JP2023550600A - ｍＲＮＡワクチンを送達するための脂質ナノ粒子 - Google Patents

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Abstract

ｍＲＮＡのような核酸を送達するための新規の脂質ナノ粒子が提供される。ｍＲＮＡのような核酸を送達するための脂質ナノ粒子を作製し使用する方法も提供される。

Description

関連出願
本出願は、２０２０年１１月６日提出の米国特許仮出願第６３／１１０，９６５号、２０２１年６月１８日提出の米国特許仮出願第６３／２１２，５２３号、および２０２１年１０月１３日提出の欧州特許優先権出願第２１３１５１９８．８号の優先権の利益を主張するものであり、前記特許文献のそれぞれの内容は参照によりその全体をあらゆる目的のために組み入れる。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ベースのワクチンは、病原体由来の抗原タンパク質を含有する伝統的なサブユニットワクチンに対する有望な代替物を提供する。抗原タンパク質は、通常組換え的に作製され、細菌発酵および／または細胞培養、ならびに複雑な精製を必要とする。ｍＲＮＡに基づくワクチンは、ワクチン接種した対象中の複合抗原の新規発現を可能にし、これにより今度は、適切な翻訳後修飾およびその天然の形態での抗原の提示が可能になる。伝統的な技術と違って、ｍＲＮＡワクチンの製造は、複雑で費用のかかる細菌発酵、組織培養、および精製方法を必要としない。さらに、確立した後は、ｍＲＮＡワクチン用の製造方法は種々の抗原について使用可能であり、ｍＲＮＡワクチンの迅速な開発および配布が可能になる。さらに、ｍＲＮＡワクチンは、抗原を一過性にしか発現せず、宿主ゲノム中に組み込まれることがないので本質的に安全な送達ベクターである。ｍＲＮＡによりコードされる抗原はワクチン接種を受けた個人においてｉｎ ｖｉｖｏで産生されるために、ｍＲＮＡワクチンは液性免疫とＴ細胞媒介免疫の両方を誘発するのに特に効果的である。
しかし、ＲＮＡは不安定であり急速な分解を受けやすい。ＲＮＡの細胞内取込みを促進する天然の細胞表面受容体もない。実際、ｍＲＮＡの開発は、ｍＲＮＡの効率の悪いｉｎ ｖｉｖｏ送達により妨げられてきた。したがって、ｍＲＮＡ送達をｉｎ ｖｉｖｏで改善できるワクチン製剤を開発する必要性が残っている。
本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル化された核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）を含み、それぞれのＬＮＰがカチオン性脂質を３５％～４５％のモル比で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲート（ペグ化）脂質を０．２５％～２．７５％のモル比で、コレステロール系脂質を２０％～３５％のモル比で、およびヘルパー脂質を２５％～３５％のモル比で含み、すべてのモル比はＬＮＰの全脂質含量に対するものである医薬組成物を提供する。組成物は、免疫防御を必要とする対象（例えば、ヒト対象）において免疫防御を誘発するワクチンとして使用しうる。
一部の実施形態では、カチオン性脂質は、ＯＦ－０２、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１０－ＤＳ－３－Ｅ１８－１、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０、またはＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－３－Ｅ１４である。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質を４０％のモル比で、ペグ化脂質を１．５％のモル比で、コレステロール系脂質を２８．５％のモル比で、およびヘルパー脂質を３０％のモル比で含む。
一部の実施形態では、カチオン性脂質は、ＯＦ－０２、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１０－ＤＳ－３－Ｅ１８－１、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０、もしくはＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－３－Ｅ１４であり、ペグ化脂質はジミリストイル－ＰＥＧ２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）であり、コレステロール系脂質はコレステロールであり、および／またはヘルパー脂質は１，２－ジオレオイル－ＳＮ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。特定の実施形態では、ＬＮＰは、ＯＦ－０２、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１０－ＤＳ－３－Ｅ１８－１、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０、またはＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－３－Ｅ１４を４０％のモル比で、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を１．５％のモル比で、コレステロールを２８．５％のモル比で、およびＤＯＰＥを３０％のモル比で含む。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、１～２０、場合により、５～１０または６～８個の核酸分子を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、抗原（例えば、インフルエンザウイルス抗原のようなウイルス抗原、または細菌抗原）をコードする１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ分子を含む。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、２つまたはそれ以上のｍＲＮＡ分子を含み、それぞれのｍＲＮＡ分子は異なる抗原をコードし、場合により、異なる抗原は同じ病原体由来または異なる病原体由来である。一部の実施形態では、組成物は、２つまたはそれ以上のＬＮＰを含み、それぞれのＬＮＰは異なる抗原をコードするｍＲＮＡを含み、場合により、異なる抗原は同じ病原体由来または異なる病原体由来である。
例えば、組成物は、（ｉ）異なるヘマグルチニン（ＨＡ）抗原、（ｉｉ）異なるノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原、または（ｉｉｉ）少なくとも１つのＨＡ抗原および少なくとも１つのＮＡ抗原をコードする２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、またはそれ以上のｍＲＮＡ分子を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質抗原は、配列番号１６に少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは配列番号１６のアミノ酸配列からなる。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質抗原は、融合前タンパク質である。
一部の実施形態では、ＯＲＦはコドン最適化されている。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、少なくとも１つの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１つの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ中のウラシルヌクレオチドの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％は化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、ＯＲＦ中のウラシルヌクレオチドの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％は化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、化学修飾は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、および２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される。
一部の実施形態では、化学修飾は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、およびその組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、化学修飾は、Ｎ１－メチルプソイドウリジンである。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１７に示される核酸配列と少なくとも８０％同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２１に示される核酸配列と少なくとも８０％同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、以下の構造エレメントを含む：
（ｉ）以下の構造を有する５’キャップ：
Figure 2023550600000001
 （ｉｉ）配列番号１９の核酸配列を有する５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）；
（ｉｉｉ）配列番号１７の核酸配列を有するタンパク質コード領域；
（ｉｖ）配列番号２０の核酸配列を有する３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）；および
（ｖ）ポリ（Ａ）テール。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、３０～２００ｎｍ（例えば、８０～１５０ｎｍ）の平均直径を有する。一部の実施形態では、組成物は、１～１０、場合により１ｍｇ／ｍＬのＬＮＰを含む。組成物は、筋肉内または皮内注射用に製剤化してもよく、リン酸緩衝生理食塩水を含んでいてもよい。一部の実施形態では、組成物は、トレハロースを、場合により、組成物の１０％（ｗ／ｖ）で含む。
別の態様では、本開示は、核酸分子を含む水性緩衝溶液を提供することと、カチオン性脂質、ペグ化脂質、コレステロール系脂質、およびヘルパー脂質を含む両親媒性溶液を提供することと、水性緩衝溶液と両親媒性溶液を５：１～３：１、場合により、４：１の比で混合することとを含む、本明細書ではＬＮＰ組成物を製造する方法を提供する。水性緩衝溶液は、例えば、酸性緩衝溶液（例えば、１ｍＭのクエン酸および１５０ｍＭの塩化ナトリウムをｐＨ約４．５で含む）でもよい。両親媒性溶液は、例えば、エタノール溶液でもよい。
別の態様では、本開示は、対象に予防有効量の本ＬＮＰ組成物を、場合により、筋肉内に、鼻腔内に、静脈内に、皮下に、または皮内に投与することを含む、免疫応答の誘発を必要とする対象において免疫応答を誘発する方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、組成物の１つまたはそれ以上（例えば、２つ）の用量で処置され、それぞれの用量は、１～２５０、場合により、２．５、５、１５、４５、または１３５μｇのｍＲＮＡを含む。用量は、２～２４、場合により、４、８、１２、１６、もしくは２０週間、または１、２、３、４、５、もしくは６カ月間の間隔で与えてもよい。
処置を必要とする対象を処置するのに使用するための薬物の製造用の本組成物の使用、ならびに処置を必要とする対象を処置するのに使用するための組成物も本明細書で提供される。
本開示は、場合により、容器がバイアルまたはプレフィルド注射器もしくはインジェクタである、本組成物の単回使用または複数回使用投薬量を含む容器を含むキットも提供する。
別の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が：
カチオン性脂質を３５％～４５％のモル比で、
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲート（ペグ化）脂質を０．２５％～２．７５％のモル比で、
コレステロール系脂質を２０％～３５％のモル比で、および
ヘルパー脂質を２５％～３５％のモル比で含み、
すべてのモル比はＬＮＰの全脂質含量に対するものであり；
ｍＲＮＡ分子がインフルエンザウイルス由来の抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、ＬＮＰにカプセル化されたｍＲＮＡ分子を含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が：
カチオン性脂質を３５％～４５％のモル比で、
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲート（ペグ化）脂質を０．２５％～２．７５％のモル比で、
コレステロール系脂質を２０％～３５％のモル比で、および
ヘルパー脂質を２５％～３５％のモル比で含み、
すべてのモル比はＬＮＰの全脂質含量に対するものであり；
ｍＲＮＡ分子が呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、ＬＮＰにカプセル化されたｍＲＮＡ分子を含む医薬組成物を提供する。
本発明の他の機能、目的、および利点は以下に続く詳細な説明において明らかである。しかし、詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を示すが、限定ではなく、例としてのみ与えられることを理解するべきである。本発明の範囲内の種々の変更および改変は、詳細な説明から当業者には明らかになる。
図１Ａは、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）ｍＲＮＡの種々のＬＮＰ製剤で処置したマウスにおけるｈＥＰＯの発現を示す一対のグラフである。パネルａ）：ＭＣ３と比べたＬＮＰ製剤「脂質Ａ」および「脂質Ｂ」。バーは平均および標準偏差を表す。パネルｂ）：カチオン性脂質ＯＦ－０２で作られた製剤。ＰＥＧ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００。Ｃｈｏｌｅｓｔ：コレステロール。「脂質Ａ」：別段指示されなければ、ＯＦ－０２、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、コレステロール、およびＤＯＰＥをこの順番にモル比４０：１．５：２８．５：３０で含有するＬＮＰ組成物。「脂質Ｂ」：ｃＫＫ－Ｅ１０、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、コレステロール、およびＤＯＰＥをこの順番にモル比４０：１．５：２８．５：３０で含有するＬＮＰ組成物。 図１Ｂは、ＬＮＰ製剤脂質Ａおよび脂質Ｂを使用するマウスおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるｈＥＰＯの発現を示す一対のグラフである。 図２Ａおよび２Ｂは、株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）（ＣＡ０９）のヘマグルチニン（ＨＡ）をコードするｍＲＮＡを有する脂質Ａおよび脂質Ｂ ＬＮＰ製剤がロバストな機能的抗体を誘導し（図２Ａ）、インフルエンザウイルスの広域流行株をチャレンジされた場合、死亡または羸痩（２０％を超える）からマウスを保護した（図２Ｂ）ことを示す一対のグラフである。ヘマグルチニン抑制（ＨＡＩ）力価は、試験日０、１４、２８、４２、５６、９２、および１０７に採取した血清試料についてｌｏｇ１０として報告されている。バーは、幾何平均および幾何標準偏差である。１日の体重は、４ＬＤ５０のＡ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／２００９（Ｈ１Ｎ１）（Ｂｅｌｇｉｕｍ０９）を用いた鼻腔内チャレンジ（９３日目）後に測定した。体重は、チャレンジの日からの体重減少のパーセンテージとして提示される。その開始体重の２０％を超える減少をしたマウスで、および感染１４日後（１０７日目）のすべてのマウスで安楽死を生じた。ｒＨＡ：組換えヘマグルチニン。ＡＦ０３：水中油型乳剤アジュバンド。希釈液＝ＰＢＳ。ＬＬＯＱ＝定量下限。１／４０＝１／４０最小目標、これは、健康な成人でのインフルエンザ感染または疾患のリスクの５０％低減に関連するＨＡＩ抗体価のことである（Ｃｏｕｄｅｖｉｌｌｅら、ＢＭＣ Ｍｅｄ Ｒｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｏｌ．（２０１０）１０：１８）。図２Ｂ中の破線＝チャレンジの日の体重に関して切り取られた２０％体重減少。 図２Ａおよび２Ｂは、株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）（ＣＡ０９）のヘマグルチニン（ＨＡ）をコードするｍＲＮＡを有する脂質Ａおよび脂質Ｂ ＬＮＰ製剤がロバストな機能的抗体を誘導し（図２Ａ）、インフルエンザウイルスの広域流行株をチャレンジされた場合、死亡または羸痩（２０％を超える）からマウスを保護した（図２Ｂ）ことを示す一対のグラフである。ヘマグルチニン抑制（ＨＡＩ）力価は、試験日０、１４、２８、４２、５６、９２、および１０７に採取した血清試料についてｌｏｇ１０として報告されている。バーは、幾何平均および幾何標準偏差である。１日の体重は、４ＬＤ５０のＡ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／２００９（Ｈ１Ｎ１）（Ｂｅｌｇｉｕｍ０９）を用いた鼻腔内チャレンジ（９３日目）後に測定した。体重は、チャレンジの日からの体重減少のパーセンテージとして提示される。その開始体重の２０％を超える減少をしたマウスで、および感染１４日後（１０７日目）のすべてのマウスで安楽死を生じた。ｒＨＡ：組換えヘマグルチニン。ＡＦ０３：水中油型乳剤アジュバンド。希釈液＝ＰＢＳ。ＬＬＯＱ＝定量下限。１／４０＝１／４０最小目標、これは、健康な成人でのインフルエンザ感染または疾患のリスクの５０％低減に関連するＨＡＩ抗体価のことである（Ｃｏｕｄｅｖｉｌｌｅら、ＢＭＣ Ｍｅｄ Ｒｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｏｌ．（２０１０）１０：１８）。図２Ｂ中の破線＝チャレンジの日の体重に関して切り取られた２０％体重減少。 図３Ａおよび３Ｂは、脂質Ａ ＬＮＰを用いて製剤化されたＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｍｉｃｈ１５）ノイラミニダーゼ（ＮＡ）ｍＲＮＡが、ロバストな機能的抗体を誘導し（図３Ａ）、インフルエンザウイルスの広域流行株をチャレンジされた場合、体重減少および死亡からマウスを保護した（図３Ｂ）ことを示す一対のグラフである。ノイラミニダーゼ抑制（ＮＡＩ）力価は、試験日１４、２８、４２、５６、８８、および１１４に採取した血清試料についてｌｏｇ１０として報告されている。１日の体重は、４ＬＤ５０のＢｅｌｇｉｕｍ０９を用いた鼻腔内チャレンジ（１回投与群では８９日目または２回投与群では１１７日目）後に測定した。体重は、チャレンジ日からの体重減少のパーセンテージとして提示される。その開始体重の２０％を超える減少をしたマウスで、および感染１４日後（１回投与群では１０３日目または２回投与群では１３１日目）のすべてのマウスで安楽死を生じた。バーは、平均および標準偏差である。図３Ａ中の上の破線＝定量上限。図３Ａ中の下の破線＝定量下限。図３Ｂ中の破線＝チャレンジの日の体重に関して切り取られた２０％体重減少。投与されたｍＲＮＡ：Ｍｉｃｈ１５ ＮＡをコードする０．４または０．０１６μｇのｍＲＮＡ。対照：ｈＥＰＯをコードする０．６μｇのｍＲＮＡまたは希釈液（ＰＢＳ）。 図３Ａおよび３Ｂは、脂質Ａ ＬＮＰを用いて製剤化されたＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｍｉｃｈ１５）ノイラミニダーゼ（ＮＡ）ｍＲＮＡが、ロバストな機能的抗体を誘導し（図３Ａ）、インフルエンザウイルスの広域流行株をチャレンジされた場合、体重減少および死亡からマウスを保護した（図３Ｂ）ことを示す一対のグラフである。ノイラミニダーゼ抑制（ＮＡＩ）力価は、試験日１４、２８、４２、５６、８８、および１１４に採取した血清試料についてｌｏｇ１０として報告されている。１日の体重は、４ＬＤ５０のＢｅｌｇｉｕｍ０９を用いた鼻腔内チャレンジ（１回投与群では８９日目または２回投与群では１１７日目）後に測定した。体重は、チャレンジ日からの体重減少のパーセンテージとして提示される。その開始体重の２０％を超える減少をしたマウスで、および感染１４日後（１回投与群では１０３日目または２回投与群では１３１日目）のすべてのマウスで安楽死を生じた。バーは、平均および標準偏差である。図３Ａ中の上の破線＝定量上限。図３Ａ中の下の破線＝定量下限。図３Ｂ中の破線＝チャレンジの日の体重に関して切り取られた２０％体重減少。投与されたｍＲＮＡ：Ｍｉｃｈ１５ ＮＡをコードする０．４または０．０１６μｇのｍＲＮＡ。対照：ｈＥＰＯをコードする０．６μｇのｍＲＮＡまたは希釈液（ＰＢＳ）。 図４は、ＣＡ０９ ＨＡ ｍＲＮＡを有する脂質Ａおよび脂質Ｂ ＬＮＰ製剤（１０μｇ）がカニクイマカクザルにおいてロバストな機能的抗体を誘導したことを示すグラフである。ＨＡＩ力価は、試験日０、１４、２８、４２、および５６に採取した血清試料についてｌｏｇ２として報告されている。 図５Ａ～Ｃは、インフルエンザウイルスＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ１６００１９／２０１６（Ｓｉｎｇ１６；Ｈ３Ｎ２）ＨＡヘマグルチニンをコードするＭＲＴ１４００ ｍＲＮＡを示す。図５Ａ：ＨＡ抗原についての野生型（ＷＴ）遺伝子とコドン最適化遺伝子（ＭＲＴ１０２７９）の整列化。図５Ｂ：ｍＲＮＡの構造。図５Ｃ：ｍＲＮＡの配列。 図５Ａ－１の続き。 図５Ａ－２の続き。 図５Ａ－３の続き。 図５Ａ－４の続き。 図５Ａ～Ｃは、インフルエンザウイルスＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ１６００１９／２０１６（Ｓｉｎｇ１６；Ｈ３Ｎ２）ＨＡヘマグルチニンをコードするＭＲＴ１４００ ｍＲＮＡを示す。図５Ａ：ＨＡ抗原についての野生型（ＷＴ）遺伝子とコドン最適化遺伝子（ＭＲＴ１０２７９）の整列化。図５Ｂ：ｍＲＮＡの構造。図５Ｃ：ｍＲＮＡの配列。 図５Ａ～Ｃは、インフルエンザウイルスＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ１６００１９／２０１６（Ｓｉｎｇ１６；Ｈ３Ｎ２）ＨＡヘマグルチニンをコードするＭＲＴ１４００ ｍＲＮＡを示す。図５Ａ：ＨＡ抗原についての野生型（ＷＴ）遺伝子とコドン最適化遺伝子（ＭＲＴ１０２７９）の整列化。図５Ｂ：ｍＲＮＡの構造。図５Ｃ：ｍＲＮＡの配列。 図６は、ＭＲＴ１４００またはＮＡ ｍＲＮＡを有する脂質Ａおよび脂質Ｂ ＬＮＰ製剤がマウスにおいてロバストな機能的抗体を誘導したことを示す一対のグラフである。第１の注射は試験日０に与えられ、第２の注射は試験日２８に与えられた。左パネル：ＨＡＩ力価は試験日１４、２８、４２、および５６に採取された血清試料についてｌｏｇ１０として報告されている。右パネル：ＮＡＩ力価は試験日１４、２８、４２、および５６に採取された血清試料についてｌｏｇ１０として報告されている。バーは、幾何平均および幾何標準偏差である。破線＝定量下限。 図７Ａは、ＭＲＴ１４００を有する脂質Ａおよび脂質Ｂ ＬＮＰ製剤がＮＨＰにおいてロバストな機能的抗体を誘導したことを示すグラフである。ＨＡＩ力価は試験日０、１４、２８、４２、および５６に採取された血清試料についてｌｏｇ２として報告されている。第１の注射は試験日０に与えられ、第２の注射は試験日２８に与えられた。バーは、平均および標準偏差である。上の破線＝１／４０最小目標。下の破線＝検出下限。 図７Ｂおよび７Ｃは、ＭＲＴ１４００ ｍＲＮＡを含有する脂質Ａ ＬＮＰ製剤（ＭＲＴ５４００）が、カニクイマカクザルにおいてｍＲＮＡの４つの用量レベル：１５、４５、１３５および２５０μｇで機能的抗体（図７Ｂ）およびロバストなＥＬＩＳＡ力価（図７Ｃ）を誘導したことを示す一対の図である。ＨＡＩおよびＥＬＩＳＡ力価は、試験日０、１４、２８、４２、および５６に採取された血清試料についてｌｏｇ２として報告されている。第１の注射は試験日０に与えられ、第２の注射は試験日２８に与えられた。バーは、平均および標準偏差である。破線＝１／４０最小目標。 図７Ｂおよび７Ｃは、ＭＲＴ１４００ ｍＲＮＡを含有する脂質Ａ ＬＮＰ製剤（ＭＲＴ５４００）が、カニクイマカクザルにおいてｍＲＮＡの４つの用量レベル：１５、４５、１３５および２５０μｇで機能的抗体（図７Ｂ）およびロバストなＥＬＩＳＡ力価（図７Ｃ）を誘導したことを示す一対の図である。ＨＡＩおよびＥＬＩＳＡ力価は、試験日０、１４、２８、４２、および５６に採取された血清試料についてｌｏｇ２として報告されている。第１の注射は試験日０に与えられ、第２の注射は試験日２８に与えられた。バーは、平均および標準偏差である。破線＝１／４０最小目標。 図８Ａおよび８Ｂは、３つの用量レベル群（２５０μｇ、１３５μｇ、および４５μｇのｍＲＮＡ）での脂質Ａ ＬＮＰ製剤ＭＲＴ５４００を用いた第２のワクチン接種後のカニクイマカクのＴ細胞サイトカイン応答を示すグラフのパネルである。組換えＨＡ（ｒＨＡ）タンパク質（左パネル）またはプールされたペプチド（右パネル）での再刺激により誘導されたＩＦＮ－γおよびＩＬ－１３は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより４２日目に末梢血単核球（ＰＭＢＣ）において評価した。ＰＢＭＣ分泌ＩＦＮ－γ（図８Ａ）またはＩＬ－１３（図８Ｂ）の発生頻度は、ＰＢＭＣ１００万個当たりの斑点形成細胞（ＳＦＣ）として計算した。それぞれの記号は、個々の試料を表し、バーは標準偏差を表す。 図８Ａおよび８Ｂは、３つの用量レベル群（２５０μｇ、１３５μｇ、および４５μｇのｍＲＮＡ）での脂質Ａ ＬＮＰ製剤ＭＲＴ５４００を用いた第２のワクチン接種後のカニクイマカクのＴ細胞サイトカイン応答を示すグラフのパネルである。組換えＨＡ（ｒＨＡ）タンパク質（左パネル）またはプールされたペプチド（右パネル）での再刺激により誘導されたＩＦＮ－γおよびＩＬ－１３は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより４２日目に末梢血単核球（ＰＭＢＣ）において評価した。ＰＢＭＣ分泌ＩＦＮ－γ（図８Ａ）またはＩＬ－１３（図８Ｂ）の発生頻度は、ＰＢＭＣ１００万個当たりの斑点形成細胞（ＳＦＣ）として計算した。それぞれの記号は、個々の試料を表し、バーは標準偏差を表す。 図９Ａは、修飾および非修飾ＣＡ０９ ＨＡ ｍＲＮＡを含有する脂質Ａ ＬＮＰ製剤が、ワクチン接種されたマウスにおいてＨＡＩ力価により示されるのに匹敵したことを示す一対のグラフである。ＨＡＩ力価は、試験日１４、２８、４２、および５６に採取された血清試料についてｌｏｇ２として報告されている。第１の注射は試験日０に与えられ、第２の注射は試験日２８に与えられた。バーは、平均および標準偏差である。上の破線＝１／４０最小目標。下の破線＝定量下限。 図９Ｂは、修飾および非修飾ＣＡ０９ ＨＡ ｍＲＮＡを含有する脂質Ａ ＬＮＰ製剤が、マウスにおいてＥＬＩＳＡ力価により示されるのに匹敵したことを示す一対のグラフである。全ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価は、試験日１４、２８、４２、および５６に採取された血清試料についてｌｏｇ１０として報告されている。第１の注射は試験日０に与えられ、第２の注射は試験日２８に与えられた。破線＝定量下限。 図１０Ａおよび１０Ｂは、ＣＡ０９ ＨＡ ｍＲＮＡおよびＳｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡを有する二価脂質Ａ ＬＮＰ製剤が、全ｍＲＮＡ０．４μｇの用量でＢａｌｂ／ｃマウスにおいてＨＡＩ力価（ＣＡ０９（図１０Ａ）およびＳｉｎｇ１６（図１０Ｂ））により評価した場合、ロバストな機能的抗体を誘導したことを示す一対のグラフである。ｍＲＮＡ０．４μｇは共カプセル化ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤として投与された、またはそれぞれのＨＡ ｍＲＮＡは別々に投与され、０．２μｇがそれぞれの下肢中に入った。それぞれのＨＡ ｍＲＮＡも、全ｍＲＮＡがＬＮＰ中に詰め込まれるように制御するための非コードｍＲＮＡと一緒に製剤中に共カプセル化された。希釈群はｍＲＮＡ－ＬＮＰ希釈バッファーを受けた。ＨＡＩ力価は、試験日－２（基準線）、１４、２８、および４２に採取された血清試料について報告されている。図１０Ｂは、試験日－２（プールされた血清からの基準線）および４２のみを示す。第１の注射は試験日０に与えられ、第２の注射は試験日２８に与えられた。バーは、幾何平均および幾何標準偏差である。破線＝定量下限。 図１１は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤の機能検証を示す。パネル（ａ）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスでのホタル（ＦＦ）ルシフェラーゼの発現を示すグラフである：単回用量のルシフェラーゼＦＦ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ（５、１、０．１、０．０５μｇ）をＩＭ経路によりマウス（ｎ＝４）に注射した。ルシフェリン（３ｍｇ）は、生物発光強度を記録するＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社を使用して全身動物撮像時に注射した。全身動物平均光輝の画像は、注射後６、２４、４８および７２時間後に撮った。Ｌｕｃ ｍＲＮＡ－ＬＮＰの１、０．５、０．１および０．０５μｇ用量投与について記録された光輝はグラフに示されている。パネル（ｂ）は、６～７２時間目での発光の全流束を示す全身動物画像を示している。０．１μｇ用量のＦＦ－ＬＮＰを受けるマウス（ｎ＝４）の群での発光の全流束が示されている。パネル（ｃ）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスでのｈＥＰＯの発現を示す。単回用量のｈＥＰＯ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ（０．１μｇ）はＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＩＭ経路により注射された。ｈＥＰＯ発現は、投与後６時間目および２４時間目にＥＬＩＳＡを使用して血清中で定量化された。バーは、平均および標準偏差を表す。パネル（ｄ）は、ＮＨＰでのｈＥＰＯの発現を示す。単回用量のｈＥＰＯ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ（１０μｇ）はカニクイマカクにおいてＩＭ経路により注射された。ｈＥＰＯ発現は、投与後６、２４、４８、７２、および９６時間目にＥＬＩＳＡを使用して血清中で定量化された。バーは、平均および標準偏差を表す。 図１２は、マウスでのＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンの血清学的評価を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（群当たりｎ＝８）は、４週間間隔を開けて、Ｃａｌ０９ ＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰまたはＳｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ ２、０．４、０．０８、および０．０１６μｇでＩＭに２度免疫された。ＣＡ０９（Ｃａｌ０９）Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス組換えＨＡ（左パネル）およびＳｉｎｇ１６ Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス組換えＨＡ（右パネル）に対して１４、２８、４２、５６日目に収集された血清について記録されたＥＬＩＳＡ力価が示されている。 図１３は、マウスでのＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンの血清学的評価を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（群当たりｎ＝８）は、４週間間隔を開けて、ＣＡ０９ ＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰまたはＳｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ ２、０．４、０．０８、および０．０１６μｇでＩＭに２度免疫された。ＣＡ０９ Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス（左パネル）およびＳｉｎｇ１６ Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス（右パネル）に対して記録されたＬｏｇ１０ＨＡＩ力価が示されている。 図１４は、マウスでのＮＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンの血清学的評価を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（群当たりｎ＝８）は、４週間間隔を開けて、Ｍｉｃｈ１５ ＮＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰまたはＳｉｎｇ１６ ＮＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ ２、０．４、０．０８、および０．０１６μｇでＩＭに２度免疫された。Ｍｉｃｈ１５ Ｎ１インフルエンザウイルス組換えＮＡ（左パネル）およびＳｉｎｇ１６ Ｎ２インフルエンザウイルス組換えＮＡ（右パネル）に対して０、１４、２８、４２、５６日目に収集された血清について記録された全ＩｇＧ力価が示されている。 図１５は、マウスでのＮＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンの血清学的評価を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（群当たりｎ＝８）は、４週間間隔を開けて、Ｍｉｃｈ１５ ＮＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰまたはＳｉｎｇ１６ ＮＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ ２、０．４、０．０８、および０．０１６μｇでＩＭに２度免疫された。Ｍｉｃｈ２０１５（Ｎ１）：Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｓｗｅｄｅｎ／２００２（Ｈ６）キメラインフルエンザウイルス（左パネル）およびＳｉｎｇ１６（Ｎ２）：Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｓｗｅｄｅｎ／２００２（Ｈ６）キメラウイルス（右パネル）に対する血清について記録されたＬｏｇ１０ＮＡＩ（ＥＬＬＡ）力価が示されている。 図１６Ａおよび１６Ｂは、致死Ａ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／２００９ Ｈ１Ｎ１ウイルスチャレンジ後のマウスでのＣＡ０９ ＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンの保護効率を示す。マウス（ｎ＝８）は、０日目および２８日目にＣＡ０９ ＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰの２度ＩＭ投与（それぞれ０．４μｇ）を受けた。対照動物は０日目および２８日目に希釈液の２度ＩＭ投与を受けた。図１６Ａは、試験日０、１４、２８、４２、５６、９２、および１０７に採取された血清試料についてＬｏｇ１０として報告されたＨＡＩ力価を示す。図１６Ｂは、４ＬＤ５０のＡ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／２００９ Ｈ１Ｎ１株を用いた９３日目の鼻腔内チャレンジ後の毎日の体重を示す。体重はチャレンジの日からの体重減少のパーセンテージとして提示されている。個々の線はそれぞれの動物を表す。 図１７Ａ～Ｂは、致死Ａ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／２００９ Ｈ１Ｎ１ウイルスチャレンジ後のマウスでの単回投与の非修飾Ｍｉｃｈ１５ ＮＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰの保護効率を示す。マウス（ｎ＝１６）は、Ｍｉｃｈ１５ ＮＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ ０．４μｇまたは０．０１６μｇをＩＭ経路により注射された。マウスの半数は試験日０に１回注射（１用量）のみを受け、その他の半数（２用量）は試験日０および試験日２８に与えられる２回注射を受けた。対照動物は、０日目および２８日目にｈＥＰＯ ｍＲＮＡ－ＬＮＰの２回ＩＭ投与（０．６μｇ）を受けた。図１７Ａは、ＮＡＩ力価が、試験日０、１４、２８、４２、５６、８８、および１１４に採取された血清試料についてＬｏｇ１０として報告されることを示す。図１７Ｂは、単回投与群では８９日目のおよび２回投与群では１１７日目の４ＬＤ５０のＢｅｌｇｉｕｍ０９ Ｈ１Ｎ１を用いた鼻腔内チャレンジ後の毎日の体重変化を示す。体重はチャレンジの日からの体重減少のパーセンテージとして提示されている。個々の線はそれぞれの動物を表す。 図１７Ａ～Ｂは、致死Ａ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／２００９ Ｈ１Ｎ１ウイルスチャレンジ後のマウスでの単回投与の非修飾Ｍｉｃｈ１５ ＮＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰの保護効率を示す。マウス（ｎ＝１６）は、Ｍｉｃｈ１５ ＮＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ ０．４μｇまたは０．０１６μｇをＩＭ経路により注射された。マウスの半数は試験日０に１回注射（１用量）のみを受け、その他の半数（２用量）は試験日０および試験日２８に与えられる２回注射を受けた。対照動物は、０日目および２８日目にｈＥＰＯ ｍＲＮＡ－ＬＮＰの２回ＩＭ投与（０．６μｇ）を受けた。図１７Ａは、ＮＡＩ力価が、試験日０、１４、２８、４２、５６、８８、および１１４に採取された血清試料についてＬｏｇ１０として報告されることを示す。図１７Ｂは、単回投与群では８９日目のおよび２回投与群では１１７日目の４ＬＤ５０のＢｅｌｇｉｕｍ０９ Ｈ１Ｎ１を用いた鼻腔内チャレンジ後の毎日の体重変化を示す。体重はチャレンジの日からの体重減少のパーセンテージとして提示されている。個々の線はそれぞれの動物を表す。 図１８は、ＮＨＰでのＨＡ Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンの血清学的評価を示す。カニクイマカク（群当たりｎ＝６）は、４週間間隔を開けて、Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ １５、４５または１３５μｇでＩＭ経路により２回注射された。血清試料は、－６、１４、２８、４２、および５６日目に収集した。Ｓｉｎｇ１６ウイルスの組換えＨＡタンパク質に対するＬｏｇ１０ＩｇＧ力価が示されている。 図１９Ａおよび１９Ｂは、ＮＨＰでのＨＡ Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンの血清学的評価を示す。カニクイマカク（群当たりｎ＝６）は、４週間間隔を開けて、Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ １５、４５または１３５μｇでＩＭ経路により２回注射された。血清試料は、０、１４、２８、４２、および５６日目に収集した。Ｓｉｎｇ１６ウイルスに対するＬｏｇ１０ＨＡＩ力価（図１９Ａ）およびＬｏｇ１０マイクロ中和（ＭＮ）価（図１９Ｂ）が示されている。 図２０Ａおよび２０Ｂは、Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンを用いてワクチン接種されたＮＨＰでのＴ細胞応答を示す。カニクイマカク（群当たりｎ＝６）は、４週間間隔を開けて、Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ ４５、１３５、または２５０μｇでＩＭ経路により２回注射された。Ｔ細胞は、全ＨＡオープンリーディングフレームを表すペプチドプールを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激されたＰＢＭＣにおいて４２日目にＥＬＩＳＰＯＴにより判定された。ＰＢＭＣ１００万個当たりの斑点形成細胞（ＳＦＣ）として計算されたＩＦＮ－γ（図２０Ａ）またはＩＬ－１３（図２０Ｂ）を分泌するＰＢＭＣの応答が示されている。それぞれの記号は、個々の試料を表し、バーは群についての幾何平均を表す。 図２１は、Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンを用いてワクチン接種されたＮＨＰでの１８０日目の記憶Ｂ細胞によるＳｉｎｇ１６ Ｈ３特異的ＩｇＧの分泌を示す。カニクイマカク（群当たりｎ＝６）は、４週間間隔を開けて、Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ １５または４５μｇでＩＭ経路により２回注射された。ヒトＩｇＧ単色記憶Ｂ細胞ＥＬＩＳＰＯＴキット（ＣＡＴ＃ ＮＣ１９１１３７２、ＣＴＬ）を使用してＳｉｎｇ１６／Ｈ３特異的および全ＩｇＧ＋抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を測定した。キットにより提供される刺激カクテルを使用することにより１８０日目に収集したＰＢＭＣにおいてＡＳＣへのＭＢＣの分化を実施した。ＩｇＧ＋の数およびＳｉｎｇ１６／Ｈ３特異的ＡＳＣの数は、それぞれの動物についてＰＢＭＣ１００万個当たりで計算し、抗原特異的ＡＳＣの出現頻度が示されている。 図２２は、マウスでのインフルエンザワクチンの二価組合せの送達を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（群当たりｎ＝８）は、４週間間隔を開けて、二価組合せ共カプセル化ｍＲＮＡ転写物（１：１ ｗｔ／ｗｔ、それぞれの脚当たり半量）全部で０．４μｇまたは別々に製剤化され異なる脚に免疫されたそれぞれの一価の０．２μｇでＩＭに２度免疫された。Ｈ１Ｈ３コンボを構成するＣＡ０９ ＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ、Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ；Ｈ３Ｎ２コンボのＳｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰおよびＳｉｎｇ１６ ＮＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰならびにＮ１Ｎ２コンボのＭｉｃｈ１５ ＮＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰおよびＰｅｒｔｈ０９ ＮＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰを０、１４、２８、４２日目に収集した血清中で対応するウイルスに対して試験した。パネル（ａ）は、ＣＡ０９ Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスおよびＳｉｎｇ２０１６ Ｈ３Ｎ２に対して記録されたＨＡＩ力価を示す。パネル（ｂ）は、それぞれＳｉｎｇ２０１６ Ｈ３Ｎ２およびＡ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｓｗｅｄｅｎ／２００２（Ｈ６）キメラインフルエンザウイルスならびにＨ６Ｎ２ Ａ／Ｐｅｒｔｈ／０９ウイルスＦ１９１９Ｄ（Ｎ２）ウイルスに対して記録されたＨＡＩおよびＮＡＩ力価を示す。パネル（ｃ）は、Ｍｉｃｈ１５（Ｎ１）：Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｓｗｅｄｅｎ／２００２（Ｈ６）キメラインフルエンザウイルスおよびＨ６Ｎ２ Ａ／Ｐｅｒｔｈ／０９ウイルスＦ１９１９Ｄ（Ｎ２）ウイルスに対して記録されたＮＡＩ力価を示す。 図２２－１の続き。 図２３は、ＮＨＰでのインフルエンザワクチンの四価組合せの送達を示す。カニクイマカク（群当たりｎ＝６）は、４週間間隔を開けて、共カプセル化ｍＲＮＡ転写物の四価組合せ（１：１：１：１ ｗｔ／ｗｔ）全部で１０μｇでＩＭに２度免疫された。ＣＡ０９ ＨＡ ｍＲＮＡ、Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡ、Ｍｉｃｈ１５ ＮＡ ｍＲＮＡ、およびＰｅｒｔｈ０９ ＮＡ ｍＲＮＡからなるＨ２Ｈ３Ｎ１Ｎ２コンボ。ＣＡ０９ ＨＡ ｍＲＮＡ、Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡおよび２×非コードｍＲＮＡ（ｎｃｍＲＮＡ）からなるＨ１Ｈ３コンボ；Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡおよびＰｅｒｔｈ０９ ＮＡ ｍＲＮＡならびに２×非コードｍＲＮＡのＨ３Ｎ２コンボ。Ｍｉｃｈ１５ ＮＡ ｍＲＮＡ、Ｐｅｒｔｈ０９ ＮＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ、および２×非コードｍＲＮＡのＮ１Ｎ２コンボ。ＣＡ０９ ＨＡ ｍＲＮＡおよび３×非コードｍＲＮＡからなるＨ１。Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡおよび３×非コードｍＲＮＡからなるＨ３。Ｍｉｃｈ１５ ＮＡ ｍＲＮＡおよび３×非コードｍＲＮＡからなるＮ１。Ｐｅｒｔｈ０９ ＮＡ ｍＲＮＡおよび３×非コードｍＲＮＡからなるＮ２。阻害力価は、０、１４、２８、４２日目に収集した血清において対応するウイルスに対して試験した。パネル（ａ）は、ＣＡ０９ Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスおよびＳｉｎｇ１６ Ｈ３Ｎ２に対して記録されたＨＡＩ力価を示す。パネル（ｂ）は、Ｍｉｃｈ１５（Ｎ１）：Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｓｗｅｄｅｎ／２００２（Ｈ６）キメラインフルエンザウイルスおよびＨ６Ｎ２ Ｐｅｒｔｈ／０９ウイルスＦ１９１９Ｄ（Ｎ２）ウイルスに対して記録されたＮＡＩ力価を示す。 図２４は、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）ｍＲＮＡの種々のＬＮＰ製剤で処置されたマウスでのｈＥＰＯの発現を示すグラフを描いている。ＬＮＰ製剤「脂質Ａ」、「脂質Ｂ」、「脂質Ｃ」、「脂質Ｄ」、および「脂質Ｅ」が示されている。バーは、平均および標準偏差を表す。ＬＮＰ組成物は、カチオン性脂質、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、コレステロール、およびＤＯＰＥを、この順番に、４０：１．５：２８．５：３０のモル比で含有する。 図２５は、ｈＥＰＯ ｍＲＮＡの種々のＬＮＰ製剤で処置された非ヒト霊長類（ＮＨＰ）でのｈＥＰＯの発現を示すグラフを描いている。ＬＮＰ製剤「脂質Ａ」、「脂質Ｂ」、「脂質Ｃ」、「脂質Ｄ」、および「脂質Ｅ」が示されている。バーは、平均および標準偏差を表す。ＬＮＰ組成物は、カチオン性脂質、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、コレステロール、およびＤＯＰＥを、この順番に、４０：１．５：２８．５：３０のモル比で含有する。 図２６は、ＨＡ ｍＲＮＡの種々のＬＮＰ製剤の注射後２８日目および４２日目のＨＡＩ力価を示すグラフを描いている。ＬＮＰ製剤「脂質Ａ」、「脂質Ｂ」、「脂質Ｃ」、「脂質Ｄ」、および「脂質Ｅ」が示されている。バーは、平均および標準偏差を表す。ＬＮＰ組成物は、カチオン性脂質、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、コレステロール、およびＤＯＰＥを、この順番に、４０：１．５：２８．５：３０のモル比で含有する。 図２７は、ＨＡ ｍＲＮＡの種々のＬＮＰ製剤の注射後２８日目および４２日目のＣａｌ０９ Ｈ１ ＨＡＩ力価を示すグラフを描いている。ＬＮＰ製剤「脂質Ａ」、「脂質Ｂ」、「脂質Ｃ」、「脂質Ｄ」、および「脂質Ｅ」が示されている。バーは、平均および標準偏差を表す。ＬＮＰ組成物は、カチオン性脂質、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、コレステロール、およびＤＯＰＥを、この順番に、４０：１．５：２８．５：３０のモル比で含有する。 図２８は、ＨＡ ｍＲＮＡの種々のＬＮＰ製剤の注射後２８日目および４２日目のＳｉｎｇ１６ Ｈ３ ＨＡＩ力価を示すグラフを描いている。ＬＮＰ製剤「脂質Ａ」、「脂質Ｂ」、「脂質Ｃ」、「脂質Ｄ」、および「脂質Ｅ」が示されている。バーは、平均および標準偏差を表す。ＬＮＰ組成物は、カチオン性脂質、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、コレステロール、およびＤＯＰＥを、この順番に、４０：１．５：２８．５：３０のモル比で含有する。 図２９は、ＦＤ３ Ｆタンパク質発現ｍＲＮＡで免疫されたＮＨＰでのＲＳＶ Ｆタンパク質抗体価を描いている。ｍＲＮＡは、いくつかのカチオン性脂質の１つを含有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で送達された。抗体価は、それぞれの抗原組成物について０、２１、および３５日目に測定された。 図３０は、ＦＤ３ Ｆタンパク質発現ｍＲＮＡで免疫されたＮＨＰでのＲＳＶ中和力価を描いている。ｍＲＮＡは、いくつかのカチオン性脂質の１つを含有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で送達された。抗体価は、それぞれの抗原組成物について０、２１、および３５日目に測定された。 図３１は、４つの異なるインフルエンザ株に対してマウスに投与された四価および八価のｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンについてのＨＡＩ力価を描いている。 図３２は、４つの異なるインフルエンザ株に対してフェレットに投与された四価および八価のｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンについてのＨＩＮＴ値を描いている。 図３３は、４つの異なるインフルエンザ株に対してマウスに投与された四価および八価のｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンについてのＮＡＩ力価を描いている。 図３４は、４つの異なるインフルエンザ株に対してフェレットに投与された四価および八価のｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンについてのＮＡＩ力価を描いている。試料は、ワクチンの第２の投与後２０日目（Ｄ２０）に得られた。 図３５は、４つの異なるインフルエンザ株に対してフェレットに投与された四価および八価のｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンについてのＮＡＩ力価を描いている。試料は、ワクチンの第２の投与後４２日目（Ｄ４２）に得られた。 図３６は、１５μｇおよび４５μｇ用量でＮＨＰに投与された、脂質Ａ ＬＮＰ製剤中のＳｉｎｇ１６ＨＡコードｍＲＮＡについてのマイクロ中和価を描いている。試料は、ワクチンの第２の投与後６日目（Ｄ６）および４２日目（Ｄ４２）に得られた。 図３７は、１５μｇおよび４５μｇ用量でＮＨＰに投与された、脂質Ｂ ＬＮＰ製剤中のＳｉｎｇ１６ＨＡコードｍＲＮＡについてのマイクロ中和価を描いている。試料は、ワクチンの第２の投与後６日目（Ｄ６）および４２日目（Ｄ４２）に得られた。
本開示は、ｍＲＮＡワクチンをｉｎ ｖｉｖｏで送達するための新規の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤およびワクチンを作製するための方法を提供する。ＬＮＰは、４種の脂質：カチオン性脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲート脂質、コレステロール系脂質、およびヘルパー脂質の混合物で作られている。ＬＮＰはｍＲＮＡ分子をカプセル化する。カプセル化されたｍＲＮＡ分子は、天然に存在するリボヌクレオチド、化学修飾されたヌクレオチド、またはその組合せを含むことができ、それぞれがまたは全体として１つまたはそれ以上のタンパク質をコードすることができる。
本発明者らは、脂質成分のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることを通じて本製剤を発見した。本ＬＮＰは、ｍＲＮＡペイロードをカプセル化して分解から保護し、カプセル化されたｍＲＮＡの細胞内取込みを促進する。本明細書に記載されるＬＮＰは、文献に記載される産業上の製剤と比べた場合、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの増強された発現により実証されるように、導入効率を増強し、ｍＲＮＡのエンドソーム脱出を促進し、その結果、有効性を改善した。例えば、本明細書で開示されるＬＮＰは既知のＬＮＰ、例えば、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（ａｋａ ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡまたはＭＣ３；Ｓｅｍｐｌｅら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１０）２８：１７２～６頁）またはジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカン酸（ａｋａ Ｌ３１９；Ｍａｉｅｒら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２０１３）２１（８）：１５７０～８頁）と比べて優れた安定性および／または有効性プロファイルを有する。下にさらに記載されるように、ｈＥＰＯをコードするｍＲＮＡをカプセル化する本製剤は、ｉｎ ｖｉｖｏで送達される場合、６時間および２４時間で血液中を循環する高レベルのエリスロポエチンをもたらし、工業標準、ＭＣ３ ＬＮＰ製剤と比べて最大で１２倍の増加であった。同様に、マウスと非ヒト霊長類モデルの両方で、インフルエンザ抗原をコードするｍＲＮＡのような他のｍＲＮＡで高い有効性が見出された。
本明細書で製剤化されるｍＲＮＡワクチンを使用すれば、細胞性免疫と体液性免疫の両方を含む均衡のとれた免疫応答を誘導することができる。本ＬＮＰ製剤の利点は配列特異的ではないので、これらの製剤を使用すれば、様々な抗原をコードするｍＲＮＡを送達することができ、エピデミック状況またはパンデミック状況で迅速な展開が可能になる。さらに、本ＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡワクチンは、高度に免疫原性であり、したがって、著しい用量節約可能性が得られる。
Ｉ．本脂質ナノ粒子の組成物
本ＬＮＰは脂質の４つの範疇：（ｉ）；イオン化可能脂質（ｉｉ）；ペグ化脂質（ｉｉｉ）コレステロール系脂質、および、（ｉｖ）ヘルパー脂質を含む。
Ａ．イオン化可能脂質
イオン化可能脂質は、ｍＲＮＡカプセル化を促進し、カチオン性脂質でもよい。カチオン性脂質は、低ｐＨで正電荷環境を与えて、負電荷ｍＲＮＡ薬物物質の効率的なカプセル化を促進する。
一部の実施形態では、カチオン性脂質はＯＦ－０２である。
Figure 2023550600000002
 ＯＦ－０２は、ＯＦ－Ｄｅｇ－Ｌｉｎの非分解性構造類似物である。ＯＦ－Ｄｅｇ－Ｌｉｎは、ジケトピペラジンコアおよび二重不飽和テールに結合するための分解可能なエステル結合を含有しており、ＯＦ－０２は、同じジケトピペラジンコアおよび二重不飽和テールに結合するための非分解性１，２－アミノアルコール結合を含有する（Ｆｅｎｔｏｎら、Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ．（２０１６）２８：２９３９；米国特許第１０，２０１，６１８号）。本明細書の例示的ＬＮＰ製剤、脂質ＡはＯＦ－２を含有する。
一部の実施形態では、カチオン性脂質はｃＫＫ－Ｅ１０である（Ｄｏｎｇら、ＰＮＡＳ（２０１４）１１１（１１）：３９５５～６０頁；米国特許第９，５１２，０７３号）。
Figure 2023550600000003
 本明細書の例示的ＬＮＰ製剤、脂質ＢはｃＫＫ－Ｅ１０を含有する。
一部の実施形態では、カチオン性脂質は、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１０－ＤＳ－３－Ｅ１８－１（２－（４－（２－（（３－（ビス（（Ｚ）－２－ヒドロキシオクタデカ－９－エン－１－イル）アミノ）プロピル）ジスルファネイル）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル４－（ビス（２－ヒドロキシデシル）アミノ）ブタン酸であり、これは、ピペラジンコアを有するＨＥＰＥＳベースのジスルフィドカチオン性脂質であり、式（ＩＩＩ）を有する。
Figure 2023550600000004
 本明細書の例示的ＬＮＰ製剤、脂質ＣはＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１０－ＤＳ－３－Ｅ１８－１を含有する。脂質Ｃは、カチオン性脂質の違いを別にすれば、脂質Ａまたは脂質Ｂと同じ組成を有する。
一部の実施形態では、カチオン性脂質は、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０（２－（４－（２－（（３－（ビス（２－ヒドロキシデシル）アミノ）ブチル）ジスルファネイル）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブタン酸であり、これは、ピペラジンコアを有するＨＥＰＥＳベースのジスルフィドカチオン性脂質であり、式（ＩＶ）を有する。
Figure 2023550600000005
 本明細書の例示的ＬＮＰ製剤、脂質ＤはＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０を含有する。脂質Ｄは、カチオン性脂質の違いを別にすれば、脂質Ａまたは脂質Ｂと同じ組成を有する。
一部の実施形態では、カチオン性脂質は、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－３－Ｅ１４（２－（４－（２－（（３－（ビス（２－ヒドロキシテトラデシル）アミノ）プロピル）ジスルファネイル）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブタン酸であり、これは、ピペラジンコアを有するＨＥＰＥＳベースのジスルフィドカチオン性脂質であり、式（Ｖ）を有する。
Figure 2023550600000006
 本明細書の例示的ＬＮＰ製剤、脂質ＥはＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－３－Ｅ１４を含有する。脂質Ｅは、カチオン性脂質の違いを別にすれば、脂質Ａまたは脂質Ｂと同じ組成を有する。
カチオン性脂質ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１０－ＤＳ－３－Ｅ１８－１（ＩＩＩ）、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０（ＩＶ）、およびＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－３－Ｅ１４（Ｖ）は、図式１に提示される一般的手順に従って合成することができる。
図式１：式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、および（Ｖ）の脂質についての一般的合成図式
Figure 2023550600000007
使用できる他のカチオン性脂質は、Ｄｏｎｇ、上記を参照、および米国特許第１０，２０１，６１８号に記載されるカチオン性脂質を含む。
Ｂ．ペグ化脂質
ペグ化脂質成分は、ナノ粒子の粒子サイズおよび安定性を制御する。そのような成分を添加すれば、複雑な凝集を予防し、循環寿命を増やし標的組織への脂質－核酸医薬組成物の送達を増やすための手段が提供されうる（Ｋｌｉｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）２６８（１）：２３５～７頁）。これらの成分は、ｉｎ ｖｉｖｏで医薬組成物から迅速に交換するように選択しうる（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号参照）。
意図されるペグ化脂質は、誘導体化セラミド（例えば、Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－［サクシニル（メトキシポリエチレングリコール）］（Ｃ８ ＰＥＧセラミド））のようなＣ６～Ｃ２０（例えば、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、またはＣ１８）のアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合している長さが最大５ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ペグ化脂質は、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）；１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリエチレングリコール（ＤＬＰＥ－ＰＥＧ）；または１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－ポリエチレングリコール（ＤＳＧ－ＰＥＧ）である。
特に例示的な実施形態では、ＰＥＧは高分子量、例えば、２０００～２４００ｇ／ｍｏｌを有する。一部の実施形態では、ＰＥＧはＰＥＧ２０００（またはＰＥＧ－２Ｋ）である。特定の実施形態では、本明細書のペグ化脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＬＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＧ－ＰＥＧ２０００、またはＣ８ ＰＥＧ２０００である。
Ｃ．コレステロール系脂質
コレステロール成分は、ナノ粒子内部の脂質二重層構造を安定化させる。一部の実施形態では、ＬＮＰは、１つまたはそれ以上のコレステロール系脂質を含む。適切なコレステロール系脂質は、例えば、ＤＣ－Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキシアミドコレステロール）、１，４－ビス（３－Ｎ－アレイルアミノ－プロピル）ピペラジン（Ｇａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ．（１９９１）１７９：２８０頁；Ｗｏｌｆら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９７）２３：１３９頁；米国特許第５，７４４，３３５号）、イミダゾールコレステロールエステル（「ＩＣＥ」；ＷＯ２０１１／０６８８１０）、β－シトステロール、フコステロール、スチグマステロール、および他の修飾型のコレステロールを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ中で使用されるコレステロール系脂質はコレステロールである。
Ｄ．ヘルパー脂質
ヘルパー脂質はＬＮＰの構造安定性を増強し、ＬＮＰのエンドソーム脱出を助ける。ヘルパー脂質は、ｍＲＮＡ薬物ペイロードの取込みおよび放出を改善する。一部の実施形態では、ヘルパー脂質は、双性イオン脂質であり、これは薬物ペイロードの取込みおよび放出を増強するための膜融合特性を有する。ヘルパー脂質の例は、１，２－ジオレオイル－ＳＮ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）；１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）；および１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＯＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）；１，２－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、および１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）である。
他の例示的ヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、ガングリオシド、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはその組合せである。
特定の実施形態では、ヘルパー脂質はＤＯＰＥである。さらなる実施形態では、本ＬＮＰは、（ｉ）ＯＦ－０２、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１０－ＤＳ－３－Ｅ１８－１、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０、またはＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－３－Ｅ１４から選択されるカチオン性脂質；（ｉｉ）ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；（ｉｉｉ）コレステロール；および（ｉｖ）ＤＯＰＥを含む。
Ｅ．脂質成分のモル比
本発明者らは、上記成分の特定のモル比がｍＲＮＡを送達する際のＬＮＰの有効性にとって重要であることを発見した。カチオン性脂質、ペグ化脂質、コレステロール系脂質、およびヘルパー脂質のモル比はＡ：Ｂ：Ｃ：Ｄで、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％である。一部の実施形態では、全脂質と比べたＬＮＰ中のカチオン性脂質のモル比（すなわち、Ａ）は、３５～４５％（例えば、４０％のような３８～４２％）である。一部の実施形態では、全脂質と比べたペグ化脂質成分のモル比（すなわち、Ｂ）は、０．２５～２．７５％（例えば、１．５％のような１～２％）である。一部の実施形態では、全脂質と比べたコレステロール系脂質のモル比（すなわち、Ｃ）は、２０～３５％（例えば、２８．５％のような２７～３０％）である。一部の実施形態では、全脂質と比べたヘルパー脂質のモル比（すなわち、Ｄ）は、２５～３５％（例えば、３０％のような２８～３２％）である。一部の実施形態では、（ペグ化脂質＋コレステロール）成分はヘルパー脂質と同じモル量を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、１よりも多いカチオン性脂質対ヘルパー脂質のモル比を含有する。
特定の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質、ペグ化脂質、コレステロール系脂質、およびヘルパー脂質を４０：１．５：２８．５：３０のモル比で含有する。さらなる特定の実施形態では、ＬＮＰは、（ｉ）ＯＦ－０２、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１０－ＤＳ－３－Ｅ１８－１、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０、またはＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－３－Ｅ１４；（ｉｉ）ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；（ｉｉｉ）コレステロール；および（ｉｖ）ＤＯＰＥを４０：１．５：２８．５：３０で含有する。
ＬＮＰ製剤中に入れるそれぞれの脂質の実際量を計算するためには、カチオン性脂質のモル量は、所望のＮ／Ｐ比に基づいてまず決定され、Ｎはカチオン性脂質中の窒素原子の数であり、ＰはＬＮＰにより輸送されるｍＲＮＡ中のリン酸基の数である。次に、その他の脂質のそれぞれのモル量は、カチオン性脂質のモル量および選択されたモル比に基づいて計算される。次に、これらのモル量は、それぞれの脂質の分子量を使用して重量に変換される。
Ｆ．ＬＮＰの活性成分
本ＬＮＰワクチン組成物の活性成分は、目的の抗原をコードするｍＲＮＡである。抗原は、ウイルス、例えば、インフルエンザウイルス、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはＭＥＲＳ関連ウイルス）、エボラウイルス、デングウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ジカウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＰＩＶ３）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、チクングニアウイルス、または呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）由来のポリペプチドでもよい。
抗原は、細菌、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）（例えば、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）；耳炎、呼吸器感染症、および／または副鼻腔炎を引き起こす）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（クラミジアを引き起こす）、ボレリア（例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ライム病を引き起こす）、バシラス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽病を引き起こす）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）（腸チフスを引き起こす）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（結核を引き起こす）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）（挫創を引き起こす）、または無莢膜型インフルエンザ菌（ｎｏｎ－ｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に由来してもよい。
望まれる場合は、ＬＮＰまたはＬＮＰ製剤は多価でもよい。一部の実施形態では、ＬＮＰは、同じまたは異なる病原体由来の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上の抗原のような１つよりも多い抗原をコードするｍＲＮＡを保有していてもよい。例えば、ＬＮＰは、それぞれが異なる抗原をコードする複数のｍＲＮＡ分子を保有する；または１つよりも多い抗原に翻訳されることが可能なポリシストロニックなｍＲＮＡ（例えば、それぞれの抗原コード配列が、２Ａペプチドのような自己切断ペプチドをコードするヌクレオチドリンカーにより分離されている）を保有していてもよい。異なるｍＲＮＡ分子を保有するＬＮＰは、典型的には、それぞれのｍＲＮＡ分子の複数のコピーを含む（カプセル化する）。例えば、２つの異なるｍＲＮＡ分子を保有するまたはカプセル化するＬＮＰは、典型的には、２つの異なるｍＲＮＡ分子のそれぞれの複数のコピーを保有する。
一部の実施形態では、単一のＬＮＰ製剤は、それぞれの種類が異なるｍＲＮＡを保有する、複数の種類（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上）のＬＮＰを含んでいてもよい。
多価ＬＮＰワクチンの例は、インフルエンザウイルス由来のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰワクチンのような、上記病原体由来の２つまたはそれ以上の抗原をコードするｍＲＮＡを含有するＬＮＰワクチンである。一部の実施形態では、多価ＬＮＰワクチンは、ヘマグルチニン（例えば、ヘマグルチニン１（ＨＡ１）およびヘマグルチニン２（ＨＡ２））、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）、および非構造タンパク質２（ＮＳ２）から選択される２つまたはそれ以上（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０）のインフルエンザウイルスタンパク質に由来するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子を含有する。さらなる実施形態では、多価ＬＮＰワクチンは、ＨＡタンパク質由来の、ＮＡタンパク質由来の、およびＨＡとＮＡタンパク質の両方由来の抗原性ポリペプチドをコードする２つまたはそれ以上（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはそれ以上）のｍＲＮＡ分子を含有する。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子は異なるインフルエンザ株由来である。
ある特定の実施形態では、組成物は、インフルエンザＡ、ＢおよびＣウイルスの抗原をコードする１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ分子を含んでもよい。一実施形態では、組成物は、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢウイルスのＨＡおよび／またはＮＡ抗原をコードする１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ分子を含んでもよい。一実施形態では、インフルエンザＡウイルスのＨＡ抗原は、サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、およびＨ１８から選択される。一実施形態では、インフルエンザＡウイルスのＮＡ抗原は、サブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１０、およびＮ１１から選択される。一実施形態では、インフルエンザＢウイルスのＨＡおよびＮＡ抗原は、インフルエンザＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統由来である。一実施形態では、インフルエンザＢウイルスのＨＡおよびＮＡ抗原は、インフルエンザＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統由来である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＨＡおよびＮＡ抗原は、世界保健機構（ＷＨＯ）によりインフルエンザワクチン製剤の年間推奨で推奨されるインフルエンザウイルス株由来である。
ある特定の実施形態では、１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスタンパク質のうちの少なくとも１つは、機械学習モデルから同定されるまたは設計される分子配列を有するインフルエンザウイルスＨＡタンパク質および／またはインフルエンザウイルスＮＡタンパク質を含み、１つまたはそれ以上のリボ核酸分子のうちの少なくとも１つは、機械学習モデルから同定されるまたは設計される分子配列を有する１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする。
ある特定の実施形態では、組成物は、（ｉ）１つまたはそれ以上のＨＡ抗原、（ｉｉ）１つまたはそれ以上のＮＡ抗原、または（ｉｉｉ）１つまたはそれ以上のＨＡ抗原およびＮＡ抗原の組合せをコードする２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、またはそれ以上のｍＲＮＡ分子を含む。
一実施形態では、組成物は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ５Ｎ２、およびＨ１０Ｎ７サブタイプならびに／またはＢ／ＹａｍａｇａｔａおよびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統から選択される、ｉ）１つまたはそれ以上のＨＡ抗原、（ｉｉ）１つまたはそれ以上のＮＡ抗原、または（ｉｉｉ）１つまたはそれ以上のＨＡ抗原およびＮＡ抗原の組合せをコードする２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、またはそれ以上のｍＲＮＡ分子を含む。
一実施形態では、組成物は、Ｈ３ ＨＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、Ｈ１ ＨＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、インフルエンザＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統由来のＨＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、およびインフルエンザＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＨＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子を含む。
一実施形態では、組成物は、Ｈ３ ＨＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、Ｎ２ ＮＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、Ｈ１ ＨＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、Ｎ１ ＮＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、インフルエンザＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統由来のＨＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、インフルエンザＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統由来のＮＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、インフルエンザＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統由来のＨＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、およびインフルエンザＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統由来のＮＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子を含む。
実施形態では、組成物は、機械学習モデルから同定されるまたは設計される分子配列を有する機械学習インフルエンザウイルスＨＡをコードする１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ分子をさらに含み、１つまたはそれ以上の機械学習インフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ１ ＨＡ、Ｈ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系列由来のＨＡ、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系列由来のＨＡ、またはその組合せから選択してもよい。
１つまたはそれ以上の機械学習インフルエンザウイルスＨＡを選択する場合、いかなる機械学習アルゴリズムを使用してもよい。例えば、ワクチンを設計するためのシステムおよび方法という表題のＰＣＴ出願国際公開第２０２１／０８０９９０号、ならびに生物学的応答を予測するためのシステムおよび方法という表題のＰＣＴ出願国際公開第２０２１／０８０９９９号に開示される機械学習アルゴリズムおよび方法のいずれかが本明細書で想定されており、前記特許文献の両方は参照によってその全体を本明細書に組み入れる。
ｍＲＮＡ分子は修飾されない（すなわち、リン酸ジエステル結合により連結された天然のリボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｃ、および／またはＧだけを含有する）、または化学的に修飾されてもよい（例えば、プソイドウリジン（例えば、Ｎ－１－メチルプソイドウリジン）、２’－フルオロリボヌクレオチド、および２’－メトキシリボヌクレオチドのようなヌクレオチド類似物、ならびに／またはホスホロチオエート結合を含む）。ｍＲＮＡ分子は、５’キャップおよびポリＡテールを含んでもよい。
ＲＳＶ Ｆタンパク質
呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）は、ニューモウイルス科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するネガティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＲＳＶは気道の感染を引き起こすことがある。ＲＳＶはエンベロープウイルスであり、表面に糖タンパク質（Ｇタンパク質）、小型の疎水性タンパク質（ＳＨタンパク質）、および融合タンパク質（Ｆタンパク質）を有する。
ＲＳＶ Ｆタンパク質は、ウイルス膜と宿主細胞膜の融合を担当し、少なくとも３つの立体構造（融合前、中間、および融合後立体構造）を帯びる。融合前立体構造（融合前、Ｐｒｅ－Ｆ）では、Ｆタンパク質は、主要な抗原部位Φを露出して三量体型で存在する。部位Φは、ＲＳＶ感染対象により産生される中和抗体の主要な標的の役目を果たす（Ｃｏｕｌｔａｓら、Ｔｈｏｒａｘ．７４：９８６～９９３頁．２０１９年；ＭｃＬｅｌｌａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．３４０（６１３６）：１１１３～７頁．２０１３年参照）。宿主細胞表面上のその標的に結合後、Ｐｒｅ－Ｆは立体構造変化を受け、その間部位Φはもはや露出していない。Ｐｒｅ－Ｆは一過性の中間立体構造に移行し、Ｆタンパク質が宿主細胞膜中に挿入されるのを可能にし、ウイルス膜と宿主細胞膜が融合される。最終的な立体構造シフトにより、タンパク質のより安定した細長い形（融合後、Ｐｏｓｔ－Ｆ）が生じる。Ｆタンパク質の部位ＩＩおよび部位ＩＶはＰｏｓｔ－Ｆに特有であり、部位ＩはＰｒｅ－ＦおよびＰｏｓｔ－Ｆ立体構造の両方に存在している（ＭｃＬｅｌｌａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８５（１５）：７７８８～７７９６頁．２０１１年）。
本明細書で使用される場合、用語「Ｆタンパク質」または「ＲＳＶ Ｆタンパク質」とは、ウイルス侵入中のウイルスエンベロープと宿主細胞膜の融合を駆動することを担当するＲＳＶのタンパク質のことである。
本明細書で使用される場合、用語「ＲＳＶ Ｆポリペプチド」または「Ｆポリペプチド」とは、Ｆタンパク質の少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドのことである。
本明細書で使用される場合、ＲＳＶ Ｆに関して用語「融合後」とは、ウイルスと細胞膜の合併後に生じるＲＳＶ Ｆの安定な立体構造のことである。
本明細書で使用される場合、ＲＳＶ Ｆに関して用語「融合前」とは、ウイルス－細胞相互作用前に取るＲＳＶ Ｆの立体構造のことである。
抗原性ＲＳＶ ＦポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子が本明細書で提供される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質抗原は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質抗原は、配列番号１６に少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む、または配列番号１６のアミノ酸配列からなる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１７に示される核酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２１に示される核酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質抗原は、融合前タンパク質である。
一部の実施形態では、ＯＲＦはコドン最適化されている。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、少なくとも１つの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１つの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ中のウラシルヌクレオチドの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％が化学修飾されている。
一部の実施形態では、ＯＲＦ中のウラシルヌクレオチドの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％が化学修飾されている。
一部の実施形態では、化学修飾は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、および２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される。
一部の実施形態では、化学修飾は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、およびその組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、化学修飾はＮ１－メチルプソイドウリジンである。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは以下の構造エレメントを含む：
（ｉ）以下の構造を有する５’キャップ；
Figure 2023550600000008
 （ｉｉ）配列番号１９の核酸配列を有する５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）；
（ｉｉｉ）配列番号１７の核酸配列を有するタンパク質コード領域；
（ｉｖ）配列番号２０の核酸配列を有する３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）；および
（ｖ）ポリ（Ａ）テール。
Ｇ．バッファーおよび他の成分
核酸および／もしくはＬＮＰを安定化させるため（例えば、ワクチン製品の貯蔵寿命を延ばすため）、ＬＮＰ医薬組成物の投与を促進するため、ならびに／または核酸のｉｎ ｖｉｖｏ発現を増強するため、核酸および／またはＬＮＰは、１つまたはそれ以上の担体、ターゲティングリガンド、安定化試薬（例えば、保存剤および抗酸化剤）および／または他の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて製剤化することができる。そのような賦形剤の例は、パラベン、チメロサール、チオメルサール、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）および同類のものである。
本開示のＬＮＰ組成物は、凍結液体形態または凍結乾燥形態として提供できる。サクロース、トレハロース、グルコース、マンニトール、マンノース、ブドウ糖、および同類のものを含むが、これらに限定されない、種々の凍結保護物質を使用しうる。凍結保護物質は、ＬＮＰ組成物の５～３０％（ｗ／ｖ）を構成していてよい。一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物はトレハロースを、例えば、５～３０％（例えば、１０％）（ｗ／ｖ）で含む。凍結保護物質を用いて製剤化された後は、ＬＮＰ組成物を－２０℃～－８０℃で凍結してもよい（または凍結乾燥され、凍結保存される）。
ＬＮＰ組成物は、水性緩衝溶液で患者に与えてもよく、予め凍結されている場合は、または予め凍結乾燥されている場合は解凍され、枕元において水性緩衝溶液で再構成される。特に例示的な実施形態では、緩衝溶液は等張であり、例えば、筋肉内または皮内注射に適している。一部の実施形態では、緩衝溶液はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。
ＩＩ．ＲＮＡ
本開示の本ＬＮＰワクチン組成物は、目的の抗原をコードするＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）を含む場合がある。本開示のＲＮＡ分子は、目的の抗原をコードするＯＲＦを含む少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）を含む場合がある。ある特定の実施形態では、ＲＮＡは、目的の抗原をコードするＯＲＦを含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。ある特定の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、少なくとも１つの５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）テール、および／または５’キャップをさらに含む。
ＩＩ．Ａ．５’キャップ
ｍＲＮＡ ５’キャップは、大半の真核細胞に見出されるヌクレアーゼに対する抵抗性を与え、翻訳効率を促進することができる。いくつかのタイプの５’キャップが知られている。７－メチルグアノシンキャップ（「ｍ７Ｇ」または「キャップ－０」とも呼ばれる）は、５’－５’三リン酸結合を通じて第１の転写されたヌクレオチドに連結されているグアノシンを含む。
５’キャップは典型的には以下の通りに付加される：まず、ＲＮＡ末端ホスファターゼは５’ヌクレオチドから末端リン酸基の１つを取り除き、２つの末端リン酸塩を残し；次にグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼにより末端リン酸塩に付加され、５’５’５三リン酸結合を生成し；次にグアニンの７－窒素がメチルトランスフェラーゼによりメチル化される。キャップ構造の例は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ、（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、およびＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含むがこれらに限定されない。追加のキャップ構造は、米国特許出願公開第２０１６／００３２３５６号および米国特許出願公開第２０１８／０１２５９８９号に記載されており、前記特許文献は参照によって本明細書に組み入れる。
ポリヌクレオチドの５’－キャッピングは、製造業者のプロトコルに従って５’－グアノシンキャップ構造を生み出す以下の化学的ＲＮＡキャップ類似物：３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ＡＲＣＡキャップ）；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＵ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ；ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応中に同時に完了させてもよい。修飾されたＲＮＡの５’－キャッピングは、キャップ０構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを生み出すワクシニアウイルスキャッピング酵素を使用して転写後に完了させてもよい。キャップ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素とｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏ－メチルを生み出す２’－Ｏメチルトランスフェラーゼの両方を使用して生み出してもよい。キャップ２構造は、キャップ１構造から生み出されてもよく、続いて２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを使用して５’－アンテペナルティメート（ａｎｔｅｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ）ヌクレオチドが２’－Ｏメチル化される。キャップ３構造は、キャップ２構造から生み出されてもよく、続いて２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを使用して５’－プレアンテペナルティメート（ｐｒｅａｎｔｅｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ）ヌクレオチドが２’－Ｏメチル化される。
ある特定の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ＡＲＣＡキャップ）、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＵ、およびｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧからなる群から選択される５’キャップを含む。
ある特定の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、
Figure 2023550600000009
 の５’キャップを含む。
ＩＩ．Ｂ．非翻訳領域（ＵＴＲ）
一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。ｍＲＮＡでは、５’ＵＴＲは転写開始部位で開始して開始コドンまで続くが開始コドンは含まない。３’ＵＴＲは終止コドンに続いてすぐに開始し、転写終止シグナルまで続く。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす１つまたはそれ以上のエレメントを含む５’ＵＴＲを含む場合がある。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは約１０～５，０００ヌクレオチド長である場合がある。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは約５０～５００ヌクレオチド長である場合がある。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、少なくとも約１０ヌクレオチド長、約２０ヌクレオチド長、約３０ヌクレオチド長、約４０ヌクレオチド長、約５０ヌクレオチド長、約１００ヌクレオチド長、約１５０ヌクレオチド長、約２００ヌクレオチド長、約２５０ヌクレオチド長、約３００ヌクレオチド長、約３５０ヌクレオチド長、約４００ヌクレオチド長、約４５０ヌクレオチド長、約５００ヌクレオチド長、約５５０ヌクレオチド長、約６００ヌクレオチド長、約６５０ヌクレオチド長、約７００ヌクレオチド長、約７５０ヌクレオチド長、約８００ヌクレオチド長、約８５０ヌクレオチド長、約９００ヌクレオチド長、約９５０ヌクレオチド長、約１，０００ヌクレオチド長、約１，５００ヌクレオチド長、約２，０００ヌクレオチド長、約２，５００ヌクレオチド長、約３，０００ヌクレオチド長、約３，５００ヌクレオチド長、約４，０００ヌクレオチド長、約４，５００ヌクレオチド長、または５，０００ヌクレオチド長である。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるｍＲＮＡは、ポリアデニル化シグナルの１つまたはそれ以上、細胞内でのｍＲＮＡの位置の安定性に影響を及ぼすタンパク質に対する結合部位、またはｍｉＲＮＡに対する１つまたはそれ以上の結合部位を含む３’ＵＴＲを含む場合がある。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは約５０～５，０００ヌクレオチド長またはそれよりも長い場合がある。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは約５０～１，０００ヌクレオチド長またはそれよりも長い場合がある。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、少なくとも約５０ヌクレオチド長、約１００ヌクレオチド長、約１５０ヌクレオチド長、約２００ヌクレオチド長、約２５０ヌクレオチド長、約３００ヌクレオチド長、約３５０ヌクレオチド長、約４００ヌクレオチド長、約４５０ヌクレオチド長、約５００ヌクレオチド長、約５５０ヌクレオチド長、約６００ヌクレオチド長、約６５０ヌクレオチド長、約７００ヌクレオチド長、約７５０ヌクレオチド長、約８００ヌクレオチド長、約８５０ヌクレオチド長、約９００ヌクレオチド長、約９５０ヌクレオチド長、約１，０００ヌクレオチド長、約１，５００ヌクレオチド長、約２，０００ヌクレオチド長、約２，５００ヌクレオチド長、約３，０００ヌクレオチド長、約３，５００ヌクレオチド長、約４，０００ヌクレオチド長、約４，５００ヌクレオチド長、または５，０００ヌクレオチド長である。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ転写物によりコードされる遺伝子とは異なる遺伝子に由来する５’または３’ＵＴＲを含む場合がある（すなわち、ＵＴＲは異種ＵＴＲである）。
ある特定の実施形態では、５’および／または３’ＵＴＲ配列は、ｍＲＮＡの安定性を増やすために安定したｍＲＮＡ（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸回路酵素）から引き出すことができる。例えば、５’ＵＴＲ配列は、ヌクレアーゼ抵抗性を改善するおよび／またはｍＲＮＡの半減期を改善するためにＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分的配列、またはその断片を含んでもよい。ｍＲＮＡの３’末端または非翻訳領域にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列またはその断片を含むことも意図されている。一般的には、これらの改変は、その非改変対応物と比べてｍＲＮＡの安定性および／または薬物動態特性（例えば、半減期）を改善し、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏヌクレアーゼ消化に対するそのようなｍＲＮＡ抵抗性を改善するために加えられる改変を含む。
例示的５’ＵＴＲは、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子由来の配列（米国特許出願公開第２０１４／０２０６７５３号および米国特許出願公開第２０１５／０１５７５６５号、前記特許文献のそれぞれは参照によって本明細書に組み入れる）、または配列ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣ（配列番号２２）（米国特許出願公開第２０１６／０１５１４０９号、参照によって本明細書に組み入れる）を含む。
種々の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ由来でもよい。ＴＯＰ遺伝子は典型的には５’－末端オリゴピリミジン（ＴＯＰ）トラクトの存在を特徴とする。さらに、大半のＴＯＰ遺伝子は成長関連翻訳調節を特徴とする。しかし、組織特異的翻訳調節を有するＴＯＰ遺伝子も知られている。ある特定の実施形態では、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ由来の５’ＵＴＲは５’ＴＯＰモチーフ（オリゴピリミジントラクト）を欠く（例えば、米国特許出願公開第２０１７／００２９８４７号、米国特許出願公開第２０１６／０３０４８８３号、米国特許出願公開第２０１６／０２３５８６４号、および米国特許出願公開第２０１６／０１６６７１０号、前記特許文献のそれぞれは参照によって本明細書に組み入れる）。
ある特定の実施形態では、５’ＵＴＲは、リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子に由来する（米国特許出願公開第２０１７／００２９８４７号、上記参照）。
ある特定の実施形態では、５’ＵＴＲは、水酸化ステロイド（１７－ｂ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲに由来する（米国特許出願公開第２０１６／０１６６７１０号、上記参照）。
ある特定の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’ＵＴＲに由来する（米国特許出願公開第２０１６／０１６６７１０号、上記参照）。
一部の実施形態では、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は５’ＵＴＲの代わりに使用される。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号１９に示される核酸配列を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号２０に示される核酸配列を含む。５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、ＷＯ２０１２／０７５０４０にさらに詳細に記載され、参照によって本明細書に組み入れる。
ＩＩ．Ｃ．ポリアデニル化テール
本明細書で使用される場合、用語「ポリ（Ａ）配列」、「ポリ（Ａ）テール」、および「ポリ（Ａ）領域」とは、ｍＲＮＡ分子の３’末端のアデノシンヌクレオチドの配列のことである。ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡに安定性を与え、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護しうる。ポリ（Ａ）テールは翻訳を増強しうる。一部の実施形態では、ポリ（Ａ）テールは本質的にホモポリマーである。例えば、１００アデノシンヌクレオチドのポリ（Ａ）テールは、本質的に１００ヌクレオチドの長さを有しうる。ある特定の実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、アデノシンヌクレオチドとは異なる少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、アデノシンヌクレオチドではないヌクレオチド）により中断されている場合がある。例えば、１００アデノシンヌクレオチドのポリ（Ａ）テールは、１００ヌクレオチドを超える長さを有する場合がある（１００アデノシンヌクレオチドおよびアデノシンヌクレオチドとは異なる少なくとも１つのヌクレオチド、または一続きのヌクレオチドを含む）。ある特定の実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、配列ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＵＡＵＧＡＣＵＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２３）を含む。
「ポリ（Ａ）テール」は、本明細書で使用される場合、典型的にはＲＮＡに関する。しかし、本開示の文脈では、本用語は、ＤＮＡ分子中の対応する配列（例えば、「ポリ（Ｔ）配列」）にも同様に関する。
ポリ（Ａ）テールは、約１０～約５００アデノシンヌクレオチド、約１０～約２００アデノシンヌクレオチド、約４０～約２００アデノシンヌクレオチド、または約４０～約１５０アデノシンヌクレオチドを含んでもよい。ポリ（Ａ）テールの長さは、少なくとも約１０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００アデノシンヌクレオチドでもよい。
核酸がＲＮＡである一部の実施形態では、核酸のポリ（Ａ）テールは、ＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写中にＤＮＡ鋳型から得られる。ある特定の実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、ＤＮＡ鋳型から転写されずに化学合成の一般的方法により得られる。種々の実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、市販のポリアデニル化キットおよび対応するプロトコルを使用してＲＮＡの酵素的ポリアデニル化により、または代わりに、固定されたポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用する、例えば、ＷＯ２０１６／１７４２７１に記載される方法および手段を使用することにより生み出される。
核酸は、酵素的ポリアデニル化により得られるポリ（Ａ）テールを含む場合があり、大多数の核酸分子は約１００（＋／－２０）～約５００（＋／－５０）または約２５０（＋／－２０）アデノシンヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、核酸は鋳型ＤＮＡ由来のポリ（Ａ）テールを含む場合があり、例えば、ＷＯ２０１６／０９１３９１に記載されるように、酵素的ポリアデニル化により生み出される少なくとも１つの追加のポリ（Ａ）テールをさらに含む場合があり、前記特許文献は参照により本明細書に組み入れる。
ある特定の実施形態では、核酸は少なくとも１つのポリアデニル化シグナルを含む。
種々の実施形態では、核酸は少なくとも１つのポリ（Ｃ）配列を含む場合がある。
用語「ポリ（Ｃ）配列」は、本明細書で使用される場合、約２００シトシンヌクレオチドまでのシトシンヌクレオチドの配列であることが意図されている。一部の実施形態では、ポリ（Ｃ）配列は、約１０～約２００シトシンヌクレオチド、約１０～約１００シトシンヌクレオチド、約２０～約７０シトシンヌクレオチド、約２０～約６０シトシンヌクレオチド、または約１０～約４０シトシンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリ（Ｃ）配列は、約３０シトシンヌクレオチドを含む。
ＩＩ．Ｄ．化学修飾
本明細書で開示されるｍＲＮＡは修飾されても非修飾でもよい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは少なくとも１つの化学修飾を含んでいてよい。一部の実施形態では、本明細書で開示されるｍＲＮＡは、典型的にはＲＮＡ安定性を増強する１つまたはそれ以上の修飾を含有してよい。例示的な修飾は、骨格修飾、糖修飾、または塩基修飾を含むことができる。一部の実施形態では、開示されたｍＲＮＡは、プリン（アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））またはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ））を含むがこれらの限定されない天然に存在するヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似物（修飾ヌクレオチド）から合成しうる。ある特定の実施形態では、開示されたｍＲＮＡは、例えば、１－メチル－アデニン、２－メチル－アデニン、２－メチルチオ－Ｎ－６－イソペンテニル－アデニン、Ｎ６－メチル－アデニン、Ｎ６－イソペンテニル－アデニン、２－チオ－シトシン、３－メチル－シトシン、４－アセチル－シトシン、５－メチル－シトシン、２，６－ジアミノプリン、１－メチル－グアニン、２－メチル－グアニン、２，２－ジメチル－グアニン、７－メチル－グアニン、イノシン、１－メチル－イノシン、プソイドウラシル（５－ウラシル）、ジヒドロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、４－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－ウラシル、５－フルオロ－ウラシル、５－ブロモ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウラシル、５－メチル－２－チオ－ウラシル、５－メチル－ウラシル、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチルアミノメチル－ウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５’－メトシキカルボニルメチル－ウラシル、５－メトキシ－ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、１－メチル－プソイドウラシル、キューオシン、β－Ｄ－マンノシル－キューオシン、ホスホロアミド酸、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホン酸、７－デアザグアノシン、５－メチルシトシン、およびイノシンのようなプリンおよびピリミジンの修飾ヌクレオチド類似物または誘導体から合成しうる。
一部の実施形態では、開示されたｍＲＮＡは、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、および２’－Ｏ－メチルウリジンを含むがこれらに限定されない少なくとも１つの化学修飾を含んでいてよい。
一部の実施形態では、化学修飾は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、およびその組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、化学修飾はＮ１－メチルプソイドウリジンを含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ中のウラシルヌクレオチドの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％が化学修飾されている。
一部の実施形態では、ＯＲＦ中のウラシルヌクレオチドの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％が化学修飾されている。
そのような類似物の製造は、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号、および米国特許第５，７００，６４２号に記載されている。
ＩＩ．Ｅ．ｍＲＮＡ合成
本明細書で開示されるｍＲＮＡは、多種多様な方法のうちのいずれに従って合成してもよい。例えば、本開示に従ったｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）により合成しうる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのいくつかの方法は、例えば、Ｇｅａｌｌら、（２０１３）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（２）：１５２～１５９頁；Ｂｒｕｎｅｌｌｅら、（２０１３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５３０：１０１～１４頁に記載されている。手短に言えば、ＩＶＴは、典型的には、プロモーターを含有する直鎖状もしくは環状ＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含む場合があるバッファー系、適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ピロホスファターゼ、ならびに／またはＲＮアーゼ阻害剤を用いて実施される。正確な条件は、特定の適用に従って変動しうる。これらの試薬の存在は最終ｍＲＮＡ製品中では一般に好ましくなく、これらの試薬は、治療使用に適しているクリーンなおよび／または均質なｍＲＮＡを提供するために精製するまたは取り除くことができる不純物または汚染物質と見なすことができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応から提供されるｍＲＮＡは一部の実施形態では望ましい場合があるが、細菌、真菌、植物、および／または動物から産生される野生型ｍＲＮＡを含むｍＲＮＡの他の供給源を本開示に従って使用することが可能である。
ＩＩＩ．本ＬＮＰワクチンを作製するための方法
本ＬＮＰは当技術分野で現在知られている種々の技法により製造することができる。例えば、多重膜ベシクル（ＭＬＶ）は、脂質を適切な溶媒に溶解し、次に溶媒を蒸発させて器の内側に薄膜を残すことによりまたは噴霧乾燥により適切な容器または器の内壁に選択された脂質を沈着させることにより、のような従来の技法に従って製造してもよい。次に、水相を渦運動する器に添加してＭＬＶを形成してもよい。次に、多重膜ベシクルの均質化、超音波処理または押し出し加工により単層膜リポソーム（ＵＬＶ）を形成することができる。さらに、単層膜リポソームは、洗剤除去技法により形成することができる。
種々の方法が、ＵＳ２０１１／０２４４０２６、ＵＳ２０１６／００３８４３２、ＵＳ２０１８／０１５３８２２、ＵＳ２０１８／０１２５９８９、およびＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４３２２３（２０２０年７月２３日提出）に記載されており、本発明を実行するのに使用することができる。１つの例示的方法は、ＵＳ２０１６／００３８４３２に記載される通りに、まず脂質を前もって脂質ナノ粒子に形成することなく、ｍＲＮＡを脂質の混合物と混ぜ合わせることによりｍＲＮＡをカプセル化することを必要とする。別の例示的方法は、ＵＳ２０１８／０１５３８２２に記載される通りに、前もって形成されたＬＮＰをｍＲＮＡと混ぜ合わせることによりｍＲＮＡをカプセル化することを必要とする。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ負荷ＬＮＰを製造する方法は、溶液の１つまたはそれ以上を環境温度よりも高い温度まで加熱する工程であって、１つまたはそれ以上の溶液は予め形成された脂質ナノ粒子を含む溶液、ｍＲＮＡを含む溶液およびＬＮＰカプセル化ｍＲＮＡを含む混合溶液である、工程を含む。一部の実施形態では、方法は、混合工程に先立って、ｍＲＮＡ溶液と予め形成されたＬＮＰ溶液のうちの１つまたは両方を加熱する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、混合工程中に、予め形成されたＬＮＰを含む溶液、ｍＲＮＡを含む溶液、およびＬＮＰカプセル化されたｍＲＮＡを含む溶液のうちの１つまたはそれ以上を加熱することを含む。一部の実施形態では、方法は、混合工程後に、ＬＮＰカプセル化ｍＲＮＡを加熱する工程を含む。一部の実施形態では、溶液のうちの１つまたはそれ以上を加熱する温度は、約３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、もしくは７０℃である、またはこれよりも高い。一部の実施形態では、溶液のうちの１つまたはそれ以上を加熱する温度は、約２５～７０℃、約３０～７０℃、約３５～７０℃、約４０～７０℃、約４５～７０℃、約５０～７０℃、または約６０～７０℃の範囲である。一部の実施形態では、温度は約６５℃である。
種々の方法を使用して本発明に適したｍＲＮＡ溶液を製造してもよい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、本明細書に記載されるバッファー溶液に直接溶解してもよい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、カプセル化のために脂質溶液と混合する前にｍＲＮＡストック液をバッファー溶液と混合することにより作製してもよい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、カプセル化のために脂質溶液と混合する直前にｍＲＮＡストック液をバッファー溶液と混合することにより作製してもよい。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック液は、水またはバッファー中に約０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、または１．６ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、３．５ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、４．５ｍｇ／ｍｌ、または５．０ｍｇ／ｍｌの濃度でまたはこれよりも高い濃度でｍＲＮＡを含有してもよい。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡストック液は、ポンプを使用してバッファー溶液と混合される。例示的なポンプは、歯車ポンプ、蠕動ポンプ、および遠心ポンプを含むがこれらに限定されない。典型的には、バッファー溶液は、ｍＲＮＡストック液の速度よりも大きな速度で混合される。例えば、バッファー溶液は、ｍＲＮＡストック液の速度の少なくとも１×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１５×、または２０×の速度で混合してもよい。一部の実施形態では、バッファー溶液は、約１００～６０００ｍｌ／分（例えば、約１００～３００ｍｌ／分、３００～６００ｍｌ／分、６００～１２００ｍｌ／分、１２００～２４００ｍｌ／分、２４００～３６００ｍｌ／分、３６００～４８００ｍｌ／分、４８００～６０００ｍｌ／分、または６０～４２０ｍｌ／分）の範囲の流量で混合される。一部の実施形態では、バッファー溶液は、約６０ｍｌ／分、１００ｍｌ／分、１４０ｍｌ／分、１８０ｍｌ／分、２２０ｍｌ／分、２６０ｍｌ／分、３００ｍｌ／分、３４０ｍｌ／分、３８０ｍｌ／分、４２０ｍｌ／分、４８０ｍｌ／分、５４０ｍｌ／分、６００ｍｌ／分、１２００ｍｌ／分、２４００ｍｌ／分、３６００ｍｌ／分、４８００ｍｌ／分、または６０００ｍｌ／分の流量、またはそれよりも大きな流量で混合される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡストック液は、約１０～６００ｍｌ／分（例えば、約５～５０ｍｌ／分、約１０～３０ｍｌ／分、約３０～６０ｍｌ／分、約６０～１２０ｍｌ／分、約１２０～２４０ｍｌ／分、約２４０～３６０ｍｌ／分、約３６０～４８０ｍｌ／分、または約４８０～６００ｍｌ／分）の範囲の流量で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡストック液は、約５ｍｌ／分、１０ｍｌ／分、１５ｍｌ／分、２０ｍｌ／分、２５ｍｌ／分、３０ｍｌ／分、３５ｍｌ／分、４０ｍｌ／分、４５ｍｌ／分、５０ｍｌ／分、６０ｍｌ／分、８０ｍｌ／分、１００ｍｌ／分、２００ｍｌ／分、３００ｍｌ／分、４００ｍｌ／分、５００ｍｌ／分、または６００ｍｌ／分の流量またはそれよりも大きな流量で混合される。
所望のｍＲＮＡを脂質ナノ粒子中に取り込む方法は、「負荷」と呼ばれる。例示的な方法は、Ｌａｓｉｃら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．（１９９２）３１２：２５５～８頁に記載されている。ＬＮＰ取込み核酸は、脂質ナノ粒子の内部空間に完全にもしくは部分的に位置している、脂質ナノ粒子の二重膜内にある、または脂質ナノ粒子膜の外面に会合していてもよい。脂質ナノ粒子中へのｍＲＮＡの取込みは、核酸が脂質ナノ粒子の内部空間内に完全にまたは実質的に含有される「カプセル化」とも本明細書では呼ばれる。
適切なＬＮＰを種々のサイズで作製しうる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子のサイズの減少は、ｍＲＮＡのより効率的な送達と関連する。適切なＬＮＰサイズの選択には、標的細胞または組織の部位およびある程度は脂質ナノ粒子が作製される目的となる適用を考慮に入れてもよい。
当技術分野で知られている多種多様の方法が、脂質ナノ粒子の集団のサイズ分類に利用可能である。本明細書で特に例示的な方法は、ゼータサイザーナノＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を利用してＬＮＰ粒子サイズを測定する。一プロトコルでは、ＬＮＰ試料１０μｌが１０％トレハロース９９０μｌと混合される。この溶液はキュベット中に負荷され、次にゼータサイザー機中に置かれる。ｚ平均直径（ｎｍ）、またはキュムラント平均は、試料中のＬＮＰについての平均サイズと見なされる。ゼータサイザー機を使用すれば、動的光散乱（ＤＬＳ）および自己相関関数のキュムラント分析を使用することにより多分散性指数（ＰＤＩ）を測定することもできる。平均ＬＮＰ直径は、形成されたＬＮＰの超音波処理により減少させうる。断続的超音波処理サイクルを、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）評価と交互に繰り返して、効率的な脂質ナノ粒子合成を導いてもよい。
一部の実施形態では、精製されたＬＮＰの大多数、すなわち、ＬＮＰの約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％よりも多い、は約７０～１５０ｎｍ（例えば、約１４５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、または約８０ｎｍ）のサイズを有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子の実質的にすべて（例えば、８０％または９０％よりも多い）は、約７０～１５０ｎｍ（例えば、約１４５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、または約８０ｎｍ）のサイズを有する。
一部の実施形態では、本組成物中のＬＮＰは、１５０ｎｍ未満、１２０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、９０ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、７０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満、または２０ｎｍ未満の平均サイズを有する。
一部の実施形態では、本組成物中のＬＮＰの約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％よりも多くは、約４０～９０ｎｍ（例えば、約４５～８５ｎｍ、約５０～８０ｎｍ、約５５～７５ｎｍ、約６０～７０ｎｍ）、または吸入投与による肺送達に特に適している約５０～７０ｎｍ（例えば、５５～６５ｎｍ）の範囲のサイズを有する。
一部の実施形態では、本発明により提供される医薬組成物中のＬＮＰの分散度、または分子サイズの不均質性の尺度（ＰＤＩ）は、約０．５未満である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約０．５未満、約０．４未満、約０．３未満、約０．２８未満、約０．２５未満、約０．２３未満、約０．２０未満、約０．１８未満、約０．１６未満、約０．１４未満、約０．１２未満、約０．１０未満、または約０．０８未満のＰＤＩを有する。ＰＤＩは、上に記載されるゼータサイザー機により測定しうる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物中の精製されたＬＮＰの約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％よりも多くは、ｍＲＮＡをそれぞれ個々の粒子内にカプセル化している。一部の実施形態では、医薬組成物中の精製された脂質ナノ粒子の実質的にすべて（例えば、８０％または９０％よりも多い）は、ｍＲＮＡをそれぞれ個々の粒子内にカプセル化している。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は５０％～９０％、または約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９８、または９９％よりも多いカプセル化効率を有する。典型的には、本明細書で使用するための脂質ナノ粒子は、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１、９２、９３、９４、または９５％）のカプセル化効率を有する。
一部の実施形態では、ＬＮＰは１～１０のＮ／Ｐ比を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、Ｎ／Ｐ比１より上、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、または約８を有する。さらなる実施形態では、本明細書の典型的なＬＮＰは４のＮ／Ｐ比を有する。
一部の実施形態では、本発明に従った医薬組成物は、少なくとも約０．５μｇ、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、１００μｇ、５００μｇ、または１０００μｇのカプセル化ｍＲＮＡを含有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも約０．１μｇ～１０００μｇ、少なくとも約０．５μｇ、少なくとも約０．８μｇ、少なくとも約１μｇ、少なくとも約５μｇ、少なくとも約８μｇ、少なくとも約１０μｇ、少なくとも約５０μｇ、少なくとも約１００μｇ、少なくとも約５００μｇ、または少なくとも約１０００μｇのカプセル化ｍＲＮＡを含有する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、化学合成によりまたはＤＮＡ鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）により作製することができる。ｍＲＮＡを作製し精製するための例示的な方法は実施例１に記載されている。この方法では、ＩＶＴ方法では、ｃＤＮＡ鋳型を使用してｍＲＮＡ転写物を作製し、ＤＮＡ鋳型はＤＮアーゼにより分解される。転写物は、深層濾過およびタンジェント流濾過（ＴＦＦ）により精製される。精製された転写物は、キャップおよびテールを付加することによりさらに修飾され、修飾されたＲＮＡは再び深層濾過およびＴＦＦにより精製される。
次に、ｍＲＮＡは水性バッファー中で製造され、ＬＮＰの脂質成分を含有する両親媒性溶液と混合される。ＬＮＰの４種の脂質成分を溶解するための両親媒性溶液はアルコール溶液でもよい。一部の実施形態では、アルコールはエタノールである。水性バッファーは、例えば、クエン酸、リン酸、酢酸、またはコハク酸バッファーでもよく、約３．０～７．０、例えば、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、または約６．５のｐＨを有していてよい。バッファーは塩（例えば、ナトリウム、カリウム、および／またはカルシウム塩）のような他の成分を含有していてよい。特定の実施形態では、水性バッファーは、１ｍＭのクエン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５を有する。
ｍＲＮＡ－ＬＮＰ組成物を作製するための例示的な非限定的方法は実施例１に記載されている。方法は、制御され均質な仕方で緩衝ｍＲＮＡ溶液をエタノール中の脂質の溶液と混合することを含み、脂質対ｍＲＮＡの比は混合方法の間ずっと維持される。この実例では、ｍＲＮＡは、クエン酸一水和物、クエン酸三ナトリウム二水和物、および塩化ナトリウムを含有する水性バッファー中で提示される。ｍＲＮＡ溶液は溶液（１ｍＭのクエン酸バッファー、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５）に添加される。４種の脂質（例えば、カチオン性脂質、ペグ化脂質、コレステロール系脂質、およびヘルパー脂質）の脂質混合物はエタノール中に溶解される。水性ｍＲＮＡ溶液およびエタノール脂質溶液は、ほぼ「パルスレス」ポンプ系を有する「Ｔ」ミキサー中４：１の容積比で混合される。次に、得られた混合液は下流精製およびバッファー交換を受ける。バッファー交換は、透析カセットまたはＴＦＦシステムを使用して達成してもよい。ＴＦＦは、Ｔ－混合方法による形成直後に得られた初期のＬＮＰを濃縮しバッファー交換するのに使用してもよい。透析濾過方法は連続操作であり、透過流と同じ速度で適切なバッファーを添加することにより容積を一定に保つ。
ＩＶ．ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンのパッケージングおよび使用
ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンは、非経口（例えば、筋肉内、皮内または皮下）投与または鼻咽頭（例えば、鼻腔内）投与用に包装することができる。ワクチン組成物は即時製剤の形態でもよく、ＬＮＰ組成物は凍結乾燥され、使用直前に生理的バッファー（例えば、ＰＢＳ）で再構成される。ワクチン組成物は、水溶液または凍結水溶液の形態で輸送し提供してもよく、再構成せずに（前もって凍結されている場合は解凍後）直接対象に投与することができる。
したがって、本開示は、単一容器でｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンを提供するキットのような製品を提供する、または１つの容器でｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンを、別の容器で再構成用の生理的バッファーを提供する。容器（複数可）は、単回使用投薬量または複数回使用投薬量を含有していてもよい。容器は、前処理されたガラス製バイアルまたはアンプルでもよい。製品は使用説明書を同様に含んでいてもよい。
特定の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンは筋肉内（ＩＭ）注射で使用するために提供される。ワクチンは、対象の、例えば、上腕の三角筋に注射することができる。一部の実施形態では、ワクチンは、プレフィルド注射器またはインジェクタ（例えば、単室型または複室型）で提供される。一部の実施形態では、ワクチンは、吸入に使用するために提供され、プレフィルドポンプ、気管内噴霧スプレー、または吸入器で提供される。
ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンは、それを必要とする対象に、予防的有効量、すなわち、標的病原体に対する十分な免疫防御を十分な時間（例えば、１年、２年、５年、１０年、または生涯）与える量で投与される。十分な免疫防御は、例えば、病原体による感染に関連する症状の予防または軽減でもよい。一部の実施形態では、複数用量（例えば、２回用量）のワクチンは、それを必要とする対象に注射されて、所望の予防効果を達成する。投与（例えば、プライムおよびブースター投与）は、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、１年、２年、５年、または１０年の間隔により隔てられてもよい。
一部の実施形態では、単回用量のｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンは、ｍＲＮＡ １～５０μｇ（例えば、一価または多価）を含有する。例えば、単回用量は、筋肉内（ＩＭ）注射用にｍＲＮＡ約２．５μｇ、約５μｇ、約７．５μｇ、１０約μｇ、約１２．５μｇ、または約１５μｇを含有してよい。さらなる実施形態では、多価単回用量のＬＮＰワクチンは、異なる抗原についてそれぞれ、複数（例えば、２、３、または４）種類のＬＮＰを含有し、それぞれの種類のＬＮＰは、例えば、ｍＲＮＡ量 約２．５μｇ、約５μｇ、約７．５μｇ、１０約μｇ、約１２．５μｇ、または約１５μｇを有する。
別の態様では、本発明は、１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスに対して対象を免疫する方法を提供する。本発明は、対象において１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する方法をさらに提供する。一部の実施形態では、本方法は、対象に本明細書に記載される有効量の組成物を投与することを含む。
種々の実施形態では、本明細書で提供される免疫する方法は、１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルス内の複数のエピトープに対して広い防御免疫応答を誘発する。種々の実施形態では、本明細書で提供される免疫する方法は、１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスに対して広い中和免疫応答を誘発する。一部の実施形態では、免疫応答は抗体応答を含む。したがって、種々の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、異なるタイプのインフルエンザウイルスに対して広い交差防御を与えることができる。一部の実施形態では、組成物は、トリ、ブタ、季節性、および／またはパンデミックインフルエンザウイルスに対して交差防御を与える。一部の実施形態では、組成物は、１つまたはそれ以上のインフルエンザＡ、Ｂ、またはＣサブタイプに対して交差防御を与える。一部の実施形態では、組成物は、インフルエンザＡ Ｈ１サブタイプウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザＡ Ｈ３サブタイプウイルス（例えば、Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＡ Ｈ５サブタイプウイルス（例えば、Ｈ５Ｎ１）、および／またはインフルエンザＢウイルス（例えば、Ｙａｍａｇａｔａ系統、Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統）の複数の株に対して交差防御を与える。
一部の実施形態では、本発明の方法は、１つまたはそれ以上の季節性インフルエンザ株に対して改善された免疫応答を誘発することができる。例示的な季節性株は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４、Ａ／Ｆｏｒｔ Ｍｏｎｍｏｕｔｈ／１／１９４７、Ａ／Ｃｈｉｌｅ／１／１９８３、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／１９９１、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／６／１９８６、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／０３／２００６、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７、細胞伝播プロトタイプウイルスＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１に抗原的に類似するＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルス、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５（Ｈ１Ｎ１）様ウイルス、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／０２／２０１８（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９様ウイルス、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００４（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）様ウイルス、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９様ウイルス、Ａ／Ｃａｍｂｏｄｉａ／ｅ０８２６３６０／２０２０（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ａ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ－Ｍａｏｎａｎ／ＳＷＬ１５３６／２０１９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９様ウイルス様ウイルス、Ａ／Ｈａｗａｉｉ／７０／２０１９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９様ウイルス様ウイルス、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２６７１／２０１９（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４５／２０１９（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ａ／Ｋａｎｓａｓ／１４／２０１７（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９様ウイルス様ウイルス、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）様ウイルス、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）様ウイルス、Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ａｕｓｔｒａｌｉａ／３４／２０１９（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／８０６０／２０１７（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／２０１３（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２５７０／２０１９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９様ウイルス、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２５７０／２０１９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９様ウイルス様ウイルス、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ａ／Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ／１／２００４（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／５８８／２０１９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９様ウイルス、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／５８８／２０１９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９様ウイルス様ウイルス、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ｂ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／１８４／９３様ウイルス、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８様ウイルス、Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７様ウイルス（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７系統）、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６様ウイルス、Ｂ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３３０／２００１様ウイルス、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４様ウイルス、Ｂ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２様ウイルス、Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統）様ウイルス、Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３様ウイルス、Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３様ウイルス（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８系統）、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７様ウイルス、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２様ウイルス、Ｂ／Ｓｉｃｈｕａｎ／３７９／９９様ウイルス、Ｂ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／０２／２０１９（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統）様ウイルス、Ｂ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／０２／２０１９様（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統）ウイルス、およびＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０様ウイルスを限定せずに含む。一部の実施形態では、本発明の方法は、１つまたはそれ以上のパンデミックインフルエンザ株に対して改善された免疫応答を誘発することができる。例示的なパンデミック株は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９、Ａ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／１４５／２００９、Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ／０１／１９１８、およびＡ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ／１９７６を限定せずに含む。パンデミックサブタイプは、特に、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ９およびＨ１０Ｎ７サブタイプを含む。一部の実施形態では、本発明の方法は、１つまたはそれ以上のブタインフルエンザ株に対して改善された免疫応答を誘発することができる。例示的なブタ株は、Ａ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ／１９７６分離株およびＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９を限定せずに含む。一部の実施形態では、本発明の方法は、１つまたはそれ以上のトリインフルエンザ株に対して改善された免疫応答を誘発することができる。例示的なトリ株は、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ９、およびＨ９Ｎ２を限定せずに含む。追加のインフルエンザパンデミック、季節性、トリおよび／またはブタ株は当技術分野では公知である。
一部の実施形態では、本発明は、本発明の組成物をそれを必要とする対象に投与することによってインフルエンザ感染症を予防するまたは処置する方法を提供する。一部の実施形態では、対象はインフルエンザ感染症に罹っているまたは罹りやすい。一部の実施形態では、対象は、インフルエンザ感染に一般に関連している１つまたはそれ以上の症状を示している場合は、インフルエンザ感染症に罹っていると見なされる。一部の実施形態では、対象は、インフルエンザウイルスに曝露されたことがあると分かっているまたは考えられる。一部の実施形態では、対象は、インフルエンザウイルスに曝露されていると分かっているまたは考えられる場合には、インフルエンザ感染しやすいと見なされる。一部の実施形態では、対象が、インフルエンザウイルスに感染していると分かっているもしくは疑われる他の個人と接触している場合および／または対象が、インフルエンザ感染が流行していることが分かっているもしくは考えられる位置にいるもしくはいたことがある場合、対象はインフルエンザウイルスに曝露されていると分かっているもしくは考えられる。
種々の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、インフルエンザ感染の１つまたはそれ以上の症状の発症に先立ってまたはその後で投与してもよい。一部の実施形態では、組成物は予防薬として投与される。そのような実施形態では、本発明の方法は、インフルエンザウイルス感染を予防するまたはそれから対象を防御するのに効果的である。一部の実施形態では、本発明の組成物は、季節性および／もしくはパンデミックインフルエンザワクチンの成分としてまたは持続性（マルチシーズン）の防御を提供するように意図されたインフルエンザワクチン接種レジメンの一部として使用される。一部の実施形態では、本発明の組成物は、インフルエンザ感染の症状を処置するために使用される。
一部の実施形態では、対象は非ヒト哺乳動物である。一部の実施形態では、対象は家畜またはペット（例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、および／またはブタ）である。一部の実施形態では、対象は非ヒト霊長類である。一部の実施形態では、対象はトリ（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウおよび／またはシチメンチョウ）である。
一部の実施形態では、対象はヒトである。ある特定の実施形態では、対象は成人、青年、または乳幼児である。一部の実施形態では、ヒト対象は生後６カ月よりも若い。一部の実施形態では、ヒト対象は、生後６カ月もしくはそれよりも年上、生後６カ月から３５カ月、生後３６カ月から８歳、または９歳もしくはそれよりも年上である。一部の実施形態では、ヒト対象は、６０歳もしくはそれよりも高齢、または６５歳もしくはそれよりも高齢のような年配の５５歳またはそれよりも高齢である。子宮内での組成物の投与および／または処置方法の実行も本明細書により意図されている。
本明細書で別段定義されなければ、本明細書に関連して使用される科学用語および専門用語は、当業者により一般に理解されている意味と同じ意味を有するものとする。例示的な方法および材料が下に記載されているが、本明細書に記載される方法および材料に類似するまたは等価である方法および材料も本発明の実行または試験で使用することが可能である。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。一般に、本明細書に記載される、細胞および組織培養、分子生物学、ウイルス学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、合成有機化学、医薬品および製薬化学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、およびそれらの技法は、当技術分野で周知であり一般に使用されるものである。酵素反応および精製技法は、当技術分野で一般に成し遂げられる通りにまたは本明細書に記載される通りに、製造業者の仕様書に従って実施される。さらに、文脈によって別段要求されなければ、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書および実施形態全体を通じて、単語「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、明言された整数または整数の群を含むことを意味するが、他のいかなる整数または整数の群も排除することを意味しないと理解される。本明細書で言及されるすべての刊行物および他の参考文献は参照によってその全体を組み入れる。いくつかの文書が本明細書で引用されているが、この引用は、これらの文書のいずれかが当技術分野の普遍的かつ一般的な知識の一部を形成することを認めたことにはならない。本明細書で使用される場合、目的の１つまたはそれ以上の値に適用される用語「おおよそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」とは、言明される参照値に類似している値のことである。ある特定の実施形態では、この用語は、別段言明されなければまたは文脈から別段明白でなければ、言明された参照値のいずれかの方向（大きいほうまたは小さいほう）に１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれよりも少ない値内に収まる一定範囲の値のことである。
本発明がもっとよく理解されるように、以下の実施例が示される。これらの実施例は、説明のみを目的とし、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
ＬＮＰ製剤の最適化
本実施例は、ｍＲＮＡワクチン用の一連のＬＮＰ製剤を、種々の成分のコンビナトリアルライブラリーから製造した研究を記載する。合理的に設計された新規のカチオン性脂質を合成した。全部で、１５０を超える脂質および４３０を超える製剤を試験した。ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）ｍＲＮＡをテストｍＲＮＡとして使用した。下に記載される主要製剤では、ｍＲＮＡは、カチオン性脂質と、ヘルパー脂質；コレステロール系脂質；およびペグ化脂質の３種の他の脂質との組合せを、種々の順列の組合せで使用してＬＮＰに製剤化される。
ＬＮＰ製剤は、イオン化可能脂質、ヘルパー脂質ＤＯＰＥ、コレステロール、およびペグ化脂質ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋの４種の脂質成分からなる。ペグ化脂質モル分率は１．５％で一定に保たれ、イオン化可能脂質および異なるヘルパー脂質およびそのモル比は、ｈＥＰＯスクリーニング研究に基づいて最適化比を確認するために評価された。
クエン酸バッファー（１ｍＭのクエン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５）は、ＬＮＰ製剤の製造に使用された。クエン酸バッファーに添加されたｍＲＮＡ溶液は、製剤方法中エタノール溶液中の脂質と混合された。バッファーのｐＨおよび濃度は、ＬＮＰ製剤中への高率でのｍＲＮＡカプセル化を達成するように選択された。
ＬＮＰ製剤方法は、ポンプ方式を使用して「Ｔ」ミキサーにおいて脂質エタノール溶液とｍＲＮＡクエン酸溶液を混合することを含んでいた。次に、得られた溶液は、ＴＦＦ／透析チューブを使用するバッファー交換を受けた。１０％（ｗ／ｖ）トレハロース中の最終製剤の濃度は、投与要求に基づいて調整された。
ｈＥＰＯタンパク質のマウスｉｎ ｖｉｖｏ発現は、ｉｎ ｖｉｖｏでｍＲＮＡを送達するＬＮＰの効力を測定する代替物として使用された。本研究では、成分の種々の組合せ由来のＬＮＰ中において製剤化されたｈＥＰＯ ｍＲＮＡの単回用量（０．１μｇ）はマウスの筋肉内（ＩＭ）に注射された。投与後６時間目および２４時間目に収集された血清は、ＥＬＩＳＡを使用してｈＥＰＯレベルについて検査した。業界ベンチマークであるＭＣ３製剤を、ｈＥＰＯ発現の増加倍率の計算のための参照として使用した（Ａｎｇｅｗ，Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ．（２０１２）５１：８５２９～３３頁）。
それぞれのＬＮＰ製剤について見られるｈＥＰＯ発現のレベルは、細胞中にｍＲＮＡを送達する製剤の能力を示していた。最初の製剤は、２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ；ヘルパー脂質）、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、およびコレステロールを、カチオン性脂質：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００：コレステロール：ＤＯＰＥの４０：１．５：２８．５：３０のモル比で含んでいた。これらの製剤は、ＭＣ３製剤と比べてロバストな効力を有することが見出された。
さらに製剤が試験された。最適化された製剤脂質Ａ ＬＮＰおよび脂質Ｂ ＬＮＰは表１に示されている。これらの製剤中のｍＲＮＡは修飾することができるまたは非修飾でも可能であり、インフルエンザまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のようなウイルス由来の抗原をコードしうる。
Figure 2023550600000010
表１では、ヒトワクチン用の最終投与は、意図された単回ヒト用量に基づいてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の上記最終バルク製品の希釈になると考えられる。ＷＦＩ量は、名目上の最終製剤に基づいて計算される。製剤中のトレハロース含量は、１０％（１００ｍｇ／ｍＬ）トレハロース二水和物に相当し、無水トレハロースとトレハロース二水和物の分子量値の比を使用して無水成分に換算される。
２種の最適化製剤、脂質Ａおよび脂質Ｂ ＬＮＰ製剤中の脂質成分のモル比は表２に示されている（ＣＬ：カチオン性脂質）。
Figure 2023550600000011
表３および図１Ａに示されるように、ＭＣ３と比べた脂質Ａおよび脂質ＢでのｈＥＰＯ発現の増加倍率は、ｍＲＮＡの送達ではＭＣ３よりもこれらのＬＮＰのほうが優れていることを示している。下の表では、「Ｐ２」はＰＥＧ２０００を意味し；「Ｔｉｍｅｓ ＭＣ３」はＭＣ３に対する増加の倍率を意味し；「Ｓｔｄ Ｄｅｖ」は標準偏差を意味する。
Figure 2023550600000012
Figure 2023550600000013
図１Ｂは、ＬＮＰ 脂質Ａおよび脂質Ｂを使用してのマウスおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）でのｈＥＰＯ発現を示す。脂質Ａまたは脂質Ｂを用いて製剤化されたｈＥＰＯ ｍＲＮＡの単回用量（マウスでは０．１μｇ、ＮＨＰでは１０μｇ）を筋肉内に注射した。血清ｈＥＰＯレベルは、ＥＬＩＳＡを使用して投与後６、２４、４８、および７２時間目に定量化した。データは、マウスおよびＮＨＰにおいて４日間を超えてもｉｎ ｖｉｖｏでの長期のｈＥＰＯタンパク質発現を示す。
最適化中に特定された重要なプロセスパラメータの１つは、最初の混合工程中の流量である。異なる最終ＬＮＰサイズ（１０８～１７７ｎｍの幅がある）を有する製剤は、混合中これらの流量を変化させることにより製造し、方法および製品属性に対する追加の制御を可能にする。流量が大きくなるにしたがって、粒子サイズはそれだけ小さくなる。流量が３７５ｍｌ／分に達し、平均ＬＮＰサイズ１０８ｎＭを作製すると、効力が著しく増加した。ＬＮＰの効力に対するサイズの影響は、表４のＭＣ３に対するｈＥＰＯ発現の増加倍率の尺度として注目した。
Figure 2023550600000014
上記スクリーニングデータは、ヘルパー脂質ＤＯＰＥがタンパク質発現を促進するのに効果的であったことを示す。データは、４種の脂質の有望なモル組成の決定（ＯＦ－０２またはｃＫＫ－Ｅ１０：ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋ：コレステロール：ＤＯＰＥ＝４０：１．５：２８．５：３０）ももたらした。１０％トレハロース中のＬＮＰ製剤は、粒子サイズ、ＰＤＩ、ｍＲＮＡカプセル化、およびｍＲＮＡ完全性を含むすべてのパラメータについて特徴付けられた。試験されたバッチすべてが、所望の特徴および凍結／解凍サイクルの安定性を示した。１０％（ｗ／ｖ）トレハロース中、－８０℃での製剤の長期安定性を評価した。脂質Ａおよび脂質Ｂ製剤は高度に安定していることが明らかにされた。
インフルエンザＨＩＮ１ ＬＮＰワクチン製剤
新規のインフルエンザウイルスがヒト集団中に現れるとインフルエンザパンデミックが起こることがある。そのようなパンデミックは公衆衛生にとって依然として大きな脅威であり、油断のない注意およびウイルスのヒトからヒトへの長引く感染の場合に使用される防御手段を備えた準備が必要である。本実施例に記載される実験では、２００９年のインフルエンザパンデミックの原因であった、高度に病原性のＨＩＮ１株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（ＣＡ０９）由来のヘマグルチニン（ＨＡ）をプロトタイプの抗原として使用して、脂質Ａおよび脂質ＢのＬＮＰ製剤で製造したｍＲＮＡワクチンの効力を評価した。
ＨＡ ｍＲＮＡは上記の通りに製造された。クエン酸バッファー（クエン酸１ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ｐＨ４．５）をＬＮＰ組成物の製造に使用した。ｍＲＮＡを含有するクエン酸バッファーは、製剤過程中エタノール溶液中脂質と混合された。バッファーのｐＨおよび濃度は、ＬＮＰ製剤中のｍＲＮＡの高いカプセル化率を達成するように選択した。２種の溶液（クエン酸バッファー中のｍＲＮＡおよびエタノール溶液中の脂質）はポンプシステムを使用して「Ｔ」ミキサーにおいて混合して、均質なパルスレスフローを得て、脂質とｍＲＮＡは方法全体を通じて一定比率で混合した。これは、所望のサイズおよび、より均質なサイズ分布の指標である低ＰＤＩを有する均質な製剤を達成するのに極めて重要であった。この方法は高いｍＲＮＡカプセル化をもたらし、この高いカプセル化は高い効力を達成するためには極めて重要である。次に、こうして得られた溶液は、ＴＦＦ／透析チューブを使用するバッファー交換を受けた。
マウス研究では、脂質Ａおよび脂質Ｂ ＣＡ０９ ＨＡ製剤の効能は、ＭＣ３ ＬＮＰ製剤ならびに組換えＨＡ（ｒＨＡ）の突き合わせ比較で評価した。異なるカチオン性脂質を用いて製剤化されたＣＡ０９（Ｈ１）ＨＡ ｍＲＮＡ（０．４μｇ）を、０日目（Ｄ０）および２８日目（Ｄ２８）にＢａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）の筋肉内に注射した。ワクチンの免疫原性は、ＨＡ阻害（ＨＡＩ）力価により示されるが、図２Ａに示されている。データは、０日目（Ｄ０）および２８日目（Ｄ２８）の脂質Ａまたは脂質Ｂの２種の免疫化が高いＨＡＩ力価を誘発し、相同なウイルスチャレンジ（Ｂｅｌｇｉｕｍ０９ Ｈ１Ｎ１ウイルス）からの動物の完全な防御を可能にしたことを示す（図２Ｂ）。１４日間のチャレンジ後観察の間、病的状態の明白な徴候（体重減少）は脂質Ａおよび脂質Ｂ処置群内では観察されず、組換えタンパク質対照群内の少数の動物が病的状態を示した（図２Ｂ）。
同様に、Ｍｉｃｈ１５インフルエンザ株（Ｍｉｃｈ１５ Ｎ１）由来のノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードするｍＲＮＡは、脂質Ａを用いて製剤化し、その効能を評価した。脂質Ａを用いて製剤化したＮＡ ｍＲＮＡの２つの用量（０．４または０．０１６μｇ）をＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝８）の筋肉内に注射した。対照群（ｎ＝８）には、ｈＥＰＯ ｍＲＮＡ ０．６μｇまたは希釈液を注射した。マウスの半数が研究０日目に１回の注射（１用量）のみを受け、その他の半数は研究０日目および２８日目に与えた２回の注射（２用量）を受けた。データは、ＮＡ阻害（ＮＡＩ）力価により示されるように、このＮ１脂質Ａ製剤がロバストな免疫応答を誘発したことを示す（図３Ａ）。データは、１用量または２用量のワクチンで処置されたマウスは、Ｂｅｌｇｉｕｍ０９ Ｈ１Ｎ１による致死性のウイルスチャレンジから防御されたことをさらに示す（図３Ｂ）。防御のレベルは、ワクチン処置群対負の対照群（ｈＥＰＯおよび希釈液）のＮＡＩ力価と相関していた。
本ＬＮＰを用いて製剤化されたＣＡ０９ Ｈ１ ｍＲＮＡもＮＨＰモデルで試験された。ｍＲＮＡ（１０μｇ）は、脂質Ａおよび脂質Ｂを用いて製剤化され、研究０日目および２８日目にカニクイマカクザル（ｎ＝６）の筋肉内に注射された。すべてのＬＮＰについて１４日までの検出可能なＨＡＩプライミングおよび２８日までのＨＡＩ力価の有意なブーストが観察された（図４、右パネル）。ＥＬＩＳＡデータも、試験されたすべての用量について１４日目までにベースラインより上の有意なプライミングを示し、ロバストなブーストがブーストの２週間後に検出された（図４、左パネル）。結果により、ＨＡＩおよびエンドポイントＥＬＩＳＡ力価により示されるように、本Ｈ１ ｍＲＮＡ製剤がロバストな免疫応答を生じたことが示される。
インフルエンザＨ３Ｎ２ ＬＮＰワクチン製剤
本実施例は、インフルエンザ株Ｓｉｎｇ１６（Ｈ３Ｎ２）に対するｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチン製剤が効能について評価される実験を説明している。これらの実験で使用されるｍＲＮＡの１つはＭＲＴ１４００である。ＭＲＴ１４００は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により製造される生合成コドン最適化ＨＡ－Ｈ３（インフルエンザウイルスヘマグルチニン、Ｈ３サブタイプ）メッセンジャーＲＮＡ（ＣＯ－ＨＡ－Ｈ３ ｍＲＮＡ）である。
インフルエンザウイルスヘマグルチニン、Ｈ３サブタイプのタンパク質配列は下に示されている。
ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩ ＬＣＬＶＦＡＱＫＩＰ ＧＮＤＮＳＴＡＴＬＣ ＬＧＨＨＡＶＰＮＧＴ ＩＶＫＴＩＴＮＤＲＩ ＥＶＴＮＡＴＥＬＶＱ ＮＳＳＩＧＥＩＣＤＳ ＰＨＱＩＬＤＧＥＮＣ ＴＬＩＤＡＬＬＧＤＰ ＱＣＤＧＦＱＮＫＫＷ ＤＬＦＶＥＲＳＫＡＹ ＳＮＣＹＰＹＤＶＰＤ ＹＡＳＬＲＳＬＶＡＳ ＳＧＴＬＥＦＫＮＥＳ ＦＮＷＴＧＶＴＱＮＧ ＴＳＳＡＣＩＲＧＳＳ ＳＳＦＦＳＲＬＮＷＬ ＴＨＬＮＹＴＹＰＡＬ ＮＶＴＭＰＮＫＥＱＦ ＤＫＬＹＩＷＧＶＨＨ ＰＧＴＤＫＤＱＩＦＬ ＹＡＱＳＳＧＲＩＴＶ ＳＴＫＲＳＱＱＡＶＩ ＰＮＩＧＳＲＰＲＩＲ ＤＩＰＳＲＩＳＩＹＷ ＴＩＶＫＰＧＤＩＬＬ ＩＮＳＴＧＮＬＩＡＰ ＲＧＹＦＫＩＲＳＧＫ ＳＳＩＭＲＳＤＡＰＩ ＧＫＣＫＳＥＣＩＴＰ ＮＧＳＩＰＮＤＫＰＦ ＱＮＶＮＲＩＴＹＧＡ ＣＰＲＹＶＫＨＳＴＬ ＫＬＡＴＧＭＲＮＶＰ ＥＫＱＴＲＧＩＦＧＡ ＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥ ＧＭＶＤＧＷＹＧＦＲ ＨＱＮＳＥＧＲＧＱＡ ＡＤＬＫＳＴＱＡＡＩ ＤＱＩＮＧＫＬＮＲＬ ＩＧＫＴＮＥＫＦＨＱ ＩＥＫＥＦＳＥＶＥＧ ＲＶＱＤＬＥＫＹＶＥ ＤＴＫＩＤＬＷＳＹＮ ＡＥＬＬＶＡＬＥＮＱ ＨＴＩＤＬＴＤＳＥＭ ＮＫＬＦＥＫＴＫＫＱ ＬＲＥＮＡＥＤＭＧＮ ＧＣＦＫＩＹＨＫＣＤ ＮＡＣＩＥＳＩＲＮＥ ＴＹＤＨＮＶＹＲＤＥ ＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧ ＶＥＬＫＳＧＹＫＤＷ ＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣ ＦＬＬＣＶＡＬＬＧＦ ＩＭＷＡＣＱＫＧＮＩ ＲＣＮＩＣＩ＊（配列番号１）
このタンパク質のコード配列はコドン最適化されていた。タンパク質をコードするコドン最適化配列は図５Ａ（配列番号２）に示されており、野生型配列は配列番号３として示されている。ｍＲＮＡ構造および配列は、それぞれ図５Ｂおよび５Ｃに示されている。図に示されるように、ＨＡ－Ｈ３ ｍＲＮＡコード配列は、それぞれ１４０および１００ヌクレオチドの５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）が隣接している。生合成ＨＡ－Ｈ３ ｍＲＮＡは、反転５’－５’三リン酸架橋を介して５’ＵＴＲの第１のヌクレオシドに連結されている７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）残基からなる５’キャップ構造も含有し、この第１のヌクレオシドはそれ自体が２’－Ｏ－リボースメチル化により修飾されている。５’キャップは、リボソームによる翻訳の開始に不可欠である。全直鎖状構造は、３’末端でおおよそ１００～５００アデノシンヌクレオシドのトラクト（ポリＡ）により終結する。ポリＡ領域はｍＲＮＡに安定性を与え、翻訳を増強するとも考えられている。これらの構造エレメントのすべてが、ＨＡ－Ｈ３ ｍＲＮＡの効率的な翻訳を促進するのに使用される天然に存在する成分である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によりコドン最適化ｍＲＮＡ配列を産生するためのＤＮＡプラスミドを構築した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応は、ＲＮＡポリメラーゼを使用して実行した。反応混合物を沈殿させた。沈殿ＲＮＡ試料を個々の深層濾過カセット上に負荷し、８０％エタノールで洗浄し、再循環水で再溶解させた。第２のアリコートの水を第１の工程に類似する方法で送り出した。この工程はもう１度繰り返された。プールされた溶出液は、５０ｋＤ中空ファイバーＴＦＦカセットを使用して限外濾過／ダイアフィルトレーションを受けた。次に、それぞれのＩＶＴ ＴＦＦプールはキャップおよびテール反応に備えて希釈された。キャップ－テール反応は沈殿させ、反応由来のＲＮＡは、上記の通りに精製し収集した。濾過されたｍＲＮＡは使用まで－２０℃で貯蔵した。
これらの実験では、Ｓｉｎｇ１６ ＮＡ（Ｎ２）またはＳｉｎｇ１６ ＨＡ（Ｈ３；ＭＲＴ１４００ ｍＲＮＡ）抗原をコードするｍＲＮＡは、脂質Ａまたは脂質Ｂを用いて製剤化され、０日目および２８日目に用量当たりｍＲＮＡ ０．４μｇでＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝８）の筋肉内に注射した。比較のため、組換えＳｉｎｇ１６ Ｈ３またはＳｉｎｇ１６ Ｎ２タンパク質１μｇを水中油型乳剤アジュバント（ＡＦ０３）と一緒にＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝８）中に筋肉内経路により注射した。免疫応答はＮＡＩおよびＨＡＩアッセイにより測定した。
データは、ＮＡ（Ｎ２）ｍＲＮＡで免疫された動物が１４日目までに検出可能なＮＡＩプライミングを、２８日目までにＮＡＩ力価の有意なブーストを実証したことを示す（図６、右パネル）。データは、ＨＡ Ｓｉｎｇ１６脂質Ａおよび脂質Ｂ製剤が２８日目のブースト後にロバストなＨＡＩ応答を誘発したことも示す（図６、左パネル）。
同様に、Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡ脂質Ａおよび脂質Ｂワクチンは、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）のカニクイマカクザル（ｎ＝６）において評価された。脂質Ａまたは脂質Ｂを用いて製剤化されたＨＡ Ｓｉｎｇ１６ ｍＲＮＡ（５０μｇ）は、筋肉内経路によりサルに注射された。第１の注射は研究日０に与えられ、第２の注射は研究日２８に与えられた。データは、ワクチンが２８日目にブーストされたロバストな免疫機能的応答を誘発したことを示す（図７Ａ）。
さらに、脂質Ａを用いて製剤化されたＨＡ Ｓｉｎｇ１６ ｍＲＮＡ（すなわち、ＭＲＴ５４００ワクチン）の４つの用量レベル、１５、４５、１３５および２５０μｇをＮＨＰで評価した。第１の免疫化は研究日０に、第２の免疫化は研究日２８に与えられた。すべてのＮＨＰは、試験したすべての用量についてＩｇＧ結合およびＨＡＩ力価を示し、４２日目の第２の注射後２週間目に試験した種々の用量の間で免疫応答に差はなかった（図７Ｂおよび７Ｃ）。
Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡ脂質Ａワクチンは、第２のワクチン接種後ＮＨＰにおいてＴ細胞応答についても評価した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は４２日目に収集し、Ｓｉｎｇ１６ Ｈ３組換えタンパク質または全ＨＡオープンリーディングフレームを表すペプチドプールと一緒に一晩インキュベートした。再刺激により誘導されたサイトカインはＥＬＩＳＰＯＴアッセイで評価した。ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１サイトカイン（図８Ａ）、またはＩＬ－１３、Ｔｈ２サイトカイン（図８Ｂ）を分泌するＰＢＭＣの出現頻度は、ＰＢＭＣ１００万個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として計算した。試験した３つの用量レベル群（２５０μｇ、１３５μｇ、および４５μｇ）の動物の大部分が、高出現頻度のＩＦＮ－γ分泌細胞の存在を示し、ＰＢＭＣ１００万個当たり１００ＳＦＣを超えていた（図８Ａ）。低い用量レベル群と高い用量レベル群の動物はＩＦＮ－γ分泌細胞の匹敵する出現頻度を示したので、用量応答は観察されなかった。これとは対照的に、ＩＬ－１３サイトカイン分泌細胞の存在は、試験した群のいずれにおいても、いずれの用量レベルでも検出されなかった（図８Ｂ）。これらのデータは、ＮＨＰにおいてワクチン接種に続くＨＡ抗原に対するＴｈ１偏向細胞応答およびＴｈ２応答の欠如という明白な証拠を提示した。
修飾されたｍＲＮＡを有するインフルエンザＬＮＰワクチン製剤
本実施例は、非修飾（非修飾非複製または「ＵＮＲ」）と修飾（修飾非複製または「ＭＮＲ」）ｍＲＮＡを含有するワクチンの効力を比較する実験を説明している。ＵＮＲ ＣＡ０９ ＨＡ ｍＲＮＡおよびＭＮＲ ＣＡ０９ ＨＡ ｍＲＮＡを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により製造した。ＭＮＲでは、すべてのウリジンがプソイドウリジンで置き換えられた。
脂質Ａを用いて製剤化したＣＡ０９ ＨＡ ｍＲＮＡ（修飾されたまたは非修飾の）の５つの異なる用量（０．０１６、０．０８、０．４、２、および１０μｇ）を筋肉内経路によりＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝１５）中に注射した。データは、ＬＮＰ製剤が裸のｍＲＮＡ（ＵＮＲ）の安定性および送達効率を増加したことを示す。これは、ＨＡＩ力価により示した場合、ＵＮＲおよびＭＮＲ ｍＲＮＡの間の効力は匹敵していたからであった（図９Ａ）。Ｂａｌｂ／ｃマウスについてのＥＬＩＳＡデータは、試験したすべての用量について１４日目までに基準線よりも有意なプライミングも示しており（ＵＮＲとＭＮＲ ｍＲＮＡの両方）、ブーストの２週間後にロバストなブーストが検出された。データは、ＵＮＲとＭＮＲ ｍＲＮＡがＥＬＩＳＡ力価を誘発するのに匹敵していたことも示す（図９Ｂ）。
結論として、本用量滴定研究は、脂質Ａを用いて製剤化された非修飾および修飾されたＣＡ０９ ＨＡ ｍＲＮＡが、ＨＡＩによりまたはエンドポイントＥＬＩＳＡアッセイにより示される通り、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて統計的に区別がつかない免疫応答を誘発したことを実証した。４つのもっと高い用量のＵＮＲおよびＭＮＲ ｍＲＮＡで免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスは、すべての用量について、１４日目までに検出可能なＨＡＩプライミングを、４２日目までにＨＡＩ力価の有意なブーストを示す。これらの１４日目プライミング力価は、１２５倍の範囲を超える検出可能な力価を生み出す用量効果と用量節約可能性の両方を表す。同じ用量範囲での第２の注射力価により、このｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤に対する免疫応答のロバストさが確認される。類似の結果が非ヒト霊長類でも観察された。
多価インフルエンザワクチンＬＮＰ製剤
本実施例は、ＣＡ０９ ＨＡをコードするｍＲＮＡ（実施例２に記載される）およびＳｉｎｇ１６ ＨＡをコードするｍＲＮＡ（実施例３に記載される）を含有する脂質ＡベースのＬＮＰワクチンを使用する研究を説明する。
より具体的には、脂質Ａに共カプセル化されたＣＡ０９ ＨＡ ｍＲＮＡおよびＳｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡをＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝８）において評価した。ｍＲＮＡ－ＬＮＰは共カプセル化された２つのｍＲＮＡとして投与したまたは単一にカプセル化されたｍＲＮＡとして別々に投与した。両方のアプローチでは、全部でＬＮＰ製剤０．４μｇを筋肉内注射によりマウスに注射した。第１の注射は研究日０に与えられ、第２の注射は研究日２８に与えられた。データは、ワクチンがロバストな免疫機能的応答を誘発したことを示す。２つの投与アプローチ間にはいかなる差もないように思われた。これらのデータは、共カプセル化が２つのｍＲＮＡ間に妨害も干渉も引き起こさなかったことを示す。
多価インフルエンザワクチンＬＮＰ製剤に関するさらなる研究
ＣＡ０９ ＨＡ、Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ、Ｓｉｎｇ１６ ＮＡ、Ｍｉｃｈ１５ ＮＡ、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９インフルエンザウイルス（Ｐｅｒｔｈ０９ ＮＡ）ならびにホタルルシフェラーゼ（ＦＦ）およびｈＥＰＯのレポーター抗原をコードする非修飾ｍＲＮＡのパネルを準備した。次に、ＨＡおよびＮＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ調合剤用のＬＮＰ製剤を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現、動物における免疫応答について、および臨床前モデルでの効力について試験した。本実施例での研究では、ＬＮＰ製剤はすべて脂質Ａ製剤であった。
材料および方法
ｍＲＮＡ－ＬＮＰ調合剤
ｈＥＰＯ、ＦＦ、ＣＡ０９ ＨＡ、Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ、Ｍｉｃｈ１５ ＮＡ、およびＳｉｎｇ１６ ＮＡをコードするｍＲＮＡ転写物は、非修飾ヌクレオチドを使用して所望の遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ鋳型と一緒にＲＮＡポリメラーゼを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により合成した。こうして得られた精製ｍＲＮＡ前駆体を、５’キャップ構造（キャップ１）ならびにゲル電気泳動により決定し精製したおおよそ２００ヌクレオチド長の３’ポリ（Ａ）テールの酵素的付加によりさらに反応させた。すべてのｍＲＮＡ調合剤は、－２０℃での貯蔵前に、純度、完全性、およびキャップ１のパーセンテージについて分析した。ｍＲＮＡ／脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の製造は上に記載された。手短に言えば、固定された脂質とｍＲＮＡ比の脂質の混合物（イオン化可能脂質、ホスファチジルエタノールアミン、コレステロールおよびポリエチレングリコール－脂質）のエタノール溶液を、制御条件下、酸性ｐＨで標的ｍＲＮＡの水性緩衝溶液と組み合わせて、均一なＬＮＰの懸濁液を得た。適切な希釈剤系に限界濾過しダイアフィルトレーションして、得られたナノ粒子懸濁液を最終濃度まで希釈し、濾過し、使用まで－８０℃で凍結保存した。ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤は、動的光散乱、パーセンテージカプセル化によりサイズについて特徴付け、適切なバッファーを用いた希釈によりさらなる使用まで１ｍｇ／ｍＬ、－８０℃で保存した。ｈＥＰＯ－ＬＮＰおよびＦＦ－ＬＮＰを利用して、ｉｎ ｖｉｖｏでの標的タンパク質の発現のレベルを調べた。
ＨｅＬａ細胞で発現されるＳ－タンパク質の可視化
インフルエンザＮＡおよびＨＡタンパク質の免疫細胞化学－免疫蛍光分析を、以前記載された方法（Ｋａｌｎｉｎら、ｎｐｊ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０２１）６：６１頁）を使用して二価Ｈ３Ｎ２（Ｓｉｎｇ１６ ＨＡおよびＰｅｒｔｈ０９ ＮＡ）ｍＲＮＡ ＬＮＰ）をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞において実施した。細胞は４％パラホルムアルデヒドに固定し、ＨＡ（ＧｅｎｅＴｅｘ ＧＴＸ４０２５８）、ＮＡ、およびＥＲマーカーＣａｌｎｅｘｉｎ（Ａｂｃａｍ ａｂ２２５９５）についての対象となる抗体染色を実施した。画像は共焦点顕微鏡上で撮り、続いてＥＲへのＨＡおよびＮＡ共局在の定量化、平均シグナル強度、および細胞面積のパーセントについて画像解析した。
フローサイトメトリー
ヒト骨格筋細胞（ＨｓｋＭＣｓ、Ｌｏｎｚａ）を、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ストレプトマイシン、ペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）、および２０％熱失活ＦＢＳ（ＶＷＲ）を補充したＭ１９９（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において３７℃、５％ＣＯ２で培養した。細胞はトリプシン処理により収穫し、ＰＢＳで洗浄し、製造業者の電気穿孔プログラムＤ－０３３に従って、１０６細胞当たりｍＲＮＡ １２ｍｇを用いてＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ２ｂ（Ｌｏｎｚａ）上でヒト一次筋肉細胞トランスフェクションキットを使用して電気穿孔した。２４時間後収穫細胞を固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ（商標）／Ｐｅｒｍ（ＢＤ）で透過処理し、ＣＡ０９ ＨＡ（Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈ）、Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ（３０－２Ｆ１１－Ｆ７－Ａ５、ＧｅｎｅＴｅｘ）、Ｍｉｃｈ１５ ＮＡ（６Ｇ６、Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈ）およびＳｉｎｇ１６ ＮＡ（４００１７－ＲＰ０１、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）特異的Ａｂで、続いてＰＥコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ二次Ａｂ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＦ６４７コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。次に、抗体標識細胞をＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）により獲得し、それぞれのタンパク質の発現はＦｌｏｗＪｏ（商標）（ＴｒｅｅＳｔａｒ）により分析した。
低温透過型電子顕微鏡
ＰＥＬＣＯ ｅａｓｉＧｌｏｗ（商標）装置を使用して、ＬＮＰ試料適用に先立ってグリッドをプラズマ洗浄し、チャンバーが１００％湿度および１８℃に保たれたＶｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をプランジ凍結用に使用した。ＬＮＰ試料３．０μｌ液滴を、カーボンフィルムおよび金のバー付の３００メッシュＲ２／１ ＱＵＡＮＴＩＦＯＩＬ（登録商標）グリッド上に分注した。グリッドは４秒間ブロットし、現位置に１０秒間保ち、次に貯蔵のために液体エタンに直ちにプランジ凍結し、Ｋｒｉｏｓ顕微鏡に移した。露光は、ＢｉｏＱｕａｎｔｕｍエネルギーフィルターおよび計数モードで作動するＫ３直接電子検出器（Ｇａｔａｎ）を備えたＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ透過型電子顕微鏡（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して収集した。検出器での較正された物理的画素サイズは１．３８Åであり、６４，０００倍率に対応していた。合計３，１４１個の６９フレームムービー露光は、デフォーカスが－０．５～－１．７μｍで、フレーム当たりの用量１．０４５ ｅ／Å２で収集された。それぞれのムービー露光について、パッチベースの動き補正、超解像度画素のビニング、およびフレーム重み付けを、ＲＥＬＩＯＮ－３．１．３４を使用して実施した。補正された画像から、７００を超える候補粒子座標が抽出された。それに続くデータ解析は、画像加工ツールボックス付きのＭＡＴＬＡＢ Ｒ２０１９ａを用いて行った。
発現研究のためのマウスおよびＮＨＰの免疫化
４頭のカニクイマカク（ＮＨＰ）（オスとメス）および４～８匹のオスＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、用量１０μｇ（ＮＨＰ）または１、０．５、０．１および０．０５μｇ（マウス）のいずれかで、ＨＡ／ＮＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤用に使用されることが意図されていた比と同じ比で製造されたｈＥＰＯ－ＬＮＰと一緒に筋肉内に投与した。血液試料は、投与前、ならびに投与後６時間、２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間目に採取して、ＲおよびＤシステムを使用するＥＬＩＳＡ、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＩＶＤ（登録商標）ＥＬＩＳＡ、ヒトエリスロポエチン免疫アッセイキットによって製造業者のプロトコル通りに血清ｈＥＰＯ発現についてモニターし、ｍＩＵ／ｍｌおよびｎｇ／ｍｌの最終値として報告した。手短に言えば、ＥＰＯに特異的なマウスモノクローナル抗体でプレコートしたマイクロプレートウェルを、標本または標準と一緒にインキュベートした。過剰な標本または標準を取り除いた後、ウェルは、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたウサギ抗ＥＰＯポリクローナル抗体とインキュベートした。第２のインキュベーション中、抗体酵素コンジュゲートは固定されたＥＰＯに結合した。過剰なコンジュゲートは洗浄により取り除いた。色素源をウェルに添加し、色素源は酵素反応により酸化されて、青色複合体を形成した。反応は酸を添加することにより停止させ、これにより青色は黄色に変わった。生み出された色の量は、ＥＰＯ抗体複合体に結合したコンジュゲートの量に正比例しており、ＥＰＯ抗体複合体は今度は標本または標準中のＥＰＯの量に正比例していた。この複合体の吸光度を測定し、吸光度対ＥＰＯ標準の濃度をプロットすることにより標準曲線を作成した。未知の標本のＥＰＯ濃度は、標本の光学密度を標準曲線と比較することにより決定した。このアッセイで使用した標準は、第二の国際参照品（６７／３４３）に対して較正された組換えｈＥＰＯ、尿由来型のヒトエリスロポエチンであった。
免疫原性研究のためのマウスおよびＮＨＰの免疫化
処置群に従ってＢａｌｂ／ｃマウス（ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））の群を、四頭筋においてＩＭ経路により、０日目は１つの後肢に、２８日目には反対側の肢に、イソフルラン麻酔下、用量０．０５ｍＬの指名されたワクチン製剤または希釈液で免疫した。その最初の体重の２０％を超えて失い、重大な臨床徴候を示したマウスは、動物の健康の獣医評価後、研究終了に先立って安楽死させた。
ナイーブオスおよびメスモーリシャス島起源のカニクイマカク（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を研究のために選択した。研究開始時、動物の体重は＞２ｋｇ、年齢は＞２歳であった。研究用に選択された動物は、研究への割り当てに先立って広範囲な身体検査を受けた。健康状態の割り当て前評価は、実地獣医検査およびＮＩＲＣ ＳＯＰにより適用できるＣＢＣ分析用の血液試料収集を含んだ。動物は一般にペアで収容され、研究開始に先立って少なくとも３日間順応させた。群は、処置群につき最大６動物からなっていた。すべての動物は、ケタミンＨＣｌ（１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）またはテラゾール（４～８ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）鎮静作用下で、研究日０に、三角筋を標的にして、それぞれの動物の一本の前肢に、ＩＭ経路によりそのそれぞれのワクチン製剤または希釈液の用量０．５ｍｌで免疫した。第１の免疫化が行われた２８日後、第２の免疫化が動物の反対側の肢に与えられた。
チャレンジ研究のためのマウスおよびＮＨＰの免疫化
マウスは、最後の免疫化のおおよそ９～１２週間後にチャレンジ株を接種された。ストックウイルスのバイアルを解凍し、氷冷無菌ＰＢＳに適切な濃度まで希釈した。すべてのマウスは、４ＬＤ５０に等しいＰＢＳ中１０５．５４ ＴＣＩＤ５０のＢｅｌｇｉｕｍ０９ウイルスを含有する全容積５０μｌでチャレンジした。ウイルスチャレンジは、拡張されたＡＢＳＬ２実験室において安全キャビネット内部で実施した。マウスは、ケタミン／キシラジン溶液（ケタミン５０ｍｇ／ｋｇおよびキシラジン５ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注射でまず麻酔をかけられ、次にマイクロピペットを使用してインフルエンザウイルスの全容積５０μｌでＩＮ（両鼻孔中に液滴；鼻腔当たり２５μｌ）にチャレンジした。チャレンジ手順に続いて、マウスを背臥位で寝かせき、麻酔から回復するまで観察した。毎日の体重はＨ１Ｎ１チャレンジに続いて量った。＞２０％の体重減少が１回でも観察されたいかなる個々の動物でも安楽死させた。体重測定は、安楽死までチャレンジ後毎日、オンラインデータベース、Ｐｒｉｓｔｉｍａ（登録商標）（Ｖｅｒｓｉｏｎ ７．５．０ Ｂｕｉｌｄ ８）に記録される、または研究特定作業用シートに記帳された。
血液収集
マウスでは、血液は、鎮静作用下でのすべての動物からの、顎下または眼窩静脈叢出血（生前出血、研究前ならびに研究日１４、２８、および４２おおよそ２００μｌ）および心臓穿刺（末端出血、５６日目）により収集した。マウスは研究前に出血させて基準線の免疫前血清試料をプレスクリーニング目的で得た。血清の加工、血液試料はＳＳＴチューブに収集し、室温で３０分間～１時間凝固させておいた。次に、試料は、ブレーキオフで５～１０分間、１０００～１３００ｇで遠心分離した。血清は、Ｐ２００ピペッタを使用して収集し、２個の０．５ｍｌクライオバイアルに分割し、－２０℃で貯蔵した。すべての出血は、検体採取および処理ログに記述し、試料収集の時刻および手順を実施する担当技術者を示した。血清試料の一部は、抗体価についてＨＡＩまたはＥＬＬＡおよびＥＬＩＳＡアッセイにおいて評価した。
ＮＨＰは、ケタミン１０ｍｇ／ｋｇ／アセプロマジン１ｍｇ／ｋｇを使用して筋肉内に投与される麻酔下で、血清分離のために出血させた（日目－４、２、７、１４、２８、３０、３５、４２、５６、９０、および１８０）。採血量は、体重のパーセンテージおよび動物の健康状態に関して確立した指針を超えなかった。血液は、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ２１ ｇａ×１”血液収集針またはＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＳＳＴ（商標）ゲルチューブに取り付けられたＡｂｂｏｔｔ Ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ ２３ ｇａ×３／４”チュービングを使用する大腿静脈穿刺を使用して麻酔したＮＨＰから採取した。血清は、室温で１２００×ｇの速度で１０分間チューブを回転させることにより分離した。次に、血清は標識されたクリオバイアル（１ｍｌ／バイアル）に等分し、≦－２０℃で貯蔵した。血清試料の一部は、抗体力価についてＨＡＩまたはＥＬＬＡおよびＥＬＩＳＡアッセイにおいて評価した。ＰＢＭＣでは、ＮＨＰはワクチン接種前におよび第１の注射のおおよそ４２～６３日後に再び前出血させた。この目的のため、血液は、ヘパリン抗凝血剤を含有するＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）チューブ中に収集した。手短に言えば、抗血液凝固性血液試料をＰＢＳに希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）分離液（Ｓｉｇｍａ）を使用して４００×ｇで３０分間、勾配密度遠心分離にかけた。次に、単核細胞を含有する不透明なインターフェイスを収集し、低速度（２５０×ｇ）遠心分離を使用してＰＢＳで３回洗浄し、最後の遠心分離で血小板の数を減らした。生対死ＰＢＭＣは、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２を使用して数え上げた。ＰＢＭＣは、Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（登録商標）凍結ボックスを使用して１０％ＤＭＳＯを有するＦＢＳに凍結保存した。ボックスは直ちに－８０℃冷凍機に２４時間置き、次に、貯蔵のために液体窒素タンクに移した。
ＥＬＩＳＡ
抗体ＥＬＩＳＡは、組換え的に産生されたＳｉｎｇ１６ ＮＡタンパク質、Ｓｉｎｇ１６ ＨＡタンパク質、またはＣＡ０９ ＨＡタンパク質を使用して実施した。タンパク質は、炭酸－重炭酸塩バッファー中、濃度２μｇ／ｍｌで、９６ウェル高結合ポリスチレンプレート上で捕捉した。プレートを回収し、２～８℃で一晩（１６±４時間）インキュベートした。一晩インキュベーション後、抗原被覆プレートは洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、室温で６０±３０分間ブロッキング溶液（ＰＢＳ中１０％ＢＳＡ）でブロックした。試験試料、ナイーブ対照、および参照試料は、試料希釈液（ＰＢＳ１０％ ＢＳＡ０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０）に希釈し、ウェルに２通り添加し、続いて室温で９０分間インキュベートした。プレートは洗浄バッファーで５回洗浄し、マウス血清にはヤギ抗マウスＨＲＰをＮＨＰ血清にはヤギ抗サルＨＲＰを希釈度１：１０，０００で添加した。次に、プレートは、室温で３０分間インキュベートし、過剰なＨＲＰ－ＩｇＧは洗浄バッファーで洗浄した。Ｓｕｒｅ－Ｂｌｕｅ ＴＭＢ基質をそれぞれのプレートに添加し、反応は約１０分後ＴＭＢ停止液で停止させた。次に、プレートは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ（商標）分光光度計を用いて４５０ｎｍで読み取った。抗抗原（ＨＡまたはＮＡ）特異的抗体価は、＞０．３の吸光値を有する最も高い血清希釈度の逆数として表された。
ＨＡＩアッセイ
ＨＡＩアッセイは、Ｓｉｎｇ１６ Ｈ３Ｎ２およびＣＡ０９ Ｈ１Ｎ１ウイルスストック（ＢＩＯＱＵＡＬ、Ｉｎｃ．）を使用して実施した。血清は、１部の血清を３部の酵素で希釈することによりレセプター破壊酵素（ＲＤＥ）で処理し、３７℃水浴中一晩インキュベートした。酵素は、５６℃での３０分間インキュベーション期間により不活化し、続いて６部のＰＢＳを添加して最終希釈度１／１０とした。ＨＡＩアッセイは、４赤血球凝集単位（ＨＡＵ）のウイルスおよび０．５％シチメンチョウＲＢＣを使用してＶ字型底９６ウェルプレートにおいて実施した。それぞれの株についての参照血清はすべてのアッセイプレート上で陽性対照として含まれた。それぞれのプレートは、抗原用量（４ＨＡＵ／２５μｌ）を確かめるための逆滴定ならびに陰性対照試料（ＰＢＳまたはナイーブ対照血清）も含んだ。ＨＡＩ力価は赤血球凝集の完全な阻害をもたらす血清の最も高い希釈度として決定した。結果は、適切な逆滴定結果（４ＨＡＵ／２５μｌ添加を立証する）および予想される力価の２倍以内の参照血清力価を有するプレートについてのみ有効であった。
ＮＡＩアッセイ
酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）のための方法を使用してノイラミニダーゼ阻害（ＮＡＩ）抗体価を決定した。抗原の供給源（ウイルスＮＡ）を滴定し、標準量を血清の段階希釈とのインキュベーションのために選択した。血清の滴定は、血清（５６℃で１時間熱失活した）の段階希釈を用いて実施し、標準量のウイルスをフェチュイン被覆プレートのウェルに２通り添加した。次に、この混合物は一晩（１６～１８時間）インキュベートし；次の日、ＨＲＰコンジュゲートピーナッツアグルチニンＰＮＡ（２．５μｇ／ｍｌまで希釈）を洗浄したプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。基質（クエン酸ナトリウム中のＯＤＰ）を添加して１０分間インキュベートして、色を発現させた。さらに次に、停止バッファー（硫酸１Ｎ）を添加して反応を停止させた。プレートは、ＯＤ４９０ｎｍでの吸光度についてスキャンした。ウイルス対照と比べて色が減少しているまたは色がないことは、ＮＡ特異的抗体の存在のせいでＮＡ活性が阻害されていることを示していた。ＮＡＩ力価（ＩＣ５０値）はＯＤ読取り値から計算し、結果はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにグラフで示した。ＥＬＬＡ滴定曲線が信頼性のあるＩＣ５０値を決定するのに良好な適合度を与えなかった場合、試料は、５０％エンドポイントに到達する異なる希釈計画を使用して再試験した。
Ｔ細胞ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
完全培地（ＤＭＥＭ１６４０＋１０％熱失活ＦＣＳ）を３７℃水浴中で予熱した。ＰＢＭＣを３７℃水浴中で急速解凍し、予熱した培地と一緒にコニカルチューブに液滴で移した。チューブは１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞は再懸濁して、Ｇｕａｖａ細胞カウンターを使用して数え上げた。サルＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴキット（Ｍａｂｔｅｃｈ ３４２１Ｍ－４ＡＰＷ）およびＩＬ－１３ ＥＬＩＳＰＯＴキット（Ｍａｂｔｅｃｈ ３４７０Ｍ－４ＡＰＷ）を使用した。キットが提供する予め被覆されたプレートを無菌ＰＢＳで４回洗浄し、３７℃インキュベーターにおいて少なくとも３０分間、２００μｌの完全培地でブロックした。Ｓｉｎｇ１６ Ｈ３ペプチドプール（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｃｕｓｔｏｍ Ｏｒｄｅｒ）（それぞれのペプチドを１μｇ／ｍｌで）アッセイにおいてリコール抗原として使用した。ＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ ＣＡＴ＃Ｃ５２７５）２μｇ／ｍｌを陽性対照として使用した。リコール抗原５０μｌおよび５０μｌ中３００，０００個のＰＢＭＣを刺激のためにそれぞれのウェルに添加した。プレートは、３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーターに４８時間置いた。
インキュベーション後、細胞を取り除き、プレートはＰＢＳで５回洗浄して、１μｇ／ｍｌのビオチン化抗ＩＦＮ－γまたは抗ＩＬ－１３検出抗体１００μｌをプレートのそれぞれのウェルに添加した。２時間インキュベーション後、プレートはＰＢＳで５回洗浄し、室温で１時間それぞれのウェルで１：１０００希釈度のストレプトアビジンの１００μｌと一緒にインキュベートした。プレートは、スポットが現れるまでＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液の１００μｌで展開した。プレートは、水道水でゆすぎ、風乾し、スキャンして、ＣＴＬ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）読み取り機（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．）を使用して数え上げた。データは、ＰＢＭＣ１００万個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として報告した。
メモリーＢ細胞（ＭＢＣ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ヒトＩｇＧ Ｓｉｎｇｌｅ－ＣｏｌｏｒメモリーＢ細胞ＥＬＩＳＰＯＴキット（ＣＡＴ＃ＮＣ１９１１３７２、ＣＴＬ）を製造業者の説明書によって使用して、Ｓｉｎｇ１６ Ｈ３特異的および全ＩｇＧ＋抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を測定した。ＭＢＣのＡＳＣへの分化は、キットにより提供される刺激カクテルを使用してＰＢＭＣにおいて実施した。手短に言えば、凍結ＰＢＭＣを３７℃水浴中で急速解凍し、ＤＮアーゼＩ（ＣＡＴ＃９００８３、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合して、１０％ＦＣＳ（ＣＡＴ＃ＳＨ３００７３．０３、ＨｙＣｌｏｎｅ（商標））を含有する予熱した完全培地（ＣＭ）（ＲＰＭＩ １６４０、（ＣＡＴ＃２２４００－０８９、Ｇｉｂｃｏ）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＣＡＴ＃Ｐ４３３３、Ｓｉｇｍａ）を含有するチューブに移し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞ペレットは、５ｍｌの完全培地に１ｍｌ当たり２×１０６細胞で再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中１時間Ｔ２５フラスコに移した。次に、細胞懸濁液の容積は６ｍｌに調整し、Ｂ－Ｐｏｌｙ－Ｓを１：１０００希釈度で添加した。細胞は、４日間の刺激のためにＣＯ２インキュベーター中に残した。キットが供給するＰＶＤＦマイクロプレートは、７０％エタノールでプリウエットし、ゆすぎ、キットが提供する抗ヒトＩｇＧ捕捉ＡｂまたはＳｉｎｇ１６／Ｈ３組換えタンパク質４μｇ／ｍｌを８０μｌ／ウェルで一晩被覆した。
細胞は刺激の４日後に収穫し、洗浄し、計数して、ＣＭ中指示された濃度に調整した。被覆マイクロプレートはＰＢＳで洗浄し、ＣＭで１時間ブロックし、中身を移した。１００μｌ／ウェルの細胞懸濁系をプレートに添加し、３７℃で１８時間、ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。洗浄後、８０μｌ／ウェルの１：４００希釈抗ヒトＩｇＧビオチン検出抗体をプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。洗浄に続いて、１：１０００希釈度のストレプトアビジン－ＡＰを８０μｌ／ウェルで１時間プレートに添加した。新たに調製した基質溶液を添加し、室温で１８分間インキュベートした。プレートは、水道水によりすすぎ、風乾し、スキャンして、ＣＴＬ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）読み取り機（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．）を使用して数え上げた。それぞれ個々の動物では、ＩｇＧ＋の数およびＳｉｎｇ１６／Ｈ３特異的ＡＳＣの数は、ＰＢＭＣ１００万個当たりで計算した。抗原特異的ＡＳＣの出現頻度は、全ＩｇＧ＋ＡＳＣに対する抗原特異的ＡＳＣの％として計算した。アッセイバックグラウンドを評価するため、すべてのプレート上の陰性対照ウェルはＰＢＳで被覆した（バックグラウンドは検出されなかった）。
統計解析
光輝のＴｍａｘを見積もるため、ノンパラメトリック法を使用して、観察されたデータに基づいて個々の対象のＴｍａｘを見積もった。光輝の半減期を見積もるため、最大値に到達した後の光輝についての指数関数的崩壊モデルを想定して、線形モデルは、最大光輝から基準線までの崩壊の時間経過中対象ごとに対数変換データに適合していた（我々は、生理食塩水群での光輝の平均を使用して基準線を見積もる）。半減期は、対数光輝が最大と基準線値の間の中点に到達した時点として見積もった。幾何平均としてまとめられた結果を用いた異なる読み出し情報の解析では、ＳＥモデルベースの幾何平均およびＳＥは、応答が対数変換読み取り情報であり、ワクチン接種が固定効果であり、時間が反復測定である場合には反復測定についての混合効果モデルから見積もり；次に、モデルからの対数ベース平均およびＳＥ見積もりは変換により元に戻して、幾何平均およびＳＥを得た。体重変化では、オーバー記述的統計解析を使用した。基準線（０日目）からの経時的な最大％体重減少のそれぞれの群の中央値および範囲はもっと悪いシナリオを評価するために報告され；最後の観察時の基準線からの％体重変化のそれぞれの群の中央値および範囲は、体重回復を評価するために報告された。
抗原配列
ここで使用されたＰｅｒｔｈ０９ Ｎ２抗原の配列は、
ＭＮＰＮＱＫＩＩＴＩＧＳＶＳＬＴＩＳＴＩＣＦＦＭＱＩＡＩＬＩＴＴＶＴＬＨＦＫＱＹＥＦＮＳＰＰＮＮＱＶＭＬＣＥＰＴＩＩＥＲＮＩＴＥＩＶＹＬＴＮＴＴＩＥＫＥＩＣＰＫＬＡＥＹＲＮＷＳＫＰＱＣＤＩＴＧＦＡＰＦＳＫＤＮＳＩＲＬＳＡＧＧＤＩＷＶＴＲＥＰＹＶＳＣＤＰＤＫＣＹＱＦＡＬＧＱＧＴＴＬＮＮＶＨＳＮＮＴＶＲＤＲＴＰＹＲＴＬＬＭＮＥＬＧＶＰＦＨＬＧＴＫＱＶＣＩＡＷＳＳＳＳＣＨＤＧＫＡＷＬＨＶＣＩＴＧＤＤＫＮＡＴＡＳＦＩＹＮＧＲＬＶＤＳＶＶＳＷＳＫＥＩＬＲＴＱＥＳＥＣＶＣＩＮＧＴＣＴＶＶＭＴＤＧＳＡＳＧＫＡＤＴＫＩＬＦＩＥＥＧＫＩＶＨＴＳＴＬＳＧＳＡＱＨＶＥＥＣＳＣＹＰＲＹＰＧＶＲＣＶＣＲＤＮＷＫＧＳＮＲＰＩＶＤＩＮＩＫＤＨＳＩＶＳＳＹＶＣＳＧＬＶＧＤＴＰＲＫＮＤＳＳＳＳＳＨＣＬＤＰＮＮＥＥＧＧＨＧＶＫＧＷＡＦＤＤＧＮＤＶＷＭＧＲＴＩＳＥＫＳＲＬＧＹＥＴＦＫＶＩＥＧＷＳＮＰＫＳＫＬＱＩＮＲＱＶＩＶＤＲＧＮＲＳＧＹＳＧＩＦＳＶＥＧＫＳＣＩＮＲＣＦＹＶＥＬＩＲＧＲＫＥＥＴＥＶＬＷＴＳＮＳＩＶＶＦＣＧＴＳＧＴＹＧＴＧＳＷＰＤＧＡＤＩＮＬＭＰＩ＊（配列番号４）
である。
ここで使用されたＭｉｃｈ１５ Ｎ１抗原の配列は、
ＭＮＰＮＱＫＩＩＴＩＧＳＩＣＭＴＩＧＭＡＮＬＩＬＱＩＧＮＩＩＳＩＷＶＳＨＳＩＱＩＧＮＱＳＱＩＥＴＣＮＱＳＶＩＴＹＥＮＮＴＷＶＮＱＴＹＶＮＩＳＮＴＮＦＡＡＧＱＳＶＶＳＶＫＬＡＧＮＳＳＬＣＰＶＳＧＷＡＩＹＳＫＤＮＳＶＲＩＧＳＫＧＤＶＦＶＩＲＥＰＦＩＳＣＳＰＬＥＣＲＴＦＦＬＴＱＧＡＬＬＮＤＫＨＳＮＧＴＩＫＤＲＳＰＹＲＴＬＭＳＣＰＩＧＥＶＰＳＰＹＮＳＲＦＥＳＶＡＷＳＡＳＡＣＨＤＧＩＮＷＬＴＩＧＩＳＧＰＤＳＧＡＶＡＶＬＫＹＮＧＩＩＴＤＴＩＫＳＷＲＮＮＩＬＲＴＱＥＳＥＣＡＣＶＮＧＳＣＦＴＩＭＴＤＧＰＳＤＧＱＡＳＹＫＩＦＲＩＥＫＧＫＩＩＫＳＶＥＭＫＡＰＮＹＨＹＥＥＣＳＣＹＰＤＳＳＥＩＴＣＶＣＲＤＮＷＨＧＳＮＲＰＷＶＳＦＮＱＮＬＥＹＱＭＧＹＩＣＳＧＶＦＧＤＮＰＲＰＮＤＫＴＧＳＣＧＰＶＳＳＮＧＡＮＧＶＫＧＦＳＦＫＹＧＮＧＶＷＩＧＲＴＫＳＩＳＳＲＫＧＦＥＭＩＷＤＰＮＧＷＴＧＴＤＮＫＦＳＩＫＱＤＩＶＧＩＮＥＷＳＧＹＳＧＳＦＶＱＨＰＥＬＴＧＬＤＣＩＲＰＣＦＷＶＥＬＩＲＧＲＰＥＥＮＴＩＷＴＳＧＳＳＩＳＦＣＧＶＮＳＤＴＶＧＷＳＷＰＤＧＡＥＬＰＦＴＩＤＫ＊（配列番号５）
である。
ここで使用されたＳｉｎｇ１６ Ｈ３抗原の配列は、
ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＬＣＬＶＦＡＱＫＩＰＧＮＤＮＳＴＡＴＬＣＬＧＨＨＡＶＰＮＧＴＩＶＫＴＩＴＮＤＲＩＥＶＴＮＡＴＥＬＶＱＮＳＳＩＧＥＩＣＤＳＰＨＱＩＬＤＧＥＮＣＴＬＩＤＡＬＬＧＤＰＱＣＤＧＦＱＮＫＫＷＤＬＦＶＥＲＳＫＡＹＳＮＣＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳＬＲＳＬＶＡＳＳＧＴＬＥＦＫＮＥＳＦＮＷＴＧＶＴＱＮＧＴＳＳＡＣＩＲＧＳＳＳＳＦＦＳＲＬＮＷＬＴＨＬＮＹＴＹＰＡＬＮＶＴＭＰＮＫＥＱＦＤＫＬＹＩＷＧＶＨＨＰＧＴＤＫＤＱＩＦＬＹＡＱＳＳＧＲＩＴＶＳＴＫＲＳＱＱＡＶＩＰＮＩＧＳＲＰＲＩＲＤＩＰＳＲＩＳＩＹＷＴＩＶＫＰＧＤＩＬＬＩＮＳＴＧＮＬＩＡＰＲＧＹＦＫＩＲＳＧＫＳＳＩＭＲＳＤＡＰＩＧＫＣＫＳＥＣＩＴＰＮＧＳＩＰＮＤＫＰＦＱＮＶＮＲＩＴＹＧＡＣＰＲＹＶＫＨＳＴＬＫＬＡＴＧＭＲＮＶＰＥＫＱＴＲＧＩＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＶＤＧＷＹＧＦＲＨＱＮＳＥＧＲＧＱＡＡＤＬＫＳＴＱＡＡＩＤＱＩＮＧＫＬＮＲＬＩＧＫＴＮＥＫＦＨＱＩＥＫＥＦＳＥＶＥＧＲＶＱＤＬＥＫＹＶＥＤＴＫＩＤＬＷＳＹＮＡＥＬＬＶＡＬＥＮＱＨＴＩＤＬＴＤＳＥＭＮＫＬＦＥＫＴＫＫＱＬＲＥＮＡＥＤＭＧＮＧＣＦＫＩＹＨＫＣＤＮＡＣＩＥＳＩＲＮＥＴＹＤＨＮＶＹＲＤＥＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳＧＹＫＤＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＡＬＬＧＦＩＭＷＡＣＱＫＧＮＩＲＣＮＩＣＩ＊（配列番号６）
である。
ここで使用されたＳｉｎｇ１６ Ｎ２抗原の配列は、
ＭＮＰＮＱＫＩＩＴＩＧＳＶＳＬＴＩＳＴＩＣＦＦＭＱＩＡＩＬＩＴＴＶＴＬＨＦＫＱＹＥＦＮＳＰＰＮＮＱＶＭＬＣＥＰＴＩＩＥＲＮＩＴＥＩＶＹＬＴＮＴＴＩＥＫＥＩＣＰＫＰＡＥＹＲＮＷＳＫＰＱＣＧＩＴＧＦＡＰＦＳＫＤＮＳＩＲＬＳＡＧＧＤＩＷＶＴＲＥＰＹＶＳＣＤＰＤＫＣＹＱＦＡＬＧＱＧＴＴＬＮＮＶＨＳＮＮＴＶＲＤＲＴＰＹＲＴＬＬＭＮＥＬＧＶＰＦＨＬＧＴＫＱＶＣＩＡＷＳＳＳＳＣＨＤＧＫＡＷＬＨＶＣＩＴＧＤＤＫＮＡＴＡＳＦＩＹＮＧＲＬＩＤＳＶＶＳＷＳＫＤＩＬＲＴＱＥＳＥＣＶＣＩＮＧＴＣＴＶＶＭＴＤＧＮＡＴＧＫＡＤＴＫＩＬＦＩＥＥＧＫＩＶＨＴＳＫＬＳＧＳＡＱＨＶＥＥＣＳＣＹＰＲＹＰＧＶＲＣＶＣＲＤＮＷＫＧＳＮＲＰＩＶＤＩＮＩＫＤＨＳＩＶＳＳＹＶＣＳＧＬＶＧＤＴＰＲＫＮＤＳＳＳＳＳＨＣＬＮＰＮＮＥＥＧＧＨＧＶＫＧＷＡＦＤＤＧＮＤＶＷＭＧＲＴＩＮＥＴＳＲＬＧＹＥＴＦＫＶＶＥＧＷＳＮＰＫＳＫＬＱＩＮＲＱＶＩＶＤＲＧＤＲＳＧＹＳＧＩＦＳＶＥＧＫＳＣＩＮＲＣＦＹＶＥＬＩＲＧＲＫＥＥＴＥＶＬＷＴＳＮＳＩＶＶＦＣＧＴＳＧＴＹＧＴＧＳＷＰＤＧＡＤＬＮＬＭＨＩ＊（配列番号７）
である。
ここで使用されたＣＡ０９ Ｈ１抗原の配列は、
ＭＫＡＩＬＶＶＬＬＹＴＦＡＴＡＮＡＤＴＬＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＫＨＮＧＫＬＣＫＬＲＧＶＡＰＬＨＬＧＫＣＮＩＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＳＬＳＴＡＳＳＷＳＹＩＶＥＴＰＳＳＤＮＧＴＣＹＰＧＤＦＩＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＴＳＳＷＰＮＨＤＳＮＫＧＶＴＡＡＣＰＨＡＧＡＫＳＦＹＫＮＬＩＷＬＶＫＫＧＮＳＹＰＫＬＳＫＳＹＩＮＤＫＧＫＥＶＬＶＬＷＧＩＨＨＰＳＴＳＡＤＱＱＳＬＹＱＮＡＤＡＹＶＦＶＧＳＳＲＹＳＫＫＦＫＰＥＩＡＩＲＰＫＶＲＤＲＥＧＲＭＮＹＹＷＴＬＶＥＰＧＤＫＩＴＦＥＡＴＧＮＬＶＶＰＲＹＡＦＡＭＥＲＮＡＧＳＧＩＩＩＳＤＴＰＶＨＤＣＮＴＴＣＱＴＰＫＧＡＩＮＴＳＬＰＦＱＮＩＨＰＩＴＩＧＫＣＰＫＹＶＫＳＴＫＬＲＬＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＬＫＳＴＱＮＡＩＤＥＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＨＬＥＫＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＹＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＲＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＡＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＴＲＩＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＶＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ＊（配列番号２４）
である。
ここで使用されたＨＡ株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）（ＣＡ０９）抗原ｍＲＮＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列は、
ＡＵＧＡＡＡＧＣＵＡＵＣＣＵＧＧＵＣＧＵＣＵＵＧＣＵＧＵＡＵＡＣＵＵＵＣＧＣＣＡＣＵＧＣＣＡＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＣＵＧＵＧＵＡＵＣＧＧＵＵＡＣＣＡＣＧＣＧＡＡＣＡＡＣＵＣＣＡＣＣＧＡＣＡＣＵＧＵＧＧＡＣＡＣＣＧＵＧＣＵＣＧＡＡＡＡＧＡＡＣＧＵＧＡＣＣＧＵＧＡＣＵＣＡＵＵＣＵＧＵＧＡＡＵＣＵＧＣＵＣＧＡＧＧＡＣＡＡＧＣＡＣＡＡＣＧＧＡＡＡＧＵＵＧＵＧＣＡＡＧＣＵＧＣＧＣＧＧＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＣＵＧＣＡＣＣＵＵＧＧＡＡＡＧＵＧＣＡＡＣＡＵＵＧＣＣＧＧＡＵＧＧＡＵＣＣＵＧＧＧＡＡＡＣＣＣＧＧＡＧＵＧＣＧＡＡＡＧＣＣＵＧＡＧＣＡＣＣＧＣＧＵＣＣＵＣＡＵＧＧＵＣＣＵＡＣＡＵＣＧＵＧＧＡＡＡＣＣＣＣＧＵＣＣＵＣＵＧＡＣＡＡＣＧＧＣＡＣＣＵＧＵＵＡＣＣＣＣＧＧＣＧＡＵＵＵＣＡＵＣＧＡＣＵＡＣＧＡＡＧＡＡＣＵＧＣＧＧＧＡＧＣＡＧＣＵＧＵＣＣＵＣＣＧＵＧＵＣＣＵＣＧＵＵＵＧＡＡＣＧＣＵＵＣＧＡＧＡＵＵＵＵＣＣＣＵＡＡＧＡＣＣＵＣＣＡＧＣＵＧＧＣＣＵＡＡＵＣＡＣＧＡＵＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＧＵＧＡＣＧＧＣＡＧＣＣＵＧＣＣＣＧＣＡＣＧＣＣＧＧＡＧＣＡＡＡＧＵＣＡＵＵＣＵＡＣＡＡＧＡＡＵＣＵＧＡＵＵＵＧＧＣＵＣＧＵＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧＡＡＣＵＣＡＵＡＣＣＣＣＡＡＧＣＵＧＵＣＣＡＡＧＵＣＧＵＡＣＡＵＣＡＡＣＧＡＣＡＡＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＧＵＧＣＵＣＧＵＧＣＵＣＵＧＧＧＧＧＡＵＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＵＣＣＡＣＣＵＣＣＧＣＣＧＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＵＧＵＡＣＣＡＧＡＡＣＧＣＣＧＡＵＧＣＵＵＡＣＧＵＧＵＵＵＧＵＧＧＧＵＵＣＣＡＧＣＣＧＧＵＡＣＵＣＣＡＡＧＡＡＧＵＵＣＡＡＧＣＣＵＧＡＡＡＵＣＧＣＧＡＵＣＡＧＧＣＣＵＡＡＡＧＵＣＣＧＧＧＡＣＣＧＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＡＵＧＡＡＣＵＡＣＵＡＣＵＧＧＡＣＵＣＵＣＧＵＧＧＡＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＡＡＧＡＵＣＡＣＣＵＵＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＧＧＡＡＡＵＣＵＣＧＵＧＧＵＧＣＣＡＣＧＣＵＡＣＧＣＵＵＵＣＧＣＣＡＵＧＧＡＡＣＧＧＡＡＣＧＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＵＣＡＵＣＡＵＵＡＧＣＧＡＵＡＣＵＣＣＵＧＵＧＣＡＵＧＡＣＵＧＵＡＡＣＡＣＣＡＣＧＵＧＣＣＡＧＡＣＡＣＣＣＡＡＧＧＧＣＧＣＣＡＵＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＣＵＧＣＣＧＵＵＵＣＡＡＡＡＣＡＵＣＣＡＵＣＣＣＡＵＵＡＣＣＡＵＵＧＧＧＡＡＧＵＧＣＣＣＣＡＡＡＵＡＣＧＵＣＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＡＧＣＵＧＡＧＧＣＵＧＧＣＧＡＣＣＧＧＡＣＵＧＣＧＧＡＡＣＡＵＵＣＣＧＡＧＣＡＵＣＣＡＧＵＣＧＡＧＡＧＧＣＣＵＧＵＵＣＧＧＵＧＣＣＡＵＣＧＣＧＧＧＡＵＵＣＡＵＣＧＡＧＧＧＣＧＧＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＡＵＧＧＵＧＧＡＣＧＧＵＵＧＧＵＡＣＧＧＧＵＡＵＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＡＣＧＡＡＣＡＧＧＧＡＵＣＡＧＧＣＵＡＣＧＣＧＧＣＣＧＡＵＵＵＧＡＡＧＵＣＣＡＣＣＣＡＧＡＡＣＧＣＣＡＵＵＧＡＵＧＡＡＡＵＣＡＣＣＡＡＣＡＡＧＧＵＣＡＡＣＵＣＣＧＵＧＡＵＵＧＡＧＡＡＧＡＵＧＡＡＵＡＣＵＣＡＡＵＵＣＡＣＣＧＣＣＧＵＧＧＧＣＡＡＡＧＡＡＵＵＣＡＡＵＣＡＣＣＵＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＵＡＧＡＧＡＡＣＣＵＧＡＡＣＡＡＧＡＡＧＧＵＣＧＡＣＧＡＣＧＧＧＵＵＣＣＵＣＧＡＣＡＵＣＵＧＧＡＣＣＵＡＵＡＡＣＧＣＣＧＡＧＵＵＧＣＵＣＧＵＧＣＵＧＣＵＧＧＡＡＡＡＣＧＡＡＣＧＧＡＣＣＣＵＧＧＡＣＵＡＵＣＡＣＧＡＣＵＣＧＡＡＣＧＵＧＡＡＧＡＡＣＣＵＧＵＡＣＧＡＧＡＡＡＧＵＣＣＧＣＵＣＧＣＡＡＣＵＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＧＡＡＡＵＣＧＧＡＡＡＵＧＧＵＵＧＣＵＵＣＧＡＧＵＵＣＵＡＣＣＡＵＡＡＧＵＧＣＧＡＣＡＡＣＡＣＵＵＧＣＡＵＧＧＡＧＵＣＣＧＵＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＣＵＵＡＣＧＡＵＵＡＣＣＣＣＡＡＧＵＡＣＵＣＣＧＡＡＧＡＧＧＣＵＡＡＡＣＵＵＡＡＣＣＧＧＧＡＡＧＡＧＡＵＣＧＡＵＧＧＣＧＵＧＡＡＧＣＵＣＧＡＧＵＣＣＡＣＣＡＧＡＡＵＣＵＡＣＣＡＧＡＵＵＣＵＣＧＣＣＡＵＣＵＡＣＵＣＧＡＣＵＧＵＧＧＣＡＵＣＧＡＧＣＣＵＣＧＵＣＣＵＵＧＵＣＧＵＧＵＣＣＣＵＧＧＧＧＧＣＣＡＵＵＵＣＡＵＵＣＵＧＧＡＵＧＵＧＣＵＣＣＡＡＣＧＧＧＵＣＣＣＵＧＣＡＧＵＧＣＣＧＧＡＵＵＵＧＣＡＵＣＵＡＡ（配列番号８）
である。
ここで使用されたＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｍｉｃｈ１５）ノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原ｍＲＮＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列は、
ＡＵＧＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＡＵＣＡＵＣＡＣＧＡＵＵＧＧＣＵＣＧＡＵＵＵＧＣＡＵＧＡＣＣＡＵＵＧＧＡＡＵＧＧＣＧＡＡＣＣＵＵＡＵＣＣＵＣＣＡＡＡＵＵＧＧＣＡＡＣＡＵＵＡＵＣＵＣＧＡＵＣＵＧＧＧＵＣＡＧＣＣＡＣＵＣＧＡＵＣＣＡＧＡＵＣＧＧＣＡＡＣＣＡＡＵＣＣＣＡＧＡＵＵＧＡＡＡＣＵＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＵＧＡＵＵＡＣＵＵＡＣＧＡＡＡＡＣＡＡＣＡＣＧＵＧＧＧＵＧＡＡＣＣＡＧＡＣＵＵＡＣＧＵＣＡＡＵＡＵＵＡＧＣＡＡＣＡＣＵＡＡＣＵＵＣＧＣＣＧＣＵＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＵＣＧＵＣＡＧＣＧＵＧＡＡＧＣＵＣＧＣＣＧＧＡＡＡＵＵＣＣＵＣＧＣＵＣＵＧＣＣＣＣＧＵＧＵＣＣＧＧＣＵＧＧＧＣＧＡＵＣＵＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＵＡＡＣＡＧＣＧＵＣＣＧＧＡＵＵＧＧＵＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＣＧＵＵＵＵＣＧＵＧＡＵＣＣＧＣＧＡＡＣＣＣＵＵＣＡＵＡＵＣＡＵＧＣＵＣＣＣＣＧＣＵＣＧＡＡＵＧＵＣＧＣＡＣＧＵＵＣＵＵＣＣＵＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＧＣＣＣＵＧＣＵＧＡＡＣＧＡＣＡＡＧＣＡＣＵＣＣＡＡＵＧＧＣＡＣＵＡＵＣＡＡＧＧＡＵＣＧＧＡＧＣＣＣＵＵＡＣＣＧＧＡＣＣＵＵＧＡＵＧＵＣＣＵＧＣＣＣＵＡＵＵＧＧＡＧＡＡＧＵＧＣＣＵＵＣＡＣＣＡＵＡＵＡＡＣＵＣＧＣＧＣＵＵＵＧＡＡＡＧＣＧＵＧＧＣＵＵＧＧＵＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＣＵＧＣＣＡＵＧＡＣＧＧＧＡＵＵＡＡＣＵＧＧＣＵＧＡＣＣＡＵＵＧＧＣＡＵＡＡＧＣＧＧＣＣＣＣＧＡＵＵＣＣＧＧＣＧＣＣＧＵＧＧＣＣＧＵＣＣＵＧＡＡＧＵＡＣＡＡＣＧＧＧＡＵＣＡＵＣＡＣＣＧＡＣＡＣＣＡＵＵＡＡＧＵＣＣＵＧＧＣＧＣＡＡＣＡＡＣＡＵＣＣＵＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＧＵＣＣＧＡＧＵＧＣＧＣＧＵＧＣＧＵＧＡＡＣＧＧＧＵＣＣＵＧＣＵＵＵＡＣＣＡＵＣＡＵＧＡＣＣＧＡＣＧＧＡＣＣＧＵＣＣＧＡＣＧＧＵＣＡＡＧＣＣＵＣＧＵＡＣＡＡＧＡＵＣＵＵＣＣＧＧＡＵＣＧＡＧＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡＵＣＡＵＣＡＡＧＡＧＣＧＵＧＧＡＧＡＵＧＡＡＧＧＣＣＣＣＧＡＡＣＵＡＣＣＡＣＵＡＣＧＡＧＧＡＡＵＧＵＵＣＡＵＧＣＵＡＵＣＣＣＧＡＣＵＣＧＵＣＣＧＡＧＡＵＵＡＣＵＵＧＣＧＵＧＵＧＣＣＧＣＧＡＣＡＡＵＵＧＧＣＡＣＧＧＡＵＣＣＡＡＣＡＧＧＣＣＧＵＧＧＧＵＣＡＧＣＵＵＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＣＵＵＧＡＡＵＡＣＣＡＧＡＵＧＧＧＡＵＡＣＡＵＵＵＧＣＡＧＣＧＧＡＧＵＧＵＵＣＧＧＧＧＡＣＡＡＣＣＣＵＣＧＣＣＣＧＡＡＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＧＡＵＣＧＵＧＵＧＧＧＣＣＣＧＵＧＵＣＣＵＣＣＡＡＣＧＧＣＧＣＡＡＡＣＧＧＣＧＵＣＡＡＧＧＧＡＵＵＵＵＣＣＵＵＣＡＡＡＵＡＣＧＧＧＡＡＣＧＧＧＧＵＣＵＧＧＡＵＣＧＧＡＣＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＣＡＵＵＵＣＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＧＧＡＵＵＣＧＡＧＡＵＧＡＵＵＵＧＧＧＡＣＣＣＧＡＡＣＧＧＣＵＧＧＡＣＵＧＧＵＡＣＣＧＡＵＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＣＡＵＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＡＵＣＧＵＧＧＧＡＡＵＵＡＡＣＧＡＧＵＧＧＵＣＣＧＧＵＵＡＣＵＣＣＧＧＧＡＧＣＵＵＣＧＵＧＣＡＧＣＡＵＣＣＣＧＡＡＣＵＣＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＣＡＵＵＣＧＧＣＣＧＵＧＣＵＵＵＵＧＧＧＵＧＧＡＡＵＵＧＡＵＣＣＧＧＧＧＣＡＧＡＣＣＵＧＡＧＧＡＧＡＡＣＡＣＧＡＵＵＵＧＧＡＣＣＵＣＣＧＧＣＵＣＣＵＣＧＡＵＣＵＣＧＵＵＣＵＧＣＧＧＡＧＵＧＡＡＣＵＣＣＧＡＣＡＣＣＧＵＧＧＧＡＵＧＧＵＣＣＵＧＧＣＣＣＧＡＣＧＧＵＧＣＡＧＡＧＣＵＧＣＣＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＧＡＵＡＡＧＵＡＡ（配列番号９）
である。
ここで使用されたＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ．ＩＮＦＩＭＨ１６００１９／２０１６（Ｓｉｎｇ１６；Ｈ３Ｎ２）ＨＡヘマグルチニン抗原ｍＲＮＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列は、
ＡＵＧＡＡＡＡＣＣＡＵＡＡＵＣＧＣＧＣＵＣＵＣＡＵＡＣＡＵＡＣＵＵＵＧＣＣＵＧＧＵＣＵＵＵＧＣＣＣＡＡＡＡＧＡＵＣＣＣＵＧＧＣＡＡＣＧＡＣＡＡＣＵＣＡＡＣＣＧＣＧＡＣＣＣＵＵＵＧＣＣＵＣＧＧＣＣＡＵＣＡＣＧＣＣＧＵＧＣＣＧＡＡＣＧＧＣＡＣＵＡＵＣＧＵＣＡＡＧＡＣＣＡＵＣＡＣＡＡＡＣＧＡＣＣＧＣＡＵＣＧＡＡＧＵＧＡＣＣＡＡＣＧＣＧＡＣＵＧＡＧＣＵＡＧＵＧＣＡＧＡＡＣＵＣＣＡＧＣＡＵＵＧＧＡＧＡＧＡＵＵＵＧＣＧＡＵＵＣＵＣＣＡＣＡＣＣＡＡＡＵＣＣＵＧＧＡＣＧＧＡＧＡＧＡＡＵＵＧＵＡＣＣＵＵＧＡＵＣＧＡＣＧＣＧＣＵＧＣＵＧＧＧＧＧＡＵＣＣＧＣＡＧＵＧＣＧＡＣＧＧＡＵＵＣＣＡＧＡＡＣＡＡＧＡＡＡＵＧＧＧＡＣＣＵＵＵＵＣＧＵＧＧＡＡＣＧＧＡＧＣＡＡＧＧＣＡＵＡＣＵＣＧＡＡＵＵＧＣＵＡＣＣＣＣＵＡＣＧＡＵＧＵＧＣＣＣＧＡＣＵＡＣＧＣＣＵＣＧＣＵＧＣＧＧＵＣＣＵＵＧＧＵＣＧＣＵＵＣＣＵＣＣＧＧＧＡＣＣＣＵＧＧＡＡＵＵＣＡＡＡＡＡＣＧＡＧＡＧＣＵＵＵＡＡＵＵＧＧＡＣＣＧＧＡＧＵＧＡＣＣＣＡＧＡＡＵＧＧＣＡＣＣＵＣＧＡＧＣＧＣＣＵＧＣＡＵＵＣＧＧＧＧＣＵＣＣＵＣＣＵＣＧＡＧＣＵＵＣＵＵＣＡＧＣＣＧＣＣＵＧＡＡＣＵＧＧＣＵＣＡＣＵＣＡＣＣＵＣＡＡＣＵＡＣＡＣＣＵＡＣＣＣＧＧＣＡＣＵＧＡＡＣＧＵＧＡＣＣＡＵＧＣＣＧＡＡＣＡＡＧＧＡＡＣＡＡＵＵＣＧＡＣＡＡＧＣＵＣＵＡＣＡＵＵＵＧＧＧＧＧＧＵＧＣＡＵＣＡＣＣＣＧＧＧＵＡＣＣＧＡＵＡＡＧＧＡＣＣＡＧＡＵＣＵＵＣＣＵＣＵＡＣＧＣＣＣＡＡＵＣＣＵＣＧＧＧＣＣＧＧＡＵＣＡＣＣＧＵＧＵＣＣＡＣＵＡＡＧＣＧＣＵＣＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＵＧＡＵＣＣＣＧＡＡＣＡＵＵＧＧＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＡＵＵＣＧＣＧＡＣＡＵＵＣＣＡＵＣＧＡＧＧＡＵＣＵＣＧＡＵＣＵＡＣＵＧＧＡＣＧＡＵＵＧＵＣＡＡＧＣＣＵＧＧＣＧＡＣＡＵＣＣＵＣＣＵＣＡＵＵＡＡＣＵＣＣＡＣＣＧＧＧＡＡＣＣＵＣＡＵＣＧＣＣＣＣＵＣＧＧＧＧＵＵＡＵＵＵＣＡＡＧＡＵＣＣＧＣＡＧＣＧＧＧＡＡＧＵＣＣＵＣＣＡＵＣＡＵＧＡＧＡＡＧＣＧＡＵＧＣＣＣＣＣＡＵＵＧＧＡＡＡＧＵＧＣＡＡＧＵＣＣＧＡＧＵＧＵＡＵＣＡＣＡＣＣＵＡＡＣＧＧＡＡＧＣＡＵＵＣＣＣＡＡＵＧＡＣＡＡＧＣＣＡＵＵＣＣＡＧＡＡＣＧＵＧＡＡＣＡＧＡＡＵＵＡＣＣＵＡＣＧＧＡＧＣＵＵＧＣＣＣＵＣＧＣＵＡＣＧＵＣＡＡＡＣＡＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＡＡＧＵＵＧＧＣＧＡＣＵＧＧＡＡＵＧＣＧＣＡＡＣＧＵＧＣＣＧＧＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣＣＣＧＧＧＧＧＡＵＣＵＵＣＧＧＧＧＣＵＡＵＣＧＣＧＧＧＡＵＵＣＡＵＣＧＡＡＡＡＵＧＧＡＵＧＧＧＡＡＧＧＡＡＵＧＧＵＣＧＡＵＧＧＵＵＧＧＵＡＣＧＧＵＵＵＣＡＧＡＣＡＣＣＡＧＡＡＣＵＣＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＧＣＡＧＡＣＣＵＧＡＡＧＵＣＣＡＣＵＣＡＧＧＣＣＧＣＧＡＵＵＧＡＣＣＡＧＡＵＣＡＡＣＧＧＡＡＡＧＣＵＣＡＡＣＡＧＡＣＵＣＡＵＵＧＧＡＡＡＧＡＣＣＡＡＣＧＡＡＡＡＧＵＵＣＣＡＣＣＡＡＡＵＣＧＡＡＡＡＧＧＡＡＵＵＣＵＣＣＧＡＡＧＵＧＧＡＧＧＧＣＣＧＧＧＵＧＣＡＡＧＡＣＣＵＧＧＡＧＡＡＧＵＡＣＧＵＧＧＡＧＧＡＣＡＣＵＡＡＧＡＵＣＧＡＣＣＵＵＵＧＧＡＧＣＵＡＵＡＡＣＧＣＡＧＡＡＣＵＣＣＵＵＧＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＡＡＣＣＡＧＣＡＣＡＣＣＡＵＣＧＡＣＣＵＧＡＣＣＧＡＵＵＣＡＧＡＧＡＵＧＡＡＣＡＡＧＣＵＣＵＵＵＧＡＧＡＡＡＡＣＵＡＡＧＡＡＧＣＡＡＣＵＣＣＧＧＧＡＡＡＡＣＧＣＵＧＡＧＧＡＣＡＵＧＧＧＡＡＡＵＧＧＡＵＧＣＵＵＵＡＡＧＡＵＣＵＡＣＣＡＣＡＡＧＵＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＣＵＧＣＡＵＵＧＡＧＵＣＣＡＵＡＣＧＧＡＡＣＧＡＡＡＣＵＵＡＣＧＡＣＣＡＵＡＡＣＧＵＣＵＡＣＣＧＧＧＡＵＧＡＡＧＣＣＣＵＧＡＡＣＡＡＣＡＧＡＵＵＣＣＡＧＡＵＣＡＡＧＧＧＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＡＧＵＣＣＧＧＣＵＡＣＡＡＡＧＡＵＵＧＧＡＵＣＣＵＧＵＧＧＡＵＵＵＣＣＵＵＣＧＣＧＡＵＵＵＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＵＣＵＧＣＧＵＧＧＣＣＣＵＣＣＵＧＧＧＡＵＵＣＡＵＡＡＵＧＵＧＧＧＣＣＵＧＵＣＡＧＡＡＧＧＧＣＡＡＣＡＵＵＡＧＧＵＧＣＡＡＣＡＵＡＵＧＣＡＵＡＵＡＡ（配列番号１０）
である。
ここで使用されたＰｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）ＮＡ抗原ｍＲＮＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列は、
ＡＵＧＡＡＣＣＣＵＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＵＣＡＵＣＡＣＡＡＵＵＧＧＡＡＧＣＧＵＧＵＣＣＣＵＧＡＣＣＡＵＵＵＣＧＡＣＧＡＵＵＵＧＣＵＵＣＵＵＣＡＵＧＣＡＡＡＵＣＧＣＧＡＵＣＵＵＧＡＵＵＡＣＣＡＣＣＧＵＣＡＣＣＣＵＧＣＡＵＵＵＣＡＡＧＣＡＡＵＡＣＧＡＡＵＵＣＡＡＣＵＣＣＣＣＧＣＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＡＧＵＣＡＵＧＣＵＣＵＧＣＧＡＧＣＣＣＡＣＣＡＵＣＡＵＣＧＡＡＣＧＣＡＡＣＡＵＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＧＵＧＵＡＣＣＵＵＡＣＣＡＡＣＡＣＵＡＣＣＡＵＣＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＵＵＵＧＣＣＣＣＡＡＧＵＵＧＧＣＣＧＡＡＵＡＣＣＧＧＡＡＣＵＧＧＡＧＣＡＡＧＣＣＣＣＡＧＵＧＵＧＡＣＡＵＣＡＣＧＧＧＡＵＵＵＧＣＧＣＣＡＵＵＣＡＧＣＡＡＧＧＡＵＡＡＣＵＣＧＡＵＣＡＧＡＣＵＵＵＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＡＣＡＵＵＵＧＧＧＵＣＡＣＵＣＧＧＧＡＧＣＣＵＵＡＣＧＵＧＡＧＣＵＧＣＧＡＣＣＣＧＧＡＣＡＡＧＵＧＣＵＡＣＣＡＡＵＵＣＧＣＡＣＵＣＧＧＡＣＡＧＧＧＵＡＣＣＡＣＣＣＵＧＡＡＣＡＡＣＧＵＣＣＡＵＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣＧＵＧＣＧＣＧＡＵＡＧＡＡＣＣＣＣＧＵＡＣＣＧＣＡＣＣＣＵＣＣＵＣＡＵＧＡＡＣＧＡＡＣＵＧＧＧＡＧＵＧＣＣＧＵＵＣＣＡＣＵＵＧＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＡＡＧＵＣＵＧＣＡＵＵＧＣＡＵＧＧＵＣＣＵＣＣＵＣＣＵＣＣＵＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＡＧＣＣＵＧＧＣＵＵＣＡＣＧＵＵＵＧＣＡＵＣＡＣＣＧＧＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＡＵＧＣＧＡＣＧＧＣＣＵＣＣＵＵＣＡＵＡＵＡＣＡＡＵＧＧＵＡＧＡＣＵＣＧＵＧＧＡＵＡＧＣＧＵＧＧＵＧＵＣＡＵＧＧＵＣＣＡＡＧＧＡＡＡＵＵＣＵＣＡＧＧＡＣＵＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＡＧＵＧＣＧＵＧＵＧＣＡＵＣＡＡＣＧＧＧＡＣＵＵＧＣＡＣＵＧＵＣＧＵＧＡＵＧＡＣＣＧＡＣＧＧＡＵＣＧＧＣＣＵＣＣＧＧＡＡＡＧＧＣＣＧＡＣＡＣＵＡＡＧＡＵＣＣＵＣＵＵＣＡＵＣＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＡＧＡＵＣＧＵＧＣＡＣＡＣＵＵＣＵＡＣＣＣＵＧＡＧＣＧＧＣＵＣＧＧＣＵＣＡＧＣＡＵＧＵＣＧＡＡＧＡＧＵＧＣＵＣＧＵＧＣＵＡＣＣＣＣＣＧＧＵＡＵＣＣＣＧＧＧＧＵＣＣＧＣＵＧＣＧＵＧＵＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＵＵＧＧＡＡＡＧＧＣＵＣＡＡＡＣＣＧＣＣＣＣＡＵＣＧＵＧＧＡＣＡＵＵＡＡＣＡＵＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＵＣＣＡＵＣＧＵＧＡＧＣＵＣＣＵＡＣＧＵＡＵＧＣＡＧＣＧＧＧＣＵＧＧＵＣＧＧＧＧＡＵＡＣＣＣＣＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＧＡＵＵＣＣＵＣＧＵＣＣＵＣＣＵＣＣＣＡＣＵＧＣＣＵＧＧＡＣＣＣＵＡＡＣＡＡＣＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＧＣＣＡＣＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＧＡＵＧＧＧＣＵＵＵＵＧＡＣＧＡＵＧＧＣＡＡＣＧＡＣＧＵＧＵＧＧＡＵＧＧＧＣＡＧＧＡＣＵＡＵＵＵＣＣＧＡＡＡＡＧＵＣＣＣＧＧＣＵＧＧＧＡＵＡＣＧＡＡＡＣＣＵＵＣＡＡＧＧＵＣＡＵＣＧＡＧＧＧＣＵＧＧＵＣＣＡＡＣＣＣＧＡＡＧＵＣＡＡＡＧＣＵＣＣＡＧＡＵＣＡＡＣＣＧＣＣＡＧＧＵＣＡＵＣＧＵＧＧＡＵＡＧＧＧＧＣＡＡＵＡＧＡＵＣＣＧＧＣＵＡＣＵＣＣＧＧＧＡＵＣＵＵＣＡＧＣＧＵＧＧＡＡＧＧＧＡＡＧＵＣＣＵＧＣＡＵＵＡＡＣＣＧＡＵＧＣＵＵＣＵＡＣＧＵＧＧＡＡＣＵＣＡＵＵＣＧＧＧＧＵＣＧＧＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＡＣＵＵＣＧＡＡＣＵＣＡＡＵＣＧＵＧＧＵＧＵＵＵＵＧＵＧＧＧＡＣＣＵＣＣＧＧＡＡＣＵＵＡＣＧＧＡＡＣＵＧＧＧＵＣＣＵＧＧＣＣＵＧＡＣＧＧＵＧＣＣＧＡＣＡＵＣＡＡＣＣＵＵＡＵＧＣＣＧＡＵＣＵＡＡ（配列番号１１）
である。
ここで使用されたＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／５８８／２０１９抗原ｍＲＮＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列は、
ＡＵＧＡＡＡＧＣＣＡＵＣＣＵＵＧＵＵＧＵＣＡＵＧＣＵＧＵＡＣＡＣＡＵＵＣＡＣＣＡＣＣＧＣＡＡＡＵＧＣＧＧＡＵＡＣＣＣＵＧＵＧＵＡＵＣＧＧＣＵＡＣＣＡＣＧＣＡＡＡＵＡＡＵＵＣＣＡＣＣＧＡＣＡＣＣＧＵＵＧＡＵＡＣＣＧＵＣＣＵＧＧＡＡＡＡＧＡＡＣＧＵＧＡＣＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＣＵＣＣＵＵＧＡＧＧＡＵＡＡＡＣＡＵＡＡＵＧＧＣＡＡＧＣＵＧＵＧＣＡＡＧＣＵＧＡＧＡＧＧＣＧＵＧＧＣＵＣＣＣＣＵＧＣＡＵＣＵＧＧＧＡＡＡＧＵＧＣＡＡＣＡＵＣＧＣＵＧＧＵＵＧＧＡＵＣＣＵＣＧＧＧＡＡＣＣＣＡＧＡＧＵＧＵＧＡＧＵＣＣＣＵＣＵＣＡＡＣＣＧＣＡＣＧＧＵＣＵＵＧＧＵＣＡＵＡＣＡＵＣＧＵＧＧＡＧＡＣＵＡＧＣＡＡＵＵＣＡＧＡＣＡＡＣＧＧＣＡＣＡＵＧＣＵＡＣＣＣＣＧＧＵＧＡＣＵＵＣＡＵＵＡＡＣＵＡＣＧＡＧＧＡＧＣＵＧＡＧＡＧＡＡＣＡＧＣＵＧＡＧＵＵＣＣＧＵＧＵＣＡＵＣＣＵＵＣＧＡＧＡＧＡＵＵＣＧＡＡＡＵＣＵＵＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＵＣＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＡＡＵＣＡＵＧＡＣＵＣＣＧＡＣＡＡＵＧＧＡＧＵＧＡＣＡＧＣＣＧＣＵＵＧＵＣＣＣＣＡＣＧＣＣＧＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＵＵＣＵＡＵＡＡＧＡＡＣＣＵＣＡＵＣＵＧＧＣＵＧＧＵＧＡＡＡＡＡＧＧＧＣＡＡＧＵＣＣＵＡＵＣＣＣＡＡＡＡＵＵＡＡＣＣＡＧＡＣＣＵＡＣＡＵＵＡＡＣＧＡＵＡＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＡＧＵＣＣＵＧＧＵＣＣＵＧＵＧＧＧＧＧＡＵＡＣＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＵＡＣＣＡＵＣＧＣＣＧＡＣＣＡＧＣＡＧＵＣＵＣＵＧＵＡＵＣＡＧＡＡＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＵＡＣＧＵＧＵＵＣＧＵＧＧＧＵＡＣＣＡＧＣＣＧＵＵＡＵＡＧＵＡＡＡＡＡＧＵＵＣＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＵＵＧＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＵＡＡＧＧＵＧＣＧＣＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＧＣＣＧＣＡＵＧＡＡＣＵＡＣＵＡＣＵＧＧＡＣＣＣＵＧＧＵＧＧＡＡＣＣＵＧＧＣＧＡＣＡＡＧＡＵＵＡＣＡＵＵＣＧＡＧＧＣＣＡＣＵＧＧＧＡＡＣＣＵＧＧＵＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＵＡＣＧＣＣＵＵＵＡＣＡＡＵＧＧＡＡＣＧＧＧＡＵＧＣＵＧＧＧＡＧＣＧＧＡＡＵＣＡＵＵＡＵＣＵＣＣＧＡＵＡＣＣＣＣＵＧＵＣＣＡＣＧＡＣＵＧＣＡＡＵＡＣＵＡＣＣＵＧＵＣＡＧＡＣＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＧＣＵＡＵＣＡＡＵＡＣＣＵＣＵＣＵＧＣＣＵＵＵＣＣＡＡＡＡＣＧＵＧＣＡＣＣＣＵＡＵＣＡＣＵＡＵＣＧＧＧＡＡＡＵＧＵＣＣＣＡＡＧＵＡＵＧＵＧＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＡＡＣＵＧＣＧＣＣＵＧＧＣＡＡＣＣＧＧＵＣＵＧＡＧＡＡＡＵＧＵＧＣＣＣＵＣＣＡＵＣＣＡＧＵＣＣＣＧＣＧＧＣＵＵＧＵＵＣＧＧＵＧＣＡＡＵＣＧＣＵＧＧＣＵＵＵＡＵＣＧＡＧＧＧＵＧＧＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＡＵＧＧＵＣＧＡＵＧＧＣＵＧＧＵＡＣＧＧＣＵＡＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＣＡＧＧＧＧＵＣＣＧＧＧＵＡＵＧＣＵＧＣＣＧＡＣＣＵＧＡＡＡＡＧＣＡＣＵＣＡＧＡＡＣＧＣＣＡＵＣＧＡＵＡＡＡＡＵＣＡＣＵＡＡＣＡＡＧＧＵＧＡＡＣＵＣＣＧＵＧＡＵＣＧＡＡＡＡＧＡＵＧＡＡＵＡＣＡＣＡＧＵＵＣＡＣＡＧＣＡＧＵＵＧＧＣＡＡＧＧＡＧＵＵＣＡＡＣＣＡＣＣＵＧＧＡＡＡＡＡＣＧＧＡＵＡＧＡＧＡＡＣＣＵＧＡＡＵＡＡＧＡＡＡＧＵＣＧＡＵＧＡＵＧＧＣＵＵＵＣＵＧＧＡＣＡＵＣＵＧＧＡＣＵＵＡＣＡＡＵＧＣＣＧＡＧＣＵＧＣＵＧＧＵＧＣＵＣＣＵＧＧＡＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＡＣＡＣＵＧＧＡＵＵＡＵＣＡＣＧＡＣＵＣＡＡＡＣＧＵＧＡＡＧＡＡＣＣＵＧＵＡＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＣＧＵＡＡＣＣＡＧＣＵＧＡＡＡＡＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＧＡＡＡＵＣＧＧＣＡＡＵＧＧＣＵＧＵＵＵＣＧＡＡＵＵＵＵＡＣＣＡＣＡＡＧＵＧＵＧＡＵＡＡＵＡＣＣＵＧＵＡＵＧＧＡＧＡＧＣＧＵＵＡＡＧＡＡＣＧＧＧＡＣＵＵＡＣＧＡＣＵＡＣＣＣＡＡＡＡＵＡＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＵＧＡＡＣＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＵＣＧＡＣＧＧＣＧＵＣＡＡＡＣＵＣＧＡＣＵＣＣＡＣＵＡＧＡＡＵＡＵＡＣＣＡＧＡＵＵＣＵＣＧＣＣＡＵＣＵＡＵＡＧＣＡＣＡＧＵＧＧＣＡＵＣＡＡＧＵＣＵＣＧＵＣＣＵＧＧＵＧＧＵＧＵＣＡＣＵＧＧＧＡＧＣＣＡＵＣＡＧＣＵＵＵＵＧＧＡＵＧＵＧＣＡＧＣＡＡＵＧＧＡＵＣＣＣＵＣＣＡＧＵＧＵＡＧＧＡＵＣＵＧＣＡＵＣＵＡＡ（配列番号１２）
である。
ここで使用されたＡ／Ｔａｓｍａｎｉａ／５０３／２０２０抗原ｍＲＮＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列は、
ＡＵＧＡＡＧＡＣＣＡＵＣＡＵＣＧＣＵＣＵＧＵＣＣＵＡＣＡＵＣＣＵＧＵＧＣＣＵＧＧＵＧＵＵＵＧＣＵＣＡＧＡＡＡＡＵＣＣＣＣＧＧＧＡＡＵＧＡＣＡＡＵＵＣＣＡＣＵＧＣＣＡＣＵＣＵＣＵＧＣＣＵＧＧＧＣＣＡＵＣＡＵＧＣＣＧＵＧＣＣＡＡＡＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＧＵＣＡＡＧＡＣＵＡＵＡＡＣＡＡＡＵＧＡＣＣＧＣＡＵＣＧＡＡＧＵＧＡＣＣＡＡＣＧＣＵＡＣＣＧＡＧＣＵＧＧＵＵＣＡＧＡＡＣＡＧＣＡＧＵＡＵＵＧＧＡＧＡＡＡＵＣＵＧＣＧＡＵＵＣＣＣＣＡＣＡＣＣＡＧＡＵＡＣＵＧＧＡＵＧＧＣＧＧＣＡＡＣＵＧＣＡＣＣＣＵＧＡＵＣＧＡＣＧＣＡＣＵＧＣＵＧＧＧＵＧＡＣＣＣＵＣＡＧＵＧＣＧＡＣＧＧＡＵＵＵＣＡＧＡＡＵＡＡＧＧＡＧＵＧＧＧＡＣＣＵＵＵＵＣＧＵＵＧＡＧＣＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＡＵＡＧＣＡＡＣＵＧＣＵＡＣＣＣＧＵＡＣＧＡＣＧＵＧＣＣＧＧＡＵＵＡＣＧＣＣＡＧＵＣＵＵＣＧＡＡＧＣＣＵＧＧＵＣＧＣＡＵＣＣＡＧＣＧＧＧＡＣＡＣＵＧＧＡＧＵＵＵＡＡＧＡＡＵＧＡＧＵＣＣＵＵＵＡＡＵＵＧＧＡＣＡＧＧＣＧＵＧＡＡＧＣＡＧＡＡＣＧＧＧＡＣＵＡＧＣＡＧＣＧＣＡＵＧＣＡＵＵＣＧＧＧＧＣＡＧＵＡＧＣＵＣＡＵＣＣＵＵＣＵＵＵＡＧＣＣＧＡＣＵＧＡＡＣＵＧＧＣＵＧＡＣＣＣＡＣＣＵＣＡＡＣＵＡＣＡＣＡＵＡＣＣＣＣＧＣＡＣＵＧＡＡＵＧＵＧＡＣＵＡＵＧＣＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡＧＵＵＵＧＡＣＡＡＡＣＵＧＵＡＣＡＵＣＵＧＧＧＧＡＧＵＧＣＡＣＣＡＵＣＣＵＡＧＣＡＣＡＧＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＧＡＵＣＡＧＣＣＵＧＵＵＵＧＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＧＡＵＵＡＣＣＧＵＧＵＣＣＡＣＡＡＡＡＣＧＧＵＣＡＣＡＧＣＡＡＧＣＣＧＵＧＡＵＣＣＣＵＡＡＵＡＵＵＧＧＡＵＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＧＡＵＡＡＧＧＧＡＣＡＵＣＣＣＵＡＧＵＣＧＣＡＵＣＡＧＵＡＵＣＵＡＣＵＧＧＡＣＣＡＵＣＧＵＧＡＡＧＣＣＣＧＧＡＧＡＵＡＵＣＵＵＧＣＵＣＡＵＣＡＡＵＡＧＣＡＣＵＧＧＣＡＡＣＣＵＣＡＵＵＧＣＣＣＣＣＡＧＧＧＧＣＵＡＵＵＵＵＡＡＧＡＵＣＡＧＡＡＧＣＧＧＣＡＡＧＵＣＣＡＧＣＡＵＵＡＵＧＣＧＣＡＧＣＧＡＣＧＣＡＣＣＣＡＵＵＧＧＣＡＡＧＵＧＣＡＡＧＵＣＣＧＡＧＵＧＣＡＵＣＡＣＵＣＣＵＡＡＵＧＧＧＵＣＣＡＵＣＣＣＡＡＡＣＧＡＣＡＡＧＣＣＡＵＵＣＣＡＡＡＡＵＧＵＣＡＡＣＡＧＡＡＵＣＡＣＣＵＡＣＧＧＧＧＣＵＵＧＣＣＣＣＣＧＣＵＡＣＧＵＧＡＡＧＣＡＧＡＧＵＡＣＡＣＵＧＡＡＡＣＵＧＧＣＣＡＣＣＧＧＧＡＵＧＣＧＣＡＡＣＧＵＧＣＣＣＧＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣＵＡＧＡＧＧＣＡＵＣＵＵＵＧＧＡＧＣＵＡＵＣＧＣＵＧＧＣＵＵＣＡＵＵＧＡＧＡＡＵＧＧＣＵＧＧＧＡＧＧＧＵＡＵＧＧＵＧＧＡＣＧＧＣＵＧＧＵＡＣＧＧＡＵＵＣＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＡＵＡＧＣＧＡＡＧＧＣＡＧＡＧＧＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＡＣＵＵＧＡＡＧＵＣＣＡＣＣＣＡＧＧＣＣＧＣＣＡＵＵＧＡＵＣＡＧＡＵＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＣＵＧＡＡＵＣＧＧＣＵＵＡＵＵＧＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＣＡＵＣＡＧＡＵＵＧＡＧＡＡＧＧＡＧＵＵＵＡＧＣＧＡＧＧＵＧＧＡＧＧＧＣＣＧＣＧＵＧＣＡＧＧＡＵＣＵＧＧＡＡＡＡＧＵＡＣＧＵＵＧＡＡＧＡＣＡＣＣＡＡＧＡＵＣＧＡＣＣＵＧＵＧＧＵＣＡＵＡＣＡＡＵＧＣＡＧＡＧＣＵＧＣＵＣＧＵＵＧＣＣＣＵＧＧＡＡＡＡＵＣＡＧＣＡＣＡＣＡＡＵＵＧＡＣＣＵＵＡＣＡＧＡＣＵＣＣＧＡＡＡＵＧＡＡＵＡＡＧＣＵＣＵＵＵＧＡＡＡＡＧＡＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＵＧＣＧＣＧＡＧＡＡＣＧＣＣＧＡＧＧＡＵＡＵＧＧＧＧＡＡＣＧＧＵＵＧＵＵＵＵＡＡＧＡＵＣＵＡＣＣＡＣＡＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＣＧＣＣＵＧＣＡＵＵＧＧＧＵＣＣＡＵＣＣＧＡＡＡＵＧＡＡＡＣＡＵＡＣＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＵＧＵＡＵＡＧＡＧＡＵＧＡＧＧＣＣＣＵＧＡＡＣＡＡＣＣＧＡＵＵＣＣＡＧＡＵＵＡＡＧＧＧＡＧＵＣＧＡＧＣＵＧＡＡＧＡＧＵＧＧＣＵＡＵＡＡＧＧＡＣＵＧＧＡＵＣＣＵＧＵＧＧＡＵＣＵＣＡＵＵＣＧＣＣＡＵＧＵＣＡＵＧＣＵＵＣＣＵＵＣＵＧＵＧＵＡＵＵＧＣＵＣＵＧＣＵＣＧＧＣＵＵＣＡＵＣＡＵＧＵＧＧＧＣＵＵＧＣＣＡＧＡＡＡＧＧＣＡＡＵＡＵＣＣＧＧＵＧＣＡＡＣＡＵＣＵＧＣＡＵＣＵＡＡ（配列番号１３）
である。
ここで使用されたＢ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／０２／２０１９抗原ｍＲＮＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列は、
ＡＵＧＡＡＡＧＣＡＡＵＣＡＵＡＧＵＧＣＵＧＣＵＧＡＵＧＧＵＧＧＵＧＡＣＵＡＧＣＡＡＵＧＣＣＧＡＵＣＧＧＡＵＣＵＧＣＡＣＣＧＧＣＡＵＣＡＣＵＵＣＣＡＧＵＡＡＣＡＧＣＣＣＵＣＡＵＧＵＧＧＵＣＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣＡＣＡＧＧＧＣＧＡＧＧＵＧＡＡＣＧＵＧＡＣＣＧＧＡＧＵＧＡＵＵＣＣＡＣＵＧＡＣＡＡＣＵＡＣＡＣＣＡＡＣＧＡＡＧＡＧＵＣＡＣＵＵＣＧＣＣＡＡＣＣＵＧＡＡＧＧＧＣＡＣＣＧＡＡＡＣＡＣＧＡＧＧＣＡＡＧＣＵＣＵＧＣＣＣＣＡＡＧＵＧＵＣＵＧＡＡＵＵＧＣＡＣＣＧＡＣＣＵＧＧＡＣＧＵＣＧＣＵＵＵＧＧＧＣＣＧＣＣＣＵＡＡＡＵＧＵＡＣＣＧＧＣＡＡＡＡＵＡＣＣＵＵＣＣＧＣＣＡＧＡＧＵＧＵＣＣＡＵＣＣＵＧＣＡＣＧＡＧＧＵＧＣＧＣＣＣＣＧＵＧＡＣＣＵＣＣＧＧＧＵＧＵＵＵＵＣＣＣＡＵＡＡＵＧＣＡＣＧＡＣＣＧＣＡＣＵＡＡＡＡＵＣＣＧＣＣＡＧＣＵＧＣＣＣＡＡＵＣＵＵＣＵＧＡＧＧＧＧＧＵＡＣＧＡＡＣＡＵＧＵＣＡＧＧＣＵＧＵＣＣＡＣＵＣＡＣＡＡＣＧＵＧＡＵＣＡＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＧＡＡＧＧＣＣＵＵＡＵＧＡＧＡＵＵＧＧＡＡＣＣＡＧＵＧＧＧＵＣＣＵＧＣＣＣＡＡＡＣＡＵＵＡＣＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＧＧＣＵＵＣＵＵＣＧＣＣＡＣＵＡＵＧＧＣＣＵＧＧＧＣＣＧＵＧＣＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＣＣＣＣＵＧＡＣＡＡＵＵＧＡＡＧＵＣＣＣＵＵＡＣＡＵＣＵＧＣＡＣＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＵＣＡＧＡＵＣＡＣＣＧＵＧＵＧＧＧＧＧＵＵＵＣＡＣＵＣＵＧＡＵＡＡＣＧＡＡＡＣＵＣＡＧＡＵＧＧＣＣＡＡＧＣＵＧＵＡＣＧＧＧＧＡＵＵＣＵＡＡＡＣＣＣＣＡＧＡＡＧＵＵＣＡＣＣＡＧＵＡＧＣＧＣＵＡＡＣＧＧＧＧＵＧＡＣＣＡＣＣＣＡＵＵＡＵＧＵＧＵＣＵＣＡＧＡＵＣＧＧＡＧＧＵＵＵＣＣＣＡＡＡＵＣＡＧＡＣＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＡＣＵＧＣＣＣＣＡＧＵＣＵＧＧＡＡＧＧＡＵＣＧＵＡＧＵＧＧＡＣＵＡＵＡＵＧＧＵＧＣＡＧＡＡＧＡＧＵＧＧＡＡＡＡＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＵＵＡＣＣＵＡＵＣＡＧＣＧＣＧＧＣＡＵＡＣＵＧＣＵＧＣＣＡＣＡＧＡＡＧＧＵＧＵＧＧＵＧＵＧＣＵＵＣＣＧＧＣＡＧＧＵＣＣＡＡＧＧＵＵＡＵＣＡＡＡＧＧＧＵＣＣＣＵＣＣＣＣＣＵＧＡＵＣＧＧＣＧＡＡＧＣＡＧＡＵＵＧＵＣＵＧＣＡＣＧＡＧＡＡＧＵＡＣＧＧＣＧＧＡＣＵＧＡＡＵＡＡＧＡＧＣＡＡＡＣＣＣＵＡＣＵＡＣＡＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＣＧＣＵＡＡＧＧＣＡＡＵＵＧＧＧＡＡＵＵＧＵＣＣＧＡＵＣＵＧＧＧＵＧＡＡＧＡＣＧＣＣＣＣＵＧＡＡＡＣＵＧＧＣＣＡＡＵＧＧＣＡＣＡＡＡＡＵＡＣＣＧＧＣＣＣＣＣＣＧＣＵＡＡＧＣＵＧＣＵＧＡＡＧＧＡＡＣＧＧＧＧＧＵＵＣＵＵＣＧＧＣＧＣＣＡＵＡＧＣＣＧＧＣＵＵＵＣＵＧＧＡＧＧＧＡＧＧＣＵＧＧＧＡＧＧＧＣＡＵＧＡＵＡＧＣＣＧＧＧＵＧＧＣＡＣＧＧＣＵＡＣＡＣＵＵＣＣＣＡＵＧＧＧＧＣＵＣＡＣＧＧＧＧＵＧＧＣＵＧＵＧＧＣＣＧＣＣＧＡＣＣＵＧＡＡＧＵＣＵＡＣＧＣＡＧＧＡＡＧＣＵＡＵＣＡＡＣＡＡＡＡＵＣＡＣＵＡＡＧＡＡＣＣＵＧＡＡＣＡＧＣＣＵＧＵＣＧＧＡＡＵＵＧＧＡＧＧＵＣＡＡＧＡＡＵＣＵＧＣＡＧＣＧＧＣＵＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＡＵＧＧＡＵＧＡＧＣＵＧＣＡＣＡＡＵＧＡＧＡＵＣＣＵＧＧＡＧＣＵＵＧＡＣＧＡＧＡＡＧＧＵＣＧＡＵＧＡＵＣＵＵＣＧＧＧＣＣＧＡＵＡＣＡＡＵＵＡＧＵＡＧＣＣＡＡＡＵＵＧＡＧＵＵＧＧＣＣＧＵＧＣＵＧＣＵＣＡＧＣＡＡＣＧＡＡＧＧＣＡＵＡＡＵＣＡＡＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＡＣＣＵＣＣＵＧＧＣＵＣＵＧＧＡＧＡＧＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＡＡＧＡＵＧＣＵＣＧＧＣＣＣＵＡＧＣＧＣＡＧＵＵＧＡＧＡＵＣＧＧＡＡＡＣＧＧＣＵＧＣＵＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＧＣＡＣＡＡＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＣＣＵＧＣＣＵＧＧＡＣＡＧＧＡＵＣＧＣＧＧＣＡＧＧＡＡＣＡＵＵＣＧＡＣＧＣＵＧＧＧＧＡＡＵＵＣＡＧＣＣＵＣＣＣＣＡＣＣＵＵＣＧＡＣＡＧＣＣＵＧＡＡＣＡＵＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＡＧＵＣＵＧＡＡＵＧＡＵＧＡＣＧＧＡＣＵＧＧＡＵＡＡＣＣＡＵＡＣＣＡＵＣＣＵＧＣＵＧＵＡＣＵＡＣＵＣＵＡＣＣＧＣＵＧＣＵＵＣＣＵＣＣＣＵＧＧＣＣＧＵＧＡＣＡＵＵＧＡＵＧＡＵＣＧＣＡＡＵＣＵＵＵＧＵＧＧＵＵＵＡＵＡＵＧＧＵＧＡＧＣＣＧＡＧＡＣＡＡＣＧＵＣＡＧＵＵＧＣＡＧＵＡＵＣＵＧＣＣＵＵＵＡＡ（配列番号１４）
である。
ここで使用されたＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３抗原ｍＲＮＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列は、
ＡＵＧＡＡＡＧＣＣＡＵＣＡＵＵＧＵＧＣＵＧＣＵＧＡＵＧＧＵＵＧＵＵＡＣＡＡＧＣＡＡＣＧＣＣＧＡＣＣＧＣＡＵＣＵＧＣＡＣＣＧＧＧＡＵＵＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＡＵＡＧＣＣＣＵＣＡＣＧＵＧＧＵＧＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡＣＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＵＧＡＡＣＧＵＧＡＣＣＧＧＣＧＵＧＡＵＵＣＣＡＣＵＧＡＣＡＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＣＵＡＡＡＵＣＵＵＡＣＵＵＵＧＣＡＡＡＣＣＵＧＡＡＡＧＧＧＡＣＡＣＧＧＡＣＣＡＧＡＧＧＡＡＡＧＣＵＧＵＧＣＣＣＵＧＡＵＵＧＣＣＵＧＡＡＵＵＧＣＡＣＡＧＡＣＣＵＧＧＡＣＧＵＧＧＣＣＣＵＧＧＧＣＡＧＡＣＣＡＡＵＧＵＧＣＧＵＧＧＧＣＡＣＵＡＣＡＣＣＡＡＧＣＧＣＣＡＡＧＧＣＣＵＣＣＡＵＣＣＵＣＣＡＵＧＡＧＧＵＧＣＧＧＣＣＣＧＵＧＡＣＵＵＣＵＧＧＡＵＧＵＵＵＣＣＣＣＡＵＵＡＵＧＣＡＣＧＡＣＡＧＡＡＣＣＡＡＧＡＵＵＡＧＡＣＡＧＣＵＧＣＣＡＡＡＣＣＵＧＣＵＣＣＧＣＧＧＣＵＡＣＧＡＧＡＡＡＡＵＵＣＧＣＣＵＧＵＣＵＡＣＡＣＡＧＡＡＵＧＵＧＡＵＣＧＡＣＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＣＵＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＡＵＡＣＡＧＡＣＵＧＧＧＧＡＣＵＵＣＵＧＧＣＡＧＣＵＧＣＣＣＵＡＡＣＧＣＣＡＣＣＵＣＵＡＡＧＡＵＣＧＧＧＵＵＣＵＵＣＧＣＡＡＣＣＡＵＧＧＣＵＵＧＧＧＣＣＧＵＧＣＣＵＡＡＡＧＡＣＡＡＵＵＡＣＡＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣＣＡＡＵＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＵＣＧＡＧＧＵＧＣＣＡＵＡＵＡＵＵＵＧＣＡＣＡＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＣＣＡＧＡＵＣＡＣＵＧＵＧＵＧＧＧＧＣＵＵＵＣＡＵＡＧＣＧＡＵＡＡＵＡＡＧＡＣＵＣＡＧＡＵＧＡＡＧＵＣＵＣＵＣＵＡＣＧＧＣＧＡＣＵＣＵＡＡＣＣＣＵＣＡＧＡＡＧＵＵＣＡＣＣＵＣＣＵＣＵＧＣＣＡＡＣＧＧＧＧＵＧＡＣＡＡＣＡＣＡＣＵＡＣＧＵＧＵＣＣＣＡＧＡＵＣＧＧＧＧＡＣＵＵＵＣＣＵＧＡＣＣＡＧＡＣＣＧＡＧＧＡＵＧＧＡＧＧＡＣＵＧＣＣＵＣＡＧＵＣＵＧＧＡＣＧＣＡＵＣＧＵＧＧＵＧＧＡＣＵＡＵＡＵＧＡＵＧＣＡＧＡＡＧＣＣＵＧＧＧＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＣＵＡＵＣＧＵＧＵＡＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＧＵＧＣＵＧＣＵＧＣＣＣＣＡＡＡＡＧＧＵＧＵＧＧＵＧＵＧＣＣＵＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＧＵＧＡＵＵＡＡＧＧＧＡＵＣＣＣＵＧＣＣＵＣＵＧＡＵＵＧＧＧＧＡＧＧＣＣＧＡＵＵＧＣＣＵＧＣＡＵＧＡＡＧＡＧＵＡＵＧＧＡＧＧＧＣＵＧＡＡＣＡＡＧＵＣＣＡＡＧＣＣＡＵＡＣＵＡＵＡＣＡＧＧＡＡＡＧＣＡＣＧＣＡＡＡＡＧＣＣＡＵＣＧＧＣＡＡＣＵＧＵＣＣＣＡＵＣＵＧＧＧＵＣＡＡＡＡＣＵＣＣＵＣＵＧＡＡＧＣＵＧＧＣＣＡＡＣＧＧＣＡＣＣＡＡＡＵＡＣＣＧＣＣＣＵＣＣＡＧＣＣＡＡＧＣＵＧＣＵＧＡＡＡＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＵＵＣＧＧＣＧＣＣＡＵＵＧＣＡＧＧＧＵＵＵＣＵＧＧＡＡＧＧＡＧＧＣＵＧＧＧＡＧＧＧＣＡＵＧＡＵＵＧＣＵＧＧＡＵＧＧＣＡＣＧＧＡＵＡＵＡＣＣＵＣＵＣＡＣＧＧＣＧＣＵＣＡＣＧＧＧＧＵＧＧＣＣＧＵＧＧＣＣＧＣＣＧＡＵＣＵＧＡＡＧＵＣＣＡＣＡＣＡＧＧＡＧＧＣＡＡＵＵＡＡＣＡＡＧＡＵＣＡＣＣＡＡＧＡＡＵＣＵＧＡＡＵＵＣＡＣＵＧＵＣＣＧＡＧＣＵＣＧＡＡＧＵＧＡＡＡＡＡＣＣＵＧＣＡＧＣＧＣＣＵＧＵＣＣＧＧＣＧＣＣＡＵＧＧＡＣＧＡＧＣＵＧＣＡＣＡＡＵＧＡＡＡＵＣＣＵＧＧＡＧＣＵＧＧＡＣＧＡＧＡＡＧＧＵＧＧＡＣＧＡＣＣＵＧＣＧＧＧＣＵＧＡＣＡＣＵＡＵＣＡＧＣＡＧＣＣＡＧＡＵＣＧＡＧＣＵＧＧＣＡＧＵＧＣＵＧＣＵＧＡＧＣＡＡＵＧＡＧＧＧＣＡＵＣＡＵＣＡＡＣＵＣＡＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＡＣＣＵＣＣＵＧＧＣＡＣＵＧＧＡＡＡＧＧＡＡＡＣＵＣＡＡＧＡＡＧＡＵＧＣＵＧＧＧＣＣＣＣＵＣＣＧＣＡＧＵＧＧＡＣＡＵＵＧＧＧＡＡＣＧＧＣＵＧＵＵＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＧＣＡＵＡＡＧＵＧＵＡＡＣＣＡＧＡＣＵＵＧＵＣＵＧＧＡＵＡＧＧＡＵＣＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＣＣＵＵＣＡＡＣＧＣＣＧＧＣＧＡＡＵＵＵＵＣＵＣＵＧＣＣＡＡＣＡＵＵＵＧＡＣＵＣＣＣＵＧＡＡＣＡＵＣＡＣＡＧＣＵＧＣＡＵＣＣＣＵＧＡＡＣＧＡＣＧＡＣＧＧＡＣＵＧＧＡＣＡＡＵＣＡＣＡＣＣＡＵＣＣＵＧＣＵＧＵＡＣＵＡＣＵＣＵＡＣＵＧＣＣＧＣＵＡＧＣＵＣＣＣＵＧＧＣＣＧＵＧＡＣＣＣＵＧＡＵＧＣＵＧＧＣＣＡＵＣＵＵＣＡＵＣＧＵＧＵＡＣＡＵＧＧＵＵＵＣＣＡＧＧＧＡＵＡＡＣＧＵＧＵＣＵＵＧＵＡＧＣＡＵＵＵＧＣＣＵＧＵＡＡ（配列番号１５）
である。
結果
ｍＲＮＡ抗原製造、特徴付け、および発現
種々のインフルエンザ株についての完全長コドン最適化ＨＡおよびＮＡをコードするｍＲＮＡは、非修飾リボヌクレオチドを使用して酵素的に合成した。すべてのｍＲＮＡ製剤は＞９５％の５’Ｃａｐ１を有し、キャピラリー電気泳動上で単一の均質なピークを示した。ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤は、制御された条件下、固定された比で種々の脂質成分をｍＲＮＡと混合することにより製造した。表５に示されるように、すべてのｍＲＮＡ－ＬＮＰは、＞９５％カプセル化を示し、均一な流体力学半径は９５～１０５ｎｍの範囲に及び、多分散指数（ＰＤＩ）は０．０６０～０．１３６であった（表５）。
Figure 2023550600000015
クライオ電子顕微鏡（クライオＴＥＭ）のＣＡ０９ ＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ画像は、多層状内部コア構造を有する均一な球状粒子を示した。フーリエ変換でさらに分析される固体コア構造の層状性は、層間に３．７ｎｍの周期性を示した。顕微鏡写真で見られる粒子の均一な形態は、ＬＮＰが適切に集合している均質なＬＮＰ製剤であることを示している。
抗原発現は、ヒト骨格筋細胞（ＨｓｋＭＣ）にＣＡ０９ ＨＡ、Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ、Ｓｉｎｇ１６ ＮＡ、またはＭｉｃｈ１５ ＮＡの非カプセル化ｍＲＮＡ構築物を一過性にトランスフェクトすることによりフローサイトメトリーで確かめ、分析のためにタンパク質特異的抗体で染色した。ＨｓｋＭＣからの高レベルのＨＡおよびＮＡ発現が観察され、筋肉細胞での発現による天然型のＨＡ三量体およびＮＡ四量体の適切な集合および輸送が確かめられた。発現されたＨＡおよびＮＡタンパク質の細胞内局在を研究するため、ＨｅＬａ細胞に二価Ｈ３Ｎ２ ＬＮＰをトランスフェクトし、タンパク質を免疫染色および共焦点顕微鏡により可視化した。透過処理した細胞を対応するタンパク質および小胞体（ＥＲ）マーカーであるカルネキシンに対する抗体で染色すると、ＮＡシグナルはＥＲにおいて強い共局在（約９０％）を示したが、ＨＡはＥＲと中程度に共局在している（２５％）ことが分かった。これは初期のＮＡおよびＨＡタンパク質が集合のためにＥＲに移動されているという理解（Ｄｏｕら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１８）９：１５８１頁）と一致している。
ＬＮＰによるｍＲＮＡ送達の効率および最適製剤化パラメータの選択は、レポーターｍＲＮＡ発現を使用して評価した（Ｔｈｅｓｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１５）２３（１）：Ｓ５５）。非修飾ＦＦ－ＬＮＰ製剤の０．０５、０．１、１、５μｇいずれかの単回用量をマウスの筋肉内（ＩＭ）に投与した。ルシフェラーゼ活性は、平均生物発光により測定されるが、すべての用量で注射後６時間目にピークに達し７２時間を過ぎても検出可能であるｍＲＮＡ構築物からの持続する発現を示していた（図１１、パネル（ａ））。高レベルのｍＲＮＡ媒介タンパク質発現は、マウスで０．１μｇおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）で１０μｇの単回用量でｈＥＰＯを用いてさらに検証した。研究は、標準ＬＮＰ Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ２５製剤を対照として使用して、ＬＮＰを比較することを意図していた。ＥＬＩＳＡにより定量化される血清ｈＥＰＯは、６時間目に最大の発現を示し、ｈＥＰＯ－ＬＮＰを用いて発現されたエリスロポエチンはｈＥＰＯ－ＭＣ３と比べておおよそ１２倍であった（図１１、パネル（ｃ））。ｈＥＰＯ－ＬＮＰとｈＥＰＯ－ＭＣ３の両方がＮＨＰにおいて類似する発現動態を示し、６時間目～７２時間目で検出可能であった（図１１、パネル（ｄ））。この結果により、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方での発現のためのｍＲＮＡの効率的送達に本ＬＮＰ製剤が有用であることが確かめられた。
マウスにおけるＨＡ（Ｈ１、Ｈ３）およびＮＡ（Ｎ１、Ｎ２）ｍＲＮＡ－ＬＮＰの免疫原性
博物誌およびワクチン研究は、インフルエンザＨＡおよびＮＡに対する抗体が抗ウイルス機能を有し、両抗原が効果的なインフルエンザワクチンにとって重要であると見なされることを示してきた（Ｋｒａｍｍｅｒら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１９）１９（６）：３８３～９７頁）。非修飾ＣＡ０９ ＨＡ－ＬＮＰおよびＳｉｎｇ１６ ＨＡ－ＬＮＰ ｍＲＮＡワクチンをＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）において、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ ２、０．４、０．０８、または０．０１６μｇが４週間開けたスケジュールで投与される２回投与レジメンで評価した。同じ株の組換えＨＡ（ｒＨＡ）抗原を使用して、ＥＬＩＳＡにおいて全ＩｇＧ応答を評価した。ＨＡ特異的抗体は１回投与後すべての群で検出されたが、力価は２回目の投与後の４２日目にピークに達した（図１２）。機能的抗体を測定するため、相同株のＣＡ０９とＳｉｎｇ１６に対して赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）応答を評価した。１回目の投与後のＨＡＩ力価は、２μｇ用量のＣＡ０９－ＬＮＰおよびＳｉｎｇ１６－ＬＮＰ処置群について観察でき、２８日目にそれぞれＧＭＴ１６０およびＧＭＴ７０であったけれども、ＨＡＩ力価のより重大な増加は２回目の投与後に観察された。４２日目、ＧＭＴ力価は、ＣＡ０９－ＨＡ－ＬＮＰでは０．０１６μｇおよび０．４μｇ群でそれぞれ８０および２２００であり、Ｓｉｎｇ １６ ＨＡ－ＬＮＰ群では０．０１６μｇおよび０．４μｇ群でそれぞれ１４および１００であった（図１３）。
同様に、抗ＮＡ応答の試験では、マウスを、２、０．４、０．０８、または０．０１６μｇのＳｉｎｇ１６ ＮＡ－ＬＮＰまたはＭｉｃｈ１５ ＮＡ－ＬＮＰで免疫した。組換えＮＡ抗原を用いたＥＬＩＳＡを行って、Ｍｉｃｈ１５ ＮＡ－ＬＮＰまたはＳｉｎｇ１６ ＮＡ－ＬＮＰ製剤により誘導される全ＩｇＧ応答を評価した。動物は１回投与後高い抗体結合応答を展開し、２回目の投与後４２日目のＮＡ結合抗体が著しく増加した（図１４）。酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）は、Ｈ６Ｎ１またはＨ６Ｎ２キメラウイルスに対するノイラミニダーゼ阻害（ＮＡＩ）活性についての機能的抗体価の代用物として使用した。ワクチンの２回投与は１回投与と比べた場合、機能的抗体応答を実質的に増やしたが、０．０１６μｇのＭｉｃｈ１５ ＮＡ－ＬＮＰおよびＳｉｎｇ１６ ＮＡ－ＬＮＰという低用量でもそれぞれＧＭＴ８００およびＧＭＴ６０を有する力強いＮＡＩ力価が１回投与後２８日目に記録された。４２日目、Ｓｉｎｇ１６ ＮＡ－ＬＮＰ群では、０．４μｇと０．０１６μｇの間のＧＭＴ力価はそれぞれ９００および１０２００であり、用量依存性応答を示しており、Ｍｉｃｈ１５ ＮＡ－ＬＮＰの場合、力価はＵＬＯＱを超えていた（図１５）。
マウスでのウイルスチャレンジからの防御
マウスインフルエンザウイルスチャレンジモデルでのｍＲＮＡワクチンの効能を試験するため、我々は、０週目と４週目にＣＡ０９ ＨＡ－ＬＮＰ ０．４μｇを２回投与のＬＮＰ希釈バッファーでの陰性対照群と一緒にＢＡＬＢ／ｃマウスにＩＭ接種した。研究日０、１４、２８、４２、５６、９２、および１０７のワクチン群血清試料のＨＡＩ力価は、５６日目および９２日目にそれぞれ１６６０および１：８３０のＧＭＴを有するロバストな免疫応答を示した（図１６Ａ）。９３日目、すべてのマウスに、ＣＡ０９に相同なＢｅｌｇｉｕｍ０９ウイルスを、５０％致死結果を引き起こすことができる４倍用量（４×ＬＤ５０）で鼻腔内にチャレンジした。ワクチン群マウスすべてがチャレンジを生き残り、死亡率はなく、５％未満の一時的体重減少を特徴とするある軽い病的症状があった（図１６Ｂ）。しかし、希釈対照群のマウスは有意な急速な体重減少を被り、これにより９日目までに高い死亡率（９０％）をもたらした。これらの結果により、致死マウスインフルエンザチャレンジモデルでのＨＡベースのＭＲＴ製剤の高い効能が実証された。
ＮＡベースのＭＲＴワクチンの防御的効能を評価するため、我々は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて類似のチャレンジ実験を行った。Ｍｉｃｈ１５ ＮＡ－ＬＮＰワクチンはナイーブマウスにおいて１回免疫化後ロバストなＮＡＩ力価を誘発したので（図１６Ａ）、我々は、４週間の間隔にわたりＭｉｃｈ１５ ＮＡ－ＬＮＰ０．４または０．０１６μｇを投与する１回または２回の投与レジメンを評価した。対照群は同じレジメンでワクチン接種され、ｈＥＰＯ－ＬＮＰ０．６μｇまたは希釈バッファーを受けた。１回投与後にロバストなＮＡＩ力価が観察され、Ｍｉｃｈ１５ ＮＡ－ＬＮＰの０．４μｇで１４，０００ＮＡＩ、０．０１６μｇで１，８００ＮＡＩのＧＭＴが２８日目に記録された（図１７Ａ）。４２日目の２回目の免疫化後、ＮＡＩ力価は４μｇで１０８，０００ＮＡＩ、０．０１６μｇ群で３７，０００ＮＡＩまで上昇した。ワクチン接種レジメン後１２週間を超えた後、すべての群に４×ＬＤ５０のＢｅｌｇｉｕｍ０９ Ｈ１Ｎ１ウイルスでチャレンジした。処置群による基準線からの経時的な個々の体重変化は図１７Ｂにグラフで示されている。２つの対照群のマウスはすべて有意な病的状態を被り、すべての動物は、感染の８日後までに＞２０％の体重減少のせいで安楽死させなければならなかった。注目すべきことに、ワクチン群の１頭を除くすべての動物が１回投与０．０１６μｇ群においてチャレンジを生き延び、わずか０．０１６μｇのＭｉｃｈ１５ ＮＡ－ＬＮＰの１回投与後でも、死亡に対する高い防御的効能を示していた。もっと高い用量（０．４μｇ）は、全体的な高い防御を示したが、ＨＡ免疫化とは対照的に、ＮＡワクチン接種は体重減少を防御するには十分ではなかった。なぜならば、ワクチン接種された動物は最初の体重の１０％の中位な体重減少を示したからであり、これは他のＮＡワクチンについて報告された知見と一致していた。体重回復はワクチン接種された群について観察され、基準線と比べて低用量で２．７％、もっと高い用量で４．８％の体重増の平均最終体重変化を生じた。全体では、結果により、１回低用量ＭＲＴ ＮＡ－ＬＮＰワクチン接種が、インフルエンザＮＡ活性をブロックするために測定可能でありマウスにおいて致死チャレンジに対して防御するのに十分な機能的抗体を誘発できることが実証された。
ＮＨＰにおけるＨＡ（Ｈ３）ｍＲＮＡ－ＬＮＰの免疫原性
ＮＨＰにおいてｍＲＮＡ－ＬＮＰの免疫原性を評価するため、１５、４５、１３５、および２５０μｇのＳｉｎｇ１６ ＨＡ－ＬＮＰを取り扱う用量範囲研究をＮＨＰで実施した。１回目の免疫化後、ワクチン接種されたＮＨＰはすべてＥＬＩＳＡに言及されている通り、組換えＨＡタンパク質に反応性の抗体を発現させた（図１８）。力価のさらなるブーストが２回目の投与後に観察された。驚くべきことに、１５μｇ用量が誘導したＥＬＩＳＡ力価は、１３５μｇ用量レベルの１／１．８に過ぎず（９５％ＣＩ １．０、３．６）、用量飽和が１５μｇレベルに近いことを示唆していた。ロバストなＨＡＩ抗体は４２日目にすべての用量群において誘導され、記録されたＧＭＴは、１５μｇでは４００、４５μｇでは７００、１３５μｇでは９００、および２５０μｇでは５７０であった。４２日目、９５％ＣＩを有するＧＭＴ力価の増加倍率は、１３５μｇ～１５μｇで２．２倍（１．０；５．０）であり、１３５μｇ～４５μｇ処置群で１．３倍（０．６；２．８）であり、用量が増えるとともに力価も高くなる傾向が観察されたにもかかわらず、群間の差は極小であることを示していた（図１９Ａ）。マイクロ中和（ＭＮ）アッセイにより評価される中和力（図１９Ｂ）は、より用量効果に向かう傾向を示し、２８日目に１５μｇでは４０、４５μｇでは１８０、１３５μｇでは３００のＧＭＴであった。
動物モデルにおいてＴ細胞が、ウイルス負荷を減らし疾患重症度を制限するのに効果的であることが明らかにされているので（Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００８）２６（４）：Ｄ４１～Ｄ４４；Ｓｒｉｄｈａｒら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１３）１９（１０）：１３０５～１２頁；Ｓｒｉｄｈａｒら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１６）７：１９５頁）、我々は、Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ－ＬＮＰ４５、１３５、２５０μｇをまたは組換えＨＡ４５μｇをワクチン接種されたＮＨＰにおいてリコールＴ細胞を評価した。４２日目に収集されたＰＢＭＣは、Ｓｉｎｇ１６ ＨＡの全配列に及ぶプールされたオーバーラッピングペプチドでのリコール刺激を用いた、ＩＦＮ－γ（Ｔｈ１サイトカイン）およびＩＬ－１３（Ｔｈ２サイトカイン）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて評価した。２５０μｇ群の１頭を除くすべてのワクチン接種された動物がＩＦＮ－γ分泌細胞を発現し、ＰＢＭＣ１００万個当たり２８～１３２８個のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の範囲に及んだ（図２０Ａ）。注目すべきことに、用量応答は観察されず、動物の低いほうと高いほうの用量レベル群はＩＦＮ－γ分泌細胞の匹敵する出現頻度を示した。これとは対照的に、組換えＳｉｎｇ１６ ＨＡタンパク質で免疫された対照群のすべての動物は、ＩＦＮ－γ産生細胞が存在しないことを示した。ＩＬ－１３サイトカイン分泌細胞の存在は、試験したすべての群において検出されなかったまたは非常に低かった（図２０Ｂ）。データは、Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ－ＬＮＰがＮＨＰにおいて強力なＴｈ１偏向細胞応答を誘導したことを示唆しており、これは、現在開発中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン、ＭＲＴ５５００を用いて見られる細胞応答に匹敵する（Ｋａｌｎｉｎら、上記）。
Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ－ＬＮＰを用いた免疫化後にＮＨＰにおいてメモリーＢ細胞（ＭＢＣ）の出現頻度を調べるため、体液性免疫記憶の読み出し情報として抗原特異的ＭＢＣを定量化するＥＬＩＳＰＯＴアッセイが開発された。１８０日目、ＰＢＭＣは、Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ４５μｇもしくは１５μｇの製剤を用いてまたは４５μｇ用量でのコンパレータとしての組換えＨＡを用いて免疫されたＮＨＰから収集された。メモリーＢ細胞を抗体分泌細胞（ＡＳＣ）まで動かすように最適化されているＰＢＭＣの４日ポリクローナル刺激を実施し、刺激されたＰＢＭＣを抗原特異的ＥＬＩＳＰＯＴに蒔き、そこでは抗原特異的ＡＳＣの出現頻度を決定することができた。次に、抗原特異的メモリーＢ細胞は全ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞のパーセンテージとして定量化した。抗原特異的メモリーＢ細胞はすべての動物で検出され、その出現頻度は、４５μｇ用量群では１～５％、１５μｇ用量群では０．３～１．５％の範囲に及んだ。ｒＨＡ免疫化動物では、メモリーＢ細胞応答は著しく低いと思われた。なぜならば、抗原特異的メモリーＢ細胞は６頭の動物のうち５頭で検出不能であったからである（図２１）。Ｓｉｎｇ１６ ＨＡ－ＬＮＰは、他のｍＲＮＡワクチン同様に、集団の免疫を延ばす見込みがある抗ＨＡ特異的メモリーＢ細胞の集団を誘発すると結論付けられた（Ｌｉｎｄｇｒｅｎら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１９）１０：６１４頁）。
多価インフルエンザウイルス抗原
ｍＲＮＡ－ＬＮＰプラットホームの利点は、複数のｍＲＮＡ抗原構築物に対するＬＮＰカプセル化の柔軟性である。しかし、抗原性干渉という懸念に取り組むためには、この潜在力は試験する必要がある。インフルエンザ抗原の組合せを調べるため、Ｈ３Ｈ１、Ｈ３Ｎ２、またはＮ１Ｎ２組合せでそれぞれのｍＲＮＡを０．２μｇ含有する二価製剤として、またはそれぞれの対応する抗原０．２μｇを含有する一価で、共カプセル化されたＨＡとＮＡ ｍＲＮＡをＬＮＰに製剤化した。これらの製剤をマウスに投与して、個々の抗原の機能的力価を二価対一価製剤で比較することにより、免疫原性に対する任意の抗原干渉を判定した（図２２、パネル（ａ）～（ｃ）および表６）。
Figure 2023550600000016
Ｈ１Ｈ３コンボでは、共カプセル化ワクチンと別々に投与されるワクチンの間では、ＨＡＩ力価については時点に関わらず統計的有意差（ｐ＝０．２５８４）は観察されず、Ｈ３力価については４２日目に有意差（ｐ＝０．８３８９）は観察されなかった。Ｈ３Ｎ２コンボでは、ワクチンのＮＡ成分はＨＡ成分と組み合わせて高い中和抗体を誘発し、ＨＡ優勢がないことを実証した。共カプセル化ワクチンと別々に投与されるワクチンの間では、Ｈ３力価については時点に関わらず統計的有意差（ｐ＝０．２９６０）は観察されず、Ｎ２力価については４２日目に有意差（ｐ＝０．０９０４）は観察されなかった。同様に、Ｎ１Ｎ２コンボではＮ２について統計的有意差（ｐ＝０．３８９９）はなかった。共カプセル化ワクチンと別々に投与されるワクチンについての４２日目のＮ１力価は、定量限界を超えていた。したがって、Ｎ２Ｎ１、Ｈ３Ｈ１、またはＨ３Ｎ２の組合せは、別々に製剤化された個々のＬＮＰに等価な抗体価を生み出した。
共カプセル化Ｈ１、Ｎ１、Ｈ３、および／またはＮ２ ｍＲＮＡの四価製剤をさらに調べた。これらの製剤は、それぞれのインフルエンザ抗原ｍＲＮＡ２．５μｇおよび組合せで必要な場合は非コードｍＲＮＡ（ｎｃ ｍＲＮＡ）の充填量で構成される全部で１０μｇでＮＨＰにおいて試験し、四価（Ｈ１Ｎ１Ｈ３Ｎ２）、二価（Ｈ１Ｎ１またはＨ３Ｎ２）、または一価（Ｈ１、Ｈ３、Ｎ１、またはＮ２）ＬＮＰを生じた（表７）。
Figure 2023550600000017
Ｈ１もしくはＨ３に対するＨＡＩ力価、またはＮ１もしくはＮ２に対するＮＡＩ力価を、一価製剤対二価または四価製剤の間で比較した（図２３）。４２日目、四価群のＨ１に対するＨＡＩ力価は、Ｈ１一価群（ｐ＝０．９０５４、ｔ－検定、独立検定、両側検定）またはＨ１Ｎ１二価群（ｐ＝０．８００２）の力価と分析した場合、匹敵していた。同様に、四価群のＨ３ ＨＡＩ力価は、Ｈ３一価群（ｐ＝０．２５０４）またはＨ３Ｎ２二価群（ｐ＝０．５８９４）と分析した場合、匹敵していた。Ｎ１に対するＮＡＩ力価は、Ｎ１一価ｍＲＮＡまたはＨ１Ｎ１二価ｍＲＮＡまたは四価Ｈ１Ｎ１Ｈ３Ｎ２ ｍＲＮＡ製剤をワクチン接種された動物の群ではほとんど同一であった。同様に、Ｎ２一価ｍＲＮＡ（ｐ＝０．８４８５）またはＨ３Ｎ２二価ｍＲＮＡ（０．４５４５）と四価Ｈ１Ｎ１Ｈ３Ｎ２ ｍＲＮＡ製剤の間でＮ２ ＮＡＩ力価に差はなかった。
全体では、これらの知見は、この用量レベルでのＨＡ／ＮＡ ｍＲＮＡ－ＬＮＰの共カプセル化ワクチンまたは組合せ多価ワクチンが、抗原干渉の懸念もなく４種の抗原すべてを送達でき、すべての抗原が、これらの抗原が単独で送達された場合の製剤中と同じくらい免疫原性であったことを示している。
追加のＬＮＰ製剤
ｍＲＮＡワクチン用の追加のＬＮＰ製剤を製造し、脂質Ｃ（カチオン性脂質ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１０－ＤＳ－３－Ｅ１８－１を含有する）、脂質Ｄ（カチオン性脂質ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０を含有する）、および脂質Ｅ（カチオン性脂質ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－３－Ｅ１４を含有する）と名付けた。ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）ｍＲＮＡはテストｍＲＮＡとして使用した。ｈＥＰＯの発現は、ＬＮＰを注射したマウスから採取した試料からＥＬＩＳＡにより測定した。試料は、注射の６時間、２４時間、４８時間、および７２時間後に採取した。図２４に示されるように、ｈＥＰＯ発現は、カチオン性脂質ＭＣ３を含有する対照ＬＮＰ製剤と比べて、ＬＮＰ製剤脂質Ａ、脂質Ｂ、脂質Ｃ、脂質Ｄ、および脂質Ｅではすべての時点で、一貫して高かった。
下の表８は、ＭＣ３カチオン性脂質を含有する対照ＬＮＰと比べた結果をまとめている。
Figure 2023550600000018
次に、同じｈＥＰＯ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤を非ヒト霊長類（ＮＨＰ）で試験した。試料は、注射後の６時間、４８時間、および９６時間目に採取した。図２５に示されるように、それぞれのＬＮＰ製剤は、ＭＣ３対照製剤に匹敵するレベルのｈＥＰＯを産生した。
インフルエンザＨＡコードｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤もＮＨＰで試験した。ＮＨＰは筋肉内注射により１０μｇでＬＮＰ製剤を投与し、試料は注射後２８日および４２日目に採取した。ＨＡＩ力価は上記の通りに測定した。図２６に示されるように、それぞれのＬＮＰ製剤は、ＭＣ３対照製剤に匹敵するまたはそれよりも高いＨＡＩ力価を生じた。
図２６に示されるのと同じ実験を実施し、ＨＡＩ力価をＣａｌ０９ Ｈ１インフルエンザ抗原を用いて測定した。図２７に示されるように、それぞれのＬＮＰ製剤は、ＭＣ３対照製剤に匹敵するまたはそれよりも高いＨＡＩ力価を生じた。
図２８に示されるように、Ｓｉｎｇ１６ Ｈ３抗原を用いたＨＡＩ力価は、ＬＮＰ製剤脂質Ｃおよび脂質Ｄでは上昇していた。
呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質コードｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤
ＬＮＰ中の異なるカチオン性脂質の効果を、ＬＮＰカプセル化ＲＳＶ Ｆタンパク質ｍＲＮＡについて試験した。脂質Ａ、脂質Ｂ、脂質Ｃ、脂質Ｄ、および脂質ＥのＬＮＰ製剤を試験した。それぞれのＬＮＰは、５種のカチオン性脂質のうちの１つ４０％、リン脂質ＤＯＰＥ３０％、ペグ化脂質ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を１．５％、およびコレステロール２８．５％で構成されていた。カチオン性脂質ＭＣ３を有するＬＮＰも使用され、工業ベンチマークと見なされた（Ｊａｙａｒａｍａｎら、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ．５１：８５２９～３３頁．２０１２年）。
試験されたＦタンパク質はＦＤ３と名付けられ、融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質と一致する。ＦＤ３のアミノ酸配列は下に列挙されている。
ＦＤ３
ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＫＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＮＫＣＮＧＴＤＡＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＧＳＧＮＶＧＬＧＧＡＩＡＳＧＶＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＳＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＦＫＶＬＤＬＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＬＮＫＱＳＣＳＩＳＮＰＥＴＶＩＥＦＱＱＫＮＮＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＶＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＮＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＬＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＴＫＮＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＮＶＳＦＦＰＱＡＥＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＲＴＬＰＳＥＶＮＬＣＮＶＤＩＦＮＰＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＶＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＱＥＧＫＳＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＦＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＬＩＮＱＳＬＡＦＩＮＱＳＤＥＬＬＨＮＶＮＡＧＫＳＴＴＮＩＭＩＴＴＩＩＩＶＩＩＶＩＬＬＳＬＩＡＶＧＬＬＬＹＣＫＡＲＳＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号１６）
本明細書に記載されるｍＲＮＡ分子は、ＲＳＶ Ｆタンパク質抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、少なくとも１つの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１つの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列を含む。ｍＲＮＡは、以下の構造：
Figure 2023550600000019
 を有する５’キャップをさらに含む。
ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするｍＲＮＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の核酸配列は下に列挙されている。
ＦＤ３ ｍＲＮＡ ＯＲＦ：
ＡＵＧＧＡＡＣＵＧＣＵＧＡＵＣＣＵＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＧＣＡＡＵＣＡＣＣＡＣＣＡＵＵＣＵＣＡＣＣＧＣＵＧＵＧＡＣＣＵＵＣＵＧＣＵＵＣＧＣＡＵＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＣＡＵＣＡＣＵＧＡＡＧＡＧＵＵＵＵＡＣＣＡＧＡＧＣＡＣＵＵＧＣＡＧＣＧＣＧＧＵＧＵＣＡＡＡＧＧＧＵＵＡＣＣＵＵＵＣＣＧＣＡＣＵＧＣＧＧＡＣＣＧＧＡＵＧＧＵＡＣＡＣＵＵＣＣＧＵＧＡＵＣＡＣＣＡＵＵＧＡＧＣＵＣＡＧＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＧＡＡＡＡＣＡＡＧＵＧＣＡＡＵＧＧＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＡＡＧＧＵＣＡＡＧＣＵＧＡＵＣＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＵＧＧＡＣＡＡＧＵＡＣＡＡＧＡＡＣＧＣＣＧＵＧＡＣＡＧＡＡＵＵＧＣＡＧＣＵＣＣＵＧＡＵＧＧＧＡＵＣＣＧＧＡＡＡＣＧＵＣＧＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＵＣＧＣＧＡＧＵＧＧＡＧＵＧＧＣＵＧＵＧＵＣＣＡＡＧＧＵＣＵＵＧＣＡＣＣＵＣＧＡＧＧＧＡＧＡＡＧＵＧＡＡＣＡＡＧＡＵＣＡＡＧＵＣＣＧＣＧＣＵＧＣＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＣＡＡＧＧＣＣＧＵＧＧＵＧＵＣＣＣＵＧＵＣＵＡＡＣＧＧＣＧＵＣＡＧＣＧＵＧＣＵＧＡＣＧＵＵＣＡＡＧＧＵＣＣＵＧＧＡＣＣＵＧＡＡＧＡＡＵＵＡＣＡＵＵＧＡＣＡＡＧＣＡＧＣＵＧＣＵＧＣＣＣＡＵＣＣＵＣＡＡＣＡＡＧＣＡＡＵＣＣＵＧＣＵＣＣＡＵＣＵＣＣＡＡＣＣＣＣＧＡＡＡＣＣＧＵＧＡＵＣＧＡＧＵＵＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＧＣＣＵＧＣＵＧＧＡＡＡＵＵＡＣＵＣＧＣＧＡＧＵＵＣＵＣＵＧＵＧＡＡＵＧＣＣＧＧＣＧＵＧＡＣＣＡＣＣＣＣＵＧＵＧＵＣＣＡＣＣＵＡＣＡＵＧＣＵＧＡＣＣＡＡＣＵＣＣＧＡＧＣＵＵＣＵＣＵＣＣＣＵＵＡＵＣＡＡＵＧＡＣＡＵＧＣＣＵＡＵＣＡＣＧＡＡＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＵＧＡＵＧＵＣＧＡＡＣＡＡＣＧＵＧＣＡＧＡＵＵＧＵＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＵＣＡＵＡＣＡＧＣＡＵＣＡＵＧＵＣＧＡＵＣＡＵＣＡＡＧＧＡＡＧＡＡＧＵＧＣＵＧＧＣＧＵＡＣＧＵＧＧＵＧＣＡＡＣＵＣＣＣＧＣＵＧＵＡＣＧＧＣＧＵＣＡＵＣＧＡＵＡＣＣＣＣＧＵＧＣＵＧＧＡＡＧＣＵＧＣＡＣＡＣＣＵＣＧＣＣＵＵＵＧＵＧＵＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＧＧＡＵＣＣＡＡＣＡＵＣＵＧＣＵＵＡＡＣＣＣＧＧＡＣＵＧＡＵＣＧＧＧＧＵＵＧＧＵＡＣＵＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＣＧＧＧＡＡＵＧＵＵＵＣＧＵＵＣＵＵＣＣＣＡＣＡＡＧＣＣＧＡＧＡＣＵＵＧＵＡＡＡＧＵＧＣＡＧＵＣＡＡＡＣＡＧＡＧＵＧＵＵＣＵＧＵＧＡＣＡＣＣＡＵＧＡＡＣＵＣＧＡＧＡＡＣＣＣＵＧＣＣＣＡＧＣＧＡＡＧＵＧＡＡＣＣＵＧＵＧＵＡＡＣＧＵＣＧＡＣＡＵＣＵＵＵＡＡＣＣＣＡＡＡＡＵＡＣＧＡＵＵＧＣＡＡＧＡＵＵＡＵＧＡＣＣＡＧＣＡＡＡＡＣＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＵＣＣＵＣＣＧＵＧＡＵＡＡＣＡＡＧＣＣＵＧＧＧＧＧＣＧＡＵＵＧＵＧＵＣＡＵＧＣＵＡＣＧＧＡＡＡＧＡＣＵＡＡＧＵＧＣＡＣＣＧＣＣＵＣＧＡＡＣＡＡＧＡＡＣＣＧＣＧＧＣＡＵＣＡＵＵＡＡＧＡＣＵＵＵＣＵＣＧＡＡＵＧＧＵＵＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＧＵＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＧＵＧＧＡＵＡＣＵＧＵＧＵＣＡＧＵＣＧＧＧＡＡＵＡＣＵＣＵＵＵＡＣＵＡＣＧＵＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＵＣＵＡＣＧＵＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＵＡＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＵＵＡＣＧＡＵＣＣＧＣＵＧＧＵＧＵＵＣＣＣＧＵＣＣＧＡＣＧＡＡＵＵＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＡＵＣＡＧＣＣＡＡＧＵＣＡＡＣＧＡＧＣＵＧＡＵＵＡＡＣＣＡＧＵＣＣＣＵＣＧＣＣＵＵＣＡＵＣＡＡＣＣＡＡＵＣＣＧＡＣＧＡＧＣＵＣＣＵＧＣＡＵＡＡＣＧＵＧＡＡＣＧＣＣＧＧＡＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＵＣＡＵＧＡＵＣＡＣＵＡＣＵＡＵＵＡＵＣＡＵＣＧＵＧＡＵＣＡＵＣＧＵＣＡＵＣＣＵＧＣＵＧＡＧＣＣＵＧＡＵＵＧＣＵＧＵＧＧＧＣＣＵＧＵＵＧＣＵＧＵＡＵＵＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＧＵＣＣＡＣＣＣＣＧＧＵＣＡＣＣＣＵＧＵＣＧＡＡＧＧＡＵＣＡＧＣＵＧＵＣＣＧＧＡＡＵＣＡＡＣＡＡＣＡＵＵＧＣＣＵＵＣＵＣＣＡＡＣＵＡＡ（配列番号１７）
ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするＤＮＡ鋳型の核酸配列は下に列挙されている。
ＦＤ３ ＤＮＡ：
ＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＧＣＡＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＴＣＴＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＡＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＣＧＣＡＴＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＡＧＡＧＴＴＴＴＡＣＣＡＧＡＧＣＡＣＴＴＧＣＡＧＣＧＣＧＧＴＧＴＣＡＡＡＧＧＧＴＴＡＣＣＴＴＴＣＣＧＣＡＣＴＧＣＧＧＡＣＣＧＧＡＴＧＧＴＡＣＡＣＴＴＣＣＧＴＧＡＴＣＡＣＣＡＴＴＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＡＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＡＡＧＧＴＣＡＡＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＡＣＡＡＧＡＡＣＧＣＣＧＴＧＡＣＡＧＡＡＴＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＡＡＣＧＴＣＧＧＴＣＴＧＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＣＧＣＧＡＧＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＣＡＡＧＧＴＣＴＴＧＣＡＣＣＴＣＧＡＧＧＧＡＧＡＡＧＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＧＣＴＧＣＴＧＴＣＡＡＣＧＡＡＣＡＡＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＡＡＣＧＧＣＧＴＣＡＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＧＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＴＡＣＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＣＡＡＣＡＡＧＣＡＡＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＣＣＣＣＧＡＡＡＣＣＧＴＧＡＴＣＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＴＴＡＣＴＣＧＣＧＡＧＴＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＴＧＣＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＧＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＡＡＣＴＣＣＧＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＣＣＴＴＡＴＣＡＡＴＧＡＣＡＴＧＣＣＴＡＴＣＡＣＧＡＡＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＧＴＣＧＡＡＣＡＡＣＧＴＧＣＡＧＡＴＴＧＴＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡＴＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＧＴＣＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＧＣＧＴＡＣＧＴＧＧＴＧＣＡＡＣＴＣＣＣＧＣＴＧＴＡＣＧＧＣＧＴＣＡＴＣＧＡＴＡＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＴＣＧＣＣＴＴＴＧＴＧＴＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＡＴＣＴＧＣＴＴＡＡＣＣＣＧＧＡＣＴＧＡＴＣＧＧＧＧＴＴＧＧＴＡＣＴＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＣＧＧＧＡＡＴＧＴＴＴＣＧＴＴＣＴＴＣＣＣＡＣＡＡＧＣＣＧＡＧＡＣＴＴＧＴＡＡＡＧＴＧＣＡＧＴＣＡＡＡＣＡＧＡＧＴＧＴＴＣＴＧＴＧＡＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＣＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＧＡＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧＴＧＴＡＡＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＡＡＣＣＣＡＡＡＡＴＡＣＧＡＴＴＧＣＡＡＧＡＴＴＡＴＧＡＣＣＡＧＣＡＡＡＡＣＣＧＡＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＴＧＡＴＡＡＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＣＧＡＴＴＧＴＧＴＣＡＴＧＣＴＡＣＧＧＡＡＡＧＡＣＴＡＡＧＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＡＧＡＡＣＣＧＣＧＧＣＡＴＣＡＴＴＡＡＧＡＣＴＴＴＣＴＣＧＡＡＴＧＧＴＴＧＣＧＡＣＴＡＴＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＣＴＧＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＴＡＣＴＣＴＴＴＡＣＴＡＣＧＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＴＣＴＡＣＧＴＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＴＡＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＴＴＡＣＧＡＴＣＣＧＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＣＧＴＣＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＡＡＧＴＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＴＴＡＡＣＣＡＧＴＣＣＣＴＣＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡＡＴＣＣＧＡＣＧＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡＴＡＡＣＧＴＧＡＡＣＧＣＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＴＣＡＴＧＡＴＣＡＣＴＡＣＴＡＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧＡＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＣＣＧＧＴＣＡＣＣＣＴＧＴＣＧＡＡＧＧＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＧＧＡＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＴＡＡ（配列番号１８）
５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの核酸配列は下に列挙されている。
５’ＵＴＲ：
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ（配列番号１９）
３’ＵＴＲ：
ＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣ（配列番号２０）
ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡの核酸配列は下に列挙されている。
ＦＤ３ ｍＲＮＡ：
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧＡＵＧＧＡＡＣＵＧＣＵＧＡＵＣＣＵＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＧＣＡＡＵＣＡＣＣＡＣＣＡＵＵＣＵＣＡＣＣＧＣＵＧＵＧＡＣＣＵＵＣＵＧＣＵＵＣＧＣＡＵＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＣＡＵＣＡＣＵＧＡＡＧＡＧＵＵＵＵＡＣＣＡＧＡＧＣＡＣＵＵＧＣＡＧＣＧＣＧＧＵＧＵＣＡＡＡＧＧＧＵＵＡＣＣＵＵＵＣＣＧＣＡＣＵＧＣＧＧＡＣＣＧＧＡＵＧＧＵＡＣＡＣＵＵＣＣＧＵＧＡＵＣＡＣＣＡＵＵＧＡＧＣＵＣＡＧＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＧＡＡＡＡＣＡＡＧＵＧＣＡＡＵＧＧＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＡＡＧＧＵＣＡＡＧＣＵＧＡＵＣＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＵＧＧＡＣＡＡＧＵＡＣＡＡＧＡＡＣＧＣＣＧＵＧＡＣＡＧＡＡＵＵＧＣＡＧＣＵＣＣＵＧＡＵＧＧＧＡＵＣＣＧＧＡＡＡＣＧＵＣＧＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＵＣＧＣＧＡＧＵＧＧＡＧＵＧＧＣＵＧＵＧＵＣＣＡＡＧＧＵＣＵＵＧＣＡＣＣＵＣＧＡＧＧＧＡＧＡＡＧＵＧＡＡＣＡＡＧＡＵＣＡＡＧＵＣＣＧＣＧＣＵＧＣＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＣＡＡＧＧＣＣＧＵＧＧＵＧＵＣＣＣＵＧＵＣＵＡＡＣＧＧＣＧＵＣＡＧＣＧＵＧＣＵＧＡＣＧＵＵＣＡＡＧＧＵＣＣＵＧＧＡＣＣＵＧＡＡＧＡＡＵＵＡＣＡＵＵＧＡＣＡＡＧＣＡＧＣＵＧＣＵＧＣＣＣＡＵＣＣＵＣＡＡＣＡＡＧＣＡＡＵＣＣＵＧＣＵＣＣＡＵＣＵＣＣＡＡＣＣＣＣＧＡＡＡＣＣＧＵＧＡＵＣＧＡＧＵＵＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＧＣＣＵＧＣＵＧＧＡＡＡＵＵＡＣＵＣＧＣＧＡＧＵＵＣＵＣＵＧＵＧＡＡＵＧＣＣＧＧＣＧＵＧＡＣＣＡＣＣＣＣＵＧＵＧＵＣＣＡＣＣＵＡＣＡＵＧＣＵＧＡＣＣＡＡＣＵＣＣＧＡＧＣＵＵＣＵＣＵＣＣＣＵＵＡＵＣＡＡＵＧＡＣＡＵＧＣＣＵＡＵＣＡＣＧＡＡＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＵＧＡＵＧＵＣＧＡＡＣＡＡＣＧＵＧＣＡＧＡＵＵＧＵＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＵＣＡＵＡＣＡＧＣＡＵＣＡＵＧＵＣＧＡＵＣＡＵＣＡＡＧＧＡＡＧＡＡＧＵＧＣＵＧＧＣＧＵＡＣＧＵＧＧＵＧＣＡＡＣＵＣＣＣＧＣＵＧＵＡＣＧＧＣＧＵＣＡＵＣＧＡＵＡＣＣＣＣＧＵＧＣＵＧＧＡＡＧＣＵＧＣＡＣＡＣＣＵＣＧＣＣＵＵＵＧＵＧＵＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＧＧＡＵＣＣＡＡＣＡＵＣＵＧＣＵＵＡＡＣＣＣＧＧＡＣＵＧＡＵＣＧＧＧＧＵＵＧＧＵＡＣＵＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＣＧＧＧＡＡＵＧＵＵＵＣＧＵＵＣＵＵＣＣＣＡＣＡＡＧＣＣＧＡＧＡＣＵＵＧＵＡＡＡＧＵＧＣＡＧＵＣＡＡＡＣＡＧＡＧＵＧＵＵＣＵＧＵＧＡＣＡＣＣＡＵＧＡＡＣＵＣＧＡＧＡＡＣＣＣＵＧＣＣＣＡＧＣＧＡＡＧＵＧＡＡＣＣＵＧＵＧＵＡＡＣＧＵＣＧＡＣＡＵＣＵＵＵＡＡＣＣＣＡＡＡＡＵＡＣＧＡＵＵＧＣＡＡＧＡＵＵＡＵＧＡＣＣＡＧＣＡＡＡＡＣＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＵＣＣＵＣＣＧＵＧＡＵＡＡＣＡＡＧＣＣＵＧＧＧＧＧＣＧＡＵＵＧＵＧＵＣＡＵＧＣＵＡＣＧＧＡＡＡＧＡＣＵＡＡＧＵＧＣＡＣＣＧＣＣＵＣＧＡＡＣＡＡＧＡＡＣＣＧＣＧＧＣＡＵＣＡＵＵＡＡＧＡＣＵＵＵＣＵＣＧＡＡＵＧＧＵＵＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＧＵＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＧＵＧＧＡＵＡＣＵＧＵＧＵＣＡＧＵＣＧＧＧＡＡＵＡＣＵＣＵＵＵＡＣＵＡＣＧＵＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＵＣＵＡＣＧＵＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＵＡＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＵＵＡＣＧＡＵＣＣＧＣＵＧＧＵＧＵＵＣＣＣＧＵＣＣＧＡＣＧＡＡＵＵＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＡＵＣＡＧＣＣＡＡＧＵＣＡＡＣＧＡＧＣＵＧＡＵＵＡＡＣＣＡＧＵＣＣＣＵＣＧＣＣＵＵＣＡＵＣＡＡＣＣＡＡＵＣＣＧＡＣＧＡＧＣＵＣＣＵＧＣＡＵＡＡＣＧＵＧＡＡＣＧＣＣＧＧＡＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＵＣＡＵＧＡＵＣＡＣＵＡＣＵＡＵＵＡＵＣＡＵＣＧＵＧＡＵＣＡＵＣＧＵＣＡＵＣＣＵＧＣＵＧＡＧＣＣＵＧＡＵＵＧＣＵＧＵＧＧＧＣＣＵＧＵＵＧＣＵＧＵＡＵＵＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＧＵＣＣＡＣＣＣＣＧＧＵＣＡＣＣＣＵＧＵＣＧＡＡＧＧＡＵＣＡＧＣＵＧＵＣＣＧＧＡＡＵＣＡＡＣＡＡＣＡＵＵＧＣＣＵＵＣＵＣＣＡＡＣＵＡＡＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣ（配列番号２１）
ＬＮＰ－ＲＳＶ ＦＤ３ ｍＲＮＡ組成物をＮＨＰに投与した。６頭のカニクイマカクの群は、０日目および２１日目に筋肉内（ＩＭ）注射により、上のＬＮＰでカプセル化されたｍＲＮＡの５μｇ用量、またはＡｌ（ＯＨ）３でアジュバント添加されたＲＳＶ Ｐｒｅ－Ｆ ＮＰサブユニット対照ワクチンの１０μｇ用量を投与された。サルはそれぞれのワクチン投与に先立って、ならびに最後のワクチン接種後２週間で（Ｄ３５）出血させた。図２９に示されるように、試験されたカチオン性脂質すべてが、アルミニウムアジュバントを用いたＰｒｅ－Ｆ ＮＰに類似するレベルまで抗ＲＳＶ Ｆタンパク質抗体の産生を効果的に誘導した。
図３０に示されるように、試験されたカチオン性脂質すべてが、アルミニウムアジュバントを用いたＰｒｅ－Ｆ ＮＰに類似するレベルまで効果的なＲＳＶ中和価を生み出した。
図２９と図３０の累積的な結果は下の表９および表１０に示されている。
Figure 2023550600000020
Figure 2023550600000021
より質の良い免疫応答は、抗体価／中和価比を表すより低い値で示される。ここでは、ＬＮＰ製剤脂質Ｂが最も質の良い免疫応答を示し、すべてのＬＮＰ製剤は、非ｍＲＮＡワクチン、Ｐｒｅ－Ｆ ＮＰと比べて優れた質の免疫応答を示し、いくつかは、ＭＣ３の工業ベンチマークＬＮＰ製剤よりも良好であった。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質コードｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質コードｍＲＮＡを有するＬＮＰ製剤
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質コードｍＲＮＡを含有するＬＮＰ製剤をヒト対象に投与した。対象には製剤脂質ＢのＬＮＰを投与した。非修飾ｍＲＮＡは、フューリン切断部位を取り除き残基９８６および９８７をプロリンに変異させるように変異されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質をコードしていた。対象には、下に記載されるＮＣＴ０４７９８０２７についての臨床試験プロトコルの下でＬＮＰ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを投与した。
これは、センチネルコーホート続いて完全登録コーホートからなる連続群予防研究であった。センチネルコーホートには３用量レベル（それぞれの用量レベルについて１８～４９歳で２５人の参加者まで）があり、これは、それぞれの用量レベルおよびそれぞれのワクチン接種について段階的安全評価と一緒に非盲検様式で行った。すべてのセンチネル参加者は、２１日間隔を開けて２回のワクチン接種を受けた。完全登録コーホートでは、登録時の年齢に基づいて２つの年齢群：若い成人の年齢群（１８～４９歳で１４０人の参加者）および高齢者年齢群（≧５０歳で１６８人の参加者）に階層化された。完全登録コーホート１（群１～４）は１回注射の研究介入を受け、コーホート２（群５～８）の参加者は２回ワクチン接種（２１日間隔を開けて与えられる）を受けた。すべての群の投与経路は筋肉内（ＩＭ）であった。
試験：群１ － １日目にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡワクチン製剤１の１回注射
試験：群２ － １日目にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡワクチン製剤２の１回注射
試験：群３ － １日目にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡワクチン製剤３の１回注射
プラセボコンパレータ：群４ － １日目にプラセボ（０．９％生理食塩水）の１回注射
試験：群５ － １日目および２２日目にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡワクチン製剤１の２回注射
試験：群６ － １日目および２２日目にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡワクチン製剤２の２回注射
試験：群７ － １日目および２２日目にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡワクチン製剤３の２回注射
プラセボコンパレータ：群８ － １日目および２２日目のプラセボ（０．９％生理食塩水）の２回注射
研究の結果は、２回目の注射の２週間後、試験された３種の投与量すべてにわたり、研究参加者の９１％～１００％で中和抗体陽転（基準線に対して４倍増加と定義される）を示した。安全性の懸念は観察されず、忍容性プロファイルは他の非修飾ｍＲＮＡ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンと匹敵している。
四価または八価インフルエンザワクチンＬＮＰ製剤に関するさらなる研究
種々の多価ＬＮＰ－インフルエンザｍＲＮＡワクチンを投与されたマウスからＨＡＩ力価およびＮＡＩ力価を測定した。ＨＡＩ力価は、インフルエンザ株Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５、Ａ／ＳＩＮＧＡＰＯＲＥ／ＩＮＦＩＭＨ１６００１９／２０１６、Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６ ＢＸ６９Ａ、およびＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３に対して測定した。ＮＡＩ力価は、インフルエンザ株Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５、Ａ／ＳＩＮＧＡＰＯＲＥ／ＩＮＦＩＭＨ１６００１９／２０１６、Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１、およびＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３に対して測定した。
ＨＡＩ力価およびＮＡＩ力価は、一価または四価ＨＡまたはＮＡ ｍＲＮＡワクチンを受けるマウスに対して比較した。
マウスに、０日目にプライムワクチンおよび２１日目に同じ投与量のブースターワクチンを注射した。１、２０、２２、および３５日目に血液を採取した。ＨＡまたはＮＡ抗原をコードするｍＲＮＡを含有する一価組成物では以下のそれぞれをコードするｍＲＮＡを個々に使用した：Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統由来のＨ１、Ｈ３、ＨＡ、およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統由来のＨＡ（具体的には、株Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６；およびＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３由来の）。Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統由来のＮ１、Ｎ２、ＮＡのそれぞれおよびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統由来のＮＡ、ならびにＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統由来のＨ１、Ｈ３、ＨＡのそれぞれ、およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統由来のＨＡ（具体的には、株Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７；およびＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３由来の）をコードするｍＲＮＡを含有する四価ワクチン組成物も準備した。最後に、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統由来のＨ１、Ｈ３、ＨＡのそれぞれ、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統由来のＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統由来のＮ１、Ｎ２、ＮＡのそれぞれおよびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統由来のＮＡ（具体的には、株Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７；およびＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０３７／２０１３由来の）をコードするｍＲＮＡを含有する八価ワクチン組成物を準備し、八価ワクチンとして投与した。すべての組成物についてそれぞれのｍＲＮＡは、０．４μｇ／株の量で添加した。それぞれの群で、ｎ＝６マウス。
それぞれの実験群の概要は下の表１１に列挙している。
Figure 2023550600000022
図３１に示されるように、八価ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤は、４種のインフルエンザ株のうちの３種について四価の４倍以内のＨＡＩ力価をもたらした。
上記群のそれぞれについてのＮＡＩ力価結果の概要は図３３に示されている。八価ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤は、四価ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤に匹敵するＮＡＩ力価を生じた。
このように、データは、八価ワクチンがロバストなＨＡおよびＮＡ免疫応答を誘導できたこと、および４種の異なるインフルエンザ株由来の免疫優性ＨＡの存在が抗ＮＡ免疫応答を抑制するまたは妨害するとは思われないことを実証する。
ＨＡおよびＮＡＩ力価についてのハイコンテンツイメージングベースの中和試験（ＨＩＮＴ）力価は、種々の多価ＬＮＰ－インフルエンザｍＲＮＡワクチンを投与されたフェレットからさらに測定した。ＨＩＮＴアッセイは、Ｊｏｒｑｕｅｒａら（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ．９：２６７６頁．２０１９年）にさらに詳細に記載されており、前記文献は参照によって本明細書に組み入れる。ＨＩＮＴ力価は、インフルエンザ株Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５、Ａ／ＳＩＮＧＡＰＯＲＥ／ＩＮＦＩＭＨ１６００１９／２０１６、Ｂ／ＩＯＷＡ／０６／２０１７、およびＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３に対して測定された。ＮＡＩ力価は、インフルエンザ株Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５、Ａ／ＳＩＮＧＡＰＯＲＥ／ＩＮＦＩＭＨ１６００１９／２０１６、Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７、およびＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３に対して測定された。
多価ワクチン免疫原性を評価するために使用されたフェレットは、下の表１２に示されるように、（１）ＮＡ抗原をコードする４種のｍＲＮＡ（Ｎ１、Ｎ２、ＢｖＮＡ、およびＢｙＮＡ）の混合物、（２）ＨＡ抗原をコードする４種のｍＲＮＡ（Ｈ１、Ｈ３、ＢｖＨＡ、およびＢｙＨＡ）の混合物、または（３）ＮＡ抗原をコードする４種のｍＲＮＡ（Ｎ１、Ｎ２、ＢｖＮＡ、およびＢｙＮＡ）およびＨＡ抗原をコードする４種のｍＲＮＡ（Ｈ１、Ｈ３、ＢｖＨＡ、およびＢｙＨＡ）の混合物で２１日間隔を開けて２回ワクチン接種された。それぞれのＨＡは、以下の４種の株：Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｈ１）；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３）；Ｂ／Ｉｏｗａ／０６／２０１７（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統）；およびＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統）のうちの１つに由来するＨＡを含む。抗原はすべて１：１比で投与された。
それぞれの実験群の概要は下の表１２に列挙されている。
フェレットはすべて、要求される通り、基準線時に、ブースター１日前または直前に、ブースター接種時に、およびチャレンジ２週間後に、鎮静下（イソフルラン）で出血させた。血清試料（必要とされるまで－２０℃で貯蔵）をＥＬＬＡにより試験してＮＡＩ活性を評価した。さらに、赤血球凝集抑制アッセイ（ＨＡＩ）に着手して、多価ワクチン接種に続く赤血球凝集素抗原に対する抗体応答を評価した。
Figure 2023550600000023
上記群のそれぞれについてのＨＩＮＴ結果の概要は図３２に示されている。八価ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤は、四価ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤に匹敵するＨＩＮＴ力価を生じた。
上記群のそれぞれについてのＮＡＩ力価結果の概要は、図３４（２０日目）および図３５（４２日目）に示されている。八価ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤は、四価ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤に匹敵するＮＡＩ力価を生じた。これは、２０日目から４２日目試料に当てはまった。
脂質Ａまたは脂質Ｂ ＬＮＰ製剤中のｍＲＮＡを用いて記録されたインフルエンザ異種サブタイプ株に対する機能的抗体価
ＮＨＰにおいてｍＲＮＡ－ＬＮＰの免疫原性を評価するため、脂質Ａまたは脂質Ｂ ＬＮＰ製剤中にカプセル化されたＳｉｎｇ１６ ＨＡコードｍＲＮＡ（ＨＡ Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６をコードする）の０、１５、４５μｇを免疫した。ナイーブオスおよびメスのモーリシャス島起源のカニクイマカク（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を使用した。研究開始時、動物の体重は＞２ｋｇで年齢は＞２歳であった。群は処置群当たり最大６頭の動物からなり、研究日０にそのそれぞれのワクチン用量または希釈液０．５ｍＬを、ＩＭ経路によりそれぞれの動物の１本の前肢に、三角筋を標的にしてワクチン接種した。最初の免疫化が生じた２８日後に、第２の免疫化を動物の反対側の肢に与えた。Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３Ｎ２）株を含有する四価卵由来失活インフルエンザワクチン（ＩＩＶ）をコンパレータとして使用した。
ＢＩＯＱＵＡＬ、Ｉｎｃ．製のＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３Ｎ２）ウイルスストックを使用してインフルエンザアッセイを実施した。ＨＡＩによる追加の幅検査を次のＨ３Ｎ１ウイルスストック：Ａ／Ｓｈａｎｄｏｇｌａｉｃｈｅｎｇ／１７６３／２０１６、Ａ／Ｌｏｕｉｓｉａｎａ／１３／２０１７、Ａ／Ｋｅｎｙａ／１０５／２０１７、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／７４６／２０１７、およびＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／８４／２０１６、Ａ／Ａｋｓａｒａｙ／４０４８／２０１６を使用して実施した。これらは、３ｃ．２ａと３ｃ．３ａクレードの両方由来の株、ならびにＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６と同じ時間枠から最大限に多様なＨ３Ｎ２配列のセットを選択するためバイオインフォマティクス解析に基づいて極めて遠縁のブタ様Ｈ３配列（Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／８４／２０１６）を含む。
マイクロ中和（ＭＮ）アッセイでは、血清試料をレセプター破壊酵素（Ｄｅｎｋａ Ｓｅｉｋｅｎ、３７００１３）に希釈し、３７℃水浴で一晩インキュベートした。試料は５６℃で３０分間熱失活し、次に、２倍の段階希釈を９６ウェルプレートに２通り流した。１００ＴＣＩＤ５０で等容積のウイルスをプレートに添加し、続いて３７℃で１時間インキュベートした。１００マイクロリットルの試料／ウイルス混合物を、ＴＰＣＫ処理培地を含有するＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－３４）の９６ウェル平底プレートに移し、５％ＣＯ２と一緒に３７℃で４８時間インキュベートした。プレートは冷アセトンで固定し、次に、ビオチンコンジュゲート抗インフルエンザＡ ＮＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ８２５８Ｂ）で染色し、続いてＤｅｌｆｉａアッセイバッファー中でＤＥＬＦＩＡユーロピウム標識ストレプトアビジンと一緒にインキュベートした。蛍光を測定し、エンドポイント力価を報告した。
４３日目、２回目の免疫化後、Ｓｉｎｇ１６ＨＡ－ＣＬ－０５９およびＳｉｎｇ１６ＨＡ－ＣＬ０１７をワクチン接種されたＮＨＰは、ＭＮアッセイに記述されるように、相同ウイルス、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３Ｎ２）に対する中和抗体を発現した（図３６および図３７）。さらに、このモデルでは、ＩＩＶワクチンとは逆に、Ａ／Ｓｈａｎｄｏｇｌａｉｃｈｅｎｇ／１７６３／２０１６、Ａ／Ｌｏｕｉｓｉａｎａ／１３／２０１７、Ａ／Ｋｅｎｙａ／１０５／２０１７、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／７４６／２０１７、およびＡ／Ａｋｓａｒａｙ／４０４８／２０１６を含む異種サブタイプウイルスパネルにＭＮ力価が観察された。データは、前記ｍＲＮＡ製剤が、インフルエンザの異種サブタイプ株の代わりを務めるＩＩＶよりも大きな幅を提供する潜在力を有することを示している。

Claims (56)

  1. 脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル化された核酸分子を含む医薬組成物であって、ＬＮＰは、
    カチオン性脂質を３５％～４５％のモル比で、
    ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲート（ペグ化）脂質を０．２５％～２．７５％のモル比で、
    コレステロール系脂質を２０％～３５％のモル比で、および
    ヘルパー脂質を２５％～３５％のモル比で含み、
    すべてのモル比はＬＮＰの全脂質含量に対するものである医薬組成物。
  2. ＬＮＰが、
    カチオン性脂質を４０％のモル比で、
    ペグ化脂質を１．５％のモル比で、
    コレステロール系脂質を２８．５％のモル比で、および
    ヘルパー脂質を３０％のモル比で含む
    請求項１に記載の組成物。
  3. カチオン性脂質は、ＯＦ－０２、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１０－ＤＳ－３－Ｅ１８－１、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０、またはＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－３－Ｅ１４である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. ペグ化脂質はジミリストイル－ＰＥＧ２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. コレステロール系脂質はコレステロールである、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
  6. ヘルパー脂質は、１，２－ジオレオイル－ＳＮ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. ＬＮＰは、
    ＯＦ－０２を４０％のモル比で、
    ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を１．５％のモル比で、
    コレステロールを２８．５％のモル比で、および
    ＤＯＰＥを３０％のモル比で
    含む、請求項１に記載の組成物。
  8. ＬＮＰは、
    ｃＫＫ－Ｅ１０を４０％のモル比で、
    ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を１．５％のモル比で、
    コレステロールを２８．５％のモル比で、および
    ＤＯＰＥを３０％のモル比で
    含む、請求項１に記載の組成物。
  9. ＬＮＰは、
    ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１０－ＤＳ－３－Ｅ１８－１を４０％のモル比で、
    ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を１．５％のモル比で、
    コレステロールを２８．５％のモル比で、および
    ＤＯＰＥを３０％のモル比で
    含む、請求項１に記載の組成物。
  10. ＬＮＰは、
    ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０を４０％のモル比で、
    ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を１．５％のモル比で、
    コレステロールを２８．５％のモル比で、および
    ＤＯＰＥを３０％のモル比で
    含む、請求項１に記載の組成物。
  11. ＬＮＰは、
    ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－３－Ｅ１４を４０％のモル比で、
    ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を１．５％のモル比で、
    コレステロールを２８．５％のモル比で、および
    ＤＯＰＥを３０％のモル比で
    含む、請求項１に記載の組成物。
  12. ＬＮＰは３０～２００ｎｍの平均直径を有する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。
  13. ＬＮＰは８０～１５０ｎｍの平均直径を有する、請求項１２に記載の組成物。
  14. 組成物は、１～１０、場合により１ｍｇ／ｍＬのＬＮＰを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物。
  15. ＬＮＰは、１～２０、場合により５～１０または６～８つのヌクレオチド分子を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
  16. 核酸分子（複数可）はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡ分子である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の組成物。
  17. ｍＲＮＡ分子は、抗原、場合によりウイルス抗原または細菌抗原をコードする、請求項１６に記載の組成物。
  18. 抗原はインフルエンザウイルスに由来する、請求項１７に記載の組成物。
  19. ＬＮＰは、２つまたはそれ以上のｍＲＮＡ分子を含み、それぞれのｍＲＮＡ分子は異なる抗原をコードし、場合により、異なる抗原は同じ病原体由来または異なる病原体由来である、請求項１７または１８に記載の組成物。
  20. ２つまたはそれ以上のＬＮＰを含み、それぞれのＬＮＰは異なる抗原をコードするｍＲＮＡを含み、場合により、異なる抗原は同じ病原体由来または異なる病原体由来である、請求項１７または１８に記載の組成物。
  21. （ｉ）１つもしくはそれ以上のヘマグルチニン（ＨＡ）抗原、（ｉｉ）１つもしくはそれ以上のノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原、または（ｉｉｉ）少なくとも１つのＨＡ抗原および少なくとも１つのＮＡ抗原をコードする２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、またはそれ以上のｍＲＮＡ分子を含む、請求項１９または２０に記載の組成物。
  22. インフルエンザＡ、Ｂおよび／またはＣウイルスの抗原をコードする１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ分子を含み、場合により、抗原はインフルエンザＡおよびインフルエンザＢウイルスのＨＡおよび／またはＮＡ抗原である、請求項１８～２１のいずれか１項に記載の組成物。
  23. インフルエンザＡウイルスのＨＡ抗原は、サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、およびＨ１８から選択され；ならびに／またはインフルエンザＡウイルスのＮＡ抗原は、サブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１０、およびＮ１１から選択される、請求項２２に記載の組成物。
  24. インフルエンザＢウイルスのＨＡおよびＮＡ抗原は、インフルエンザＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統またはインフルエンザＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統由来である、請求項２２または２３に記載の組成物。
  25. （ｉ）１つもしくはそれ以上のＨＡ抗原、（ｉｉ）１つもしくはそれ以上のＮＡ抗原、または（ｉｉｉ）Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ５Ｎ２、およびＨ１０Ｎ７サブタイプならびに／またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統およびインフルエンザＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統から選択される１つまたはそれ以上のＨＡ抗原およびＮＡ抗原の組合せをコードする２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、またはそれ以上のｍＲＮＡ分子を含む、請求項２２～２４のいずれか１項に記載の組成物。
  26. Ｈ３ ＨＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、Ｈ１ ＨＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、インフルエンザＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統由来のＨＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、およびインフルエンザＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＨＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子を含む、請求項２２～２５のいずれか１項に記載の組成物。
  27. Ｈ３ ＨＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、Ｎ２ ＮＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、Ｈ１ ＨＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、Ｎ１ ＮＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、インフルエンザＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統由来のＨＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、インフルエンザＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統由来のＮＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、インフルエンザＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統由来のＨＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子、およびインフルエンザＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統由来のＮＡ抗原をコードする１つのｍＲＮＡ分子を含む、請求項２２～２６のいずれか１項に記載の組成物。
  28. ｍＲＮＡ分子は、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、請求項１６に記載の組成物。
  29. ＲＳＶ Ｆタンパク質抗原は、配列番号１６に少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは配列番号１６のアミノ酸配列からなる、請求項２８に記載の組成物。
  30. ＲＳＶ Ｆタンパク質抗原は融合前タンパク質である、請求項２８または２９に記載の組成物。
  31. ＯＲＦはコドン最適化されている、請求項１６～３０のいずれか１項に記載の組成物。
  32. ｍＲＮＡ分子は、少なくとも１つの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１つの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列を含む、請求項１６～３１のいずれか１項に記載の組成物。
  33. ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１６～３２のいずれか１項に記載の組成物。
  34. ｍＲＮＡ中のウラシルヌクレオチドの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％が化学修飾されている、請求項１６～３３のいずれか１項に記載の組成物。
  35. ＯＲＦ中のウラシルヌクレオチドの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％が化学修飾されている、請求項１６～３３のいずれか１項に記載の組成物。
  36. 化学修飾は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、および２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の組成物。
  37. 化学修飾は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、およびその組合せからなる群から選択される、請求項３６に記載の組成物。
  38. 化学修飾はＮ１－メチルプソイドウリジンである、請求項３６に記載の組成物。
  39. ｍＲＮＡは、配列番号１７に示される核酸配列と、少なくとも８０％同一性を有する核酸配列を含む、請求項２８～３８のいずれか１項に記載の組成物。
  40. ｍＲＮＡは、配列番号２１に示される核酸配列と、少なくとも８０％同一性を有する核酸配列を含む、請求項２８～３８のいずれか１項に記載の組成物。
  41. ｍＲＮＡは以下の構造エレメント：
    （ｉ）以下の構造を有する５’キャップ：
    Figure 2023550600000024
     （ｉｉ）配列番号１９の核酸配列を有する５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）；
    （ｉｉｉ）配列番号１７の核酸配列を有するタンパク質コード領域；
    （ｉｖ）配列番号２０の核酸配列を有する３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）；および
    （ｖ）ポリ（Ａ）テール
    を含む、請求項２８～３８のいずれか１項に記載の組成物。
  42. 筋肉内注射用に製剤化されている、請求項１～４１のいずれか１項に記載の組成物。
  43. リン酸緩衝食塩水を含む、請求項４２に記載の組成物。
  44. トレハロースを、場合により、組成物の１０％（ｗ／ｖ）で含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の組成物。
  45. 核酸分子を含む水性緩衝溶液を提供すること、
    カチオン性脂質、ペグ化脂質、コレステロール系脂質、およびヘルパー脂質を含む両親媒性溶液を提供すること、ならびに
    水性緩衝溶液と両親媒性溶液を５：１～３：１、場合により、４：１の比で混合すること
    を含む、請求項１～４４のいずれか１項に記載の組成物を製造する方法。
  46. 水性緩衝溶液は、場合により、クエン酸１ｍＭおよび塩化ナトリウム１５０ｍＭをｐＨ約４．５で含む、酸性緩衝溶液である、請求項４５に記載の方法。
  47. 両親媒性溶液はエタノール溶液である、請求項４５または４６に記載の方法。
  48. 免疫応答を誘発することを必要とする対象において免疫応答を誘発する方法であって、請求項１～４７のいずれか１項に記載の組成物の予防有効量を対象に、場合により、筋肉内に、鼻腔内に、静脈内に、皮下に、または皮内に投与することを含む方法。
  49. インフルエンザ感染症を予防するまたはインフルエンザ感染症の１つもしくはそれ以上の症状を低減させる方法であって、請求項１８～２７のいずれか１項に記載の組成物の予防有効量を対象に、場合により、筋肉内に、鼻腔内に、静脈内に、皮下に、または皮内に投与することを含む方法。
  50. 組成物は、１つまたはそれ以上の季節性および／またはパンデミックインフルエンザ株に対して免疫応答を誘発する、請求項４９に記載の方法。
  51. それぞれの用量が１～２５０、場合により、２．５、５、１５、４５、または１３５μｇのｍＲＮＡを含む、１つまたはそれ以上の用量の組成物を対象に投与することを含む、請求項４８～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. ２つの用量の組成物を、２～６、場合により、４週間の間隔を開けて、対象に投与することを含む、請求項４８～５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 場合により、請求項４８～５２のいずれか１項に記載の方法で、処置を必要とする対象を処置するのに使用するための薬物の製造のための請求項１～４４のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  54. 場合により、請求項４８～５２のいずれか１項に記載の方法で、処置を必要とする対象を処置するのに使用するための請求項１～４４のいずれか１項に記載の組成物。
  55. 場合により、容器はバイアルまたはプレフィルド注射器もしくはインジェクタである、請求項１～４４のいずれか１項に記載の組成物の単回使用または複数回使用投薬量を含む容器を含むキット。
  56. 抗原は、機械学習モデルから同定されるまたは設計される分子配列を有するインフルエンザウイルスＨＡ抗原および／またはインフルエンザウイルスＮＡ抗原を含む、請求項２１～２７のいずれか１項に記載の組成物。
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