KR101979497B1 - 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체, 이의 용도 및 이의 제조방법 - Google Patents

양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체, 이의 용도 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체, 이의 용도 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입되어 있고, 핵산으로 siRNA가 리포좀과 복합체를 형성하며, 종양 표적 앱타머가 리포좀 외부 표면에 부착된 구조의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체를 제조하고, 상기 복합체를 이용하여 암세포 특이적으로 양자점 및 siRNA를 전달할 수 있고, 형광 발현을 통해 이미지화할 수 있음을 확인하였으므로, 본 발명의 복합체를 암 진단 및 치료에 이용할 수 있다.

Description

양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체, 이의 용도 및 이의 제조방법{Quantum dot-nucleic acid-aptamer-liposome complex, uses thereof and method thereof}
본 발명은 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체, 이의 용도 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입되어 있고, 핵산이 리포좀과 복합체를 형성하며, 종양 표적 앱타머가 리포좀 외부 표면에 부착된 구조의 양자점-핵산-앱타머 리포좀 복합체, 이의 용도 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근 연구 분야 및 임상 분야에서 살아있는 세포의 실시간 이미지화에 대한 관심이 증가하면서, 크게 형광 이미징(fluorescence imaging, FI)과 생물발광 이미징(bioluminescence imaging, BLI)로 분류되는 광학 이미징이 분자 이미징 기술로서 급속도로 떠오르고 있다.
FI는 단파장 또는 고에너지 광선에 의해 여기되면 가시광선으로 방출하는 형광물질을 이용하는 기술이다. 그러나, FI는 관심 있는 물질의 형광 신호 이외에 다른 신호를 감지하는 문제점이 있다. 뿐만 아니라, 상대적으로 단파장의 광선이 조직 깊숙한 곳까지 침투하는 것이 쉽지 않다. 그럼에도 불구하고, FI는 핵 이미징에 비해 생체 내 이미징을 위해 보다 안전하고, 다양한 표지 및 다채널 형광 이미징이 가능하며, 표적 질환을 반복적으로 추적함으로써 진단 분석에 이용할 수 있다는 장점이 있다. 이러한 장점으로 인해 FI는 빠르고, 재현이 가능하며 정량적인 진단을 가능하게 하기 위해 개발되고 있다.
지난 몇 년 동안, 생물학적 이미징에서 형광 반도체 나노결정인 양자점(quantum dots, Q-dots)을 이용하기 위한 많은 노력이 있었다. 생체적합성 형광단(biocompatible fluorophore)으로서 양자점을 임상에 적용하는 것이 널리 시도되어 왔다. 양자점은 일반적으로 사용되는 유기 염료에 비해 장기간 안정성, 넓은 여기 스펙트럼과 좁은 방출 스펙트럼, 및 형광의 높은 양자 수율과 같은 독특한 광학 특성을 가지고 있다. 그러나 혈액 순환을 통해 양자점을 전달하는 경우 전달효율이 낮아 체내 깊숙한 위치의 조직에서 방출되는 형광은 거의 검출되지 않는다는 문제점이 있다. 그러므로, 형광 양자점은 전달체(delivery system)를 통해 표적 조직으로 전달되어야 한다. 리포좀 전달체(Liposomal delivery system)은 물리적, 화학적 생물학적 특성의 변형에 있어서 큰 적재용량(loading capacity) 및 유연성이 있기 때문에 다양한 치료제의 전달체로서 광범위하게 시도되고 있다. 다른 전달체와 비교하여 리포좀은 많은 양의 양자점을 전달할 수 있기 때문에, 리포좀의 지질 구성, 표면전하, 크기, 표적 리간드 및 기타 요인을 최적화하여 양자점을 전달하면 표적 부위에서 형광 광자를 검출할 수 있다.
한편 테라노스틱스(Theranostics)는 특정 부위에 치료제를 전달하고, 질환을 진단하며 질환의 경과를 추적할 수 있는 나노의약(nanomedicine)으로 정의된다. 최근, 테라노스틱스를 암 진단 및 치료에 적용하는 분야에서 학제간 연구가 폭발적으로 진행되고 있다. 더욱이, 많은 종류의 테라노스틱스 물질들이 나노의약에 이미 적용되고 있으며 임상 및 실험적 사용이 승인되고 있다. 일 예로 높은 친화력 및 특이성으로 표적 단백에 결합할 수 있는 핵산분자인 앱타머(aptamer)는 항체와 유사한 특징을 나타내면서 항체보다는 상대적으로 크기가 작고, 면역원성이 적다는 특징으로 인해 치료 및 진단 분야에 적용하려는 시도가 이루어지고 있다. 그러나 다양한 후보물질이 나노의약에 있어서 다목적 플랫폼으로 조립되는 것이 여전히 중요하다.
이에, 본 발명자들은 테라노스틱스에 적용하기 위한 물질을 개발하기 위해 노력한 결과, 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입되어 있고, 핵산으로 siRNA가 리포좀과 복합체를 형성하며, 종양 표적 앱타머가 리포좀 외부 표면에 부착된 구조의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체를 제조하고, 상기 복합체를 이용하여 암세포 및 마우스 종양모델에서 암 특이적으로 양자점 및 siRNA를 전달하고, 이미지화할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
Kim H.S. et al. In vitro and in vivo gene-transferring characteristics of novel cationic lipids, DMKD (O,O'-dimyristyl-N-lysyl aspartate) and DMKE (O,O'-dimyristyl-N-lysyl glutamate).J Control Release 115, 234-41 (2006) Alivisatos A.P., Gu W., Larabell C. Quantum dots as cellular probes. Annu Rev Biomed Eng 7, 55-76 (2005) Sumer B., Gao J. Theranostic nanomedicine for cancer. Nanomedicine (Lond) 3, 137-40, doi: 10.2217/17435889.3.2.137 (2008)
본 발명의 목적은 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입되어 있고, 핵산이 리포좀과 복합체를 형성하고, 종양 표적 앱타머가 리포좀 외부 표면에 부착된 구조의 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 본 발명의 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체를 포함하는 핵산 전달체(nucleic acid delivery system)를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 본 발명의 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체를 포함하는 생체 진단 이미징 시스템을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 핵산을 세포 내로 전달하여 암 또는 유전자 질환을 치료하기 위한, 본 발명의 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체 및 약제학적으로 이용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 지질이중층(lipid bilayer)으로 이루어진 리포좀;
(b) 상기 리포좀의 지질이중층에 삽입된 양자점;
(c) 상기 리포좀과 복합체가 된 핵산; 및
(d) 상기 리포좀의 외부 표면에 부착된 앱타머(aptamer)를 포함하는 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체를 포함하는 핵산 전달체(nucleic acid delivery system)를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체를 포함하는 생체 진단 이미징 시스템을 제공한다.
또한, 본 발명은 핵산을 세포 내로 전달하여 암 또는 유전자 질환을 치료하기 위한, 본 발명의 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체 및 약제학적으로 이용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 지질 및 양자점을 유기용매에 용해하여 양자점이 지질이중층에 삽입된 리포좀을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 양자점이 지질이중층에 삽입된 리포좀에 핵산을 첨가하여 리포좀과 핵산이 복합체를 형성하는 양자점-핵산-리포좀 복합체를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 양자점-핵산 리포좀 복합체에 앱타머 접합체를 첨가하여 앱타머를 리포좀의 외부 표면에 부착하는 단계를 포함하는, 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입되어 있고, 핵산으로 siRNA가 리포좀과 복합체를 형성하며, 종양 표적 앱타머가 리포좀 외부 표면에 부착된 구조의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체를 제조하고, 상기 복합체를 이용하여 암세포 및 마우스 종양모델에서 암 특이적으로 양자점 및 siRNA를 전달하고, 이미지화할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 복합체를 암 진단 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)의 제조 과정 및 구조를 모식화한 도이다.
도 2a 및 도 2b는 siRNA를 N/P 비율 1:1 내지 10:1로 첨가하여 제조한 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 이용하여 겔 지연 분석법(gel retardation assay)을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 3a는 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 TEM으로 시각화한 도이다.
도 3b는 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)의 형광 방출을 확인한 도이다.
도 3c는 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 제조하는 과정에서 리포좀의 입자 크기 및 표면 전하를 확인한 도이다.
도 3d는 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 이용하여 RNase 보호 분석법(RNase protection assay)을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
1: siRNA;
2: RNase 처리한 siRNA;
3: 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA);
4: RNase 처리한 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA); 및
5: RNase 및 TritonX-100 처리한 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA).
도 3e는 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 전기영동하여 복합체 형성 여부를 확인한 도이다.
도 4a는 EGF 발현 유방암세포인 MDA-MB-231 세포 및 EGF 미발현 유방암세포인 MDA-MB-453 세포에 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 처리하고 유세포 분석을 수행하여 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)와 EGFR 발현 표적 종양 세포의 결합을 확인한 도이다.
도 4b는 혈청이 없는 배지 또는 50% 혈청이 포함된 배지로 배양한 MDA-MB-231 세포에 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 또는 FITC-siRNA 포함 리포펙타민(lipofectamine)을 형질감염한 후 유세포 분석을 수행하여 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)의 siRNA 전달 효율을 확인한 도이다.
도 5a는 MDA-MB-231 세포 및 MDA-MB-453 세포 각각에 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 또는 상기 복합체 제조과정에서 획득한 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA)를 처리하고 시간별로 공초점 현미경을 통해 형광 이미지를 확인한 도이다.
도 5b는 MDA-MB-231 세포 및 MDA-MB-453 세포 각각에 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 또는 상기 복합체 제조과정에서 획득한 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA)를 처리하고 8시간 째에 공초점 현미경을 통해 형광 이미지를 확인한 도이다.
도 6a는 MDA-MB-231 세포를 이용하여 종양을 유도한 마우스 종양모델에 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 정맥 투여하고 시간 경과에 따른 형광 이미지를 확인한 도이다.
도 6b는 MDA-MB-231 세포를 이용하여 종양을 유도한 마우스 종양모델에 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 제조과정에서 획득한 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA)를 정맥 투여하고 시간 경과에 따른 형광 이미지를 확인한 도이다.
도 7a는 MDA-MB-231 세포를 이용하여 종양을 유도한 마우스 종양모델에 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 또는 상기 복합체 제조과정에서 획득한 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA)를 정맥 투여하고 1, 4, 8 및 24시간에 장기를 적출하여 장기의 형광광도를 확인한 도이다.
도 7b는 MDA-MB-231 세포를 이용하여 종양을 유도한 마우스 종양모델에 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 또는 상기 복합체 제조과정에서 획득한 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA)를 정맥 투여하고 4시간에 장기를 적출하여 장기의 형광 이미지를 확인한 도이다.
도 7c는 MDA-MB-231 세포를 이용하여 종양을 유도한 마우스 종양모델에 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 또는 상기 복합체 제조과정에서 획득한 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA)를 정맥 투여하고 1, 4, 8 및 24시간에 종양에서 평균 형광강도를 확인한 도이다.
도 7d는 MDA-MB-231 세포를 이용하여 종양을 유도한 마우스 종양모델에 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 또는 상기 복합체 제조과정에서 획득한 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA)를 정맥 투여하고 1, 4, 8 및 24시간에 종양 및 간에서 형광강도 비율을 확인한 도이다.
도 8a 및 도 8b는 MDA-MB-231 세포를 이용하여 종양을 유도한 마우스 종양모델에 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 또는 상기 복합체 제조과정에서 획득한 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA)를 정맥 투여하고 4시간에 장기를 적출하여 동결 절편화한 후 공초점 현미경을 통해 형광 이미지를 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은
(a) 지질이중층(lipid bilayer)으로 이루어진 리포좀;
(b) 상기 리포좀의 지질이중층에 삽입된 양자점;
(c) 상기 리포좀과 복합체가 된 핵산; 및
(d) 상기 리포좀의 외부 표면에 부착된 앱타머(aptamer)를 포함하는 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체를 포함하는 핵산 전달체(nucleic acid delivery system)를 제공한다.
본 발명에서 상기 "리포좀(liposome)"은 폐쇄된 지질이중층(lipid bilayer)을 형성함으로써 만들어지는 지질 운반체를 말한다. 리포좀은 지질이중층으로 생체 친화적이며 양쪽 친매성을 가지고 있어, 내부에 친수성 물질과 소수성 물질을 모두 포함한 채로 소수성 막을 통과하여 세포에 친수성 물질과 소수성 물질을 전달할 수 있다.
또한, 본 발명에서, 상기 "지질"은 중성지질, 음이온성 및 양이온성 지질 중 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 지질은 당업계에서 약물을 담지하기 위한 리포좀을 제조하기 위하여 사용하는 것이라면 제한되지 않고 사용할 수 있으며, 식물 오일 등에서 분리, 정제하거나, 재조합, 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있다. 예를 들어 상기 중성지질은 L-a-포스파티딜콜린 (L-a-phosphatidylcholine, PC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dioleoylsn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-distearoyl-snglycero-3-phophocholine, DSPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phophocholine, DPPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phophoethanolamine, DSPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phophoethanolamine, DPPE), 콜레스테롤 (cholesterol), 이소프로필 미리스테이트 (isopropyl myristate) 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.
상기 음이온성 지질은 L-α-포스파티딕산(L-α-phosphatidic acid), L-α-포스파티딜-DL-글리세롤(L-α-phosphatidyl-DL-glycerol), 카디오리핀(cardiolipin), L-a-포스파티딜이노시톨(L-aphosphatidylinositol), L-α-포스파티딜세린(L-α-phosphatidylserine), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)](1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)], DLPG), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine], DLPS), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스페이트(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphate, DLPA), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)]1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)], DMPG), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine], DMPS), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate, DMPA), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)] (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)], DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine], DOPS), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate, DOPA), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine], DPPS), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate, DPPA), 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)], DSPG), 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine], DSPS), 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스페이트(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphate, DSPA),1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[카복시(폴리에틸렌글리콜2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[carboxy(polyethylene glycol)2000]), 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)2000](1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoyx(polyethylene glycol)2000], DSPE-mPEG2000), 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌글리콜)2000](1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)2000], DSPE-PEG2000-MAL), 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[PDP(폴리에틸렌글리콜)2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)2000]), 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)] (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)], POPG), 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine], POPS), 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스페이트(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate, POPA), 올레산 (oleicacid) 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 양이온성 지질은 O,O'-디미리스틸-N-리실 글루타메이트(O,O'-Dimyristyl-N-lysyl glutamate, DMKE) 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane, DOTAP), 디올레오일 글루타마이드 (dioleoyl glutamide), 디스테아로일 글루타마이드 (distearoyl glutamide), 디팔미토일 글루타마이드 (dipalmitoyl glutamide), 디올레오일 아스파르타마이드 (dioleoyl aspartamide), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 (1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane, DODAP), ß-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄-카바모일], (3ß-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl], DC-Chol), 메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (dimethyldioctadecylammonium bromide, DDAB) 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
본 발명에서, 상기 리포좀은
i) 양이온성 지질;
ii) 음이온성 지질; 및
iii) 콜레스테롤을 포함할 수 있고, 보다 구체적으로 상기 양이온성 지질은 DMKE일 수 있으며, 상기 음이온성 지질은 DSPE-mPEG2000 및 DSPE-PEG2000-MAL일 수 있다. 또한, 상기 DMKE, DSPE-mPEG2000, DSPE-PEG2000-MAL 및 콜레스테롤의 몰 비율은 9~13 : 0.5~2 : 0.5~1.5 : 9~13일 수 있고, 보다 구체적으로 11.5 : 1 : 1 : 11.5일 수 있다. 또한, 상기 DSPE-mPEG2000은 전체 지질 몰%의 3.5 내지 8 몰%로 함유될 수 있으며, 보다 더 구체적으로 4 내지 5 몰%로 함유될 수 있다. 상기 DSPE-mPEG2000이 3.5 몰% 미만 또는 8 몰% 초과하여 함유될 경우 양자점이 리포좀의 지질이중층에서 가용화되지 않을 수 있다.
상기 PEG화된 지질은 소수성 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입되도록 하고 음이온성 핵산과 결합하여 복합체를 형성하기 위한 양이온성 전하를 제공한다.
본 발명에서, 상기 복합체는 140 nm 내지 180 nm의 직경을 가지는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 160 nm 내지 170 nm의 직경을 가지는 것일 수 있다. 또한, 상기 복합체는 균일한 입도분포를 나타내며, 특징적인 입자의 크기 때문에 혈관이 매우 약하며 느슨한 구조를 갖는 암, 염증 등의 부위의 조직에 쉽게 혈관 내로 통과할 수 있다. 따라서, 상기 범위의 직경을 갖는 입자는 전신핵산전달(systemic nucleic acid delivery)에 바람직하다.
본 발명에서, 상기 복합체는 제타 전위(zeta potential) 값이 -3.5 mV 내지 -1.5 mV로서, 음의 값을 가지므로, 서로 응집이 발생하지 않는다.
본 발명에서, 상기 "양자점(Quantum dot, QD)"은 형광성 반도체 결정으로서, 나노미터 크기를 지닌다. 또한, 상기 양자점은 광안전성(photostability), 좁은 방출 밴드(narrow emission band) 또는 넓은 여기 스펙트럼(broad excitationspectrum) 등의 형광적 특성을 지닌다. 상기와 같은 특성을 지니는 양자점은 그의 물리적 크기에 의하여 결정된 파장에서 넓은 스펙트럼 범위 및 형광에 걸쳐 빛을 흡수하고, 정확하며 좁은 스펙트럼에서 빛을 방출하기 때문에, 빛을 효과적으로 흡수하면서 고도로 안정화된 형광 방출을 가져올 수 있다.
본 발명에서, 상기 핵산은 전하-기반 상호작용(charge-based interaction)을 통해 리포좀과 복합체를 형성한다.
본 발명에서, 상기 핵산은 유전자, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발명의 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 타겟 유전자의 mRNA에 상보적이고 타겟 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고 타겟 유전자의 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.
상기 "siRNA"란 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉-다운 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다. 또한, siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음)등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 가장 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기 , 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 타겟 유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 siRNA는 타겟 유전자에 특이적으로 작동하도록 타겟 유전자 또는 타겟 뉴클레오타이드와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥을 가진다.
상기 "shRNA"는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드를 의미하며, 생체 내에서 스템-루프(stemloop) 구조를 이루고 있다. 5-10 염기의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29 염기의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다.
상기 "miRNA(microRNA)"는 유전자 발현을 조절하며, 전장 21-23개의 뉴클레오타이드로 구성된 단일 가닥 RNA 분자를 의미한다. miRNA는 세포내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오타이드이며, 짧은 스템-루프 구조를 가진다. miRNA는 1 또는 2이상의 mRNA(messenger RNA)와 전체 또는 부분적으로 상동성을 가지며, 상기 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제시킨다.
본 발명에서, 상기 복합체는 N:P(복합체의 아민기:핵산의 인산염기 비율)가 4:1 내지 10:1의 범위인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 "앱타머(aptamer)"는 특정 타겟에 결합하는 올리고뉴클레오타이드(일반적으로, RNA 분자)를 의미한다. 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.
또한, 상기 앱타머는 암세포에서 과발현하는 특정 타겟에 특이적으로 결합하는 올리고튜클레오타이드로서 암세포에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 상기 암세포는 예를 들어 두경부암, 유방암, 전립선암, 폐암, 비호지킨 림프종, 신경아교종 또는 육종 종양 세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 앱타머는 EGF 수용체에 결합하는 올리고뉴클레오타이드로서 EGF 수용체를 과발현하는 세포에 특이적으로 결합하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 EGF 수용체를 과발현하는 암세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 양이온성 지질인 DMKE, 보조지질인 콜레스테롤, DSPE-mPEG2000 및 CdSe/ZnS 양자점(지질:양자점 중량비율 = 5:1)을 이용하여 박막 수화법(thin-film hydration method)으로 양자점이 지질이중층에 삽입된 리포좀(QLs)을 제조하였다. 또한, 이 때 4 mol%의 DSPE-mPEG2000를 이용한 경우 양자점의 가용화가 우수함을 확인하였다(표 2).
또한, 본 발명자들은 상기 양자점의 가용화가 우수한, 양자점이 지질이중층에 삽입된 리포좀(QLs)에 siRNA를 첨가하여 siRNA와 복합체를 형성한 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA)을 제조하였다. 그 다음, 상기 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA)에 EGF 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 앱타머 접합체를 혼합하여 종양 표적 앱타머가 리포좀 외부 표면에 부착된 구조의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 제조하였다. 이 때, 상기 siRNA를 N/P 비율 4:1 내지 10:1로 첨가한 경우 복합체 형성율이 우수함을 확인하였다(도 2a 및 도 2b).
또한, 본 발명자들은 양자점의 가용화가 우수하고, siRNA가 지질과 복합체를 이루는 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 제조하고, 상기 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 EGFR 발현 유방암세포 MDA-MB-231과 EGFR 미발현 유방암세포 MDA-MB-453에 처리하여 MDA-MA-231에서 siRNA 및 양자점 전달이 우수하게 나타나므로, 상기 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)가 EGFR 을 과발현하는 암세포를 인식하여 양자점 및 siRNA를 세포 내로 전달할 수 있음을 확인하였다(도 4a 및 도 4b, 도 5a 및 도 5b).
또한, 본 발명자들은 양자점의 가용화가 우수하고, siRNA가 지질과 복합체를 이루는 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 제조하고, 상기 양자점- siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 MDA-MA-231 종양 이식 마우스 종양모델에 정맥 주사하여 in vivo 종양모델 이미징 분석을 수행하여 종양 조직에서 형광 신호가 높게 나타나고, 상기 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)에 의해 종양세포 내로 양자점 및 siRNA가 전달되어 세포질에 위치해 있음을 확인하였다(도 6a 및 도 6b, 도 7a 및 도 7b, 도 8a 및 도 8b).
따라서, 본 발명자들은 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입되어 있고, 핵산으로 siRNA가 리포좀과 복합체를 형성하며, 종양 표적 앱타머가 리포좀 외부 표면에 부착된 구조의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체를 제조하고, 상기 복합체를 이용하여 암세포 특이적으로 양자점 및 siRNA를 전달할 수 있고, 형광 발현을 통해 이미지화할 수 있음을 확인하였으므로, 본 발명의 양자점-핵산-앱타머 리포좀 복합체를 핵산 전달체로 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체를 포함하는 생체 진단 이미징 시스템을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 시스템은 세포 내 형광을 측정하는 것일 수 있고, 상기 세포는 EGF 수용체를 과발현하는 세포일 수 있으며, 보다 구체적으로 EGF 수용체를 과발현하는 암세포일 수 있다. 상기 암세포는 예를 들어 두경부암, 유방암, 전립선암, 폐암, 비호지킨 림프종, 신경아교종 또는 육종 종양 세포일 수 있다.
본 발명자들은 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입되어 있고, 핵산으로 siRNA가 리포좀과 복합체를 형성하며, 종양 표적 앱타머가 리포좀 외부 표면에 부착된 구조의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체를 제조하고, 상기 복합체를 이용하여 암세포 특이적으로 양자점 및 siRNA를 전달할 수 있고, 형광 발현을 통해 이미지화할 수 있음을 확인하였으므로, 본 발명의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체를 생체 진단 이미징 시스템으로 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 핵산을 세포 내로 전달하여 암 또는 유전자 질환을 치료하기 위한, 본 발명의 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체 및 약제학적으로 이용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 예를 들어 두경부암, 유방암, 전립선암, 폐암, 비호지킨 림프종, 신경아교종 또는 육종 종양일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명자들은 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입되어 있고, 핵산으로 siRNA가 리포좀과 복합체를 형성하며, 종양 표적 앱타머가 리포좀 외부 표면에 부착된 구조의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체를 제조하고, 상기 복합체를 이용하여 암세포 특이적으로 양자점 및 siRNA를 전달할 수 있고, 형광 발현을 통해 이미지화할 수 있음을 확인하였으므로, 본 발명의 양자점-핵산-앱타머 리포좀 복합체를 암 질환 치료를 위한 약제학적 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "약제학적으로 이용가능한 담체"는 인간을 포함한 동물에 리포좀성 생리활성물질 조성물을 포함하는 지질 및 리포좀 투여와 관여하여 일반적으로 이용할 수 있는 매체를 말한다. 약제학적으로 이용가능한 담체는 당업자에게 잘 알려진 여러 가지 인자에 따라 제조될 수 있는데, 예를 들면 이용된 특정 생리활성물질, 이의 농도, 안정성 및 의도된 생체이용성; 양자점-핵산-앱타머 리포좀 복합체로 치료하고자 하는 질환 및 질병 또는 상태; 치료받을 개체, 나이, 크기 및 일반적인 상태; 조성물을 투여하는데 이용되는 경로, 예를 들어 비강, 구강, 안구, 국소, 경피 및 근육 등의 요인을 고려해야 하나, 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로 경구 투여 경로 이외의 생리활성물질 투여에 이용되는 약제학적으로 이용가능한 담체에는 D5W, 덱스트로즈 및 생리학적 염을용적의 5% 이내로 포함하는 수용액을 포함한다. 또한 약제학적으로 이용가능한 담체에는 보존제 및 항산화제와 같은 활성 성분들의 안정성을 보강시킬 수 있는 추가 성분들을 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 투여 경로는 적합한 모든 투여 경로가 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 의도하는 치료에 유효한 용량으로 투여된다. 특정의 의학적 질환을 치료하거나 또는 이의 진행을 억제시키는데 요구되는 치료학적 유효량은 의학 분야에 공지된 예비임상 연구 및 임상 연구를 이용하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명에서 상기 사용된 용어, "치료학적 유효량"은 임상의 또는 연구자가 목적하는, 특정 조직, 시스템, 및 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유발시키는 활성 성분의 양을 말한다.
또한, 본 발명은
1) 지질 및 양자점을 유기용매에 용해하여 양자점이 지질이중층에 삽입된 리포좀을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 양자점이 지질이중층에 삽입된 리포좀에 핵산을 첨가하여 리포좀과 핵산이 복합체를 형성하는 양자점-핵산-리포좀 복합체를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 양자점-핵산 리포좀 복합체에 앱타머 접합체를 첨가하여 앱타머를 리포좀의 외부 표면에 부착하는 단계를 포함하는, 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 1)에서 리포좀은 DMKE, DSPE-mPEG2000 및 콜레스테롤을 구성 성분으로 하는 지질로 이루어진 것일 수 있고, 상기 DMKE, DSPE-mPEG2000 및 콜레스테롤의 몰비율은 9~13 : 0.5~2 : 9~13일 수 있으며, 보다 구체적으로 11.5 : 1 : 11.5일 수 있다. 또한, 상기 DSPE-mPEG2000은 전체 지질 몰%의 3.5 내지 8 몰%일 수 있고, 보다 더 구체적으로 4 내지 5 몰%일 수 있다.
상기 단계 1)에서 상기 리포좀에서 PEG화된 지질에 의한 PEG화(PEGylation)는 소수성 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입되도록 하고, 음이온성 핵산이 결합하여 복합체를 형성할 수 있도록 양이온성 전하를 제공한다.
상기 단계 1)에서 양자점이 지질이중층에 삽입된 리포좀은 다음의 단계로 제조될 수 있다:
a) 지질 및 양자점을 유기용매에 용해하는 단계;
b) 유기용매를 증발 및 건조하여 지질 박막을 형성시키는 단계; 및
c) 상기 단계 b)에서 제조된 지질 박막을 수화하고, 양자점을 혼합하여 양자점이 지질이중층에 삽입된 리포좀을 형성하는 단계.
또한, 상기 단계 c) 이후에 초음파처리하여 리포좀의 입자크기를 균일화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 2)에서 핵산은 N:P(양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체의 아민기:핵산의 인산염기 비율)가 4:1 내지 10:1로 첨가될 수 있다.
상기 단계 2)에서 핵산은 음이온성으로, 양이온성 표면을 갖는 상기 단계 1)의 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입된 리포좀이 음이온성 핵산을 수용하여 전하-기반 상호작용(charge-based interaction)을 통해 리포좀과 복합체를 형성하고 중성화된 양자점-핵산-리포좀 복합체를 형성한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 3)에서 앱타머 접합체는 앱타머와 DSPE-PEG2000-MAL가 접합된 앱타머 접합체일 수 있다.
상기 단계 3)에서 DSPE-PEG2000-MAL은 양자점-핵산-리포좀 복합체의 표면을 음이온성으로 만들고, 양자점-핵산-리포좀 복합체이 충분한 투과성 및 EPR 효과를 나타내는 입자 크기를 가지도록 한다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 시료의 준비
DSPE-mPEG2000 (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleneglycol)2000]), DSPE-PEG2000-MAL (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethyleneglycol)2000]) 및 콜레스테롤은 Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL, USA)에서 구입하였다. 양이온성 지질인 DMKE(O,O'-Dimyristyl-N-lysyl glutamate)는 Kim H.S. et al. 에 기재된 방법으로 화학적으로 합성하였다. 종양 표적 앱타머로서 EGFR 앱타머-SH-3'(5'-Epidermal growth factor receptor aptamer-SH-3')는 Aptamer Science Inc. (Pohang, Korea)에서 구입하였다. CdSe/ZnS High Quality Organic NSQ-dots 양자점(Q-dots, λemit = 620 nm)은 Nanosquare Inc. (Seoul, Korea)에서 구입하였다. FITC 형광이 표지된 음성대조군 siRNA (AccuTarget™ Fluorescein-labeled Negatvie Control siRNA, SN-1022)는 BioNeer Inc. (Daejeon, Korea)에서 구입하였다.
< 실시예 2> 양자점 - siRNA - 앱타머 - 리포좀 복합체의 제조
<2-1> 앱타머 접합체( aptamer conjugate)의 제조
도 1의 모식도와 같이 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입되어 있고, siRNA가 리포좀과 복합체를 형성하며, 종양 표적 앱타머가 리포좀 외부 표면에 부착된 구조의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 제조하기 위하여, 먼저 종양 표적 앱타머 접합체를 제조하였다.
구체적으로, 티올화된 앱타머(thiolated aptamer, 100 μM) 및 DTT(dithiothreitol, 10 mM)을 TE 버퍼(pH 7.5)에 동일한 부피로 혼합하고 실온에서 1시간 동안 반응시켜 앱타머를 환원하였다. 상기 반응 용액을 PD-10 컬럼을 이용하여 여분의 DTT 용액을 제거한 후 DSPE-PEG2000-MAL 지질과 환원된 앱타머를 클로로포름 및 메탄올 혼합액(2:1, v/v)에 1:1의 몰비로 16시간 동안 실온에서 반응시켜 지질에 앱타머를 접합하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 100K Amicon tube (Merck Millipore, Darmstadt, Germany)를 이용하여 10분 동안 4,000 x g에서 원심분리하여 앱타머 접합체를 정제하였다.
<2-2> 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입된 리포좀의 제조
도 1의 모식도와 같이 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입되어 있고, siRNA가 리포좀과 복합체를 형성하며, 종양 표적 앱타머가 리포좀 외부 표면에 부착된 구조의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 제조하기 위하여, 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입된 리포좀(QLs)을 제조하였다.
구체적으로, 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 제조 시 상기 실시예 <2-1>에서 제조한 앱타머 접합체 4 mol%를 추가하는 것을 고려하여 하기 [표 1]의 조성으로 지질로서 양이온성 지질인 DMKE, 보조지질인 콜레스테롤 및 DSPE-mPEG2000, 및 CdSe/ZnS 양자점(지질:양자점 중량비율 = 5:1)을 클로로포름 및 메탄올 혼합액(2:1, v/v)에 용해하였다.
DSPE-mPEG2000/리포좀
(mol%)		 DMKE
(mol%)		 콜레스테롤
(mol%)		 DSPE-mPEG2000
(mol%)
0/100 48 48 0
1/99 47.5 47.5 1
4/96 46 46 4
8/92 44 44 8
그 다음, 유기용매를 N2 가스 스트림 하에 증발시켜 지질 및 양자점을 포함하는 박막을 형성하였다. 상기 박막을 형성한 혼합물을 1시간 동안 진공 건조하여 여분의 유기용매를 제거하였다. 1 mg 지질을 포함하는 건조한 박막을 1 ㎖ 식염수로 수화하고 5분 동안 격렬하게 혼합하여 양자점이 지질이중층에 삽입된 리포좀(QLs)을 제조하였다. 그 다음, 실온에서 20분 간격으로 10분씩 3회 초음파처리하여 획득한 리포좀의 크기를 균일화하였다.
그 다음, 상기 제조한 양자점이 지질이중층에 삽입된 리포좀(QLs)을 Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK)를 이용하여 리포좀 크기, 다분산지수(polydispersity indes), 제타전위(Zeta potential) 및 양자점 포획율(Q-dot incorporation rate)을 측정하였다.
그 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 4 mol%의 DSPE-mPEG2000를 첨가한 경우 양자점 포획율이 가장 높게 나타나므로, 4 mol%의 DSPE-mPEG2000를 첨가하여 제조한, 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입된 리포좀(QLs)의 지질이중층에서 소수성 CdSe/ZnS 양자점의 가용화(solubilization)가 가장 우수한 것을 확인하였다. 또한, 4 mol%의 DSPE-mPEG2000를 첨가하여 제조한, 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입된 리포좀(QLs)의 평균 제타전위는 8.01 mV로 양전하를 띠고 있어 핵산을 포획하여 리포좀과 복합체를 형성하는 것이 유리하고, 평균 입자크기는 174.6 nm로 핵산 전달체로서 활용도가 높은 크기임을 확인하였다(표 2).
DSPE-mPEG2000/리포좀
(mol%)		 입자 크기
(nm)		 다분산지수 제타전위
(mV)		 양자점 포획율
(%)
0/100 384.8±78.67 0.414±0.36 51.8±1.27 67.88±1.15
1/99 339.1±74.23 0.322±0.234 22.9±3.07 74.96±6.33
4/96 174.6±5.101 0.25±0.035 8.01±3.39 94.91±5.79
8/92 185.1±4.598 0.221±0.028 0.187±0.517 93.65±3.97
<2-3> 양자점 - siRNA - 앱타머 - 리포좀 복합체의 제조
도 1의 모식도와 같이 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입되어 있고, siRNA가 리포좀과 복합체를 형성하며, 종양 표적 앱타머가 리포좀 외부 표면에 부착된 구조의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 제조하기 위하여, 상기 실시예 <2-2>에서 제조한 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입된 리포좀(QLs)에 siRNA를 첨가하여 siRNA와 복합체를 형성한 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA)를 획득 한 후, 상기 리포좀 복합체(QLs-siRNA)에 종양 표적 앱타머 접합체를 첨가하여 종양 표적 앱타머가 리포좀 외부 표면에 부착된 구조의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 제조하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 4 mol%의 DSPE-mPEG2000를 첨가하여 양자점의 가용화가 우수한, 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입된 리포좀(QLs)을 제조하였다. 그 다음, 실온에서 20분 간격으로 10분씩 3회 초음파처리하여 획득한 리포좀의 크기를 균일화하고, siRNA(25 pmole)를 N/P 비율(양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)의 아민기: 핵산의 인산염기 비율) 1:1 내지 10:1로 첨가한 후 상온에서 30분 간 교반하여 siRNA와 복합체를 형성한 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA)을 제조하였다. 마지막으로, 상기 실시예 <2-1>에서 제조한 앱타머 접합체(4 mol%)를 상기 제조한 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA)와 37℃에서 2시간 동안 배양하여 종양 표적 앱타머가 리포좀 외부 표면에 부착된 구조의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 제조하였다.
그 다음, 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)에서 N/P 비율에 따른 siRNA와의 복합체 형성 여부를 확인하기 위하여, 상기 siRNA를 N/P 비율 1:1 내지 10:1로 첨가하여 제조한 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 이용하여 겔 지연 분석법(gel retardation assay)을 수행하였다.
구체적으로, siRNA를 N/P 비율 1:1 내지 10:1로 첨가하여 제조한 상기 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 1.5% 아가로오스 겔 상에서 100 V, 25분 동안 전기영동하였다. 전기영동 후 아가로오스 겔을 EtBr 염색하고 세척한 후 Quantity One program of the Gel Doc EQ system (Bio-Rad Lab., Hercules, CA, USA)을 이용하여 복합체 형성 여부를 확인하였다(도 2a 및 도 2b).
그 결과, 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, siRNA를 N:P 비율 = 4:1로 첨가한 경우부터 siRNA가 양이온성 지질과 복합체를 형성하여 siRNA 분자의 지연이 이뤄짐을 확인하였다(도 2a 및 도 2b).
< 실시예 3> 양자점 - siRNA - 앱타머 - 리포좀 복합체의 특성 확인
상기 <실시예 2>의 결과를 통해 양자점의 가용화가 우수하고, siRNA가 리포좀과 복합체를 형성하는 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 제조하고, 이의 구조 및 특성을 분석하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 4 mol%의 DSPE-mPEG2000를 첨가하여 양자점의 가용화가 우수한, 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입된 리포좀(QLs)을 제조하였다. 그 다음, 실온에서 20분 간격으로 10분씩 3회 초음파처리하여 획득한 리포좀의 크기를 균일화하고, siRNA가 지질과 복합체를 이루는 N/P 비율인 4:1로 siRNA(25 pmole)를 첨가한 후 상온에서 30분 간 교반하여 siRNA와 복합체를 형성한 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA)을 제조하였다. 그 다음, 상기 실시예 <2-3>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 앱타머 접합체(4 mol%)를 첨가하여 종양 표적 앱자머가 리포좀 외부 표면에 부착된 구조의 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 제조하였다.
그 후, 상기 제조한 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 용액을 탄소가 코팅된 300-메쉬의 구리 그리드(grid)에 놓고 2%(w/v) 아세트산우라닐(uranyl acetate)를 이용하여 음성 염색하여 샘플을 제작하였다. 상기 샘플을 투과전자현미경을 이용하여 80 kV 가속 전압 세기에서 TEM(Transmission electron microscopic) 이미지를 획득하여 리포좀 복합체의 구조를 확인하였다(도 3a).
또한, 상기 제조한 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 용액의 형광 방출을 Maestro in vivo imaging system(λex = 550 nm, λem = 620 nm)을 이용하여 확인하였다(도 3b).
또한, 상기 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 제조하는 과정에서 리포좀의 입자 크기 및 표면 전하를 DLS(dynamic light scattering) Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK)를 이용하여 측정하였다. 상기 측정은 5회 반복하였다(도 3c).
또한, 상기 제조한 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)의 siRNA가 RNase에 의해 손상이 야기되는 확인하기 위하여, RNase 보호 분석법(RNase prtection assay)를 수행하였다. 구체적으로 상기 제조한 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 용액에 RNase A(ribonuclease A) 20 g/㎖를 첨가하고 30분 동안 반응하였다. 그 다음, 정지 용액(0.5 M EDTA) 10 ㎕를 첨가하고 실온에서 45분 동안 배양하여 반응을 멈춘 후 1시간 동안 0.1% Triton® X-100을 처리하여 siRNA와 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 분리한 후 전기영동하여 siRNA가 분해되었는지 확인하였다(도 3d).
또한, 상기 제조한 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)에 앱타머가 리포좀 외부 표면에 부착되어 있는지 확인하기 위하여, 상기 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 제조하는 과정에서 획득한 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입된 리포좀(QLs) 용액, 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 용액, 앱타머 및 실시예 <2-1>에서 획득한 앱타머 접합체를 1.5% 아가로오스 겔 상에서 100 V, 25분 동안 전기영동하였다. 전기영동 후 아가로오스 겔을 EtBr 염색하고 세척한 후 Quantity One program of the Gel Doc EQ system (Bio-Rad Lab., Hercules, CA, USA)을 이용하여 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 확인하였다(도 3e).
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)가 안정한 다중층 리포좀 소포체 구조임을 확인하였다(도 3a).
또한, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)는 550 nm 여기파장에서 여기되어 적생광을 방출하는 것을 확인하였다(도 3b).
또한, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입된 리포좀(QLs)의 크기는 대략 152 nm이고, siRNA와 복합체를 형성한 후 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA)의 크기는 146 nm로 QLs보다 크기가 감소하였다. 그러나 앱타머 접합체를 첨가한 후 형성된 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)의 크기는 164 nm로 다시 증가하였다. 또한, 양자점이 리포좀의 지질이중층에 삽입된 리포좀(QLs)의 양이온성 표면은 siRNA와 복합체를 형성하면서 거의 중화되었다. 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA) 표면에 앱타머 분자가 부착된 후 제타전위(zeta potential) 값은 -2.69 mV로 감소하였다(도 3c).
또한, 도 3d에 나타낸 바와 같이, 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)에서 siRNA를 분리한 후 siRNA가 78% 남아있음을 확인함으로써, 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)는 세포외 핵산내부가수분해효소(extracellular endonuclease)에 의한 분해로부터 결합된 siRNA 분자를 효율적으로 보호함을 확인하였다(도 3d).
또한, 도 3e에 나타낸 바와 같이, 항-EGFR 앱타머는 티오에테르 결합(thioether bond)를 통해 DSPE-PEG2000-MAL과 효율적으로 접합되고, 앱타머 접합체가 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)에 삽입되어, 앱타머가 리포좀 외부 표면에 부착됨을 확인하였다(도 3e).
< 실시예 4> 양자점 - siRNA - 앱타머 - 리포좀 복합체의 종양 표적 세포 결합 및 전달 효율 확인
EGF 수용체(EGFR)에 특이적인 앱타머가 표면에 부착된 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)의 EGF 수용체 선택적 전달 효율을 확인하기 위하여, 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 EGFR 발현 유방암세포 MDA-MB-231과 EGFR 미발현 유방암세포 MDA-MB-453에 각각 처리하고 유세포 분석을 수행하였다.
구체적으로, 인간 유방선암 세포주인 MDA-MB-231 (No. HTB-26) 및 인간 유방전이암 세포주인 MDA-MB-453 (No. HTB-131)은 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구매하였다. 또한, 상기 <실시예 3>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 제조하였다. 이때, siRNA는 FITC(fluorescein isothiocyanate)로 표지된 siRNA(FITC-siRNA, 50 pmole)를 첨가하였다. 상기 제조한 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 상기 세포주 각각에 첨가한 후 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 FACS Calibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)로 분석하였다(도 4a).
또한, siRNA 전달 효율을 알아보기 위하여, 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지 또는 50% 혈청이 포함된 DMEM 배지에서 4시간 동안 배양한 MDA-MB-231를 상기 제조한 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 또는 FITC-siRNA(50 pmole) 포함 리포펙타민2000(Lipofectamine2000, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 형질감염하였다. 그 다음, FACS Calibur 유세포 분석기로 분석하였다(도 4b).
통계분석은 ANOVA를 이용하여 수행하였다. P < 0.05를 통계적으로 유의한 값으로 보았다. *는 p < 0.05, **는 P < 0.01, ***는 P < 0.0001을 나타낸다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)는 EGFR 미발현 유방암세포인 MDA-MB-453 세포(1.75% 변화)보다 EGFR 발현 유방암세포인 MDA-MB-231 세포(86.33% 변화)에서 FITC(fluorescein isothiocyanate)로 표지된 siRNA 분자(FITC-siRNA)를 보다 효율적으로 전달하는 것을 확인하였다. 양자점 형광을 이용한 유세포 분석을 통해서도 MDA-MB-453 세포(0.90% 변화)보다 MB-231 세포(31.63% 변화)에서 양자점 전달이 우수하게 나타남을 확인하였다. 따라서 상기 결과를 통해 리포좀 나노입자 표면에 부착된 항-EGFR 앱타머 리간드가 EGFR을 과발현하는 암세포를 인식하는 역할을 함을 확인하였다(도 4a).
또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 4시간 동안 혈청이 없는 배지에서 배양한 후 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 및 siRNA를 포함하는 리포펙타민으로 형질감염된 세포는 각각 91.12%, 93.13%의 형광강도(MFI, fluorescence intensity)를 나타내므로, 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 및 리포펙타민 모두 유사한 siRNA 형질감염율을 갖는 것을 확인하였다. 반면, 50% 혈청이 포함된 배지에서 배양한 후 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 및 siRNA를 포함하는 리포펙타민으로 형질감염된 세포는 각각 87.78%, 32.1% MFI를 나타내므로, 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)을 이용한 경우 siRNA 형질감염율이 보다 우수함을 확인하였다(도 4b).
< 실시예 4> in vitro 암세포 이미징 분석을 통해 양자점 - siRNA - 앱타머 - 리포 좀 복합체를 이용한 세포 내 양자점 및 siRNA 전달 확인
양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)의 세포 내 양자점 및 siRNA 전달 양상을 알아보기 위하여, 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 EGFR 발현 유방암세포 MDA-MB-231과 EGFR 미발현 유방암세포 MDA-MB-453에 각각 처리하고 시간별로 공초점 현미경을 통한 이미징 분석을 수행하였다.
구체적으로, MDA-MB-231 세포주(2.5×105 세포/웰) 및 MDA-MB-453 세포주(2.5×105 세포/웰) 각각에 상기 <실시예3>에 기재된 방법으로 제조한 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 및 상기 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 제조 과정에서 획득한 siRNA와 복합체를 형성한 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA)를 처리하고 37℃에서 배양하였다. 그 다음, DAPI 용액으로 염색하고 1, 4, 8 및 24시간에 공초점 현미경(confocal laser scanning microscope, LSM 510, Zeiss, Heidenheim, Germany)으로 관찰하였다(도 5a). 또한, 상기 8시간에 양자점 및 siRNA 분자의 형광 신호를 공초점 현미경으로 관찰하였다(도 5b).
그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA) 또는 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 처리 후 시간이 경과하면서 형광 신호가 점차적으로 증가하는 것을 확인하였다. 특히, MDA-MB-231 세포에서 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 처리하고 8시간 경과 후 형광 신호가 가장 높게 나타나고, 그 후, 24시간이 지났을 때 형광 신호가 감소하는 것을 확인하였다(도 5a).
또한, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 처리한 MDA-MB-231 세포에서 양자점 및 siRNA의 전달 효율이 가장 높게 나타났고, 세포질에 양자점 및 siRNA가 함께 존재하는 것을 확인하였다. 반면, 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA)의 경우 전달 효율이 낮게 나타남을 확인하였다(도 5b, 위). 뿐만 아니라 EGFR-음성 MDA-MB-453 세포에서는 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA) 및 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)의 형광 신호가 감지되지 않고 세포막의 바깥 부분에서도 형광 신호가 나타나지 않음을 확인하였다(도 5b, 아래).
< 실시예 5> 양자점 - siRNA - 앱타머 - 리포좀 복합체를 이용한 in vivo 종양모델 이미징 분석
<5-1> in vivo 종양모델 이미징 분석을 위한 마우스 종양모델 제작
1×107개의 MDA-MB-231 세포를 마트리겔(Matrigel, BD Biosciences, San Jose, CA)과 1:1 비율로 혼합하고 5 내지 6주령 된 암컷 BALB/c 누드 마우스(Orient, Seongnam, Korea)의 4th mammary fat pad에 주사하여 마우스 종양모델을 제작하였다. 모든 동물실험은 원주연세대학교 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 승인을 받아 수행하였다(YWCI-201605-002-01).
<5-2> 양자점 - siRNA - 앱타머 - 리포좀 복합체를 이용한 in vivo 종양모델 이미 징 분석
마우스 종양모델에 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA) 또는 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 정맥 투여한 후 시간 경과에 따라 이미징 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <5-1>에서 제작한 마우스 종양모델의 종양이 약 200 mm3 (length×width2/2)의 크기가 되었을 때, 마우스에 상기 <실시예 3>에 기재된 방법으로 제조한 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 및 상기 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 제조 과정에서 획득한 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA)을 꼬리 정맥을 통하여 각각 주사한 후 Maestro 2 in vivo imaging system (Caliper Life Sciences, PerkinElmer, Hopkinton, MA) (λex 550 nm, λem 620 nm)을 이용하여 정맥 주사 후 1, 4, 8 및 24시간에 형광영상을 확보하였다(도 6a 및 도 6b).
그 결과, 도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, 마우스 자체에서 발현되는 형광은 녹색으로 나타나고, 양자점에 의해 발현되는 형광은 적색으로 나타났다. 일부 다른 조직 및 장기에서 특정 수준의 양자점 신호가 검출되지는 않는 반면, 종양조직에서 양자점에 의해 발현되는 적색형광 신호가 나타남을 확인하였다. 특히, 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 정맥 주사한 마우스 종양모델의 복측 종양 조직에서 유의적인 양자점 신호를 확인하였다. 또한, 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 정맥 주사 4시간 후까지 종양에서 형광 신호는 점차적으로 증가한 후 감소하여 정맥 주사 24시간 후에 거의 사라졌다(도 6a). 반면, 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA)을 투여한 마우스 종양모델의 경우 모든 측정 시간에 종양 조직으로부터 감지되는 형광 신호가 상대적으로 낮은 수준으로 나타나고. 측정 시간에 따라 종양에서 형광 신호가 두드러지게 변화하지 않음을 확인하였다(도 6b).
< 실시예 6> 양자점 - siRNA - 앱타머 - 리포좀 복합체를 이용한 종양의 생물학적 분포( biodistribution ) 확인
마우스 종양모델에 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA) 또는 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 정맥 투여한 후 시간 경과에 따라 주요 장기에서 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA) 또는 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)의 생물학적 분포 양상을 확인하고, 장기에서 siRNA 및 양자점의 전달 양상을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <5-2>에 기재된 방법으로 마우스 종양모델에 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA) 또는 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 정맥 주사 후 1, 4, 8 및 24시간에 희생하고, 종양, 간, 폐, 이자, 신장 및 심장을 적출하였다. 상기 적출한 장기의 형광강도를 Maestro 2 in vivo imaging system을 이용하여 측정하였다(도 7a 내지 도 7b).
통계분석은 ANOVA를 이용하여 수행하였다. P < 0.05를 통계적으로 유의한 값으로 보았다. *는 p < 0.05, **는 P < 0.01, ***는 P < 0.001을 나타낸다.
또한, 양자점 및 siRNA의 형광을 관찰하기 위하여, 상기 적출한 장기 조직을 크라이오스탯(cryostat)을 이용하여 10 μm 두께로 동결 절편하고, DAPI 용액으로 30분 동안 암실에서 염색한 후 공초점 현미경을 이용하여 분석하였다(도 8a 및 도 8b).
그 결과, 도 7a 내지 도 7d에 나타낸 바와 같이, 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA) 또는 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 정맥 주사 후 1시간 째에, 양자점에 의한 적색형광 신호가 간 및 폐에서 높게 관찰되었고, 그 다음으로 신호 강도는 이자, 종양, 신장 및 심장 순으로 나타남을 확인하였다. 적출 후, 간, 폐 및 이자와 같은 세망내피계 장기에서 형광 신호는 양자점 전달과 상관 없이 점차적으로 낮아졌다. 그러나, 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 투여한 마우스 종양모델의 경우 정맥 주사 후 4시간까지 종양 조직에서 형광 신호가 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 7a 및 도 7b). 또한, 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 정맥 주사 후 4시간 째에 가장 높은 양자점 형광 신호가 나타남을 통계 분석을 통해서도 확인하였다(도 7c). 뿐만 아니라, 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 정맥 주사한 마우스 종양모델의 경우 모든 형광 신호 측정 시간에서 간 대비 종양에서 높은 형광 신호를 나타내었다(도 7d).
또한, 도 8a 및 도 8b에 나타낸 바와 같이, 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA) 및 양자점-siRNA-리포좀 복합체(QLs-siRNA) 모두 주요 장기에서 양자점(적색) 및 siRNA(녹색) 전달 양상이 유사하였다. 그러나 양자점-siRNA-앱타머-리포좀 복합체(Apt-QLs-siRNA)를 통해 전달된 양자점 및 siRNA가 종양 조직에서 보다 우수한 전달효율을 나타내었다. 또한, 전달된 양자점 및 siRNA는 종양세포의 세포질에 위치해 있음을 확인하였다(도 8a 및 도 8b).

Claims (21)

  1. (a) 양이온성 지질, 음이온성 지질 및 콜레스테롤을 포함하는 지질이중층(lipid bilayer)으로 이루어진 리포좀;
    (b) 상기 리포좀의 지질이중층에 삽입된 양자점;
    (c) 상기 리포좀과 복합체가 된 핵산; 및
    (d) 상기 리포좀의 외부 표면에 부착된 앱타머(aptamer)를 포함하고,
    상기 음이온성 지질은 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)2000](1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoyx(polyethylene glycol)2000], DSPE-mPEG2000), 및 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌글리콜)2000](1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)2000], DSPE-PEG2000-MAL)를 포함하고, 상기 DSPE-mPEG2000은 전체 지질 몰%의 3.5 내지 8 몰%로 함유하여 상기 리포좀이 양전하를 띠게 하고, 상기 DSPE-PEG2000-MAL는 앱타머와 접합되어 리포좀에 포함되는 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 O,O'-디미리스틸-N-리실 글루타메이트(O,O'-Dimyristyl-N-lysyl glutamate, DMKE), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane, DOTAP), 디올레오일 글루타마이드 (dioleoyl glutamide), 디스테아로일 글루타마이드 (distearoyl glutamide), 디팔미토일 글루타마이드 (dipalmitoyl glutamide), 디올레오일 아스파르타마이드 (dioleoyl aspartamide), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 (1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane, DODAP), ß-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄-카바모일], (3ß-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl], DC-Chol), 메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (dimethyldioctadecylammonium bromide, DDAB) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는, 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 상기 핵산은 전하-기반 상호작용(charge-based interaction)을 통해 리포좀과 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는, 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 핵산은 유전자, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 복합체는 N:P(복합체의 아민기:핵산의 인산염기 비율)가 4:1 내지 10:1의 범위인 것을 특징으로 하는, 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 앱타머는 EGF 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 복합체는 암세포에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 암세포는 두경부암, 유방암, 전립선암, 폐암, 비호지킨 림프종, 신경아교종 및 육종 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체.
  11. 제 1항의 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체를 포함하는 핵산 전달체(nucleic acid delivery system).
  12. 제 1항의 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체를 포함하는 생체 진단 이미징 시스템.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 시스템은 세포 내 형광을 측정하는 것을 특징으로 하는, 생체 진단 이미징 시스템.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 세포는 EGF 수용체를 과발현하는 세포인 것을 특징으로 하는, 생체 진단 이미징 시스템.
  15. 핵산을 세포 내로 전달하여 암을 치료하기 위한, 제 1항의 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체 및 약제학적으로 이용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 암은 두경부암, 유방암, 전립선암, 폐암, 비호지킨 림프종, 신경아교종 및 육종 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  17. 1) 양이온성 지질, 음이온성 지질, 및 콜레스테롤 및 양자점을 유기용매에 용해하여 양자점이 지질이중층에 삽입된 리포좀을 제조하되, 상기 음이온성 지질로 DSPE-mPEG2000를 전체 지질 몰%의 3.5 내지 8 몰%로 함유하여 상기 리포좀이 양전하를 띠도록 제조하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 양자점이 지질이중층에 삽입된 리포좀에 핵산을 첨가하여 리포좀과 핵산이 복합체를 형성하는 양자점-핵산-리포좀 복합체를 제조하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 양자점-핵산 리포좀 복합체에 DSPE-PEG2000-MAL가 접합된 앱타머 접합체를 첨가하여 앱타머를 리포좀의 외부 표면에 부착하는 단계를 포함하는, 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체의 제조방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 단계 1)에서 양이온성 지질은 O,O'-디미리스틸-N-리실 글루타메이트(O,O'-Dimyristyl-N-lysyl glutamate, DMKE), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane, DOTAP), 디올레오일 글루타마이드 (dioleoyl glutamide), 디스테아로일 글루타마이드 (distearoyl glutamide), 디팔미토일 글루타마이드 (dipalmitoyl glutamide), 디올레오일 아스파르타마이드 (dioleoyl aspartamide), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 (1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane, DODAP), ß-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄-카바모일], (3ß-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl], DC-Chol), 메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (dimethyldioctadecylammonium bromide, DDAB) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는, 양자점-핵산-앱타머 리포좀 복합체의 제조방법.
  19. 삭제
  20. 제 17항에 있어서, 상기 단계 2)에서 핵산은 N:P(양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체의 아민기:핵산의 인산염기 비율)가 4:1 내지 10:1로 첨가되는 것을 특징으로 하는, 양자점-핵산-앱타머-리포좀 복합체의 제조방법.
  21. 삭제
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