG2000, DLPE-PEG2000, DSG-PEG2000, C8 PEG2000, 또는 ALC-0159(2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드)이다. 특정 구현예에서, 본원의 PEG화된 지질은 DMG-PEG2000이다.
C. 콜레스테롤계 지질
콜레스테롤 성분은 나노입자 내의 지질 이중층 구조에 안정성을 제공한다. 일부 구현예에서, LNP는 하나 이상의 콜레스테롤계 지질을 포함한다. 적합한 콜레스테롤계 지질은 예를 들어: DC-Choi (N,N-디메틸-N-에틸카르복사미도콜레스테롤), l,4-비스(3-N-올레일아미노-프로필)피페라진(문헌[Gao et al., Biochem Biophys Res Comm. (1991) 179:280]; [Wolf et al., BioTechniques (1997) 23:139]; 미국 특허 제5,744,335호), 이미다졸 콜레스테롤 에스테르("ICE"; WO2011/068810), 시토스테롤(22,23-디하이드로스티그마스테롤), β-시토스테롤, 시토스타놀, 푸코스테롤, 스티그마스타롤(스티그마스타-5,22-디엔-3-올), 에르고스테롤; 데스모스테롤(3β-히드록시-5,24-콜레스타디엔); 라노스테롤(8,24-라노스타디엔-3b-올); 7-데하이드로콜레스테롤(Δ5,7-콜레스테롤); 디하이드로라노스테롤(24,25-디하이드로라노스테롤); 자이모스테롤(5α-콜레스타-8,24-디엔-3β-올); 라토스테롤(5α-콜레스트-7-엔-3β-올); 디오스게닌((3β,25R)-스피로스트-5-엔-3-올); 캄페스테롤(캄페스트-5-엔-3β-올); 캄페스타놀(5a-캄페스탄-3b-올); 24-메틸렌 콜레스테롤(5,24(28)-콜레스타디엔-24-메틸렌-3β-올); 콜레스테릴 마가레이트(콜레스트-5-엔-3β-일 헵타데카노에이트); 콜레스테릴 올리에이트; 콜레스테롤 스테아레이트 및 기타 변형된 형태의 콜레스테롤을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP에 사용되는 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤이다.
D. 헬퍼 지질
헬퍼 지질은 LNP의 구조적 안정성을 향상시키고, 엔도좀 탈출에서 LNP를 돕는다. 그것은 mRNA 약물 페이로드의 흡수 및 방출을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 약물 페이로드의 흡수 및 방출을 향상시키기 위한 융해성 특성들을 갖는 양쪽이온성 지질이다. 헬퍼 지질의 예는 1,2-디올레오일-SN-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(DOPS); 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DEPE); 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPOC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), DMPC, 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 및 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE)이다.
다른 예시적인 헬퍼 지질은 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-l-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 포스파티딜세린, 스핑고지질, 스핑고미엘린, 세라마이드, 세레브로시드, 강글리오시드, 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, l-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민(SOPE), 또는 이들의 조합이다. 특정 구현예에서, 헬퍼 지질은 DOPE이다. 특정 구현예에서, 헬퍼 지질은 DSPC이다.
다양한 구현예에서, 본 LNP는 (i) OF-02, cKK-E10, GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1, GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10, 또는 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14로부터 선택된 양이온성 지질; (ii) DMG-PEG2000; (iii) 콜레스테롤; 및 (iv) DOPE를 포함한다.
E. 지질 성분의 몰비율
상기 성분들의 몰비율은 mRNA 전달에서 LNP의 유효성에 중요하다. 양이온성 지질, PEG화된 지질, 콜레스테롤계 지질, 및 헬퍼 지질의 몰비율은 A: B: C: D이며, 여기서 A + B + C + D = 100%이다. 일부 구현예에서, 전체 지질에 대한 LNP내 양이온성 지질(즉, A)의 몰비율은 35~55%, 예컨대 35~50%(예를 들어, 38~42%, 예컨대 40%, 또는 45~50%)이다. 일부 구현예에서, 전체 지질에 대한 PEG화된 지질 성분(즉, B)의 몰비율은 0.25~2.75%(예를 들어, 1~2% 예컨대 1.5%)이다. 일부 구현예에서, 전체 지질에 대한 콜레스테롤계 지질(즉, C)의 몰비율은 20~50%(예를 들어, 27~30% 예컨대 28.5%, 또는 38~43%)이다. 일부 구현예에서, 전체 지질에 대한 헬퍼 지질(즉, D)의 몰비율은 5~35%(예를 들어, 28~32%, 예컨대 30%, 또는 8~12%, 예컨대 10%)이다. 일부 구현예에서, (PEG화된 지질 + 콜레스테롤) 성분은 헬퍼 지질과 동일한 몰량을 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 1보다 큰 헬퍼 지질에 대한 양이온성 지질의 몰비율을 함유한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 LNP는
35% 내지 55% 또는 40% 내지 50%의 몰비율의 양이온성 지질(예를 들어, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41% 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 또는 55%의 몰비율의 양이온성 지질);
0.25% 내지 2.75% 또는 1.00% 내지 2.00%의 몰비율의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 공액 (PEG화된) 지질(예를 들어, 0.25%, 0.50%, 0.75%, 1.00%, 1.25%, 1.50%, 1.75%, 2.00%, 2.25%, 2.50%, 또는 2.75%의 몰비율의 PEG화된 지질);
20% 내지 50%, 25% 내지 45%, 또는 28.5% 내지 43%의 몰비율의 콜레스테롤계 지질(예를 들어, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41% 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 또는 50%의 몰비율의 콜레스테롤계 지질); 및
5% 내지 35%, 8% 내지 30%, 또는 10% 내지 30%의 몰비율의 헬퍼 지질(예를 들어, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 또는 35%의 몰비율의 헬퍼 지질)을 포함하고,
여기서 모든 몰비율은 LNP의 총 지질 함량에 상대적이다.
특정 구현예에서, LNP는 40%의 몰비율의 양이온성 지질; 1.5%의 몰비율의 PEG화된 지질; 28.5%의 몰비율의 콜레스테롤계 지질; 및 30%의 몰비율의 헬퍼 지질을 포함한다.
특정 구현예에서, PEG화된 지질은 디미리스토일-PEG2000(DMG-PEG2000)이다.
다양한 구현예에서, 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤이다.
일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 1,2-디올레오일-SN-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이다.
특정 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비율의 OF-02; 0.25% 내지 2.75%의 몰비율의 DMG-PEG2000; 20% 내지 50%의 몰비율의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비율의 DOPE를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비율의 cKK-E10; 0.25% 내지 2.75%의 몰비율의 DMG-PEG2000; 20% 내지 50%의 몰비율의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비율의 DOPE를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비율의 GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1; 0.25% 내지 2.75%의 몰비율의 DMG-PEG2000; 20% 내지 50%의 몰비율의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비율의 DOPE를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비율의 GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10; 0.25% 내지 2.75%의 몰비율의 DMG-PEG2000; 20% 내지 50%의 몰비율의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비율의 DOPE를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비율의 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14; 0.25% 내지 2.75%의 몰비율의 DMG-PEG2000; 20% 내지 50%의 몰비율의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비율의 DOPE를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비율의 SM-102; 0.25% 내지 2.75%의 몰비율의 DMG-PEG2000; 20% 내지 50%의 몰비율의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비율의 DSPC를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비율의 ALC-0315; 0.25% 내지 2.75%의 몰비율의 ALC-0159; 20% 내지 50%의 몰비율의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비율의 DSPC를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 40%의 몰비율의 OF-02; 1.5%의 몰비율의 DMG-PEG2000; 28.5%의 몰비율의 콜레스테롤; 및 30%의 몰비율의 DOPE를 포함한다. 이 LNP 제형은 본원에서 "지질 A"로 명명된다.
특정 구현예에서, LNP는 40%의 몰비율의 cKK-E10; 1.5%의 몰비율의 DMG-PEG2000; 28.5%의 몰비율의 콜레스테롤; 및 30%의 몰비율의 DOPE를 포함한다. 이 LNP 제형은 본원에서 "지질 B"로 명명된다.
특정 구현예에서, LNP는 40%의 몰비율의 GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1; 1.5%의 몰비율의 DMG-PEG2000; 28.5%의 몰비율의 콜레스테롤; 및 30%의 몰비율의 DOPE를 포함한다. 이 LNP 제형은 본원에서 "지질 C"로 명명된다.
특정 구현예에서, LNP는 (40%의 몰비율의 GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10; 1.5%의 몰비율의 DMG-PEG2000; 28.5%의 몰비율의 콜레스테롤; 및 30%의 몰비율의 DOPE를 포함한다. 이 LNP 제형은 본원에서 "지질 D"로 명명된다.
특정 구현예에서, LNP는 40%의 몰비율의 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14; 1.5%의 몰비율의 DMG-PEG2000; 28.5%의 몰비율의 콜레스테롤; 및 30%의 몰비율의 DOPE를 포함한다. 이 LNP 제형은 본원에서 "지질 E"로 명명된다.
특정 구현예에서, LNP는 50%의 몰비율의 9-헵타데카닐 8-{(2-하이드록시에틸)[6-옥소-6-(운데실옥시)헥실]아미노}옥타노에이트(SM-102); 10%의 몰비율의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 38.5%의 몰비율의 콜레스테롤; 및 1.5%의 몰비율의 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2000)을 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 46.3%의 몰비율의 (4-하이드록시부틸)아잔디일]디(헥산-6,1-디일) 비스(2-헥실데카노에이트)(ALC-0315); 9.4%의 몰비율의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 42.7%의 몰비율의 콜레스테롤; 및 1.6%의 몰비율의 2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드(ALC-0159)를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 47.4%의 몰비율의 (4-하이드록시부틸)아잔디일]디(헥산-6,1-디일) 비스(2-헥실데카노에이트)(ALC-0315); 10%의 몰비율의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 40.9%의 몰비율의 콜레스테롤; 및 1.7%의 몰비율의 2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드(ALC-0159)를 포함한다.
LNP 제형에 투입될 각각의 지질의 실제 양을 계산하기 위해, 양이온성 지질의 몰량은 먼저 원하는 N/P 비율에 기초하여 결정되며, 여기서 N은 양이온성 지질에서 질소 원자의 수이며, P는 LNP에 의해 수송되는 mRNA의 인산기의 수이다. 다음으로, 각각의 다른 지질의 몰량은 양이온성 지질의 몰량과 선택된 몰비율에 기초하여 계산된다. 그런 다음, 이러한 몰량은 각 지질의 분자량을 사용하여 중량으로 변환된다
F. LNP의 활성 성분
본 LNP 백신 조성물의 활성 성분은 인플루엔자 항원을 암호화하는 mRNA이다.
필요한 경우, LNP는 다가일 수 있다. 일부 구현예에서, LNP는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 항원과 같은 1개 초과의 인플루엔자 항원을 암호화하는 mRNA를 운반할 수 있다. 예를 들어, LNP는 각각 다른 인플루엔자 항원을 암호화하는 여러 mRNA를 운반할 수 있거나; 하나 초과의 인플루엔자 항원으로 번역될 수 있는 폴리시스트론 mRNA를 운반할 수 있다(예를 들어, 각각의 항원-암호화 서열은 2A 펩티드와 같은 자가-절단 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 링커에 의해 분리된다). 상이한 mRNA를 운반하는 LNP는 전형적으로 각 mRNA의 다중 복제본을 포함(캡슐화)한다. 예를 들어, 2개의 다른 mRNA를 운반하거나 캡슐화하는 LNP는 전형적으로 2개의 다른 mRNA 각각의 여러 복제본을 운반한다.
일부 구현예에서, 단일 LNP 제형은 여러 종류(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)의 LNP를 포함할 수 있으며, 각각의 종류는 상이한 mRNA를 운반한다.
일부 구현예에서, 다가 LNP 백신은 헤마글루티닌(예를 들어, 헤마글루티닌 1(HA1) 및 헤마글루티닌 2(HA2)), 뉴라미니다제(NA), 핵단백질(NP), 기질 단백질 1(M1), 기질 단백질 2(M2), 비구조 단백질 1(NS1), 및 비구조 단백질 2(NS2)로부터 선택되는 8개의 인플루엔자 바이러스 단백질로부터 유래되는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA 분자를 함유한다. 추가 구현예에서, 다가 LNP 백신은 HA 단백질로부터, NA 단백질로부터, 및 HA 및 NA 단백질 둘 다로부터 유래되는 항원성 폴리펩티드를 암호화하는 8개의 mRNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 항원성 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA는 상이한 인플루엔자 균주로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 조성물은 인플루엔자 A, B 및 C 바이러스들의 항원을 암호화하는 하나 이상의 mRNA를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 조성물은 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스들의 HA 및/또는 NA 항원을 암호화하는 하나 이상의 mRNA를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 인플루엔자 A 바이러스들의 HA 항원은 아형 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17, 및 H18로부터 선택된다. 한 구현예에서, 인플루엔자 A 바이러스들의 NA 항원은 아형 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, N10, 및 N11로부터 선택된다. 한 구현예에서, 인플루엔자 B 바이러스들의 HA 및 NA 항원은 인플루엔자 B/야마가타(Yamagata) 계통에서 유래한다. 한 구현예에서, 인플루엔자 B 바이러스들의 HA 및 NA 항원은 인플루엔자 B/빅토리아(Victoria) 계통에서 유래한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 HA 및 NA 항원은 인플루엔자 백신 제형에 대한 연간 권장사항에서 세계 보건 기구(WHO)에 의해 권장되는 인플루엔자 바이러스 균주로부터 유래한다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 단백질 중 적어도 하나는 기계 학습 모델로부터 식별되거나 설계된 분자 서열을 갖는 인플루엔자 바이러스 HA 단백질 및/또는 인플루엔자 바이러스 NA 단백질을 포함하며, 특정 구현예에서, 하나 이상의 리보핵산 분자 중 적어도 하나는 기계 학습 모델로부터 식별되거나 설계된 분자 서열을 갖는 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 단백질을 암호화한다.
한 구현예에서, 조성물은 H3 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, H1 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, 인플루엔자 B/야마가타 계통으로부터의 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, 및 인플루엔자 B/빅토리아 계통으로부터의 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA를 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 H3 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, N2 NA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, H1 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, N1 NA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, 인플루엔자 B/야마가타 계통으로부터의 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, 인플루엔자 B/야마가타 계통으로부터의 NA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, 인플루엔자 B/빅토리아 계통으로부터의 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, 및 인플루엔자 B/빅토리아 계통으로부터의 NA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA를 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 기계 학습 모델로부터 식별되거나 설계된 분자 서열을 갖는 기계 학습 인플루엔자 바이러스 HA를 암호화하는 하나 이상의 mRNA를 추가로 포함하며, 여기서 하나 이상의 기계 학습 인플루엔자 바이러스 HA는 H1 HA, H3 HA, B/빅토리아 계통으로부터의 HA, B/야마가타 계통으로부터의 HA, 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
하나 이상의 기계 학습 인플루엔자 바이러스 HA를 선택할 때, 임의의 기계 학습 알고리즘이 사용될 수 있다. 예를 들어, 발명의 명칭이 Systems and Methods for Designing Vaccines인, PCT 출원번호 WO 2021/080990 A1 및 발명의 명칭이 Systems and Methods for Predicting Biological Responses인, WO 2021/080999 A1에 개시된 임의의 기계 학습 알고리즘 및 방법들이 본원에 구상되어 있으며, 이들은 모두 본원에 그 전체가 참조로 포함된다.
mRNA는 변형되지 않을 수 있거나(즉, 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 천연 리보뉴클레오티드 A, U, C, 및/또는 G만을 함유함), 또는 화학적으로 변형될 수 있다(예를 들어, 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 슈도우리딘(예를 들어, N-1-메틸 슈도우리딘), 2’-플루오로 리보뉴클레오티드, 및 2’-메톡시 리보뉴클레오티드, 및/또는 포스포로티오에이트 결합을 포함함). mRNA 분자는 5’ 캡 및 폴리A 테일을 포함할 수 있다.
G. 완충액 및 다른 성분들
핵산 및/또는 LNP를 안정화하기 위해 (예를 들어, 백신 제품의 유통기한을 연장하기 위해), LNP 약제학적 조성물의 투여를 용이하게 하기 위해, 및/또는 핵산의 생체내 발현을 향상시키기 위해, 핵산 및/또는 LNP는 하나 이상의 담체, 표적 리간드, 안정화 시약(예를 들어, 보존제 및 항산화제), 및/또는 기타 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께 제형화될 수 있다. 이러한 부형제의 예는 파라벤, 티메로살, 티오메르살, 클로로부탄올, 염화베잘코늄 및 킬레이트제(예를 들어, EDTA)이다.
본 개시내용의 LNP 조성물은 냉동 액체 형태 또는 동결건조 형태로 제공될 수 있다. 수크로스, 트레할로스, 글루코스, 만니톨, 만노스, 덱스트로스 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 동결방지제가 사용될 수 있다. 동결방지제는 LNP 조성물의 5~30% (w/v)를 구성할 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 조성물은 예를 들어, 5~30%(예를 들어, 10%)(w/v)의 트레할로스를 포함한다. 일단 동결방지제로 제형화되면, LNP 조성물은 -20℃ 내지 -80℃에서 동결(또는 동결건조 및 동결보존)될 수 있다.
LNP 조성물은 완충 수용액으로 환자에게 제공될 수 있다 - 이전에 동결된 경우 해동되거나, 이전에 동결건조된 경우 병상에서 완충 수용액으로 재구성된다. 완충 용액은 바람직하게는 등장성이고, 예를 들어 근육내 또는 피내 주사에 적합하다. 일부 구현예에서, 완충 용액은 인산염-완충 식염수(PBS)이다.
II. RNA
본 개시내용의 본 LNP 백신 조성물은 관심 항원을 암호화하는 RNA 분자 (예를 들어, mRNA)를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 RNA 분자는 관심 항원을 암호화하는 ORF를 포함하는 적어도 하나의 리보핵산(RNA)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, RNA는 관심 항원을 암호화하는 ORF를 포함하는 메신저 RNA(mRNA)이다. 특정 구현예에서, RNA(예를 들어, mRNA)는 적어도 하나의 5’ UTR, 3’ UTR, 폴리(A) 테일, 및/또는 5’ 캡을 추가로 포함한다.
II. A. 5’ 캡
mRNA 5’ 캡은 대부분의 진핵 세포에서 발견되는 뉴클레아제에 대한 저항성을 제공하고, 번역 효율을 촉진할 수 있다. 여러 유형의 5’ 캡이 알려져 있다. 7-메틸구아노신 캡(“m7G” 또는 “캡-0”이라고도 함)은 5’ - 5’ - 삼인산 결합을 통해 첫 번째 전사된 뉴클레오티드에 연결된 구아노신을 포함한다.
5' 캡은 전형적으로 다음과 같이 추가된다: 첫째, RNA 말단 포스파타제는 5’ 뉴클레오티드로부터 말단 인산염 기들 중 하나를 제거하여, 2개의 말단 인산염을 남기고; 구아노신 삼인산염(GTP)은 구아닐릴 트랜스퍼라제를 통해 말단 인산염에 추가되어, 5 ‘5 ‘5 삼인산 연결을 생성하고; 그런 다음, 구아닌의 7-질소는 메틸트랜스퍼라제에 의해 메틸화된다. 캡 구조의 예는 m7G(5’)ppp, (5’(A,G(5’)ppp(5’)A, 및 G(5’)ppp(5’)G을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 추가 캡 구조는 미국 공개 번호 US 2016/0032356 및 미국 공개 번호 US 2018/0125989에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다.
폴리뉴클레오티드의 5'-캡핑은 하기 화학적 RNA 캡 유사체를 사용하여 시험관내-전사 반응 동안 부수적으로 완료되어 제조업체 프로토콜에 따라 5’-구아노신 캡 구조를 생성할 수 있다: 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G(ARCA 캡); G(5’)ppp(5’)A; G(5’)ppp(5’)G; m7G(5’)ppp(5’)A; m7G(5’)ppp(5’)G; m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG; m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU; m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG(New England BioLabs, Ipswich, MA; TriLink Biotechnologies). 변형된 RNA의 5’-캡핑은 백시니아 바이러스 캡핑 효소를 사용하여 전사 후 완료되어, 캡 0 구조: m7G(5’)ppp(5’)G를 생성할 수 있다. 캡 1 구조는 백시니아 바이러스 캡핑 효소 및 2’-O 메틸-트랜스퍼라제를 모두 사용하여 생성되어: m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-메틸을 생성할 수 있다. 캡 2 구조는 2’-O 메틸-트랜스퍼라제를 사용하여 5’-끝에서 세번째 뉴클레오티드의 2’-O-메틸화가 뒤따르는 캡 1 구조로부터 생성될 수 있다. 캡 3 구조는 2’-O 메틸-트랜스퍼라제를 사용하여 5’-끝에서 네번째 뉴클레오티드의 2’-O-메틸화가 뒤따르는 캡 2 구조로부터 생성될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 mRNA는 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G (ARCA 캡), G(5’)ppp(5’)A, G(5’)ppp(5’)G, m7G(5’)ppp(5’)A, m7G(5’)ppp(5’)G, m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU, 및 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG로 이루어진 군으로부터 선택되는 5’ 캡을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 mRNA는 하기의 5’ 캡을 포함한다:
.
II. B. 비번역 영역(UTR)
일부 구현예에서, 본 개시내용의 mRNA는 5’ 및/또는 3’ 비번역 영역(UTR)을 포함한다. mRNA에서, 5’ UTR은 전사 시작 부위에서 시작하여 시작 코돈까지 계속되지만, 시작 코돈을 포함하지 않는다. 3’ UTR은 정지 코돈 바로 다음에서 시작하여 전사 종료 신호까지 계속한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 mRNA는 mRNA의 안정성 또는 번역에 영향을 미치는 하나 이상의 요소를 포함하는 5’ UTR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 5’ UTR은 약 10 내지 5,000개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 5’ UTR은 약 50 내지 500개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 5’ UTR은 적어도 약 10개 뉴클레오티드 길이, 약 20개 뉴클레오티드 길이, 약 30개 뉴클레오티드 길이, 약 40개 뉴클레오티드 길이, 약 50개 뉴클레오티드 길이, 약 100개 뉴클레오티드 길이, 약 150개 뉴클레오티드 길이, 약 200개 뉴클레오티드 길이, 약 250개 뉴클레오티드 길이, 약 300개 뉴클레오티드 길이, 약 350개 뉴클레오티드 길이, 약 400개 뉴클레오티드 길이, 약 450개 뉴클레오티드 길이, 약 500개 뉴클레오티드 길이, 약 550개 뉴클레오티드 길이, 약 600개 뉴클레오티드 길이, 약 650개 뉴클레오티드 길이, 약 700개 뉴클레오티드 길이, 약 750개 뉴클레오티드 길이, 약 800개 뉴클레오티드 길이, 약 850개 뉴클레오티드 길이, 약 900개 뉴클레오티드 길이, 약 950개 뉴클레오티드 길이, 약 1,000개 뉴클레오티드 길이, 약 1,500개 뉴클레오티드 길이, 약 2,000개 뉴클레오티드 길이, 약 2,500개 뉴클레오티드 길이, 약 3,000개 뉴클레오티드 길이, 약 3,500개 뉴클레오티드 길이, 약 4,000개 뉴클레오티드 길이, 약 4,500개 뉴클레오티드 길이 또는 약 5,000개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 mRNA는 하나 이상의 폴리아데닐화 신호를 포함하는 3’ UTR, mRNA의 세포내 위치 안정성에 영향을 미치는 단백질에 대한 결합 부위, 또는 miRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 3’ UTR은 50 내지 5,000개 뉴클레오티드 길이 또는 그 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 3’ UTR은 50 내지 1,000개 뉴클레오티드 길이 또는 그 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 3’ UTR은 적어도 약 50개 뉴클레오티드 길이, 약 100개 뉴클레오티드 길이, 약 150개 뉴클레오티드 길이, 약 200개 뉴클레오티드 길이, 약 250개 뉴클레오티드 길이, 약 300개 뉴클레오티드 길이, 약 350개 뉴클레오티드 길이, 약 400개 뉴클레오티드 길이, 약 450개 뉴클레오티드 길이, 약 500개 뉴클레오티드 길이, 약 550개 뉴클레오티드 길이, 약 600개 뉴클레오티드 길이, 약 650개 뉴클레오티드 길이, 약 700개 뉴클레오티드 길이, 약 750개 뉴클레오티드 길이, 약 800개 뉴클레오티드 길이, 약 850개 뉴클레오티드 길이, 약 900개 뉴클레오티드 길이, 약 950개 뉴클레오티드 길이, 약 1,000개 뉴클레오티드 길이, 약 1,500개 뉴클레오티드 길이, 약 2,000개 뉴클레오티드 길이, 약 2,500개 뉴클레오티드 길이, 약 3,000개 뉴클레오티드 길이, 약 3,500개 뉴클레오티드 길이, 약 4,000개 뉴클레오티드 길이, 약 4,500개 뉴클레오티드 길이, 또는 약 5,000개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 mRNA는 mRNA 전사물에 의해 암호화된 유전자와 구별되는 유전자로부터 유래된 5’ 또는 3’ UTR을 포함할 수 있다(즉, UTR은 이종 UTR임).
특정 구현예에서, 5’ 및/또는 3’ UTR 서열은 안정한 mRNA(예를 들어, 글로빈, 액틴, GAPDH, 튜불린, 히스톤 또는 시트르산 사이클 효소)로부터 유래되어 mRNA의 안정성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 5’ UTR 서열은 CMV 극초기 1(IE1) 유전자의 부분 서열, 또는 이의 단편을 포함하여, 뉴클레아제 저항성을 개선하고/하거나 mRNA의 반감기를 개선할 수 있다. 인간 성장 호르몬(hGH)을 암호화하는 서열, 또는 이의 단편을 mRNA의 3' 말단 또는 비번역 영역에 포함시키는 것도 고려된다. 일반적으로, 이러한 변형은 비변형 대응물에 비해 mRNA의 안정성 및/또는 약동학적 특성(예를 들어, 반감기)을 개선하고, 예를 들어 생체내 뉴클레아제 소화에 대한 이러한 mRNA 내성을 개선하기 위해 이루어진 변형을 포함한다.
예시적인 5’ UTR은 CMV 극초기 1(IE1) 유전자로부터 유래된 서열(미국 공개 번호 2014/0206753호 및 2015/0157565호, 이들 각각은 본원에 참고로 포함됨), 또는 서열 GGGAUCCUACC(서열번호 22)(미국 공개 번호 2016/0151409호, 본원에 참고로 포함됨)을 포함한다.
다양한 구현예에서, 5’ UTR은 TOP 유전자의 5’ UTR로부터 유래될 수 있다. TOP 유전자는 전형적으로 5’-말단 올리고피리미딘(TOP) 트랙트의 존재를 특징으로 한다. 또한, 대부분의 TOP 유전자는 성장-관련 번역 조절을 특징으로 한다. 그러나, 조직 특이적 번역 조절을 하는 TOP 유전자도 알려져 있다. 특정 구현예에서, TOP 유전자의 5’ UTR로부터 유래된 5’ UTR은 5’ TOP 모티프(올리고피리미딘 트랙트)가 결여되어 있다(예를 들어, 미국 공개 번호 2017/0029847호, 2016/0304883호, 2016/0235864호, 및 2016/0166710호, 이들 각각은 본원에 참고로 포함됨).
특정 구현예에서, 5’ UTR은 리보솜 단백질 Large 32 (L32) 유전자로부터 유래된다(미국 공개 번호 2017/0029847호, 위와 같음).
특정 구현예에서, 5’ UTR은 하이드록시스테로이드(17-b) 데하이드로게나제 4 유전자(HSD17B4)의 5’ UTR로부터 유래된다(미국 공개 번호 2016/0166710호, 위와 같음).
특정 구현예에서, 5’ UTR은 ATP5A1 유전자의 5’ UTR로부터 유래된다(미국 공개 번호 2016/0166710호, 위와 같음).
일부 구현예에서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES)는 5’ UTR 대신에 사용된다.
일부 구현예에서, 5’ UTR은 서열번호 19에 기재되고 하기에 재현된 핵산 서열을 포함한다:
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG (서열번호 19).
일부 구현예에서, 3’ UTR은 서열번호 20에 기재되고 하기에 재현된 핵산 서열을 포함한다:
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC (서열번호 20).
5’ UTR 및 3’ UTR은 본원에 참고로 포함된 WO2012/075040에 더 상세히 기재되어 있다.
II. C. 폴리아데닐화 테일
본원에 사용된 바와 같이, 용어들 “폴리(A) 서열,” “폴리(A) 테일,” 및 “폴리(A) 영역”은 mRNA 분자의 3’ 말단에 아데노신 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 폴리(A) 테일은 mRNA에 안정성을 부여하고 이를 엑소뉴클레아제 분해로부터 보호할 수 있다. 폴리(A) 테일은 번역을 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 본질적으로 단일중합체이다. 예를 들어, 100개의 아데노신 뉴클레오티드의 폴리(A) 테일은 본질적으로 100개의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리(A) 테일은 아데노신 뉴클레오티드와 상이한 적어도 하나의 뉴클레오티드(예를 들어, 아데노신 뉴클레오티드가 아닌 뉴클레오티드)에 의해 중단될 수 있다. 예를 들어, 100개 아데노신 뉴클레오티드의 폴리(A) 테일은 100개 초과의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다(100개의 아데노신 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 뉴클레오티드, 또는 아데노신 뉴클레오티드와 상이한 뉴클레오티드의 스트레치 포함). 특정 구현예에서, 폴리(A) 테일은 서열 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUGACUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (서열번호 23)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, “폴리(A) 테일”은 전형적으로 RNA에 관한 것이다. 그러나, 본 개시내용의 맥락에서, 용어는 마찬가지로 DNA 분자 내의 상응하는 서열(예를 들어, “폴리(T) 서열”)에 관한 것이다.
폴리(A) 테일은 약 10 내지 약 500개 아데노신 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 200개 아데노신 뉴클레오티드, 약 40 내지 약 200개 아데노신 뉴클레오티드, 또는 약 40 내지 약 150개 아데노신 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 폴리(A) 테일의 길이는 적어도 약 10, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개 아데노신 뉴클레오티드일 수 있다.
핵산이 RNA인 일부 구현예에서, 핵산의 폴리(A) 테일은 RNA 시험관내 전사 동안 DNA 주형으로부터 얻어진다. 특정 구현예에서, 폴리(A) 테일은 DNA 주형으로부터 전사되지 않고 일반적인 화학적 합성 방법에 의해 시험관 내에서 얻어진다. 다양한 구현예에서, 폴리(A) 테일은 상업적으로 입수가능한 폴리아데닐화 키트 및 상응하는 프로토콜을 사용한 RNA의 효소적 폴리아데닐화(RNA 시험관 내 전사 후)에 의해, 또는 대안적으로, 고정된 폴리(A)폴리머라제를 사용하여, 예를 들어, WO2016/174271에 기재된 바와 같은 방법 및 수단을 사용하여, 생성된다.
핵산은 효소적 폴리아데닐화에 의해 수득된 폴리(A) 테일을 포함할 수 있으며, 여기서 대부분의 핵산 분자는 약 100개 (+/-20) 내지 약 500개 (+/-50) 또는 약 250개 (+/-20) 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산은 주형 DNA로부터 유래된 폴리(A) 테일을 포함할 수 있고, 예를 들어, WO2016/091391에 기재된 바와 같이, 효소적 폴리아데닐화에 의해 생성된 적어도 하나의 추가의 폴리(A) 테일을 추가로 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 핵산은 적어도 하나의 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
다양한 구현예에서, 핵산은 적어도 하나의 폴리(C) 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “폴리(C) 서열”은 약 200개 이하의 시토신 뉴클레오티드의 시토신 뉴클레오티드의 서열인 것으로 의도된다. 일부 구현예에서, 폴리(C) 서열은 약 10 내지 약 200개 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 100개 시토신 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 70개 시토신 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 60개 시토신 뉴클레오티드, 또는 약 10 내지 약 40개 시토신 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(C) 서열은 약 30개의 시토신 뉴클레오티드를 포함한다.
II. D. 화학적 변형
본원에 개시된 mRNA는 변형되거나 변형되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 mRNA는 전형적으로 RNA 안정성을 향상시키는 하나 이상의 변형을 함유할 수 있다. 예시적인 변형은 백본 변형, 당 변형, 또는 염기 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 개시된 mRNA는 자연 발생 뉴클레오티드 및/또는 퓨린(아데닌(A) 및 구아닌(G)) 또는 피리미딘(티민(T), 시토신(C), 및 우라실(U))을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 뉴클레오티드 유사체(변형된 뉴클레오티드)로부터 합성될 수 있다. 특정 구현예에서, 개시된 mRNA는 퓨린 및 피리미딘의 변형된 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체, 예컨대, 예를 들어, 1-메틸-아데닌, 2-메틸-아데닌, 2-메틸티오-N-6-이소펜테닐-아데닌, N6-메틸-아데닌, N6-이소펜테닐-아데닌, 2-티오-시토신, 3-메틸-시토신, 4-아세틸-시토신, 5-메틸-시토신, 2,6-디아미노퓨린, 1-메틸-구아닌, 2-메틸-구아닌, 2,2-디메틸-구아닌, 7-메틸-구아닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 슈도우라실 (5-우라실), 디하이드로-우라실, 2-티오-우라실, 4-티오-우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오-우라실, 5-(카르복시하이드록시메틸)-우라실, 5-플루오로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-우라실, 5-메틸-2-티오-우라실, 5-메틸-우라실, N-우라실-5-옥시 아세트산 메틸 에스테르, 5-메틸아미노메틸-우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오-우라실, 5’-메톡시카르보닐메틸-우라실, 5-메톡시-우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 1-메틸-슈도우라실, 퀘오신, β-D-만노실-퀘오신, 포스포라미데이트, 포스포로티오에이트, 펩티드 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트, 7-데아자구아노신, 5-메틸시토신, 및 이노신으로부터 합성될 수 있다.
일부 구현예에서, 개시된 mRNA는 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4’-티오우리딘, 5-메틸시토신, 2-티오-l-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-l-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-l-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 및 2’-O-메틸 우리딘을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 5-메틸시토신, 5-메톡시우리딘, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 화학적 변형은 N1-메틸슈도우리딘을 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA에서 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%가 화학적으로 변형된다.
일부 구현예에서, ORF에서 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%가 화학적으로 변형된다.
이러한 유사체의 제조는 예를 들어, 미국 특허 제4,373,071호, 미국 특허 제4,401,796호, 미국 특허 제4,415,732호, 미국 특허 제4,458,066호, 미국 특허 제4,500,707호, 미국 특허 제4,668,777호, 미국 특허 제4,973,679호, 미국 특허 제5,047,524호, 미국 특허 제5,132,418호, 미국 특허 제5,153,319호, 미국 특허 제5,262,530호, 및 미국 특허 제5,700,642호에 기재되어 있다.
II. E. mRNA 합성
본원에 개시된 mRNA는 임의의 다양한 방법에 따라 합성될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용에 따른 mRNA는 시험관내 전사(IVT)를 통해 합성될 수 있다. 시험관 내 전사를 위한 일부 방법은, 예를 들어, 문헌[Geall et al. (2013) Semin. Immunol. 25(2): 152-159]; 문헌[Brunelle et al. (2013) Methods Enzymol. 530:101-14]에 기재되어 있다. 간단히 말해서, IVT는 전형적으로 프로모터, 리보뉴클레오티드 삼인산염의 풀, DTT 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있는 완충 시스템, 적당한 RNA 폴리머라제(예를 들어, T3, T7, 또는 SP6 RNA 폴리머라제), DNase I, 피로포스파타제 및/또는 RNase 억제제를 함유하는 원형 DNA 주형으로 수행된다. 정확한 조건은 특정 용도에 따라 다를 수 있다. 이들 시약의 존재는 일반적으로 최종 mRNA 생성물에서 바람직하지 않으며, 이들 시약은 치료 용도에 적합한 깨끗하고/하거나 균질한 mRNA를 제공하기 위해 정제 또는 제거될 수 있는 불순물 또는 오염물로 간주될 수 있다. 일부 구현예에서 시험관내 전사 반응으로부터 제공된 mRNA가 바람직할 수 있지만, 박테리아, 진균, 식물 및/또는 동물로부터 생성된 야생형 mRNA를 포함하는 mRNA의 다른 공급원이 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다.
III. 본 LNP 백신의 제조 방법
본 LNP는 당업계에 현재 공지된 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 다층 소포(multilamellar vesicles, MLV)는 적절한 용매에 지질을 용해시킴으로써 적절한 용기 또는 용기의 내벽에 선택된 지질을 침착시킨 다음, 용매를 증발시켜 용기 내부의 박막을 남기거나 분무 건조와 같은 통상적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 그런 다음 MLV를 형성시키는 보르텍싱 운동으로 수성 상이 용기에 첨가될 수 있다. 그런 다음, 단층 소포(ULV)는 다층 소포의 균질화, 초음파처리 또는 압출에 의해 형성될 수 있다. 또한, 단층 소포는 시약 제거 기술에 의해 형성될 수 있다.
US 2011/0244026, US 2016/0038432, US 2018/0153822, US 2018/0125989, 및 PCT/US2020/043223(2020년 7월 23일 출원)에 다양한 방법들이 기재되어 있으며, 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다. 하나의 예시적인 방법은 US 2016/0038432에 기재된 바와 같이, 지질을 먼저 지질 나노입자로 미리 형성하지 않으면서 mRNA를 지질 혼합물과 혼합함으로써 mRNA를 캡슐화하는 것을 수반한다. 또다른 예시적인 방법은 US 2018/0153822에 기재된 바와 같이, 미리 형성된 LNP를 mRNA와 혼합함으로써 mRNA를 캡슐화하는 것을 수반한다.
일부 구현예에서, mRNA-로드된 LNP를 제조하는 방법은 하나 이상의 용액을 주위 온도보다 높은 온도로 가열하는 단계를 포함하며, 상기 하나 이상의 용액은 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액, mRNA를 포함하는 용액 및 LNP-캡슐화된 mRNA를 포함하는 혼합 용액이다. 일부 구현예에서, 방법은 혼합 단계 이전에, mRNA 용액 및 미리 형성된 LNP 용액 중 하나 또는 둘 모두를 가열하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 미리 형성된 LNP를 포함하는 용액, mRNA를 포함하는 용액 및 LNP-캡슐화된 mRNA를 포함하는 용액 중 하나 이상을 혼합 단계 동안 가열하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 혼합 단계 후에 LNP-캡슐화된 mRNA를 가열하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 용액이 가열되는 온도는 약 30℃, 37℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 또는 70℃이거나, 이보다 높다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 용액이 가열되는 온도는 약 25~70℃, 약 30~70℃, 약 35~70℃, 약 40~70℃, 약 45~70℃, 약 50~70℃, 또는 약 60~70℃ 범위이다. 일부 구현예에서, 온도는 약 65℃이다.
본 발명에 적합한 mRNA 용액을 제조하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 본원에 기재된 완충 용액에 직접 용해될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 캡슐화를 위해 지질 용액과 혼합하기 전에 mRNA 스톡 용액을 완충 용액과 혼합함으로써 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 캡슐화를 위해 지질 용액과 혼합하기 직전에 mRNA 스톡 용액을 완충 용액과 혼합함으로써 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 mRNA 스톡 용액은 약 0.2 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.8 mg/ml, 1.0 mg/ml, 1.2 mg/ml, 1.4 mg/ml, 1.5 mg/ml, 또는 1.6 mg/ml, 2.0 mg/ml, 2.5 mg/ml, 3.0 mg/ml, 3.5 mg/ml, 4.0 mg/ml, 4.5 mg/ml, 또는 5.0 mg/ml 이상의 농도로 물 또는 완충액에 mRNA를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA 스톡 용액은 펌프를 사용하여 완충 용액과 혼합된다. 예시적인 펌프는 기어 펌프, 연동 펌프 및 원심 펌프를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 완충 용액은 mRNA 스톡 용액보다 더 큰 속도로 혼합된다. 예를 들어, 완충 용액은 mRNA 스톡 용액의 속도보다 적어도 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 또는 20x 더 큰 속도로 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 완충 용액은 약 100~6000 ml/분 (예를 들어, 약 100~300 ml/분, 300~600 ml/분, 600~1200 ml/분, 1200~2400 ml/분, 2400~3600 ml/분, 3600~4800 ml/분, 4800~6000 ml/분, 또는 60~420 ml/분) 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, 완충 용액은 약 60 ml/분, 100 ml/분, 140 ml/분, 180 ml/분, 220 ml/분, 260 ml/분, 300 ml/분, 340 ml/분, 380 ml/분, 420 ml/분, 480 ml/분, 540 ml/분, 600 ml/분, 1200 ml/분, 2400 ml/분, 3600 ml/분, 4800 ml/분, 또는 6000 ml/분 이상의 유속으로 혼합된다.
일부 구현예에서, mRNA 스톡 용액은 약 10~600 ml/분 (예를 들어, 약 5~50 ml/분, 약 10~30 ml/분, 약 30~60 ml/분, 약 60~120 ml/분, 약 120~240 ml/분, 약 240~360 ml/분, 약 360~480 ml/분, 또는 약 480~600 ml/분) 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 스톡 용액은 약 5 ml/분, 10 ml/분, 15 ml/분, 20 ml/분, 25 ml/분, 30 ml/분, 35 ml/분, 40 ml/분, 45 ml/분, 50 ml/분, 60 ml/분, 80 ml/분, 100 ml/분, 200 ml/분, 300 ml/분, 400 ml/분, 500 ml/분, 또는 600 ml/분 이상의 유속으로 혼합된다.
원하는 mRNA를 지질 나노입자에 도입하는 과정을 "로딩"이라고 한다. 예시적인 방법은 문헌[Lasic et al., FEBS Lett. (1992) 312:255-8]에 기재되어 있다. LNP-통합된 핵산은 지질 나노입자의 이중층 막 내에서 지질 나노입자의 내부 공간에 완전히 또는 부분적으로 위치하거나, 지질 나노입자 막의 외부 표면과 회합될 수 있다. 지질 나노입자로의 mRNA의 혼입은 본원에서 "캡슐화"라고도 지칭되며, 여기서 핵산은 지질 나노입자의 내부 공간 내에 완전히 또는 실질적으로 함유된다.
적합한 LNP는 다양한 크기로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 감소된 크기는 mRNA의 보다 효율적인 전달과 관련이 있다. 적당한 LNP 크기의 선택은 표적 세포 또는 조직의 부위 및 어느 정도 지질 나노입자가 제조되는 용도를 고려할 수 있다.
당업계에 공지된 다양한 방법이 지질 나노입자 집단의 크기결정에 이용가능하다. 본원의 바람직한 방법은 Zetasizer Nano ZS(Malvern Panalytical)를 이용하여 LNP 입자 크기를 측정한다. 한 프로토콜에서, 10 μl의 LNP 샘플이 990 μl의 10% 트레할로스와 혼합된다. 이 용액은 큐벳에 넣은 다음, Zetasizer 기계에 넣는다. z-평균 직경(nm), 또는 누적 평균은 샘플의 LNP에 대한 평균 크기로 간주된다. Zetasizer 기계는 동적 광 산란(DLS) 및 자기상관 함수의 누적 분석을 사용하여 다분산 지수(PDI)를 측정하는 데에도 사용될 수 있다. 평균 LNP 직경은 형성된 LNP의 초음파 처리에 의해 감소될 수 있다. 간헐적인 초음파 처리 주기는 준탄성 광 산란(QELS) 평가와 번갈아 가며 효율적인 지질 나노입자 합성을 가이드할 수 있다.
일부 구현예에서, 대부분의 정제된 LNP, 즉, LNP의 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과가 약 70~150 nm (예를 들어, 약 145 nm, 약 140 nm, 약 135 nm, 약 130 nm, 약 125 nm, 약 120 nm, 약 115 nm, 약 110 nm, 약 105 nm, 약 100 nm, 약 95 nm, 약 90 nm, 약 85 nm, 또는 약 80 nm)의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 실질적으로 모든 (예를 들어, 80 또는 90% 초과)의 정제된 지질 나노입자가 약 70~150 nm (예를 들어, 약 145 nm, 약 140 nm, 약 135 nm, 약 130 nm, 약 125 nm, 약 120 nm, 약 115 nm, 약 110 nm, 약 105 nm, 약 100 nm, 약 95 nm, 약 90 nm, 약 85 nm, 또는 약 80 nm)의 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 조성물 중 LNP는 150 nm 미만, 120 nm 미만, 100 nm 미만, 90 nm 미만, 80 nm 미만, 70 nm 미만, 60 nm 미만, 50 nm 미만, 30 nm 미만, 또는 20 nm 미만의 평균 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 조성물 중 LNP의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과가 약 40~90 nm (예를 들어, 약 45~85 nm, 약 50~80 nm, 약 55~75 nm, 약 60~70 nm) 또는 약 50~70 nm (예를 들어, 55~65 nm) 범위의 크기를 가지며, 분무를 통한 폐 전달용으로 특히 적합하다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 약제학적 조성물 중 LNP의 분산도 또는 분자 크기의 이질성(PDI) 측정치는 약 0.5 미만이다. 일부 구현예에서, LNP는 약 0.5 미만, 약 0.4 미만, 약 0.3 미만, 약 0.28 미만, 약 0.25 미만, 약 0.23 미만, 약 0.20 미만, 약 0.18 미만, 약 0.16 미만, 약 0.14 미만, 약 0.12 미만, 약 0.10 미만, 또는 약 0.08 미만의 PDI를 갖는다. PDI는 상기 기재된 바와 같이 Zetasizer 기계에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물 중 정제된 LNP의 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과는 각 개별 입자 내에서 mRNA를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물 중 실질적으로 모든 (예를 들어, 80% 또는 90% 초과의) 정제된 지질 나노입자는 각 개별 입자 내에서 mRNA를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 50% 내지 99%; 또는 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 98, 또는 99% 초과의 캡슐화 효율을 갖는다. 전형적으로, 본원에서 사용하기 위한 지질 나노입자는 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91, 92, 93, 94, 또는 95%)의 캡슐화 효율을 갖는다.
일부 구현예에서, LNP는 1 내지 10의 N/P 비율을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 1 초과, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 또는 약 8의 N/P 비율을 갖는다. 추가 구현예에서, 본원의 전형적인 LNP는 4의 N/P 비율을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 적어도 약 0.5 μg, 1 μg, 5 μg, 10 μg, 100 μg, 500 μg, 또는 1000 μg의 캡슐화된 mRNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 0.1 μg 내지 1000 μg, 적어도 약 0.5 μg, 적어도 약 0.8 μg, 적어도 약 1 μg, 적어도 약 5 μg, 적어도 약 8 μg, 적어도 약 10 μg, 적어도 약 50 μg, 적어도 약 100 μg, 적어도 약 500 μg, 또는 적어도 약 1000 μg의 캡슐화된 mRNA를 함유한다.
일부 구현예에서, mRNA는 화학적 합성 또는 DNA 주형의 시험관내 전사(IVT)에 의해 제조될 수 있다. mRNA를 제조하고 정제하는 예시적인 방법은 실시예 1에 기재되어 있다. 이 과정에서, IVT 과정에서, cDNA 주형은 mRNA 전사물을 생산하기 위해 사용되고 DNA 주형은 DNase에 의해 분해된다. 전사물은 심층 여과 및 접선 유동 여과(TFF)에 의해 정제된다. 정제된 전사물은 캡과 테일을 첨가하여 추가로 변형되며, 변형된 RNA는 심층 여과 및 TFF에 의해 다시 정제된다.
그런 다음 mRNA는 수성 완충액에서 준비되고, LNP의 지질 성분을 함유하는 양친매성 용액과 혼합된다. LNP의 4가지 지질 성분을 용해시키기 위한 양친매성 용액은 알코올 용액일 수 있다. 일부 구현예에서, 알코올은 에탄올이다. 수성 완충액은 예를 들어 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트 또는 숙시네이트 완충액일 수 있고, 약 3.0~7.0, 예를 들어, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 또는 약 6.5의 pH를 가질 수 있다. 완충액은 염(예를 들어, 나트륨, 칼륨 및/또는 칼슘 염)과 같은 다른 성분을 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 수성 완충액은 1 mM 시트레이트, 150 mM NaCl, pH 4.5를 갖는다.
mRNA-LNP 조성물을 제조하기 위한 예시적이고 비제한적인 방법이 실시예 1에 기재되어 있다. 이 방법은 제어된 균질 방식으로 완충된 mRNA 용액을 에탄올 중의 지질 용액과 혼합하는 단계를 수반하며, 여기서 지질:mRNA의 비율은 혼합 과정 내내 유지된다. 이 예시적인 예에서, mRNA는 시트르산 일수화물, 시트르산 삼나트륨 이수화물 및 염화나트륨을 함유하는 수성 완충액 내에 제시된다. mRNA 용액이 용액(1 mM 시트레이트 완충액, 150 mM NaCl, pH 4.5)에 첨가된다. 네 가지 지질(예를 들어, 양이온성 지질, PEG화된 지질, 콜레스테롤계 지질, 및 헬퍼 지질)의 지질 혼합물이 에탄올에 용해된다. mRNA 수용액과 에탄올 지질 용액은 거의 "무펄스" 펌프 시스템을 갖춘 "T" 혼합기에서 4:1의 부피비로 혼합된다. 그런 다음 생성된 혼합물에는 이후 다운스트림 정제 및 완충액 교환이 가해진다. 완충액 교환은 투석 카세트 또는 TFF 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. TFF는 T-mix 공정을 통한 형성 직후 생성된 초기 LNP를 농축 및 완충액-교환하는 데 사용될 수 있다. 정용여과 공정은 투과 흐름과 동일한 속도로 적절한 완충액을 첨가하여 부피를 일정하게 유지하는 연속 작업이다.
IV. mRNA-LNP 백신의 패키징 및 용도
mRNA-LNP 백신은 비경구(예를 들어, 근육내, 피내 또는 피하) 투여 또는 비인두(예를 들어, 비강내) 투여를 위해 패키징될 수 있다. 백신 조성물은 즉석 제형의 형태일 수 있으며, 여기서 LNP 조성물은 동결건조되고 사용 직전에 생리학적 완충액(예를 들어, PBS)으로 재구성된다. 백신 조성물은 또한 수용액 또는 냉동 수용액의 형태로 운송 및 제공될 수 있고, 재구성 없이 대상체에게 직접 투여될 수 있다(이전에 냉동된 경우, 해동 후).
따라서, 본 개시내용은 단일 용기에 mRNA-LNP 백신을 제공하거나, 하나의 용기에 mRNA-LNP 백신을 제공하고 또 다른 용기에 재구성을 위한 생리학적 완충액을 제공하는 키트와 같은 제조 물품을 제공한다. 용기(들)는 단일-사용 용량 또는 다중-사용 용량을 함유할 수 있다. 용기는 전처리된 유리 바이알 또는 앰플일 수 있다. 제조 물품은 사용 지침도 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, mRNA-LNP 백신은 근육내(IM) 주사에 사용하기 위해 제공된다. 백신은 예를 들어 상완의 삼각근에 대상체에게 주사될 수 있다. 일부 구현예에서, 백신은 미리 채워진 주사기 또는 주입기(예를 들어, 단일 챔버 또는 다중 챔버)에 제공된다. 일부 구현예에서, 백신은 흡입에 사용하기 위해 제공되고, 미리 채워진 펌프, 에어로졸기 또는 흡입기에 제공된다.
mRNA-LNP 백신은 예방적 유효량, 즉 충분한 시간(예를 들어, 1년, 2년, 5년, 10년, 또는 평생) 동안 표적 병원체에 대해 충분한 면역 보호를 제공하는 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 충분한 면역 보호는 병원체에 의한 감염과 관련된 증상의 예방 또는 완화일 수 있다. 일부 구현예에서, 백신의 다중 용량(예를 들어, 2회 용량)은 원하는 예방 효과를 달성하기 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 주사된다. 용량(예를 들어, 프라임 및 부스터 용량)은 예를 들어, 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년, 2년, 5년, 또는 10년의 간격만큼 분리될 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA-LNP 백신의 단일 용량은 1~50 μg의 mRNA (예를 들어, 1가 또는 다가)를 함유한다. 예를 들어, 단일 용량은 근육내(IM) 주사를 위한 약 2.5 μg, 약 5 μg, 약 7.5 μg, 약 10 μg, 약 12.5 μg, 또는 약 15 μ의 mRNA를 함유할 수 있다. 추가 구현예에서, 다가 단일 용량의 LNP 백신은 각각 상이한 항원에 대한 다중(예를 들어, 2, 3 또는 4) 종류의 LNP를 함유하고, 각 종류의 LNP는 예를 들어, 2.5 μg, 약 5 μg, 약 7.5 μg, 약 10 μg, 약 12.5 μg, 또는 약 15 μg의 mRNA 양을 갖는다.
추가 양태에서, 본 발명은 대상체에서 하나 이상의 인플루엔자 바이러스에 대해 대상체를 면역화하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 대상체에서 하나 이상의 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 대상체에게 본원에 기재된 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에 제공된 면역화 방법은 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 내의 다중 에피토프에 대해 광범위하게 보호적인 면역 반응을 유도한다. 다양한 구현예에서, 본원에 제공된 면역화 방법은 하나 이상의 인플루엔자 바이러스에 대해 광범위하게 중화하는 면역 반응을 유도한다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 항체 반응을 포함한다. 따라서, 다양한 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 상이한 유형의 인플루엔자 바이러스에 대한 광범위한 교차-보호를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 조류, 돼지, 계절성 및/또는 유행성 인플루엔자 바이러스에 대한 교차-보호를 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 인플루엔자 A, B, 또는 C 아형에 대한 교차-보호를 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 인플루엔자 A H1-아형 바이러스(예를 들어, H1N1), 인플루엔자 A H3-아형 바이러스(예를 들어, H3N2), 인플루엔자 A H5-아형 바이러스(예를 들어, H5N1), 및/또는 인플루엔자 B 바이러스(예를 들어, 야마가타 계통, 빅토리아 계통)의 여러 균주에 대한 교차-보호를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 계절성 인플루엔자 균주에 대해 개선된 면역 반응을 유도할 수 있다. 예시적인 계절성 균주는 A/Puerto Rico/8/1934, A/Fort Monmouth/1/1947, A/Chile/1/1983, A/Texas/36/1991, A/Singapore/6/1986, A/Beijing/32/1992, A/New Caledonia/20/1999, A/Solomon Islands/03/2006, A/Brisbane/59/2007, 세포-증식 원형 바이러스 A/Victoria/361/2011과 항원적으로 유사한 A(H3N2) 바이러스, A/Beijing/262/95 (H1N1)-유사 바이러스, A/Brisbane/02/2018 (H1N1)pdm09-유사 바이러스, A/Brisbane/10/2007 (H3N2)-유사 바이러스, A/California/7/2004 (H3N2)-유사 바이러스, A/California/7/2009 (H1N1)-유사 바이러스, A/California/7/2009 (H1N1)pdm09-유사 바이러스, A/Cambodia/e0826360/2020 (H3N2)-유사 바이러스, A/Fujian/411/2002 (H3N2)-유사 바이러스, A/Fujian/411/2002 (H3N2)-유사 바이러스, A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09-유사 바이러스-유사 바이러스, A/Hawaii/70/2019 (H1N1)pdm09-유사 바이러스-유사 바이러스, A/Hong Kong/2671/2019 (H3N2)-유사 바이러스, A/Hong Kong/45/2019 (H3N2)-유사 바이러스, A/Hong Kong/4801/2014 (H3N2)-유사 바이러스, A/Kansas/14/2017 (H3N2)-유사 바이러스, A/Michigan/45/2015 (H1N1)pdm09-유사 바이러스, A/Moscow/10/99 (H3N2)-유사 바이러스, A/New Caledonia/20/99 (H1N1)-유사 바이러스, A/Perth/16/2009 (H3N2)-유사 바이러스, A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016 (H3N2)-유사 바이러스, A/Solomon Islands/3/2006 (H1N1)-유사 바이러스, A/South Australia/34/2019 (H3N2)-유사 바이러스, A/Switzerland/8060/2017 (H3N2)-유사 바이러스, A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2)-유사 바이러스, A/Sydney/5/97 (H3N2)-유사 바이러스, A/Texas/50/2012 (H3N2)-유사 바이러스, A/Victoria/2570/2019 (H1N1)pdm09-유사 바이러스, A/Victoria/2570/2019 (H1N1)pdm09-유사 바이러스 -유사 바이러스, A/Victoria/361/2011 (H3N2)-유사 바이러스, A/Wellington/1/2004 (H3N2)-유사 바이러스, A/Wisconsin/588/2019 (H1N1)pdm09-유사 바이러스, A/Wisconsin/588/2019 (H1N1)pdm09-유사 바이러스-유사 바이러스, A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)-유사 바이러스, B/Beijing/184/93-유사 바이러스, B/Brisbane/60/2008-유사 바이러스, B/Colorado/06/2017-유사 바이러스 (B/Victoria/2/87 계통), B/Florida/4/2006-유사 바이러스, B/Hong Kong/330/2001-유사 바이러스, B/Malaysia/2506/2004-유사 바이러스, B/Massachusetts/2/2012-유사 바이러스, B/Phuket/3073/2013 (B/야마가타 계통)-유사 바이러스, B/Phuket/3073/2013-유사 바이러스, B/Phuket/3073/2013-유사 바이러스 (B/Yamagata/16/88 계통), B/Shangdong/7/97-유사 바이러스, B/Shanghai/361/2002-유사 바이러스, B/Sichuan/379/99-유사 바이러스, B/Washington/02/2019 (B/빅토리아 계통)-유사 바이러스, B/Washington/02/2019-유사 (B/빅토리아 계통) 바이러스, 및 B/Wisconsin/1/2010-유사 바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 유행성 인플루엔자 균주에 대해 개선된 면역 반응을 유도할 수 있다. 예시적인 유행성 균주는 A/California/07/2009, A/California/04/2009, A/Belgium/145/2009, A/South Carolina/01/1918, 및 A/New Jersey/1976을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 유행성 아형은 특히, H1N1, H5N1, H2N2, H3N2, H9N2, H7N7, H7N3, H7N9 및 H10N7 아형을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 돼지 인플루엔자 균주에 대해 개선된 면역 반응을 유도할 수 있다. 예시적인 돼지 균주는 A/New Jersey/1976 분리주 및 A/California/07/2009를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 조류 인플루엔자 균주에 대해 개선된 면역 반응을 유도할 수 있다. 예시적인 조류 균주는 H5N1, H7N3, H7N7, H7N9, 및 H9N2를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 추가적인 인플루엔자 유행성, 계절성, 조류 및/또는 돼지 균주는 당업계에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 인플루엔자 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 대상체는 인플루엔자 감염을 앓고 있거나 감염에 민감하다. 일부 구현예에서, 대상체가 인플루엔자 감염과 일반적으로 관련된 하나 이상의 증상을 나타내는 경우, 대상체는 인플루엔자 감염을 앓고 있는 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 대상체는 인플루엔자 바이러스에 노출된 것으로 알려지거나 믿어진다. 일부 구현예에서, 대상체가 인플루엔자 바이러스에 노출된 것으로 알려지거나 믿어지는 경우, 대상체는 인플루엔자 감염에 민감한 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 대상체가 인플루엔자 바이러스에 감염된 것으로 알려지거나 의심되는 다른 개체와 접촉한 경우 및/또는 인플루엔자 감염이 널리 퍼져 있다고 알려지거나 생각되는 장소에 대상체가 있거나 있었던 경우, 대상체는 인플루엔자 바이러스에 노출된 것으로 알려져 있거나 믿어진다.
다양한 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 인플루엔자 감염의 하나 이상의 증상의 발생 전 또는 후에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 예방제로서 투여된다. 이러한 구현예에서, 본 발명의 방법은 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 대상체를 예방하거나 보호하는데 효과적이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 계절성 및/또는 유행성 인플루엔자 백신의 성분으로서 또는 오래 지속되는 (여러 시즌) 보호를 부여하기 위한 인플루엔자 백신접종 요법의 일부로서 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 인플루엔자 감염의 증상을 치료하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 대상체는 비-인간 포유동물이다. 일부 구현예에서, 대상체는 농장 동물 또는 애완동물(예를 들어, 개, 고양이, 양, 소 및/또는 돼지)이다. 일부 구현예에서, 대상체는 비-인간 영장류이다. 일부 구현예에서, 대상체는 조류(예를 들어, 닭)이다.
일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 특정 구현예에서, 대상체는 성인, 청소년 또는 유아이다. 일부 구현예에서, 인간 대상체는 6개월 미만이다. 일부 구현예에서, 인간 대상체는 6개월 이상, 6개월 내지 35개월, 36개월 내지 8세, 또는 9세 이상이다. 일부 구현예에서, 인간 대상체는 55세 이상, 예컨대 60세 이상 또는 65세 이상 노인이다. 또한 조성물의 투여 및/또는 자궁내 치료 방법의 수행이 본 발명에 의해 고려된다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 관해 사용된 과학적 및 기술적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 예시적인 방법 및 물질이 아래에 기재되지만, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질도 본 발명의 실시 또는 평가에 사용될 수 있다. 상충되는 경우, 정의를 비롯한 본 명세서가 우선할 것이다. 일반적으로, 본원에 기술되어 있는 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 바이러스학, 면역학, 미생물학, 유전학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 의학 및 제약 화학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 이들의 기법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 흔히 사용되는 것이다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조사의 사양서에 따라 수행되거나, 당업계에서 일반적으로 달성되는 바와 같이, 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행된다. 또한, 문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 명세서 및 구현예 전반에 걸쳐, 단어 "가지다" 및 "포함하다", 또는 "갖다", "가지고 있는", "포함한다", 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수군을 포함하되, 임의의 기타 정수 또는 정수군을 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 언급된 모든 간행물 및 기타 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 여러 문헌이 본원에 인용되지만, 상기 인용은 임의의 이들 문헌이 당업계의 통상의 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것으로 간주되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 하나 이상의 관심 값에 적용되는 용어 “대략” 또는 “약”은 언급된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 구현예에서, 이 용어는 달리 명시되거나 문맥에서 달리 명백하지 않는 한 명시된 기준 값의 (보다 크거나 보다 작음) 어느 한 방향으로 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만에 속하는 값의 범위를 지칭한다.
V. 벡터
일 양태에서, 본원에 개시된 mRNA 조성물을 포함하는 벡터가 본원에 개시된다. 관심 단백질을 암호화하는 RNA 서열(예를 들어, 인플루엔자 단백질을 암호화하는 mRNA)은 다양한 유형의 벡터로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 벡터로 클로닝될 수 있다. 특별한 관심 벡터에는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 시퀀싱 벡터 및 시험관내 전사에 최적화된 벡터가 포함될 수 있다.
특정 구현예에서, 벡터는 숙주 세포에서 mRNA를 발현하는 데 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 벡터는 IVT에 대한 주형으로 사용될 수 있다. 치료 용도에 적합한 최적으로 번역된 IVT mRNA의 작제는 문헌[Sahin, et al. (2014). Nat. Rev. Drug Discov. 13, 759-780]; 문헌[Weissman (2015). Expert Rev. Vaccines 14, 265-281]에 상세하게 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터는 5'에서 3'으로 적어도 다음을 포함할 수 있다: RNA 폴리머라제 프로모터; 5' UTR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열; ORF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열; 3' UTR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및 적어도 하나의 RNA 앱타머를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터는 폴리(A) 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
다양한 RNA 폴리머라제 프로모터가 알려져 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터일 수 있다. 다른 유용한 프로모터에는 T3 및 SP6 RNA 폴리머라제 프로모터가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 공통 뉴클레오티드 서열이 알려져 있다.
또한, 본원에 개시된 벡터 또는 RNA 조성물을 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포)가 본원에 개시된다.
폴리뉴클레오티드는 임의의 다수의 다양한 방법, 예를 들어 전기천공법(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)), (ECM 830)(BTX)(Harvard Instruments, Boston, MA) 또는 Gene Pulser II(BioRad, Denver, Colo.), Multiporator(Eppendorf, Hamburg, Germany), 리포펙션을 이용한 양이온성 리포솜 매개 형질감염, 폴리머 캡슐화, 펩티드 매개 형질감염, "유전자 총"과 같은 바이올리스틱(biolistic) 입자 전달 시스템(예를 들어, 문헌[Nishikawa, et al. (2001). Hum Gene Ther. 12(8):861-70], 또는 TransIT-RNA 형질감염 키트(Mirus, Madison, WI)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 상업적으로 이용 가능한 방법을 사용하여 표적 세포로 도입될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 수단에는 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드와 같은 콜로이드 분산 시스템과 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 비롯한 지질 기반 시스템이 포함된다. 시험관내 및 생체내 전달 운반체로 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜(예를 들어, 인공 막 소포)이다.
외인성 핵산을 숙주 세포에 도입하거나 세포를 본 개시내용의 억제제에 노출시키는 데 사용되는 방법에 관계없이, 숙주 세포에서 mRNA 서열의 존재를 확인하기 위해 다양한 분석이 수행될 수 있다.
VI. 자가 복제 RNA 및 트랜스 복제 RNA
자가 복제 RNA:
일 양태에서, 인플루엔자 단백질을 암호화하는 자가 복제 RNA가 본원에 개시된다.
자가 복제 RNA는 예를 들어 알파바이러스로부터 유래된 복제 요소를 사용하고 구조적 바이러스 단백질을 관심 단백질(예를 들어 인플루엔자 단백질)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체함으로써 생산될 수 있다. 자가 복제 RNA는 일반적으로 세포에 전달된 후 직접 번역될 수 있는 양성 가닥 분자이며, 이 번역은 전달된 RNA로부터 안티센스 및 센스 전사체를 모두 생성하는 RNA 의존성 RNA 폴리머라제를 제공한다. 따라서, 전달된 RNA는 여러 딸 RNA의 생성으로 이어진다. 이러한 딸 RNA와 동일 선상의 하위 게놈 전사체는 자체적으로 번역되어 암호화된 항원(즉, 인플루엔자 단백질 항원)의 제자리 발현(in situ expression)을 제공할 수 있거나, 전사되어 전달된 RNA와 동일한 의미를 갖는 추가 전사체를 제공할 수 있으며, 이는 번역되어 항원의 제자리 발현을 제공한다. 이러한 순서의 전사의 전체적인 결과로, 도입된 레플리콘 RNA의 수가 크게 증폭되고, 따라서 암호화된 항원은 세포의 주요 폴리펩티드 생성물이 된다.
이러한 방식으로 자가 복제를 달성하는 데 적합한 시스템 중 하나는 알파바이러스 기반 레플리콘을 사용하는 것이다. 이들 레플리콘은 세포에 전달된 후 복제효소(또는 복제효소-전사효소)의 번역을 유도하는 양성 가닥(양성 센스 가닥) RNA이다. 복제효소는 자동 절단되어 전달된 양성 가닥 RNA의 게놈 가닥 복제본을 생성하는 복제 복합체를 제공하는 다단백질로 번역된다. 이러한 음성(-) 가닥 전사체는 그 자체로 전사되어 양성 가닥 모 RNA의 추가 복제본을 제공하고 또한 항원을 암호화하는 하위 게놈 전사체를 제공할 수 있다. 따라서 하위 게놈 전사체의 번역은 감염된 세포에 의한 항원의 제자리 발현을 유도한다. 적합한 알파바이러스 레플리콘은 Sindbis 바이러스, Semliki 숲 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 등의 복제효소를 사용할 수 있다. 돌연변이 또는 야생형 바이러스 서열이 사용될 수 있다. 예를 들어, VEEV의 약독화 TC83 돌연변이가 레플리콘에서 사용되었다. 다음의 참조를 참고: WO2005/113782(본원에 참조로 포함됨).
한 구현예에서, 본원에 기재된 각각의 자가 복제 RNA는 (i) 자가 복제 RNA 분자로부터 RNA를 전사할 수 있는 RNA 의존성 RNA 폴리머라제 및 (ii) 인플루엔자 단백질 항원을 암호화한다. 폴리머라제는 예를 들어 알파바이러스 단백질 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4 중 하나 이상을 포함하는 알파바이러스 복제효소일 수 있다. 천연 알파바이러스 게놈은 비구조적 복제효소 다단백질에 더하여 구조적 비리온 단백질을 암호화하는 반면, 특정 구현예에서 자가 복제 RNA 분자는 알파바이러스 구조 단백질을 암호화하지 않는다. 따라서, 자가 복제 RNA는 세포 내에서 자신의 게놈 RNA 복제본을 생성할 수 있지만 RNA를 포함하는 비리온을 생성하지는 않는다. 이러한 비리온을 생산할 수 없다는 것은 야생형 알파바이러스와 달리 자가 복제 RNA 분자가 감염 형태로 영속될 수 없음을 의미한다. 야생형 바이러스에서 영속하는 데 필요한 알파바이러스 구조 단백질은 본 개시내용의 자가 복제 RNA에는 없고, 그 자리는 관심 면역원을 암호화하는 유전자(들)이 차지하여, 하위 게놈 전사체가 구조적 알파바이러스 비리온 단백질보다는 면역원을 암호화한다. 자가 복제 RNA는 본원에 참고로 포함된 WO 2011005799에 더 상세히 기재되어 있다.
트랜스 복제 RNA:
일 양태에서, 인플루엔자 단백질을 암호화하는 트랜스 복제 RNA가 본원에 개시된다.
트랜스 복제 RNA는 전술한 자가 복제 RNA와 유사한 요소를 가지고 있다. 그러나 트랜스 복제 RNA의 경우 두 개의 별도 RNA 분자가 사용된다. 제1 RNA 분자는 전술한 RNA 복제효소(예를 들어, 알파바이러스 복제효소)를 암호화하고, 제2 RNA 분자는 관심 단백질(예를 들어, 인플루엔자 단백질 항원)을 암호화한다. RNA 복제효소는 제1 및 제2 RNA 분자 중 하나 또는 둘 다를 복제함으로써 관심 단백질을 암호화하는 RNA 분자의 복제본 수를 크게 증가시킬 수 있다. 트랜스 복제 RNA는 본원에 참고로 포함된 WO 2017162265에 더 상세히 기재되어 있다.
VII. 약제학적 조성물
본 개시내용에 따라 정제된 RNA는 예를 들어 백신으로 사용하기 위한 약제학적 조성물의 성분으로서 유용할 수 있다. 이들 조성물은 전형적으로 RNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 것이다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 또한 소분자 면역강화제(예를 들어, TLR 효능제)와 같은 하나 이상의 추가 성분을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 또한 리포솜, 수중유 에멀젼 또는 미세입자와 같은 RNA 전달 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 지질 나노입자(LNP)를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 LNP 내에 캡슐화된 항원 암호화 핵산 분자를 포함한다.
VIII. 백신접종 방법
본원에 개시된 인플루엔자 백신은 하나 이상의 인플루엔자 단백질에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 대상체에게 투여될 수 있으며, 여기서 대상체의 항-항원 항체 역가는 본원에 개시된 인플루엔자 백신을 접종하지 않은 대상체의 항-항원 항체 역가에 비해 또는 인플루엔자에 대한 대체 백신에 비해 백신접종 후 증가된다. "항-항원 항체"는 항원에 특이적으로 결합하는 혈청 항체이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 인플루엔자 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도하거나 인플루엔자 감염으로부터 대상체를 보호하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도하거나 인플루엔자 감염으로부터 대상체를 보호하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 인플루엔자 백신을 제공한다. 본 개시내용은 또한 인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도하거나 인플루엔자 감염으로부터 대상체를 보호하기 위한 백신의 제조에 사용하기 위한 본원에 기재된 인플루엔자 mRNA를 제공한다.
본 발명이 보다 잘 이해되도록, 하기 실시예가 기술된다. 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: LNP 제형의 최적화
본 실시예는 다양한 성분의 조합 라이브러리로부터 일련의 mRNA 백신용 LNP 제형을 제조한 연구를 설명한다. 합리적으로 설계된 새로운 양이온성 지질이 합성되었다. 전체적으로, 150개 초과의 지질과 430개 초과의 제형이 테스트되었다. 인간 에리스로포이에틴(hEPO) mRNA를 테스트 mRNA로 사용하였다. 아래 설명된 리드 제형에서, mRNA는 양이온성 지질과 세 가지 다른 지질 - 헬퍼 지질; 콜레스테롤계 지질; 및 PEG화된 지질의 조합을 조합의 다양한 순열로 사용하여 LNP로 제형화되었다.
LNP 제형은 4가지 지질 성분 - 이온화 지질, 헬퍼 지질 DOPE, 콜레스테롤, 및 PEG화된 지질 DMG-PEG-2K로 이루어졌다. PEG화된 지질 몰 분율은 1.5%로 일정하게 유지되는 반면, 이온화가능한 지질 및 상이한 헬퍼 지질 및 이들의 몰비율은 hEPO 스크리닝 연구에 기초하여 최적화된 비율을 확인하기 위해 평가되었다.
시트레이트 완충액(1 mM 시트레이트, 150 mM NaCl, pH 4.5)을 LNP 제형의 제조에 사용하였다. 시트레이트 완충액에 첨가된 mRNA 용액은 제형화 과정에서 에탄올 용액의 지질과 혼합되었다. LNP 제형에서 mRNA 캡슐화의 높은 비율을 달성하기 위해 완충액의 pH 및 농도를 선택하였다.
LNP 제형화 과정은 펌프 시스템을 사용하여 'T' 혼합기에서 지질 에탄올 용액과 mRNA 시트레이트 용액을 혼합하는 것을 포함하였다. 그런 다음, 생성된 용액을 TFF/투석 튜브를 사용하여 완충액 교환하였다. 10% (w/v) 트레할로스에서 최종 제형의 농도는 투여 필요성에 따라 조정되었다.
hEPO 단백질의 마우스 생체내 발현은 생체내 mRNA 전달에 대한 LNP의 효능을 측정하기 위한 대용물로서 사용되었다. 이 연구에서, 구성요소의 다양한 조합으로부터 유래된 LNP로 제형화된 단일 용량의 hEPO mRNA(0.1 μg)를 마우스에 근육내(IM) 주사하였다. 투여 후 6시간 및 24시간에 수집된 혈청을 ELISA를 사용하여 hEPO 수준에 대해 테스트하였다. 산업 벤치마크인 MC3 제형은 hEPO 발현의 배수 증가 계산을 위한 기준으로 사용되었다(문헌[Angew, Chem Int Ed. (2012) 51:8529-33]).
각각의 LNP 제형에 대해 관찰된 hEPO 발현 수준은 세포 내로 mRNA를 전달하는 제형의 능력을 나타내었다. 초기 제형은 2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE; 헬퍼 지질), DMG-PEG2000, 및 콜레스테롤을 40:1.5:28.5:30의 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPE의 몰비율로 포함하였다. 이들 제형은 MC3 제형과 비교할 때 강력한 효능을 갖는 것으로 밝혀졌다.
추가 제형을 시험하였다. 최적화된 제형 지질 A LNP 및 지질 B LNP는 표 1에 개시되어 있다. 이러한 제형의 mRNA는 변형되거나 변형되지 않을 수 있으며, 인플루엔자에서 유래된 항원을 암호화할 수 있다.
예시적인 LNP 제형의 조성
성분 기능 설명
mRNA 활성 물질 mRNA 작제물
지질 나노입자(LNP)
 양이온성 지질 OF-02(A) 또는 cKK-E10(B) 전달 이온화가능한 지질, mRNA 캡슐화 촉진
DOPE 양쪽이온성 지질은 약물 페이로드의 흡수 및 방출을 향상시킴
콜레스테롤 지질 이중층에 안정성을 제공함
DMG-PEG-2K 지질 이중층에 제어 및 안정성을 제공함
트레할로스 부형제 동결방지제
주사용수(WFI) 희석제 해당 없음
표 1에서, 인간 백신에 대한 최종 투여는 의도된 단일 인간 투여량에 기초하여 인산염-완충 식염수(PBS)에서 상기 최종 벌크 생성물의 희석일 것이다. WFI 양은 최종 의약품의 명목상을 기준으로 계산된다. 제형의 트레할로스 함량은 무수 트레할로스 및 트레할로스 이수화물의 분자량 값의 비율을 사용하여 무수 기준으로 환산된 10%(100 mg/mL) 트레할로스 이수화물에 해당한다.
2개의 최적화된 제형 - 지질 A 및 지질 B LNP 제형에서 지질 성분의 몰비율은 표 2에 개시되어 있다(CL: 양이온성 지질).
예시적인 LNP에서 지질 성분의 몰비율
CL LNP 코드 CL: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPE의 몰비율
OF-02 지질 A 40: 1.5: 28.5: 30
cKK-E10 지질 B 40: 1.5: 28.5: 30
표 3 및 도 1a에 나타낸 바와 같이, MC3와 비교하여 지질 A 및 지질 B에 대한 hEPO 발현의 배수 증가는 mRNA 전달에 있어서 이들 LNP가 MC3보다 우월함을 나타낸다. 하기 표에서, “P2”는 PEG2000을 의미하고; “Times MC3”은 MC3에 대한 증가 배수를 의미하고; “Std Dev”는 표준 편차를 의미한다.
마우스에서 hEPO mRNA의 생체내 전달
연구 # 양이온성 지질 제형 조성 MC3 배수 표준 편차
1 OF-02
(P2 저 DOPE)		 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPE 40:3:27:30 1.74 0.97
OF-02(P2 w/ DSPC) 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DSPC 50:1.5:38.5:10 0.18 0.17
2 OF-02 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPE 40:1.5:28.5:30 5.04 1.79
3 OF-02(고 DOPE) 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPE 40:1.5:13.5:45 7.35 3.90
4 OF-02 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPE 40:1.5:28.5:30 16.19 7.86
5 OF-02 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPE 40:1.5:28.5:30 12.13 6.56
6 cKK-E10 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPE 40:1.5:28.5:30 5.41 3.46
7 cKK-E10(DEPE) 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DEPE 40:1.5:28.5:30 5.77 2.09
8 OF-02
(177 nm)		 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPE 40:1.5:28.5:30 6.59 2.50
OF-02
(161 nm)		 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPE 40:1.5:28.5:30 4.94 1.75
OF-02(153 nm) 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPE 40:1.5:28.5:30 7.40 3.54
OF-02(133 nm) 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPE 40:1.5:28.5:30 7.15 3.86
OF-02(115 nm) 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPE 40:1.5:28.5:30 5.91 2.79
OF-02(118 nm) 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPE 40:1.5:28.5:30 10.54 4.38
9 OF-02 (DSPC) 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DSPC 40:5:25:30 0.00 0.00
OF-02 (DSPC) 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DSPC 40:3.5:26.5:30 0.00 0.00
OF-02 (DSPC) 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DSPC 40:2:28:30 0.00 0.00
OF-02 (DSPC) 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DSPC 40:2:53:5 0.99 0.70
10 OF-02 (DOPS) 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPS 40:1.5:28.5:30 3.26 1.97
OF-02 (DEPE) 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DEPE 40:1.5:28.5:30 11.83 6.89
OF-02 (DOPC) 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPC 40:1.5:28.5:30 3.32 1.20
OF-02 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPE 40:1.5:28.5:30 7.14 3.37
11 cKK-E10 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPE 40:1.5:28.5:30 5.58 2.01
OF-02
(PD lot)		 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPE 40:1.5:28.5:30 8.81 3.22
cKK-E10 양이온성 지질: DMG-PEG2000: 콜레스테롤: DOPE 40:1.5:28.5:30 5.16 3.25
도 1b는 LNP 지질 A 및 지질 B를 사용한 마우스 및 비인간 영장류(NHP)에서의 hEPO 발현을 나타낸다. 지질 A 또는 지질 B로 제형화된 단일 용량의 hEPO mRNA (마우스의 경우 0.1 μg 및 NHP의 경우 10 μg)를 근육내 주사하였다. ELISA를 사용하여 투여 후 6, 24, 48 및 72시간에 혈청 hEPO 수준을 정량화하였다. 데이터는 마우스 및 NHP에서 심지어 4일을 초과하여 생체내 연장된 hEPO 단백질 발현을 보여준다.
최적화 동안 확인된 핵심 공정 매개변수 중 하나는 초기 혼합 단계 동안의 유속이었다. 다양한 최종 LNP 크기(108~177 nm 범위)를 갖는 제형은 혼합 중에 이러한 유속을 변경하여 제조하여, 공정 및 제품 속성을 추가로 제어할 수 있다. 유속이 높을수록 입자 크기가 작아진다. 유속이 375 ml/분에 도달하여 평균 LNP 크기가 108 nM이 되었을 때, 효능이 현저하게 증가했다. LNP의 효능에 대한 크기의 영향은 표 4에서와 같이 MC3에 대한 hEPO 발현의 배수 증가의 척도로 기록되었다.
LNP 크기 최적화
제형 로트# 총 유속
(ml/분) 		크기(nm) PDI 캡슐화(%) 양이온성 지질 MC3 배수
1 250 108 0.077 99 MC3 1.00
2 62.5 177 0.086 94 OF-02 6.59
3 75 161 0.075 95 OF-02 4.94
2-88 87.5 152 0.116 97 OF-02 7.40
2-89 125 133 0.089 97 OF-02 7.15
2-90 250 115 0.076 98 OF-02 5.91
2-91 375 108 0.042 98 OF-02 10.54
*PDI: 다분산 지수.
상기 스크리닝 데이터는 헬퍼 지질 DOPE가 단백질 발현 촉진에 효과적임을 보여준다. 데이터는 또한 4가지 지질의 유망한 몰 조성(OF-02 또는 cKK-E10: DMG-PEG-2K: 콜레스테롤: DOPE = 40:1.5:28.5:30)을 결정하도록 했다. 10% 트레할로스의 LNP 제형은 입자 크기, PDI, mRNA 캡슐화, 및 mRNA 무결성을 포함한 모든 매개변수에 대해 특징화되었다. 테스트된 모든 배치는 동결/해동 주기에서 원하는 특성과 안정성을 보여주었다. 10% (w/v) 트레할로스에서 -80℃에서 제형의 장기 안정성을 평가하였다. 지질 A 및 지질 B 제형은 매우 안정한 것으로 나타났다.
실시예 2: 인플루엔자 H1N1 LNP 백신 제형
인플루엔자 팬데믹은 새로운 인플루엔자 바이러스가 인간 집단에서 출현할 때 발생할 수 있다. 이러한 팬데믹은 공중 보건에 대한 주요 위협으로 남아 있으며, 바이러스가 지속적으로 사람 간 전파되는 경우 사용할 대책과 함께 경계심과 준비가 필요하다. 이 실시예에 기술된 실험에서, 2009년 유행성 독감의 원인인, 고병원성 H1N1 균주 A/California/7/2009 (CA09)로부터의 헤마글루티닌(HA)은 지질 A 및 지질 B의 LNP 제형으로 제조된 mRNA 백신의 효능을 평가하기 위한 프로토타입 항원으로서 사용했다.
HA mRNA는 상기 기술된 바와 같이 제조되었다. 시트레이트 조성물(1 mM 시트레이트, 150 mM NaCl, pH 4.5)을 LNP 제형의 제조에 사용하였다. mRNA를 포함하는 시트레이트 완충액은 제형화 과정 동안 에탄올 용액에서 지질과 혼합되었다. LNP 제형에서 mRNA의 높은 캡슐화율을 달성하기 위해 완충액의 pH 및 농도를 선택하였다. 두 용액(시트레이트 완충액의 mRNA 및 에탄올 용액의 지질)을 펌프 시스템을 사용하여 "T" 혼합기에서 혼합하여, 균질한 펄스없는 흐름을 생성했으며, 여기에서 지질과 mRNA는 공정 전반에 걸쳐 일정한 비율로 혼합되었다. 이것은 원하는 크기와, 보다 균일한 크기 분포의 지표인 낮은 PDI를 가진 균일한 제형을 달성하는 데 중요했다. 이 공정은 높은 효능을 달성하는 데 중요한, 높은 mRNA 캡슐화를 초래했다. 그런 다음, 생성된 용액을 TFF/투석 튜브를 사용하여 완충액 교환하였다.
마우스 연구에서, 지질 A 및 지질 B CA09 HA 제형의 효능은 MC3 LNP 제형 및 재조합 HA(rHA)에 대한 일대일 비교에서 평가하였다. 상이한 양이온성 지질로 제형화된 CA09 (H1) HA mRNA(0.4 μg)는 0일(D0) 및 28일(D28)에 Balb/C 마우스(n=8)에 근육내 주사하였다. HA 억제(HAI) 역가로 표시되는 백신의 면역원성은 도 2a에 도시되어 있다. 데이터는 0일(D0) 및 28일(D28)에 지질 A 또는 지질 B의 2회 면역화가 높은 HAI 역가를 유도하고 동종 바이러스 시험접종(Belgium09 H1N1 바이러스)으로부터 동물을 완전히 보호할 수 있음을 보여준다(도 2b). 시험접종 후 관찰 14일 동안, 지질 A 및 지질 B 처리 그룹 내에서 이환율(체중 감소)의 명백한 징후가 관찰되지 않은 반면, 재조합 단백질 대조군 내 소수의 동물이 이환율을 나타냈다(도 2b).
유사하게, Mich15 인플루엔자 균주(Mich15 N1)로부터의 뉴라미니다제(NA)를 암호화하는 mRNA는 지질 A로 제형화하고, 그 효능에 대해 평가하였다. 지질 A로 제형화된 NA mRNA의 2회 용량(0.4 또는 0.016 μg)은 Balb/c 마우스(n=8)에 근육내 주사하였다. 대조군(n=8)에는 0.6 μg의 hEPO mRNA 또는 희석제를 주사하였다. 마우스의 절반은 연구 0일에 1회 주사(1회 용량)만 받은 반면, 나머지 절반은 연구 0일과 28일에 2회 주사(2회 용량)를 받았다. 데이터는 NA 억제(NAI) 역가로 표시된 바와 같이, 이 N1 지질 A 제형이 강력한 면역 반응을 유도했음을 보여준다(도 3a). 데이터는 백신의 1회 용량 또는 2회 용량으로 처리된 마우스가 Belgium09 H1N1에 의한 치명적인 바이러스 공격으로부터 보호되었음을 추가로 보여준다(도 3b). 보호 수준은 백신 처리군 대 음성 대조군(hEPO 및 희석제)의 NAI 역가와 상관관계가 있었다.
본 LNP로 제형화된 CA09 H1 mRNA는 또한 NHP 모델에서 테스트되었다. mRNA (10 μg)를 지질 A 및 지질 B와 제형화하고, 연구 0일 및 28일에 사이노몰구스 마카크 원숭이(n=6)에 근육내 주사하였다. 모든 LNP에 대해 14일까지 검출 가능한 HAI 프라이밍 및 28일까지 HAI 역가의 상당한 부스트가 관찰되었다(도 4, 오른쪽 패널). ELISA 데이터는 또한 부스트 2주 후에 검출된 강력한 부스트와 함께 테스트된 모든 용량에 대해 14일까지 기준선에 비해 상당한 프라이밍을 입증했다(도 4, 왼쪽 패널). 결과는 본 H1 mRNA 제형이 HAI 및 종점 ELISA 역가에 의해 표시되는 바와 같이, 강력한 면역 반응을 야기하였음을 보여준다.
실시예 3: 인플루엔자 H3N2 LNP 백신 제형
본 실시예는 인플루엔자 균주 Sing16(H3N2)에 대한 mRNA-LNP 백신 제형이 효능에 대해 평가된 실험을 기술한다. 이 실험에 사용된 mRNA 중 하나는 MRT1400이다. MRT1400은 시험관내 전사에 의해 제조된 생합성 코돈-최적화된 HA-H3 (인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, H3 아형) 메신저 RNA (CO-HA-H3 mRNA)이다.
인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, H3 아형에 대한 단백질 서열은 다음과 같다:
MKTIIALSYI LCLVFAQKIP GNDNSTATLC LGHHAVPNGT IVKTITNDRI EVTNATELVQ NSSIGEICDS PHQILDGENC TLIDALLGDP QCDGFQNKKW DLFVERSKAY SNCYPYDVPD YASLRSLVAS SGTLEFKNES FNWTGVTQNG TSSACIRGSS SSFFSRLNWL THLNYTYPAL NVTMPNKEQF DKLYIWGVHH PGTDKDQIFL YAQSSGRITV STKRSQQAVI PNIGSRPRIR DIPSRISIYW TIVKPGDILL INSTGNLIAP RGYFKIRSGK SSIMRSDAPI GKCKSECITP NGSIPNDKPF QNVNRITYGA CPRYVKHSTL KLATGMRNVP EKQTRGIFGA IAGFIENGWE GMVDGWYGFR HQNSEGRGQA ADLKSTQAAI DQINGKLNRL IGKTNEKFHQ IEKEFSEVEG RVQDLEKYVE DTKIDLWSYN AELLVALENQ HTIDLTDSEM NKLFEKTKKQ LRENAEDMGN GCFKIYHKCD NACIESIRNE TYDHNVYRDE ALNNRFQIKG VELKSGYKDW ILWISFAISC FLLCVALLGF IMWACQKGNI RCNICI* (서열번호 1)
이 단백질에 대한 암호화 서열은 코돈-최적화되었다. 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 서열은 도 5a에 도시되어 있으며(서열번호 2), 여기서 야생형 서열은 서열번호 3으로 표시된다. mRNA 구조 및 서열은 각각 도 5b 및 5c에 도시되어 있다. 도면에 도시된 바와 같이, HA-H3 mRNA 암호화 서열은 각각 140개 및 100개 뉴클레오티드의 5’ 및 3’ 비번역 영역(UTR) 옆에 있다. 생합성 HA-H3 mRNA는 또한 5’ UTR의 첫번째 뉴클레오시드에 역 5’-5’ 삼인산염 브릿지를 통해 연결된 7-메틸 구아노신 (m7G) 잔기로 구성된 5’ 캡 구조를 함유하며, 이는 그 자체가 2’-O-리보스 메틸화에 의해 변형된다. 5’ 캡은 리보솜에 의한 번역 개시에 필수적이다. 전체 선형 구조는 대략 100개 내지 500개 아데노신 뉴클레오시드(polyA)의 관으로 3’ 말단에서 종결된다. polyA 영역은 mRNA에 안정성을 부여하고, 번역을 향상시키는 것으로 생각된다. 이러한 모든 구조적 요소는 HA-H3 mRNA의 효율적인 번역을 촉진하는 데 사용되는 자연 발생 구성요소이다.
시험관내 전사에 의해 코돈-최적화된 mRNA 서열을 생산하기 위해 DNA 플라스미드를 작제하였다. 시험관내 전사(IVT) 반응은 RNA 폴리머라제를 이용하여 수행하였다. 반응 혼합물이 침전되었다. 침전된 RNA 샘플을 개별 심층 여과 카세트에 로드하고, 80% 에탄올로 세척하고, 재순환 H2O로 재용해했다. 두 번째 분량의 H2O를 첫 번째 단계와 유사한 방식으로 펌핑했다. 상기 단계를 1회 더 반복하였다. 풀링된 용출액은 50 kD 중공 섬유 TFF 카세트를 사용하여 한외여과/정용여과를 거쳤다. 그런 다음, 각 IVT TFF 풀을 희석하여 캡 및 테일 반응을 준비했다. 캡-테일 반응을 침전시키고, 반응으로부터의 RNA를 정제하고, 상기 기재된 바와 같이 수집하였다. 여과된 mRNA는 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.
이들 실험에서, Sing16 NA (N2) 또는 Sing16 HA (H3; MRT1400 mRNA) 항원을 암호화하는 mRNA는 지질 A 또는 지질 B LNP로 제형화하고, D0 및 D28에 Balb/c 마우스(n=8)에 용량당 0.4 μg의 mRNA를 근육내 주사했다 비교를 위해, 수중유형 에멀젼 아쥬반트(AF03)와 함께 1 μg의 재조합 Sing16 H3 또는 Sing16 N2 단백질을 Balb/c 마우스(n=8)에 근육내 경로로 주사하였다. 면역 반응은 NAI 및 HAI 분석으로 측정되었다.
데이터는 NA(N2) mRNA로 면역화된 동물이 14일까지 검출가능한 NAI 프라이밍 및 28일까지 NAI 역가의 상당한 부스트를 입증하였음을 보여준다(도 6, 오른쪽 패널). 데이터는 또한 HA Sing16 지질 A 및 지질 B 제형이 28일에 부스팅 후 강력한 HAI 반응을 도출했음을 보여준다(도 6, 왼쪽 패널).
유사하게, Sing16 HA mRNA 지질 A 및 지질 B 백신을 비인간 영장류(NHP), 사이노몰구스 마카크 원숭이(n=6)에서 평가하였다. 지질 A 또는 지질 B로 제형화된 HA Sing 16 mRNA(50 μg)를 원숭이에게 근육내 경로로 주사했다. 첫 번째 주사는 연구 0일에 제공되었고 두 번째 주사는 연구 28일에 제공되었다. 데이터는 백신이 28일에 강화된 강력한 면역 기능 반응을 유도했음을 보여준다(도 7a).
또한, 지질 A로 제형화된 HA Sing16 mRNA(즉, MRT5400 백신)의 4가지 용량 수준 - 15, 45, 135 및 250 μg을 NHP에서 평가하였다. 첫 번째 면역화는 연구 0일에 제공되었고 두 번째 면역화는 연구 28일에 제공되었다. 모든 NHP는 D42에 2차 주사 후 2주째에 테스트된 다양한 용량 사이의 면역 반응에서 차이 없이 테스트된 모든 용량에 대해 IgG 결합 및 HAI 역가를 입증하였다(도 7b 및 7c).
Sing16 HA mRNA 지질 A 백신은 또한 두 번째 백신접종 후 NHP에서 T 세포 반응에 대해 평가되었다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 42일에 수집하고, Sing16 H3 재조합 단백질 또는 전체 HA 오픈 리딩 프레임을 나타내는 펩티드 풀과 함께 밤새 인큐베이션하였다. 재자극에 의해 유도된 사이토카인은 ELISPOT 분석에서 평가되었다. IFN-γ, Th1 사이토카인(도 8a), 또는 IL-13, Th2 사이토카인(도 8b)을 분비하는 PBMC의 빈도는 백만 개의 PBMC당 스폿 형성 세포(SFC)로 계산되었다. 시험된 3개의 용량 수준 그룹(250 μg, 135 μg, 및 45 μg)의 대부분의 동물은 백만 PBMC당 100개 초과의 SFC와 함께 높은 빈도의 IFN-γ 분비 세포의 존재를 입증하였다(도 8a). 용량 반응은 관찰되지 않았는데, 이는 저용량 및 고용량 그룹의 동물이 비슷한 빈도의 IFN-γ 분비 세포를 나타냈기 때문이다. 대조적으로, IL-13 사이토카인 분비 세포의 존재는 임의의 시험된 그룹 및 임의의 용량 수준에서 검출되지 않았다(도 8b). 이 데이터는 NHP에서 백신접종 후 Th1-편향 세포 반응 및 HA 항원에 대한 Th2 반응 부족에 대한 명확한 증거를 제시했다.
실시예 4: 변형된 mRNA를 갖는 인플루엔자 LNP 백신 제형
본 실시예는 비변형 (비변형 비복제 또는 “UNR”) 및 변형 (변형 비복제 또는 “MNR”) mRNA를 함유하는 백신의 효능을 비교하는 실험을 기술한다. UNR CA09 HA mRNA 및 MNR CA09 HA mRNA는 시험관내 전사에 의해 준비되었다. MNR에서, 모든 우리딘은 슈도우리딘으로 대체되었다.
지질 A로 제형화된 CA09 HA mRNA (변형 또는 비변형)의 5가지 상이한 용량(0.016, 0.08, 0.4, 2, 및 10 μg)을 Balb/c 마우스(n=15)에 근육내 경로로 주사하였다. 데이터는 LNP 제형이 네이키드 mRNA(UNR)의 안정성 및 전달 효율을 증가시켰음을 보여주며, 이는 UNR과 MNR mRNA 사이의 효능이 HAI 역가에 의해 표시된 바와 유사했기 때문이다(도 9a). Balb/c 마우스에 대한 ELISA 데이터는 또한 테스트된 모든 용량(UNR 및 MNR mRNA 둘 다)에 대해 14일까지 기준선을 넘어 상당한 프라이밍을 입증했으며, 부스트 2주 후에 강력한 부스트가 감지되었다. 데이터는 또한 UNR 및 MNR mRNA가 ELISA 역가 도출에 있어 필적할 만하다는 것을 보여준다(도 9b).
결론적으로, 본 용량 적정 연구는 지질 A로 제형화된 비변형 및 변형 CA09 HA mRNA가 Balb/c 마우스에서 HAI 또는 종점 ELISA 분석에 의해 표시된 바와 같이 통계적으로 구별할 수 없는 면역 반응을 도출해냈다는 것을 입증했다. 4회 더 높은 용량의 UNR 및 MNR mRNA로 면역화된 Balb/c 마우스는 모든 용량에 대해 14일까지 검출 가능한 HAI 프라이밍 및 42일까지 HAI 역가의 상당한 부스트를 입증했다. 이러한 14일 프라이밍 역가는 125배 범위에서 검출 가능한 역가를 생성하기 위한 용량 효과 및 용량 절약 가능성을 모두 나타낸다. 동일한 용량 범위에서 두 번째 주입 역가는 이 mRNA-LNP 제형에 대한 면역 반응의 견고성을 확인한다. 비인간 영장류에서도 유사한 결과가 관찰되었다.
실시예 5: 다가 인플루엔자 백신 LNP 제형
본 실시예는 CA09 HA를 암호화하는 mRNA(실시예 2에 기재된 바와 같음) 및 Sing16 HA를 암호화하는 mRNA(실시예 3에 기재된 바와 같음)를 함유하는 지질 A-기반 LNP 백신을 사용한 연구를 기술한다.
보다 구체적으로, 지질 A내 동시-캡슐화 CA09 HA mRNA 및 Sing16 HA mRNA를 Balb/c 마우스(n=8)에서 평가하였다. mRNA-LNP는 동시-캡슐화된 2개의 mRNA로 투여되거나, 단일 캡슐화된 mRNA로 개별적으로 투여되었다. 두 접근법 모두의 경우, 근육내 주사에 의해 총 0.4 μg LNP 제형을 마우스에 주사하였다. 첫 번째 주사는 연구 0일에 제공되었고 두 번째 주사는 연구 28일에 제공되었다. 데이터는 백신이 강력한 면역 기능 반응을 유도했음을 보여준다. 두 가지 투여 방식 간에 차이가 없는 것으로 나타났다. 이 데이터는 동시-캡슐화가 두 mRNA 사이에 방해 또는 간섭을 일으키지 않았음을 보여준다.
실시예 6: 다가 인플루엔자 백신 LNP 제형에 대한 추가 연구
CA09 HA, Sing16 HA, Sing16 NA, Mich15 NA, A/Perth/16/2009 인플루엔자 바이러스(Perth09 NA), 및 반딧불이 루시페라아제(FF) 및 hEPO의 리포터 항원을 암호화하는 비변형 mRNA의 패널을 제조하였다. 그런 다음, HA 및 NA mRNA-LNP 제제를 위한 LNP 제형을 시험관내 발현, 동물에서의 면역 반응 및 전임상 모델에서의 효능에 대해 시험하였다. 본 실시예의 연구를 위해, 모든 LNP 제형은 지질 A 제형이었다.
재료 및 방법
mRNA-LNP 제제
hEPO, FF, CA09 HA, Sing16 HA, Mich15 NA, 및 Sing16 NA를 암호화하는 mRNA 전사물은 비변형 뉴클레오티드를 사용하여 원하는 유전자를 암호화하는 플라스미드 DNA 주형과 함께 RNA 폴리머라제를 사용하는 시험관내 전사에 의해 합성되었다. 생성된 정제된 전구체 mRNA는 겔 전기영동에 의해 결정된 바와 같은, 대략 200개 뉴클레오티드 길이의 5’ 캡 구조(캡 1) 및 3’ 폴리(A) 테일의 효소적 첨가를 통해 추가로 반응되고, 정제되었다. 모든 mRNA 제제는 -20℃에서 보관하기 전에 캡 1의 순도, 무결성 및 백분율에 대하여 분석하였다. mRNA/지질 나노입자(LNP) 제형의 제조는 상기에 기재되어 있다. 간략하게, 고정된 지질 및 mRNA 비율의 지질 혼합물(이온화가능한 지질, 포스파티딜에탄올아민, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌 글리콜-지질)의 에탄올 용액을 통제된 조건 하에서 산성 pH에서 표적 mRNA의 완충 수용액과 조합하여 균일한 LNP의 현탁액을 생성하였다. 적합한 희석제 시스템으로의 한외여과 및 정용여과 시, 생성된 나노입자 현탁액을 최종 농도로 희석하고, 여과하고, 사용할 때까지 -80℃에서 냉동 보관하였다. mRNA-LNP 제형은 동적 광 산란, 캡슐화 백분율에 의해 크기를 특징화하고, 적절한 완충액으로 희석하여 추가로 사용할 때까지 1 mg/mL으로 -80℃에 보관하였다. hEPO-LNP 및 FF-LNP를 이용하여 생체 내 표적 단백질의 발현 수준을 확인하였다.
HeLa 세포에서 발현되는 S-단백질의 시각화
인플루엔자 NA 및 HA-단백질의 면역세포화학-면역형광 분석은 이전에 기술된 방법(문헌[Kalnin et al., npj Vaccines (2021) 6:61])을 사용하여 2가 H3N2 (Sing16 HA 및 Perth09 NA) mRNA LNP)로 형질감염된 HeLa 세포에서 수행하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드에 고정하고, HA(GeneTex GTX40258), NA, 및 ER 마커 칼넥신(Calnexin)(Abcam ab22595)에 대한 항체 염색을 수행하였다. 공초점 현미경에서 이미지를 캡처한 다음, ER에 대한 HA 및 NA의 공동국소화, 평균 신호 강도 및 세포 면적의 퍼센트를 정량화하기 위한 이미지 분석이 뒤따랐다.
유세포 분석법
인간 골격근 세포(HskMC, Lonza)를 GlutaMAX(Life Technologies), 스트렙토마이신, 페니실린(Gibco), 및 20% 열 불활성화 FBS(VWR)가 보충된 M199(Life Technologies)에서 37℃에서 5% CO2와 함께 배양하였다. 트립신 처리로 세포를 수확하고, PBS로 세척하고, 제조업체의 전기천공 프로그램 D-033에 따라 Nucleofector 2b(Lonza)에서 106개 세포당 12 mg의 mRNA로 인간 1차 근육 세포 형질감염 키트를 사용하여 전기천공했다. 24시간 후 수확된 세포를 고정하고, CYTOFIX™/Perm(BD)으로 투과되고, CA09 HA(Immune Tech), Sing16 HA(30-2F11-F7-A5, GeneTex), Mich15 NA(6G6, Immune Tech) 및 Sing16 NA(40017-RP01, Sino Biologicals) 특이적 Ab로 염색한 다음, PE 접합 염소 항-마우스 IgG 2차 Ab(Southern Biotech) 또는 AF647 접합 염소 항-토끼 IgG(Life Technologies)로 염색하였다. 그런 다음, 항체-표지 세포를 Fortessa(BD)로 획득하고, 각 단백질의 발현을 FLOWJO™(TreeStar)로 분석하였다.
극저온 투과 전자 현미경
PELCO EASIGLOW™ 장치를 사용하여 LNP 샘플 적용 전에 그리드를 플라즈마 세정하고, Vitrobot Mark IV 시스템(ThermoFisher)을 사용하여 100% 습도 및 18℃로 유지된 챔버를 급냉동에 사용하였다. LNP 샘플의 3.0 μl 액적을 탄소 필름과 골드 바가 있는 300 메쉬 R2/1 QUANTIFOIL® 그리드 상에 분배했다. 그리드는 4초 동안 블롯팅되고, 10초 동안 제자리에 고정된 다음, 저장을 위해 액체 에탄에 즉시 동결되고, Krios 현미경으로 옮겨졌다. 카운팅 모드에서 작동하는 BioQuantum 에너지 필터 및 K3 직접 전자 검출기(Gatan)가 장착된 Titan Krios 투과 전자 현미경(ThermoFisher)을 사용하여 노출물을 수집했다. 검출기에서 보정된 물리적 픽셀 크기는 64,000x 배율에 해당하는 1.38 Å이었다. 총 3,141개의 69-프레임 무비 노출이 -0.5 내지 -1.7 μm의 디포커스와 함께 1.045 e/Å2의 프레임당 선량으로 수집되었다. 각 무비 노출에 대해, RELION-3.1.34를 사용하여 패치-기반 모션 보정, 초해상도 픽셀 비닝 및 프레임 선량 가중치를 수행했다. 보정된 이미지에서 700개가 넘는 후보 입자 좌표가 추출되었다. 후속 데이터 분석은 이미지 처리 도구상자가 있는 MATLAB R2019a로 수행하였다.
발현 연구를 위한 마우스 및 NHP의 면역화
4마리의 사이노몰구스 마카크(NHP)(수컷 및 암컷) 그룹과 4 내지 8마리의 수컷 BALB/c 마우스에 HA/NA mRNA-LNP 제형에 사용되기 위한 것과 동일한 비율로 제조된 hEPO-LNP를 10 μg (NHP) 또는 1, 0.5, 0.1, 및 0.05 μg (마우스)의 용량으로 근육내로 투여하였다. 혈액 샘플을 투여 전, 및 투여 후 6시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 채취하여 제조업체의 프로토콜에 따라 R 및 D 시스템, QUANTIKINE® IVD® ELISA, 인간 에리스로포이에틴 면역분석 키트를 사용하는 ELISA를 통해 혈청 hEPO 발현을 모니터링했고, mIU/ml 및 ng/ml의 최종 값으로 보고했다. 간략하게, EPO에 특이적인 마우스 단일클론 항체로 미리 코팅된 마이크로플레이트 웰을 표본 또는 표준과 함께 인큐베이션하였다. 과량의 표본 또는 표준을 제거한 후, 웰을 홀스래디시 퍼옥시다제에 접합된 토끼 항-EPO 다중클론 항체와 함께 인큐베이션하였다. 두 번째 인큐베이션 동안, 항체-효소 접합체는 고정된 EPO에 결합했다. 과량의 접합체를 세척하여 제거하였다. 크로모겐을 웰에 첨가하고, 효소 반응에 의해 산화시켜 청색 복합체를 형성하였다. 산을 첨가하여 반응을 중지시켰고, 이는 청색을 황색으로 변화시켰다. 생성된 색상의 양은 EPO 항체 복합체에 결합된 접합체의 양에 직접적으로 비례했으며, 이는 표본 또는 표준에서의 EPO의 양에 정비례했다. 이 복합체의 흡광도를 측정하고, 흡광도 대 EPO 표준 농도를 플로팅하여 표준 곡선을 생성했다. 미지 표본의 EPO 농도는 표본의 광학 밀도를 표준 곡선과 비교하여 결정하였다. 이 분석에 사용된 표준은 인간 에리스로포이에틴의 소변-유래 형태인 Second International Reference Preparation (67/343)에 대해 보정된 재조합 hEPO였다.
면역원성 연구를 위한 마우스 및 NHP의 면역화
처리군에 따른 Balb/c 마우스(무스 무스쿨루스(Mus musculus))의 그룹을 이소플루란 마취 하에 한쪽 뒷다리에서 0일 및 반대쪽 다리에서 28일에 대퇴사두근에 IM 경로를 통해 0.05 mL 용량의 지정된 백신 제제 또는 희석제로 면역화시켰다. 초기 체중의 20% 초과 감소하고 심각한 임상 징후를 보인 마우스는 연구가 종료되기 전에 동물의 건강에 대한 수의사의 평가 후 안락사시켰다.
나이브 수컷 및 암컷 모리셔스 기원 사이노몰구스 마카크(마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))를 연구를 위해 선택하였다. 동물의 체중은 > 2kg이고, 연구 시작 시점에 >2세였다. 연구를 위해 선택된 동물은 연구에 배정되기 전에 종합적인 신체 검사를 받았다. 건강 상태에 대한 배정-전 평가에는 NIRC SOP에 따라 적용 가능한 CBC 분석을 위한 실습 수의사 검사 및 혈액 샘플 수집이 포함되었다. 동물을 일반적으로 쌍으로 수용하고, 연구 시작 전 적어도 3일 동안 적응시켰다. 그룹은 처리군당 최대 6마리의 동물로 구성되었다. 모든 동물은 케타민 HCl (10 mg/kg, IM) 또는 텔라졸 (4~8 mg/kg, IM) 진정제 하에 0.5 ml 용량의 해당 백신 제제 또는 희석제를 IM 경로를 통해 연구 0일에 삼각근을 표적으로 하여 각 동물의 한 앞다리에 면역화했다. 첫 번째 면역화 후 28일에 동물의 반대쪽 다리에 두 번째 면역화를 실시했다.
시험접종 연구를 위한 마우스 및 NHP의 면역화
마지막 면역화 후 대략 9~12주 후에 마우스에 시험접종 균주를 접종하였다. 스톡 바이러스 바이알을 해동하고, 빙냉 멸균 PBS에서 적절한 농도로 희석했다. 모든 마우스는 4LD50에 해당하는 PBS내에 Belgium09 바이러스의 105.54 TCID50을 함유하는 총 부피 50 μl로 시험접종되었다. 개선된 ABSL2 실험실의 생물안전 캐비닛 내부에서 바이러스 시험접종을 수행했다. 마우스는 먼저 케타민/자일라진 용액(50 mg/kg 케타민 및 5 mg/kg 자일라진)을 IP 주사하여 마취시킨 다음, 마이크로피펫을 사용하여 총 부피 50 μl의 인플루엔자 바이러스를 IN(두 콧구멍에 점적; 콧구멍당 25 μl)으로 시험접종하였다. 시험접종 절차 후, 마우스를 등쪽으로 눕혀서 마취에서 회복될 때까지 관찰하였다. H1N1 시험접종 후 일일 체중을 측정했다. 단일 관찰로 > 20% 체중 감소를 갖는 임의의 개별 동물을 안락사시켰다. 체중 측정은 온라인 데이터베이스인, PRISTIMA®(버전 7.5.0 빌드 8)에서 안락사될 때까지 시험접종 후 매일 기록하거나 연구 특정 작업 시트에 기록했다.
혈액 수집
마우스의 경우, 혈액을 턱밑 또는 안와동 출혈(평생 출혈, 연구 전 및 연구 14일, 28일 및 42일에 약 200 μl) 및 심장 천자(말단 출혈, 56일)를 통해 진정제 상태의 모든 동물로부터 수집하였다. 기준선 면역-전 혈청 샘플을 얻기 위해 그리고 사전 스크리닝 목적을 위해 사전 연구에서 마우스를 채혈했다. 혈청 처리, 혈액 샘플을 SST 튜브에 수집하고 실온에서 30분 내지 1시간 동안 응고되도록 하였다. 그런 다음 샘플을 브레이크를 끈 상태에서 5~10분 동안 1000~1300 g에서 원심분리했다. P200 피펫터를 사용하여 혈청을 수집하고, 2개의 0.5 ml 냉동 바이알로 나누어 -20℃에서 보관했다. 모든 출혈은 표본 수집 및 처리 로그에 문서화되어, 표본 수집 시간과 절차 수행을 담당하는 기술자를 나타낸다. 항체 역가에 대한 HAI 또는 ELLA 및 ELISA 검정에서 혈청 샘플의 일부를 평가하였다.
10 mg/kg 케타민/1 mg/kg 아세프로마진을 사용하여 근육내 투여된 마취하에 혈청 단리를 위해 NHP를 채혈하였다(-4, 2, 7, 14, 28, 30, 35, 42, 56, 90일, 및 180일). 채혈한 혈액의 양은 체중 백분율과 동물의 신체 상태에 대해 확립된 지침을 초과하지 않았다. BD Vacutainer® SST™ 겔 튜브에 부착된 Vacutainer 21 ga x 1” 채혈 바늘 또는 Abbott Butterfly 23 ga x ¾” 튜빙을 사용하여 대퇴부 정맥천자를 사용하여 마취된 NHP에서 혈액을 채취했다. 튜브를 실온에서 1200 x g의 속도로 10분간 회전시켜 혈청을 분리했다. 그런 다음 혈청을 표지된 냉동 바이알(1 ml/바이알)에 분주하고 ≤ -20℃에서 보관했다. 항체 역가에 대한 HAI 또는 ELLA 및 ELISA 검정에서 혈청 샘플의 일부를 평가하였다. PBMC의 경우, NHP는 백신접종 전 및 첫 번째 주사 후 대략 42~63일 후에 사전 채혈되었다. 이를 위해, 헤파린 항응고제를 함유한 BD Vacutainer® 튜브에 혈액을 수집했다. 간략하게, 항응고 혈액 샘플을 PBS에 희석하고, HISTOPAQUE® 분리 용액(Sigma)을 사용하여 400 x g에서 30분 동안 밀도 구배 원심분리를 수행했다. 그런 다음 단핵 세포를 함유하는 불투명한 계면을 수집하고, 마지막 원심분리를 위해 저속(250 x g) 원심분리를 사용하여 PBS에서 3회 세척하여 혈소판 수를 줄였다. 살아있는 대 죽은 PBMC는 Nexcelom Cellometer K2를 사용하여 열거되었다. PBMC는 MR. FROSTY® 냉동 박스를 사용하여 10% DMSO가 포함된 FBS에서 동결보존되었다. 박스를 즉시 -80℃ 냉동고에 24시간 동안 넣은 다음, 액체 질소 탱크에 보관하기 위해 옮겼다.
ELISA
항체 ELISA는 재조합 생산된 Sing16 NA 단백질, Sing16 HA 단백질, 또는 CA09 HA 단백질을 사용하여 수행하였다. 단백질은 탄산염-중탄산염 완충액에서 2 μg/ml의 농도로 96웰 고결합 폴리스티렌 플레이트에 포획되었다. 플레이트를 덮고 2~8℃에서 밤새(16 ± 4시간) 인큐베이션하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 항원 코팅된 플레이트를 세척 완충액(PBS, 0.5% Tween20)으로 5회 세척하고 차단 용액(PBS 중의 10% BSA)으로 실온에서 60±30분 동안 차단시켰다. 테스트 샘플, 나이브 대조군 및 참조 샘플을 샘플 희석제(PBS 10% BSA 0.5% Tween 20)에 희석하고, 웰에 이중으로 첨가한 다음, 실온에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 5회 세척하고, 마우스 혈청용 염소 항-마우스 HRP 또는 NHP 혈청용 염소 항-원숭이 HRP를 1:10,000의 희석 비율로 첨가하였다. 그런 다음 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고 과량의 HRP-IgG를 세척 완충액으로 세척하였다. Sure-Blue TMB 기질을 각 플레이트에 첨가하고, TMB 정지 용액으로 약 10분 후에 반응을 정지시켰다. 그런 다음 플레이트를 Thermo Labsystems MULTISKAN™ 분광광도계로 450 nm에서 판독했다. 항-항원(HA 또는 NA) 특이적 항체 역가는 흡광도 값이 >0.3인 가장 높은 혈청 희석의 역수로 표현되었다.
HAI 분석
Sing16 H3N2 및 CA09 H1N1 바이러스 스톡(BIOQUAL, Inc.)을 사용하여 HAI 분석을 수행하였다. 혈청을 수용체-파괴 효소(RDE)로 1부 혈청을 3부 효소로 희석하여 처리하고, 37℃ 수조에서 밤새 인큐베이션하였다. 효소는 56℃에서 30분간 인큐베이션한 후 최종 희석액이 1/10이 되도록 PBS 6부를 첨가하여 비활성화했다. 바이러스의 4개의 혈구응집 단위(HAU) 및 0.5% 칠면조 RBC를 사용하여 V-바닥 96-웰 플레이트에서 HAI 분석을 수행하였다. 각 균주에 대한 참조 혈청은 모든 분석 플레이트에서 양성 대조군으로 포함되었다. 각 플레이트에는 항원 용량(4 HAU/25 μl)과 음성 대조군 샘플(PBS 또는 나이브 대조군 혈청)을 확인하기 위한 역적정도 포함되어 있다. HAI 역가는 혈구응집의 완전한 억제를 초래하는 혈청의 가장 높은 희석으로 결정되었다. 결과는 적절한 역적정 결과(추가된 4 HAU/25 μl 확인)와 예상 역가의 2배 이내의 참조 혈청 역가가 있는 플레이트에 대해서만 유효했다.
NAI 분석
효소-결합 렉틴 분석(ELLA) 분석을 위한 방법을 사용하여 뉴라미니다제-억제(NAI) 항체 역가를 결정했다. 항원(바이러스 NA)의 공급원을 적정하고, 일련의 혈청 희석액과 함께 인큐베이션하기 위해 표준량을 선택했다. 혈청의 연속 희석액으로 혈청의 적정을 수행하고(56℃에서 1시간 동안 열 불활성화), 표준량의 바이러스를 페투인-코팅된 플레이트의 이중 웰에 첨가했다. 그런 다음, 이 혼합물을 밤새(16~18시간) 인큐베이션하고; 다음날 HRP-접합된 땅콩 응집소 PNA(2.5 μg/ml로 희석됨)를 세척된 플레이트에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 기질(시트르산나트륨의 ODP)을 첨가하고 10분 동안 인큐베이션하여 발색시켰다. 그리고 그런 다음, 정지 완충액(1N 황산)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. OD 490 nm에서 흡광도에 대해 플레이트를 스캔했다. 바이러스 대조군에 비해 색상의 감소 또는 부재는 NA-특이적 항체의 존재로 인한 NA 활성의 억제를 나타낸다. NAI 역가(IC50 값)를 OD 판독으로부터 계산하고, 그 결과를 GraphPad Prism에 그래프로 표시했다. ELLA 적정 곡선이 신뢰할 수 있는 IC50 값을 결정하는 데 적합하지 않은 경우, 샘플을 다른 희석 방식을 사용하여 다시 테스트하여 50% 종점에 도달했다.
T 세포 ELISPOT 분석
완전 배지(DMEM1640 + 10% 열-불활성화된 FCS)를 37℃ 수조에서 미리 데웠다. PBMC를 37℃ 수조에서 빠르게 해동하고, 예열된 배지와 함께 원추형 튜브에 적가하여 옮겼다. 튜브를 1,500 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 세포를 재현탁하고 Guava 세포 계수기를 사용하여 계수했다. 원숭이 IFN-γ ELISPOT 키트(Mabtech 3421M-4APW) 및 IL-13 ELISPOT 키트(Mabtech 3470M-4APW)를 사용하였다. 키트에서 제공하는 미리 코팅된 플레이트를 멸균 PBS로 4회 세척하고, 37℃ 인큐베이터에서 적어도 30분 동안 200 μl의 완전 배지로 차단했다. Sing16 H3 펩티드 풀(Genscript Custom Order)(각 펩티드의 1 μg/ml에서)을 분석에서 리콜 항원으로 사용했다. 2 μg/ml의 ConA(Sigma CAT#C5275)를 양성 대조군으로 사용했다. 50 μl의 리콜 항원과 50 μl 중의 300,000개의 PBMC를 각 웰에 첨가하여 자극하였다. 플레이트를 48시간 동안 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에 두었다.
인큐베이션 후, 세포를 제거하고, 플레이트를 PBS로 5회 세척하고, 100 μl의 1 μg/ml 비오티닐화 항-IFN-γ 또는 항-IL-13 검출 항체를 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 2시간 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS로 5회 세척하고 각 웰에서 스트렙타비딘의 1:1000 희석액 100 μl와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 스폿이 나타날 때까지 100 μl의 BCIP/NBT 기질 용액으로 플레이트를 현상했다. 플레이트를 수돗물로 헹구고, 기건시킨 다음, CTL IMMUNOSPOT® 판독기(Cellular Technology Ltd.)를 사용하여 스캔하고 계수했다. 데이터는 PBMC 백만 개당 스폿 형성 세포(SFC)로 보고되었다.
기억 B 세포(MBC) ELISPOT 분석
제조업체의 지침에 따라 인간 IgG 단색 기억 B 세포 ELISPOT 키트(CAT# NC1911372, CTL)를 사용하여 Sing16 H3-특이적 및 전체 IgG+ 항체-분비 세포(ASC)를 측정하였다. MBC에서 ASC로의 분화는 키트에서 제공하는 자극 칵테일을 사용하여 PBMC에서 수행되었다. 요약하면, 동결된 PBMC를 37℃ 수조에서 빠르게 해동하고, DNase I (CAT# 90083, Fisher Scientific)과 혼합하고, 10% FCS (CAT # SH30073.03, HYCLONE™), 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(CAT# P4333, Sigma)을 함유하는 예열된 완전 배양 배지(CM)(RPMI 1640, (CAT# 22400-089, Gibco)를 함유하는 튜브에 옮기고, 1,500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 세포 펠릿을 ml당 2x106 개 세포로 5 ml의 완전 배지에 재현탁하고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 T25 플라스크로 옮겼다. 그런 다음 세포 현탁액의 부피를 6 ml로 조정하고 B-Poly-S를 1:1000 희석으로 첨가하였다. 세포를 4일 동안 자극을 위해 CO2 인큐베이터에 두었다. 키트에서 제공하는 PVDF 마이크로플레이트를 70% 에탄올로 미리 적시고, 헹구고, 키트에서 제공하는 항-인간 IgG 포획 Ab 또는 4 μg/ml의 Sing16/H3 재조합 단백질 80 μl/웰로 밤새 코팅했다.
자극 4일 후에 세포를 수확하고, 세척하고, 계수하고, CM에서 지정된 농도로 조정하였다. 코팅된 마이크로플레이트를 PBS로 세척하고 CM으로 1시간 동안 차단한 후 비웠다. 100 μl/웰의 세포 현탁액을 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 18시간 동안 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 세척 후, 1:400으로 희석된 항-인간 IgG 비오틴 검출 항체 80 μl/웰을 플레이트에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 1:1000 희석의 스트렙타비딘-AP를 1시간 동안 80 μl/웰로 플레이트에 첨가했다. 신선하게 제조된 기질 용액을 첨가하고, 실온에서 18분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 수돗물로 헹구고, 기건시키고 CTL IMMUNOSPOT® 판독기(Cellular Technology Ltd)를 사용하여 스캔하고 계수했다. 각각의 개별 동물에 대해 IgG+의 수 및 Sing16/H3-특이적 ASC의 수를 PBMC 백만 개당 계산하였다. 항원-특이적 ASC의 빈도는 전체 IgG+ ASC에 대한 항원-특이적 ASC의 %로 계산하였다. 분석 배경을 평가하기 위해, 모든 플레이트의 음성 대조군 웰을 PBS로 코팅하였다(배경이 검출되지 않음).
통계 분석
광도의 Tmax를 추정하기 위해, 관찰된 데이터를 기반으로 개별 대상체의 Tmax를 추정하기 위해 비모수적 방법을 사용하였다. 광도의 반감기를 추정하기 위해, 최대값에 도달한 후 광도에 대한 지수적 감쇠 모델을 가정하고, 최대 광도에서 기준선까지의 감쇠까지의 시간 경과 동안 대상체당 로그 변환된 데이터에 선형 모델을 적용했다(식염수 그룹의 평균 광도를 사용하여 기준선을 추정함). 반감기는 로그 광도가 최대값과 기준선 값 사이의 중간 지점에 도달한 시점으로 추정되었다. 기하 평균으로 요약된 결과를 갖는 상이한 판독값의 분석을 위해, SE 모델 기반 기하 평균 및 SE는 반응이 로그 변환된 판독값이고, 백신접종이 고정 효과이고 시간이 반복 측정인 반복 측정에 대한 혼합 효과 모델로부터 추정되었으며; 그런 다음 모델로부터의 로그-기반 평균 및 SE 추정치를 역변환하여 기하학적 평균 및 SE를 얻었다. 체중변화는 과대기술적 통계분석을 사용하였다. 악화된 시나리오를 평가하기 위해 기준선(0일)으로부터 시간 경과에 따른 최대 % 체중 감소의 각 그룹의 중앙값 및 범위를 보고했으며; 마지막 관찰에서 기준선으로부터 % 체중 변화의 각 그룹의 중앙값 및 범위를 보고하여 체중 회복을 평가했다.
항원 서열
본원에 사용된 Perth09 N2 항원의 서열은 다음과 같다:
MNPNQKIITIGSVSLTISTICFFMQIAILITTVTLHFKQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVYLTNTTIEKEICPKLAEYRNWSKPQCDITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNVHSNNTVRDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCITGDDKNATASFIYNGRLVDSVVSWSKEILRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGKADTKILFIEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDNWKGSNRPIVDINIKDHSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEGGHGVKGWAFDDGNDVWMGRTISEKSRLGYETFKVIEGWSNPKSKLQINRQVIVDRGNRSGYSGIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKEETEVLWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI* (서열번호 4)
본원에 사용된 Mich15 N1 항원의 서열은 다음과 같다:
MNPNQKIITIGSICMTIGMANLILQIGNIISIWVSHSIQIGNQSQIETCNQSVITYENNTWVNQTYVNISNTNFAAGQSVVSVKLAGNSSLCPVSGWAIYSKDNSVRIGSKGDVFVIREPFISCSPLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTIKDRSPYRTLMSCPIGEVPSPYNSRFESVAWSASACHDGINWLTIGISGPDSGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSCFTIMTDGPSDGQASYKIFRIEKGKIIKSVEMKAPNYHYEECSCYPDSSEITCVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQMGYICSGVFGDNPRPNDKTGSCGPVSSNGANGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSISSRKGFEMIWDPNGWTGTDNKFSIKQDIVGINEWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPEENTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK* (서열번호 5)
본원에 사용된 Sing16 H3 항원의 서열은 다음과 같다:
MKTIIALSYILCLVFAQKIPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQNSSIGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFKNESFNWTGVTQNGTSSACIRGSSSSFFSRLNWLTHLNYTYPALNVTMPNKEQFDKLYIWGVHHPGTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIRDIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKHSTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRVQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNETYDHNVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI* (서열번호 6)
본원에 사용된 Sing16 N2 항원의 서열은 다음과 같다:
MNPNQKIITIGSVSLTISTICFFMQIAILITTVTLHFKQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVYLTNTTIEKEICPKPAEYRNWSKPQCGITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNVHSNNTVRDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCITGDDKNATASFIYNGRLIDSVVSWSKDILRTQESECVCINGTCTVVMTDGNATGKADTKILFIEEGKIVHTSKLSGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDNWKGSNRPIVDINIKDHSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLNPNNEEGGHGVKGWAFDDGNDVWMGRTINETSRLGYETFKVVEGWSNPKSKLQINRQVIVDRGDRSGYSGIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKEETEVLWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADLNLMHI* (서열번호 7)
본원에 사용된 CA09 H1 항원의 서열은 다음과 같다:
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDREGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI* (서열번호 24)
본원에 사용된 HA 균주 A/California/7/2009(H1N1)(CA09) 항원 mRNA 오픈 리딩 프레임(ORF)의 서열은 다음과 같다:
AUGAAAGCUAUCCUGGUCGUCUUGCUGUAUACUUUCGCCACUGCCAACGCCGACACCCUGUGUAUCGGUUACCACGCGAACAACUCCACCGACACUGUGGACACCGUGCUCGAAAAGAACGUGACCGUGACUCAUUCUGUGAAUCUGCUCGAGGACAAGCACAACGGAAAGUUGUGCAAGCUGCGCGGAGUGGCACCGCUGCACCUUGGAAAGUGCAACAUUGCCGGAUGGAUCCUGGGAAACCCGGAGUGCGAAAGCCUGAGCACCGCGUCCUCAUGGUCCUACAUCGUGGAAACCCCGUCCUCUGACAACGGCACCUGUUACCCCGGCGAUUUCAUCGACUACGAAGAACUGCGGGAGCAGCUGUCCUCCGUGUCCUCGUUUGAACGCUUCGAGAUUUUCCCUAAGACCUCCAGCUGGCCUAAUCACGAUAGCAACAAGGGCGUGACGGCAGCCUGCCCGCACGCCGGAGCAAAGUCAUUCUACAAGAAUCUGAUUUGGCUCGUGAAGAAAGGGAACUCAUACCCCAAGCUGUCCAAGUCGUACAUCAACGACAAGGGAAAGGAAGUGCUCGUGCUCUGGGGGAUCCACCACCCAUCCACCUCCGCCGACCAGCAGAGCCUGUACCAGAACGCCGAUGCUUACGUGUUUGUGGGUUCCAGCCGGUACUCCAAGAAGUUCAAGCCUGAAAUCGCGAUCAGGCCUAAAGUCCGGGACCGCGAGGGCCGCAUGAACUACUACUGGACUCUCGUGGAGCCUGGAGACAAGAUCACCUUCGAGGCCACCGGAAAUCUCGUGGUGCCACGCUACGCUUUCGCCAUGGAACGGAACGCCGGAAGCGGCAUCAUCAUUAGCGAUACUCCUGUGCAUGACUGUAACACCACGUGCCAGACACCCAAGGGCGCCAUCAACACCAGCCUGCCGUUUCAAAACAUCCAUCCCAUUACCAUUGGGAAGUGCCCCAAAUACGUCAAGUCCACCAAGCUGAGGCUGGCGACCGGACUGCGGAACAUUCCGAGCAUCCAGUCGAGAGGCCUGUUCGGUGCCAUCGCGGGAUUCAUCGAGGGCGGCUGGACUGGAAUGGUGGACGGUUGGUACGGGUAUCACCACCAAAACGAACAGGGAUCAGGCUACGCGGCCGAUUUGAAGUCCACCCAGAACGCCAUUGAUGAAAUCACCAACAAGGUCAACUCCGUGAUUGAGAAGAUGAAUACUCAAUUCACCGCCGUGGGCAAAGAAUUCAAUCACCUGGAGAAGAGAAUAGAGAACCUGAACAAGAAGGUCGACGACGGGUUCCUCGACAUCUGGACCUAUAACGCCGAGUUGCUCGUGCUGCUGGAAAACGAACGGACCCUGGACUAUCACGACUCGAACGUGAAGAACCUGUACGAGAAAGUCCGCUCGCAACUGAAGAACAACGCCAAGGAAAUCGGAAAUGGUUGCUUCGAGUUCUACCAUAAGUGCGACAACACUUGCAUGGAGUCCGUGAAGAACGGCACUUACGAUUACCCCAAGUACUCCGAAGAGGCUAAACUUAACCGGGAAGAGAUCGAUGGCGUGAAGCUCGAGUCCACCAGAAUCUACCAGAUUCUCGCCAUCUACUCGACUGUGGCAUCGAGCCUCGUCCUUGUCGUGUCCCUGGGGGCCAUUUCAUUCUGGAUGUGCUCCAACGGGUCCCUGCAGUGCCGGAUUUGCAUCUAA (서열번호 8)
본원에 사용된 A/Michigan/45/2015(Mich15) 뉴라미니다제(NA) 항원 mRNA 오픈 리딩 프레임(ORF)의 서열은 다음과 같다:
AUGAACCCAAACCAGAAAAUCAUCACGAUUGGCUCGAUUUGCAUGACCAUUGGAAUGGCGAACCUUAUCCUCCAAAUUGGCAACAUUAUCUCGAUCUGGGUCAGCCACUCGAUCCAGAUCGGCAACCAAUCCCAGAUUGAAACUUGCAACCAGAGCGUGAUUACUUACGAAAACAACACGUGGGUGAACCAGACUUACGUCAAUAUUAGCAACACUAACUUCGCCGCUGGGCAGAGCGUCGUCAGCGUGAAGCUCGCCGGAAAUUCCUCGCUCUGCCCCGUGUCCGGCUGGGCGAUCUACAGCAAGGAUAACAGCGUCCGGAUUGGUAGCAAGGGCGACGUUUUCGUGAUCCGCGAACCCUUCAUAUCAUGCUCCCCGCUCGAAUGUCGCACGUUCUUCCUGACCCAAGGCGCCCUGCUGAACGACAAGCACUCCAAUGGCACUAUCAAGGAUCGGAGCCCUUACCGGACCUUGAUGUCCUGCCCUAUUGGAGAAGUGCCUUCACCAUAUAACUCGCGCUUUGAAAGCGUGGCUUGGUCAGCCUCCGCCUGCCAUGACGGGAUUAACUGGCUGACCAUUGGCAUAAGCGGCCCCGAUUCCGGCGCCGUGGCCGUCCUGAAGUACAACGGGAUCAUCACCGACACCAUUAAGUCCUGGCGCAACAACAUCCUGAGGACCCAGGAGUCCGAGUGCGCGUGCGUGAACGGGUCCUGCUUUACCAUCAUGACCGACGGACCGUCCGACGGUCAAGCCUCGUACAAGAUCUUCCGGAUCGAGAAAGGAAAGAUCAUCAAGAGCGUGGAGAUGAAGGCCCCGAACUACCACUACGAGGAAUGUUCAUGCUAUCCCGACUCGUCCGAGAUUACUUGCGUGUGCCGCGACAAUUGGCACGGAUCCAACAGGCCGUGGGUCAGCUUCAACCAGAACCUUGAAUACCAGAUGGGAUACAUUUGCAGCGGAGUGUUCGGGGACAACCCUCGCCCGAACGACAAGACCGGAUCGUGUGGGCCCGUGUCCUCCAACGGCGCAAACGGCGUCAAGGGAUUUUCCUUCAAAUACGGGAACGGGGUCUGGAUCGGACGGACCAAGAGCAUUUCAAGCAGAAAGGGAUUCGAGAUGAUUUGGGACCCGAACGGCUGGACUGGUACCGAUAACAAAUUCAGCAUCAAGCAGGACAUCGUGGGAAUUAACGAGUGGUCCGGUUACUCCGGGAGCUUCGUGCAGCAUCCCGAACUCACUGGACUGGACUGCAUUCGGCCGUGCUUUUGGGUGGAAUUGAUCCGGGGCAGACCUGAGGAGAACACGAUUUGGACCUCCGGCUCCUCGAUCUCGUUCUGCGGAGUGAACUCCGACACCGUGGGAUGGUCCUGGCCCGACGGUGCAGAGCUGCCCUUCACCAUUGAUAAGUAA (서열번호 9)
본원에 사용된 A/Singapore.INFIMH160019/2016(Sing16; H3N2) HA 헤마글루티닌 항원 mRNA 오픈 리딩 프레임(ORF)의 서열은 다음과 같다:
AUGAAAACCAUAAUCGCGCUCUCAUACAUACUUUGCCUGGUCUUUGCCCAAAAGAUCCCUGGCAACGACAACUCAACCGCGACCCUUUGCCUCGGCCAUCACGCCGUGCCGAACGGCACUAUCGUCAAGACCAUCACAAACGACCGCAUCGAAGUGACCAACGCGACUGAGCUAGUGCAGAACUCCAGCAUUGGAGAGAUUUGCGAUUCUCCACACCAAAUCCUGGACGGAGAGAAUUGUACCUUGAUCGACGCGCUGCUGGGGGAUCCGCAGUGCGACGGAUUCCAGAACAAGAAAUGGGACCUUUUCGUGGAACGGAGCAAGGCAUACUCGAAUUGCUACCCCUACGAUGUGCCCGACUACGCCUCGCUGCGGUCCUUGGUCGCUUCCUCCGGGACCCUGGAAUUCAAAAACGAGAGCUUUAAUUGGACCGGAGUGACCCAGAAUGGCACCUCGAGCGCCUGCAUUCGGGGCUCCUCCUCGAGCUUCUUCAGCCGCCUGAACUGGCUCACUCACCUCAACUACACCUACCCGGCACUGAACGUGACCAUGCCGAACAAGGAACAAUUCGACAAGCUCUACAUUUGGGGGGUGCAUCACCCGGGUACCGAUAAGGACCAGAUCUUCCUCUACGCCCAAUCCUCGGGCCGGAUCACCGUGUCCACUAAGCGCUCGCAGCAGGCCGUGAUCCCGAACAUUGGAAGCAGACCCCGCAUUCGCGACAUUCCAUCGAGGAUCUCGAUCUACUGGACGAUUGUCAAGCCUGGCGACAUCCUCCUCAUUAACUCCACCGGGAACCUCAUCGCCCCUCGGGGUUAUUUCAAGAUCCGCAGCGGGAAGUCCUCCAUCAUGAGAAGCGAUGCCCCCAUUGGAAAGUGCAAGUCCGAGUGUAUCACACCUAACGGAAGCAUUCCCAAUGACAAGCCAUUCCAGAACGUGAACAGAAUUACCUACGGAGCUUGCCCUCGCUACGUCAAACAUUCGACCCUCAAGUUGGCGACUGGAAUGCGCAACGUGCCGGAGAAGCAAACCCGGGGGAUCUUCGGGGCUAUCGCGGGAUUCAUCGAAAAUGGAUGGGAAGGAAUGGUCGAUGGUUGGUACGGUUUCAGACACCAGAACUCCGAGGGGCGGGGCCAGGCCGCAGACCUGAAGUCCACUCAGGCCGCGAUUGACCAGAUCAACGGAAAGCUCAACAGACUCAUUGGAAAGACCAACGAAAAGUUCCACCAAAUCGAAAAGGAAUUCUCCGAAGUGGAGGGCCGGGUGCAAGACCUGGAGAAGUACGUGGAGGACACUAAGAUCGACCUUUGGAGCUAUAACGCAGAACUCCUUGUGGCCCUGGAAAACCAGCACACCAUCGACCUGACCGAUUCAGAGAUGAACAAGCUCUUUGAGAAAACUAAGAAGCAACUCCGGGAAAACGCUGAGGACAUGGGAAAUGGAUGCUUUAAGAUCUACCACAAGUGCGACAACGCCUGCAUUGAGUCCAUACGGAACGAAACUUACGACCAUAACGUCUACCGGGAUGAAGCCCUGAACAACAGAUUCCAGAUCAAGGGCGUGGAGCUGAAGUCCGGCUACAAAGAUUGGAUCCUGUGGAUUUCCUUCGCGAUUUCAUGCUUCUUGCUCUGCGUGGCCCUCCUGGGAUUCAUAAUGUGGGCCUGUCAGAAGGGCAACAUUAGGUGCAACAUAUGCAUAUAA (서열번호 10)
본원에 사용된 Perth/16/2009 (H3N2) NA 항원 mRNA 오픈 리딩 프레임(ORF)의 서열은 다음과 같다:
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본원에 사용된 A/Wisconsin/588/2019 항원 mRNA 오픈 리딩 프레임(ORF)의 서열은 다음과 같다:
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본원에 사용된 A/Tasmania/503/2020 항원 mRNA 오픈 리딩 프레임(ORF)의 서열은 다음과 같다:
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본원에 사용된 B/Washington/02/2019 항원 mRNA 오픈 리딩 프레임(ORF)의 서열은 다음과 같다:
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본원에 사용된 B/Phuket/3073/2013 항원 mRNA 오픈 리딩 프레임(ORF)의 서열은 다음과 같다:
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결과
mRNA 항원 제조, 특징화, 및 발현
다양한 인플루엔자 균주에 대한 전장 코돈-최적화 HA 및 NA를 암호화하는 mRNA를 비변형 리보뉴클레오티드를 사용하여 효소적으로 합성하였다. 모든 mRNA 제제는 5' 캡1의 > 95%를 가졌고, 모세관 전기영동에서 단일 균질 피크를 보여주었다. mRNA-LNP 제형은 조절된 조건 하에서 고정된 비율로 mRNA와 다양한 지질 성분을 혼합함으로써 제조되었다. 표 5에 개시된 바와 같이, 모든 mRNA-LNP는 95~105 nm 범위의 균일한 유체역학적 반경 및 0.060~0.136의 다분산 지수(PDI)로 >95% 캡슐화를 나타냈다.
마우스 전임상 테스트에 사용된 LNP 제형의 특성
LNP 크기(nm) PDI 캡슐화(%)
CA09 HA 97.54 0.117 95.2
Sing16 HA 103.2 0.068 97.3
Sing16 NA 105.8 0.128 96.5
Mich15 NA 103.3 0.136 97.4
CA09 HA mRNA-LNP 이미지의 극저온 전자현미경(Cryo-TEM)은 다중-라멜라 내부 코어 구조를 가진 균일한 구형 입자를 보여주었다. 푸리에 변환으로 추가로 분석한 솔리드 코어 구조의 라멜라리티(lamellarity)는 레이어 간 3.7 nm 주기성을 나타냈다. 현미경 사진에서 볼 수 있는 입자의 균일한 형태는 LNP의 적절한 조립과 함께 균질한 LNP 준비를 나타낸다.
CA09 HA, Sing16 HA, Sing16 NA, 또는 Mich15 NA의 캡슐화되지 않은 mRNA 작제물로 인간 골격근 세포(HskMC)를 일시적으로 형질감염시키고, 분석을 위해 단백질-특이적 항체로 염색하여 유세포 분석으로 항원 발현을 확인하였다. HskMC로부터 높은 수준의 HA 및 NA 발현이 관찰되었고, 이는 근육 세포에서의 발현 시 천연 형태 HA 트리머 및 NA 테트라머의 적절한 조립 및 트래피킹을 확인하였다. 발현된 HA 및 NA 단백질의 세포내 국소화를 연구하기 위해, HeLa 세포를 2가 H3N2 LNP로 형질감염시키고 단백질을 면역염색 및 공초점 현미경으로 가시화하였다. NA 신호는 ER에서 강한(약 90%) 공동국재화를 나타내었지만, 투과성 세포가 상응하는 단백질 및 소포체(ER) 마커인 칼넥신에 대한 항체로 염색되었을 때 HA는 ER과 적당히(25%) 공동국재화하는 것으로 밝혀졌다. 이는 초기 NA 및 HA 단백질이 조립을 위해 ER로 전위된다는 이해와 일치한다(문헌[Dou et al., Front Immunol. (2018) 9:1581]).
LNP에 의한 mRNA의 전달 효율 및 최적 제형 매개변수의 선택을 리포터 mRNA 발현을 사용하여 평가하였다(문헌[Thess et al., Molecular Therapy (2015) 23(1):S55]). 0.05, 0.1, 1, 5, μg의 비변형 FF-LNP 제형의 단일 용량을 마우스에 근육내(IM) 투여하였다. 평균 생물발광에 의해 측정된 루시페라아제 활성은 주사 후 6시간에 피크에 도달하고 모든 용량에서 72시간 이후에 검출가능한 mRNA 작제물로부터 지속된 발현을 나타냈다(도 11, 패널 (a)). 높은 수준의 mRNA-매개 단백질 발현은 마우스에서 단일 0.1 μg 용량 및 비인간 영장류(NHP)에서 10 μg의 hEPO로 추가로 확인되었다. 이 연구는 표준 LNP Dlin-MC3-DMA25 제형을 대조군으로 사용하여 LNP를 비교하기 위한 것이었다. ELISA에 의해 정량화된 혈청 hEPO는 hEPO-MC3에 비해 hEPO-LNP로 발현된 약 12배 더 높은 에리스로포이에틴으로 6시간에서 최대 발현을 입증했다(도 11, 패널 (c)). hEPO-LNP 및 hEPO-MC3 둘 다 NHP에서 유사한 발현 동역학을 나타내었고, 6시간 내지 72시간에서 검출가능하였다(도 11, 패널 (d)). 결과는 시험관내 및 생체내 모두에서 발현을 위한 mRNA의 효율적인 전달을 위한 본 LNP 제형의 유용성을 확인시켜주었다.
마우스에서 HA (H1, H3) 및 NA (N1, N2) mRNA-LNP의 면역원성
자연사 및 백신 연구는 인플루엔자 HA 및 NA에 대한 항체가 항바이러스 기능을 가지며 두 항원 모두 효과적인 인플루엔자 백신에 중요한 것으로 간주됨을 보여주었다(문헌[Krammer et al., Nat Rev Immunol. (2019) 19(6):383-97]). 비변형 CA09 HA-LNP 및 Sing16 HA-LNP mRNA 백신은 4주 간격 일정으로 투여된 2, 0.4, 0.08, 또는 0.016 μg mRNA-LNP로 2회 투여 요법으로 BALB/c 마우스(n=8)에서 평가하였다. 동일한 균주의 재조합 HA(rHA) 항원을 사용하여 ELISA에서 전체 IgG 반응을 평가하였다. 단일 투여 후 모든 그룹에서 HA-특이 항체가 검출되었지만, 역가는 두 번째 투여 후 42일에 피크에 달했다(도 12). 기능적 항체를 측정하기 위해, 동종 균주 CA09 및 Sing16에 대해 혈구응집 억제(HAI) 반응을 평가하였다. 28일째에 GMT가 각각 160 및 GMT 70인 CA09-LNP 및 Sing16-LNP 처리군의 2 μg 용량에 대해 1차 투여 후 HAI 역가가 관찰될 수 있었지만, 2차 투여 후 HAI 역가의 더 큰 증가가 관찰되었다. 42일에 GMT 역가는 CA09 -HA-LNP에서 각각 0.016 μg 및 0.4 μg 그룹에 대해 80 및 2200이었고, Sing 16 HA-LNP 그룹에서 각각 0.016 μg 및 0.4 μg 그룹에 대해 14 및 100이었다(도 13).
유사하게, 항-NA 반응을 시험하기 위해, 마우스를 2, 0.4, 0.08, 또는 0.016 μg의 Sing16 NA-LNP 또는 Mich15 NA-LNP로 면역화시켰다. 재조합 NA 항원을 사용한 ELISA를 수행하여 Mich15 NA-LNP 또는 Sing16 NA-LNP 제형에 의해 유도된 전체 IgG 반응을 평가하였다. 동물은 42일째에 두 번째 투여 후 NA 결합 항체의 현저한 증가와 함께 단일 투여 후 높은 항체 결합 반응을 나타냈다(도 14). 효소-결합 렉틴 분석(ELLA)은 H6N1 또는 H6N2 키메라 바이러스에 대한 뉴라미니다제 억제(NAI) 활성에 대한 기능적 항체 역가의 대용물로 사용되었다. 2회 용량의 백신이 단일 용량에 비해 기능성 항체 반응을 실질적으로 증가시켰지만, GMT 800 및 GMT 60으로 NAI 역가를 증진시키는 것은 각각 0.016 μg의 Mich15 NA-LNP 및 Sing16 NA-LNP의 낮은 용량에서도 단일 투여 후에 28일째에 기록되었다. 42일째에, 0.4 μg 내지 0.016 μg의 GMT 역가는 Sing16 NA-LNP 그룹에서 각각 900 및 10200이었으며, 이는 Mich15 NA-LNP의 경우 역가가 ULOQ 초과에 도달하는 용량-의존적 반응을 나타낸다(도 15).
마우스의 바이러스 시험접종으로부터의 보호
마우스 인플루엔자 바이러스 시험접종 모델에서 mRNA 백신의 효능을 시험하기 위해, 본 발명자들은 0 및 4주차에 0.4 μg의 CA09 HA-LNP를 IM으로 BALB/c 마우스에 접종하고, 음성 대조군에는 2회 용량의 LNP 희석제 완충액을 접종했다. 연구 0, 14, 28, 42, 56, 92, 및 107일에 백신 그룹 혈청 샘플에 대한 HAI 역가는 각각 56일 및 92일에 각각 1660 및 1:830의 GMT로 강력한 면역 반응을 입증했다(도 16a). 93일째에, 모든 마우스는 50% 치사 결과(4xLD50)를 야기할 수 있는 용량의 4배인 CA09에 동종인 Belgium09 바이러스로 비강내로 시험접종되었다. 백신 그룹의 모든 마우스는 치사 없이 시험접종에서 살아남았고, 5% 미만의 일시적인 체중 감소로 표시되는 약간의 경미한 이환율을 보였다(도 16b). 그러나, 희석제 대조군에 속한 마우스는 9일까지 높은 치사율(90%)로 이어지는 현저하고 빠른 체중 감소를 겪었다. 이러한 결과는 치명적인 마우스 인플루엔자 시험접종 모델에서 HA-기반 MRT 제형의 높은 효능을 입증했다.
NA-기반 MRT 백신의 보호 효능을 평가하기 위해, BALB/c 마우스에서 유사한 시험접종 실험을 수행했다. Mich15 NA-LNP 백신은 나이브 마우스에서 단일 면역화 후 강력한 NAI 역가를 도출해냈기 때문에(도 16a), 4주 간격에 걸쳐 0.4 또는 0.016 μg의 Mich15 NA-LNP를 투여하여 1개 또는 2개의 투여 요법을 평가하였다. 대조군 그룹은 0.6 μg hEPO-LNP 또는 희석 완충액을 받는 동일한 요법으로 백신접종하였다. 강력한 NAI 역가는 28일에 기록된 Mich15 NA-LNP의 0.4 μg에 대해 14,000 NAI 및 0.016 μg에 대해 1,800 NAI의 GMT로 단일 투여후 관찰되었다(도 17a). 42일째에 2차 면역화 후, NAI 역가는 0.4 μg의 경우 108,000 NAI로, 0.016 μg 그룹의 경우 37,000 NAI로 상승했다. 백신접종 요법 후 12주 넘게 지난 후, 모든 그룹은 4xLD50의 Belgium09 H1N1 바이러스로 시험접종되었다. 처리군에 의한 시간 경과에 따른 기준선으로부터의 개별 체중 변화는 도 17b에 그래프로 나타내었다. 두 대조군의 모든 마우스는 심각한 이환율을 보였고, 감염 후 8일까지 >20%의 체중 감소로 인해 모든 동물을 안락사시켜야 했다. 놀랍게도, 백신 그룹 중 하나를 제외한 모든 동물이 0.016 μg 단회 투여 그룹의 시험접종에서 살아남았으며, 이는 Mich15 NA-LNP의 0.016 μg의 낮은 단회 투여 후에도 사망에 대한 높은 보호 효능을 나타낸다. 더 높은 용량(0.4 μg)은 전반적으로 더 높은 보호를 입증했지만, HA-면역화와 대조적으로 NA 백신접종은 다른 NA 백신의 경우 보고된 관찰과 일치하여 백신접종된 동물이 초기 체중의 10% 중간 체중 감소를 보였기 때문에 체중 감소로부터 보호하기에 충분하지 않았다. 기준선과 비교하여 저용량에서 2.7%의 평균 최종 체중 변화 및 고용량에서 4.8%의 체중 증가를 초래하는 백신접종 그룹의 체중 회복이 관찰되었다. 전반적으로, 그 결과는 단일 저용량 MRT NA-LNP 백신접종이 인플루엔자 NA 활성을 차단하는 데 측정 가능하고 마우스에서 치명적인 시험접종에 대한 보호를 부여하기에 충분한 기능성 항체를 도출할 수 있음을 입증했다.
NHP에서 HA (H3) mRNA-LNP의 면역원성
NHP에서 mRNA-LNP의 면역원성을 평가하기 위해, 15, 45, 135, 및 250 μg의 Sing16 HA-LNP를 포함하는 용량 범위 연구를 NHP에서 수행하였다. 1차 면역화 후, 모든 백신접종된 NHP는 ELISA에서 언급된 바와 같이 재조합 HA 단백질에 반응성인 항체를 발달시켰다(도 18). 역가의 추가 부스팅이 2차 투여 후 관찰되었다. 놀랍게도, 15 μg 용량은 135 μg 용량 수준(95% CI 1.0, 3.6)보다 단지 1.8배 낮은 ELISA 역가를 유도했으며, 이는 15 μg 수준에 가까운 용량 포화를 시사한다. 강력한 HAI 항체는 42일에 모든 용량 그룹에서 유도되었고, 기록된 GMT는 15 μ의 경우 400, 45 μg의 경우 700, 135 μg의 경우 900, 그리고 250 μg의 경우 570이었다. 42일째에, 95% CI를 갖는 GMT 역가의 배수 증가는 135 μg 내지 15 μg에서 2.2배(1.0; 5.0)였고, 135 μg 내지 45 μg 치료군에서 1.3배(0.6; 2.8)였으며, 이는 용량이 증가함에 따라 더 높은 역가를 향한 관찰된 경향에도 불구하고 그룹 간의 차이는 미미했음을 나타낸다(도 19a). 미세중화(MN) 검정에 의해 평가된 중화 효능(도 19b)은 D28에 15 μg의 경우 40, 45 μg의 경우 180, 및 135 μg의 경우 300의 GMT로 용량 효과에 대해 더 나은 경향을 나타냈다.
T 세포는 동물 모델에서 바이러스 부하를 감소시키고 질환 중증도를 제한하는 데 효과적인 것으로 나타났기 때문에(문헌[Rimmelzwaan et al., Vaccine (2008) 26(4):D41-D44]; [Sridhar et al., Nat Med. (2013) 19(10):1305-12]; [Sridhar et al., Front Immunol. (2016) 7:195]), 본 발명자들은 45, 135, 250 μg의 Sing16 HA-LNP 또는 45 μg의 재조합 HA로 백신접종된 NHP에서 리콜 T 세포를 평가했다. 42일째에 수집된 PBMC를 IFN-γ (Th1 사이토카인) 및 IL-13 (Th2 사이토카인) ELISPOT 분석에서 Sing16 HA의 전체 서열에 걸친 풀링된 중복 펩티드로 리콜 자극을 사용하여 평가했다. 250 μg 그룹 중 하나를 제외한 모든 백신접종된 동물은 PBMC 100만개당 28 내지 1328개의 스폿-형성 세포(SFC) 범위의 IFN-γ 분비 세포를 발달시켰다(도 20a). 특히, 용량-반응은 관찰되지 않았고, 더 낮은 용량 및 더 높은 용량 수준의 동물 그룹은 IFN-γ 분비 세포의 유사한 빈도를 나타냈다. 대조적으로, 재조합 Sing16 HA 단백질로 면역화된 대조군의 모든 동물은 IFN-γ 생성 세포의 부재를 입증하였다. IL-13 사이토카인 분비 세포의 존재는 테스트된 모든 그룹에서 검출되지 않았거나 매우 낮았다(도 20b). 데이터는 Sing16 HA-LNP가 현재 개발 중인 SARS-CoV-2 백신인, MRT5500 (Kalnin et al., supra)에서 볼 수 있는 것과 비슷한, NHP에서의 강력한 Th1-편향된 세포 반응을 유도했음을 시사한다.
Sing16 HA-LNP로 면역화한 후 NHP에서의 기억 B 세포(MBC)의 빈도를 조사하기 위해, ELISPOT 분석을 개발하여 체액성 면역 기억의 판독값으로서 항원-특이적 MBC를 정량화했다. 180일째에, 45 μg 또는 15 μg의 Sing16 HA mRNA-LNP 제형 또는 45 μg 용량의 비교자로서 재조합 HA로 면역화된 NHP로부터 PBMC를 수집하였다. 기억 B 세포를 항체 분비 세포(ASC)로 유도하도록 최적화된 PBMC의 4일 다클론 자극을 수행하고, 자극된 PBMC를 항원-특이적 ASC의 빈도를 결정할 수 있는 항원-특이적 ELISPOT에 플레이팅했다. 그런 다음, 항원-특이적 기억 B 세포를 총 IgG+ 기억 B 세포의 백분율로 정량화했다. 항원-특이적 기억 B 세포는 모든 동물에서 검출되었고, 그의 빈도는 45 ug 용량 그룹의 경우 1~5%, 15 μg 용량 그룹의 경우 0.3~1.5%였다. rHA 면역화된 동물에서, 항원-특이적 기억 B 세포가 6마리 동물 중 5마리에서 검출되지 않았기 때문에 기억 B 세포 반응은 현저하게 낮은 것으로 나타났다(도 21). 본 발명자들은 Sing16 HA-LNP는 다른 mRNA 백신과 마찬가지로 면역성을 연장할 것을 약속하는 항-HA 특이적 기억 B 세포의 집단을 도출해낸다고 결론지었다(문헌[Lindgren et al., Front Immunol. (2019) 10:614]).
다가 인플루엔자 바이러스 항원
mRNA-LNP 플랫폼의 이점은 다수의 mRNA 항원 작제물에 대한 LNP 캡슐화의 유연성이다. 그러나, 항원 간섭 문제를 해결하려면 이 가능성을 테스트해야 한다. 인플루엔자 항원의 조합을 조사하기 위해, H3H1, H3N2, 또는 N1N2 조합에서 0.2 μg의 각각의 mRNA를 함유하는 2가 제형으로서, 또는 0.2 μg의 각각의 상응하는 항원을 함유하는 1가 제형으로서 동시-캡슐화 HA 및 NA mRNA를 LNP에서 제형화하였다. 2가 대 1가 제형에서 개별 항원의 기능성 역가를 비교함으로써 면역원성에 대한 임의의 항원 간섭을 결정하기 위해 이들 제형을 마우스에 투여하였다(도 22, 패널 (a)~(c) 및 표 6).
H3 mRNA-LNP 백신으로 백신접종된 NHP에서의 항원 특이적 기억 B 세포의 빈도
동물 그룹 동물 ID Ag-특이적 IgG의 웰 당
PBMC 		Ag-특이적 IgG의 스폿 #/백만 PBMC 총 IgG의 웰 당
PBMC 		총 IgG의 스폿 #/백만 PBMC 총 IgG에 대한 Ag-특이적 IgG의 %
H3 mRNA-LNP
(45 μg) 		1 3 x 105 1082 5x103 21700 5.0
2 3 x 105 232 5x103 6100 3.8
3 3 x 105 282 5x103 11700 2.4
4 3 x 105 2 5x103 100 2.0
5 3 x 105 283 5x103 8700 3.3
6 3 x 105 225 5x103 22800 1.0
H3 mRNA-LNP
(15 μg) 		1 3 x 105 63 5x103 21600 0.3
2 3 x 105 58 5x103 11300 0.5
3 3 x 105 253 5x103 17300 1.5
4 3 x 105 173 5x103 17300 1.0
5 3 x 105 63 5x103 9300 0.7
6 3 x 105 107 5x103 19300 0.6
rHA
(45 μg) 		1 3 x 105 2 5x103 19800 0.0
2 3 x 105 28 5x103 14300 0.2
3 3 x 105 2 5x103 17000 0.0
4 3 x 105 0 5x103 7900 0.0
5 3 x 105 0 5x103 21600 0.0
6 3 x 105 0 5x103 14600 0.0
희석제 1 3 x 105 0 5x103 30900 0.0
2 3 x 105 0 5x103 7100 0.0
H1H3 콤보에서, 동시-캡슐화된 백신과 별도로 투여된 백신 사이에서, HAI 역가의 경우 시점에 상관없이 통계적으로 유의한 차이가 나타나지 않았고(p=0.2584), D42에 H3 역가의 경우 유의한 차이가 나타나지 않았다(p=0.8389). H3N2 콤보의 경우, 백신의 NA 성분이 HA 성분과 결합하여 높은 중화 항체를 유도하여 HA 우위성이 부족함을 보여준다. 동시-캡슐화된 백신과 별도로 투여된 백신 사이에서, H3 역가의 경우 시점에 상관없이 통계적으로 유의한 차이가 나타나지 않았고(p=0.2960), D42에 N2 역가의 경우 유의한 차이가 나타나지 않았다(p=0.0904). 마찬가지로, N1N2 콤보는 N2에 대해 통계적으로 유의한 차이가 없었다(p=0.3899). 동시-캡슐화되고 개별적으로 투여된 백신에 대한 42일째 N1 역가는 정량 한계 초과였다. 따라서, N2N1, H3H1, 또는 H3N2의 조합은 개별적으로 제형화된 개별 LNP와 동등한 항체 역가를 생성했다.
본 발명자들은 동시-캡슐화된 H1, N1, H3, 및/또는 N2 mRNA의 4가 제형을 추가로 조사하였다. 이들 제형은 각각 2.5 μg의 인플루엔자 항원 mRNA 및 충전량의 비암호화 mRNA(nc mRNA)가 조합되어 필요한 경우 4가(H1N1H3N2), 2가(H1N1 또는 H3N2), 또는 1가(H1, H3, N1, 또는 N2) LNP로 구성된 총 10 μg의 NHP에서 시험되었다(표 7).
마우스 연구에서 인플루엔자 바이러스의 2가 조합
그룹 N mRNA1 mRNA2 LNP mRNA 용량(μg) 설명 CA09 HAI Sing16 HAI Mich15 NAI Perth09 NAI
1 8 Sing16 H3 Perth09 N2 네 0.2, 0.2 동시제형화됨 x x
2 8 분리 x x
3 8 CA09 H1 Sing16 H3 동시제형화됨 x x
4 8 분리 x x
5 8 Mich15 N1 Perth09 N2 동시제형화됨 x x
6 8 분리 x x
7 8 희석제 - - 0 단일 x x x x
H1 또는 H3에 대한 HAI 역가, 또는 N1 또는 N2에 대한 NAI 역가를 1가 제형 대 2가 또는 4가 제형 간에 비교하였다(도 23). 42일에, 4가 그룹의 H1에 대한 HAI 역가는 H1 1가 그룹(p=0.9054, t-검정, 독립표본, 양측) 또는 H1N1 2가 그룹(p=0.8002)과 비교했을 때 비슷했다. 유사하게, 4가 그룹의 H3 HAI 역가는 H3 1가 그룹(p=0.2504) 또는 H3N2 2가 그룹(p=0.5894)과 분석했을 때 비슷했다. N1에 대한 NAI 역가는 N1 1가 mRNA 또는 H1N1 2가 mRNA 또는 4가 H1N1H3N2 mRNA 제형으로 백신접종된 동물 그룹에서 거의 동일했다. 마찬가지로, N2 1가 mRNA (p=0.8485) 또는 H3N2 2가 mRNA (0.4545)와 4가 H1N1H3N2 mRNA 제형 사이의 N2 NAI 역가에는 차이가 없었다.
전반적으로, 이러한 발견은 이 용량 수준에서 HA/NA mRNA-LNP의 동시-캡슐화 또는 조합 다가 백신이 항원 간섭에 대한 어떠한 우려도 없이 모든 4개의 항원을 효율적으로 전달할 수 있고 이들 항원이 단독으로 전달되었을 때 모든 항원이 제형에서와 같이 면역원성이었음을 나타낸다.
실시예 7: 추가의 LNP 제형
지질 C(양이온성 지질 GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1 함유), 지질 D(양이온성 지질 GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10 함유), 및 지질 E(양이온성 지질 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14 함유)로 명명된, mRNA 백신을 위한 추가 LNP 제형을 제조하였다. 인간 에리스로포이에틴(hEPO) mRNA를 테스트 mRNA로 사용하였다. hEPO의 발현은 LNP가 주사된 마우스로부터 취한 샘플로부터 ELISA에 의해 측정하였다. 주사 후 6시간, 24시간, 48시간, 및 72시간 후에 샘플을 채취하였다. 도 24에 도시된 바와 같이, hEPO 발현은 양이온성 지질 MC3을 함유하는 대조군 LNP 제형과 비교하여, LNP 제형 지질 A, 지질 B, 지질 C, 지질 D, 및 지질 E를 사용하여 모든 시점에서 일관되게 더 높았다.
하기 표 8은 MC3 양이온성 지질을 함유하는 대조군 LNP에 대한 결과를 요약한 것이다.
MC3에 대한 LNP 제형 지질 A-E로부터의 hEPO의 수준.
LNP 제형 6시간에 hEPO의 증가된 배수
(MC3와 비교됨)		 STDEV
지질 A 10.35 4.15
지질 B 5.62 1.34
지질 D 7.78 2.79
지질 E 6.17 1.57
다음으로 동일한 hEPO mRNA-LNP 제형을 비 영장류(NHP)에서 시험하였다. 주사 후 6시간, 48시간, 및 96시간 후에 샘플을 채취하였다. 도 25에 도시된 바와 같이, 각각의 LNP 제형은 MC3 대조군 제형에 필적하는 수준의 hEPO를 생성하였다.
인플루엔자 HA-암호화 mRNA-LNP 제형은 또한 NHP에서 시험하였다. NHP는 근육내 주사를 통해 10 μg의 LNP 제형을 투여받았고, 샘플은 주사 후 28일 및 42일에 채취하였다. HAI 역가는 전술한 바와 같이 측정하였다. 도 26에 도시된 바와 같이, 각각의 LNP 제형은 MC3 대조군 제형과 비슷하거나 더 높은 HAI 역가를 생성하였다.
도 26에 도시된 것과 동일한 실험은 Cal09 H1 인플루엔자 항원으로 HAI 역가를 측정하면서 수행하였다. 도 27에 도시된 바와 같이, 각각의 LNP 제형은 MC3 대조군 제형과 비슷하거나 더 높은 HAI 역가를 생성하였다.
도 28에 도시된 바와 같이, Sing16 H3 항원을 사용한 HAI 역가는 LNP 제형 지질 C 및 지질 D에 대해 상승하였다.
실시예 8: 4가 또는 8가 인플루엔자 백신 LNP 제형에 대한 추가 연구
다양한 다가 LNP-인플루엔자 mRNA 백신을 투여한 마우스로부터 HAI 역가 및 NAI 역가를 측정하였다. 인플루엔자 균주 A/Michigan/45/2015, A/SINGAPORE/INFIMH160019/2016, B/Maryland/15/2016 BX69A, 및 B/Phuket/3073/2013에 대해 HAI 역가를 측정하였다. 인플루엔자 균주 A/Michigan/45/2015, A/SINGAPORE/INFIMH160019/2016, B/Colorado/06/201, 및 B/Phuket/3073/2013에 대해 NAI 역가를 측정하였다.
HAI 역가 및 NAI 역가를 1가 또는 4가 HA 또는 NA mRNA 백신을 투여받은 마우스와 비교하였다.
마우스에게 0일에 프라임 백신을 주사하고, 21일에 동일한 용량의 부스터 백신을 주사하였다. 혈액을 1일, 20일, 22일 및 35일에 수집하였다. HA 또는 NA 항원을 암호화하는 mRNA를 함유하는 1가 조성물의 경우, 하기 중 각각을 개별적으로 암호화하는 mRNA를 사용하였다: H1, H3, B/빅토리아 계통으로부터의 HA, 및 B/야마가타 계통으로부터의 HA(특히 균주 A/Michigan/45/2015; A/Singapore/Infimh160019/2016; B/Maryland/15/2016; 및 B/Phuket/3037/2013로부터). 각각의 N1, N2, B/빅토리아 계통으로부터의 NA 및 B/야마가타 계통으로부터의 NA, 및 각각의 H1, H3, B/빅토리아 계통으로부터의 HA 및 B/야마가타 계통으로부터의 HA(특히 균주 A/Michigan/45/2015; A/Singapore/Infimh160019/2016; B/Colorado/06/2017; 및 B/Phuket/3037/2013으로부터)를 암호화하는 mRNA를 함유하는 4가 백신 조성물을 또한 제조하였다. 마지막으로, 각각의 H1, H3, B/빅토리아 계통으로부터의 HA, B/야마가타 계통으로부터의 HA, 각각의 N1, N2, B/빅토리아 계통으로부터의 NA 및 B/야마가타 계통으로부터의 NA(특히 균주 A/Michigan/45/2015; A/Singapore/Infimh160019/2016; B/Colorado/06/2017; 및 B/Phuket/3037/2013으로부터)를 암호화하는 mRNA를 함유하는 8가 백신 조성물을 제조하고, 8가 백신으로 투여했다. 모든 조성물에 대한 각 mRNA는 0.4 mg/균주의 양으로 첨가되었다. 각 그룹에 대해, n=6 마우스이다.
각 실험 그룹의 개요는 하기 표 9에 인용되어 있다.
마우스의 다가 인플루엔자 백신에 대한 실험군 개요
그룹 # N 프라임 (D0)/부스트 (D21) - NA mRNA 용량 mRNA NA (균주당 μg) 프라임 (D0)/부스트 (D21) - HA (NA와 함께) 용량 rHA (균주당 μg) 아쥬반트 (rHA)
1 6 LNP 희석제 - - - -
3 6 NA mRNA-LNP (N2 Perth) 0.4 - - -
4 6 NA mRNA-LNP (N1) 0.4 - - -
5 6 NA mRNA-LNP (N2) 0.4 - - -
6 6 NA mRNA-LNP (NV) 0.4 - - -
7 6 NA mRNA-LNP (NY) 0.4 - - -
8 6 NA mRNA-LNP (N1, N2, BV, BY) 0.4 - - -
9 6 - - HA mRNA-LNP (H1) 0.4 -
10 6 - - HA mRNA-LNP (H3) 0.4 -
11 6 - - HA mRNA-LNP (BV) 0.4 -
12 6 - - HA mRNA-LNP (BY) 0.4 -
13 6 - - HA mRNA-LNP (H1, H3, BV, BY) 0.4 -
14 6 NA mRNA-LNP (N1, N2, BV, BY) 0.4 HA mRNA-LNP (H1, H3, BV, BY) 0.4 -
도 29에 도시된 바와 같이, 8가 mRNA-LNP 제형은 4개의 인플루엔자 균주 중 3개에 대해 4가의 4배 이내의 HAI 역가를 나타냈다.
위의 그룹 각각에 대한 NAI 역가 결과의 개요가 도 31에 도시되어 있다. 8가 mRNA-LNP 제형은 4가 mRNA-LNP 제형과 비슷한 NAI 역가를 나타냈다.
따라서, 데이터는 8가 백신이 강력한 HA 및 NA 면역 반응을 유도할 수 있고 4개의 상이한 인플루엔자 균주로부터의 면역우성 HA의 존재가 항-NA 면역 반응을 억제하거나 방해하는 것으로 보이지 않는다는 것을 입증한다.
다양한 다가 LNP-인플루엔자 mRNA 백신이 투여된 흰담비로부터 HA 및 NAI 역가에 대한 고함량 영상-기반 중화 시험(HINT) 역가를 추가로 측정하였다. HINT 분석은 Jorquera et al.의 문헌(Scientific Reports. 9: 2676. 2019)에 추가로 상세히 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 인플루엔자 균주 A/Michigan/45/2015, A/SINGAPORE/INFIMH160019/2016, B/IOWA/06/2017, 및 B/Phuket/3073/2013에 대해 HINT 역가를 측정하였다. 인플루엔자 균주 A/Michigan/45/2015, A/SINGAPORE/INFIMH160019/2016, B/Colorado/06/201, 및 B/Phuket/3073/2013에 대해 NAI 역가를 측정하였다.
다가 백신 면역원성을 평가하기 위해 사용된 흰담비를 하기 표 12에 나타낸 바와 같이, (1) NA 항원을 암호화하는 4개의 mRNA(N1, N2, BvNA, 및 ByNA)의 혼합물, (2) HA 항원을 암호화하는 4개의 mRNA(H1, H3, BvHA, 및 ByHA)의 혼합물, 또는 (3) NA 항원을 암호화하는 4개의 mRNA(N1, N2, BvNA, 및 ByNA) 및 HA 항원을 암호화하는 4개의 mRNA(H1, H3, BvHA, 및 ByHA)의 혼합물로 21일 간격으로 2회 백신접종하였다. 각각의 HA는 다음 4개의 균주 중 하나로부터의 HA를 포함한다: A/Michigan/45/2015 (H1); A/Singapore/Infimh-16-0019/2016 (H3); B/Iowa/06/2017 (B/빅토리아 계통); 및 B/Phuket/3073/2013 (B/야마가타 계통). 모든 항원은 1:1 비율로 투여하였다.
각 실험 그룹의 개요는 하기 표 10에 인용되어 있다.
모든 흰담비는 기준선, 부스터 1일 전 또는 직전, 부스터 백신접종 시 및 필요에 따라 시험접종 2주 후에 진정제(이소플루란) 하에 채혈되었다. NAI 활성을 평가하기 위해 ELLA에서 혈청 샘플(필요할 때까지 -20℃에 보관)을 테스트했다. 추가로, 다가 백신접종 후 헤마글루티닌 항원에 대한 항체 반응을 평가하기 위해 헤마글루티닌 억제 분석(HAI)을 수행하였다.
흰담비의 다가 인플루엔자 백신에 대한 실험군 개요
그룹 # N 프라임 (D0)/부스트 (D21) - NA 프라임 (D0)/부스트 (D21) - HA 용량(균주당 μg) 아쥬반트
1 6 PBS PBS 0 -
11 6 NA mRNA-LNP (N1, N2, BV, BY) - 1 -
12 6 NA mRNA-LNP (N1, N2, BV, BY) - 15 -
13 6 - HA mRNA-LNP (H1, H3, BV, BY) 1 -
14 6 - HA mRNA-LNP (H1, H3, BV, BY) 15 -
15 6 NA mRNA-LNP (N1, N2, BV, BY) HA mRNA-LNP (H1, H3, BV, BY) 1 -
16 6 NA mRNA-LNP (N1, N2, BV, BY) HA mRNA-LNP (H1, H3, BV, BY) 15 -
위의 그룹 각각에 대한 HINT 결과의 개요가 도 30에 도시되어 있다. 8가 mRNA-LNP 제형은 4가 mRNA-LNP 제형과 비슷한 HINT 역가를 나타냈다.
위의 그룹 각각에 대한 NAI 역가 결과의 개요가 도 32(20일) 및 도 33(42일)에 도시되어 있다. 8가 mRNA-LNP 제형은 4가 mRNA-LNP 제형과 비슷한 NAI 역가를 나타냈다. 이는 20일 및 42일 샘플에서 사실이었다.
SEQUENCE LISTING <110> Sanofi CHIVUKULA, SUDHA ALEFANTIS, Tim <120> MULTIVALENT INFLUENZA VACCINES <130> PAT21205-730050-SA9-324PC <140> PCT/IB2022/055655 <141> 2022-06-17 <150> US 63/212,523 <151> 2021-06-21 <150> US 63/276,243 <151> 2021-11-05 <150> PCT/US2021/058250 <151> 2021-11-05 <150> EP21315198.8 <151> 2021-10-13 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 566 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H3 sub type of Influenza virus hemagglutinin <400> 1 Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala 1 5 10 15 Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly 20 25 30 His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp 35 40 45 Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile 50 55 60 Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys 65 70 75 80 Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln 85 90 95 Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn 100 105 110 Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val 115 120 125 Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Lys Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr 130 135 140 Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Ile Arg Gly Ser Ser 145 150 155 160 Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr 165 170 175 Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Lys Glu Gln Phe Asp Lys 180 185 190 Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile 195 200 205 Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg 210 215 220 Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg 225 230 235 240 Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly 245 250 255 Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly 260 265 270 Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala 275 280 285 Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile 290 295 300 Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala 305 310 315 320 Cys Pro Arg Tyr Val Lys His Ser Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met 325 330 335 Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala 340 345 350 Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly 355 360 365 Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys 370 375 380 Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu 385 390 395 400 Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser 405 410 415 Glu Val Glu Gly Arg Val Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr 420 425 430 Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu 435 440 445 Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe 450 455 460 Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn 465 470 475 480 Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Glu Ser 485 490 495 Ile Arg Asn Glu Thr Tyr Asp His Asn Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu 500 505 510 Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys 515 520 525 Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys 530 535 540 Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile 545 550 555 560 Arg Cys Asn Ile Cys Ile 565 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MRT10279 <400> 2 aggtgcaaca tatgcatata a 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3_WT <400> 3 agatgcaaca tttgcatttg a 21 <210> 4 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Perth09 N2 antigen <400> 4 Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Val Ser Leu Thr 1 5 10 15 Ile Ser Thr Ile Cys Phe Phe Met Gln Ile Ala Ile Leu Ile Thr Thr 20 25 30 Val Thr Leu His Phe Lys Gln Tyr Glu Phe Asn Ser Pro Pro Asn Asn 35 40 45 Gln Val Met Leu Cys Glu Pro Thr Ile Ile Glu Arg Asn Ile Thr Glu 50 55 60 Ile Val Tyr Leu Thr Asn Thr Thr Ile Glu Lys Glu Ile Cys Pro Lys 65 70 75 80 Leu Ala Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Asp Ile Thr Gly 85 90 95 Phe Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly 100 105 110 Asp Ile Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Asp Lys 115 120 125 Cys Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asn Asn Val His 130 135 140 Ser Asn Asn Thr Val Arg Asp Arg Thr Pro Tyr Arg Thr Leu Leu Met 145 150 155 160 Asn Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val Cys Ile 165 170 175 Ala Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Val 180 185 190 Cys Ile Thr Gly Asp Asp Lys Asn Ala Thr Ala Ser Phe Ile Tyr Asn 195 200 205 Gly Arg Leu Val Asp Ser Val Val Ser Trp Ser Lys Glu Ile Leu Arg 210 215 220 Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Thr Val Val 225 230 235 240 Met Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Lys Ala Asp Thr Lys Ile Leu Phe 245 250 255 Ile Glu Glu Gly Lys Ile Val His Thr Ser Thr Leu Ser Gly Ser Ala 260 265 270 Gln His Val Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr Pro Gly Val Arg 275 280 285 Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Ile Val Asp 290 295 300 Ile Asn Ile Lys Asp His Ser Ile Val Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly 305 310 315 320 Leu Val Gly Asp Thr Pro Arg Lys Asn Asp Ser Ser Ser Ser Ser His 325 330 335 Cys Leu Asp Pro Asn Asn Glu Glu Gly Gly His Gly Val Lys Gly Trp 340 345 350 Ala Phe Asp Asp Gly Asn Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Ser Glu 355 360 365 Lys Ser Arg Leu Gly Tyr Glu Thr Phe Lys Val Ile Glu Gly Trp Ser 370 375 380 Asn Pro Lys Ser Lys Leu Gln Ile Asn Arg Gln Val Ile Val Asp Arg 385 390 395 400 Gly Asn Arg Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Lys Ser 405 410 415 Cys Ile Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Lys Glu 420 425 430 Glu Thr Glu Val Leu Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val Val Phe Cys Gly 435 440 445 Thr Ser Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala Asp Ile 450 455 460 Asn Leu Met Pro Ile 465 <210> 5 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mich15 N1 antigen <400> 5 Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Ile Cys Met Thr 1 5 10 15 Ile Gly Met Ala Asn Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile 20 25 30 Trp Val Ser His Ser Ile Gln Ile Gly Asn Gln Ser Gln Ile Glu Thr 35 40 45 Cys Asn Gln Ser Val Ile Thr Tyr Glu Asn Asn Thr Trp Val Asn Gln 50 55 60 Thr Tyr Val Asn Ile Ser Asn Thr Asn Phe Ala Ala Gly Gln Ser Val 65 70 75 80 Val Ser Val Lys Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Val Ser Gly 85 90 95 Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Val Arg Ile Gly Ser Lys Gly 100 105 110 Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser Pro Leu Glu 115 120 125 Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His 130 135 140 Ser Asn Gly Thr Ile Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser 145 150 155 160 Cys Pro Ile Gly Glu Val Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser 165 170 175 Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Ile Asn Trp Leu Thr 180 185 190 Ile Gly Ile Ser Gly Pro Asp Ser Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr 195 200 205 Asn Gly Ile Ile Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu 210 215 220 Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr 225 230 235 240 Ile Met Thr Asp Gly Pro Ser Asp Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe 245 250 255 Arg Ile Glu Lys Gly Lys Ile Ile Lys Ser Val Glu Met Lys Ala Pro 260 265 270 Asn Tyr His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Ser Glu Ile 275 280 285 Thr Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val 290 295 300 Ser Phe Asn Gln Asn Leu Glu Tyr Gln Met Gly Tyr Ile Cys Ser Gly 305 310 315 320 Val Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly 325 330 335 Pro Val Ser Ser Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys 340 345 350 Tyr Gly Asn Gly Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Ile Ser Ser Arg 355 360 365 Lys Gly Phe Glu Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp 370 375 380 Asn Lys Phe Ser Ile Lys Gln Asp Ile Val Gly Ile Asn Glu Trp Ser 385 390 395 400 Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp 405 410 415 Cys Ile Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Glu 420 425 430 Glu Asn Thr Ile Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val 435 440 445 Asn Ser Asp Thr Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro 450 455 460 Phe Thr Ile Asp Lys 465 <210> 6 <211> 566 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sing16 H3 antigen <400> 6 Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala 1 5 10 15 Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly 20 25 30 His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp 35 40 45 Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile 50 55 60 Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys 65 70 75 80 Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln 85 90 95 Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn 100 105 110 Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val 115 120 125 Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Lys Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr 130 135 140 Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Ile Arg Gly Ser Ser 145 150 155 160 Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr 165 170 175 Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Lys Glu Gln Phe Asp Lys 180 185 190 Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile 195 200 205 Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg 210 215 220 Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg 225 230 235 240 Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly 245 250 255 Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly 260 265 270 Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala 275 280 285 Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile 290 295 300 Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala 305 310 315 320 Cys Pro Arg Tyr Val Lys His Ser Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met 325 330 335 Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala 340 345 350 Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly 355 360 365 Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys 370 375 380 Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu 385 390 395 400 Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser 405 410 415 Glu Val Glu Gly Arg Val Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr 420 425 430 Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu 435 440 445 Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe 450 455 460 Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn 465 470 475 480 Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Glu Ser 485 490 495 Ile Arg Asn Glu Thr Tyr Asp His Asn Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu 500 505 510 Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys 515 520 525 Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys 530 535 540 Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile 545 550 555 560 Arg Cys Asn Ile Cys Ile 565 <210> 7 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sing16 N2 antigen <400> 7 Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Val Ser Leu Thr 1 5 10 15 Ile Ser Thr Ile Cys Phe Phe Met Gln Ile Ala Ile Leu Ile Thr Thr 20 25 30 Val Thr Leu His Phe Lys Gln Tyr Glu Phe Asn Ser Pro Pro Asn Asn 35 40 45 Gln Val Met Leu Cys Glu Pro Thr Ile Ile Glu Arg Asn Ile Thr Glu 50 55 60 Ile Val Tyr Leu Thr Asn Thr Thr Ile Glu Lys Glu Ile Cys Pro Lys 65 70 75 80 Pro Ala Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Gly Ile Thr Gly 85 90 95 Phe Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly 100 105 110 Asp Ile Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Asp Lys 115 120 125 Cys Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asn Asn Val His 130 135 140 Ser Asn Asn Thr Val Arg Asp Arg Thr Pro Tyr Arg Thr Leu Leu Met 145 150 155 160 Asn Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val Cys Ile 165 170 175 Ala Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Val 180 185 190 Cys Ile Thr Gly Asp Asp Lys Asn Ala Thr Ala Ser Phe Ile Tyr Asn 195 200 205 Gly Arg Leu Ile Asp Ser Val Val Ser Trp Ser Lys Asp Ile Leu Arg 210 215 220 Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Thr Val Val 225 230 235 240 Met Thr Asp Gly Asn Ala Thr Gly Lys Ala Asp Thr Lys Ile Leu Phe 245 250 255 Ile Glu Glu Gly Lys Ile Val His Thr Ser Lys Leu Ser Gly Ser Ala 260 265 270 Gln His Val Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr Pro Gly Val Arg 275 280 285 Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Ile Val Asp 290 295 300 Ile Asn Ile Lys Asp His Ser Ile Val Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly 305 310 315 320 Leu Val Gly Asp Thr Pro Arg Lys Asn Asp Ser Ser Ser Ser Ser His 325 330 335 Cys Leu Asn Pro Asn Asn Glu Glu Gly Gly His Gly Val Lys Gly Trp 340 345 350 Ala Phe Asp Asp Gly Asn Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Asn Glu 355 360 365 Thr Ser Arg Leu Gly Tyr Glu Thr Phe Lys Val Val Glu Gly Trp Ser 370 375 380 Asn Pro Lys Ser Lys Leu Gln Ile Asn Arg Gln Val Ile Val Asp Arg 385 390 395 400 Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Lys Ser 405 410 415 Cys Ile Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Lys Glu 420 425 430 Glu Thr Glu Val Leu Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val Val Phe Cys Gly 435 440 445 Thr Ser Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala Asp Leu 450 455 460 Asn Leu Met His Ile 465 <210> 8 <211> 1701 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA strain A/California/7/2009 (H1N1) (CA09) <400> 8 augaaagcua uccuggucgu cuugcuguau acuuucgcca cugccaacgc cgacacccug 60 uguaucgguu accacgcgaa caacuccacc gacacugugg acaccgugcu cgaaaagaac 120 gugaccguga cucauucugu gaaucugcuc gaggacaagc acaacggaaa guugugcaag 180 cugcgcggag uggcaccgcu gcaccuugga aagugcaaca uugccggaug gauccuggga 240 aacccggagu gcgaaagccu gagcaccgcg uccucauggu ccuacaucgu ggaaaccccg 300 uccucugaca acggcaccug uuaccccggc gauuucaucg acuacgaaga acugcgggag 360 cagcuguccu ccguguccuc guuugaacgc uucgagauuu ucccuaagac cuccagcugg 420 ccuaaucacg auagcaacaa gggcgugacg gcagccugcc cgcacgccgg agcaaaguca 480 uucuacaaga aucugauuug gcucgugaag aaagggaacu cauaccccaa gcuguccaag 540 ucguacauca acgacaaggg aaaggaagug cucgugcucu gggggaucca ccacccaucc 600 accuccgccg accagcagag ccuguaccag aacgccgaug cuuacguguu uguggguucc 660 agccgguacu ccaagaaguu caagccugaa aucgcgauca ggccuaaagu ccgggaccgc 720 gagggccgca ugaacuacua cuggacucuc guggagccug gagacaagau caccuucgag 780 gccaccggaa aucucguggu gccacgcuac gcuuucgcca uggaacggaa cgccggaagc 840 ggcaucauca uuagcgauac uccugugcau gacuguaaca ccacgugcca gacacccaag 900 ggcgccauca acaccagccu gccguuucaa aacauccauc ccauuaccau ugggaagugc 960 cccaaauacg ucaaguccac caagcugagg cuggcgaccg gacugcggaa cauuccgagc 1020 auccagucga gaggccuguu cggugccauc gcgggauuca ucgagggcgg cuggacugga 1080 augguggacg guugguacgg guaucaccac caaaacgaac agggaucagg cuacgcggcc 1140 gauuugaagu ccacccagaa cgccauugau gaaaucacca acaaggucaa cuccgugauu 1200 gagaagauga auacucaauu caccgccgug ggcaaagaau ucaaucaccu ggagaagaga 1260 auagagaacc ugaacaagaa ggucgacgac ggguuccucg acaucuggac cuauaacgcc 1320 gaguugcucg ugcugcugga aaacgaacgg acccuggacu aucacgacuc gaacgugaag 1380 aaccuguacg agaaaguccg cucgcaacug aagaacaacg ccaaggaaau cggaaauggu 1440 ugcuucgagu ucuaccauaa gugcgacaac acuugcaugg aguccgugaa gaacggcacu 1500 uacgauuacc ccaaguacuc cgaagaggcu aaacuuaacc gggaagagau cgauggcgug 1560 aagcucgagu ccaccagaau cuaccagauu cucgccaucu acucgacugu ggcaucgagc 1620 cucguccuug ucgugucccu gggggccauu ucauucugga ugugcuccaa cgggucccug 1680 cagugccgga uuugcaucua a 1701 <210> 9 <211> 1410 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A/Michigan/45/2015 (Mich15) neuraminidase <400> 9 augaacccaa accagaaaau caucacgauu ggcucgauuu gcaugaccau uggaauggcg 60 aaccuuaucc uccaaauugg caacauuauc ucgaucuggg ucagccacuc gauccagauc 120 ggcaaccaau cccagauuga aacuugcaac cagagcguga uuacuuacga aaacaacacg 180 ugggugaacc agacuuacgu caauauuagc aacacuaacu ucgccgcugg gcagagcguc 240 gucagcguga agcucgccgg aaauuccucg cucugccccg uguccggcug ggcgaucuac 300 agcaaggaua acagcguccg gauugguagc aagggcgacg uuuucgugau ccgcgaaccc 360 uucauaucau gcuccccgcu cgaaugucgc acguucuucc ugacccaagg cgcccugcug 420 aacgacaagc acuccaaugg cacuaucaag gaucggagcc cuuaccggac cuugaugucc 480 ugcccuauug gagaagugcc uucaccauau aacucgcgcu uugaaagcgu ggcuugguca 540 gccuccgccu gccaugacgg gauuaacugg cugaccauug gcauaagcgg ccccgauucc 600 ggcgccgugg ccguccugaa guacaacggg aucaucaccg acaccauuaa guccuggcgc 660 aacaacaucc ugaggaccca ggaguccgag ugcgcgugcg ugaacggguc cugcuuuacc 720 aucaugaccg acggaccguc cgacggucaa gccucguaca agaucuuccg gaucgagaaa 780 ggaaagauca ucaagagcgu ggagaugaag gccccgaacu accacuacga ggaauguuca 840 ugcuaucccg acucguccga gauuacuugc gugugccgcg acaauuggca cggauccaac 900 aggccguggg ucagcuucaa ccagaaccuu gaauaccaga ugggauacau uugcagcgga 960 guguucgggg acaacccucg cccgaacgac aagaccggau cgugugggcc cguguccucc 1020 aacggcgcaa acggcgucaa gggauuuucc uucaaauacg ggaacggggu cuggaucgga 1080 cggaccaaga gcauuucaag cagaaaggga uucgagauga uuugggaccc gaacggcugg 1140 acugguaccg auaacaaauu cagcaucaag caggacaucg ugggaauuaa cgaguggucc 1200 gguuacuccg ggagcuucgu gcagcauccc gaacucacug gacuggacug cauucggccg 1260 ugcuuuuggg uggaauugau ccggggcaga ccugaggaga acacgauuug gaccuccggc 1320 uccucgaucu cguucugcgg agugaacucc gacaccgugg gaugguccug gcccgacggu 1380 gcagagcugc ccuucaccau ugauaaguaa 1410 <210> 10 <211> 1701 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A/Singapore.INFIMH160019/2016 (Sing16; H3N2) <400> 10 augaaaacca uaaucgcgcu cucauacaua cuuugccugg ucuuugccca aaagaucccu 60 ggcaacgaca acucaaccgc gacccuuugc cucggccauc acgccgugcc gaacggcacu 120 aucgucaaga ccaucacaaa cgaccgcauc gaagugacca acgcgacuga gcuagugcag 180 aacuccagca uuggagagau uugcgauucu ccacaccaaa uccuggacgg agagaauugu 240 accuugaucg acgcgcugcu gggggauccg cagugcgacg gauuccagaa caagaaaugg 300 gaccuuuucg uggaacggag caaggcauac ucgaauugcu accccuacga ugugcccgac 360 uacgccucgc ugcgguccuu ggucgcuucc uccgggaccc uggaauucaa aaacgagagc 420 uuuaauugga ccggagugac ccagaauggc accucgagcg ccugcauucg gggcuccucc 480 ucgagcuucu ucagccgccu gaacuggcuc acucaccuca acuacaccua cccggcacug 540 aacgugacca ugccgaacaa ggaacaauuc gacaagcucu acauuugggg ggugcaucac 600 ccggguaccg auaaggacca gaucuuccuc uacgcccaau ccucgggccg gaucaccgug 660 uccacuaagc gcucgcagca ggccgugauc ccgaacauug gaagcagacc ccgcauucgc 720 gacauuccau cgaggaucuc gaucuacugg acgauuguca agccuggcga cauccuccuc 780 auuaacucca ccgggaaccu caucgccccu cgggguuauu ucaagauccg cagcgggaag 840 uccuccauca ugagaagcga ugcccccauu ggaaagugca aguccgagug uaucacaccu 900 aacggaagca uucccaauga caagccauuc cagaacguga acagaauuac cuacggagcu 960 ugcccucgcu acgucaaaca uucgacccuc aaguuggcga cuggaaugcg caacgugccg 1020 gagaagcaaa cccgggggau cuucggggcu aucgcgggau ucaucgaaaa uggaugggaa 1080 ggaauggucg augguuggua cgguuucaga caccagaacu ccgaggggcg gggccaggcc 1140 gcagaccuga aguccacuca ggccgcgauu gaccagauca acggaaagcu caacagacuc 1200 auuggaaaga ccaacgaaaa guuccaccaa aucgaaaagg aauucuccga aguggagggc 1260 cgggugcaag accuggagaa guacguggag gacacuaaga ucgaccuuug gagcuauaac 1320 gcagaacucc uuguggcccu ggaaaaccag cacaccaucg accugaccga uucagagaug 1380 aacaagcucu uugagaaaac uaagaagcaa cuccgggaaa acgcugagga caugggaaau 1440 ggaugcuuua agaucuacca caagugcgac aacgccugca uugaguccau acggaacgaa 1500 acuuacgacc auaacgucua ccgggaugaa gcccugaaca acagauucca gaucaagggc 1560 guggagcuga aguccggcua caaagauugg auccugugga uuuccuucgc gauuucaugc 1620 uucuugcucu gcguggcccu ccugggauuc auaauguggg ccugucagaa gggcaacauu 1680 aggugcaaca uaugcauaua a 1701 <210> 11 <211> 1410 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Perth/16/2009 (H3N2) NA <400> 11 augaacccua accagaagau caucacaauu ggaagcgugu cccugaccau uucgacgauu 60 ugcuucuuca ugcaaaucgc gaucuugauu accaccguca cccugcauuu caagcaauac 120 gaauucaacu ccccgccaaa caaccaaguc augcucugcg agcccaccau caucgaacgc 180 aacaucaccg agaucgugua ccuuaccaac acuaccaucg aaaaggagau uugccccaag 240 uuggccgaau accggaacug gagcaagccc cagugugaca ucacgggauu ugcgccauuc 300 agcaaggaua acucgaucag acuuuccgcc gggggcgaca uuugggucac ucgggagccu 360 uacgugagcu gcgacccgga caagugcuac caauucgcac ucggacaggg uaccacccug 420 aacaacgucc auagcaacaa caccgugcgc gauagaaccc cguaccgcac ccuccucaug 480 aacgaacugg gagugccguu ccacuuggga accaaacaag ucugcauugc augguccucc 540 uccuccugcc acgacggcaa agccuggcuu cacguuugca ucaccggcga cgacaagaau 600 gcgacggccu ccuucauaua caaugguaga cucguggaua gcgugguguc augguccaag 660 gaaauucuca ggacucagga gucagagugc gugugcauca acgggacuug cacugucgug 720 augaccgacg gaucggccuc cggaaaggcc gacacuaaga uccucuucau cgaggaggga 780 aagaucgugc acacuucuac ccugagcggc ucggcucagc augucgaaga gugcucgugc 840 uacccccggu aucccggggu ccgcugcgug ugccgggaca auuggaaagg cucaaaccgc 900 cccaucgugg acauuaacau caaggaccac uccaucguga gcuccuacgu augcagcggg 960 cuggucgggg auaccccgcg gaagaacgau uccucguccu ccucccacug ccuggacccu 1020 aacaacgaag agggaggcca cggagugaag ggaugggcuu uugacgaugg caacgacgug 1080 uggaugggca ggacuauuuc cgaaaagucc cggcugggau acgaaaccuu caaggucauc 1140 gagggcuggu ccaacccgaa gucaaagcuc cagaucaacc gccaggucau cguggauagg 1200 ggcaauagau ccggcuacuc cgggaucuuc agcguggaag ggaaguccug cauuaaccga 1260 ugcuucuacg uggaacucau ucggggucgg aaggaggaaa ccgaagugcu guggacuucg 1320 aacucaaucg ugguguuuug ugggaccucc ggaacuuacg gaacuggguc cuggccugac 1380 ggugccgaca ucaaccuuau gccgaucuaa 1410 <210> 12 <211> 1701 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A/Wisconsin/588/2019 <400> 12 augaaagcca uccuuguugu caugcuguac acauucacca ccgcaaaugc ggauacccug 60 uguaucggcu accacgcaaa uaauuccacc gacaccguug auaccguccu ggaaaagaac 120 gugacaguga cucacagcgu caaucuccuu gaggauaaac auaauggcaa gcugugcaag 180 cugagaggcg uggcuccccu gcaucuggga aagugcaaca ucgcugguug gauccucggg 240 aacccagagu gugagucccu cucaaccgca cggucuuggu cauacaucgu ggagacuagc 300 aauucagaca acggcacaug cuaccccggu gacuucauua acuacgagga gcugagagaa 360 cagcugaguu ccgugucauc cuucgagaga uucgaaaucu uccccaaaac cuccuccugg 420 cccaaucaug acuccgacaa uggagugaca gccgcuuguc cccacgccgg ugccaagagu 480 uucuauaaga accucaucug gcuggugaaa aagggcaagu ccuaucccaa aauuaaccag 540 accuacauua acgauaaggg gaaagaaguc cugguccugu gggggauaca ccaccccccu 600 accaucgccg accagcaguc ucuguaucag aacgccgacg ccuacguguu cguggguacc 660 agccguuaua guaaaaaguu caagccagaa auugccacca gaccuaaggu gcgcgaccag 720 gagggccgca ugaacuacua cuggacccug guggaaccug gcgacaagau uacauucgag 780 gccacuggga accugguggc acccagauac gccuuuacaa uggaacggga ugcugggagc 840 ggaaucauua ucuccgauac cccuguccac gacugcaaua cuaccuguca gaccccagaa 900 ggcgcuauca auaccucucu gccuuuccaa aacgugcacc cuaucacuau cgggaaaugu 960 cccaaguaug ugaaaagcac caaacugcgc cuggcaaccg gucugagaaa ugugcccucc 1020 auccaguccc gcggcuuguu cggugcaauc gcuggcuuua ucgagggugg cuggacugga 1080 auggucgaug gcugguacgg cuaccaucac cagaacgagc agggguccgg guaugcugcc 1140 gaccugaaaa gcacucagaa cgccaucgau aaaaucacua acaaggugaa cuccgugauc 1200 gaaaagauga auacacaguu cacagcaguu ggcaaggagu ucaaccaccu ggaaaaacgg 1260 auagagaacc ugaauaagaa agucgaugau ggcuuucugg acaucuggac uuacaaugcc 1320 gagcugcugg ugcuccugga aaacgagcgg acacuggauu aucacgacuc aaacgugaag 1380 aaccuguaug aaaaggugcg uaaccagcug aaaaacaacg ccaaggaaau cggcaauggc 1440 uguuucgaau uuuaccacaa gugugauaau accuguaugg agagcguuaa gaacgggacu 1500 uacgacuacc caaaauacag cgaggaggcc aagcugaacc gggagaagau cgacggcguc 1560 aaacucgacu ccacuagaau auaccagauu cucgccaucu auagcacagu ggcaucaagu 1620 cucguccugg uggugucacu gggagccauc agcuuuugga ugugcagcaa 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gucgcaucag uaucuacugg accaucguga agcccggaga uaucuugcuc 780 aucaauagca cuggcaaccu cauugccccc aggggcuauu uuaagaucag aagcggcaag 840 uccagcauua ugcgcagcga cgcacccauu ggcaagugca aguccgagug caucacuccu 900 aaugggucca ucccaaacga caagccauuc caaaauguca acagaaucac cuacggggcu 960 ugcccccgcu acgugaagca gaguacacug aaacuggcca ccgggaugcg caacgugccc 1020 gagaagcaaa cuagaggcau cuuuggagcu aucgcuggcu ucauugagaa uggcugggag 1080 gguauggugg acggcuggua cggauuccgc caccagaaua gcgaaggcag aggccaggca 1140 gcagacuuga aguccaccca ggccgccauu gaucagauca acggcaaacu gaaucggcuu 1200 auuggaaaaa caaacgagaa guuccaucag auugagaagg aguuuagcga gguggagggc 1260 cgcgugcagg aucuggaaaa guacguugaa gacaccaaga ucgaccugug gucauacaau 1320 gcagagcugc ucguugcccu ggaaaaucag cacacaauug accuuacaga cuccgaaaug 1380 aauaagcucu uugaaaagac caagaagcag cugcgcgaga acgccgagga uauggggaac 1440 gguuguuuua agaucuacca caagugugac aacgccugca uuggguccau ccgaaaugaa 1500 acauacgacc acaacgugua uagagaugag gcccugaaca accgauucca gauuaaggga 1560 gucgagcuga agaguggcua 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cggggauucu 660 aaaccccaga aguucaccag uagcgcuaac ggggugacca cccauuaugu gucucagauc 720 ggagguuucc caaaucagac cgaggacggc ggacugcccc agucuggaag gaucguagug 780 gacuauaugg ugcagaagag uggaaaaacc ggcaccauua ccuaucagcg cggcauacug 840 cugccacaga agguguggug ugcuuccggc agguccaagg uuaucaaagg gucccucccc 900 cugaucggcg aagcagauug ucugcacgag aaguacggcg gacugaauaa gagcaaaccc 960 uacuacaccg gagaacacgc uaaggcaauu gggaauuguc cgaucugggu gaagacgccc 1020 cugaaacugg ccaauggcac aaaauaccgg ccccccgcua agcugcugaa ggaacggggg 1080 uucuucggcg ccauagccgg cuuucuggag ggaggcuggg agggcaugau agccgggugg 1140 cacggcuaca cuucccaugg ggcucacggg guggcugugg ccgccgaccu gaagucuacg 1200 caggaagcua ucaacaaaau cacuaagaac cugaacagcc ugucggaauu ggaggucaag 1260 aaucugcagc ggcugagcgg cgccauggau gagcugcaca augagauccu ggagcuugac 1320 gagaaggucg augaucuucg ggccgauaca auuaguagcc aaauugaguu ggccgugcug 1380 cucagcaacg aaggcauaau caacagcgag gacgagcacc uccuggcucu ggagagaaag 1440 cugaagaaga ugcucggccc uagcgcaguu gagaucggaa acggcugcuu cgaaaccaag 1500 cacaagugca accagaccug ccuggacagg aucgcggcag gaacauucga cgcuggggaa 1560 uucagccucc ccaccuucga cagccugaac aucacagccg ccagucugaa ugaugacgga 1620 cuggauaacc auaccauccu gcuguacuac ucuaccgcug cuuccucccu ggccgugaca 1680 uugaugaucg caaucuuugu gguuuauaug gugagccgag acaacgucag uugcaguauc 1740 ugccuuuaa 1749 <210> 15 <211> 1755 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B/Phuket/3073/2013 <400> 15 augaaagcca ucauugugcu gcugaugguu guuacaagca acgccgaccg caucugcacc 60 gggauuacaa gcagcaauag cccucacgug gugaagacag caacacaggg agaggugaac 120 gugaccggcg ugauuccacu gacaaccacc ccaacuaaau cuuacuuugc aaaccugaaa 180 gggacacgga ccagaggaaa gcugugcccu gauugccuga auugcacaga ccuggacgug 240 gcccugggca gaccaaugug cgugggcacu acaccaagcg ccaaggccuc cauccuccau 300 gaggugcggc ccgugacuuc uggauguuuc cccauuaugc acgacagaac caagauuaga 360 cagcugccaa accugcuccg cggcuacgag aaaauucgcc ugucuacaca gaaugugauc 420 gacgccgaga aggcuccagg aggaccauac agacugggga cuucuggcag cugcccuaac 480 gccaccucua agaucggguu cuucgcaacc auggcuuggg ccgugccuaa agacaauuac 540 aagaaugcca ccaauccacu gacugucgag gugccauaua uuugcacaga gggggaggac 600 cagaucacug uguggggcuu ucauagcgau aauaagacuc agaugaaguc ucucuacggc 660 gacucuaacc cucagaaguu caccuccucu gccaacgggg ugacaacaca cuacgugucc 720 cagaucgggg acuuuccuga ccagaccgag gauggaggac ugccucaguc uggacgcauc 780 gugguggacu auaugaugca gaagccuggg aagaccggca cuaucgugua ccagaggggc 840 gugcugcugc cccaaaaggu guggugugcc uccggaagaa gcaaagugau uaagggaucc 900 cugccucuga uuggggaggc cgauugccug caugaagagu auggagggcu gaacaagucc 960 aagccauacu auacaggaaa gcacgcaaaa gccaucggca acugucccau cugggucaaa 1020 acuccucuga agcuggccaa cggcaccaaa uaccgcccuc cagccaagcu gcugaaagaa 1080 cgcggauucu ucggcgccau ugcaggguuu cuggaaggag gcugggaggg caugauugcu 1140 ggauggcacg gauauaccuc ucacggcgcu cacggggugg ccguggccgc cgaucugaag 1200 uccacacagg aggcaauuaa caagaucacc aagaaucuga auucacuguc cgagcucgaa 1260 gugaaaaacc ugcagcgccu guccggcgcc auggacgagc ugcacaauga aauccuggag 1320 cuggacgaga agguggacga ccugcgggcu gacacuauca gcagccagau cgagcuggca 1380 gugcugcuga gcaaugaggg caucaucaac ucagaagacg aacaccuccu ggcacuggaa 1440 aggaaacuca agaagaugcu gggccccucc gcaguggaca uugggaacgg cuguuucgaa 1500 accaagcaua aguguaacca gacuugucug gauaggaucg cagcaggaac cuucaacgcc 1560 ggcgaauuuu cucugccaac auuugacucc cugaacauca cagcugcauc ccugaacgac 1620 gacggacugg acaaucacac cauccugcug uacuacucua cugccgcuag cucccuggcc 1680 gugacccuga ugcuggccau cuucaucgug uacaugguuu ccagggauaa cgugucuugu 1740 agcauuugcc uguaa 1755 <210> 16 <400> 16 000 <210> 17 <400> 17 000 <210> 18 <400> 18 000 <210> 19 <211> 140 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5UTR <400> 19 ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60 cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120 gacucaccgu ccuugacacg 140 <210> 20 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3UTR sequence <400> 20 cggguggcau cccugugacc ccuccccagu gccucuccug gcccuggaag uugccacucc 60 agugcccacc agccuugucc uaauaaaauu aaguugcauc 100 <210> 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Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val 530 535 540 Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu 545 550 555 560 Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 25 <211> 1941 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3 sub type of Influenza virus hemagglutinin <400> 25 ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60 cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120 gacucaccgu ccuugacacg augaaaacca uaaucgcgcu cucauacaua cuuugccugg 180 ucuuugccca aaagaucccu ggcaacgaca acucaaccgc gacccuuugc cucggccauc 240 acgccgugcc gaacggcacu aucgucaaga ccaucacaaa cgaccgcauc gaagugacca 300 acgcgacuga gcuagugcag aacuccagca uuggagagau uugcgauucu ccacaccaaa 360 uccuggacgg agagaauugu accuugaucg acgcgcugcu gggggauccg cagugcgacg 420 gauuccagaa caagaaaugg gaccuuuucg uggaacggag caaggcauac ucgaauugcu 480 accccuacga ugugcccgac uacgccucgc ugcgguccuu ggucgcuucc uccgggaccc 540 uggaauucaa aaacgagagc uuuaauugga ccggagugac ccagaauggc accucgagcg 600 ccugcauucg gggcuccucc ucgagcuucu ucagccgccu gaacuggcuc acucaccuca 660 acuacaccua cccggcacug aacgugacca ugccgaacaa ggaacaauuc gacaagcucu 720 acauuugggg ggugcaucac ccggguaccg auaaggacca gaucuuccuc uacgcccaau 780 ccucgggccg gaucaccgug uccacuaagc gcucgcagca ggccgugauc ccgaacauug 840 gaagcagacc ccgcauucgc gacauuccau cgaggaucuc gaucuacugg acgauuguca 900 agccuggcga cauccuccuc auuaacucca ccgggaaccu caucgccccu cgggguuauu 960 ucaagauccg cagcgggaag uccuccauca ugagaagcga ugcccccauu ggaaagugca 1020 aguccgagug uaucacaccu aacggaagca uucccaauga caagccauuc cagaacguga 1080 acagaauuac cuacggagcu ugcccucgcu acgucaaaca uucgacccuc aaguuggcga 1140 cuggaaugcg caacgugccg gagaagcaaa cccgggggau cuucggggcu aucgcgggau 1200 ucaucgaaaa uggaugggaa ggaauggucg augguuggua cgguuucaga caccagaacu 1260 ccgaggggcg gggccaggcc gcagaccuga aguccacuca ggccgcgauu gaccagauca 1320 acggaaagcu caacagacuc auuggaaaga ccaacgaaaa guuccaccaa aucgaaaagg 1380 aauucuccga aguggagggc cgggugcaag accuggagaa guacguggag gacacuaaga 1440 ucgaccuuug gagcuauaac gcagaacucc uuguggcccu ggaaaaccag cacaccaucg 1500 accugaccga uucagagaug aacaagcucu uugagaaaac uaagaagcaa cuccgggaaa 1560 acgcugagga caugggaaau ggaugcuuua agaucuacca caagugcgac aacgccugca 1620 uugaguccau acggaacgaa acuuacgacc auaacgucua ccgggaugaa gcccugaaca 1680 acagauucca gaucaagggc guggagcuga aguccggcua caaagauugg auccugugga 1740 uuuccuucgc gauuucaugc uucuugcucu gcguggcccu ccugggauuc auaauguggg 1800 ccugucagaa gggcaacauu aggugcaaca uaugcauaua acggguggca ucccugugac 1860 cccuccccag ugccucuccu ggcccuggaa guugccacuc cagugcccac cagccuuguc 1920 cuaauaaaau uaaguugcau c 1941

Claims (51)

  1. 8개의 메신저 RNA(mRNA)를 포함하는 인플루엔자 백신 조성물로서, 각각의 mRNA는 상이한 인플루엔자 항원을 암호화하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는, 인플루엔자 백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 조성물은 (i) 하나 이상의 헤마글루티닌(HA) 항원, (ii) 하나 이상의 뉴라미니다제(NA) 항원, 또는 (iii) 적어도 하나의 HA 항원 및 적어도 하나의 NA 항원을 암호화하는 8개의 mRNA를 포함하는, 인플루엔자 백신 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물은 인플루엔자 A, B 및/또는 C 바이러스들의 항원을 암호화하는 하나 이상의 mRNA를 포함하는, 인플루엔자 백신 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스들의 HA 및/또는 NA 항원인, 인플루엔자 백신 조성물.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스들의 HA 항원은 아형 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17, 및 H18로부터 선택되는, 인플루엔자 백신 조성물.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스들의 NA 항원은 아형 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, N10, 및 N11로부터 선택되는, 인플루엔자 백신 조성물.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 B 바이러스들의 HA 및 NA 항원은 인플루엔자 B/야마가타 계통 또는 인플루엔자 B/빅토리아 계통에서 유래하는, 인플루엔자 백신 조성물.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, HA 항원 및 NA 항원은 H1N1, H3N2, H2N2, H5N1, H7N9, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H5N2, 및 H10N7 아형 및/또는 B/야마가타 및 B/빅토리아 계통으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인플루엔자 백신 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 H3 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, H1 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, 인플루엔자 B/야마가타 계통으로부터의 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, 및 인플루엔자 B/빅토리아 계통으로부터의 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA를 포함하는, 인플루엔자 백신 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 H3 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, N2 NA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, H1 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, N1 NA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, 인플루엔자 B/야마가타 계통으로부터의 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, 인플루엔자 B/야마가타 계통으로부터의 NA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, 인플루엔자 B/빅토리아 계통으로부터의 HA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA, 및 인플루엔자 B/빅토리아 계통으로부터의 NA 항원을 암호화하는 1개의 mRNA를 포함하는, 인플루엔자 백신 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, ORF는 코돈 최적화된, 인플루엔자 백신 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 분자는 적어도 하나의 5’ 비번역 영역(5’ UTR), 적어도 하나의 3’ 비번역 영역(3’ UTR), 및 적어도 하나의 폴리아데닐화(폴리(A)) 서열을 포함하는, 인플루엔자 백신 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함하는, 인플루엔자 백신 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA에서 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%가 화학적으로 변형되는, 인플루엔자 백신 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, ORF에서 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%가 화학적으로 변형되는, 인플루엔자 백신 조성물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4’-티오우리딘, 5-메틸시토신, 2-티오-l-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-l-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-l-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 및 2’-O-메틸 우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인플루엔자 백신 조성물.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 5-메틸시토신, 5-메톡시우리딘, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인플루엔자 백신 조성물.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 화학적 변형은 N1-메틸슈도우리딘인, 인플루엔자 백신 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 지질 나노입자(LNP)에 제형화되는, 인플루엔자 백신 조성물.
  20. 제19항에 있어서, LNP는 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함하는, 인플루엔자 백신 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 양이온성 지질은 생분해성인, 인플루엔자 백신 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 양이온성 지질은 생분해성이 아닌, 인플루엔자 백신 조성물.
  23. 제20항에 있어서, 양이온성 지질은 절단 가능한, 인플루엔자 백신 조성물.
  24. 제20항에 있어서, 양이온성 지질은 절단 가능하지 않은, 인플루엔자 백신 조성물.
  25. 제20항에 있어서, 양이온성 지질은 OF-02, cKK-E10, GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1, GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10, 및 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인플루엔자 백신 조성물.
  26. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 공액 (PEG화된) 지질, 콜레스테롤계 지질 및 헬퍼 지질을 추가로 포함하는, 인플루엔자 백신 조성물.
  27. 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는
    35% 내지 55%의 몰비율의 양이온성 지질;
    0.25% 내지 2.75%의 몰비율의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 공액 (PEG화된) 지질;
    20% 내지 45%의 몰비율의 콜레스테롤계 지질; 및
    5% 내지 35%의 몰비율의 헬퍼 지질을 포함하며,
    여기서 모든 몰비율은 LNP의 총 지질 함량에 상대적인, 인플루엔자 백신 조성물.
  28. 제27항에 있어서, LNP는
    40%의 몰비율의 양이온성 지질;
    1.5%의 몰비율의 PEG화된 지질;
    28.5%의 몰비율의 콜레스테롤계 지질; 및
    30%의 몰비율의 헬퍼 지질을 포함하는, 인플루엔자 백신 조성물.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, PEG화된 지질은 디미리스토일-PEG2000(DMG-PEG2000) 또는 2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드(ALC-0159)인, 인플루엔자 백신 조성물.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤인, 인플루엔자 백신 조성물.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 헬퍼 지질은 1,2-디올레오일-SN-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)인, 인플루엔자 백신 조성물.
  32. 제19항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는
    40%의 몰비율의, OF-02, cKK-E10, GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1, GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10, 및 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14로 이루어진 군으로부터 선택되는 양이온성 지질;
    1.5%의 몰비율의 DMG-PEG2000;
    28.5%의 몰비율의 콜레스테롤; 및
    30%의 몰비율의 DOPE를 포함하는, 인플루엔자 백신 조성물.
  33. 제19항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는 30 nm 내지 200 nm의 평균 직경을 갖는, 인플루엔자 백신 조성물.
  34. 제33항에 있어서, LNP는 80 nm 내지 150 nm의 평균 직경을 갖는, 인플루엔자 백신 조성물.
  35. 제19항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 1 mg/mL 내지 10 mg/mL의 LNP를 포함하는, 인플루엔자 백신 조성물.
  36. 제19항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는 1 내지 20개의 mRNA 분자를 포함하는, 인플루엔자 백신 조성물.
  37. 제19항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는 5 내지 10개 또는 6 내지 8개의 mRNA 분자를 포함하는, 인플루엔자 백신 조성물.
  38. 제19항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는 2개 이상의 mRNA를 포함하며, 각각의 mRNA는 상이한 인플루엔자 항원을 암호화하는, 인플루엔자 백신 조성물.
  39. 제19항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 8개의 LNP를 포함하며, 각각의 LNP는 상이한 인플루엔자 항원을 암호화하는 mRNA를 포함하는, 인플루엔자 백신 조성물.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 근육내 주사용으로 제형화되는, 인플루엔자 백신 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 조성물은 인산염-완충 식염수를 포함하는, 인플루엔자 백신 조성물.
  42. 면역 반응 유도를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 선택적으로 근육내로, 비강내로, 정맥내로, 피하로 또는 피내로, 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 인플루엔자 백신 조성물의 예방적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 인플루엔자 감염을 예방하거나 인플루엔자 감염의 하나 이상의 증상을 감소시키는 방법으로서, 선택적으로 근육내로, 비강내로, 정맥내로, 피하로, 또는 피내로, 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 인플루엔자 백신 조성물의 예방적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 인플루엔자 백신 조성물은 하나 이상의 계절성 및/또는 유행성 인플루엔자 균주에 대한 면역 반응을 유도하는, 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 1회 이상의 용량의 인플루엔자 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 각 용량은 약 1 μg 내지 약 250 μg의 mRNA를 포함하는, 방법.
  46. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 1회 이상의 용량의 인플루엔자 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 각 용량은 약 2.5, 5, 15, 45, 또는 135 μg의 mRNA를 포함하는, 방법.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 2~6주, 선택적으로 4주의 간격으로 2회 용량의 인플루엔자 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  48. 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 약제를 제조하기 위한, 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 인플루엔자 백신 조성물의 용도.
  49. 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 인플루엔자 백신 조성물.
  50. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물의 1회용 또는 다회용 투여량을 포함하는 용기를 포함하는 키트로서, 선택적으로 용기는 바이알 또는 사전충전형 주사기 또는 주입기인, 키트.
  51. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 항원은 기계 학습 모델로부터 식별되거나 설계된 분자 서열을 갖는 인플루엔자 바이러스 HA 항원 및/또는 인플루엔자 바이러스 NA 항원을 포함하는, 인플루엔자 백신 조성물.

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