TW202410883A - 用於體內遞送包含經修飾的核苷酸的ｍＲＮＡ的組合物 - Google Patents

Abstract

揭露了一種用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物，包括基於陽離子脂質的脂質體。用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物具有優異的儲存穩定性和體內的高表達效率，從而增加了用於癌症治療的mRNA疫苗或用於預防病毒感染的mRNA疫苗以及其他mRNA疫苗或治療劑的穩定性和效率。

Description

用於體內遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物

本發明涉及一種用於體內遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物，更具體地涉及一種包括基於陽離子脂質的脂質體的用於體內遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物。

基因療法和基因疫苗接種是已經在醫學領域得到證實並且被普遍應用的技術，並且不僅可以用於治療遺傳疾病，還可以用於治療自體免疫性疾病、感染性疾病、癌症或腫瘤相關疾病、炎性疾病等。

基因疫苗的開發始於據報導當將編碼靶基因的DNA和RNA直接注射到動物體內時，該靶基因在活體動物體內表達，並且透過這種表達免疫是可行的(Wolff JA et al. Science, 247:1465-8, 1990)。

基因疫苗接種引發所需的針對所選的抗原的免疫反應，所選的抗原諸如細菌表面的特徵成分、病毒顆粒、腫瘤抗原等。總而言之，疫苗接種是現代醫學的關鍵成就之一。然而，有效的疫苗目前只對數量有限的疾病有用。因此，每年仍有數百萬人經受無法被疫苗預防的傳染的影響。

在基因療法或基因疫苗接種中，DNA和RNA可以被用作用於基因給藥的核酸分子，並且已知與RNA相比，DNA相對穩定且易於處理。然而，在DNA的情況下，如果給藥到患者基因組中的DNA片段被插入到不期望的位置並且基因被損傷，則可能引起潛在的風險。此外，可能出現不需要的抗-DNA抗體，並且其他問題是在DNA給藥後透過轉錄/轉譯所表達的肽或蛋白質的水準受到限制。調控DNA轉錄的特定轉錄因子的存在或缺失對給藥的DNA的表達水準具有重大影響，並且在缺失特定轉錄因子的情況下，DNA轉錄無法產生足夠量的RNA，因此，透過轉譯產生的肽或蛋白質的水準亦受到限制。

另一方面，當RNA被用作基因給藥的工具時，RNA不需要轉錄，因此能夠在細胞質中直接合成蛋白質，而不需要像DNA一樣進入細胞核，所以不用擔心侵入細胞染色體並引起不期望的基因損傷。此外，RNA的半衰期比DNA短，因此不會誘導長期的基因修飾(Sayour EJ, et al., J. Immunother. Cancer 2015; 3:13, 2015)。當遞送到細胞中時，一般的RNA疫苗在短時間內被啟動以表達靶蛋白，並在幾天內被酶反應破壞，並且保留對表達的靶抗原(蛋白質)的特異性免疫反應。

此外，當使用RNA作為基因給藥的工具時，RNA僅在穿過細胞膜時起作用而不需要穿過核膜，因此，甚至使用比DNA更少的量，亦能表達與使用DNA時類似水準的靶蛋白。此外，RNA本身具有免疫增強活性，因此即使與DNA相比以少量給藥亦能表現出相同的免疫效果。

透過使用RNA代替DNA進行基因疫苗接種，可以最小化或避免不期望的整合到基因組中的風險以及抗DNA抗體的產生。然而，RNA是高度不穩定的分子種類，可以容易地被普遍存在的RNA酶降解。

儘管在過去的幾年中已經取得了許多進展，但是在本領域中仍然需要提供一種其中給藥的有效性不會被由於抗原的過早降解或mRNA從細胞中的低效(inefficient)釋放而導致的mRNA的低效轉譯而損害的方法，作為可以誘導免疫反應的mRNA疫苗接種的有效方法。此外，還需要減少mRNA疫苗的劑量，以減少潛在的安全問題，並使疫苗在整個第三世界皆負擔得起。

關於核酸遞送仍有許多問題需要解決，以在生物系統中獲得期望的反應。基於核酸的療法具有巨大的前景，但實現這一前景需要將核酸有效地遞送至細胞或生物體內的適當區域。

然而，目前將核酸用於治療和預防目的面臨兩個問題。首先，游離RNA容易被血液中的核酸酶降解。其次，游離RNA進入轉譯該RNA的轉譯機制所在的胞內區室的能力有限。已經嘗試摻入由陽離子脂質和其他脂質成分諸如中性脂質、膽固醇、PEG、聚乙二醇化脂質形成的脂質奈米顆粒和寡核苷酸以阻斷血液中RNA的降解並促進核酸的細胞攝取。

當使用基於脂質的遞送載體諸如脂質體或脂質奈米顆粒時，mRNA通常被吸附到外面或被包封在裡面。特別地，當mRNA被吸附到遞送載體的外面時，已知使用的是脂質體和核酸的聚集體，而不是單獨的脂質體。由於脂質的組合、核酸的狀態以及核酸與脂質體的比例可能影響吸附能力和穩定性，因此需要對其進行優化。

通常，即使驗證了遞送載體的體外mRNA表達，亦會存在體內表達結果可能不同的問題。取決於脂質的組成和遞送載體在體內的物理化學性質，存在降低細胞內遞送效率的因素，諸如由於血液中蛋白質聚集導致的半衰期和生物分佈減少、基於脂質組成的不同細胞攝取方法、ECM(細胞外基質)的屏障等。

同時，為了增加體內遞送的mRNA的表達效率，已經嘗試了使用透過修飾mRNA的鹼基而構建的mRNA的方法，並且已知與使用未經修飾的核苷酸的mRNA相比，經修飾的核苷酸在體內具有更高表達效率(US8278036B2、KR10-2171849B1、KR10-2014601B1)。經修飾的核苷酸的實例可以包括假尿苷、N1-甲基-假尿苷，但是有必要優化遞送載體和經修飾的核苷酸的組合。

因此，本發明人付出了巨大的努力，以發現用於改進遞送載體的技術，所述遞送載體能夠透過在體內穩定地遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA來誘導穩定的蛋白質表達，以提高細胞內表達效率，並因此確定基於陽離子脂質體和包含特定的經修飾的核苷酸的mRNA的[脂質體+mRNA複合物]可以在體內表現出低炎症反應和高表達效率，從而完成本發明。

本發明的目的是提供一種用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物，所述組合物包含基於陽離子脂質的脂質體，在體內具有低炎症反應和高表達效率。

本發明的另一個目的是提供一種用於預防或治療選自由以下組成的組的疾病的藥物組合物：癌症、腫瘤、自體免疫性疾病、遺傳性疾病、炎性疾病、病毒感染和細菌感染，所述藥物組合物包括如上所述的用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物作為活性成分。

本發明的又一個目的是提供一種疫苗，所述疫苗包括如上所述的用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物作為活性成分。

本發明的再一個目的是提供一種功能性化妝品組合物，所述功能性化妝品組合物包括如上所述的用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物作為活性成分。

為了實現上述目的，本發明提供一種用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物，所述組合物包括基於陽離子脂質的脂質體。

此外，本發明提供一種用於預防或治療選自由以下組成的組的疾病的藥物組合物：癌症、腫瘤、自體免疫性疾病、遺傳性疾病、炎性疾病、病毒感染和細菌感染，所述藥物組合物包括如上所述的用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物作為活性成分。

此外，本發明提供一種疫苗，所述疫苗包括如上所述的用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物作為活性成分。

此外，本發明提供一種功能性化妝品組合物，所述功能性化妝品組合物包括如上所述的用於遞送包含經修飾的核苷酸mRNA的組合物作為活性成分。

此外，本發明提供了一種用於預防或治療選自由以下組成的組的疾病的方法：癌症、腫瘤、自體免疫性疾病、遺傳性疾病、炎性疾病、病毒感染和細菌感染，所述方法包括給藥用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物，所述組合物包括基於陽離子脂質的脂質體。

此外，本發明提供了用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物用於預防或治療選自由以下組成的組的疾病的用途：癌症、腫瘤、自體免疫性疾病、遺傳性疾病、炎性疾病、病毒感染和細菌感染，所述組合物包括基於陽離子脂質的脂質體。

此外，本發明提供了用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物在製造用於預防或治療選自由以下組成的組的疾病的藥物的用途：癌症、腫瘤、自體免疫性疾病、遺傳性疾病、炎性疾病、病毒感染和細菌感染，所述組合物包括基於陽離子脂質的脂質體。

除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常理解的相同的含義。通常，本文所用的術語是本領域習知的，並且是典型的。

在使用核酸的體內基因轉移中，隨著透過誘導針對所選定的抗原(諸如病毒或細菌表面的特徵成分、病毒顆粒和腫瘤抗原)的所需免疫反應以及誘導治療性蛋白質的表達來預防或治療疾病的方法的發展，本發明旨在提供一種透過增加mRNA的細胞內表達效率來顯示穩定效果的方法。因此，製備了使用基於陽離子脂質的脂質體遞送mRNA的組合物，證實了體內的低炎症反應和高表達效率。

特別地，證實了用於遞送包含特定類型的經修飾的核苷酸的mRNA的組合物的性能非常優越。

在根據本發明的使用基於陽離子脂質的脂質體遞送mRNA的組合物中，mRNA可以以與基於陽離子脂質的脂質體形成複合物的形式提供，因此，使用基於陽離子脂質的脂質體遞送mRNA的組合物可以與[脂質體+ mRNA複合物]互換使用。

在下文中，將給出本發明的具體實施方式。

本發明的一個方面涉及一種用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物，所述組合物包括基於陽離子脂質的脂質體。

在本發明中，經修飾的核苷酸可以包括至少一個經修飾的骨架修飾、經修飾的糖或經修飾的鹼基，但不限於此。

糖修飾：

如本文所述，可以摻入到包括mRNA序列的經修飾的mRNA化合物中的經修飾的核苷或核苷酸可以在糖部分進行修飾。例如，2'羥基(OH)可以被許多不同的「氧基」或「去氧」取代基修飾或取代。「氧基」-2'羥基修飾的實例包括，但不限於，烷氧基或烯丙氧基(-OR，例如，R=H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)，-O(CH ₂CH ₂O) _nCH ₂CH ₂OR；「鎖」核酸(LNA)，其中2'羥基透過例如亞甲基交聯連接到同一核糖的4'碳；以及胺基(-O-胺基，其中胺基，例如，NRR是烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基、乙二胺或聚胺基)或胺基烷氧基。

「去氧」修飾可以包括氫或胺基(例如，NH ₂；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)；或者胺基可以透過接頭附接到糖，其中接頭包括選自C原子、N原子和O原子中的至少一種。

糖基還可以包括至少一個與核糖中相應的碳相比立體化學構型相反的碳。因此，經修飾的mRNA可以包括包含阿拉伯糖(諸如糖)的核苷酸。

骨架修飾：

如本文所述，在可以摻入到包括mRNA序列的經修飾的mRNA化合物中的經修飾的核苷或核苷酸中，可以將磷酸酯骨架進行進一步修飾。可以透過使用其他取代基取代一個或多個氧原子來修飾骨架的磷酸基團。此外，經修飾的核苷或核苷酸可以包括使用本文所述的經修飾的磷酸酯完全取代未經修飾的磷酸酯部分。經修飾的磷酸酯基團的實例可以包括，但不限於，硫代磷酸酯(phosphorothioate)、硒代磷酸酯(phosphoroselenate)、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、硼烷磷酸酯(boranophosphate ester)、磷酸氫酯、胺基磷酸酯(hydrogen phosphonate)、烷基膦酸酯或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的兩個未連接的氧皆被硫取代。

磷酸酯接頭亦可以透過用氮(交聯的磷醯胺)、硫(交聯的硫代磷酸酯)或碳(交聯的亞甲基膦酸酯)取代連接的氧來修飾。

鹼基修飾：

如本文所述，可以摻入到包括mRNA序列的經修飾的mRNA化合物中的經修飾的核苷或核苷酸還可以在核鹼基部分進行修飾。在mRNA中發現的核鹼基的實例包括但不限於腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。例如，本文所述的核苷或核苷酸可以在大溝面進行化學修飾。在一些實施方式中，大溝化學修飾可以包括胺基、硫醇基、烷基或鹵素基團。

在本發明的優選實施方式中，核苷酸類似物/修飾選自諸如以下的鹼基修飾：2-胺基-6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸酯、2-胺基嘌呤-核苷-5'-三磷酸酯、2-胺基腺苷-5'-三磷酸酯、2'-胺基-2'-去氧胞苷-三磷酸酯、2-硫代胞苷-5'-三磷酸酯、2-硫代尿苷-5'-三磷酸酯、2'-氟胸苷-5'-三磷酸酯、2'-O-甲基-肌苷-5'-三磷酸酯、4-硫代尿苷-5'-三磷酸酯、5-胺基烯丙基胞苷-5'-三磷酸酯、5-胺基烯丙基尿苷-5'-三磷酸酯、5-溴胞苷-5'-三磷酸酯、5-溴尿苷-5'-三磷酸酯、5-溴-2'-去氧胞苷-5'-三磷酸酯、5-溴-2'-去氧尿苷-5'-三磷酸酯、5-碘胞苷-5'-三磷酸酯、5-碘-2'-去氧胞苷-5'-三磷酸酯、5-碘尿苷-5'-三磷酸酯、5-碘-2'-去氧尿苷-5'-三磷酸酯、5-甲基胞苷-5'-三磷酸酯(5-methylcitidine-5’-triphosphate)、5-甲基尿苷-5'-三磷酸酯、5-丙炔基-2'-去氧胞苷-5'-三磷酸酯、5-丙炔基-2'-去氧尿苷-5'-三磷酸酯、6-氮雜胞苷-5'-三磷酸酯、6-氮雜尿苷-5'-三磷酸酯、6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸酯、7-去氮雜腺苷-5'-三磷酸酯、7-去氮雜鳥苷-5'-三磷酸酯、8-氮雜腺苷-5'-三磷酸酯、8-疊氮腺苷-5'-三磷酸酯、苯并咪唑-核苷-5'-三磷酸酯、N1-甲基腺苷-5'-三磷酸酯、N1-甲基鳥苷-5'-三磷酸酯、N6-甲基腺苷-5'-三磷酸酯、O6-甲基鳥苷-5'-三磷酸酯、假尿苷-5'-三磷酸酯、嘌呤黴素-5'-三磷酸酯以及黃苷-5'-三磷酸酯。

優選的是選自由以下組成的組的任何鹼基修飾的核苷酸：5-甲基胞苷-5'-三磷酸酯、7-去氮雜鳥苷-5'-三磷酸酯、5-溴胞苷-5'-三磷酸酯和假尿苷-5'-三磷酸酯。

在一些實施方式中，經修飾的核苷可以包括吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羥基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧基甲基-尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基-尿苷、1-牛磺酸基甲基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸基甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、二氫尿苷、二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷或4-甲氧基-2-硫代-假尿苷。

在一些實施方式中，經修飾的核苷可以包括5-氮雜-胞苷、偽異胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙醯胞苷、5-甲醯胞苷、N4-甲基胞苷、5-羥甲基胞苷、1-甲基-偽異胞苷、吡咯基-胞苷、吡咯基-偽異胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-偽異胞苷、4-硫代-1-甲基-偽異胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮雜-偽異胞苷、1-甲基-1-去氮雜-偽異胞苷、澤布拉林(zebularine)、5-氮雜-澤布拉林、5-甲基-澤布拉林、5-氮雜-2-硫代-澤布拉林、2-硫代-澤布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-偽異胞苷或4-甲氧基-1-甲基-偽異胞苷。

在其他實施方式中，經修飾的核苷可以包括2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、7-去氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-2-胺基嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-2-胺基嘌呤、7-去氮雜-2,6-二胺基嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、N6-甘胺醯胺甲醯基腺苷、N6-蘇胺醯胺甲醯基腺苷、2-甲基硫代-N6-蘇胺醯胺甲醯基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤或2-甲氧基-腺嘌呤。

在其他實施方式中，經修飾的核苷包括肌苷、1-甲基-肌苷、丫苷(wyosine)、懷丁苷(wybutosine)、7-去氮雜-鳥苷、7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷、6-硫代-鳥苷、6-硫代-7-去氮雜-鳥苷、6-硫代-7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷、6-硫代-7-甲基-鳥苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基鳥苷、N2-甲基鳥苷、N2,N2-二甲基鳥苷、8-氧代-鳥苷、7-甲基-8-氧代-鳥苷、1-甲基-6-硫代-鳥苷、N2-甲基-6-硫代-鳥苷或N2,N2-二甲基-6-硫代-鳥苷。

在一些實施方式中，核苷酸可以在大溝面被修飾並且可以包括在尿嘧啶C-5位使用甲基或鹵素基團取代氫。在某些實施方式中，經修飾的核苷是5'-O-(1-硫代磷酸酯)-腺苷、5'-O-(1-硫代磷酸酯)-胞苷、5'-O-(1-硫代磷酸酯)-鳥苷、5'-O-(1-硫代磷酸酯)-尿苷或5'-O-(1-硫代磷酸酯)-假尿苷。

在其他實施方式中，經修飾的mRNA可以包括選自以下的核苷修飾：6-氮雜-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、偽異胞苷、5-胺基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氫尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮雜-尿苷、5-羥基-尿苷、去氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯基-胞苷、肌苷、α-硫代-鳥苷、6-甲基-鳥苷、5-甲基-胞苷、8-氧代-鳥苷、7-去氮雜-鳥苷、N1-甲基-腺苷、2-胺基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-胺基-嘌呤、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-疊氮-腺苷以及7-去氮雜-腺苷。

在本發明中，經修飾的核苷酸選自由以下組成的組：假尿苷(Ψ)、N1-甲基假尿苷(m1Ψ)、5-甲基尿苷(m5U)、2-硫代尿苷(s2U)、2'-O-甲基尿苷(Um)、5-甲基胞苷(m5C)以及5-甲氧基尿苷(5moU)，最優選5-甲氧基尿苷(5moU)，但不限於此。

在本發明中，陽離子脂質包括不受pH變化影響而持續呈陽離子的脂質或透過pH變化轉化為陽離子的離子脂質。

在本發明中，陽離子脂質優選地為選自以下組成的組的至少一種：二甲基雙十八烷基溴化銨(DDA)、C12-200、1,2-二油醯基-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)、3β-[N-(N',N'-二甲基胺基乙烷)胺基甲醯基膽固醇(DC-Chol)、1,2-二油醯氧基-3-二甲基銨丙烷(DODAP)、1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基銨丙烷(DOTMA)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(14:1乙基PC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(16:0-18:1乙基PC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(18:1乙基PC)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(18:0乙基PC)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(16:0乙基PC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(14:0乙基PC)、1,2-二月桂醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(12:0乙基PC)、N1-[2-((1S)-1-[(3-胺基丙基)胺基]-4-[二(3-胺基-丙基)胺基]丁基羧醯胺基)乙基]-3,4-二[油醯氧基]-苯甲醯胺(MVL5)、1,2-二肉豆蔻醯基-3-二甲基銨-丙烷(14:0 DAP)、1,2-二棕櫚醯基-3-二甲基銨-丙烷(16:0 DAP)、1,2-二硬脂醯基-3-二甲基銨-丙烷(18:0 DAP)、N-(4-羧基苄基)-N,N-二甲基-2,3-雙(油醯氧基)丙-1-胺(DOBAQ)、1,2-二硬脂醯基-3-三甲基銨-丙烷(18:0 TAP)、1,2-二棕櫚醯基-3-三甲基銨-丙烷(16:0 TAP)、1,2-二肉豆蔻醯基-3-三甲基銨-丙烷(14:0 TAP)以及N4-膽固醇基-精胺(GL67)，但不限於此，並且最優選C12-200或1,2-二油醯基-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)，但不限於此。

在本發明中，DOTAP(二油醯基-3-三甲基銨丙烷)是優選的陽離子脂質的一實例，是具有以下化學式1的結構的陽離子乳化劑，用作織物柔軟劑，並且最近被用作蛋白質、化合物、肽等的遞送載體，包括形成脂質體或脂質奈米顆粒的核酸載體。

[化學式1]

在本發明中，包括基於陽離子脂質的脂質體的用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物，還可以包括中性脂質。

在本發明中，中性脂質包括不受pH變化影響而持續呈中性的脂質或透過pH變化轉變為中性的離子脂質。

在本發明中，中性脂質可以選自由以下組成的組：1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DMPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DLPC)、磷脂醯基絲胺酸(PS)、磷酸乙醇胺(PE)、磷脂醯基甘油(PG)、磷酸(PA)、磷脂醯基膽鹼(PC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-肌醇)(DOPI)和1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸肌醇(DSPI)，但不限於此，並且最優選1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，但不限於此。

同樣，在本發明中，DOPE(1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)，其為優選的中性脂質的實例，具有以下化學式2的結構，並用作形成陽離子脂質體或脂質奈米顆粒的輔助脂質。

[化學式2]

根據本發明的脂質體還可以包括至少一種選自由以下組成的組的遞送因子：魚精蛋白、白蛋白、轉鐵蛋白、PTD(蛋白質轉導結構域)、CPP(細胞穿透肽)、PEG(聚乙二醇)、聚乙二醇化脂質、金屬離子連接的脂質以及巨噬細胞靶向部分。

在本發明中，陽離子脂質與中性脂質的重量比為1∶9至9.5∶0.5，優選2∶8至9∶1，更優選3∶7至8∶2，最優選4∶6至7∶3，但不限於此。

如果其重量比超出上述範圍，mRNA遞送效率可能會大大降低。

在本發明中，包括基於陽離子脂質的脂質體的用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物，還可以包括膽固醇。

在本發明的脂質體或脂質奈米顆粒中，陽離子脂質與膽固醇的重量比為6∶1至1∶3，優選4∶1至1.0∶2.5，更優選3∶1至1∶2，最優選2.5∶1.0至1.0∶1.5，但不限於此。

此外，在本發明中，當根據本發明的陽離子脂質、中性脂質和膽固醇全部被包括時，陽離子脂質與中性脂質與膽固醇的重量比為1.0-9.5∶0.5-9.0∶0.05-3.00，優選3-8∶7-1∶0.45-7.00，更優選1.0-3.5∶1.0-3.5∶0.5-3.0，但不限於此。

如果其重量比超出上述範圍，mRNA遞送效率可能會大大降低。

在本發明的實施方式中，將陽離子脂質與中性脂質與膽固醇的重量比設定為2∶2∶1(40∶40∶20，w/w/w)，但不限於此。

在額外包括膽固醇時，例如，當DOTAP和DOPE以1∶1的重量比使用時，膽固醇可以相對於DOTAP以0.20-0.85，優選0.4-0.6的重量比混合以形成脂質體。

此外，在根據本發明的包括基於陽離子脂質的脂質體的用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物中，脂質體和mRNA的混合比可以表示為N∶P比，並且N∶P比影響組合物的mRNA表達和穩定性。

在本發明中，脂質體或脂質奈米顆粒和mRNA的N∶P比可以是0.2∶1.0至1.4∶1.0，優選0.23∶1.00至1.0∶1.0，更優選0.46∶1.00至1.0∶1.0，但不限於此。在本發明的示例性實施例中，所使用的N∶P比為0.6∶1.0。

在本發明中，包括基於陽離子脂質的脂質體的用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物，還可以包括免疫增強劑，但是免疫增強劑不是必需使用的，並且即使在沒有免疫增強劑的情況下，亦表現出足夠的疫苗效果。本發明中可用的免疫增強劑是選自由以下組成的組：回應於與病原體相關分子模式(PAMP)相對應的模式識別受體(PRR)的材料、CpG DNA、脂蛋白、鞭毛、聚I:C、皂苷、角鯊烯、三癸酸酯、3D-MPL和脫毒脂寡糖(dLOS)，但不限於此。

在免疫增強劑中，脫毒脂寡糖(dLOS)可以是韓國專利第1509456號或韓國專利號第2042993號中揭露的材料，但是本發明不限於此。

在本發明中，mRNA可以編碼可以充當免疫原的肽或蛋白質。

這裡，mRNA可以是具有至少一個可被細胞或生物體轉譯的開放閱讀框(ORF)的mRNA，該開放閱讀框通常與mRNA一起提供。這種轉譯的產物是抗原，優選用作免疫原的肽或蛋白質。這種產物亦可以是由兩種或多種免疫原組成的融合蛋白，例如，由來源於相同或不同病毒蛋白的兩種或多種表位、肽或蛋白組成的融合蛋白，其中表位、肽或蛋白可以透過接頭序列連接。

此外，mRNA可以理解為合成的mRNA，即非天然存在的mRNA分子。合成的mRNA分子可以理解為非天然mRNA分子。這種mRNA分子可能由於(非天然存在的)單個序列和/或其他非天然存在的改變，諸如核苷酸的結構改變而非天然。合成的mRNA分子可以透過對應於所需核苷酸的合成序列(異源序列)的基因工程方法來設計和/或生產。

此外，mRNA可以表現出修飾，所述修飾可增加對體內降解(例如，由外切或內切核酸酶降解)和/或體外降解(例如，透過給藥疫苗前的製備過程，例如，在製備待給藥的疫苗溶液的過程中)的抗性。可以例如，透過提供5'-帽結構、多聚-A-尾或任何其他UTR修飾來實現RNA的穩定化。亦可以透過化學修飾或核酸G/C含量的修飾來實現RNA的穩定化。各種其他方法在本領域中是已知的，並且適用於本發明。

根據本發明的包括基於陽離子脂質的脂質體的用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物可以呈以下形式，其中包含經修飾的核苷酸的mRNA被包封在脂質體內，或者其中包含經修飾的核苷酸的mRNA另外結合到脂質體的外部以及內部。

此外，本發明的組合物的特徵為具有多層囊泡(MLV)結構，但不限於此。

此外，本發明的組合物的特徵為表面電荷值為負值，但不限於此。

本發明的另一方面涉及提供用於一種預防或治療選自由以下組成的組的疾病的藥物組合物：癌症、腫瘤、自體免疫性疾病、遺傳性疾病、炎性疾病、病毒感染和細菌感染，所述藥物組合物包括如上所述的用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物作為活性成分。

在本發明中，「預防」是指透過給藥根據本發明的藥物組合物來抑制上述疾病或延緩其發展的任何行為。

在本發明中，「治療」是指透過給藥根據本發明的藥物組合物來改善或有利地改變上述疾病的症狀的任何行為。

本發明的藥物組合物可以與至少一種藥學上或生理學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑組合。藥物組合物可以包括緩衝液，諸如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、檸檬酸鹽緩衝液等；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、葡聚糖或甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；鉗合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如氫氧化鋁)；以及防腐劑。

本發明的藥物組合物可以口服或經胃腸外給藥，例如透過靜脈內給藥、皮下給藥、真皮內給藥、肌內給藥、腹腔內給藥、腫瘤內給藥、腦內給藥、顱內給藥、肺內給藥和直腸內給藥，但本發明不限於此。

本發明的藥物組合物是以藥物有效量來給藥。

在本發明中，「藥物有效量」是指足以以適用於藥物治療的合理效益/風險比治療疾病的量，並且該有效量可以根據患者的疾病類型、疾病的嚴重程度、藥物活性、藥物敏感性、給藥時間、給藥途徑、排泄率、治療持續時間、伴隨藥物的類型以及醫學領域公知的其他因素來確定。

本發明的藥物組合物可以作為單獨的治療劑或與其他治療劑聯合給藥，可以與常規治療劑依次或同時給藥，並且可以一次或多次給藥。考慮到所有上述因素，重要的是能以最小量獲得最大效果而沒有副作用的量給藥，這可由本領域具有通常知識者容易地確定。

具體而言，本發明藥物組合物的有效量可以根據患者的年齡、性別、狀況、體重、活性成分在體內的吸收率、失活率和排泄率、疾病類型和伴隨藥物的類型而變化。

由於本發明的藥物組合物包括如上所述的用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物作為活性成分，因此在本說明書中省略了對其的重複描述，以避免過於複雜。

本發明的再又一方面涉及預防或治療癌症、腫瘤、自體免疫性疾病、炎性疾病、病毒感染或細菌感染的方法，該方法包括向需要預防或治療癌症、腫瘤、自體免疫性疾病、炎性疾病、病毒感染或細菌感染的患者給藥根據本發明的用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物。

所給藥的mRNA的量可以是每劑量1至5μg、5至10μg、10至15μg、15至20μg、10至25μg、20至25μg、20至50μg、30至50μg、40至50μg、40至60μg、60至80μg、60至100μg、50至100μg、80至120μg、40至120μg、40至150μg、50至150μg、50至200μg、80至200μg、100至200μg、120至250μg、150至250μg、180至280μg、200至300μg、50至300μg、80至300μg、100至300μg、40至300μg、50至350μg、100至350μg、200至350μg、300至350μg、320至400μg、40至380μg、40至100μg、100至400μg、200至400μg、300至400μg、30至500μg、40至500μg、50至500μg、100至500μg、200至500μg、300至500μg、400至500μg、40至600μg、100至600μg、200至600μg、400至600μg、40至700μg、100至700μg、300至700μg、500至700μg、40至800μg、100至800μg、200至800μg、400至800μg或600至800μg，但不限於此。

本發明的再又一個目的是涉及一種疫苗，所述疫苗包括用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物作為活性成分。

在本發明中，疫苗可以是針對能夠感染人類和動物的病毒的疫苗，所述病毒諸如流感、冠狀病毒、帶狀皰疹病毒、人乳突瘤病毒、茲卡病毒、皰疹病毒、愛滋病病毒、SFTS病毒、麻疹病毒、水痘病毒、伊波拉病毒、MERS病毒、肝炎病毒、禽流感、狂犬病病毒和口蹄疫病毒，但是本發明不限於此。

在本發明中，疫苗可以是多價疫苗，多價疫苗中所包括的病毒可以包括兩種或多種選自由以下組成的組的病毒：能夠感染人類和動物的病毒，諸如流感、冠狀病毒、帶狀皰疹病毒、人乳突瘤病毒、茲卡病毒、皰疹病毒、愛滋病病毒、SFTS病毒、麻疹病毒、水痘病毒、伊波拉病毒、MERS病毒、肝炎病毒、禽流感、狂犬病病毒和口蹄疫病毒，但是本發明不限於此。

在本發明中，疫苗包括包含至少一個經修飾的核苷酸的mRNA，所述經修飾的核苷酸具有編碼至少一種病毒抗原多肽或其免疫原性片段的ORF。

在本發明中，考慮到給藥受試者的體重、年齡、飲食階段和/或免疫力，在預防由肽或蛋白質引起的疾病的目的範圍內，疫苗可以包括適當濃度的用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物，所述肽或蛋白質可以充當上述mRNA的免疫原。

在本發明中，疫苗還可以包括選自由載體、稀釋劑、賦形劑和佐劑組成的組中的至少一種。載體的類型沒有特別限制，但可以包括任何和所有的溶劑、分散介質、包衣、穩定劑、防腐劑、抗細菌和抗真菌劑、等滲劑、吸收延遲劑等。

在本發明中，疫苗可以透過口服、腸胃外、皮下、肌內、真皮內、舌下、經皮、直腸內、經粘膜、經吸入表面區域或口腔途徑或其組合給藥。

在本發明中，根據疫苗接種或治療的所需持續時間和有效性，疫苗可以以相同的量或不同的量給藥一次或幾次，亦可以間歇地給藥，例如幾天、幾周或幾個月的每天給藥。其可注射溶液可以透過注射以所需量給藥，或者透過皮下或鼻內噴霧給藥，或者透過連續輸注給藥。

在本發明中，疫苗可以以凍乾製劑的形式提供，但不限於此。

由於本發明的疫苗包括如上所述的用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物作為活性成分，因此在本說明書中省略了對其的重複描述，以避免過於複雜。

本發明的還又一方面涉及一種功能性化妝品組合物，其包括如上所述的用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物作為活性成分。

根據本發明的化妝品組合物可以包括化妝品組合物中常用的成分，例如，典型的佐劑諸如螯合劑、活性成分(例如，透明質酸鈉、生育酚醋酸酯等)、防腐劑、增稠劑和香精以及載體。

此外，根據本發明的化妝品組合物可以以本領域典型製劑的形式製備，例如乳液製劑或增溶製劑。乳液製劑的實例可以是營養乳液、霜劑、精華素等，而增溶製劑的實例可以是軟化洗劑。此外，本發明的化妝品組合物可以透過除化妝品之外還包括皮膚病學可接受的介質或基質，以可局部或全身施用的佐劑的形式製備，其通常用於皮膚病學領域。

合適的化妝品製劑的實例可以包括溶液、凝膠、固體或無水糊劑產品、水包油乳液、懸浮液、微乳液、微膠囊、微粒、離子(脂質體)或非離子濾泡分散體、霜劑、爽膚水(toners)、洗劑、散劑、軟膏、噴霧劑和遮瑕條(conceal stick)。此外，本發明的化妝品組合物可以以泡沫或的氣溶膠組合物的形式來製備，並進一步包括壓縮推進劑。

此外，本發明的化妝品組合物還可以包括：脂肪材料、有機溶劑、增溶劑、增稠劑、膠凝劑、軟化劑、抗氧化劑、懸浮劑、穩定劑、發泡劑、芳香劑、表面活性劑、水、離子或非離子乳化劑、填充劑、螯合劑(sequestering agent)、鉗合劑、防腐劑、維生素、封閉劑、保濕劑、精油、染料、色素、親水性或親脂性活化劑、脂囊泡或美容學或皮膚病學中常用的佐劑，諸如化妝品中常用的任何其他成分。此外，上述成分可以以皮膚病學領域中通常使用的量引入。

可以加入的本發明的化妝品組合物的產品的實例可以包括諸如收斂洗劑、軟化洗劑、營養乳液、各種霜、精華素、面膜、粉底等的化妝品以及諸如清潔劑、洗面乳、肥皂、護理品、美容精華素等的化妝品。

本發明的化妝品組合物的具體製劑包括皮膚洗劑、皮膚柔軟劑、皮膚爽膚水、收斂劑、洗劑、乳液、保濕洗劑、營養洗劑、按摩霜、營養霜、保濕霜、護手霜、精華素、營養精華、面膜、肥皂、香波、清潔泡沫、潔面乳、清潔霜、身體洗劑、身體清潔劑、乳液、粉餅、散粉、貼劑、噴霧劑等。

由於本發明的化妝品組合物包括如上所述的用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物作為活性成分，因此在本說明書中省略了對其的重複描述，以避免過於複雜。

本發明的其他方面涉及用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物用於預防或治療選自由以下組成的組的疾病的用途：癌症、腫瘤、自體免疫性疾病、遺傳性疾病、炎性疾病、病毒感染和細菌感染，所述組合物包括基於陽離子脂質的脂質體。

本發明的另外其他方面涉及用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物在製備用於預防或治療選自由以下組成的組的疾病的藥物中的用途：癌症、腫瘤、自體免疫性疾病、遺傳性疾病、炎性疾病、病毒感染和細菌感染，所述組合物包括基於陽離子脂質的脂質體。

實施例

透過以下實施例可以更好地理解本發明。對本領域具有通常知識者來說顯而易見的是，這些實施例僅僅是為了說明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。

實施例1：包含經修飾的核苷酸的IVT mRNA的製備

所用的經修飾的核苷酸是N1-甲基假尿苷(m1Ψ，TriLink BioTechnologies，USA)和5-甲氧基尿苷(5moU，TriLink BioTechnologies，USA)，所用的靶mRNA範本是螢火蟲螢光素酶(F. Luc)和SARS-CoV-2奧密克戎(omicron)棘蛋白mRNA (EG-COVARo)。

透過用相應的經修飾的核苷酸取代任何尿苷來合成包含經修飾的核苷酸的mRNA。這裡，合成mRNA的具體實例如下，所用的螢光素酶和SARS-CoV-2奧密克戎棘蛋白mRNA (EG-COVARo)的ORF和由此構建的胺基酸序列如下表1所示。

1) 未經修飾的螢火蟲螢光素酶mRNA

2) 經5moU修飾的螢火蟲螢光素酶mRNA

3) 經m1Ψ修飾的螢火蟲螢光素酶mRNA

4) 未經修飾的SARS-CoV-2奧密克戎棘蛋白mRNA

5) 經5moU修飾的SARS-CoV-2奧密克戎棘蛋白mRNA

6) 經m1Ψ修飾的SARS-CoV-2奧密克戎棘蛋白mRNA

[表1]

SEQ ID NO:	名稱	序列
1	螢火蟲螢光素酶ORF	AUGACCAGCAAGGUGUACGACCCCGAGCAGCGGAAGCGGAUGAUCACCGGCCCCCAGUGGUGGGCCCGGUGCAAGCAGAUGAACGUGCUGGACAGCUUCAUCAACUACUACGACAGCGAGAAGCACGCCGAGAACGCCGUGAUCUUCCUGCACGGCAACGCCGCCAGCAGCUACCUGUGGCGGCACGUGGUGCCCCACAUCGAGCCCGUGGCCCGGUGCAUCAUCCCCGACCUGAUCGGCAUGGGCAAGAGCGGCAAGAGCGGCAACGGCAGCUACCGGCUGCUGGACCACUACAAGUACCUGACCGCCUGGUUCGAGCUGCUGAACCUGCCCAAGAAGAUCAUCUUCGUGGGCCACGACUGGGGCGCCUGCCUGGCCUUCCACUACAGCUACGAGCACCAGGACAAGAUCAAGGCCAUCGUGCACGCCGAGAGCGUGGUGGACGUGAUCGAGAGCUGGGACGAGUGGCCCGACAUCGAGGAGGACAUCGCCCUGAUCAAGAGCGAGGAGGGCGAGAAGAUGGUGCUGGAGAACAACUUCUUCGUGGAGACCAUGCUGCCCAGCAAGAUCAUGCGGAAGCUGGAGCCCGAGGAGUUCGCCGCCUACCUGGAGCCCUUCAAGGAGAAGGGCGAGGUGCGGCGGCCCACCCUGAGCUGGCCCCGGGAGAUCCCCCUGGUGAAGGGCGGCAAGCCCGACGUGGUGCAGAUCGUGCGGAACUACAACGCCUACCUGCGGGCCAGCGACGACCUGCCCAAGAUGUUCAUCGAGAGCGACCCCGGCUUCUUCAGCAACGCCAUCGUGGAGGGCGCCAAGAAGUUCCCCAACACCGAGUUCGUGAAGGUGAAGGGCCUGCACUUCAGCCAGGAGGACGCCCCCGACGAGAUGGGCAAGUACAUCAAGAGCUUCGUGGAGCGGGUGCUGAAGAACGAGCAGUGA
2	螢火蟲螢光素酶胺基酸	MTSKVYDPEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVIFLHGNAASSYLWRHVVPHIEPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWGACLAFHYSYEHQDKIKAIVHAESVVDVIESWDEWPDIEEDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETMLPSKIMRKLEPEEFAAYLEPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKMFIESDPGFFSNAIVEGAKKFPNTEFVKVKGLHFSQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQ
3	SARS-CoV-2奧密克戎棘蛋白ORF	AUGUUCGUGUUCCUGGUGCUGCUGCCCCUGGUGAGCAGCCAGUGCGUGAACCUGACCACCAGAACCCAGCUGCCCCCCGCCUACACCAACAGCUUCACCAGAGGCGUGUACUACCCCGACAAGGUGUUCAGAAGCAGCGUGCUGCACAGCACCCAGGACCUGUUCCUGCCCUUCUUCAGCAACGUGACCUGGUUCCACGUGAUCAGCGGCACCAACGGCACCAAGAGAUUCGACAACCCCGUGCUGCCCUUCAACGACGGCGUGUACUUCGCCAGCAUCGAGAAGAGCAACAUCAUCAGAGGCUGGAUCUUCGGCACCACCCUGGACAGCAAGACCCAGAGCCUGCUGAUCGUGAACAACGCCACCAACGUGGUGAUCAAGGUGUGCGAGUUCCAGUUCUGCAACGACCCCUUCCUGGACCACAAGAACAACAAGAGCUGGAUGGAGAGCGAGUUCAGAGUGUACAGCAGCGCCAACAACUGCACCUUCGAGUACGUGAGCCAGCCCUUCCUGAUGGACCUGGAGGGCAAGCAGGGCAACUUCAAGAACCUGAGAGAGUUCGUGUUCAAGAACAUCGACGGCUACUUCAAGAUCUACAGCAAGCACACCCCCAUCAUCGUGAGAGAGCCCGAGGACCUGCCCCAGGGCUUCAGCGCCCUGGAGCCCCUGGUGGACCUGCCCAUCGGCAUCAACAUCACCAGAUUCCAGACCCUGCUGGCCCUGCACAGAAGCUACCUGACCCCCGGCGACAGCAGCAGCGGCUGGACCGCCGGCGCCGCCGCCUACUACGUGGGCUACCUGCAGCCCAGAACCUUCCUGCUGAAGUACAACGAGAACGGCACCAUCACCGACGCCGUGGACUGCGCCCUGGACCCCCUGAGCGAGACCAAGUGCACCCUGAAGAGCUUCACCGUGGAGAAGGGCAUCUACCAGACCAGCAACUUCAGAGUGCAGCCCACCGAGAGCAUCGUGAGAUUCCCCAACAUCACCAACCUGUGCCCCUUCGACGAGGUGUUCAACGCCACCAGAUUCGCCAGCGUGUACGCCUGGAACAGAAAGAGAAUCAGCAACUGCGUGGCCGACUACAGCGUGCUGUACAACCUGGCCCCCUUCUUCACCUUCAAGUGCUACGGCGUGAGCCCCACCAAGCUGAACGACCUGUGCUUCACCAACGUGUACGCCGACAGCUUCGUGAUCAGAGGCGACGAGGUGAGACAGAUCGCCCCCGGCCAGACCGGCAACAUCGCCGACUACAACUACAAGCUGCCCGACGACUUCACCGGCUGCGUGAUCGCCUGGAACAGCAACAAGCUGGACAGCAAGGUGAGCGGCAACUACAACUACCUGUACAGACUGUUCAGAAAGAGCAACCUGAAGCCCUUCGAGAGAGACAUCAGCACCGAGAUCUACCAGGCCGGCAACAAGCCCUGCAACGGCGUGGCCGGCUUCAACUGCUACUUCCCCCUGAAGAGCUACAGCUUCAGACCCACCUACGGCGUGGGCCACCAGCCCUACAGAGUGGUGGUGCUGAGCUUCGAGCUGCUGCACGCCCCCGCCACCGUGUGCGGCCCCAAGAAGAGCACCAACCUGGUGAAGAACAAGUGCGUGAACUUCAACUUCAACGGCCUGAAGGGCACCGGCGUGCUGACCGAGAGCAACAAGAAGUUCCUGCCCUUCCAGCAGUUCGGCAGAGACAUCGCCGACACCACCGACGCCGUGAGAGACCCCCAGACCCUGGAGAUCCUGGACAUCACCCCCUGCAGCUUCGGCGGCGUGAGCGUGAUCACCCCCGGCACCAACACCAGCAACCAGGUGGCCGUGCUGUACCAGGGCGUGAACUGCACCGAGGUGCCCGUGGCCAUCCACGCCGACCAGCUGACCCCCACCUGGAGAGUGUACAGCACCGGCAGCAACGUGUUCCAGACCAGAGCCGGCUGCCUGAUCGGCGCCGAGUACGUGAACAACAGCUACGAGUGCGACAUCCCCAUCGGCGCCGGCAUCUGCGCCAGCUACCAGACCCAGACCAAGAGCCACCAGCAGGCCCAGAGCGUGGCCAGCCAGAGCAUCAUCGCCUACACCAUGAGCCUGGGCGCCGAGAACAGCGUGGCCUACAGCAACAACAGCAUCGCCAUCCCCACCAACUUCACCAUCAGCGUGACCACCGAGAUCCUGCCCGUGAGCAUGACCAAGACCAGCGUGGACUGCACCAUGUACAUCUGCGGCGACAGCACCGAGUGCAGCAACCUGCUGCUGCAGUACGGCAGCUUCUGCACCCAGCUGAAGAGAGCCCUGACCGGCAUCGCCGUGGAGCAGGACAAGAACACCCAGGAGGUGUUCGCCCAGGUGAAGCAGAUCUACAAGACCCCCCCCAUCAAGUACUUCGGCGGCUUCAACUUCAGCCAGAUCCUGCCCGACCCCAGCAAGCCCAGCAAGAGAAGCUUCAUCGAGGACCUGCUGUUCAACAAGGUGACCCUGGCCGACGCCGGCUUCAUCAAGCAGUACGGCGACUGCCUGGGCGACAUCGCCGCCAGAGACCUGAUCUGCGCCCAGAAGUUCAAGGGCCUGACCGUGCUGCCCCCCCUGCUGACCGACGAGAUGAUCGCCCAGUACACCAGCGCCCUGCUGGCCGGCACCAUCACCAGCGGCUGGACCUUCGGCGCCGGCGCCGCCCUGCAGAUCCCCUUCGCCAUGCAGAUGGCCUACAGAUUCAACGGCAUCGGCGUGACCCAGAACGUGCUGUACGAGAACCAGAAGCUGAUCGCCAACCAGUUCAACAGCGCCAUCGGCAAGAUCCAGGACAGCCUGAGCAGCACCGCCAGCGCCCUGGGCAAGCUGCAGGACGUGGUGAACCACAACGCCCAGGCCCUGAACACCCUGGUGAAGCAGCUGAGCAGCAAGUUCGGCGCCAUCAGCAGCGUGCUGAACGACAUCUUCAGCAGACUGGACCCCCCCGAGGCCGAGGUGCAGAUCGACAGACUGAUCACCGGCAGACUGCAGAGCCUGCAGACCUACGUGACCCAGCAGCUGAUCAGAGCCGCCGAGAUCAGAGCCAGCGCCAACCUGGCCGCCACCAAGAUGAGCGAGUGCGUGCUGGGCCAGAGCAAGAGAGUGGACUUCUGCGGCAAGGGCUACCACCUGAUGAGCUUCCCCCAGAGCGCCCCCCACGGCGUGGUGUUCCUGCACGUGACCUACGUGCCCGCCCAGGAGAAGAACUUCACCACCGCCCCCGCCAUCUGCCACGACGGCAAGGCCCACUUCCCCAGAGAGGGCGUGUUCGUGAGCAACGGCACCCACUGGUUCGUGACCCAGAGAAACUUCUACGAGCCCCAGAUCAUCACCACCGACAACACCUUCGUGAGCGGCAACUGCGACGUGGUGAUCGGCAUCGUGAACAACACCGUGUACGACCCCCUGCAGCCCGAGCUGGACAGCUUCAAGGAGGAGCUGGACAAGUACUUCAAGAACCACACCAGCCCCGACGUGGACCUGGGCGACAUCAGCGGCAUCAACGCCAGCGUGGUGAACAUCCAGAAGGAGAUCGACAGACUGAACGAGGUGGCCAAGAACCUGAACGAGAGCCUGAUCGACCUGCAGGAGCUGGGCAAGUACGAGCAGUACAUCAAGUGGCCCUGGUACAUCUGGCUGGGCUUCAUCGCCGGCCUGAUCGCCAUCGUGAUGGUGACCAUCAUGCUGUGCUGCAUGACCAGCUGCUGCAGCUGCCUGAAGGGCUGCUGCAGCUGCGGCAGCUGCUGCAAGUUCGACGAGGACGACAGCGAGCCCGUGCUGAAGGGCGUGAAGCUGCACUACACCUGA
4	SARS-CoV-2奧密克戎棘蛋白胺基酸	MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHVISGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASIEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPIIVREPEDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNLAPFFTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNCYFPLKSYSFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLKGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEYVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTKSHQQAQSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLKRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKYFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFKGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNHNAQALNTLVKQLSSKFGAISSVLNDIFSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT

實施例2：使用薄膜法製備脂質體遞送載體

將DOTAP (CH2900014，Merck，德國)、DOPE (LP-R4-069，Corden Pharma，德國)和膽固醇(W004591，Sigma-Aldrich，USA)以40∶40∶20比例各自與氯仿混合，並在37℃下完全溶解10分鐘以形成液體溶液。

透過在圓底燒瓶中以預定的重量比混合液體溶液製備脂質混合物，並且將包含DOTAP的脂質混合物在旋轉蒸發器(B491_R200，Buchi，Switzerland)中於60℃下揮發30分鐘以吹掉氯仿，並且在燒瓶的壁上形成脂質膜。

將包括4%蔗糖的20 mM HEPES緩衝液置於燒瓶中，在60℃下溶解脂質膜以形成脂質體。使用動態光散射分析儀測量由此形成的脂質體的粒徑、界達(ζ)電位和分散度。將所製備的脂質體冷藏(2-8℃)直至測試。

實施例3：mRNA-脂質體複合物的製備

透過在包括4%蔗糖的20 mM HEPES緩衝液中混合實施例2中製備的脂質體(LP-DOTAP/DOPE/膽固醇(40∶40∶20))和6種類型的mRNA來製備相應的mRNA-脂質體複合物。

這裡，所用的脂質體溶液(LP-DOTAP/DOPE/膽固醇(40∶40∶20))是在製備後立即獲得的溶液或在製備後冷藏達2周的溶液。將mRNA溶液儲存在-70℃或更低的溫度下，使用前立即在冰上解凍後使用。所用的含4%蔗糖的20 mM HEPES緩衝液是在實驗前立即製備的，或在實驗前一天製備後冷藏(2-8℃)的。

N/P比，即脂質體和mRNA的混合比，使用以下方程計算。 N:P = DOTAP的莫耳數:mRNA的莫耳數 * mRNA的核苷酸數

陽離子脂質體和每種mRNA的N/P比為0.6∶1.0。

實施例4：mRNA表達效率依賴於經修飾的核苷酸類型的證實

為了證實與陽離子脂質體混合時體內表達效率依賴於經修飾的核苷酸的類型，將實施例1中製備的2)和3)中每一種的mRNA與陽離子脂質體以與實施例3中相同的方式混合，以形成mRNA-脂質體複合物。

將所製備的mRNA-脂質體複合物以每種100μL經肌內注射到6周齡雌性Balb/c裸鼠(Orient Bio，Korea)的左大腿中(IM注射)。

給藥後6小時，透過腹膜內給藥250 mg/kg的Avertin工作溶液來麻醉小鼠，並將20 mL的1x PBS加入到螢光素酶受質(VivoGloTM螢光素，P1043，Promega，USA)中以獲得50 mg/mL的受質工作溶液，然後在給藥前將其稀釋至15 mg/mL，並透過尾靜脈對每隻小鼠經靜脈注射200μL的受質工作溶液(IV注射)。

受質給藥後，立即將小鼠置於體內成像系統(IVIS) (Ami HTX，Spectral Instrument，USA)中，透過將暴露時間設置為60秒來拍攝圖像，並定量感興趣區域(ROI)的螢光素酶表達水準。

由此，如圖1所示出，證實了經5moU修飾的mRNA+脂質體組的ROI值比經m1ψ修飾的mRNA+脂質體組的ROI值高約4.3至10.2倍。

實施例5.免疫原性依賴於經修飾的核苷酸類型的證實

為了證實體內免疫原性依賴於經修飾的核苷酸的類型，將實施例1中製備的5)和6)中每一種的mRNA與陽離子脂質體以與實施例3中相同的方式混合，以製備mRNA-脂質體複合物。

基於mRNA的量，將5、10、20和40μg的每種mRNA-脂質體複合物經肌內注射到6周齡雌性Balb/c小鼠(Central Lab. Animal Inc.，韓國)的左大腿，條件是每隻小鼠100μL，間隔3周注射3次(IM注射)。

最終免疫後兩周，處死小鼠，分離血清，透過間接ELISA分析SARS-CoV-2奧密克戎受體結合域(RBD)蛋白特異性總IgG抗體滴度(log10)來確定終點滴度。

5-1: 血液採集

在最後一次給藥mRNA-脂質體複合物後兩周，透過腹腔內給藥250 mg/kg的Avertin工作溶液來麻醉小鼠，並透過心臟採血收集全血。將如此收集的全血轉移到微管中，使其在室溫下靜置3小時，並在4℃和15000 rpm下離心10分鐘，之後將上清液轉移到新的微管中，獲得血清並儲存在-20℃或更低的溫度下直至分析。

5-2: 抗體滴度的分析

使用1x PBS將RBD抗原(SARS-CoV-2棘蛋白，MBS335825，Mybiosource，USA)稀釋至1μg/mL，以100μL/孔分配到免疫板中，用密封膜覆蓋，並允許在4℃的冰箱中靜置過夜。用ELISA洗滌器(Hydroflexelisa，Tecan，瑞士)去除每個孔中的溶液，隨後使用洗滌緩衝液(將500μL的吐溫-20添加到透過用純水稀釋20x PBS獲得的1L的1x PBS中)洗滌三次。將試劑稀釋劑(1% BSA在PBS中，透過將1 g的BSA溶解在100 mL的PBS中製備)以200μL/孔分配到免疫板中，用密封膜覆蓋，並允許在37℃的反應器中靜置1小時。用ELISA洗滌器除去每個孔中的溶液，然後用洗滌緩衝液洗滌三次。將100μL/孔的試劑稀釋劑分配到免疫板中。

在使用試劑稀釋劑(1% BSA在PBS中)以1∶50稀釋上述獲得的血清樣品中的陰性對照組(緩衝液給藥組)和以1∶100稀釋疫苗給藥組之後，將其100μL分配到免疫板的B至G的第1行中，並且透過在孔中吸移幾次來混合樣品，之後以從第1行中取出100μL並將其添加到第2行中的方式對樣品進行1/2系列稀釋，直到ELISA板上的第12行。因此，為了評估試驗的充分性，使用試劑稀釋劑將超血清按照1:200稀釋，之後將其100μL分配到免疫板的H的第1行，接著以與上述相同的方式進行1/2系列稀釋。

用密封膜覆蓋免疫板，然後在反應器中於37℃反應2小時。用ELISA洗滌器除去每個孔中的溶液，然後用洗滌緩衝液洗滌三次。使用試劑稀釋劑將山羊抗小鼠IgG抗體(Jackson Laboratory，USA)按照1:5000稀釋，以100μL的量分配到免疫板中，用密封膜覆蓋，並在37℃的反應器中反應1小時。用ELISA洗滌器除去每個孔中的溶液，然後用洗滌緩衝液洗滌三次。

將平衡至室溫的TMB受質工作溶液以100μL/孔分配到免疫板中，並在室溫下於黑暗中反應12分鐘。透過將1 N H ₂SO ₄溶液以100μL/孔分配到免疫板中來終止反應，並使用ELISA讀數器(Epoch，Biotek，USA)在450 nm處測量吸光度。

因此，如圖2所示，證實當每隻小鼠加入基於mRNA量的5μg或10μg的複合物時，經5moU修飾的mRNA+脂質體組的結合抗體滴度高於經m1ψ修飾的mRNA+脂質體組的結合抗體滴度。

實施例6：炎性反應依賴於經修飾的核苷酸的類型的鑒定

為了證實mRNA-脂質體複合物的炎性反應依賴於經修飾的核苷酸的類型，將實施例1中製備的4)、5)和6)中每一種的mRNA與陽離子脂質體以與實施例3中相同的方式混合，以形成mRNA-脂質體複合物。

將小鼠免疫細胞系J774A.1細胞(TIB-67，ATCC，美國)以1×10 ⁶個細胞/孔接種於24孔細胞培養板中，隨後在CO ₂培養箱中於37℃培養過夜。當細胞匯合為70-80%時，用每種mRNA-脂質體複合物處理細胞，以mRNA為基準10μg/孔，隨後在CO ₂培養箱中於37℃培養過夜。在陽性對照組中，用LPS以10μg/孔來處理細胞。此後，將板在3000 rpm和4℃下離心3分鐘，之後傾去上清液並收集每種細胞培養液。

使用ELISA測定每種培養液中分泌的炎性細胞因子標誌物的濃度，使用的ELISA試劑盒如下。 - IL-1β：小鼠IL-1β quantikine ELISA (SMLB00C，R&D systems，USA) - IL-6：小鼠IL-6 quantikine ELISA (SM6000B，R&D systems，USA) - TNF-α：小鼠TNF-α quantikine ELISA (SMTA00B，R&D systems，USA) - IFN-α：小鼠IFN-α所有亞型 quantikine ELISA (MFNAS0，R&D systems，USA)

因此，如下表2所示，使用未經修飾的核苷酸+脂質體組的mRNA中IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-α的分泌比經5moU修飾的mRNA+脂質體組高約1.9至159.5倍，而經m1ψ修飾的mRNA+脂質體組中IL-6、TNF-α和IFN-α的分泌比經5moU修飾的mRNA+脂質體組高約2.5至94.3倍。

[表2]

脂質體混合後，炎性細胞因子的分泌依賴於UTP修飾(pg/mL)

(pg/mL)	未處理	LPS	奧密克戎 mRNA + 脂質體
UTP	5moU	m1ψ
IL-1β	＜ 12.5	110.4	525.5	＜ 12.5	＜ 12.5
IL-6	5.5	33575.0	1994.4	＜ 12.5	1179.0
TNF-α	＜ 109	40221.7	2119.7	666.6	1706.9
IFN-α	65.9	269.5	124.0	66.8	1410.9

通常，已知當使用經修飾的核苷酸進行IVT時，由於非炎性mRNA的影響，與使用未經修飾的核苷酸相比，炎症反應較低。在經修飾的核苷酸中，經5moU修飾的mRNA+脂質體組顯示出比經m1ψ修飾的mRNA +脂質體組更低水準的炎性細胞因子分泌，證實了在5moU修飾的mRNA和脂質體的組合中炎症反應大大降低。

上面已經詳細描述了本發明的特定部分，對於本領域具有通常知識者來說顯而易見的是，這些特定描述僅僅是優選實施方式，本發明的範圍並不因此受到限制。因此，本發明的實質範圍由所附請求項及其等同物來限定。

根據本發明，用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物具有優異的儲存穩定性，並在體內表現出高的細胞內遞送和表達效率，從而增加了用於癌症治療的mRNA疫苗或用於預防病毒感染的mRNA疫苗以及其他mRNA疫苗或治療劑的穩定性和效率。

無

根據下面具體實施方式結合圖式將更清楚地理解本發明的上述和其他目的、特徵和其他優點，其中：

圖1示出了小鼠中mRNA表達效率依賴於mRNA-脂質體複合物中經修飾的核苷酸的類型的；和

圖2示出了在給藥製備的mRNA-脂質體複合物的小鼠血清中，透過ELISA分析的RBD特異性IgG抗體滴度的結果依賴於經修飾的核苷酸的類型。

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無。

Claims (17)

1. 一種用於遞送包含經修飾的核苷酸的mRNA的組合物，包括基於陽離子脂質的脂質體。
2. 如請求項1所述的組合物，其中，所述經修飾的核苷酸選自由以下組成的組：假尿苷(Ψ)、N1-甲基假尿苷(m1Ψ)、5-甲基尿苷(m5U)、2-硫代尿苷(s2U)、2'-O-甲基尿苷(Um)、5-甲基胞苷(m5C)以及5-甲氧基尿苷(5moU)。
3. 如請求項1所述的組合物，其中，所述脂質體還包括中性脂質。
4. 如請求項1所述的組合物，其中，所述脂質體還包括膽固醇。
5. 如請求項1所述的組合物，其中，所述陽離子脂質為選自以下組成的組的至少一種：二甲基雙十八烷基溴化銨(DDA)、C12-200、1,2-二油醯-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)、3β-[N-(N',N'-二甲基胺基乙烷)胺基甲醯基膽固醇(DC-Chol)、1,2-二油醯氧基-3-二甲基銨丙烷(DODAP)、1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基銨丙烷(DOTMA)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(14:1乙基PC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(16:0/18:1乙基PC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(18:1乙基PC)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(18:0乙基PC)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(16:0乙基PC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(14:0乙基PC)、1,2-二月桂醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(12:0乙基PC)、N1-[2-((1S)-1-[(3-胺基丙基)胺基]-4-[二(3-胺基-丙基)胺基]丁基羧醯胺基)乙基]-3,4-二[油醯氧基]-苯甲醯胺(MVL5)、1,2-二肉豆蔻醯基-3-二甲基銨-丙烷(14:0 DAP)、1,2-二棕櫚醯基-3-二甲基銨-丙烷(16:0 DAP)、1,2-二硬脂醯基-3-二甲基銨-丙烷(18:0 DAP)、N-(4-羧基苄基)-N,N-二甲基-2,3-雙(油醯氧基)丙-1-胺(DOBAQ)、1,2-二硬脂醯基-3-三甲基銨-丙烷(18:0 TAP)、1,2-二棕櫚醯基-3-三甲基銨-丙烷(16:0 TAP)、1,2-二肉豆蔻醯基-3-三甲基銨-丙烷(14:0 TAP)以及N4-膽固醇基-精胺(GL67)。
6. 如請求項3所述的組合物，其中，所述中性脂質是選自由以下組成的組的至少一種：1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DMPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DLPC)、磷脂醯基絲胺酸(PS)、磷酸乙醇胺(PE)、磷脂醯基甘油(PG)、磷酸(PA)、磷脂醯基膽鹼(PC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-肌醇)(DOPI)和1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸肌醇(DSPI)。
7. 如請求項3所述的組合物，其中，所述陽離子脂質與所述中性脂質的重量比為1∶9至9.5∶0.5。
8. 如請求項4所述的組合物，其中，所述陽離子脂質與所述膽固醇的重量比為6∶1至1∶3。
9. 如請求項8所述的組合物，其中，所述陽離子脂質與所述中性脂質與所述膽固醇的重量比為1.0-9.5:0.5-9.0:0.05-3.00。
10. 如請求項1所述的組合物，其中，所述包含經修飾的核苷酸的mRNA編碼充當免疫原的肽或蛋白質。
11. 如請求項1所述的組合物，其中，所述脂質體和所述包含經修飾的核苷酸的mRNA的N∶P比為0.23∶1.00至1.39∶1.00。
12. 如請求項1所述的組合物，其中，所述脂質體還包括免疫增強劑。
13. 如請求項12所述的組合物，其中，所述免疫增強劑包括選自由以下組成的組的至少一種：PAMP、皂苷、CpG DNA、脂蛋白、鞭毛、聚I:C、角鯊烯、三癸酸酯、3D-MPL和脫毒脂寡糖(dLOS)。
14. 一種用於預防或治療選自由以下組成的組的疾病的藥物組合物：癌症、腫瘤、自體免疫性疾病、遺傳性疾病、炎性疾病、病毒感染和細菌感染，包括如請求項1至13中任一項所述的組合物作為活性成分。
15. 一種疫苗，其包括如請求項1至13中任一項所述的組合物作為活性成分。
16. 如請求項15所述的疫苗，其中，所述疫苗呈凍乾製劑的形式。
17. 一種功能性化妝品組合物，包括如請求項1至13中任一項所述的組合物作為活性成分。