JP2023545401A - 高度な細胞透過性ペプチド担体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、一般に、薬剤を所望の細胞に送達するための最適化されたペプチド送達システムを含む組成物及びそのシステムの使用方法に関する。特定の態様において、薬剤は生物活性剤であり、方法は１つ又はそれ以上の疾患又は障害の治療又は予防を含む。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６３／０８６，８２３号に対する優先権を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６３／０８６，８２３号に対する優先権を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
連邦政府が支援する研究開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与された助成金番号ＮＩＤＣＲ Ｒ２１ＤＥ０２７２３１及びＮＩＣＤＲ Ｔ３２ＤＥ０１７５５１の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与された助成金番号ＮＩＤＣＲ Ｒ２１ＤＥ０２７２３１及びＮＩＣＤＲ Ｔ３２ＤＥ０１７５５１の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
発明の背景
癌治療における最近の有望な手段の１つは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用であり、これは、小さな非コード二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子による分解のためのｍＲＮＡの特異的ターゲティングを含む、高度に保存された転写後の遺伝子サイレンシングメカニズムである（Fire, et al. Nature, 1998. 391(6669):806-811; Rana. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007. 8(1): 23-36）。実際、化学合成された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を哺乳動物の培養細胞に導入すると、配列特異的な遺伝子サイレンシングを効率的に誘導できることが発見された（Elbashir, et al. Nature, 2001. 411(6836): 494-498）ため、疾患の原因となる遺伝子を特異的に標的としてサイレンシングする手段として、ＲＮＡｉの治療可能性が明らかになった（Cummings, et al. Transl Res, 2019. 214: 92-104）。それ以来、様々な臨床試験を含む多くの研究が、ＲＮＡｉの治療の可能性を示しており、２０１８年に世界で初めてＦＤＡがｓｉＲＮＡ薬を承認するに至った。これらの試験には、ＲＮＡｉを癌治療の有望な治療手段として証明したヒト癌患者の前臨床試験及び早期臨床試験が含まれていた（Cummings, et al. Transl Res, 2019. 214: 92-104; Bobbin, et al. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2016. 56: 103-122; Das, et al. Nucleic Acid Ther, 2019. 29(2): 61-66; Zuckerman, et al. Nat Rev Drug Discov, 2015. 14(12): 843-856）。
癌治療における最近の有望な手段の１つは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用であり、これは、小さな非コード二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子による分解のためのｍＲＮＡの特異的ターゲティングを含む、高度に保存された転写後の遺伝子サイレンシングメカニズムである（Fire, et al. Nature, 1998. 391(6669):806-811; Rana. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007. 8(1): 23-36）。実際、化学合成された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を哺乳動物の培養細胞に導入すると、配列特異的な遺伝子サイレンシングを効率的に誘導できることが発見された（Elbashir, et al. Nature, 2001. 411(6836): 494-498）ため、疾患の原因となる遺伝子を特異的に標的としてサイレンシングする手段として、ＲＮＡｉの治療可能性が明らかになった（Cummings, et al. Transl Res, 2019. 214: 92-104）。それ以来、様々な臨床試験を含む多くの研究が、ＲＮＡｉの治療の可能性を示しており、２０１８年に世界で初めてＦＤＡがｓｉＲＮＡ薬を承認するに至った。これらの試験には、ＲＮＡｉを癌治療の有望な治療手段として証明したヒト癌患者の前臨床試験及び早期臨床試験が含まれていた（Cummings, et al. Transl Res, 2019. 214: 92-104; Bobbin, et al. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2016. 56: 103-122; Das, et al. Nucleic Acid Ther, 2019. 29(2): 61-66; Zuckerman, et al. Nat Rev Drug Discov, 2015. 14(12): 843-856）。
遺伝子サイレンシング効率を最大化するために、ｓｉＲＮＡの治療的投与には、通常この種の治療に関連する多くの課題（例えば、急速な腎排泄、ＲＮａｓｅによる分解、特定の細胞型へのホーミング、細胞内取り込み、エンドソーム捕捉、及び送達プラットフォームからのｓｉＲＮＡカーゴの放出）を克服できる送達プラットフォームが必要である（Cummings, et al. Transl Res, 2019. 214: 92-104; Whitehead, et al. Nat Rev Drug Discov, 2009. 8(2): 129-138; Gavrilov, et al. Yale J Biol Med, 2012. 85(2): 187-200）。現在、ウイルスベクターから非ウイルスベクターまで様々なタイプのｓｉＲＮＡ送達プラットフォームがあり、脂質、ポリマー、アプタマー、及びペプチドなどの技術を包含する非ウイルスベクターを用いて上記の障害を軽減することに関しては、それぞれに長所と短所がある（Cummings, et al. Transl Res, 2019. 214: 92-104; Singh, et al. Artif Cells Nanomed Biotechnol, 2018. 46(2): 274-283; Marquez, et al. Oncomedicine, 2018. 3: 48-58）。特にペプチドは、その設計を容易に制御できるため、機能及び物理化学的特性の調整を可能にする非常に好ましい薬物担体であることがわかっている（Cummings, et al. Transl Res, 2019. 214: 92-104）。実際、ペプチド送達システムが適切に設計されている場合、ペプチド結合ｓｉＲＮＡ複合体は、ネイキッドｓｉＲＮＡ（naked siRNA）が直面する送達の課題の多くを克服することができる。そのようなペプチドの１つがキメラペプチドであり、これは、そのカチオン性ノナ－アルギニンＣ末端と融合性ＩＮＦ７ Ｎ末端を介して、それぞれｓｉＲＮＡ細胞の取り込みとエンドソームの捕捉に関連する課題を克服するために特別に設計された（Cantini, et al. PLoS One, 2013. 8(9): e73348）。まとめるとこれらの特徴により、ＣＩＰ２Ａ癌遺伝子（ｓｉＣＩＰ２Ａ）をインビトロで癌細胞へ及びインビボで腫瘍内注射によりターゲティングし、ＣＩＰ２Ａサイレンシングを誘導するように設計された治療用ｓｉＲＮＡの細胞内送達とバイオアベイラビリティを増強する５９９の能力が得られ、腫瘍増殖の顕著な抑制がもたらされた（Cantini, et al. PLoS One, 2013. 8(9): e73348; Alexander-Bryant, et al. J Control Release, 2015. 218: 72-81）。その後の研究では、非共有多機能ペプチド複合体アプローチを使用して、５９９ペプチドと癌細胞ターゲティングペプチドとの複合体形成が、全身投与時に異種移植口腔癌腫瘍へのｓｉＣＩＰ２Ａの効果的なターゲティング／送達を相乗的に媒介し、ＣＩＰ２Ａサイレンシングを顕著に増強することがわかった。（Alexander-Bryant, et al. Oral Oncol, 2017. 72: 123-131）。
しかし、インビボでのペプチド担体の治療的応用に関する一般的な懸念は、薬物カーゴの送達のために細胞標的に到達する前のその時期尚早な分解である（Patel, et al. Pharm Res, 2007. 24(11): 1977-1992; Verdurmen, et al. Chem Biol, 2011. 18(8): 1000-1010）。従って、この問題に対処するための一般的な戦略は、Ｄ－アミノ酸を含むようにペプチドの立体化学を調節し、それによって、対応するＬ－アミノ酸体よりもプロテアーゼ耐性を高めたものにすることであり（Verdurmen, et al. Chem Biol, 2011. 18(8): 1000-1010; Elmquist, et al. Biol Chem, 2003. 384(3): 387-393; Pujals, et al. Biochem Soc Trans, 2007. 35(Pt 4): 794-796; Youngblood, et al. Bioconjug Chem, 2007. 18(1): 50-60）、安定性の増加が、完全にＤ－アミノ酸で構成されたペプチドに限定されず、部分的なＤ－アミノ酸置換を有するペプチドでも観察される（Verdurmen, et al. Chem Biol, 2011. 18(8): 1000-1010; Youngblood, et al. Bioconjug Chem, 2007. 18(1): 50-60; Tugyi, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2005. 102(2): 413-418）。実際、この具体的な理由から、５９９中のノナ－アルギニン片はＤ－アルギニンを含むように設計されており、インビトロでの血清及びリボヌクレアーゼによる分解から、またインビボでの腫瘍内注射時に、ｓｉＲＮＡを保護できることが示されている（Cantini, et al. PLoS One, 2013. 8(9): e73348; Alexander-Bryant, et al. J Control Release, 2015. 218: 72-81）。ペプチド担体の設計にＤ－アルギニンを含めるとプロテアーゼ耐性が付与される可能性があるが、Ｌ－アルギニンを含めることにも利点があるようである。興味深いことに、細胞結合リガンドをアルギニンが豊富な細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）に結合する効果を評価する際に、Zeller et al. は、Ｄ－アルギニンが豊富なＣＰＰではなくＬ－アルギニンが豊富なＣＰＰに結合したリガンドは、後期エンドソームからサイトゾルへのｓｉＲＮＡの放出の増強のために、遺伝子サイレンシングの動力学を延長できることを見いだした（Zeller, et al. Chem Biol, 2015. 22(1): 50-62）。この効果は、エンドソームのタンパク質分解活性に依存することが証明されており、これは、アルギニンに富むＣＰＰの部分的な分解が、ｓｉＲＮＡのエンドソームからサイトゾルへの移動に必要であることを意味した。さらに、この効果は、ｓｉＲＮＡの送達のために腫瘍ターゲティングペプチドをＤ－アルギニンに富む断片と結合させる同様のアプローチを使用した別の研究が、エンドソーム溶解ペプチドの存在下でさえ、標的遺伝子のノックダウンを示さなかった理由を説明することもできた（Jun, et al. PLoS One, 2015. 10(2): e0118310）。ペプチドとｓｉＲＮＡの間の静電的相互作用を減少させることがたとえ部分的であっても、選択されたアルギニンがアラニンに置き換えられた場合にのみ、遺伝子サイレンシングが誘導され、ペプチドからのｓｉＲＮＡの効果的な放出の必要性が再度示唆された（Jun, et al. PLoS One, 2015. 10(2): e0118310）．
従って、ｓｉＲＮＡ及びＲＮＡｉ関連分子を細胞に送達するための改善された組成物及び方法が当技術分野で必要とされている。本発明は、この満たされていない必要性を満たす。
１つの実施態様において、本発明は、ａ）５９９ペプチド（配列番号１）の誘導体を含むペプチドと、ｂ）薬剤とを含む、薬剤の送達のための組成物に関する。。
組成物の１つの実施態様において、配列番号１の誘導体を含むペプチドは、配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基がアラニン残基で置換されているアミノ酸配列を含む。１つの実施態様において、配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基は、Ｄ－アラニン残基で置換されている。１つの実施態様において、配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基は、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、及び３５からなる群から選択される番号のアミノ酸残基の位置でＤ－アラニン残基で置換されている。
１つの実施態様において、ペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
組成物の１つの実施態様において、配列番号１の誘導体を含むペプチドは、配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基がＬ－アラニン残基で置換されているアミノ酸配列を含む。１つの実施態様において、配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基は、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、及び３５からなる群から選択される番号のアミノ酸残基の位置でＬ－アラニン残基で置換される。１つの実施態様において、ペプチドは、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
組成物の１つの実施態様において、配列番号１の誘導体を含むペプチドは、少なくとも１つのＤ－アルギニン残基がＬ－アルギニン残基で置換されているアミノ酸配列を含む。
組成物の１つの実施態様において、配列番号１の誘導体を含むペプチドは、少なくとも３つのＤ－アルギニン残基がそれぞれＬ－アルギニン残基で置換されているアミノ酸配列を含む。１つの実施態様において、ペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
組成物の１つの実施態様において、配列番号１の誘導体を含むペプチドは、配列番号１の少なくとも１つのＬ型残基が前記残基のＤ型で置換されているアミノ酸配列を含む。１つの実施態様において、ペプチドは、配列番号７及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
組成物の１つの実施態様において、薬剤は、核酸分子、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体断片、及び低分子からなる群から選択される。１つの実施態様において、核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、キラー－ｔＲＮＡ、ガイドＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムの一部）、ロング非コードＲＮＡ、抗ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、及びプラスミドＤＮＡからなる群から選択される。
組成物の１つの実施態様において、ペプチドと薬剤は、約５：１～５０：１のモル比である。組成物の１つの実施態様において、前記ペプチドは、腎クリアランスを防止するためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾を含む。
１つの実施態様において、組成物は、ターゲティング部分と密集したカチオン性アミノ酸残基のストレッチとを含む第２のペプチドをさらに含む。１つの実施態様において、第２のペプチドは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。
１つの実施態様において、本発明は、薬剤を細胞に投与する方法に関し、この方法は、細胞に、ａ）５９９ペプチド（配列番号１）の誘導体を含むペプチドとｂ）薬剤とを含む組成物の有効量を接触させることを含む。
１つの実施態様において、本発明は、本発明の組成物のいずれか１つの治療有効量を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体における疾患又は障害を治療する方法に関する。１つの実施態様において、この方法は、被験体に、ａ）５９９ペプチド（配列番号１）の誘導体を含むペプチドと、ｂ）薬剤とを含む組成物の治療有効量を投与することを含む以下を含む組成物の治療有効量を投与することを含む：ａ）５９９ペプチド（配列番号１）の誘導体を含むペプチド；及びｂ）薬剤とを含む組成物の治療有効量を投与することを含む。１つの実施態様において、この方法は、被験体に、以下を含む組成物の治療有効量を投与することを含む：ａ）５９９ペプチド（配列番号１）の誘導体を含むペプチド；ｂ）薬剤；及びｃ）ターゲティング部分と密集したカチオン性アミノ酸残基のストレッチとを含む第２のペプチド。１つの実施態様において、薬剤は、疾患又は障害の少なくとも１つの症状を軽減する。１つの実施態様において、疾患又は障害は癌である。
１つの実施態様において、本発明は、ａ）５９９ペプチド（配列番号１）を含むペプチドと、ｂ）薬剤とを含む、薬剤の送達のための組成物を含み、ここで薬剤は、プラスミドＤＮＡ及びｍＲＮＡからなる群から選択される１つ又はそれ以上を含む。
１つの実施態様において、本発明は、薬剤を細胞に投与する方法であって、この方法は、細胞に、ａ）５９９ペプチド（配列番号１）を含むペプチドと、ｂ）薬剤とを含む組成物の有効量を接触させることを含み、ここで薬剤は、プラスミドＤＮＡ及びｍＲＮＡからなる群から選択される１つ又はそれ以上を含む。
１つの実施態様において、本発明は、それを必要とする被験体における疾患又は障害を治療する方法を含み、この方法は、被験体に、ａ）５９９ペプチド（配列番号１）を含むペプチドと、ｂ）薬剤とを含む組成物の治療有効量を被験体に投与することを含み、ここで薬剤は、プラスミドＤＮＡ及びｍＲＮＡからなる群から選択される１つ又はそれ以上を含む。
本発明の実施態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと、よりよく理解されるであろう。本発明は、図面に示される実施態様の正確な構成及び手段に限定されないことを理解されたい。
詳細な説明
本発明は、薬剤を所望の細胞に送達するための組成物及び方法に関する。例えば、特定の態様において本発明は、薬剤と効率的に相互作用し、細胞への薬剤の送達を媒介するペプチドの組成物を含む。本発明は、ペプチド内のアミノ酸立体化学及び／又は特定のアミノ酸置換のパターンを改変することにより、所望の細胞への生物活性剤の送達及び放出を改善することができるという発見に基づく。本発明はまた、そのようなペプチドを作製及び使用する方法、薬剤を送達する方法、並びに前記送達方法を使用して疾患又は障害を治療又は予防する方法に関する。
本発明は、薬剤を所望の細胞に送達するための組成物及び方法に関する。例えば、特定の態様において本発明は、薬剤と効率的に相互作用し、細胞への薬剤の送達を媒介するペプチドの組成物を含む。本発明は、ペプチド内のアミノ酸立体化学及び／又は特定のアミノ酸置換のパターンを改変することにより、所望の細胞への生物活性剤の送達及び放出を改善することができるという発見に基づく。本発明はまた、そのようなペプチドを作製及び使用する方法、薬剤を送達する方法、並びに前記送達方法を使用して疾患又は障害を治療又は予防する方法に関する。
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書で使用される場合、以下の各用語は、このセクションで関連付けられる意味を有する。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として「要素」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。
量、持続時間などの測定可能な値に言及する場合に本明細書で使用される「約」は、指定された値からの±２０％、±１０％、±５％、±１％、又は±０．１の変動を包含することを意味するが、そのような変動は、開示された方法を実行するのに適切であるためである。
「アンチセンス」は、特に、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コード鎖の核酸配列、又は非コード鎖と実質的に相同的な配列を指す。本明細書で定義されるように、アンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列がＤＮＡ分子のコード鎖のコード部分のみに相補的である必要はない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコード鎖上で特定される調節配列に相補的であることができ、この調節配列はコード配列の発現を制御する。
本明細書で使用される用語「抗腫瘍効果」は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、又は癌状態に関連する様々な生理学的症状の改善によって明らかになり得る生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、及び抗体が、最初に腫瘍の発生を予防する能力によっても明らかにすることができる。
本明細書で使用される用語「結合」又は「結合する」は、特に限定されるものではないが、タンパク質－ＤＮＡ／ＲＮＡ相互作用及びタンパク質－タンパク質相互作用などの２つの分子種間の特異的会合又は他の特異的相互作用、例えばタンパク質とそのＤＮＡ／ＲＮＡ標的、受容体とそのリガンド、酵素とその基質などとの間の特異的な結合を指す。このような結合は、特異的又は非特異的である可能性があり、水素結合、金属配位、疎水性力、ファンデルワールス力、ｐｉ－ｐｉ相互作用、及び／又は静電効果などの様々な非共有相互作用が関与する可能性がある。
本明細書で使用される用語「癌」は、異常細胞の急速かつ制御されない増殖によって特徴付けられる疾患と定義される。癌細胞は、局所的に、又は血流やリンパ系を介して体の他の部分に広がる可能性がある。様々な癌の例には、特に限定されるものではないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌、口腔癌などが含まれる。
用語「細胞」及び「細胞の集団」は交換可能に使用され、複数の細胞、すなわち２つ以上の細胞を指す。集団は１つの細胞型を含む純粋な集団であってもよい。あるいは、集団は複数の細胞型を含み得る。本発明において、細胞集団が含み得る細胞型の数に制限はない。
用語「細胞透過性ペプチド」は、細胞の細胞膜又は細胞壁の細胞外側と接触すると、細胞の細胞内領域に入るペプチドを指す。
本明細書で使用される用語「相補的」又は「相補性」は、塩基対合規則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に関して使用される。例えば、配列「Ａ－Ｇ－Ｔ」は、配列「Ｔ－Ｃ－Ａ」と相補的である。相補性は「部分的」である場合があり、この場合、塩基対合規則に従って核酸の塩基の一部のみが一致する。又は、核酸間に「完全な」又は「全体的な」相補性が存在する可能性がある。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率と強度に大きな影響を与える。これは、増幅反応、及び核酸間の結合に依存する検出方法において特に重要である。
「疾患」とは、動物が恒常性を維持できない健康状態であり、疾患が改善されない場合、動物の健康状態は悪化し続ける。対照的に動物の「障害」とは、動物が恒常性を維持できるが、動物の健康状態が障害がない場合よりも好ましくない健康状態である。治療せずに放っておいても、障害は、動物の健康状態をさらに低下させるとは限らない。
本明細書で使用される「有効量」は、治療又は予防上の利益を提供する量を意味する。
「コード化する」とは、生物学的プロセスにおける、定義された配列のヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）又は定義された配列のアミノ酸及びそこから生じる生物学的特性を有する他のポリマー及び高分子の合成のための鋳型として機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。従って、ある遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞又は他の生物学的システムにおいてタンパク質を産生する場合、その遺伝子はそのタンパク質をコードしている。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に記載されているコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される非コーディング鎖の両方は、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコード化していると言われる。
本明細書で使用される用語「発現」は、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳として定義される
「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって又はインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターには、当技術分野で知られているすべてのベクター、例えば、組み換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド（例えば、ネーキッド又はリポソームに含まれる）、及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）が含まれる。
本明細書で使用される用語「内因性」は、生物、細胞、組織、又はシステムから又はそれらの内部で産生される任意の物質を指す。
本明細書で使用される用語「外因性」は、生物、細胞、組織、又はシステムから又はそれらの外部で産生される任意の物質を指す。
本明細書で使用される用語「断片」は、核酸に適用される場合、より大きな核酸の部分配列を指す。核酸の「断片」は、長さが少なくとも約３６ヌクレオチドであり得る。例えば、少なくとも約４０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、少なくとも約５０～約６０ヌクレオチド、少なくとも約６０～約７０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、又は約１００ヌクレオチド（及びその間の任意の整数値）であり得る。本明細書で使用される用語「断片」は、タンパク質又はペプチドに適用される場合、より大きなタンパク質又はペプチドの部分配列を指す。タンパク質又はペプチドの「断片」は、長さが少なくとも約１２アミノ酸であり得る。例えば、配列番号１の断片は、長さが少なくとも約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５アミノ酸であり得る。
本明細書で使用される用語「機能的に同等」は、第１又は第２のペプチドのいずれかの特定のアミノ酸配列の少なくとも１つの生物学的機能又は活性を保持する本発明によるポリペプチドを指す。
「相同的」は、２つのポリペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性又は配列同一性を指す。２つの比較配列の両方で、ある位置が同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、例えば２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンによって占められている場合、分子はその位置で相同的である。２つの配列間の相同性のパーセントは、２つの配列により共有され一致する位置又は相同的な位置の数を、比較される位置の数で割って１００を掛けた数の関数である。例えば、２つの配列中の１０の位置のうちの６が一致又は相同的なら、２つの配列は６０％の相同性がある。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣ及びＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有する。一般に、最大の相同性が得られるように２つの配列を並べたときに比較が行われる。
本明細書で使用される用語「阻害する」は、分子、反応、相互作用、遺伝子、ｍＲＮＡ、及び／又はタンパク質の発現、安定性、機能、又は活性を測定可能な量だけ低下させるか、又は完全に防止することを意味する。阻害剤は、例えば刺激に結合する、これを部分的又は完全にブロックする、タンパク質、遺伝子、及びｍＲＮＡの安定性、発現、機能、及び活性を、低下させる、防止する、活性化を減少させる、遅らせる、不活化する、脱感作する、又はダウンレギュレートする化合物、例えばアンタゴニストである。
本明細書で使用される用語「取扱説明書」には、本発明の組成物又は方法の有用性を伝達するために使用できる出版物、記録、図表、又は任意の他の表現媒体が含まれる。任意選択的に、又は代わりに、取扱説明書は、被験体の細胞又は組織における疾患又は障害を特定、診断、又は緩和する１つ又はそれ以上の方法を説明することができる。キットの取扱説明書は、例えば、本発明の組成物を含む容器に添付するか、又は組成物を含む容器と一緒に輸送することができる。あるいは、受領者が取扱説明書と組成物を一緒に使用することを意図して、取扱説明書を容器とは別に輸送することができる。
「単離されている」とは、自然状態から変更又は取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に自然に存在する核酸又はペプチドは「単離されている」のではなく、その自然状態の共局在物質から部分的又は完全に分離された同じ核酸又はペプチドは「単離されている」。単離されている核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、又は例えば宿主細胞などの非天然環境に存在することができる。
本明細書で使用される用語「標識物」は、分子に直接的又は間接的に結合されて「標識された」分子を生成する検出可能な化合物又は組成物を指す。標識物は、それ自体で検出可能（例えば、放射性同位体標識物又は蛍光標識物）であるか、又は酵素標識物の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変化を触媒し得る（例えば、アビジン－ビオチン）。
用語「ｍｉＲＮＡ」は、その通常の単純な意味に従って使用され、ＲＮＡベースの遺伝子調節に関与する真核生物に見られるマイクロＲＮＡ分子を指す。例えば、Carrington et al., 2003を参照されたい（これは、参照により本明細書に組み込まれる）。この用語は、前駆体から加工された一本鎖ＲＮＡ分子を指すために使用される。個々のｍｉＲＮＡは様々な生物で特定及び配列決定されており、名前が付けられている。ｍｉＲＮＡの名前とその配列は本明細書に記載されている。さらに、他のｍｉＲＮＡは当業者に知られており、本発明の実施態様において容易に使用することができる。これらの方法及び組成物は、本出願において特定されたｍｉＲＮＡに限定されるべきではなく、これらは例として提供されており、必ずしも本発明を限定するものではない。
本明細書で使用される用語「調節する」は、処置若しくは化合物の非存在下での、被験体における又は被験体の細胞若しくは組織におけるｍＲＮＡ、ポリペプチド、又は応答のレベルと比較して、及び／又は本来は同一であるが未処置の被験体又は被験体の細胞若しくは組織におけるｍＲＮＡ、ポリペプチド、又は応答のレベルと比較して、被験体における又は被験体の細胞若しくは組織におけるｍＲＮＡ、ポリペプチド、又は応答のレベルの検出可能な増加又は減少を媒介することを意味する。この用語は、本来のシグナル又は応答を変化させるか及び／又は影響を与え、それによって被験体、例えばヒトにおいて有益な治療応答を媒介することを包含する。
「核酸」は、ポリヌクレオチドを指し、ポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明による核酸は、ピリミジン及びプリン塩基、例えば、それぞれシトシン、チミン、及びウラシル、並びにアデニン及びグアニンの任意のポリマー又はオリゴマーを含み得る。（Albert L. Lehninger, Principles of Biochemistry, at 793-800 (Worth Pub. 1982)を参照されたい。これは、すべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれている）。実際、本発明は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はペプチド核酸成分、及びこれらの任意の化学変種、例えばこれらの塩基のメチル化、ヒドロキシメチル化、又はグルコシル化形態などを企図する。ポリマー又はオリゴマーは、組成が不均一でも均一でもよく、天然源から単離され得るか、又は人工的若しくは合成的に生成され得る。さらに核酸は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はこれらの混合物でもよく、一本鎖又は二本鎖形態（例えばホモ二本鎖、ヘテロ二本鎖、及びハイブリッド状態を含む）で永久的又は一時的に存在し得る。
「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は、長さが少なくとも２、８、１５、又は２５ヌクレオチドの範囲の核酸であるが、最大５０、１００、１０００、又は５０００ヌクレオチドの長さであり得るか、又はポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする化合物である。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）の配列、又は天然源から単離され、組換え法により生成され、又は人工的に合成され得るそれらの模倣物を含む。本発明のポリヌクレオチドのさらなる例は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。（米国特許第６，１５６，５０１号を参照、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本発明はまた、特定のｔＲＮＡ分子において同定され、三重らせんで存在すると仮定されているフーグスティーン（Hoogsteen）塩基対合などの非伝統的な塩基対合が存在する状況を包含する。「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、本開示において交換可能に使用される。本明細書においてヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣ）によって表される場合、これには、Ｕ」が「Ｔ」を置換する対応するＲＮＡ配列（例えば、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含むことが理解されるであろう。
用語「過剰発現」腫瘍抗原又は腫瘍抗原「過剰発現」は、患者の特定の組織又は臓器内の固形腫瘍のような疾患領域からの細胞における腫瘍抗原の異常なレベルの発現を、その組織又は臓器の正常細胞における発現レベルと比較して示すことを意図している。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍又は血液悪性腫瘍を有する患者は、当技術分野で知られている標準的なアッセイによって決定することができる。
用語「患者」、「被験体」、「個体」などは、本明細書において交換可能に使用され、インビトロ又はインサイチュの任意の動物又はその細胞を指し、本明細書に記載の方法で使用可能である。特定の非限定的な実施態様において、患者、被験体、又は個体はヒトである。
本明細書で使用される用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は交換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含む必要があり、タンパク質又はペプチドの配列を構成できるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いに結合された２つ又はそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質が含まれる。本明細書で使用されるこの用語は、例えば、当技術分野で一般的にペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも呼ばれる短鎖と、当技術分野で多くの種類がある一般にタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば特に、生物学的に活性な断片、実質的に相同的なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変種、修飾ポリペプチド、誘導体、類似物、融合タンパク質などが、特に含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、又はそれらの組み合わせが含まれる。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」は、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ゲノムＤＮＡ、合成形態、及びセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の混合ポリマーを含み、化学的又は生化学的に改変されて非天然、又は誘導体化、合成、又は半合成ヌクレオチド塩基を含む。また、特に限定されるものではないが、１つ又はそれ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、置換、又は他のポリヌクレオチド配列への融合を含む、野生型又は合成遺伝子の改変も企図される。
本明細書で使用される用語「リボヌクレオチド」、ヌクレオチド」、及び「ポリリボヌクレオチド」は、少なくとも２つの塩基－糖－リン酸の組み合わせの列を指す。この用語には、別の実施態様において、糖部分がリボースであるヌクレオチドを含む化合物が含まれる。別の実施態様において、この用語は、骨格が修飾されたＲＮＡ及びＲＮＡ誘導体の両方を含む。「ヌクレオチド」は、別の実施態様において、核酸ポリマーのモノマー単位を指す。ＲＮＡは、別の実施態様において、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（小型核ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、小型干渉／小型阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及びリボザイムの形態であり得る。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの使用は記載されている（Caudy AA et al., Genes & Devel 16: 2491-96、及びそこで引用された参考文献）。さらに、これらの形態のＲＮＡは、一本鎖、二本鎖、三重鎖、又は四重鎖であり得る。この用語にはまた、別の実施態様において、他のタイプの骨格を含むが同じ塩基を含む人工核酸も含まれる。別の実施態様において、人工核酸はＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡは、ペプチド骨格及びヌクレオチド塩基を含み、別の実施態様において、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の両方に結合することができる。別の実施態様において、ヌクレオチドはオキセタン修飾される。別の実施態様において、ヌクレオチドは、１つ又はそれ以上のホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合で置換することによって修飾される。別の実施態様において、人工核酸は、当技術分野で知られている天然核酸のリン酸骨格の任意の他の変種を含む。ホスホチオレート核酸及びＰＮＡの使用は、当業者に知られており、例えば、Neilsen PE, Curr Opin Struct Biol 9:353-57; 及び Raz NK et al. Biochem Biophys Res Commun. 297:1075-84に記載されている。核酸の産生及び使用は当業者に知られており、例えば、Molecular Cloning, (2012), Sambrook and Green, eds. 及び Methods in Enzymology: MethodsMolecular Cloning, (2012), Sambrook and Green, eds. 及び Methods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cells (2003) Purchio and G. C. Fareedに記載されている。各核酸誘導体は、本発明の別個の実施態様を表す
本明細書で使用される用語「特異的に結合する」は、別の分子又は特徴を認識して結合するが、試料中の他の分子又は特徴を実質的に認識又は結合しない、抗体又はペプチドなどの分子を意味する。
本明細書で使用される用語「治療」又は「治療計画」は、疾患又は障害状態を緩和又は改変するために行われる活動、例えば、薬理学的、外科的、食事、及び／又はその他の技術を使用して、疾患又は障害の少なくとも１つの徴候又は症状を軽減又は排除することを意図した一連の治療を指す。治療計画には、処方用量の１種又はそれ以上の薬物又は手術が含まれる場合がある。治療はほとんどの場合、有益であり、障害又は疾患状態の少なくとも１つの徴候又は症状を軽減又は排除するが、場合によっては、治療の効果が望ましくない作用又は副作用をもたらすことがある。治療の効果は、被験体の生理学的状態、例えば年齢、性別、遺伝、体重、その他の疾患又は障害の状態などによっても影響を受ける。
用語「治療有効量」は、研究者、獣医師、医師、又は他の臨床家によって求められている組織、系、又は被験体の生物学的又は医学的応答を誘発する対象化合物の量を指す。用語「治療有効量」は、投与された時、治療される障害又は疾患の徴候又は症状の１つ又はそれ以上の発症を予防するか又はある程度軽減するのに十分な化合物の量を含む。治療有効量は、化合物、疾患又は障害及びその重症度、並びに治療される被験体の年齢、体重などに応じて変化する。
本明細書で使用される用語としての疾患又は障害を「治療する」とは、被験体が経験している疾患又は障害の少なくとも１つの徴候又は症状の頻度又は重症度を軽減することを意味する。
範囲：本開示を通して、本発明の様々な態様を範囲形式で提示することができる。範囲形式での説明は、便宜上及び簡潔にするためだけのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。従って、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、すべての可能な部分範囲を具体的に開示していると見なすべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６など、及びその範囲内の個々の数値（例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６）を有すると見なすべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
説明
本発明は一般的に、薬剤を所望の細胞に送達するための担体として使用できるペプチド送達システムに関する。例えば１つの実施態様において、本発明は、細胞透過能力、薬剤に結合する能力、及び細胞内に入ると薬剤を放出する能力を有するペプチドを含む組成物に関する。特定の実施態様において、ペプチドは、これらの好ましい特徴を改善するために修飾される。例えば１つの実施態様において、ペプチドは、生物活性試薬への結合を改善し、おそらく細胞取り込み時に放出するために、１つ又はそれ以上の非極性残基で中断されたカチオン性残基のストレッチを含む。他の実施態様において、ペプチドは、Ｄ及びＬカチオン性アミノ酸の混合物を含むカチオン性残基のストレッチを含む。
本発明は一般的に、薬剤を所望の細胞に送達するための担体として使用できるペプチド送達システムに関する。例えば１つの実施態様において、本発明は、細胞透過能力、薬剤に結合する能力、及び細胞内に入ると薬剤を放出する能力を有するペプチドを含む組成物に関する。特定の実施態様において、ペプチドは、これらの好ましい特徴を改善するために修飾される。例えば１つの実施態様において、ペプチドは、生物活性試薬への結合を改善し、おそらく細胞取り込み時に放出するために、１つ又はそれ以上の非極性残基で中断されたカチオン性残基のストレッチを含む。他の実施態様において、ペプチドは、Ｄ及びＬカチオン性アミノ酸の混合物を含むカチオン性残基のストレッチを含む。
いくつかの実施態様において、組成物は、ペプチドによって送達される薬剤を含む。例えば１つの実施態様において、薬剤は生物活性剤であり、ここで薬剤は所望の生物学的機能又は活性を調節することができる。１つの実施態様において、生物活性剤は、所望の細胞内の内因性タンパク質の発現を調節する。例えば薬剤は、標的遺伝子のｍＲＮＡ発現を低下させて、翻訳されるタンパク質レベルを低下させることができるｓｉＲＮＡであり得る。１つの実施態様において、薬剤は、細胞によって内因的に発現される外因性核酸を含む。例えば薬剤は、内因的に発現されるタンパク質の発現を増加させるためのｍＲＮＡ又はプラスミドＤＮＡであり得る。他の実施態様において、生物活性剤は、疾患又は障害を治療するために使用される。例えば生物活性剤は、癌を治療する抗腫瘍活性を有することができる。
特定の実施態様において、本発明のペプチドは、二重ペプチド系において１つ又はそれ以上のターゲティングペプチドと組み合わせて、特定の細胞又は細胞の特徴を標的とすることができる。
組成物
１つの態様において、本発明は、薬剤を標的細胞に送達するためのペプチドを含む組成物に関する。従って１つの実施態様において、本発明は、（１）薬剤の送達のためにエンドソーム破壊活性を示す１つ又はそれ以上のペプチドと、（２）１つ又はそれ以上の目的の薬剤との組み合わせを含む組成物に関する。
１つの態様において、本発明は、薬剤を標的細胞に送達するためのペプチドを含む組成物に関する。従って１つの実施態様において、本発明は、（１）薬剤の送達のためにエンドソーム破壊活性を示す１つ又はそれ以上のペプチドと、（２）１つ又はそれ以上の目的の薬剤との組み合わせを含む組成物に関する。
特定の実施態様において、ペプチドは、密集したカチオン性アミノ酸残基のストレッチを含む。カチオン性アミノ酸残基の非限定的な例には、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが含まれる。場合によっては、密集したカチオン性アミノ酸残基のストレッチは、少なくとも４つのアルギニン残基を含む。場合によっては、アルギニン残基の少なくとも１つはＤ型立体異性体である。場合によっては、少なくとも１つのアルギニン残基はＤ型立体異性体であり、少なくとも１つのアルギニン残基はＬ型立体異性体である。場合によっては、カチオン性アミノ酸残基のストレッチは、少なくとも１つの非極性残基によって中断される。場合によっては、非極性残基はアラニンである。場合によっては、アラニンはＤ－アラニンである。
特定の実施態様において、ペプチドは細胞透過能力を有する。場合によっては、ペプチドは所望の細胞に結合し、そこに薬剤を送達することができる。場合によっては、ペプチドは、細胞内に入ると薬剤を放出することができる。１つの実施態様において、ペプチドは、所望の細胞のサイトゾルへの薬剤の放出を促進するエンドソーム破壊活性を有する。１つの実施態様において、薬剤は、生物学的機能又は活性を有する生物活性剤である。例えば１つの実施態様において、生物活性剤は、疾患又は障害の症状を緩和するように機能する。特定の実施態様において、疾患又は障害は癌である。
いくつかの実施態様において、ペプチドは５９９ペプチド（配列番号１）を含む。いくつかの実施態様において、ペプチドは、５９９ペプチド（配列番号１）の誘導体を含む。５９９ペプチドの例示的な誘導体を以下の表に示す。
いくつかの実施態様において、本発明のペプチドは、配列番号１～４０の任意の１つを含む。いくつかの実施態様において、本発明のペプチドは、配列番号２～４０の任意の１つを含む。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の残基のカチオン性ストレッチ内の９個の残基のうちの少なくとも６個はＬ型に改変されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の２７、２８、２９、３３、３４、及び３５位のＤ－アルギニン残基はＬ－アルギニンに改変されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧＲＲＲｒｒｒＲＲＲＫ（配列番号２）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の残基のカチオン性ストレッチ内の９個の残基のうちの少なくとも９個はＬ型に改変されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の２７～３５位のＤ－アルギニン残基はＬ－アルギニン残基に改変されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫ（配列番号３）を含み、ここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の残基のカチオン性ストレッチ内の９個の残基のうちの少なくとも７個はＬ型に改変されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の２８～３４位のＤ－アルギニン残基はＬ－アルギニン残基に改変されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒＲＲＲＲＲＲＲｒＫ（配列番号４）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の残基のカチオン性ストレッチ内の９個の残基のうちの少なくとも３個はＬ型に改変されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の３０、３１、及び３２位のＤ－アルギニン残基はＬ－アルギニン残基に改変されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒｒｒＲＲＲｒｒｒＫ（配列番号５）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の残基のカチオン性ストレッチ内の９個の残基のうちの少なくとも４個はＬ型に改変されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の２８、３０、３２、及び３４位のＤ－アルギニン残基はＬ－アルギニン残基に改変されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒＲｒＲｒＲｒＲｒＫ（配列番号６）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここでＬ型である配列番号１の残基の少なくとも１つ又はそれ以上はＤ型残基に改変されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１のＬ型残基のすべてがＤ型残基に改変されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧｌｆｅａｉｅＧｆｉｅｎＧｗｅＧｍｉｄＧｗｙＧＧＧＧｒｒｒｒｒｒｒｒｒｋ（配列番号７）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここでＬ型残基である配列番号１の残基の少なくとも１つ又はそれ以上はＤ型残基に改変されており、及びここで配列番号１のカチオン性残基のストレッチ内の残基の少なくとも１つ又はそれ以上はＬ型に改変されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１のＬ型残基のすべてがＤ型残基に改変されており、及びここで配列番号１のカチオン性残基のストレッチ内の残基のすべてがＬ型に改変されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧｌｆｅａｉｅＧｆｉｅｎＧｗｅＧｍｉｄＧｗｙＧＧＧＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫ（配列番号８）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の残基のカチオン性ストレッチ内の９個の残基のうちの少なくとも５個はＬ型に改変されており、及びここで配列番号１の少なくとも１つのアルギニン残基はアラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の２７、２８、３３、３４、及び３５位のＤ－アルギニン残基はＬ－アルギニン残基に改変されており、及びここで２９位のＤ－アルギニンはＤ－アラニンに置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧＲＲａｒｒｒＲＲＲＫ（配列番号９）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の残基のカチオン性ストレッチ内の９個の残基のうちの少なくとも８個はＬ型に改変されており、及びここで配列番号１の少なくとも１つのアルギニン残基はアラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の２７、２８、及び３０～３５位のＤ－アルギニン残基はＬ－アルギニン残基に改変されており、及びここで２９位のＤ－アルギニンはＤ－アラニンに置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧＲＲａＲＲＲＲＲＲＫ（配列番号１０）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の残基のカチオン性ストレッチ内の９個の残基のうちの少なくとも６個はＬ型に改変されており、及びここで配列番号１の少なくとも１つのアルギニン残基はアラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の２８位、及び３０～３４位のＤ－アルギニン残基はＬ－アルギニン残基に改変されており、及びここで２９位のＤ－アルギニンはＤ－アラニンに置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒＲａＲＲＲＲＲｒＫ（配列番号１１）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の残基のカチオン性ストレッチ内の９個の残基のうちの少なくとも３個はＬ型に改変されており、及びここで配列番号１の少なくとも１つのアルギニン残基はアラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の３０、３１、及び３２位のＤ－アルギニン残基はＬ－アルギニン残基に改変されており、及びここで２９位のＤ－アルギニンはＤ－アラニンに置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒｒａＲＲＲｒｒｒＫ（配列番号１２）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の残基のカチオン性ストレッチ内の９個の残基のうちの少なくとも４個はＬ型に改変されており、及びここで配列番号１の少なくとも１つのアルギニン残基はアラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の２８、３０、３２、及び３４位のＤ－アルギニン残基はＬ－アルギニン残基に改変されており、及びここで２９位のＤアルギニンはＤ－アラニンに置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒＲａＲｒＲｒＲｒＫ（配列番号１３）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここでＬ型残基である配列番号１の残基の少なくとも１つ又はそれ以上はＤ型残基に改変されており、及びここで配列番号１の少なくとも１つのアルギニンはアラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１のＬ型残基のすべてがＤ型残基に改変されており、及びここで２９位のＤアルギニンはＤ－アラニンに置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧｌｆｅａｉｅＧｆｉｅｎＧｗｅＧｍｉｄＧｗｙＧＧＧＧｒｒａｒｒｒｒｒｒｋ（配列番号１４）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここでＬ型残基である配列番号１の残基の少なくとも１つ又はそれ以上はＤ型残基に改変されており、ここで配列番号１のカチオン性残基のストレッチ内の残基の少なくとも１つ又はそれ以上はＬ型に改変されており、及びここで配列番号１の少なくとも１つのアルギニン残基はアラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１のＬ型残基のすべてがＤ型残基に改変されており、ここで配列番号１のカチオン性残基のストレッチ内の９個の残基のうち８個はＬ型に改変されており、及びここで２９位のＤ－アルギニンはＤ－アラニンに置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧｌｆｅａｉｅＧｆｉｅｎＧｗｅＧｍｉｄＧｗｙＧＧＧＧＲＲａＲＲＲＲＲＲＫ（配列番号１５）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基はＤ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の２７位のＤ－アルギニン残基はＤ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧａｒｒｒｒｒｒｒｒＫ（配列番号１６）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基はＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の２７位のＤ－アルギニン残基はＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧＡｒｒｒｒｒｒｒｒＫ（配列番号１７）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基はＤ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の２８位のＤ－アルギニン残基はＤ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒａｒｒｒｒｒｒｒＫ（配列番号１８）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基はＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の２８位のＤ－アルギニン残基はＬ－アラニンで置換されている、１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒＡｒｒｒｒｒｒｒＫ（配列番号１９）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基はＤ－アラニンで置換されている、１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の２９位のＤ－アルギニン残基はＤ－アラニンで置換されている、１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒｒａｒｒｒｒｒｒＫ（配列番号２０）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基はＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の２９位のＤ－アルギニン残基はＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒｒＡｒｒｒｒｒｒＫ（配列番号２１）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基はＤ－アラニンで置換されている、１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の３０位のＤ－アルギニン残基はＤ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒｒｒａｒｒｒｒｒＫ（配列番号２２）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基はＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の３０位のＤ－アルギニン残基はＬ－アラニンで置換されている、１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒｒｒＡｒｒｒｒｒＫ（配列番号２３）を含む、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基はＤ－アラニンで置換されている、１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の３１位のＤ－アルギニン残基はＤ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒｒｒｒａｒｒｒｒＫ（配列番号２４）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基はＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の３１位のＤ－アルギニン残基はＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒｒｒｒＡｒｒｒｒＫ（配列番号２５）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基はＤ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の３２位のＤ－アルギニン残基はＤ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒｒｒｒｒａｒｒｒＫ（配列番号２６）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基はＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の３２位のＤ－アルギニン残基はＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒｒｒｒｒＡｒｒｒＫ（配列番号２７）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基はＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の３３位のＤ－アルギニン残基はＤ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒｒｒｒｒｒａｒｒＫ（配列番号２８）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基はＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の３３位のＤ－アルギニン残基はＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒｒｒｒｒｒＡｒｒＫ（配列番号２９）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基はＤ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の３４位のＤ－アルギニン残基はＤ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒｒｒｒｒｒｒａｒＫ（配列番号３０）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基はＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の３４位のＤ－アルギニン残基はＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒｒｒｒｒｒｒＡｒＫ（配列番号３１）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基はＤ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の３５位のＤ－アルギニン残基はＤ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒｒｒｒｒｒｒｒａＫ（配列番号３２）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基はＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の３５位のＤ－アルギニン残基はＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒｒｒｒｒｒｒｒＡＫ（配列番号３３）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、配列番号１の残基のカチオン性ストレッチ内の９個の残基のうちの少なくとも６個はＬ型に改変されており、及びここで配列番号１の少なくとも１つのアルギニン残基はアラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の２７、２８、３３、３４、及び３５位のＤ－アルギニン残基はＬ－アルギニン残基に改変されており、及びここで２９位のＤ－アルギニンはＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧＲＲＡｒｒｒＲＲＲＫ（配列番号３４）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の残基のカチオン性ストレッチ内の少なくとも９個の残基はＬ型に改変されており、及びここで配列番号１の少なくとも１つのアルギニン残基はアラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の２７、２８、及び３０～３５位のＤ－アルギニン残基はＬ－アルギニン残基に改変されており、及びここで２９位のＤ－アルギニンはＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲＫ（配列番号３５）を含み、ここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の残基のカチオン性ストレッチ内の９個の残基のうちの少なくとも７個はＬ型に改変されており、及びここで配列番号１の少なくとも１つのアルギニン残基はアラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の２８位及び３０～３４位のＤ－アルギニン残基はＬ－アルギニン残基に改変されており、及びここで２９位のＤ－アルギニンはＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒＲＡＲＲＲＲＲｒＫ（配列番号３６）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の残基のカチオン性ストレッチ内の９個の残基のうちの少なくとも４個はＬ型に改変されており、及びここで配列番号１の少なくとも１つのアルギニン残基はアラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の３０、３１、及び３２位のＤ－アルギニン残基はＬ－アルギニン残基に改変されており、２９位のＤ－アルギニンはＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒｒＡＲＲＲｒｒｒＫ（配列番号３７）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の残基のカチオン性ストレッチ内の９個の残基のうちの少なくとも５個はＬ型に改変されており、及びここで配列番号１の少なくとも１つのアルギニン残基はアラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１の２８、３０、３２、及び３４位のＤ－アルギニン残基はＬ－アルギニン残基に改変されており、２９位のＤ－アルギニンはＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＧＧＧｒＲＡＲｒＲｒＲｒＫ（配列番号３８）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここでＬ型である配列番号１の残基の少なくとも１つ又はそれ以上はＤ型残基に改変されており、及びここで配列番号１の少なくとも１つのアルギニン残基はアラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１のＬ型残基のすべてがＤ型残基に改変されており、及びここで２９位のＤアルギニンはＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧｌｆｅａｉｅＧｆｉｅｎＧｗｅＧｍｉｄＧｗｙＧＧＧＧｒｒＡｒｒｒｒｒｒｋ（配列番号３９）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、Ｌ型残基である配列番号１の残基の少なくとも１つ又はそれ以上はＤ型残基に改変されており、ここで配列番号１のカチオン性残基のストレッチ内の少なくとも１つ又はそれ以上の残基はＬ型に改変されており、及びここで配列番号１の少なくとも１つのアルギニン残基はアラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列番号１の誘導体を含み、ここで配列番号１のＬ型残基のすべてがＤ型残基に改変されており、ここで配列番号１のカチオン性残基のストレッチ内のすべての残基はＬ型に改変されており、及びここで２９位のＤ－アルギニンはＬ－アラニンで置換されている。１つの実施態様において、ペプチドは配列：ＧｌｆｅａｉｅＧｆｉｅｎＧｗｅＧｍｉｄＧｗｙＧＧＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲＫ（配列番号４０）を含み、ここで小文字はＤ－アミノ酸を指し、及びここで大文字はＬ－アミノ酸を指す。
１つの実施態様において、ペプチドは、長さが１０～１００アミノ酸である。１つの実施態様において、ペプチドは、長さが２０～５０アミノ酸である。１つの実施態様において、ペプチドは、長さが３０～４０アミノ酸である。１つの実施態様において、ペプチドは長さが約３６アミノ酸である。
１つの態様において、本発明は、本明細書に記載のポリアルギニン片又はその誘導体を含むペプチドを含む組成物を提供する。例えば１つの実施態様において、ペプチドは、少なくとも４つのアルギニン残基を含むポリアルギニン片を含む。場合によっては、アルギニン残基の少なくとも１つはＤ型立体異性体である。場合によっては、少なくとも１つのアルギニン残基はＤ型立体異性体であり、及び少なくとも１つのアルギニン残基はＬ型立体異性体である。いくつかの実施態様において、ポリアルギニン片はすべてＤ型残基を含む。いくつかの実施態様において、ポリアルギニン片はすべてＬ型残基を含む。いくつかの実施態様において、ポリアルギニン片はＤ型残基とＬ型残基の両方の組み合わせを含む。いくつかの実施態様において、ポリアルギニン片はアルギニン残基のみを含む。場合によっては、ポリアルギニン領域は、少なくとも１つの非極性残基によって中断される。場合によっては、非極性残基はアラニンである。特定の場合には、アラニンはＤ－アラニンである。
１つの実施態様において、ペプチドのポリアルギニン片は、配列番号１～４０のいずれか１つのポリアルギニン片又はその誘導体を含む。１つの実施態様において、ペプチドのポリアルギニン片は、配列番号２～４０のいずれか１つのポリアルギニン片又はその誘導体を含む。１つの実施態様において、ペプチドのポリアルギニン片又はその誘導体は、配列番号２～４０のいずれか１つの残基２７～３５を含む。
いくつかの実施態様において、ペプチドは標識物に結合される。１つの実施態様において、Ｃ末端残基は、ペプチドが標識を受けやすいようなものである。１つの実施態様において、Ｃ末端残基はリジン残基である。１つの実施態様において、標識物はペプチドの精製を可能にする。１つの実施態様において、標識物はペプチドの検出を可能にする。１つの実施態様において、標識物はビオチンである。
１つの態様において、本発明は、標的細胞への薬剤のターゲティング及び送達のための二重ペプチド系を含む組成物に関する。１つの実施態様において、二重ペプチド系は、（１）本明細書に記載の薬剤の送達のためにエンドソーム破壊活性を示す第１のペプチド、（２）ターゲティング機能を示す第２のペプチド、及び（３）目的の薬剤を含む。
１つの実施態様において、ターゲティング機能を示す第２のペプチドは、ターゲティング部分を含む。第２のペプチドのターゲティング部分は、所望の標的と特異的に結合又は相互作用することができる任意の分子であり得る。１つの実施態様において、ターゲティング部分は、膜貫通タンパク質又は細胞内受容体タンパク質によって認識される任意の部分であり得る。１つの実施態様において、ターゲティング部分はリガンドである。リガンドは通常、第２のメンバーが標的細胞上、標的細胞内、又は標的細胞を含む組織内に存在する結合対のメンバーである。１つの実施態様において、ターゲティング部分は、チロシンキナーゼ受容体に結合するリガンドである。１つの実施態様において、ターゲティング部分は、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する。ＥＧＦＲは、特に限定されるものではないが、口腔癌を含む多くの種類の癌でしばしば過剰発現される。
１つの実施態様において、第２のペプチドはＧＥ１１ペプチドの誘導体である（Li, et al. FASEB J, 2005. 19:1978-1985）。１つの実施態様において、ＧＥ１１ペプチドの誘導体は、密集したカチオン性アミノ酸残基のストレッチを含む。カチオン性アミノ酸残基のストレッチは、静電的相互作用を介して核酸をペプチドに結合させることを可能にする。１つの実施態様において、第２のペプチドはＧＥ１１Ｒ９（ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩＧＧＧＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫ；配列番号４１）である。ＧＥ１１Ｒ９は、ＧＥ１１のＥＧＦＲターゲティング能力を維持しながら、核酸に結合する密集したカチオン性アミノ酸のストレッチも含んでいる（Alexander-Bryant, et al. Oral Oncol, 2017. 72: 123-131）。
１つの実施態様において、第２のペプチドのターゲティング部分は、腫瘍抗原に結合するように工学操作することができ、それにより、前記腫瘍抗原を発現する癌性腫瘍の特異的ターゲティングを可能にする。腫瘍抗原は、免疫応答（特にＴ細胞媒介性免疫応答）を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。本発明の抗原結合部分の選択は、ターゲティング又は治療される癌の特定のタイプに依存する。
いくつかの実施態様において、本発明のペプチドは、検出可能なマーカーで標識される。特に限定されるものではないが、ビオチン、蛍光原、酵素、エピトープ、色原体、又は放射性核種を含む広範囲の検出可能なマーカーを使用することができる。１つの実施態様において、検出可能なマーカーは、ペプチドのＣ末端リジンに結合することができる。
特定の実施態様において、本発明のペプチドは、本明細書に記載のペプチドの保存的変種をさらに含む。本明細書で使用される「保存的変種」とは、ペプチドの結合又は会合能力に実質的なかつ悪い影響を及ぼさないアミノ酸配列の変化を指す。置換、挿入、又は欠失は、変更された配列がペプチドに関連する機能又は活性を妨害、低減、又は破壊する場合、ペプチドに悪影響を与えると言われている。例えば、活性に悪影響を与えることなく、ペプチドの全体的な電荷、構造、又は疎水－親水特性を変更することができる。従ってアミノ酸配列は、例えばペプチドの活性に悪影響を与えることなく、ペプチドをより疎水性又は親水性になるように改変することができる。
これらの変種は、本明細書の他の箇所で挙げたアミノ酸配列とはわずかに異なるアミノ酸配列を有するが、本明細書で論じたペプチドのいずれかと関連する同一又は類似の特性を依然として有する。通常、保存的置換変種は、本明細書の他の場所で議論されたペプチドのいずれかと、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
本発明のペプチドにおける密集したカチオン性アミノ酸残基のストレッチに関して、ペプチドは、アルギニンなどの少なくとも４つのカチオン性アミノ酸残基を含むことができる。他の実施態様において、ペプチドは、アルギニンなどの少なくとも５個のカチオン性アミノ酸残基を含むことができる。他の実施態様において、ペプチドは、アルギニンなどの少なくとも６個のカチオン性アミノ酸残基を含むことができる。他の実施態様において、ペプチドは、アルギニンなどの少なくとも７個のカチオン性アミノ酸残基を含むことができる。他の実施態様において、ペプチドは、アルギニンなどの少なくとも８個のカチオン性アミノ酸残基を含むことができる。他の実施態様において、ペプチドは、アルギニンなどの少なくとも９個のカチオン性アミノ酸残基を含むことができる。他の実施態様において、ペプチドは、カチオン性アミノ酸残基の後にＣ末端リジン残基を有し得る。さらなる実施態様において、ペプチドは、９個のカチオン性残基の後にＣ末端リジン残基を有し得る。密集したカチオン性アミノ酸残基のストレッチは、静電的相互作用を介してペプチドへの核酸の結合を可能にすることである。
いくつかの実施態様において、本発明のペプチド送達システムの１つ又はそれ以上の構成要素は、本発明の分子は、核酸、他のタンパク質、又は低分子と会合（又は結合）することができる。これらのペプチドは、例えば、核酸分子、他のタンパク質、又は低分子に、高い親和性と選択性で結合することができる可能性がある。そのような結合は、相互作用する２つ（又はそれ以上）の分子種のそれぞれの特定の部位を介して媒介され得ると考えられる。結合は、構造的及び／又はエネルギー的要素によって媒介され得る。場合によっては、後者は反対の電荷を有する分子の相互作用を含む。
本発明のペプチドは、化学的方法を使用して作成することができる。例えばペプチドは、固相技術（Roberge J Y et al (1995) Science 269: 202-204）によって合成し、樹脂から切断し、分取高速液体クロマトグラフィーによって精製することができる。自動合成は、例えばＡＢＩ４３１Ａペプチド合成機（Perkin Elmer）を製造元の説明書に従って使用して達成することができる。
あるいは、ペプチドは、組換え手段によって、又はより長いポリペプチドからの切断によって作製され得る。ペプチドの組成は、アミノ酸分析又は配列決定によって確認することができる。
本発明に係るポリペプチドの変種は、（ｉ）１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、保存又は非保存アミノ酸残基（例えば、保存アミノ酸残基）で置換されたものなどであってもよく、そのような置換アミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされるものであってもなくてもよい、（ｉｉ）１つ又はそれ以上の改変アミノ酸残基、例えば置換基の結合により改変されている残基があるもの、（ｉｉｉ）ポリペプチドが、本発明のポリペプチドの代替スプライス変種であるもの、（ｉｖ）ポリペプチドの断片、及び／又は（ｖ）ポリペプチドが、リーダー配列又は分泌配列、又は精製（例えば、Ｈｉｓタグ）若しくは検出（例えば、Ｓｖ５エピトープタグ）に使用される配列などの別のポリペプチドと融合されているもの、でもよい。断片は、元の配列のタンパク質分解切断（マルチサイトタンパク質分解を含む）を介して生成されたポリペプチドを含む。変種は、翻訳後修飾又は化学的に修飾されていてもよい。そのような変種は、本明細書の教示から当業者の範囲内にあると見なされる。
ペプチド類似体
１つの実施態様において本発明は、本発明での使用に適した本発明のペプチドのペプチド類似体（例えば、５９９ペプチド又はその誘導体）及びその使用に関する。例えば、特定の例において本発明は、配列番号１～４０の断片に基づくペプチド及びペプチド類似体を提供し、ここで、本発明のペプチド及びその類似体、断片、及び誘導体を含むペプチドは、望ましい特性を示す。いくつかの実施態様において本発明は、完全長５９９とその誘導体と比較して、改善された溶解性、半減期、バイオアベイラビリティ、減少した腎クリアランスなどのうちの１つ又はそれ以上を示すペプチド及びその類似体、断片、及び誘導体を含む組成物を提供する。
１つの実施態様において本発明は、本発明での使用に適した本発明のペプチドのペプチド類似体（例えば、５９９ペプチド又はその誘導体）及びその使用に関する。例えば、特定の例において本発明は、配列番号１～４０の断片に基づくペプチド及びペプチド類似体を提供し、ここで、本発明のペプチド及びその類似体、断片、及び誘導体を含むペプチドは、望ましい特性を示す。いくつかの実施態様において本発明は、完全長５９９とその誘導体と比較して、改善された溶解性、半減期、バイオアベイラビリティ、減少した腎クリアランスなどのうちの１つ又はそれ以上を示すペプチド及びその類似体、断片、及び誘導体を含む組成物を提供する。
融合、キメラ、及び修飾ポリペプチド
本発明のペプチドは、タンパク質などの他の分子とコンジュゲートして、融合タンパク質又はキメラペプチドを調製することができる。これは、例えば、得られる融合タンパク質又はキメラペプチドが本発明のペプチドの機能を保持するという条件で、Ｎ末端又はＣ末端融合タンパク質の合成によって達成され得る。
本発明のペプチドは、タンパク質などの他の分子とコンジュゲートして、融合タンパク質又はキメラペプチドを調製することができる。これは、例えば、得られる融合タンパク質又はキメラペプチドが本発明のペプチドの機能を保持するという条件で、Ｎ末端又はＣ末端融合タンパク質の合成によって達成され得る。
いくつかの実施態様において、本発明のペプチド又はキメラタンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）に結合され得る。当業者は、ペプチド又はキメラタンパク質を核に局在化できる当技術分野で知られている任意のＮＬＳが、本発明の方法において有用であることを認識するであろう。
本発明のペプチド又はキメラタンパク質は、Reedijk et al. (The EMBO Journal 11(4):1365, 1992) に記載の方法などの従来法を使用してリン酸化することができる。
本発明のペプチド又はキメラタンパク質の環状誘導体もまた、本発明の一部である。環化により、ペプチド又はキメラタンパク質は、他の分子との会合に適したコンフォメーションをとることができる。環化は、当技術分野で知られている技術を使用して達成することができる。例えば、遊離スルフヒドリル基を有する２つの適切に離間した成分間ではジスルフィド結合が形成され得るか、又は１つの成分のアミノ基と別の成分のカルボキシル基との間でアミド結合が形成され得る。環化はまた、Ulysse, L., et al., J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 8466-8467 によって記載されたように、アゾベンゼン含有アミノ酸を使用して達成することもできる。結合を形成する成分は、ペプチドのＮ末端、ペプチドのＣ末端、ペプチド内のアミノ酸の側鎖、非アミノ酸成分、又はこれらの任意の組み合わせであり得る。本発明の１つの実施態様において、環状ペプチドは正しい位置にベータターンを含み得る。正しい位置にアミノ酸Ｐｒｏ－Ｇｌｙを付加することにより、ベータターンを本発明のペプチドに導入することができる。
上述のペプチド結合連結を含む環状ペプチドよりも柔軟な環状ペプチドを生成することが望ましい場合がある。より柔軟なペプチドは、ペプチドの左右の位置にシステインを導入し、２つのシステイン間にジスルフィド架橋を形成することにより調製することができる。２つのシステインは、ベータシート及びターンを変形させないように配置されている。ペプチドは、ジスルフィド結合の長さとベータシート部分の水素結合の数が少ないため、より柔軟である。環状ペプチドの相対的な柔軟性は、分子動力学シミュレーションによって決定することができる。
いくつかの実施態様において、対象の組成物は、本発明のペプチドのペプチド模倣物である。ペプチド模倣物は、ペプチド及びタンパク質に基づくか又はそれらに由来する化合物である。本発明のペプチド模倣物は、典型的には、非天然のアミノ酸、コンホメーション拘束、等配位置換などを使用する既知のペプチド配列の構造修飾によって得ることができる。対象のペプチド模倣物は、ペプチドと非ペプチド合成構造との間の構造空間の連続体を構成する。従って、ペプチド模倣物は、薬理作用団の描写や、ペプチドを親ペプチドの活性を有する非ペプチド化合物に翻訳するのに役立つ可能性がある。
本発明のペプチド模倣物は、翻訳後修飾によって、又は翻訳中に非天然のアミノ酸を導入することによって形成された非天然のアミノ酸を含み得る。タンパク質翻訳中に非天然のアミノ酸を導入するために、様々なアプローチが利用可能である。例として、サプレッサー特性を有するｔＲＮＡであるサプレッサーｔＲＮＡなどの特殊なｔＲＮＡが、部位特異的非天然のアミノ酸置換（ＳＮＡＡＲ）のプロセスで使用されている。ＳＮＡＡＲでは、タンパク質合成中に非天然のアミノ酸を固有の部位にターゲティングするように作用する固有のコドンが、ｍＲＮＡ及びサプレッサーｔＲＮＡ上に必要である（ＷＯ９０／０５７８５に記載）。しかし、サプレッサーｔＲＮＡは、タンパク質翻訳システムに存在するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によって認識されてはならない。特定の場合には、天然のアミノ酸を特異的に修飾し、アミノアシル化ｔＲＮＡの機能活性を大きく変化させない化学反応を用いてｔＲＮＡ分子をアミノアシル化した後に、非天然のアミノ酸を形成することができる。これらの反応は、アミノアシル化後修飾と呼ばれる。例えば、同種のｔＲＮＡに結合したリジン（ｔＲＮＡＬＹＳ）のイプシロン－アミノ基は、アミン特異的な光親和性標識物で修飾することができる。
いくつかの実施態様において、所望の生物学的特性（すなわち、標的部位に結合する能力、又は親の非修飾ペプチドと同じエフェクター活性を有する能力）が保持される限り、本発明のペプチドを修飾して、クリアランス速度の低下又は半減期の増加を有するタンパク質の変種、類似体、及び断片を生成することができる。ペプチドは、様々な遺伝子工学又はタンパク質工学技術を使用して改変することができる。
１つの実施態様において、本発明のペプチドはさらに修飾される。１つの実施態様において、本発明のペプチドの機能性断片はさらなる修飾を含む。一例では、ペプチドのさらなる修飾にはＮ末端での修飾が含まれる。１つの実施態様において、さらなる修飾は、Ｃ末端での修飾が含まれる。１つの実施態様において、本発明のペプチドはＮ末端及びＣ末端の両方で修飾される。
１つの実施態様において、本発明のペプチドの修飾は、化学修飾、合成ポリマー又は天然ポリマーへの結合、グリコシル化、アセチル化、メチル化、リン酸化、化学リンカーの結合、脂肪アシル誘導体化、又は多糖の結合である。１つの実施態様において、本発明のペプチドの修飾は、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）又はアルブミン結合ペプチド若しくはタンパク質への縮合を含む。１つの実施態様において、本発明のペプチドの修飾は、Ｆｃ縮合タンパク質を形成するための免疫グロブリンＦｃドメインへの結合を含む。１つの実施態様において、本発明のペプチドに結合されるポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、XTEN（商標）及びヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）のうちの１つである。１つの例示的な実施態様において、本発明の１つ又はそれ以上のペプチドのＰＥＧ化は、ＰＥＧ部分がペプチドに流体力学的半径を付加するため、腎クリアランスを遅らせることによってその半減期を増加させることができる。単量体タンパク質に対する従来のＰＥＧ化方法は、当技術分野で公知である。
１つの実施態様において、単一のポリマーが本発明の単一のペプチドに結合される。１つの実施態様において、複数のポリマーが本発明の単一のペプチドに結合される。１つの実施態様において、本発明のペプチドの集団は、各ペプチドに結合された０から１を超えるポリマーを有する修飾及び非修飾ペプチドの混合物を含む。
本発明のペプチドは、翻訳後修飾されることができる。例えば、本発明の範囲内に入る翻訳後修飾は、シグナルペプチド切断、グリコシル化、アセチル化、イソプレニル化、タンパク質分解、ミリストイル化、タンパク質折り畳み、及びタンパク質分解プロセシングなどを含む。いくつかの修飾又はプロセシング事象は、追加の生物学的機構の導入を必要とする．例えば、シグナルペプチド切断及びコアグリコシル化などのプロセシング事象は、イヌミクロソーム膜又はアフリカツメガエル卵抽出物（米国特許第６，１０３，４８９号）を標準翻訳反応に付加することによって調べることができる。
核酸
本発明はさらに、別の実施態様において、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する。当業者は、アミノ酸配列が与えられれば、通常の技術のみを使用して、アミノ酸配列を生成するために使用され得る対応する核酸配列を生成することができる。
本発明はさらに、別の実施態様において、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する。当業者は、アミノ酸配列が与えられれば、通常の技術のみを使用して、アミノ酸配列を生成するために使用され得る対応する核酸配列を生成することができる。
翻訳中にペプチド配列に組み込まれたアミノ酸の欠失、付加、又は改変による一次構造自体の修飾は、ペプチドの活性を破壊することなく行うことができる。そのような置換又は他の改変は、本発明の意図する範囲内の核酸によってコードされるアミノ酸配列を有するペプチドをもたらす。
本発明はさらに、いくつかの実施態様において、コード配列を含む組換え核酸分子を提供する。本明細書で使用される「組換えＤＮＡ分子」は、分子操作を受けたＤＮＡ分子である。組換えＤＮＡ分子を生成する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York を参照されたい。いくつかの組換えＤＮＡ分子では、コードＤＮＡ配列は、発現制御配列及びベクター配列に作動可能に連結されている。
本発明のペプチドファミリーコード配列の１つが作動可能に連結されているベクター及び発現制御配列の選択は、当技術分野で公知のように、所望の機能特性（例えば、タンパク質発現、及び形質転換される宿主細胞）に直接依存する。本発明のベクターは、組換えＤＮＡ分子に含まれる構造遺伝子の、宿主染色体への複製又は挿入、及び発現を少なくとも指令することができる。
作動可能に連結されたタンパク質コード配列の発現を調節するために使用される発現制御要素は、当技術分野で知られており、特に限定されるものではないが、誘導性プロモーター、構成性プロモーター、分泌シグナル、及び他の調節要素を含む。いくつかの実施態様において、誘導性プロモーターは、宿主細胞の培地中の栄養素に応答するなどで、容易に制御される。
１つの実施態様において、コード核酸分子を含むベクターは、原核生物レプリコン、すなわち、組換えＤＮＡ分子で形質転換された細菌宿主細胞などの原核宿主細胞において染色体外の組換えＤＮＡ分子の自律複製及び維持を指令する能力を有するＤＮＡ配列を含む。そのようなレプリコンは、当技術分野で公知である。さらに、原核生物レプリコンを含むベクターはまた、その発現が薬剤耐性などの検出可能なマーカーを付与する遺伝子も含み得る。細菌の薬剤耐性遺伝子の典型は、アンピシリン又はテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。
原核生物レプリコンを含むベクターは、大腸菌などの細菌宿主細胞においてコード遺伝子配列の発現（転写及び翻訳）を指令できる原核生物又はバクテリオファージプロモーターをさらに含むことができる。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合と転写の発生を可能にするＤＮＡ配列によって形成される発現制御要素である。細菌宿主に適合するプロモーター配列は、典型的には本発明のＤＮＡセグメントの挿入に便利な制限部位を含むプラスミドベクターで提供される。本発明のペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を発現させるために、任意の適切な原核生物宿主を使用することができる。
脊椎動物細胞に適合するものを含む、真核細胞に適合する発現ベクターを使用して、コード配列を含む組換えＤＮＡ分子を形成することもできる。真核細胞発現ベクターは、当技術分野で公知であり、いくつかの商業的供給源から入手可能である。典型的には、所望のＤＮＡセグメントの挿入のための便利な制限部位を含むそのようなベクターが提供される。
本発明の組換えＤＮＡ分子を構築するために使用される真核細胞発現ベクターは、真核細胞において有効な選択マーカー、例えば薬剤耐性選択マーカーをさらに含み得る。薬剤耐性マーカーの例は、その発現がネオマイシン耐性をもたらす遺伝子、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である。あるいは、選択マーカーは別のプラスミド上に存在し、宿主細胞の同時トランスフェクションによって導入された２つのベクター、及び選択マーカーに適した薬物中で培養することによってトランスフェクタントを選択することができる。
本発明はさらに、さらに別の実施態様において、本発明のペプチドをコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞のいずれかであり得る。細胞株が細胞培養法に適合し、発現ベクターの増殖及び遺伝子産物の発現に適合する限り、本発明のペプチドの発現に有用な真核細胞は限定されない。
本発明のペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を有する適切な細胞宿主の形質転換は、使用されるベクターのタイプ及び使用される宿主系に典型的に依存する公知の方法によって達成される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、電気穿孔法及び塩処理法を使用することができる（例えば、Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照）。組換えＤＮＡを含有するベクターによる脊椎動物細胞の形質転換に関しては、電気穿孔法、カチオン性脂質、又は塩処理法を使用することができる（例えば、Graham et al., (1973) Virology 52, 456-467; Wigler et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1373-1376 を参照）。
形質転換に成功した細胞は、選択マーカーの選択を含む公知の技術によって同定することができる。例えば、本発明の組換えＤＮＡの導入により得られた細胞をクローニングして、単一コロニーを作製することができる。それらのコロニーからの細胞を採取し、溶解し、それらのＤＮＡ含有量を、Southern (1975) J. MoI. Biol. 98, 503-517により記載された方法を使用して組換えＤＮＡの存在について、又は免疫学的方法を介してアッセイされた細胞から生成されたペプチドについて調べることができる。
本発明はさらに、さらに別の実施態様において、本明細書に記載の核酸分子を使用して本発明のペプチドを産生する方法を提供する。一般的に言えば、組換え体形態のペプチドの産生は、典型的には以下の工程を含む：本発明のペプチドをコードする核酸分子が得られる。
次に、核酸分子は、上記したように、適切な制御配列と作動可能に連結されて、ペプチドのオープンリーディングフレームを含む発現単位を形成し得る。発現単位は、適切な宿主を形質転換するために使用され、形質転換された宿主は、組換えペプチドの産生を可能にする条件下で培養される。任意選択的に、組換えペプチドは培地又は細胞から単離される。いくらかの不純物が許容されるいくつかの例では、ペプチドの回収と精製が必要ない場合がある。
前述の各工程は、様々な方法で実行することができる。様々な宿主で機能する発現ベクターの構築は、上記のように、適切なレプリコン及び制御配列を使用して達成される。制御配列、発現ベクター、及び形質転換方法は、遺伝子の発現に使用される宿主細胞の種類によって異なる。適切な制限部位は、通常利用できない場合、これらのベクターに挿入するための切除可能な遺伝子を提供するために、コード配列の末端に追加することができる。当業者は、本発明の核酸分子と共に使用するために、当技術分野で知られている任意の宿主／発現系を容易に適合させて、組換えペプチドを産生することができる。
生物活性剤
特定の実施態様において、本発明の組成物は、本明細書の他の場所で１つ又は複数のペプチドを介して目的の細胞又は組織に送達される１つ又はそれ以上の薬剤を含む。特定の実施態様において、薬剤は、本発明のペプチドの密集したカチオン性アミノ酸残基のストレッチと相互作用する。他の実施態様において、細胞取り込みは、カチオン性アミノ酸残基の密集ストレッチを非極性残基、例えばアラニンで中断することによって増強される。
特定の実施態様において、本発明の組成物は、本明細書の他の場所で１つ又は複数のペプチドを介して目的の細胞又は組織に送達される１つ又はそれ以上の薬剤を含む。特定の実施態様において、薬剤は、本発明のペプチドの密集したカチオン性アミノ酸残基のストレッチと相互作用する。他の実施態様において、細胞取り込みは、カチオン性アミノ酸残基の密集ストレッチを非極性残基、例えばアラニンで中断することによって増強される。
いくつかの実施態様において、薬剤は生物活性剤であり、ここで薬剤は生物学的機能又は活性を示す。例示的な生物活性剤には、特に限定されるものではないが、核酸分子、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体断片、及び低分子が含まれる。
１つの実施態様において、生物活性剤は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、キラー－ｔＲＮＡ、ガイドＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムの一部）、長い非コードＲＮＡ、抗ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、アプタマー、及びプラスミドＤＮＡからなる群から選択される核酸分子を含む。
いくつかの実施態様において、核酸分子は、目的の遺伝子の遺伝子発現を阻害又は抑制する。いくつかの実施態様において、抑制される遺伝子は、癌の病因に関与する癌遺伝子である。例えば、特定の実施態様において、抑制される遺伝子はＣＩＰ２Ａ又はＨＰＶ Ｅ６である。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、通常二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又は内因性マイクロＲＮＡ前駆体（プリｍｉＲＮＡ／プレｍｉＲＮＡ）によって引き起こされる。その発見以来、ＲＮＡｉは哺乳動物細胞における遺伝子発現を抑制するための強力な遺伝的ツールとして浮上してきた。安定した遺伝子ノックダウンは、合成ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の発現によって達成することができる。
ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、一般的に転写後の遺伝子サイレンシングメカニズムを介して起こると考えられているＲＮＡ活性を妨害するＲＮＡ核酸分子である。１つの実施態様において、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むが、そのように限定されることを意図するものではなく、一本鎖ＲＮＡを含んでもよい（例えば、Martinez et al., 2002 Cell 110:563-74 を参照）。本発明に含まれるｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、本明細書で提供されるヌクレオチドの他の天然に存在する組換え又は合成の一本鎖若しくは二本鎖ポリマー（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド又は両方の組み合わせ）及び／又はヌクレオチド類似体（例えば、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドなど、典型的には５'から３'へのホスホジエステル結合）を含み得る。従って、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの転写を指令することができるＤＮＡ配列として本明細書に開示される特定の例示的な配列はまた、相補的なヌクレオチド塩基対合の十分に確立された原理により、対応するＲＮＡ配列及びそれらの相補体を説明することも意図されていることが理解される。
１つの実施態様において、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、約１８～３０ヌクレオチド塩基対の二本鎖ポリヌクレオチドを含む。別の実施態様において、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、又は約２７塩基対の二本鎖ポリヌクレオチドを含み、及び別の実施態様において約１９、約２０、約２１、約２２、又は約２３塩基対、又は約２７塩基対の二本鎖ポリヌクレオチドを含み、ここで「約」の使用は、特定の実施態様及び特定の条件下で、選択されたポリペプチドの発現を妨害することができる機能的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを生じさせ得る連続的切断工程が、完全に効率的ではないかもしれないことを示す。従って、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡのプロセシング、生合成、又は人工合成における変動の結果として、１、２、３、４個、又はそれ以上の塩基対だけ長さが（例えば、ヌクレオチドの挿入又は欠失によって）異なり得る１つ又はそれ以上のｓｉＲＮＡポリヌクレオチド分子を含み得る。本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドはまた、特定の配列から１、２、３、又は４個のヌクレオチドが（例えば、転移又は塩基転換を含むヌクレオチド置換によって）異なることによって変動を示すポリヌクレオチド配列も含み得る。これらの違いは、二本鎖ポリヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖に位置するかどうかにかかわらず、分子の長さに応じて、特定のｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列のヌクレオチド位置のいずれかで発生する可能性がある。ヌクレオチドの差異は二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖に見られ、ここで代替ヌクレオチドが典型的に水素結合塩基対合を形成する相補的ヌクレオチドは、必ずしも対応して置換されなくてもよい。いくつかの実施態様において、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、特定のヌクレオチド配列に関して均一である。
本開示に基づいて、本発明のｓｉＲＮＡは、標的ポリペプチド発現のサイレンシングを異なる程度にもたらし得ることを理解するべきである。従って、ｓｉＲＮＡはまずその有効性を試験する必要がある。ｓｉＲＮＡは、そこから、所定のｓｉＲＮＡが標的ポリペプチドの発現を妨害又は調節する能力に基づいて選択される。従って、所望の標的ポリペプチドの発現を妨害することができる特定のｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列の同定は、各ｓｉＲＮＡの産生及び試験を必要とする。各ｓｉＲＮＡを試験する方法、及び本発明で使用するのに適したｓｉＲＮＡを選択する方法は、本明細書の実施例に充分に記載されている。タンパク質発現を妨害するすべてのｓｉＲＮＡが生理学的に重要な作用をするわけではないため、本開示はまた、本発明のｓｉＲＮＡを使用して標的タンパク質発現の妨害のレベルが臨床的に関連する重要性を有するかどうかを決定するための様々な生理学的に関連するアッセイを記載する。
１つの実施態様において、薬剤はＣＩＰ２Ａに対するｓｉＲＮＡである。１つの実施態様において本発明は、（ａ）本明細書に記載の５９９変種を含むペプチドと、（ｂ）ＣＩＰ２Ａに対するｓｉＲＮＡとを含む組成物を提供し、それにより、被験体におけるＣＩＰ２Ａの発現又は活性を阻害する。
１つの実施態様において、薬剤はＨＰＶ Ｅ６に対するｓｉＲＮＡである。１つの実施態様において、本発明は、（ａ）本明細書に記載の５９９ペプチド又は５９９変種を含むペプチドと、（ｂ）ＨＰＶ Ｅ６に対するｓｉＲＮＡとを含む組成物を提供し、それにより、被験体におけるＨＰＶ Ｅ６の発現又は活性を阻害する。
１つの実施態様において、薬剤は、ＣＩＰ２Ａ及びＨＰＶ Ｅ６に対する別個のｓｉＲＮＡである。１つの実施態様において本発明は、（ａ）本明細書に記載の５９９ペプチド又は５９９変種を含む１つ又はそれ以上のペプチドと、（ｂ）ＣＩＰ２Ａに対するｓｉＲＮＡ及びＨＰＶ Ｅ６に対するｓｉＲＮＡとを含む組成物を提供し、それにより、被験体におけるＣＩＰ２Ａ及びＨＰＶ Ｅ６の発現又は活性を阻害する。
当業者は、遺伝暗号の縮重の結果として、多くの異なるヌクレオチド配列が同じポリペプチドをコードし得ることを容易に理解するであろう。すなわち、アミノ酸はいくつかの異なるコドンのうちの１つによってコードされ得、当業者は、ある特定のヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列と異なり得るが、ポリヌクレオチドが実際には同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得ることを容易に決定し得る。このように、コドン使用の違いにより変化するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に企図される。
１つの実施態様において、調節配列は、プラスミドベクターによって発現されるアンチセンス核酸配列である。アンチセンス発現ベクターは、哺乳動物細胞又は哺乳動物自体をトランスフェクトするために使用され、それによって細胞内の所望の調節物質の内因性発現を低下させる。しかし本発明は、アンチセンス分子による細胞のトランスフェクションによって、調節物質の発現を阻害することに限定されると解釈されるべきではない。むしろ本発明は、特に限定されるものではないが、リボザイムの使用、非機能的調節物質の発現（すなわち、トランスドミナントネガティブ変異体）、及び細胞内抗体の使用を含む細胞内のタンパク質の発現又は活性を阻害する当該分野で公知の他の方法を包含する。
アンチセンス分子及び遺伝子発現を阻害するためのそれらの使用は、当技術分野で公知である（例えば、Cohen, 1989, In: Oligodeoxyribonucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press を参照）。アンチセンス核酸は、その用語が本明細書の他の場所で定義されるように、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に対して相補的であるＤＮＡ又はＲＮＡ分子である（Weintraub, 1990, Scientific American 262:40）。細胞内では、アンチセンス核酸は、対応するｍＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、それによって遺伝子の翻訳を阻害する。
遺伝子の翻訳を阻害するためのアンチセンス法の使用は当技術分野で知られており、例えば、Marcus-Sakura（1988, Anal. Biochem. 172:289）に記載されている。このようなアンチセンス分子は、Inoue, 1993、米国特許第５，１９０，９３１号によって教示されるように、アンチセンス分子をコードするＤＮＡを使用した遺伝子発現を介して細胞に提供され得る。
あるいは、本発明のアンチセンス分子を合成法で作製し、次に細胞に提供することができる。約１０～約３０、場合によっては約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーは容易に合成され、標的細胞に導入される。本発明が企図する合成アンチセンス分子には、非修飾オリゴヌクレオチドと比較して改善された生物学的活性を有する当技術分野で既知のオリゴヌクレオチド誘導体が含まれる（米国特許第５，０２３，２４３号を参照）。
リボザイム及び遺伝子発現を阻害するためのそれらの使用も、当技術分野で公知である（例えば、Cech et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:17479-17482; Hampel et al., 1989, Biochemistry 28:4929-4933; Eckstein et al., 国際公開第ＷＯ９２／０７０６５号; Altman et al., 米国特許第５，１６８，０５３号を参照）。リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと同様の方法で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾により、ＲＮＡ分子中の特異的ヌクレオチド配列を認識して切断するように分子を工学操作することができる（Cech, 1988, J. Amer. Med. Assn. 260:3030）。このアプローチの主な利点は、リボザイムが配列特異的であるという事実である。
リボザイムには、テトラヒメナ型（Hasselhoff, 1988, Nature 334:585）とハンマーヘッド型の２つの基本的な型がある。テトラヒメナ型リボザイムは長さ４塩基の配列を認識し、ハンマーヘッド型リボザイムは長さ１１～１８塩基の塩基配列を認識する。配列が長いほど、その配列が標的ｍＲＮＡ種のみに存在する可能性が高くなる。その結果、ハンマーヘッド型リボザイムは、特定のｍＲＮＡ種を不活性化するためにテトラヒメナ型リボザイムよりも好ましく、１８塩基の認識配列は、様々な無関係なｍＲＮＡ分子内でランダムに存在する可能性のある短い認識配列よりも好ましい．
調節因子の発現を阻害するのに有用なリボザイムは、本発明の所望の標的のｍＲＮＡ配列に相補的な標的配列を、基本的なリボザイム構造に組み込むことによって設計することができる。所望の調節因子を標的とするリボザイムは、市販の試薬（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）を使用して合成するか、又はそれらをコードするＤＮＡから遺伝子的に発現させることができる。
本発明のいくつかの実施態様において、遺伝子発現を調節するための治療剤として、ｍｉＲＮＡ又は合成ｍｉＲＮＡが使用される。ｍｉＲＮＡは、１つ又はそれ以上の設計要素を含む場合がある。これらの設計要素には、特に限定されるものではないが、以下が含まれる：ｉ）相補領域の５'末端のヌクレオチドのリン酸塩又はヒドロキシルの置換基；ｉｉ）相補領域の最初又は最後の１～６残基における１つ又はそれ以上の糖の修飾；又は、ｉｉｉ）相補領域の３'末端の最後の１～５残基の１つ又はそれ以上のヌクレオチドと、ｍｉＲＮＡ領域の対応するヌクレオチドとの間の非相補性。
特定の実施態様において、合成ｍｉＲＮＡは、リン酸基及び／又はヒドロキシル基が別の化学基で置換された（「置換設計」と呼ばれる）相補領域の５'末端にヌクレオチドを有する。リン酸基が置換されている場合もあれば、ヒドロキシル基が置換されている場合もある。特定の実施態様において、置換基は、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、２'Ｏ－Ｍｅ（２'酸素－メチル）、ＤＭＴＯ（酸素を有する４，４'－ジメトキシトリチル）、フルオレセイン、チオール、又はアクリジンであるが、他の置換基は当業者に公知であり、同様に使用することができる。
追加の実施態様は、相補領域の最初又は最後の１～６残基に１つ又はそれ以上の糖の修飾を有する合成ｍｉＲＮＡに関する（「糖置換設計」と呼ばれる）。場合によっては、相補領域の最初の１、２、３、４、５、６、又はそれ以上の残基、又はそこから得られる任意の範囲に、１つ又はそれ以上の糖の修飾が存在する。追加の場合において、糖の修飾を有する相補領域の最後の１、２、３、４、５、６、又はそれ以上の残基、又はそこから得られる任意の範囲に、１つ以上の糖の修飾が存在する。用語「最初」及び「最後」は、領域の５'末端から３'末端への残基の順序に関するものであることは理解されるであろう。特定の実施態様において、糖の修飾は２'Ｏ－Ｍｅ修飾である。さらなる実施態様において、相補領域の最初又は最後の２～４残基、又は相補領域の最初又は最後の４～６残基に、１つ又はそれ以上の糖の修飾がある。
本発明の他の実施態様において、相補的領域の３'末端の最後の１～５残基中の１つ又はそれ以上のヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡ領域の対応するヌクレオチドと相補的でない（「非相補性」）合成ｍｉＲＮＡが存在する（「非相補性設計」と呼ばれる）。非相補性は、相補的ｍｉＲＮＡの最後の１、２、３、４、及び／又は５残基にあり得る。特定の実施態様において、相補領域に少なくとも２つのヌクレオチドとの非相補性がある。
ｍｉＲＮＡ領域及び相補的領域は、同じか又は別のポリヌクレオチド上にあってもよい。それらが同じポリヌクレオチド上又は中に含まれる場合、ｍｉＲＮＡ分子は単一のポリヌクレオチドと見なされる。異なる領域が別々のポリヌクレオチド上にある実施態様において、合成ｍｉＲＮＡは２つのポリヌクレオチドから構成されると考えられる。
ＲＮＡ分子が単一のポリヌクレオチドである場合、ｍｉＲＮＡ領域と相補領域の間にリンカー領域が存在する。いくつかの実施態様において、単一のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ領域と相補的領域との間の結合の結果としてヘアピンループ構造を形成することができる。リンカーはヘアピンループを構成する。いくつかの実施態様において、リンカー領域は、少なくとも又は多くとも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０残基の長さ、又はそこから得られる任意の範囲であることが企図される。特定の実施態様において、リンカーは、３～３０残基（両端を含む）の長さである。
ｍｉＲＮＡ領域と相補領域とを有することに加えて、領域の５'又は３'末端にフランキング配列が存在する場合もある。いくつかの実施態様において、これらの領域の片側又は両側に隣接する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のヌクレオチド、又はそこから得られる任意の範囲が存在する。
１つの実施態様において、核酸分子は、治療用ペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ分子などである。例えば、特定の実施態様において、核酸分子が所望の細胞に侵入すると、本明細書に記載のペプチドの１つ又はそれ以上を介して、核酸分子は、所望の治療用ペプチドに転写及び／又は翻訳され得る。
方法
１つの実施態様において、本発明は、被験体又は細胞に１つ又はそれ以上の薬剤を送達するための方法である。１つの実施態様において、方法は、被験体又は細胞に、本明細書に記載の１つ又はそれ以上のペプチド（例えば、５９９ペプチド又はその誘導体）と１つ又はそれ以上の薬剤とを含む組成物を接触させることを含む。
１つの実施態様において、本発明は、被験体又は細胞に１つ又はそれ以上の薬剤を送達するための方法である。１つの実施態様において、方法は、被験体又は細胞に、本明細書に記載の１つ又はそれ以上のペプチド（例えば、５９９ペプチド又はその誘導体）と１つ又はそれ以上の薬剤とを含む組成物を接触させることを含む。
１つの実施態様において、方法は、被験体又は細胞に、エンドソーム破壊能力を有する１つ又はそれ以上の第１のペプチド（例えば、５９９ペプチド又はその誘導体）と、ターゲティング能力を有する１つ又はそれ以上の第２のペプチド（例えば、ＧＥ１１Ｒ９）と、１つ又はそれ以上の薬剤とを含む組成物を、接触させることを含む。
いくつかの実施態様において本発明は、所望の薬剤を、様々な哺乳動物、両生類、爬虫類、鳥類、又は昆虫の細胞に輸送する方法を提供する。細胞は初代細胞又は細胞株であり得る。哺乳類細胞には、特に限定されるものではないが、ヒト、サル、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ハムスター、及びウサギが含まれる。哺乳動物由来の初代細胞には、特に限定されるものではないが、脂肪細胞、星状細胞、心筋細胞、軟骨細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経節細胞、腺細胞、グリア細胞、造血細胞、肝細胞、角化細胞、筋芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、卵巣細胞、膵臓ベータ細胞、腎細胞、平滑筋細胞、及び横紋筋細胞が含まれる。
様々な実施態様において、本発明は、それを必要とする被験体における疾患又は障害を治療する方法を提供する。１つの実施態様において、方法は、疾患又は障害を有する被験体に、本明細書に記載の１つ又はそれ以上のペプチド（例えば、５９９ペプチド又はその誘導体）と１つ又はそれ以上の薬剤とを含む組成物を接触させることを含む。１つの実施態様において、方法は、疾患又は障害を有する被験体に、本明細書に記載の１つ又はそれ以上のペプチド（例えば、５９９ペプチド又はその誘導体）と１つ又はそれ以上の生物活性剤とを含む組成物を接触させることを含み、ここで生物活性剤は、疾患又は障害の１つ又はそれ以上の徴候又は症状を軽減又は改善する生物学的機能又は活性を示す。
１つの実施態様において、方法は、疾患又は障害を有する被験体に、エンドソーム破壊能力を有する１つ又はそれ以上の第１のペプチド（例えば、５９９ペプチド又はその誘導体）と、ターゲティング能力を有する１つ又はそれ以上の第２のペプチド（例えば、ＧＥ１１Ｒ９）と、１つ又はそれ以上の薬剤とを含む組成物を接触させることを含み、ここで薬剤は、疾患又は障害の１つ又はそれ以上の徴候又は症状を軽減又は改善する生物学的機能又は活性を示す。
本発明のいくつかの実施態様において、本発明のペプチドは、被験体に、癌、疾患、又は障害の症状を治療、予防、又は緩和するのに有効な量で投与される。本発明のペプチドは、被験体の細胞に、単独で、又はこれらの疾患又は障害の治療又は予防のための他の治療用化合物又は生物活性化合物の投与と組み合わせて、疾患又は障害（例えば、癌）の症状を治療、予防、又は緩和するために投与され得る。
１つの実施態様において、薬剤はＣＩＰ２Ａに対するｓｉＲＮＡである。１つの実施態様において本発明は、被験体に、（ａ）本明細書に記載の５９９変種を含むペプチド、及び（ｂ）ＣＩＰ２Ａに対するｓｉＲＮＡを投与することを含む方法を提供し、それにより、被験体におけるＣＩＰ２Ａの発現又は活性を阻害する。
１つの実施態様において、薬剤はＨＰＶ Ｅ６に対するｓｉＲＮＡである。１つの実施態様において本発明は、被験体に、（ａ）本明細書に記載の５９９ペプチド又は５９９変種を含むペプチド、及び（ｂ）ＨＰＶ Ｅ６に対するｓｉＲＮＡを投与することを含む方法を提供し、それにより、被験体におけるＨＰＶ Ｅ６の発現又は活性を阻害する。
いくつかの実施態様において、本発明は、被験体に、本明細書に記載の５９９ペプチド又は５９９ペプチド変種を、ＣＩＰ２Ａ又はＨＰＶ Ｅ６を標的とするｓｉＲＮＡと組み合わせて投与することによって、被験体におけるＣＩＰ２Ａ又はＨＰＶ Ｅ６の発現又は活性を低下させることによって、被験体における癌を治療又は予防する方法を提供する。いくつかの実施態様において本発明は、被験体に、本明細書に記載の５９９ペプチド又は５９９ペプチド変種を、ＣＩＰ２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ及びＨＰＶ Ｅ６を標的とするｓｉＲＮＡと組み合わせて投与することによって、被験体におけるＣＩＰ２Ａ及びＨＰＶ Ｅ６の発現又は活性を低下させることによって、被験体における癌を治療又は予防する方法を提供する。
１つの実施態様において本発明のペプチドは、所望の薬剤と共に、細胞への薬剤の効果的な結合及び特異的な取り込みを示すモル比で投与される。モル比は、細胞への薬剤の効果的なターゲティングと送達を相乗的に媒介し、最小限の細胞毒性で最適なターゲティングをもたらすように、最適化することができる。
１つの実施態様において、１：１のモル比のペプチドと薬剤が使用される。本発明の特定の態様において、１：１のモル比を使用して観察される効果と比較して、ペプチドへの薬剤の結合、薬剤の細胞取り込み、薬剤の活性、又は薬剤の放出を上昇させる、ペプチド対薬剤のモル比が使用される。１つの実施態様において、ペプチド対薬剤のモル比は、１：１～１００：１の範囲及びその間のすべての整数値である。特定の実施態様においてペプチド対試薬のモル比は、約１：１、約１０：１、約２０：１、約３０：１、約４０：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、及び約１００：１である。１つの実施態様において、ペプチド対試薬の比率は約５０：１である。
１つの実施態様において、ターゲティング部分を示す第２のペプチド（第２ペプチド）と、エンドソーム破壊生物活性を示す第１のペプチド（第１ペプチド）と、及び薬剤との１：１：１のモル比が使用される。本発明の特定の態様において、１：１：１の比率を使用して観察された効果と比較して、細胞のターゲティング、エンドソーム破壊生物活性、及び薬剤の活性の上昇が観察されるような、第２ペプチド：第１ペプチド：薬剤のモル比が使用される。１つの実施態様において、第２ペプチド：第１ペプチド：薬剤のモル比は、１００：１：１～１：１００：１の範囲、及びその間のすべての整数値である。本発明の１つの態様において、第１ペプチドに比較してより多くの第２ペプチドが使用される。本発明の特定の実施態様において、第２ペプチド：第１ペプチド：薬剤のモル比は、約１００：１０：１、約１００：２０：１、約１００：３０：１、約１００：４０：１、約１００：５０：１、約１００：６０：１、約１００：７０：１、約１００：８０：１、約１００：９０：１、約１００：１００：１である。本発明の特定の実施態様において、第２ペプチド：第１ペプチド：薬剤のモル比は、約１０：１００：１、約２０：１００：１、約３０：１００：１、約４０：１００：１、約５０：１００：１、約６０：１００：１、約７０：１００：１、約８０：１００：１、約９０：１００：１、約１００：１００：１である。特定の実施態様において、第２ペプチド：第１ペプチド：薬剤のモル比は、約６０：３０：１である。
当業者が容易に理解できるように、使用されるモル比は細胞型に依存し得る。モル比は薬剤にも依存し得る。当業者は、様々な他のモル比が本発明での使用に適している可能性があることを理解するであろう。
本発明のペプチドが、被験体に、単独で、又は別の生物活性剤又は治療薬と組み合わせて投与され得ることは理解されるであろう。１つの実施態様において、本発明のペプチドは、被験体に、抗癌療法と組み合わせて投与される。
医薬組成物及び投与
従って本発明の治療法及び予防法は、本発明の方法を実施するために、本発明のペプチド送達システムの１つ又はそれ以上の構成要素を含む医薬組成物の使用を包含する。本発明の実施に有用な医薬組成物は、１００ｎｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量を送達するように投与され得る。１つの実施態様において、本発明は、哺乳動物において１μＭ～１０μＭの濃度の本発明の化合物を与える用量の投与を企図する。
従って本発明の治療法及び予防法は、本発明の方法を実施するために、本発明のペプチド送達システムの１つ又はそれ以上の構成要素を含む医薬組成物の使用を包含する。本発明の実施に有用な医薬組成物は、１００ｎｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量を送達するように投与され得る。１つの実施態様において、本発明は、哺乳動物において１μＭ～１０μＭの濃度の本発明の化合物を与える用量の投与を企図する。
典型的には、本発明の方法において哺乳動物、例えばヒトに投与され得る投与量は、哺乳動物の体重１ｋｇ当たり０．５μｇ～約５０ｍｇ量の範囲である。投与される正確な投与量は、特に限定されるものではないが、治療される哺乳動物の種類及び疾患状態の種類、哺乳動物の年齢、及び投与経路を含む多くの要因に応じて変化する。１つの実施態様において、化合物の投与量は、哺乳動物の体重１キログラムあたり約１μｇ～約１０ｍｇまで変化する。別の実施態様において、投与量は、哺乳動物の体重１キログラム当たり約３μｇ～約１ｍｇまで変化する。
化合物は哺乳動物に、毎日数回の頻度で投与されてもよいし、又はそれ以下の頻度、例えば１日１回、１週間に１回、２週間に１回、１か月に１回、又はさらにより少ない頻度で、例えば数か月に１回、又は年に１回又はそれ以下の頻度で投与され得る。投与の頻度は、当業者には容易に明らかであり、特に限定されるものではないが、治療される疾患の種類と重症度、哺乳動物の種類と年齢などの任意の数の要因に依存する。
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で知られているか又は今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法には、有効成分を担体又は１つ以上の他の副成分と組合わせ、次に、必要な又は望ましい場合、生成物を所望の単回投与又は複数回投与単位に成形又は包装する工程が含まれる。
本明細書で提供される医薬組成物の説明は、原則として、ヒトへの倫理的投与に適した医薬組成物であるが、そのような組成物があらゆる種類の動物への投与に一般的に適していることは、当業者によって理解されるであろう。ヒトへの投与に適した医薬組成物を修飾して、様々な動物への投与に適した組成物にすることは十分に理解されており、通常の熟練した獣医薬理学者は、あるとしても通常の実験だけで、そのような修飾を設計及び実施することができる。本発明の医薬組成物の投与が企図される被験体には、特に限定されるものではないが、ヒト及び他の霊長類、哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、及びイヌなどの商業的に関連する哺乳動物が含まれる。
本発明の方法において有用な医薬組成物は、眼、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻腔内、口腔、又は別の投与経路に適した製剤で、調製、包装、又は販売され得る。他の企図される製剤には、突出したナノ粒子、リポソーム調製物、有効成分を含む再密封赤血球、及び免疫学に基づく製剤が含まれる。
本発明のペプチド、又は任意のキメラタンパク質若しくはその誘導体は、塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸などの無機酸と、又はギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸、ベンゼンスルホン酸、及びトルエンスルホン酸などの有機酸と反応させることにより、医薬的塩に変換され得る。
本発明の医薬組成物は、バルクで、単一単位用量として又は複数の単一単位用量として、調製、包装、又は販売され得る。本明細書で使用される「単位用量」は、所定量の有効成分を含む医薬組成物の個別の量である。有効成分の量は、一般に、被験体に投与される有効成分の投与量、又はそのような投与量の都合のよい分量、例えばそのような投与量の半分又は３分の１などに等しい。
本発明の医薬組成物中の有効成分、医薬的に許容し得る担体、及び任意の追加成分の相対量は、治療される被験体の本体、大きさ、及び状態に応じて、さらに組成物が投与される経路に応じて変化する。例として、組成物は、０．１％～１００％（ｗ／ｗ）の有効成分を含み得る。
本発明の医薬組成物は、口腔投与に適した製剤で調製、包装、又は販売され得る。このような製剤は、例えば、従来の方法を使用して製造された錠剤又はロゼンジの形態であってもよく、例えば０．１～２０％（ｗ／ｗ）の有効成分を含み、残りは経口溶解性又は分解性組成物を含み、任意選択的に、本明細書に記載の１つ又はそれ以上の追加成分を含む。あるいは、口腔投与に適した製剤は、有効成分を含む粉末又はエアロゾル化若しくは噴霧化された溶液又は懸濁液を含み得る。そのような粉末化、エアロゾル化、又は噴霧化された製剤は、分散されると、約０．１～約２００ナノメートルの範囲の平均粒径又は液滴サイズを有し、本明細書に記載の１つ又はそれ以上の追加成分をさらに含んでもよい。
本明細書で使用される「追加成分」には、特に限定されるものではないが、以下の１つ又はそれ以上が含まれる：賦形剤；界面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；造粒剤及び崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味剤；香味剤；着色剤；防腐剤；ゼラチンなどの生理学的に分解可能な組成物；水性ビヒクル及び溶剤；油性ビヒクル及び溶剤；懸濁剤；分散剤又は湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；緩衝剤；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定剤；及び医薬的に許容し得るポリマー又は疎水性材料。本発明の医薬組成物に含めることができる他の「追加成分」は、当技術分野で知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (1985, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA) に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる
実験例
本発明を、以下の実験例を参照してさらに詳細に説明する。これらの例は、説明のみを目的として提供されており、別段の指定がない限り限定を意図したものではない。従って本発明は、決して以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変更態様を包含すると解釈されるべきである。
本発明を、以下の実験例を参照してさらに詳細に説明する。これらの例は、説明のみを目的として提供されており、別段の指定がない限り限定を意図したものではない。従って本発明は、決して以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変更態様を包含すると解釈されるべきである。
さらなる説明がなくても、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な実施例を使用して、本発明を作成及び利用し、請求された方法を実施できると考えられる。従って、以下の実施例は、決して本開示の残りを限定するものと解釈されるべきではない。
実施例１：癌細胞に送達のためのペプチドｓｉＲＮＡ－担体設計の進歩
ｓｉＲＮＡベースの細胞送達のためのペプチド担体の設計／機能における立体化学の重要性をよりよく理解するために、異なる立体化学パターンのＬ／Ｄ－アミノ酸又は特定のＤ－アミノ酸置換のいずれかを組み込んだ８個の５９９ペプチド変種が設計され、次にこれらは、ｓｉＲＮＡに結合し、送達し、及び放出する能力、並びに効果的な遺伝子サイレンシングを誘導する能力が特性解析された。結果は、５９９ペプチド設計内の異なる立体化学パターンのＬ／Ｄ－アミノ酸又は特定のＤ－アミノ酸置換の組み込みが、未変性の５９９ペプチドと比較して、場合によってはｓｉＲＮＡの結合、ヌクレアーゼ／血清安定性、及び複合体放出を増加／減少させ、並びに複合体の遺伝子サイレンシング効率に影響を与え得ることを証明する。さらに、５９９ペプチド設計におけるこれらの修飾は、ｓｉＲＮＡカーゴの細胞内取り込みと細胞内局在化パターンに様々な程度で影響を与えることもわかっており、特定のＤ－アミノ酸置換を含む１つの特定の５９９ペプチド変種が、糸状仮足として識別される特定の細胞突起へのｓｉＲＮＡのより規則的な結合を媒介することができた。興味深いことに、この特定の変種はまた、未変性の５９９ペプチドと比較して最も増強された遺伝子サイレンシングも示し、従って、そのペプチド設計の修飾が、ｓｉＲＮＡ薬物送達のより効率的な様式ドを指令し、遺伝子サイレンシングの増強をもたらす可能性があることを意味している。
ｓｉＲＮＡベースの細胞送達のためのペプチド担体の設計／機能における立体化学の重要性をよりよく理解するために、異なる立体化学パターンのＬ／Ｄ－アミノ酸又は特定のＤ－アミノ酸置換のいずれかを組み込んだ８個の５９９ペプチド変種が設計され、次にこれらは、ｓｉＲＮＡに結合し、送達し、及び放出する能力、並びに効果的な遺伝子サイレンシングを誘導する能力が特性解析された。結果は、５９９ペプチド設計内の異なる立体化学パターンのＬ／Ｄ－アミノ酸又は特定のＤ－アミノ酸置換の組み込みが、未変性の５９９ペプチドと比較して、場合によってはｓｉＲＮＡの結合、ヌクレアーゼ／血清安定性、及び複合体放出を増加／減少させ、並びに複合体の遺伝子サイレンシング効率に影響を与え得ることを証明する。さらに、５９９ペプチド設計におけるこれらの修飾は、ｓｉＲＮＡカーゴの細胞内取り込みと細胞内局在化パターンに様々な程度で影響を与えることもわかっており、特定のＤ－アミノ酸置換を含む１つの特定の５９９ペプチド変種が、糸状仮足として識別される特定の細胞突起へのｓｉＲＮＡのより規則的な結合を媒介することができた。興味深いことに、この特定の変種はまた、未変性の５９９ペプチドと比較して最も増強された遺伝子サイレンシングも示し、従って、そのペプチド設計の修飾が、ｓｉＲＮＡ薬物送達のより効率的な様式ドを指令し、遺伝子サイレンシングの増強をもたらす可能性があることを意味している。
この実施例の材料と方法をここで説明する。
ペプチド合成
表１に列記したペプチドは、固相ペプチド合成プロセスによって合成され、GenScript (Piscataway, NJ) で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製された（＞９５％の純度）。Ｄ－アミノ酸は合成プロセス中に直接使用され、ラセミ化を抑制するためにヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＯｔ）が添加された。すべてのペプチドはまた、５９９と同様に、もともと生物学的タグとして機能するように設計に追加されたＣ末端のリジン残基でビオチン化された（Cantini, et al. PLoS One, 2013. 8(9): e73348）。精製されたペプチドの電子噴霧イオン化質量分析及びＨＰＬＣ分析は、アミノ酸のラセミ化のいかなる例も明らかにしなかった。
表１に列記したペプチドは、固相ペプチド合成プロセスによって合成され、GenScript (Piscataway, NJ) で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製された（＞９５％の純度）。Ｄ－アミノ酸は合成プロセス中に直接使用され、ラセミ化を抑制するためにヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＯｔ）が添加された。すべてのペプチドはまた、５９９と同様に、もともと生物学的タグとして機能するように設計に追加されたＣ末端のリジン残基でビオチン化された（Cantini, et al. PLoS One, 2013. 8(9): e73348）。精製されたペプチドの電子噴霧イオン化質量分析及びＨＰＬＣ分析は、アミノ酸のラセミ化のいかなる例も明らかにしなかった。
ｓｉＲＮＡ
ｓｉＣＩＰ２Ａ、そのＤＹ５４７蛍光標識誘導体であるＤＹ５４７－ｓｉＣＩＰ２Ａ、及び陰性対照siGENOME（商標）非ターゲティングｓｉＲＮＡ＃５であるｓｉＮＴは、既に記載されており（Cantini, et al. PLoS One, 2013. 8(9): e73348; Alexander-Bryant, et al. J Control Release, 2015. 218: 72-81; Alexander-Bryant, et al. Oral Oncol, 2017. 72: 123-131; Junttila, et al. Cell, 2007. 130(1): 51-62）、Horizon Discovery Dharmacon（商標） (Lafayette, CO) によって合成された。
ｓｉＣＩＰ２Ａ、そのＤＹ５４７蛍光標識誘導体であるＤＹ５４７－ｓｉＣＩＰ２Ａ、及び陰性対照siGENOME（商標）非ターゲティングｓｉＲＮＡ＃５であるｓｉＮＴは、既に記載されており（Cantini, et al. PLoS One, 2013. 8(9): e73348; Alexander-Bryant, et al. J Control Release, 2015. 218: 72-81; Alexander-Bryant, et al. Oral Oncol, 2017. 72: 123-131; Junttila, et al. Cell, 2007. 130(1): 51-62）、Horizon Discovery Dharmacon（商標） (Lafayette, CO) によって合成された。
細胞培養
ヒト舌扁平上皮癌（ＳＣＣ）細胞株ＣＡＬ２７及びＵＰＣＩ：ＳＣＣ０９０（ＳＣＣ－９０）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection：ＡＴＣＣ, Manassas, VA）から購入した。細胞株は、ＡＴＣＣ指定の完全増殖培地で、３７℃インキュベーターで５％ＣＯ２で培養した。これら２つの細胞株を使用するすべての実験は、継代数が２０未満で行った。
ヒト舌扁平上皮癌（ＳＣＣ）細胞株ＣＡＬ２７及びＵＰＣＩ：ＳＣＣ０９０（ＳＣＣ－９０）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection：ＡＴＣＣ, Manassas, VA）から購入した。細胞株は、ＡＴＣＣ指定の完全増殖培地で、３７℃インキュベーターで５％ＣＯ２で培養した。これら２つの細胞株を使用するすべての実験は、継代数が２０未満で行った。
ｓｉＲＮＡ結合アッセイ
３０ｐｍｏｌのｓｉＣＩＰ２Ａは、５９９ペプチド（又はペプチド変種）と、１：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、及び５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比（それぞれ０．２５、１．２５、２．５、５、７．５、１０、及び１２．５のＮ／Ｐ比に等しいが、ただしＮ／Ｐ比がそれぞれ０．２２５、１．１２５、２．２５、４．５、６．７５、９、及び１１．２５であったＲＤ３ＡＤを除く）で、室温（ＲＴ）で２５分間、複合体形成させた。その後、試料を４％アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色した。遊離ｓｉＣＩＰ２Ａを正規化対照として使用した。Ultra-Low Range DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) をＭＷマーカーとして使用した。得られたｓｉＣＩＰ２Ａバンドは、それぞれG:Box Chemi XX6 及びGeneSys画像キャプチャーソフトウェア（Syngene, Frederick, MD）を使用して画像化及び定量を行った。
３０ｐｍｏｌのｓｉＣＩＰ２Ａは、５９９ペプチド（又はペプチド変種）と、１：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、及び５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比（それぞれ０．２５、１．２５、２．５、５、７．５、１０、及び１２．５のＮ／Ｐ比に等しいが、ただしＮ／Ｐ比がそれぞれ０．２２５、１．１２５、２．２５、４．５、６．７５、９、及び１１．２５であったＲＤ３ＡＤを除く）で、室温（ＲＴ）で２５分間、複合体形成させた。その後、試料を４％アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色した。遊離ｓｉＣＩＰ２Ａを正規化対照として使用した。Ultra-Low Range DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) をＭＷマーカーとして使用した。得られたｓｉＣＩＰ２Ａバンドは、それぞれG:Box Chemi XX6 及びGeneSys画像キャプチャーソフトウェア（Syngene, Frederick, MD）を使用して画像化及び定量を行った。
定量的ｓｉＲＮＡ細胞取り込みアッセイ
２４ウェルプレート上で６０％のコンフルエンスまで増殖させたＣＡＬ２７細胞を、Opti-MEMＩ還元血清培地（Opti-MEM; Thermo Fisher Scientific）で３回洗浄した。一方、６０ｐｍｏｌのＤＹ５４７－ｓｉＣＩＰ２Ａを単独で、又は５９９ペプチド（又は５９９ペプチド変種）とともに３０：１及び５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比でＲＴで２５分間インキュベートして、複合体を形成させた。複合体形成後、Opti-MEMで総量を６００μＬにし、その後、細胞を５００μＬのペプチド－ｓｉＣＩＰ２Ａ複合体とともに３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。追加の対照として、細胞を５０ｐｍｏｌのＤＹ５４７－ｓｉＣＩＰ２ＡでLipofectamine（登録商標）3000（Thermo Fisher Scientific）を使用して、製造元の指示に従ってトランスフェクトした。処理後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次に３７℃で１０分間トリプシン処理し、続いて１，０００ｘｇ、４℃で５分間遠心分離した。次に、細胞を氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、再度１，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離した。次に、細胞を２５０μｌの氷冷０．１Ｍ ＮａＯＨで溶解した。細胞溶解物を４℃で５分間、１０，０００×ｇで遠心分離して、細胞破片を除去した。その後、１００μＬの各試料を黒い９６ウェルプレートに移し、BioTek (Winooski, VT) Synergy HT プレートリーダーを使用して５３０／５９０ｎｍで蛍光を測定した。０～１００ｆｍｏｌ／μｌの範囲のＤＹ５４７－ｓｉＣＩＰ２Ａの既知の濃度を使用して、実験ごとに生成された標準曲線を使用して、蛍光測定値を内在化ｓｉＲＮＡの量に変換した。次に、内在化されたｓｉＲＮＡの量をタンパク質の量に正規化し、これを、Pierce BCA タンパク質アッセイKit (Thermo Fisher Scientific) を使用して定量した。
２４ウェルプレート上で６０％のコンフルエンスまで増殖させたＣＡＬ２７細胞を、Opti-MEMＩ還元血清培地（Opti-MEM; Thermo Fisher Scientific）で３回洗浄した。一方、６０ｐｍｏｌのＤＹ５４７－ｓｉＣＩＰ２Ａを単独で、又は５９９ペプチド（又は５９９ペプチド変種）とともに３０：１及び５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比でＲＴで２５分間インキュベートして、複合体を形成させた。複合体形成後、Opti-MEMで総量を６００μＬにし、その後、細胞を５００μＬのペプチド－ｓｉＣＩＰ２Ａ複合体とともに３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。追加の対照として、細胞を５０ｐｍｏｌのＤＹ５４７－ｓｉＣＩＰ２ＡでLipofectamine（登録商標）3000（Thermo Fisher Scientific）を使用して、製造元の指示に従ってトランスフェクトした。処理後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次に３７℃で１０分間トリプシン処理し、続いて１，０００ｘｇ、４℃で５分間遠心分離した。次に、細胞を氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、再度１，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離した。次に、細胞を２５０μｌの氷冷０．１Ｍ ＮａＯＨで溶解した。細胞溶解物を４℃で５分間、１０，０００×ｇで遠心分離して、細胞破片を除去した。その後、１００μＬの各試料を黒い９６ウェルプレートに移し、BioTek (Winooski, VT) Synergy HT プレートリーダーを使用して５３０／５９０ｎｍで蛍光を測定した。０～１００ｆｍｏｌ／μｌの範囲のＤＹ５４７－ｓｉＣＩＰ２Ａの既知の濃度を使用して、実験ごとに生成された標準曲線を使用して、蛍光測定値を内在化ｓｉＲＮＡの量に変換した。次に、内在化されたｓｉＲＮＡの量をタンパク質の量に正規化し、これを、Pierce BCA タンパク質アッセイKit (Thermo Fisher Scientific) を使用して定量した。
ｓｉＲＮＡの細胞取り込みと局在化の共焦点蛍光顕微鏡分析
BioCoat（商標）コラーゲンＩ型でコーティングされた８チャンバースライド（Corning, Corning, NY）上で６０％のコンフルエンスまで増殖させたＣＡＬ２７（又はＳＣＣ－９０）細胞を、Opti-MEMで３回洗浄した。一方、２０ｐｍｏｌのＤＹ５４７－ｓｉＣＩＰ２Ａは、５９９ペプチド（又はペプチド変種）と５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比でOpti-MEM中で室温で２５分間、複合体を形成させた。その後、複合体を細胞に添加して、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。経時変化の実験では、細胞を特定の複合体とともに０．５、１、２、及び４時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定した後、スライドを４'，６－ジアミジノ－２－フェニルインドールを含むVECTASHIELD 封入剤（DAPI, VECTOR Laboratories, Burlingame, CA）を使用してカバーガラスでマウントしたか、又０．１％トリトンＸ－１００で室温で５分間透過処理し、次にAlexa Fluor（商標）４８８ファロイジン（Thermo Fisher Scientific）で２０分間インキュベートした。その後、透過処理した細胞を含むスライドを、上記のようにカバーガラスでマウントした。蛍光画像は、×２５及び×６３対物レンズを備えたZeiss（Thornwood, NY）880 LSM NLO（Fast Airyscan超解像検出器付き）共焦点顕微鏡を使用して取得した。
BioCoat（商標）コラーゲンＩ型でコーティングされた８チャンバースライド（Corning, Corning, NY）上で６０％のコンフルエンスまで増殖させたＣＡＬ２７（又はＳＣＣ－９０）細胞を、Opti-MEMで３回洗浄した。一方、２０ｐｍｏｌのＤＹ５４７－ｓｉＣＩＰ２Ａは、５９９ペプチド（又はペプチド変種）と５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比でOpti-MEM中で室温で２５分間、複合体を形成させた。その後、複合体を細胞に添加して、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。経時変化の実験では、細胞を特定の複合体とともに０．５、１、２、及び４時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定した後、スライドを４'，６－ジアミジノ－２－フェニルインドールを含むVECTASHIELD 封入剤（DAPI, VECTOR Laboratories, Burlingame, CA）を使用してカバーガラスでマウントしたか、又０．１％トリトンＸ－１００で室温で５分間透過処理し、次にAlexa Fluor（商標）４８８ファロイジン（Thermo Fisher Scientific）で２０分間インキュベートした。その後、透過処理した細胞を含むスライドを、上記のようにカバーガラスでマウントした。蛍光画像は、×２５及び×６３対物レンズを備えたZeiss（Thornwood, NY）880 LSM NLO（Fast Airyscan超解像検出器付き）共焦点顕微鏡を使用して取得した。
物理化学的測定：
水中で５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル（１２．５Ｎ／Ｐ）比で調製されたｓｉＣＩＰ２Ａとの複合体中の５９９及びそのペプチド変種の流体力学的直径、ゼータ電位、及び多分散指数を、Malvern Panalytical Zetasizer ZS 装置を使用して測定した。
水中で５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル（１２．５Ｎ／Ｐ）比で調製されたｓｉＣＩＰ２Ａとの複合体中の５９９及びそのペプチド変種の流体力学的直径、ゼータ電位、及び多分散指数を、Malvern Panalytical Zetasizer ZS 装置を使用して測定した。
生存率アッセイ
CellTiter 96（登録商標）AQueous One Solution 細胞増殖アッセイ (Promega, Madison, WI) を使用して、長期の細胞生存率を評価した。簡単に説明すると、ＣＡＬ２７細胞を９６ウェルプレート上で６０％の細胞コンフルエンスまで増殖させた後、細胞を、５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比の５９９ペプチド（又は５９９ペプチド変種）との複合体中で、１２５ｎＭのｓｉＮＴを有するOpti-MEMで４時間処理した後、５０％ＦＢＳ／Opti-MEM培地を加えて、ｓｉＲＮＡとウシ胎児血清（ＦＢＳ）濃度をそれぞれ１００ｎＭと１０％に調整した。４８時間の処理後、製造元の説明書に従って、細胞生存率をアッセイした。BioTek Synergy HTプレートリーダーを使用して、４９０ｎｍで吸光度を測定した。未処理の細胞は、１００％生存と定義された。
CellTiter 96（登録商標）AQueous One Solution 細胞増殖アッセイ (Promega, Madison, WI) を使用して、長期の細胞生存率を評価した。簡単に説明すると、ＣＡＬ２７細胞を９６ウェルプレート上で６０％の細胞コンフルエンスまで増殖させた後、細胞を、５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比の５９９ペプチド（又は５９９ペプチド変種）との複合体中で、１２５ｎＭのｓｉＮＴを有するOpti-MEMで４時間処理した後、５０％ＦＢＳ／Opti-MEM培地を加えて、ｓｉＲＮＡとウシ胎児血清（ＦＢＳ）濃度をそれぞれ１００ｎＭと１０％に調整した。４８時間の処理後、製造元の説明書に従って、細胞生存率をアッセイした。BioTek Synergy HTプレートリーダーを使用して、４９０ｎｍで吸光度を測定した。未処理の細胞は、１００％生存と定義された。
ＲＮａｓｅ保護アッセイ
３０ｐｍｏｌのｓｉＣＩＰ２Ａを、５９９ペプチド（又は５９９ペプチド変種）と５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比で、室温で２５分間複合体形成させた。その後、複合体を０．１８μｇのＲＮａｓｅＡ（Thermo Fisher Scientific）で３７℃で１時間処理したか又は処理せずに、続いて４％ＳＤＳで変性させた。次に、試料を４％アガロースゲルで電気泳動し、得られたｓｉＣＩＰ２Ａバンドを上記のように画像化し、定量した。
３０ｐｍｏｌのｓｉＣＩＰ２Ａを、５９９ペプチド（又は５９９ペプチド変種）と５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比で、室温で２５分間複合体形成させた。その後、複合体を０．１８μｇのＲＮａｓｅＡ（Thermo Fisher Scientific）で３７℃で１時間処理したか又は処理せずに、続いて４％ＳＤＳで変性させた。次に、試料を４％アガロースゲルで電気泳動し、得られたｓｉＣＩＰ２Ａバンドを上記のように画像化し、定量した。
血清保護アッセイ
３０ｐｍｏｌのｓｉＣＩＰ２Ａを、５９９ペプチド（又は５９９ペプチド変種）と５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比で、室温で２５分間複合体形成させた。その後、複合体を５０％ヒト血清（最終濃度;VWR, Radnor, PA）で３７℃で１時間処理したか又は処理せずに、続いて４％ＳＤＳで変性させた。次に、試料を４％アガロースゲルで電気泳動し、得られたｓｉＣＩＰ２Ａバンドを上記のように画像化し、定量した。
３０ｐｍｏｌのｓｉＣＩＰ２Ａを、５９９ペプチド（又は５９９ペプチド変種）と５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比で、室温で２５分間複合体形成させた。その後、複合体を５０％ヒト血清（最終濃度;VWR, Radnor, PA）で３７℃で１時間処理したか又は処理せずに、続いて４％ＳＤＳで変性させた。次に、試料を４％アガロースゲルで電気泳動し、得られたｓｉＣＩＰ２Ａバンドを上記のように画像化し、定量した。
ｓｉＲＮＡ放出アッセイ
３０ｐｍｏｌのｓｉＣＩＰ２Ａを、５９９ペプチド（又は５９９ペプチド変種）と５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比で、室温で２５分間複合体形成させた。その後、複合体を０、０．１、０．５、１．０、２．０、５．０、又は１０μｇのヘパリン（Millipore Sigma, St. Louis, MO）と室温で３０分間インキュベートした。次に、試料を４％アガロースゲルで電気泳動し、得られたｓｉＣＩＰ２Ａバンドを上記のように画像化し、定量した。
３０ｐｍｏｌのｓｉＣＩＰ２Ａを、５９９ペプチド（又は５９９ペプチド変種）と５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比で、室温で２５分間複合体形成させた。その後、複合体を０、０．１、０．５、１．０、２．０、５．０、又は１０μｇのヘパリン（Millipore Sigma, St. Louis, MO）と室温で３０分間インキュベートした。次に、試料を４％アガロースゲルで電気泳動し、得られたｓｉＣＩＰ２Ａバンドを上記のように画像化し、定量した。
細胞中のＣＩＰ２Ａサイレンシング
２４ウェルプレート上で６０％のコンフルエンスまで増殖させたＣＡＬ２７細胞を、Opti-MEMで３回すすいだ。一方、６０ｐｍｏｌのｓｉＮＴ又はｓｉＣＩＰ２Ａを、５９９ペプチド（又は５９９ペプチド変種）と５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比で、Opti-MEM中で室温で２５分間複合体形成させた。その後、複合体を１２５ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度で細胞に添加し、５％ＣＯ２で３７℃で４時間インキュベートし、次に５０％ＦＢＳ／Opti-MEM培地を添加して、ｓｉＲＮＡとＦＢＳの濃度をそれぞれ１００ｎＭと１０％に調整した。処理の４８時間後、その後のリアルタイムＰＣＲ及びウエスタンブロット分析用に、全ＲＮＡ又はタンパク質を採取した。
２４ウェルプレート上で６０％のコンフルエンスまで増殖させたＣＡＬ２７細胞を、Opti-MEMで３回すすいだ。一方、６０ｐｍｏｌのｓｉＮＴ又はｓｉＣＩＰ２Ａを、５９９ペプチド（又は５９９ペプチド変種）と５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比で、Opti-MEM中で室温で２５分間複合体形成させた。その後、複合体を１２５ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度で細胞に添加し、５％ＣＯ２で３７℃で４時間インキュベートし、次に５０％ＦＢＳ／Opti-MEM培地を添加して、ｓｉＲＮＡとＦＢＳの濃度をそれぞれ１００ｎＭと１０％に調整した。処理の４８時間後、その後のリアルタイムＰＣＲ及びウエスタンブロット分析用に、全ＲＮＡ又はタンパク質を採取した。
リアルタイムＰＣＲ
RNeasy Miniキット（Qiagen, Germantown, MD）を使用して、全ＲＮＡを採取した。次に、Bio-Rad (Hercules, CA) T100サーマルサイクラーでHigh-Capacity cDNA逆転写キット（Thermo Fisher Scientific）を使用して、ＲＮＡを逆転写した。次に、Applied Biosystems（商標）StepOnePlus（商標）Real-Time PCR 装置 (Thermo Fisher Scientific) で、TaqMan（商標）Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) 及び設計済みTaqMan（商標）遺伝子発現アッセイ (Thermo Fisher Scientific) を使用して、製造元の説明書に従ってＣＩＰ２Ａ（Ｈｓ００４０５４１３＿ｍ１）及び１８Ｓ（４３１９４１３Ｅ）について、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。
RNeasy Miniキット（Qiagen, Germantown, MD）を使用して、全ＲＮＡを採取した。次に、Bio-Rad (Hercules, CA) T100サーマルサイクラーでHigh-Capacity cDNA逆転写キット（Thermo Fisher Scientific）を使用して、ＲＮＡを逆転写した。次に、Applied Biosystems（商標）StepOnePlus（商標）Real-Time PCR 装置 (Thermo Fisher Scientific) で、TaqMan（商標）Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) 及び設計済みTaqMan（商標）遺伝子発現アッセイ (Thermo Fisher Scientific) を使用して、製造元の説明書に従ってＣＩＰ２Ａ（Ｈｓ００４０５４１３＿ｍ１）及び１８Ｓ（４３１９４１３Ｅ）について、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。
ウエスタンブロット分析
処理した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Thermo Fisher Scientific）を有する氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、及び１％ ＮＰ－４０）を使用して溶解した。Pierce BCA Protein Assayキット（Thermo Fisher Scientific）を使用してタンパク質溶解物を定量し、次に、Mini-PROTEAN TGX染色フリー、４～２０％勾配ゲル（Bio-Rad）上のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。その後、Bio-Rad Trans-Blot Turbo Transfer Systemを使用して試料をニトロセルロース膜に転写した。次に、ニトロセルロース膜を約６０ｋＤａの２片に切断し、上部膜（≧６０ｋＤａ）と下部膜（＜６０ｋＤａ）を生成し、その後両方をトリス塩酸緩衝化生理食塩水－０．１％ツイーン（ＴＢＳ－Ｔ；ｐＨ７．５）中の５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳で、ＲＴで１時間ブロックした。次に、上部膜をマウスモノクローナル抗ＣＩＰ２Ａ抗体（１：５００、クローン２Ｇ１０－３Ｂ５、Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA）とともにインキュベートし、下部膜をＴＢＳ－Ｔ中の５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳中のマウスモノクローナル抗β－アクチン抗体（１：５０００、クローンＡＣ－１５、Millipore Sigma）と共に４℃で一晩インキュベートした。次に、膜をＴＢＳ－Ｔで４回、各５分間洗浄し、次にＴＢＳ－Ｔ中の５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳中の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス二次抗体（１：３０００又は１：５０００、SouthernBiotech, Birmingham, AL）と共に室温で１時間インキュベートした。免疫反応性バンドは、Bio-Rad Clarity又はBio-Rad Clarity Max基質システムを製造元の説明書に従って使用して検出し、得られた画像をG:Box Chemi XX6システム（Syngene）を使用してキャプチャーした。
処理した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Thermo Fisher Scientific）を有する氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、及び１％ ＮＰ－４０）を使用して溶解した。Pierce BCA Protein Assayキット（Thermo Fisher Scientific）を使用してタンパク質溶解物を定量し、次に、Mini-PROTEAN TGX染色フリー、４～２０％勾配ゲル（Bio-Rad）上のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。その後、Bio-Rad Trans-Blot Turbo Transfer Systemを使用して試料をニトロセルロース膜に転写した。次に、ニトロセルロース膜を約６０ｋＤａの２片に切断し、上部膜（≧６０ｋＤａ）と下部膜（＜６０ｋＤａ）を生成し、その後両方をトリス塩酸緩衝化生理食塩水－０．１％ツイーン（ＴＢＳ－Ｔ；ｐＨ７．５）中の５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳で、ＲＴで１時間ブロックした。次に、上部膜をマウスモノクローナル抗ＣＩＰ２Ａ抗体（１：５００、クローン２Ｇ１０－３Ｂ５、Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA）とともにインキュベートし、下部膜をＴＢＳ－Ｔ中の５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳中のマウスモノクローナル抗β－アクチン抗体（１：５０００、クローンＡＣ－１５、Millipore Sigma）と共に４℃で一晩インキュベートした。次に、膜をＴＢＳ－Ｔで４回、各５分間洗浄し、次にＴＢＳ－Ｔ中の５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳中の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス二次抗体（１：３０００又は１：５０００、SouthernBiotech, Birmingham, AL）と共に室温で１時間インキュベートした。免疫反応性バンドは、Bio-Rad Clarity又はBio-Rad Clarity Max基質システムを製造元の説明書に従って使用して検出し、得られた画像をG:Box Chemi XX6システム（Syngene）を使用してキャプチャーした。
この実施例の結果を次に説明する。
５９９ペプチド担体へのＬ／Ｄ－アミノ酸立体化学的修飾は、ｓｉＲＮＡに結合する、を送達する、保護する、及び放出する能力を上昇又は低下させ得る
本実施例の目的のために、ｓｉＲＮＡベースの治療薬のための５９９ペプチド担体設計を進める際に、アミノ酸立体化学の役割に焦点を当てた。既に、ペプチドの立体化学の調節が、遊離アルギニンを豊富に含有するＣＰＰとアンチセンスオリゴヌクレオチド結合ＣＰＰポリプレックスとの両方の細胞取り込み効率に影響を与える可能性があることが証明されていた（Verdurmen, WP, et al., Chem Biol, 2011. 18(8): 1000-1010; Favretto, ME, and Brock, R, Small, 2015, 11: 1414-1417）。従って、ｓｉＲＮＡカーゴの送達に対するペプチド立体化学の影響を調べるために、異なるパターンのＬ／Ｄ－アミノ酸を含む７つの５９９ペプチド変種（ペプチド配列については上記表１を参照）を設計し、７つの設計は、Verdurmen et al. の研究 (Chem Biol, 2011. 18(8): 1000-1010) で使用されたポリアルギニン立体ペプチド配列に基づいていた。さらに、受容体ターゲティングＣＰＰ内の同様の修飾により、多機能ペプチド複合体からのｓｉＲＮＡ放出の改善につながる可能性があるという証拠（Jun, et al. PLoS One, 2015. 10(2): e0118310）に基づいて、Ｄ－アラニンのＤ－アルギニン置換（ＲＤ３ＡＤ）を含む８番目の５９９ペプチド変種も設計された。
本実施例の目的のために、ｓｉＲＮＡベースの治療薬のための５９９ペプチド担体設計を進める際に、アミノ酸立体化学の役割に焦点を当てた。既に、ペプチドの立体化学の調節が、遊離アルギニンを豊富に含有するＣＰＰとアンチセンスオリゴヌクレオチド結合ＣＰＰポリプレックスとの両方の細胞取り込み効率に影響を与える可能性があることが証明されていた（Verdurmen, WP, et al., Chem Biol, 2011. 18(8): 1000-1010; Favretto, ME, and Brock, R, Small, 2015, 11: 1414-1417）。従って、ｓｉＲＮＡカーゴの送達に対するペプチド立体化学の影響を調べるために、異なるパターンのＬ／Ｄ－アミノ酸を含む７つの５９９ペプチド変種（ペプチド配列については上記表１を参照）を設計し、７つの設計は、Verdurmen et al. の研究 (Chem Biol, 2011. 18(8): 1000-1010) で使用されたポリアルギニン立体ペプチド配列に基づいていた。さらに、受容体ターゲティングＣＰＰ内の同様の修飾により、多機能ペプチド複合体からのｓｉＲＮＡ放出の改善につながる可能性があるという証拠（Jun, et al. PLoS One, 2015. 10(2): e0118310）に基づいて、Ｄ－アラニンのＤ－アルギニン置換（ＲＤ３ＡＤ）を含む８番目の５９９ペプチド変種も設計された。
ペプチドを化学的に合成する際に、ゲルシフトアッセイを実施して、最初に、５９９ペプチドへのＬ／Ｄ－アミノ酸の立体化学的修飾が、ペプチド内に見られるアニオン性ｓｉＲＮＡとＣ末端カチオン性ポリアルギニン配列間の静電的相互作用を介して、遊離ｓｉＲＮＡに結合するその能力を変化させることができるかどうかを決定した。ＣＩＰ２Ａ癌遺伝子を標的とするように設計されたｓｉＲＮＡであるｓｉＣＩＰ２Ａを使用して、このｓｉＲＮＡと、ｓｉＲＮＡの１～５０倍のモル過剰の範囲で増加する量の５９９ペプチド又はそのペプチド変種との複合体形成が、５９９ペプチドのｓｉＲＮＡへの結合特性に有意に影響する可能性があることがわかった（図１）。特に、ペプチド対ｓｉＲＮＡ（ペプチド：ｓｉＲＮＡ）のモル比が１：１から２０：１（ＲＤ３ＡＤを除くすべてのペプチドについて窒素：リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比が０．２５から５に相当し、ＲＤ３ＡＤは、Ｄ－アラニンがＤ－アルギニンに置換されているため、のＮ／Ｐ比はわずかに小さかった；ペプチド：ｓｉＲＮＡのモル比に関するすべてのペプチドの特定のＮ／Ｐ比率の値については、材料と方法のセクションを参照）で、ほとんどの５９９のペプチド変種は、未変性の５９９ペプチドと比較して、ｓｉＲＮＡへの結合が有意に良好であり、ペプチドＲＤ４５６及びＲＤ１９が結合の最も一貫した増強を示す。逆に、ペプチドＲＤ１２３７８９及びＡｌｌ－Ｌ（すべてＬ－アミノ酸のみを含む）は、５９９と比較してｓｉＲＮＡ結合に有意な変化をほとんど示さなかった。しかし、ペプチド：ｓｉＲＮＡモル比３０：１（Ｎ／Ｐ比７．５）以上では、すべてのペプチド変種がｓｉＲＮＡの約１００％に等しく結合し、５９９と比較して有意差は観察されなかった。従って、これらのデータは、ペプチド担体へのｓｉＲＮＡ結合能力が、配列特異的なＬ／Ｄ－アミノ酸の立体化学的変化の影響を受ける可能性があることを示したが、これは、定義された閾値を下回るペプチド：ｓｉＲＮＡモル（Ｎ／Ｐ）比の場合のみであった。
ｓｉＲＮＡを細胞に送達する能力における５９９ペプチドへのＬ／Ｄ－アミノ酸立体化学的修飾の効果をさらに調べるために、次に一連の定量的取り込みアッセイを実施した。既に、５９９ペプチドのペプチド：ｓｉＲＮＡモル比を増加させると、複合体形成ｓｉＲＮＡの細胞への送達が増強されることが決定され、５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル（１２．５Ｎ／Ｐ）比がｓｉＲＮＡの結合と細胞内測定に最適であることがわかった（Cantini, et al. PLoS One, 2013. 8(9): e73348）。それにもかかわらず、本研究では、約１００％のｓｉＲＮＡが、５９９ペプチド及びその変種に３０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比（７．５Ｎ／Ｐ）及びそれ以上で結合することが判明したため、これらのいずれかの変種が、３０：１及び５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル（７．５及び１２．５Ｎ／Ｐ）比の両方で、親の５９９ペプチドと比較して、ｓｉＲＮＡ細胞取り込みの改善を示すかどうかを調べることを決定した。ＤＹ－５４７蛍光体標識ｓｉＣＩＰ２Ａ（ＤＹ５４７－ｓｉＣＩＰ２Ａ；図２Ａ）の定量的送達のモニタリングにおいて、我々のデータの分析は、ペプチド：ｓｉＲＮＡモル比３０：１（Ｎ／Ｐ比７．５）で、ＩＮＦ７Ｄ（これは、細胞へのｓｉＲＮＡ送達を劇的かつ顕著に低下させた）を除いて、処理の２時間後に、ＣＡＬ２７癌細胞にｓｉＲＮＡを送達する能力が、５９９と有意に異なる５９９ペプチド変種はなかった。しかし、ペプチド：ｓｉＲＮＡのモル比５０：１（Ｎ／Ｐ比１２．５）では、ペプチド変種間でｓｉＲＮＡの取り込みの違いがより明らかになり、ＲＤ１９、ＲＤ１２３７８９、及びＲＤ３ＡＤが、平均して細胞へのより大きなｓｉＲＮＡの送達を示したが、ＲＤ３ＡＤのみが、５９９よりもほぼ２倍高い有意に大きな内在化を示した。逆に、ＩＮＦ７Ｄ以外にＲＤ１３５７９は、有意に低下したレベルのｓｉＲＮＡ細胞内在化をもたらした。対照として、市販の脂質ベースのトランスフェクション試薬（ＬＴＲ）であるLipofectamine（登録商標）3000（ＬＦ３０００）も使用し、これは、ペプチド：ｓｉＲＮＡのモル比３０：１（Ｎ／Ｐ比７．５）で、５９９及びその変種と同等にｓｉＲＮＡを送達することがわかったが、これは５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル（１２．５Ｎ／Ｐ）比と比較すると有意に低かった。５９９及びそのペプチド変種（５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル（１２．５Ｎ／Ｐ）比）によって媒介されるＣＡＬ２７癌細胞へのＤＹ５４７－ｓｉＣＩＰ２Ａの送達の、共焦点蛍光顕微鏡を使用した目視検査（図２Ｂ）は、５９９について既に報告されたもの（Cantini, et al. PLoS One, 2013. 8(9): e73348）と同様に、主にランダムな斑点状の取り込みパターンを示したが、ＲＤ３ＡＤは例外で、ランダムなパターンと高度に秩序化された線状の斑点状の取り込みパターンの両方を示した（後者のパターンの視覚化については、ＲＤ３ＡＤパネルの矢頭を参照）。さらに、ＲＤ３ＡＤ処理細胞を詳しく調べたところ、５９９又は他のペプチド変種で処理した細胞（その病巣は大きく数が少ない傾向があった）と比較して、多数の大小の病巣が明らかになった。まとめると、特に定量的取り込みアッセイにおいて、このペプチドについてより高レベルのｓｉＲＮＡ細胞内在化が観察された事実を考慮すると、ＲＤ３ＡＤの染色パターンのこれらの違いは、ｓｉＲＮＡ送達においてより効率的なＲＤ３ＡＤによって媒介される細胞侵入の別の様式を示している可能性がある。それにもかかわらず、これらの結果は、５９９内のペプチドの立体化学パターンを変化させると、細胞へのｓｉＲＮＡの送達の程度に影響を与える可能性があるが、ＲＤ３ＡＤを通して観察されるように、５９９ペプチド担体内の特定のＤ－アミノ酸置換が、複合体形成したｓｉＲＮＡカーゴの細胞内在化を促進するために必要であることを示した。注目すべきことは、５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル（１２．５Ｎ／Ｐ）比でｓｉＲＮＡと複合体形成した５９９のペプチド変種の物理化学的特性の測定値（粒径、ゼータ電位、及び多分散指数を含む（表２参照されたい））が、ｓｉＲＮＡ細胞取り込みパターンで観察された違いを説明できる、又はこれらの違いが粒子凝集特性の変動の結果であることを意味する複合体間の識別可能な特徴を、明らかにしなかったことである。それにもかかわらず、上記の発見に基づいて、未処理の細胞と比較して、５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル（１２．５Ｎ／Ｐ）比で５９９のペプチド変種のいずれも長期の細胞傷害効果を誘発しなかったこと（図３Ａ）、そしてそれらが５９９と有意に異なっていなかった（図３Ｂ）という観察結果と合わせて、この特定のペプチド：ｓｉＲＮＡのモル比をその後の実験に使用した。
インビボで送達されたｓｉＲＮＡはその治療標的に到達する前に、ｓｉＲＮＡを分解し得る生理的環境（例えば血清）でＲＮａｓｅに遭遇する（Gavrilov, et al. Yale J Biol Med, 2012. 85(2): 187-200; Alexander-Bryant, et al. J Control Release, 2015. 218: 72-81）。従ってｓｉＲＮＡ送達システムは、その遺伝子サイレンシング機能を維持するために、小さなＲＮＡを分解から保護できなければならない。既に、５９９は、ＲＮａｓｅＡ及びヒト血清の存在下でｓｉＲＮＡを分解から保護することが示されていた（Alexander-Bryant, et al. J Control Release, 2015. 218: 72-81）。従って、ペプチド担体へのＬ／Ｄ－アミノ酸の立体化学的修飾が、そのｓｉＲＮＡ保護能力を変化させ得るかどうかをさらに評価するために、ペプチドをｓｉＣＩＰ２Ａと複合体形成させ、ＲＮａｓｅＡ又はヒト血清の存在下で１時間インキュベートすることにより、ＲＮａｓｅに対する５９９及びその変種の耐性をアッセイした（図４）。アッセイのデータから、ＲＮａｓｅＡの存在下では、ＲＤ４５６のみがｓｉＲＮＡを保護する能力が著しく低下し、複合体形成したｓｉＲＮＡの約２５％が分解された。あるいは、ヒト血清の存在下では、Ａｌｌ－Ｌ、ＲＤ１９、ＲＤ１２３７８９、及びＩＮＦ７Ｄを含むいくつかのペプチドは、複合体形成ｓｉＲＮＡを保護する能力が大幅に低下し、分解は約２０～６０％の範囲であった。ＲＤ３ＡＤ、ＲＤ１３５７９、及びＡｌｌ－Ｄを含む他のすべての５９９ペプチド変種は、ＲＮａｓｅＡ又は血清のいずれかの存在下でｓｉＲＮＡを保護する能力において、５９９と差がなかった。従って、まとめるとこれらの結果は、ペプチド担体設計の立体化学が複合体形成ｓｉＲＮＡの保存に重要な役割を果たしていることを意味し、特に、５９９設計のポリアルギニン片内のＬ／Ｄ－アルギニンは、ＲＮａｓｅ／血清媒介分解に対する複合体形成ｓｉＲＮＡの感受性の決定要因であると思われる。
遺伝子サイレンシングの効率は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へのｓｉＲＮＡの取り込みを可能にする細胞質に入る際の、送達複合体からのｓｉＲＮＡの放出に依存する（Jun, et al. PLoS One, 2015. 10(2): e0118310; Ren, et al. ACS Nano, 2012. 6(10): 8620-8631）。従って、特定のＬ／Ｄ－アミノ酸の立体化学的修飾がｓｉＲＮＡ放出動力学に影響を与えるかどうかを調べるために、５９９及びそのペプチド変種からのｓｉＲＮＡの解離を定量的ヘパリン競合アッセイを実行することによって評価した（図５）。これらの実験の結果は、約６ｐｍｏｌ（０．１μｇ）のヘパリンを添加すると、ｓｉＲＮＡがすべてのペプチド複合体から様々な程度で解離し始めることを示し、負に帯電した試薬の競合的量を増加させると、５９９は複合体形成されたｓｉＲＮＡのほぼ１００％を放出させることができた。５９９と比較して、ＲＤ４５６、ＲＤ１９、ＲＤ１２３７８９、及びＩＮＦ７Ｄでは、ｓｉＲＮＡ放出の統計的差異は観察されなかった。逆に、ＲＤ３ＡＤとＡＬＬ－Ｌ／ＡＬＬ－Ｄ／ＲＤ１３５７９は、５９９と比較して、ｓｉＲＮＡ解離において有意差を示し、４倍以上の過剰レベル（≧２μｇ；≧１２０ｐｍｏｌ）のヘパリンで、これらの複合体形成されたｓｉＲＮＡのそれぞれ約９０％及び約７０％が最大に放出された。興味深いことに、ｓｉＲＮＡ放出能力の最大の障害を示した３つのペプチド変種のうち２つは、単一アミノ酸の立体化学を含む担体であった（Ａｌｌ－Ｌ又はＡｌｌ－Ｄ）。さらに、ｓｉＲＮＡの放出には依然として非常に効果的であるが、ＲＤ３ＡＤのポリアルギニン片内のＤ－アラニンから３番目のＤ－アルギニンへの置換は、ｓｉＲＮＡの送達について多機能性ペプチド複合体の研究でJun et al. によって報告されていた（Jun, et al. PLoS One, 2015. 10(2): e0118310）ように、ペプチド複合体からのｓｉＲＮＡ放出の増強をもたらす点において普遍的ではないようであった（少なくとも親ペプチドと比較して）。それにもかかわらず、Ｌ及びＤ－アミノ酸配列パターンの両方を含む７つのペプチドのうち６つが９０％以上のｓｉＲＮＡ放出を示したという事実は、ペプチド担体設計に交互のアミノ酸の立体化学を組み込むことが、複合体からの効率的なｓｉＲＮＡ放出を確保するのに重要な要因である可能性を示唆した。
５９９ペプチドｓｉＲＮＡ－担体へのＬ／Ｄ－アミノ酸立体化学修飾は複合体の遺伝子サイレンシング特性に影響を与える
５９９は、既にインビトロ及びインビボ遺伝子サイレンシングの両方を誘導できるｓｉＲＮＡの送達において効果的な担体であることが示されている（Cantini, et al. PLoS One, 2013. 8(9): e73348; Alexander-Bryant, et al. J Control Release, 2015. 218: 72-81）。それにもかかわらず、特定のＬ／Ｄ－アミノ酸の立体化学的変化が、５９９によって媒介されるｓｉＲＮＡの結合、細胞内在化、保護、及び放出に影響を与える可能性があるという上記の発見により、ｓｉＲＮＡと複合体形成した５９９ペプチド変種の遺伝子サイレンシング機能をさらに評価する必要性が明らかになった。そうすることで、これは、これらの特性が遺伝子サイレンシングの増強に関連しているかどうか、及びペプチド担体設計の進歩の可能性があるかどうかを確認するのに役立つであろう。従って、５９９及びそのペプチド変種によって媒介される遺伝子サイレンシング効率を評価するために、ＣＡＬ２７癌細胞を、対照の非ターゲティングｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ）又はｓｉＣＩＰ２Ａと複合体形成した５９９又はそのペプチド変種で処理し、その後、処理の４８時間後にリアルタイムＰＣＲによりＣＩＰ２ＡｍＲＮＡレベルを評価した。結果の定量により、試験したすべてのペプチドのＣＩＰ２ＡｍＲＮＡレベルが約５０～８０％の範囲で大幅にノックダウンされ、ＲＤ３ＡＤが約８０％のＣＩＰ２ＡｍＲＮＡレベルの最も大きな低下が観察されることが示された（図６Ａ）。しかし、５９９と比較して、ＲＤ３ＡＤとＡｌｌ－Ｌの２つのペプチド変種のみが遺伝子サイレンシングの有意な増強を示すことがわかり、ＲＤ３ＡＤは約３０％で最大の改善を示した（図６Ｂ）。リアルタイムＰＣＲの結果をさらに確証するために、ウエスタンブロット分析を実施した。これにより、処理後４８時間でＣＩＰ２Ａタンパク質レベルの抑制を示すことによって、５９９ペプチド変種が機能的ｓｉＲＮＡを送達する能力が確認された（図６Ｃ）。興味深いことに、データはまた、５９９と比較して、ペプチド変種の中でＣＩＰ２Ａタンパク質レベルの低下が最も高いＲＤ３ＡＤを支持しているようにも見えた。従ってこれらの知見は、５９９－ｓｉＲＮＡ複合体の遺伝子サイレンシング機能が、ペプチド担体設計内の立体化学的パターンの変更により影響を受け得ることを示したが、ＲＤ３ＡＤで観察されるように特定のＤ－アミノ酸置換は、ｓｉＲＮＡベースの治療薬のための５９９ペプチド担体設計を進める可能性を明らかにしたため、特に重要であった。
５９９は、既にインビトロ及びインビボ遺伝子サイレンシングの両方を誘導できるｓｉＲＮＡの送達において効果的な担体であることが示されている（Cantini, et al. PLoS One, 2013. 8(9): e73348; Alexander-Bryant, et al. J Control Release, 2015. 218: 72-81）。それにもかかわらず、特定のＬ／Ｄ－アミノ酸の立体化学的変化が、５９９によって媒介されるｓｉＲＮＡの結合、細胞内在化、保護、及び放出に影響を与える可能性があるという上記の発見により、ｓｉＲＮＡと複合体形成した５９９ペプチド変種の遺伝子サイレンシング機能をさらに評価する必要性が明らかになった。そうすることで、これは、これらの特性が遺伝子サイレンシングの増強に関連しているかどうか、及びペプチド担体設計の進歩の可能性があるかどうかを確認するのに役立つであろう。従って、５９９及びそのペプチド変種によって媒介される遺伝子サイレンシング効率を評価するために、ＣＡＬ２７癌細胞を、対照の非ターゲティングｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ）又はｓｉＣＩＰ２Ａと複合体形成した５９９又はそのペプチド変種で処理し、その後、処理の４８時間後にリアルタイムＰＣＲによりＣＩＰ２ＡｍＲＮＡレベルを評価した。結果の定量により、試験したすべてのペプチドのＣＩＰ２ＡｍＲＮＡレベルが約５０～８０％の範囲で大幅にノックダウンされ、ＲＤ３ＡＤが約８０％のＣＩＰ２ＡｍＲＮＡレベルの最も大きな低下が観察されることが示された（図６Ａ）。しかし、５９９と比較して、ＲＤ３ＡＤとＡｌｌ－Ｌの２つのペプチド変種のみが遺伝子サイレンシングの有意な増強を示すことがわかり、ＲＤ３ＡＤは約３０％で最大の改善を示した（図６Ｂ）。リアルタイムＰＣＲの結果をさらに確証するために、ウエスタンブロット分析を実施した。これにより、処理後４８時間でＣＩＰ２Ａタンパク質レベルの抑制を示すことによって、５９９ペプチド変種が機能的ｓｉＲＮＡを送達する能力が確認された（図６Ｃ）。興味深いことに、データはまた、５９９と比較して、ペプチド変種の中でＣＩＰ２Ａタンパク質レベルの低下が最も高いＲＤ３ＡＤを支持しているようにも見えた。従ってこれらの知見は、５９９－ｓｉＲＮＡ複合体の遺伝子サイレンシング機能が、ペプチド担体設計内の立体化学的パターンの変更により影響を受け得ることを示したが、ＲＤ３ＡＤで観察されるように特定のＤ－アミノ酸置換は、ｓｉＲＮＡベースの治療薬のための５９９ペプチド担体設計を進める可能性を明らかにしたため、特に重要であった。
ＲＤ３ＡＤ－ｓｉＲＮＡ複合体は細胞表面の糸状仮足と共局在する
ｓｉＲＮＡと複合体を形成しているＲＤ３ＡＤが遺伝子サイレンシングを増強できること、及びこのペプチドが複合体形成ｓｉＲＮＡカーゴの細胞内在化の増加を媒介し、細胞周辺と思われる場所でのｓｉＲＮＡを含む病巣の明らかに高度に規則正しい線形蓄積を発見したことは、その細胞侵入モードが、５９９及び他のペプチド変種と比較して、潜在的により効率的であることを意味した。従って、これらの構造をよりよく説明し、ｓｉＲＮＡの取り込みの改善、その結果としてＲＤ３ＡＤによって媒介される遺伝子サイレンシングの増強に関与するメカニズムを解明するために、５９９及びそのペプチド変種によって媒介される細胞への蛍光体標識ｓｉＲＮＡの送達が、高倍率の共焦点蛍光顕微鏡を使用して評価された（図７Ａ）。これらの実験の結果は、ＤＹ５４７－ｓｉＣＩＰ２Ａと複合体形成した５９９又はそのペプチド変種によるＣＡＬ２７癌細胞の処理が、主に、処理の２時間後に、細胞膜の周辺と細胞質の両方にランダムに局在する様々なサイズの不規則な形状の病巣（そのほとんどは大きかった）を示すことを確認した。特に、例外はＲＤ３ＡＤであり、これは、糸状仮足として同定される細胞表面の突起に沿って並んだ、均一な形状の球状病巣の高度に整然とした蓄積を示した。興味深いことに、糸状仮足は、ウイルス、細菌、活性化受容体、リポ／ポリプレックス、及びエキソソームの非常に効率的な細胞侵入を促進することが報告されている、非常に動的で細長く薄い細胞突起である（Heusermann, et al. J Cell Biol, 2016. 213(2): 173-184; Lehmann, et al. J Cell Biol, 2005. 170(2): 317-25; Lidke, et al. J Cell Biol, 2005. 170(4): 619-26）。従って、糸状仮足に沿って局在するようには思われず、ほとんどが大きな斑点状構造でそのｓｉＲＮＡカーゴの限られた取り込みのみを示した５９９－ｓｉＲＮＡ複合体に対して、逆に、ＲＤ３ＡＤ－ｓｉＲＮＡ複合体と糸状仮足との結合は、処理された細胞の細胞質で小さなｓｉＲＮＡを含む病巣のより多くの蓄積も検出された理由を説明することができるであろう（図７Ｂ）。同様に、ＲＤ３ＡＤ媒介ｓｉＲＮＡ取り込みの染色パターンが別の癌細胞株で再現可能かどうかをさらに調べると、ＤＹ５４７－ｓｉＣＩＰ２Ａｓと複合体形成したＲＤ３ＡＤ又は５９９のいずれかでＳＣＣ－９０細胞を処理すると、ＣＡＬ２７処理において両方のペプチドで観察されたものと同じ染色パターンの違いが生じることが、同様に証明された（図７Ｃ）。より詳しくは、ＲＤ３ＡＤ－ｓｉＲＮＡ複合体は、多数の小さな細胞質病巣の蓄積に加えて、糸状仮足に沿って同じ劇的な「糸につないだビーズ」パターンを示すことがわかったが、５９９－ｓｉＲＮＡ複合体は、主に大きくて不規則な形状の構造であり、これは数が少なく、細胞質と細胞膜の周辺との両方に局在し、糸状仮足との明らかな結合はなかった。両方の癌細胞株におけるＲＤ３ＡＤ媒介ｓｉＲＮＡの取り込みについて我々が観察した染色パターンは、ウイルス、細菌、活性化受容体、リポ／ポリプレックス、及びエキソソームの細胞侵入について既に報告されたパターンを非常に連想させ（Heusermann, et al. J Cell Biol, 2016. 213(2): 173-184; Lehmann, et al. J Cell Biol, 2005. 170(2): 317-25; Lidke, et al. J Cell Biol, 2005. 170(4): 619-26）、このペプチド担体が、糸状仮足を使用して細胞に侵入することにより、そのカーゴの効率的な送達のための同様の細胞機構を利用できる可能性があり、それによって遺伝子サイレンシングの増強に寄与している可能性があることを意味していた。実際、５９９－ｓｉＲＮＡ複合体で処理された細胞と比較して、ＤＹ５４７－ｓｉＣＩＰ２Ａと複合体形成したＲＤ３ＡＤで処理した細胞の経時的分析は、４時間にわたって、糸状仮足、細胞周辺に沿って、及び細胞内にｓｉＲＮＡが蓄積することを明確に示し、最も顕著な違いは４時間目に観察された（図８）。さらに、４時間目の処理細胞の断面分析は、細胞質Ｆ－アクチンとのｓｉＲＮＡ共局在の程度が高いことから明らかなように、細胞内でのｓｉＲＮＡの取り込みの増加を裏付け、これは、糸状仮足に加えて細胞体を区別するのに有用であった。逆に、５９９処理は、ｓｉＲＮＡが主に細胞体の表面に局在し、細胞内取り込みが制限されていることが示しているように思われた。従って、まとめると、これらのデータは、ＲＤ３ＡＤが、おそらく糸状仮足との結合を通して、より効率的な細胞侵入モードを媒介するように見えるという考えを増強した。
ｓｉＲＮＡと複合体を形成しているＲＤ３ＡＤが遺伝子サイレンシングを増強できること、及びこのペプチドが複合体形成ｓｉＲＮＡカーゴの細胞内在化の増加を媒介し、細胞周辺と思われる場所でのｓｉＲＮＡを含む病巣の明らかに高度に規則正しい線形蓄積を発見したことは、その細胞侵入モードが、５９９及び他のペプチド変種と比較して、潜在的により効率的であることを意味した。従って、これらの構造をよりよく説明し、ｓｉＲＮＡの取り込みの改善、その結果としてＲＤ３ＡＤによって媒介される遺伝子サイレンシングの増強に関与するメカニズムを解明するために、５９９及びそのペプチド変種によって媒介される細胞への蛍光体標識ｓｉＲＮＡの送達が、高倍率の共焦点蛍光顕微鏡を使用して評価された（図７Ａ）。これらの実験の結果は、ＤＹ５４７－ｓｉＣＩＰ２Ａと複合体形成した５９９又はそのペプチド変種によるＣＡＬ２７癌細胞の処理が、主に、処理の２時間後に、細胞膜の周辺と細胞質の両方にランダムに局在する様々なサイズの不規則な形状の病巣（そのほとんどは大きかった）を示すことを確認した。特に、例外はＲＤ３ＡＤであり、これは、糸状仮足として同定される細胞表面の突起に沿って並んだ、均一な形状の球状病巣の高度に整然とした蓄積を示した。興味深いことに、糸状仮足は、ウイルス、細菌、活性化受容体、リポ／ポリプレックス、及びエキソソームの非常に効率的な細胞侵入を促進することが報告されている、非常に動的で細長く薄い細胞突起である（Heusermann, et al. J Cell Biol, 2016. 213(2): 173-184; Lehmann, et al. J Cell Biol, 2005. 170(2): 317-25; Lidke, et al. J Cell Biol, 2005. 170(4): 619-26）。従って、糸状仮足に沿って局在するようには思われず、ほとんどが大きな斑点状構造でそのｓｉＲＮＡカーゴの限られた取り込みのみを示した５９９－ｓｉＲＮＡ複合体に対して、逆に、ＲＤ３ＡＤ－ｓｉＲＮＡ複合体と糸状仮足との結合は、処理された細胞の細胞質で小さなｓｉＲＮＡを含む病巣のより多くの蓄積も検出された理由を説明することができるであろう（図７Ｂ）。同様に、ＲＤ３ＡＤ媒介ｓｉＲＮＡ取り込みの染色パターンが別の癌細胞株で再現可能かどうかをさらに調べると、ＤＹ５４７－ｓｉＣＩＰ２Ａｓと複合体形成したＲＤ３ＡＤ又は５９９のいずれかでＳＣＣ－９０細胞を処理すると、ＣＡＬ２７処理において両方のペプチドで観察されたものと同じ染色パターンの違いが生じることが、同様に証明された（図７Ｃ）。より詳しくは、ＲＤ３ＡＤ－ｓｉＲＮＡ複合体は、多数の小さな細胞質病巣の蓄積に加えて、糸状仮足に沿って同じ劇的な「糸につないだビーズ」パターンを示すことがわかったが、５９９－ｓｉＲＮＡ複合体は、主に大きくて不規則な形状の構造であり、これは数が少なく、細胞質と細胞膜の周辺との両方に局在し、糸状仮足との明らかな結合はなかった。両方の癌細胞株におけるＲＤ３ＡＤ媒介ｓｉＲＮＡの取り込みについて我々が観察した染色パターンは、ウイルス、細菌、活性化受容体、リポ／ポリプレックス、及びエキソソームの細胞侵入について既に報告されたパターンを非常に連想させ（Heusermann, et al. J Cell Biol, 2016. 213(2): 173-184; Lehmann, et al. J Cell Biol, 2005. 170(2): 317-25; Lidke, et al. J Cell Biol, 2005. 170(4): 619-26）、このペプチド担体が、糸状仮足を使用して細胞に侵入することにより、そのカーゴの効率的な送達のための同様の細胞機構を利用できる可能性があり、それによって遺伝子サイレンシングの増強に寄与している可能性があることを意味していた。実際、５９９－ｓｉＲＮＡ複合体で処理された細胞と比較して、ＤＹ５４７－ｓｉＣＩＰ２Ａと複合体形成したＲＤ３ＡＤで処理した細胞の経時的分析は、４時間にわたって、糸状仮足、細胞周辺に沿って、及び細胞内にｓｉＲＮＡが蓄積することを明確に示し、最も顕著な違いは４時間目に観察された（図８）。さらに、４時間目の処理細胞の断面分析は、細胞質Ｆ－アクチンとのｓｉＲＮＡ共局在の程度が高いことから明らかなように、細胞内でのｓｉＲＮＡの取り込みの増加を裏付け、これは、糸状仮足に加えて細胞体を区別するのに有用であった。逆に、５９９処理は、ｓｉＲＮＡが主に細胞体の表面に局在し、細胞内取り込みが制限されていることが示しているように思われた。従って、まとめると、これらのデータは、ＲＤ３ＡＤが、おそらく糸状仮足との結合を通して、より効率的な細胞侵入モードを媒介するように見えるという考えを増強した。
ペプチド担体の立体化学修飾とＤ－アミノ酸置換はｓｉＲＮＡ送達と遺伝子サイレンシングに影響を与える
ここで提示された結果は、ｓｉＲＮＡ複合体形成、細胞内送達、ＲＮａｓｅ／血清感受性、複合体放出、及び遺伝子サイレンシング効率に関して、ペプチド立体化学、特にペプチド担体設計における特定のＬ／Ｄ－アミノ酸配列パターンの修飾の重要性を強調している。さらに、我々の知見は、特に、Ｄ－アミノ酸置換を介するペプチド担体がｓｉＲＮＡ送達を増強し、その結果、糸状仮足に沿った潜在的な「サーフィング（surfing）」を介する遺伝子サイレンシングを増強できることを特に示す。前述のように、従来の考えでは、ペプチド担体の設計における立体化学は、主にペプチド－ｓｉＲＮＡ複合体にタンパク質分解耐性機能を付与するために使用され、ペプチドとその治療的カーゴをインビボ治療用途でより安定にするものであった。しかし、Zeller et al.は、代替的に、エンドソーム内のペプチド担体のタンパク質分解的消化が、実際には、後期エンドソームからサイトゾルへのｓｉＲＮＡの放出の増強により、遺伝子サイレンシングの動力学を長引かせるために重要であることを発見した（Zeller, et al. Chem Biol, 2015. 22: 50-62）。従って、これらのデータは、Ｌ／Ｄ－アミノ酸の立体化学を調節する際に、ペプチド担体の設計におけるバランスの必要性を明らかにした。さらに、Verdurmen et al.及び Favretto et al.による研究では、ペプチドの立体化学の調節は、遊離アルギニンを豊富に含むＣＰＰとアンチセンスオリゴヌクレオチド結合ＣＰＰポリプレックスの両方の細胞取り込み効率にも影響を与える可能性があることが証明されており（Verdurmen, WP, et al., Chem Biol, 2011. 18(8): 1000-1010; Favretto, ME, and Brock, R, Small, 2015, 11: 1414-1417）、ペプチドの立体化学が、プロトタイプのプロテアーゼ耐性機能を超えた追加の機能を潜在的に付与できることをさらに示唆していた。従って、ペプチド担体設計における立体化学の応用に関する我々の知識をさらに拡大するために、この研究では、我々が以前に設計した５９９ペプチド担体内の特定のＬ／Ｄ－アミノ酸立体化学的修飾が、ペプチド担体の特性／機能にどのように影響するかを判断し、癌細胞の遺伝子サイレンシングを増強するための５９９ペプチド担体の設計を進める。
ここで提示された結果は、ｓｉＲＮＡ複合体形成、細胞内送達、ＲＮａｓｅ／血清感受性、複合体放出、及び遺伝子サイレンシング効率に関して、ペプチド立体化学、特にペプチド担体設計における特定のＬ／Ｄ－アミノ酸配列パターンの修飾の重要性を強調している。さらに、我々の知見は、特に、Ｄ－アミノ酸置換を介するペプチド担体がｓｉＲＮＡ送達を増強し、その結果、糸状仮足に沿った潜在的な「サーフィング（surfing）」を介する遺伝子サイレンシングを増強できることを特に示す。前述のように、従来の考えでは、ペプチド担体の設計における立体化学は、主にペプチド－ｓｉＲＮＡ複合体にタンパク質分解耐性機能を付与するために使用され、ペプチドとその治療的カーゴをインビボ治療用途でより安定にするものであった。しかし、Zeller et al.は、代替的に、エンドソーム内のペプチド担体のタンパク質分解的消化が、実際には、後期エンドソームからサイトゾルへのｓｉＲＮＡの放出の増強により、遺伝子サイレンシングの動力学を長引かせるために重要であることを発見した（Zeller, et al. Chem Biol, 2015. 22: 50-62）。従って、これらのデータは、Ｌ／Ｄ－アミノ酸の立体化学を調節する際に、ペプチド担体の設計におけるバランスの必要性を明らかにした。さらに、Verdurmen et al.及び Favretto et al.による研究では、ペプチドの立体化学の調節は、遊離アルギニンを豊富に含むＣＰＰとアンチセンスオリゴヌクレオチド結合ＣＰＰポリプレックスの両方の細胞取り込み効率にも影響を与える可能性があることが証明されており（Verdurmen, WP, et al., Chem Biol, 2011. 18(8): 1000-1010; Favretto, ME, and Brock, R, Small, 2015, 11: 1414-1417）、ペプチドの立体化学が、プロトタイプのプロテアーゼ耐性機能を超えた追加の機能を潜在的に付与できることをさらに示唆していた。従って、ペプチド担体設計における立体化学の応用に関する我々の知識をさらに拡大するために、この研究では、我々が以前に設計した５９９ペプチド担体内の特定のＬ／Ｄ－アミノ酸立体化学的修飾が、ペプチド担体の特性／機能にどのように影響するかを判断し、癌細胞の遺伝子サイレンシングを増強するための５９９ペプチド担体の設計を進める。
５９９ペプチドはｓｉＲＮＡと静電的に複合体を形成するように設計された（Cantini, et al. PLoS One, 2013. 8(9): e73348）ため、Ｌ／Ｄ－アミノ酸配列パターンの改変、及びＤ－アラニンの特定のＤ－アルギニンによる置換が、５９９ペプチド担体の結合親和性を変化させるかどうかを最初に調べた。この実施例の結果から、５９９ペプチドに対するこれらの修飾が、用量依存的に遊離ｓｉＲＮＡに結合する能力を実際に変化させることができ、すべてのペプチド変種が３０：１以上のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比でｓｉＲＮＡの約１００％に結合することが分かった。この特定のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比以上でｓｉＲＮＡ結合に違いはなかったが、ほとんどのペプチド（Ａｌｌ－ＬとＲＤ１２３７８９を除く）は、１：１～２０：１の間のペプチド：ｓｉＲＮＡで５９９よりも有意に良好に結合し、ＲＤ４５６が全体的に最も顕著な改善を示した。さらに、８つのペプチド変種のうち６つが１０：１のモル比で結合能力の最大の差を示し、ＲＤ４５６とＩＮＦ７Ｄは、５９９と比較して約２０％の結合改善を示した。５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比で最適に機能することが以前に決定されている５９９は、通常、１回の反応でペプチドとｓｉＲＮＡの両方の相対モル量を混合することによって調製処方される（Cantini, et al. PLoS One, 2013. 8(9): e73348）ため、この知見は特に興味深い。従って、例えば、１０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比増分で、ペプチドをｓｉＲＮＡに連続して５回添加（出発ｓｉＲＮＡ量が約２０％増加）して、ＲＤ４５６を複合体形成させることにより、複合体のｓｉＲＮＡ結合能力の改善を企図することができ、最適なペプチド：ｓｉＲＮＡのモル比で機能することを可能になる。
５９９のペプチド変種によって媒介されるｓｉＲＮＡの細胞内送達に関するその後の研究では、すべてのペプチドが３０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比でｓｉＲＮＡの約１００％のｓｉＲＮＡに結合したにもかかわらず、ペプチド：ｓｉＲＮＡモル比を５０：１に増加させると、５９９に加えて、７つのペプチドのうち５つについてネーキッドｓｉＲＮＡと比較して、処理後２時間で細胞へのｓｉＲＮＡの取り込みをさらに増加させることが明らかになり、これは、ＣＰＰ濃度を増加させると一般的にｓｉＲＮＡ取り込み能力が増加することを同様に見いだした他の報告（Lundberg, et al. Faseb j, 2007. 21: 2664-2671; Kumar, et al. Nature, 2007. 448: 39-43）とともに、５９９について既に公表されていたデータに一致していた（Cantini, et al. PLoS One, 2013. 8(9): e73348）。５９９ペプチド設計に対する立体化学的変化に関して、Ｌ／Ｄ－アミノ酸配列パターンの変更は、５９９と比較して、ＩＮＦ７ＤとＲＤ１３５７９の２つのペプチドのｓｉＲＮＡの細胞内送達に悪影響を与えるだけであることが分かったが、それ以外の場合、これらの変化はほとんど影響を受けず、５９９と比較して他の５つのペプチドについて有意差は観察されなかった。しかし、これらのデータは、融合性ＩＮＦ７Ｎ末端領域のキラリティーを非天然Ｄ－アミノ酸に変更することがｓｉＲＮＡの取り込みに対して潜在的に有害であることを明らかにし、これはＡｌｌ－Ｄ及びＩＮＦ７Ｄを介して観察され、これらはどちらも５９９と比較して平均して低いｓｉＲＮＡ取り込み能力を示し、これは、おそらく膜の不安定化におけるその機能的重要性のために、このタイプの修飾は避けるべきであることが示唆された（Plank, et al. J Biol Chem, 1994. 269: 12918-12924）。特に、細胞内ｓｉＲＮＡ送達の劇的かつ有意な増加（５９９のほぼ２倍）を示した唯一のペプチドはＲＤ３ＡＤであり、これはＤ－アラニンを特定のＤ－アルギニンで置換することにより修飾され、その設計は、受容体を標的とするＣＰＰ内の同様の修飾が、多機能性ペプチド複合体によって媒介される遺伝子サイレンシングの増強につながる可能性があるという証拠に基づいていた（Jun, et al. PLoS One, 2015. 10(2): e0118310）。興味深いことに、立体化学的に修飾されたペプチドと、蛍光体標識ｓｉＲＮＡと複合体形成したＲＤ３ＡＤの両方の細胞取り込みパターンの共焦点蛍光顕微鏡分析は、ＲＤ３ＡＤを除くすべてのペプチド変種が主にランダムな斑点状パターンを示し、５９９と同様に、その病巣は大きく、数が少なくなるが、違いは、ＲＤ３ＡＤはまた、高度に秩序化された線形の斑点状の取り込みパターンと、多数の大小の病巣の両方を示したことである。従って、ＲＤ３ＡＤの細胞取り込みパターンのこれらの違いは、ＲＤ３ＡＤ－ｓｉＲＮＡ複合体で処理された細胞内に見られるｓｉＲＮＡの検出可能なレベルが高いことを説明できる可能性があり、５９９及び他のペプチド変種と比較して、別の及びより効率的な細胞侵入様式を示している可能性がある。
５９９ペプチドの特性に対する立体化学的修飾とＤ－アミノ酸置換の効果をさらに分析すると、細胞毒性に関して、５９９と比較して、また未処理の細胞に対しても同様に、処理された細胞の長期生存率に影響を与える能力において有意に異なるペプチド変種はなかった（後者の比較は５９９にも当てはまり、ｓｉＲＮＡと複合体形成した５９９処理は非細胞毒性であるというCantini, et al.の以前の知見を裏付けている）。逆に、ｓｉＲＮＡの安定性に関しては、データは、これらの修飾が複合体形成したｓｉＲＮＡの保存に重要な役割を果たしていることを示唆しており、特に５９９設計のポリアルギニン片内のＬ／Ｄ－アルギニンは、ＲＮａｓｅ／血清媒介性分解に対する複合体形成されたｓｉＲＮＡの感受性の決定要因であるようであった。興味深いことに、ノナ－アルギニン片の中央のアルギニン残基（＃４、５、及び６）は、複合体の安定性を決定する鍵であると思われ、ＲＤ４５６は、その複合体形成ｓｉＲＮＡが直接のＲＮａｓｅ処理に感受性である唯一のペプチド変種であることが判明し、約２５％のｓｉＲＮＡが分解された。さらに、血清（これはプロテアーゼとヌクレアーゼの両方を含む [Whitehead, et al. Nat Rev Drug Discov, 2009. 8(2): 129-138; Pujals, et al. Biochem Soc Trans, 2007. 35(Pt 4): 794-796; Guidotti, et al. Trends Pharmacol Sci, 2017 38: 406-424] ）の存在下で、ノナアルギニン片の４、５、及び６位にＬ－アルギニンを持っていたペプチドＡｌｌ－Ｌ、ＲＤ１９、ＲＤ１２３７８９、及びＩＮＦ７Ｄはすべて、５９９と比較して、複合体形成したｓｉＲＮＡを保護する能力が有意に低く、分解は約２０～６０％の範囲であり、一方、ＲＤ４５６は発現できたという事実は、これらの３つの位置でのＬ－アミノ酸のキラリティの取り込みは、複合体がタンパク質分解消化を受けやすくなり、結果的にｓｉＲＮＡが血清ヌクレアーゼに曝されて不安定化するため、避けるべきであったことを示した。従って、ＲＤ４５６設計により、ペプチドがｓｉＲＮＡカーゴのＲＮａｓｅ媒介性分解を受けやすくなり、ポリアルギニン片（Ａｌｌ－Ｌ、ＲＤ１９、ＲＤ１２３７８９、及びＩＮＦ７Ｄ）の中央領域内にＬ－アルギニンを維持すると、ペプチドがプロテアーゼ分解を受けやすいため、これらの特定の修飾は、５９９ペプチド設計の進歩において避けるべきであったと思われた。ｓｉＲＮＡ放出に関するデータはまた、５９９ペプチド担体設計内の交互のアミノ酸立体化学の組み込みが、複合体からの効率的なｓｉＲＮＡ放出を確保する上で重要な要因であると思われ、９０％以上のｓｉＲＮＡ放出を占めることも示しており、放出能力が最も低い３つのペプチドのうちの２つは、単一アミノ酸の立体化学（Ａｌｌ－Ｌ又はＡｌｌ－Ｄ）で含んでいた。興味深いことに、Ａｌｌ－ＬとＡｌｌ－Ｄの間でｓｉＲＮＡ放出能力が劣っていることが同等であることは、Favretto et al. (Favretto, ME, and Brock, R, Small, 2015, 11: 1414-1417) による以前の研究からの知見を裏付けるものであり、これが、同様に、すべてのＤ－ＣＰＰ又はすべてのＬ－ＣＰＰを含むポリプレックスはバラバラになる可能性が低く、高ペプチド濃度で処方された場合、ヘパリンの存在下で同様に安定であることを見いだした。まとめると、これらのデータは、Ａｌｌ－Ｌ及びＡｌｌ－Ｄによって媒介されるｓｉＲＮＡの放出が乏しいのは、単一アミノ酸の立体化学ペプチド設計によって付与されたより大きな複合体の安定性の結果であることも潜在的に示唆していた。しかし、ｓｉＲＮＡの静電的な複合体形成に関与している（Cantini, et al. PLoS One, 2013. 8(9): e73348）ポリアルギニン片内の他のすべてのアミノ酸のキラリティーを変化させることは、複合体からのｓｉＲＮＡの放出も同様に不十分であることにも注意する必要がある。驚くべきことに、ＲＤ３ＡＤのポリアルギニン片内のＤ－アラニンの３番目のＤ－アルギニンによる置換は、ｓｉＲＮＡの放出には依然として非常に効果的であるが、Jun et al. により、ｓｉＲＮＡの送達のための多機能性ペプチド複合体の彼らの研究（Jun, et al. PLoS One, 2015. 10(2): e0118310）において報告されたように、ペプチド複合体からのｓｉＲＮＡ放出の増強を普遍的に付与しなかった（少なくとも親ペプチドと比較して）。従って、ｓｉＲＮＡとペプチド担体間の静電的相互作用を低下させるための、ポリアルギニン片への非荷電アミノ酸の導入は、必ずしもｓｉＲＮＡの大きな放出をもたらさない。しかし、興味深いことにJun et al. の研究は、彼らのペプチド担体の設計における置換アラニン残基のキラリティーを明らかにしておらず、従って、知見中のこの不一致がアミノ酸の立体化学の違いに関連しているという可能性が開かれた。
上記の機能特性の違いにもかかわらず、５９９ペプチド担体の設計におけるＬ／Ｄ－アミノ酸配列パターンの修飾により、標的であるＣＩＰ２Ａ癌遺伝子の効果的な遺伝子サイレンシングがまだ得られ、約５０～７０％の範囲のノックダウンが起きた。しかし、約８０％の最大のサイレンシングを示したのは、特定のＤ－アミノ酸置換を有するＲＤ３ＡＤであった。さらに、ほとんどのペプチド変種は改善を示したが、ＲＤ３ＡＤとＡｌｌ－Ｌのみが、５９９よりも遺伝子サイレンシングでそれぞれ約３０％と約２０％と、より有意に効率的であることが分かった。５９９と比較してＡｌｌ－Ｌが遺伝子サイレンシングでより効率的であるという観察は、Zeller et al. の研究を考慮すると予想できないことではなかった。Zeller et al. は、Ｄ－アルギニンが豊富なＣＰＰではなく、Ｌ－アルギニンが豊富なＣＰＰが、複合体形成ｓｉＲＮＡのエンドソームから細胞質へのより効果的な移行を可能にするために、エンドソームプロテアーゼによるアルギニンが豊富なＣＰＰの部分的な分解の必要性により、遺伝子サイレンシングの動力学を延長できることを報告した（Zeller, et al. Chem Biol, 2015. 22(1): 50-62）。５９９－ｓｉＲＮＡ複合体と比較して、Ａｌｌ－Ｌ－ｓｉＲＮＡ複合体が血清中で不安定であることが判明したという事実は、その設計がタンパク質分解の影響をより受けやすく、従ってエンドソームからサイトゾルへのｓｉＲＮＡの移行に優れていることを示唆した。しかし、ＩＮＦ７Ｄについては同じことが言えず、ＩＮＦ７Ｄは、すべてＬ－アミノ酸のポリアルギニン片を含み、その複合体は血清中で最も不安定であったが、同時にｓｉＲＮＡの細胞取り込みが最も少なく、これが拮抗作用をして、ＩＮＦ７Ｄがペプチド変種の中で最も弱い遺伝子サイレンシング効果を有することに寄与した可能性が高い。
最後に、ＲＤ３ＡＤが最も増強されたｓｉＲＮＡ送達を示し、さらに２Ｄ／３Ｄ共焦点蛍光イメージングによって確証され、その結果、より大きな遺伝子サイレンシングが示されたという知見は、その細胞侵入モードが、５９９及び他のペプチド変種と比較して潜在的により効率的であることを示唆したため、重要である。実際、ＲＤ３ＡＤ－ｓｉＲＮＡ複合体が細胞表面の糸状仮足に沿って局在できるという発見は、特にウイルス、活性化受容体、リポ／ポリプレックス、及びエキソソームが糸状仮足に結合し、細胞に入るために細胞体に向かって、急速な、しかし指令された逆行する「サーフィン」運動を誘導するという事実（Heusermann, et al. J Cell Biol, 2016. 213(2): 173-184; Lehmann, et al. J Cell Biol, 2005. 170(2): 317-25; Lidke, et al. J Cell Biol, 2005. 170(4): 619-26; ur Rehman, et al. ACS Nano, 2012. 6: 7521-7532）の観点から、この考えを支持した。特に注目に値するのは、糸状仮足の基部はエンドサイトーシスのホットスポットであり、これは、密な皮質アクチン細胞骨格のために貫通がより困難な細胞膜に沿う他の部位と比較して、細胞への侵入を容易にする可能性があるアクチンリモデリングの活性領域として記載されている（Lehmann, et al. J Cell Biol, 2005. 170(2): 317-25）。興味深いことに、エキソソームの場合、これは、カーゴ放出の可能性のある部位として、小胞体（ＥＲ）を標的とする糸状仮足の基部にあるエンドソーム輸送回路に分類されることがわかっている（Heusermann, et al. J Cell Biol, 2016. 213(2): 173-184）。偶然にも、ＥＲはまた、ｓｉＲＮＡを介するサイレンシングの中心的な核形成部位としても同定されている（Stalder, et al. EMBO J, 2013. 32: 1115-1127）。従って、このように糸状仮足に沿ったエンドサイトーシスのホットスポットへの指令された輸送に続いて、エンドサイトーシスとＥＲへの輸送が行われると、ペプチド担体によって利用される可能性のある細胞のＲＮＡｉ機構へのｓｉＲＮＡカーゴの効率的な侵入が可能になる可能性がある。
結論として、我々のデータは、癌細胞における遺伝子サイレンシングの増強のために５９９担体設計を進める上での、ペプチド立体化学の有用性と重要なＤ－アミノ酸修飾の重要性をまとめて示している。さらにこの研究は、これらの立体化学を調節する際にペプチド担体の設計におけるバランスの必要性を明らかにするだけでなく、Ｌ／Ｄ－アミノ酸配列パターンを変更することにより、ペプチド担体の特性／機能を微調整する可能性も示している。今後の研究では、細胞取り込みのメカニズムをさらに明確に説明し、５９９ペプチド担体設計におけるペプチドの立体化学及び／又は特定のＤ－アラニン置換が、糸状仮足などの宿主細胞機構を利用して、細胞へのより効率的なｓｉＲＮＡ薬物侵入を達成する方法を詳述することは興味深いであろう。さらに、今後の研究では、ＲＤ３ＡＤ－ｓｉＲＮＡ複合体の細胞内送達を媒介する際の糸状仮足の直接的な細胞取り込み作用を確認する必要もあり、これは、それぞれ糸状仮足を介する逆行性輸送と糸状仮足構造の既知の阻害剤であるサイトカラシンＤやＳＭＩＦＨ２などのいくつかの化学阻害剤を使用して試験されるであろう（Heusermann, et al. J Cell Biol, 2016. 213(2): 173-184; Rizvi SA, et al., Chem Biol, 2009, 16(11):1158-1168; Barry DJ, et al., J Cell Biol, 2015, 209(1):163-180; Isogai T, et al., Sci Rep, 2015, 5:9802）。さらに、リポ／ポリプレックスは、糸状仮足のシンデカン依存性輸送機構を使用して細胞表面に到達することが報告されているため、シンデカンの既知の破壊因子であるヘパリナーゼと塩素酸ナトリウム（ur Rehman Z, et al., ACS Nano, 2012, 6(8):7521-7532）が、同様に、糸状仮足を介するＲＤ３ＡＤ－ｓｉＲＮＡ複合体の細胞取り込みを損なう可能性があるかどうかを試験することも考えられるであろう。それにもかかわらず、メカノバイオロジーと３Ｄ構造の両方の観点から、ペプチド担体－ｓｉＲＮＡカーゴ複合体の形成／分解及び機能におけるこれらの修飾の将来の研究は、同様に魅力的であり、これは、５９９ペプチド担体設計のさらなる進歩と、ｓｉＲＮＡベースのヒト癌治療の送達ビヒクルとしての臨床への翻訳の可能性につながるであろう。
実施例２：５９９ペプチド誘導体のキラリティーと糸状仮足への局在化
口腔癌細胞上に見出される糸状仮足への複合体形成ｓｉＲＮＡの局在化の媒介におけるＲＤ３ＡＤペプチド内の特定のＤ－アミノ酸修飾（上記の実施例１の表１を参照；また、上記の組成物セクション内の表の配列番号２０も参照）の重要性を明確に説明するために、Ｄ－アラニンの代わりにＬ－アラニン置換を組み込んだＲＤ３ＡＬと名付けられたＲＤ３ＡＤの誘導体を設計及び合成した（上記の組成物セクション内の表の配列番号２０を参照）。優先事項は、まず、ＲＤ３ＡＤ設計内の置換アラニン残基のキラリティーが糸状仮足との関連を媒介する鍵であるかどうか、及びこの変化がＲＤ３ＡＤと比較して遺伝子サイレンシング効率に影響を与えるかどうかを判断することであった。
口腔癌細胞上に見出される糸状仮足への複合体形成ｓｉＲＮＡの局在化の媒介におけるＲＤ３ＡＤペプチド内の特定のＤ－アミノ酸修飾（上記の実施例１の表１を参照；また、上記の組成物セクション内の表の配列番号２０も参照）の重要性を明確に説明するために、Ｄ－アラニンの代わりにＬ－アラニン置換を組み込んだＲＤ３ＡＬと名付けられたＲＤ３ＡＤの誘導体を設計及び合成した（上記の組成物セクション内の表の配列番号２０を参照）。優先事項は、まず、ＲＤ３ＡＤ設計内の置換アラニン残基のキラリティーが糸状仮足との関連を媒介する鍵であるかどうか、及びこの変化がＲＤ３ＡＤと比較して遺伝子サイレンシング効率に影響を与えるかどうかを判断することであった。
ＲＤ３ＡＤ又はＲＤ３ＡＬと複合体形成したＤＹ５４７標識ｓｉＣＩＰ２Ａ（ＤＹ５４７－ｓｉＣＩＰ２Ａ）でＣＡＬ２７口腔癌細胞を処理すると、ＲＤ３ＡＬは、ＲＤ３ＡＤと同様に、細胞表面の突起に沿って均一な形状の球状ｓｉＲＮＡ含有病巣の高度に規則的な線状蓄積と細胞の細胞質内でのｓｉＲＮＡの蓄積とを、同様に生成できることがわかった（図９Ａ）。その後、細胞表面の突起に沿ったｓｉＲＮＡ含有病巣の線状蓄積は、糸状仮足と共局在していることが確認された（データは示していない）。その後の遺伝子サイレンシング実験（図９Ｂ）はさらに、ＲＤ３ＡＬ－ｓｉＣＩＰ２Ａ複合体で処理された癌細胞が、対照の非標的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ）と複合体形成したＲＤ３ＡＬと比較して、顕著なＣＩＰ２Ａノックダウンを媒介できること、及びサイレンシングがＲＤ３ＡＤ－ｓｉＣＩＰ２Ａ複合体で観察されたものに匹敵することを示した。さらに、ｓｉＲＮＡを結合、放出、及び保護する能力において２つのペプチド間で違いが観察されなかったという事実（データは示していない）は、元のＲＤ３ＡＤ設計内の置換アラニン残基のキラリティーが、そのユニークな特性を媒介するのに重要ではないことを意味した。しかしこれは、ＲＤ３ＡＤ設計のノナアルギニン片内のアラニンの配置が依然として要因であるかどうかを排除するものではない．
次に、ｓｉＲＮＡと複合体を形成したＲＤ３ＡＤ及びそのペプチド変種の細胞内取り込みにおいて、糸状仮足が果たす可能性がある直接的な役割を決定するために分析が行われた。興味深いことに、糸状仮足に局在し、逆行性輸送を媒介することが知られているＨＳＰＧのファミリーであるシンデカン（ur Rehman Z, et al., ACS Nano, 2012, 6(8):7521-7532；Schelhaas M, et al., PLoS Pathog, 2008, 4(9):e1000148）を含むヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）（ur Rehman Z, et al., ACS Nano, 2012, 6(8):7521-7532）の硫酸化を阻害する塩素酸ナトリウムによる癌細胞の前処理は、ＲＤ３ＡＤが糸状仮足と相互作用してｓｉＲＮＡを細胞に送達する能力を妨害した（図１０Ａ）。逆に、糸状仮足と結合しない５９９ペプチド（上記実施例１の図７を参照）は、複合体形成ｓｉＲＮＡを細胞に送達する能力に影響を受けなかった。さらに、癌細胞を阻害剤ＳＭＩＦＨ２で前処理すると、糸状仮足が失われ（Heusermann, et al. J Cell Biol, 2016. 213(2): 173-184; Rizvi SA, et al., Chem Biol, 2009, 16(11):1158-1168; Barry DJ, et al., J Cell Biol, 2015, 209(1):163-180; Isogai T, et al., Sci Rep, 2015, 5:9802）、ｓｉＲＮＡを細胞に送達するＲＤ３ＡＤの能力を無効にした（図１０Ｂ）。従って、これらの知見の重要性は、これらが、ペプチド担体－ｓｉＲＮＡ複合体の細胞内送達の媒介における糸状仮足の直接的な役割についての最初の証拠を提供していることである。さらに、これらのデータはまた、ＲＤ３ＡＤ／Ｌなどの特定の５９９ペプチド誘導体を、細胞表面の糸状仮足を特異的に標的とするように設計でき、これが、特に豊富な糸状仮足を有する転移細胞に関して、癌介入のためのより効果的なターゲティング送達プラットフォームの開発に役立つことが証明される可能性を示している（Han S, et al., Mol Oncol, 2016, 10(7):966-980; Coopman PJ, et al., Clin Cancer Res, 1998, 4(2):507-515; Wang W, et al., Cancer Res, 2002, 62(21):6278-6288）。
実施例３：ＲＤ３ＡＤは二重ペプチドシステムにおけるｓｉＲＮＡ送達と遺伝子サイレンシングを増強する
以前の研究は、ＥＧＦＲを標的とするＧＥ１１Ｒ９ペプチドがｓｉＲＮＡをＥＧＦＲ過剰発現細胞に特異的に送達できたが、ｓｉＲＮＡはエンドソームを回避して効果的な遺伝子サイレンシングを媒介することができなかったことを示している（Alexander-Bryant, et al. Oral Oncol, 2017. 72: 123-131）。しかし、エンドソーム破壊性の５９９ペプチドと組み合わせて使用すると、二重ペプチドシステムは、ＥＧＦＲ過剰発現細胞へのｓｉＲＮＡの効率的なターゲティングとｓｉＲＮＡ特異的癌遺伝子のサイレンシングの両方をもたらした（Alexander-Bryant, et al. Oral Oncol, 2017. 72: 123-131）。ＲＤ３ＡＤが、検討した５９９誘導体の最も増強されたｓｉＲＮＡ送達と遺伝子サイレンシングを示したという実施例１の知見のフォローアップとして、二重ペプチド送達システムの一部としてＧＥ１１Ｒ９と組み合わせて使用した場合のＲＤ３ＡＤの効果を調べた。
以前の研究は、ＥＧＦＲを標的とするＧＥ１１Ｒ９ペプチドがｓｉＲＮＡをＥＧＦＲ過剰発現細胞に特異的に送達できたが、ｓｉＲＮＡはエンドソームを回避して効果的な遺伝子サイレンシングを媒介することができなかったことを示している（Alexander-Bryant, et al. Oral Oncol, 2017. 72: 123-131）。しかし、エンドソーム破壊性の５９９ペプチドと組み合わせて使用すると、二重ペプチドシステムは、ＥＧＦＲ過剰発現細胞へのｓｉＲＮＡの効率的なターゲティングとｓｉＲＮＡ特異的癌遺伝子のサイレンシングの両方をもたらした（Alexander-Bryant, et al. Oral Oncol, 2017. 72: 123-131）。ＲＤ３ＡＤが、検討した５９９誘導体の最も増強されたｓｉＲＮＡ送達と遺伝子サイレンシングを示したという実施例１の知見のフォローアップとして、二重ペプチド送達システムの一部としてＧＥ１１Ｒ９と組み合わせて使用した場合のＲＤ３ＡＤの効果を調べた。
図１１Ａに示されるように、ＧＥ１１Ｒ９と組み合わせたＲＤ３ＡＤは、ＥＧＦＲ過剰発現ＣＡＬ２７癌細胞へのｓｉＣＩＰ２Ａの送達と、ＣＩＰ２ＡｍＲＮＡの約６２％のノックダウンを示した。比較すると、５９９とＧＥ１１Ｒ９は、ＣＩＰ２ＡｍＲＮＡを約４８％ノックダウンした。これは、ＲＤ３ＡＤと５９９の両方をＧＥ１１Ｒ９と組み合わせて使用した場合、５９９と比較して、ＲＤ３ＡＤの約３０％の遺伝子サイレンシングの倍率変化に対応する（図１１Ｂ）。最後に、ＧＥ１１Ｒ９の効果は特異的であることが示され、ＲＤ３ＡＤと５９９の両方が、スクランブルされたコントロールペプチドであるＧＥ１１ＳＣＲ９と比較して、ＧＥ１１Ｒ９と組み合わせて使用した場合、ＣＡＬ２７細胞中のＣＩＰ２Ａをノックダウンするのに実質的により効率的であった（図１１Ｃ）。特に、５９９ペプチドに対するＲＤ３ＡＤの効率の向上は、スクランブルされたペプチドに対して正規化した場合でも維持された。
これらの結果は、Ｄ－アミノ酸置換を行い、立体化学を変更することにより、ｓｉＲＮＡ送達システムとして５９９ペプチドがさらに最適化された実施例１の知見は、二重ペプチドシステムに応用できることを示すを証明している。より詳しくは、この結果は、５９９よりも効率的なｓｉＲＮＡ送達ビヒクルであることが示されたＲＤ３ＡＤが、ＧＥ１１Ｒ９などのターゲティングペプチドと組み合わせて使用された場合、この効率の上昇を維持することを示唆している。従って当業者は、ＧＥ１１Ｒ９などのターゲティングペプチドと組み合わせて使用する場合、本発明の５９９誘導体を使用して、インビボで細胞療法の一形態としてｓｉＲＮＡを特定の細胞型に効率的に送達して、疾患又は障害を治療又は予防することができる方法を理解することができるであろう。
実施例４：５９９は複数のｓｉＲＮＡ種と同様に相互作用する
実施例１、２、及び３で証明されたように、５９９及びその誘導体は、特により高いペプチド：ｓｉＲＮＡモル比（＞３０：１）で、ｓｉＣＩＰ２Ａに効率的に結合することができる。これにより、細胞へのｓｉＣＩＰ２Ａの効率的な送達と、その後の腫瘍癌遺伝子ＣＩＰ２Ａのノックダウンが可能になる。これらの実施例のフォローアップとして、５９９への代替ｓｉＲＮＡの結合を調べて、観察された結果が、ｓｉＲＮＡ特異的であるか又は広範囲のｓｉＲＮＡ種により広く適用可能であるかを決定した。
実施例１、２、及び３で証明されたように、５９９及びその誘導体は、特により高いペプチド：ｓｉＲＮＡモル比（＞３０：１）で、ｓｉＣＩＰ２Ａに効率的に結合することができる。これにより、細胞へのｓｉＣＩＰ２Ａの効率的な送達と、その後の腫瘍癌遺伝子ＣＩＰ２Ａのノックダウンが可能になる。これらの実施例のフォローアップとして、５９９への代替ｓｉＲＮＡの結合を調べて、観察された結果が、ｓｉＲＮＡ特異的であるか又は広範囲のｓｉＲＮＡ種により広く適用可能であるかを決定した。
図１２Ａに示されるように、ｓｉＣＩＰ２Ａと、Ｄｉｃｅｒ１を標的とする無関係のｓｉＲＮＡであるｓｉＤｉｃｅｒ１の両方が、３０：１を超えるペプチド：ｓｉＲＮＡのモル比で５９９ペプチドに同様に結合することができ、結合はほぼ１００％である。さらに５９９ペプチドはまた、ＨＰＶ Ｅ６癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡであるｓｉＥ６に、同様の効率で、特に５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比で結合することもできる（図１２Ｂ）。さらに、５９９に結合した場合の、ヘパリンを使用するｓｉＥ６の放出（図１２Ｃ）とＲＮＡｓｅＡからの保護（図１２Ｄ）は、特に５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比で、５９９及びその誘導体と複合体形成したｓｉＣＩＰ２Ａで観察された結果に匹敵する。
これらの結果は、５９９ペプチドがｓｉＣＩＰ２Ａ単独よりも広範囲のｓｉＲＮＡ種に広く適用できることを示唆している。従って当業者は、本明細書に記載された５９９及び誘導体を一連の異なるｓｉＲＮＡ遺伝子ターゲティング配列と組み合わせて（及び第２のターゲティングペプチドの存在下又は非存在下で）、様々な疾患又は障害を治療又は予防するために、どのように使用できるかを理解することができる。
実施例５：５９９ペプチドと別のカーゴ
５９９ペプチド及びその誘導体がｓｉＲＮＡに結合する能力が証明されたため、次に、本明細書に開示されたペプチドを介して別のカーゴを送達できるかどうかを評価した。まず、５９９ペプチドがプラスミドＤＮＡに結合する能力を有することが証明された。長さ４．３ｋｂのプラスミドＤＮＡは、５，０００：１のペプチド：ＤＮＡモル比で観察された最大の結合で、５９９ペプチドに結合することが証明された（図１３）。さらに、５９９：プラスミドＤＮＡ複合体が細胞に侵入し、プラスミドによってコードされるＧＦＰレポーターの発現によって証明されるように、プラスミドＤＮＡ発現をもたらすことができることが証明された（図１４）。第２に、５９９ペプチドは、特に２０：１を超えるペプチド：ｍＲＮＡモル比で、ｍＲＮＡに結合する能力を有することが証明された（図１５）。放出アッセイはまた、増加量のヘパリンを添加すると、５９９ペプチドが、その結合したｍＲＮＡカーゴを放出する能力を有することも証明された（図１６）。従って、これらの結果は、５９９ペプチド及びそれらの誘導体を含む本発明の組成物を使用して、プラスミドＤＮＡ及びｍＲＮＡなどの追加のカーゴを細胞に送達し、治療及び予防上の利益を得ることができることを示唆している。
５９９ペプチド及びその誘導体がｓｉＲＮＡに結合する能力が証明されたため、次に、本明細書に開示されたペプチドを介して別のカーゴを送達できるかどうかを評価した。まず、５９９ペプチドがプラスミドＤＮＡに結合する能力を有することが証明された。長さ４．３ｋｂのプラスミドＤＮＡは、５，０００：１のペプチド：ＤＮＡモル比で観察された最大の結合で、５９９ペプチドに結合することが証明された（図１３）。さらに、５９９：プラスミドＤＮＡ複合体が細胞に侵入し、プラスミドによってコードされるＧＦＰレポーターの発現によって証明されるように、プラスミドＤＮＡ発現をもたらすことができることが証明された（図１４）。第２に、５９９ペプチドは、特に２０：１を超えるペプチド：ｍＲＮＡモル比で、ｍＲＮＡに結合する能力を有することが証明された（図１５）。放出アッセイはまた、増加量のヘパリンを添加すると、５９９ペプチドが、その結合したｍＲＮＡカーゴを放出する能力を有することも証明された（図１６）。従って、これらの結果は、５９９ペプチド及びそれらの誘導体を含む本発明の組成物を使用して、プラスミドＤＮＡ及びｍＲＮＡなどの追加のカーゴを細胞に送達し、治療及び予防上の利益を得ることができることを示唆している。
本明細書で引用されたすべての特許、特許出願、及び刊行物の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明は、特定の実施態様を参照して開示されているが、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施態様及び変形態様が当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような実施態様及び同等の変形態様のすべてを含むと解釈されることを意図している。
Claims (27)
- ａ）５９９ペプチド（配列番号１）の誘導体を含むペプチドと、
ｂ）薬剤とを含む、薬剤の送達のための組成物。 - 配列番号１の誘導体を含む前記ペプチドが、配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基がアラニン残基で置換されているアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
- 配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基がＤ－アラニン残基で置換されている、請求項２に記載の組成物。
- 配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基が、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、及び３５からなる群から選択される番号のアミノ酸残基の位置で、Ｄ－アラニン残基で置換されている、請求項３に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の組成物。
- 配列番号１の誘導体を含む前記ペプチドが、配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基がＬ－アラニン残基で置換されているアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
- 配列番号１の少なくとも１つのＤ－アルギニン残基が、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、及び３５からなる群から選択される番号のアミノ酸残基の位置で、Ｌ－アラニン残基で置換されている、請求項３に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の組成物。
- 配列番号１の誘導体を含む前記ペプチドが、少なくとも１つのＤ－アルギニン残基がＬ－アルギニン残基で置換されているアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
- 配列番号１の誘導体を含む前記ペプチドが、少なくとも３つのＤ－アルギニン残基がそれぞれＬ－アルギニン残基で置換されているアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
- 配列番号１の誘導体を含む前記ペプチドが、配列番号１の少なくとも１つのＬ型残基が前記残基のＤ型で置換されているアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、配列番号７及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
- 前記薬剤が、核酸分子、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体断片、及び低分子からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
- 前記核酸分子が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、キラー－ｔＲＮＡ、ガイドＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムの一部）、ロング非コードＲＮＡ、抗ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、及びプラスミドＤＮＡからなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
- 前記ペプチドと前記薬剤が、約５：１～５０：１のモル比である、請求項１に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、腎クリアランスを防止するためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾を含む、請求項１に記載の組成物。
- 細胞に、ａ）５９９ペプチド（配列番号１）の誘導体を含むペプチドと、ｂ）薬剤とを含む組成物の有効量を接触させることを含む、薬剤を組成物を投与する方法。
- 被験体に、ａ）５９９ペプチド（配列番号１）の誘導体を含むペプチドと、ｂ）薬剤とを含む組成物の治療有効量を投与することを含む、それを必要とする被験体における疾患又は障害を治療する方法。
- 前記薬剤が前記疾患又は障害の少なくとも１つの症状を軽減する、請求項１９に記載の方法。
- 前記疾患又は障害が癌である、請求項１９に記載の方法。
- ターゲティング部分と密集したカチオン性アミノ酸残基のストレッチとを含む第２のペプチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記第２のペプチドが配列番号４１のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の組成物。
- 被験体に、請求項２２に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、それを必要とする被験体における疾患又は障害を治療する方法。
- ａ）５９９ペプチド（配列番号１）を含むペプチドと、
ｂ）プラスミドＤＮＡ及びｍＲＮＡからなる群から選択される１つ又はそれ以上を含む薬剤とを含む、薬剤の送達のための組成物。 - 細胞に請求項２５に記載の組成物の有効量を接触させることを含む、薬剤を前記細胞に投与する方法。
- 被験体に、ペプチドと薬剤とを含む組成物の治療有効量を、請求項２６に記載の方法に従って投与することを含む、それを必要とする前記被験体における疾患又は障害を治療する方法。
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