CN100368020C - 用于刺激细胞因子分泌和诱导免疫应答的组合物 - Google Patents

用于刺激细胞因子分泌和诱导免疫应答的组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN100368020C
CN100368020C CNB008137692A CN00813769A CN100368020C CN 100368020 C CN100368020 C CN 100368020C CN B008137692 A CNB008137692 A CN B008137692A CN 00813769 A CN00813769 A CN 00813769A CN 100368020 C CN100368020 C CN 100368020C
Authority
CN
China
Prior art keywords
lipid
odn
compositions
nucleic acid
granule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB008137692A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1501811A (zh
Inventor
S·C·森普尔
T·O·哈拉斯姆
S·K·克利穆克
L·D·科吉
J·L·布拉松
B·缪尔
M·J·霍普
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of British Columbia
Original Assignee
University of British Columbia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of British Columbia filed Critical University of British Columbia
Publication of CN1501811A publication Critical patent/CN1501811A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100368020C publication Critical patent/CN100368020C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/18—Type of nucleic acid acting by a non-sequence specific mechanism

Abstract

脂质-核酸颗粒即使当核酸与靶细胞中的编码序列不互补时也能提供治疗上的益处。已发现脂质-核酸颗粒(包括含有非序列特异性寡脱氧核苷酸)可用于刺激细胞因子分泌，从而增强受治疗的哺乳动物的整体免疫应答。另外，可通过施用与含有非序列特异性寡脱氧核苷酸的脂质-核酸颗粒结合的抗原性分子，诱导针对特定靶抗原的免疫应答。包括在脂质-核酸颗粒中的核酸可以是磷酸二酯(即由核苷酸残基与磷酸二酯键结合组成的寡脱氧核苷酸)或经修饰的核酸分子，它包含磷酸硫酯或其它经修饰的键，还可以是与人基因组非互补的核酸分子，因此它所产生的免疫刺激作用并不依赖于该核酸与被治疗的哺乳动物核酸之间常规的碱基配对的相互作用。特别是核酸可以适当的含有免疫刺激基序(如CpG基序)或免疫刺激回文序列。核酸颗粒中所含的阳离子脂质可以合适的选自DODAP、DODMA、DMDMA、DOTAP、DC-Chol、DDAB、DODAC、DMRIE、DOSPA和DOGS。另外，脂质颗粒可以适当的含有经修饰的聚集限制性脂质，如PEG-脂质、PAO-脂质或神经节苷脂。

Description

用于刺激细胞因子分泌和诱导免疫应答的组合物
发明背景
本文描述的本发明涉及用脂质配制的核酸组合物及其在哺乳动物中用于诱导免疫应答的方法。某些组合物使用其它组分，如抗原、其它治疗剂和/或其它组分，但这些额外组分不是所有应用必需的。
由于在1980年代中期已知核酸和其它大分子一样，可作为生物反应调节剂，并在体内给药后在哺乳动物中诱导免疫应答(Tokunaga等，1984；Shimada等，1985；Mashiba等，1988；Yamamoto等，1988；Phipps等，1988)。1990年代早期的几份出版物确立了免疫应答的刺激是由所用的核酸的特征决定的。重要的特征包括二级结构回文序列的存在(Yamamoto 1992a)和核酸的化学性质(即C核苷酸甲基化状态-由DNA的细菌或哺乳动物起源决定(Messina等，1991；Yamamoto 1992a)或核苷酸间键的化学性质，如磷酸硫酯(Piseteky和Reich 1993))；以及核苷酸序列的特定作用，如聚dG和CpG基序(Tokunaga等，1992；Yamamoto等，1992b；McInttyre，KW等，1993；Pisetsky和Reich，1993；Yamamoto等，1994；Krieg等，1995)。
提出这些免疫刺激序列(在本领域也称为免疫刺激序列或“ISS”)的作用机制与本领域熟知的“反义”或“基因表达”机制不同。这导致潜在明显不同的用途。Pisetsky DS 1996提出了其中一些不同的潜在用途，其它是本领域已知的。这些包括用游离形式的ISS作为免疫佐剂，作为与各种抗原联合的抗体(见PCT出版物WO 98/40100，Davis，HL等)，与其它生物活性剂的联合作用。还推测了避免产生免疫刺激作用的方法。
非常需要进一步利用ISS的发现，而开发与使用它们的治疗性产品。本发明的目的是提供脂质配制的核酸及其用于在哺乳动物中诱导免疫应答的方法。还有一个目的是提供脂质-核酸组合物，它使用其它成分例如抗原、其它治疗剂和/或其它成分，及其使用方法。
含有以脂质为载体的核酸组合物是本领域已知的。例如，国际专利出版物号WO 98/51278所述的脂质-反义核酸组合物，其中含有可质子化的脂质和聚集限制脂质的脂质混合物，以产生完全包裹核酸的颗粒。据信这些组合物在治疗上是有效的，例如当使用的反义核酸与编码核酸序列在靶细胞中互补时，肿瘤尺寸变小。
发明简述
现在我们惊奇的发现，即使当核酸与靶细胞中的编码序列不互补时，脂质-核酸颗粒也能提供治疗上的益处。因此，已发现可用脂质-核酸颗粒，包括那些含有非序列特异性的寡脱氧核苷酸，刺激细胞因子分泌，从而增强受治疗哺乳动物的整体免疫应答。另外，可将一种抗原分子与含有非序列特异性寡脱氧核苷酸的脂质颗粒联合给药，以诱导对特定靶抗原的免疫应答。
根据本发明，提供了一种对哺乳动物(包括人)产生治疗上的益处的方法，该方法通过制备一种含有完全被脂质制剂包被的核酸的脂质-核酸颗粒，其中脂质制剂含有阳离子脂质；和对哺乳动物施用该脂质-核酸颗粒实现。在本发明的一个实施例中，脂质-核酸颗粒中包含的核酸是一种可能不与特定细胞的特异性序列结合的核酸，但当与脂质颗粒联合施用时，有效刺激细胞因子的分泌。在本发明的第二个实施例中，抗原性分子与脂质-核酸颗粒结合，诱导对靶抗原特异性的免疫应答。
包含在脂质-核酸颗粒中的核酸可以是磷酸二酯(即含有通过磷酸二酯键连接的核苷酸残基的寡脱氧核苷酸)或经修饰的核酸，其包括磷酸硫酯或其它经修饰的键，可以是与人基因组不互补的，从而起到产生免疫刺激的作用，其方式是不依赖于核酸和受治疗的哺乳动物核酸之间的常规碱基配对的相互作用。特别是，核酸可以适当含有免疫刺激基序，如CpG基序或免疫刺激性回文序列。核酸颗粒中所含的阳离子脂质可以适当选自DODAP、DODMA、DMDMA、DOTAP、DC-Chol、DDAB、DODAC、DMRIE、DOSPA和DOGS。另外，脂质颗粒可含有经修饰的聚集限制性脂质，如PEG-脂质、PAO-脂质或神经节苷脂。
附图简述
图1A-C显示PEG-脂质体对免疫活性Balb/c小鼠(A)和缺乏免疫力的Balb/c裸鼠(B)和Balb/c SCID-Rag2小鼠(C)中重复给药的循环水平。
图2A和B显示核酸序列(A)和结构(B)对SALP(PEG-CerC20)消除的影响。
图3显示DNA与脂质比对脂质体回收的影响。
图4显示给药程序对快速消除应答发生的影响。
图5A和B说明PEG-脂质对含有ODN的脂质体快速消除的影响。
图6显示交叉研究的结果。
图7A和B显示实体瘤中AS4200的聚集。
图8A和8B说明c-myc/TCS的能力比游离c-myc高和反义/脂质比的影响。
图9显示包被的磷酸二酯ODN(INX-6298)在小鼠黑色素瘤B16中显示效力比游离INX-6298高。
图10显示15聚INX-6298在SCID-Rag2小鼠的DoHH2人淋巴瘤中的效力。
图11A和11B显示在体内DoHH2中对游离和AS4200INX-6295的剂量应答。
图12显示用各种c-myc和脂质制剂治疗的小鼠中脾重量的变化。
图13显示各种ODN对体外脾细胞增殖试验的促分裂作用。
图14显示促细胞分裂剂对照ODN INX-4420在体内显示对皮下黑色素瘤B16与LR-3280相似的活性。
图15显示在一脂质体中共同包被c-myc和常规药物，抑制肿瘤生长。
图16说明AS4204的免疫原性和用共包被的阿霉素的逆转。
图18A和B显示在重复施用INXC-6295后，肝脏中单核细胞和自然杀伤细胞活性提高。
图19A和B显示INX-6295/SALP治疗后，肝脏中NK1.1+/TCR细胞的增加。
图20显示INX-6295/SALP治疗后beige小鼠HMNC中细胞裂解活性的丧失。
图21显示施用游离和包被的PS ODN后HMNC的增加。
图22A和B显示SALP治疗后肝脏中NK1.1+/TCR-细胞的增加。
图23A-C显示施用游离和包被的PS ODN后HMNC群中自然杀伤细胞的激活。
图24A-C显示含有DODAC、DOTAP或DOTMA的lipoplex的转染情况。
图25显示lipoplex给药后会阴细胞渗出物的水平。
图26A-C显示lipoplex诱导的炎症与IFN-γ的产生增加有关。
图27显示lipoplex诱导NK细胞的激活。
图28A-D显示游离和脂质体c-myc PS ODN诱导的血清细胞因子。
图29A-D显示游离和脂质体c-myc PS ODN诱导的血清细胞因子。
图30A-D显示比较PO和PS ODN的细胞因子分泌比较试验的结果。
图31A和B显示IFN-γ诱导的两个阶段。
图32A和B显示在对应IFN-γ诱导时的第二阶段时的血清IL-12水平。
图33显示ODN剂量对血清细胞因子诱导的影响。
发明详述
就广义而言，本文描述的发明涉及脂质配制的核酸组合物，及其用于刺激细胞因子分泌和在哺乳动物中诱导对靶抗原免疫应答的方法。某些这样的组合物使用其它的成分如抗原、其它的治疗剂和/或其它成分，但这些其它的成分不是所有申请所必需的。
如本文说明书和权利要求中所用，术语“刺激细胞因子分泌”指作为给药的直接结果，施用本发明的组合物的器官分泌的一种或多种细胞因子量的提高。
本申请说明书和权利要求中使用的术语“诱导免疫应答”指初次免疫应答的产生或对靶抗原预先存在的免疫应答的增强。
A.脂质-核酸组合物
A.1核酸
本发明的每种组合物都含有核酸。可使用任何核酸，但常用的是大型双链质粒DNA(500-50,000bp)或8-50nt的短的单链寡核苷酸(有时称为ODN或寡脱氧核苷酸)。标准核酸包括核酸间的磷酸二酯键，但这些键可以是任何化学键，包括磷酸硫酯、磷酸酰胺等。还可有许多针对其它碱基、糖或键基团的化学修饰。碱基可以是甲基化或非甲基化的。优选核酸的化学性质是聚阴离子，与下文的优选制造方法相配合。核酸序列可以与病人/个体的mRNA互补，如反义寡核苷酸，或可以是外源或非互补的(意味着它们不能与病人/个体基因组专一性杂交)。序列可以是可表达的，如与合适启动子和表达元件连接的基因序列，通常作为更大的质粒构建物的一部分。序列可以是免疫刺激序列(“ISS”)，如某些回文序列，形成发夹二级结构(见Yamamoto S.等(1992)J.Immunol.148：4072-4076)或CpG基序(见下文)或其它已知的ISS特征(例如多G区域，见WO 96/11266)；或它们可以是非ISS序列，或可以是免疫中和基序，它抑制CpG基序的活性。许多ISS、非ISS和中和性基序是本领域熟知的。
作为CpG基序的ISS是特定旁侧碱基模式内的未甲基化的胞苷-鸟苷二核苷酸(Kreig，A.M.等(1995)Nature 374，546-549)。另见PCT出版号WO 96/02555；PCT出版号WO 98/18810；PCT出版号WO 98/40100；美国专利号5,723,335。CpG基序的前后碱基组成对于ISS活性是非常关键的，因为许多CpG基序没有免疫刺激性。对特定DNA序列免疫刺激性质的最剧烈的影响通常来自两个CpG二核苷酸旁侧的碱基(在5′和3′侧)改变。甚至一个改变可将ISS基序变成非ISS基序。另外背对背CpG二核苷酸，CCG三核苷酸或CGG三核苷酸单独或联合可以是中和性基序，封阻CpG基序的免疫刺激作用(Kreig，AM(1999)J Gene Med 1：56-63)。
ISS、非ISS和中和性基序序列可以是生物特异性的。在一个生物中序列的免疫刺激能力可以将待测的序列和其它佐剂相比较，或由测量宿主防御机制的激活，诱导免疫系统成分等实验确定，这些都是本领域熟知的。当非ISS序列以游离形式对未接种的哺乳动物给药时，不刺激免疫系统或诱导免疫应答。
A.2脂质和其它颗粒成分
除了核酸，本发明的组合物使用脂质，还可使用其它成分。
术语“脂质”指一组有机化合物，它是脂肪酸酯，其特征是不溶于水但溶于许多有机溶剂。它们通常分成至少三类：(1)“单脂”，包括脂肪和油，以及蜡；(2)“化合物脂”包括磷脂和糖脂；和(3)“衍生的脂质”，例如类固醇和衍生自脂质操作的化合物。本发明可使用各种各样的脂质，一些如下所述。
术语“带电荷的脂质”指一种脂质，带有正电荷或负电荷，或是一种未完全中性带电的两性离子，通常需要取决于该脂质所处的溶液pH。
生理pH下带正电荷的脂质包括但不限于氯化N，N-二油酰基-N，N-二甲基铵(“DODAC”)；氯化N-(2，3-二油酰氧基)丙基-N，N，N-三甲基铵(“DOTMA”)；溴化N，N-二硬酯酰基-N，N-二甲基铵(“DDAB”)；氯化N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基铵(“DOTAP”)；3β-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(“DC-Chol”)和溴化N-(1，2-二肉豆蔻氧基丙-3-基)-N，N-二甲基-N-羟乙基铵(“DMRIE”)。另外，可购得许多能用于本发明的阳离子脂质的商品。这些包括例如LipofectinTM(商品购得的阳离子脂质体，含有DOTMA和1，2-油酰基-sn-3-磷酯酰乙醇胺(“DOPE”)，来自GIBCO/BRL，Grand Island，New York，USA)；LipofectamineTM(商品购得的脂质体，含有N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N，N-二甲基三氟乙酸铵(“DOSPA”)和DOPE，来自GIBCO/BRL)；和TransfectamTM(商品购得的含有双十八烷基酰氨基甘氨酰基羧基精胺(“DOGS”)的乙醇溶液的阳离子性脂质体，购自Promega公司，Madison，Wisconsin，USA)。
一些带正电荷的脂质是可滴定的，即它们的pKa是或者接近生理pH值，这对于本发明有重要的意义，因为在温和的酸性条件下它们是强阳离子，而在生理pH值它们则表现为弱(或者没有)阳离子性。这些带正电荷的脂质包括但不限于氯化N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N-二甲基铵(“DODMA”)和1，2-二油酰基-3-二甲基丙铵(“DODAP”)。DMDMA也是有用的可滴定阳离子脂。
在生理pH下带负电荷的脂质包括但不限于：磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、二磷脂酰甘油、聚(乙二醇)-磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、双肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、脑磷脂酰丝氨酸等。
一些带负电荷的脂质是可滴定的，即它们具有生理pH或接近生理pH的pKa，这对于本发明有重要的意义，因为在温和的碱性条件中它们为强阴离子性，而在生理pH值它们则表现为弱(或者没有)阴离子性。本领域熟练技术人员可根据本文所公开的原理鉴定这些带负电荷的脂质。
术语“中性脂质”指在生理pH值以不带电荷或中性的两性离子的形式存在的许多脂质中的任何一种。这些脂质包括但不限于二酰基卵磷脂、二酰磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。
本发明使用的某些优选脂质制剂包括阻止聚集的脂质，如PEG-脂质或聚酰胺寡聚物-脂质(如ATTA-脂质)，和其他的空间屏障的脂质或“隐秘的”脂质。在Sears的美国专利4320121、Choi等人的5820873、Holland等人的5885613、WO98/51278(发明者为Semple等人)和涉及聚酰胺寡聚物的美国专利临时申请号09/218988中描述了这些脂质，在此引入以供参考。这些脂质和去污剂化合物防止含有相反电荷的脂质和治疗剂的制剂沉淀和聚集。这些脂质还可用于改善制剂在体内循环寿命(见Klibanov等(1990)，FEBS Letters，268(1)：235-237)，或者在体内选择，它们可快速的从制剂中被交换出来(见美国专利号5885613)。
本发明的一个优选例使用可交换立体屏障脂质(如美国专利号5,820,873、5,885,613和美国临时专利申请号09/094540和09/218988，转让给本发明的申请人，在此引入以供参考)。可交换立体屏障脂质，如PEG2000-Cer14和ATTA8-CerC14是立体屏障脂质，在施给个体/病人后，它们能迅速交换出脂质颗粒的外侧单层。每一种这样的脂质都具有交换出颗粒的特征性速率，由各种因素，包括酰基链长度、饱和度、立体屏障基团的大小、膜组分和血清组分等决定。这些脂质用于在颗粒形成过程中防止聚集，它们在给药后从颗粒加速分离提供了益处，例如可控融合性和颗粒去稳定活性，如上述提交的专利中所述的。
一些脂质颗粒制剂可以有针对某靶细胞或靶组织定位而设计的靶向分子部分。靶向分子可在配制过程中或配制后与脂质颗粒的外层双层结合。这些方法在本领域中熟知的。另外，一些脂质颗粒制剂可使用融合聚合物(如PEAA)、血球聚集素(hemagluttinin)、其他脂肽(参见美国临时专利申请号08/835281和60/083294，所有文献在此引入以供参考)和其他用于体内和/或细胞内传送的物质。
A.3其它药物组分
本发明的一些优选例还包括其它药物或生物活性成分。这些额外的成分可提供制剂的额外疗效或额外的免疫刺激作用。在下面的例子中，阿霉素(羟基柔红霉素)，一种熟知的化疗剂与核酸共同包裹在本发明的颗粒中。可以类似的使用其它药物或生物活性剂，视本发明所需的用途而定。细胞毒性剂包括所有具有细胞杀伤作用的化合物，包括但不限于环磷酰胺、达卡巴嗪(dicarbazine)、紫杉烷、喜树碱、长春新碱和其它长春生物碱、顺铂。其它特别的例子是用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的RITUXINTM(Rituximab)。可用抗菌剂，如环丙氟哌酸。总之，所有可掺入脂质颗粒的本领域已知的生物活性剂是额外组分的可能候选物。
在本发明的一个实施例中，可合适的提供与脂质-核酸颗粒结合的药物或其它生物活性剂。如本申请说明书和权利要求中使用的，术语“结合”指药物或生物活性剂与核酸共同包裹在脂质颗粒腔或片层内部空间内，沉积在或部分在脂肪膜内，或与脂质颗粒的外部结合(共价或离子形式)。
作为药物和生物活性剂与脂质颗粒结合的替代品，本发明的组合物可含有与脂质-核酸颗粒不结合的的药物或生物活性剂。这些药物或生物活性剂可以在独立的脂质载体中。例如，可用脂质体长春新碱(OncoTCSTM)。
A.4疫苗组分
本发明在此显示本发明的组合物引起对PEG-脂(一种常见的无免疫原性或免疫原性微弱的组合物)的强体液应答。本发明的一些实施例使用其它抗原分子，作为疫苗组合物的一部分。抗原分子可以是本身具有免疫原性的抗原，或它们可以是无免疫原性或免疫原性微弱的抗原。这些抗原包括外源或同源抗原，并包括HBA-乙肝抗原(重组或其它的)；其它肝炎肽；HIV蛋白GP120和GP160；支原体细胞壁脂质；任何肿瘤相关抗原；癌胚抗原(CEA)；其它作为肿瘤特异性抗原表达的胚性肽；细菌细胞壁糖脂；神经节苷脂(GM2、GM3)；分支杆菌糖脂；PGL-1；AG85B；TBGL；淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoae)的淋球菌脂-寡糖2C7表位；Lewis(y)；Globo-H；Tn；TF；Stn；PorA；TspA或病毒糖脂/糖蛋白和表面蛋白质等。
抗原分子可以是肽抗原形式，或可以是编码抗原性肽的核酸，其形式适合在受治疗的哺乳动物中表达，并递呈给免疫系统。抗原还可以是糖脂或糖肽。在任何情况下，抗原可以是完整抗原，或可以是完整抗原的片段，含有至少一个治疗相关表位。本申请所用的术语“治疗相关表位”指对该表位进行免疫应答将产生疗效。因此，该术语将排除高度免疫原性，但不产生针对完整抗原或抗原来源(例如细菌)的免疫应答的片段。联合含有多个来自相同靶抗原的表位或来自两种或多种不同靶抗原(多价疫苗)的表位的抗原。在后一种情况下，抗原可以是相同或不同类型的(例如肽+肽，糖脂+肽，糖脂+糖脂)。
本发明的疫苗组合物含有脂质-核酸颗粒和抗原性分子。在本发明的优选例中，抗原性分子与脂质-核酸颗粒结合。
接种本发明的疫苗可通过肌肉内或皮下注射。这减少了针对制备静脉内给药的组合物时需要的制造限制。特别是可用较大尺寸(150-300纳米)的脂质颗粒，它可以消除或减少昂贵的排除步骤的需要。另外，由于颗粒不需要循环，液体组分的选择可偏向较便宜的材料。例如，可减少Chol量，用刚性较小的物质，例如DOPC或DMPC代替DSPC，可用较便宜的PEG-乙酰链代替PEG-脂。
B.组合物的制造
B.1制造
可用任何技术制造和制备本发明的组合物，但最优选的是乙醇透析或去污剂透析法，在下面的出版物和专利申请中详述，全部在此引入以供参考：美国专利号5,705,385；美国临时专利申请号08/660,025；09/140,476；08/484,282；08/856,374；09/078954；09/078955；60/143,978；和PCT出版号WO 96/40964和WO 98/51278。
这些方法提供了小批量和大批量制造脂质-核酸颗粒，产生具有卓越药物特征(如下文C.2所述)的颗粒。在下面的例子中列出了这些技术的一些具体实施例。
除了去污剂透析和乙醇透析技术，可用经典的脂质体制造技术产生本发明的颗粒，虽然困难很大。在本领域中，包括上述专利文献，大量列出了传统技术，包括被动加药，主动加药(通过pH梯度)，脂膜重新水合，挤压/整形，脱水等。
类似的，可使用这些经典技术，在本发明的组合物中掺入额外的常规治疗剂。在脂质-核酸颗粒配好后，可实现含有细胞毒性化合物(如阿霉素)、长春生物碱(如长春花新碱和长春新碱)的叔胺或季胺。为了方便，颗粒的内部空间维持在原来配制步骤中的低pH4.2。在中和的颗粒混合物中简单加入治疗剂的中性缓冲溶液，足够对颗粒加药，正如本领域熟知的。
可通过在配制过程中将弱抗原加到需要应答的地方，或通过配制后操作来制备本发明的疫苗组合物。掺入抗原的方法包括：1.配制过程中的被动包裹(与ODN溶液一起放入)；2.对于糖脂和其它抗原性脂质，掺入脂质的乙醇混合物并用每种优选方案配制；3.后插入(即抗原-脂质可通过将胞膜与抗原-脂质微团一起培养，加到形成的载体中)；和4.后偶联(与包括在已制成颗粒中的具有连接基团的脂质进行后偶联)，连接在配制后被激活，与所需抗原偶联。标准偶联和交联方法是本领域已知的。另一种制备物将抗原掺入不含核酸的脂质颗粒，这些颗粒与脂质-核酸颗粒在施给病人前混合。
B.2本发明组合物特征的确定
不论用于制备的技术，本发明的组合物具有下列优选特征。
本发明的脂质-核酸颗粒含有脂膜(通常是磷脂双层)外部，其完全包裹内部空间。这些颗粒(有时在本文中称为脂膜小泡)是平均直径50-200纳米，优选60-130纳米的小颗粒。静脉内给药最优选的是粒径相对单一的颗粒，其中95％颗粒平均在30纳米内。核酸和其它生物活性剂包含在内部空间中，或与包裹膜的内表面结合。
“完全包裹”指颗粒中的核酸在与血清接触后或与显著降解游离DNA的核酸酶试验接触后不显著降解。在一个完全包裹的系统中，优选少于25％的颗粒核酸在通常被降解100％游离核酸的处理中降解，更优选少于10％，最优选少于5％颗粒核酸降解。另外，可用OligreenTM试验确定完全包裹。完全包裹还提示颗粒是对于血清稳定的，即它们在体内施用后不能快速分解成其组成部分。
这些特征从脂质-核酸聚集物(也称为阳离子复合物或脂复合物)，例如DOTMA/DOPE(LIPOFECTINTM)制剂中鉴别出本发明的关键颗粒。这些聚集物通常直径大得多(＞250纳米)，不能经受核酸酶消化，而且通常在体内给药后分解。如上所述阳离子脂质-核酸聚集物与弱抗原的制剂可提供局部和区域性应用，如肌肉内、腹膜内和鞘内给药的合适疫苗。
本发明的颗粒可以各式各样的药物∶脂质比配制。如本文所用的“药物∶脂质比”意味着治疗性核酸量(即包裹的和在接触血液后不迅速降解的核酸量)在一定体积的制备物中除以相同体积中脂质的量。这可以摩尔比摩尔或重量比重量确定。药物∶脂质比确定与给定剂量的核酸结合的脂质剂量；注意药物∶脂质比的最高可能药物不一定是最强的制剂。本发明的颗粒用于0.001-0.45药物脂质比(w/w)。
除了弱抗原与颗粒(共价或非共价)结合以外，疫苗组合物与本发明的其它颗粒类似。
C.脂质-核酸组合物的用途
广义上，本文描述的本发明涉及脂质配制的核酸组合物及其在哺乳动物中诱导免疫应答的方法。本发明相对现有技术的免疫刺激性核酸应用具有几点显著而惊人的优点，包括：
1.与核酸的游离制剂相比，使用的脂质制剂将核酸传递给不同细胞和免疫系统成分，将其以不同方式递呈给这些细胞和成分，因此赋予显著不同和提高的免疫应答，其中一些在下面的实施例中说明；
2.与核酸的游离制剂相比，脂质制剂需要相对量较少的寡核苷酸赋予免疫应答，从而降低了成本和潜在的毒性。
3.脂质制剂可运送磷酸二酯寡核苷酸，用于免疫刺激，这是不能以游离形式运送的化学物质。
4.可正常的将非ISS核苷酸转化成ISS核酸，从而建立了一类新ISS。
5.可用核酸的脂质体制剂产生一类更强大的疫苗，因为需要产生免疫应答的弱免疫原可直接和天然的与制剂结合，从而导致对免疫原不同的增强免疫应答，与简单混合佐剂和免疫原(如PCT出版物WO 98/40100，发明人Davis等)相反。
6.使用脂质制剂被公认为在使核酸获得直接的“反义”效果上有作用(见：美国专利号5,705,385；美国专利临时申请号08/660,025；09/140,476；08/484,282；08/856,374；09/078954；09/078955；60/143,978；和PCT出版物号WO 96/40964和WO 98/51278，在此引入以供参考)本发明的制剂可导致协同免疫应答和与治疗疾病相结合的反义作用。
7.共同施用含有核酸的脂质制剂和细胞毒性剂(如阿霉素)可导致协同免疫应答和细胞毒性作用，它与治疗疾病有关。
8.核酸脂质制剂在对游离形式ISS核酸不反应体内模型中具有疗效。
在下文的一个或多个例子中说明了每一个优点。
“免疫刺激”或“诱导免疫应答”通常定义为免疫系统细胞或成分对干涉的直接或间接反应。这些应答可用许多方法测量，包括免疫系统细胞(B细胞、T细胞、树突细胞、抗体生成细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞等)的激活、增殖或分化，标记、细胞因子、干扰素表达的上调或下调，IgM和IgG在血清中的释放，脾肿大(包括增加的脾细胞细胞构成)，增生和各种器官中混合细胞渗出物。许多更强的应答和许多其它免疫系统细胞和成分是本领域已知的。另外，刺激和应答可以是先天性免疫系统细胞的，或后天免疫系统细胞(例如通过含有正常的弱抗原的疫苗)。免疫刺激可以用基于其它核酸的可能作用机制鉴别，例如直接反义作用(通过与mRNA的杂交)或基因表达(如通过质粒)，然而结果中疗效的理想结果并不必鉴定。
D.适应症、给药和剂量
在其它东西中，本发明的组合物和方法适用于任何需要免疫系统刺激的病人或生物。这可包括许多医学领域，如癌症学、炎症、关节炎和风湿病学、免疫缺陷性疾病等。本领域熟练技术人员能根据本文的公开内容选出合适的指标来测试效力。在一个优选例中，本发明的组合物和方法被用于治疗肿瘤(任何病理性或可能是病理性的肿瘤细胞生长)，例如下文实施例中所述的肿瘤。
对个体/病人施用本发明的组合物可以是任何方法，包括体内或体外方法。体内方法可包括局部、区域性或全身性给药。在一个优选例中，静脉内施用组合物，使颗粒能到达病人内的B细胞、巨噬细胞或脾细胞，和/或颗粒能刺激淋巴细胞增殖，导致所述病人中IL-6、IL-12、IFNγ和/或IgM的分泌。
本领域熟练技术人员知道如何鉴定制剂的潜在毒性，例如补体激活、聚集、肾毒性、肝酶试验等。这些毒性在机体之间可以是不同的。在下面的实施例中，如果鉴定出就报道毒性；在达600毫克/公斤脂质剂量下，在啮齿类中未观察到毒性(除了重复给药情况下鉴定的)。
组合物的药物制备物通常使用其它载体，来促进或辅助运送模式。通常本发明的组合物将在生理学上可接受的载体，例如根据标准药物学实践选出的生理盐水或磷酸缓冲盐中施用。其它合适的载体包括水、0.9％盐水、0.3％甘氨酸等，包括用于增强稳定性的糖蛋白，如清蛋白、脂蛋白、球蛋白等。
脂质-核酸颗粒的剂量由所需的脂质剂量、所需的核酸剂量和组合物的药物∶脂质比决定。在哺乳动物中，典型的脂质剂量是0.5毫克/公斤-300毫克/公斤之间。给药后网状内皮系统(RES)细胞(如肝脏的Kupffer细胞)立即清除了大量脂质，因此通常需要最小脂质剂量来饱和RES，使颗粒循环。核酸剂量优选是0.01毫克/公斤-60毫克/公斤之间。通常哺乳动物将接受药物∶脂质比为0.01-0.25的制剂，因此将接受100毫克/公斤脂质和1-25毫克/公斤。灵长类剂量通常是5-50毫克/公斤脂质和0.005-15毫克/公斤ODN。本领域熟练技术人员能根据本文提供的信息选择正确的剂量。
E.实施例：
材料和方法
寡脱氧核苷酸(“ODN”)和质粒DNA。这些研究中使用的命名和ODN的5′-3′序列(在括号中含有已知的描述)和质粒如下：
hICAM或INX-2302(人ICAM-1mRNA的3′非翻译区)(PO&PS)；
GCCCAAGCTGGCATCCGTCA        SEQ ID NO.1
mICAM或INX-3082(小鼠ICAM-1mRNA的3′非翻译区)(PO&PS)
TGCATCCCCCAGGCCACCAT        SEQ ID NO.2
EGFR(人表皮生长因子mRNA，受体翻译终止密码子区)；
CCGTGGTCATGCTCC             SEQ ID NO.3
c-myc或INX-6295(人/小鼠c-myc原癌基因mRNA)(PS和甲基化PS)；
TAACGTTGAGGGGCAT            SEQ ID NO.4
c-myc或INX-3280或LR-3280(人/小鼠c-myc原癌基因mRNA的起始密码子)(PS)；
AACGTTGAGGGGCAT             SEQ ID NO.5
c-myc或INX-6298(人/小鼠c-myc原癌基因mRNA的起始密码子)(PO&PS)；
AACGTTGAGGGGCAT             SEQ ID NO.5
c-myc或INX-6300(与INX-6295类似的非-ISS对照组合物)
TAAGCATACGGGGTGT            SEQ ID NO.6
LR-4420(与INX-6295类似的ISS对照组合物)
AACGAGTTGGGGCAT             SEQ ID NO.7
LR-3001或INX-3001(与c-myb mRNA杂交)；
TATGCTGTGCCGGGGTCTTCGGGC    SEQ ID NO.8
IGF-1R或INX-4437(与IGF-1R mRNA杂交)；
GGACCCTCCTCCGGAGCC          SEQ ID NO.9
INX-6299(INX-6298的对照PO)
AAGCATACGGGGTGT             SEQ ID NO.10
INX-8997(含有3CpG基序的对照)(PO&PS)
TCGCATCGACCCGCCCACTA        SEQ ID NO.11
使用的质粒DNA是荧光酶表达质粒，pCMV luc18(也称为pCMVLuc)。质粒在大肠杆菌中产生，如前所述分离和纯化(Wheeler，J.J.，Palmer，L.，Ossanlou，M.，MacLachlan，I.，Graham，R.W.，Zhang，Y.P.，Hope，M.J.，Scherrer，P.& Cullis，P.R.(1999)Gene Ther.6，271-281)。(另见Mortimer I，Tam P，MacLachlan I，Graham RW，SaravolacEG，Joshi PB阳离子脂质介导的培养物基的细胞转染需要有丝分裂活性。GeneTher.1999；6：403-411)。
磷酸二酯(PO)和磷酸硫酯(PS)ODN购自Hybridon Specialty Products(Milford，MA)或在Inex Pharmaceuticals(Bumaby，BC，Canada)合成。用标准技术在InexPharmaceuticals(USA)，Inc.(Hayward，CA)制备甲基化ODN。用31P-NMR确定了骨架组成。特别分析了所有ODN的内毒素，含量小于0.05EU/毫克。
实施例1
该系列实施例在其中说明了当脂质体含有核酸时，含有聚乙二醇-脂质偶联物的立体稳定的脂质体是免疫原性的，并鉴定了这些组合物的用途。
化学物质和脂质DSPC(1，2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和与聚乙二醇偶联的二硬酯酰磷酯酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)购自Avanti Polar Lipids(Pelham，AL)或Northern Lipids(Vancouver，BC，Canada)。胆固醇(CH)购自Sigma(St Louis，MO)。1，2-二油酰基-3-N，N-二甲基丙铵(DODAP)由Dr.Steven Ansell(Inex PharmaceuticalsCorp.)合成或从Avanti Polar Lipids购得(仅DODAP)。1-O-(2′-(ω-甲氧基聚乙二醇)琥珀酰基)-2-N-肉豆蔻酰鞘氨醇(PEG-Cer14)和1-O-(2′-(ω-甲氧基聚乙二醇)琥珀酰基)-2-N-花生酰鞘氨醇(PEG-Cer20)由Dr.Zhao Wang(Inex Pharmaceuticals Corp.)合成。[3H]-胆甾醇基十六醚(CHE)从Dupont NEN(Boston，MA)获得。所有脂质纯度＞99％。所有试剂不经纯化使用。
ODN和质粒的包裹。如本专利申请的母专利申请，即美国专利临时申请号08/856,374、09/078954、09/078955和PCT出版号WO 98/51278(这些专利都转让给本专利申请的申请人，在此引入以供参考)含有DSPC:CH:DODAP:PEG-CerC14(有时称为AS4200)或DSPC:CH:DODAP:PEG-CerC20(有时称为AS4204)和包裹的PSODN的稳定的反义-脂质颗粒(SALP)。通常将总共1000毫克脂质溶于100毫升乙醇。在独立的烧瓶中，在60毫升300mM柠檬酸，pH4.0中溶解200毫克(基于A260)ODN制备含有ODN的溶液。在ODN溶液中通过26G针滴加脂质溶液，一边搅拌。混合物用热屏障挤出器(Lipex Biomembranes，BC，Canada)通过维持在65℃的2层80纳米聚羧酸酯滤膜(Poretics)10次。用具有100000分子量截留的切向流动装置，用20倍体积的20mM PBS/145mM NaCl交换柠檬酸缓冲液。该步骤除去了过量乙醇和未包裹的ODN，产生可体内施用的等渗溶液。用切向流动浓缩SALP制备物，调节到1.5毫克/毫升ODN，0.22微米膜无菌滤过并储藏在4℃。用NICOMP 370型亚微米颗粒分级器测定SALP平均直径和大小分布，通常是110±30纳米。当需要含有较低寡核苷酸：脂质重量比的制剂时，以合适的比例减少最初溶液中的ODN，产生颗粒，如本申请的母案所述。另外，为了给药可将一些样品切换到HEPES-缓冲盐水(HBS)，pH7.0，用HBS替换外部柠檬酸缓冲液最少透析12小时。这使得外侧双层中的大部分DODAP是中性的，释放任何表面结合的反义核酸。可任选的用DEAE-琼脂糖层析从AS4200/4除去其它未包裹的反义核酸。对于PO-ODN和质粒制剂，最初使用的缓冲液是20mM柠檬酸，pH4.0。未经挤出质粒制剂，得到约200纳米的颗粒。包裹在AS4200或AS4204制剂中的ODN在本文中有时用ODN名称称呼，但将INX改成INXC(即INXC-6295)。
用本领域已知的标准脂质体方法制备对照制剂：根据Hope等(41)的方法，从无水脂质膜通过在HBS(20mM Hepes，145mM NaCl，pH7.4)中水合，制备了DSPC:CH和DSPC:CH:PEG2000-DSPE小泡。类似的，通过将100毫克脂质与100毫克ODN在1.0毫升HBS中水合，然后经过5轮冻融和挤过2层100纳米滤膜实现了ODN包裹。[3H]-CHE(一种不可交换、不可代谢的脂质标记)掺入所有小泡组合物，以监测血液中的脂质水平(42)。用NICOMP亚微米颗粒分级器(370型)通过准弹性光散射判断得到的颗粒粒径约110-140纳米。通常该过程的包裹效力小于10％。从制备物中用DEAE-琼脂糖CL-6B通过阴离子交换层析除去未包裹的ODN。将游离寡核苷酸溶于HBS，根据A260调节(假定35微克/毫升得到A260是1.0)所需的剂量。当阿霉素与寡核苷酸一起包裹时，首先根据这些方法制备含有寡核苷酸的颗粒，然后将阿霉素用标准pH加药技术加到颗粒中，达到所需浓度。用pH加药制备的DSPC/Chol包裹的阿霉素(约10毫克/脂质/公斤和0.05-0.2毫克Dox/公斤)进行阿霉素封阻实验，在注射AS420424小时前施给小鼠。
小鼠。从Garlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN)获得雌性，7-8周龄ICR、C57BL/6和Balb/c小鼠。从The Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)获得了Balb/cnu/nu和Balb/c SCID-Rag2小鼠，维持在无病原体环境下。在使用前至少一周对小鼠检疫。根据Canadian Council on Animal Care的指导进行所有与动物有关的实验。
剂量：在研究持续期内，除非另外指定，每隔一日对小鼠给药(如指定的共7-10剂)。通过尾静脉静脉内注射(注射体积20微升)施用测试样品和对照。除非另外说明，将这些制剂的脂质剂量调节到100毫克/公斤/剂。在使用不同药物∶脂质比的实验中，所有制剂的脂质剂量调节到80毫克/公斤/剂。注射前过滤(0.22微米)样品。外部缓冲液是HBS(20mM Hepes，145mM NaCl，pH7.45)。
循环中脂质体消除。为了估计血液中的脂质体消除(在本文中也称为“血液中的脂质体回收”)，小鼠通过尾梢静脉接受含有1μCi/小鼠的[3H]-CHE的空脂质体(50毫克/公斤脂质体)或包裹的ODN(50毫克/公斤脂质和20毫克/公斤ODN，除非另外说明)单剂静脉内给药。除非另外说明，每周给药。注射后一小时用无菌手术刀通过尾部切口收集血液(25微升)，置于装有200微升5％EDTA的玻璃闪烁指管中。然后消化血液(SolvableTM，Packard)，脱色并用标准闪烁技术根据厂商指示分析放射活性。尾部切口方法得到与心脏穿刺取血样的小鼠获得的结果非常相似，但更有用，因为所有的数据收集自同一小组动物。
图1A-C显示PEG-脂质体对免疫活性Balb/c小鼠(图1A)和缺乏免疫力的Balb/c裸鼠(图1B)和Balb/c SCID-Rag2小鼠(图1C)中重复给药的循环水平。用空DSPC:CH:PEG2000-DSPE脂质体(a)，含有hICAM PS ODN的DSPC:CH:PEG2000-DSPE(b)，空SALP(PEG-CerC20，c)，或含有hICAM ODN的SALP(PEG-CerC20，d)。脂质剂量是50毫克/公斤。DSPC:CH:PEG2000和SALP(PEG-CerC20)的ODN/脂质比分别是0.05和0.20。每周注射给药，用脂质标记[3H]-CHE监测注射后一小时的循环水平。条代表第一(空心条)、第二(反斜线)、第三(正斜线)和第四(交叉影线)次注射。所有条代表8只小鼠的平均和标准误差。如“a”和“c”栏反映的，含空PEG-脂质的小泡在几次给药中观察不到消除的差异，然而，在第二次和随后的注射中，含ODN的小泡中观察到惊人和迅速的消除(1小时时血液中剩余的注射剂量＜20％)。该作用伴随有显著的病状，而且在某些情况下导致动物在注射后30分钟内死亡。在T-细胞缺陷型Balb/c裸鼠中也观察到该迅速消除，但在B-细胞和T-细胞依赖性Balb/c SCID-Rag2小鼠中未观察到，提出反应依赖于B-细胞和免疫球蛋白的存在。
图2A和B显示核酸序列(A)和结构(B)对SALP(PEG-CerC20)消除的影响。用含有各种核苷酸序列的PS ODN的SALP(PEG-CerC20)静脉内注射小鼠(图2A)。还评估了磷酸二酯(PO)hICAM ODN和细菌质粒DNA。将脂质剂量调节到50毫克/公斤，各制剂的ODN/脂质比约0.20。每周注射给药，用脂质标记[3H]-CHE监测注射后一小时的循环水平。条和动物数量如图1A-C的图例中标出的。静脉内给药后，所有包裹在SALP(PEG-CerC20)中的PS ODN诱导病状，并在重复给药后迅速从循环中降低。不论ODN是ISS(hICAM，c-myc，c-mycC)或非ISS(即mICAM、EGFR)状态，都观察到这种情况。图2B显示不论被包裹的核酸是PS、PO或质粒，都发生颗粒从血液中快速消除(注射后1小时监测每周注射)。
图3显示DNA与脂质比对脂质体回收的影响。用含有hICAM PS ODN的SALP(PEG-CerC20)以各种ODN/脂质比注射小鼠。将脂质调节到50毫克/公斤/剂量。每周注射给药，用脂质标记[3H]-CHE监测注射后一小时的循环水平。条和动物数量如图1A-C的图例中标出的。如所示，结果证明药物∶脂质比(w/w)在0.040以上的颗粒诱导快速清除应答，而0.040或以下的颗粒在重复注射后不引起清除。该结果提示免疫系统在开始清除应答前识别核酸的阈值(或浓度)。另外，w/w在0.040以下的颗粒用于获得直接反义作用，避免在AS4204(长循环)制剂中重复给药后的快速清除应答。
图4显示给药事件对快速消除应答发生的影响。用含有hICAM PS ODN的SALP(PEG-CerC20)以不同给药时间表静脉内注射小鼠：每日(○)、每2日(●)、每3日(□)和每周(■)。将脂质调节到50毫克/公斤/剂量，用脂质标记[3H]-CHE监测感染后1小时的循环水平。符号代表8只小鼠的平均和标准偏差。颗粒的D∶L比在阈值清除诱导水平之上。如图4所示，至少要5日才能在小鼠中产生快速清除能力，不论SALP的给药频率(每日、每2、3或7日)。对于每日注射，循环屏障的血浆水平在头3次注射中增加。这并不惊奇，因为30-40％给定剂量的PEG-包裹的脂质体在注射后24小时仍留在循环内。然而，这种增加后随后剂量的循环水平剧烈下降。在所有给药时间表中，随后剂量的迅速消除在最初剂量的4-6日后观察到。这些结果提出在最初剂量后进行清除应答的免疫系统成分饱和，清除反应的进展和产生要约5-6日，不论干涉剂量的数量。这提出了体液(抗体)应答是优选的。
图5A和B说明PEG-脂质对含有ODN的脂质体快速消除中的作用。在第一个实验中，用空SALP(PEG-CerC20，a)、SALP(PEG-CerC20，b)、空SALP(PEG-CerC14，c)、SALP(PEG-CerC14，d)、空DSPC:CH脂质体(e)或含有hICAM PS ODN的DSPC:CH(f)。将脂质调节到50毫克/公斤/剂量，用脂质标记[3H]-CHE监测感染后1小时的循环水平。条和动物数量如图1A-C的图例中标出的。在图5B报道的第二次实验中，监测24小时内血浆中[3H]-PEG-神经酰胺和[14C]-CHE之比评估PEG-CerC20(●)和PEG-CerC20(○)交换的时间过程。符号代表6只小鼠的平均和标准偏差。
PEG-CerC14的酰基链脂质-锚定分子比PEG-CerC20短，因此更容易交换出双层(体内t1/2＝约3分钟，对大于24小时)。当在本发明的颗粒中使用PEG-CerC14时，与含有SALP的CerC20(栏b)相比，重复给药(栏c&d)后检测无快速清除反应。由于空的和不携带ODN的DSPC:CH小泡和PEG-Cer14制剂不显示任何差别，我们总结PEG-脂质在小泡外侧单层中的存在和维持是快速清除反应发生的关键。
图6显示了交叉研究的结果，在3次之前每周注射含有ODN的PEG-CerC20SALP后引发了清除反应。用SALP(PEG-CerC20)静脉内注射小鼠，每周注射，共4次，导致与图1A-C观察到的相似的消除情况。在最后一次注射时，小鼠接受SALP(PEG-CerC20)、空SALP(PEG-CerC20)、空DSPC:CH:PEG2000-DSPE小泡、空SALP(PEG-CerC14)或空DSPC:CH脂质体。在各种情况下，将脂质调节到50毫克/公斤/剂量，用脂质标记[3H]-CHE监测感染后1小时的循环水平。各条代表8只小鼠的平均和标准偏差。第4次给药显示清除反应独一无二的针对PEG-脂质维持在外侧脂单层中的那些颗粒，无论它们是否携带ODN。因此除去了PEG-CerC20和PEG-DSPE制剂，不论ODN状态，其中非PEG-脂质制剂(如DSPC:CH)或可交换PEG-脂质制剂(如PEG-CerC14)不被清除。这提出只要能够识别颗粒外表面上的先前弱免疫原，清除反应不依赖于颗粒的(内部)ODN状态。该结果提出根据本发明可产生各种各样的抗原，包括颗粒外表面上的弱免疫原，首先以含ODN的形式施用疫苗，然后用病原体攻击病人将被识别，不论病原体的ODN状态。
实施例2
该系列实施例说明了对免疫刺激性脂质-核酸颗粒的进一步应答。这些方法使用实施例1的材料和方法，具有下列变化。
这些研究中使用了下列小鼠品种：ICR、Balb/c、Balb/c裸鼠、Balb/c SCID-Rag2、C57BL/6。所有都商品购得Harlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN)或TaconicFarms(Germantown，NY)。
这些小鼠中的肿瘤模型如下建立。
B16/Bl6小鼠骨髓瘤。将细胞[NCI目录B16BL6]维持在补充有10％FBS的MEM培养基中。在研究第0日，在背侧皮下(s.c.)注射3×105个细胞(注射体积：50微升)C57BL/6雌性小鼠(20-23克)。15％额外的小鼠注射非球形肿瘤，或观察到无肿瘤的小鼠可从研究中排除。使肿瘤生长5-7日，然后开始用测试样品/对照进行治疗，随机分组。当肿瘤大50-100立方毫米时开始治疗。
DoHH2人滤泡性淋巴瘤。DoHH2细胞(一种Kluin-Nelemans HC等(1991)Leukemia 5(3)221-224描述的非霍奇金氏B-细胞淋巴瘤)维持在补充有10％PBS的RPMI1640培养基的培养物中。在研究第0日，在SCID/Rag-2雌性小鼠(20-23克)的静脉内注射5×106细胞(静脉内；注射体积200微升HBSS)。使肿瘤生长3日，然后开始用测试样品/对照治疗。在第3日，随机对小鼠编组，然后给药。
Lewis肺。在补充有10％FBS的MEM培养基中培养lewis肺癌细胞(ATCC#CRL-1642)。在研究第0日，在背脊中皮下注射3×105细胞(注射体积100微升)。使肿瘤生长3日，然后开始用测试样品/对照治疗。用测径器测量原发肿瘤体积。
NG黑色素瘤。如Leonetti，C.等(1996)J.Nat.Canc.Inst.88(7)419-429中列出的，使用从Regina Elena癌症研究所(Rome，Italy)手术部的病人活体检查获得的人原发黑色素瘤[NG，Clark′s等级V]。在6-8周龄的CD-1雄性裸鼠(nu/nu)后腿肌肉中注射2.5×106NG细胞悬液。移植后第4日，在所有小鼠中明显可见约70毫克的肿瘤团块。在裸鼠中5和8次传代之间进行所有实验。
效能/效力终点。如下测量了本文描述了作为“肿瘤大小(或体积)的增加”的结果：用测径器测量原发肿瘤体积。在研究持续的过程中，每隔一日(在非注射日)测量长度(毫米)、宽度(毫米)和高度(毫米)。用下式计算肿瘤体积：
肿瘤体积(立方毫米)＝(π/6)(L×W×H)
当肿瘤体积达到10％体重，或在首次出现溃疡症状时，杀死小鼠(用CO2吸入或一般麻醉进行的颈部错位)。
作为治疗组的平均肿瘤重量除以对照组的平均肿瘤重量，减去1/100计算“肿瘤重量抑制(“TWI％”)”。“肿瘤生长延迟”(“T-C”)计算成治疗(T)组达到任意决定的肿瘤重量(即250毫克)平均时间(日)减去对照(C)组达到相同大小的平均时间(日)。
基于原始测试组中动物数量计算“存活”或“％存活”。根据加拿大动物保护委员会的指导，死亡不用作终点。相反，每日观察动物，在发病或垂死的第一症状出现时，使动物无痛致死，对于这些情况通常是后肢瘫痪。在无痛致死情况下，动物的死亡计算成翌日。其它终点：
IgM和IgG产生/清除：用合适的ELISA实验从小鼠收集的血样样品测量作为对组合物的免疫应答产生的IgM和IgG。
肿瘤聚集：为了监测ODN的肿瘤聚集，用游离或包裹在稳定的反义-脂质颗粒(SALP)中的[3H]-标记的ODN静脉内注射(200微升)动物。将[14C]-胆甾醇基十六醚掺入SALP中作为不可交换、不可代谢的脂质标记，以监测运送系统的命运。在不同时间，使小鼠无痛致死，手术取下肿瘤，称重并置于Fast Prep试管中。在各试管中加入PBS(500微升)，用Bio 101 Fast Prep FP120装置(Savant)匀浆样品3×8秒。将肿瘤匀浆液等份(100-200微升)置于500微升组织增溶剂(SolvableTM，Packard)中，根据厂商指示消化并脱色。将得到样品加到5.0毫升Pico-Fluor40TM闪烁混合物中，用标准液体闪烁方法分析总放射性。结果表示成微克ODN等价物/克组织。
体外脾细胞增殖试验。通过测量体外脾细胞增殖的刺激评估这些研究中所用的ODN的促有丝分裂性。用两片末端冰冷的玻璃载玻片温和撕开脾脏，并制备脾细胞悬液。将100∶1新鲜制备的脾细胞悬液(5×106细胞/毫升完整RPMI)等份一式三份加到96孔板中，该孔含有等体积的完整RPMI和2x浓度的ODN(即12.5、25.0、50.0或100.0毫克/毫升ODN的完整RPMI溶液)。24小时后，在各孔中加入1：Ci[3H]-胸腺嘧啶(NEN Life Science Products；Boston，MA，USA)，再培养培养物48小时。在培养期终点，将细胞收集到玻璃滤膜上，用β-闪烁计数测量掺入的放射量。在各板中包括合适的对照(有丝分裂原：ConA和LPS，或仅培养基)。[3H]-胸腺嘧啶表示成平均DPM±SEM。
图7A和B显示一些实体瘤中AS4200的聚集。在0时静脉内施用AS4200制剂。杀死小鼠，在指定的时间点取出肿瘤。测量ODN聚集。在Lewis肺肿瘤(图7B)中，比游离ODN聚集程度高得多(5-10％剂量对1％剂量)；而在B16肿瘤中(图7A)聚集的量与游离ODN基本相同(1-3％剂量)。ODN聚集受到这些肿瘤微环境的影响，可能受到肿瘤发育阶段的影响。
图8A和8B说明AS4200大大增强了ODN的效力。从肿瘤移植后第5日(用星号标出)开始，每隔1日进行治疗(脂质剂量＝100毫克/公斤；D/L比是0.18或0.005)，共7日。“c-myc”＝INX-6295。肿瘤＝B16小鼠黑色素瘤。在AS4200制剂(图8A)中，0.5毫克/公斤的ODN制剂和18毫克/公斤ODN提供了相同作用。这和游离ODN相反(图8B)，其中0.5毫克/公斤与HBS对照相比未提供显著作用。
图9显示当包裹在TCS(AS4200)中时，INX-6298，一种特殊的磷酸二酯ODN抑制肿瘤生长，而以游离形式运送时不能抑制。肿瘤移植后21日测量肿瘤体积。
表1显示了证明NG人转移性黑色素瘤模型中ODN制剂的效力。用2.5×106细胞在后腿肌肉中注射小鼠，提供0.5毫克/小鼠/日(约20毫克/公斤/日)的ODN剂量，连续8日(＝1轮)。在各轮之间间隔7日，进行共三轮。ODN∶脂质比＝0.20w/w。在各轮终点计算肿瘤重量抑制(TWI％)。肿瘤生长延迟(T-C)是治疗和对照肿瘤达到相同大小的平均时间(日)。
  表1
  样品   TWI％第一轮   TWI％第二轮   TWI％第三轮   T-C(日)   ％肺部转移的减少   ％存活期增加
  LR-3280   37   41   50   8   24   28
  INX6295   39   43   49   8   28   30
  INX-6300   13   4   9   1   0   12
  INX-6295AS4200   53   55   63   16   72   49
  INX-6300AS4200   23   20   26   3   10   14
图10是用各种c-myc或对照ODN制剂肿瘤接种后，从第4日起每隔2日治疗携带DoHH2肿瘤的SCID-Rag2小鼠10日的存活曲线。小鼠接受静脉注射1X106。存活监测150日。各组由5-6只小鼠组成。PO-ODN6298的AS4200制剂非常显著的基本治愈肿瘤(n＝5-6只小鼠)。PS对照(6299)AS4200显示比游离ODN显著存活增强。
图11A显示i/v/DoHH2小鼠中对游离和AS4200INX-6295的剂量应答。AS4200制剂使用不变的D/L比(高D/L，起始0.20)。每2日给药10日。在HBS，pH7.6中稀释获得各药物剂量。脂质剂量变化(50和20毫克/公斤)。如所示，AS4200INX-6295治疗与药物的游离形式相比，在DoHH2小鼠中获得更高的存活。在该模型中，该剂量(5毫克/公斤)下药物的游离形式与HBS对照相比没有统计学上的提高。另外非常明显的，AS4200/INX-6300在5毫克/公斤得到了显著但较小的益处。INX-6300不携带ISS序列，预期它的用途不能提供任何存活优势(见下面进一步对INX-6300的特征确定)。AS4204制剂的存活优势归功于这些小鼠是B-细胞缺陷型的，因此不产生快速清除反应。因此B-细胞引起清除作用，但不是疗效/治疗的存活优势必需的。实际上，AS4204制剂的长循环方面似乎比AS4200治疗的存活优势增强。图11B在不同剂量水平，即脂质剂量从100-20毫克/公斤变化的相似结果。如所示，还在更高(10毫克/公斤)剂量发现了治疗优势。
发现一些静脉给药的LR-3280(c-myc)在体内诱导脾肿大，如在对本发明的某些颗粒的应答中小鼠脾增大。图12显示脂质本身(600毫克/公斤)不诱导脾肿大，游离c-myc(LR-3280)(125毫克/公斤)诱导温和脾肿大，AS4200包裹的LR-3280在高剂量(＞200毫克/公斤脂质和42毫克/公斤ODN)时诱导脾肿大，但在20毫克/公斤脂质和4.2毫克/公斤ODN下不诱导。脂质包裹的剂量比游离ODN诱导的脾肿大显然大得多。
图13显示各种ODN对体外脾细胞增殖试验的促分裂作用。所有PS ODN显示背景背景刺激作用，但在含有ISS的序列中发现了最大作用。该作用与对照和熟知的促分裂素LPS和ConA相同或更大。PO-ODN不显示作用，可能由于在血清缓冲液中降解。未显示甲基化INX-6295的结果，虽然其活性未被完全消除，其显示与未甲基化的INX-6295相比小得多的促分裂性，与其它PS ODN相当。
由于图13结果中的活性，进一步调查了LR-4420的促细胞分裂性。如图14可见，10毫克/公斤的一剂LR-4420比游离LR-3280具有相等或更高的肿瘤抑制效果(另见图7的LR-3280的游离和AS4200制剂的相对活性)。
将阿霉素和c-myc包裹在AS4200脂质体中。图15总结了结果。(括号中的阿霉素量是毫克/公斤。AS4200包括IDN，L4200是脂质包裹的阿霉素，不含ODN。在该图中，AS4200含有INX-6295)。结果显示在21日，与阿霉素(2毫克/公斤)共同包被的AS4200(15毫克/公斤)提供了与单独施用的制剂相比惊人而统计学显著的进步。另外，将AS4200中的阿霉素增加到10毫克/公斤不提高应答，虽然10毫克/公斤包裹的阿霉素单独提供了相同应答。这些结果表明可能在本发明的颗粒提供的联合治疗中发生细胞之间的复杂相互作用和应答。可能阿霉素剂量的增加抵消了ODN的作用。
为了测定肝RES，尤其是Kupffer细胞是否与清除应答有关，通过封阻RES抑制Kupffer细胞。施用AS420424小时前，施用低剂量包裹的阿霉素(足够杀死成熟Kupffer细胞)实现。另外，每周施用起始阿霉素/脂质比为0.2、0.1、0.05和0.01的AS4204中共包裹的阿霉素，评估相应的体内应答。血液中脂质回收(起始％)在图16中绘出。明显用DSPC/Chol阿霉素封阻对抑制循环消除没有作用，因为在第二次和随后注射后的循环中存在的最初施用的脂质少于5％。然而，以起始比0.2和0.1在AS4204中共同包裹阿霉素导致三次随后注射的循环水平维持在大于起始施用的制剂的75％。因此，抑制循环消除的阈值似乎在0.1和0.5之间。这些结果提示Kupffer细胞不能单独引起清除应答；其它被共同施用的大于0.05阿霉素禁止的细胞起到了大部分作用。这些其它细胞可以是B细胞或可以是激活B-细胞的细胞；或它们可以是外周免疫系统细胞，如肿瘤相关巨噬细胞等。
实施例3
该系列实验的特征是施用本发明的脂质-核酸颗粒产生的一些免疫应答。所有方法和材料与实施例1和2相同，标出了改变。这些实施例证明用于产生疗效的SALP制剂的未料到的性质。
细胞系和小鼠品系。在cRPMI(RPMI 1640，10％FCS，50μM2-巯基乙醇，2mML-谷氨酰胺、100U/毫升链霉素、100微克/毫升青霉素)中培养YAC-1细胞。所有组织培养基购自GIBCO BRL(Gaithersburg，MD，USA)，FALCON塑料器具购自Becton dickinson(Franklin lakes，NJ，USA)。雌性C57BL/6J-Lystbg-J/+(beige)小鼠从Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME，USA)获得。应注意当使用beige小鼠时，野生型C57B1/6J也从Jackson获得。
肝脏单核细胞(HMNC)的收集。用过量麻醉药[3.2％(v/v)开他敏/0.8％(v/v)甲苯噻嗪]使小鼠无痛致死。然后从左心房灌注动物6毫升预温至37℃的Hank′s平衡盐溶液(HBSS)，然后灌注6毫升0.25％胶原酶IV(Sigma，St.Louis，MO，USA)的HBSS溶液(也预温)。15分钟消化期后，取下肝脏，用手在含有5毫升冰冷的加入5％FCS的RPMI 1640(RPMI-5％)的100毫升培养皿中简单分散，转移到置于冰上的含有共20毫升RPMI-5％的50毫升锥形试管中。然后将消化产物通过100微米金属筛，分散肝脏。从上清液中通过600rpm离心3分钟除去肝细胞。1300rpm离心5分钟沉淀剩余细胞，用HBSS洗涤一次。将细胞沉淀重悬浮在30％Percoll(AmershamPharmacia Biotech；Baie d’Urfe，PQ。Canada)的PBS溶液中，2000rpm离心10分钟，分离肝脏单核细胞。小心除去Percoll，用10毫升HBSS洗涤细胞沉淀两次，重新悬浮在最终体积为2毫升的cPRMI中。常规上该过程从8-10周龄的C57B1/6小鼠中获得2-3×106单核细胞。
铬释放试验。为了测定单核细胞制备物中的NK活性，如Bramson等(1996)所述的测试细胞悬液裂解51Cr标记的NK-靶细胞(YAC-1)的能力。简单说，在50μCi的51Cr(NEN Life Science Products；boston，MA，USA)中37℃培养106个细胞1小时，用51Cr标记YAC-1细胞。将标记的YAC-1以106细胞/毫升悬浮在cRPMI中，在U-型底部的96孔板中混合50微升等份的YAC-1悬液与不同数量的腹膜排出细胞，得到效应物∶靶比90∶1、30∶1和10∶1。37℃，5％CO2下培养板4-6小时。培养完后，从各孔取出100微升培养上清液，用于闪烁计数。
FACS分析。用2-色流式细胞分析测定单核细胞制备物上的NK1.1和T细胞受体(TCR)表面表达，使用下列抗体：PE-偶联的抗NK1.1(克隆PK136)、FITC-偶联的抗-TCRβ(克隆H57-597)、PE-偶联的小鼠IgG2a，κ同型对照(克隆G155-178)和FITC-偶联的HamsterIgG，组2，λ同型对照(克隆Ha4/8)。所有抗体从Pharmingen(Mississauga，0N)获得。单和双阳性细胞在群体中的百分数用Cellquest软件包(Becton-Dickinson，San Jose，CA)计算。从阳性染色的细胞百分数中减去非特异性染色的细胞百分数，然后乘以总细胞数，得到NK和NKt的绝对数目。
统计学分析。所有数据表示成平均值±SEM，用双尾Student’s t-试验比较。用运行于Macintosh上的Statview 512+(Abacus Concepts，Inc.Berkeley，CA)获得统计数据。
图17显示在INX-6295(含CpG)和INX-6300(无CpG)的促细胞分裂性试验中，INX-6295的促细胞分裂性至少是4倍。不过INX-6300与单用培养基相比确实具有刺激活性，与PS骨架本身是促细胞分裂剂的报道一致。体外用递减量的游离PSODN(6.25微克/毫升-25微克/毫升)培养最初的脾细胞。用3H-胸腺嘧啶脉冲标记培养物，72小时后收集。各点代表3个独立培养物的平均3H-胸腺嘧啶掺入±SEM。该图代表一式三份进行的2种实验之一，方块，游离INX-6295；圆圈，游离INX-6300。
C57B1/6小鼠接受1次(6295X1)、两次(6295X2)或三次(6295x3)静脉内注射INX-6295/SALP(15毫克/公斤ODN；注射之间相隔48小时)或3次静脉内注射PBS(注射之间相隔48小时)。最后一次注射24小时后收集肝脏单核细胞(HMNC)。图18A显示HMNC的总数。各条代表6-25只小鼠的平均HMNC+SEM。图18B显示HMNC针对YAC-1细胞的裂解活性。各点代表3个单独HMNC的群体的平均特异性裂解％±SEM。该图代表该图代表一式三份进行的2种实验之一，方块，INX-6295/SALP的3次注射；菱形，INX/SALP的2次注射；三角，INX-6295/SALP的1次注射；圆圈，PBS的3次注射。***，p＜0.0001；**，p＜0.01。如图18A所反映的，INXC-6295的三次重复注射导致肝脏单核细胞和自然杀伤细胞活性中的线性增加。在INXC-6295中的第二次和第三次给药后观察到脾肿大，如脾重量测定的，然而在脾细胞数量中没有增加(数据未显示)，因此表明细胞数量的增加不引起肿大。图18显示用YAC-1铬释放试验测定的HMNC群的细胞裂解活性在INXC-6295治疗后增加。第二和第三次施用INXC-6295后收集的HMNC群的裂解曲线之间斜率的相似性提示，在两种样品中都存在相同的效应细胞。还观察到脾脏内NK活性在随后施用INXC-6295后增加，但程度比HMNC小。
3只C57B1/6小鼠的组接受2次静脉内注射INX-6295/SALP(15毫克/公斤ODN；注射间隔48小时)或PBS(注射间隔48小时)。最后一次注射后24小时后收集肝脏单核细胞(HMNC)。从三份样品中合并等量细胞，用流式细胞计数测定NK1.1和TCRβ的表面表达。图19A显示NK1.1+/TCR-细胞在HMNC库中的总数。各条代表5-6个实验的平均细胞数+SEM。图19B显示NK1.1+/TCR+细胞在HMNC库中的总数。各条代表5-6个实验的平均细胞数+SEM。。***p＜0.0001；N.S.不显著。如所示，在ganzINXC-6295/SALP治疗后肝脏中NK1.1+/TCR-细胞增加。由于YAC-1细胞对NK和NK介导的裂解是敏感的，从铬释放试验不清楚是哪类群体引起的。INXC-6295处理后NKT细胞无显著增加。相反INXC-6295处理后肝脏NK细胞有5-倍增加。这些结果有力提示在施用INXC-6295后引起所观察到的裂解活性的增加的细胞群是Nk细胞。
3只C57B1/6小鼠(野生型)和3只C57BL/6J-Lystbg-J/+(beige)小鼠组接受2次静脉内注射INX-6295/SALP(15毫克/公斤ODN；注射间隔48小时。最后一次注射24小时后收集肝脏单核细胞(HMNC)。测试HMNC针对YAC-1细胞的裂解活性。图21显示了结果，其中各点代表3个独立的HMNC群的平均特异性裂解％±SEM。方块，INX-6295/SALP的2次注射，野生型小鼠；菱形菱形，PBS的2次注射，野生型小鼠；空心方块，INX-6295/SALP的2次注射，beige小鼠；空心菱形，PBS的2次注射，beige小鼠。如图21中所示，在beige小鼠(NK细胞和B细胞缺陷型)的HMNC中，在用INX-6295/SALP处理后缺乏细胞裂解活性。虽然INXC-6295在野生型小鼠中诱导强裂解活性，在使用相同处理的beige小鼠中仅观察到弱裂解活性。这提示NK细胞由本发明的颗粒特异性激活。beige小鼠中的弱裂解活性可能仍是由于NK活性在小鼠中未充分抑制，或可能是NKT细胞活性的小组分的证明。带有肿瘤的Beige小鼠还显示INXC-6295无治疗应答或效力，因此提示NK细胞和B细胞是被本发明的颗粒激活的关键细胞。
C57B1/6小鼠接受2次静脉注射INX-6295/SALP、INX-6300/SALP、游离INX--6295、游离INX-6300(15毫克/公斤ODN；注射间隔48小时)、脂质单独或PBS(注射间隔48小时)。最后一次注射24小时后收集HMNC。图22显示了结果，其中各点代表8-25只小鼠的平均HMNC+SEM。***P＝0.0001；N.S.，非显著。如所示，施用游离和包裹的PS ODN后HMNC有增加。施用游离INX-6295在HMNC中产生类似INX-6295的AS4200制剂观察到的增加。然而，AS4200中的INX-6300与PBS相比仅产生了少量HMNC增加，而游离INX-6300不引起任何增加。
3只C57B1/6小鼠组接受2次静脉内注射INX-6295/SALP，INX-6300/SALP，游离INX-6295，游离INX-6300(15毫克/公斤ODN；注射间隔48小时)，单独脂质或PBS(注射间隔48小时)。最后一次注射24小时后收集HMNC。从三份样品合并相等数量的细胞，用流式细胞计数测定NK1.1和TCRβ链的表面表达。图22A显示HMNC库中NK1.1+/TCR细胞的总数。各点代表3-6次实验的平均细胞数+SEM。图22B显示HMNC库中NK1.1+/TCR+细胞的总数。***，P＝0.0001；N.S.，不显著。如所示，SALP处理后肝脏中的NK1.1+/TCR-细胞增加。还发现在用游离或包裹的INX-6295处理后NK细胞扩增，用INXC-6300程度较小(不显著)。没有一种处理在NKT区室中产生显著改变。
3只C57B1/6小鼠的组在第0和2日接受2次静脉内注射INX-6295/SALP，INX-6300/SALP，游离INX-6295，游离INX-6300(15毫克/公斤ODN；注射间隔48小时)，或PBS(注射间隔48小时)。在第3日，最后一次注射24小时后收集HMNC。测试HMNC针对YAC-1细胞的裂解活性。图23A-C显示了结果，各点代表3个独立HMNC群的平均特异性裂解％±SEM。各图代表一式三份进行的2-3次实验。实心方块，游离INX-6295的2次注射；实心菱形，游离INX-6300的2次注射；空心方块，INX-6295/SALP的2次注射；空心菱形，INX-6300/SALP的2次注射；空心圆圈，PBS的2次注射。如所示，施用游离和包裹的PS ODN后HMNC群内的自然杀伤细胞激活。静脉施用SALP可在不存在ISS基序的情况下激活肝脏NK细胞。图23A显示游离和包裹的INX-6295促进肝NK细胞的类似激活。令人惊奇的是，INX-6300/SALP与INXC-6295产生的裂解活性几乎一样多，表明非ISS序列的SALP(或AS4200)制剂可产生ISS型应答。这建立了一类新的ISS基序，它们的游离形式不激活免疫应答，但依赖于脂质-颗粒的包裹，产生免疫应答。
总的说，该实施例的结果显示INX-6300/SALP，非ODN或脂质本身的免疫激活作用可能反映出一个不依赖于ISS基序或双链核酸的其它途径。然而应注意虽然INX6300/SALP(缺乏ISS基序)刺激的NK细胞显示与INX6295/SALP(含ISS基序)刺激的裂解活性类似，仅在ODN负荷含有ISS基序时观察到NK细胞的扩增。这提示NK细胞可能需要多种裂解活性或扩增的激活信号，或INX6300-SALP引起的信号对于激活细胞毒性足够强，但对于启动扩增太弱。用刺激性脂质如α-半乳糖神经酰胺修饰SALP制剂，可提供额外的刺激，以启动肝NK细胞和可能的NKT细胞的扩增和激活。
实施例4
该系列实施例说明了一些阳离子脂质：DNA复合物(非包裹的系统或脂复合物)产生免疫应答的能力，从而提供了癌基因治疗的功能性佐剂。
试剂。Dr.Steven Ansell(Inex Pharmaceuticals，Vancouver，BC，Canada)制备了DODAC(氯化N，N-二油酰基-N，N-二甲基铵)。从Avanti PolarLipids(Alabaster，AL，USA)获得了DOTAP(氯化N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基铵)和DOPE(1，2-油酰基-sn-3-磷酯酰乙醇胺)。从Sigma(St.Louis，MO，USA)购得放线菌素D和N-(1-萘基)乙二胺，磺胺。
细胞培养物。在cRPMI[RPMI 1640，10％FCS、50μM2-巯基乙醇、2-mM L-谷氨酰胺、100U/ml链霉素、100微克/毫升青霉素]中培养MCA207[小鼠纤维肉瘤](S.Rosenberg，National Cancer Institute，Frederick/Bethsda，MD提供)、SKOV-3(人卵巢癌，ATCC#HTB-77)、LS180(人结肠直肠癌)和WEHI13VAR(ATCC#CRL-2148)。所有组织培养基购自GIBCO BRL(Gaithersburg，MD，USA)，FALCON塑料器具购自Becton Dickinson(Franklin Lakes，NJ，USA)。
LUV的制备。通过冻干含10毫克/毫升脂质的100％乙醇溶液制备脂膜。将脂质以40mM脂质的最终浓度重悬浮在水中。然后将溶解的脂质体挤过100纳米碳膜10次，产生大单层小泡(LUV)，储藏在4℃。这些研究中使用的LUV由(DODAC、DOTMA或DOTAP)和DOPE的阳离子脂的1∶1分子比构成。
脂复合物的形成。制备带电比为+3的LUV/DNA复合物(为了本说明书是“不完全包裹的系统”)。制备含有最终浓度为500微克/毫升的pCMVluc18的5％葡萄糖溶液。在含有9.0mMDODAC∶DOPE(1∶1)LUV的5％葡萄糖溶液中滴加DNA溶液，一边搅拌。然后4℃培养复合物30分钟。在每次使用前新鲜制备脂复合物。
荧光酶和蛋白质试验。用荧光酶试验系统试剂盒(Promega；Madison，WI，USA)如前所述(12)进行荧光酶试验。用二金鸡纳酸显色法(Pierce Chemical Co.；Rockford，IL，USA)根据厂商方法分析细胞裂解物的蛋白质含量。
小鼠腹膜炎。雌性C57B1/6小鼠(Harlan Sprague Dawley；Indianapolis，IN，USA)接受腹膜内注射LUV或脂质体的200微升的5％葡萄糖溶液(脂质剂量＝60毫克/公斤)。在特定时间点，用二氧化碳窒息无痛致死小鼠，用5毫升冰冷的hanks BalancedSalt Solution(HBSS)灌洗回收腹膜排出细胞。用细胞计数器(Coulter Diagnostics；Hiatech，Fla.，USA)定量灌洗液中细胞浓度，用HBSS洗涤细胞两次。在最后一次洗涤后，将细胞沉淀重悬浮在cRPMI中。
NK试验。为了测定NK活性，如Bramson等(13)所述测试腹膜排出细胞裂解51Cr标记的YAC-1细胞的能力。一个裂解单位(LU)相当于产生5000个YAC-1细胞的30％特异性裂解的排出细胞数。
TNF-α生物试验。如Khabar等(14)所述进行TNF-α生物试验，用以下修改：在试验期终点，从各孔中取出100微升上清液，在各孔中加入20微升MTS溶液(CellTiter 96水相非放射性细胞增殖试验；Promega，WI，USA)再培养平板1.5个小时。测量各孔中的溶液490纳米的吸光度。通过与重组标准品比较，计算实验孔中TNF-α的浓度。常规上该试验对于15皮克/毫升的重组标准品是敏感的。
细胞因子ELISA。用特异性ELISA如厂商所述测量IFNγ(Endogen；Woburn，MA，USA)和IL-12p70(Pharmagen；Sandiego，CA，USA)。
一氧化氮(NO)释放试验。将5×105腹膜排出细胞等份转移到24孔板中。然后在+/-10纳克/毫升LPS，总体积为1毫升的培养基中培养细胞24小时。培养完毕后，用Griess试验测试上清液中硝酸盐浓度。将100微升等份的培养培养液与100微升Griess试剂[等体积Griess试剂A(0.1％N-(1-萘基)乙二胺)和Griess试剂B(1％磺胺的5％磷酸溶液)]在平底96孔板中混合。然后测量各孔在570纳米处的吸光度。用1mM到1.6μM的标准曲线测定硝酸盐浓度。
细胞和0.25微克/毫升DNA(与100nm LUV复合，含有1∶1摩尔比的阳离子脂和DOPE)培养过夜。然后裂解细胞，如“材料和方法”部分中所述测量荧光酶表达。图24A-C显示了结果。在该实验中使用了三种肿瘤细胞系：小鼠纤维肉瘤MCA207(图24A)、人卵巢癌SKOV-3(图24B)、和人结肠直肠癌LS180(图24C)。该数据反映了3个独立实验之一。各条代表4次重复转染的平均RLU+s.e.m。含有DODAC、DOTAP或DOTMA的脂复合物的转染情况说明了不同的阳离子脂具有不同的转染能力，不同的肿瘤细胞系对其的应答也不同。这提示视治疗的适应症(肿瘤类型)本发明的颗粒可使用不同的阳离子脂。
用50微克DNA(与100nm LUV复合，含有1∶1摩尔比的阳离子脂和DOPE)接种C57B1/6小鼠。在第0、1、3和5日收集腹膜排出细胞。图25显示了结果，代表每组4-6只动物的2次独立实验的结果。各点代表8-12只小鼠的灌洗液中平均细胞滤出液±s.em.。如所示，施用脂复合物后腹膜内细胞比例增加，但第5日DOTAP脂复合物分解到接近正常水平。
用50微克DNA(与100nm LUV复合，含有1∶1摩尔比的阳离子脂和DOPE)接种C57B1/6小鼠。在第1、3和5日收集腹膜排出细胞。图26A-C显示了用DODAC(图26A)、DOTAP(图26B)和DOTMA(图26C)作为阳离子脂，每组4-6只动物的两次独立实验的结果。各点代表8-12只小鼠的灌洗液中IFN-γ平均浓度±s.e.m.。如所示，细胞因子IFN-γ对于不同阳离子脂的处理应答不同。在这些实验中检测不到对于TNF-α或IL-12的应答。
用50微克DNA(与100nm LUV复合，含有1∶1摩尔比的阳离子脂和DOPE)接种C57B1/6小鼠。在第1、3和5日收集腹膜排出细胞，测试对51Cr标记的YAC-1细胞的细胞毒性。图27显示了每组4-6只动物的2次独立实验的结果。各点代表4-6只小鼠的灌洗液中平均裂解单位±s.e.m.。如所示，NK细胞脂复合物诱导的激活与这些实验中细胞滤出液的聚集平行。DODAC和DOTMA脂复合物引起NK活性在5日内的进行性增加，而DOTAP脂复合物诱导NK活性，其在第3日达到峰值，在第5日仍有充分提高。在炎症反应过程中，腹腔内激活的巨噬细胞仍有增加(结果未显示)。
总的说，这些结果提示由于炎症信号是激活分枝树突状细胞正确成熟和功能必需的，因此脂复合物施用后的炎症应答可逆转肿瘤衍生的细胞因子的作用。另外，由于观察到脂复合物的施用导致局部NK活性增加，而且NK细胞已显示自发裂解肿瘤细胞，对肿瘤微环境施用脂复合物的联合作用可能产生理想的治疗反应。
实施例5
设计该系列实验调查在施用脂质包裹的ISS寡脱氧核苷酸后f血清细胞因子的诱导。
材料和方法
1，2-二硬酯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-氯化三甲基铵(DOTAP)购自Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL，USA)，而胆固醇购自sigma(St.Louis，MO，USA)。1-O-(2′-(ω-甲氧基聚乙二醇)琥珀酰基)-2-N-肉豆蔻酰基鞘氨醇(PEG-Cer14)由Dr.Zhao Wang(Inex Pharmaceuticals Corp.)合成。所用的ODN包括与人/小鼠c-myc原癌基因mRNA互补的15聚c-myc ODN(5′-AACGTTGAGGGGCAT-3′)(SEQ ID NO.5)、同一ODN的16聚形式(5′-TAACGTTGAGGGGCAT-3′)(SEQ ID NO.4)、和与ICAM-1mRNA3′-非翻译区互补的ICAM-1ODN(ISIS 3082)(5′-TGCATCCCCCAGGCCACCAT-3′)(SEQ ID NO.2)。c-MYC ODN来自Lynx Therapeutics(Hayward，CA，USA)，ISIS 3082购自BostonBiosystems，Inc.(Bedford，MA，USA)。从Harlan sprague Dawley(Indianapolis，IN，USA)获得了6周龄的ICR小鼠，在使用前至少1周检疫。
SALP。如前所述(Semple等，1999)制备了含有DSPC∶胆固醇∶DODAP∶PEG-CerC14(20∶45∶25∶10摩尔比)的SALP。对于PS ODN，用200mM柠檬酸缓冲液溶解ODN，而用20mM柠檬酸，pH4.0溶解含PO ODN的SALP。简单说，将溶于乙醇的脂混合物加到ODN(3.33毫克/毫升)柠檬酸缓冲液(40％最终乙醇浓度)中。冻融得到的小泡5次，用挤压机(Northern Lipids，Van，BC，Can.)挤过2片层叠的100纳米孔径的滤膜。小泡对柠檬酸缓冲液透析2小时，除去乙醇，然后在500倍体积的HBS(150mM NaCl，20mM HEPES，pH7.5)中过夜，在外部单层上中和DODAP。从制备物中用DEAE-琼脂糖CL-6B阴离子交换层析除去未包裹的ODN。基于A260的ODN定量和磷酸试验定量的脂含量(Fiske & Subbarow 1925)计算ODN与脂质比，假定脂混合物含有20摩尔％的DSPC。由于ODN骨架上的磷酸会影响脂质分析，对样品进行Bligh & Dyer(1959)然后用水-甲醇洗涤3次，除去ODN。ODN与脂的比通常是0.15-0.20(wt/wt)。用NICOMP亚微米颗粒分级器(370型)进行准弹性光散射测定的小泡尺寸大约是120纳米。
血清分离。用0.2毫升HBS中的样品静脉内注射ICR小鼠(实验起始是7周龄)。在不同时间用极限剂量的麻醉剂(3.2％(v/v)开他敏/0.8％(v/v)甲苯噻嗪)杀死小鼠。离心血液(2000xg，4℃10分钟)，沉淀血细胞，分离血清并在-20℃下冷冻，直到进行试验。
ELISA。用商品ELISA试剂盒(PharMingen，San Diego，CA，USA)测定IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ、MCP-1和TNF-α的血清含量。
该实施例中所用的免疫刺激性CpG ODN是设计成与小鼠和人c-myc原癌基因的起始密码区互补的反义ODN。该ODN的15和16聚物都显示在体外和体内针对各种人和小鼠肿瘤的活性(Leonetti等；Citro等，1998；Harasym等，手稿正在起草中)。然而，两种ODN(16聚物和15聚物相同，除了5’末端有一个额外的胸腺嘧啶)含有已知的刺激性CpG基序，5′-(T)AACGTT-3′(Ballas等，1996)。该研究中所用的对照ODN序列是ISIS3082，一种与小鼠ICAM-1mRNA的3′非翻译区互补的20聚反义ODN。与c-myc ODN相反，ISIS3082不含CpG基序，在体外不是免疫原性的(Boggs等，1997)。
之前已观察到与血清细胞因子水平提高有关的对游离PS ODN的免疫应答。腹膜内注射游离PS ODN(50毫克/公斤)治疗的ICR小鼠具有提高的IL-12、IL-6、MIP-β和MCP-1水平，而IFN-γ、IL-10、IL-2和IL-4不变(Zhao等，1997)。为了评估SALP包裹的作用，我们进行了相似的研究，测定用20毫克/公斤游离形式或包裹的(SALP x-myc PS ODN)16聚c-myc PS ODN，或空SALP小泡注射的ICR小鼠的血清细胞因子水平。经过24小时测定的血清细胞因子水平包括影响Th1/Th2应答(IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10)、MCP-1(巨噬细胞趋化因子)和TNF-α(炎症介体)的细胞因子水平。在Th1/Th2关联的细胞因子中，IL-12和IFN-γ是Th1应答的强启动子，而IL-4和IL-10促进Th2应答。发现注射游离c-myc PS ODN在注射2-24小时后诱导显著提高，峰表达在4小时时发生(与未处理小鼠相比提高20倍)(图28B)。MCP-1(图28C)和IL-10(图29B)微弱增加2-3倍，而在IL-6中未见显著差异(图28A)、IFN-γ(图1D)、IL-2(图29A)、IL-4(图29C)和TNF-α(图29D)水平。
在脂质体中包裹c-myc PS ODN提高ODN的促细胞分裂性。与游离c-myc PSODN类似，注射SALP c-myc PS ODN 2小时后IL-12水平大大提高，在4小时达到峰值表达(图28B)。用c-myc PS ODN诱导的IL-12水平是基线的50倍，或比游离c-myc PS ODN高2.5倍。血清中IL-6(1000倍)、MCP-1(400倍)和IFN-γ(20倍)的水平也大大增强，IL-6和MCP-1的峰表达出现在4小时，而IFN-γ出现在8小时(图28A-D)。TNF-α(图29D)和IL-10(图29B)水平与未处理小鼠相比显著增加，而IL-2和IL-4水平未受影响。还调查了空SALP的作用。注射1小时后可见IL-6开始增加，而在3小时后回到基线水平(图28A)。还微弱诱导了MCP-1和IL-12水平，但与IL-6相似，与SALP c-myc PS ODN相比少得多(图28A-D)。IFN-γ表达未变。因此SALP c-myc PS ODN诱导细胞因子血清水平不是由于游离ODN和脂质载体的额外作用。
ODN骨架对血清细胞因子诱导的作用
线性或单链的PO ODN被血清核酸酶迅速降解(Fisher等，1993)，因此与更稳定的游离形式的磷酸硫酯ODN相比，没有免疫原性(Boggs等，1997)。然而，包裹该ODN将保护它在循环中不被降解。如果免疫系统演化成识别含有CpG基序的细菌DNA，那么预期具有正常磷酸二酯骨架的ODN是更容易被识别的，因此与含有经化学修饰的磷酸硫酯骨架刺激性相当强的。因此，感兴趣的是比较含有PS和PO ODN的SALP制剂的免疫原性。由于限制了条件，在该实验中使用15聚PO c-myc ODN，而用在5′端含有额外的胸腺嘧啶的16聚c-myc ODN作为PSODN。两种ODN已知的免疫刺激新基序相同，显示诱导的血清细胞因子水平在对照实验中，比较含有16聚PO或16聚c-myc PS ODN的SALP诱导的血清水平是相同的。在7天的过程中未发现显著差异。如另一个实验记录的，我们观察了两个实验间用类似的样品测量，在血清细胞因子水平上可有约2倍的差异。例如，虽然在下列实验中(图30A-D)用SALP c-myc PS ODN(16聚)和图28A-D所示的那些，在第一个实验中4小时时检测到23±2微克/毫升的IL-12，而在随后的研究中仅10±1。变化不是由于SALP制备物中的差异(数据未显示)，而是由于不同批的ICR小鼠之间的环境条件或遗传可变性引起的。然而重复实验表明不同样品类型之间观察到的比较差异仍然相对未变。
在图30A-D所示的研究中，用20毫克/公斤SALP c-myc PS ODN(16聚)、SALPc-myc PO ODN(15聚)或游离的c-myc PO ODN(15聚)注射ICR小鼠，在8日过程中测量血清细胞因子水平。在注射SALP c-myc PS ODN的小鼠中，如前(图28A-D)检测到IL-6、IL-12、MCP-1和IFN-γ的血清浓度，IL-6(图30A)、IL-12(图30B)和MCP-1(图30C)的峰值是4小时，对于IFN-γ(图30D)的峰值是8小时。用SALPc-myc PO ODN注射的小鼠在约4小时或8小时时也显示最大血清细胞因子诱导，然而表达的细胞因子水平更高。MCP-1的血清细胞因子水平增加了1.4倍，而对于IL-12、IFN-γ和IL-6(图3)观察到2-4倍的增加。在用游离c-myc PO ODN注射的小鼠中，如预期的未检测到血清细胞因子水平的可检测变化，因为磷酸二酯ODN在循环中快速降解。
当我们观察24小时后的IFN-γ水平时，检测到含磷酸硫酯和磷酸二酯ODN的SALP之间的第二个主要差异。在用SALP c-myc PS ODN注射的小鼠时，如先前说明8小时产生IFN-γ峰值，而在第2和7日之间可见第二次广泛诱导，约5日时产生峰值(图31A)。在8小时时诱导高水平IFN-γ的SALP c-myc PO ODN还导致约6日时开始的第二个IFN-γ峰(图31B)。然而，表达的量与SALP c-myc PS ODN相比明显低。含磷酸硫酯和磷酸二酯ODN的SALP诱导的IFN-γ水平的差异提示，第二个IFN-γ阶段依赖于未降解ODN的存在。已鉴定聚核苷酸诱导的IFN-γ是体内NK细胞响应巨噬细胞释放的IL-12分泌的(Chase等，1997)。然而当分析血清IL-12时第二个IL-12诱导期不明显。可见用SALP c-myc PS ODN在3-5日之间(72-120小时)(图32A)，，用SALP c-myc PO ODN7日时(图32B)IL-12增加很少。图5中的虚线代表HBS注射小鼠的IL-12水平。两个诱导期相对IL-12和IFN-γ水平的差异的一个解释是在后一个阶段，存在更多NK细胞(Bramson等，提交)，因此放大了IL-12的作用。另一个可能性是可能是由树突状细胞的成熟引起的IL-12的释放是局部的。在摄取SALP/ODN后，未成熟的树突状细胞将被激活，易位到滤水淋巴结内富含T细胞的区域，释放IL-12并刺激T细胞和NK细胞产生IFN-γ。游离c-myc PS ODN也诱导第二次IFN-γ表达，但需要更高(＞40毫克/公斤)的剂量实现可测量的(基线上2倍)差异，而游离c-myc PO ODN无效果(数据未显示)。检测IL-6和MCP-1水平中没有显著增加，在7日过程中超过最初4小时峰的尾端(图28和30)。另外，在IL-2、IL-4、IL-10或TNF-α水平中未检测到变化。
ODN序列依赖性
已发现SALP制剂中ODN的存在，对于在重复注射后，诱导含有聚乙烯-偶联的脂质的小泡的识别和清除具有适应性免疫原性作用(Semple等，已提交)。然而所见的应答依赖于ODN序列和使用PS或PO ODN。因此，我们调查了SALP中ODN的序列和骨架关于诱导的细胞因子水平的作用。比较了两条ODN序列，c-myc ODN和非或弱免疫刺激性ISIS 3082。
用20毫克/公斤SALP c-myc PO ODN(15聚)、SALP ISIS 3082PO ODN或游离ISIS 3082PO ODN治疗小鼠，7日中测量血清Il-6、IL-12、MCP-1和IFN-γ水平。血清细胞因子的动力学与之前IL-6、MCP-1和IL-12的4小时峰表达，和IFN-γ的8和120小时峰表达观察到的相似。表I列出了这些时间点的血清细胞因子浓度，和之前两个研究获得的结果(图28和29)。IL-6、MCP-1、IL-12和IFN-γ的血清水平在用SALP ISIS 3082(PO)治疗的小鼠中比用SALP c-myc PO ODN治疗的小鼠低2-10倍。当比较ODN的PS形式时，获得的相似的效果。与含有ISIS PS ODN的SALP比较，SALP c-myc PS ODN诱导的上述细胞因子表达高10-2000倍。
剂量对细胞因子诱导的影响
为了更好的确定SALP诱导的细胞因子相对水平，我们用SALP c-myc PSODN(15聚)和游离c-myc PO ODN(15聚物)进行了剂量滴定研究。用2-20或10-60毫克/公斤SALP或游离的ODN分别注射小鼠，测量IL-6、IL-12、MCP-1和IFN-γ的血清水平。IL-12所示典型剂量滴度表明甚至在60毫克/公斤的c-myc PS ODN下，IL-6、IL-12。MCP-1和IFN-γ水平未达到与5毫克/公斤SALPc-myc PS ODN或SALP c-myc PO ODN相同的水平(图33)。
这些实验的结果显示，脂质载体中包裹的ODN的免疫原性增强。与游离ODNxiangbi，SALP免疫原性的增加部分是由于ODN的稳定性增强，也是由于巨噬细胞的生物分布。前者可解释用包裹的c-myc PO ODN与游离的PO ODN相比观察到更高的细胞因子表达，后者是由于血清核酸酶快速降解。用更具核酸酶抗性的PSODN，巨噬细胞中提高的ODN分布类似由SALP提高的免疫原性引起，和游离PSODN相对。包裹的PO ODN比对应的SALP PS ODN更具免疫刺激性，可能反映了CpG聚核苷酸的模式识别受体，其预期与天然PO骨架具有更强的亲和力。
当在SALP中施用时，不含CpG序列基序的ISIS 3082PO ODN也刺激细胞因子表达。不清楚该效果是否是由于ODN(非CpGODN能在体外刺激树突细胞(Jakob等，1998)和B细胞(Davis等，1998；Monteith等，1997)，但需要高得多的浓度)，或是由于脂质/ODN组合，而不是简单由于ODN本身。如细胞因子(IFN-γ)或诱导的同型抗体(IgG2a)证明的，甚至当抗原单独具有Th2偏性的应答时(Afrin & Ali，1998；Krishnan等，2000；Sehra等，1998)，含有蛋白质抗原的脂质体可能增强Th1-型应答。在细胞水平上，脂质体蛋白质颗粒改变APC中脂质和蛋白质的胞内运输模式，从而使抗原也能进入MHC I型家族(Rao & Alving，2000)。Th1偏性的应答和与MHC I型分子的结合是对胞内病原体(如病毒)的经典应答。用含有可作为病毒样颗粒被识别的聚核苷酸的脂质体可产生类似效果。
用游离和包裹的c-myc PS ODN诱导IL-12表明诱导了Th1型应答。另外，当ODN在SALP中施用而不是游离形式施用时，大大上调了IFN-γ、IL-6和MCP-1(表2)。因此，SALP显著增强了免疫应答，但似乎不改变可被ODN诱导的细胞因子的类型或动力学(cf Zhao等，1997；Klinman等，1996)。然而，改变了诱导的细胞因子的相对表达。例如，SALP与游离c-myc PS ODN相比，仅提高了IL-12表达2-3倍，而IFN-γ表达提高了1000倍(表3)。这不是简单的由于IL-12对下游IFN-γ表达的放大作用，因为SALP ISIS 3082在4小时时诱导的IL-12水平与游离c-mycPS相比低得多，但是在8小时时刺激大于1000倍的IFN-γ表达。
在响应SALP大大上调的4种细胞因子中，已知IL-12和IFN-γ在CpG ODN抗肿瘤作用(Dow等，1999)和对感染性媒介的抵抗(Walker等，1999；Krieg等，1998；Schwartz等，1999；Zimmermann等，1998)是重要或关键的。实验已表明，DNA/脂质颗粒对IFN-γ的最大诱导是在8小时(Dow等，1999；Whitmore等，1999)，与该研究中的结果类似。在比该时间早的时刻，SALP PO ODN比SALP PS ODN诱导的IFN-γ表达水平高得多，然而，当我们将时间延长到7日以上，观察到在约第5日发生的第二个更宽的IFN-γ诱导阶段(图31)。这第二个IFN-γ峰对于SALP PSODN是最大的，但是对于含有PO ODN的SALP就小得多，提示需要完整ODN的存在。这第二个IFN-γ峰之前没有相应的高血清IL-12表达提示，免疫系统已改变或起动，可能是通过NK细胞的扩增(Bramson等，2000)或树突细胞的成熟(Lipford，1998)。IFN-γ涉及激活巨噬细胞和NK细胞，抑制肿瘤血管生成，以及通过诱导抗体同型改变调节适应性免疫应答。IL-12和IFN-γ启动Th1应答。该细胞因子显示抗转移和抗血管生成性，导致肿瘤被巨噬细胞深入浸润。另外，IL-12在临床试验中作为抗癌剂，因为它能抑制生长并导致免疫原性更强的肿瘤退化(Golab& Zagozdzon，1999)。
MCP-1的表达，它能由各种细胞产生，包括表皮和平滑肌细胞(Graves &Valente，1991)，特别与单核细胞和巨噬细胞有关。除了其趋化作用，MCP-1还可通过上调巨噬细胞上的粘着分子，诱导接触依赖性的肿瘤细胞裂解(Shinohara等，2000)。由B细胞和巨噬细胞释放，体外响应CpG ODN(ref)的IL-6涉及刺激B细胞分化和诱导急性阶段蛋白质。
与本研究中所见的细胞因子诱导的差异不同，先前未见SALP对ODN序列和骨架有依赖性，该处发现SALP有诱导免疫识别和后继的含PEG-脂质小泡的清除。这可能是由于各种原因。可能不同的抗PEG抗体滴度是由不同的含ODN的SALP产生的，但在测量的小泡清除速率中不可检测。另外，适应性应答的产生与初始先天应答相比，对于ODN不敏感。例如，支持适应性免疫应答的起动信号可能需要仅一个阈值信号，来支持B-细胞分化和增殖，而ODN对巨噬细胞的作用更直接。
本文报道的结果表明在脂质体小泡(如SALP)中包裹ODN大大增强了ODN的免疫原性，使任何与甚至相对非免疫原性的ODN(如ISIS 3082)真正的反义活性变复杂。然而，这些结果支持了SALP在免疫治疗中的潜在用途。已用游离的CpGODN作为蛋白质基的疫苗(ref)的佐剂和作为抵抗感染(ref)和抗癌治疗(ref)的药物。CpG ODN所见的可能益处是它们能刺激Th1偏向的佐剂应答，如本研究中证明的，可被SALP显著增强。SALP的免疫刺激作用可证明有利于激活肿瘤相关的巨噬细胞变为肿瘤杀伤性，这是现在用另一种免疫调节剂胞壁酰基二肽的方法(Fidler等，1997；Worth等，1999)。另外，免疫刺激能通过减少所需细胞因子量，以防止正常细胞凋亡(Killion等，1996；Shinohara等，1998)降低抗癌药(如阿霉素)的毒性副作用。从佐剂的观点来看，脂质体可共同定位抗原和CpG ODN，该作用能增强体液应答。目前进行的研究有比较SALP和其它常用佐剂(如一磷酸脂A、铝盐和弗氏佐剂)的佐剂质量。
表2
各种ODN制剂诱导的血清细胞因子水平的比较
  IL-6(皮克/毫升)4小时   MCP-1(皮克/毫升)4小时   IL-12(皮克/毫升)4小时   IFN-γ(皮克/毫升)8小时   IFN-γ(皮克/毫升)120小时
  游离c-myc PS   0±5   2±1   7±2   80±6   130±10
  c-myc PO   50±10   0±0   0±1   101±7   47±5
  ISIS 3082PS   0±2   0±0   1±0   43±3   64±2
  ISIS 3082PO   30±10   2±2   1±1   110±10   40±1
  SALPc-myc PS   900±200   36±5   12±3   1700±400   2200±400
  c-myc PO   3100±600   51±6   36±5   5000±2000   260±40
  ISIS 3082PS   0±3   0±0   2±1   60±10   80±10
  ISIS 3082PO   400±100   7±2   3±2   2300±500   34±2
  HBS   60±80   0±0   1±1   100±50   100±50
所提供的例子说明了本发明的一些实施例。然而从广义上说，本发明包含组合物和对哺乳动物个体(包括人)提供这些组合物的方法。本发明的组合物的形式是含有脂膜的小泡；和完全包裹在所述小泡中的核酸。当需要刺激产生对特定抗原的应答时，该组合物还可将抗原掺入小泡中，例如通过与小泡外表面结合。
优选组合物是核酸占组合物重量4％以上的组合物。
本发明组合物中的核酸可以是合适的核酸，它不和受治疗的动物的基因组互补，并通过不依赖于与哺乳动物的核酸互补的碱基配对作用的机制提供免疫刺激。这些核酸常常含有免疫刺激性序列，如CpG基序或免疫刺激性回文序列。
本发明的组合物中使用的核酸可以是当以游离形式施给未受免疫攻击的哺乳动物时不诱导免疫应答的核酸，或当以游离形式施给未受免疫攻击的哺乳动物时，抑制对核苷酸的免疫刺激性序列免疫应答的核酸。
核酸可以完全是磷酸二酯键或可以是经修饰的，其方式是具有多个磷酸二酯核苷酸间的键和经修饰的核苷酸间的键。核苷酸还可完全是磷酸硫酯核苷酸间键或多个磷酸硫酯核苷酸间键。
用于合适的配制组合物的阳离子脂选自DODAP、DODAP、DODMA、DMDMA、DOTAP、DC-Chol、DDAB、DODAC、DNRIE、DOSPA和DOGS。另外，脂质制剂优选含有防聚集化合物，如PEG-脂质、PAO-脂质或神经节苷脂。
除了或代替抗原，本发明的组合物可含有共同包裹的细胞毒性剂，如阿霉素。脂膜载体完全包裹核酸和细胞毒性剂。该类组合物可用作为本发明的另一部分的方法制备。在该方法中，将脂质制备在乙醇中；将脂与寡核苷酸在水相缓冲液中混合，形成负荷寡核苷酸的脂质小泡；并使寡核苷酸负荷的脂质小泡与细胞毒性剂接触，使细胞毒性剂活性聚集在所述小泡的内部空间中，制备治疗组合物。
本发明的组合物可以不同方法使用，对哺乳动物(包括人提供治疗上的益处)，通过使用脂质-核酸颗粒(含有完全包裹在脂质制剂中的核酸，该脂质制剂含有制造药物中的阳离子脂)。因此，可用组合物在哺乳动物中诱导免疫应答，激活哺乳动物中的B细胞或治疗具有肿瘤形成的哺乳动物中的肿瘤形成，使用方法：制备含有完全包裹在脂质制剂中的核酸的脂质-核酸颗粒，该脂质制剂含有阳离子脂；对哺乳动物施用脂质-核酸颗粒。
当在组合物中包括抗原时，本发明提供了一种诱导对抗原的免疫应答的方法，包括：制备含有脂膜小泡和一种抗原的颗粒，该脂膜小泡含有完全包裹在所述小泡中的核酸，所需抗原是免疫应答所针对的，它与所述小泡外表面结合，并将颗粒施给要治疗的哺乳动物。
本发明的一个特定应用是治疗淋巴瘤。因此，本发明提供了一种治疗淋巴瘤的方法，包括：对患有淋巴瘤的个体/病人施用以0.0075-75毫克/公斤寡核苷酸完全包裹在脂膜小泡中的寡核苷酸，该寡核苷酸含有多个磷酸二酯键。在本发明的一个实施例中，寡核苷酸含有免疫刺激性序列。
如上文实施例中所显示的，根据本发明，在组合物中利用脂质载体，使需要实现免疫系统的所需刺激的寡核苷酸量充分减少。在某些情况下，这由当以脂质包裹的形式提供时，游离形式下没有明显活性的寡核苷酸能用于刺激免疫应答反映。在其它情况下，这由需要用较低的ODN剂量水平，实现相同应答水平的ODN量反映。因此，在实施使用有效量的寡核苷酸刺激哺乳动物的免疫应答的方法中，本发明提供了改进，包括在脂质小泡中完全包裹寡核苷酸，对哺乳动物个体施用小于所述有效量20％的寡核苷酸，从而在所述哺乳动物个体中获得所述免疫应答。
序列表
<110>英耐克斯药品股份有限公司(Inex Pharmaceuticals Corp..)
     S.森普尔(SEMPLE，Sean)
     T.哈拉斯姆(HARASYM，Troy)
     S.克利穆克(KLIMUK，Sandra)
     L.科吉(KOJIC，Ljiljiana)
     J.L.布拉松(BRAMSON，Jonathan)
     B.缪尔(MUI，Barbara)
     M.霍普(HOPE，Michael)
<120>用于刺激细胞因子分泌和诱导免疫应答的组合物
<130>INEXP006WO
<150>60/176,406
<151>2000-01-13
<150>60/151,211
<151>1999-08-27
<160>11
<170>PatentIn Ver.3.0
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>人ICAM-1mRNA的3’非翻译区
<222>(1)..(20)
<400>1
gcccaagctg gcatccgtca                                     20
<210>2
<211>46
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>小鼠ICAM-1mRNA的3’非翻译区
<222>(1)..(20)
<400>2
tgcatccccc aggccaccat                                     20
<210>3
<211>15
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>人表皮生长因子mRNA，受体翻译区密码子区
<222>(1)..(15)
<400>3
ccgtggtcat gctcc                                          15
<210>4
<211>16
<212>DNA
<213>人类/小鼠(Homo sapiens/Mus musculus)
<220>
<221>人类/小鼠c-myc原癌基因mRNA的起始密码子区
<222>(1)..(16)
<400>4
taacgttgag gggcat                                         16
<210>5
<211>15
<212>DNA
<213>人类/小鼠(Homo sapiens/Mus musculus)
<220>
<221>人类/小鼠c-myc原癌基因mRNA的起始密码子区
<222>(1)..(15)
<400>5
aacgttgagg ggcat                                          15
<210>6
<211>16
<212>DNA
<213>质粒
<220>
<221>非-ISS对照
<222>(1)..(16)
<400>6
taagcatacg gggtgt                                         16
<210>7
<211>15
<212>DNA
<213>质粒
<220>
<221>ISS对照
<222>(1)..(15)
<400>7
aacgagttgg ggcat                                          15
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>质粒
<220>
<221>与c-myb mRNA杂交
<222>(1)..(24)
<400>8
tatgctgtgc cggggtcttc gggc                                24
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>质粒
<220>
<221>与IGF-1R mRNA的杂交物
<222>(1)..(18)
<400>9
ggaccctcct ccggagcc                                       18
<210>10
<211>15
<212>DNA
<213>质粒
<220>
<221>对照PO
<222>(1)..(15)
<400>10
aagcatacgg ggtgt                                          15
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>质粒
<220>
<221>含有3个CpG基序的对照
<222>(1)..(20)
<400>11
tcgcatcgac ccgcccacta                                     20

Claims (28)

1.一种刺激哺乳动物中细胞因子分泌的组合物，该组合物含有寡脱氧核苷酸和脂质颗粒，其特征在于，所述脂质颗粒是阳离子脂质，含有完全包裹内部空间的脂膜外部，其中所述颗粒平均直径50-200纳米，其中所述寡脱氧核苷酸包含在内部空间中，或与包裹膜的内表面结合，其中所述寡脱氧核苷酸是无序列特异性的免疫刺激性序列。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述无序列特异性的免疫刺激性序列含有至少一个CpG基序。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，寡脱氧核苷酸由脱氧核苷酸残基磷酸二酯键组成。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述阳离子脂质选自DODAP、DODMA、DMDMA、DOTAP、DC-Chol、DDAB、DODAC、DMRIE、DOSPA和DOGS。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述阳离子脂质是DODMA。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述脂质颗粒还含有可交换立体屏障脂质。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述可交换立体屏障脂质是PEG-脂质、PAO-脂质或神经节苷脂。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述可交换立体屏障脂质是PEG-脂质。
9.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述脂质颗粒还含有中性脂质。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述中性脂质是二酰基卵磷脂。
11.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述脂质颗粒还含有胆固醇。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述脂质颗粒含有以摩尔百分数计的20％中性脂质、45％胆固醇、25％阳离子脂质、和10％PEG-脂质。
13.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述颗粒的寡核苷酸和脂质组分以0.001-0.45的重量比存在。
14.含有寡脱氧核苷酸和脂质颗粒的组合物的用途，所述脂质颗粒是阳离子脂质，含有完全包裹内部空间的脂膜外部，其中所述颗粒平均直径50-200纳米，其中所述寡脱氧核苷酸包含在内部空间中，或与包裹膜的内表面结合，其特征在于，该组合物用于制备刺激细胞因子分泌的药物制备物，所述寡脱氧核苷酸是无序列特异性的免疫刺激性序列。
15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述无序列特异性的免疫刺激性序列含有至少一个CpG基序。
16.如权利要求14所述的用途，其特征在于，寡脱氧核苷酸由通过磷酸二酯键连接的脱氧核苷酸残基组成。
17.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述阳离子脂质选自DODAP、DODMA、DMDMA、DOTAP、DC-Chol、DDAB、DODAC、DMRIE、DOSPA和DOGS。
18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述阳离子脂质是DODMA。
19.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述脂质颗粒还含有可交换立体屏障脂质。
20.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述可交换立体屏障脂质是PEG-脂质、PAO-脂质或神经节苷脂。
21.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述可交换立体屏障脂质是PEG-脂质。
22.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述脂质颗粒还含有中性脂质。
23.如权利要求22所述的用途，其特征在于，所述中性脂质是二酰基卵磷脂。
24.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述脂质颗粒还含有胆固醇。
25.如权利要求24所述的用途，其特征在于，所述脂质颗粒含有以摩尔百分数计的20％中性脂质、45％胆固醇、25％阳离子脂质、和10％PEG-脂质。
26.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述颗粒的寡核苷酸和脂质组分以0.001-0.45的重量比存在。
27.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述组合物还含有抗原性分子，所述抗原性分子选自含有至少一个靶抗原表位的多肽和编码至少一个靶抗原表位的核酸，所述组合物用于制备刺激细胞因子分泌和对靶抗原的免疫应答的药物。
28.如权利要求27所述的用途，其特征在于，所述抗原分子与脂质颗粒结合。
CNB008137692A 1999-08-27 2000-08-28 用于刺激细胞因子分泌和诱导免疫应答的组合物 Expired - Fee Related CN100368020C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15121199P 1999-08-27 1999-08-27
US60/151,211 1999-08-27
US17640600P 2000-01-13 2000-01-13
US60/176,406 2000-01-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1501811A CN1501811A (zh) 2004-06-02
CN100368020C true CN100368020C (zh) 2008-02-13

Family

ID=26848421

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB008137692A Expired - Fee Related CN100368020C (zh) 1999-08-27 2000-08-28 用于刺激细胞因子分泌和诱导免疫应答的组合物

Country Status (15)

Country Link
EP (1) EP1212085B1 (zh)
JP (1) JP2003509341A (zh)
KR (1) KR100737980B1 (zh)
CN (1) CN100368020C (zh)
AT (1) ATE376838T1 (zh)
AU (1) AU780535B2 (zh)
BR (1) BR0013834A (zh)
CA (1) CA2382611A1 (zh)
CZ (1) CZ20021029A3 (zh)
DE (1) DE60036950T2 (zh)
HU (1) HUP0202327A3 (zh)
IL (1) IL148359A0 (zh)
MX (1) MXPA02002107A (zh)
PL (1) PL354879A1 (zh)
WO (1) WO2001015726A2 (zh)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7129222B2 (en) 2000-03-10 2006-10-31 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US20030129251A1 (en) 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
FR2814958B1 (fr) * 2000-10-06 2003-03-07 Aventis Pasteur Composition vaccinale
ATE471374T1 (de) 2000-12-27 2010-07-15 Dynavax Tech Corp Immunomodulatorische polynukleotide und verfahren zur deren verwendung
US20030199466A1 (en) 2001-06-21 2003-10-23 Fearon Karen L. Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same - ll
WO2003000232A2 (en) * 2001-06-25 2003-01-03 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Method for preparation of vesicles loaded with immunostimulator y oligodeoxynucleotides
US20030133988A1 (en) 2001-08-07 2003-07-17 Fearon Karen L. Immunomodulatory compositions, formulations, and methods for use thereof
CA2456201A1 (en) * 2001-08-10 2003-02-27 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory oligonucleotide formulations and methods for use thereof
US20030119774A1 (en) * 2001-09-25 2003-06-26 Marianna Foldvari Compositions and methods for stimulating an immune response
JP2005516897A (ja) * 2001-11-07 2005-06-09 イネックス ファーマシューティカルズ コーポレイション 改善された粘膜のワクチン及びその使用方法
MXPA04003192A (es) 2001-11-29 2004-07-27 Pfizer Prod Inc Sales de acido succinico de 5, 7, 14-triazatetraciclo ?10.3.1.02,11.04,9? -hexadeca-2(11), 3, 5, 7, 9-pentaeno y composiciones farmacetucias de las mismas.
AU2003229433B2 (en) * 2002-05-10 2008-04-24 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methylated immunostimulatory oligonucleotides and methods of using the same
WO2003094829A2 (en) * 2002-05-10 2003-11-20 Inex Pharmaceuticals Corporation Pathogen vaccines and methods for using the same
EP3100719A3 (en) 2002-05-15 2017-02-22 California Pacific Medical Center Delivery of nucleic acid-like compounds
SG172476A1 (en) 2002-08-12 2011-07-28 Dynavax Tech Corp Immunomodulatory compositions comprising a cationic condensing agent, an immunostimulatory compound comprising 5'-cg-3', an a non ionic detergent
DE60329223D1 (de) 2002-12-23 2009-10-22 Dynavax Tech Corp Oligonukleotide mit einer immunsystemstimulierenden sequenz und verfahren zu deren anwendung
US8158768B2 (en) 2002-12-23 2012-04-17 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
CA2542099A1 (en) * 2003-10-11 2005-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Methods and compositions for enhancing innate immunity and antibody dependent cellular cytotoxicity
WO2005060330A2 (en) * 2003-12-22 2005-07-07 Statens Serum Institut Freeze-dried vaccine adjuvant
CA2600036A1 (en) 2005-03-04 2006-09-14 Dynavax Technologies Corporation Vaccines comprising oligonucleotides having immunostimulatory sequences (iss) wherein the iss are conjugated to antigens and stabilized by buffer conditions and further excipients
EP2476756A1 (en) 2005-06-15 2012-07-18 Massachusetts Institute of Technology Amine-containing lipids and uses thereof
CN100418583C (zh) * 2006-02-21 2008-09-17 朱鸿飞 预防和治疗乳腺炎的药物组合物
US20110117125A1 (en) 2008-01-02 2011-05-19 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Compositions and methods for the delivery of nucleic acids
NZ588583A (en) 2008-04-15 2012-08-31 Protiva Biotherapeutics Inc Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
CN104119242B (zh) 2008-10-09 2017-07-07 泰米拉制药公司 改善的氨基脂质和递送核酸的方法
US20120009222A1 (en) * 2008-10-27 2012-01-12 Massachusetts Institute Of Technology Modulation of the immune response
CN104910025B (zh) 2008-11-07 2019-07-16 麻省理工学院 氨基醇类脂质和其用途
US20120101148A1 (en) 2009-01-29 2012-04-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. lipid formulation
KR20180094137A (ko) 2009-05-05 2018-08-22 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 지질 조성물
CA3045126A1 (en) 2009-05-05 2010-11-11 Arbutus Biopharma Corporation Methods of delivering oligonucleotides to immune cells
US8158601B2 (en) 2009-06-10 2012-04-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulation
WO2011000107A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors
WO2012027675A2 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Massachusetts Institute Of Technology Poly(beta-amino alcohols), their preparation, and uses thereof
PL2691443T3 (pl) 2011-03-28 2021-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Sprzężone lipomery i ich zastosowania
KR20220045089A (ko) 2012-02-24 2022-04-12 아뷰터스 바이오파마 코포레이션 트리알킬 양이온성 지질 및 그의 사용 방법
EP2852380A4 (en) * 2012-05-23 2016-01-20 Univ Ohio State LIPID-COATED ALBUMIN NANOPARTICLE COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE PREPARATION AND METHOD OF USE THEREOF
CA2884870C (en) 2012-08-13 2022-03-29 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipidoids and uses thereof
WO2014179562A1 (en) 2013-05-01 2014-11-06 Massachusetts Institute Of Technology 1,3,5-triazinane-2,4,6-trione derivatives and uses thereof
EP3164379A1 (en) 2014-07-02 2017-05-10 Massachusetts Institute of Technology Polyamine-fatty acid derived lipidoids and uses thereof
EP3824891A4 (en) * 2018-07-19 2022-07-13 The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University LIPID PARTICLES WITH CPG OLIGODESOXYNUCLEOTIDE TYPE A
EP3892260A1 (en) * 2020-04-10 2021-10-13 Bayer Animal Health GmbH Immunostimulatory compositions based on liposomes with zwiterionic and cationic lipids
EP4019006A1 (en) * 2020-12-28 2022-06-29 Industrial Technology Research Institute Immunostimulatory lipoplex, pharmaceutical composition including immunostimulatory lipoplex, and uses thereof
WO2023144798A1 (en) 2022-01-31 2023-08-03 Genevant Sciences Gmbh Ionizable cationic lipids for lipid nanoparticles

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996002555A1 (en) * 1994-07-15 1996-02-01 The University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
WO1998018810A1 (en) * 1996-10-30 1998-05-07 The University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
WO1998051278A2 (en) * 1997-05-14 1998-11-19 Inex Pharmaceuticals Corporation High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2196028T3 (es) * 1994-04-12 2003-12-16 Elan Pharm Inc Liposomas fusogenicos y metodos de fabricacion y utilizacion.
DK1005368T3 (da) * 1997-03-10 2010-01-04 Ottawa Hospital Res Inst Anvendelse af nukleinsyrer, der indeholder ikke-metyleret CpG dinukleotid i kombination med alun som hjælpestoffer
JP4101888B2 (ja) * 1997-06-06 2008-06-18 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション 免疫刺激オリゴヌクレオチド、その組成物およびその使用方法
AU8525098A (en) * 1997-07-24 1999-02-16 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for the delivery of nucleic acid catalysts

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996002555A1 (en) * 1994-07-15 1996-02-01 The University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
WO1998018810A1 (en) * 1996-10-30 1998-05-07 The University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
WO1998051278A2 (en) * 1997-05-14 1998-11-19 Inex Pharmaceuticals Corporation High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles

Also Published As

Publication number Publication date
ATE376838T1 (de) 2007-11-15
DE60036950D1 (de) 2007-12-13
AU780535B2 (en) 2005-03-24
KR20020068500A (ko) 2002-08-27
CA2382611A1 (en) 2001-03-08
IL148359A0 (en) 2002-09-12
WO2001015726A3 (en) 2001-07-26
BR0013834A (pt) 2002-04-23
PL354879A1 (en) 2004-03-08
CN1501811A (zh) 2004-06-02
KR100737980B1 (ko) 2007-07-12
EP1212085B1 (en) 2007-10-31
DE60036950T2 (de) 2008-08-07
MXPA02002107A (es) 2003-08-20
EP1212085A2 (en) 2002-06-12
WO2001015726A2 (en) 2001-03-08
JP2003509341A (ja) 2003-03-11
AU6813900A (en) 2001-03-26
HUP0202327A3 (en) 2004-07-28
HUP0202327A2 (en) 2002-10-28
CZ20021029A3 (cs) 2002-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100368020C (zh) 用于刺激细胞因子分泌和诱导免疫应答的组合物
US20030104044A1 (en) Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response
Krieg CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects
Mutwiri et al. Strategies for enhancing the immunostimulatory effects of CpG oligodeoxynucleotides
Dalpke et al. Phosphodiester CpG oligonucleotides as adjuvants: polyguanosine runs enhance cellular uptake and improve immunostimulative activity of phosphodiester CpG oligonucleotides in vitro and in vivo
Semple et al. Immunogenicity and rapid blood clearance of liposomes containing polyethylene glycol-lipid conjugates and nucleic acid
Scheule The role of CpG motifs in immunostimulation and gene therapy
Nishikawa et al. Biodegradable CpG DNA hydrogels for sustained delivery of doxorubicin and immunostimulatory signals in tumor-bearing mice
Hanagata Structure-dependent immunostimulatory effect of CpG oligodeoxynucleotides and their delivery system
Kandimalla et al. Divergent synthetic nucleotide motif recognition pattern: design and development of potent immunomodulatory oligodeoxyribonucleotide agents with distinct cytokine induction profiles
Higgins et al. Immunostimulatory DNA as a vaccine adjuvant
US20040052763A1 (en) Immunostimulatory RNA/DNA hybrid molecules
MXPA06014915A (es) Multimeros oligonucleotidicos inmunoestimuladores.
CN114762695A (zh) 具有免疫增强活性的包含寡核苷酸的复合体及其用途
Dobrovolskaia et al. Immunological and hematological toxicities challenging clinical translation of nucleic acid-based therapeutics
Wilson et al. Effects of intravenous and subcutaneous administration on the pharmacokinetics, biodistribution, cellular uptake and immunostimulatory activity of CpG ODN encapsulated in liposomal nanoparticles
US20050249794A1 (en) Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response
Mizuno et al. Simultaneous delivery of doxorubicin and immunostimulatory CpG motif to tumors using a plasmid DNA/doxorubicin complex in mice
Wang et al. Oral administration of second-generation immunomodulatory oligonucleotides induces mucosal Th1 immune responses and adjuvant activity
Kuramoto et al. Inhibition of peritoneal dissemination of tumor cells by single dosing of phosphodiester CpG oligonucleotide/cationic liposome complex
Milhaud et al. Antibody targeted liposomes containing poly (rI)· poly (rC) exert a specific antiviral and toxic effect on cells primed with interferons α/β or γ
Pan et al. Antitumor activity of G3139 lipid nanoparticles (LNPs)
Rudginsky et al. Antitumor activity of cationic lipid complexed with immunostimulatory DNA
Zhou et al. Intranasal administration of CpG DNA lipoplex prevents pulmonary metastasis in mice
Maubant et al. Adjuvant properties of cytosine-phosphate-guanosine oligodeoxynucleotide in combination with various polycations in an ovalbumin-vaccine model

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20080213

Termination date: 20090928