MXPA06014915A - Multimeros oligonucleotidicos inmunoestimuladores. - Google Patents

Multimeros oligonucleotidicos inmunoestimuladores.

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MXPA06014915A
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immunostimulatory
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Sudhir Agrawal
Dong Yu
Ekambar Kandimalla
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Idera Pharmaceuticals Inc
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Abstract

La invencion provee un acido nucleico inmunoestimulador; en ciertas modalidades de acuerdo con este aspecto de la invencion, la secuencia del oligonucleotido inmunoestimulador y/o inmunomero es por lo menos parcialmente autocomplementario.

Description

MULTIMEROS OLIGONUCLEOT1DICOS 1NMUNOESTI ULADORES ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN SOLICITUDES RELACIONADAS Esta Solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de E.U.A. No. de Serie 60/579,985, presentada en Junio 15, del 2004, y la -Solicitud -Provisional de E.U.A. No. de Serie 60/599,362, presentada en Agosto 6, del 2004. Las enseñanzas completas de las Solicitudes referidas anteriormente se incorporan en la presente como referencia.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con la estimulación inmune mediante análogos oligonucleotídicos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA Tokunaga et al., J. Nati. Cáncer Inst. 72 (1984) 955-96; Pisetsky et al.; Reichet al., Mol. Biol. Rep. 18 (1993) 217-221 ; Krieg et al., Yi et al., Nature 374 (1995) 546-549 y Sato et al., Science 273 (1996) 352-354, enseñan que el ADÑ bacteriano, los oligodesoxinucleótidos sintéticos y las vacunas de ADN que contienen dinucleótidos CpG no metilados en contextos específicos de la secuencia (ADN CpG), activan el sistema inmune de los vertebrados. Krieg et al., Annu. Rev. Immunol. 20 (2002) 709-760; Dalpke et al., Biol. Chem. 383 (2002) 1491-1500 y Kandimalla et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 4 (2002) 122-129, enseñan que los ADN CpG inducen las células inmunes innatas para producir citocinas Th1 que fomentan el las respuestas del linfocito T citotóxico (CTL) y la producción de inmunoglobulinas por los linfocitos B. Las propiedades inmunoestimuladoras de los ADN CpG han permitido su uso como agentes terapéuticos para un amplio espectro de indicaciones de enfermedad, incluyendo cánceres, infecciones virales y bacterianas, trastornos inflamatorios y como adyuvantes en la inmunoterapia. Además de las modificaciones químicas, varias modificaciones estructurales influencian la actividad de los ADN CpG. Kandimalla et al., Nucleic Acids Res. 30 (2002) 4460-4469 enseñan que los ADN CpG que contienen dos extremos 5' libremente accesibles a través de un enlace 3'-3' tienen mayor actividad que los ADN CpG convencionales que contienen múltiples copias de los motivos CpG y un solo extremo 5'. Kandimalla et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 306 (2003) 948-953 enseña que la presencia de una estructura secundaria en los ADN CpG afecta de manera significativa su actividad dependiendo de la posición y la naturaleza de la estructura secundaria, que la presencia de una estructura de horquilla en el extremo 5' anula la actividad estimuladora, y que la misma estructura en el extremo 3' tuvo un efecto insignificante en la actividad estimuladora, pero causó una menor secreción de IL-6 y contribuyó a una estabilidad más alta contra las nucleasas. Existe la necesidad de "ajustar a la medida" la respuesta inmune a través de la modificación de los análogos oligonucleotídicos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la invención proporciona un oligonucleótido inmunoestimulador, la secuencia del cual es al menos parcialmente autocomplementaria. El ácido nucleico inmunoestimulador comprende una secuencia oligonucleotídica que contiene al menos un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste de CpG, C*pG, C*pG* y CpG*, en donde C es cistidina o 2'-desoxicistidina, G es guanosina o 2'-desoxiguanosina, C* es 2'-desoxitimidina, 1-(2'-desoxi-ß-D-r¡bofuranosil)-2-oxo-7-deaza-d-metil-purina, 2'-didesoxi-5-halocitosina, 2'-didesoxi-5-nitrocitosina, arabinocistidina, arabinocistidina 2'-desoxi-2'-sustituida, arabinocistidina 2'-O-sust¡tuida, 2'-desoxi-5-hidrox¡cistidina, 2'-desoxi-N4-alquil-cistidina, 2'-desoxi-4-tiouridina u otros análogos del nucleósido pirimidina, G* es 2'-desoxi-7-deazaguanosina, 2'-desoxi-6-tioguanosina, arabinoguanosina, arabinoguanosina 2'-desoxi-2'-sustituida, arabinoguanosina 2'-O-sustituida, 2'- desoxiinosina u otros análogos del nucleósido purina, y p es un enlace internucleósido seleccionado del grupo que consiste de fosfodiéster, fosforotioato y fosforoditioato. En algunas modalidades, el ácido nucleico inmunoestimulador es de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En ciertas modalidades, el ácido nucleico inmunoestimulador es de aproximadamente 12 a aproximadamente 26 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, los oligonucleótidos tienen cada uno de aproximadamente 3 a aproximadamente 35 residuos nucleosídicos, en las modalidades adicionales, de aproximadamente 4 a aproximadamente 30 residuos nucleosídicos, en modalidades aún adicionales, de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 residuos nucleosídicos. En algunas modalidades, los oligonucleótidos tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 18, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 14 residuos nucleosídicos. Como se utiliza en la presente, el término "aproximadamente" implica que el número exacto no es crítico. Así, el número de residuos nucleosídicos en los oligonucleótidos no es crítico, y los oligonucleótidos que tienen uno o dos residuos nucleosídicos menos, o de uno a varios residuos nucleosídicos adicionales, están contemplados como equivalentes de cada una de las modalidades descritas anteriormente. En algunas modalidades, uno o más de los oligonucleótidos tienen 11 nucleótidos. En un segundo aspecto, la invención proporciona un ¡nmunómero que comprende al menos dos oligonucleótidos enlazados por un enlazante no nucleotídico, en donde las secuencias de los oligonucleótidos inmunoestimuladores son al menos parcialmente autocomplementarias. En ciertas modalidades, de acuerdo con este aspecto de la invención, al menos uno de los oligonucleótidos contiene al menos un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste de CpG, C*pG, C*pG* y CpG*, en donde C es cistidina o 2'-desoxicistidina, G es guanosina o 2'- desoxiguanosina, C* es 2'-desoxitimidina, 1-(2'-desoxi-ß-D-ribofuranos¡l)-2-oxo-7-deaza-8-metil-purina, 2'-didesoxi-5-halocitosina, 2'-didesoxi-5-nitrocitosina, arabinocistidina, arabinocistidina 2'-desoxi-2'-sustituida, arabinocistidina 2'-O-sustituida, 2'-desoxi-5-hidroxicistidina, 2'-desoxi-N4-alquil-cistidina, 2'-desoxi-4-tiour¡d¡na u otros análogos del nucleósido pirimidina, G* es 2'-desoxi-7-deazaguanosina, 2'-desoxi-6-tioguanosina, arabinoguanosina, arabinoguanosina 2'-desox¡-2'-sustituida, arabinoguanosina 2'-O-sustituida, 2'- desoxiinosina u otros análogos del nucleósido purina, y p es un enlace internucleósido seleccionado del grupo que consiste de fosfodiéster, fosforotioato y fosforoditioato. En algunas modalidades, el ácido nucleico ¡nmunoestimulador es de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En ciertas modalidades el ácido nucleico inmunoestimulador es de aproximadamente 12 a aproximadamente 26 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, los oligonucleótidos tienen cada uno de aproximadamente 3 a aproximadamente 35 residuos nucleosídicos, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 30 residuos nucleosídicos, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 residuos nucleosídicos. En algunas modalidades, los oligonucleótidos tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 18, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 14, residuos nucleosídicos. Como se utiliza en la presente, el término "aproximadamente" implica que el número exacto no es crítico. Así, el número de residuos nucleosídicos en los oligonucleótidos no es crítico, y los oligonucleótidos que tiene uno o más residuos nucleosídicos menos, o d? uno a varios residuos nucleosídicos adicionales están contemplados como equivalentes de cada una de las modalidades descritas anteriormente. En algunas modalidades, uno o más de los oligonucleótidos tienen 11 nucleótidos. En un tercer aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas. Estas composiciones comprende cualquiera de las composiciones descritas en el primer y segundo aspectos de la ¡nvención, ya sea solas o en combinación y un portador farmacéuticamente aceptable. En un cuarto aspecto, la invención proporciona un método para generar una respuesta inmune en un vertebrado. Este método comprende administrar al vertebrado cualquiera de las composiciones, solas o en combinación, descritas en el primer, segundo y tercer aspectos de la ¡nvención. Las composiciones descritas en la presente pueden administrarse a través de cualquier ruta adecuada de administración, ¡ncluyendo, de manera no exclusiva, parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal, aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, pistola génica, parche dérmico, gotas de ojos y lavados bucales.
En un quinto aspecto, la invención proporciona un método para tratar terapéuticamente a un vertebrado que tiene cáncer, un trastorno autoinmune, inflamación de las vías aéreas, trastornos inflamatorios, trastornos de la piel, alergia, asma o una enfermedad causada por un patógeno. Este método comprende administrar al vertebrado cualquiera de las composiciones, solas o en combinación, descritas en el primer, segundo y tercer aspectos de la invención. Las composiciones descritas en la presente pueden administrarse a través de cualquier ruta adecuada de administración, ¡ncluyendo, de manea no exclusiva, parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal, aerosol, intraocular, intratraqueal, ¡ntrarrecta!, vaginal, pistola génica, parche dérmico, gotas de ojos y lavados bucales. En un sexto aspecto, la ¡nvención proporciona un método para prevenir el cáncer, una enfermedad autoinmune, inflamación de las vías aéreas, trastornos inflamatorios, trastornos de la piel, alergia, asma o una enfermedad causada por un patógeno. Este método comprende administrar al vertebrado cualquiera de las composiciones, solas o en combinación, descritas en el primer, segundo y tercer aspectos de la ¡nvención. Las composiciones descritas en la presente pueden administrarse a través de cualquier ruta adecuada de administración, incluyendo, de manea no exclusiva, parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, ¡ntranasal, aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, pistola génica, parche dérmico, gotas de ojos y lavados bucales.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A y 1B son representaciones de varias modalidades de la invención. En la Figura 1 B, m y n son de manea independiente 0-1000.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Las patentes expedidas, solicitudes de patente y referencias que se citan en la presente, se incorporan en la presente como referencia al mismo grado que si cada una se indicara de manera específica e individual como incorporada como referencia. En el caso de inconsistencias entre cualquier enseñanza de cualquier referencia citada en la presente y la presente especificación, la última deberá prevalecer para propósitos de la invención. La invención se relaciona con el uso terapéutico de oligonucleótidos como agentes inmunoestimuladores para las aplicaciones de ¡nmunoterapia. La invención también proporciona métodos para generar, mejorar y modificar la respuesta inmune causada por los compuestos inmunoestimuladores utilizados para aplicaciones de inmunoterapia, tales como, de manera no exclusiva, tratamiento y/o prevención del cáncer, trastornos autoinmunes, asma, alergias respiratorias, alergias a alimentos e infecciones bacterianas, parasitarias y virales en humanos adultos y pediátricos y aplicaciones veterinarias. El asma alérgica es una cierta condición incorporada, para el tratamiento de los presentes métodos y compuestos. Así, la invención proporciona además compuestos que tienen niveles óptimos de efecto inmunoestimulador para la ¡nmunoterapia y métodos para hacer y utilizar tales compuestos. Además, los oligonucleótidos inmunoestimuladores/inmunómeros de la ¡nvención son útiles como adyuvantes en combinación con las vacunas de ADN, anticuerpos, alérgenos, quimioagentes terapéuticos y oligonucleótidos antisentido. En un primer aspecto, la invención proporciona un oligonucleótido inmunoestimulador, la secuencia del cual es al menos parcialmente autocomplementaria. El ácido nucleico inmunoestimulador comprende una secuencia de ácido nucleico que contiene al menos un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste de CpG, C*pG, C*pG* y CpG*, en donde C es cistidina o 2'-desoxicistidina, G es guanosina o 2'-desoxiguanosina, C* es 2'-desoxitimid¡na, 1-(2'-desoxi-ß-D-ribofuranosil)-2-oxo-7-deaza-8-metil-purina, 2'-didesoxi-5-halocitosina, 2'-didesoxi-5-nitrocitosina, arabinocistidina, arabinocistidina 2'-desoxi-2'-sustituida, arabinocistidina 2'-O-sustituida, 2'-desoxi-5-hidroxicistidina, 2'-desoxi-N4-alquil-cistidina, 2'-desoxi-4-tiouridina u otros análogos del nucleósido pirimidina, G* es 2'-desoxi-7-deazaguanosina, 2'-desoxi-6-tioguanosina, arabinoguanosina, arabinoguanosina 2'-desoxi-2'-sustituida, arabinoguanosina 2'-O-sustituida, 2'- desoxiinosina u otros análogos del nucleósido purina, y p es un enlace internucleósido seleccionado del grupo que consiste de fosfodiéster, fosforotioato y fosforoditioato. En algunas modalidades, el oligonucleótido inmunoestimulador es de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En ciertas modalidades, el oligonucleótido inmunoestimulador es de aproximadamente 12 a aproximadamente 26 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, los oligonucleótidos son de aproximadamente 3 a aproximadamente 35 residuos nucleosídicos, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 30 residuos nucleosídicos, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 residuos nucleosídicos. En algunas modalidades, los oligonucleótidos tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 18, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 14 residuos nucleosídicos. Como se utiliza en la presente, el término "aproximadamente" implica que el número exacto no es crítico. Así, el número de residuos nucleosídicos en los oligonucleótidos no es crítico, y los oligonucleótidos que tiene uno o más residuos nucleosídicos menos, o de uno a varios residuos nucleosídicos adicionales están contemplados como equivalentes de cada una de las modalidades descritas anteriormente. En algunas modalidades, uno o más de los oligonucleótidos tienen 11 nucleótidos. Como se reconocerá por alguien con experiencia en la técnica, la secuencia complementaria de los oligonucleótidos permite la unión de hidrógeno intermolecular, proporcionando por lo tanto la estructura secundaria de los oligonucleótidos. Los oligonucleótidos adicionales pueden unirse creando por lo tanto una cadena, o multímeros de los oligonucleótidos de acuerdo con la invención. En un segundo aspecto, la invención proporciona un inmunómero que comprende al menos dos oligonucleótidos enlazados por un enlazante no nucleotídico, en donde las secuencias de los oligonucleótidos inmunoestimuladores son al menos parcialmente autocomplementarias. En ciertas modalidades de acuerdo con este aspecto de la invención al menos uno de los oligonucleótidos contiene al menos un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste de CpG, C*pG, C*pG* y CpG*, en donde C es cistidina o 2'-desoxicistidina, G es guanosina o 2'- desoxiguanosina, C* es 2'-desoxitimidina, 1-(2'-desoxi-ß-D-ribofuranosil)-2-oxo-7-deaza-8-metil-pur¡na, 2'-didesoxi-5-halocitosina, 2'-didesoxi-5-nitrocitosina, arabinocistidina, arabinocistidina 2'-desoxi-2'-sustituida, arabinocistidina 2'-O-sustituida, 2'-desoxi-5-hidroxicistidina, 2'-desoxi-N4-alquil-cistidina, 2'-desoxi-4-tiouridina u otros análogos del nucleósido pirimidina, G* es 2'-desoxi-7-deazaguanosina, 2'-desoxi-6-tioguanosina, arabinoguanosina, arabinoguanosina 2'-desoxi-2'-sustituida, arabinoguanosina 2'-O-sustituida, 2'- desoxiinosina u otros análogos del nucleósido purina, y p es un enlace internucleósido seleccionado del grupo que consiste de fosfodiéster, fosforotioato y fosforoditioato. En este aspecto, el ácido nucleico inmunoestimulador comprende una estructura como se detalla en la fórmula (l).
Dominio A-Dominio B-Dominio C (I) Los dominios pueden ser de aproximadamente 2 a aproximadamente 12 nucleótidos de longitud. El dominio A puede ser ADN, ARN, ARN-ADN, ADN-ARN 5'-3' o 3'-5' o 2'-5' que tiene un dominio palindrómico o autocomplementario que contiene o no contiene al menos un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste de CpG, C*pG, C*pG* y CpG*, en donde C es cistidina o 2'-desoxicistidina, G es guanosina o 2'-desoxiguanosina, C* es 2'-desoxitimidina, 1-(2'-desoxi-ß-D-ribofuranosil)-2-oxo-7-deaza-8-metil-purina, 2'-didesoxi-5-halocitosina, 2'-didesoxi-5-nitrocitosina, arabinocistidina, arabinocistidina 2'-desoxi-2'-sustitu¡da, arabinocistidina 2'-O-sustituida, 2'-desoxi-5-hidroxicistidina, 2'-desoxi-N4-alquil-cistidina, 2'-desoxi-4-tiouridina u otros análogos del nucleósido pirimidina, G* es 2'-desoxi-7-deazaguanosina, 2'-desoxi-6-tioguanosina, arabinoguanosina, arabinoguanosina 2'-desoxi-2'-sustituida, arabinoguanosina 2'-O-sustituida, 2'- desoxiinosina u otros análogos del nucleósido purina, y p es un enlace internucleósido seleccionado del grupo que consiste de fosfodiéster, fosforotioato y fosforoditioato. En ciertas modalidades, el dinucleótido inmunoestimulador no es CpG. En ciertas modalidades, el dominio A tendrá más de un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste de CpG, C*pG, C*pG* y CpG*. El dominio B, como se describe por una "X" a continuación, es un enlazante que une los dominios A y C que puede ser un enlace 3'-'5', un enlace 2'-5', un enlace 3'-3', un grupo fosfato, un nucleósido o un enlazante no nucleosídico que puede ser una porción alifática, aromática, arilo, cíclica, quiral, aquiral, un péptido, un carbohidrato, un lípido, un ácido graso, mono, tri, o hexapolietilenglicol o heterocíclica. El dominio C puede ser ADN, ARN, ARN-ADN, ADN-ARN Poli I-Poli C 5'-3' o 3'-5', 2'-5' que tiene una secuencia palindrómica o autocomplementaria, que contiene o no contiene un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste de CpG, C*pG, C*pG* y CpG*, en donde C es cistidina o 2'-desoxicistidina, G es guanosina o 2'- desoxiguanosina, C* es 2'-desoxitimidina, 1-(2'-desoxi-ß-D-ribofuranosil)-2-oxo-7-deaza-8-metil-purina, 2'-didesoxi-5-halocitosina, 2'-didesoxi-5-n¡trocitos¡na, arabinocistidina, arabinocistidina 2'-desoxi-2'-sustituida, arabinocistidina 2'-O-sustituida, 2'-desoxi-5-hidroxicistidina, 2'-desoxi-N4-alquil-cistidina, 2'-desoxi-4-tiourid¡na u otros análogos del nucleósido pirimidina, G* es 2'-desoxi-7-deazaguanosina, 2'-desoxi-6-tioguanos¡na, arabinoguanosina, arabinoguanosina 2'-desox¡-2'-sustituida, arabinoguanosina 2'-O-sustituida, 2'- desoxiinosina u otros análogos del nucleósido purina, y p es un enlace ¡nternucleósido seleccionado del grupo que consiste de fosfodiéster, fosforotioato y fosforoditioato. En ciertas modalidades, el dinucleótido inmunoestimulador no es CpG. En algunas modalidades, el dominio B es de manera preferida un enlazante no nucleotídico que conecta los oligonucleótidos del dominio A y el dominio C, que se refieren como "inmunómeros". En ciertas modalidades, el dominio C no tiene el dinucleótido CpG, C*pG, C*pG* o CpG*.
En algunas modalidades, los oligonucleótidos contenidos en la fórmula (I) son de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En ciertas modalidades los oligonucleótidos contenidos en la fórmula (I) son de aproximadamente 12 a aproximadamente 26 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, los oligonucleótidos tienen cada uno de aproximadamente 3 a aproximadamente 35 residuos nucleosídicos, de manera preferida de aproximadamente 4 a aproximadamente 30 residuos nucleosídicos, de manera más preferida de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 residuos nucleosídicos. En algunas modalidades, los oligonucleótidos tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 18, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 14 residuos nucleosídicos. Como se utiliza en la presente, el término "aproximadamente" implica que el número exacto no es crítico. Así, el número de residuos nucleosídícos en los oligonucleótidos no es crítico, y los oligonucleótidos que tiene uno o más residuos nucleosídicos menos, o de uno a varios residuos nucleosídicos adicionales están contemplados como equivalentes de cada una de las modalidades descritas anteriormente. En algunas modalidades, uno o más de los oligonucleótidos tienen 11 nucleótidos. Una secuencia autocomplementaria, como se utiliza en la presente, se refiere a una secuencia base, que tras la alineación, puede formar un apareamiento de bases intramolecular o más típicamente, intermolecular entre los pares oscilantes G-C, A-T, A-U y/o G-U. En una modalidad, el grado de autocomplementariedad es de al menos 50 por ciento.
Por ejemplo, un 8-mero que es al menos 50 por ciento autocomplementario puede tener una secuencia capaz de formar 4,5, 6,7 u 8 pared de bases oscilantes G-C, A-T, A-U y/o G-U. Tales pares de bases pueden, pero de manera no necesaria, involucrar bases localizadas en cualquier extremo del oligonucleótido inmunoestimulador y/o inmunómero autocomplementario. En donde la estabilización del ácido nucleico puede ser importante para el oligonucleótido inmunoestimulador y/o inmunómero, puede ser ventajoso "sujetar" uno o ambos extremos de un ácido nucleico de doble hebra, ya se mediante el apareamiento de bases o mediante cualquier otro medio adecuado. El grado de autocomplementariedad puede depender de la alineación entre el oligonucleótido inmunoestimulador y/o inmunómero, y tal alineación puede o no incluir una sola o múltiples salientes nucleosídicas. En otras modalidades, el grado de autocomplementariedad es de al menos 60 por ciento, al menos 70 por ciento, al menos 80 por ciento, al menos 90 por ciento o incluso 100 por ciento. Se aplican consideraciones similares al apareamiento de bases ¡ntermolecular entre los oligonucleótidos inmunoestimuladores y/o inmunómeros de diferente secuencia de bases. Así, en donde se utiliza junta una pluralidad de oligonucleótidos ¡nmunoestimuladores y/o ¡nmunómeros, la pluralidad de oligonucleótidos inmunoestimuladores y/o inmunómeros puede, pero no necesita, incluir secuencias que son al menos parcialmente complementarias una con la otra. En una modalidad, la pluralidad de oligonucleótidos inmunoestimuladores y/o ¡nmunómeros ¡ncluye un oligonucleótido inmunoestimulador y/o inmunómero que tiene una primera secuencia y un oligonucleótido inmunoestimulador y/o inmunómero que tiene una segunda secuencia, en donde la primera secuencia y la segunda secuencia son al menos 50 por ciento complementarias. Por ejemplo, como entre dos 8-meros que son al menos 50 por ciento complementarios, pueden formar 4,5, 6,7 u 8 pares de bases oscilantes G-C, A-T, A-U y/o G-U. Tales pares de bases pueden, pero no necesariamente, involucrar bases localizadas en cualquier extremo de los oligonucleótidos inmunoestimuladores y/o inmunómeros complementarios. El grado de complementariedad puede depender de la alineación entre los oligonucleótidos inmunoestimuladores y/o inmunómeros, y tal alineación puede o no incluir una sola o múltiples salientes nucleosídicas. En otras modalidades, el grado de complementariedad es al menos del 60 por ciento, al menos 70 por ciento, al menos 80 por ciento, al menos 90 por ciento o incluso el 100 por ciento. A manera de ejemplo no limitante, en ciertas modalidades de este aspecto, el ácido nucleico inmunoestimulador tendrá una estructura como se detalla en la fórmula (II).
B B { -X- '— "V M"im??nmna?»l"»u?|H -i Xn <?HHaHlwlHli?l>??n>»W y 5* A* B" C 5' 3' A* ). (ll) Como se reconocerá por alguien con experiencia en la técnica, los compuestos descritos de ácido nucleico inmunoestimulador/inmunómero tienen una estructura secundaria debido a que las secuencias de los dominios son complementarias, permitiendo la formación de enlaces de hidrógeno intermoleculares. Los dominios A y A' pueden o no ser idénticos, los dominios A y C pueden o no ser idénticos, los dominios A y C pueden o no ser idénticos, los dominios A' y C pueden o no ser idénticos, los dominios A' y C pueden o no ser idénticos, los dominios B y B' pueden o no ser idénticos y los dominios C y C pueden o no ser idénticos. Además, como se muestra en el esquema A posterior, los ¡nmunómeros adicionales pueden unirse a través de enlaces de hidrógeno intermoleculares, creando por lo tanto una cadena, o multímeros de ¡nmunómeros de acuerdo con la invención, n puede ser cualquier número de compuestos de inmunómero continuos, autocomplementarios. Como se utiliza en la presente, el término "complementario" significa que tiene la capacidad de hibridarse a un ácido nucleico. Tal hibridación es ordinariamente el resultado de la formación de enlaces de hidrógeno entre las hebras complementarias, de manera preferida para formar pares de bases de Watson-Crick o Hoogsteen, aunque otros modos de formación de enlaces de hidrógeno, así como de apilamiento de las bases también puede conducir a al hibridación. Como se utiliza en la presente, el término "estructura secundaria" se refiere a la formación de enlaces de hidrógeno intermoleculares. La formación de enlaces de hidrógeno intermoleculares resulta en la formación de una molécula duplexada de ácido nucleico.
"Secuencia palindrómica" significará una repetición invertida (es decir, una secuencia tal como ABCDEE'D'C'B'A' en la cual A y A', B y B', etc., son pares de bases capaces de formar los pares de bases usuales de Watson-Crick. In vivo, tales secuencias pueden formar estructuras con doble hebra. En una modalidad, el ácido nucleico CpG contiene una secuencia palindrómica. Una secuencia palindrómica utilizada en este contexto se refiere a un palíndromo en el cual CpG es parte del palíndromo. En algunas modalidades, CpG es el centro del palíndromo. En otra modalidad, el ácido nucleico CpG está libre de un palíndromo. Un ácido nucleico inmunoestimulador que está libre de un palíndromo es uno en el cual el dinucleótido CpG no es parte de un palíndromo. Tal oligonucleótido puede incluir un palíndromo en el cual CpG no es el centro del palíndromo. Para propósitos de la invención, el término "oligonucleótido" se refiere a un polinucleósido formado de una pluralidad de unidades nucleosídicas enlazadas. Tales oligonucleótidos pueden obtenerse de fuentes existentes de ácidos nucleicos, incluyendo ADN genómico o ADNc, pero son producidos de manera preferida mediante métodos sintéticos. En algunas modalidades, cada unidad nucleosídica incluye una base heterocíclica y un grupo de azúcar de pentofuranosilo, 2'-desoxipentfuranosilo, trehalosa, arabinosa, arabinosa 2'-desoxi-2'-sustituida, arabinose 2'-O-sustituida o hexosa. Los residuos nucleosídicos pueden acoplarse unos con otros mediante cualquiera de los numerosos enlaces internucleósido conocidos. Tales enlaces internucleósido incluyen, de manera no exclusiva, enlaces intemucleósido de fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, alquilfosfonato, alquilfosfonotioato, fosfotriéster, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboalcoxi, acetamidato, carbamato, morfolino, borano, tioéter, fosforamidato puenteado, fosfonato de metileno puenteado, fosforotioato puenteado y sulfona. El término "oligonucleótido" también abarca polinucleósidos que tienen uno o más enlaces internucleósido estereoespecíficos (por ejemplo, enlaces de (RP) - o (SP)-fosforotioato, alquilfosfonato o fosfotriéster). Como se utiliza en la presente, los términos "oligonucleótido" y "dinucleótido" pretenden incluir de manera expresa polinucleósidos y dinucleósidos que tienen cualquiera de tales enlaces internucleósido, ya sea que el enlace comprenda o no un grupo fosfato. En ciertas modalidades, estos enlaces internucleósido pueden ser enlaces de fosfodiéster, fosforotioato o fosforoditioato o combinaciones de los mismos. El término "oligonucleótido" también abarca polinucleósídos que tienen sustituyentes adicionales, ¡ncluyendo, de manera no exclusiva, grupos de proteína, grupos lipofílicos, agentes intercalantes, diaminas, ácido fólico, colesterol y adamantano. El término "oligonucleótido" también abarca cualquier otra nucleobase que contiene un polímero, ¡ncluyendo, de manera no exclusiva, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos peptídicos con grupos fosfato (PHONA), ácidos nucleicos asegurados (LNA), oligonucleótidos con cadena principal de morfolino y oligonucleótidos que tienen secciones de la cadena principal con enlazantes alquilo o enlazantes amino.
Los oligonucleótidos de la ¡nvención pueden incluir nucleósidos naturales, nucleósidos modificados o mezclas de los mismos. Como se utiliza en la presente, el término "nucleósido modificado" es un nucleósido que incluye una base heterocíclica modificada, una porción de azúcar modificada o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, el nucleósido modificado es un nucleósido de pirimidina o purina no natural, como se describe en la presente. En algunas modalidades, el nucleósido modificado es un ribonucleósido 2'-sustituido, un arabinonucleósido o un arabinósido 2'-desoxi-2'-sustituido. Para los propósitos de la ¡nvención, el término "ribonucleósido 2'-sustituido" o "arabinósido 2'- sustituido" incluye ribonucleósidos o arabinonucleósidos en los cuales el grupo hldroxilo en la posición 2' de la porción de pentosa está sustituido para producir un ribonucleósido 2'-sustituido o 2'-O-sustituido. En ciertas modalidades, tal sustitución es con un grupo alquilo inferior que contiene 1-6 átomos de carbono saturados o no saturados, o con un grupo arilo que tiene 6-10 átomos de carbono, en donde tal grupo alquilo o arilo puede estar no sustituido o puede sustituirse, por ejemplo, con grupos halo, hidroxi, trifluorometilo, ciano, nitro, acilo, aciloxi, alcoxi, carboxilo, carboalcoxi o amino. Los ejemplos de ribonucleósidos 2'-O-sustituidos o arabinósidos 2'-O-sustituidos incluyen, de manera no exclusiva 2'-O-metilribonucleósidos o 2'-O-metilarabinósidos y 2'-O-metoxietoxiribonucleósidos o 2'-O- metoxietoxiarabinósidos.
El término "ribonucleósido 2'-sustituido" o "arabinósido 2'-sustituido" también incluye ribonucleósidos o arabinonucleósidos en los cuales el grupo 2'-hidroxilo está reemplazado con un grupo alquilo inferior que contiene 1-6 átomos de carbono saturados o no saturados, o con un grupo amino o halo. Los ejemplos de tales ribonucleósidos 2'-sustituidos o arabinósidos 2'-sustituidos incluyen, de manera no exclusiva, 2'-amino, 2'-fluoro, 2'-alil y 2'-propargil ribonucleósidos o arabinósidos. El término "oligonucleótido" incluye oligonucleótidos híbridos y quiméricos. Un "oligonucleótido quimérico" es un oligonucleótido que tiene más de un tipo de enlace internucleósido. Un ejemplo no limitante de tal oligonucleótido quimérico es un oligonucleótido quimérico que comprende una región de fosforotioato, fosfodiéster o fosforoditioato y enlaces no iónicos tales como enlaces de alquilfosfonato o alquilfosfonotioato (véase, por ejemplo, Pederson et al. Patentes de E.U.A. Nos. 5,635,377 y 5,366,878). Un "oligonucleótido híbrido" es un oligonucleótido que tiene más de un tipo de nucleósido. Un ejemplo no limitante de tal oligonucleótido híbrido comprende una región de ribonucleótido o ribonucleótido 2'-sustituido, y una región de desoxirribonucleótido (véase, por ejemplo, Metelev y Agrawal, Patente de E.U.A. No. 5,652,355, 6,346,614 y 6,143,881 ). De manera alterna, la molécula de ácido nucleico de la ¡nvención puede ser de dos inmunómeros enlazados por medio de un enlazante no nucleotídico.
En ciertas modalidades de la invención, el menos un oligonucleótido inmunoestimulador de la ¡nvención comprende un dinucleótido ¡nmunoestimulador de la fórmula 5'-Pyr-Pur-3', en donde Pyr es un nucleósido de pirimidina natural o un análogo del mismo y Pur es un nucleósido de purina natural o un análogo del mismo. Como se utiliza en la presente, el término "nucleósido de pirimidina" se refiere a un nucleósido en donde el componente de la base del nucleósido es una base de pirimidina. De manera similar, el término "nucleósido de purina" se refiere a un nucleósido en donde el componente de la base del nucleósido es una base de purina. Para propósitos de la invención, un nucleósido de pirimidina o purina "sintético" incluye una base de pirimidina o purina no natural, una porción de azúcar no natural o una combinación de los mismos. En ciertas modalidades, los nucleósidos de pirimidina en los oligonucleótidos inmunoestimuladores y/o inmunómeros utilizados en el método de acuerdo con la invención, tienen la estructura (lll): en donde: D es un donador de enlaces de hidrógeno; D' se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, un donador de enlaces de hidrógeno, aceptor de enlaces de hidrógeno, grupo hidrofílico, grupo hidrofóbico, grupo que extrae electrones y grupo que dona electrones; A aceptor de enlace de hidrógeno o un grupo hidrofílico; A' se selecciona del grupo que consiste de un aceptor de enlace de hidrógeno, un grupo hidrofílico, un grupo hidrofóbico, un grupo que extrae electrones y un grupo que dona electrones; X es carbono o nitrógeno; y S' es un anillo de azúcar de pentosa o hexosa, o un azúcar no natural. En ciertas modalidades, el anillo de azúcar se deriva con una porción de fosfato, una porción de fosfato modificada u otra porción enlazante adecuada para enlazar el nucleósido de pirimidina a otro nucleósido o análogo de nucleósido. En algunas modalidades, los donadores del enlace de hidrógeno incluyen, de manera no exclusiva, -NH-, -NH2, -SH y -OH. Los aceptores preferidos de enlace de hidrógeno incluyen, de manera no exclusiva, C=O, C=S, y los átomos de nitrógeno del anillo de un heterociclo aromático, por ejemplo, N3 de citosina. En algunas modalidades, la porción de base en (lll), es una base de pirimidina no natural. Los ejemplos de las bases de pirimidina no naturales incluyen, de manera no exclusiva, 5-hidroxicitosina, 5-hidroximetilcitosina, N4- alquilcitosina o N4-etilcitosina y 4-tiouracilo. En algunas modalidades, la porción de azúcar S' en (lll), es una porción de azúcar no natural. Para los propósitos de la presente invención, una "porción de azúcar natural", es una porción de azúcar que aparece de manera natural como parte de un ácido nucleico, por ejemplo, ribosa y 2'-desoxirribosa y una "porción de azúcar no natural" es cualquier azúcar que no aparece naturalmente como parte de un ácido nucleico, pero que puede utilizarse en la cadena principal para un oligonucleótido, por ejemplo, hexosa. La arabinosa y los derivados de arabinosa son ejemplos no limitantes de porciones de azúcar. En algunas modalidades, los análogos del nucleósido de purina en ios oligonucleótidos inmunoestimuladores y/o ¡nmunómeros utilizados en el método de acuerdo con la invención, tienen la estructura (IV): en donde: D es un donador de enlaces de hidrógeno; D' se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, un donador de enlaces de hidrógeno y un grupo hidrofílico; A es un aceptor de enlaces de hidrógeno o un grupo hidrofílico; X es carbono o nitrógeno; cada L se selecciona de manera independiente del grupo que consiste de C, O, N y S; y S' es un anillo de azúcar de pentosa o hexosa, o un azúcar no natural. En ciertas modalidades, el anillo de azúcar se deriva con una porción de fosfato, porción de fosfato modificada u otra porción enlazante adecuada para enlazar el nucleósido de pirimidina a otro nucleósido o análogo de nucleósido. En ciertas modalidades, los donadores del enlace de hidrógeno incluyen, de manera no exclusiva, -NH-, -NH2, -SH y -OH. Los aceptores preferidos de los enlaces de hidrógeno incluyen, de manera no exclusiva, C=O, C=S, -NO2 y los átomos de nitrógeno del anillo de un heterociclo aromático, por ejemplo, N1 de la guanina. En algunas modalidades, la porción de base en (IV), es una base de purina no natural. Los ejemplos de bases de purina no naturales preferidas incluyen, de manera no exclusiva, 6-tioguanina y 7-deazaguanina. En algunas modalidades, la porción de azúcar S' en (IV), es una porción de azúcar natural, como se describió anteriormente para la estructura (lll). En un tercer aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas. Estas composiciones comprenden cualquiera de las composiciones descritas en el primer y segundo aspecto de la invención, ya sea solas o en combinación, y un portador farmacéuticamente aceptable.
Como se utiliza en la presente, el término "fisiológicamente aceptable", se refiere a un material que no interfiere con la efectividad de las composiciones del primer, segundo o tercer aspectos de la invención, y que es compatible con un sistema biológico tal como una célula, cultivo celular, tejido u organismo. En ciertas modalidades, el sistema biológico es un organismo viviente tal como un vertebrado. Como se utiliza en la presente, el término "portador" abarca cualquier excipiente, diluyente, relleno, sal, amortiguador, estabilizante, solubilizante, lípido u otro material bien conocido en la técnica para utilizarse en ias formulaciones farmacéuticas. Se entenderá que las características del portador, excipiente o diluyente dependerán de la ruta de administración para una aplicación particular. La preparación de formulaciones farmacéuticamente aceptables que contienen estos materiales se describe en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edición, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, ISBN: 0-912734-04-3. Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden incluir una vacuna para el cáncer, incluyendo una vacuna para el cáncer seleccionada de EFG, vacunas para el cáncer antiidiotípicas, antígeno Gp75, vacuna para el melanoma GMK, vacuna para el conjugado del gangliósido MGV, Her2/new, Ovarex, M-Vax, O-Vax, L-Vax, teratopo STn-KHL, BLP25 (MUC-1), vacuna idiotípica liposomal, Melacina, vacunas de antígeno peptídico, vacunas de toxina/agente, vacunas basadas en MVA, PACIS, vacuna BCG, TA-HPV, TA-CIN, DISC-virus e ImmunCyst/TheraCys.
En varias modalidades de la invención, las composiciones del primer, segundo o tercer aspectos de la invención pueden enlazarse de manera covalente a un antígeno o asociarse de manera operativa de otra manera con un antígeno. Como se utiliza en la presente, el término "asociado de manera operativa con", se refiere a cualquier asociación que mantiene la actividad de las composiciones del primer, segundo o tercer aspectos de la invención y el antígeno. Los ejemplos no limitantes de tales asociación es operativas incluyen ser parte del mismo liposoma u otro vehículo o reactivo de suministro. En las modalidades en donde las composiciones del primer, segundo o tercer aspectos de la invención están enlazadas de manera covalente a un antígeno, tal enlace covalente está en cualquier posición de las composiciones del primer, segundo o tercer aspectos de la invención, diferentes a un extremo 5' accesible de un oligonucleótido inmunoestimulador. Por ejemplo, el antígeno puede unirse a un enlace internucleósido o puede unirse al enlazante no nucleotídico. De manera alterna, el antígeno puede, por sí mismo, ser un enlazante no nucleotídico. En varías modalidades de la invención, las composiciones del primer, segundo o tercer aspectos de la ¡nvención pueden incluir un oligonucleótido con actividad antisentido. Como se utiliza en la presente, "actividad antisentido", significa que el oligonucleótido, cuando se introduce en una célula o un animal, causa una reducción en la expresión del gen al cual es complementario.
En varias modalidades de la ¡nvención, las composiciones del primer, segundo o tercer aspectos de la invención pueden incluir una secuencia oligonucleotídica que es un aptámero. Los aptámeros son moléculas de ácido nucleico que se han seleccionado de recolecciones aleatorias basándose en su capacidad para unirse a otras moléculas. Se han seleccionado aptámetos que se unen a ácidos nucleicos, proteínas, compuestos orgánicos pequeños e incluso organismos completos. Estas moléculas novedosas tienen muchos usos potenciales en medicina y la tecnología (véase, por ejemplo, Burgstaller P., et al. Curr Opin Drug Discov Devel. 5:690-700 (2002)). Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse mediante cualquier ruta adecuada, incluyendo, de manera no exclusiva, en forma parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal, aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, mediante pistola génica, parche dérmico o gotas para los ojos o lavado bucal. Las composiciones farmacéuticas pueden suministrarse utilizando procedimientos conocidos a dosificaciones y durante periodos de tiempo efectivos para obtener el efecto deseado, por ejemplo, el tratamiento del cáncer, el tratamiento de infección y el tratamiento de enfermedades autoinmunes. Cuando se administran sistémicamente, las composiciones farmacéuticas se administran a una dosificación suficiente para obtener un nivel en sangre de las composiciones del primer, segundo y/o tercer aspectos de la invención, de aproximadamente 0.0001 micromolar a aproximadamente 10 micromolar.
Para la administración localizada, concentraciones mucho menores que estas pueden ser efectivas, y pueden tolerarse concentraciones mucho mayores. En ciertas modalidades, una dosificación total del oligonucleótido inmunoestimulador y/o el inmunómero varía de aproximadamente 0.0001 mg por paciente por día a aproximadamente 200 mg por kg de peso corporal por día. Puede ser deseable administrar de manera simultánea o secuencial, una cantidad terapéuticamente efectiva de una o más de las composiciones terapéuticas de la invención a individuos como un solo episodio de tratamiento. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores se crearon como inmunómeros utilizando los siguientes protocolos para la síntesis. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores y/o inmunómeros de la invención pueden sintetizarse de manera conveniente utilizando un sintetizador automatizado y un procedimiento con fosforoamidita como se describe de manera esquemática en los esquemas A y B.
ESQUEMA A Síntesis lineal de inmunómeros 5' 5' A G"*N -5?- 0— t 3 -3'-enlazado ( desprotecdon 3'-fosforamiditas ESQUEMA B Síntesis paralela de inmunómeros En algunas modalidades, los oligonucleótidos inmunoestimuladores y/o inmunómeros se sintetizan mediante un procedimiento de síntesis lineal (véase el esquema A). Los enlazantes representativos para esta síntesis se presentan abajo. Como se utiliza en la presente, el término "síntesis lineal" se refiere a una síntesis que empieza en un extremo del inmunómero y progresa linealmente al otro extremo. La síntesis lineal permite la incorporación de unidades monoméricas idénticas o no idénticas (en términos de longitud, composición de la base y/o modificaciones químicas incorporadas) en los oligonucleótidos inmunoestimuladores y/o inmunómeros.
Enlazadores para la síntesis lineal Un modo alterno de síntesis para los oligonucleótidos inmunoestimuladores y/o inmunómeros es la "síntesis en paralelo", en la cual, la síntesis procede hacia fuera desde una porción enlazante central (véase el esquema B). Los enlazantes representativos para este método de síntesis se presentan en bajo. Un soporte sólido unido a un enlazante puede utilizarse para la síntesis en paralelo, como se describe en la Patente de E.U.A. No. 5,912,332. De manera alterna, un soporte sólido universal, tal como fosfato unido a un soporte de vidrio con poro controlado, puede utilizarse.
Sin enlazador S. Ramificador enlazador B. Ramificador sim. enlazador corto enlazador larqo La síntesis en paralelo de los oligonucleótidos inmunoestimuladores y/o inmunómeros tiene varias ventajas sobre la síntesis lineal: (1) la síntesis en paralelo permite la incorporación de unidades monoméricas idénticas; (2) a diferencia de la síntesis lineal, ambas (o todas) las unidades monoméricas se sintetizan al mismo tiempo, por lo tanto, el número de pasos sintéticos y el tiempo requerido para la síntesis es el mismo que para la unidad monomérica; y (3) la reducción en los pasos sintéticos mejora la pureza y el rendimiento del producto de inmunómero final. Al final de la síntesis mediante los protocolos de síntesis lineal o síntesis en paralelo, los oligonucleótidos inmunoestimuladores o inmunómeros de acuerdo con la invención, pueden desprotegerse de manera conveniente con una solución de amoniaco concentrado o como se recomienda por el proveedor de la fosforamidita, si se incorpora un nucleósido modificado. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores y/o inmunómeros del producto se purifican de manera preferida mediante HPLC en fase inversa, se destritilan, desalan y dializan. Las composiciones descritas en el primer, segundo y tercer aspectos de la invención, pueden comprender el oligonucleótido inmunoestimulador o inmunómero solo o como conjugados de oligonucleótido/inmunómero. Un conjugado de oligonucleótido/inmunómero, comprende un oligonucleótido o inmunómero, como se describió anteriormente, y un antígeno conjugado al oligonucleótido y/o inmunómero en una posición diferente al extremo 5' accesible. En algunas modalidades, el enlazante no nucleotídico comprende un antígeno, que se conjuga al oligonucleótido. En algunas otras modalidades, el antígeno se conjuga al oligonucleótido en una posición diferente a su extremo 3'. En algunas modalidades, el antígeno produce un efecto de vacuna. El oligonucleótido inmunoestimulador o inmunómero solo como conjugados de oligonucleótido/inmunómero, pueden administrarse en los métodos descritos a continuación. El antígeno se selecciona opcionalmente de antígenos asociados con un patógeno, antígenos asociados con un cáncer, antígenos asociados con un trastorno autoinmune y antígenos asociados con otras enfermedades, tales como, de manera exclusiva, enfermedades veterinarias o pediátricas, o en donde el antígeno es un alérgeno. Para propósitos de la invención, el término "asociado con", significa que el antígeno está presente con el patógeno, cáncer, trastorno autoinmune, alergia a alimentos, alergia de la piel, alergia respiratoria, asma u otra enfermedad está presente, pero no está presente o está presente en cantidades reducidas, cuando el patógeno, cáncer, trastorno autoinmune, alergia a los alimentos, alergia de la piel, alergia respiratoria o enfermedad está ausente.
El inmunómero está enlazado de manera covalente al antígeno, o está asociado de manera operativa de otra manera con el antígeno. Como se utiliza en la presente, el término "asociado de manera operativa con", se refiere a cualquier asociación que mantenga la actividad del inmunómero y el antígeno. Los ejemplos no limitantes de tales asociaciones operativas incluyen ser parte del mismo liposoma u otro vehículo o reactivo de suministro. En las modalidades en donde el inmunómero está enlazado de manera covalente al antígeno, tal enlace covalente de manera preferida está en cualquier posición del inmunómero diferente al extremo 5' accesible de un oligonucleótido inmunoestimulador. Por ejemplo, el antígeno puede unirse a un enlace internucleósido o puede unirse al enlazante no nucleotídico. De manera alterna, el antígeno puede ser por sí mismo un enlazante no nucleotídico. En un cuarto aspecto, la invención proporciona métodos para generar y/o modular una respuesta inmune en un vertebrado, tales métodos comprenden administrar al vertebrado un inmunómero o conjugado de inmunómero de acuerdo con la invención. En algunas modalidades, el vertebrado es un mamífero. Para propósitos de esta invención, el término "mamífero", pretende de manera expresa incluir humanos. En ciertas modalidades, el inmunómero o conjugado de inmunómero se administra a un vertebrado en necesidad de inmunoestimulación. Como se utiliza en la presente, el término "modulador" o "modular", significa incrementar o disminuir la actividad inmunoestimuladora de un ácido nucleico inmunoestimulador, con relación a aquella del ácido nucleico inmunoestimulador original. En los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención, la administración de los inmunómeros puede ser mediante cualquier ruta adecuada, incluyendo, de manera no exclusiva, en forma parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, intradérmica, aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, mediante pistola génica, parche dérmico o en gotas de ojos o lavado bucal. La administración de las composiciones terapéuticas de los inmunómeros, puede llevarse a cabo utilizando procedimientos conocidos a dosificaciones y durante periodos de tiempo efectivos para reducir los síntomas o sustituir los marcadores de la enfermedad. Cuando se administra sistémicamente, la composición terapéutica se administra de manera preferida a una dosificación suficiente para obtener un nivel en sangre de inmunómero de aproximadamente 0.0001 micromolar a aproximadamente 10 micromolar. Para la administración localizada, concentraciones mucho menores que esta pueden ser efectivas, y pueden tolerarse concentraciones mucho mayores. De manera preferida, una dosificación total de inmunómero varía de aproximadamente 0.001 mg por paciente por día a aproximadamente 200 mg por kg de peso corporal por día. Puede ser deseable administrar de manera simultánea o secuencial una cantidad terapéuticamente efectiva de una o más de las composiciones terapéuticas de la invención a un individuo como un solo episodio de tratamiento.
El inmunómero o la vacuna, o ambos, pueden enlazarse opcionalmente a una proteína inmunogénica, tal como hemocianina de lapa calada (KLH), subunidad B de la toxina del cólera o cualquier otra proteína inmunogénica o proteína portadora no inmunogénica. Cualquiera de la multitud de adyuvantes puede utilizarse, incluyendo, de manera no exclusiva, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, KLH, monofosforil lípido A (MPL), alumbre y saponinas, incluyendo QS-21 , imiquimod, R848 o combinaciones de los mismos. Los receptores similares a Toll (TLR), funcionan como sensores de la infección e inducen la activación de las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Los TLR reconocen una amplia variedad de ligandos, llamados patrones moleculares asociados al patógeno (PAMP). Tras el reconocimiento de los productos moleculares asociados con el patógeno conservado, los TLR activan las respuestas de defensa del hospedero a través de su dominio de señalización intracelular, el dominio del receptor Toll/interleucina-1 (TIR), y la proteína del adaptador corriente abajo MyDdd. Las células dendríticas y los macrófagos normalmente responden a los ligandos del receptor similar a Toll (TLR) y las citocinas (por ejemplo, interleucina-1ß, IL-6 y factor de necrosis del tumor, TNF), que también producen; linfocitos citolítícos naturales (NK) y linfocitos T, también están involucrados en el circuito proinflamatorio. Después de la estimulación de los TLR mediante compuestos bacterianos, las células inmunes innatas liberan una gama de citocinas. Algunos ejemplos de ligandos TLR incluyen, de manera no exclusiva, lipoproteínas; peptidoglicano, zimosan (TLR2), ARN de doble hebra, polilpoliC (TLR3), lipopolisacárido, proteínas de choque por calor, taxol (TLR4), flagelina (TLR5), e imidazoquinolinas-R848, resiquimod, imiquimod; ARNss (TLR7/8), beta-linfocitos (TLR 10) y E. coli uropatogénica (TLR11 ). Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención son útiles para estudios de modelos del sistema inmune. Los métodos también son útiles para el tratamiento profiláctico o terapéutico de la enfermedad humana o animal. Por ejemplo, los métodos son útiles para aplicaciones de vacunas pediátricas y veterinarias. En un quinto aspecto, la invención proporciona métodos para tratar terapéuticamente un vertebrado que tiene una enfermedad o trastorno, tales métodos comprenden administrar al vertebrado un inmunómero o conjugado de inmunómero de acuerdo con la invención. En varias modalidades, la enfermedad o trastorno a ser tratado es cáncer, un trastorno autoinmune, inflamación de las vías aéreas, trastornos inflamatorios, alergia, asma o enfermedad causada por un patógeno. Los patógenos incluyen bacterias, parásitos, hongos, virus, viroides y priones. La administración se lleva a cabo como se describió para el cuarto aspecto de la invención. Para los propósitos de la invención, el término "alergia" incluye, de manera no exclusiva, alergias a los alimentos, dermatitis atópica, rinitis alérgica (también conocida como fiebre del heno), conjuntivitis alérgica, urticaria (también conocida como ronchas), alergias respiratorias y reacciones alérgicas a otras sustancias tales como látex, medicinas y picaduras de insecto o problemas que resultan comúnmente de rinitis-sinusitis alérgica, otitis media y COPD. El término "inflamación de las vías aéreas" incluye, de manera no exclusiva, asma. Los ejemplos específicos de asma incluyen, de manera no exclusiva, asma alérgico, asma no alérgico, asma inducido por el ejercicio, asma ocupacional y asma nocturno. El asma alérgico está caracterizado por la obstrucción de las vías aéreas asociada con alergias y desencadenado por sustancias llamados alérgenos. Los desencadenantes del asma alérgico incluyen, de manera no exclusiva, pólenes transportados por el aire, mohos, caspa animal, ácaros del polvo caseros y deyecciones de cucarachas. El asma no alérgico es causado por infecciones virales, ciertas medicinas o irritantes encontrados en el aire, que agravan la nariz y las vías aéreas. Los desencadenantes del asma no alérgico incluyen, de manera no exclusiva, partículas transportas por el aire (por ejemplo, carbón, polvo de gis), contaminantes del aire (por ejemplo, humo del tabaco, humo de madera), olores fuertes o rocíos (por ejemplo, perfumes, limpiadores caseros, humo del cocinado, pinturas o barnices), infecciones virales (por ejemplo, resfriados, neumonía viral, sinusitis, pólipos nasales), sensibilidad a la aspirina y enfermedad de reflujo gastroesofágico (GERD). El asma inducido por el ejercicio (ElA), se desencadena por ia actividad física vigorosa. Los síntomas del ElA ocurren a grados variables en una mayoría de personas que sufren del asma y probablemente se desencadenan como resultado de respirar aire seco, frío, mientras se hace ejercicio. Los desencadenantes del ElA incluyen, de manera no exclusiva, respirar pólenes transportados por el aire durante el ejercicio, respirar contaminantes del aire durante ejercicio, hacer ejercicio con infecciones virales del tracto respiratorio y hacer ejercicio en aire frío, seco. El asma ocupacional está relacionado directamente con la inhalación de irritantes y otras sustancias potencialmente dañinas encontradas en el lugar de trabajo. Los desencadenantes del asma ocupacional incluyen, de manera no exclusiva, humos, químicos, gases, resinas, metales, polvos, vapores e insecticidas. Como se utiliza en la presente, el término "trastorno autoinmune", se refiere a trastornos en los cuales las proteínas "propias", se someten al ataque por el sistema inmune. Tal término ¡ncluye asma autoinmune. Sin desear apegarse a alguna teoría en particular, la exposición disminuida a bacterias puede ser responsable parcialmente de la incidencia incrementada de la severidad de, y la mortalidad debida a las enfermedades alérgicas tales como el asma, dermatitis atópica y rinitis en los países desarrollados. Esta hipótesis es apoyada por la evidencia de que las infecciones o productos bacterianos pueden inhibir el desarrollo de los trastornos alérgicos en modelos animales experimentales y estudios clínicos. El ADN bacteriano o los oligodesoxinucleótidos sintéticos que contienen dinucleótidos CpG no metilados y/o dinucleótidos CpG modificados en ciertos contextos de la secuencia (ADN CpG), estimulan de manera potente las respuestas inmunes innatas y por lo tanto la inmunidad adquirida. La respuesta inmune al ADN CpG incluye la activación de las células inmunes innatas, la proliferación de los linfocitos B, la inducción de secreción de la citocina Th1 y la producción de inmunoglobulinas (Ig). La activación de las células inmunes por el ADN CpG ocurre vía el receptor 9 similar a Toll (TLR9), un receptor de reconocimiento del patrón molecular. El ADN CpG induce fuertes respuestas inmunes dominantes por Th1 caracterizadas por la secreción de IL-12 e IFN-?. Los inmunómeros (IMO) solos o como conjugados del alérgeno, disminuyen la producción de IL-4, IL-5 e IgE, y reducen la eosinofilia en modelos de ratón del asma alérgico. Los compuestos de IMO también invierten de manera efectiva la enfermedad de las vías aéreas eosinofílica atópica establecida, convirtiendo una respuesta Th2 a una respuesta Th1. Se utiliza comúnmente OVA con alumbre para establecer una respuesta inmune dominante por Th2 en varios modelos de ratones y ratas. La respuesta inmune de Th2 incluye producción incrementada de IL-4, IL-5 e IL-13, niveles elevados en suero de IgE, lgG1 totales y específicas del antígeno y niveles inferiores de lgG2a. Los compuestos de IMO evitan e invierten las respuestas inmunes dominantes por Th2 establecidas en ratones. La coadministración de compuestos de IMO con OVA/alumbre a ratones, reduce la producción de lL-4, IL-5 e IL-13 e induce la producción de IFN-? en los cultivos de células del bazo sometidos a reestimulación con el antígeno. Además, los compuestos de IMO inhiben la IgE específica del antígeno y total, y mejoran la producción de lgG2a en estos ratones.
La inyección de OVA/alumbre y compuestos de IMO, inducen una respuesta de retorno del antígeno del linfocito (tipo Th1 ) en ratones, caracterizada por niveles bajos de citocinas asociadas con Th2, IgE e lgG1 , y altos niveles de citocinas asociados con Th1 e lgG2a. La coadministración de compuestos de IMO con otras clases de antígenos, tales como huevo de S. masoni y lisozima de huevo de gallina, también resulta en la inversión de la respuesta de Th2 a una respuesta dominante de Th1 en estudios in vitro e in vivo. Como se describe en la presente, los compuestos de IMO evitan de manera efectiva el desarrollo de una respuesta inmune Th2 y permiten una fuerte respuesta Th1. Aunque las citocinas Th2 desencadenan un cambio del isotipo Ig hacia la producción de IgE e lgG1 , el IFN-? de citocina Th1 , induce la producción de lgG2a por los linfocitos B. Los ratones inyectados con OVA/alumbre y los compuestos de IMO producen niveles más bajos de IL-4, IL-5 e IL-13 y niveles más altos de IFN-?, acompañados por niveles más bajos de IgE e lgG1 y más altos de lgG2a, que los ratones inyectados con OVA/alumbre solo. Esto sugiere la existencia de un enlace estrecho entre la inducción de la citocina Th1 y el cambio del isotipo de inmunoglobulina en ratones que reciben el antígeno y los compuestos de IMO. Los niveles totales y específicos del antígeno en suero de IgE son significativamente menores en ratones que reciben OVA/alumbre y los compuestos de IMO que los ratones que reciben OVA/alumbre solo. En contraste, los niveles de lgG1 específicos de OVA están cambiados de manera significativa y los niveles totales de lgG1 están sólo ligeramente disminuidos en comparación con los ratones inyectados con OVA/alumbre solo (datos no mostrados). La respuesta diferente puede resultar de diferentes mecanismos involucrados en el control del cambio de la clase de IgE e lgG1 , aunque ambos isotipos son influenciados por IL-4 e IL-13. Por ejemplo, la IL-6 fomenta los linfocitos B para que sinteticen lgG1 en la presencia de IL-4. En un sexto aspecto, la invención proporciona un método para prevenir el cáncer, una enfermedad autoinmune, inflamación de las vías aéreas, trastornos inflamatorios, trastornos de la piel, alergia, asma o una enfermedad causada por un patógeno en un vertebrado. Este método comprende administrar al vertebrado cualquiera de las composiciones, solas o en combinación, descritas en el primer, segundo y tercer aspectos de la invención. Los patógenos incluyen bacterias, parásitos, hongos, virus, viroides y priones. La administración se lleva a cabo como se describió para el cuarto aspecto de la invención. En cualquiera de los métodos de acuerdo con la invención, el ollgonucleótido inmunoestimulador y/o ¡nmunómero o un conjugado del mismo, puede administrarse en combinación con cualquier otro agente útil para tratar la enfermedad o condición que no disminuye el efecto inmunoestimulador del ollgonucleótido o el ¡nmunómero. Para los propósitos de este aspecto de la invención, el término "en combinación con", significa en el curso del tratamiento de la misma enfermedad en el mismo paciente, e incluye administrar el oligonucleótido y/o inmunómero y un agente en cualquier orden, incluyendo la administración simultánea, así como cualquier orden temporal separado, por ejemplo, de secuencialmente con uno que siga inmediatamente al otro hasta varios días aparte. Tal tratamiento en combinación también ¡ncluye más de una sola administración del inmunómero, y de manera independiente el agente. La administración del oligonucleótido y/o el inmunómero y el agente, puede hacerse por rutas iguales o diferentes. En cualquiera de los métodos de acuerdo con la invención, el agente útil para tratar la enfermedad o condición incluye, de manera no exclusiva, vacunas, antígenos, anticuerpos, agentes citotóxicos, alérgenos, antibióticos, oligonucleótidos antisentido, péptidos, proteínas, vectores de terapia génica, vacunas de ADN y/o adyuvantes para mejorar la especificidad o magnitud de la respuesta inmune, o moléculas coestimuladoras, tales como citocinas, quimiocinas, ligandos de proteína, factores de transactivación, péptidos y péptidos que comprenden aminoácidos modificados. Además, el agente puede incluir vectores de ADN que codifican para el antígeno o el alérgeno. En estas modalidades, los inmunómeros de la invención pueden actuar de manera variada como adyuvantes y/o producir efectos inmunoestimuladores directos. Los ejemplos siguientes pretenden ilustrar además ciertas modalidades preferidas de la invención, y no pretenden limitar el alcance de la invención.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Síntesis, purificación y perfiles de fusión térmica de los oligonucleótidos Los oligonucleótidos CpG (oligonucleótidos/inmunómeros ¡nmunoestimuladores) se sintetizaron en una escala de 1 a 2 µmoles, utilizando ß-cianoetilfosforamiditas en un sintetizador de ADN 8909 Expedite de PerSeptive Biosystem (PerSeptive Biosystem's, Boston, MA). Las fosforoamiditas de dA, dG, dC y T, se obtuvieron de PE Biosystems (Foster City, CA). Como se describió por lyer R. P„ et al. (J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254 (1990)), se utilizó un agente oxidante de yodo para obtener la modificación de la cadena principal del fosforotioato. Todos los oligos se desprotegieron utilizando protocolos estándar, se purificaron mediante HPLC, y se dializaron contra agua estéril calidad USP para la irrigación. Los oligos se liofilizaron y disolvieron nuevamente en agua destilada y las concentraciones se determinaron a partir de la absorbancia UV a 260 nm. Todos los oligos se caracterizaron por CGE y espectrometría de masas MALDI-TOF (Estación de Trabajo de BioespectrometríaTM Voyager-DETM STR de Applied Biosystem's), para la pureza y la masa molecular, respectivamente. La pureza de los oligos de longitud completa varió de 90-96% con el resto siendo más cortos por uno o dos nucleótidos (n-1 y n-2), como se determina por CGE y/o PAGE desnaturalizante. Todos los oligos contenían menos que <0.1 EU/mL de endotoxina como se determinó por el ensayo de Limulus (Bio-Whittaker, ahora conocido como Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., Walkersville, MD). Los estudios de fusión térmica se llevaron a cabo en 1 mL de solución de fosfato ácido disódico 10 mM, pH 7.2±0.2, que contiene NaCl 150 mM y MgCI2 2 mM. Las soluciones se calentaron a 95°C durante 10 minutos y se dejaron llegar a temperatura ambiente lentamente antes de almacenarse a 4°C durante la noche. La concentración final de la hebra de oligonucleótidos fue 2.0 M. Las mediciones de la fusión térmica UV se realizaron a 260 nm en un Espectrómetro Lambda 20 de Perkin-Elmer unido a un controlador peltier térmico y a una computadora personal utilizando cubetas de cuarzo de longitud de la trayectoria de 1 cm a una velocidad de calentamiento de 0.5°C/minutos. Las temperaturas de fusión (Tm), se tomaron como la temperatura de la disociación media y se obtuvieron de las gráficas de la primera derivada. Cada valor de Tm es un promedio de dos o tres experimentos independientes, y los valores están dentro de ±1.0°C.
EJEMPLO 2 Condiciones y reactivos del cultivo celular Las células del bazo de ratones BALB/c, C57BL/6 o C3H/HeJ de 4-8 semanas de edad, se cultivaron en medio completo RPMl como se describe por Zhao, Q., et al. (Biochem Pharmacol. 51 :173-182 (1996)) y Branda, R.F., et al. (Biochem. Pharmacol. 45:2037-2043 (1993)). Los macrófagos J774 murinos (Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA), se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco, suplementado con suero de becerro fetal al 10% (volumen/volumen) y antibióticos (100 UI/mL de penicilina G/estreptomicina). Todos los otros reactivos se compraron de Mediatech (Gaithersburg, MD).
EJEMPLO 3 Ensayo de la proliferación celular de las células del bazo Típicamente, las células del bazo de ratones (Balb-C), se cultivaron con compuestos de inmunómeros a concentraciones de 0.1 , 1.0 y 10.0 µg/ml durante 48 horas, y la proliferación célula se determinó mediante la incorporación de 3H-uridina, como se describió por Zhao, Q., et al. (Biochem Pharmacol. 51 :173-182 (1996)).
EJEMPLO 4 Ensayos de la inducción de la citocina El bazo de ratón o células J774 se emplacaron en placas de 24 pozos utilizando 5x106 ó 1x106 células/mL, respectivamente. Los compuestos de inmunómero disueltos en amortiguador TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM), se agregaron a una concentración final de 0.03, 0.1 , 0.3, 1.0, 3.0 ó 10.0 µg/mL a los cultivos celulares. Las células se incubaron a continuación a 37°C durante 24 horas, y los sobrenadantes se recolectaron para los ensayos ELISA. Los experimentos se realizaron dos o tres veces para cada compuesto de ¡nmunómero y por triplicado para concentración. La secreción de IL-12 e IL-6 se midió mediante un ELISA emparedado, como se describe por Bhagat L, et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 300:853-861 (2003)). Los reactivos requeridos, incluyendo los anticuerpos de citocina y los estándares se compraron de BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA).
EJEMPLO 5 Ensayo de esplenomegalia del ratón Ratones BALB/c hembra (4-6 semanas, 19-21 gramos), se dividieron en grupos de tres ratones. Los compuestos del inmunómero se disolvieron en suero fisiológico amortiguado con fosfato estéril (PBS), y se administraron subcutáneamente (SC) a los ratones a una dosis de 5 mg/kg. Los ratones se sacrificaron después de 48 horas y los bazos se recolectaron y pesaron como se describió por Zhao, Q., et al. (Biochem Pharmacol. 51 :173-182 (1996)) y Branda, R. F., et al. (Biochem. Pharmacol. 45:2037-2043 (1993)).
EJEMPLO 6 Activación de la trayectoria NF-?B El receptor 9 similar a Toll (TLR9), ha mostrado reconocer los dinucleótidos CpG no metilados en ADN bacterianos, plasmídicos y sintéticos (Hemmi H.s et al., Nature 408:740-745 (2000)) y activar las trayectorias de la cinasa de la tensión (Yi A. K., et al. J. Immunol. 161:4493- 4497 (1998)) y de NF-?B (Stacey K. J., et al. J. Immunol. 157:2116-2122 (1996)). La activación de NF-?B en las células J774 tratadas con compuestos de inmunómero se llevó a cabo y analizó mediante EMSA como se describe por Yu D., et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 297:83-90 (2002)) y Bhagat L., et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 300:853-861 (2003)).
EJEMPLO 7 Aislamiento de los linfocitos B humanos y las células dendríticas plasmacitoides (pDC) Las PBMC de sangre extraída recientemente de un voluntario sano (CBR Laboratories, Boston, MA), se aislaron mediante el método de centrifugación con gradiente de densidad con Ficoll (Histopaque-1077, Sigma), y los linfocitos B se aislaron de las PBMC mediante selección positiva utilizando el equipo de aislamiento de células CD19 (Miltenyi Biotec), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El Cuadro 1 muestra la actividad inmunoestimuladora de los compuestos de inmunómero de la invención en el Ensayo de Esplenocitos C57BL/6. CUADRO 1 La fase normal representa un enlace de fosforotioato; la fase en itálica representa un enlace fosfodiéster. G-? = 2'-desoxi-7-deazaguanosina G2 = Arabinoguanosina C-i = 1 -(2'-desoxi-ß-D-ribofuranos¡l)-2-oxo-7-deaza-8-met¡lpurina X = Enlazante de Glicerol Y = Enlazante de C3 EJEMPLO 8 Cultivos de pDC humanas y ELISA de IFN-a e IFN-ß Las pDC se aislaron de PBMC humanas utilizando el equipo de aislamiento de las células BDCA-4 (Miltenyi Biotec), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las pDC se emplacaron en placas de 96 pozos, utilizando 1x106 células/mL, 200 µL/pozo). Los compuestos de inmunómero se agregaron a una concentración final de 0.3, 1.0, 3.0 ó 10.0 µg/mL a los cultivos celulares, y se incubaron a 37°C durante 24 horas. Los sobrenadantes se recolectaron a continuación y se ensayaron para IFN-a e lFN-ß utilizando el equipo ELISA (PBL). Los Cuadros 2A-2D muestran un promedio ± SD de IFN-a e IFN-ß para los compuestos de inmunómero de acuerdo con la ¡nvención, a una concentraciones de 10.0 µg/mL.
CUADRO 2A Estructura y actividad inmunoestimuladora del inmunómero en el ensayo de DC humanas (24 horas) La fase normal representa un enlace de fosforotioato G-i = 2'-desoxi-7-deazaguanosina G = Arabinoguanosina X = Enlazante de glicerol CUADRO 2B Estructura y actividad inmunoestimuladora del inmunómero en el ensayo de DC humanas (24 horas) La fase normal representa un enlace de fosforotioato G1 = 2'-desoxi-7-deazaguanosina G2 = Arabinoguanosina G3 = 2'-desoxiinosina C-i = 1 -(2'-desoxi-ß-D-ribofuranosil)-2-oxo-7-deaza-8-metilpurina C2 = Arabinocitidina C3 = 2'-desoxi-5-hidroxicitidina CUADRO 2C Estructura y actividad inmunoestimuladora del inmunómero en el ensayo de DC humanas (24 horas) La fase normal representa un enlace de fosforotioato Gi = 2'-desox¡-7-deazaguanos¡na G2 = Arabinoguanosina C-i = 1 -(2'-desoxi-ß-D-ribofuranosil)-2-oxo-7-deaza-8-metilpurina X = Enlazante de Glicerol CUADRO 2D Estructura y actividad inmunoestimuladora del inmunómero en el ensayo de DC humanas (24 horas) La fase normal representa un enlace de fosforotioato; la fase en itálica representa un enlace fosfodiéster. Gi = 2'-desoxi-7-deazaguanosina G2 = Arabinoguanosina C-i = 1 -(2'-desoxi-ß-D-ribofuranosil)-2-oxo-7-deaza-8-metilpurina X = Enlazante de Glicerol Y = Enlazante C3 EJEMPLO 9 Análisis de citocina La secreción de IFN-a en células de vertebrados, de manera preferida, células de bazo de ratón BALB/c o PBMC humanas, se midió mediante ELISA emparedado. Los reactivos requeridos, ¡ncluyendo los anticuerpos de citocina y los estándares de citocina se compraron de PharMingen, San Diego, CA. Las placas de ELISA (Costar), se incubaron con anticuerpos apropiados a 5 µg/mL en amortiguador PBSN (PBS/azida de sodio al 0.05%, pH 9.6) durante la noche a 4°C, y a continuación se bloquearon con PBS/BSA al 1% a 37°C durante 30 minutos. Los sobrenadantes del cultivo celular y los estándares de citocina se diluyeron de manera apropiada con PBS/FBS al 10%, se agregaron a las placas por triplicado, y se incubaron a 25°C durante 2 horas. Las placas se cubrieron con 1 µg/mL de anticuerpo biotinilado apropiado y se incubaron a 25°C durante 1.5 horas. Las placas se lavaron a continuación de manera extensa con Amortiguador PBS-T (PBS/Tween 20 al 0.05%) y se incubaron además a 25°C durante 1.5 horas, después de agregar peroxidasa conjugada con estreptavidina (Sigma, St. Louis, MO). Las placas se revelaron con reactivo cromogénico Sure Blue™ (Kirkegaard y Perry), y la reacción se terminó agregando Solución de Paro (Kirkegaard y Perry). El cambio del color se midió en un Espectrofotómetro HDI Ceres 900 (Bio-Tek Instruments). Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), se aislaron de la sangre periférica de voluntarios sanos mediante la centrifugación con gradiente de densidad con Ficoll-Paque (Histopaque-1077, Sigma, St. Louis, MO). Brevemente, la sangre heparinizada se estratificó en Histopaque-1077 (volumen igual) en una centrífuga cónica y se centrífugo a 400 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente. La cubierta amarilla, que contiene las células mononucleares, se retiró cuidadosamente y se lavó dos veces con suero fisiológico amortiguado con fosfato isotónico (PBS) mediante centrifugación a 250 x g durante 10 minutos. La pelotilla celular resultante se resuspendió a continuación en medio RPMl 1640 que contiene L-glutamina (MediaTech, Inc., Herndon, VA), y se suplemento con FCS inactivado con calor al 10% y penicilina-estreptomicina (100 U/ml). Las células se cultivaron en placas de 24 pozos durante diferentes periodos de tiempo a 1 X 106 células/ml/pozo en la presencia o ausencia de oligonucleótidos. Al final del periodo de incubación, los sobrenadantes se recolectaron y almacenaron congelados a -70°C hasta que se probaron para varias citocinas, incluyendo IFN-a (BioSource International) mediante ELISA emparedado. Los resultados se muestran en el Cuadro 3A-3D siguiente. En todos los casos, los niveles de IFN-a en los sobrenadantes del cultivo celular se calcularon de la curva estándar construida bajo las mismas condiciones experimentales para IFN-a.
CUADRO 3A Estructura y actividad inmunoestimuladora del inmunómero en el ensayo de PBMC humanas (24 horas) La fase normal representa un enlace de fosforotioato Gi = 2'-desoxi-7-deazaguanosina G2 = Arabinoguanosina X = Enlazante de Glicerol CUADRO 3B Estructura y actividad inmunoestimuladora del inmunómero en el ensayo de PBMC humanas (24 horas) La fase normal representa un enlace de fosforotioato G-t = 2'-desoxi-7-deazaguanosina G2 = Arabinoguanosina G3 = 2'-desoxiinosina C-i = 1 -(2'-desoxi-ß-D-ribofuranosil)-2-oxo-7-deaza-8-metilpurina C2 = Arabinocitidina C = 2'-desoxi-5-hidroxicitidina CUADRO 3C Estructura y actividad inmunoestimuladora del inmunómero en el ensayo de PBMC humanas (24 horas) La fase normal representa un enlace de fosforotioato G? = 2'-desoxi-7-deazaguanosina G2 = Arabinoguanosina C-i = 1 -(2,-desox¡-ß-D-ribofuranosil)-2-oxo-7-deaza-8-met¡lpur¡na X = Enlazante de Glicerol CUADRO 3D Estructura y actividad inmunoestimuladora del inmunómero en el ensayo de PBMC humanas (24 horas) La fase normal representa un enlace de fosforotioato; la fase en itálica representa un enlace fosfodiéster.
G? = 2'-desox¡-7-deazaguanosina G2 = Arabinoguanosina C-i = 1 -(2'-desoxi-ß-D-ribofuranos¡l)-2-oxo-7-deaza-8-metilpurina X = Enlazante de Glicerol Y = Enlazante C3 EJEMPLO 10 Análisis de citometría de flujo Los marcadores de la superficie celular de CD69 y CD86 se detectaron con un Citómetro de Flujo Coulter Epics-XL utilizando CD69-Fitc y CD86-F¡tc antihumano, que se compraron de BD Pharmingen (San Diego, EUA). Los métodos de tinción se describen brevemente como sigue. Las células del cultivo activadas se bloquearon con suero AB Humano al 10% (Sigma) en amortiguador de tinción (PBS con BSA al 1% y NaN3 al 0.1 %) a 4°C durante 1 hora, y se tiñeron con los anticuerpos a 4°C durante la noche. Las PBMC (4x105) se tiñeron con CD69-Fitc y CD86-Fitc. Las PDC (2x105) se tiñeron con CD86-Fitc. Los datos de tinción de las células se adquirieron y analizaron con el programa Coulter System II (véanse los Cuadros 4A-4F siguientes).
CUADRO 4A Estructura y expresión del inmunómero de BC de PBMC humanas (2X106 células/ml) (24 horas) La fase normal representa un enlace de fosforotioato G-? = 2'-desoxi-7-deazaguanosina G2 = Arabinoguanosina X = Enlazante de glicerol CUADRO 4B Estructura v expresión del inmunómero de BC de PBMC humanas (2X106 células/ml) (24 horas) La fase normal representa un enlace de fosforotioato G-] = 2'-desoxi-7-deazaguanosina G2 = Arabinoguanosina G3 = 2'-desoxiinosina C-i = 1 -(2'-desoxi-ß-D-ribofuranosil)-2-oxo-7-deaza-8-meti!purina C2 = Arabinocitidina C3 = 2'-desoxi-5-hidroxicitidina CUADRO 4C Estructura y expresión del inmunómero de BC de PBMC humanas (2X106 células/ml) (24 horas) La fase normal representa un enlace de fosforotioato G? = 2'-desoxi-7-deazaguanosina G2 = Arabinoguanosina C-i = 1 -(2'-desoxi-ß-D-ribofuranosil)-2-oxo-7-deaza-8-metilpurina X = Enlazante de glicerol CUADRO 4D Estructura y expresión del ¡nmunómero de BC de PBMC humanas (2X106 células/ml) (24 horas) La fase normal representa un enlace de fosforotioato Gi = 2'-desoxi-7-deazaguanosina G2 = Arabinoguanosina C-i = 1 -(2'-desoxi-ß-D-ribofuranosil)-2-oxo-7-deaza-8-metilpurina X = Enlazante de Glicerol CUADRO 4E Estructura y expresión del inmunómero del ensayo de BC de PBMC humanas (24 horas) La fase normal representa un enlace de fosforotioato; la fase en itálica representa un enlace fosfodiéster. G? = 2'-desoxi-7-deazaguanos¡na G2 = Arabinoguanosina Ci = 1 -(2'-desoxi-ß-D-ribofuranosil)-2-oxo-7-deaza-8-metilpurina X = Enlazante de Glicerol Y = Enlazante de C3 CUADRO 4F Estructura y expresión del inmunómero de DC del ensayo de PBMC humanas (24 horas) 03 91 01. 98 La fase normal representa un enlace de fosforotioato; la fase en itálica representa un enlace fosfodiéster. G-) = 2'-desoxi-7-deazaguanosina G2 = Arabinoguanosina C-i = 1 -(2'-desoxi-ß-D-ribofuranosil)-2-oxo-7-deaza-8-metilpurina X = Enlazante de Glicerol Y = Enlazante de C3 EJEMPLO 11 Ensayo de la proliferación de los linfocitos B Un total de 1 X 105 linfocitos B/200 µl, se estimuló con concentraciones de 0.3, 1.0, 3.0 ó 10.0 µg/mL de compuestos de inmunómero de la invención durante 16 horas, a continuación se sometieron a impulsos con 0.75 µCi de [3H]-timidina y se recolectaron 8 horas más tarde. La incorporación de la radioactividad se midió utilizando un contador de centelleo líquido. El Cuadro 5 muestra un promedio ± SD de la proliferación de linfocitos B a una concentración final de 1.0 µg/mL.
CUADRO 5 Estructura y actividad inmunoestimuladora del inmunómero en el ensayo de proliferación de linfocitos B humanos (24 horas) La fase normal representa un enlace de fosforotioato; la fase en itálica representa un enlace fosfodiéster. G-i = 2'-desoxi-7-deazaguanosina G2 = Arabinoguanosina Ci = 1 -(2'-desoxi-ß-D-ribofuranosii)-2-oxo-7-deaza-8-metilpurina X = Enlazante de Glicerol Y = Enlazante de C3 Equivalentes Aunque la invención anterior se ha descrito con algunos detalles para propósitos de claridad y entendimiento, se apreciará por alguien con experiencia en la técnica a partir de la lectura de esta descripción, que varios cambios en la forma y detalle pueden hacerse sin apartarse del verdadero alcance de la invención y las reivindicaciones anexas.

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Un oligonucleótido inmunoestimulador que comprende al menos un dinucleótido seleccionado de C*pG, C*pG* y CpG*, en donde la secuencia del oligonucleótido es al menos parcialmente autocomplementaria.
2.- El oligonucleótido inmunoestimulador de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el oligonucleótido es de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud.
3.- El oligonucleótido inmunoestimulador de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la secuencia del oligonucleótido es al menos 40 por ciento autocomplementaria.
4.- El uso de un oligonucleótido inmunoestimulador de conformidad con la reivindicación 1 , en la fabricación de un medicamento útil para tratar terapéuticamente a un vertebrado que tiene cáncer, un trastorno autoinmune, inflamación de las vías aéreas, trastornos inflamatorios, trastornos de la piel, alergia, asma o una enfermedad causada por un patógeno.
5.- El uso como se reclama en la reivindicación 4, en donde el medicamento es adaptado para ser administrable mediante una ruta parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal, aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, pistola génica, parche dérmico, gotas para ojos, gotas para oídos y lavado bucal.
6.- Una formulación farmacéutica que comprende el oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 1 y un portador fisiológicamente aceptable.
7.- El uso de un oligonucleótido inmunoestimulador de conformidad con la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento útil para generar una respuesta inmune en un vertebrado.
8.- El uso como se reclama en la reivindicación 7, en donde el medicamento es adaptado para ser administrable mediante ruta parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal, aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, pistola génica, parche dérmico, gotas para ojos y lavado bucal.
9.- El uso de un ollgonucleótido inmunoestimulador de conformidad con la reivindicación 1 , en la fabricación de un medicamento útil para prevenir el cáncer, un trastorno autoinmune, inflamación de las vías aéreas, trastornos inflamatorios, trastornos de la piel, alergia, asma o una enfermedad causada por un patógeno en un vertebrado.
10.- El uso como se reclama en la reivindicación 9, en donde el medicamento es adaptado para ser administrable mediante ruta parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal, aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, pistola génica, parche dérmico, gotas para ojos y lavado bucal.
11.- Un ¡nmunómero que comprende al menos dos oligonucleótidos enlazados por un enlazante no nucleotídico, en donde al menos uno de los oligonucleótidos comprende al menos un dinucleótido seleccionado de CpG, C*pG, C*pG* y CpG*, y en donde la secuencia de los oligonucleótidos es al menos parcialmente autocomplementaria.
12.- El inmunómero de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el oligonucleótido es de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud.
13.- El inmunómero de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la secuencia del oligonucleótido es al menos 40 por ciento autocomplementaria.
14.- El uso de un inmunómero de conformidad con la reivindicación 11 , en la fabricación de un medicamento útil para tratar terapéuticamente a un vertebrado que tiene cáncer, un trastorno autoinmune, inflamación de las vías aéreas, trastornos inflamatorios, trastornos de la piel, alergia, asma o una enfermedad causada por un patógeno.
15.- El uso como se reclama en la reivindicación 14, en donde el medicamento es adaptado para ser administrable mediante ruta parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal, aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, pistola génica, parche dérmico, gotas para ojos, gotas para oídos y lavado bucal.
16.- Una formulación farmacéutica que comprende el inmunómero de conformidad con la reivindicación 11 y un portador fisiológicamente.
17.- El uso de un inmunómero de conformidad con la reivindicación 11 , en la fabricación de un medicamento útil para generar una respuesta inmune en un vertebrado.
18.- El uso como se reclama en la reivindicación 17, en donde el medicamento es adaptado para ser administrable por ruta parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal, aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, pistola génica, parche dérmico, gotas para ojos, gotas para oídos y lavado bucal.
19.- El uso de un inmunómero de conformidad con la reivindicación 11 , en la fabricación de un medicamento útil para prevenir el cáncer, un trastorno autoinmune, inflamación de las vías aéreas, trastornos inflamatorios, trastornos de la piel, alergia, asma o una enfermedad causada por un patógeno en un vertebrado.
20.- El uso como se reclama en la reivindicación 19, en donde el medicamento es adaptado para ser administrable por ruta parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal, aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, pistola génica, parche dérmico, gotas para ojos, gotas para oídos y lavado bucal.
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Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030026782A1 (en) * 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
DE69837094T2 (de) * 1997-09-05 2007-08-30 The Regents Of The University Of California, Oakland Verwendung von immunerregenden oligonukleotiden zur vorbeugung oder behandlung von asthma
US20030022854A1 (en) 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
US6693086B1 (en) * 1998-06-25 2004-02-17 National Jewish Medical And Research Center Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes
KR100917101B1 (ko) * 2000-08-04 2009-09-15 도요 보세키 가부시키가이샤 플렉시블 금속적층체 및 그 제조방법
AU9475001A (en) * 2000-09-26 2002-04-08 Hybridon Inc Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes
JP4598389B2 (ja) * 2001-06-21 2010-12-15 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション キメラ免疫調節化合物とその使用方法
US7785610B2 (en) * 2001-06-21 2010-08-31 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—III
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
AR040996A1 (es) * 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
US8158768B2 (en) * 2002-12-23 2012-04-17 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
CA2512484A1 (en) * 2003-01-16 2004-05-08 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by utilizing modified immunostimulatory dinucleotides
US7354907B2 (en) * 2003-02-07 2008-04-08 Idera Pharmaceuticals, Inc. Short immunomodulatory oligonucleotides
CA2526212C (en) * 2003-05-16 2013-08-27 Hybridon, Inc. Synergistic treatment of cancer using immunomers in conjunction with chemotherapeutic agents
JP4874801B2 (ja) * 2003-06-11 2012-02-15 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 安定化免疫調節オリゴヌクレオチド
US20050013812A1 (en) * 2003-07-14 2005-01-20 Dow Steven W. Vaccines using pattern recognition receptor-ligand:lipid complexes
AU2004259204B2 (en) * 2003-07-15 2010-08-19 Idera Pharmaceuticals, Inc. Synergistic stimulation of the immune system using immunostimulatory oligonucleotides and/or immunomer compounds in conjunction with cytokines and/or chemotherapeutic agents or radiation therapy
US7615539B2 (en) * 2003-09-25 2009-11-10 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid-lipophilic conjugates
GEP20094767B (en) 2003-10-30 2009-09-10 Coley Pharm Group Inc C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency
EP1753453A2 (en) * 2004-06-08 2007-02-21 Coley Pharmaceutical GmbH Abasic oligonucleotide as carrier platform for antigen and immunostimulatory agonist and antagonist
US7427405B2 (en) * 2004-06-15 2008-09-23 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory oligonucleotide multimers
HUE036894T2 (hu) * 2004-06-15 2018-08-28 Idera Pharmaceuticals Inc Immunstimuláló oligonukleotid multimerek
MY159370A (en) * 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
AU2006216493A1 (en) * 2005-02-24 2006-08-31 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory oligonucleotides
PL2380584T3 (pl) 2005-07-01 2014-03-31 Index Pharmaceuticals Ab Sposób do immunostymulacji
US8148341B2 (en) 2005-07-01 2012-04-03 Index Pharmaceuticals Ab Method for modulating responsiveness to steroids
AU2006306805A1 (en) 2005-10-28 2007-05-03 Index Pharmaceuticals Ab Composition and method for the prevention, treatment and/or alleviation of an inflammatory disease
US7470674B2 (en) * 2005-11-07 2008-12-30 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds comprising modified immunostimulatory dinucleotides
PT2405002E (pt) * 2006-02-15 2015-01-05 Adiutide Pharmaceuticals Gmbh Composições e métodos para formulações de oligonucleotídeos
KR101251707B1 (ko) 2006-09-27 2013-04-11 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체
EP2173912A4 (en) * 2007-08-01 2013-03-20 Idera Pharmaceuticals Inc NEW SYNTHETIC AGONISTS OF TLR9
CN103800906B (zh) 2009-03-25 2017-09-22 德克萨斯大学系统董事会 用于刺激哺乳动物对病原体的先天免疫抵抗力的组合物
GB201021867D0 (en) 2010-12-23 2011-02-02 Mologen Ag Non-coding immunomodulatory DNA construct
BR112015016420B1 (pt) * 2013-01-08 2022-12-06 Idera Pharmaceuticals, Inc Composto de oligonucleotídeo imunorregulatório, composição farmacêutica e uso do composto iro ou da composição farmacêutica
EP3024936B1 (en) 2013-07-25 2019-09-04 Exicure, Inc. Spherical nucleic acid-based constructs as immunostimulatory agents for prophylactic and therapeutic use
EP3095461A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator
US10322173B2 (en) 2014-01-15 2019-06-18 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent
EP3095459A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having antitumor effect and antitumor agent
CA2953216C (en) 2014-06-04 2020-12-22 Exicure, Inc. Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications
WO2016044839A2 (en) 2014-09-19 2016-03-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for treating viral infections through stimulated innate immunity in combination with antiviral compounds
WO2016057898A1 (en) * 2014-10-10 2016-04-14 Idera Pharmaceuticals, Inc. Treatment of cancer using tlr9 agonist with checkpoint inhibitors
AU2015349680A1 (en) 2014-11-21 2017-06-08 Northwestern University The sequence-specific cellular uptake of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates
LU92821B1 (en) 2015-09-09 2017-03-20 Mologen Ag Combination comprising immunostimulatory oligonucleotides
GB2542425A (en) 2015-09-21 2017-03-22 Mologen Ag Means for the treatment of HIV
US11364304B2 (en) 2016-08-25 2022-06-21 Northwestern University Crosslinked micellar spherical nucleic acids
JP7200093B2 (ja) 2016-09-15 2023-01-06 アイデラ・ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド がん治療用ｔｌｒ９アゴニストを用いた免疫調節
US11696954B2 (en) 2017-04-28 2023-07-11 Exicure Operating Company Synthesis of spherical nucleic acids using lipophilic moieties
US11433131B2 (en) 2017-05-11 2022-09-06 Northwestern University Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (SNAs)
AU2021236055A1 (en) * 2020-03-09 2022-10-20 Dynavax Technologies Corporation Active booster immunization against tetanus, diphtheria and pertussis
WO2021183540A1 (en) * 2020-03-09 2021-09-16 Dynavax Technologies Corporation Shingles vaccines comprising a tlr9 agonist

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
TW244371B (es) * 1992-07-23 1995-04-01 Tri Clover Inc
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5912332A (en) 1996-07-26 1999-06-15 Hybridon, Inc. Affinity-based purification of oligonucleotides using soluble multimeric oligonucleotides
US20020028784A1 (en) * 2000-03-10 2002-03-07 Nest Gary Van Methods of preventing and treating viral infections using immunomodulatory polynucleotide sequences
AU9475001A (en) * 2000-09-26 2002-04-08 Hybridon Inc Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes
KR100881923B1 (ko) * 2000-12-27 2009-02-04 다이나박스 테크놀로지 코퍼레이션 면역자극 폴리뉴클레오티드 및 그것의 사용 방법
JP4598389B2 (ja) * 2001-06-21 2010-12-15 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション キメラ免疫調節化合物とその使用方法
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
WO2003035836A2 (en) * 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
WO2004058159A2 (en) * 2002-12-23 2004-07-15 Dynavax Technologies Corporation Branched immunomodulatory compounds and methods of using the same
CA2512484A1 (en) * 2003-01-16 2004-05-08 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by utilizing modified immunostimulatory dinucleotides
US7354907B2 (en) * 2003-02-07 2008-04-08 Idera Pharmaceuticals, Inc. Short immunomodulatory oligonucleotides
JP4874801B2 (ja) * 2003-06-11 2012-02-15 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 安定化免疫調節オリゴヌクレオチド
US20050004579A1 (en) 2003-06-27 2005-01-06 Schneider M. Bret Computer-assisted manipulation of catheters and guide wires
AU2004259204B2 (en) * 2003-07-15 2010-08-19 Idera Pharmaceuticals, Inc. Synergistic stimulation of the immune system using immunostimulatory oligonucleotides and/or immunomer compounds in conjunction with cytokines and/or chemotherapeutic agents or radiation therapy
US7427405B2 (en) * 2004-06-15 2008-09-23 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory oligonucleotide multimers
HUE036894T2 (hu) * 2004-06-15 2018-08-28 Idera Pharmaceuticals Inc Immunstimuláló oligonukleotid multimerek

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