KR101814879B1

KR101814879B1 - 유전자 전달체 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101814879B1
Application number: KR1020150158082A
Authority: KR
Inventors: 함승주; 허용민; 장은지; 한승민; 이훈재
Original assignee: 연세대학교 산학협력단; 대한민국 (식품의약품안전처장)
Priority date: 2015-11-11
Filing date: 2015-11-11
Publication date: 2018-01-03
Also published as: KR20170055201A

Abstract

본 발명은 체내 안정성이 현저히 우수하고, 표적부위 유전자 전달 효율이 우수한 유전자 전달체 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 유전자 전달체에 의하면 인지질 이중막을 통하여 세포 독성을 저하시키고, 세포 유입을 개선하였으며, in vivo 환경에서 효소 등에 의한 목적 유전자의 소실을 방지함으로써 유전자 전달 효율을 높이며, 리소좀 pH 조건에서 양이온성 고분자의 이온 완충 능력이 우수하여, 전달 유전자를 세포질 내로 방출시키는 효과가 우수하므로, 유전자 전달체 및 본 발명의 전달체를 이용한 유전자 치료에 효과적으로 사용할 수 있다.

Description

유전자 전달체 및 그 제조방법{Gene delivery and Preparing Method thereof}

본 발명은 유전자 전달체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

위암에 대한 현재의 표준적인 치료로 전체 종양의 크기를 감소시키고 진행을 늦추기 위한 수술적 절제와 화학 요법이 있는데, 완전한 절제 후에도 재발률이 70%까지 발생하는 것은 암 치료에 있어 중요한 문제로 남아있다. 암 줄기 세포이론은 휴지상태의 암 줄기 세포(CSC)의 존재로 인해 종양이 재발한다고 보고 있는 것으로, 가장 효과적인 암 치료법은 암 줄기 세포(CSC)를 표적으로 하는데, 종양에서 CSC의 부분 모집단을 제거하기 위해 암 줄기 세포 특이적으로 약물 또는 유전자를 전달해주는 것이 중요하다.

CD44는 세포막에 부착한 분자로 유방, 췌장, 결장, 전립선, 위 등 많은 CSC의 분자 표지자로 보고 되어왔다. 기존의 항암제를 CSC에 특정하여 전달하고자 하는 많은 시험들이 CD44 와 그 발현 세포를 표적으로 하는 항체, 앱타머, 탄수화물을 이용하여 진행 중이다. 종양에서 CD44 발현을 억제하기 위한 접근방식이 취해진 이유는 CD44의 신호 전달 경로 활성화가 암의 시작, 증식, 이동, 침윤, 혈관형성 및 생존에 핵심적인 역할을 하기 때문이다. CD44를 억제하기 위해서, 현대 후생 유전학적 수단이 현재 개발되고 있으며, 그 예로 표적 전사물(transcripts)들을 결합하고, 그 전사를 막는 RNA 간섭(RNAi) 유도 소분자 생화합물(예: siRNA 및 miRNA)과 그 변이체가 있다.

그 중 가능성이 있는 것은 최근 발견된 종양 억제인자인 miRNA-34a(miR-34a)로, miR-34a는 종양 조직에서 종종 발현이 사라지거나 저발현 되는데, miR-34a mimic(또는 miR-34a를 포함하는 벡터)을 재도입 해주면 체내 및 체외에서 종양 성장과 이동을 저해한다. 예를 들어, Liu 등은 miR-34a mimic이 전립선 CSC의 분화와 전이를 직접적으로 표적으로 삼고 그 결과 조절하여 전립선 암 세포에서 CD44 발현을 억제한다고 보고했고(Liu, C. et al. Nat Med 2011, 17, 211-U105.), 최 등은 miR-34a가 NANOG, SOX2 및 MYCN과 같은 만능성 유전자를 억제하며, miR-34a가 줄기세포성과 분화를 조절함을 밝혔다(Choi, Y. J. et al. Nat Cell Biol 2011, 13, 1353-U1154). 기존의 화학 요법 함께 miR-34a에 의하여 항암제 저항성이 약화되었다는 것은 재발을 극복하기 위한 miR-34 매개 CSC 치료에 관한 분자적 근거를 제공한다. 따라서, CD44를 저발현 시키기 위한 miR-34a를 이용한 치료법은 CD44를 다량 포함한 CSC를 제거하는 데 있어서 중요한 역할을 할 수 있을 것이다.

그러나 이러한 치료적 잠재력에도 불구하고, micro RNA(miR, miRNA)는 핵산분해효소에 취약하고, 다중음이온 특성을 가지고 있기 때문에, in vivo 환경에서 타겟 부위까지 소실없이 안정적으로 miRNA를 전달하는 것은 매우 어려우며, 타겟 부위로 이동하였다고 하더라도 miRNA를 다시 세포질로 방출하는 효율이 떨어진다는 문제점이 여전히 존재한다.

따라서 microRNA를 생체 내에서도 안정적이고, 효율적으로 전달할 수 있는 유전자 전달체의 개발이 여전히 요구되고 있다.

따라서, 이러한 요구에 맞추어 본 발명의 발명자는 체내 안정성이 향상되면서도, 독성이 낮아 유전자 등을 효율적으로 전달할 수 있는 유전자 전달체를 개발하였다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하고자 하는 것으로, 본 발명의 발명자들은 양이온성 고분자 및 유전자를 포함하는 유전자 전달체의 체내 안정성 및 전달 효율을 높이기 노력하였고, 그 결과 pH에 따른 반응성을 갖는 양이온성 고분자를 포함하는 인지질 이중막을 포함하는 나노 구조체 형태의 유전자 전달체의 경우 체내에서 안정성 및 유전자 전달 효율이 우수함을 확인 하였고, 이러한 유전자 전달체를 제조하는 최적의 제조 조건을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 체내 안정성이 현저히 우수하고, 표적부위 유전자 전달 효율이 우수한 유전자 전달체를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 전달체의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 체내 안정성이 우수하고, 암세포 조건인 pH 4 내지 6에서 pH 완충능이 우수하여 세포질 내로 유전자를 더 잘 방출시킬 수 있는 항암 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 전달체를 포함하는 유전자 치료제를 제공하는데 있다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 전달 대상인 뉴클레오타이드 분자 및 L-리신-g-이미다졸 중합체(Poly(L-lysine-graft-imidazole, PLI)를 포함하는 복합체; 및 상기 복합체를 내부에 봉입하고있는 인지질 이중막;을 포함하는 유전자 전달체를 제공한다.

상기 인지질 이중막은 페길화 된 것 일 수 있다.

상기 PLI는 pH 4 내지 pH 6에서 반응성을 갖는 양이온성 고분자 일 수 있다.

상기 뉴클레오타이드 분자는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앱타머, siRNA, shRN, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA 및 DNAzyme으로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있다.

상기 뉴클레오타이드 분자 및 PLI의 몰비가 1 : 0.04 이상 인것 일 수 있다.

상기 유전자 전달체는 평균입경 150 nm 내지 200 nm일 수 있다.

또한, 본 발명은 뉴클레오타이드 분자 및 양이온성 고분자인 (L-리신-g-이미다졸) 중합체를 포함하는 복합체를 형성하는 단계; 인지질, 포스패틸콜린 (PC) 및 디스테아로일포스포에탄올아민-메톡시폴리에틸렌글리콜(DSPE-mPEG)을 혼합하여 지질 필름을 제조하는 단계: 및 상기 복합체 및 제조된 지질 필름을 혼합 및 압출하여 내부에 복합체가 봉입된 지질막 나노 베지클을 얻는 단계;를 포함하는 유전자 전달체 제조방법에 관한 것이다.

상기 복합체 형성단계는 뉴클레오 타이드 분자 및 양이온성 고분자의 결합 몰비 1 : 0.04 이상으로 혼합하여 형성하는 것 일 수 있다.

상기 지질 필름 제조단계는 DSPE-mPEG 대 PC는 몰비 1 : 0.05 내지 0.20, DSPE-mPEG 대 인지질은 몰비 1: 0.35 내지 0.5로 혼합하는 것 일 수 있다.

상기 지질 필름 제조는 제조된 지질막을 20 시간 내지 48시간 동안 수화시키는 단계를 더 포함 할 수 있다.

상기 유전자 전달체 제조방법은 상기 나노베지클을 20 내지 48시간 동안 완충액으로 투석하는 정제단계를 더 포함 할 수 있다.

또한 본 발명은 miRNA-34a 및 (L-리신-g-이미다졸) 중합체(Poly(L-lysine-graft-imidazole, PLI)를 포함하는 복합체; 및 상기 복합체를 내부에 봉입하고 있는 인지질 이중막;을 포함하는 항암 조성물에 관한 것이다.

상기 miRNA-34a 와 PLI의 몰비가 1 : 0.04 이상 인것 일 수 있다.

상기 인지질 이중막은 페길화 된 것 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 전달체를 포함하는 유전자 치료제에 관한 것이다.

본 발명의 유전자 전달체에 의하면 인지질 이중막을 통하여 세포 독성을 저하시키고, 세포 유입을 개선하였으며, in vivo 환경에서 효소 등에 의한 목적 유전자의 소실을 방지함으로써 유전자 전달 효율을 높이며, 리소좀 pH 조건에서 양이온성 고분자의 이온 완충 능력이 우수하여, 전달 유전자를 세포질 내로 방출시키는 효과가 우수하므로, 유전자 전달체 및 본 발명의 전달체를 이용한 유전자 치료에 효과적으로 사용할 수 있다.

도 1은 PLI/miR 복합체를 포함하는 나노소포체(NVs-miR)의 구조를 나타내는 모식도이다. 엔도좀 pH에서 향상된 체내 안정성을 가진 NVs-miR 및 pH 반응성 양이온 고분자(PLI)에 의한 양성자 완충에 대한 개략적인 묘사를 나타낸다.
도 2는 i) LysZ NCA, ii) PLZ, iii) PL, iv) PLI의 합성식을 나타내는 도이다.
도 3은 i) LysZ, ii) LysZ NCA, iii) PLZ, iv) PL과 v) PLI의 (A) 1H-NMR와 (B) FT-IR 스펙트라를 확인한 도이다.
도 4은 PL 과 PLI의 산 -염기의 적정곡선. 0.1 N HCl의 단계적 추가에 따라 적정된 고분자 용액(1 mg/mL)을 나타내는 도이다.
도 5는 (A) 몰 비 0.01부터 0.1사이에서 맨 miR 및 PLI/miR 복합체의 겔 지연 분석, (B) 유체역학적 직경, (C) PLI/miR, NVs(PLI/miR 복합체 없는 나노소포체), NVs-miR의 제타 전위를 나타낸다.
도 6는 NVs-miR의 체내 세포간 전달을 확인한 도이다. (A) 37℃에서 24시간 동안 배양 된 이후 PLI(채워진 원)에 의해서만 그리고 PLI/miR(비어있는 원), NVs-miR(역전된 삼각형)에 의해 유도되는 MKN-74세포의 세포독성, (B) 성숙 miR-34a(채워진 막대)의 비교 발현과 37℃에서 8시간 동안 NVs-miR, PLI/miR, Lipofectamine(LF)을 통해서 miR-34a 또는 miR-nc로 처리한 MKN-74세포 내 miR-34a 전구체(비어있는 막대)의 세 번째 가지에서 나온 소량의 물질로서의 miR-34a*을 보여주는 역전사 중합효소 양적연쇄반응(qRT-PCR) 분석. 세포들은 37℃에서 48시간동안 추가적으로 배양된 후 수집되었다
도 7은 NVs-miR의 체내 세포간 전달과 세포질 내 위치 선정을 확인한 도이다. PLI 형광(FL) 표지 miR 복합체를 가지고 있는 Cy5.5 표지 NVs(Cy5.5-NVs-FL-miR)를 처리한 MKN-74 세포의 공 초점 현미경 검사. 이 세포들은 37℃에서 (A) 4시간과 (B) 24시간 동안 Cy5.5-NVs-FL-miR와 같이 배양되었고, LysoTracker® 청색으로 염색하였고, 녹색, 적색, 청색은 각각, 플로리다, Cy5.5 및 LysoTracker® 블루를 나타낸다. 모든 기준 자는 10 μm이다.
도 8은 MKN-74 세포들의 NVs-miR에 의한 체외 CD44 억제효과를 확인한 것이다. 37℃에서 8시간 동안 NVs-miR, PLI/miR 와 Lipofectamine(LF)을 통해 miR-34a 이나 miR-nc로 트렌스펙션된 MKN-74세포들의 CD44 mRNA와 단백질의 상대적 발현을 보이는 (A) qRT-PCR와 (B) 웨스턴 블랏분석. 세포들을 37 ℃에서 48시간 동안 추가 배양 뒤 수확했다. Tubulin을 사용하여 부하를 조절하였고, 상대적 CD44 단백질 레벨은 아래에 나타난 바와 같다. *p와 **p <0.0001, ***p < 0.0005.
도 9는 MKN-74 위 동소위 마우스모델의 PLI/형광표지된 miR(Cy5.5-NVs-FL-miR)를 포함하고 있는 Cy5.5-표지된 NVs. 생체 내 전달 (a) Cy5.5-NVs-FL-miR 을 여러 간격으로(pre-injection, 0, 3, 6시간) 정맥 내 투여한 뒤 MKN-74 종양을 가지고 있는 마우스들의 체내광학형광이미지. 종양 부위는 붉은 색 점선경계부위에 나타난다. (b) Cy5.5-NVs-FL-miR 주입 후 종양부위에서 계수한 전체 광자의 수를 나타낸 그래프. (c) Cy5.5-NVs-FL-miR 주입 6시간 후 절개한 간, 위, 뇌, 폐, 신장, 비장, 심장, 근육의 생체 외 광학 형광이미지. 형광이미지에 대한 강도 지도는 레이저파워3.0 μW와 통합시간0.4초를 가진 표준화된 광자 수를 나타낸다.
도 10은 MKN-74 위암 동소위 마우스모델의 (a) FL-miR만, (b) PLI/FL-miR, 그리고 (c) NVs-FL-miR의 생체 내 전달을 평가한 도이다. NVs-FL-miR 의 정맥 내 주입 후 마우스에서 절개한 MKN-74 종양 부위의 조직학적 염색(왼쪽)과 공초점 현미경이미지(오른쪽). 화살표는 MKN-74 세포에서 심어진 곳을 나타낸다. 녹색과 파란색은 각각 핵에서 나온 Hoechst 33342와 miR 로부터 나온 형광물질을 나타낸다. 확대된 이미지의 모든 스케일 바는 10 μm이다
도 11은 위 동소위 마우스 모델에서 NVs-miR에 의한 생체 내 CD44억제 효과를 확인한 것이다. 2주 동안 (a) miR 만으로, (b) PLI/miR, 그리고 (c) NVs-miR -FL-miR 의 정맥 내 투여 후 마우스에서 절개한 MKN-74 종양 부위의 형광물질 현미경이미지(A-C)(주 당 3번, 절개마다 miR-34a 1 μmole). CD44 는 PE-표지한 항 인간 CD44 항체(붉은색)으로 염색이 되고, 핵은 Hoechst 33342(파란색)으로 대조 염색됐다. 확대된 이미지의 모든 스케일 바는 10 μm이다. (D) 마우스에서 절개한 MKN-74 종양 시편의 상대 CD44 단백질 은 miR만, PLI/miR, 그리고 NVs-miR로 처리됐다. β-actin을 사용하여 부하를 조절하였고, 상대 CD44 레벨은 맨 위에 나타나있다.

본 발명은 전달 대상인 뉴클레오타이드 분자 및 L-리신-g-이미다졸 중합체(Poly(L-lysine-graft-imidazole, PLI)를 포함하는 복합체; 및 상기 복합체를 내부에 봉입하고있는 인지질 이중막;을 포함하는 유전자 전달체를 제공한다.

상기 인지질 이중막은 페길화 된 것 일 수 있다.

상기 유전자 전달체는 평균입경 150 nm 내지 200 nm일 수 있다.

상기 복합체 형성단계는 뉴클레오 타이드 분자 및 양이온성 고분자 결합체의 결합 몰비가 1 : 0.04 이상으로 혼합하여 형성하는 것 일 수 있다.

상기 miRNA-34a 와 PLI의 결합 몰비가 1 : 0.04 이상 인것 일 수 있다.

상기 인지질 이중막은 페길화 된 것 일 수 있다.

본 발명자들은 체내 안정성이 향상된 유전자 전달체를 개발하고자 노력하여, 인지질 이중막 구조를 통해서 체내 안정성이 우수하면서도, PLI 고분자에 의하여 세포 유입시 전달 유전자의 세포질 내로의 방출 효율이 우수하여 유전자 전달 효율이 증가하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

다만, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

이하에서, 본 발명의 에 대하여 상세히 설명한다.

본 명세서에서 용어 "베지클(vesicle)"은 세포 밖 소포체 모사체 또는 리포좀을 의미하는 것으로, 폐쇠된 인지질 이중막을 형성하여 만들어지는 지질 운반체를 의미하고, 나노베지클은 상기 운반체가 나노사이즈, 약 1 내지 200 nm 수준의 지질 운반체를 의미한다. 상기 지질 이중막을 갖는 베지클은 생체 친화적이며, 양쪽 친매성을 가지고 있어 내부에 친수성 물질을 포함한 채로 소수성 막을 통과할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "인지질"은 특별한 다른 언급이 없는 한, 상기 베지클을 형성할 수 있는 인지질을 의미하며, 레시틴(포스파티딜 콜린), 포스파티딜 세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨 및 스핑고마이엘린을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 레시틴은 난, 대두 및 다른 식물들에서 얻을 수 있으며, 가장 바람직하게는 대두 레시틴이다. 본 발명에 이용될 수 있는 합성, 반합성 및 천연 레시틴은, 대두 레시틴, 디스테아로일포스파티딜콜린, 수첨 대두 레시틴, 난(egg) 레시틴, 디올레오일포스파티딜콜린, 수첨난 레시틴, 디엘라이도일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디미리스토일포스파티딜콜린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 용어 "봉입(encapsulation)"은 전달물질을 둘러싸서 효율적으로 생체내로 함입시키기 위해 캡슐화하는 것을 말한다.

본 명세서에서 용어, "세포 투과성(cell penetrating) "은 인 비트로 및/또는 인 비보 상에서 운반 대상을 세포 내로 운반할 수 있는 특성을 의미한다.

본 명세서에서 본 발명의 명세서에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발명의 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 타겟 유전자의 mRNA에 상보적이고 타겟 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고 타겟 유전자의 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내 40 염기이다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 올리고뉴클레오타이드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다.

용어 "앱타머(aptamer) "는 특정 타겟에 결합하는 올리고뉴클레오타이드(일반적으로, RNA 분자)를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 명세서에서의 “앱타머”는 올리고뉴클레오타이드 앱타머(예컨대, RNA aptamer)를 의미한다. 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142-727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

용어 "siRNA"란 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉-다운 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음)등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 가장 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기, 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 본 명세서에서 siRNA의 전장은, 중앙의 이중사슬 부분의 길이와 양 말단의 단일사슬 돌출을 구성하는 길이의 합으로 나타내었다. 또한, siRNA는 타겟 유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 siRNA는 타겟 유전자에 특이적으로 작동하도록 타겟 유전자 또는 타겟 뉴클레오타이드와 상보적인 서열을 포함 하는 안티센스 RNA 가닥을 가진다.

용어 "shRNA"는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드를 의미하며, in vivo상에서 스템-루프(stemloop) 구조를 이루고 있다. 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다.

용어 "miRNA(microRNA)"는 유전자 발현을 조절하며, 전장 21-23개의 뉴클레오타이드로 구성된 단일 가닥 RNA 분자를 의미한다. miRNA는 세포 내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오타이드이며, 짧은 스템-루프 구조를 가진다. miRNA는 1 또는 2이상의 mRNA(messenger RNA)와 전체 또는 부분적으로 상동성을 가지며, 상기 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제시킨다.

용어 "리보자임(ribozyme) "은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA이다. 리보자임은 타겟 전령 RNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 되어 있다.

용어 "DNAzyme"은 효소 활성을 가지는 단일 가닥 DNA 분자로, 10-23 뉴클레오타이드로 구성된 DNAzyme(10-23 DNAzyme)은 생리적으로 유사한 조건 하에서 RNA가닥을 특정위치에서 절단한다. 10-23 DNAzyme은 염기 쌍을 이루지 않고 노출된 어떠한 퓨린 및 피리미딘 사이를 절단한다. 10-23 DNA효소(DNAzyme)는 15개의 보존된 염기 서열(5'-GGCTAGCTACAACGA-3')로 이루어진 효소의 활성부위(catalytic domain) 및 상술한 효소의 활성부위 좌우로 RNA 기질을 인식하는 7-8개의 DNA 염기서열로 이루어진 기질인식 자리(RNA substrate binding domain)로 구성된다.

용어 "PNA(Peptide nucleic acid)"는 핵산과 단백질의 성질을 모두 가지고 있는 [0045] 분자로서, DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합이 가능한 분자를 의미한다. PNA는 핵산염기(nucleobase)가 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1999년에 처음 보고되었다(문헌 [Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O, "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide", Science 1991, Vol. 254: pp1497-1500]). PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 펩티드 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이며, 이 경우 펩티드 핵산의 기본골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산염기는 공간적 크기와 핵산염기 사이의 거리가 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다.

본 발명은, 뉴클레오타이드 분자 및 L-리신-g-이미다졸 중합체(Poly(L-lysine-graft-imidazole, PLI)를 포함하는 복합체; 및 상기 복합체를 내부에 봉입하고있는 인지질 이중막;을 포함하는 유전자 전달체를 제공한다.

상기 인지질 이중막은 페길환된 것일 수 있다. 상기 페길화는 인지질 이중막 형성 된 후 페길화를 거쳐서 PEG 분자가 인지질 이중막 표면에 결합한 것 일 수 있고, 디스테아로일포스포에탄올아민-메톡시폴리에틸렌글리콜(DSPE-mPEG)를 이용하여 형성된 인지질 일 수 있다.

상기 mPEG의 분자량은 2000 내지 5000 일 수 있다. 상기 페길화된 인지질 이중막을 포함하는 전달체의 경우, in vivo 환경에서 유전자 전달체의 안정성을 더욱 향상시킬 수 있고, 다중 이온성 유전자 전달체를 중성을 띄는 인지질 이중막으로 감싸, 세포 내에서 양이온에 의하여 유발되는 세포 독성 등을 더 낮출 수 있어, 유전자 치료의 효과를 증대시킬 수 있다.

상기 L-리신-g-이미다졸 중합체(Poly(L-lysine-graft-imidazole, PLI)는 양이온성 고분자로 하기 화학식 1로 표시된다.

[화학식 1]

상기 PLI는 폴리 리신에 이미다졸 잔기가 결합된 형태로, 다른 유전자 전달체로 사용될 수 있는 양이온성 고분자에 비하여 세포로의 트랜스펙션 효율이 우수하고, pH 4.0 내지 pH 6.0 범위 내에서 양성자 흡수 용량이 높아, 리소좀 pH 조건에서 효과적으로 miRNA를 세포질 내로 방출시킬 수 있어, 유전자 전달 효율이 우수함을 실험적으로 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 양이온성 고분자와 복합체를 형성하는 뉴클레오타이드 분자는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앱타머, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), DNAzyme 및 PNA로 이루어진 군에서 선택된 것이고, 바람직하게는 종양세포에 CD44의 발현에 억제능을 갖는 miRNA 일 수 있으며 그 종류에 한정되지 않고 본 발명에 이용될 수 있고, 일 예로 miRNA 34-a, miRNA-199a 및 miRNA-328로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있다. 본 발명의 PLI 고분자와 복합체를 형성하는 유전자 전달체의 경우, PLI가 pH 4.0 내지 pH 6.0 범위 내에서 양성자 흡수 용량이 높아 종양세포 환경에서 세포질 내로 상기 뉴클레오타이드 분자를 더욱 잘 방출시킬 수 있어, 유전자 전달체의 전달 효율을 높일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 분자 및 PLI의 결합 몰비가 1 : 0.01 내지 0.1일 수 있고, 바람직하게는 몰비 1 : 0.04 이상, 더욱 바람직하게는 몰비 1 : 0.04 내지 0.06 일 수 있다. 상기 몰비 범위 내에서 형성된 뉴클레오타이드 분자 및 PLI를 혼합체의 경우 miRNA과 PLI가 효과적으로 복합체를 이루고, 잉여 PLI 없이 복합체를 형성할 수 있어 경제적이고, 유전자 전달체의 순도도 높일 수 있음을 실험적으로 확인하였다.

상기 본 발명의 유전자 전달체는 나노 구조체 일 수 있고, 바람직하게는 평균입경 150 nm 내지 200 nm인 나노 구조체 일 수 있고, 구형일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 전달체 및 인지질 이중막 구조를 포함하지 않는 PLI와 전달 대상 유전자(폴리펩타이드 분자)의 결합체와 세포 투과효율 및 유전자 전달 효율을 확인해본 결과 PLI/폴리펩타이드 분자 복합체가 봉입된 인지질 이중막을 갖는 본 발명의 유전자 전달체가 체내 전달 효율 등이 더욱 우수함을 실험적으로 확인하였다. 이는 in vivo 환경에서 전달 대상을 보호함으로써 폴리텝타이드의 손실 등이 저하되었기 때문이다.

또한, 본 발명은 유전자 전달체 제조방법을 제공한다.

본 발명의 유전자 전달체 제조방법은 뉴클레오타이드 분자 및 양이온성 고분자인 (L-리신-g-이미다졸) 중합체를 포함하는 복합체를 형성하는 단계; 인지질, 포스패틸콜린(PC) 및 디스테아로일포스포에탄올아민-메톡시폴리에틸렌글리콜(DSPE-mPEG)을 혼합하여 지질 필름을 제조하는 단계: 및 상기 복합체 및 제조된 지질 필름을 혼합 및 압출하여 내부에 복합체가 봉입된 지질막 나노 베지클을 얻는 단계;를 포함한다.

본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 유전자 전달체를 제조하기 위한 공정이기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

상기 복합체는 양이온성 고분자와 전달 대상인 뉴클레오티드 분자(음이온성)의 전기적 상호작용에 의하여 안정한 복합체가 형성될 수 있고, 완충용액 하에서 형성될 수 있다.

상기 복합체 형성단계는 뉴클레오 타이드 분자 및 양이온성 고분자를 몰비가 1 : 0.01 이상, 바람직하게는 몰비 1 : 0.04 이상, 더욱 바람직하게는 몰비 1 : 0.05 내지 0.07 로 혼합하여 형성 할 수 있다. 상기 몰비 범위에서 복합체를 형성하는 경우 최소의 양으로 생체 내 전달에 적합한 크기를 형성할 수 있어, 유전자 전달체 제조 시 복합체 형성 효율을 높일 수 있다.

상기 지질 필름 제조단계는 PC 대 DSPE-mPEG 는 몰비 1 : 0.05 내지 0.20, PC 대 콜레스테롤은 몰비 1: 0.35 내지 0.5로 혼합하는 것 일 수 있다. 상기 몰비로 지질 필름을 제조하는 경우 제조된 나노입자의 생체 내 안정성을 높이는 효과가 있어, 지질 필름을 효과적으로 형성시킬 수 있고, 상기 복합체의 봉입 시에도 효과적이다.

상기 지질 필름은 20 시간 내지 48시간 동안 수화되는 단계를 더 거칠 수 있다.

상기 지질 필름은 형성 된 후 페길화 될 수 있고, 바람직하게는 페길화된 인지질을 함께 혼합하여 지질필름을 제조하는 방법으로 페길화 할 수 있다.

상기 나노 베지클을 얻는 단계는 상기 복합체 및 제조된 지질 필름을 혼합 및 압출하여 내부에 복합체가 봉입된 지질막을 갖는 나노 베지클을 형시킨다. 상기 압출 성형은 예를 들어 고압균질기(high pressure homogenizer), 음파발생기(sonicator), 미소유동기(microfluidizer), 압출기(extrusion apparatus) 또는 프렌치 프레스(French press)를 이용하여 실시하며, 보다 바람직하게는 음파발생기(sonicator) 및 압출기(extrusion apparatus)를 이용하여 실시할 수 있다.

상기 얻어진 나노 베지클은 완충액에서 정재하는 단계를 더 거칠 수 있고, 이 경우 미결합된 miRNA를 제거할 수 있어, 유전자 전달 효율을 더욱 높일 수 있다.

본 발명에 의하여 제조된 유전자 전달체는 평균입경 150 nm 내지 200 nm 일 수 있고, 바람직하게는 180 nm 내지 190 nm 일 수 있다.

또한, 본 발명은 항암용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 유전자 전달체를 포함하는 유전자 치료제를 제공한다.

상기 항암용 조성물은 miRNA-34a 및 (L-리신-g-이미다졸) 중합체(Poly(L-lysine-graft-imidazole, PLI)를 포함하는 복합체; 및 상기 복합체를 내부에 봉입하고 있는 인지질 이중막;을 포함한다.

본 발명의 일 실시예서, 형광 표지자를 이용하여 유전자 전달체의 전달 효율을 확인한 결과, 상기 형광 표지자가 종양 세포로 이동 및 축적되는 것을 실험적으로 확인 하였고, 또한 체내 두여 이후, 일정 시간이 지난 후에는 유전자 전달체와 miRNA가 다른 위치에서 발견되는 것을 형광표지를 이용하여 확인하였는바, 세포 내 전달 및 세포 환경 내에서 miRNA의 세포질내로 방출하는 유전자 전달 효율이 매우 우수한 것을 확인하였다.

또한, 상기 전달 된 miRNA-34a에 의한 종양세포 내에서 CD44의 발현 억제 정도를 확인한 결과, 인지질 이중막을 갖지 않은 유전자 전달체보다 더 우수한 발현 억제 효과를 나타냄을 실험적으로 확인하였다.

본 발명의 조성물에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 질병은 암이고, 바람직하게는 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암이다.

본 발명의 항암제 조성물에는 다른 항암효과를 갖는 약물을 비롯한 유효성분이 함께 포함될 수 있다.

락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이고, 비경구 투여 인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 제조예 및 실험예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1] 재료와 방법

1-1. 세포주와 동물의 준비

American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA) 에서 얻은 인간 위암 세포주 MKN-74 는 10%의 소 태아 혈청과 1%의 항생제를 포함하는 RPMI 1640 배지(Gibco®, Life Technologies, NY, USA)에서 배양되었고, 37 ℃, 5%의 CO₂를 함유한 가습 된 공기에서 배양되었다. MKN-74 세포의 줄기세포성은 Takaishi 등이 평가했다.

오리엔트 바이오 사에서 수컷 BALB/c 누드 마우스(4주 령, 체중 20-24g)를 구매했다. 모든 동물 실험은 연세대학교 보건 시스템의 동물실험윤리위원회의 허가를 받아 수행했다.

1-2. 화합물 및 시료의 준비

Nε-카르보벤질옥시-L-리신(LysZ), 헥실라민, 트리플루오로아세트 산(TFA), 하이드로브로민 산용액(아세트산33 wt%)(HBr/AcOH), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염(EDC), 무수상태N'N-디메틸포름아미드(DMF), 및 술폭시화디메틸(DMSO)를 Sigma-Aldrich(USA)에서 구매했다. Tokyo Chemical Industry(일본 도쿄)에서 Triphosgene과 이미다졸-4(5)-아세트산 염산염을 구매했다. 대정화금(한국 시흥)에서1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트(HOBt)를 구매했다. L-α-포스파티딜콜린(PC), β-콜레스탄올(Chol), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DSPE-mPEG)와 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DSPE-PEG 아민)과 같은 액체는 모두 Avanti Polar Lipids에서 구매했다(USA). Cy5.5 NHS에스테르는 Lumiprobe(USA)에서 구매했다. AccuTargetTM Human miR-34a mimic(miR-34a, sequence: has-miR-34a-5p 5'-UGG CAG UGU CUU AGC UGG UUG U-3'), AccuTarget^TM miRNA mimic Negative Control #1(miR-nc), 그리고 AccuTargetTM Fluorescein-labeled miR-nc을 포함한 모든 합성 miRNAs은 바이오니르(한국 대전)에서 구매했다. 실시간 qRT-PCR 분석에 사용된 프라이머들은 바이오니르와 Qiagen에서 구매했다. 그 외 다른 화합물 및 시약은 분석등급이었으며 주문하여 사용했다.

1-3. 폴리(L-리신- g -이미다졸)(PLI)의 합성

Nε-카르보벤질옥시-L-리신의 N-carboxyanhydrides는 Triphosgene3을 이용한 Fuchs-Farthing 방법으로 합성시켰다. Nε-카르보벤질옥시-L-리신은 분자비 40:1에서 헥실라민에 의해 시작된 무수상태 DMF로 중합되었다. 그 후 poly(Nε-카르보벤질옥시-L-리신)의 카르보벤질옥시(Z) 그룹들은 폴리(L-리신)(PL) 동종중합체를 얻기 위해 TFA와 HBr/AcOH(7:1 v/v) 혼합제와 함께 폴리(Nε-카르보벤질옥시-L-리신)그룹의 카르보벤질옥시(Z) 그룹들에서 제외되었다. PL의 ε-아민은 EDC/HOBt 커플링 방법(57)을 이용하여 이미다졸-4(5)-아세틱 산(카르복실산 대 ε-아민의 분자비 = 0.5)과 결합했다. 이 결과로 얻은 PLI은 과도한 교차연계자를 제거하기 위해 초순수물로 여막분석을 통해 한층 더 순수화한 뒤, 동결건조하고 사용할 때까지 -20℃로 보관시켰다. PL 동종중합체의 혼합 정도와 PLI의 이미다졸 대체물의 정도는 1H NMR에서 드러난 대로 각각 PL마다 35와 14 였다.

[ 실시예 2] PLI / miR 복합체를 포함하는 나노소포체의 제작과 특성( NVs - miR )

TE 완충액(10 mM Tris, 1.0 mM EDTA, pH 8.0)에서 음성대조군(miR-nc) 10 μM과 폴리(L-라이신-그라프트-이미다졸)(poly(L-lysine-graft-imidazole, PLI) 원액(1.0 μM)을 이용하여 PLI/miR 폴리플렉스를 형성하였다. miR-nc의 고정량(20 pmol)을 PLI 용액과 몰비 0에서 0.1 범위에서 혼합, 간단하게 볼텍스(vortex) 하였고, 실온에 15분동안 배양하였다. PLI의 miRNA 응축 능력을 측정하기 위해서, 준비된 폴리플렉스를 3% 아가로스겔에 올리고 100 V에서 40분 동안 트리스 붕산염 EDTA(TBE) 완충액(89 mM 트리스, 89 Mm 붕산, 2 mM EDTA, pH 8.0)하에서 전기 영동 하였다. dsRNA ladder(New England BioLabs, USA)를 miRNA 크기 표지자로 사용하였다. 겔은 SYBR® Green II RNA Gel Stain(Molecular Probes®, Life Technologies)으로 염색되었으며, Typhoon^TM FLA 7000(GE Healthcare, Pittsburgh, USA)에 의해 시각화 되었다.

PLI/miR 복합체를 가지는 나노소포체(NVs-miR)를 만들기 위해서 두 개의 지질 포스패틸콜린(PC) 및 DSPE-mPEG 그리고 콜레스테롤을 클로로포름 하에서 2:0.15:1의 몰 비로 혼합하였고, 용매를 지시 질소 기류(directed nitrogen stream)로 완전하게 제거하였다. 둥근 바닥 플라스크의 안쪽 표면에 형성된 얇은 지질 필름은 TE 완충액 하에서 미리 만들어진 PLI/miR용액(miR 대비 PLI의 몰비= 0.06)을 이용하여 4 ℃에서 하룻밤 동안 완전히 수화되었다. 한 시간 동안 부드럽게 자기 교반 한 후, 생성된 다중 층 소포(multilamellar vesicle)는 Avanti® Mini-Extruder(미니 압출기)를 이용하여100 nm의 폴리 카보네이트 막을 통해 10 회 압출되었다. 그 결과로 만들어진 나노소포체를 QuixSep® Micro Dialyzer(molecular weight cut-off, MWCO: 25 kDa, Membrane Filtration Products, Inc, TX, USA)에 놓고, 유리 miRNA를 제거하기 위해 하루 동안 TE 완충액 투석을 했다. 그 결과 얻어진 NVs-miR는 사용하기 전까지 4℃에서 보관되었다.

NVs-miR를 형광 표지하기 위해, DSPE-PEG Amine과 PLI와 결합된 형광 표지된 miRNA(FL-miR)를 각각 지질 혼합물 및 완충용액에 첨가한 것을 제외하고는 상기와 같은 과정으로 소포체를 제조하였다. PLI/FL-miR복합물을 포함하는 NVs((NVs-FL-miR)가 형성된 이후, TE 완충액을 10 mM HEPES 완충액(pH 7.5)으로 변경하였다. Cy5.5 NHS에스테르(DMSO내 1 mg/mL)는 안정적인 아미드 결합을 만들기 위해 DSPE-PEG Amine의 표면 아민 그룹과 연결되었다. 만들어진 결과물은 소포체 밖에 있는Cy5.5 분자를 제거하기 위해서 QuixSep® Micro Dialyzer(MWCO: 25 kDa)로 한번 더 정제하였다.

준비된 폴리플렉스(PLI/miR)와 소포체(miR만을 포함하는 지질소포체, NVs-miR)의 평균 크기와 제타 전위가 동적 레이저 산란(일본 오사카 Otsuka Electronics, ELS-Z)에 의해 분석되었다. 가속 전압 200 kV에서 투과형 전자 현미경(일본 도쿄 JEOL Ltd, JEM-2100 LAB6, TEM )으로 형태를 관찰하였다. 시료 용액의 3 ㎕를 Formvar 필름으로 피복된 TEM 구리 격자판 위에 놓고, NVs와 NVs-miR는 3%의 포스포텅스텐산으로(w/v) 염색되었다.

[ 실시예 3] 시험관내 트랜스펙션과 역전사 중합효소 양적연쇄반응 ( qRT - PCR )

MKN-74 세포에서 CD44 mRNA와 성숙한 miR-34a의 발현 변화를 확인하기 위해, 실시간 qRT-PCR 분석을 시험실 내부표준에 맞춰 수행했다. 10% FBS 가 첨가된 배양액이2 mL씩 들어있는 6개의 well-plate에 MKN-74 세포(3×10⁵cell/well)를 분주(seeding)하고, 37 ℃에서 하룻밤 배양기하였다. 배양배지를 무혈청 배지로 바꾸고 miR-34a 또는 miR-nc(60 pmol)를 포함하는 NVs-miR와 PLI/miR 100 ㎕를 각 well에 첨가하였다. 8시간 배양 후에, 배양배지를 10 % FBS와 1 % 항생제가 첨가된 새 배지2 mL로 바꾼 후 37 ℃에서 48시간 더 배양했다. 양성 대조군으로, MKN-74 세포를 miR-34a 또는 miR-nc로 트랜스펙션 하였고, 상기 트랜스펙션은 Lipofectamine^® RNAiMax(InvitrogenTM, Life technologies)을 사용하였다(제조사의 추천방법을 따랐다). 트랜스펙션하지 않은 세포(Non-treated cell)와 miR-nc로 트랜스펙션한 세포(PLI와 Lipo로 전달)들을 음성대조군으로 사용되었다. 트랜스펙션 후 48시간이 지나서 세포들을 수확하고 제조사의 사용방법에 따라 RNeasy® Plus Mini Kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 세포에서 전체RNA를 분리하였다.

성숙한 miR-34a(miR-34a-5p)와 miR-34a*(miR-34a-3p)의 발현의 측정을 위해, miScript II RT Kit(QIAGEN)를 이용하여 전체 RNA(1 ㎍ )을 상보성 DNA(cDNA)로 역전사 시켰다. 실시간 PCR은 miScript SYBR Green PCR Kit와 miScript Primer Assay(QIAGEN)를 이용하여 실시간 PCR 시스템(LightCycler® 480 System, R℃he)에서 실행했다. PCR 조건은 다음과 같았다. 초기활성은 95에서 15분, 증폭은 40주기로 94에서 15초, 55에서 30초 그리고 70에서 30초이다. 각 시료는 3번씩 수행되었다. 성숙한 miR-34a와miR-34a* 의 상대적 발현들은 작은 핵소체 RNA(miScript PCR Controls, QIAGEN) 로 표준화, 트랜스펙션시키지 않은 세포들과 비교, 그리고 Ct 방법으로 계산되었다.

CD44발현의 정량화를 위해, High Capacity RNA-to-cDNA kit(Applied Biosystems®, Life Technologies)를 이용하여 전체RNA(2 ㎍)을 cDNA로 역전사시켰다. 역전사된 cDNA는 PCR로 증폭했는데, 실시간 PCR시스템에서 QuantiMix SYBR Kit(PhileKorea Technology, 한국)로 수행했다. 프라이머 순서는 다음과 같았다. CD44, Forward 5'-CCT CTT GGC CTT GGC TTT G-3'와 Reverse 5'-TCC ATT GCC ACT GTT GAT CA-3'; β-actin, Forward 5'-CAC CTT CAC CGT TCC AGT TT-3'와 Reverse 5'-TGC GTT ACA CCC TTT CTT GA-3'; GAPDH, Forward 5'- GCT CTC TGC TCC TCC TGT TC-3'와 Reverse 5'- TGA CTC CGA CCT TCA CCT TC-3'.

PCR 조건은 다음과 같았다. 초기 변성은 95에서 5분, 증폭은 45주기로 95에서10초, 60에서 10초 그리고 72에서 10초, 그리고 마지막은 4에서 30초 냉각시켰다. 각 시료는 3개씩 실행되었다. CD44 mRNA의 상대적 발현은 세포 내 내생적인 기준 유전자들(β-actin와 GAPDH) 로 표준화시키고, 트랜스펙션 시키지 않은 세포들과 비교하여, 그리고 Ct 방법으로 계산되었다.

[ 실시예 4] 웨스턴 블랏 분석

면역블랏법을 이용하여MKN-74 세포 내의 NVs-miR에 의한 세포 내재 단백질 발현을 확인했다. 간단하게 설명하면, 세포들은 트랜스펙션48시간 후에 수확되어 프로테아제 억제제(cOmplete Mini, R℃he)가 함유된 차가운 RIPA 버퍼(Pierce®, Thermo Scientific, USA)에서 용해되었다. 용해물을 4℃에서 15분 동안 배양한 뒤, 13,000 rpm 으로 15분간 원심분리 하였다. 상층액의 단백질 농도는 BCA Protein Assay Kit(Pierce®)를 이용하여 결정됐다. 동일한 양의 단백질(5.5 ㎍)을 SDS 폴리아크릴아미드겔에서 전기영동을 실시한 뒤, 나이트로섬유소막(AmershamTM Hybond ECL, GE Healthcare)으로 옮겼다. 블랏된 막들은 CD44(156-3C11, Cell Signaling Technology, U.S.), Snail(L70G2, Cell Signaling Technology)과 tubulin(Sigma Aldrich)을 표적하는 항체들과 면역반응을 가졌다. 제조자의 프로토콜에 따라 표준 강화 ECL(Pierce® ECL Plus Western Blotting Substrate) 로 그 신호들을 시각화했다.

[ 실시예 5] NVs - miR의 세포 내 흡수

세포 내 추적 연구를 위해, 다중양이온의PLI와 결합된 형광-표지된 miR(FL-miR)는 소낭에 담겼고, 근적외선(NIR) 형광표지(Cy5.5)로 표지되었다. MKN-74 세포들을 35-mm μ-디쉬(Ibidi, Madison, WI, USA)에 디쉬 하나당 2 × 10⁵ 세포 밀집도로 분주하고 37℃ 로 하룻밤 배양했다. 세포를 PBS(10 mM, pH 7.4)로 두 번 세척하고, 100 nM Cy5.5-표지된 NVs-FL-miR(Cy5.5-NVs-FL-miR)와 함께 결정된 시간 간격(4시간, 24시간)동안 배양했다. 세포 내 소기관의 위치(리소좀 내부의 구획들)를 확인하기 위해, 세포를 PBS로 두 번 세척하고, 37℃에서 2시간동안 세포질 내 리소좀을 50 nM LysoTracker® Blue DNA-22(Molecular Probes®)로 착색시켰다. 그 다음 세포들을 PBS로 세척하고 4% 포름알데히드로 고정했다. LysoTracker® Blue, 형광물질(Fluorescein)과Cy5.5 각각에 대해서 405 nm, 488 nm, 과639 nm의 흥분파장에서63배 담금대물렌즈가 부착된 공초점 레이저 주사현미경(LSM700, Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 세포를 관찰했다.

[ 실시예 6] In vivo NIR 이미징

마우스 모델에서 NVs-miR의 실시간 바이오디스트리뷰션 확인을 위해, 위암 이종이식 동소모델(orthotopic gastric cancer xenograft model)은 마취상태(Zoletil/Rompun의 3:1 혼합)의 수컷 BALB/c-누드 마우스들에 1 mL 일회용 인슐린주사기(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA )로 노출시킨 위의 점막밑층에 MKN-74 세포(동물당 50 ㎕ PBS에 1 × 10⁷ cell이 현탁된 상태)를 주사하여 만들었다. 그리고 마우스들의 위를 복강으로 다시 돌려 놓고 복부 절개부위는 외과 수술 봉합했다. 6주 동안 종양을 성장시켰고, in vivo MRI 촬영으로 확인했다.

eXplore Optix 시스템(ART, Advanced Research Technologies, Montreal, Canada)을 이용하여 NIR형광단층이미지를 획득했다. Cy5.5-NVs-FL-miR 주입 후 6시간 동안 촬영을 실행했고, Analysis Workstation(ART, Advanced Research Technologies)으로 촬영이미지를 평가했다. 마우스 꼬리정맥으로 Cy5.5-NVs-FL-miR를 주입한 뒤, eXplore Optix 시스템에서 37℃ 로 예열된 동물 플레이트 위에 마우스들을 위치하여 MKN-74 마우스들에서 종양이 형성되는 것의 형광프로파일을 촬영했다. 마우스는 스캐닝을 위해 이미징 챔버로 자동 이동되었다. 레이저 파워와 통합시간은 포인트 당 각각 3.0 μW와 0.4초로 최적화시켰다. 방출 파장을 스캔하고자 관심 지역이상의 영역에서부터 1 mm 마다 흥분점과 방출점을 래스터-스캔하였다. Cy5.5 형광단을 흥분시키기 위해 A 670-nm 펄스형 레이저다이오드(PLD)를 이용했고, 690 nm에서 NIR 형광 방출을 고속 광전자증배관(fast photomultiplier tube, Hamamatsu, Japan)을 이용하여 수집했다. In vivo 종양 분포는 선결정된 시간 간격(주사 후, 선-주입 0, 3, 6시간)에서 선 주입에서 획득한 광자에 대해 표준화된 광자로 정량화시켰다.

[ 실시예 7] 체외 광학 이미지

FL-miR, PLI/FL-miR, 과 NVs-FL-miR 주입하고 6시간 후에, 마우스들은 희생되고, 선별된 장기들(간, 위, 뇌, 폐, 신장, 비장, 심장 및 근육)을 적출 한 후, eXplore Optix 시스템으로 관찰했다. 더 정확한 나노입자 위치를 확인하기 위해, 적출한 종양시편을 동결 절편화하고, 핵을 확인하기 위해 Hoechst 33342(Invitrogen, 1 ㎍/mL)로 대조염색을 한 뒤, LSM700 공초점레이저현미경을 이용하여 관찰했다. 종양 부위도 헤마톡실린-에오신(H&E)으로 염색한 뒤 버츄얼 마이크로스코프(Olympus BX51, Japan)과 OlyVIA® 소프트웨어로 관찰했다.

[ 실시예 8] NVs - miR의 체내 CD44 억제효능

MKN-74 원발성 위암 모델을 준비하여, miR-34a, PLI/miR-34a와 NVs-miR-34a 를2주 동안 체계적으로 투여했다(그룹 당 N=5, 주당 처치 회수: 3, 투여 당 1 μmole의 miR-34a). 2주 후, 마우스들은 희생되었고, 위를 적출하였다. 파라핀 안의 종양 부위는 헤마톡실린-에오신(H&E)으로 염색되었고, 종양의 동결 절편은 Hoechst 33342와 PE Mouse anti-Human CD44(BD PharmingenTM, 550989)로 대조염색이 됐다. NVs-miR-34a 로 처리한MKN-74 세포들의CD44 저발현을 평가하는 절차는 액체질소에서 적출 조직을 부순 것을 제외하면 체외 면역 블랏법과 동일하다.

[ 실시예 9] 통계 분석

데이터 통계는 분산 분석(Student's t-test)을 이용하여 평가했다. 0.001미만의 p-value는 통계적으로 유의 하다고 판단됐다.

[ 제조예 1] 폴리 L-리신-접합-이미다졸( PLI )의 합성

나노소포체 내의 miR 페이로드를 싣고, 낮은 pH의 엔도좀과 리포좀을 삼투적으로 혼란 시키기 위한 포획된 PLI/miR 복합체를 추적하기 위해서, 축합제로 폴리(L-리신)(PL)이 합성되고 pH완충을 위해 이미다졸아세틱산 잔기(imidazoleacetic acid residues)로 변형되었다. PL은 Nε-카보벤질옥시-L-리신 N-카복시하이드라이드(Nε-carbobenzyloxy-L-lysine N-carboxyanhydride, LysZNCA)의 개환중합(ring-opening polymerization)을 통해서 준비하였다. 폴리(Nε-카보벤질옥시-L-리신)의 카보벤질옥시(Z) 그룹은 탈보호 되었다(도 2). 이어서, 이미다졸 부분(imidazole moiety)은 PLI를 생산하기 위한 EDC/HOBt 화학을 이용하여 몰비 0.5(카복실 산을 ε-아민으로)에서 PL로 그래프트 되었다. PLI는 7.5ppm에서 양성자 피크 영역에 의해 결정되는 융합 효율이 80% 였다. PLI의 FT-IR과 ¹H-NMR 스펙트럼은 도 3에 나타나 있다. pH 6 이하에서 이미다졸 40%의 양성자 흡수 용량을 가진 PLI를 드러내는 기존의 산 염기 적정을 사용하여 PL과 PLI의 중화 완충용량을 측정하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도4에 나타낸 바와 같이, PL과 비교해서, PLI의 pH 완충용량이 우수한바, in vivo 환경에서 miR를 세포질로 전달하는 효과가 PL을 전달용 고분자로 이용한 경우보다, PLI를 이용한 경우가 더욱 우수하다는 것을 확인 하였다.

[ 실험예 2] PLI / miR복합체(NVs-miR)를 포함하는 나노소포체의 제작 및 특징

PLI와 함께 miR를 충분히 응축하기 위해서, 정전기 상호작용을 통해 10 mM HEPES 완충액(pH 8.0)에서 형성된 다양한 몰비의PLI/miR 복합체를 miR에 대한 PLI의 몰비(0.01 ~ 0.1)에서 겔 전기영동을 통해 조사하였다(도 5의 A). miR 방해는 0.04 몰비에서 사라졌고, 최적의 몰비는 0.06이었으며, 이후 부터는 PLI/miR 복합체의 제조 시 miR : PLI = 1 : 0.06 몰비로 하였다. 실시예 2에서 설명한 수화법과 압출법을 사용해서 PLI/miR 복합체를 포함하는 나노소포체(NVs-miR)를 제조하였다.

체내 전달을 위한 NVs-miR의 적합성을 확인하기 위해서, NVs-miR의 유체 역학적 크기와 표면 전하를 동적 광 산란을 통해서 측정했다. NVs-miR의 평균 크기는 186.7 nm 이고, 다분산지수(PDI)가 1.12였으며, 이는 PLI/miR이 없는 나노소포체(NVs)(144.3 nm; PDI, 1.12) 보다 약간 컸다. NVs-miR는 또한 PLI/miR의 양전하를 중화하는 지질층 때문에 PLI/miR복합체(21.6 ± 1.1 mV)(도 5B와 5C)와 비교했을 때 낮은 표면 전하인 6.8 ± 2.5 mV을 가지고 있었다. 낮은 표면 전하는 PLI/miR의 탈착물화를 일으키고 생체거대분자와의 비특이적 전하 상호작용과 그 결과 표적에 도달하기 전에 miR의 손실을 감소시킬 것이다.

PLI/miR, NVs그리고 NVs-miR의 형태적 특성은 투과전자현미경(TEM)을 통해서 관찰되었으며, PLI/miR이 거의 구형임이 관찰되었고, NVs와 NVs-miR는 지질 2중층의 소포구조를 가지고 있음이 관찰되었다(도 5D). 이러한 결과는NVs-miR이 miR을 전달할 잠재력이 있음을 확인시켜주었다.

[ 실험예 3] NVs - miR의 생체 내 전달과 세포 간 위치선정

폴리머 나노운반체가 임상적으로 사용될 수 있을지 결정하기 위해서, 높은 전하 밀도가 세포막을 심각하게 파괴할 수 있으므로, 나노 운반체의 세포독성을 확인하였다.

NVs-miR의 세포 독성을 측정하기 위해서, PLI 농도 20 ~ 0.1 nM 사이에서 MKN-74세포를 NVs-miR, PLI/miR 및 PLI로 37 ℃, 24시간 동안 처리하였다. 세포 생존율은 MTT 분석을 사용하여 평가하였다.

도 6A에 나타낸 바와 같이, 동일한 PLI 농도(2.5 nM)에서 PLI/miR(51.1%) 또는 PLI(31.2%)로 처리한 세포 보다, NVs-miR로 처리한 MKN-74 세포가 72.1%의 높은 세포 생존율을 보였다. 이러한 결과는 생체 적합한 지질 2중층으로 설명할 수 있고, 이러한 지질 이중층은 PLI/miR 와 세포막의 물리적 상호작용과 막 보전을 교란하는 것을 막는다. 또한, 이러한 낮은 세포 독성은 NVs-miR과 PLI/miR의 제타 전위에 의해서도 설명 가능하다. 이러한 경향은 유리(free) PLI 또는 PLI/miR의 세포 생존율의 차이에 적용될 수 있으며, miR의 인산염 축(phosphate backbones)은 PLI의 자유 아민(free amine)을 중화하고 세포 독성을 감소시킨다.

NVs-miR의 전달 능력을 시험하기 위해, NVs-miR-34a로 처리된 MKN-74 세포 내 성숙 miR-34a의 비교 발현을 확인 하였고, 대조군(control group)으로 miR-34a 단독 및 PLI/miR-34a, 그리고 양성대조군으로 리포펙타민/miR-34a 복합체(Lipofectamine/miR-34a complex)룰 사용하였다. PLI/miR, NVs-miR, 및 Lipofectamine/miR를 포함하는 miR-34a 조절에 기반을 둔 전달 운반체는 miR-34a 단독으로 처리한 군보다 세포 내 miR-34a의 발현이 50배- 60배 더 증가하였다((도 6B). 해당 표적 miR의 증가된 발현은 miR-nc(negative control miRNA mimic)의 운반체 기반 전달과의 비교에서도 유효했다. NVs-miR-34a처리군 에서는 PLI/miR-34a 및 Lipofectamine/miR-34a 보다 약간 낮은 발현을 보였는데, 이는 나노소포체로 감싼 형태가 PLI의 세포막과의 전하 상호작용을 낮추고, PLI 및 Lipofectamine처리군과 비교했을 때 세포독성을 낮춘다는 것을 의미한다(도 6A). 게다가, NVs-miR-34a는 miR-34a 전구체의 3번 가지(arm)로부터 얻어지는 miR-34a*의 발현에 영향을 미치지 않았는데, 이러한 결과는 NVs-miR가 miR-34a를 표적 세포에 성공적으로 전달하여, 내부 성숙miR-34a 수준에 크게 영향을 미쳤다는 것을 의미한다.

NVs-miR로부터 miR의 엔도좀 탈출을 확인하기 위해서, 우리는 LysoTracker® Blue로 염색된 MKN-74세포 내에서 형광물질-결합된 miR를 포함하는 Cy5.5-표지된 NVs(Cy5.5-NVs-FL-miR)를 이용하여 세포 내 추적 연구를 실시했다(도 7A 및 7B).

4시간의 배양 후, Cy5.5 표지 NVs(붉은색)과 FL-miR(녹색)가 MKN-74세포의 세포질에 분명히 존재했고, 흰색 점(도 7A의 두 번째 패널) 및 노란색 점(도 7A의 세 번째 패널)들과 함께 위치해있었다. 그러나 24시간의 배양 후에는, miR의 녹색 형광은 NVs 또는 리소좀과 함께 위치하는 것 대신 자율적으로 분산되는 것이 확인되었고, 이는 miR의 NVs-매개 엔도좀/리소좀 탈출이 성공적이었음을 의미하며, 나아가 전달된 miR에 의한 표적 mRNA의 전사를 조절할 수 있음을 나타낸다.

[ 실험예 4] NVs - miR의 in vitro CD44 억제효과 확인

NVs-miR-34a로 처리된 MKN-74 세포에서의 단백질과 CD44 mRNA의 발면 변화를 확인하기 위하여, 역전사 중합효소 양적연쇄반응(qRT-PCR) 및 웨스턴 블랏을 실시하였다.

도 8A에 나타낸 바와 같이, miR-34a 만으로 트랜스펙트 한 경우와 비교해서, PLI, NVs 및 Lipofectamine을 이용한 MKN-74 세포로의 운반체 기반 miR-34a의 전달은 CD44 mRNA 발현을 크게 감소(각각 82%, 58%, 75%) 시켰다(도 8A). 운반체 만으로 또는 miR-nc를 포함하는 운반체와 같은 음성 대조군(negative control)으로 처리된 MKN-74 세포 내에서는 CD44 mRNA의 발현이 거의 변화하지 않았다. 각각의 PLI-, NVs- 및 Lipofectamine- 기반의 miR-34a 트랜스펙션은 miR-nc(도 8B)와 비교했을 때 82%, 85% 및61%까지 지속적으로 그리고 상당히 CD44 단백질 발현을 하향 조절했다. PLI를 포함하는 NVs-miR-34a에 의한 CD44의 억제 효과가 다른 운반체와 비교해서 가장 효과적이었다. 비록 이 결과들이 PLI 폴리플렉스(도 6B)와 비교하면 전달 효율이 약간 낮았음에도 불구하고, NVs-miR-34a 운반은 MKN-74 세포에서 CD44 단백질 발현을 비슷하게 억제했다.

[ 실험예 5] NVs - miR의 in vivo 전달

정맥 내 주사된 NVs-miR가 MKN-74 위암 이종 이식 동소모델(MKN-74 gastric orthotopic xenograft model)에서 원하는 암세포에 도달하는지 시험하기 위해, 우리는 위에서 NIR 광학 이미징 기술을 이용하여 형광-결합된 miR을 포함하는 Cy5.5-표지된 NVs(Cy5.5-NVs-FL-miR)의 실시간 축적을 측정했다. Cy5.5-NVs-FL-miR(5 nmol)을 정맥 주입한 후 6시간 동안 종양에서 방출되는 신호를 이용해서 위의 형광 이미지를 시간 의존적으로 측정하고, 도 9A에 나타내었고, 주입 이전 수준까지 정상화 된 종양으로부터 나오는 양자는 도 9B에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 거의 80 %의 Cy5.5-NVs-FL-miR가 측정 1시간 이내에 축적되는 것을 확인하였다. 6시간 이후에, NVs-miR의 종양 특이적 전달은 장기(간, 위, 뇌, 폐, 신장, 비장, 심장, 근육) 적출 이후에 즉각적으로 ex vivo 형광 신호에 의하여 확인되었다.

도 9C에 나타낸 바와 같이, NVs-miR는 주로 위의 종양에 축적되었다. 이러한 NVs-miR의 뚜렷한 종양 축적(retention)은 나노 크기 에 의하여 향상된 투과성 및 축적(enhanced permeability and retention, EPR)에 유리하기 때문이다.

종양 조직에서 NVs-miR의 위치(localization)에 대해 더 시험하기 위해서, 적출된 위를 동결 절편화 하고, 공초점 현미경으로 시각화 하였다(도 10). 이렇게, NVs-miR의 향상된 in vivo전달과 결과적으로 종양에서 miR 축적을 확인하기 위해, FL-miR, PLI/FL-miR 및 NVs-FL-miR와 함께 정맥투여 된 MKN-74 세포를 가진 마우스(mice)에서 종양을 적출하였다(도 10).

도 10에 나타낸 바와 같이, 녹색 반점들은 FL-miR(도 10A)또는 PLI/FL-miR(도 10B)를 주입했을 때보다 NVs-FL-miR(도 10C)를 주입했을 때 miR 축적이 종양 내에서 치밀 하다는 것을 보여준다. 따라서 NVs-miR를 사용한 miR 전달은 in vivo 환경에서 PLI/miR 복합체를 보호하는 효과가 있어, miR의 손실을 피함으로써, 표적 암세포로의 miR 전달을 향상시켰다.

[ 실험예 6] NVs - miR의 in vivo CD44 억제효과 확인

NVs-miR-34a가 MKN-74 위 동소 마우스 모델(gastric orthotopic mouse model)에서 항 CD44 효능이 있는지 여부를 확인하기 위해서, 2주 동안(3회 처리/주) miR-34a, PLI/miR-34a 및 NVs-miR-34a을 체계적으로 투여한 이후 조직학적 면역염색법과 웨스턴 블랏을 이용하여 적출된 종양에서 CD44 발현을 분석했다.

도 11에 나타낸 바와 같이, PE-표지된 항-인간 CD44 항체를 이용한 적출된 위의 조직학적 면역염색 결과, miR-34a 만 투여된 마우스의 종양 조직에서 CD44가 많은 결과를 나타냈다. 이와 대조적으로, NVs-miR-34a로 처리된 처리군에서는 CD44 발현이 눈의 띄게 억제됨을 확인 하였다(도 11A-C).

면역염색법 결과와 일치하여, 웨스턴 블랏 결과는 NVs-miR-34a로 처리된 마우스의 CD44 단백질 발현이 miR-34a 만으로 또는 PLI/miR-34a로만 처리한 마우스의 발현 보다 62%까지 크게 줄어들었음을 보여주었다. (도 11D) 이러한 결과는 NVs-miR-34a을 이용한 체계적 전달을 통해서 CD44 과발현 종양이식 마우스에서 CD44를 효과적으로 억제했다는 것을 의미한다.

Claims

miRNA-34a 및 L-리신-g-이미다졸 중합체(Poly(L-lysine-graft-imidazole, PLI)를 포함하는 복합체; 및
상기 복합체를 내부에 봉입하고 있는 인지질 이중막;을 포함하는 항암용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 miRNA-34a 와 PLI의 결합 몰비가 1 : 0.04 이상인 것인 항암용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 인지질 이중막은 페길화 된 것인, 항암용 조성물.
제1항에 따른 항암용 조성물을 포함하는 유전자 치료제.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제