CN108743964B - 一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽修饰的脑靶向核酸递送载体及其应用 - Google Patents

一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽修饰的脑靶向核酸递送载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明将狂犬病毒糖蛋白衍生肽(RDP)与多聚精氨酸连接，设计了RDP修饰的脑靶向核酸递送载体，通过RDP与乙酰胆碱受体的相互作用介导入脑，同时利用多聚精氨酸所携带的正电荷，通过静电作用加载核酸，并对其进行理化性质的研究。本发明考察了RDP的细胞摄取效率，与RVG29摄取效率相当，并通过复凝聚法制备了加载siRNA或质粒DNA的RDP‑(R)n的纳米粒，所得纳米粒粒径较小且较为均一，扫描电镜下观察，纳米粒颗粒圆整，有较好的脑靶向应用前景。

Description

一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽修饰的脑靶向核酸递送载体及其 应用
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及一种多肽修饰的脑靶向核酸递送系统及其应用，具体涉及一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽(Rabies virus glycoprotein-derived peptide,RDP)与多聚精氨酸连接构成的脑靶向核酸递送系统及其应用。
背景技术：
脑是人体重要器官，目前，脑部疾病已严重危害人类健康，包括脑肿瘤、中枢退行性疾病〔帕金森病(PD)、阿尔兹海默病(Alzheimer disease，AD)等〕、脑血管病变及脑部细菌病毒感染等。脑部疾病种类繁多，发病机制复杂，且由于血脑屏障(blood brainbarrier,BBB)的存在，治疗难度较大。目前上市药物疗效大多不理想，主要原因是由于药物难以跨过BBB达到病变部位。为克服BBB，实现脑部疾病的有效治疗，目前已有报道的方法包括：脑部注射给药(如颅腔内给药)、动脉注射高渗物质暂时打开BBB、将水溶性药物制成脂溶性前药、主动靶向分子介导跨过BBB等。
主动靶向分子主要是能特异性地结合BBB上的受体或转运体一类分子。采用主动靶向分子修饰的给药系统可模拟BBB上的受体或转运体介导相应内源性的配体或底物跨过BBB转运的过程，此方法能够极大程度谁地降低脑部损伤，并且可以增加药物的脑部摄取效率。狂犬病毒糖蛋白衍生的由29个氨基酸构成的多肽RVG-29是一种主动靶向分子，可特异性的与血脑屏障上的乙酰胆碱受体进行特异性结合，介导药物跨过血脑屏障，但由于29个氨基酸结构过长，对所形成的纳米颗粒历经有一定影响，因此，有研究对狂犬病毒糖蛋白衍生肽结构及靶向效率进行考察，筛选出由15个氨基酸构成，脑靶向效率与RVG-29相当的狂犬病毒糖蛋白衍生肽片段RDP。以RDP为靶头对脑靶向给药系统进行修饰，将有利于进一步提高脑靶向效率，对治疗脑部疾病有重要意义。
基因疗法是近年来发展起来的一种新型疗法，因其高特异性、低毒性，可用于治疗各种脑部疾病，如脑胶质瘤，阿尔兹海默症等。核酸药物，如siRNA、shRNA或质粒DNA，已作为基因治疗药物成功应用，核酸药物能够特异性地表达功能蛋白或通过沉默与疾病相关的靶基因，抑制其表达，从而发挥治疗作用。核酸药物具有特异性高、用药剂量小、毒副作用小等优点，但由于半衰期短、体内稳定性差、易被核酸酶降解，种种缺陷限制了其在临床上的应用，因此必须借助适宜的载体，进行安全有效的递送，才能发挥其治疗作用。多聚精氨酸由于其携带的大量正电荷，可与携带负电荷的核酸药物通过静电作用结合，从而对核酸药物进行加载并携带其入胞，可作为核酸药物载体进行应用。
发明内容：
本发明解决的技术问题是克服现有脑靶向给药系统的缺陷和不足，提供一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽修饰的脑靶向核酸递送载体及其应用，以及一种脑靶向核酸递送系统。为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：
本发明技术方案的第一方面是提供了一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽修饰的脑靶向核酸递送载体RDP-(R)n。
本发明中，采用狂犬病毒衍生肽RDP作为脑靶向头基，通过n型乙酰胆碱受体介导入脑，以多聚精氨酸作为核酸载体材料，通过电性作用与核酸复合。所述脑靶向核酸递送载体由RDP与多聚精氨酸连接而成。
其中，所述RDP的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。优选3-20，再优选3-12，具体最优选3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。
本发明技术方案的第二方面提供了狂犬病毒糖蛋白衍生肽修饰的脑靶向核酸递送载体RDP-(R)n在脑靶向核酸递送中的应用。
其中，所述的核酸选自RNA或DNA。
所述的RNA优选siRNA或shRNA。所述的siRNA的大小为15-30bp，可以生存素或Bcl-2作为靶点，用于脑肿瘤的治疗；所述的shRNA的大小为15-30bp，可以BACE1-AS作为靶点，用于神经退行性疾病的治疗。
所述的DNA优选质粒DNA，大小为2kbp-12kbp，可为编码BACE1-AS shRNA或p53蛋白的质粒DNA，用于神经退行性疾病或脑肿瘤的治疗。
本发明技术方案的第三方面提供了一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽修饰的脑靶向核酸递送系统，所述的脑靶向核酸递送系统由权利要求1所述的脑靶向核酸递送载体RDP-(R)n和核酸构成。
其中，核酸递送载体与核酸的氮磷比为1000:1-1:1，优选的氮磷比为1000：1、500：1、200：1、100：1、50：1、20：1、10：1、5：1、2：1、1：1，最优选的氮磷比为200：1、100：1、50：1、20：1，最最优选的氮磷比为：50:1。
所述的脑靶向核酸递送系统由RDP-(R)n与核酸通过复凝聚法制备而成。
最优选的,为达到上述目的，本发明采用复凝聚法制备以RDP为靶头、包载核酸的纳米粒，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将siRNA或质粒DNA溶解于DEPC水中，稀释至一定浓度；
(2)将RDP-(R)n溶解于DEPC水中，并按照一定的氮磷比，稀释至一定浓度；
(3)将两种溶液分别预热；
(4)取等体积RDP-(R)n溶液，加入到siRNA或质粒DNA溶液中，混匀后于涡旋混合器涡旋，即得包载核酸的RDP-(R)n纳米粒。
其中步骤(2)中
优选氮磷比：1000：1、500：1、200：1、100：1、50：1、20：1、10：1、5：1、2：1、1：1
其中步骤(3)中
优选预热温度：20℃、37℃
其中步骤(4)中
优选涡旋时间：0s、15s、30s、45s、60s
有益技术效果
本发明选择了具有脑靶向功能、由15个氨基酸构成的的狂犬病毒糖蛋白衍生肽RDP，细胞摄取效率稍差于阳性对照RVG-29，但肽链长度减小一半，更有利于形成小粒径的纳米粒，便于实现脑靶向递送，且极大节约了生产成本。
以RDP作为靶头，通过与三聚至20聚精氨酸连接，构成核酸递送载体，采用复凝聚法与siRNA或质粒DNA形成纳米粒，所得纳米粒粒径较小且较为均一，透射电镜观察下颗粒成球状且圆整，具有后续体内外开发及应用价值。
尤其是一种与RVG-29相比较短的狂犬病毒糖蛋白衍生肽RDP与多聚精氨酸连接构成的脑靶向核酸递送载体，其能够携带核酸穿透血脑屏障。
附图说明
图1是实施例1中荧光显微镜观察细胞摄取情况结果。
图2是实施例2中流式细胞仪测定的细胞摄取情况结果。
图3是实施例3中RDP-R3/siRNA纳米粒的粒径及zeta电位结果图。
图4是实施例4中RDP-R4/siRNA纳米粒的粒径及zeta电位结果图。
图5是实施例5中RDP-R5/siRNA纳米粒的粒径及zeta电位结果图。
图6是实施例6中RDP-R6/siRNA纳米粒的粒径及zeta电位结果图。
图7是实施例7中RDP-R7/siRNA纳米粒的粒径及zeta电位结果图。
图8是实施例8中RDP-R8/siRNA纳米粒的粒径及zeta电位结果图。
图9是实施例9中RDP-R9/siRNA纳米粒的粒径及zeta电位结果图。
图10是实施例10中RDP-R10/siRNA纳米粒的粒径及zeta电位结果图。
图11是实施例11中RDP-R11/siRNA纳米粒的粒径及zeta电位结果图。
图12是实施例12中RDP-R12/siRNA纳米粒的粒径及zeta电位结果图。
图13是实施例13中RDP-R5/DNA纳米粒的粒径及zeta电位结果图。
图14是实施例14中RVG29-R5/DNA纳米粒的粒径及zeta电位结果图。
图15是实施例15中RDP-R5/siRNA纳米粒的扫描电镜图。
图16是实施例16中RDP-R5细胞毒性评价结果。
图17是实施例17中流式细胞仪考察RDP-R5/siFAM纳米粒细胞摄取结果。
图18是实施例18中RDP-R5/siSur纳米粒体外抑瘤效果考察结果(siSur指靶向Survivin基因的siRNA)。
图19是实施例19中流式细胞仪考察RDP-R5/siSur纳米粒诱导细胞凋亡结果(siSur指靶向Survivin基因的siRNA)。
术语和简称
RVG-29：狂犬病毒糖蛋白衍生肽，由29个氨基酸构成
RDP：狂犬病毒糖蛋白衍生肽，由15个氨基酸构成
siRNA：小干扰RNA
shRNA：短发夹RNA
具体实施方式
实施例
实施例1：倒置荧光显微镜观察RDP的细胞摄取情况
收集对数生长期的小鼠神经母细胞瘤细胞Neuro-2a，按5个/孔的密度接种到24孔板中，37℃、5％CO2培养24h。孵育结束后，用PBS预先孵育细胞15min，然后每孔加入浓度为2.5μM、5’端FAM标记RDP的PBS溶液，于37℃孵育20min，同时设置加入2.5μM、5’FAM标记的RVG-29PBS溶液的细胞为阳性对照组，加入空白PBS溶液的细胞为空白对照组。孵育结束后，弃去多肽溶液，用预冷PBS溶液终止摄取。用PBS溶液冲洗细胞3次以上，以除去吸附在细胞表面的多肽，4％多聚甲醛避光固定10min后，用倒置荧光显微镜观察细胞的荧光强度并拍照。由图1可见，RDP组细胞荧光强度与RVG-29相当。
实施例2:流式细胞仪考察RDP的细胞摄取情况
收集对数生长期的Neuro-2a细胞，按15万个/孔的密度接种于12孔板中，37℃、5％CO2培养24h。孵育结束后，用PBS预先孵育细胞15min，然后每孔加入浓度为2.5μM、5’端FAM标记RDP的PBS溶液，同时设置加入2.5μM、5’FAM标记的RVG-29PBS溶液的细胞为阳性对照组，加入空白PBS溶液的细胞为空白对照组，于37℃孵育20min后，用0.25％的胰蛋白酶消化孔内细胞，离心收集后用0.5mL PBS溶液重悬，于流式细胞仪中检测。结果如图2所示，RDP组细胞荧光强度与RVG-29组细胞荧光强度相当，且明显高于空白组。
实施例3：RDP-R3/siRNA纳米粒的制备及理化性质考察
实验采用复凝聚法制备包载siRNA的RDP-R3纳米粒。将siRNA和RDP-R3分别用DEPC水稀释至一定浓度，且氮磷浓度比为50：1，分别置于37℃水浴中预热10min。吸取等体积RDP-R3溶液，加入到siRNA溶液中，迅速于涡旋混合器上涡旋45s，即得RDP-R3/siRNA纳米粒。
将制得的RDP-R3/siRNA纳米粒稀释5倍，于马尔文粒径仪分别测定纳米粒的粒径数及Zeta电位。
如图3所示，所得RDP-R3/siRNA纳米粒粒径为72.42nm，PDI为0.214，zeta电位为19.1mV。所得纳米粒粒径较小且较为均一，具有脑靶向应用前景。
实施例4：RDP-R4/siRNA纳米粒的制备及理化性质考察
实验采用复凝聚法制备包载siRNA的RDP-R4纳米粒。将siRNA和RDP-R4分别用DEPC水稀释至一定浓度，且氮磷浓度比为50：1，分别置于37℃水浴中预热10min。吸取等体积RDP-R4溶液，加入到siRNA溶液中，迅速于涡旋混合器上涡旋45s，即得RDP-R4/siRNA纳米粒。
将制得的RDP-R4/siRNA纳米粒稀释5倍，于马尔文粒径仪分别测定纳米粒的粒径数及Zeta电位。
如图4所示，所得RDP-R4/siRNA纳米粒粒径为75.95nm，PDI为0.201，zeta电位为19.7mV。所得纳米粒粒径较小且较为均一，具有脑靶向应用前景。
实施例5：RDP-R5/siRNA纳米粒的制备及理化性质考察
实验采用复凝聚法制备包载siRNA的RDP-R5纳米粒。将siRNA和RDP-R5分别用DEPC水稀释至一定浓度，且氮磷浓度比为50：1，分别置于37℃水浴中预热10min。吸取等体积RDP-R5溶液，加入到siRNA溶液中，迅速于涡旋混合器上涡旋45s，即得RDP-R5/siRNA纳米粒。
将制得的RDP-R5/siRNA纳米粒稀释5倍，于马尔文粒径仪分别测定纳米粒的粒径数及Zeta电位。
如图5所示，所得RDP-R5/siRNA纳米粒粒径为76.97nm，PDI为0.203，zeta电位为20.1mV。所得纳米粒粒径较小且较为均一，具有脑靶向应用前景。
实施例6：RDP-R6/siRNA纳米粒的制备及理化性质考察
实验采用复凝聚法制备包载siRNA的RDP-R6纳米粒。将siRNA和RDP-R6分别用DEPC水稀释至一定浓度，且氮磷浓度比为50：1，分别置于37℃水浴中预热10min。吸取等体积RDP-R6溶液，加入到siRNA溶液中，迅速于涡旋混合器上涡旋45s，即得RDP-R6/siRNA纳米粒。
将制得的RDP-R6/siRNA纳米粒稀释5倍，于马尔文粒径仪分别测定纳米粒的粒径数及Zeta电位。
如图6所示，所得RDP-R6/siRNA纳米粒粒径为84.70nm，PDI为0.169，zeta电位为21.9mV。所得纳米粒粒径较小且较为均一，具有脑靶向应用前景。
实施例7：RDP-R7/siRNA纳米粒的制备及理化性质考察
实验采用复凝聚法制备包载siRNA的RDP-R7纳米粒。将siRNA和RDP-R7分别用DEPC水稀释至一定浓度，且氮磷浓度比为50：1，分别置于37℃水浴中预热10min。吸取等体积RDP-R7溶液，加入到siRNA溶液中，迅速于涡旋混合器上涡旋45s，即得RDP-R7/siRNA纳米粒。
将制得的RDP-R7/siRNA纳米粒稀释5倍，于马尔文粒径仪分别测定纳米粒的粒径数及Zeta电位。
如图7所示，所得RDP-R7/siRNA纳米粒粒径为89.38nm，PDI为0.198，zeta电位为26.0mV。所得纳米粒粒径较小且较为均一，具有脑靶向应用前景。
实施例8：RDP-R8/siRNA纳米粒的制备及理化性质考察
实验采用复凝聚法制备包载siRNA的RDP-R8纳米粒。将siRNA和RDP-R8分别用DEPC水稀释至一定浓度，且氮磷浓度比为50：1，分别置于37℃水浴中预热10min。吸取等体积RDP-R8溶液，加入到siRNA溶液中，迅速于涡旋混合器上涡旋45s，即得RDP-R8/siRNA纳米粒。
将制得的RDP-R8/siRNA纳米粒稀释5倍，于马尔文粒径仪分别测定纳米粒的粒径数及Zeta电位。
如图8所示，所得RDP-R8/siRNA纳米粒粒径为92.12nm，PDI为0.221，zeta电位为32.7mV。所得纳米粒粒径较小且较为均一，具有脑靶向应用前景。
实施例9：RDP-R9/siRNA纳米粒的制备及理化性质考察
实验采用复凝聚法制备包载siRNA的RDP-R9纳米粒。将siRNA和RDP-R8分别用DEPC水稀释至一定浓度，且氮磷浓度比为50：1，分别置于37℃水浴中预热10min。吸取等体积RDP-R9溶液，加入到siRNA溶液中，迅速于涡旋混合器上涡旋45s，即得RDP-R9/siRNA纳米粒。
将制得的RDP-R9/siRNA纳米粒稀释5倍，于马尔文粒径仪分别测定纳米粒的粒径数及Zeta电位。
如图9所示，所得RDP-R9/siRNA纳米粒粒径为93.53nm，PDI为0.208，zeta电位为31.9mV。所得纳米粒粒径较小且较为均一，具有脑靶向应用前景。
实施例10：RDP-R10/siRNA纳米粒的制备及理化性质考察
实验采用复凝聚法制备包载siRNA的RDP-R10纳米粒。将siRNA和RDP-R10分别用DEPC水稀释至一定浓度，且氮磷浓度比为50：1，分别置于37℃水浴中预热10min。吸取等体积RDP-R10溶液，加入到siRNA溶液中，迅速于涡旋混合器上涡旋45s，即得RDP-R10/siRNA纳米粒。
将制得的RDP-R10/siRNA纳米粒稀释5倍，于马尔文粒径仪分别测定纳米粒的粒径数及Zeta电位。
如图10所示，所得RDP-R10/siRNA纳米粒粒径为97.89nm，PDI为0.144，zeta电位为32.1mV。所得纳米粒粒径较小且较为均一，具有脑靶向应用前景。
实施例11：RDP-R11/siRNA纳米粒的制备及理化性质考察
实验采用复凝聚法制备包载siRNA的RDP-R11纳米粒。将siRNA和RDP-R11分别用DEPC水稀释至一定浓度，且氮磷浓度比为50：1，分别置于37℃水浴中预热10min。吸取等体积RDP-R11溶液，加入到siRNA溶液中，迅速于涡旋混合器上涡旋45s，即得RDP-R11/siRNA纳米粒。
将制得的RDP-R11/siRNA纳米粒稀释5倍，于马尔文粒径仪分别测定纳米粒的粒径数及Zeta电位。
如图11所示，所得RDP-R11/siRNA纳米粒粒径为109.6nm，PDI为0.047，zeta电位为30.9mV。所得纳米粒粒径较小且较为均一，具有脑靶向应用前景。
实施例12：RDP-R12/siRNA纳米粒的制备及理化性质考察
实验采用复凝聚法制备包载siRNA的RDP-R12纳米粒。将siRNA和RDP-R12分别用DEPC水稀释至一定浓度，且氮磷浓度比为50：1，分别置于37℃水浴中预热10min。吸取等体积RDP-R12溶液，加入到siRNA溶液中，迅速于涡旋混合器上涡旋45s，即得RDP-R12/siRNA纳米粒。
将制得的RDP-R12/siRNA纳米粒稀释5倍，于马尔文粒径仪分别测定纳米粒的粒径数及Zeta电位。
如图12所示，所得RDP-R12/siRNA纳米粒粒径为126.6nm，PDI为0.245，zeta电位为33.3mV。所得纳米粒粒径较小且较为均一，具有脑靶向应用前景。
实施例13：RDP-R5/DNA纳米粒的制备及理化性质考察
实验采用复凝聚法制备包载pGL4.50质粒DNA的RDP-R5纳米粒。将DNA和RDP-R5分别用DEPC水稀释至一定浓度，且氮磷浓度比为50：1，分别置于37℃水浴中预热10min。吸取等体积RDP-R5溶液，加入到DNA溶液中，迅速于涡旋混合器上涡旋45s，即得RDP-R5/DNA纳米粒。
将制得的RDP-R5/DNA纳米粒稀释5倍，于马尔文粒径仪分别测定纳米粒的粒径数及Zeta电位。
如图13所示，所得RDP-R5/DNA纳米粒粒径为149.0nm，PDI为0.277，zeta电位为27.0mV。所得纳米粒粒径较小且较为均一，具有脑靶向应用前景。
实施例14：RVG29-R5/siRNA纳米粒的制备及理化性质考察
实验采用复凝聚法制备包载siRNA的RVG29-R5纳米粒。将siRNA和RVG29-R5分别用DEPC水稀释至一定浓度，且氮磷浓度比为50：1，分别置于37℃水浴中预热10min。吸取等体积RVG29-R5溶液，加入到DNA溶液中，迅速于涡旋混合器上涡旋45s，即得RVG29-R5/DNA纳米粒。
将制得的RVG29-R5/DNA纳米粒稀释5倍，于马尔文粒径仪分别测定纳米粒的粒径数及Zeta电位。
如图14所示，所得RVG29-R5/siRNA纳米粒粒径为119.7nm，PDI为0.268，zeta电位为23.1mV。所得纳米粒粒径相比RDP-R5/siRNA较大，由此可见，RDP不仅降低生产成本，更能在一定程度上减小纳米粒粒径，相对RVG更具有脑靶向应用前景。
实施例15：扫描电镜观察RDP-R5/siRNA形态
实验采用负染法观察RDP-R5/siRNA纳米粒外观。取少量纳米粒混悬液，稀释5倍后滴至铺有碳膜的铜网上，静置2min，用滤纸吸干混悬液，再滴加2％磷钨酸负染2min，于透射电镜下观察纳米粒形态，并选取有代表性的视野拍照。
由图15可见，所得RDP-R5/siRNA纳米粒为圆整球形粒子，表面光滑，粒径约为100nm左右，与粒径测定结果基本一致。
实施例16：RDP-R5细胞毒性评价实验采用CCK-8法测定RDP-R5对大鼠脑胶质瘤细胞C6-Luc的细胞毒性。取对数生长期的C6-Luc细胞，以5×103/孔或3×103/孔的密度接种于96孔板，于37℃、5％CO2孵育24h。分别加入RDP-R5浓度为100、75、50、25、10、7.5、5、2.5、1μg/mL的RPMI-1640培养液100μL，继续孵育24h或48h。孵育结束后，吸去培养液，每孔加入含10％CCK-8的培养液100μL，孵育2h后于酶标仪450nm处测定OD值。
细胞活力(％)＝(OD实验孔-OD调零孔)/(OD对照孔-OD调零孔)×100％。
如图16所示，与不同浓度的RDP-R5共同孵育24h或48h后，C6-Luc细胞活力均高于95％，表明RDP-R5几乎无细胞毒性，具有良好的安全性，可作为包载siRNA的载体材料使用。
实施例17：RDP-R5/siFAM纳米粒细胞摄取效率考察
实验以FAM标记的阴性对照siRNA(siFAM)为模型药物，采用流式细胞仪测定RDP-R5/siFAM纳米粒细胞摄取情况。取对数生长期的C6-Luc细胞，以15×104/孔的密度铺于12孔板中，37℃、5％CO2孵育24小时。将RDP-R5/siFAM纳米粒以siRNA剂量40pmol/孔转染入相应孔中培养1小时。孵育结束后，用预冷PBS洗涤细胞3次，用浓度为0.25％的胰蛋白酶消化收集孔内的细胞，0.5mL PBS溶液分散，上机检测。
实验采用同源阴性对照多肽RV-MAT与R5相连，包载siFAM，作为阴性对照组。由图17可见，RDP-R5/siFAM组细胞摄取效率明显高于其他组，裸siFAM及RV-MAT-R5/siFAM几乎无摄取，表明RDP-R5/siFAM纳米粒可显著被细胞摄取，从而发挥效果。
实施例18：RDP-R5/siSur纳米粒体外抑瘤效果考察
实验采用CCK-8法测定载靶向Survivin基因的siRNA纳米粒RDP-R5/siSur对肿瘤细胞增殖抑制效果。取对数生长期的C6-Luc细胞以7×104个/孔或5×104/孔的密度铺于24孔板，37℃、5％CO2孵育24h。弃培养液，PBS洗一次，将RDP-R5/siSur纳米粒以siSur剂量为20pmol/孔转染至相应孔中，同时设置仅加入无血清RPMI-1640培养液的组别为空白对照组，以加入同浓度裸siSur的组别及加入同浓度RV-MAT-R5/siSur的组别作为阴性对照组，每组设置3个复孔。培养4h后更换含10％FBS的培养液，继续孵育20h或44h。孵育结束后，弃培养液，每孔加入含10％CCK-8的培养液200μL，继续孵育2h后，于酶标仪450nm处测定吸光度。
细胞增殖抑制率/％＝[1-(OD实验-OD调零)/(OD对照-OD调零)]×100％。
实验结果由图18所示，RDP-R5/siSur纳米粒对C6-Luc细胞24h抑制率为61.97％，48h抑制率为84.61％，远高于其他组别。
实施例19：流式细胞仪考察RDP-R5/siSur纳米粒诱导C6-Luc细胞凋亡
实验采用Annexin V/FITC双染法考察载靶向Survivin基因的siRNA纳米粒RDP-R5/siSur诱导细胞凋亡情况。取对数生长期C6-Luc细胞以15×104个/孔的密度铺于12孔板，37℃、5％CO2孵育24h。将载RDP-R5/siSur的纳米粒以siSur剂量为40pmol/孔转染至各孔中，同时设置仅加入无血清RPMI-1640培养液的组别为空白对照组，以加入同浓度裸siSur的组别及加入同浓度RV-MAT-R5/siSur的组别作为阴性对照组，每组设置3个复孔。培养4h后更换含10％FBS的培养液，继续孵育44h。孵育结束后使用不含EDTA的胰酶消化并以2000rpm转速，离心5min收集细胞，PBS洗涤一次后参照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明，用500μL结合液吹散，加入10μL Annexin V室温避光染色10min后加入5μL PI，立即使用流式细胞仪检测。
如图19所示，RDP-R5/siSur纳米粒处理的组别细胞晚期调往率为(57.93±4.00)％，远高于其他组别。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院药物研究所
<120> 一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽修饰的脑靶向核酸递送载体及其应用
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Arg Arg Arg
35

Claims (14)

1.一种脑靶向核酸递送载体RDP-(R)n，其特征在于，所述的脑靶向核酸递送载体RDP-(R)n由狂犬病毒糖蛋白衍生肽与多聚精氨酸连接而得，RDP表示狂犬病毒衍生肽，具体为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，R表示精氨酸，n表示多聚精氨酸聚合度，n选自3～12。
2.根据权利要求1的脑靶向核酸递送载体RDP-(R)n，其特征在于，所述的狂犬病毒糖蛋白衍生肽的氨基酸序列中的氨基酸包括L型或D型氨基酸。
3.根据权利要求1的脑靶向核酸递送载体RDP-(R)n，其特征在于，所述的脑靶向核酸递送载体RDP-(R)n的氨基酸序列为SEQ ID NO:2～11所示的氨基酸序列。
4.权利要求1的脑靶向核酸递送载体RDP-(R)n在制备脑靶向核酸递送药物中的应用。
5.一种脑靶向核酸递送系统，其特征在于，所述的脑靶向核酸递送系统由权利要求1所述的脑靶向核酸递送载体RDP-(R)n和核酸构成。
6.根据权利要求5所述的脑靶向核酸递送系统，其特征在于，核酸递送载体与核酸的氮磷比为1：1-1000：1。
7.根据权利要求6所述的脑靶向核酸递送系统，其特征在于，核酸递送载体与核酸的氮磷比为20：1-200：1。
8.根据权利要求5所述的脑靶向核酸递送系统，其特征在于，所述核酸选自RNA或DNA。
9.根据权利要求5所述的脑靶向核酸递送系统，其特征在于，所述的RNA选自siRNA或shRNA；所述的DNA取自质粒DNA。
10.根据权利要求9所述的脑靶向核酸递送系统，其特征在于，所述的siRNA的大小为15-30bp；所述的shRNA的大小为15-30bp；质粒DNA大小为2kbp-12kbp。
11.根据权利要求10所述的脑靶向核酸递送系统，其特征在于，所述的siRNA用于脑肿瘤的治疗，生存素或Bcl-2作为靶点；所述的shRNA用于神经退行性疾病的治疗，BACE1-AS作为靶点；所述的DNA用于神经退行性疾病或脑肿瘤的治疗，为编码BACE1-AS shRNA或p53蛋白的质粒DNA。
12.根据权利要求5所述的脑靶向核酸递送系统，其特征在于，所述的脑靶向核酸递送系统由核酸递送载体与核酸通过复凝聚法制备。
13.根据权利要求12所述的脑靶向核酸递送系统，其特征在于，所述复凝聚法的制备温度为：20℃、37℃。
14.根据权利要求12所述的脑靶向核酸递送系统，其特征在于，所述复凝聚法的涡旋时间为15s、30s、45s、60s。
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