WO2024022263A1 - 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物 - Google Patents

Abstract

脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物。所述脂质化合物具有式（I）所示结构，其可以与其他脂质组分，例如中性脂质、胆固醇和聚合物缀合的脂质结合使用，形成脂质纳米颗粒，用于递送用于治疗或预防目的的治疗剂，例如核酸分子。所述脂质纳米颗粒组合物包含所述脂质化合物。

Description

脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物 技术领域

本发明总体上涉及一种脂质化合物，其可用于与其他脂质组分(例如中性脂质，胆固醇和聚合物缀合的脂质)结合，以形成在胞内和胞外用于递送治疗剂(例如核酸分子，包括锁(LNA)，肽核酸(PNA)和吗啉环寡聚核苷酸等核酸模拟物)的脂质纳米颗粒，进而用于包括疫苗接种在内的治疗或预防目的。

背景技术

治疗性核酸具有彻底改变疫苗接种，基因疗法，蛋白质替代疗法和其他遗传疾病疗法的潜力。自2000年代开始对治疗性核酸的首次临床研究以来，通过核酸分子的设计及其递送方法的改进已经取得了重大进展。然而，核酸治疗剂仍面临若干挑战，包括低细胞渗透性和对某些核酸分子(包括RNA)降解的高敏感性。因此，需要开发新的核酸分子以及相关的方法和组合物，以促进其在胞外或胞内的递送以用于治疗和/或预防目的。

发明内容

在一个实施方案中本文提供了脂质化合物，包括其药学上可接受的盐或立体异构体，其可以单独使用，或者与其他脂质组分例如中性脂质，带电脂质，类固醇(包括例如所有固醇)和/或它们的类似物，和/或与聚合物共轭的脂质，和/或聚合物组合使用，以形成脂质纳米颗粒，从而用于递送治疗剂(例如核酸分子，包括如锁核酸(LNA)，肽核酸(PNA)和吗啉环寡聚核苷酸等核酸模拟物)。在一些情况下，脂质纳米颗粒用于递送核酸，例如反义和/或信使RNA。其还提供了使用这种脂质纳米颗粒来治疗各种疾病或病况(如由感染性实体和/或蛋白质不足引起的疾病或病况)的方法。

在一个实施方式中，本文提供了式(I)所表示的化合物：

或其药物可用的盐或立体异构体，其中L₁、L₂、L₃、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₆如本文或其它处所定义。

在一个实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的化合物以及治疗剂或预防剂的纳米颗粒组合物。在一个实施方案中，治疗剂或预防剂包含至少一种编码抗原或其片段或表位的mRNA。

对本领域技术人员显而易见的是，本发明对于具体的实施方式作出了详细描述，然而，应理解的是，其仅以说明性方式而非限制性方式给出，在本发明的范围内的各种变化和修改对于所属领域的技术人员将是显而易见的。

附图说明

图1是显示化合物在脾中的表达的图。

具体实施方式

通用技术

本发明中描述或引用的技术和方法包括本领域技术人员通常容易理解或通常使用的常规方法，例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3d ed.2001)；Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.eds.,2003)等中所描述的方法。

术语

除非另有描述，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。为了解释本说明书的目的，将使用以下术语描述，并且在适当时，以单数形式使用的术语还将包括复数，反之亦然。本文引用的所有专利和其他出版物的公开内容通过引用的方式整体并入本文。在本文术语的任何描述阐释与通过引用并入本文的任何文件相冲突的情况下，以下述术语的描述与阐释为准。

除非本文另有说明，术语“脂质”是指一组有机化合物，其包括，但不限于，脂肪酸的酯，并且以通常在水中有较差的溶解性，但可溶于许多非极性有机物中为特征。尽管脂质通常在水中具有较差的溶解度，但是某些类别的脂质(例如，被极性基团修饰的脂质如DMG-PEG2000)具有有限的水溶性，并且在某些条件下可以溶解于水中。脂质的已知类型包括生物分子，例如脂肪酸、蜡、固醇、脂溶性维生素、甘油单酸酯、甘油二酸酯、甘油三酸酯和磷脂。脂质通常至少可分为三类：(1)“简单脂质”，包括脂肪和油以及蜡；(2)“化合物脂质”，包括磷脂和糖脂(如DMPE-PEG2000)；(3)“衍生脂质”，如类固醇等。此外，如本文所用，脂质也包括类脂质化合物。术语“类脂质化合物”，也简称为“类脂质”，是指具有类脂质物理性质的两亲性化合物等类脂质化合物。

术语“脂质纳米颗粒”或“LNP”是指具有纳米量级(nm)(例如1nm至1,000nm)的颗粒，其包含一种或多种类型的脂质分子。本文提供的LNP可以进一步包含至少一种非脂质有效载荷分子(例如，一种或多种核酸分子)。在一些实施方案中，LNP包含部分或完全包封在脂质壳内部的非脂质有效载荷分子。特别地，在一些实施方案中，其中有效载荷是带负电荷的分子(例如，编码病毒蛋白的mRNA)，并且LNP的脂质组分包含至少一种阳离子脂质。可以预期的是，阳离子脂质可以与带负电荷的有效负载分子相互作用，并在LNP形成过程中促进有效负载掺入和/或封装到LNP中。如本文提供的，可以形成LNP的一部分的其他脂质包括但不限于中性脂质和带电荷的脂质，例如类固醇、聚合物缀合的脂质和各种两性离子脂质。在某些实施方案中，根据本发明的LNP包含一种或多种本文所述的式(I)(及其子式)的脂质。

术语“阳离子脂质”是指在其所处环境的任何pH值或氢离子活性下带正电荷的脂质，或能够响应其所处环境(例如其预期使用环境)的pH值或氢离子活性而带正电荷的脂质。因此，术语“阳离子”涵盖“永久阳离子”和“可阳离子化的”的范围。在某些实施方案中，阳离子脂质中的正电荷源自季氮原子的存在。在某些实施方案中，阳离子脂质包括两性离子脂质，该两性离子脂质在其预期施用的环境中(例如，在生理pH下)带正电荷。在某些实施方案中，阳离子脂质是本文所述的一种或多种式(I)(及其子式)的脂质。

术语“聚合物缀合脂质”或“聚合物共轭脂质”是指既包含脂质部分又包含聚合物部分的分子。聚合物缀合脂质的实例是聚乙二醇化脂质(PEG-脂质)，其中聚合物部分包含聚乙二醇。

术语“中性脂质”涵盖在选定的pH下以不带电荷形式或中性两性离子形式存在的任何脂质分子。在一些实施方案中，选定的有用的pH值或范围对应于脂质的预期使用的环境的pH条件，例如生理pH。作为非限制性实例，可以与本文公开结合使用的中性脂质包括但不限于磷脂酰胆碱，例如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、11,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)，磷脂酰乙醇胺如1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，2-(((2,3-双(油酰氧基)丙基))磷酸二甲基铵)乙基氢(DOCP)，鞘磷脂(SM)，神经酰胺，类固醇如甾醇及其衍生物。中性脂质可以是合成的或衍生(分离或修饰)自天然来源或化合物。

术语“带电脂质”涵盖在选定pH值或范围内以带正电或带负电形式存在的任何脂质分子。在一些实施方案中，选定的pH值或范围对应于脂质的预期使用环境的pH条件，例如生理pH。作为非限制性实例，可以与本文公开结合使用的带电脂质包括但不限于磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、固醇半琥珀酸酯、二烷基三甲基铵-丙烷(例如DOTAP、DOTMA)、二烷基二甲基氨基丙烷、乙基磷胆碱、二甲基氨基乙烷氨基甲酰基甾醇(例如DC-Chol)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸钠盐(DOPS-Na)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)钠盐(DOPG-Na)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸钠盐(DOPA-Na)。本文提供的带电脂质可以是合成的或衍生(分离或修饰)自天然来源或化合物。

如本文所述的，除非另有说明，术语“烷基”是指仅由饱和的碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团。在一个实施方案中，烷基具有例如1至24个碳原子(C₁-C₂₄烷基)、4至20个碳原子(C₄-C₂₀烷基)、10至20个碳原子(C₁₀-C₂₀烷基)、6至16个碳原子(C₆-C₁₆烷基)、六至九个碳原子(C₆-C₉烷基)、一至十五个碳原子(C₁-C₁₅烷基)、一至十二个碳原子(C₁-C₁₂烷基)、一至八个碳原子(C₁-C₈烷基)或一至六个碳原子(C₁-C₆烷基)，并通过单键与分子的其余部分相连。烷基的实例包括但不限于甲基，乙基，丙基，1-甲基乙基(异丙基)，正丁基，正戊基，1,1-二甲基乙基(叔丁基)，3-甲基己基，2-甲基己基等。除非另有说明，否则烷基是任选取代的。

如本文所述的，除非另有说明，术语“烯基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，其含有一个或多个碳-碳双键。如本领域普通技术人员所理解的，术语“烯基”还包括具有“顺式”和“反式”构型，或者“E”和“Z”构型的基团。在一个实施方案中，烯基具有例如2至24个碳原子(C₂-C₂₄烯基)、4至20个碳原子(C₄-C₂₀烯基)、6至16个碳原子(C₆-C₁₆烯基)、六至九个碳原子(C₆-C₉烯基)、二至十五个碳原子(C₂-C₁₅烯基)、二至十二个碳原子(C₂-C₁₂烯基)、二至八个碳原子(C₂-C₈烯基)或2至6个碳原子(C₂-C₆烯基)，并通过单键与分子的其余部分相连。烯基的实例包括但不限于乙烯基，丙-1-烯基，丁-1-烯基，戊-1-烯基，戊-1,4-二烯基等。除非另有说明，否则烯基是任选取代的。

如本文所述的，除非另有说明，术语“炔基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，其含有一个或多个碳-碳三键。在一个实施方案中，炔基具有例如2至24个碳原子(C₂-C₂₄炔基)、4至20个碳原子(C₄-C₂₀炔基)、6至16个碳原子(C₆-C₁₆炔基)、六个到九个碳原子(C₆-C₉炔基)、两个到十五个碳原子(C₂-C₁₅炔基)、两个到十二个碳原子(C₂-C₁₂炔基)、两个到八个碳原子(C₂-C₈炔基)或两个到六个碳原子(C₂-C₆炔基)，并通过单键与分子的其余部分相连。炔基的实例包括但不限于乙炔基，丙炔基，丁炔基，戊炔基等。除非另有说明，否则炔基是任选取代的。

如本文所述的，除非另有说明，术语“亚烷基”或“亚烷基链”是指将分子的其余部分连接至仅由饱和的碳和氢组成的基团的直链或支链二价烃链。在一个实施方案中，亚烷基具有例如1至24个碳原子(C₁-C₂₄亚烷基)、1至15个碳原子(C₁-C₁₅亚烷基)、1至12个碳原子(C₁-C₁₂亚烷基)、1至8个碳原子(C₁-C₈亚烷基)、1至6个碳原子(C₁-C₆亚烷基)、2至4个碳原子(C₂-C₄亚烷基)、1至2个碳原子(C₁-C₂亚烷基)。亚烷基的实例包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、正丁烯等。亚烷基链通过单键连接至分子的其余部分，并通过单键连接至自由基基团。亚烷基链与分子其余部分和与自由基基团的连接可以通过链中的一个碳或任何两个碳。除非另有说明，否则亚烷基链是任选取代的。

如本文所述的，除非另有说明，术语“亚烯基”是指将分子的其余部分连接至仅由碳和氢组成的自由基基团的直链或支链二价烃链，该自由基基团包含一个或多个碳-碳双键。在一个实施方案中，亚烯基具有例如2至24个碳原子(C₂-C₂₄亚烯基)、2至15个碳原子(C₂-C₁₅亚烯基)、2至12个碳原子(C₂-C₁₂亚烯基)、2至8个碳原子(C₂-C₈亚烯基)、2至6个碳原子(C₂-C₆亚烯基)或2至4个碳原子(C₂-C₄亚烯基)。亚烯基的实例包括但不限于亚乙烯基、亚丙烯基、正丁烯基等。亚烯基通过单键或双键连接至分子的其余部分，并通过单键或双键连接至自由基基团。亚烯基与分子的其余部分和与自由基基团的连接可以通过链中的一个碳或任何两个碳。除非另有说明，亚烯基是任选取代的。

如本文所述的，除非另有说明，术语“环烷基”是指仅由碳和氢原子组成且为饱和的非芳族单环或多环烃基。环烷基可以包括稠环或桥环系统。在一个实施方案中，环烷基具有例如3至15个环碳原子(C₃-C₁₅环烷基)，3至10个环碳原子(C₃-C₁₀环烷基)或3至8个环碳原子(C₃-C₈环烷基)。环烷基通过单键连接至分子的其余部分。单环环烷基的实例包括但不限于环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基和环辛基。多环环烷基基团的实例包括但不限于金刚烷基，降冰片基，十氢烷基，7,7-二甲基-双环[2.2.1]庚基等。除非另有说明，否则环烷基是任选取代的。

如本文所述的，除非另有说明，术语“亚环烷基”是二价环烷基。除非另有说明，亚环烷基任选地被取代。

如本文所述的，除非另有说明，术语“环烯基”是指仅由碳和氢原子组成且包括一个或多个碳-碳双键的非芳族单环或多环烃基。环烯基可包括稠环或桥环系统。在一个实施方案中，环烯基具有例如3至15个环碳原子(C₃-C₁₅环烯基)、3至10个环碳原子(C₃-C₁₀环烯基)或3至8个环碳原子(C₃-C₈环烯基)。环烯基通过单键连接至分子的其余部分。单环环烯基基团的实例包括但不限于环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基等。除非另有说明，环烯基基团是任选取代的。

如本文所述的，除非另有说明，否则术语“亚环烯基”是二价环烯基。除非另有说明，亚环烯基基团是任选取代的。

如本文所述的，除非另有说明，否则术语“杂环基”是指包含一个或多个(例如，一个，一个或两个，一至三个，或一至四个)独立地选自氮，氧，磷和硫杂原子的非芳香族基团单环或多环部分。杂环基可以在任何杂原子或碳原子处连接至主结构。杂环基可以是单环，双环，三环，四环或其他多环系统，其中多环系统可以是稠环，桥环或螺环系统。杂环多环系统可在一个或多个环中包括一个或多个杂原子。杂环基可以是饱和的或部分不饱和的。饱和的杂环烷基可以被称为“杂环烷基”。若杂环基包含至少一个双键，则部分不饱和的杂环烷基可被称为“杂环烯基”；若杂环基包含至少一个三键，则可被称为“杂环炔基”。在一个实施方案中，杂环基具有例如3至18个环原子(3至18元杂环基)，4至18个环原子(4至18元杂环基)，5至18个环原子(5至18元杂环基)，4至8个环原子(4至8元杂环基)或5至8个环原子(5至8元杂环基)。在本文中，无论何时出现，诸如“3至18”的数值范围是指给定范围内的每个整数。例如，“3至18元杂环基”是指杂环基可以由3个环原子，4个环原子，5个环原子，6个环原子，7个环原子，8个环原子，9个环原子，10个环原子，最多18个环原子等组成。杂环基的例子包括但不限于咪唑基，咪唑烷基，恶唑基，恶唑烷基，噻唑基，噻唑烷基，吡唑烷基，吡唑基，异恶唑烷基，异恶唑基，异噻唑烷基吡咯基，异噻唑基，呋喃基，呋喃基，呋喃基，哌啶基，喹啉基和异喹啉基。除非另有说明，否则杂环基是任选取代的。

如本文所述的，除非另有说明，否则术语“亚杂环基”是二价杂环基。除非另有说明，否则亚杂环基是任选取代的。

如本文所述的，除非另有说明，术语“芳基”是指包含至少一个芳族烃环的单环芳族基团和/或多环一价芳族基团。在某些实施方案中，芳基具有6至18个环碳原子(C6-C18芳基)、6至14个环碳原子(C6-C14芳基)或6至10个环碳原子(C6-C10芳基)。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基、芴基、薁基(azulenyl)，蒽基、菲基，芘基(pyrenyl)、联苯基和三联苯基。术语“芳基”还指双环，三环或其他多环烃环，其中至少一个环是芳族的，并且其他环可以是饱和的，部分不饱和的或芳族的，例如二氢萘基、茚基、茚满基或四氢萘基(四氢萘基)。除非另有说明，否则芳基是任选取代的。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“亚芳基”是二价芳基。除非另有说明，亚芳基是任选取代的。

如本文所述的，除非另有说明，术语“杂芳基”是指含有至少一个芳香环的单环芳香族基团和/或多环芳香族基团，其中至少一个芳香族环含有一个或多个独立地选自O，S和N的一个至三个或一个至四个杂原子。杂芳基中杂原子可以在任何碳原子处连接至主结构。在某些实施方案中，杂芳基具有5至20、5至15或5至10个环原子。术语“杂芳基”还指双环，三环或其他多环，其中至少一个环是芳族的，并且其他环可以是饱和的，部分不饱和的或芳族的，其中至少一个芳族环包含一个或多个单环杂芳基的实例，包括但不限于，吡咯基，吡唑基，吡唑啉基，咪唑基，恶唑基，异恶唑基，噻唑基，噻二唑基，异噻唑基，呋喃基，噻吩基，恶二唑基，吡嗪基，嘧啶基，哒嗪基和三嗪基。双环杂芳基的实例包括但不限于吲哚基，苯并噻唑基，苯并恶唑基，苯并噻吩基，喹啉基，四氢异喹啉基，异喹啉基，苯并咪唑基，苯并吡喃基，吲 哚嗪基，苯并呋喃基，异苯并呋喃基，氧萘基，呋喃吡啶基，噻吩并吡啶基，二氢异吲哚基和四氢喹啉基。三环杂芳基的实例,包括但不限于,咔唑基，苯并吲哚基，菲咯啉基，吖啶基，菲啶基和黄嘌呤。除非另有说明，否则杂芳基是任选取代的。

如本文所述的，除非另有说明，术语“亚杂芳基”是二价杂芳基。除非另有说明，否则亚杂芳基是任选取代的。

本文所述的基团被“取代的”时，它们可以被任何合适的一个或多个取代基取代。取代基的说明性实例，包括但不限于在本文提供的示例性化合物和实施方案中展示的那些，以及：例如F，Cl，Br或I等卤素原子；氰基；氧代基团(＝O)；羟基(-OH)；烷基；烯基炔基环烷基芳基-(C＝O)OR’；-O(C＝O)R’；-C(＝O)R’；-S(O)_xR’；-S-SR’；-C(＝O)SR’；-SC(＝O)R’；-NR’R’；-NR’C(＝O)R’；-C(＝O)NR’R’；-NR’C(＝O)NR’R’；-OC(＝O)NR’R’；-NR’C(＝O)OR’；-NR’S(O)_xNR’R’；-NR’S(O)_xR’；和-S(O)_xNR'R'，其中R'在每次出现时独立地为H、C₁-C₁₅烷基或环烷基，并且x为0、1或2。在一些实施方案中，取代基为C₁-C₁₂烷基。在其他实施方案中，取代基是环烷基。在其他实施方案中，取代基是卤素基团，例如氟代。在其他实施方案中，取代基是氧代基团。在其他实施方案中，取代基是羟基。在其他实施方案中，取代基是烷氧基(-OR’)。在其他实施方案中，取代基是羧基。在其他实施方案中，取代基是氨基(-NR’R’)。

如本文所述的，除非另有说明，术语“任选的”或“任选地”(例如，任选取代的)是指随后描述的情况事件可能发生或不发生，并且描述包括所述事件或情况发生的实例以及所述事件或情况不发生的实例。例如，“任选取代的烷基”是指烷基可以被取代或可以不被取代，并且描述包括取代的烷基和无取代的烷基。

“前药”是指可以在生理条件下或通过溶剂分解而转化为生物活性化合物的化合物。因此，术语“前药”是指药学上可接受的生物活性化合物的代谢前体。当向有需要的受试者施用时，前药可以是无活性的，但是在体内被转化为本发明的生物活性化合物。前药通常在体内快速转化得到本发明的母体生物活性化合物，例如，通过在血液中水解。前药化合物通常提供在哺乳动物生物体内的溶解性、组织相容性或延迟释放的优点(参见Bundgard,H.,Design of Prodrugs(1985),pp.7-9,21-24(Elsevier,Amsterdam))。在Higuchi,T.,et al.,A.C.S.Symposium Series,Vol.14,和Bioreversible Carriers in Drug Design,Ed.Edward B.Roche,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987.中提供了对前药的讨论。

在一些实施方案中，术语“前药”还意味着包括任何通过共价键合的载体，当这种前药对哺乳动物对象施用时，它们在体内释放本发明的活性化合物。本发明化合物的前药可以通过修饰化合物中存在的官能团来制备，通过这种方式，所述修饰通过常规操作或在体内裂解成为本发明的母体化合物。前药包括以下本发明化合物：其中羟基、氨基或巯基与以下任何基团键合，当本发明化合物的前药对哺乳动物对象施用时，所述基团裂解分别形成游离羟基，游离氨基或游离巯基。

“前药”的实例包括，但不限于，本文提供的化合物中的醇或胺官能团的酰胺衍生物的乙酸酯，甲酸酯和苯甲酸酯衍生物等。

如本文所述的，除非另有说明，术语“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐。

“药学上可接受的酸加成盐”的实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，以及有机酸，例如但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸，柠檬酸、环酰胺酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖酸、龙胆酸、葡庚酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5二甲酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、棕榈酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。

“药学上可接受的碱加成盐”的实例包括，但不限于，通过将无机碱或有机碱加成至游离酸化合物而制备的盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐，锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。优选的，无机盐是铵盐、钠盐、钾盐、钙盐和镁盐。衍生自有机碱的盐包括，但不限于，下列伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、环胺和碱性离子交换树脂的盐：例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、脱醇、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、肼苯胺、胆碱、甜菜碱、苯那敏(benethamine)、苄星青霉素(benzathine)、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。优选的，有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。

本文提供的化合物可包含一个或多个不对称中心，并因此可产生对映异构体、非对映异构体和其他立体异构形式，对于氨基酸，其可以根据绝对立体化学的方式定义为(R)-或(S)-，或定义为(D)-或(L)-。除非另有说明，否则本文提供的化合物旨在包括所有这些可能的异构体，以及它们的外消旋和光学纯形式。光学活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-或(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术，例如，色谱法和分步结晶来拆分。用于制备/分离单个对映异构体的常规技术包括由合适的光学纯前体进行手性合成或使用例如手性高压液相色谱法(HPLC)的外消旋体(或盐或衍生物的外消旋体)的拆分。当本文所述的化合物包含烯烃双键或其他几何不对称中心时，除非另有说明，该化合物意指包括E和Z型几何异构体。同样地，也意在包括所有互变异构形式。

如本文所述的，除非另有说明，术语“异构体”是指具有相同分子式的不同化合物。“立体异构体”是仅原子在空间中排列方式不同的异构体。“阻转异构体”是由于原子绕单键旋转受阻的立体异构体。“对映异构体”是一对彼此互不重叠的镜像的立体异构体。一对对映异构体的任何比例的混合物都可以称为“外消旋”混合物。“非对映异构体”是具有至少两个不对称原子，但彼此不是镜像的立体异构体。

“立体异构体”还可以包括E和Z型异构体或其混合物，和顺式和反式异构体或其混合物。在某些实施方案中，本文所述的化合物被分离为E或Z型异构体。在其他实施方案中，本文所述的化合物是E和Z型异构体的混合物。

“互变异构体”是指彼此平衡的化合物的异构形式。异构体形式的浓度的不同将取决于该化合物所处的环境，并且可以取决于该化合物是否是固体还是在有机溶液或水溶液中存在的状态。

文所述的化合物可在一个或多个原子上包含非自然部分的原子同位素。例如，化合物可以用放射性同位素进行放射性标记，例如氚3(³H)，碘-125(¹²⁵I)，硫35(³⁵S)或碳14(¹⁴C)，或者可以是氘(²H)，碳13(¹³C)或氮15(¹⁵N)同位素富集的。如本文所用，“同位素”是同位素富集的化合物。术语“同位素富集”是指具有不同于该原子的天然同位素组成的同位素组成的原子。“同位素富集的”还可以指含有至少一个原子的化合物，该原子的同位素组成不同于该原子的天然同位素组成。术语“同位素组成”是指给定原子存在的每种同位素的量。放射性标记的和同位素富集的化合物可用作治疗剂，例如癌症治疗剂，研究试剂(例如结合测定试剂)和诊断剂(例如体内显像剂)。本文所描述的化合物的所有同位素变体，无论是否具有放射性，都旨在被包含在本文所提供的实施方案的范围内。在一些实施方案中，提供了本文描述的化合物的同位素，例如，同位素是富含氘，碳-13和/或氮15的。如本文所用，“氘代”是指其中至少一个氢(H)被氘(以D或²H表示)取代的化合物，即，该化合物在至少一个位置上富含氘。

应当注意的是，若本文所描述的结构与该结构的名称之间存在差异，则所描述的结构应具有更大的权重。

如本文所述的，除非另有说明，术语“药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂”包括但不限于任何已被美国食品和药物管理局批准的，可用于人类或家畜的佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增香剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。

术语“组合物”旨在涵盖含有任选地以指定量的指定成分(例如mRNA分子)的产品。

术语“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，其是指任何长度的核苷酸的聚合物，包括例如DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可以是通过DNA聚合酶或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其类似物。核酸可以是单链或双链形式。如本文所述的且除非另有说明，“核酸”还包括核酸模拟物，例如锁核酸(LNA)，肽核酸(PNA)和吗啉环寡聚核苷酸。如本文所用，“寡核苷酸”是指短的合成多核苷酸，其长度通常但非必须小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不是互相排斥的。上面对多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。除非另有说明，否则本文公开的任何单链多核苷酸序列的左端均为5'端；双链多核苷酸序列的左侧方向称为5'方向。新生RNA转录本从5'到3'的添加方向称为转录方向；具有与RNA转录物相同的序列的DNA链上位于RNA转录物的5'至5'末端的序列区域被称为“上游序列”；DNA链上具有与RNA转录物相同的序列的3'到3'末端的序列区域称为“下游序列”。

“分离的核酸”是指核酸，例如其可以是RNA，DNA或混合核酸，它们与其他基因组DNA序列以及蛋白质或复合物(如核糖体和聚合酶)基本自然分离，包含天然序列。“分离的”核酸分子是与天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。此外，当通过重组技术生产时，“分离的”核酸分子(例如mRNA分子)可以基本上不含其他细 胞材料或培养基，或者当化学合成时可以基本上不含化学前体或其他化学品。在一个具体的实施方案中，编码本文所述抗原的一种或多种核酸分子是分离或纯化的。该术语包括已经从其天然存在的环境中除去的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA或RNA分离物以及化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。基本上纯的分子可以包括分子的分离形式。

术语“编码核酸”或其语法上的等同物包括：(a)处于天然状态或通过本领域技术人员众所周知的方法操作时，可以转录产生能够翻译成肽和/或多肽的mRNA的核酸分子，以及(b)mRNA分子本身。反义链是核酸分子的互补序列，并且可以由此推断出编码序列。术语“编码区”是指编码核酸序列中可翻译成肽或多肽的部分。术语“非翻译区”或“UTR”是指编码核酸中未翻译成肽或多肽的部分。这取决于UTR相对于核酸分子的编码区的取向，如果UTR位于编码区的5'末端，则将该UTR称为5'-UTR；如果位于编码区域的3'端，则将该UTR称为3'-UTR。

如本文所述的，术语“mRNA”是指包含一个或多个开放阅读框(ORF)的信使RNA分子，其可以被细胞或有机体翻译以产生一种或多种肽或蛋白质产物。包含一个或多个ORF的区域被称为mRNA分子的编码区域。在某些实施方案中，mRNA分子还包含一个或多个非翻译区(UTR)。

在某些实施方案中，mRNA是仅包含一个ORF的单顺反子mRNA。在某些实施方案中，单顺反子mRNA编码包含所选抗原(例如，病原性抗原或肿瘤相关抗原)的至少一个表位的肽或蛋白质。在其他实施方案中，mRNA是包含两个或更多个ORF的多顺反子mRNA。在某些实施方案中，多顺反子mRNA编码两个或多个彼此相同或不同的肽或蛋白质。在某些实施方案中，由多顺反子mRNA编码的每种肽或蛋白质包含所选抗原的至少一个表位。在某些实施方案中，由多顺反子mRNA编码的不同肽或蛋白质各自包含不同抗原的至少一个表位。在本文所述的任何实施方案中，至少一个表位可以是一个抗原的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个或至少10个表位。

术语“核碱基”涵盖嘌呤和嘧啶，包括天然化合物腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶，肌苷及其天然或合成类似物或衍生物。

如本文所用，术语“功能核苷酸类似物”是指规范核苷酸A，G，C，U或T的修饰形式，其(a)保留相应规范核苷酸的碱基配对性质，并且(b)包含(i)核碱基，(ii)糖基，(iii)磷酸基或(iv)相应天然核苷酸的(i)至(iii)的任何组合的至少一种化学修饰。如本文所述的，碱基对不仅涵盖标准的沃森-克里克A-T，A-U或C-G碱基对，而且还包括在规范核苷酸与功能核苷酸类似物之间或在一对功能核苷酸类似物之间形成的碱基对，其中氢键供体和氢键受体的排列允许修饰的核碱基与标准核碱基之间或两个互补的修饰的核碱基结构之间形成氢键。例如，鸟苷(G)的功能类似物保留了与胞嘧啶(C)或胞嘧啶的功能类似物碱基配对的能力。这种非规范碱基配对的一个例子是修饰的核苷酸肌苷和腺嘌呤，胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。如本文所述，功能核苷酸类似物可以是天然存在的或非天然存在的。因此，包含功能性核苷酸类似物的核酸分子可具有至少一个修饰的核碱基、糖基或核苷间键。本文提供了对核酸分子的核碱基、糖基或核苷间键的示例性化学修饰。

如本文所述的，术语“翻译增强元件”、“TEE”和“翻译增强子”是指核酸分子中的一个区域，其功能是促进核酸的编码序列翻译成蛋白质或肽产物，例如通过cap依赖或非cap依赖的翻译。TEE通常位于核酸分子(如mRNA)的UTR区域中，能够增强位于上游或下游的编码序列的翻译水平。例如，核酸分子的5'-UTR中的TEE可以位于核酸分子的启动子和起始密码子之间。各种TEE序列在本领域中是已知的(Wellensiek et al.Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing elements,Nature Methods,2013 Aug；10(8):747–750；Chappell et al.PNAS June 29,2004 101(26)9590-9594)。已知某些TEE在多种物种中是保守的(Pánek et al.Nucleic Acids Research,Volume 41,Issue 16,1 September 2013,Pages 7625–7634)。

如本文所述的，术语“茎环序列”是指具有至少两个区域的单链多核苷酸序列，当以相反的方向阅读时，所述两个区域彼此互补或基本互补，以形成至少一个双螺旋和不互补的环，所得的环结构称为茎环结构、发夹或发夹环，这也是存在于许多RNA分子的二级结构。

如本文所述的，术语“肽”是指含有2-50个被一个或多个共价肽键所连接的氨基酸残基的聚合物。该术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然存在的氨基酸(例如，氨基酸类似物或非天然氨基酸)的氨基酸聚合物。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指通过共价肽键连接的具有超过五十个氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于蛋白质的描述，反之亦然。该术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然存在的氨基酸(例如，氨基酸类似物)的氨基酸聚合物。如本文所用，该术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质(例如抗原)。

术语“抗原”是指能够被受试者的免疫系统(包括适应性免疫系统)识别，并且能够在受试者体内与抗原接触产生免疫反应(包括抗原-特异性免疫反应)的物质。在某些实施方案中，抗原是与患病细胞(例如病原体或赘生性细胞感染的细胞)相关的蛋白质(例如肿瘤相关抗原(TAA))。

在肽或多肽的语境中，术语“片段”是指包含少于全长氨基酸序列的肽或多肽。这样的片段可以来自N端的截短，C端的截短和/或氨基酸序列内部残基的缺失。片段可以由替代的RNA剪接或体内蛋白酶产生。在某些实施方案中，片段是指包含至少5个连续的氨基酸残基、至少10个连续的氨基酸残基、至少15个连续的氨基酸残基、至少20个连续的氨基酸残基、至少25个连续的氨基酸序列、至少30个连续氨基酸残基，至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少连续100个氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少550、至少600、至少650、至少700、至少750、至少800、至少850、至少900或至少950个连续氨基酸残基序列的多肽。在一个具体的实施方案中，多肽的片段保留了该多肽的至少1个、至少2个、至少3个或更多个功能。

“表位”是抗原分子表面的特异性抗体分子结合的位点，例如是能够结合至抗体的一个或多个抗原结合区的抗原表面上的局部区域，在动物例如哺乳动物(例如人)中具有抗原或免疫原活性，并且能够引发免疫反应。具有免疫原性活性的表位是在动物中 引发抗体应答的多肽的一部分。具有抗原活性的表位是抗体结合的多肽的一部分，如通过本领域公知的任何方法所确定的，包括例如通过免疫测定法。抗原表位不必一定是免疫原性的。表位通常由分子的化学活性表面基团集合组成，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。抗体表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由蛋白质中氨基酸的连续序列形成。构象性表位由蛋白质序列中不连续的氨基酸形成，但是在蛋白质折叠成其三维结构时会结合在一起。当蛋白质的三维结构处于改变的构型时，如在另一蛋白质或配体激活或结合之后，形成诱导的表位。在某些实施方案中，表位是多肽的三维表面特征。在其他实施方案中，表位是多肽的线性特征。通常情况下，抗原具有几个或许多不同的表位，并且可以与许多不同的抗体反应。

如本文所用，术语“基因疫苗”是指包含至少一种编码与靶标疾病(如传染病或肿瘤性疾病)相关抗原的核酸分子的治疗或预防性组合物。通过向受试者施用疫苗(疫苗接种)来编码产生肽或蛋白质，从而在受试者中引发针对靶标疾病的免疫应答。在某些实施方案中，免疫应答包括适应性免疫应答，例如产生针对所编码的抗原的抗体，和/或能够活化和增殖用于特异性消除表达抗原的患病细胞的免疫细胞。在某些实施方案中，免疫应答还包括先天免疫应答。根据本发明，可以在目标疾病的临床症状发作之前或之后将疫苗给予施用对象。在一些实施方案中，健康或无症状对象的疫苗接种使接种的对象对目标疾病进程具有免疫性或较不敏感。在一些实施方案中，具有疾病症状的对象的疫苗接种可改善接种对象的疾病状况或治疗该疾病。

术语“先天免疫应答”和“先天免疫”在本领域中是公知的，是指人体免疫系统在识别病原体相关分子时启动的非特异性防御机制，其涉及不同形式的细胞活动，包括各种途径的细胞因子产生和细胞死亡。如本发明所述的，先天免疫应答包括但不限于炎症细胞因子(例如，I型干扰素或IL-10产生)的产生增加，NFκB途径的活化，免疫细胞的增殖、成熟、分化和/或存活增加，在某些情况下诱导的细胞凋亡。可以使用本领域已知的方法来检测先天免疫的激活情况，例如通过测量(NF)-κB的激活.

术语“适应性免疫应答”和“适应性免疫”在本领域中是公知的，是指人体的免疫系统在识别出特定抗原后启动的抗原特异性防御机制，包括体液应答和细胞介导的应答。如本发明所述的，适应性免疫应答包括由疫苗组合物(如本文所述的基因性组合物)触发和/或增强的细胞应答。在一些实施方案中，疫苗组合物包含抗原，该抗原是抗原特异性适应性免疫应答的靶标。在其他实施方案中，疫苗组合物在给药后允许在免疫对象中产生抗原，该抗原是抗原特异性适应性免疫应答的靶标。可以使用本领域已知的方法来检测适应性免疫应答的激活，如通过监测抗原特异性抗体的产生情况或监测抗原特异性细胞介导的细胞毒性水平。

术语“抗体”旨在包括由效应b细胞分泌的多肽产物，其由两对相同的多肽链组成，其中每对多肽链具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，每条链的N端部分包含约100至约130或更多个氨基酸组成的的可变区，每条链的C端部分包括一个恒定区域，其能够与特定分子抗原结合，免疫球蛋白不仅仅只是抗体。例如可参见Antibody Engineering(Borrebaeck ed.,2d ed.1995)和Kuby,Immunology(3d ed.1997)。在特定的实施方案中，特定的分子抗原包括多肽，其片段或表位，其可以与本文所述的抗体结合。抗体还包括，但不限于合成抗体，通过重组产生的抗体，骆驼化抗体，细胞内抗体 (intracelluar antibodies)，anti-Id抗体和这些抗体的功能片段，抗体的功能片段指从前述抗体重链或轻链分离出来的能够保留一部分货全部结合活性的功能性多肽片段。功能片段的一些非限制性实例包括单链抗体(scFv)(包括单特异性，双特异性等)，Fab片段，F(ab’)片段，F(ab)2片段，F(ab’)2片段，二硫键稳定性抗体(dsFv)，Fd片段，Fv片段，双抗，三抗，四抗和微型抗体。特别地，本文所述的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，例如可以是抗原结合结构域或含有抗原结合位点(如抗体的一个或多个CDR)的分子。这样的抗体片段可以是在Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(1989)；Mol.Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference(Myers ed.,1995)；Huston et al.,1993,Cell Biophysics 22:189-224；Plückthun and Skerra,1989,Meth.Enzymol.178:497-515；and Day,Advanced Immunochemistry(2d ed.1990)中所述的。本发明提供的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA型等)或任何亚类(如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2型等)。

术语“施用”是指例如通过粘膜，肌内/皮下注射，静脉注射或以本领域已知的其他物理方式将体外物质(如本文所述的脂质纳米颗粒组合物)递送至患者的行为。当用于治疗疾病，病症，病状或其症状时，通常在疾病，病症，病状或其症状发作后进行物质的施用。当用于预防疾病，病症，病状或症状时，通常在疾病，病症，病状或症状发作之前进行物质的施用。

“慢性”给药是指与急性给药模式相反的，以连续模式(如持续一段时间如几天、几周、几个月或几年)给药，以在延长的一段时间维持初始治疗效果(活性)。“间歇性”给药不是连续进行而是周期性的，不会中断治疗。

术语“靶向递送”或动词形式的“靶”是指促进递送的试剂(例如本文所述的脂质纳米颗粒组合物中的治疗有效载荷分子)到达特定器官，组织，细胞和/或细胞内区室(称为目标位置)的过程，使的目标位置比任何其他的器官，组织，细胞或细胞内区室(称为非目标位置)递送的更多。靶向递送可以通过本领域已知的方法来检测，例如通过比较全身给药后靶细胞群体中递送的试剂的浓度与非靶细胞群体中递送的试剂的浓度。在某些实施方案中，与非靶标位置相比，靶向递送导致在靶标位置的浓度高至少2倍。

“有效量”通常是足以降低症状的严重性和/或频率，消除症状和/或根本病因，防止症状和/或其病因的发生，和/或改善或补救损害的量。由疾病，病症或病状引起或与之相关的疾病包括感染和瘤的形成等。在一些实施方案中，有效量是治疗有效量或预防有效量。

如本文所述的，术语“治疗有效量”是指足以降低和/或改善给定疾病、病症或病状相关症状(如由病毒感染引起的传染性疾病，或癌症的肿瘤性疾病等)的严重性和/或持续时间的试剂(如疫苗组合物)的量。本公开内容的物质/分子/试剂(如本文所述的脂质纳米颗粒组合物)的“治疗有效量”可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素，以及物质/分子/试剂在个体中引起所需反应的能力等而变化。治疗有效量包括该物质/分子/试剂的任何毒性或有害作用均被治疗的有益作用所抵消的量。在某些实施方案中，术语“治疗有效量”是指在受试者或哺乳动物中，能够有效“治疗”疾病、病症或病状的脂质纳米颗粒组合物或其中包含的治疗或预防剂(如治疗性mRNA)的量。

“预防有效量”是当给予受试者时将具有预期的预防作用的量，例如，预防、延迟或减少疾病、病症以及相关症状(如由病毒感染引起的传染性疾病或诸如癌症的肿瘤性疾病)的发作(或复发)可能性的药物组合物的量。状况或相关症状。通常但不是必须的，因 为在疾病、病症或病状之前或较早阶段在受试者中使用预防剂量，所以预防有效量可以小于治疗有效量。完全的治疗或预防作用不一定通过给药一个剂量而发生，而可能仅在给药一系列剂量后才发生。因此，可以一次或多次施用来施用治疗或预防有效量。

术语“预防”是指降低患疾病、病症、病状或相关症状(例如传染病，例如由病毒感染或肿瘤性疾病，例如癌症)的可能性。

术语“管理”，是指受试者从治疗(例如预防剂或治疗剂)中获得的有益效果，其不会导致疾病的治愈。在某些实施方案中，向受试者施用一种或多种疗法(例如预防或治疗剂，例如本文所述的脂质纳米颗粒组合物)以“管理”感染性或赘生性疾病的一种或多种症状，从而预防疾病的进展或恶化。

术语“预防剂”是指可以在受试者中完全或部分抑制疾病和/或与其相关的症状的发展、复发、发作或扩散的任何药剂。

术语“治疗剂”是指可用于治疗、预防或减轻疾病、病症或病状，包括用于治疗、预防或减轻疾病、病症或病状及相关症状的一种或多种症状的任何药物。

术语“疗法”是指可用于预防、管理、治疗和/或改善疾病、病症或病状的任何方案、方法和/或药剂。在某些实施方案中，术语““疗法”是指可用于预防、控制、治疗和/或改善已知的疾病、病症或病状的生物疗法、支持疗法和/或其他疗法等本领域技术人员如医务人员已知的疗法。

“预防有效的血清滴度”是受试者(例如人)中抗体的血清滴度，其完全或部分抑制疾病、病症或病状及与之有关的症状的发展、复发、发作或扩散。

在某些实施方案中，“治疗有效的血清滴度”是受试者(例如人)中抗体的血清滴度，其降低了与疾病、病症或病状相关的严重性、持续时间和/或症状。

术语“血清滴度”是指来自多个样品(例如在多个时间点)的受试者或至少10，至少20，至少40个受试者，至多约100、1000或者更多的受试者人群中的平均血清滴度。

术语“副作用”涵盖疗法(如预防剂或治疗剂)的不希望的和/或不利的作用。有害的影响不一定是不利的。治疗(例如预防剂或治疗剂)的不利影响可能是有害的、不舒服的或有风险的。副作用的例子包括腹泻、咳嗽、肠胃炎、喘息、恶心、呕吐、厌食、腹部绞痛、发烧、疼痛、体重减轻、脱水、脱发、呼吸困难、失眠、头晕、粘膜炎、神经和肌肉效应、疲劳、口干、食欲不振、给药部位出现皮疹或肿胀，类似流感的症状如发烧、发冷、疲倦、消化道问题和过敏反应等。患者经历的其他不期望的作用在本领域中是已知的，在Physician’s Desk Reference(68th ed.2014)中进行了相关介绍。

术语“受试者”和“患者”可以互换使用。如本文所述的，在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如非灵长类动物(如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(如猴和人)。在特定的实施方案中，受试者是人。在一个实施方案中，受试者是患有传染病或赘生性疾病的哺乳动物(例如人)。在另一个实施方案中，所述受试者是处于发生传染病或赘生性疾病风险的哺乳动物(例如人)。

术语“可检测探针”是指提供可检测信号的组合物。该术语包括但不限于通过其活性提供可检测信号的任何荧光团，发色团，放射性标记，酶，抗体或抗体片段等。

术语“可检测剂”是指可用于确定样品或受试者中所需分子的存在的物质，如由本文所述的mRNA分子编码的抗原。可检测剂可以是能够被可视化的物质，或者是可被确定和/或测量(如通过定量)的物质。

“基本上全部”是指至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约98％，至少约99％或约100％。

如本文所述的，除非另有说明，否则术语“大约”或“近似”是指对于由本领域的普通技术人员确定的特定值的可接受的误差，其部分取决于该值的测量或确定方式。在某些实施例中，术语“大约”或“大约”是指在1、2、3或4个标准偏差之内。在某些实施例中，术语“大约”或“近似”是指在给定值或范围的20％，15％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.05％之内或更少。

除非上下文另外明确指出，否则本文所用的单数术语“一个”，“一种”和“该”包括其复数形式。

本说明书中引用的所有出版物、专利申请、登录号和其他参考文献均通过引用全文的方式并入本文，每个单独的出版物或专利申请均被明确地并单独地通过引用并入。本文讨论的公开的出版物是在本申请的提交日期之前公开的出版物。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类出版物。此外，本文提供的发布日期可能与实际发布日期不同，实际的发布日期可能需要独立确认。

本发明了已经描述了多个实施例。然而，将理解的是，在不脱离本发明的主旨构思和范围的情况下可以做出各种修改。因此，实验部分和实施例中的描述旨在说明而非限制权利要求中描述的发明范围。

脂质化合物

在一个实施方式中，本文提供了式(I)所表示的化合物：

或其药物可用的盐或立体异构体，其中：

L₁为C₅-C₁₀亚烷基，其中至少一个亚甲基被氧原子或-NH-代替，且至少一个亚甲基被羰基代替；

L₂为C₅-C₁₀亚烷基，其中至少一个亚甲基被氧原子或-NH-代替，且至少一个亚甲基被羰基代替；

L₃为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆亚烷基；

R₁为C₅-C₃₀烷基，其中至少一个亚甲基被氧原子代替，且至少一个亚甲基被羰基代替；

R₂为C₅-C₃₀烷基，其中至少一个亚甲基被氧原子代替，且至少一个亚甲基被羰基代替；

R₃为C₅-C₃₀烷基，其中至少一个亚甲基被氧原子代替，且至少一个亚甲基被羰基代替；

R₄为C₅-C₃₀烷基，其中至少一个亚甲基被氧原子代替，且至少一个亚甲基被羰基代替；

任选地，R₁-R₄中的一个或多个，其末端的甲基被C₂烯基或C₂炔基取代；

R₅为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基，任选地，其中一个亚甲基被羰基代替；

R₆为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基，且其被羟基或-NR₇R₈取代；

R₇为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基，且其被羟基取代；且

R₈为C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀环烷基或C₆-C₁₀芳基或C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基或C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烯基，任选地，其被选自甲基、氟、羟基、硝基、苯基、甲基苯基、硝基苯基、C₃-C₁₀环烷基的基团取代。

在一个实施方式中，

L₁为C₅-C₆亚烷基，其中一个或两个亚甲基被氧原子代替，且一个亚甲基被羰基代替；

L₂为C₆-C₇亚烷基，其中一个或两个亚甲基被氧原子代替，且一个亚甲基被羰基代替；

R₁为C₆-C₁₂烷基，例如C₆-C₁₀烷基，其中一个亚甲基被氧原子代替，且一个亚甲基被羰基代替；

R₂为C₆-C₁₂烷基，例如C₆-C₁₀烷基，其中一个亚甲基被氧原子代替，且一个亚甲基被羰基代替；

R₃为C₆-C₁₂烷基，例如C₆-C₁₀烷基，其中一个亚甲基被氧原子代替，且一个亚甲基被羰基代替；且

R₄为C₆-C₁₂烷基，例如C₆-C₁₀烷基，其中一个亚甲基被氧原子代替，且一个亚甲基被羰基代替。

在一个实施方式中，

R₆为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基，且其末端的甲基被羟基或-NR₇R₈取代；且

R₇为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基，且其末端的甲基被羟基取代。

在一个实施方式中，

L₁为*-O-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_m-、*-O-CO-(CH₂)_m-或*-O-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_m-；

L₂为*-(CH₂)_m-O-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_m-、*-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_m-、*-(CH₂)_m-O-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_m-或*-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_m-；

L₃为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆亚烷基；

R₁为-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_n-CH₃或-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_n-CH₃；

R₂为-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_n-CH₃或-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_n-CH₃；

R₃为-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_n-CH₃或-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_n-CH₃；

R₄为-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_n-CH₃或-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_n-CH₃；

R₅为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基；

R₆为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基，且其末端的甲基被羟基或-NR₇R₈取代；

R₇为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基，且其末端的甲基被羟基取代；且

R₈为C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀单环烷基或C₆-C₁₀芳基或C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基或C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烯基，任选地，其被选自甲基、氟、羟基、硝基、苯基、甲基苯基、硝基苯基、C₃-C₁₀环烷基的基团取代；

其中的-(CH₂)_m-和-(CH₂)_n-任选地被C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基取代；

m在每次出现时分别独立地选自1、2、3、4、5或6；

n在每次出现时分别独立地选自3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；且

*表示与式(I)中同时连接L₁、L₂和L₃的C的连接位点。

在一个实施方式中，L₁为*-O-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_m-、*-O-CO-(CH₂)_m-或*-O-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_m-。

在一个实施方式中，L₂为*-(CH₂)_m-O-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_m-、*-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_m-、*-(CH₂)_m-O-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_m-或*-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_m-。

在一个实施方式中，L₃为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆亚烷基。

在一个实施方式中，R₁为-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_n-CH₃或-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_n-CH₃。

在一个实施方式中，R₂为-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_n-CH₃或-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_n-CH₃。

在一个实施方式中，R₃为-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_n-CH₃或-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_n-CH₃。

在一个实施方式中，R₄为-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_n-CH₃或-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_n-CH₃。

在一个实施方式中，R₅为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基。

在一个实施方式中，R₆为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基，且其末端的甲基被羟基或-NR₇R₈取代。

在一个实施方式中，R₇为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基，且其末端的甲基被羟基取代。

在一个实施方式中，R₈为C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀单环烷基。

在一个实施方式中，-(CH₂)_m-和-(CH₂)_n-任选地被C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基取代。

在一个实施方式中，m在每次出现时分别独立地选自1、2、3、4、5或6。

在一个实施方式中，n在每次出现时分别独立地选自3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。

在一个实施方式中，*表示与式(I)中同时连接L₁、L₂和L₃的C的连接位点。

在一个实施方式中，所述亚烷基或烷基为直链的。

在一个实施方式中，所述R₁、R₂、R₃和R₄是相同的。

在一个实施方式中，R₅为C₁、C₂、C₃或C₄烷基；R₆为C₁、C₂、C₃或C₄烷基，且其被-NR₇R₈取代；R₇为C₂、C₃、C₄或C₅烷基，且其被羟基取代；R₈为C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀环烷基，或被苯基或C₃-C₁₀环烷基取代的C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基。

在一个实施方案中，所述化合物是表1中的化合物，或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。

表1

在一个实施方案中，所述化合物是表1A中的化合物，或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。

表1A.

应当理解的是，如上所述的本文提供的化合物的任何实施方案，以及如上所述的本文提供的化合物的任何具体的取代基和/或变量可以独立地与其他实施方案和/或取代基和/或化合物的各种变量以形成未具体阐述的实施方案。另外，在为任何特定基团或变量列出取代基和/或变量的列表的情况下，应理解，可以从特定实施方案和/或权利要求中删除每个单独的取代基和/或变量，并且其余的取代基和/或变量的列表将被认为在本文提供的实施方案的范围内。

应当理解的是，在本说明书中，仅当所描述的化学式的取代基和/或变量的组合使得化合物是稳定的情况下才是允许的。

纳米颗粒组合物

一方面，本文描述了包含本文描述的脂质化合物的纳米颗粒组合物。在特定的实施方案中，纳米粒子组合物包含本文所述的根据式(I)(及其子式)的化合物。

在一些实施方案中，本文提供的纳米颗粒组合物的最大尺寸为1μm或更短(例如，≤1μm，≤900nm，≤800nm，≤700nm，≤600nm，≤500nm，≤400nm，≤300nm，≤200nm，≤175nm，≤150nm，≤125nm，≤100nm，≤75nm，≤50nm或更短)，当通过动态光散射(DLS)，透射电子显微镜，扫描电子显微镜或其他方法进行测量时。在一实施方案中，本文提供的脂质纳米颗粒至少一个维度具有在约40至约200nm范围内。在一实施例中，至少一个维度在约40至约100nm的范围内。

可以结合本发明使用的纳米颗粒组合物包括脂质纳米颗粒(LNP)，纳米脂蛋白颗粒，脂质体，脂质囊泡和脂质复合物等。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含一个或多个脂质双层的囊泡。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含两个或更多个被 水性隔室隔开的同心双层。脂质双层可以被官能化和/或彼此交联。脂质双层可以包括一种或多种配体、蛋白质或通道。

纳米颗粒组合物的特性可取决于其组分。例如，包含胆固醇作为结构脂质的纳米颗粒组合物可以与包含不同结构脂质的纳米颗粒组合物具有不同的特性。类似地，纳米颗粒组合物的特性可取决于其组分的绝对或相对量。例如，包含较高摩尔分数的磷脂的纳米颗粒组合物可与包含较低摩尔分数的磷脂的纳米颗粒组合物具有不同的特性。所述特性也可以根据纳米颗粒组合物的制备方法和条件而变化。

纳米颗粒组合物可以通过多种方法表征。例如，可以使用显微镜(透射电子显微镜或扫描电子显微镜等)来检测纳米颗粒组合物的形态和尺寸分布。动态光散射或电位测定法(例如电位滴定法)可用于测量ζ电位。动态光散射也可以用于确定粒度。如Zetasizer Nano ZS(Malvem Instruments Ltd,Malvem,and Worcestershire,UK)的仪器也可以用于测量纳米颗粒组合物的多个特征，例如粒度，多分散指数和ζ电势。

Dh(尺寸)：纳米颗粒组合物的平均尺寸可以在10s nm至100s nm之间。例如，平均尺寸可以为约40nm至约150nm，如，约40nm，45nm，50nm，55nm，60nm，65nm，70nm，75nm，80nm，85nm，90nm，95nm，100nm，105nm，110nm，115nm，120nm，125nm，130nm，135nm，140nm，145nm或150nm。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的平均尺寸可以为约50nm至约100nm，约50nm至约90nm，约50nm至约80nm，约50nm至约70nm，约50nm至约60nm，约60nm至约100nm，约60nm至约90nm，约60nm至约80nm，约60nm至约70nm，约70nm至约70nm 100nm，约70nm至约90nm，约70nm至约80nm，约80nm至约100nm，约80nm至约90nm，或约90nm至约100nm。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物的平均尺寸可以为约70nm至约100nm。在一些实施例中，平均尺寸可以是大约80nm。在其他实施例中，平均尺寸可以是大约100nm。

PDI：纳米颗粒的组成可相对均匀。可以使用多分散指数来指示纳米颗粒组合物的均匀性，例如，纳米颗粒组合物的粒度分布。小的(例如小于0.3)多分散指数通常表明窄的粒度分布。纳米颗粒组合物可具有约0至约0.25的多分散指数，例如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17，0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的多分散指数可以为约0.10至约0.20。

包封效率：治疗剂和/或预防剂的包封效率表示，制备后被包封或与纳米颗粒组合物结合的治疗剂和/或预防剂的量，相对于初始提供量的比例。期望高的包封效率(例如接近100％)。包封效率可以通过比较在用一种或多种有机溶剂或去污剂分解纳米颗粒组合物之前，和在溶液中分解之后包含纳米颗粒组合物的治疗剂和/或预防剂的量来测量。荧光可用于测量溶液中游离治疗剂和/或预防剂(例如，RNA)的量。对于本文所述的纳米颗粒组合物，治疗剂和/或预防剂的包封效率可以为至少50％，如50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。在一些实施例中，封装效率可以是至少80％。在某些实施例中，封装效率可以是至少90％。

表观pKa：纳米颗粒组合物的ζ电势可用于指示组合物的电动势。例如，ζ电势可以描述纳米颗粒组合物的表面电荷。对纳米颗粒组合物而言，通常期望其具有相对较低 的正或负电荷，因为较高电荷的物质可能与人体的细胞、组织和其他元素发生不良相互作用。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的ζ电势可以为约-10mV至约+20mV，约-10mV至约+15mV，约-10mV至约+10mV，约-10mV。至约+5mV，约-10mV至约0mV，约-10mV至约-5mV，约-5mV至约+20mV，约-5mV至约+15mV，约-5mV至约+10mV，约-5mV至约+5mV，约-5mV至约0mV，约0mV至约+20mV，约0mV至约+15mV，约0mV至约+10mV，约0mV至约+5mV，约+5mV至约+20mV，约+5mV至约+15mV或约+5mV至约+10mV。

在另一个实施方案中，可以在脂质体中配制自我复制的RNA。作为非限制性实例，可以如国际公开号WO20120067378中所述，将自身复制的RNA配制在脂质体中，该文献通过引用整体并入本文。一方面，脂质体可包含有利于mRNA的递送pKa值的脂质。在另一方面，脂质体在生理pH下可具有基本中性的表面电荷，因此可有效用于免疫(参见例如国际公开号WO20120067378中描述的脂质体，其通过引用整体并入本文)。

在一些实施方案中，所述的纳米颗粒组合物包含脂质组分，所述脂质组分包含至少一种脂质，例如本文所述的根据式(I)(及其子式)的化合物。例如，在一些实施方案中，纳米颗粒组合物可以包括脂质组分，该脂质组分包括本文提供的化合物之一。纳米颗粒组合物还可包含一种或多种如下所述的其他脂质或非脂质组分。

阳离子/可离子化脂质

如本文所述，在一些实施方案中，本文提供的纳米颗粒组合物除了包含根据式(I)(及其子式)的脂质以外，还包含一种或多种带电或可电离的脂质。可以预期的是，纳米颗粒组合物的某些带电或两性离子脂质组分类似于细胞膜中的脂质组分，从而可以改善纳米颗粒的细胞摄取。可以形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的示例性带电或可电离的脂质，包括但不限于，3-(二十二烷基氨基)-N1,N1,4-三十二烷基-1-哌嗪乙胺(KL10)，N1-[2-(二十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三十二烷基-1,4-哌嗪二烯酰胺(KL22)，14,25-二十三烷基-15,18,21,24-四氮杂八孔烷(KL25)，1,2-二亚油酰氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)，2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)，三十七醇酯(heptatriaconta)-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)，2,2-二亚油酰基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)，1,2-二醇氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)，2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧)-N,N-二甲基-3[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)，(2R)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[[(9Z，12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))，(2S)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N，N-二甲基乙基-3-[((9Z-，12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))，(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十二烷基12，15-den-1-胺，N，N-二甲基-1-{((1S，2R)-2-辛基环丙基}十七烷-8-胺。可以形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的另外的示例性的带电或可电离的脂质(如lipid 5)，包括Sabnis et al.“A Novel Amino Lipid Series for mRNA Delivery:Improved Endosomal Escape and Sustained Pharmacology and Safety in Non-human Primates”,Molecular Therapy Vol.26 No 6,2018中所描述的，其全部内容通过引用的方式并入本文。

在一些实施方式中，适合的阳离子脂质包括N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化氨(DOTMA)；N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化氨 (DOTAP)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-乙基胆碱磷酸(DOEPC)；1,2-二月桂酰-sn-甘油基-3-乙基胆碱磷酸(DLEPC)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-乙基胆碱磷酸(DMEPC)；1,2-二肉豆蔻油酰基-sn-甘油基-3-乙基胆碱磷酸(14:1)；N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基甲酰胺基)乙基]-3,4-二[油烯基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)；双十八基氨基-甘氨酰基精胺(DOGS)；3b-[N-(N',N'-二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)；双十八基二甲基溴化铵(DDAB)；SAINT-2、N-甲基-4-(二油烯基)甲基吡啶；1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基羟乙基溴化铵(DMRIE)；1,2-二油酰基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)；1,2-二油酰基氧基丙基-3-二甲基羟乙基氯化铵(DORI)；二-烷基化氨基酸(DILA²)(例如，C18:1-norArg-C16)；二油烯基二甲基氯化铵(DODAC)；1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油基-3-乙基胆碱磷酸(POEPC)；1,2-二肉豆蔻油酰基-sn-甘油基-3-乙基胆碱磷酸(MOEPC)；(R)-5-(二甲基氨)戊烷-1,2-二基二油酸脂盐酸盐(DODAPen-Cl)；(R)-5-胍基戊烷-1,2-二基二油酸脂盐酸盐(DOPen-G)；和(R)-N,N,N-三甲基-4,5-双(油酰基氧基)戊-1-氯化铵(DOTAPen)。具有在生理学pH带电的头部基团，如伯胺(例如，DODAGN',N'-双十八基-N-4,8-二氮杂-10-氨基癸酰基甘氨酸酰胺)和胍盐头部基团(例如，双-胍盐-亚精胺-胆固醇(BGSC)、双-胍三氨乙基胺-胆固醇(BGTC)、PONA和(R)-5-胍基戊烷-1,2-二基二油酸脂盐酸盐(DOPen-G))的阳离子脂质也是适合的。另一种适合的阳离子脂质是(R)-5-(二甲基氨)戊烷-1,2-二基二油酸脂盐酸盐(DODAPen-Cl)。在某些实施方式中，所述阳离子脂质是特定对映异构体或消旋形式，并且包括如上的阳离子脂质的多种盐形式(例如，氯化物或硫酸盐)。例如，在一些实施方式中，所述阳离子脂质是N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化氨(DOTAP-Cl)或者N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基硫酸氨(DOTAP-硫酸盐)。在一些实施方式中，所述阳离子脂质是可离子化的阳离子脂质，如(例如)双十八基二甲基溴化铵(DDAB)；1,2-二亚油醇基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)；2,2-二亚油醇基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)；七-三十烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)；1,2-二油酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DODAP)；1,2-二油烯基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DODMA)；和吗啉代胆固醇(Mo-CHOL)。在某些实施方式中，脂质纳米颗粒包括两种或更多种阳离子脂质(例如，如上的两种或更多种阳离子脂质)的组合。

另外，在一些实施方案中，可以形成本纳米颗粒组合物的一部分的带电或可电离的脂质是包括环胺基的脂质。适用于本文公开的制剂和方法的另外的阳离子脂质包括WO2015199952，WO2016176330和WO2015011633中描述的那些，其全部内容通过引用整体并入本文。

聚合物缀合的脂质

在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的脂质组分可包括一种或多种聚合物缀合的脂质(聚合物共轭脂质)，例如PEG化脂质(PEG脂质)。可以预期的是，纳米颗粒组合物中的聚合物共轭脂质组分可以改善胶体稳定性和/或减少纳米颗粒的蛋白质吸收。可以结合本公开使用的示例性阳离子脂质包括但不限于PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG 修饰的二烷基甘油及其混合物。例如，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE、神经酰胺-PEG2000或Chol-PEG2000。

在一个实施方案中，聚合物缀合的脂质是聚乙二醇化的脂质。一些实施方案包括聚乙二醇化二酰基甘油(PEG-DAG)，如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻基甘油(PEG-DMG)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEG-S-DAG)，如4-O-(2'，3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、聚乙二醇化神经酰胺(PEG-cer)，或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯，如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2,3-二(四癸氧基)丙基-N-(ω-甲氧基)(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。

在一个实施方案中，聚合物缀合的脂质以1.0至2.5％的摩尔浓度存在。在一个实施方案中，聚合物缀合的脂质以约1.7％的摩尔浓度存在。在一个实施方案中，聚合物缀合的脂质的存在的摩尔浓度为约1.5％。

在一实施方案中，阳离子脂质与聚合物缀合脂质的摩尔比为约35∶1至约25∶1。在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物缀合的脂质的摩尔比为约100∶1至约20∶1。

在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质具有下式：

或其药学上可接受的盐，互变异构体或立体异构体，其中：

R¹²和R¹³各自独立地为含有10至30个碳原子的直链或支链的饱和或不饱和烷基链，其中烷基链任选地被一个或多个酯键中断；和

w的平均值在30到60之间。

在一个实施方案中，R¹²和R¹³各自独立地为含有12至16个碳原子的直链饱和烷基链。在其他实施例中，w平均在42至55的范围内，例如，w平均为42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55。在特定实施例中，平均w约为49。

在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质具有下式：

其中w的平均值约为49。

结构脂质

在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的脂质组分可包括一种或多种结构脂质。可以预期的是结构脂质可以稳定纳米颗粒的两亲结构，例如但不限于，纳米颗粒的脂质双层结构。可以结合本公开使用的示例性结构脂质包括但不限于胆固醇、非甾甾醇、谷固醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、番茄碱、熊果酸、α-生育酚及其混合物。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇。在一些实施方案中，结构脂质包括胆固醇和皮质类固醇(例如泼尼松龙、地塞米松、泼尼松和氢化可的松)或其组合。

在一实施方案中，本文提供的脂质纳米颗粒包含类固醇或类固醇类似物。在一实施方案中，类固醇或类固醇类似物是胆固醇。在一个实施方案中，类固醇的存在的摩尔浓 度范围为39-49％，40-46％，40-44％，40-42％，42-44％或44-46％。在一实施方案中，类固醇以40、41、42、43、44、45或46％的摩尔浓度存在。

在一个实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比为1.0：0.9至1.0：1.2，或1.0：1.0至1.0：1.2。在一个实施方案中，阳离子脂质与胆固醇的摩尔比为约5∶1至1∶1。在一实施方案中，类固醇以类固醇的32-40％的摩尔浓度存在。

磷脂

在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的脂质组分可包括一种或多种磷脂，例如一种或多种(多)不饱和脂质。可以预期的是，磷脂可以组装成一个或多个脂质双层结构。可以形成本纳米颗粒组合物的一部分的示例性磷脂，包括但不限于，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二十一烷酰基-sn-甘油磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18：0 Diether PC)、1-油基-2-胆甾醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16Lyso PC)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基1-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)和鞘磷脂。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物包括DSPC。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物包含DOPE。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包括DSPC和DOPE。

另外的示例性中性脂质包括二棕榈酰基磷脂酰甘油甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二戊酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(transDOPE)。在一个实施方案中，中性脂质是1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3磷酸胆碱(DSPC)。在一个实施方案中，中性脂质选自DSPC，DPPC，DMPC，DOPC，POPC，DOPE和SM。

在一个实施方案中，中性脂质是磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰丝氨酸(PS)，磷脂酸(PA)或磷脂酰甘油(PG)。

可以形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的另外的磷脂也包括在WO2017/112865中描述的那些，其全部内容通过引用整体并入本文。

治疗有效负荷

根据本文所述的纳米颗粒组合物可进一步包含一种或多种治疗剂和/或预防剂。这些治疗剂和/或预防剂在本公开中有时被称为“治疗有效载荷”或“有效载荷”。在一些实施方案中，可以使用纳米颗粒作为递送载体在体内或体外施用治疗有效载荷。

在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含小分子化合物(如小分子药物)作为治疗有效载荷，例如抗肿瘤药(如长春新碱、阿霉素、米托蒽醌、喜树碱、顺铂、博来霉素、 环磷酰胺、甲氨蝶呤和链脲佐菌素)，抗肿瘤药(如放线菌素D、长春新碱、长春碱、阿糖胞苷、蒽环类、烷化剂、铂化合物、抗代谢物和核苷类似物如甲氨蝶呤、嘌呤和嘧啶类似物)，抗感染药，局部麻醉药(如地布卡因和氯丙嗪)，β-肾上腺素能阻滞剂(如普萘洛尔、噻吗洛尔和拉贝洛尔)，降压药(如可乐定和肼苯哒嗪)，抗抑郁药(如丙咪嗪、阿米替林和多塞平)，抗惊厥药(如苯妥英钠)，抗组胺药(如苯海拉明、扑尔敏和异丙嗪)，抗生素/抗菌剂(庆大霉素、环丙沙星和头孢西丁等)，抗真菌药(如咪康唑、特康唑、益康唑、异康唑、丁康唑、克霉唑、伊曲康唑、制霉菌素、萘替芬和两性霉素B)，抗寄生虫药，激素，激素拮抗剂，免疫调节剂，神经递质拮抗剂，抗青光眼剂，麻醉剂和成像剂。

在一些实施方案中，治疗有效载荷包括细胞毒素、放射性离子、化学治疗剂、疫苗、引起免疫应答的化合物和/或另一种治疗剂和/或预防剂。细胞毒素或细胞毒性剂包括任何可能对细胞有害的物质。实例包括，但不限于，紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽醌、酮米松酮、1-去甲睾丸素、米曲霉素、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、美登木素生物碱、美登醇、雷切霉素(CC-1065)及其类似物或同系物。放射性离子包括但不限于碘(如碘125或碘131)、锶89、磷、钯、铯、铱、磷酸盐、钴、钇90、钐153和镨。

在其他实施方案中，本纳米颗粒组合物的治疗有效载荷可以包括但不限于治疗和/或预防剂，如抗代谢物(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)，烷基化剂(如甲氯乙胺、噻菌胺苯丁酸氮芥、雷切霉素(CC-1065)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类药物(如柔红霉素(以前为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(如Dactinomycin(以前是放线菌素)、博来霉素、光神霉素和蒽霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(如长春碱、长春新碱、紫杉醇和美登木素生物碱)。

在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含作为治疗有效载荷的生物分子，例如肽和多肽。形成纳米颗粒组合物的一部分的生物分子可以是天然来源或合成来源的。例如，在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的治疗有效载荷，可包括但不限于庆大霉素、丁胺卡那霉素、胰岛素、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、因子VIR、促黄体激素释放激素(LHRH)类似物、干扰素、肝素、乙型肝炎表面抗原、伤寒疫苗、霍乱疫苗以及肽和多肽.

核酸

在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含一种或多种核酸分子(如DNA或RNA分子)作为治疗有效载荷。可以包括在本纳米颗粒组合物中作为治疗有效载荷的核酸分子的示例性形式，包括但不限于脱氧核糖核酸(DNA)，包括信使mRNA(mRNA)在内的核糖核酸(RNA)，及其杂交形式，RNAi诱导剂，RNAi试剂，siRNA，shRNA，miRNA，反义RNA，核酶，催化DNA，诱导三螺旋形成的RNA，适配体，载体等。在某些实施方案中，治疗有效载荷包含RNA。可以包含在本发明纳米颗粒组合物中作为治疗有效载荷的RNA分子，包括但不限于：短异构体，激动剂(agomir)，拮抗剂(antagomir)，反义分子，核酶，小干扰RNA(siRNA)，不对称干扰RNA(aiRNA)，microRNA(miRNA))，切割底物RNA(Dicer-substrate RNA)(dsRNA)，小发夹RNA(shRNA)，转移RNA(tRNA)， 信使RNA(mRNA)和本领域已知的其他形式的RNA分子。在特定的实施方案中，所述RNA是mRNA。

在其他实施方案中，纳米颗粒组合物包含siRNA分子作为治疗有效载荷。特别地，在一些实施方案中，siRNA分子能够选择性地干扰和下调目的基因的表达。在一些实施方案中，当向施用对象受试者施用包含siRNA的纳米颗粒组合物时，siRNA有效载荷会选择性地沉默与特定疾病、病症或病状相关的基因。在一些实施方案中，siRNA分子包含与编码目的蛋白产物的mRNA序列互补的序列。在一些实施方案中，siRNA分子是免疫调节siRNA。

在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含shRNA分子或编码shRNA分子的载体作为治疗有效载荷。特别地，在一些实施方案中，治疗有效载荷在施用于靶细胞后在靶细胞内部产生shRNA。与shRNA有关的构建体和机制在本领域是已知的。

在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含mRNA分子作为治疗有效载荷。特别地，在一些实施方案中，mRNA分子编码目的多肽，包括任何天然或非天然存在的或经修饰的多肽。由mRNA编码的多肽可以具有任意大小，并且可以具有任意二级结构或活性。在一些实施方案中，当在细胞中表达时，由mRNA有效载荷编码的多肽可以具有治疗作用。

在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含mRNA分子。在特定的实施方案中，核酸分子包含至少一个编码目的肽或多肽的编码区(如开放阅读框(ORF))。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含至少一个非翻译区(UTR)。在特定实施例中，非翻译区(UTR)位于编码区的上游(5'端)，在本文中称为5'-UTR。在特定实施例中，非翻译区(UTR)位于编码区的下游(3'端)，在本文中称为3'-UTR。在特定的实施方案中，核酸分子同时包含5'-UTR和3'-UTR。在一些实施例中，5’-UTR包括5’-帽结构。在一些实施方案中，核酸分子包含Kozak序列(例如，在5'-UTR中)。在一些实施方案中，核酸分子包含poly-A区域(例如在3'-UTR中)。在一些实施方案中，核酸分子包含聚腺苷酸信号(例如在3'-UTR中)。在一些实施方案中，核酸分子包含保守区(如在3'-UTR中)。在一些实施方案中，核酸分子包含二级结构。在一些实施方案中，二级结构是茎环。在一些实施方案中，核酸分子包含茎环序列(如，在5’-UTR和/或3’-UTR中)。在一些实施方案中，核酸分子包含一个或多个能够在剪接过程中被切除的内含子区域。在一个具体的实施方案中，核酸分子包含一个或多个选自5'-UTR和编码区的区域。在一个具体的实施方案中，核酸分子包含一个或多个选自编码区和3'-UTR的区域。在一个具体的实施方案中，核酸分子包含一个或多个选自5’-UTR、编码区和3’-UTR的区域。

编码区

在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含至少一个编码区。在一些实施方案中，编码区是编码单个肽或蛋白质的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，编码区包含至少两个ORF，每个ORF编码肽或蛋白质。在编码区包含一个以上ORF的实施方案中，所述ORF编码的肽和/或蛋白质可以彼此相同或不同。在一些实施例中，编码区域中的多个ORF被非编码序列分开。在特定的实施方案中，分开两个ORF的非编码序列包含内部核糖体进入位点(IRES)。

可以预期的是，内部核糖体进入位点(IRES)可以充当唯一的核糖体结合位点，或充当mRNA的多个核糖体结合位点之一。含有一个以上功能性核糖体结合位点的mRNA 分子，可以编码由核糖体独立翻译的几种肽或多肽(如多顺反子mRNA)。因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子(如mRNA)包含一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。可以结合本公开使用的IRES序列的实例，包括但不限于，来自微瘤病毒(如FMDV)、害虫病毒(CFFV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心肌炎病毒(ECMV)、手足口病毒(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、鼠白血病病毒(MLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)或麻痹病毒(CrPV)的序列。

在各种实施方案中，本发明的核酸分子编码至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个肽或蛋白质。核酸分子编码的肽和蛋白质可以相同或不同。在一些实施方案中，本公开的核酸分子编码二肽(如肌肽和鹅肌肽)。在一些实施方案中，核酸分子编码三肽。在一些实施方案中，核酸分子编码四肽。在一些实施方案中，核酸分子编码五肽。在一些实施方案中，核酸分子编码六肽。在一些实施方案中，核酸分子编码七肽。在一些实施方案中，核酸分子编码八肽。在一些实施方案中，核酸分子编码九肽。在一些实施方案中，核酸分子编码十肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约15个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约50个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约100个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约150个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约300个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约500个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约1000个氨基酸的肽或多肽.

在一些实施方案中，本公开的核酸分子的长度为至少约30个核苷酸(nt)。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约35nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约40nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约45nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约50nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约55nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约60nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约65nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约70nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约75nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约80nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约85nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约90nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约95nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约100nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约120nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约140nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约160nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约180nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约200nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约250nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约300nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约400nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约600nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约700nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约800nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约900nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1000nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1100nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1200nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1300nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1400nt。在一些实施方案中，核酸分子的 长度为至少约1500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1600nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1700nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1800nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1900nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约2000nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约2500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约3000nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约3500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约4000nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约4500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约5000nt。

在特定的实施方案中，治疗有效载荷包括本文所述的疫苗组合物(如基因疫苗)。在一些实施方案中，治疗有效载荷包含能够引发针对一种或多种靶病症或疾病免疫力的化合物。在一些实施方案中，目标症状与例如冠状病毒(例如2019-nCoV)、流感、麻疹、人乳头瘤病毒(HPV)、狂犬病、脑膜炎、百日咳、破伤风、鼠疫、肝炎和肺结核等病原体或其引发的感染相关。在一些实施方案中，治疗有效载荷包含编码病原体特征性病原蛋白或其抗原性片段或表位的核酸序列(如mRNA)。疫苗在接种给受试者后，表达编码的病原蛋白(或其抗原性片段或表位)，从而在受试者中引发针对病原体的免疫力。

在一些实施方案中，靶病症与细胞的赘生性生长有关或由其引起，例如癌症。在一些实施方案中，治疗有效载荷包含编码癌症特征性肿瘤相关抗原(TAA)或其抗原性片段或表位的核酸序列(如mRNA)。该疫苗在给予接种疫苗的受试者后，表达编码的TAA(或其抗原片段或表位)，从而在受试者中引发针对表达TAA的肿瘤细胞的免疫力。

5`-帽结构

可以预期的是，多核苷酸的5'-帽结构参与核输出并提高多核苷酸稳定性，并结合细胞中负责多核苷酸稳定性的mRNA帽结合蛋白(CBP)。通过CBP与聚-A结合蛋白的结合形成成熟的环状mRNA，从而获得翻译能力。5'-帽结构在mRNA剪接过程中进一步协助去除5'端内含子。因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含5'-帽。

核酸分子可能被细胞的内源性转录机制5'端封端，从而在鸟嘌呤帽末端残基与多核苷酸的5'端转录有义核苷酸之间产生5'-ppp-5'-三磷酸键。然后这个5'-鸟苷酸帽甲基化以生成N7-甲基-鸟苷酸残基。多核苷酸5’末端的末端和/或前末端转录的核苷酸的核糖也可以任选地被2’-O-甲基化。通过鸟苷酸帽结构的水解和裂解进行的5'-脱帽可以靶向核酸分子，例如mRNA分子，以进行降解。

在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含由内源过程产生的天然5'-帽结构的一个或多个改变。对5’-帽的修饰可以增加多核苷酸的稳定性，增加多核苷酸的半衰期，并且可以提高多核苷酸的翻译效率。

对天然5’-Cap结构的示例性改变包括产生不可水解的帽结构，从而防止脱帽而增加多核苷酸的半衰期。在一些实施方案中，由于帽结构水解需要裂解5'-ppp-5'磷酸二酯键，因此在一些实施方案中，可以在封端反应期间使用修饰的核苷酸。例如，在一些实施方案中，可以根据制造商的说明书将来自New England Biolabs的牛痘菌封顶酶与α-硫代鸟苷核苷酸一起使用以在5'-ppp-5'中产生硫代磷酸酯键。也可以使用其他修饰的鸟苷核苷酸，例如α-甲基膦酸酯和硒代磷酸核苷酸。

天然5'-Cap结构的其他示例性改变还包括在封端的鸟苷三磷酸(GTP)的2'-和/或3'-位进行修饰，将糖环氧(参与碳环的氧)替换为亚甲基部分(CH2)，帽结构的三磷酸桥部分的修饰或核碱基(G)部分的修饰。

天然5'-帽结构的其他示例性改变包括但不限于多核苷酸的5'-末端和/或5'-末端核酸的在核糖的2'-羟基上的2'-O-甲基化，可生成多核苷酸(例如mRNA分子)的多个不同的5'-帽结构。可以与本公开结合使用的另外的示例性5’-帽结构还包括在国际专利公开号WO2008127688，WO 2008016473和WO 2011015347中描述的那些，其全部内容通过引用并入本文。

在各种实施例中，5’-帽可以包括帽类似物。帽类似物，在本文中也称为合成帽类似物、化学帽、化学帽类似物或结构或功能帽类似物，在化学上不同于天然(即内源，野生型或生理学上的)5'-帽结构，同时保留帽的功能。帽类似物可以化学(即非酶促地)或酶促合成和/或连接至多核苷酸。

例如，反反向帽类似物(ARCA)帽包含两个通过5'-5'-三磷酸基团连接的鸟苷，其中一个鸟苷包含N7-甲基以及3'-O-甲基(即，N7,3'-O-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷，m7G-3'mppp-G，可以等效地称为3'O-Me-m7G(5')ppp(5')G)。另一个未改变的鸟苷的3'-O原子与封端的多核苷酸(例如，mRNA)的5'-末端核苷酸连接。N7-和3’-O-甲基化鸟苷提供了封端的多核苷酸(例如，mRNA)的末端部分。另一个示例性的帽结构是mCAP，其类似于ARCA，但是在鸟苷上具有2'-O-甲基(即，N7,2'-O-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷(N7,2’-O-dimethyl-guanosine-5’-triphosphate-5’-guanosine),m₇Gm-ppp-G)。

在一些实施方案中，帽类似物可以是二核苷酸帽类似物。作为非限制性实例，二核苷酸帽类似物可以在不同的磷酸位置被硼酸磷酸酯基团或磷酸硒酸酯基团修饰，例如在美国专利号：8,519,110中描述的二核苷酸帽类似物，其全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，帽类似物可以是本领域已知和/或本文描述的N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽类似物。N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽类似物的非限制性实例包括N7-(4-氯苯氧基乙基)-G(5')ppp(5')G和N7-(4-氯苯氧基乙基)-m3'-OG(5')ppp(5')G帽类似物(例如参见Kore et al.Bioorganic&Medicinal Chemistry 2013 21:4570-4574中所述的各种帽类似物和合成帽类似物的方法，其通过引用并入本文)。在其他实施方案中，可用于本公开内容的核酸分子的帽类似物是4-氯/溴苯氧基乙基类似物。

在各种实施方案中，帽类似物可包括鸟苷类似物。可用的鸟苷类似物包括但不限于肌苷，N1-甲基-鸟苷，2'-氟-鸟苷，7-脱氮-鸟苷，8-氧代-鸟苷，2-氨基-鸟苷，LNA-鸟苷和2-叠氮基。

可以预期的是，尽管帽类似物允许在体外转录反应中同时封端多核苷酸，但高达20％的转录物保持未封端。这与从细胞内源转录机制产生的多核苷酸的天然5'-cap结构的cap类似物的结构差异，可能导致翻译能力降低和细胞稳定性降低。

因此，在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子也可以使用酶在转录后加帽，以产生更真实的5'-帽结构。如本文所用，短语“更真实”是指在结构上或功能上紧密反映或模仿内源或野生型特征的特征。也就是说，与现有技术的合成的或其类似物相比，“更真实”的特征代表了更好地内源性、野生型、天然或生理细胞功能和/或结构，或者其表现优于相应的内源性、野生型一种或多种方面的自然类型、自然或生理特征。与本公开 内容的核酸分子结合使用的更真实的5'-帽结构的非限制性实例是那些具有增强的帽结合蛋白的结合，增加的半衰期，降低的对5'的敏感性的。与本领域已知的合成5'-帽结构(或与野生型、天然或生理学5'-帽结构)相比，β-内切核酸酶减少的5'-脱帽。例如，在一些实施方案中，重组痘苗病毒加帽酶和重组2'-O-甲基转移酶可在多核苷酸的5'-末端核苷酸和鸟苷帽核苷酸之间产生规范的5'-5'-三磷酸键。帽鸟嘌呤含有N7-甲基化，而多核苷酸的5'-末端核苷酸含有2'-O-甲基。这种结构称为Cap1结构。与例如本领域已知的其他5’帽类似物结构相比，该帽导致更高的翻译能力、细胞稳定性和减少细胞促炎细胞因子的活化。其他示例性盖帽结构包括7mG(5’)ppp(5’)N,pN2p(Cap 0),7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp(Cap 1),7mG(5’)-ppp(5’)NlmpN2mp(Cap 2),和m(7)Gpppm(3)(6,6,2’)Apm(2’)Apm(2’)Cpm(2)(3,2’)Up(Cap 4)。

可以预期的是，本公开内容的核酸分子可以在转录后被封端，并且因为该过程更有效，所以可以把近100％的核酸分子进行封端。

非翻译区(UTRs)

在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含一个或多个非翻译区(UTR)。在一些实施方案中，UTR位于核酸分子编码区的上游，称为5'-UTR。在一些实施方案中，UTR位于核酸分子编码区的下游，称为3’-UTR。UTR的序列可以与核酸分子中编码区的序列同源或异源。核酸分子可包含多个UTR可，它们并且可以具有相同或不同的序列和/或遗传起源。根据本公开，可以对核酸分子中UTR的任何部分(包括没有的情况)进行密码子优化，并且可以独立地包含一个或多个不同的结构或化学修饰，在密码子优化之前和/或之后。

在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子(如mRNA)包含彼此同源的UTR和编码区。在其他实施方案中，本公开的核酸分子(如mRNA)包含相对于彼此异源的UTR和编码区。在一些实施方案中，为了检测UTR序列的活性，可以在体外(例如细胞或组织培养物)或在体内(例如向受试者)施用包含UTR和可检测探针编码序列的核酸分子。并可以使用本领域已知的方法检测UTR序列的作用(如对表达水平的调节、编码产物的细胞定位或编码产物的半衰期)。

在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子(如mRNA)的UTR包含至少一种翻译增强子元件(TEE)，其起增加从该核酸分子产生的多肽或蛋白质产量的作用。在一些实施方案中，TEE位于核酸分子的5'-UTR中。在其他实施方案中，TEE位于核酸分子的3'-UTR处。在其他实施方案中，至少两个TEE分别位于核酸分子的5'-UTR和3'-UTR。在一些实施方案中，本公开的核酸分子(如mRNA)可包含TEE序列的一个或多个拷贝或包含多于一个的不同TEE序列。在一些实施方案中，核酸分子中的不同TEE序列可以彼此是同源的或异源的。

本领域已知存在可以结合本公开使用的各种TEE序列。例如，在一些实施方案中，TEE可以是内部核糖体进入位点(IRES)、HCV-IRES或IRES元件。Chappell等。Chappell et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:9590-9594,2004；Zhou et al.Proc.Natl.Acad.Sci.102:6273-6278,2005.。可结合本公开使用的另外的内部核糖体进入位点(IRES)，包括但不限于，美国专利号7,468,275，美国专利公开号2007/0048776和美国专利公开号2011/0124100和国际专利公开号WO2007/025008以及国际专利公开号WO2001/055369中记载的，其全部内容通过引用方式整体并入本文。在一些实施方案中，TEE可以是在Wellensiek et al Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing  elements,Nature Methods,2013Aug；10(8):747–750的补充表1和补充表2中描述的那些，其内容通过引用的方式整体并入本文。

可以结合本公开使用的另外的示例性TEE，包括但不限于，在美国专利号6,310,197，美国专利号6,849,405，美国专利号7,456,273，美国专利号7,183,395，美国专利公开号2009/0226470，美国专利公开号2013/0177581，美国专利公开号2007/0048776，美国专利公开号2011/0124100，美国专利公开号2009/0093049，国际专利公开号WO2009/075886，国际专利公开号WO2012/009644和国际专利公开号WO1999/024595，国际专利公开号WO2007/025008，国际专利公开号WO2001/055371，欧洲专利号2610341，欧洲专利号2610340中公开的TEE序列，其全部内容通过引用的方式整体并入本文。

在各种实施方案中，本公开的核酸分子(如mRNA)包含至少一个UTR，其包含至少1，至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少67，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，至少25，至少30，至少35，至少40，至少45，至少50，至少55或大于60个TEE序列的情况。在一些实施方案中，核酸分子的UTR中的TEE序列是相同TEE序列的拷贝。在其他实施方案中，核酸分子的UTR中的至少两个TEE序列具有不同的序列。在一些实施方案中，多个不同的TEE序列以一种或多种重复模式排列在核酸分子的UTR区域中。仅出于说明目的，重复模式可以是例如ABABAB，ABABBAABBAABB，ABCABCABC等，其中在这些示例性模式中，每个大写字母(A，B或C)代表不同的TEE序列。在一些实施方案中，至少两个TEE序列在核酸分子的UTR中彼此连续(即，在它们之间没有间隔序列)。在其他实施方案中，至少两个TEE序列由间隔子序列隔开。在一些实施方案中，UTR可以包含TEE序列-间隔子序列模块，其重复至少一次，至少两次，至少3次，至少4次，至少5次，至少6次，至少7次，至少8次，至少9次或9次以上。在该段落中描述的任何实施方案中，UTR可以是核酸分子的5’-UTR，3’-UTR，或5’-UTR和3’-UTR两者。

在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子(如mRNA)的UTR包含至少一种翻译抑制元件，其功能是减少从该核酸分子产生的多肽或蛋白质的量。在一些实施方案中，核酸分子的UTR包含一种或多种被一种或多种微RNA识别的miR序列或其片段(如miR种子序列)。在一些实施方案中，核酸分子的UTR包含下调核酸分子的翻译活性的一个或多个茎环结构。抑制与核酸分子相关的翻译活性的其他机制是本领域已知的。在该段落中描述的任何实施方案中，UTR可以是核酸分子的5’-UTR，3’-UTR，或5’-UTR和3’-UTR两者。

聚腺苷酸化(Poly-A)区

在天然RNA加工过程中，通常将长链腺苷核苷酸(poly-A)区添加到信使RNA(mRNA)分子中，以增加分子的稳定性。转录后，立即将转录本的3'-末端裂解以释放3'-羟基。然后，poly-A聚合酶将腺苷核苷酸链添加到RNA。该过程称为聚腺苷酸化，添加了一个长度为100至250个残基的poly-A区。可以预期的是，poly-A区可以赋予本发明的核酸分子多种优点。

因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子(如mRNA)包含聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，本公开的核酸分子(如mRNA)包含一个或多个聚腺苷酸化(poly-A)区 域。在一些实施方案中，poly-A区完全由腺嘌呤核苷酸或其功能类似物组成。在一些实施方案中，核酸分子在其3'末端包含至少一个poly-A区。在一些实施方案中，核酸分子在其5’末端包含至少一个poly-A区。在一些实施方案中，核酸分子在其5'末端包含至少一个poly-A区域，在其3'末端包含至少一个poly-A区域。

根据本公开，在不同的实施例中，poly-A区域可以具有变化的长度。特别地，在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少30个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少35个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少40个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少45个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少50个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少55个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少60个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少65个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少70个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少75个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少80个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少85个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少90个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少95个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少100个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少110个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少120个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少130个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少140个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少150个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少160个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少170个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少180个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少190个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少200个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少225个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少250个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少275个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少300个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少350个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少400个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少450个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少500个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少600个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少700个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸 分子的poly-A区的长度为至少800个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少900个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少1000个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少1100个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少1200个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少1300个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少1400个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少1500个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少1600个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少1700个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少1800个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少1900个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少2000个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少2250个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少2500个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少2750个核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子的poly-A区的长度为至少3000个核苷酸。

在一些实施方案中，可以基于核酸分子或其部分的总长度(如编码区的长度或开放阅读框的长度)选择核酸分子中的poly-A区的长度。例如，在一些实施例中，poly-A区域占含有多poly-A区的核酸分子的总长度的约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。

可以预期某些RNA结合蛋白可以结合位于mRNA分子3'端的poly-A区域。这些poly-A结合蛋白(PABP)可以调节mRNA表达，例如与细胞中的翻译起始机制相互作用和/或保护3'-poly-A尾免于降解。因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子(如mRNA)包含poly-A结合蛋白(PABP)的至少一个结合位点。在其他实施方案中，在将核酸分子装载到递送载体(例如脂质纳米颗粒)中之前使其与PABP缀合或复合。

在一些实施方案中，本公开的核酸分子(如mRNA)包含poly-A-G四聚体。G四聚体是四个鸟苷核苷酸的环状氢键阵列，可以由DNA和RNA中的富G序列形成。在该实施例中，将G四聚体结合在poly-A区域的末端。可以测定所得的多核苷酸(如mRNA)的稳定性、蛋白质产生和其他参数，包括在不同时间点的半衰期。研究表明，polyA-G四聚体结构产生的蛋白质产量至少等于单独使用120个核苷酸的poly-A区域产生蛋白质产量的75％。

在一些实施方案中，本公开的核酸分子(如mRNA)可以包括poly-A区，并且可以通过添加3'稳定区来稳定。在一些实施方案中，可用于稳定核酸分子(如mRNA)的3'稳定区，包括poly-A或poly-A-G四聚体结构，记载于国际专利公开号WO2013/103659中，其通过引用方式全部并入本文。

在其他实施方案中，可与本公开内容的核酸分子结合使用的3'稳定区包括链终止核苷，例如但不限于，3'-脱氧腺苷(cordycepin)、3'-脱氧尿苷，3'-脱氧胞嘧啶、3'-脱氧鸟苷、3'-脱氧胸腺嘧啶、2'，3'-二脱氧核苷、2'，3'-二脱氧腺苷、2'，3'-二脱氧尿苷、2'，3'-二脱氧胞嘧啶、2'，3'-二脱氧鸟苷、2'，3'-二脱氧胸腺嘧啶、2'-脱氧核苷或O-甲基核 苷、3'-脱氧核苷、2'，3'-二脱氧核苷3'-O-甲基核苷、3'-O-乙基核苷、3'-阿拉伯糖苷，本文所述的或本领域已知的其他替代核苷。

二级结构

茎环结构可以指导RNA折叠，保护核酸分子(如mRNA)的结构稳定性，提供RNA结合蛋白的识别位点，并用作酶促反应底物。例如，整合加入miR序列和/或TEE序列会改变茎环区域的形状，这可能会增加和/或减少翻译(Kedde et al.A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3’UTR controls miR-221 and miR-222 accessibility.Nat Cell Biol.,2010 Oct；12(10):1014-20，其内容通过引用整体并入本文)。

因此，在一些实施方案中，本文所述的核酸分子(如mRNA)或其一部分可采取茎环结构，例如但不限于组蛋白茎环。在一些实施方案中，茎环结构由长度为约25或约26个核苷酸的茎环序列形成，可以是但不限于如国际专利公开号WO2013/103659中所述的那些，其通过引用方式将其全部内容并入本文。茎-环序列的其他实例包括国际专利公开号WO2012/019780和国际专利公开号WO201502667中描述的那些，其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，茎-环序列包括如本文所述的TEE。在一些实施方案中，茎-环序列包含如本文所述的miR序列。在特定的实施方案中，茎环序列可以包括miR-122种子序列。在特定的实施方案中，核酸分子包含茎环序列CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA(SEQ ID NO：1)。在其他实施方案中，核酸分子包含茎环序列CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA(SEQ ID NO：2)。

在一些实施方案中，本公开的核酸分子(如mRNA)包含位于核酸分子编码区上游(5'端)的茎环序列。在一些实施方案中，茎环序列位于核酸分子的5'-UTR内。在一些实施方案中，本公开的核酸分子(如mRNA)包含位于核酸分子编码区下游(3'端)的茎环序列。在一些实施方案中，茎环序列位于核酸分子的3'-UTR内。在某些情况下，核酸分子可包含一个以上的茎环序列。在一些实施方案中，核酸分子在5'-UTR中包含至少一个茎环序列，在3'-UTR中包含至少一个茎环序列。

在一些实施方案中，包含茎环结构的核酸分子进一步包含稳定化区域。在一些实施方案中，稳定区包含至少一个链终止核苷，其起减缓降解的作用并因此增加了核酸分子的半衰期。可以结合本公开使用的示例性的链终止核苷，包括但不限于，3'-脱氧腺苷(cordycepin)、3'-脱氧尿苷、3'-脱氧胞嘧啶、3'-脱氧鸟苷、3'-脱氧胸腺嘧啶、2',3'-二脱氧核苷、2'，3'-二脱氧腺苷、2'，3'-二脱氧尿苷、2'，3'-二脱氧胞嘧啶、2'，3'-二脱氧鸟苷、2'，3'-二脱氧胸腺嘧啶、2'-脱氧核苷或O-甲基核苷、3'-脱氧核苷、2'，3'-二脱氧核苷3'-O-甲基核苷、3'-O-乙基核苷、3'-阿拉伯糖苷，本文所述的或本领域已知的其他替代核苷。在其他实施方案中，可以通过改变多核苷酸的3'区域来稳定茎环结构，该改变可以防止和/或抑制oligio(U)的添加(国际专利公开号WO2013/103659，其全文通过引用方式并入本文)。

在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含至少一个茎环序列和poly-A区或聚腺苷酸化信号。包含至少一个茎环序列和poly-A区或聚腺苷酸化信号的多核苷酸序列的非限制性实例，包括在国际专利公布号WO2013/120497，国际专利公布号WO2013/120629，国际专利公布号WO2013/120500号，第WO2013/120627号国际专利，第WO2013/120498号国际专利，国际专利公布号WO2013/120626，国际专利公布号WO2013/120499和国际专利公布号WO2013/120628中所述，其全部内容通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，包含茎环序列和poly-A区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码病原体抗原或其片段，如国际专利公开号WO2013/120499和国际专利公开号WO2013/120628中所述的，其内容通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，包含茎环序列和poly-A区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码治疗性蛋白质，如国际专利公开号WO2013/120497和国际专利公开号No.WO2013/120629所述的，其内容通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，包含茎环序列和poly-A区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码肿瘤抗原或其片段，如国际专利公开号WO2013/120500和国际专利公开号WO2013/120627中所述的，其内容通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，包含茎环序列和poly-A区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码变应原性抗原或自身免疫自身抗原，如国际专利公开号WO2013/120498和国际专利公开号WO2013/120626中所述的，其内容通过引用整体并入本文。

功能性核苷酸类似物

在一些实施方案中，包含茎环序列和poly-A区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码变应原性抗原或自身免疫自身抗原，如国际专利公开号WO2013/120498和国际专利公开号WO2013/120626中所述的，其内容通过引用整体并入本文。

因此，在一些实施方案中，有效载荷核酸分子包含至少一种本文所述的功能核苷酸类似物。在一些实施方案中，功能核苷酸类似物包含对核碱基、糖基和/或磷酸基的至少一种化学修饰。因此，包含至少一种功能性核苷酸类似物的有效载荷核酸分子含有对核碱基、糖基和/或核苷键的至少一种化学修饰。本文提供了对核酸分子的核碱基、糖基或核苷键的示例性化学修饰。

如本文所述，有效载荷核酸分子中所有核苷酸在0％至100％范围可以是如本文所述的功能性核苷酸类似物。例如，在各种实施例中，从约1％至约20％，从约1％至约25％，从约1％至约50％，从约1％至约60％，从约1％至约70百分比，约1％至约80％，约1％至约90％，约1％至约95％，约10％至约20％，约10％至约25％，约10％％至约50％，约10％至约60％，约10％至约70％，约10％至约80％，约10％至约90％，约10％至约95％，约10％至约100％，约20％至约25％，约20％至约50％，约20％至约60％，约20％至约70％，约20％至约80％，约20％至约90％，约20％至约95％，约20％至约100％，约50％至约60％，约50％至约70％，约50％至约80％，约50％至约90％，约50％至约95％，约50％至约100％，约70％至约80％，约70％至约90％，约70％至约95％，约70％至约100％，约80％至约90％，约80％至约95％，约80％至约100％，约90％至约95％，约90％至约100％或约95％至约100％是本文所述的功能核苷酸类似物。在这些实施方案的任一个中，功能性核苷酸类似物可以存在于核酸分子的任何位置，包括5’-末端，3’-末端和/或一个或多个内部位置。在一些实施方案中，单个核酸分子可包含不同的糖修饰，不同的核碱基修饰和/或不同类型的核苷键(如骨架结构)。

如本文所述，在一种类型的所有核苷酸的0％至100％(例如，一种类型的所有含嘌呤的核苷酸，或一种类型的所有含嘧啶的核苷酸，或所有A，G，C，T或U的范围从0％到100％有效载荷核酸分子中的“作为一种”)可以是本文所述的功能核苷酸类似物。例如，在各种实施例中，从约1％至约20％，从约1％至约25％，从约1％至约50％，从约1％至约60％，从约1％至约70％，约1％至约80％，约1％至约90％，约1％至约 95％，约10％至约20％，约10％至约25％，约10％％至约50％，约10％至约60％，约10％至约70％，约10％至约80％，约10％至约90％，约10％至约95％，约10％至约100％，约20％至约25％，约20％至约50％，约20％至约60％，约20％至约70％，约20％至约80％，约20％至约90％，约20％至约95％，约20％至约100％，约50％至约60％，约50％至约70％，约50％至约80％，约50％至约90％，约50％至约95％，约50％至约100％，约70％至约80％，约70％至约90％，约70％至约95％，约70％至约100％，约80％至约90％，约80％至约95％，约80％至约100％，约90％至约95％，约90％至大约100％或约95％至约100％是本文所述的功能核苷酸类似物。在这些实施方案的任一个中，功能性核苷酸类似物可以存在于核酸分子的任何位置，包括5’-末端，3’-末端和/或一个或多个内部位置。在一些实施方案中，单个核酸分子可包含不同的糖修饰、不同的核碱基修饰和/或不同类型的核苷键(如骨架结构)。

碱基的修饰

在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物包含非标准核碱基。在一些实施方案中，可以修饰或替换核苷酸中的标准核碱基(例如，腺嘌呤，鸟嘌呤，尿嘧啶，胸腺嘧啶和胞嘧啶)以提供该核苷酸的一种或多种功能类似物。核碱基的示例性修饰，包括但不限于，一个或多个取代或修饰，包括但不限于烷基、芳基、卤素、氧代、羟基、烷氧基和/或硫代取代；一个或多个稠环或开环，氧化和/或还原。

在一些实施方案中，非标准核碱基是修饰的尿嘧啶。具有修饰的尿嘧啶的示例性核碱基和核苷包括伪尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂尿嘧啶、6-氮杂尿嘧啶、2-硫-5-氮杂尿嘧啶、2-硫尿嘧啶(s²U)、4-硫-尿嘧啶(s⁴U)、4-硫-伪尿苷、2-硫-伪尿苷、5-羟基-尿嘧啶(ho⁵U)、5-氨基烯丙基-尿嘧啶、5-卤-尿嘧啶(例如5-碘-尿嘧啶或5-溴尿嘧啶)、3-甲基尿嘧啶(m³U)、5-甲氧基尿嘧啶(mo⁵U)、尿嘧啶5-氧乙酸(cmo⁵U)、尿嘧啶5-氧乙酸甲酯(mcmo⁵U)、5-羧甲基-尿嘧啶(cm⁵U)、1-羧甲基-伪尿苷、5-羧基羟甲基-尿嘧啶(chm⁵U)、5-羧羟甲基-尿嘧啶甲酯(mchm⁵U)、5-甲氧羰基甲基尿嘧啶(mcm⁵U)、5-甲氧羰基甲基-2-硫尿嘧啶(mcm⁵s²U)、5-氨基甲基-2-硫代尿嘧啶(nm⁵s²U)、5-甲基氨基甲基-2-尿嘧啶(mnm⁵U)、5-甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶(mnm⁵s²U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代尿嘧啶(mnm⁵se²U)、5-氨基甲酰基甲基尿嘧啶(ncm5U)、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶(cmnm⁵U)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶(cmnm⁵s²U)、5-丙炔基尿嘧啶、1-丙炔基-伪尿嘧啶，5-牛磺酸甲基尿嘧啶(τm⁵U)、1-牛磺酸甲基-伪尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫尿嘧啶(τm⁵s²U)、1-牛磺基甲基-4-硫代-伪尿苷、5-甲基-尿嘧啶(m⁵U，即具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基-伪神经苷(m¹ψ)、1-乙基-伪神经苷(Et¹ψ)、5-甲基-2-硫-尿嘧啶(m⁵s²U)、1-甲基-4-硫代-古杜里定(m¹s⁴ψ)、4-硫-1-甲基-古杜里定、3-甲基-古杜里定(m³ψ)、2-硫-1-甲基-杜杜里定、1-甲基-1-去氮杂-伪尿苷、2-硫-1-甲基-1-去氮杂-伪尿苷、二氢尿嘧啶(D)、二氢伪尿苷、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基-二氢尿嘧啶(m⁵D)、2-硫代-二氢尿嘧啶、2-硫代-二氢伪尿苷、2-甲氧基-尿嘧啶、2-甲氧基-4-硫代尿嘧啶、4-甲氧基-伪尿苷、4-甲氧基-2-硫代伪尿苷、N1-甲基-伪尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿嘧啶(acp³U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)伪尿苷(acp³ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿嘧啶(m⁵U)、5-(异戊烯基)氨基甲基)-2-硫尿嘧啶(m⁵s²U)、5,2'-O-二甲基尿苷(m⁵Um)、2-硫基-2'-O-甲基尿苷(s²Um)、5-甲氧羰基甲基-2'-O-甲基尿苷(mcm⁵Um)、5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷(ncm⁵Um)、5-羧甲基氨基甲基-2'-O-甲基尿苷(cmnm⁵Um)、3,2'-O-二甲基尿苷(m³Um)和5-(异戊烯基氨基甲 基)-2'-O-甲基-尿苷(inm⁵Um)、1-硫-尿嘧啶、脱氧胸苷、5-(2-羰甲氧基乙烯基)-尿嘧啶、5-(氨基甲酰基羟甲基)-尿嘧啶、5-氨基甲酰基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-2-硫尿嘧啶、5-氰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-2-硫尿嘧啶和5-3-(1-E-丙烯氨基)尿嘧啶。

在一些实施方案中，非标准核碱基是修饰的胞嘧啶。具有修饰的胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包括5-氮杂胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶、假异胞苷、3-甲基胞嘧啶(m3C)、N4-乙酰基胞嘧啶(ac4C)、5-甲酰基胞嘧啶(f5C)、N4-甲基-胞嘧啶(m4C)、5-甲基-胞嘧啶(m5C)、5-卤代-胞嘧啶(例如5-碘-胞嘧啶)、5-羟甲基-胞嘧啶(hm5C)、1-甲基-伪异胞苷、吡咯并胞嘧啶、吡咯并假异胞嘧啶核苷、2-硫代胞嘧啶核苷(s2C)、2-硫代-5-甲基胞嘧啶核苷、4-硫代-伪异胞嘧啶核苷、4-硫代-1-甲基-伪异胞嘧啶核苷、4-硫基-1-甲基-1–脱氮-伪异胞苷、1-甲基-1-脱氮-伪异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮-泽布拉林(5-aza-zebularine)、5-甲基-泽布拉林(5-methyl-zebularine)、5-氮-2-硫代-泽布拉林(5-aza-2-thio-zebularine)、2-硫代-泽布拉林(2-thio-zebularine)、2-甲氧基-胞嘧啶、2-甲氧基-5-甲基胞嘧啶、4-甲氧基-伪异胞嘧啶核苷、4-甲氧基-1-甲基-伪异胞嘧啶核苷、赖氨酸(k2C)、5,2'-O-二甲基胞嘧啶核苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2'-O-甲基胞苷(ac4Cm)、N4,2'-O-二甲基胞苷(m4Cm)、5-甲酰基-2'-O-甲基胞苷(fSCm)、N4，N4,2'-O-三甲基胞苷(m42Cm)、1-硫代胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-(3-叠氮基丙基)-胞嘧啶和5-(2-叠氮基乙基)-胞嘧啶。

在一些实施方案中，非标准核碱基是修饰的腺嘌呤。具有替代腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤代嘌呤(例如2-氨基-6-氯嘌呤)、6-卤代嘌呤(例如6-氯嘌呤)、2-氨基-6-甲基嘌呤、8-叠氮基腺嘌呤、7-脱氮基腺嘌呤、7-脱氮基-8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮基-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺嘌呤(m1A)、2-甲基腺嘌呤(m2A)、N6-甲基腺嘌呤(m6A)、2-甲硫基-N6-甲基腺嘌呤(ms2m6A)、N6-异戊烯基腺嘌呤(i6A)、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤(ms2i6A)、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺嘌呤(io6A)、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺嘌呤(ms2io6A)、N6-甘氨酰氨基甲酰基-腺嘌呤(g6A)、N6-苏氨甲氨基甲酰基-腺嘌呤(t6A)、N6-甲基-N6-苏氨甲氨基甲酰基-腺嘌呤(m6t6A)、2-甲硫基-N6-苏氨甲氨基甲酰基-腺嘌呤(ms2g6A)、N6，N6-二甲基-腺嘌呤(m62A)、N6-羟基-正戊基氨基甲酰基-腺嘌呤(hn6A)、2-甲硫基-N6-羟基-正戊基氨基甲酰基-腺嘌呤(ms2hn6A)、N6-乙酰基腺嘌呤(ac6A)、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基腺嘌呤、2-甲氧基腺嘌呤、N6,2'-O-二甲基腺苷(m6Am)、N6，N6,2'-O-三甲基腺苷(m62Am)、1,2'-O-二甲基腺苷(m1Am)、2-氨基-N6-甲基嘌呤、1-硫代腺嘌呤，8-叠氮腺嘌呤、N6-(19-氨基-五氧杂十二烷)-腺嘌呤、2,8-二甲基-腺嘌呤、N6-甲酰基-腺嘌呤和N6-羟甲基-腺嘌呤

在一些实施方案中，非标准核碱基是修饰的鸟嘌呤。具有修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基肌苷(m1I)、肌苷(imG)、甲基肌苷(mimG)、4-脱甲基肌苷(imG-14)、异代酪氨酸(imG2)、怀丁苷(wybutosine)(yW)、过氧代酪氨酸(o2yW)，羟基代酪氨酸(OHyW)、改性不足的羟基代酪氨酸(OHyW*)、7-脱氮鸟嘌呤、奎松碱(Q)、环氧奎松碱(oQ)、半乳糖基奎松碱(galQ)、甘露糖基奎奴松、7-氰基-7-脱氮鸟嘌呤(preQO)、7-氨基甲基-7-脱氮鸟嘌呤(preQ1)、古生物碱(G+)、7-脱氮8-氮杂鸟嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、6-硫代-7-脱氮-鸟嘌呤、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤(m7G)、6-硫代-7-甲基鸟嘌呤、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟嘌呤、1-甲基鸟嘌呤(m1G)、 N2-甲基鸟嘌呤(m2G)、N2，N2-二甲基鸟嘌呤(m22G)、N2,7-二甲基鸟嘌呤(m2,7G)、N2，N2,7-二甲基鸟嘌呤(m2,2,7G)、8-氧代鸟嘌呤、7-甲基-8-氧代鸟嘌呤、1-甲基-6-硫代鸟嘌呤、N2-甲基-6-硫代鸟嘌呤、N2，N2-二甲基-6-硫代鸟嘌呤、N2-甲基-2'-O-甲基-鸟嘌呤(m2Gm)、N2，N2-di甲基-2'-O-甲基鸟苷(m22Gm)、1-甲基-2'-O-甲基鸟苷(m1Gm)、N2,7-二甲基-2'-O-甲基鸟苷(m2,7Gm)、2'-O-甲基肌苷(Im)、1,2'-O-二甲基肌苷(mIm)、1-硫代鸟嘌呤和O-6-甲基鸟嘌呤。

在一些实施方案中，功能核苷酸类似物的非标准核碱基可以独立地是嘌呤、嘧啶、嘌呤或嘧啶类似物。例如，在一些实施方案中，非规范核碱基可以是修饰的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或次黄嘌呤。在其他实施方案中，非规范核碱基还可以包括例如碱基的天然存在和合成的衍生物，包括吡唑并[3,4-d]嘧啶、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶，8-卤代(例如8-溴)、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、脱氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、脱氮腺苷、7-脱氮腺苷、3-脱氮腺苷、吡唑并[3,4-d]嘧啶、咪唑并[1,5-a]1,3,5三嗪酮、9-去氮杂嘌呤、咪唑并[4,5-d]吡嗪、噻唑并[4,5-d]嘧啶、吡嗪-2-酮、1,2,4-三嗪、哒嗪，或1,3,5三嗪。

糖的修饰

在一些实施方案中，功能核苷酸类似物包含非标准糖基。在各种实施方案中，非标准糖基团可以是具有一个或多个取代基的5-碳或6-碳糖(例如戊糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖或其脱氧衍生物)，所述取代基可以是卤素、羟基、硫醇基、烷基、烷氧基、烯基氧基、炔基氧基、环烷基、氨基烷氧基、烷氧基烷氧基、羟基烷氧基、氨基、叠氮基基团、芳基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基等。

通常，RNA分子包含核糖基团，其是具有氧的五元环。示例性的非限制性替代核苷酸包括核糖中的氧置换(例如用S，Se或亚烷基，如亚甲基或亚乙基)取代；双键的加成(例如用环戊烯基或环己烯基取代核糖)；核糖的环收环(例如形成环丁烷或氧杂环丁烷的四元环)；核糖的扩环(例如形成具有额外碳原子或杂原子的6或7元环，例如脱水己糖醇，阿糖醇，甘露糖醇，环己基，环己烯基和吗啉代(也具有氨基磷酸酯主链))；多环形式(例如三环和“解锁”形式，例如乙二醇核酸(GNA)(如R-GNA或S-GNA，其中核糖被附着在磷酸二酯键上的乙二醇单元取代)，苏糖核酸(TNA，其中核糖被α-L-苏呋喃呋喃糖基-(3'→2')取代)和肽核酸(PNA，其中2-氨基-乙基-甘氨酸键取代了核糖和磷酸二酯主链)。

在一些实施方案中，糖基团包含一个或多个碳，其具有与核糖中相应碳相反的立体化学构型。因此，核酸分子可包括含有例如阿拉伯糖或L-核糖作为糖的核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包括至少一个核苷，其中糖是L-核糖，2'-O-甲基核糖，2'-氟核糖，阿拉伯糖，己糖醇，LNA或PNA。

核苷键的修饰

在一些实施方案中，本公开的有效载荷核酸分子可包含一个或多个修饰的核苷键(如磷酸骨架)。可以通过用不同的取代基取代一个或多个氧原子来改变骨架的磷酸基团。

在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物可包括另一个核苷键取代未改变的磷酸部分。替代的磷酸酯基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯，亚磷酸硒酸酯，硼酸磷酸酯，硼酸磷酸酯，膦酸氢根，氨基磷酸酯，二氨基磷酸酯，烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧都被硫取代。也可以通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)，硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)代替氧来连接改变的磷酸酯键。

可替代的核苷和核苷酸包括硼烷部分(BH₃)，硫(thio)，甲基，乙基和/或甲氧基代替一个或多个非桥连的氧。作为非限制性实例，在相同位置(如α，β或γ位置)的两个非桥连的氧可以被硫(thio)和甲氧基取代。通过在磷酸部分(如α-硫代磷酸酯)的位置上的一个或多个氧原子的取代，以非天然硫代磷酸酯主链连接增强RNA和DNA的稳定性(例如针对核酸外切酶和核酸内切酶时)。硫代磷酸酯DNA和RNA具有增强的核酸酶抗性，因此在细胞环境中具有更长的半衰期。

根据本公开使用的其他核苷键包括不包含磷原子的核苷键。

可以结合本公开使用的核酸分子(如mRNA)、组合物、制剂和/或与其相关的方法的其他实例，进一步包括在WO2002/098443，WO2003/051401，WO2008/052770，WO2009127230，WO2006122828，WO2008/083949，WO2010088927，WO2010/037539，WO2004/004743，WO2005/016376，WO2006/024518，WO2007/095976，WO2008/014979，WO2008/077592，WO2009/030481，WO2009/095226，WO2011069586，WO2011026641，WO2011/144358，WO2012019780，WO2012013326，WO2012089338，WO2012113513，WO2012116811，WO2012116810，WO2013113502，WO2013113501，WO2013113736，WO2013143698，WO2013143699，WO2013143700，WO2013/120626，WO2013120627，WO2013120628，WO2013120629，WO2013174409/WO2015127917，WO2015024667，WO2015/024665，WO2015/024666，WO2015/024664，WO2015101415，WO2015101414，WO2015024667，WO2015062738，WO2015101416中，其每一个的内容整体并入本文。

剂型

根据本公开，本文所述的纳米颗粒组合物可包含至少一种脂质组分和一种或多种其他组分，例如治疗剂和/或预防剂。可以将纳米颗粒组合物设计用于一种或多种特定应用或目标。可以基于特定的应用或目标和/或基于一种或多种元素的功效、毒性、费用、易用性、可用性或其他特征来选择纳米颗粒组合物的元素。类似地，可以根据元素的特定组合的功效和毒性，为特定的应用或目标选择纳米颗粒组合物的特定制剂。

纳米颗粒组合物的脂质组分可包括如本文所述的式(I)(及其子式)的脂质、磷脂(例如不饱和脂质，如DOPE或DSPC等)、PEG脂质和结构脂质。脂质组分的元素可以特定的比例提供。

在一个实施方案中，本文提供了纳米颗粒组合物，其包含本文提供的阳离子或可电离的脂质化合物、治疗剂和一种或多种赋形剂。在一个实施方案中，阳离子或可电离的脂质化合物包含如本文所述的式(I)(及其子式)的化合物，以及任选地一种或多种其他可电离的脂质化合物。在一个实施方案中，一种或多种赋形剂选自中性脂质、类固醇和聚 合物缀合的脂质。在一实施方案中，治疗剂被包封在脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒缔合。

在一个实施方案中，本文提供了一种纳米颗粒组合物(脂质纳米颗粒)，其包含：

i)40至50摩尔百分数的阳离子脂质；

ii)中性脂质；

iii)类固醇；

iv)聚合物共轭脂质；和

v)治疗剂。

如本文所述的，“摩尔百分数”是指某组分相对于LNP中所有脂质组分总摩尔数(即阳离子脂质、中性脂质、类固醇和聚合物共轭脂质的总摩尔数)的摩尔百分数。

在一个实施方案中，脂质纳米颗粒占41至49摩尔百分数，41至48摩尔百分数，42至48摩尔百分数，43至48摩尔百分数，44至48摩尔百分数，45至48摩尔百分数，阳离子脂质的含量为46-48摩尔百分数，或47.2-47.8摩尔百分数。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒占阳离子脂质的约47.0、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9或48.0摩尔百分数。

在一个实施方案中，中性脂质以5至15摩尔百分数，7至13摩尔百分数或9至11摩尔百分数的浓度存在。在一个实施方案中，中性脂质以约9.5、10或10.5摩尔百分数的浓度存在。在一个实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比为约4.1：1.0至约4.9：1.0，约4.5：1.0至约4.8：1.0，或约4.7：1.0至4.8：1.0。

在一个实施方案中，类固醇的存在浓度范围为39-49摩尔百分数，40-46摩尔百分数，40-44摩尔百分数，40-42摩尔百分数，42-44摩尔百分数或44-46摩尔百分数％。在一实施方案中，类固醇以40、41、42、43、44、45或46摩尔百分数的浓度存在。在一个实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比为1.0：0.9至1.0：1.2，或1.0：1.0至1.0：1.2。在一实施方案中，类固醇是胆固醇。

在一个实施方案中，LNP中治疗剂与脂质的比率(即，N/P，N代表阳离子脂质的摩尔，P代表作为核酸主链的一部分存在的磷酸盐的摩尔)为2：1至2。30：1，例如3：1到22：1。在一个实施方案中，N/P为6∶1至20∶1或2∶1至12∶1。示例性N/P范围包括约3：1。大约6：1，大约12：1和大约22：1。

在一个实施方案中，本文提供一种脂质纳米颗粒，其包含：

i)有效pKa大于6.0的阳离子脂质；

ii)5至15摩尔百分数的中性脂质；

iv)30至45摩尔百分数的类固醇；

v)聚合物共轭脂质；和

vi)治疗剂或其药学上可接受的盐或前药，

其中，摩尔百分数是基于脂质纳米颗粒中存在的脂质的总摩尔确定的。

在一个实施方案中，阳离子脂质可以是在选定的pH(如生理pH)下带有净正电荷的多种脂质中的任何一种。示例性的阳离子脂质在下文描述。在一个实施方案中，阳离子脂质的pKa大于6.25。在一实施方案中，阳离子脂质的pKa大于6.5。在一个实施方案中，阳离子脂质具有大于6.1，大于6.2，大于6.3，大于6.35，大于6.4，大于6.45，大于6.55，大于6.6，大于6.65或大于6.7的pKa。

在一实施方案中，脂质纳米颗粒占阳离子脂质的40至45摩尔百分数。在一实施方案中，脂质纳米颗粒占阳离子脂质的45至50摩尔百分数。

在一个实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比为约2∶1至约8∶1。在一个实施方案中，中兴脂质占脂质纳米颗粒中脂质的5至10摩尔百分数。

示例性的阴离子脂质包括但不限于磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DSPG)。

在一个实施方案中，脂质纳米颗粒含有1至10摩尔％的阴离子脂质。在一个实施方案中，脂脂质纳米颗粒含有1至5摩尔％的阴离子脂质。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒中含有1至9摩尔％，1至8摩尔％，1至7摩尔％或1至6摩尔％的阴离子脂质。在一个实施方案中，阴离子脂质与中性脂质的摩尔比为1：1至1:10。

在一实施方案中，类固醇胆固醇。在一个实施方案中，阳离子脂质与胆固醇的摩尔比为约5∶1至1∶1。在一实施方案中，脂质纳米颗粒含有32至40摩尔％的类固醇。

在一个实施方案中，中性脂质的摩尔百分比与阴离子脂质的摩尔百分比之和为5至15摩尔百分比。在一个实施方案中，其中中性脂质的摩尔百分比和阴离子脂质的摩尔百分比的总和为7至12摩尔百分比。

在一个实施方案中，阴离子脂质与中性脂质的摩尔比为1：1至1:10。在一个实施方案中，中性脂质和类固醇的摩尔百分数的总和为35至45摩尔百分比。

在一实施方案中，脂质纳米颗粒包括：

i)45-55摩尔百分数的阳离子脂质；

ii)5-10摩尔百分数的中性脂质；

iii)1-5摩尔百分数的的阴离子脂质；和

iv)32-40摩尔百分数的的类固醇。

在一实施方案中，脂质纳米颗粒含有1.0至2.5摩尔百分数的聚合物缀合的脂质。在一个实施方案中，聚合物缀合的脂质以约1.5摩尔百分数的浓度存在。

在一个实施方案中，中性脂质以5至15摩尔百分数，7至13摩尔百分数或9至11摩尔百分数的浓度存在。在一个实施方案中，中性脂质以约9.5、10或10.5摩尔百分数的浓度存在。在一个实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比为约4.1：1.0至约4.9：1.0，约4.5：1.0至约4.8：1.0，或约4.7：1.0至4.8：1.0。

在一实施方案中，类固醇是胆固醇。在一些实施方案中，类固醇的存在浓度范围为39至49摩尔百分数，40至46摩尔百分数，40至44摩尔百分数，40至42摩尔百分数，42至44摩尔百分数或44至46摩尔百分数。在一实施方案中，类固醇以40、41、42、43、44、45或46摩尔百分数的浓度存在。在某些实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比为1.0：0.9至1.0：1.2，或1.0：1.0至1.0：1.2。

在一个实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比为5∶1至1∶1。

在一实施方案中，脂质纳米颗粒中含有1.0至2.5摩尔百分数的聚合物缀合的脂质。在一个实施方案中，聚合物缀合的脂质以约1.5摩尔百分数的浓度存在。

在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物缀合的脂质的摩尔比为约100∶1至约20∶1。在一实施方案中，阳离子脂质与聚合物缀合脂质的摩尔比为约35∶1至约25∶1。

在一实施方案中，脂质纳米颗粒的平均直径为50nm至100nm，或60nm至85nm。

在一个实施方案中，该组合物包含本文提供的阳离子脂质，DSPC，胆固醇和PEG-脂质以及mRNA。在一个实施方案中，本文提供的阳离子脂质，DSPC，胆固醇和PEG-脂质的摩尔比为约50：10：38.5：1.5。

可以将纳米颗粒组合物设计用于一种或多种特定应用或目标。例如，可以设计纳米颗粒组合物以将治疗剂和/或预防剂(例如RNA)输送到哺乳动物体内的特定细胞、组织、器官或其系统等。可以改变纳米颗粒组合物的物理化学性质，以增加对特定身体靶标的选择性。例如，可以基于不同器官的开窗尺寸(fenestration size)来调节粒径。纳米颗粒组合物中包含的治疗剂和/或预防剂也可以基于所需的一个或多个递送靶标进行选择。例如，可以选择治疗剂和/或预防剂用于特定适应症、状况、疾病或病症和/或递送至特定细胞、组织、器官或系统等(例如，局部或特异性递送)。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物可包含编码能够在细胞内翻译产生目的多肽的mRNA。可以专门设计这种组合物以递送至特定器官。在某些实施方案中，可以将组合物设计为特异性递送至哺乳动物肝脏。

纳米颗粒组合物中治疗剂和/或预防剂的量可以取决于纳米颗粒组合物的大小、组成、目期望靶标和/或其他性质以及治疗剂和/或预防剂的性质。例如，可用于纳米颗粒组合物中的RNA的量可取决于RNA的大小、序列和其他特征。纳米颗粒组合物中治疗剂和/或预防剂和其他元素(例如脂质)的相对量也可以调整。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物中脂质组分与治疗剂和/或预防剂的wt/wt比可以为约5：1至约60：1，例如5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1、25：1、30：1、35：1、40：1、45：1、50：1和60：1。脂质组分与治疗剂和/或预防剂的wt/wt比可以为约10∶1至约40∶1。在某些实施方案中，重量/重量比为约20∶1。纳米颗粒组合物中治疗剂和/或预防剂的量可以通过吸收光谱法(如紫外线-可见光谱法)来测量。

在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含一种或多种RNA，并且可以选择一种或多种RNA、脂质及其用量以提供特定的N：P比。组合物的N：P比是指一种或多种脂质中的氮原子与RNA中磷酸基团数目的摩尔比。在一些实施例中，选择较低的N：P比。可以选择一种或多种RNA、脂质及其用量以使N：P比为约2：1至约30：1，例如2：1、3：1、4：1、5：1，6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、12：1、14：1、16：1、18：1、20：1、22：1、24：1、26：1、28：1或30：1。在某些实施方案中，N∶P比可为约2∶1至约8∶1。在其他实施方案中，N∶P比为约5∶1至约8∶1。例如，N：P比可以为约5.0：1，约5.5：1，约5.67：1，约6.0：1，约6.5：1或约7.0：1。例如，N∶P比可以是大约5.67∶1。

纳米颗粒组合物的物理性质可以取决于其组分。例如，与包括不同的结构脂质的纳米颗粒组合物相比，包含胆固醇作为结构脂质的纳米颗粒组合物可以具有不同的特性。类似地，纳米颗粒组合物的特性可以取决于其组分的绝对或相对量。例如，包含较高摩尔分数的磷脂的纳米颗粒组合物具有与包含较低摩尔分数的磷脂的纳米颗粒组合物不同的特性。特性也可以根据纳米颗粒组合物的制备方法和条件而变化。

纳米颗粒组合物可以通过多种方法表征。例如，可以使用显微镜(如透射电子显微镜或扫描电子显微镜)来检查纳米颗粒组合物的形态和尺寸分布。动态光散射或电位测定法(如电位滴定法)可用于测量ζ电位。动态光散射也可以用于确定粒度。ZetasizerNano  ZS(Malvem Instruments Ltd,Malvem,Worcestershire,UK)也可以用于测量纳米颗粒组合物的多个特征，例如粒度、多分散指数和Zeta电位。

在各种实施方案中，纳米颗粒组合物的平均尺寸可以在10snm至100snm之间。例如，平均尺寸可以为约40nm至约150nm，例如约40nm，45nm，50nm，55nm，60nm，65nm，70nm，75nm，80nm，85nm，90nm，95nm，100nm，105nm，110nm，115nm，120nm，125nm，130nm，135nm，140nm，145nm或150nm。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的平均尺寸可以为约50nm至约100nm，约50nm至约90nm，约50nm至约80nm，约50nm至约70nm，约50nm至约60nm，约60nm至约100nm，约60nm至约90nm，约60nm至约80nm，约60nm至约70nm，约70nm至约70nm 100nm，约70nm至约90nm，约70nm至约80nm，约80nm至约100nm，约80nm至约90nm，或约90nm至约100nm。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物的平均尺寸可以为约70nm至约100nm。在一些实施方案中，平均尺寸可以为约80nm。在其他实施方式中，平均尺寸可以为约100nm。

纳米颗粒组合物可以是相对均匀的。可以使用多分散指数来指示纳米颗粒组合物的均匀性，例如，纳米颗粒组合物的粒度分布。小的(例如小于0.3)多分散指数通常表明窄的粒度分布。纳米颗粒组合物可以具有约0至约0.25的多分散指数，如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的多分散指数可以为约0.10至约0.20。

纳米颗粒组合物的ζ电势可用于指示该组合物的电动势。例如，ζ电位可以表征纳米颗粒组合物的表面电荷。通常期望具有相对较低的带正电荷或负电荷的纳米颗粒组合物，因为带更高电荷的物质会与人体的细胞，组织和其他元素发生不良相互作用。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的ζ电势可以为约-10mV至约+20mV，约-10mV至约+15mV，约-10mV至约+10mV，约-10。mV至约+5mV，约-10mV至约0mV，约-10mV至约-5mV，约-5mV至约+20mV，约-5mV至约+15mV，约-5mV至约+10mV，约-5mV至约+5mV，约-5mV至约0mV，约0mV至约+20mV，约0mV至约+15mV，约0mV至约+10mV，约0mV到约+5mV，约+5mV到约+20mV，约+5mV到约+15mV，或约+5mV至约+10mV。

治疗剂和/或预防剂的包封效率描述了相对于所提供的初始量，在制备后被囊封或与纳米颗粒组合物缔合的治疗剂和/或预防剂的量。期望包封效率高(例如接近100％)。包封效率可以例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或去污剂分解纳米颗粒组合物之前和在包含纳米颗粒组合物的溶液中处理之后的治疗剂和/或预防剂的量来测量。荧光可用于测量溶液中游离治疗剂和/或预防剂(例如，RNA)的量。对于本文所述的纳米颗粒组合物，治疗剂和/或预防剂的包封效率可以为至少50％，例如50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。在一些实施例中，封装效率可以是至少80％。在某些实施例中，封装效率可以是至少90％。

纳米颗粒组合物可以任选地包含一种或多种涂层。例如，可以将纳米颗粒组合物配制成具有涂层的胶囊、薄膜或片剂。本文所述的组合物的胶囊、薄膜或片剂可具有任何有用的尺寸、抗张强度、硬度或密度。

药物组合物

根据本公开，纳米颗粒组合物可以配制成药物组合物部分或全部。药物组合物可以包括一种或多种纳米颗粒组合物。例如，药物组合物可以包括一种或多种纳米颗粒组合物，和一种或多种不同的治疗剂和/或预防剂。药物组合物可进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或辅助成分，例如本文所述的那些。药物组合物和制剂的配制和生产的一般准则，在例如Remington’s The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,A.R.Gennaro；Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,Md.,2006等中即有相关描述。常规赋形剂和辅助成分可用于任何药物组合物中，除非其与纳米颗粒组合物的一种或多种组分不相容。如果赋形剂或辅助成分与纳米颗粒组合物的组分不相容，则其组合会导致不良的生物学作用或有害作用。

在一些实施方案中，一种或多种赋形剂或辅助成分可占包括纳米颗粒组合物的药物组合物的总质量或体积的大于50％。例如，通常一种或多种赋形剂或辅助成分可占药学的50％，60％，70％，80％，90％或更多。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂为至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％纯。在一些实施方案中，赋形剂是被批准用于人类和兽医用途的。在一些实施方案中，赋形剂是由美国食品和药物管理局批准的。在一些实施方案中，赋形剂是药物级的。在一些实施方案中，赋形剂符合美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准的。

根据本公开内容的药物组合物中的一种或多种纳米颗粒组合物，一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对量的变化调整，取决于其特征、大小等相关状况，并进一步取决于组合物的施用对象和施用途径。举例来说，药物组合物可包含0.1％至100％(wt/wt)的一种或多种纳米颗粒组合物。

在某些实施方案中，将本公开内容的纳米颗粒组合物和/或药物组合物冷藏或冷冻以用于存储和运输。例如，在4℃或更低的温度下，在约-150℃和0℃之间或在大约-80℃到大约-20℃的温度下存储，如大约-5℃，-10℃，-15℃，-20℃，-25℃，-30℃，-40℃，-50℃，-60℃，-70℃，-80℃，-90℃，-130℃或-150℃的温度下存储)。溶液形式的包含式(I)的化合物及其子式的药物组合物是在如约-20℃，-30℃，-40℃，-50℃，-60℃，-70℃或-80℃的条件下冷藏以进行存储或运输。在一些实施方案中，本公开还涉及提高包含式(I)(及其子式)的化合物的纳米颗粒组合物和/或药物组合物的稳定性的方法。通过将纳米颗粒组合物和/或药物组合物储存在4℃或更低的温度下，如在约-150℃与约0℃之间或约-80℃与约-20℃之间，如约-5℃，-10℃，-15℃，-20℃，-25℃，-30℃，-40℃，-50℃，-60℃，-70℃，-80℃，-90℃，-130℃或-150℃温度下。本文公开的纳米颗粒组合物和/或药物组合物在4℃或更低的温度下(如约4℃和-20℃之间)稳定约至少1周，至少2周，至少3周，至少4周，至少5周，至少6周，至少一个月，至少2个月，至少4个月，至少6个月，至少8个月，至少10个月，至少12个月，至少14个月，至少16个月，至少18个月，至少20一个月，至少22个月或至少24个月。在一个实施方案中，制剂在约4℃下稳定至少4周。在某些实施方案中，本公开的药物组合物包含本文公开的纳米颗粒组合物和选自Tris、乙酸盐(例如乙酸)、柠檬酸盐(如柠檬酸钠)、盐水、PBS和蔗糖中的一种或多种的药学上可接受的载体。在某些实施方案中，本公开的药物组合物的pH值在约7和8之间(如6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0，或在7.5和8或7和7.8之间)。本公开内容的药物组合物包 含本文公开的纳米颗粒组合物、Tris、盐水和蔗糖，并且具有约7.5-8的pH，其适于在约-20℃下储存或运输。例如，本公开的药物组合物包含本文公开的纳米颗粒组合物和PBS，并且具有约7-7.8的pH，适合于在如约4℃或更低的温度下存储或运输。在本公开的上下文中，“稳定的”和“稳定性”是指本文公开的纳米颗粒组合物或药物组合物，在给定的制造、制备、运输、存储和/或使用条件下(如施加应力(剪切力、冻结/融化应力等))，对化学或物理变化(如降解、粒度变化、聚集变化)的抵抗力。

可以将纳米颗粒组合物和/或包含一种或多种纳米颗粒组合物的药物组合物施用于任何患者或受试者，包括可以通过将治疗剂和/或预防剂递送至患者或受试者特定的细胞、组织、器官或其系统，例如肾脏系统而提供有益治疗效果。尽管本文对纳米颗粒组合物和包括纳米颗粒组合物的药物组合物的描述主要是针对适合于对人给药的组合物，但是本领域技术人员应理解，此类组合物通常适合于对任何其他哺乳动物给药。为了使该组合物适于对各种动物给药而对适于对人给药的组合物进行修饰是众所周知的，并且普通技术的兽医药理师可以仅通过普通的实验来设计和/或进行这种修饰。预期给予该组合物的受试者包括但不限于人、其他灵长类动物和其他哺乳动物，包括与商业相关的哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和大鼠。

包含一种或多种纳米颗粒组合物的药物组合物，可以通过药理学领域中已知或以后开发的任何方法来制备。通常情况下，这样的制备方法包括使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合，如果必要的话，也可以将产品分开成形和/或包装成所需的多剂量单位的单一或混合形式。

根据本公开的药物组合物可以作为单个单位剂量和/或作为多个单个单位剂量散装制备、包装和/或出售。“单位剂量”是包含预定量的活性成分(例如纳米颗粒组合物)的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将被施用于受试者的活性成分的剂量和/或该剂量的方便分数，例如该剂量的一半或三分之一。

药物组合物可以制备成适合各种途径和给药方法的各种形式。例如，药物组合物可以制备成液体剂型(如乳剂、微乳剂、纳米乳剂、溶液，混悬剂、糖浆和酏剂)，可注射剂型，固体剂型(例如胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂)，用于局部和/或经皮给药的剂型(例如软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂和贴剂)，混悬剂，粉剂和其他形式。

用于口服和肠胃外给药的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂，微乳剂，纳米乳剂，溶液剂，混悬剂，糖浆剂和/或酏剂。除活性成分外，液体剂型还可以包含本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺，油类(特别是棉籽、花生、玉米、胚芽、橄榄油，蓖麻和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物可包含其他治疗剂和/或预防剂，如湿润剂、乳化和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或加香剂等其他制剂。在用于肠胃外施用的某些实施方案中，将组合物与增溶剂例如CremophorTM、醇、油、改性油、二醇、聚山梨酯、环糊精聚合物和/或其组合混合。

可以根据已知技术使用合适的分散剂、湿润剂和/或悬浮剂来配制可注射制剂，例如可无菌注射的水性或油性悬浮液。无菌注射制剂可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌注射溶液，悬浮液和/或乳剂，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可使用 的可接受的媒介物和溶剂包括水，美国林格溶液和等渗氯化钠溶液。无菌的不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸可用于制备注射剂。

可注射制剂可通过细菌保留过滤器过滤和/或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂灭菌，在使用前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。

本发明公开了向哺乳动物细胞或器官递送治疗剂和/或预防剂，在哺乳动物细胞中产生目标多肽，以及包括对哺乳动物和/或给予使哺乳动物细胞与包含治疗剂和/或预防剂的纳米颗粒组合物接触在以哺乳动物中治疗疾病或病症的方法。

本发明化合物可提供所需的尺寸、多分散性、包封效率、表观pKa，以及相对MC3的表达。本发明化合物可提供在脾中的较高的表达。本发明化合物可提供在肝中的快速清除，避免在肝脏中累积造成肝毒。

实施例

在本节中的实施例仅作为示例提供而并非限定。

一般方法

常规制备型HPLC方法：HPLC纯化是在配备有Inertsil Pre-C8 OBD柱上的二极管阵列检测器(DAD)的Waters 2767上进行的，通常使用含有0.1％TFA的水作为溶剂A，使用乙腈作为溶剂B。

通用LCMS方法：在Shimadzu(LC-MS2020)系统上进行LCMS分析。色谱法是在SunFire C18上进行的，通常使用含有0.1％甲酸的水作为溶剂A和含有0.1％甲酸的乙腈作为溶剂B的乙腈。

实施例1：化合物1的制备

步骤1：化合物1-2的制备

向化合物1-1(10.06g,30.39mmol,1.0eq.)在DCM(150mL)中的溶液中，在0℃下加入化合物A(9.66g,182.34mmol,6.0eq.)、Triton B(2.53g,6.07mmol,0.2eq.)。将反应混合物在室温搅拌16小时。LCMS显示反应完成。将反应混合物倒入水中并用DCM萃取。有机层用盐水洗涤，经NaSO₄干燥并浓缩。残余物通过柱色谱纯化，得到标题化合物(10.08g，96.1％收率)，为无色油(MC22-161-015)。

步骤2：化合物1-3的制备

向化合物1-2(10.06g,29.16mmol,1.0eq.)在EtOH(120mL)中的搅拌的溶液中在0℃下滴加浓H₂SO₄(20mL)。将反应混合物在90℃搅拌16小时。LCMS显示反应完成。将反应混合物倒入冰水中并用DCM萃取。有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并浓缩。残余物通过柱色谱纯化，得到标题化合物(7.91g，58.9％收率)，为无色油(MC22-161-022)。

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ：1.27-1.28(m,6H),2.50(t,J＝6.4Hz,2H),2.57(t,J＝6.0Hz,2H),2.94(s,3H),3.19-3.25(m,1H),3.37-3.44(m,3H),3.54(d,J＝4.0Hz,2H),3.67-3.73(m,2H),3.80-3.95(m,4H),4.00-4.18(m,5H),4.54(s,2H),7.27-7.36(m,5H)。

步骤3：化合物1-4的制备

将化合物1-3(7.91g,18.01mmol,1.0eq.)、LiOH-H₂O(6.05g,144.08mmol,8.0eq.)和H₂O(30mL)在THF(60mL)中的溶液在60℃搅拌16小时。LCMS显示反应完成。反应混合物浓缩以除去THF。残余物用2N的HCl调节pH至5～6，然后通过反相制备型HPLC纯化，得到标题化合物(5.15g，74.7％收率)，为无色油(MC22-161-028)。

步骤4：化合物1-5的制备

向化合物1-4(1.52g,3.96mmol,1.0eq.)和化合物B(3.11g,8.71mmol,2.2eq.)在DCM(30mL)中的溶液中加入EDCI(1.89g,9.90mmol,2.5eq.)、DIEA(2.04g,15.84mmol,4.0eq.)和DMAP(96mg,0.79mmol,0.2eq.)。混合物在40℃搅拌16小时。将反应混合物倒入水中并用DCM萃取。有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并浓缩。残余物通过柱色谱纯化，得到标题化合物(1.73g,41.0％产率)，为无色油(MC22-161-039)。

¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ：0.86(t,J＝6.8Hz,12H),1.27-1.29(m,32H),1.57-1.62(m,8H),2.28-2.31(m,11H),2.35-2.41(m,2H),2.44-2.50(m,2H),2.54(q,J＝6.0Hz,4H),2.63(t,J＝6.0Hz,2H),3.42-3.47(m,1H),3.53-3.56(m,4H),3.68(t,J＝6.4Hz,2H),3.76-3.87(m,2H),4.11-4.15(m,12H),4.51(s,2H),7.24-7.28(m,1H),7.29-7.33(m,4H)。

步骤5：化合物1的制备

在H₂气氛下向化合物1-5(1.70g,1.60mmol,1.0eq.)和化合物C(234mg,1.76mmol,1.1eq.)在MeOH(30mL)中的溶液中加入Pd/C(300mg)。混合物在40℃搅拌3小时。将反应混合物过滤并浓缩。残余物通过柱色谱纯化，得到标题化合物(768mg,45.9％产率)，为无色油。100mg产物通过制备型HPLC进一步纯化，得到标题化合物(53mg)，为无色油(MC22-161-042)。

¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ：0.86(t,J＝6.4Hz,12H),1.28-1.31(m,32H),1.57-1.62(m,8H),2.28-2.32(m,8H),2.35-2.42(m,5H),2.57-2.60(m,8H),3.51-3.52(m,2H),3.62-3.74(m,5H),3.77-3.88(m,2H),4.11-4.16(m,12H)。

LCMS：Rt:1.050min；MS m/z(ESI):974.7[M+H]⁺。

实施例2：化合物2的制备

步骤1：化合物2-1的制备

向化合物1(327mg,0.336mmol,1.0eq.)在DCM(80mL)中的溶液中加入SOCl₂(120mg,1.008mmol,3.0eq.)。混合物在30℃搅拌2小时。TLC显示反应完成。混合物浓缩以得到标题化合物(330mg，99.3％收率)，为黄色油(MC22-161-045)。

步骤2：化合物2的制备

向化合物2-1(330mg,0.333mmol,1.0eq.)和化合物D(143mg,0.999mmol,3.0eq.)在THF(10mL)中的溶液中加入DIEA(86mg,0.666mmol,2.0eq.)、NaI(10mg,0.067mmol,0.2eq.)。LCMS显示反应完成。混合物倒入水中并用EA萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并浓缩。残余物通过制备型HPLC纯化，得到标题化合物(48mg，13.1％产率)，为无色油(MC22-161-046)。

¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ：0.79(t,J＝6.4Hz,12H),1.10-1.24(m,39H),1.50-1.55(m,9H),1.70-1.72(m,3H),2.21(t,J＝7.2Hz,10H),2.28-2.53(m,15H),3.42-3.48(m,4H),3.63-3.81(m,5H),4.01-4.09(m,12H),7.99-8.03(m,1H)。

LCMS：Rt:1.180min；MS m/z(ESI):1099.9[M+H]⁺。

使用相应的原料与化合物2类似的方式制备以下化合物。

实施例3：化合物5的制备

步骤1：化合物5-1的制备

向化合物1-1(239mg,1.0mmol,1.0eq.)和化合物E(912mg,2.2mmol,2.2eq.)在DCM(20mL)中的溶液中加入EDCI(575mg,3.0mmol,3.0eq.)、DIPEA(388mg,3.0mmol,3.0eq.)和DMAP(24mg,0.2mmol,0.2eq.)。将混合物回流搅拌24小时。将混合物倒入水中并用DCM萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(PE/EA＝3/1)，得到标题化合物(640mg，62％产率)，为无色油 (MC21-1113-071)。

步骤2：化合物5的制备

向化合物5-1(550mg,0.53mmol,1.0eq.)在EA(10mL)中的溶液中加入Pd/C(55mg)。混合物在50℃下在H₂下搅拌48小时。LCMS显示反应完成。通过硅藻土垫过滤并用EA洗涤。滤液浓缩得到标题化合物(445mg，89％产率)，为黄色油。将110mg产物通过制备型HPLC进一步纯化得到标题化合物(36mg，33％产率)，为黄色油(MC21-1113-077)。

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.86-0.90(m,12H),1.28-1.40(m,37H),1.44-1.74(m,14H),1.95-2.03(m,2H),2.28-2.50(m,14H),2.62-2.90(m,3H),3.60-3.73(m,2H),4.04-4.11(m,9H),4.34-4.37(m,1H),5.22-5.34(m,1H)。

LCMS：Rt:0.560min；MS m/z(ESI):942.5[M+H]⁺。

实施例4：化合物12的制备

步骤1:H-2的制备

向1-2(4克，12.26毫摩尔，1.0当量)的DCM(50毫升)溶液中加入a(9.62克，26.98毫摩尔，2.2当量)、EDCI(5.87克，30.66毫摩尔，2.5当量)、DMAP(0.79克，6.13毫摩尔，0.5当量)和DIEA(7.5克，36.79毫摩尔，3.0当量)。将混合物在55℃下搅拌16小时。之后，TLC显示起始H-2完全消失，将反应混合物倒入水中并用DCM萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。粗产物通过柱色谱-硅胶(PE/EA＝20/1)纯化，得到黄色油状的标题化合物H-2(6.5g，产率52.8％)。

步骤2:H-3的制备

向搅拌的H-2(6.5克，6.45毫摩尔，1.0当量)在MeOH(50毫升)中的溶液中加入Pd/C(0.15克，15％)。将该混合物在室温下在H2中搅拌2小时。之后，TLC显示起始H-3完全消失。粗产物通过柱色谱-硅胶(PE/EA＝3/1)纯化，得到黄色油状的标题化合物H-3(5.3g，89.8％产率)

步骤3:H的制备

向搅拌的H-3(800mg，0.872mmol，1.0eq)在DCM(10mL)中的溶液中加入 MsCl(119.8mg，1.046mmol，1.2eq)和TEA(176.5mg，1.74mmol，2.0eq)。将该混合物在室温下搅拌2小时。之后，TLC显示起始H-3完全消失，将反应混合物倒入水中并用DCM萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩，得到黄色油状的标题化合物H(821mg，93.8％产率)。

步骤:

向化合物H(1.08克，1.08毫摩尔，1.0当量)的ACN(20毫升)的溶液中加入化合物B(134.3毫克，1.3毫摩尔，1.2当量)、K2CO3(449.8毫克，3.25毫摩尔，3.0当量)、Cs2CO3(106.05毫克，0.325毫摩尔、0.3当量)和NaI(48.7毫克，0.32毫摩尔，0.3当量)。将混合物在80℃下搅拌16小时。之后，LCMS显示起始12完全消失。将反应混合物倒入水中并用EA萃取。有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。残留物通过制备HPLC纯化，得到无色油状的标题化合物(33mg，16.2％产率)

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ：4.16-4.11(m,12H),3.96-3.84(m,1H),3.78-3.68(m,3H),3.56-3.44(m,4H),2.60-2.57(m,7H),2.46-2.28(m,12H),1.62-1.56(m,13H),1.49-1.28(m,32H),0.89-0.86(m,15H).

LCMS：Rt:0.437min；MS m/z(ESI):1002.8[M+H]⁺.

使用相应的原料与化合物12类似的方式制备以下化合物。

实施例5：化合物13的制备

步骤1：化合物13-3的制备

向化合物12(440mg，0.438mmol，1.0当量)的DCM(15mL)溶液中加入SOCl2(156mg，1.32mmol，3.0当量)。将该混合物在室温下搅拌2小时。此后，LCMS显示起始化合物12完全消失，浓缩反应混合物，得到黄色油状的标题化合物13-3(441mg，99.7％产率)

LCMS：MS m/z(ESI):1020.8[M+H]⁺.

步骤2：化合物13的制备

向化合物13-3(441mg，0.432mmol，1.0eq)的THF(10mL)溶液中加入化合物C(160mg，1.296mmol，3.0eq)、DIEA(167mg，1.296mmol，3.0eq)和NaI(23.2mg，0.13mmol，0.3eq)。将该混合物在70℃下搅拌16小时。之后LCMS显示起始13-3完全消失，将反应混合物倒入水中并用EA萃取。有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。残留物通过制备HPLC纯化，得到无色油状的标题化合物(80mg，产率21.2％)

H NMR(400MHz,CDCl3)δ：4.15-4.11(m,12H),3.88-3.67(m,4H),3.55-3.42(m,4H),2.76-2.66(m,1H),2.59-2.57(m,11H),2.37-2.28(m,12H)1.91-1.73(m,7H),1.68-1.60(m,12H),1.49-1.46(m,8H),1.38-1.28(m,32H),0.89-0.86(m,15H).

LCMS：Rt:0.487min；MS m/z(ESI):1156.0[M+H]⁺.

使用相应的原料与化合物13类似的方式制备以下化合物。

实施例6：脂质纳米颗粒的制备和表征

简而言之，将本发明提供的阳离子脂质，DSPC，胆固醇和PEG-脂质以50：10：38.5：1.5的摩尔比溶于乙醇，并将mRNA在10至50mM柠檬酸盐缓冲液中稀释，pH＝4。使用微流控装置通过9-30mL/min流速将乙醇脂质溶液与mRNA水溶液以1：3的 体积比混合，以总脂质与mRNA的重量比约为10：1至30：1制备LNP。并使用透析用PBS代替乙醇，由此除去乙醇。最后，脂质纳米颗粒通过0.2μm无菌过滤器过滤。

脂质体纳米颗粒的尺寸使用173°反向散射检测模式的Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern UK)通过动态光散射来确定。根据制造商的说明，使用Quant-it Ribogreen RNA定量测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific，UK)确定脂质纳米颗粒的包封效率。

如文献报道，LNP制剂的表观pKa与LNP与体内核酸的递送效率相关。使用基于2-(对甲苯基)-6-萘磺酸(TNS)的荧光测定法确定每种制剂的表观pKa。如上所述制备包含阳离子脂质/DSPC/胆固醇/DMG-PEG(50/10/38.5/1.5mol％)的LNP制剂。将TNS制成300uM蒸馏水储备液。将LNP制剂在3mL缓冲溶液中稀释至总脂质0.1mg/ml，该缓冲溶液包含50mM柠檬酸钠，50mM磷酸钠，50mM硼酸钠和30mM氯化钠，其中pH值为3至9。加入TNS溶液至终浓度为0.1mg/ml，并且在涡旋混合之后，在室温下在Molecular Devices Spectramax iD3光谱仪中使用325nm和435nm的激发波长测量荧光强度。对荧光数据进行S形最佳拟合分析，并在pH值达到最大荧光强度的一半时测量pKa值。

实施例7：动物研究

将包含下表中的化合物封装的人促红细胞生成素(hEPO)mRNA的脂质纳米颗粒以0.5mg/kg的剂量向包含6-8周龄雌性ICR小鼠(Xipuer-Bikai，上海)通过尾静脉注射施用。在给药后的特定时间点(例如6小时)取小鼠血样。除上述测试组外，将包含包裹hEPO mRNA的二亚油酰基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA，通常缩写为MC3)的脂质纳米颗粒以相同剂量给药于类似年龄和性别的小鼠，作为阳性对照。

在最后的采样时间点之后，通过过量的CO₂安乐死小鼠。4℃下以5000g离心10分钟将血清与全血分离，速冻并保存在-80℃以备分析。根据制造商的说明，使用市售试剂盒(DEP00，R&D系统)进行ELSA分析。

下表中列出了测试脂质纳米颗粒的特征，包括从测试组测得的超过MC3的表达水平。

荧光素酶表达数据

实施例8：脂质纳米颗粒的制备与表征

简而言之，将本文提供的阳离子脂质、DSPC、胆固醇和PEG-脂质以50:10:38.5:1.5的摩尔比溶解在乙醇中，并将mRNA在10至50mM柠檬酸盐缓冲液(pH＝4)中稀释。LNP通过使用微流体装置，总流速范围为9-30毫升/分钟，将乙醇脂质溶液与mRNA水溶液以1:3的体积比混合制备，总脂质与mRNA的重量比约为10:1至30:1。由此使用透析去除乙醇并用DPBS代替。最后，脂质纳米颗粒通过0.2μm无菌过滤器过滤。

使用Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern UK)，使用173°反向散射检测模式，通过动态光散射测定脂质纳米颗粒尺寸。根据制造商的说明，使用Quant-it Ribogreen RNA定量测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific,UK)测定脂质纳米颗粒的包封效率。

正如文献中所报道的，LNP制剂的表观pKa与LNP对核酸的体内递送效率相关。使用基于2-(对甲苯胺基)-6-萘磺酸(TNS)荧光的测定法确定每种制剂的表观pKa。如上所述制备在PBS中包含阳离子脂质/DSPC/胆固醇/DMG-PEG(50/10/38.5/1.5mol％)的LNP制剂。TNS在蒸馏水中制备为300uM储备溶液。在3mL缓冲溶液中将LNP制剂稀释至0.1mg/ml总脂质，该缓冲溶液含有50mM柠檬酸钠、50mM磷酸钠、50mM硼酸钠和30mM氯化钠，其中pH范围为3至9。添加一定量TNS溶液以提供0.1mg/ml的最终浓度，并在涡旋混合后在室温下在Molecular Devices Spectramax iD3光谱仪中使用325nm和435nm的激发和发射波长测量荧光强度。对荧光数据应用sigmoidal最佳拟合分析，并将pKa值测量为产生一半最大荧光强度的pH。

测试的脂质纳米颗粒的特征列于下表。

实施例9.动物研究

将包含包封荧光素酶编码(荧光素酶)mRNA的上表中化合物的脂质纳米颗粒以0.25mg/kg的剂量通过尾静脉注射全身给予6-8周龄雌性Balb/c小鼠(Charles River Lab,ZheJiang)，并在给药后特定时间点(例如，6小时)取小鼠血样。使用IVIS Spectrum CT设备(PerkinElmer Inc.,Paris,France)进行光学成像。通过应用于注射部位区域的ROI评估发光水平(Living Image软件,PerkinElmer Inc.,Paris,France)。

在6小时采集化合物的脾辐射，将解剖的器官放置在黑色薄片上并使用IVIS Spectrum CT(PerkinElmer,Hopkinton,MA)成像。为了量化生物发光发射信号，相同的感兴趣区域(ROI)被定位以包围每个器官区域，成像信号被量化为总通量(p/s)。这些化合物提供了在脾中的较高的表达(参见图1)。

实施例10：脂质清除研究

将LNP通过尾静脉注射到小鼠体内(ICR雌性，IV，0.5mg mRNA/kg)，然后在施用后不同时间(包括6h、24h和48h)将小鼠在二氧化碳下麻醉，并通过心脏穿刺处死。立即收集肝脏组织，然后用冰冷的盐水洗涤。称重肝脏样品，并在冰水浴中通过加入预冷的20％甲醇-水(v/v)在2-8℃下以1:5(w/v)的比率均质化。在分析前，将均质化的组织样品储存在-90℃至-60℃的冷冻箱中。

样品处理。允许所有肝脏组织匀浆样品在室温下解冻。向50μL样品的等分试样中加入50μL MgCl2(2M)，然后加入ACN，其中含有5ng·mL-1维拉帕米(Verapamil)和50ng·mL-1格列本脲(Glibenclamide)和200ng·mL-1双氯芬酸(Diclofenac)和200ng·mL-1甲苯磺丁脲(Tolbutamide)用于蛋白质沉淀，然后以13000rpm离心8分钟。然后向100μL上清液中加入100μL水，然后充分涡旋。将5μL混合物的等分试样注入LC-MS/MS系统中。

MC3和本文提供的选定脂质化合物的结果列于下表中。从表格可以看出，化合物3提供了在肝中的快速清除，避免在肝脏中累积造成肝毒。

^a0.5mg/kg静脉内单次推注剂量(bolus dose)mRNA后不同时间小鼠肝脏中原始脂 质剂量的百分比。

Claims (26)

1. 式(I)所表示的化合物：
   

   或其药物可用的盐或立体异构体，其中：

   L₁为C₅-C₁₀亚烷基，其中至少一个亚甲基被氧原子或-NH-代替，且至少一个亚甲基被羰基代替；

   L₂为C₅-C₁₀亚烷基，其中至少一个亚甲基被氧原子或-NH-代替，且至少一个亚甲基被羰基代替；

   L₃为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆亚烷基；

   R₁为C₅-C₃₀烷基，其中至少一个亚甲基被氧原子代替，且至少一个亚甲基被羰基代替；

   R₂为C₅-C₃₀烷基，其中至少一个亚甲基被氧原子代替，且至少一个亚甲基被羰基代替；

   R₃为C₅-C₃₀烷基，其中至少一个亚甲基被氧原子代替，且至少一个亚甲基被羰基代替；

   R₄为C₅-C₃₀烷基，其中至少一个亚甲基被氧原子代替，且至少一个亚甲基被羰基代替；

   任选地，R₁-R₄中的一个或多个，其末端的甲基被C₂烯基或C₂炔基取代；

   R₅为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基，任选地，其中一个亚甲基被羰基代替；

   R₆为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基，且其被羟基或-NR₇R₈取代；

   R₇为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基，且其被羟基取代；且

   R₈为C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀环烷基或C₆-C₁₀芳基或C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基或C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烯基，任选地，其被选自甲基、氟、羟基、硝基、苯基、甲基苯基、硝基苯基、C₃-C₁₀环烷基的基团取代。
2. 根据权利要求1所述的化合物或其药物可用的盐或立体异构体，其中

   L₁为C₅-C₆亚烷基，其中一个或两个亚甲基被氧原子代替，且一个亚甲基被羰基代替；

   L₂为C₆-C₇亚烷基，其中一个或两个亚甲基被氧原子代替，且一个亚甲基被羰基代替；

   R₁为C₆-C₁₂烷基，其中一个亚甲基被氧原子代替，且一个亚甲基被羰基代替；

   R₂为C₆-C₁₂烷基，其中一个亚甲基被氧原子代替，且一个亚甲基被羰基代替；

   R₃为C₆-C₁₂烷基，其中一个亚甲基被氧原子代替，且一个亚甲基被羰基代替；且

   R₄为C₆-C₁₂烷基，其中一个亚甲基被氧原子代替，且一个亚甲基被羰基代替。
3. 根据权利要求1所述的化合物或其药物可用的盐或立体异构体，其中

   R₆为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基，且其末端的甲基被羟基或-NR₇R₈取代；且

   R₇为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基，且其末端的甲基被羟基取代。
4. 根据权利要求1所述的化合物或其药物可用的盐或立体异构体，其中L₁为*-O-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_m-、*-O-CO-(CH₂)_m-或*-O-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_m-；

   L₂为*-(CH₂)_m-O-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_m-、*-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_m-、*-(CH₂)_m-O-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_m-或*-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_m-；

   L₃为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆亚烷基；

   R₁为-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_n-CH₃或-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_n-CH₃；

   R₂为-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_n-CH₃或-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_n-CH₃；

   R₃为-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_n-CH₃或-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_n-CH₃；

   R₄为-(CH₂)_m-O-CO-(CH₂)_n-CH₃或-(CH₂)_m-CO-O-(CH₂)_n-CH₃；

   R₅为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基；

   R₆为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基，且其末端的甲基被羟基或-NR₇R₈取代；

   R₇为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基，且其末端的甲基被羟基取代；且

   R₈为C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀单环烷基或C₆-C₁₀芳基或C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基或C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烯基，任选地，其被选自甲基、氟、羟基、硝基、苯基、甲基苯基、硝基苯基、C₃-C₁₀环烷基的基团取代；

   其中的-(CH₂)_m-和-(CH₂)_n-任选地被C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基取代；

   m在每次出现时分别独立地选自1、2、3、4、5或6；

   n在每次出现时分别独立地选自3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；且

   *表示与式(I)中同时连接L₁、L₂和L₃的C的连接位点。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的化合物或其药物可用的盐或立体异构体，其中所述亚烷基或烷基为直链的。
6. 根据权利要求1-4中任一项所述的化合物或其药物可用的盐或立体异构体，其中所述R₁、R₂、R₃和R₄是相同的。
7. 根据权利要求1-4中任一项所述的化合物或其药物可用的盐或立体异构体，其中R₅为C₁、C₂、C₃或C₄烷基；R₆为C₁、C₂、C₃或C₄烷基，且其被-NR₇R₈取代；R₇为C₂、C₃、C₄或C₅烷基，且其被羟基取代；R₈为C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀环烷基，或被苯基或C₃-C₁₀环烷基取代的C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基。
8. 根据权利要求1所述的化合物或其药物可用的盐或立体异构体，其中所述化合物选自：
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
9. 组合物，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的化合物和治疗或预防剂。
10. 根据权利要求9所述的组合物，还包含一种或多种结构脂质。
11. 根据权利要求10所述的组合物，其中所述一种或多种结构脂质是DSPC。
12. 根据权利要求10或11所述的组合物，其中所述化合物与所述结构脂质的摩尔比在约2:1至约8:1的范围内。
13. 根据权利要求9至12中任一项所述的组合物，还包含类固醇。
14. 根据权利要求13所述的组合物，其中所述类固醇是胆固醇。
15. 根据权利要求13或14所述的组合物，其中所述化合物与所述类固醇的摩尔比在约5:1至约1:1的范围内。
16. 根据权利要求9至15中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含一种或多种聚合物缀合的脂质。
17. 根据权利要求16所述的组合物，其中所述聚合物缀合的脂质为DMG-PEG2000或者DMPE-PEG2000。
18. 根据权利要求16或17所述的组合物，其中所述化合物与所述聚合物缀合的脂质的摩尔比在约100:1至约20:1的范围内。
19. 根据权利要求9至18中任一项所述的组合物，其中所述治疗或预防剂包含至少一种编码抗原的mRNA或其片段或表位。
20. 根据权利要求19所述的组合物，其中所述mRNA是单顺反子mRNA或多顺反子mRNA。
21. 根据权利要求19至20中任一项所述的组合物，其中所述抗原是病原性抗原。
22. 根据权利要求19至20中任一项所述的组合物，其中所述抗原是肿瘤相关抗原。
23. 根据权利要求19至22中任一项所述的组合物，其中所述mRNA包含一种或多种功能性核苷酸类似物。
24. 根据权利要求23所述的组合物，其中所述功能性核苷酸类似物是选自假尿嘧啶核苷、1-甲基-假尿嘧啶核苷和5-甲基胞嘧啶中的一种或多种。
25. 包含根据权利要求1至8中任一项所述的化合物或者根据权利要求9至24中任一项所述的组合物的脂质纳米颗粒。
26. 药物组合物，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，根据权利要求9至24中任一项所述的组合物或者根据权利要求25所述的脂质纳米颗粒和药物可用的赋形剂或稀释剂。