CN116019927B - 三药共组装无载体药物递送体系及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，公开了一种三药共组装无载体药物递送体系及其制备方法和应用。该三药共组装无载体药物递送体系由多肽、肿瘤细胞化疗药物和siRNA药物共组装而成，所述多肽含有穿膜肽、靶向肽和抗肿瘤肽中的至少一种。本发明提供的三药共组装无载体药物递送体系的载药量高，也避免了大分子材料引入造成的代谢问题和毒副作用；其次，本发明提供的体系组分明确，质量易控，制备工艺简单，易于大规模工业化生产，在癌症治疗过程中具有重大的意义。该无载体药物递送体系具有良好的靶向性，可有效抑制肿瘤细胞的增殖，且具有良好的生物安全性。

Description

三药共组装无载体药物递送体系及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及一种三药共组装无载体药物递送体系及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是由多种基因变化和细胞异常引起的高度复杂的疾病，包括白血病在内的肿瘤的异质性和信号通路的复杂性加快了肿瘤细胞的生长和转移，最终导致患者的死亡率显著增加。化疗已成为治疗癌症患者的标准方案，但由于癌症的异质性和复杂性，很难通过使用单一的化学治疗药物来彻底根除肿瘤。两种或多种作用机制不同的疗法的组合，在治疗癌症的研究中引起了极大的关注。小干扰RNA(siRNA)通过激活RNA干扰(RNAi)，可以高效和特异性地沉默几乎任何基因的表达。RNAi技术的进步为沉默与癌症治疗相关的靶基因提供了高度特异性的治疗选择，因此，它已被用作一种新的治疗策略。近期多项研究表明，化疗药物和siRNA的组合与单独的化疗药物或siRNA相比具有更好的抗癌效果。因此，化学疗法和RNAi技术结合的联合疗法是一种理想的癌症治疗方法，siRNA和化疗药物的联合治疗可以克服多药耐药，通过多种途径诱导细胞凋亡产生协同作用，并降低毒性和其他副作用。
为了实现这种组合的协同效应，化疗药物和siRNA需要被同时递送到相同的肿瘤细胞中。由于寡核苷酸与小分子药物的物理化学性质截然不同，因此，通常需要载体来封装这两种不同的药物实现有效载荷。纳米载体能够通过物理或化学相互作用同时包裹化学药物和siRNA，并共同递送至相同的细胞，已成为一种有潜力的联合治疗递送平台。纳米载体还具有许多其他优势，包括提高疏水性药物的溶解度、延长循环时间、通过被动或主动靶向将药物递送至肿瘤以最大限度地减少全身副作用，以及控制药物释放。目前，已经开发了各种纳米粒来共同递送化疗药物和siRNA，包括脂质体、树枝状大分子、胶束、聚合物和无机纳米材料等。
基于纳米载体的药物递送系统不仅可以提高药物的稳定性和生物相容性，还可以延长药物分子的血液循环时间，从而增强药物在肿瘤组织内的积累。但大多数基于纳米载体的药物递送系统复杂的制备或纯化过程阻碍了它们的规模化生产，因此很难从实验室向临床转化。此外，纳米载体的低载药能力和缓慢的药物释放进一步限制了它们的治疗效果，且这些传统的合成纳米载体材料主要是外源性的，可能会在机体诱导免疫反应或引起潜在的长期全身毒性，从而进一步限制其临床转化。近年来，完全或大部分由活性药物成分自组装的无载体纳米药物递送体系由于其突出的特性而引起了极大的关注：(i)无载体纳米药物通过增强渗透和滞留效应，具有更长的血液循环时间，更好的细胞渗透性和更高的肿瘤积累；(ii)在制备纳米药物时不使用额外的纳米载体，不仅提高了载药效率(甚至高达100％)，而且避免了与载体相关的潜在生物毒性问题；(iii)其简单的制备方法显著促进了大规模的工业化生产。
目前，用于癌症治疗的化学/基因联合治疗的无载体纳米药物的研究报道仍十分有限。因此，开发无载体纳米药物，有效控制药物和基因释放，最大限度地提高治疗效率，将具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种三药共组装无载体药物递送体系及其制备方法和应用，该无载体药物递送体系具有良好的靶向性，可有效抑制肿瘤细胞的增殖，激活抗肿瘤免疫，且具有良好的生物安全性。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种三药共组装无载体药物递送体系，该三药共组装无载体药物递送体系由多肽、肿瘤细胞化疗药物和siRNA药物共组装而成，所述多肽含有穿膜肽、靶向肽和抗肿瘤肽中的至少一种。
优选地，所述多肽含有穿膜肽和抗肿瘤肽；
优选地，所述穿膜肽为特异性靶向肿瘤细胞的穿膜肽；
优选地，所述穿膜肽为特异性靶向急性髓系白血病细胞的穿膜肽，优选为靶向穿膜肽CPP44。
优选地，所述靶向穿膜肽CPP44的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，所述抗肿瘤肽为p16肽。
优选地，所述p16肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选地，所述穿膜肽、所述抗肿瘤肽、所述肿瘤细胞化疗药物与所述siRNA药物的摩尔比为4-10:4-10:4-200:1，优选为6-10:6-10:7-16:1。
优选地，所述肿瘤细胞化疗药物为可π-π堆积的药物，更优选为选自盐酸柔红霉素、阿霉素和紫杉醇中的至少一种，进一步优选为盐酸柔红霉素。
优选地，所述siRNA药物为能够特异性抑制和沉默白细胞免疫球蛋白类受体表达的siRNA。
优选地，所述siRNA药物含有完全反向互补的正义链和反义链，所述正义链和所述反义链的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20以及SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22中的任意一对所示。
优选地，所述siRNA药物的正义链和反义链的核苷酸序列为SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10。
本发明第二方面提供上述的三药共组装无载体药物递送体系的制备方法，包括以下步骤：
将多肽与肿瘤细胞化疗药物进行反应I形成多肽-化疗药物合成体，将所述多肽-化疗药物合成体与siRNA药物进行反应II，形成所述三药共组装无载体药物递送体系。
优选地，所述多肽为由穿膜肽与抗肿瘤肽融合形成的穿膜-抗肿瘤融合肽；
优选地，所述反应I的过程包括：在三氟乙酸存在的条件下，将含有所述穿膜-抗肿瘤融合肽的溶液滴加至含有所述肿瘤细胞化疗药物的溶液中，进行避光反应形成穿膜肽-抗肿瘤肽-化疗药物合成体。
优选地，所述避光反应的条件包括：温度为4-42℃，时间为20-60h。
优选地，所述穿膜-抗肿瘤融合肽和所述肿瘤细胞化疗药物分别采用二甲基亚砜为溶剂形成各自的溶液。
优选地，所述反应II的过程包括：将含有所述多肽-化疗药物合成体的溶液与含有所述siRNA药物的溶液混合后，吹打混匀，进行静置反应。
优选地，所述静置反应的条件包括：温度为4-42℃，时间为5-60min。
优选地，所述靶向多肽-化疗药物合成体的溶液与含有所述siRNA药物分别采用无RNA酶水为溶剂形成各自的溶液。
本发明第三方面提供上述的三药共组装无载体药物递送体系、上述的制备方法制得的三药共组装无载体药物递送体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述抗肿瘤药物为治疗急性髓系白血病的药物。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
本发明提供的三药共组装无载体药物递送体系为自组装纳米粒，在体外具有良好的稳定性，对抗肿瘤肽、肿瘤细胞化疗药物和siRNA药物均具有很高的药物装载能力，避免了大分子材料引入造成的代谢问题和毒副作用；该三药共组装无载体药物递送体系显著抑制肿瘤细胞的增殖，激活抗肿瘤免疫反应，进而实现对肿瘤的多机制联合治疗，且该药物递送体系具有良好的生物安全性；
进一步地，以靶向穿膜肽CPP44、p16肽、针对LILRB4的siRNA和盐酸柔红霉素共组装形成的无载体药物递送体系，在急性髓系白血病(AML)细胞中的摄取量显著提高，有效沉默AML细胞中的靶标LILRB4的mRNA表达，通过直接杀伤肿瘤细胞和激活抗肿瘤免疫的多重作用，实现对AML细胞的多机制联合治疗，为解决急性髓系白血病的临床治疗难题提供新策略。
本发明提供的三药共组装无载体药物递送体系载药量高，粒径均一，稳定性高，生物相容性好，提供了更高效的光热治疗，能够用于治疗或缓解良性肿瘤或恶性肿瘤，因此具有良好的实际应用之价值；且该体系组分明确，质量易控，制备工艺简单，易于大规模工业化生产，在癌症治疗过程中具有重大的意义。
附图说明
图1是实施例1中CPP44-p16-hyd的LC-MS检测图谱；
图2是实施例1中多肽CPP44-p16-hyd的HPLC检测图谱；
图3是实施例1中CPP44-p16-hyd的MALDI-TOF图谱；
图4是实施例1中CPP44-p16-hyd-DNR的MALDI-TOF图谱；
图5是实施例1中CPDS纳米颗粒的凝胶阻滞实验的凝胶成像图；
图6是CPP44-p16-hyd-DNR与siRNA摩尔比为8:1时制得的CPDS纳米颗粒的透射电镜图；
图7是实施例1中制得的CPDS纳米颗粒的zeta电位图，a为CPD与siRNA不同比例制得的CPDS纳米颗粒，b为CPD、siRNA、CPDS纳米颗粒；
图8是CPP44-p16-hyd-DNR与siRNA摩尔比为8:1时制得的CPDS纳米颗粒中DNR、siRNA和p16的包封率(a)和载药量(b)；
图9是CPP44-p16-hyd-DNR与siRNA摩尔比为8:1时制得的CPDS纳米颗粒的血清稳定性TEM图；
图10是实施例2中测定SDS置换siRNA浓度的凝胶电泳图(a)以及负载于CPDS内的siRNA在RNase A作用下的降解凝胶电泳图(b)；
图11是不同组DNR和Cy5-siRNA在THP-1细胞中的摄取情况；
图12是qRT-PCR检测LILRB4 mRNA的表达量结果图；
图13是不同给药组对THP-1细胞的增殖抑制效果图；
图14是CD8+T细胞对THP-1细胞的杀伤效果图；
图15是CPDS纳米颗粒的体内组织分布结果图，a为CPD@Cy5-siRNA在各脏器的荧光信号图，b为Cy5-siRNA和CPD@Cy5-siRNA在各脏器的总发光效率；
图16是体内安全性考察时的给药方案(a)和各组小鼠的体重变化图(b)。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供了一种三药共组装无载体药物递送体系，该三药共组装无载体药物递送体系由多肽、肿瘤细胞化疗药物和siRNA药物共组装而成，多肽含有穿膜肽、靶向肽和抗肿瘤肽中的至少一种。
本发明中，三药共组装无载体药物递送体系为纳米粒，其纳米粒的粒径大小优选为20-150nm。
本发明中，所采用的多肽、肿瘤细胞化疗药物和siRNA药物分别可以根据该无载体药物递送体系所针对的肿瘤细胞的类别进行设计或者选择。三药共组装无载体药物递送体系在穿膜肽的作用下，可选择性结合肿瘤细胞，在体内特异性靶向肿瘤细胞富集的部位，以促进肿瘤细胞对无载体药物递送体系的摄取，进而提高肿瘤细胞对肿瘤细胞化疗药物、siRNA药物和抗肿瘤肽的摄取量，siRNA药物对肿瘤细胞中靶分子的高效特异性抑制作用，与肿瘤细胞化疗药物的作用相结合，能够显著抑制靶向肿瘤细胞的增殖，激活抗肿瘤免疫反应，实现对靶向肿瘤细胞的协同增效的治疗作用。
根据本发明，优选地，多肽含有穿膜肽和抗肿瘤肽；进一步优选地，穿膜肽为特异性靶向肿瘤细胞的穿膜肽。本发明提供的三药共组装无载体药物递送体系为自组装纳米粒，在体外具有良好的稳定性，对肿瘤细胞化疗药物、siRNA药物和抗肿瘤肽均具有很高的药物装载能力；该三药共组装无载体药物递送体系对肿瘤细胞具有良好的靶向性，显著抑制肿瘤细胞的增殖，进而实现抗肿瘤的效果，且该药物递送体系具有良好的生物安全性。
根据本发明，优选地，在三药共组装无载体药物递送体系用于对急性髓系白血病(AML)进行治疗时，穿膜肽为特异性靶向急性髓系白血病细胞的穿膜肽，更优选为靶向穿膜肽CPP44。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，靶向穿膜肽CPP44既具有靶向急性髓系白血病细胞的功能，又具有穿膜功能，融合到抗肿瘤肽上，可以不经化学修饰简单地将靶向配体引入无载体纳米递送系统，有助于增强肿瘤细胞的摄取并最大限度地减少在细胞外环境中的滞留。
根据本发明，优选地，靶向穿膜肽CPP44的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，
靶向穿膜肽CPP44：KRPTMRFRYTWNPMK(SEQ ID NO：1)。
根据本发明，在三药共组装无载体药物递送体系用于对急性髓系白血病(AML)进行治疗时，优选地，抗肿瘤肽为p16肽。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，能够利用p16肽的周期特异性药物特性，与肿瘤细胞化疗药物联用协同，以更好地治疗急性髓系白血病。
根据本发明，优选地，p16肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，
p16肽：GPG-rhlvvltdlf-GPRRRR(SEQ ID NO：2)，其中，小写字母代表“D”型氨基酸，大写为“L”型氨基酸，其中，rhlvvltdlf为p16肽中发挥毒性作用的氨基酸，通过GP-Linker在C端添加4个精氨酸残基(RRRR)以增加溶解度。
根据本发明，优选地，穿膜肽、抗肿瘤肽、肿瘤细胞化疗药物与siRNA药物的摩尔比为4-10:4-10:4-200:1，优选为6-10:6-10:7-16:1。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，可实现该无载体药物递送体系对抗肿瘤肽、肿瘤细胞化疗药物和siRNA药物三种药物的高效共载，获得较高的载药量和包封率，该无载体药物递送体系在血清中可以稳定维持其纳米结构，且稳定性和递送效率高，有利于提升其在体内外的转染能力和沉默效果，增强其抗肿瘤疗效。
根据本发明，在三药共组装无载体药物递送体系用于对急性髓系白血病(AML)进行治疗时，优选地，肿瘤细胞化疗药物为可π-π堆积的药物。进一步优选地，肿瘤细胞化疗药物选自盐酸柔红霉素、阿霉素和紫杉醇中的至少一种，更优选为盐酸柔红霉素。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，盐酸柔红霉素能够与穿膜肽、抗肿瘤肽和siRNA药物形成更好的协同作用，更高效地抑制肿瘤细胞的增殖。
根据本发明，siRNA药物可以是任意一种能够用于抗肿瘤的siRNA。在三药共组装无载体药物递送体系用于对急性髓系白血病(AML)进行治疗时，优选地，siRNA药物为能够特异性抑制和沉默白细胞免疫球蛋白类受体表达的siRNA；进一步优选为能够特异性抑制和沉默白细胞免疫球蛋白类受体B4(LILRB4)表达的siRNA。LILRB4在原发性AML细胞中高度表达，会抑制T细胞活性并促进肿瘤浸润，采用对靶分子LILRB4具有高特异性沉默效果的siRNA药物，该无载体药物递送体系携载的siRNA药物发挥沉默效果后，能够有效促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤，从而达到免疫治疗的目的。
根据本发明，优选地，siRNA药物含有完全反向互补的正义链和反义链，siRNA药物的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
SEQ ID NO.3：5’-GGAGAUACCGCUGUUACUA-3’，
SEQ ID NO.4：5’-UAGUAACAGCGGUAUCUCCCU-3’；
或者，siRNA药物正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
SEQ ID NO.5：5’-GGGAGUACCGUCUGGAUAA-3’，
SEQ ID NO.6：5’-UUAUCCAGACGGUACUCCCGA-3’；
或者，siRNA药物正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
SEQ ID NO.7：5’-GUGAAACACUCCAGACCUA-3’，
SEQ ID NO.8：5’-UAGGUCUGGAGUGUUUCACCU-3’；
或者，siRNA药物正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
SEQ ID NO.9：5’-GAGGACAGACAGAUGGACA-3’，
SEQ ID NO.10：5’-UGUCCAUCUGUCUGUCCUCUU-3’；
或者，siRNA药物正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
SEQ ID NO.11：5’-GAGUCCUCUUGUGACCUCA-3’，
SEQ ID NO.12：5’-UGAGGUCACAAGAGGACUCGG-3’；
或者，siRNA药物正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
SEQ ID NO.13：5’-GAGACAGGCUGAUUUCCAA-3’，
SEQ ID NO.14：5’-UUGGAAAUCAGCCUGUCUCUG-3’；
或者，siRNA药物正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
SEQ ID NO.15：5’-GGGUCUUGGUGGUCUCCAU-3’，
SEQ ID NO.16：5’-AUGGAGACCACCAAGACCCCG-3’；
或者，siRNA药物正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
SEQ ID NO.17：5’-CAAGGCCAGAUUCUCCAUC-3’，
SEQ ID NO.18：5’-GAUGGAGAAUCUGGCCUUGUU-3’；
或者，siRNA药物正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
SEQ ID NO.19：5’-CAUCCCCUACUGCAUCUGA-3’，
SEQ ID NO.20：5’-UCAGAUGCAGUAGGGGAUGGG-3’；
或者，siRNA药物正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
SEQ ID NO.21：5’-CCUGGAGCUCAUAGUCUCA-3’，
SEQ ID NO.22：5’-UGAGACUAUGAGCUCCAGGGG-3’。
进一步优选地，siRNA药物的正义链和反义链的核苷酸序列为SEQ ID NO.9和SEQID NO.10。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，siRNA药物对于AML细胞的靶分子LILRB4具有更强的沉默效果，且活性高。
根据本发明，为了进一步提高siRNA药物对靶分子LILRB4的抑制效果和稳定性，对siRNA药物的正义链和反义链进行稳定化修饰，包括：按照5'末端到3'末端的方向，正义链的第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，反义链的第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间、第2个核苷酸和第3个核苷酸之间，以及反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间、第2个核苷酸和第3个核苷酸之间，3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间、第2个核苷酸和第3个核苷酸之间均具有修饰基团的磷酸酯基。
修饰后的siRNA药物的序列信息如表1所示：
表1
本发明第二方面提供上述的三药共组装无载体药物递送体系的制备方法，包括以下步骤：
将多肽与肿瘤细胞化疗药物进行反应I形成多肽-化疗药物合成体，将所述多肽-化疗药物合成体与siRNA药物进行反应II，形成所述三药共组装无载体药物递送体系。
本发明中，肿瘤细胞化疗药物通过酸不稳定的腙键与多肽进行共价偶联形成前体药物——多肽，再将前体药物与siRNA药物通过静电相互作用和π-π堆积作用，自组装形成致密的球形纳米颗粒，即为三药共组装无载体药物递送体系。该制备方法具有简单、绿色和普适性等特点，可应用于各种蒽环类分子之间自组装形成纳米颗粒。
根据本发明，优选地，多肽为由穿膜肽与抗肿瘤肽融合形成的穿膜-抗肿瘤融合肽。
本发明中，为了进一步提高穿膜-抗肿瘤融合肽与肿瘤细胞化疗药物进行共价偶联，优选地，在穿膜-抗肿瘤融合肽的C端修饰酰肼基团，以利用酰肼基团与肿瘤细胞化疗药物的氨基结合形成前体药物——穿膜肽-抗肿瘤肽-化疗药物合成体，通过腙键实现可逆结合，从而在内体条件下能够有效释放抗肿瘤肽和肿瘤细胞化疗药物。
根据本发明，反应I的过程能够将穿膜-抗肿瘤融合肽与肿瘤细胞化疗药物进行接触、偶联即可。优选地，所述反应I的过程包括：在三氟乙酸存在的条件下，将含有所述穿膜-抗肿瘤融合肽的溶液滴加至含有所述肿瘤细胞化疗药物的溶液中，进行避光反应。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，可促进穿膜-抗肿瘤融合肽与肿瘤细胞化疗药物的偶联效果，提高穿膜肽-抗肿瘤肽-化疗药物合成体的稳定性。
根据本发明，优选地，所述避光反应的条件包括：温度为4-42℃，时间为20-60h。
根据本发明，所述穿膜-抗肿瘤融合肽和所述肿瘤细胞化疗药物可分别独立地选择有机溶剂进行溶解，形成相应的溶液后，进行反应I。优选地，所述穿膜-抗肿瘤融合肽和所述肿瘤细胞化疗药物分别采用二甲基亚砜为溶剂形成各自的溶液。
根据本发明，反应II的过程能够将多肽-化疗药物合成体(如：穿膜肽-抗肿瘤肽-化疗药物合成体)与siRNA药物进行接触，通过静电相互作用和π-π堆积作用等物理作用力进行自组装即可。优选地，所述反应II的过程包括：将含有所述多肽-化疗药物合成体的溶液与含有所述siRNA药物的溶液混合后，吹打混匀，进行静置反应。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，可提高三药共组装无载体药物递送体系的形成效率。
根据本发明，优选地，所述静置反应的条件包括：温度为4-42℃，时间为5-60min。
根据本发明，所述多肽-化疗药物合成体和所述siRNA药物可分别独立地选择合适的溶剂进行溶解，形成相应的溶液后，进行反应II。优选地，所述多肽-化疗药物合成体的溶液与含有所述siRNA药物分别采用无RNA酶水为溶剂形成各自的溶液，以避免溶剂的引入对siRNA药物的活性和纯度产生干扰，进而提高siRNA药物的特异性和有效性。
本发明中，穿膜-抗肿瘤融合肽、穿膜肽-抗肿瘤肽-化疗药物合成体、三药共组装无载体药物递送体系形成后的反应溶液，均可以通过透析袋在超纯水中进行透析，除去游离的未反应底物和溶剂得到产物-水溶液，再经过冷冻干燥得到相应的产物。
本发明第三方面提供上述的三药共组装无载体药物递送体系、上述的制备方法制得的三药共组装无载体药物递送体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述抗肿瘤药物为治疗急性髓系白血病的药物。
根据本发明一种特别优选的实施方式，三药共组装无载体药物递送体系的制备方法，包括以下步骤：
(1)将靶向穿膜肽CPP44(氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)与p16肽(氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)融合形成穿膜-抗肿瘤融合肽(CPP44-p16肽)，将穿膜-抗肿瘤融合肽的C端修饰酰肼基团形成CPP44-p16-hyd；
(2)将CPP44-p16-hyd溶于二甲基亚砜形成CPP44-p16-hyd溶液，将盐酸柔红霉素溶于二甲基亚砜形成盐酸柔红霉素溶液，在三氟乙酸(TFA)的存在下，将CPP44-p16-hyd溶液逐滴加入盐酸柔红霉素溶液中，在温度为4-42℃的温度下避光反应20-60h，形成穿膜肽-抗肿瘤肽-化疗药物合成体(CPP44-p16-hyd-DNR)；
(3)将CPP44-p16-hyd-DNR溶于无RNA酶水中形成CPP44-p16-hyd-DNR溶液，将siRNA药物溶于去RNA酶水中形成siRNA药物溶液，将CPP44-p16-hyd-DNR溶液添加到siRNA药物溶液中，轻柔吹打混匀，在4-42℃的温度下静置5-60min，形成所述三药共组装无载体药物递送体系，
其中，siRNA药物的正义链为：
5’-GmsAmsGmGmAfCmAfGfAfCmAmGmAmUmGmGmAmCmAm-3’
siRNA药物的反义链为：
5’-UmsGfsUmCmCmAfUmCfUfGmUmCmUmGfUmCfCmUmCmsUmsUm-3’。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，CPP44-p16-hyd由合肥森尔生物科技有限公司合成，通过将靶向穿膜肽CPP44(氨基酸序列为KRPTMRFRYTWNPMK)与p16肽(氨基酸序列GPG-rhlvvltdlf-GPRRRR)融合形成CPP44-p16肽(氨基酸序列为KRPTMRFRYTWNPMK-GPG-rhlvvltdlf-GPRRRR)，并将CPP44-p16肽的C端修饰酰肼基团形成CPP44-p16-hyd；
siRNA药物siNC的正义链(SEQ ID NO.23)为：
UmsUmsCmUmCfCmGfAfAfCmGmUmGmUmCmAmCmGmUm；
siRNA药物siNC的反义链(SEQ ID NO.24)为：
AmsCfsGmUmGmAfCmAfCfGmUmUmCmGfGmAfGmAmAmsUmsUm。
以下实施例中，siRNA药物由苏州吉玛基因股份有限公司合成，盐酸柔红霉素购自大连美仑生物公司，RPMI1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素购自美国美国Gibco公司，无水二甲基亚砜购自J&K百灵威科技有限公司，无RNA酶水购自北京兰杰科科技有限公司、品牌为Biosharp，4％多聚甲醛溶液、CCK-8均购自大连美仑生物有限公司，β-actin单克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司；在无特征说明的情况下，其他原料试剂为常规的市售品，室温为25±5℃。
以下实施例中，人急性髓系白血病细胞系THP-1细胞和稳定表达荧光素酶的THP-1-Luc细胞由北京理工大学黄渊余老师惠赠，THP-1、THP-1-Luc采用含10％FBS和1％双抗的RPMI 1640培养基；正常人皮肤成纤维细胞NHDF细胞购买于美国ATCC细胞库，采用含10％FBS和1％双抗的DMEM高糖培养基。上述细胞均在37℃，5％CO2的条件下培养。
实施例1
(1)称取40mg的CPP44-p16-hyd(0.0095mmol，简称CP)，用0.4mL无水二甲基亚砜(DMSO)溶解形成CPP44-p16-hyd溶液，称取8mg的盐酸柔红霉素(DNR·HCl，0.014mmol)溶于0.2mL的DMSO中形成DNR·HCl溶液，将CPP44-p16-hyd溶液逐滴加入DNR·HCl溶液中得到混合溶液，将混合溶液在三氟乙酸(TFA)的存在下37℃避光反应48h，之后使用截留分子量为1000的透析袋在超纯水中进行透析，除去游离的柔红霉素(DNR)分子及溶剂DMSO得到CPP44-p16-hyd-DNR水溶液，经过冷冻干燥便可得到终产物CPP44-p16-hyd-DNR(简称CPD)；通过质谱(MS)对终产物CPP44-p16-hyd-DNR进行确证后，于5mL离心管中锡纸避光保存，在-20℃冰箱储存备用；
(2)以去RNA酶水为溶剂，分别配制浓度为1nmol/mL、5nmol/mL、10nmol/mL、15nmol/mL、20nmol/mL、25nmol/mL、30nmol/mL、35nmol/mL、40nmol/mL、45nmol/mL、50nmol/mL的CPP44-p16-hyd溶液以及5nmol/mL的siRNA药物溶液，
其中，siRNA药物(简称siLILRB4)的正义链(SEQ ID NO.9)为：
5’-GmsAmsGmGmAfCmAfGfAfCmAmGmAmUmGmGmAmCmAm-3’
siRNA药物的反义链(SEQ ID NO.10)为：
5’-UmsGfsUmCmCmAfUmCfUfGmUmCmUmGfUmCfCmUmCmsUmsUm-3’；
将不同浓度的CPP44-p16-hyd-DNR溶液添加到等体积的siRNA溶液中，使得CPP44-p16-hyd-DNR：siRNA的摩尔比为0.2:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1，再进行轻柔吹打混匀，在室温下静置15min后，即制得CPP44-p16-hyd-DNR@siRNA纳米复合物(简称CPDS)。
CPP44-p16-hyd-DNR的质谱表征
利用针头蘸取一定量的CPP44-p16-hyd、于1.5mL的EP管中，加入600μL至1mL纯甲醇使样品溶解，将溶解的样品用滤膜过滤后，使用液相色谱质谱联用(LC-MS)进行检测；取适量CPP44-p16-hyd、CPP44-p16-hyd-DNR冻干粉用溶剂(甲醇+超纯水+0.01％TFA)溶解到浓度约为1-2μg/mL，用取样针将多肽溶液点到测试板上，使用MALDI-TOF质谱仪检测多肽分子量。
CPP44-p16-hyd的LC-MS质谱检测的结果参见图1，其质荷比为：1403.25+3、1053.85+4、843.35+5、703.00+6、602.80+7、527.60+8、469.05+9，根据质荷比得出的产物分子量接近理论分子量4212；多肽CPP44-p16-hyd的HPLC检测图谱参见图2，从图2可以得出其主峰CPP44-p16-hyd的峰面积％为99.39％，表明其纯度可以达到99％以上。
通过MALDI-TOF质谱表征CPP44-p16-hyd和CPP44-p16-hyd-DNR的图谱参见图3和图4，结果显示二者质谱图主峰分子量分别为4211.86Da(图3)和4721.71Da(图4)，表明成功合成了前药CPP44-p16-hyd-DNR。
CPDS纳米颗粒的凝胶阻滞实验
称取0.8g琼脂糖，加入40mL的TBE缓冲液，在微波炉中高火加热溶解成2％(重量)琼脂糖凝胶；然后加入4μL的1/10000的SuperRedGelRedTM(擎科，中国北京)，用玻璃棒轻轻搅拌混匀；倒入模具中，在室温静置30min；待冷却凝固后，取10μL实施例1中制得的CPDS纳米颗粒溶液(颗粒的siRNA终浓度为25pmol)，加入2μL上样缓冲液，吹打混匀后加入琼脂糖凝胶上样孔中；用1×TBE缓冲液(Tris/Acetate/EDTA缓冲液)作为电泳缓冲液，100V下电泳20min，然后通过凝胶成像仪进行成像拍照，以游离siRNA(Free siRNA)用作对照。
通过凝胶阻滞实验分析实施例1制得的CPP44-p16-hyd-DNR：siRNA药物为不同摩尔比的条件下，CPP44-p16-hyd-DNR结合siRNA药物的能力。如图5所示，游离的siRNA条带在琼脂糖凝胶上没有受到阻滞，出现了明显的迁移且条带亮度较高，当CPP44-p16-hyd-DNR:siRNA摩尔比为4:1，即氮磷(N/P)比为1时(详见表2)，泳道中游离的siRNA条带完全消失，siRNA被滞留在凝胶上样孔内，CPP44-p16-hyd-DNR将siRNA完全组装在颗粒中，siRNA与CPP44-p16-hyd-DNR完全结合形成稳定的复合物。基于凝胶阻滞结果可知，CPP44-p16-hyd-DNR可以达到对siRNA的高效包裹。
表2CPP44-p16-hyd:siRNA摩尔比与氮磷比的对照表
摩尔比 0.2:1 1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 6:1 7:1 8:1 9:1 10:1
N/P 0.05 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 2.5
实施例2CPP44-p16-hyd-DNR@siRNA纳米复合物的表征
2.1形貌观察
取实施例1制得的CPDS纳米颗粒，利用透射电子显微镜(TEM)进行形貌观察，具体操作为：取一片碳支持膜，将其正面朝上置于一块洁净的封口膜表面，用移液器吸取10μL的CPDS纳米颗粒溶液滴加到碳支持膜上，静置2min后用滤纸吸去碳支持膜表面液体；然后滴加10μL的2％的磷钨酸溶液，负染2min后，用滤纸吸去液体，自然晾干后进行检测。
当CPP44-p16-hyd-DNR：siRNA摩尔比为8:1时，通过透射电镜观察CPDS纳米颗粒的形貌见图6，结果显示，CPDS纳米颗粒呈现类似球形的结构紧凑的颗粒，粒径约为40nm，分布均一。因此，将该比例下制得的CPDS纳米颗粒用于后续研究。
2.2动态光散射(DLS)分析
在进行DLS测定时，用粒径杯装入200μL体积实施例1制得的CPDS纳米颗粒溶液(颗粒的siRNA终浓度均为2.5nmol/mL)测定；在进行电势测定时，用电势杯装入1000μL的实施例1制得的CPDS纳米颗粒溶液(siRNA终浓度均为0.25nmol/mL)测定，保证颗粒溶液充分接触到两头的电极片。
不同CPP44-p16-hyd-DNR:siRNA摩尔比下，CPDS纳米颗粒的zeta电位值如图7所示，随着CPP44-p16-hyd-DNR比例的增加，纳米颗粒的zeta电位值逐渐升高，当CPP44-p16-hyd-DNR:siRNA摩尔比为4:1(即N/P比为1)时，zeta电位发生了从负电荷到正电荷的反转，这与凝胶阻滞实验结果一致。CPP44-p16-hyd-DNR：siRNA为8:1时，zeta电位为23.0mV，而游离CPD和siRNA的zeta电位分别为35.8mV和-22.8mV，CPDS一定程度上中和了CPD和siRNA的电势，提示二者的结合可能存在静电相互作用力。
2.3CPP44-p16-hyd-DNR@siRNA的载药量和包封率检测
分别使用荧光定量和紫外定量的方法确定siRNA和DNR的包封率和载药量。配置一系列浓度梯度的Cy5-siRNA标准溶液，利用荧光酶标仪检测Cy5-siRNA溶液在EX＝627nm，EM＝670nm处的荧光值，以浓度为横坐标，荧光值为纵坐标建立标准曲线。同时配置一系列浓度梯度的DNR·HCl标准溶液，利用酶标仪检测DNR·HCl溶液在480nm处的吸光值，以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标建立标准曲线。
按照实施例1的方法制备CPDS纳米颗粒(siRNA用Cy5标记，CPP44-p16-hyd-DNR:siRNA摩尔比为8:1)，将形成的CPDS纳米颗粒溶液以4℃，12000g离心2h后收集上清液；以DEPC水作为参比液体，通过酶标仪来测定上清液中CPP44-p16-hyd-DNR在480nm处的吸光度，同时通过荧光酶标仪来测定上清液中Cy5-siRNA在EX＝627nm，EM＝670nm处的荧光值，然后通过各自的标准曲线计算出上清液中的DNR和siRNA的量。
siRNA的包封率和载药量按照如下公式计算：
包封率(％)＝(1-M上清siRNA/M总siRNA)×100％ (公式1)，
载药量(％)＝(M总siRNA-M上清siRNA)/M纳米颗粒×100％ (公式2)，
DNR的包封率和载药量按照如下公式计算：
包封率(％)＝(1-M上清DNR/M总DNR)×100％ (公式3)，
载药量(％)＝(M总DNR-M上清DNR)/M纳米颗粒×100％ (公式4)；
分别使用紫外分光光度法和荧光分光光度法测定当CPP44-p16-hyd-DNR：siRNA摩尔比为8:1时，CPDS纳米颗粒中DNR、p16和siRNA的包封率和载药量，如图8所示，DNR、siRNA和p16的包封率(EE)分别为82.3％、77.9％和82.5％；载药量分别为9.0％、24.9％和19.3％，CPDS纳米颗粒对这三种药物均能实现较高的负载，体现了无载体共组装纳米体系相比传统载体材料包载能力高的优势，而较高的药物装载率对于提高白血病的疗效非常关键。
2.4纳米粒稳定性的检测
2.4.1血清稳定性检测
在实施例1制得的CPDS纳米颗粒(CPP44-p16-hyd-DNR：siRNA摩尔比为8:1)中分别加入10％和50％的胎牛血清(FBS)，在37℃摇床中孵育48h，用TEM拍摄其形貌。
siRNA药物在血清中游离时，易被血清中蛋白和酶的吸附、降解，因此，CPDS纳米颗粒必须可以保护siRNA药物在血清稳定存在以发挥药效。为了检测所设计的CPDS纳米颗粒的稳定性，利用血清稳定性实验，考察CPD对siRNA药物的保护效果。从TEM实验结果图9可以看出，CPDS纳米颗粒分别与10％和50％的血清孵育48h后，CPDS形态没有改变，依旧是均匀规则的球形颗粒，表明siRNA分子在48h内仍然被包覆在CPDS的内部，且纳米颗粒的粒径并未增大，表明其表面没有吸附血清中的蛋白质，以上结果显示出CPDS纳米颗粒结构的完整性和稳定性。
2.4.2核酸酶稳定性检测
将实施例1中以CPP44-p16-hyd-DNR与siRNA摩尔比为8:1的比例制得的CPDS纳米颗粒分装6管，向管中逐个加入2％、1％、0.8％、0.5％、0.2％和0.1％SDS(w/v)，37℃条件下孵育10min；取出各管，与上样缓冲液混匀后于2％的琼脂糖凝胶上样；设置电压80V开始跑胶，待样品跑出样品孔，调节电压至120V继续电泳30min；电泳结束后，利用凝胶成像仪观察条带并拍照。
将CDP与siRNA按照摩尔比为8:1的比例室温下孵育15min，分别准备6管游离siRNA和CPDS，向管中逐个加入终浓度为100μg/mL的核酸酶RNase A溶液，在37℃条件下分别孵育0、15、30、60、90、120min；孵育完成后，向各管中加入0.2％SDS溶液于37℃条件下继续孵育10min；按照上述操作进行琼脂糖凝胶电泳并用凝胶成像仪拍照。
siRNA药物在应用过程中极易被核糖核酸酶RNase A降解，因此，稳定性是siRNA成药的核心问题。SDS是一种阴离子物质，可以将带负电的siRNA置换出来，可通过琼脂糖凝胶电泳评价CPD与siRNA复合后对siRNA的保护、压缩效果。利用核糖核酸酶RNase A进行酶降解实验，考察CPDS复合物的稳定性。如图10所示，SDS浓度为0.1％及以上均可将CPDS纳米颗粒中的siRNA完全置换出来，后续RNase稳定性实验采用0.2％的SDS。游离siRNA和CPDS复合的siRNA分别与RNase A作用0至120min的时间，游离siRNA条带15min后就完全消失，结果表明游离的siRNA稳定性很差，极易被RNase A降解，而CPDS纳米颗粒与RNase A即使孵育2h，经0.2％SDS置换后凝胶上依然可见清晰的条带，说明CPD的复合有效地保护了siRNA不被RNase降解，体系具有较高的稳定性。
实施例3
3.1激光共聚焦观察CPDS纳米颗粒的细胞摄取情况
将THP-1细胞以5×105个/孔接种于24孔板中，加入siRNA浓度为100nM的CPDS纳米颗粒(siRNA用Cy5标记，CPP44-p16-hyd-DNR:siRNA摩尔比为8:1)孵育2、4、8h，用PBS洗涤细胞，分别收集各组细胞，用4％的多聚甲醛固定并DAPI染色液染色，用适量抗荧光淬灭封片剂封片，最后通过激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察柔红霉素(DNR)和Cy5-siRNA的荧光，结果如图11所示。
激光扫描共聚焦图像显示，游离DNR和siRNA几乎没有进入细胞，而CPDS纳米颗粒组可在细胞质中检测到较强的DNR和siRNA的荧光信号，且将CPDS纳米颗粒与THP-1细胞共孵育的时间延长至8h后，Cy5-siRNA在胞质的荧光显著增强，细胞核中也出现明显的DNR的荧光信号。这些结果表明共组装纳米治疗体系CPDS可以将加载的药物(DNR、Cy5-siRNA)分别递送至其发挥疗效的靶细胞器(细胞核、细胞质)。
3.2实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测mRNA表达量
将THP-1细胞以5×105个/孔接种于12孔板中，设立不同给药组：PBS、Lipo/siLILRB4(将LILRB4利用转染试剂Lipofectamine 2000进行转染获得，siRNA浓度为50nM)、CPD@siNC(CPD与siNC结合形成的颗粒)、CPDS(siRNA浓度为50nM)和CPDS(siRNA浓度为100nM)，加入各组药物孵育4h，每孔加入1mL含10％FBS的RPMI 1640培养基，继续培养20h；
RNA提取后使用Nanodrop测定RNA浓度；使用快速逆转录试剂盒合成cDNA，配制gDNA去除反应体系，模板mRNA 1μg/管，在42℃下加热3min；然后配制逆转录反应体系，加入到gDNA去除反应体系中，在42℃下加热15min，继续在95℃加热3min进行逆转录；qPCR：用SuperReal荧光定量预混试剂盒配制反应体系，设置反应程序为95℃，15min；95℃，3s；60℃，20s；循环40次，进行qPCR反应，以GAPDH为内参，用2-△△Ct法计算LILRB4基因的相对表达量。
结果如图12所示，在相同siLILRB4浓度下，Lipo/siLILRB4复合物下调LILRB4的mRNA水平为22.0％，Lipo转染阴性对照NC组Lipo/siNC与未处理的细胞相比，其LILRB4mRNA仅下调12.7％。基于50nM和100nM siLILRB4的CPDS纳米颗粒处理后，THP-1细胞内LILRB4的mRNA水平分别下调了27.0％和60.9％，表现出明显的剂量依赖效应，而继续增大给药浓度，可能出现细胞活力的明显下降。同时考虑沉默效率和细胞活力，100nM siRNA浓度将是下调靶基因的最佳浓度。
3.3细胞增殖活性实验
取THP-1细胞每孔为2×104个细胞(100μL)接种于96孔板中，设立不同给药组：CPP44、CP、CPD、DNR、CPD@siNC(CPD与siNC结合形成的颗粒)和CPD@siLILRB4(即CPDS，给药浓度为siRNA 100nM)，加入各组药物孵育48h，于每孔中加入10μL的CCK-8溶液，继续培养4h，用酶标仪检测各孔在450nm处的吸光度值，按下式计算细胞存活率；
细胞活力值(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(对照)-A(空白)]×100％(公式5)，
A(加药)：含有细胞、CCK-8试剂和药物溶液的孔的OD，A(空白)：含有培养基和CCK-8试剂、无细胞的孔的OD，A(对照)：含有细胞、CCK-8试剂、无药物溶液的孔的OD。
经过48h的孵育后结果显示在图13中，CPP44和CP组没有显示出对细胞活力的影响，CPD组有约21％的细胞增殖抑制作用，游离DNR细胞活力仅为34.31％，显示出较强的增殖抑制效果。这些结果说明CPP44作为一种靶向穿膜肽对于细胞无毒性，柔红霉素相比p16在该剂量下对细胞的杀伤作用更强。CPD@siNC(16.63％)处理组和CPDS(17.67％)处理组之间无显著性差异，主要是由于siLILRB4是通过沉默AML细胞内的LILRB4表达，促进T细胞的增殖从而杀伤AML细胞，而在体外进行CCK8实验并无T细胞存在，无法实现siLILRB4的药物疗效。但是，相比游离DNR组34.31％的细胞活力，CPD@siNC和CPD@siLILRB4组的对THP-1细胞的抗增殖作用更强，表明CPDS纳米复合物的共组装形式有利于药物发挥疗效，显示了显著的细胞毒性，提高了在体内进一步应用的可能性。
3.4细胞对THP-1细胞的杀伤效果
3.4.1人外周血单个核细胞的分离
将外周血加入到离心管中，用等量的PBS稀释外周血，吹打或颠倒混匀；在另一离心管中加入Ficoll分离液，按照Ficoll:稀释血＝3:4的比例加入稀释好的外周血；20℃，300g，离心20min，离心后轻轻吸取“白膜层”，将其转移到新的离心管中，加入PBS充分洗涤，300g，离心10min，完全弃上清，细胞沉淀即PBMC细胞，细胞沉淀加用适量PBS重悬，进行细胞计数，取107进行T细胞的磁珠分选。
3.4.2CD8+T细胞分选
将上一步分离得到的外周血单个核细胞离心，用适量的MACS缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为107/mL，按照20μL/107PBMCs加入CD8免疫磁珠，4℃避光孵育15min，加入MACS缓冲液洗涤细胞，离心，用500μL MACS缓冲液重悬细胞，将MS分选柱安装在磁力架上，加入适量MACS buffer润洗分选柱，然后将细胞悬液加入MS分选柱，待样本流完之后开始洗柱子，将500μL的MACS buffer加入分选柱，同样的操作重复三次；待样本流空之后，将新的阳性收集管放在分选柱下，加1mL MACS buffer到分选柱上，用分选柱配备的活塞快速地推下去，洗脱液即为CD8+T细胞，用含10％FBS、200IU/mL rIL-2、2μg/mL anti-CD28抗体的RPMI1640的培养基重悬。
3.4.3CD8+T细胞的激活和扩增
将24孔板用10μg/mL anti-CD3抗体包被过夜后弃去抗体溶液，用PBS洗三遍，调整CD8+T细胞密度为1×106/mL，加入上述24孔板中，于恒温培养箱中培养。
3.4.4T细胞杀伤活性检测
将THP-1细胞接种于6孔板中，分别用PBS、CPD@siNC(CPD与siNC结合形成的颗粒)、CPD@siLILRB4(即CPDS纳米颗粒)处理72h，将处理后的THP-1细胞按照1×104/孔接种于96孔板中，每孔100μL，调整激活的CD8+T细胞密度，分别按不同效靶比1:1、5:1和10:1加入96孔板中，每孔100μL，与THP-1共培养12h，每孔加入10μL CCK-8试剂，继续培养4h，用酶标仪检测各孔450nm下的吸光度值。
效应T细胞对靶细胞的杀伤作用是由细胞膜表面的分子的特异性识别。白血病细胞表面的LILRB4介导的下游通路分子与T细胞表面的特异性受体结合，使T细胞的活性被抑制。而当白血病细胞表面的LILRB4的表达被沉默以后，T细胞则会被激活从而发挥杀伤肿瘤细胞作用。为了评估CPDS对T细胞杀死THP-1细胞的效果的影响，将CD8+T细胞(效应细胞，E)与THP-1(靶细胞，T)以指定的效靶比E:T进行孵育。结果如图14所示，在不同效靶比(1:1、5:1和10:1)下，CPD@siLILRB4处理THP-1细胞后，CD8+T细胞可以有效杀伤CD8+T细胞，杀伤比例明显高于PBS对照组。随着CD8+T细胞比例的增加，效靶比的增高，激活的CD8+T细胞对THP-1细胞的杀伤率明显升高。这些结果提示，CPD@siLILRB4有效沉默THP-1细胞的LILRB4，从而介导激活的CD8+T细胞的显著的杀伤THP-1肿瘤细胞作用。
3.5体内分布实验
将1×106的THP-1-Luc细胞尾静脉注射至每只6至8周龄的雌性NOG小鼠中，然后立即尾静脉注射0.5×106分离的健康捐助者的人正常T细胞，在THP-1和T细胞植入后5天，将NOG小鼠随机分为3组，每组3只，分别通过尾静脉注射：①PBS、②Cy5-siRNA、③CPD@Cy5-siRNA；注射24h后处死小鼠，进行心脏灌注，取其主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏)及左右胫骨和股骨，利用活体成像仪观察各器官中的荧光强度并进行荧光定量。
如图15所示，与游离siRNA相比，CPD@Cy5-siRNA在各脏器的荧光信号均较高，特别是在白血病细胞容易增殖的骨髓和脾脏中显著富集，表明无载体纳米递送系统可以有效保护siRNA在体内的稳定性，且进一步证明了CPP44肽在体内的靶向性。
3.6体内安全性
按照3.5所述构建AML小鼠移植模型，在THP-1和T细胞植入后5天，将小鼠随机分为4组，每组4只：①PBS，②CPD@siNC，③CPD@siLILRB4，④DNR，通过尾静脉进行给药，siRNA的给药量为1.0mg/kg，DNR给药量为0.3mg/kg，每两天给药一次，共给药8次，治疗过程中每2天对小鼠体重进行一次测量。
实验数据以平均值±标准差(Mean±SEM)表示，利用Graphpad软件进行统计分析，两组之间的比较采用t检验，三组及以上采用单因素方差分析(One-way ANOVA)及Bonferroni多重比较检验，P<0.05认为差异有显著性。按照图16所示，建立NOG小鼠异种移植模型后，在两周内连续给药8次，监测小鼠的体重变化；各组小鼠在给药期间与PBS组相比，无明显变化，表明无载体纳米递送系统进入体内后，不会影响小鼠的正常生长，在体内具有良好的生物安全性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津医科大学 北京理工大学
<120> 三药共组装无载体药物递送体系及其制备方法和应用
<130> 2022.6.2
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
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<212> PRT
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<212> PRT
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uuauccagac gguacucccg a 21
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uaggucugga guguuucacc u 21
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 9
gaggacagac agauggaca 19
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 10
uguccaucug ucuguccucu u 21
<210> 11
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 11
gaguccucuu gugaccuca 19
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 12
ugaggucaca agaggacucg g 21
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 13
gagacaggcu gauuuccaa 19
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 14
uuggaaauca gccugucucu g 21
<210> 15
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 15
gggucuuggu ggucuccau 19
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 16
auggagacca ccaagacccc g 21
<210> 17
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 17
caaggccaga uucuccauc 19
<210> 18
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 18
gauggagaau cuggccuugu u 21
<210> 19
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 19
cauccccuac ugcaucuga 19
<210> 20
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 20
ucagaugcag uaggggaugg g 21
<210> 21
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 21
ccuggagcuc auagucuca 19
<210> 22
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 22
ugagacuaug agcuccaggg g 21
<210> 23
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 23
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 24
acgugacacg uucggagaau u 21

Claims (10)

1.一种三药共组装无载体药物递送体系，其特征在于，该三药共组装无载体药物递送体系由多肽、肿瘤细胞化疗药物和siRNA药物共组装而成，所述多肽为由穿膜肽与抗肿瘤肽融合形成的穿膜-抗肿瘤融合肽，所述穿膜肽为靶向穿膜肽CPP44，所述靶向穿膜肽CPP44的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述抗肿瘤肽为p16肽，所述p16肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示，所述肿瘤细胞化疗药物为盐酸柔红霉素，所述siRNA药物的正义链和反义链的核苷酸序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；
该三药共组装无载体药物递送体系的制备方法包括以下步骤：将多肽与肿瘤细胞化疗药物进行反应I形成多肽-化疗药物合成体，将所述多肽-化疗药物合成体与siRNA药物进行反应II，形成所述三药共组装无载体药物递送体系；
所述反应I的过程包括：在三氟乙酸存在的条件下，将含有所述穿膜-抗肿瘤融合肽的溶液滴加至含有所述肿瘤细胞化疗药物的溶液中，进行避光反应形成穿膜肽-抗肿瘤肽-化疗药物合成体；所述反应II的过程包括：将含有所述多肽-化疗药物合成体的溶液与含有所述siRNA药物的溶液混合后，吹打混匀，进行静置反应。
2.根据权利要求1所述的三药共组装无载体药物递送体系，其特征在于，所述穿膜肽、所述抗肿瘤肽、所述肿瘤细胞化疗药物与所述siRNA药物的摩尔比为4-10:4-10:4-200:1。
3.根据权利要求2所述的三药共组装无载体药物递送体系，其特征在于，所述穿膜肽、所述抗肿瘤肽、所述肿瘤细胞化疗药物与所述siRNA药物的摩尔比为6-10:6-10:7-16:1。
4.权利要求1至3中任意一项所述的三药共组装无载体药物递送体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将多肽与肿瘤细胞化疗药物进行反应I形成多肽-化疗药物合成体，将所述多肽-化疗药物合成体与siRNA药物进行反应II，形成所述三药共组装无载体药物递送体系；
所述反应I的过程包括：在三氟乙酸存在的条件下，将含有所述穿膜-抗肿瘤融合肽的溶液滴加至含有所述肿瘤细胞化疗药物的溶液中，进行避光反应形成穿膜肽-抗肿瘤肽-化疗药物合成体；所述反应II的过程包括：将含有所述多肽-化疗药物合成体的溶液与含有所述siRNA药物的溶液混合后，吹打混匀，进行静置反应。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述避光反应的条件包括：温度为4-42℃，时间为20-60h。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述穿膜-抗肿瘤融合肽和所述肿瘤细胞化疗药物分别采用二甲基亚砜为溶剂形成各自的溶液。
7.根据权利要求4至6中任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述静置反应的条件包括：温度为4-42℃，时间为5-60 min。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述多肽-化疗药物合成体的溶液与含有所述siRNA药物分别采用无RNA酶水为溶剂形成各自的溶液。
9.根据权利要求1至3中任意一项所述的三药共组装无载体药物递送体系、根据权利要求4至8中任意一项所述的制备方法制得的三药共组装无载体药物递送体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为治疗急性髓系白血病的药物。
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