KR101229809B1 - 유전자 운반체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다음을 포함하는 유전자 운반체(gene delivery system)에 관한 것이다: (a) 표면에 양이온성 펩타이드가 결합되어 있고 이중막 구조를 가지는 인지질 리포좀; 및 (b) (i) 운반대상(cargo)으로서의 뉴클레오타이드 분자, 및 (ii) 세포투과펩타이드(cell penetration peptide)로서 양이온성 펩타이드를 포함하는 복합체(complex), 상기 복합체는 상기 인지질 리포좀 내부에 봉입(encapsulation) 되어 있다. 본 발명은 유전자 전달체에 포함되는 양이온성 펩타이드의 세포-투과 펩타이드 및 복합제로서의 두 가지 특성을 이용하여, 본 발명에 이용되는 양이온성 펩타이드는 운반대상(cargo)으로서의 뉴클레오타이드 분자와 단단한 복합체를 형성하여 리포좀 내에 뉴클레오타이드 분자를 고 로딩 효율로 봉입시킬 수 있으며, 본 발명에 포함되는 리포좀 표면에 결합된 양이온성 펩타이드는 세포-투과능이 우수하여 세포질로 운반대상을 전달할수 있어 세포내 흡수율이 우수하다. 또한, 본 발명은 항암 또는 항암제 민감화 조성물로 적용할 수 있다.

Description

유전자 운반체{Gene Delivery System}

본 발명은 유전자 운반체, 상기 유전자 운반체의 제조방법, 항암 조성물 또는 항암제 민감화 조성물에 관한 것이다.

유전자 치료법은 질환 치료를 위한 새로운 접근법이고, 치료제로서 유전물질을 이용한다. 관행에 따라서 적용된, 상기 치료법은 결손 또는 소실 유전자를 기능적으로 교체하기 위한 외인성으로 도입된 유전자의 발현과 관련되어 있고, 유전성 및 후천성 질환을 치료하는데 이용되어 왔다. 유전자 치료법은 안티센스 ODN(oligodeoxynucleotide), siRNA(small interfering RNA) 및 리보자임과 같은 유전 물질을 이용하여 내인성 유전자 발현을 조절하는데 까지 확장될 수 있다.

그러나, 대부분의 유전자 치료 전략은 혈류에서의 상기 유전 물질의 매우 짧은 반감기와 세포막을 통과하는데 어려움 때문에 전신성 적용에 대해서는 부적절한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 유전자 치료의 성공은 ODN 또는 전체 유전자(플라스미드 DNA)의 제형으로, 요구되는 세포 작용 부위로의 핵산 치료제의 운반에 달려있다. 결과적으로, 효율적인 비-침윤성 운반 전략의 개발이 요구된다.

전사 인자 데코이(decoy)는 암의 발병 중에 과-발현된 전사 인자를 하향 조절하는데 잠재적인 접근법을 제공하면서, in vitro 및 in vivo에서 유전자 전사를 억제하는데 효율적임이 알려져 있다. 상기 전사 인자 데코이 중 하나는 NF-κB 결합 부위의 보존 서열(consensus sequence)에 상응하는 서열을 가지는 안티센스 ODN이다. 상기 ODN은 타깃 유전자의 프로모터 영역에 NF-κB 결합을 블록킹함으로써 작용하고, 이로써 증식-관련 유전자의 전사를 정지시킨다[1,2]. 고 특이성 및 최소한의 독성의 이점을 제공하는 ODN은 요로상피세포암(urothelial carcinoma)에 대한 화학 치료법을 최적화하기 위한 유망한 접근법으로 보고되어 왔다[3]. ODN이 유전자 발현을 하향-조절하기 위해서는, 우선 ODN은 타깃 세포로 투과해야 한다[4]. 그래서, ODN 이용에 다음과 같은 두 개의 주요한 장애가 남아 있다: 세포막을 통과하는데 음전하를 띄는 ODN 입자의 무능력 및 in vivo에서의 네이키드 ODN의 불안정성.

효율적으로 생물학적 막을 통과하고 세포질로 들어갈 수 있는[5,6], 세포-투과 펩타이드(cell-penetrating peptide; CPP)는 in vitro와 in vivo에서 고효율로 다중 운반대상(cargo)[7]를 전달할 수 있다. 중요하게도, CPP는 일반적으로 낮은 독성을 나타낸다[8]. CPP는 이들이 전달하는 유전 물질의 유전자 타깃으로 통합되지 않기 때문에, CPP는 암유전자 활성화를 초래하지 않는 것으로 나타났다[9]. CPP는 폭넓게 연구되어 왔고 합성 거대분자[11], 미셀(micelle), 리포좀[2,12,13] 및 나노입자[14,15]와 같은 작은 약물 분자의 세포 내 전달을 위해 성공적으로 이용되었다. 수많은 타입의 약물 담체의 세포내 전달을 위한 CPP의 성공적 이용은 신규한 치료제에 대한 거대한 가능성을 제공할 것이다[10].

CPP의 다중 양전하 때문에, CPP는 정전기적 상호작용을 일으킬 수 있고 중합/응축제로서 이용되어 왔다. 또한, CPP는 전체로서 벡터 내재화(internalization)를 개선시키기 위해서 전달 비히클에 공유적으로 부착될 수 있다[8]. 하나의 바람직한 방법은 올리고뉴클레오타이드를 양전하를 띄는 PEI와 중합하는 것인데, 이러한 결과 산물은 상당한 독성을 나타내었다[16]. 세포 독성을 나타내지 않는, 노나-아르기닌 펩타이드(9R)는 중합에 이용되는 매우 적절한 후보펩타이드이다. 약물 봉입 효율은 약물 전달의 중요한 측면인데, 이는 봉입은 전달 중에 카고를 보호하여 효율적인 치료를 촉진하기 때문이다. 이는 운반대상(cargo)이 뉴클레아제에 의해 분해되기 쉬운 ODN인 경우에 특히 그러하다[17]. 합성 벡터는 봉입 벡터로서 매력적인 선택인데, 이는 상기 벡터가 향상된 안전성, 보다 큰 융통성 및 제조 용이성에 대한 기회를 제공하기 때문이다[18].

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 세포 투과 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP) 및 복합제(complex agent)로서 작용하는 양이온성 펩타이드를 이용한 뉴클레오타이드 운반체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 간단한 공정으로 양이온성 펩타이드 및 뉴클레오타이드 복합체(complex)가 봉입되고, 표면에 양이온성 펩타이드가 결합되어 있는 이중막 구조를 가지는 인지질 리포좀를 제조하면, 양이온성 펩타이드에 의해 단단한 복합체가 형성되어 뉴클레오타이드의 봉입 효율이 증가하고, 리포좀에 표면에 결합된 양이온성 펩타이드에 의해 세포-투과능이 개선되어 세포내 흡수율이 증가함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 유전자 운반체(gene delivery system)을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 유전자 운반체의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 항암 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 항암제 민감화 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 유전자 운반체(gene delivery system)를 제공한다: (a) 표면에 양이온성 펩타이드가 결합되어 있고 이중막 구조를 가지는 인지질 리포좀; 및 (b) (i) 운반대상(cargo)으로서의 뉴클레오타이드 분자, 및 (ii) 세포투과펩타이드(cell penetration peptide)로서 양이온성 펩타이드를 포함하는 복합체(complex), 상기 복합체는 상기 인지질 리포좀 내부에 봉입(encapsulation) 되어 있다.

본 발명자들은 세포 투과 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP) 및 복합제(complex agent)로서 작용하는 양이온성 펩타이드를 이용한 뉴클레오타이드 운반체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 간단한 공정으로 양이온성 펩타이드 및 뉴클레오타이드 복합체(complex)가 봉입되고, 표면에 양이온성 펩타이드가 결합되어 있는 이중막 구조를 가지는 인지질 리포좀를 제조하면, 양이온성 펩타이드에 의해 단단한 복합체가 형성되어 뉴클레오타이드의 봉입 효율이 증가하고, 리포좀에 표면에 결합된 양이온성 펩타이드에 의해 세포-투과능이 개선되어 세포내 흡수율이 증가함을 확인하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 전달체에 이용되는 상기 양이온성 펩타이드는 상기 인지질 리포좀의 표면에 결합되어 있는 친수성 고분자를 통하여 간접적으로 상기 인지질 리포좀의 표면에 결합된다.

본 명세서에서 용어“리포좀(liposome)”은 폐쇄된 지질 이중막을 형성함으로서 만들어지는 지질 운반체를 말한다. 리포좀은 지질 이중막으로 생체 친화적이며 양쪽 친매성을 가지고 있어 내부의 친수성 물질을 포함한 채로 소수성 막을 통과할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “인지질”은 특별한 다른 언급이 없는 한, 리포좀을 형성할 수 있는 인지질을 의미하며, 레시틴(포스파티딜 콜린), 포스파티딜 세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨 및 스핑고마이엘린을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 레시틴은 난, 대두 및 다른 식물들에서 얻을 수 있으며, 가장 바람직하게는 대두 레시틴이다. 본 발명에 이용될 수 있는 합성, 반합성 및 천연 레시틴은, 대두 레시틴, 디스테아로일포스파티딜콜린, 수첨 대두 레시틴, 난(egg) 레시틴, 디올레오일포스파티딜콜린, 수첨 난 레시틴, 디엘라이도일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디미리스토일포스파티딜콜린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 용어“봉입(encapsulation)”은 전달물질을 둘러싸서 효율적으로 생체내로 함입시키기 위해 캡슐화하는 것을 말한다.

본 발명의 유전자 전달체에 이용되는 양이온성 펩타이드는 본 발명에서 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)로서 그리고 운반대상(cargo)과 복합체를 형성하는데 이용된다. 양이온성 펩타이드가 세포 투과성 펩타이드로 작용하는 경우에는 상기 인지질 리포좀의 표면에 결합되고 운반대상(cargo)과 복합체를 형성하는 경우에는 상기 인지질 리포좀 내에 봉입된다.

본 명세서에서 용어, “세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)”는 인 비트로 및/또는 인 비보 상에서 운반 대상의 카고(cargo)를 세포 내로 운반할 수 있는 능력을 가진 펩타이드를 의미하며, 용어 “세포막 투과 도메인”과 혼용된다.

본 발명에서 세포 투과성 펩타이드 및 복합체로 이용되는 양이온성 펩타이드는 바람직하게는 HIV(human immunodeficiency virus)-Tat, 6-40 아미노산 잔기로 구성되어 있고 상기 아미노산 잔기 중 최소 3개는 라이신, 아르기닌 또는 라이신과 아르기닌인 펩타이드, KALA 또는 프로타민이고, 보다 바람직하게는 8-15 아미노산 잔기로 구성되어 있고 상기 아미노산 잔기 중 최소 3개는 라이신, 아르기닌 또는 라이신과 아르기닌인 펩타이드이며, 보다 더 바람직하게는 8-10 아미노산 잔기로 구성되어 있고 상기 아미노산 잔기 중 최소 6개는 라이신, 아르기닌 또는 라이신과 아르기닌인 펩타이드이고, 가장 바람직하게는 9 아르기닌 잔기로 구성된 아르기닌 펩타이드이다. 상기 사용되는 아미노산은 L-form뿐만 아니라, D-form의 아미노산도 포함할 수 있다.

본 발명에 이용되는 친수성 고분자는 당업계에 공지된 다양한 친수성 고분자를 포함하며, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜과 폴리프로필렌글리콜의 공중합체, 키토산, 덱스트란, 셀룰로오스, 헤파린, 알지네이트 또는 이들의 모노에스테르화 유도체이고, 보다 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 키토산, 덱스트란, 알지네이트이며, 가장 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜이다.

본 발명의 명세서에서 용어 “안티센스 올리고뉴클레오타이드”이란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발명의 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 타겟 유전자의 mRNA에 상보적이고 타겟 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고 타겟 유전자의 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내 40 염기이다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol ., 5(3):343-55, 1995). 올리고뉴클레오타이드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다.

용어 “앱타머(aptamer)”는 특정 타겟에 결합하는 올리고뉴클레오타이드(일반적으로, RNA 분자)를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 명세서에서의 “앱타머”는 올리고뉴클레오타이드 앱타머(예컨대, RNA aptamer)를 의미한다. 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med . 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

용어 “siRNA”란 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉-다운 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음)등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 가장 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기 , 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 본 명세서에서 siRNA의 전장은, 중앙의 이중사슬 부분의 길이와 양 말단의 단일사슬 돌출을 구성하는 길이의 합으로 나타내었다. 또한, siRNA는 타겟 유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 siRNA는 타겟 유전자에 특이적으로 작동하도록 타겟 유전자 또는 타겟 뉴클레오타이드와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥을 가진다.

용어 “shRNA”는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드를 의미하며, in vivo상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루고 있다. 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다.

용어 “miRNA(microRNA)”는 유전자 발현을 조절하며, 전장 21-23개의 뉴클레오타이드로 구성된 단일 가닥 RNA분자를 의미한다. miRNA는 세포내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오타이드이며, 짧은 스템-루프 구조를 가진다. miRNA는 1 또는 2이상의 mRNA(messenger RNA)와 전체 또는 부분적으로 상동성을 가지며, 상기 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제시킨다.

용어 “리보자임(ribozyme)”은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA이다. 리보자임은 타겟 전령 RNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 되어 있다.

용어 “DNAzyme”은 효소 활성을 가지는 단일 가닥 DNA 분자로, 10-23 뉴클레오타이드로 구성된 DNAzyme(10-23 DNAzyme)은 생리적으로 유사한 조건 하에서 RNA가닥을 특정위치에서 절단한다. 10-23 DNAzyme은 염기 쌍을 이루지 않고 노출된 어떠한 퓨린 및 피리미딘 사이를 절단한다. 10-23 DNA효소(DNAzyme)는 15개의 보존된 염기서열(5'-GGCTAGCTACAACGA-3')로 이루어진 효소의 활성부위(catalytic domain) 및 상술한 효소의 활성부위 좌우로 RNA 기질을 인식하는 7-8개의 DNA 염기서열로 이루어진 기질인식 자리(RNA substrate binding domain)로 구성된다.

본 명세서에서 용어“전사인자 결합 서열에 해당하는 이중쇄 올리고뉴클레오타이드(double-stranded ODN)”는 서열 특이적 방식으로 전사 인자와 결합하여 전사 활성을 억제하는 이중쇄 올리고뉴클레오티드를 의미하고 “데코이 올리고뉴클레오티드”와 혼용되어 사용된다. 이중쇄 올리고뉴클레오타이드의 길이는 바람직하게는 전장 6 내지 50 뉴클레오타이드이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 뉴클레오타이드이고, 가장 바람직하게는 15 내 30 뉴클레오타이드이다. 상기 전사인자는 암과 관련된 전사인자로서 바람직하게는 NF-κB, AP-1, STAT 및 스테로이드 수용체이고, 보다 바람직하게는 NF-κB이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 양이온성 펩타이드와 복합체를 형성하는 운반대상의 뉴클레오타이드 분자는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앱타머, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), DNAzyme 또는 전사인자 결합 서열에 해당하는 이중쇄 올리고뉴클레오타이드(double-stranded ODN)이고, 보다 바람직하게는 NF-κB 전사인자의 결합 서열에 해당하는 이중쇄 올리고뉴클레오타이드(double-stranded ODN)이며, 가장 바람직하게는 서열목록 제1서열 및 제2서열로 이루어진 이중쇄 올리고뉴클레오타이드이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 복합체는 운반대상(cargo)으로서의 뉴클레오타이드 분자 및 세포투과펩타이드(cell penetration peptide)로서 양이온성 펩타이드의 전하의 비(음전하:양전하)가 1:1-12로 형성되고, 보다 바람직하게는 1:4-9이며, 가장 바람직하게는 1:5-7이다. 상기 전하비의 범위를 초과한 경우에는 유전자의 전달효율이 감소하는 문제점이 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 운반체는 평균 크기가 80-200 nm 이고, 보다 바람직하게는 90-150 nm이며, 가장 바람직하게는 100-120 nm 이다.

본 명세서에서 용어 “제타 전위(zeta potential)”는 물속에 분산되어 있는 리포좀의 표면 전하의 전체적인 경향을 나타내는 수치를 나타내고, 제타 전위가 음수일 경우 음전하의 리포좀들이 물에 분산되어 있을 가능성이 높다는 것을 의미하고 제타 전위가 0이면 리포좀들이 서로 반발하는 전하를 더 이상 가지지 않는다는 의미가 되며 이때 부터는 더 큰 입자로 응집되어 침전할 가능성이 높아진다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 운반체의 제타 전위(zeta potential) 값이 -30 mV 내지 -10 mV 로서, 음의 값을 가지므로 본 발명의 유전자 전달체는 서로 응집이 발생하지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 운반체의 인지질 리포좀의 표면은 타겟팅 리간드(targeting ligand)를 추가적으로 포함한다.

본 발명에 적합한 타겟팅 리간드는 당업계에 공지된 어떠한 것도 포함할 수 있으며, 예를 들어 항체, 앱타머, 폴리펩타이드, 펩타이드, 리간드, 렉틴, 당, 지질, 당지질 또는 핵산이 타겟팅 리간드로 이용될 수 있다.

보다 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 타겟팅 리간드는 다음을 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더(Bipodal Peptide Binder: BPB) 구조를 갖는 펩타이드이다: (i) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성된 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); 및 (ii) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 Ⅱ(target binding region Ⅱ).

상기 BPB 구조에서 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ가 타겟에 결합하에 타겟팅 역할을 수행하게 된다. 바람직하게는, 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ는 세포 표면 분자에 결합한다. 예컨대, 본 발명에 이용되는 타겟팅 리간드로서의 BPB는 T 세포의 CD 수용체(예컨대, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD1e, CD2-CD244 수용체), 암세포 특이적 표면 단백질(예컨대, Her2/neu 수용체), 이온 채널, 수용체(예컨대, VEGF 수용체, G-단백질 커플드 수용체 등), ED-B(Fibronectin extra domain B), VCAM1(vascular cell adhesion molecule-1), nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor), EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule), BTA(Bladder Tumor Antigens), 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 PSA(Prostate-Specific Antigen) 등을 타겟팅한다.

BPB의 기본적인 전략은 리지드한 펩타이드 골격의 양 말단에 타겟에 결합되는 펩타이드를 연결하는 것이다. 이 경우 리지드한 펩타이드 골격은 바이포달 펩타이드 바이더의 전체적인 구조를 안정화시키는 작용을 하며, 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ가 타겟 분자에 결합되는 것을 강화시킨다. 본 발명에서 이용 가능한 구조안정화 부위는 패러럴, 안티패러럴 또는 패러럴과 안티패러럴 아미노산 가닥들을 포함하며, 가닥간(interstrand) 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용, 양이온-파이 상호작용 또는 이들의 조합에 의한 비공유결합이 형성되는 단백질 구조 모티프들을 포함한다. 가닥간 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용, 양이온-파이 상호작용 또는 이들의 조합에 의한 형성되는 비공유결합은 구조안정화 부위의 견고성(rigidity)에 기여한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조안정화 부위에서의 가닥간(interstrand) 비공유결합은 수소결합, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용 또는 이들의 조합을 포함한다.

선택적으로, 구조화안정화 부위에 공유결합이 있을 수 있다. 예를 들어, 구조화안정화 부위에 이황화결합을 형성시켜 구조안정화 부위의 견고성을 더 증가시킬 수 있다. 이러한 공유결합에 의한 견고성 증가는 바이포달 펩타이드 바인더의 타겟에 대한 특이도 및 친화도를 고려하여 부여한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조 안정화 부위의 아미노산 가닥들은 링커로 연결되어 있다. 본 명세서에서 가닥을 언급하면서 사용되는 용어 “링커”는 가닥과 가닥을 연결시켜 주는 물질을 의미한다. 예컨대, 구조안정화 부위로서 β-헤어핀이 이용되는 경우에는 β-헤어핀에 있는 턴 서열이 링커의 역할을 하며, 루이신 지퍼가 이용되는 경우에는 루이신 지퍼의 두 C-말단을 연결하는 물질(예컨대, 펩타이드 링커)이 링커의 역할을 한다.

링커는 패러럴, 안티패러럴 또는 패러럴과 안티패러럴 아미노산 가닥들을 연결한다. 예컨대, 패러럴 방식으로 정렬된 최소 2개의 가닥(바람직하게는 2개의 가닥), 안티패러럴 방식으로 정렬된 최소 2개의 가닥(바람직하게는 2개의 가닥), 패러럴 및 안티패러럴 방식으로 정렬된 최소 3개의 가닥(바람직하게는 3개의 가닥)을 링커가 연결하게 된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 링커는 턴 서열 또는 펩타이드 링커이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 턴 서열은 β-턴, γ-턴, α-턴, π-턴 또는 ω-loop이다(Venkatachalam CM (1968), Biopolymers, 6, 1425-1436; Nemethy G and Printz MP. (1972), Macromolecules, 5, 755-758; Lewis PN et al., (1973), Biochim . Biophys . Acta, 303, 211-229; Toniolo C. (1980) CRC Crit . Rev . Biochem ., 9, 1-44; Richardson JS. (1981), Adv . Protein Chem., 34, 167-339; Rose GD et al., (1985), Adv . Protein Chem ., 37, 1-109; Milner-White EJ and Poet R. (1987), TIBS, 12, 189-192; Wilmot CM and Thornton JM. (1988), J. Mol . Biol ., 203, 221-232; Milner-White EJ. (1990), J. Mol . Biol ., 216, 385-397; Pavone V et al. (1996), Biopolymers, 38, 705-721; Rajashankar KR and Ramakumar S. (1996), Protein Sci ., 5, 932-946). 가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 턴 서열은 β-턴이다.

턴 서열로서 β-턴이 이용되는 경우, 바람직하게는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ', 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, 보다 바람직하게는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 턴 서열이고, 보다 더 바람직하게는 타입 I' 또는 타입 Ⅱ' 턴 서열이며, 가장 바람직하게는 타입 I' 턴 서열이다(B. L. Sibanda et al., J. Mol . Biol ., 1989, 206, 4, 759-777; B. L. Sibanda et al., Methods Enzymol., 1991, 202, 59-82).

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 턴 서열로서 이용될 수 있는 것은 H. Jane Dyson et al., Eur . J. Biochem . 255:462-471(1998)에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 턴 서열로 이용될 수 있는 것은 다음의 아미노산 서열을 포함한다: X-Pro-Gly-Glu-Val; Ala-X-Gly-Glu-Val (X는 20개의 아미노산으로부터 선택된다).

본 발명의 일 구현예에 따라, 구조안정화 부위로서 β-쉬트 또는 루이신 지퍼가 이용되는 경우, 패러럴 방식으로 정렬된 2개의 가닥 또는 안티패러럴 방식으로 정렬된 2개의 가닥을 펩타이드 링커가 연결하는 것이 바람직하다.

펩타이드 링커는 당업계에 공지된 어떠한 것도 이용 가능하다. 적합한 펩타이드 링커의 서열은 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연한 연장된 컨포메이션(flexible extended conformation)에 적용될 수 있는 능력; (b) 생물학적 타겟 분자와 상호작용 하는 이차구조를 생성하지 않는 능력; 및 (c) 생물학적 타겟 분자와 상호작용하는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재. 바람직한 펩타이드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함한다. Thr 및 Ala과 같은 다른 중성 아미노산들도 링커 서열에 포함될 수 있다. 링커에 적합한 아미노산 서열은 Maratea et al., Gene 40:39-46( 1985); Murphy et al., Proc . Natl . Acad Sci . USA 83:8258-8562(1986); 미국 특허 제4,935,233호, 제4,751,180호 및 제5,990,275호에 개시되어 있다. 펩타이드 링커 서열은 1-50 아미노산 잔기로 구성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조안정화 부위는 β-헤어핀, 링커로 연결된 β-쉬트 또는 링커로 연결된 루이신 지퍼이고, 보다 바람직하게는 구조안정화 부위는 β-헤어핀 또는 링커로 연결된 β-쉬트이며, 가장 바람직하게는 β-헤어핀이다.

본 명세서에서 용어 “β-헤어핀”은 두 개의 β 가닥을 포함하는 가장 간단한 단백질 모티프를 의미하며, 이 두 개의 β 가닥은 서로 안티패러럴한 정렬을 나타낸다. 이 β-헤어핀에서 두 개의 β 가닥은 일반적으로 턴 서열에 의해 연결된다.

바람직하게는, β-헤어핀에 적용되는 턴 서열은 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ', 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, 보다 바람직하게는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 턴 서열이고, 보다 더 바람직하게는 타입 I' 또는 타입 Ⅱ' 턴 서열이며, 가장 바람직하게는 타입 I' 턴 서열이다. 또한, X-Pro-Gly-Glu-Val; 또는 Ala-X-Gly-Glu-Val (X는 20개의 아미노산으로부터 선택된다)으로 표시되는 턴 서열도 β-헤어핀에 이용될 수 있다.

본 발명의 예시적인 실시예에 따르면, 타입 I 턴 서열은 Asp-Asp-Ala-Thr-Lys-Thr이고, 타입 I' 턴 서열은 Glu-Asn-Gly-Lys이며, 타입 Ⅱ 턴 서열은 X-Pro-Gly-Glu-Val; 또는 Ala-X-Gly-Glu-Val (X는 20개의 아미노산으로부터 선택된다)이고, 타입 Ⅱ' 턴 서열은 Glu-Gly-Asn-Lys 또는 Glu-D-Pro-Asn-Lys이다.

β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,914,123호 및 Andrea G. Cochran et al., PNAS, 98(10):5578-5583)에 개시되어 있는 트립토판 지퍼, WO 2005/047503에 개시되어 있는 주형-고정된 β-헤어핀 미멕틱, 미국 특허 제5,807,979호에 개시되어 있는 β-헤어핀 변형체들이 잘 알려져 있다. 이외에도, β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드는 Smith & Regan (1995) Science 270:980-982; Chou & Fassman (1978) Annu. Rev. Biochem. 47:251-276; Kim & Berg (1993) Nature 362:267-270; Minor & Kim (1994) Nature 367:660-663; Minor & Kim (1993) Nature 371:264-267; Smith et al. Biochemistry (1994) 33:5510-5517; Searle et al. (1995) Nat. Struct. Biol. 2:999-1006; Haque & Gellman (1997) J. Am. Chem. Soc. 119:2303-2304; Blanco et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:5887-5888; de Alba et al. (1996) Fold. Des. 1: 133-144; de Alba et al. (1997) Protein Sci. 6:2548-2560; Ramirez-Alvarado et al. (1996) Nat. Struct. Biol. 3:604-612; Stanger & Gellman (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:4236-4237; Maynard & Searle (1997) Chem. Commun. 1297-1298; Griffiths-Jones et al. (1998) Chem. Commun. 789-790; Maynard et al. (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:1996-2007; 및 Blanco et al. (1994) Nat. Struct. Biol. 1:584-590에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드를 구조안정화 부위로 이용하는 경우, 가장 바람직하게는 트립토판 지퍼를 이용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 트립토판 지퍼는 다음 일반식 I로 표시된다:

일반식 I

X₁-Trp(X₂)X₃-X₄-X₅(X'₂)X₆-X₇

X₁은 Ser 또는 Gly-Glu이고, X₂ 및 X'₂는 서로 독립적으로 Thr, His, Val, Ile, Phe 또는 Tyr이며, X₃는 Trp 또는 Tyr이고, X₄는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 또는 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, X₅는 Trp 또는 Phe이며, X₆는 Trp 또는 Val이고, X₇는 Lys 또는 Thr-Glu이다.

보다 바람직하게는, 상기 일반식 I에서 X₁은 Ser 또는 Gly-Glu이고, X₂ 및 X'₂는 서로 독립적으로 Thr, His 또는 Val이며, X₃는 Trp 또는 Tyr이고, X₄는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ 또는 타입 Ⅱ' 턴 서열이고, X₅는 Trp 또는 Phe이며, X₆는 Trp 또는 Val이고, X₇는 Lys 또는 Thr-Glu이다.

보다 더 바람직하게는, 일반식 I에서 X₁은 Ser 또는 Gly-Glu이고, X₂ 및 X'₂는 서로 독립적으로 Thr, His 또는 Val이며, X₃는 Trp이고, X₄는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ 또는 타입 Ⅱ' 턴 서열이고, X₅는 Trp이며, X₆는 Trp이고, X₇는 Lys 또는 Thr-Glu이다.

보다 더욱 더 바람직하게는, 일반식 I에서 X₁은 Ser이고, X₂ 및 X'₂는 Thr이며, X₃는 Trp이고, X₄는 타입 I' 또는 타입 Ⅱ' 턴 서열이고, X₅는 Trp이며, X₆는 Trp이고, X₇는 Lys이다.

가장 바람직하게는, 일반식 I에서 X₁은 Ser이고, X₂ 및 X'₂는 Thr이며, X₃는 Trp이고, X₄는 타입 I' 턴 서열 (ENGK) 또는 타입 Ⅱ' 턴 서열(EGNK)이고, X₅는 Trp이며, X₆는 Trp이고, X₇는 Lys이다.

본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용가능한 β-헤어핀 펩타이드는 단백질 G의 B1 도멘인으로부터 유래된 펩타이드, 즉 GB1 펩타이드이다.

본 발명에서 GB1 펩타이드가 이용되는 경우, 바람직하게는 구조안정화 부위는 다음 일반식 Ⅱ로 표시된다:

일반식 Ⅱ

X₁-Trp-X₂-Tyr-X₃-Phe-Thr-Val-X₄

X₁은 Arg, Gly-Glu 또는 Lys-Lys이고, X₂는 Gln 또는 Thr이며, X₃는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 또는 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, X₄는 Gln, Thr-Glu 또는 Gln-Glu이다.

보다 바람직하게는, 일반식 Ⅱ의 구조안정화 부위는 다음 일반식 II'으로 표시된다:

일반식 Ⅱ

X₁-Trp-Thr-Tyr-X₂-Phe-Thr-Val-X₃

X₁은 Gly-Glu 또는 Lys-Lys이고, X₂는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 또는 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, X₃는 Thr-Glu 또는 Gln-Glu이다.

본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용 가능한 β-헤어핀 펩타이드는 HP 펩타이드이다. 본 발명에서 HP 펩타이드가 이용되는 경우, 바람직하게는 구조안정화 부위는 다음 일반식 Ⅲ으로 표시된다:

일반식 Ⅲ

X₁-X₂-X₃-Trp-X₄-X₅-Thr-X₆-X₇

X₁은 Lys 또는 Lys-Lys이고, X₂는 Trp 또는 Tyr이고, X₃는 Val 또는 Thr이며, X₄는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 또는 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, X₅는 Trp 또는 Ala이며, X₆는 Trp 또는 Val이고, X₇은 Glu 또는 Gln-Glu이다.

본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용 가능한 또 다른 β-헤어핀 펩타이드는 다음 일반식 Ⅳ로 표시된다:

일반식 Ⅳ

X₁-X₂-X₃-Trp-X₄

X₁은 Lys-Thr 또는 Gly이고, X₂는 Trp 또는 Tyr이고, X₃는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 또는 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, X₄는 Thr-Glu 또는 Gly이다.

본 발명에 따르면, 구조안정화 부위로서 링커로 연결된 β-쉬트를 이용할 수 있다. β-쉬트 구조에서 패러럴 또는 안티패러럴한, 바람직하게는 안티패러럴한 두 개의 아미노산 가닥이 뻗은 구조(extended form)로 되어 있으며, 아미노산 가닥 사이에 수소 결합이 형성된다.

β-쉬트 구조에서 두 개의 아미노산 가닥의 인접한 두 말단은 링커에 의해 연결된다. 링커로서는 상술한 다양한 턴-서열 또는 펩타이드 링커가 이용될 수 있다. 턴-서열이 링커로 이용되는 경우, β-턴 서열이 가장 바람직하다.

본 발명의 다른 변형예에 따르면, 구조안정화 부위로서 루이신 지퍼 또는 링커로 연결된 루이신 지퍼가 이용될 수 있다. 루이신 지퍼는 패러럴한 2개의 α-사슬의 다이머화를 야기하는 보존성 펩타이드 도메인이며, 일반적으로 유전자 발현에 관여하는 단백질에 발견되는 다이머화 도메인이다("Leucine scissors". Glossary of Biochemistry and Molecular Biology (Revised). (1997). Ed. David M. Glick. London: Portland Press; Landschulz WH, et al. (1988) Science 240:1759-1764). 루이신 지퍼는 일반적으로 헵태드(heptad) 반복 서열을 포함하며, 루이신 잔기가 4번째 또는 5번째에 위치해 있다. 예를 들어, 본 발명에 이용될 수 있는 루이신 지퍼는 LEALKEK, LKALEKE, LKKLVGE, LEDKVEE, LENEVAR 또는 LLSKNYH의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에서 이용되는 루이신 지퍼의 구체적인 예를 서열목록 제39서열에 기재되어 있다. 루이신 지퍼의 각각의 반은 짧은 α-사슬로 이루어져 있으며, α-사슬간의 직접적인 루이신 접촉이 있다. 전사인자에 있는 루이신 지퍼는 일반적으로 소수성 루이신 지퍼 부위 및 염기성 부위(DNA 분자의 주 그루브와 상호작용하는 부위)로 이루어져 있다. 본 발명에서 루이신 지퍼가 이용되는 경우에는 염기성 부위는 반드시 필요로 하지 않는다. 루이신 지퍼 구조에서 두 개의 아미노산 가닥(즉, 두 개의 α-사슬)의 인접한 두 말단은 링커에 의해 연결될 수 있다. 링커로서는 상술한 다양한 턴-서열 또는 펩타이드 링커가 이용될 수 있으며, 바람직하게는 루이신 지퍼의 구조에 영향을 미치지 않는 펩타이드 링커가 이용된다.

상술한 구조안정화 부위의 양 말단에는 무작위 아미노산 서열이 결합된다. 상기 무작위 아미노산 서열이 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ를 형성한다. 본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는, 구조안정화 부위의 양쪽 말단에 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ를 연결하여 바이포달 방식으로 펩타이드 바인더를 제작하는 것이다. 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ는 서로 협동적으로(cooperatively) 타겟에 결합함으로써, 타겟에 대한 친화도를 크게 증가시킨다.

타겟 결합 부위 I의 아미노산 개수 n은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 2-100의 정수, 보다 바람직하게는 2-50의 정수, 보다 더욱 더 바람직하게는 2-20의 정수, 가장 바람직하게는 3-10의 정수이다.

타겟 결합 부위 Ⅱ의 아미노산 개수 m은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 2-100의 정수, 보다 바람직하게는 2-50의 정수, 보다 더욱 더 바람직하게는 2-20의 정수, 가장 바람직하게는 3-10의 정수이다.

타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ에는 서로 각각 다른 또는 동일한 개수의 아미노산 잔기가 포함될 수 있다. 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ에는 서로 각각 다른 또는 동일한 아미노산 서열이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 서로 각각 다른 아미노산 서열이 포함된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 유전자 운반체(gene delivery system)의 제조방법을 제공한다: (a) (i) 운반대상(cargo)으로서의 뉴클레오타이드 분자 및 (ii) 세포투과펩타이드(cell penetration peptide)로서 양이온성 펩타이드를 포함하는 복합체(complex)를 형성하는 단계; (b) 인지질 및 표면에 양이온성 펩타이드가 결합되어 있는 인지질을 혼합하여 인지질 필름을 형성하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (a)의 복합체 및 상기 단계 (b)의 인지질 필름을 혼합 및 압출하여 상기 복합체가 봉입된 리포좀을 수득하는 단계.

본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 유전자 운반체를 제조하기 위한 공정이기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

유전자 운반체를 제조하기 위한 본 발명의 방법을 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

(a) 운반대상( cargo ) 및 세포투과펩타이드( cell penetration peptide )의 복합체( complex ) 형성

우선, 본 발명은 (i) 운반대상(cargo)으로서의 뉴클레오타이드 분자 및 (ii) 세포투과펩타이드(cell penetration peptide)로서 양이온성 펩타이드를 포함하는 복합체(complex)를 제조한다.

본 발명의 방법에 있어서, 운반대상(cargo)과 세포투과펩타이드(cell penetration peptide)의 복합체는 전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성하기 위해서 운반대상(cargo)으로는 뉴클레오타이드 분자를 그리고 세포투과펩타이드(cell penetration peptide)로서는 양이온성 펩타이드를 이용하여 뉴클레오타이드 분자에 하전된 음전하와 양이온성 펩타이드의 양전하에 의해 전기적 인력이 작용하여 매우 안정한 복합체를 형성하게 된다.

본 발명의 방법에서 복합체를 형성하는데 있어, 운반대상의 뉴클레오타이드 분자와 양이온성 펩타이드 사이의 결합을 촉진시키는 데 필요한 주위 환경 (surrounding environment)을 제공하기 위하여 결합제가 필요하며, 이러한 결합제는 pH 값이 6.5-8.5인 완충 용액이 바람직하다. 한편, 공지된 기술에 따르면, 운반대상의 뉴클레오타이드 분자와 양이온성 펩타이드 사이의 적합한 결합을 위하여, 특별한 물질이 요구되거나 복잡한 과정이 요구된다. 그러나, 본 발명에 있어서는 적합한 pH 값을 갖는 완충 용액에서 뉴클레오타이드 분자와 양이온성 펩타이드를 적합한 온도에서 일정 기간 동안 항온 처리 하는 간단한 방법을 통해 복합체 형성 단계가 이루어진다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 결합제는 인산염 완충액, HEPES 완충액, MOPS 완충액, 혈청을 첨가하지 않은 각종 세포 배양액(예컨대, DMEM (Dulbecco's modified minimum essential medium), Ham's F12, CMRL 1066, RPMI 1640, IMDM (Iscove's modified Dulbecco's medium) 등)을 포함하며, 보다 바람직하게는 HEPES 완충액이고 가장 바람직하게는 HEPES 완충-글루코오스 용액이다.

상기 복합체에서 뉴클레오타이드 분자 및 양이온성 펩타이드의 적절한 전하의 비(음전하:양전하)는 1:1-12이고, 보다 바람직하게는 1:4-9이며, 가장 바람직하게는 1:5-7이다.

(b) 인지질 필름의 형성

이어, 인지질 및 표면에 양이온성 펩타이드가 결합되어 있는 인지질을 혼합하여 인지질 필름을 형성한다.

본 발명의 방법에서 인지질 필름은 상기 미리-형성된 복합체를 봉입하기 위하여 제조된다. 인지질 필름을 제조하기 위해서 이용되는 인지질은 상술한 바와 같이 당업계에 공지된 다양한 인지질을 포함하고, 바람직하게는 POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 콜레스테롤 및 POPG(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol))을 포함하며, 보다 바람직하게는 몰 비(molar ratio) 4:3:3의 POPC, 콜레스테롤 및 POPG를 포함하고, 가장 바람직하게는 상기 인지질은 전하 비(양전하:음전하:음전하)가 6:1:6이다.

본 발명의 유전자 전달체는 세포 투과능을 증가시키기 위해서 리포좀 표면에 세포투과 펩타이드를 결합된 제형을 특징으로 하는 바, 양이온성 펩타이드가 결합되어 있는 인지질과 상기 인지질을 혼합한다. 본 발명의 방법에서 양이온성 펩타이드가 결합되어 있는 인지질로는 양이온성 펩타이드-DSPE(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)가 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 이용되는 표면에 양이온성 펩타이드가 결합되어 있는 인지질은 상기 인지질의 표면에 결합되어 있는 친수성 고분자를 통하여 간접적으로 상기 양이온성 펩타이드가 상기 인지질의 표면에 결합될 수 있고, 보다 바람직하게는 양이온성 펩타이드-친수성 고분자-DSPE(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)를 상기 인지질 필름을 형성하기 위해서 추가적으로 혼합할 수 있다.

그런 다음, 인지질 혼합물을 진공조건하에서 건조시키고 동결-건조하여 건조된 인지질 필름을 제조한다.

(c) 상기 (a)의 복합체 및 상기 (b)의 인지질 필름의 혼합 및 압출하여 상기 복합체가 봉입된 리포좀의 수득

본 발명의 방법에 따르면, 리포좀을 수득하기 위해서 복합체와 인지질 필름에 재수화하여 혼합함으로써 자가-리포좀(self-liposome)을 형성시킨다. 리포좀을 형성시키기 위해서 바람직하게는 고압균질기(high pressure homogenizer), 음파발생기(sonicator), 미소유동기(microfluidizer), 압출기(extrusion apparatus) 또는 프렌치 프레스(French press)를 이용하여 실시하며, 보다 바람직하게는 음파발생기(sonicator) 및 압출기(extrusion apparatus)를 이용하여 실시한다.

바람직하게는 상기 혼합물에 초음파를 처리하고 3-10℃에서 2-8 시간동안 반응시킨다음, 균일한 크기(평균 크기: 80-130 nm)의 리포좀을 제조하기 위해서 막(membrane)을 통한 압출 과정을 실시한다.

압출 과정을 실시하기 위해서 당업계에 공지된 다양한 압출기를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 핸드-헬드 압출기를 이용한다. 균일하게 분산된 리포좀을 얻기 위해서 압출과정을 실시하므로 압출과정에 이용되는 막(membrane)의 기공 크기는 수득하고자 하는 리포좀의 크기에 따라 달라질 수 있으며, 바람직하게는 100 nm의 기공크기를 가지는 막(membrane)을 이용한다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 유전자 전달체는 평균 크기가 80-130 nm 이고, 보다 바람직하게는 90-120 nm이며, 가장 바람직하게는 100-110 nm 이고, 리포좀에 봉입된 복합체의 로딩 효율은 약 100%이며, 보다 바람직하게는 80-98%이고 가장 바람직하게는 90-98%이다. 이러한 높은 로딩 효율은 나타내는 것은 뉴클레오타이드 분자와 양이온성 펩타이드가 미리 단단한 복합체를 형성하였기 때문이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 항암 조성물을 제공한다: (a) 표면에 양이온성 펩타이드가 결합되어 있고 이중막 구조를 가지는 인지질 리포좀; 및 (b) (i) 운반대상(cargo)으로서 NF-κB 전사인자의 결합 서열에 해당하는 이중쇄 올리고뉴클레오타이드(double-stranded ODN), 및 (ii) 세포투과펩타이드(cell penetration peptide)로서 양이온성 펩타이드를 포함하는 복합체(complex), 상기 복합체는 상기 인지질 리포좀 내부에 봉입(encapsulation) 되어 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 항암제 민감화 조성물을 제공한다: (a) 표면에 양이온성 펩타이드가 결합되어 있고 이중막 구조를 가지는 인지질 리포좀; 및 (b) (i) 운반대상(cargo)으로서 NF-κB 전사인자의 결합 서열에 해당하는 이중쇄 올리고뉴클레오타이드(double-stranded ODN), 및 (ii) 세포투과펩타이드(cell penetration peptide)로서 양이온성 펩타이드를 포함하는 복합체(complex), 상기 복합체는 상기 인지질 리포좀 내부에 봉입(encapsulation) 되어 있다.

항암 또는 항암제 민감화 조성물은 항암 효과를 달성하기 위해서 운반대상(cargo)으로 NF-κB 전사인자의 결합 서열에 해당하는 이중쇄 올리고뉴클레오타이드(double-stranded ODN)를 이용하는 것을 특징으로 할 뿐, 상술한 본 발명의 유전자 전달체를 이용하는 것이므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 조성물은 그 자체로 NF-κB 전사인자의 결합 서열에 해당하는 이중쇄 올리고뉴클레오타이드(double-stranded ODN)(데코이 올리고뉴클레오티드)를 포함하고 있으므로 서열 특이적 방식으로 NF-κB 전사 인자와 결합하여 전사 활성을 억제하여 NF-κB 전사 인자 관련 암 질환을 치료할 수 있는 유전자 치료에 이용될 수 있으며, 리포좀 내부에 항암제를 추가적으로 봉입시켜 약물 및 유전자 운반체(drug and gene delivery system)으로 이용될 수 있고, 항암제를 투여한 후 본 발명의 조성물을 이용하여 암세포를 민감화 시킬 수 있다.

본 발명의 조성물에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 질병은 암이고, 바람직하게는 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암이다.

본 발명의 리포좀에 추가적으로 봉입되거나 암세포 민감화하는데 이용되는 항암제는 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 프로카르바진 (procarbazine), 메클로레타민 (mechlorethamine), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실 (chlorambucil), 비술판 (bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 독소루비신 (doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 플리코마이신 (plicomycin), 미토마이신 (mitomycin), 에토포시드 (etoposide), 탁목시펜 (tamoxifen), 파클리탁셀 (paclitaxel), 트랜스플라티눔 (transplatinum), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 빈크리스틴 (vincristin), 빈블라스틴 (vinblastin) 또는 메토트렉세이트 (methotrexate)가 바람직하다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 유전자 전달체에 포함되는 양이온성 펩타이드의 세포-투과 펩타이드 및 복합제로서의 두가지 특성을 이용한 최초의 기술이다.

(b) 본 발명에 이용되는 양이온성 펩타이드는 운반대상(cargo)으로서의 뉴클레오타이드 분자와 단단한 복합체를 형성하여 리포좀 내에 뉴클레오타이드 분자를 고 로딩 효율로 봉입시킬 수 있다.

(c) 본 발명에 포함되는 리포좀 표면에 결합된 양이온성 펩타이드는 세포-투과능이 우수하여 세포질로 운반대상을 전달할수 있어 세포내 흡수율이 우수하다.

(d) 본 발명은 유전자 전달체, 항암 또는 항암제 민감화 조성물에 적용할 수 있다.

도 1a는 9R-LS(9R/ODN)을 제조하는 과정을 보여주는 모식도이다. 9R-LS는 9R 펩타이드가 표면에 컨쥬게이트된 리포좀을 의미하고, 9R/ODN은 9R 펩타이드 및 ODN(oligonucleotide) 복합체를 의미하며 9R-LS(9R/ODN)는 상기 리포좀 내부에 상기 복합체가 봉입되고 9R 펩타이드가 표면에 컨쥬게이트된 리포좀을 의미한다.
1) 수용액상 완충액에서 9R/ODN 복합체를 형성하고, 2) 인지질 필름을 수득하기 위해서 진공조건에서 건조시키고 하룻밤 동안 동결-건조하여, 별개의 바이알(vial)에서 리포좀 인지질 필름을 제조하며, 3) 수용액상 완충액에서 9R/ODN 복합체 인지질 필름을 재수화하고, 4) 9R/ODN 복합체가 봉입된 PEG-안정 리포좀을 형성하며, 5) 막 압출에 의해 크기가 균일한 리포좀을 제조하는 과정을 보여준다.
도 1b는 상기 과정으로 제조된 9R/ODN 복합체가 봉입되고 9R이 리포좀 표면에 컨쥬게이트된 리포좀의 구조를 보여준다.
도 2는 9R-LS(9R/ODN)을 제조한 결과를 보여준다. 도 2a는 9R 펩타이드 및 ODN 복합체의 (+/-) 전하비가 5 이상임을 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 확인한 겔 사진이다. 도 2b는 ODN 로딩 효율이 약 100% 임을 보여주는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)이다. 9R 펩타이드로 미리 복합체를 형성하는 않는 경우에는, ODN의 로딩은 무시할 만 하다. 도 2c는 막 압출이 불규칙한 구조의 불안정한 분산 상태에서 구형 구조의 안정하고 나노-크기의 입자로 전환시킴을 보여주는 TEM(transmission electron microscopy) 분석 결과를 보여주는 사진이다.
도 3은 U87MG 인간 아교모세포종(glioblastoma) 세포에서 9R-LS(9R/ODN)의 in vitro 세포내 흡수 결과를 보여준다. Rh-PE(rhodamine-phosphatidylethanolamine)로 형광 라벨링된 9R-LS(9R/ODN)로 1 시간 반응시킨 후, 세포를 파라포름알데히드로 고정시키고 레이저-스캐닝 공초점 현미경으로 가시화하였다. Alexa 488-라벨링 9R(청색) 및 Alexa 546-라벨링 ODN(적색)을 이용한 이중 라벨링 실험으로 9R-LS 입자의 세포내 흡수(도 3a), 그리고 온전한(intact)(노란색) 입자 및 해리된 입자의 방출 및 세포내 위치(도 3b)를 확인하였다.
도 4는 U87MG 인간 아교모세포종(glioblastoma) 세포에 대한 9R-LS(9R/ODN)의 in vitro 활성을 보여준다. 4시간 동안 세포를 9R-LS(9R/ODN)로 또는 9R-LS(9R/ODN) 없이 반응시키거나 복합체가 봉입되지 않은 9R-리포좀(대조군)으로 반응시킨 다음, 24시간 동안 50 nM PTX(paclitaxel)로 또는 PTX 없이 반응시켰다. 세포 생존율은 실시예에서 기재한 바와 같이 MTT 어세이를 이용하여 평가하였다. 상대적인 세포 생존율은 배지만으로 처리된 세포의 생존율에 대한 비율로 계산하였다. 상대적으로 낮은 NF-κB 데코이 ODN 농도(50 nM)에서, 세포 생존율은 9R-LS(9R/ODN)로 처리함으로써 감소하였고(p ＜0.01)(도 4a), 50 nM PTX로 공-처리함으로써 보다 감소하였는데(p ＜0.02)(도 4b), 이는 NF-κB 경로를 억제하는 항암제와 조합함으로써 치료학적 이점을 보여준다. 도 4c는 TUNEL 어세이를 이용하여 세포 사멸의 시그널을 확인한 사진이다. 세포 사멸은 9R-LS(9R/ODN)로 처리한 세포에서 명백하였으며(녹색 반점 시그널), 50 nM PTX이 존재하는 경우에 상당히 증가하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 방법

실험재료

NF-κB cis element를 포함하는 단일 가닥 20-mer 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)를 바이오니아 사(한국)로부터 구입하였다. 1.22 μg/μl(100 μM)의 최종 ODN 농도에서 등몰량(equimolar amount)의 단일 가닥 센스(5’CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3’)(서열목록 제1서열) 및 안티센스 (3’GGAACTTCCCTAAAGGGAGG-5’)(서열목록 제2서열) ODN을 어닐링하여 이중 가닥 ODN을 준비하였다. D-형의 9R 및 1-시스테인/2-글라이신 스페이서로 티올화된 9R 펩타이드(CGG-9R)를 애니젠 사(한국)으로부터 구입하였다. POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPG(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol)), DSPE(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), PEG2000-DSPE (polyethylene glycol(2000)-DSPE) (암모늄 염), Mal-PEG2000-DSPE(N-maleimide-PEG2000-DSPE) (암모늄 염) 및 식물성 콜레스테롤(Chol)을 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA)로부터 구입하였다. OliGreen 어세이 키트를 Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA)로부터 입수하였다. 모든 다른 화학약품은 시약 등급이고 구입한 대로 이용하였다.

ODN 및 9R 펩타이드의 복합체 형성

최종 부피 250 ㎕이 되도록 일정량의 ODN(50 ㎍) 및 다양한 양의 9R 펩타이드를 HEPES-완충 5% 글루코오스 용액(pH 7.4)에서 각각 희석하였다. 실온에서 10분 동안 반응시킨 다음, 상기 용액을 빠르게 혼합하고 동시에 볼텍싱하여, 1-12의 양전하/음전하 비율을 가지는 500 ㎕의 9R/ODN 복합체(complex)를 수득하였다. 각 9R 펩타이드는 아르기닌 구아니디윰기로부터 9개의 양전하를, 그리고 각 ODN 분자는 인산기로부터 40개의 음전하를 포함하고 있다는 추정하에 목적하는 전하 비율을 구하여 9R 펩타이드의 양을 계산하였다. 완벽한 복합체 형성을 위한 최적 전하 비율을 결정하기 위해서 2% 아가로스 겔 전기영동(100 V, 30 분)을 이용하여 각 혼합물을 분석하였다.

음이온 리포좀의 제조

최종 부피 250 ㎕이 되도록 9R 펩타이드 및 NF-κB ODN을 HEPES-완충 5% 글루코오스 용액(pH 7.4)에서 각각 희석하고, 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 상기 용액을 혼합하고 볼텍싱하여, 6:1의 양전하/음전하 비율을 가지는 500 ㎕의 9R/ODN 복합체를 수득하였다. 상기 9R/ODN 복합체를 6:1:6의 +/-/- 전하 비를 가지는 POPC/Chol/POPG/ (몰비: 4:3:3)의 음이온 인지질 필름에 첨가하였다. 이 혼합물을 짧게 초음파로 처리하고 4℃에 4시간 동안 반응시킨 다음, 핸드-헬드 압출기(Avanti Polar Lipid, AL, USA)를 이용하여 두 개의 폴리카보네이트 막(기공 사이즈: 100 nm)의 스택을 통해서 11번 압출하였다. 압출은 균일하게 분산된 리포좀을 얻기 위해서 중요하다. 9R-DSPE가 포함된 리포좀을 2 wt%의 농도로 원래의 리포좀 조성에 첨가하였다. 9R-DSPE는 없으나 NF-κB 9R/ODN 복합체가 로딩된 리포좀을 대조군으로 제공하였다. ODN 만이 로딩된 유사한 제형을 제조하려는 시도는 실패하였고, 이는 9R/ODN 복합체 형성은 로딩 효율을 증가시키기 위해서 절대적으로 요구됨을 의미한다. 우선, 크기-배제 크로마토그래피(CL-4B 컬럼)을 이용하여 9R/ODN-로딩 리포좀을 정제하였다. 컬럼은 HBS 완충액으로 세 번 미리 세척하였다. 컬럼에의 제형의 비-특이적 결합을 방지하기 위해서, 우선 컬럼을 1 ml의 5% 덱스트란으로 세척하였다. 1 ml 씩의 전체 15개의 분획을 시료(대조군 리포좀 및 9R/ODN-컨쥬게이트 리포좀)로 수집하였다. 이러한 제형 결과물의 복합체 제형, 크기 분포, 제타 포텐셜 및 로딩 효율에 대한 특성을 파악하였다.

크기 분포 및 제타-포텐셜

최적 산란 세기를 얻기 위해서, 9R/ODN로 로딩된 9R-LS(9R 펩타이드-컨쥬게이트 리포좀)을 HBS로 희석하였다. ELS 8000 장치(Otsuka Electronics Korea, 서울, 한국)를 이용하여 유체역학적 지름(hydrodynamic diameter) 및 제타 포텐셜을 전기영동 광산란법(electrophoretic light scattering)으로 측정하였다.

봉입(encapsulation) 효율

상기한 바와 같이 9R/ODN가 로딩된 9R-LS를 제조하고 세파로스 CL4B 컬럼 용리액(eluent)의 분획에 대해서 OliGreen (Invitrogen)을 이용하여 ODN 함량을 분석하였다[17]. 요약하면, 100 ㎕의 각 분획을 트리톤-X 100 (1.0 wt%) 및 헤파린(20 U)으로 처리하였다. UV 전이(excitation)와 485 및 560 nm의 방출 파장을 각각 이용하여, ODN 결합 후에 OliGreen에 의해 방출된 형광 세기로 ODN의 방출을 측정하였다. ODN의 봉입(entrapment) 효율은 곡선 아래의 전체 면적에 대한 첫 번째 피크의 곡선 아래의 면적의 상대적인 값으로 계산하였다. 9R 펩타이드가 없는 제형을 9R 펩타이드에 의한 ODN 복합체의 봉입 효율에 대한 효과를 확인하기 위해서 대조군으로 이용하였다.

TEM(transmission electron microscopy)

9R-LS(9R/ODN) 입자의 10-분액(aliquot)을 탄소-코딩 메쉬 구리 그리드(carbon-only mesh copper grids)에 적용하였다. 실온에서 5 분 후에, 과량의 시료를 제거하기 위해서 여과 종이를 블롯팅하고 물로 다섯 번 세척하였다. 물에 10 ㎕의 1% 우라닐 아세테이트를 적용함으로써 시료를 음성적으로 염색하였다. 실온에서 2 분 후, 시료를 물로 세 번 세척하고 30 분 동안 실온에서 공기-건조시켰다. 200 kV에서 수행된 TECNAI F20 전자 현미경(Philips Electronic Instruments Corp., Mahwah, NJ)을 이용하여 TEM(transmission electron microscopy)으로 시료를 가시화하였다.

리포좀 흡수의 In vitro 효능

Rh-PE(rhodamine-phosphatidylethanolamine)으로 형광 라벨링된 9R-LS(9R/ODN) 입자를 0.5 μM ODN의 농도까지 무-혈청 RPMI 1640에서 희석하였다. 커버 슬립(cover slips) (12x12 mm, Fisher Scientific, TX, USA)상에서 약 80% 컨플루언스가 되도록, 인간 U87MG 아교모세포종(glioblastoma) 세포를 FBS(fetal bovine serum)으로 보충된 10% RPMI 1640에서 배양하고, 형광 라벨링된 9R-LS(9R/ODN)을 포함하는 무-혈청 배지로 상기 배지를 교체하였다. 37℃에서 1시간 동안 배양시킨 다음, 세포들은 PBS로 세 번 세척하고 4%(w/v) 파라포름알데히드로 고정하였다. 핵은 DRAQ5(Biostatus, UK)로 대조-염색하였다. 고정 세포가 있는 커버슬립을 글리세롤 마운팅 배지(Dako)와 함께 슬라이드 글라이스 위에 마운팅하고 25X 및 60X 유침(oil-immersion) 렌즈가 구비된 Leica TCS SP2 AOBS 공초점 현미경(Mannheim, 독일)을 이용하여 조사하였다. Cy2 및 Cy3의 전이 각각에 대한 488 및 543 nm의 레이저 라인을 Ar 레이저 및 HeNe 레이저를 이용하여 제공하였다.

NF-κB 억제를 통한 파클리탁셀에 in vitro 민감성

9R-LS(9R/ODN)의 in vitro 효능은 파클리탁셀 화학요법에 대한 U87MG 아교모세포종(glioblastoma)의 NF-κB 데코이 ODN-매개 민감성을 평가함으로써 확인하였다. 9R-LS(9R/ODN)을 ODN의 0.5 μM 농도로 무-혈청 RPMI 1640에서 희석하였다. U87MG 세포를 10% FBS로 보충한 RPMI 1640의 96-웰 플레이트상에서 약 50% 컨플루언스까지 배양하였다. 완전 배지를 지질 제형을 포함하는 무-혈청 배지로 교체함으로써 처리를 시작하였다. 37℃에서 4 시간 동안 상기 제형을 반응시킨 다음, 세포를 세척하고 50 nM의 농도로 파클리탁셀을 포함하는 완전 RPMI 1640에서 추가적으로 24시간 동안 반응시켰다. 파클리탁셀로 24시간 동안 반응시킨 다음, 세포 생존율은 MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 어세이로 측정하였다. 요약하면, 40 ㎕의 MTT 용액(2.5 mg/ml)을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 4시간 동안 반응시켰다. 배지를 세척하고 200 ㎕의 DMSO를 각 웰에 첨가한 다음 잘 혼합되도록 하기 위해서 몇 번 파이펫팅하였다. OD(Optical density)는 플레이트 리더를 이용하여 570 nm 파장에서 측정하였다. 각 조건을 세 번 반복하여 분석하였고, 상대적인 세포 생존율은 배지만을 처리한 세포 생존율의 비율로 계산하였다.

In vitro TUNEL 어세이

세포를 씨딩하기 24시간 전에, 커버슬립을 6-웰 플레이트의 웰에 위치시키고 화학적 간섭(chemical intervention) 없이 세포 부착을 향상시키기 위해서 완전 배지로 배양함으로써 “에이징” 시켰다. U87MG 세포를 약 50% 컨플루언시에서 커버슬립상에 씨딩하였다. 세포를 대조군 리포좀 또는 9R/ODN-로딩 리포좀 제형으로 처리하였다. 4시간 동안 처리 한 후, 배지를 세척하고 완전 배지로 교체한 다음, 세포를 24시간 동안 추가적으로 배양하였다. 파클리탁셀 처리를 위해서, 50 nM PTX(paclitaxel)를 첨가된 완전 배지에 포함시켰다. TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) 어세이를 TdT-FragEL DNA 절편 검출 키트(Promega, WI)를 이용하여 실시하였고, 단편(section)은 형광 현미경(TCS SL, Leica, Heidelberg, 독일)을 이용하여 조사하였다.

실험결과

9R/ODN 복합체(complex)가 로딩된 9R-변형 리포좀

전하의 상호작용을 적용한 종래에 기재된 과정[16, 18]에 수정을 가하여, 리포좀으로 미리 형성된 9R/ODN 복합체를 봉입하는데 이용하였다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 양이온의 9R 펩타이드와 20-mer 이중-가닥 음이온 ODN과의 전-응축(pre-condensation)에 의해서 제형을 구축(construct)하였다. 9R 펩타이드와 ODN간의 복합체 형성은 2% (w/v) 아가로스 겔 상에서 전기영동을 이용하여 확인하였다(도 2a). 9R 펩타이드와 복합체를 형성하는 경우에는, ODN은 크기 제한 때문에 겔을 통해서 이동할 수 없다. +/- 전하 비 5에서 유리(free) ODN의 이동 없이 모든 ODN은 웰에 존재하였는데, 이는 모든 ODN이 완전히 복합체를 형성하였음을 의미한다. 이러한 실험을 통해서, 6의 +/- 전하 비는 전체적으로 양전하를 띄는 9R/ODN 복합체를 수득하는데 이용되었다. 수용액에서 음이온의 지질 막과 반응시킴으로써, 상기 미리 형성되고 전체적으로 양전하를 가지는 복합체를 9R 펩타이드-변형 리포좀(9R-LS) 내에 봉입시키고 막을 통해서 현탁액을 압출하였다. 펩타이드 내의 (+), ODN 내의 (-) 및 POPG 내의 (-) 전하의 비는 6:1:6이었다.

9R/ODN 복합체를 포함하는 수용액상의 완충액에서 인지질 필름의 재수화는 폭넓은 크기 분포(478 ± 2)와 급속한 응집 및 상분리를 하는 경향을 가지는 혼탁상의 현탁액을 만들었다. 그러나, 막 압출(extrusion)로 좁고 단모드(unimodal)한 크기 분포를 가지는 투명하고 안정한 현탁액을 제조하였다(106± 3, 표 1).

크기 분포 및 제타 포텐셜

-	크기 분포(nm)	제타 포텐셜(mV)
LS-(9R/ODN)	125.9 ± 2.82	-23.41 ± 2.82
9R-LS(9R/ODN)	106.2 ± 3.44	-14.55 ± 1.65

데이터는 평균 ± s.e.m을 나타낸다(n≥3).

이러한 관측 결과는 TEM(transmission electron microscopy)에 의한 형태적 분석과 일치하였다. 대조 염색 후 TEM 가시화는 밝게 염색된 피막에 의해 둘러싸이고 어둡게 염색된 코어를 가지는 소낭 구조를 보여주었고, 피막은 인지질막 그리고 코어는 9R/ODN 복합체를 각각 나타낸다(도 2c). 크기 배제 크로마토그래피는 거의 모든 ODN이 리포좀으로 봉입됨(ODN이 공극 부피에 용리되기 때문에)을 보여주고 있으나, 이는 ODN이 9R 펩타이드와 먼저 복합체를 형성하는 경우만 그러했다(도 2b). ODN만이 리포좀에 봉입될 수는 없었다.

따라서, 9R과 ODN의 미리 복합체 형성은 9R/ODN-공 로딩된 음이온 리포좀의 제조에 절대적으로 요구된다. 순차적인 전하 상호작용은 음이온 리포좀 내에 9R/ODN 복합체의 효율적인 봉입을 보장하고 2.5 wt% 함량의 약 100% 로딩 효율을 초래하였다. 또한, 같은 전하끼리 작용하는 척력 때문에 리포좀 그 자체가 세포막에 크게 감소된 비-특이적 결합을 나타낼 것임을 음이온 리포좀의 이용은 보여주었다.

In vitro 세포 내 흡수

형광 라벨링된 9R-LS(9R/ODN) 리포좀을 1 시간의 반응 시간 중에 세포와 관련시키고 포함시켰다. 형광 시그널을 세포 막에서 그리고 세포질에서 별개의 입자로 빠르게 검출하였다. 핵에서의 축적은 관찰되지 않았다. 한편, 세포 친화성 및 세포 내 흡수는 리포좀 표면에 9R 펩타이드가 결합되어 있지 않은 대조군 제형 LS(9R/ODN)로 처리한 세포에서 제일 작았는데, 이는 표면상에 존재하는 9R 펩타이드가 세포 친화성 및 세포 내 흡수를 가능하게 함을 의미한다. TMR과 A488의 공-위치화는 입자들이 온전한(intact) 형태로 존재하고 세기를 유지함을 보여주었다(도 2c).

종합하면, 이러한 결과는 CPP로서 9R 펩타이드와 1:6의 총 전하 비율(N/P)을 이용하여 9R/ODN-로딩 리포좀을 제조하였고, 음이온 리포좀에의 PEG2000-DSPE의 포함은 효율적인 세포간 전달 시스템을 제공하였음을 의미한다.

In vitro 세포독성 어세이

9R-LS(9R/ODN) 제형의 세포독성을 검출할 수 있는 범위까지 조정하였고, 이는 9R-LS 피막(envelope)에 의해서가 아니라 9R/ODN 코어에 의해 야기시켰다. 0.5 μM ODN 농도에서 9R-LS(9R/ODN)로 U87MG 세포를 처리함으로써, 무처리 세포와 비교하여 세포 생존율을 약 20% 감소시켰으나, 9R/ODN이 없는 동일한 농도의 9R-LS 제형은 세포 생존율에 영향이 없었다(도 4b).

NF-κB 경로는 다양한 암의 발달 및 진행에 관여해 왔고, 상기 경로의 활성화는 항암 치료에 대한 내성을 유도하는 것으로 알려져 왔다[19,20]. 따라서, NF-κB 경로의 억제는 파클리탁셀과 같은 화학치료제에 암 세포를 민감화시키는 유망한 전략으로 보여졌는데[21], 이는 NF-κB를 다양한 블록킹제로 억제시키는 경우에 보다 효율적으로 나타났다. 9R-LS(9R/ODN) 리포좀이 NF-κB cis-element를 포함하는 데코이(decoy) ODN의 카고(cargo)를 효율적으로 운반하는지 여부를 결정하기 위해서[18], 본 발명자들은 파클리탁셀만의 처리로 단지 근소적으로 세포독성을 보였던 파클리탁셀의 농도에서 U87MG 아교모세포종(glioblastoma) 세포를 민감화시키기 위한 인지질 제형의 능력을 시험하였다. 50 nM 파클리탁셀 또는 9R-LS(9R/ODN)으로 U87MG 세포를 처리하는 경우에, 무처리 세포에 비해서 약 20% 까지 세포 생존율을 감소시켰다. 그러나, 동일한 농도의 파클리탁셀을 처리하는 경우, 9R-LS(9R/ODN)로 전처리한 세포의 생존율을 약 50%까지 감소시켰다. 이러한 결과는 데코이(decoy) ODN이 NF-κB 활성화를 성공적으로 억제함을 의미하고, 파클리탁셀과 조합된 데코이 ODN에 의한 NF-κB의 억제는 암을 치료하기 위한 유망한 접근법임을 보여준다.

In vitro TUNEL 어세이

세포 사멸 세포(apoptotic cell)의 핵에서의 녹색 반점 형광의 존재에 의해 입증된 바와 같이, TUNEL 어세이는 세포 사멸의 DNA 절편 특성을 보여주었다. 녹색 시그널이 9R-LS(9R/ODN) 또는 9R-LS(9R/ODN)와 50 nM PTX로 처리된 세포에 존재함을 형광 현미경 이미지는 보여주었으나, 후자 군에서 형광세기가 훨씬 더 높았다. 한편, 50 nM PTX만으로 처리된 세포는 세포사멸을 보여주지 않았다. 이러한 결과는 MTT 어세이 결과와 일치하였고, 이는 50 nM PTX는 U87MG 세포에 독성이 있는 것이 아니고, 실질적으로 9R-LS(9R/ODN)로 처리한 후에 생존율을 감소시킴을 보여주었다(도 4c).

논의 사항

본 실험의 결과는 다음의 결론과 양립할 수 있다: 첫째, 양이온의 9R 펩타이드는 단단한 복합체 형성을 통해서 리포좀 담체 내에 올리뉴클레오타이드를 봉입시킬 수 있다. 둘째, 리포좀 담체의 표면에 존재하는 9R 펩타이드는 세포질로 상기 담체 및 이의 운반대상(cargo)를 전달할 수 있다. 셋째는, NF-κB 데코이 ODN의 세포간 운반은 U87MG 아교모세포종(glioblastoma) 세포에 대한 파클리탁셀의 항-암 효능을 개선시켰다.

효율적인 약물 전달 시스템의 중요한 특성은 높은 약물 봉입 효율인데, 이는 투여 주기를 감소시키기 위해서 요구된다. 또한, 봉입은 타깃에 도달하기 전에 분해로부터 운반대상을 보호할 수 있다. 종래 그리고 페길화된 리포좀으로의 유리(free) DNA 분자의 봉입은 몇 가지 방법으로 연구되어 왔다; 그러나, 대부분의 경우에서 약 50%의 낮은 효율만이 나타났다.

9R 펩타이드는 세포 독성을 유도하지 않는 이점을 가지고 있다. 또한, 9R 펩타이드를 이용한 복합체 형성은 ODN 봉입 효율을 증가시키기 위한 용이하고 효율적인 방법으로 제공한다. 복합 및 응축제로서 9R 펩타이드를 이용함으로써, 복합체를 형성하지 않은 ODN(5% 이하)과 비교하여 ODN의 봉입 효율은 약 95%로 크게 증가하였다. 이러한 높은 봉입율은 9R 펩타이드 및 ODN의 N/P 전하 비를 조작함으로써 달성될 수 있다; 1:6의 전하 비(N/P)에서, 복합체는 다소 양 전하를 가질 수 있다. 담체의 알짜 표면 전하(net surface charge)는 유전자 전달 효율을 결정하는데 중요한 역할을 한다. 이상적으로, 담체의 양(+)의 제타 포텐셜은 DNA 응축을 개선시킬 수 있다[23]. 이는 복합체가 음이온의 리포좀으로 봉입되는데 도움을 준다.

CPP로서 9R의 특성과 일치하여, 9R 펩타이드-컨쥬게이트 리포좀은 개선된 세포 투과 능력을 보여주었다. 리포좀의 (POPG 상의) 전체 음전하 때문에 대조군 리포좀은 U87MG 세포에 비-특이적으로 결합하지 않음을 보여주었는데, 이는 음전하를 띄는 세포막에 의해 척력이 작용하기 때문이다. 따라서, 본 발명자들은 리포좀의 세포-부착 및 투과 특성은 오로지 9R 펩타이드의 효과 때문이라고 결론지었다.

Alexa 546로 형광 라벨링된 ODN을 이용하여, 본 발명자들은 세포 내로의 ODN의 트래픽킹(trafficking)을 조사할 수 있었다. 본 발명자들은 심지어 반응 24 시간 후 에도 U87MG 세포에 ODN이 존재함을 발견하였다(데이터는 제시하지 않음). 이는 ODN이 빠르게 분비되었다거나 엔도좀(endosome)에 의해 분해되었음을 의미하지 않는다. 왜냐하면 ODN이 보다 오랜 시간 동안 세포질에 존재하였기 때문에, 세포질 내에서 운반대상의 안정적이고 지속적인 체류를 요구하는, 넉다운 연구에서 ODN은 효과적으로 이용될 수 있었다. 이중 라벨링 연구에 Alexa 488-라벨링 9R 펩타이드를 이용하여, 본 발명자들은 9R 펩타이드만이 핵을 투과할 수 있음을 확인하였다.

이러한 관측 결과로부터, 본 발명자들은 9R-LS는 세포로 9R/ODN 복합체를 효율적으로 전달할 수 있다고 결론지었다. 또한, 본 발명자들은 상기 복합체가 세포질로 방출된 후, 강한 공유 결합에 의해 유지되지 않은 9R/ODN 복합체는 세포질내에서 해리됨을 알 수 있었다. 그 다음 9R 펩타이드는 핵으로 이동하였으나, ODN은 세포질에 머물렀다. 만약에 이러한 해석이 타당하다면, 9R 펩타이드에 운반대상을 공유적으로 컨쥬게이팅 시킴으로써 핵 타깃팅이 증가할 가능성이 높을 것이다.

NF-κB 경로는 다양한 암의 발달과 진행에 관련되어 있으며, 상기 경로의 활성화는 항암 치료의 내성을 유도하는 것으로 보여졌다[19,20]. 그러나, 단순히 NF-κB를 억제하는 것은 확고한 세포 사멸 반응을 초래하지는 않을 것이다. 다소, 상기 억제는 세포 사멸의 역치를 낮추는 경향이 있고, 다른 암 치료에 부가(adjunct)로서 이용될 가능성은 높을 것이다[21]. 따라서, NF-κB 경로의 억제는 화학치료제에 암 세포를 민감화시키기 위한 그리고 화학치료법의 효능을 개선시키는데 유망한 전략으로 제안되어 왔다[22].

9R-LS(9R/ODN)의 가능성은 파클리탁셀의 NF-κB 경로의 억제 및 U87MG 암세포에서의 개선된 세포독성 효과에 의해 명백히 입증되었다. 또한, 9R-LS(9R/ODN)와 파클리탁셀의 조합 처리의 개선된 항암 효능은 9R의 지질막 내부에 파클리탁셀을 봉입함으로써 추가적인 개선이 얻어질 수 있다는 아주 흥미로운 가능성을 제시하였다. 상기 제형은 NF-κB 경로와 관련된 다양한 염증 질환의 치료에 또한 효율적일 것이고 다양한 치료학적 유전 물질의 세포내 운반에 대해 유망한 접근법을 제공할 수 있을 것이다.

결론

본 발명자들은 9R 펩타이드가 세포-투과 및 복합제로서 작용하는 신규한 ODN 운반 시스템을 보고한다. ODN 봉입 효율은 9R 펩타이드를 이용하여 크게 개선되었고, 이로써 ODN은 종양 치료를 위한 효율적인 운반 시스템으로 제공될 수 있다. 9R 펩타이드의 세포-투과능은 제형의 특이성 및 효율성을 보다 더 개선시키기 위해서 종양-특이적 타깃팅 리간드에 의해 보완 될 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참조문헌

[1] J. S. Gill, X. Zhu, M. J. Moore, L. Lu, M. J. Yaszwmski, A. J. Windebank, Biomaterials . 2002, 23, 2773.

[2] S. Futaki, W. Ohashi, T. Suzuki, M. Niwa, S. Tanaka, K. Ueda, H. Harashima, Y. Sugiura, Bioconjug Chem 2001, 12, 1005.

[3] C. Bolenz, C. Weiss, M. Wenzel, U. Gabriel, A. Steidler, A. Becker, E. Herrmann, L. Trojan, M. S. Michel, J. Cancer Res . Clin . Oncol . 2009, 135, 679

[4] N. Dias, C. A. Stein, Mol . Cancer Ther . 2002, 1, 347

[5] C. Plank, W. Zauner, E. Wagner, Adv Drug Deliv Rev 1998, 34, 21.

[6] A. Prochiantz, Curr Opin Cell Biol 2000, 12, 400.

[7] K. M. Stewart, K. L. Horton, S. O. Kelley, Org Biomol Chem 2008, 6, 2242.

[8] Y. Wang, Y. Hou, H. Lee, J. Biochem . Bioph . Meth . 2007. 70, 579.

[9] V. Sebbage, Bioscience Horizons . 2009, 2, 64.

[10] J. Guo, U. N. Verma, R. B. Gaynor, E. P. Frenkel, C. R. Becerra, Clin . Cancer Res . 2004, 10, 3333.

[11] S. Deshayes, M. Morris, F. Heitz, G. Divita, Adv Drug Deliv Rev 2008, 60, 537.

[12] P. A. Wender, D. J. Mitchell, K. Pattabiraman, E. T. Pelkey, L. Steinman, J. B. Rothbard, Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97, 13003.

[13] C. Zhang, N. Tang, X. Liu, W. Liang, W. Xu, V. P. Torchilin, J. Control Release . 2006, 112, 229.

[14] W. J. Kim, L. V. Christensen, S. Jo, J. W. Yockman, J. H. Jeong, Y. H. Kim, S. W. Kim, Mol Ther 2006, 14, 343.

[15] P. Kumar, H. Wu, J. L. McBride, K. E. Jung, M. H. Kim, B. L. Davidson, S. K. Lee, P. Shankar, N. Manjunath, Nature 2007, 448, 39.

[16] Y. T. Ko, R. Bhattacharya, U. Bickel, J Control Release 2009, 133, 230.

[17] M. N. Uddin, D. P. Do, S. B. Pai, S. Gayakwad, C. W. Oettinger, M. J. D’Souza, Analyst . 2009, 134, 1483.

[18] D. W. Pack, A. S. Hoffman, S. Pun, P. S. Stayton, Nat . Dru Del . Rev . 2005, 4, 581.

[19] M. Karin, Nature 2006, 441, 431.

[20] W. E. Naugler, M. Karin, Curr Opin Genet Dev 2008, 18, 19.

[21] M. Karin, Mol Carcinog 2006, 45, 355.

[22] O. P. Veiby, M. A. Read, Clin Cancer Res 2004, 10, 3262.

[23] X. D. Guo, F. Tandiono, N. Wiradharma, D. Y. Khor, C. G. Tan, M. Khan, Y. Qian, Y. Y. Yang, Biomaterials . 2008, 29, 4838-4846

<110> Gwangju Institute of Science and Technology <120> Gene Delivery System <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligodeoxynucleotide Sense Strand <400> 1 ccttgaaggg atttccctcc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligodeoxynucleotide Antisense Strand <400> 2 ggagggaaat cccttcaagg 20

Claims (17)

1. 다음을 포함하는 유전자 운반체(gene delivery system):
   (a) 표면에 양이온성 펩타이드가 결합되어 있고 이중막 구조를 가지는 인지질 리포좀; 및
   (b) (i) 운반대상(cargo)으로서의 뉴클레오타이드 분자, 및 (ii) 세포투과펩타이드(cell penetration peptide)로서 양이온성 펩타이드를 포함하는 복합체(complex), 상기 복합체는 상기 인지질 리포좀 내부에 봉입(encapsulation) 되어 있으며,
   상기 운반대상으로서의 뉴클레오타이드 분자와 세포투과펩타이드로서 양이온성 펩타이드의 전하의 비(음전하:양전하)가 1:4-9인 것을 특징으로 하는 유전자 운반체.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 양이온성 펩타이드는 상기 인지질 리포좀의 표면에 결합되어 있는 친수성 고분자를 통하여 간접적으로 상기 인지질 리포좀의 표면에 결합된 것을 특징으로 하는 유전자 운반체.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 양이온성 펩타이드는 HIV(human immunodeficiency virus)-Tat, 6-40 아미노산 잔기로 구성되어 있고 상기 아미노산 잔기 중 최소 3개는 라이신, 아르기닌 또는 라이신과 아르기닌인 펩타이드, KALA 및 프로타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 운반체.
   
4. 제 2 항에 있어서, 상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜과 폴리프로필렌글리콜의 공중합체, 키토산, 덱스트란, 셀룰로오스, 헤파린, 알지네이트 또는 이들의 모노에스테르화 유도체인 것을 특징으로 하는 유전자 운반체.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 운반대상의 뉴클레오타이드 분자는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앱타머, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), DNAzyme 또는 전사인자 결합 서열에 해당하는 이중쇄 올리고뉴클레오타이드(double-stranded ODN)인 것을 특징으로 하는 유전자 운반체.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 복합체는 운반대상(cargo)으로서의 뉴클레오타이드 분자 및 세포투과펩타이드(cell penetration peptide)로서 양이온성 펩타이드의 전하의 비(음전하:양전하)가 1:5-7로 형성된 것을 특징으로 하는 유전자 운반체.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자 운반체의 인지질 리포좀의 표면은 타겟팅 리간드(targeting ligand)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 운반체.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 타겟팅 리간드는 다음을 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더(Bipodal Peptide Binder: BPB) 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 유전자 운반체: (i) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성된 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); 및 (ii) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 Ⅱ(target binding region Ⅱ).
   
9. 다음의 단계를 포함하는 유전자 운반체(gene delivery system)의 제조방법:
   (a) (i) 운반대상(cargo)으로서의 뉴클레오타이드 분자 및 (ii) 세포투과펩타이드(cell penetration peptide)로서 양이온성 펩타이드를 포함하는 복합체(complex)를 형성하는 단계로서, 상기 운반대상으로서의 뉴클레오타이드 분자 및 세포투과펩타이드로서 양이온성 펩타이드의 전하의 비(음전하:양전하)가 1:4-9로 형성되며;
   (b) 인지질 및 표면에 양이온성 펩타이드가 결합되어 있는 인지질을 혼합하여 인지질 필름을 형성하는 단계; 및
   (c) 상기 단계 (a)의 복합체 및 상기 단계 (b)의 인지질 필름을 혼합 및 압출하여 상기 복합체가 봉입된 리포좀을 수득하는 단계.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 운반대상의 뉴클레오타이드 분자는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앱타머, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), DNAzyme 또는 전사인자 결합 서열에 해당하는 이중쇄 올리고뉴클레오타이드(double-stranded ODN)인 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. 제 9 항에 있어서, 상기 양이온성 펩타이드는 HIV(human immunodeficiency virus)-Tat, 6-40 아미노산 잔기로 구성되어 있고 상기 아미노산 잔기 중 최소 3개는 라이신, 아르기닌 또는 라이신과 아르기닌인 펩타이드, KALA 및 프로타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
12. 제 9 항에 있어서, 상기 단계 (b)에 표면에 친수성 고분자가 결합되어 있는 인지질을 추가적으로 혼합하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
13. 다음을 포함하는 항암 조성물:
    (a) 표면에 양이온성 펩타이드가 결합되어 있고 이중막 구조를 가지는 인지질 리포좀; 및
    (b) (i) 운반대상(cargo)으로서 NF-κB 전사인자의 결합 서열에 해당하는 이중쇄 올리고뉴클레오타이드(double-stranded ODN), 및 (ii) 세포투과펩타이드(cell penetration peptide)로서 양이온성 펩타이드를 포함하는 복합체(complex), 상기 복합체는 상기 인지질 리포좀 내부에 봉입(encapsulation) 되어 있으며,
    상기 운반대상으로서의 이중쇄 올리고뉴클레오타이드와 세포투과펩타이드로서 양이온성 펩타이드의 전하의 비(음전하:양전하)가 1:4-9인 것을 특징으로 하는 항암 조성물.
    
14. 다음을 포함하는 항암제 민감화 조성물:
    (a) 표면에 양이온성 펩타이드가 결합되어 있고 이중막 구조를 가지는 인지질 리포좀; 및
    (b) (i) 운반대상(cargo)으로서 NF-κB 전사인자의 결합 서열에 해당하는 이중쇄 올리고뉴클레오타이드(double-stranded ODN), 및 (ii) 세포투과펩타이드(cell penetration peptide)로서 양이온성 펩타이드를 포함하는 복합체(complex), 상기 복합체는 상기 인지질 리포좀 내부에 봉입(encapsulation) 되어 있으며,
    상기 운반대상으로서의 이중쇄 올리고뉴클레오타이드와 세포투과펩타이드로서 양이온성 펩타이드의 전하의 비(음전하:양전하)가 1:4-9인 것을 특징으로 하는 항암제 민감화 조성물.
    
15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 양이온성 펩타이드는 상기 인지질 리포좀의 표면에 결합되어 있는 친수성 고분자를 통하여 간접적으로 상기 인지질 리포좀의 표면에 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
    
16. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 인지질 리포좀의 표면은 타겟팅 리간드(targeting ligand)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
17. 제 16 항에 있어서, 상기 타겟팅 리간드는 다음을 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더(Bipodal Peptide Binder: BPB) 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물: (i) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성된 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); 및 (ii) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 Ⅱ(target binding region Ⅱ).

Images