CN101426370A - 免疫刺激性寡核苷酸多聚体 - Google Patents

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CN101426370A
CN101426370A CNA2005800277901A CN200580027790A CN101426370A CN 101426370 A CN101426370 A CN 101426370A CN A2005800277901 A CNA2005800277901 A CN A2005800277901A CN 200580027790 A CN200580027790 A CN 200580027790A CN 101426370 A CN101426370 A CN 101426370A
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萨德希尔·阿格拉沃尔
艾坎巴尔·坎迪马拉
郁东
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Aceragen Inc
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Idera Pharmaceuticals Inc
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Abstract

本发明提供了免疫刺激性核酸。本发明该方面所述的一些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸的序列至少部分自补。

Description

免疫刺激性寡核苷酸多聚体
背景技术
相关申请
本申请要求于2004年6月15号提交的美国临时专利申请第60/579,985号，和于2004年8月6号提交的美国临时专利申请第60/599,362号的权益。上述专利申请内容在此全部引用作为参考。
技术领域
本发明涉及通过寡核苷酸类似物引发免疫刺激。
相关技术概述
Tokunaga et al.，J.Natl.Cancer Inst.72(1984)955-96；.Pisetsky et al.；Reich et al.，Mol.Biol.Rep.18(1993)217-221；Krieg et al.，Yi et al.，Nature 374(1995)546-549和Sato et al.，Science 273(1996)352-354报道：细菌DNA，合成寡聚脱氧核苷酸，含有非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸为基元构成的特定序列结构(CpG DNA)的DNA疫苗能够激活脊椎动物免疫系统。
Krieg et al.，Annu.Rev.Immunol.20(2002)709-760；Dalpke et al.，Biol.Chem.383(2002)1491-1500和Kandimalla et al.，Curr.Opin.Mol.Ther.4(2002)122-129报道：CpG DNAs能够诱导天然免疫细胞产生Th1细胞因子，其激活细胞毒性T细胞(CTL)免疫应答及B细胞的免疫球蛋白生成。具有免疫刺激特性的CpG DNAs可以用来作为药物治疗许多疾病包括：肿瘤、细菌性和病毒性感染、炎症，及作为免疫治疗的佐剂。
除了化学修饰外，结构改性也可以影响CpG DNAs的活性。Kandimallaet al.，Nucleic Acids Res.30(2002)4460-4469报道：通过3′-3′连接形成两个可结合的自由5′末端的CpG DNAs比普通CpG DNAs有着更强的活性，普通CpG DNAs含有多个CpG基序拷贝及单一的5′末端。
Kandimalla et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.306(2003)948-953报道：CpG DNAs二级结构的状态和性质对CpG DNAs的活性有重要影响，当CpG DNAs 5′末端出现发夹结构时，CpG DNAs表现为刺激活性丧失，当CpG DNAs 3′末端同样出现发夹结构时，CpG DNAs的刺激活性不会受到明显影响，但会导致IL-6分泌水平降低，而使抗核酸酶的稳定性提高。
目前仍需要通过对寡核苷酸类似物的修饰来“个性化调制(customize)”免疫应答。
发明概述
第一方面，本发明提供了序列中至少有部分自补(self-complementary)的免疫刺激性寡核苷酸。该免疫刺激性寡核苷酸包含至少有一个二核苷酸的寡核苷酸序列，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*和CpG*，其中，C表示胞苷或2′-脱氧胞苷；G表示鸟苷或2′-脱氧鸟苷；C*表示2′-脱氧胸苷，1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-去氮-8-甲基-嘌呤，2′-双脱氧-5-卤基胞嘧啶，2′-双脱氧-5-硝基胞嘧啶，阿糖胞苷，2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷，2′-O-取代阿糖胞苷，2′-脱氧-5-羟基胞苷，2′-脱氧-N4-烷基-胞苷，2′-脱氧-4-硫代尿苷，或其它的嘧啶核苷类似物；G*表示2′-脱氧-7-去氮鸟苷，2′-脱氧-6-硫代鸟苷，阿糖鸟苷，2′-脱氧-2′取代-阿糖鸟苷，2′-O-取代-阿糖鸟苷，2′-脱氧肌苷，或其它嘌呤核苷类似物；p表示核苷间的连接，选自磷酸二酯、硫代磷酸酯及二硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，免疫刺激性核酸的长度大约为2到50个核苷酸。在一些实施方案中，免疫刺激性核酸的长度大约为12到26个核苷酸。在一些实施方案中，每一个寡核苷酸具有大约3到35个核苷残基，在另一些实施方案中具有大约4到30个核苷残基，甚而在一些方案中具有大约4到20个核苷残基。在一些实施方案中，寡核苷酸具有大约5到18个核苷残基，或大约5到14个核苷残基。在这里使用术语“大约”意味着准确的数目并不是关键所在。因而，寡核苷酸的核苷残基数目并非关键，少一或两个核苷残基数目的寡核苷酸和多一至数个核苷残基数目的寡核苷酸都被认为是上述实施方案的等效方案。在一些实施方案中，一个或者更多的寡核苷酸具有11个核苷酸。
第二方面，本发明提供了含有至少两个通过非核苷酸连接形成的寡核苷酸的免疫核酸(immunomer)，其中免疫刺激性寡核苷酸的序列中至少要有部分自补。按照本发明在这一方面所述，在一些实施方案中至少有一个寡核苷酸包含有至少一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*和CpG*，其中，C表示胞苷或2′-脱氧胞苷；G表示鸟苷或2′-脱氧鸟苷；C*表示2′-脱氧胸苷，1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-去氮-8-甲基-嘌呤，2′-双脱氧-5-卤基胞嘧啶，2′-双脱氧-5-硝基胞嘧啶，阿糖胞苷，2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷，2′-O-取代阿糖胞苷，2′-脱氧-5-羟基胞苷，2′-脱氧-N4-烷基-胞苷，2′-脱氧-4-硫代尿苷，或其它的嘧啶核苷类似物；G*表示2′-脱氧-7-去氮鸟苷，2′-脱氧-6-硫代鸟苷，阿糖鸟苷，2′-脱氧-2′取代-阿糖鸟苷，2′-O-取代-阿糖鸟苷，2′-脱氧肌苷，或其它嘌呤核苷类似物；p表示核苷间的连接，选自磷酸二酯、硫代磷酸酯及二硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，免疫刺激性核酸的长度大约为2到50个核苷酸。在一些实施方案中，免疫刺激性核酸的长度大约为12到26个核苷酸。在一些实施方案中，每一个寡核苷酸具有大约3到35个核苷残基，或大约4到30个核苷残基，或大约4到20个核苷残基。一些实施方案中，寡核苷酸具有大约5到18个核苷残基，或大约5到14个核苷残基。在这里使用术语“大约”意味着准确的数目并不是关键性问题。因而，寡核苷酸的核苷残基数目并非关键，少一或两个核苷残基数目的寡核苷酸和多一至数个核苷残基数目的寡核苷酸都被认为是上述实施方案的等效方案。在一些实施方案中，一个或者更多的寡核苷酸具有11个核苷酸。
第三方面，本发明提供了药物组合物。这些组合物包含上述第一和第二方面中的任一方面的任一种组合物或其联合，以及可接受的药用载体。
第四方面，本发明提供了在脊椎动物中诱发免疫应答的方法。该方法包括单独或联合给予脊椎动物本发明第一，第二和第三方面中所公开的任一组合物。这里所公开的组合物可通过适当的给药途径给予，包括但不限于，经胃肠外，经口，经舌下，经皮肤，经局部，经鼻内，经气雾，经眼内，经气管内，经直肠内，经阴道，经基因枪，经皮肤贴片，滴眼和漱口。
第五方面，本发明提供了疾病治疗方法，用于治疗如下脊椎动物疾病：癌症，自身免疫性疾病，气道炎症，炎性疾病，皮肤病，过敏症，哮喘或由病原体引起的疾病。方法包括单独或联合给予脊椎动物本发明第一，第二和第三方面所公开的任一组合物。这里所公开的组合物可通过适当的给药途径给予，包括但不限于，经胃肠外，经口，经舌下，经皮肤，经局部，经鼻内，经气雾，经眼内，经气管内，经直肠内，经阴道，经基因枪，经皮肤贴片，滴眼和漱口。
第六方面，本发明提供了疾病预防方法，用来预防如下脊椎动物疾病：癌症，自身免疫性疾病，气道炎症，炎性疾病，皮肤病，过敏症，哮喘或病原体引起的疾病。方法包括单独或联合给予脊椎动物本发明第一，第二和第三方面所公开的任一组合物，这里所公开的组合物可通过适当的给药途径给予，包括但不限于，经胃肠外，经口，经舌下，经皮肤，经局部，经鼻内，经气雾，经眼内，经气管内，经直肠内，经阴道，经基因枪，经皮肤贴片，滴眼和漱口。
附图说明
图1A和图1B表示本发明中的各种实施方案。图1B中的m和n各自是0-1000。
图2表示通过平行法合成本发明中的免疫核酸的合成方案。DMTr＝4，4′-二甲氧三苯甲基；CE＝氰乙基。
图3描述一组代表性低分子量连接子，适用于线性合成法合成本发明中的免疫核酸。
图4表示通过线性合成法合成本发明中的免疫核酸的合成方案。DMTr＝4，4′-二甲氧三苯甲基；CE＝氰乙基。
图5描述一组代表性低分子量连接子，适用于平行法合成本发明中的免疫核酸。
优选方案详述
本发明引用的授权专利，专利申请及参考文献是以同等程度引入作为参考，即每个引用都能特定地、单独地引入作为参考。如果出现本发明所引用的任何参考同本发明申请说明书不一致，出于本发明的目的以后者为准。
本发明涉及寡核苷酸的治疗应用，即寡核苷酸可作为免疫刺激性药物应用于免疫治疗中。本发明也提供了在免疫治疗应用中利用免疫化合物诱发，增强和改变免疫应答的方法，所述的免疫治疗应用包括例如，但不限于，治疗/预防成人和小儿的癌症，自身免疫性疾病，哮喘，呼吸道过敏症，食物过敏，细菌性、寄生虫性和病毒性感染，以及应用于兽医领域。过敏性哮喘是本发明的方法和免疫化合物具体治疗应用的一种疾病。因而，本发明还进一步提供了在免疫治疗中能起到最佳免疫刺激效果的化合物以及制备和使用这些免疫化合物的方法。另外，本发明中免疫刺激性寡核苷酸/免疫核酸可以作为佐剂同DNA疫苗、抗体、变应原、化疗药物及反义寡核苷酸联合使用。
第一方面，本发明提供了序列至少有部分自补的免疫刺激性寡核苷酸。本发明的免疫刺激性核酸包含至少一个二核苷酸的核酸序列，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*和CpG*，其中，C表示胞苷或2′-脱氧胞苷；G表示鸟苷或2′-脱氧鸟苷；C*表示2′-脱氧胸苷，1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-去氮-8-甲基-嘌呤，2′-双脱氧-5-卤基胞嘧啶，2′-双脱氧-5-硝基胞嘧啶，阿糖胞苷，2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷，2′-O-取代阿糖胞苷，2′-脱氧-5-羟基胞苷，2′-脱氧-N4-烷基-胞苷，2′-脱氧-4-硫代尿苷，或其它的嘧啶核苷类似物；G*表示2′-脱氧-7-去氮鸟苷，2′-脱氧-6-硫代鸟苷，阿糖鸟苷，2′-脱氧-2′取代-阿糖鸟苷，2′-O-取代-阿糖鸟苷，2′-脱氧肌苷，或其它嘌呤核苷类似物；p表示核苷间的连接，选自磷酸二酯、硫代磷酸酯及二硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸的长度大约为2到50个核苷酸。在一些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸的长度大约为12到26个核苷酸。在一些方案中，寡核苷酸具有大约3到35个核苷残基，或大约4到30个核苷残基，或大约4到20个核苷残基。一些实施方案中，寡核苷酸具有大约5到18个核苷残基，或大约5到14个核苷残基。在这里使用术语“大约”意味着准确的数目并不是关键性问题。因而，寡核苷酸的核苷残基数目并非关键，少一或两个核苷残基数目的寡核苷酸和多一至数个核苷残基数目的寡核苷酸都被认为是上述实施方案的等效方案。在一些实施方案中，一个或者更多的寡核苷酸具有11个核苷酸。
正如本领域技术人员所知，寡核苷酸的互补序列允许分子间通过氢键连接形成寡核苷酸的二级结构。因此，其它寡核苷酸可以通过互相连接形成本发明寡核苷酸的链或多聚体。
第二方面，本发明提供了含有至少两个通过非核苷酸连接形成的寡核苷酸的免疫核酸，其中免疫刺激性寡核苷酸的序列中至少要有部分自补。按照本发明在这一方面所述，在一些实施方案中至少有一个寡核苷酸包含有至少一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*和CpG*，其中，C表示胞苷或2′-脱氧胞苷；G表示鸟苷或2′-脱氧鸟苷；C*表示2′-脱氧胸苷，1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-去氮-8-甲基-嘌呤，2′-双脱氧-5-卤基胞嘧啶，2′-双脱氧-5-硝基胞嘧啶，阿糖胞苷，2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷，2′-O-取代阿糖胞苷，2′-脱氧-5-羟基胞苷，2′-脱氧-N4-烷基-胞苷，2′-脱氧-4-硫代尿苷，或其它的嘧啶核苷类似物；G*表示2′-脱氧-7-去氮鸟苷，2′-脱氧-6-硫代鸟苷，阿糖鸟苷，2′-脱氧-2′取代-阿糖鸟苷，2′-O-取代-阿糖鸟苷，2′-脱氧肌苷，或其它嘌呤核苷类似物；p表示核苷间的连接，选自磷酸二酯、硫代磷酸酯及二硫代磷酸酯。
在本方面，免疫刺激性核酸含有如下结构，如式(I)所示：
结构域A-结构域B-结构域C        (I)
在这里，结构域的长度大约是2到12个核酸。结构域A可以是5′-3′或3′-5′或2′-5′DNA，RNA，RNA-DNA，DNA-RNA，其中存在含有或不含有至少一个二核苷酸的回文式结构域或自补式结构域，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*和CpG*，其中，C表示胞苷或2′-脱氧胞苷；G表示鸟苷或2′-脱氧鸟苷；C*表示2′-脱氧胸苷，1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-去氮-8-甲基-嘌呤，2′-双脱氧-5-卤基胞嘧啶，2′-双脱氧-5-硝基胞嘧啶，阿糖胞苷，2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷，2′-O-取代阿糖胞苷，2′-脱氧-5-羟基胞苷，2′-脱氧-N4-烷基-胞苷，2′-脱氧-4-硫代尿苷，或其它的嘧啶核苷类似物；G*表示2′-脱氧-7-去氮鸟苷，2′-脱氧-6-硫代鸟苷，阿糖鸟苷，2′-脱氧-2′取代-阿糖鸟苷，2′-O-取代-阿糖鸟苷，2′-脱氧肌苷，或其它嘌呤核苷类似物；p表示核苷间的连接，选自磷酸二酯、硫代磷酸酯及二硫代磷酸酯。在一些实施方案中，免疫刺激性二核苷酸并非CpG。
在一些实施方案中，结构域A含有一个以上的二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*和CpG*。
结构域B(在下文中用“X”表示)是结构域A和结构域C间的连接子，可以通过3′-′5′，2′-5′或3′-3′连接，也可以是磷酸基团、核苷，或非核苷连接子如：脂肪族、芳香族、芳基、环、手性、非手性、肽、碳水化合物、脂类、脂肪酸、单聚乙二醇、三聚乙二醇、六聚乙二醇或杂环部分。
结构域C可以是5′-3′或3′-5′，2′-5′DNA，RNA，RNA-DNA，NA-RNAPoly I-Poly C，其中存在含有或不含有二核苷酸的回文式结构域或自补的序列，二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*和CpG*，其中，C表示胞苷或2′-脱氧胞苷；G表示鸟苷或2′-脱氧鸟苷；C*表示2′-脱氧胸苷，1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-去氮-8-甲基-嘌呤，2′-双脱氧-5-卤基胞嘧啶，2′-双脱氧-5-硝基胞嘧啶，阿糖胞苷，2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷，2′-O-取代阿糖胞苷，2′-脱氧-5-羟基胞苷，2′-脱氧-N4-烷基-胞苷，2′-脱氧-4-硫代尿苷，或其它的嘧啶核苷类似物；G*表示2′-脱氧-7-去氮鸟苷，2′-脱氧-6-硫代鸟苷，阿糖鸟苷，2′-脱氧-2′取代-阿糖鸟苷，2′-O-取代-阿糖鸟苷，2′-脱氧肌苷，或其它嘌呤核苷类似物；p表示核苷间的连接，选自磷酸二酯、硫代磷酸酯及二硫代磷酸酯。在一些实施方案中，免疫刺激性二核苷酸并非CpG。在一些实施方案中，优选地结构域B是连接结构域A和结构域C寡核苷酸的非核苷酸连接子，这里的寡核苷酸就是“免疫核酸(immunomer)”。在一些实施方案中，结构域C不含有选自CpG、C*pG、C*pG*或CpG*的二核苷酸。
在一些实施方案中，含有式(I)结构的寡核苷酸长度大约为2到50个核苷酸。在一些实施方案中，含有式(I)结构的寡核苷酸长度大约为12到26个核苷酸。在一些实施方案中，每一个寡核苷酸具有大约3到35个核苷残基，优选具有大约4到30个核苷残基，更优选具有大约4到20个核苷残基。在一些实施方案中，寡核苷酸具有大约5到18个核苷残基，或大约5到14个核苷残基。在这里使用“大约”意味着准确的数目并不是关键所在。因而，寡核苷酸的核苷残基数目并非关键，少一或两个核苷残基数目的寡核苷酸和多一至数个核苷残基数目的寡核苷酸都被认为是上述实施方案的等效方案。在一些实施方案中，一个或者更多的寡核苷酸具有11个核苷酸。
本发明中，自补序列是指，通过适当对排(alignment)，可以在分子内、或更常见在分子间按G-C，A-T，A-U和/或G-U摆动对(wobble pair)来形成碱基配对的那些碱基序列。在一实施方案中，自补的程度至少占50％。比如：至少50％自补的8-mer可含有一段序列能够形成4，5，6，7，或8G-C，A-T，A-U和/或G-U摆动对。这些碱基对可以但不一定包括位于自补的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸任一末端的碱基对。当核酸的稳定性对于免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸可能比较重要时，通过碱基配对或其它适当的方法使双链核苷酸的一端或两端“夹”在一起是有利的。自补的程度取决于免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸之间的对排，这样的对排可以包括或不包括单个或多个核苷突出端。在其它一些实施方案中，自补的程度达到至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，甚至100％。
对于具有不同碱基序列的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸的分子间碱基配对有类似考虑。因此，当大量的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸一起使用时，这些免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸可以但不一定含有至少部分彼此互补的序列。在一实施方案中，在大量的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸中存在含有第一序列的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸和含有第二序列的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸，其中，第一序列和第二序列间至少有50％互补。比如：在两个至少50％互补的8-mer间可以形成4，5，6，7，或8G-C，A-T，A-U和/或G-U摆动对。这些碱基对可以但不一定包括位于互补的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸任一末端的碱基。互补的程度取决于免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸之间的对排，这样的对排可以包括或不包括单个或多个核苷突出端。在其它一些实施方案中，互补的程度达到至少60％、至少70％、至少80％、至少90％甚至100％
通过非限制性实施例可知，在这一方面的一些实施方案中免疫刺激性核酸具有以下结构，如式(II)所示：
Figure A200580027790D00111
如本领域的技术人员所知，本方面描述的免疫刺激性核酸和/或免疫核酸化合物存在二级结构，这是因为结构域的序列互补使分子间可以形成氢键。结构域A和A′可以相同或不同，结构域A和C可以相同或不同，结构域A和C′可以相同或不同，结构域A′和C可以相同或不同，结构域A′和C′可以相同或不同，结构域B和B′可以相同或不同，结构域C和C′可以相同或不同。此外，如图1所示，另外的免疫核酸间可以通过分子间氢键结合而形成本发明免疫核酸的链或多聚体。n可以表示任意数目的连续、自补性免疫核酸化合物。
本发明中的术语“互补”表示具有与核酸杂交的能力。这样的杂交一般是互补链之间氢键结合的结果，优选形成Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，但其它氢键结合模式及碱基堆积也可以导致杂交。
本发明中的术语“二级结构”表示分子间的氢键结合。分子间的氢键结合导致形成双链核酸分子。
“回文序列”指反向重复序列(例如：序列ABCDEE′D′C′B′A′，其中A和A′，B和B′等，这些碱基能够形成经典的Watson-Crick碱基配对)。在体内，这些序列可以形成双链结构。在一个实施例中，CpG核酸含有回文序列。本发明的上下文中，回文序列是指一种回文结构，其中CpG是该回文结构的一部分。在一些实施例中，CpG位于回文序列的中心。在另一些实施例中，回文序列中不含有CpG核酸。在不含有回文序列的免疫刺激性核酸中，CpG二核苷酸就不是回文序列的一部分。这样的寡核苷酸也可含有不以CpG为中心的回文结构。
从本发明的目的出发，术语“寡核苷酸”指的是由多个核苷单位连接形成的多核苷酸。这些寡核苷酸可以从现存的核酸资源包括基因组或cDNA中获得，优选通过合成方法生产出来。在一些实施方案中，每一个核苷单位包括杂环碱基、呋喃核糖、2′-脱氧呋喃核糖(2′-deoxypentfuranosyl)、海藻糖(trehalose)、阿拉伯糖、2′-脱氧-取代阿拉伯糖(2′-deoxy-2′-substitutedarabinose)、2′-O-取代阿拉伯糖(2′-O-substituted arabinose)或己糖基团(hexosesugar group)。核苷残基彼此可以通过已知的众多连接子中任一种相互连结，这些核苷间连接子包括但不限于：磷酸二酯(phosphodiester)、硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、烷基膦酸酯(alkylphosphonate)、烷基硫代磷酸酯(alkylphosphonothioate)、磷酸三酯(phosphotriester)、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、硅氧烷(siloxane)、碳酸酯(carbonate)、碳烷氧基(carboalkoxy)、乙酰唑胺(acetamidate)、氨基甲酸酯(carbamate)、吗啉基(morpholino)、硼烷基(borano)、硫醚(thioether)、桥联氨基磷酸酯(bridged phosphoramidate)、桥联亚甲基磷酸酯(bridged methylenephosphonate)、桥联硫代磷酸酯(bridged phosphorothioate)和砜(sulfone)。术语“寡核苷酸”也包括含有一个或多个立体特异性核苷间连接的多核苷酸(例如：(RP)-或(SP)-硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、或磷酸三酯连接)。本发明中使用的术语“寡核苷酸”和“二核苷酸”明确指明包括含有上述任一种核苷间连接的多核苷酸和二核苷酸，无论这些连接是否含有磷酸基团。在一些实施方案中，这些核苷间连接可以是磷酸二酯、硫代磷酸酯、或二硫代磷酸酯，或三者的组合。
术语“寡核苷酸”还涵盖了含有附加的取代基的多核苷酸，这些取代基包括但不限于：蛋白基团、亲脂基团、嵌入剂、二胺、叶酸、胆固醇和金刚烷胺。术语“寡核苷酸”还涵盖了含有多聚体的其它任意核碱基(nucleobase)，包括但不限于：肽核酸(PNA)、含磷酸基团的肽核酸(PHONA)、锁定核酸(LNA)、以吗啉基为主链的寡核苷酸，以及主链中有氨基或烷基连接子的寡核苷酸。
本发明中的寡核苷酸可以包括自然存在的核苷、修饰的核苷或两者的混合。本发明中使用的术语“修饰的核苷”指的是核苷中含有修饰的杂环碱基、修饰的糖基或二者的组合。在一些实施例中，修饰的核苷为本文所述的非天然嘧啶核苷或嘌呤核苷。在一些实施方案中，修饰的核苷为2′-取代核糖核苷、阿糖核苷或2′-脱氧-2′-取代-阿拉伯糖苷。
从本发明目的出发，术语“2′-取代核糖核苷”或“2′-取代阿拉伯糖苷”包括核糖核苷或阿糖核苷，且它们的戊糖部分2′位置上的羟基被取代而形成2′-取代或2′-O-取代核糖核苷。在一些实施方案中，这些取代是被带有1到6个饱和或不饱和碳原子的低级烷基取代，或被含有6到10个碳原子的芳香取代，其中，这样的烷基或芳香基团可被或不被以下基团取代，例如：卤素、羟基、三氟甲基(trifluoromethyl)、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、碳烷氧基、或氨基。2′-O-取代-核糖核苷或2′-O-取代-阿拉伯糖苷的例子包括但不限于：2′-O-甲基核糖核苷或2′-O-甲基阿拉伯糖苷及2′-O-甲氧基乙氧基核糖核苷或2′-O-甲氧基乙氧基阿拉伯糖苷。
术语“2′-取代核糖核苷”或“2′-取代阿拉伯糖苷”也包括如下核糖核苷或阿拉伯糖苷，其2′-羟基被以下基团替代：带有1到6个饱和或不饱和碳原子的低级烷基、氨基或卤素。这样的2′-取代核糖核苷或2′-取代阿拉伯糖苷的例子包括但不限于：2′-氨基、2′-氟基、2′-烯丙基和2′-炔丙基核糖核苷或阿拉伯糖苷。
术语“寡核苷酸”包括杂合寡核苷酸和嵌合寡核苷酸。“嵌合寡核苷酸”指的是有一种以上核苷间连接类型的寡核苷酸。这样的嵌合寡核苷酸的非限制性例子有含有硫代磷酸酯区、磷酸二酯区或二硫代磷酸酯区以及者如烷基膦酸酯连接或烷基硫代磷酸酯连接等非离子连接的嵌合寡核苷酸(参见Pederson et al.U.S.专利号5,635,377和5,366,878)。
“杂合寡核苷酸”指的是有一种以上核苷类型的寡核苷酸。这样的杂合寡核苷酸的非限制性例子包含有核糖核苷酸区或2′取代核糖核苷酸区，及脱氧核糖核苷酸区(参见Metelev and Agrawal，U.S.专利号5,652,355，6,346,614和6,143,881)。
或者，本发明中的核酸分子可以是两个通过非核苷酸连接子连接的免疫核酸。
在本发明的一些实例中，至少有一个本发明免疫刺激性寡核苷酸含有结构式5′-Pyr-Pur-3′所示的免疫刺激性二核苷酸，其中Pyr是指天然嘧啶核苷或其类似物，Pur是指天然嘌呤核苷或其类似物。本发明中使用的术语“嘧啶核苷”是指核苷碱基成分为嘧啶碱基的核苷，类似地，术语“嘌呤核苷”是指核苷碱基成分为嘌呤碱基的核苷。出于本发明的目的，“合成”嘧啶核苷或嘌呤核苷包括非天然嘧啶碱基或嘌呤碱基、非天然糖基部分、或二者的组合。
在一些实施方案中，本发明所述的方法使用的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸中的嘧啶核苷具有如下结构，如式(III)所示：
Figure A200580027790D00141
其中，
D：氢键供体
D′：选自氢、氢键供体、氢键受体、亲水基团、疏水基团、吸电子基团、供电子基团。
A：氢键受体或亲水基团
A′：选自氢键受体、亲水基团、疏水基团、吸电子基团、供电子基团
X：碳或氮；以及
S′：戊糖或己糖环，或非天然糖类
在一些实施方案中，糖环经衍生含有磷酸部分、修饰的磷酸部分，或其它适于将嘧啶核苷与另一核苷或核苷类似物连接的连接子部分。
在一些实施方案中，氢键供体包括但不限于：-NH-，-NH2，-SH和-OH.。优选的氢键受体包括但不限于：C＝O，C＝S，和芳香族杂环中环上的氮原子，如胞嘧啶的N3。
在一些实施方案中，结构式(III)中的碱基部分为非天然嘧啶碱基。在一些优选例中非天然嘧啶碱基包括但不限于：5-羟基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、N4-烷基胞嘧啶、或N4-乙基胞嘧啶，及4-硫尿嘧啶。在一些实施方案中结构式(III)中糖基部分S′是非天然糖基部分。出于本发明的目的，“天然糖基部分”是指天然存在于核酸中的糖基部分，如：核糖和2′-脱氧核糖。“非天然糖基部分”是指任何非天然存在于核酸中的糖基，但是非天然糖基部分如己糖可用于构成寡核苷酸的主链。阿拉伯糖和阿拉伯糖衍生物都是糖基部分的非限制性例子。
在一些实施方案中，本发明所述的方法使用的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸中的嘌呤核苷具有结构式(IV)所示结构
Figure A200580027790D00151
其中，
D：氢键供体
D′：选自氢、氢键供体、亲水基团
A：氢键受体或亲水基团
X：碳或氮
每个L都单独的选自C、O、N和S；以及
S′：戊糖环或己糖环，或非天然糖类
在一些实施方案中，糖环经衍生含有磷酸部分、修饰的磷酸部分，或其它适于将嘧啶核苷与另一核苷或核苷类似物连接的连接子部分。
在一些实施方案中，氢键供体包括但不限于：-NH-，-NH2，-SH和-OH。优选的氢键受体包括但不限于：C＝O、C＝S、-NO2，和芳香族杂环中环上的氮原子，如鸟嘌呤的N1。
在一些实施方案中，结构式(IV)中的碱基部分为非天然嘌呤碱基。在一些优选例中非天然嘌呤碱基包括但不限于：6-硫代鸟嘌呤和7-去氮鸟嘌呤。在一些实施方案中，结构式(IV)中的糖基部分S′是天然糖基部分，这在上述结构式(III)中已阐述过。
在第三方面，本发明提供了药物组合物。这些组合物包含本发明第一和第二方面中的任一方面的任一种组合物或其联合，以及可接受的药用载体。
在本发明中使用术语“生理上可接受”指的是不会影响到本发明第一、第二或第三方面中组合物的功效的材料，这种材料也能够与诸如细胞、细胞培养物、组织或生物等系统相容。在一些实施方案中，生物系统是活体生物，如脊椎动物。
在本发明中使用的术语“载体”涵盖了任何赋形剂、稀释剂、充填剂、盐、缓冲液、稳定剂、脂质或其它在药物制剂领域中公知常用的材料。可以理解，选用的载体、赋形剂或稀释剂的性质取决于具体应用时的给药途径。制备含有上述材料的可药用制剂的方法已在例如Remington’sPharmaceutical Sciences，18th Edition，ed.A.Gennaro，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990，ISBN：0-912734-04-3中描述。
本发明中的药物组合物还包括癌症疫苗，选自EFG、抗独特型癌症疫苗、Gp75抗原、GMK黑色素瘤疫苗、MGV神经节苷脂偶联疫苗、Her2/new、Ovarex、M-Vax、O-Vax、L-Vax、STn-KHL癌疫苗(theratope)、BLP25(MUC-1)、脂质体独特型疫苗、黑素瘤疫苗(Melacine)、肽抗原疫苗、毒素/抗原疫苗、MVA-vased疫苗、PACIS、BCG疫苗、TA-HPV、TA-CIN、DISC-病毒和ImmunCyst/TheraCys。
在本发明的不同实施方案中，本发明中第一、第二或第三方面所述组合物可以与抗原共价结合或有效地交联。本发明中使用的术语“有效地交联”是指保持本发明中第一、第二或第三方面组合物的活性，同时也保持抗原的活性的任何交联。这样的有效交联的非限制性实例包括同一脂质体或其它这样的运送载体或试剂的一部分。在本发明的第一、第二或第三方面所述的组合物与抗原共价结合的实施方案中，这样的共价结合除了不在免疫刺激性寡核苷酸的5′可及端外可以处于本发明所述的第一、第二或第三方面所述的组合物的任何位置。例如：抗原可附着至核苷间连接，也可附着至非核苷酸连接子。或者，抗原可以本身就是非核苷酸连接子。
在本发明的不同实施方案中，本发明中第一、第二或第三方面所述的组合物可以包括具有反义活性的寡核苷酸。本发明中使用的术语“反义活性”是指寡核苷酸在导入细胞或动物后会引起与其互补的基因的表达减少。
在本发明的不同实施方案中，本发明第一、第二或第三方面所述的组合物可包括作为适体的寡核苷酸序列。适体是依据与其它分子结合的能力从随机库中筛选出来的核酸分子。与核酸、蛋白、小分子有机化合物、甚至整个生物相结合的适体已被筛选出来。这些新型的分子在医疗技术应用中有着广泛的潜力(参见例如Burgstaller P.，et al.Curr Opin Drug DiscovDevel.5：690-700(2002))。
本发明中的药物组合物可以通过多种合适的途径给予，包括但不限于：经胃肠外，经口，经舌下，经皮肤，经局部，经鼻内，经气雾，经眼内，经气管内，经直肠内，经阴道，经基因枪，经皮肤贴片或经滴眼或漱口形式。可以按已知的应用剂量给予本发明中的药物组合物并在效用时间内获得预期效果，例如肿瘤、感染和自身性免疫性疾病的治疗。在系统性给药时，以足够剂量给予所述药物组合物，使本发明中第一、第二或第三方面的组合物可获得大约0.0001微摩尔到约10微摩尔血药浓度。在局部用药时，比上述小得多的血药浓度可能有效，高于上述血药浓度可能可以耐受。在一些方案中，免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸的总剂量为大约0.001毫克/每天每人到约200毫克/每公斤体重每天。在单个治疗阶段，同时或序贯对个体给予本发明的一种或多种治疗性组合物的有效剂量是可取的。
免疫刺激性寡核苷酸用以下合成方案制成免疫核酸。本发明的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸可以通过自动合成器和亚磷酰胺(phosphoramidite)途径方便地合成(在图2和图4中描述)。在一些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸通过线性合成法合成(见图2)。用于该合成法的代表性连接子见图3。本发明中使用的术语“线性合成法”是指合成开始于免疫核酸的一端，然后呈线性地进行至另一端。线性合成法允许相同或不相同(就长度、碱基组成和/或掺入的化学修饰而言)的单体单元并入免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸。
免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸的另一种合成方法是“平行合成法”，就是合成从中心连接子部分往外进行(见图4)。平行合成法中的代表性连接子见图5。附有连接子的固相载体可用于平行合成法(见美国专利第5,912,332.号)。或者，一种通用的固相载体如附有磷酸根的可控孔径玻璃载体也可用于平行合成法。
在免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸合成中，比起线性合成法，平行合成法具有如下优点：(1)平行合成法可以并入相同的单体单元；(2)两个(或全部的)单体单元能同时合成，因而合成两个(或全部的)单体单元所用的步骤和时间同合成一个单体单元的相同，这不同于线性合成法；(3)合成步骤的减少提高了免疫核酸终产物的纯度和产量。
无论是通过线性合成法或平行合成法，合成结束时，如果并入了修饰的核苷，本发明的免疫刺激性寡核苷酸或免疫核酸可以方便地通过浓缩的氨水溶液或用亚磷酰胺供应商推荐的方法进行脱保护。优选的，可以通过反向HPLC、脱三苯甲基、脱盐和透析对免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸产物进行纯化。
本发明第一和第三方面所述的组合物可以只包括免疫刺激性寡核苷酸或免疫核酸，或作为寡核苷酸/免疫核酸偶联物。寡核苷酸/免疫核酸偶联物包括如上述的寡核苷酸或免疫核酸及与该寡核苷酸和/或与免疫核酸在除5′可及端外的位置偶联的抗原。在一些实施方案中，非核苷酸连接子含有偶联于该寡核苷酸的抗原。在一些实施方案中，抗原与寡核苷酸除3′端外的位置偶联。在一些实施方案中，抗原产生疫苗效力。可通过下述给药方法给予单独的免疫刺激性寡核苷酸或免疫核酸，或寡核苷酸/免疫核酸偶联物。
抗原是任选自与病原体、癌症、自身免疫性疾病、例如但不限于畜病或小儿疾病的其它疾病相关联的抗原，或抗原本身就是变应原。出于本发明的目的，术语“相关联”是指当病原体、癌症、自身免疫性疾病、食物过敏症、皮肤过敏症、呼吸道过敏、哮喘或其它疾病存在时抗原存在；当病原体、癌症、自身免疫性疾病、食物过敏症、皮肤过敏症、呼吸道过敏或其它疾病不存在时，这些抗原可以不存在，或存在但减量。
免疫核酸与抗原共价结合，或有效地联合。本发明中的术语“有效地联合”是指同时保持免疫核酸和抗原活性的任何联合。这样有效地联合的非限制性例子包括成为同一脂质体或其它这样的运送载体或试剂的一部分。在一些实施方案中，免疫核酸与抗原共价结合，这样的共价结合优选除了不位于免疫刺激性寡核苷酸的5′可及端外可位于免疫核酸的任一位置。例如，抗原可与核苷间连接子结合，也可与非核苷酸连接子结合。或者，抗原本身为非核苷酸连接子。
第四方面，本发明提供了在脊椎动物中产生和/或调节免疫应答的方法。这些方法包括对脊椎动物给予本发明的免疫核酸或免疫核酸偶联物。在一些实施方案中，脊椎动物为哺乳动物。为了本发明的目的，术语“哺乳动物”明确指明包括人类在内。在一些实施方案中，对需要免疫刺激的脊椎动物给予免疫核酸或免疫核酸偶联物。
本发明中使用的术语“调节”是指增强或降低免疫刺激性核酸相比于亲本免疫刺激性核酸的免疫刺激活性。
本发明上述方面的方法中，可以通过任意合适的途径给予免疫核酸，包括但不限于：经胃肠外，经口，经舌下，经皮肤，经局部，经鼻内，经肌肉，经腹腔，经皮下，经皮内，经气雾，经眼内，经气管内，经直肠内，经阴道，经基因枪，经皮肤贴片，或经滴眼或漱口形式。免疫核酸的治疗性组合物可以用已知方法在足够长的时间内给予足够剂量，以便有效减轻疾病症状或减少疾病的代表性标志物。在系统性给药时，优选的以足够剂量给予治疗性组合物以获得大约0.0001微摩尔到10微摩尔的免疫核酸血药浓度。在局部用药时，比上述小得多的血药浓度可能有效，高得多的血药浓度可以耐受。优选的，免疫核酸的总剂量为大约0.001毫克/每天每人到200毫克/每公斤体重每天。在单个治疗阶段，同时或序贯对个体给予本发明的一种或多种治疗性组合物的有效剂量是可取的。
无论是免疫核酸或疫苗，或上述二者，都可以与免疫原性蛋白连接。这些免疫原性蛋白具体如：钥孔血蓝蛋白(KLH)、霍乱毒素B亚基、或任意其它的免疫原性载体蛋白或非免疫原性载体蛋白。可能应用到的多种佐剂包括但不限于：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、KLH、单磷酸类脂A(MPL)、明矾和皂甙，包括QS-21、咪喹莫特(imiquimod)、R848，或上述的组合。
Toll样受体(TLRs)作为感染的感应器可诱导激活天然免疫应答和获得性免疫应答。TLRs识别各种配体，被称为病原体相关分子模式(PAMP)。TLR通过其细胞间信号区域、Toll/白介素-1受体(TIR)区域和下游接应(adaptor)蛋白MyD88，识别保守的病原体相关分子产物，而激活宿主防御应答。通常树突状细胞和巨噬细胞也对TOLL样受体(TLR)配体和细胞因子(如：白介素-1β、IL-6和肿瘤坏死因子TNF)有反应，这两种细胞本身也会产生这些细胞因子；自然杀伤(NK)细胞和T细胞也参与促炎循环(circuit)。在TLR受到细菌来源的化合物的刺激后，天然免疫细胞会分泌一系列细胞因子。TLR配体的例子包括但不限于：脂蛋白、肽聚糖、酵母聚糖(zymosan，TLR2)，双链RNA，polyI：polyC(TLR3)，脂多糖、热休克蛋白、紫杉醇(taxol，TLR4)、鞭毛蛋白(TLR5)和咪唑喹啉-R848，瑞喹莫德(resiquimod)、咪喹莫特、ssRNA(TLR7/8)，β-淋巴细胞(TLR10)和尿路致病性大肠杆菌(TLR11)。
本发明上述方面的方法可用于免疫系统的模型研究。这些方法也可用于人类或动物疾病的预防和治疗。例如，这些方法可以用于儿科和兽医学的疫苗应用。
第五方面，本发明提供治愈性治疗脊椎动物疾病或失调病症的方法，这些方法包括给予脊椎动物本发明的免疫核酸或免疫核酸偶联物。在不同的实施方案中，所治疗的疾病或失调病症是：癌症、自身免疫性疾病、呼吸道炎症、炎性疾病、过敏症、哮喘或病原体引起的疾病。病原体包括细菌、寄生虫、真菌、病毒、类病毒、和朊病毒。具体的给药途径在本发明第四方面已阐述。
基于本发明的目的，术语“过敏症”包括但不限于：食物过敏症、特应性皮炎、过敏性鼻炎(也称枯草热)、过敏性结膜炎、荨麻疹、呼吸道过敏症和其它物质如乳胶、药剂及昆虫螫伤引起的过敏症，或通常由过敏性鼻炎-鼻窦炎、中耳炎和COPD引起的症状。术语“气道炎症”包括但不限于哮喘。哮喘的具体例子包括但不限于：过敏性哮喘、非过敏性哮喘、运动性哮喘、职业性哮喘和夜间哮喘。
过敏性哮喘主要表现为与变态反应相关的气道阻塞，其由称作变应原的物质激发。过敏性哮喘的发作诱因包括但不限于：空气花粉、霉菌、动物毛屑、室内尘螨和蟑螂粪便。非过敏性哮喘由病毒感染、某种药剂或空气中刺激鼻和气道的刺激剂诱发。非过敏性哮喘的发作诱因包括但不限于：空气微粒(如：煤、粉尘)、空气污染物(如：烟草烟雾、木材烟雾)、强烈气味或喷雾(如：香水、家用清洁剂、烹调烟雾、涂料或清漆)、病毒感染(如：感冒、病毒性肺炎、鼻窦炎、鼻息肉)、阿司匹林过敏、胃食管反流疾病(GERD)。运动性哮喘(exercise-induced asthma，EIA)是由剧烈的身体运动诱发。大多数哮喘患者的EIA症状轻重不一，且很可能因在运动时吸入干燥的冷空气而诱发这些症状。运动性哮喘发作诱因包括但不限于：在运动时吸入空气花粉、在运动时吸入空气污染物、在病毒性呼吸道感染时运动、在干燥的冷空气中运动。职业性哮喘与吸入工作场所中刺激物或其它可能有害的物质有直接关系。职业性哮喘发作诱因包括但不限于：烟雾(fume)、化学试剂、气体、树脂、金属材料、灰尘、蒸汽和杀虫剂。
本发明中使用的术语“自身免疫性疾病”是指由于免疫系统攻击自身蛋白引起的疾病。该术语所指包括自身免疫性哮喘。
本发明并不希望受限于于任何特定的理论，在发达国家中减少与细菌的接触可能与过敏性疾病(如：哮喘、特应性皮炎和鼻炎)发病率的增加、严重度的提高和病死率的增高有部分关系。已有证据支持这种假说：在实验性动物模型和临床研究中发现细菌感染或细菌产物能够抑制过敏性疾病的进展。细菌DNA或以某种序列结构含有未甲基化CpG二核苷酸和/或修饰的CpG二核苷酸的合成寡聚脱氧核苷酸(CpG DNA)能够有效地激活天然免疫应答从而获得免疫力。CpG DNA激发的免疫应答包括：天然免疫细胞的活化、B细胞的增殖、Th1细胞因子分泌的诱导以及免疫球蛋白(Ig)的产生。CpG DNA通过Toll样受体9(TLR9)这种分子模式识别受体使免疫细胞活化。CpG DNA诱发以分泌IL-12和IFN-γ为特征的Th1介导的强烈免疫应答。在过敏性哮喘小鼠模型中，免疫核酸(IMO)单独或作为变应原偶联物形式的IMO减少IL-4、IL-5和IgE的生成并减轻嗜酸粒细胞增多。IMO化合物也通过将Th2应答转换为Th1应答，而有效逆转已有的特应性嗜酸粒细胞增多性气道炎症。
在各种小鼠和大鼠模型中，结合明矾的OVA通常用来建立Th2介导的免疫应答。Th2免疫应答包括：增加IL-4、IL-5和IL-13的生成、提高血清中IgE及IgG1的总水平和抗原特异性水平、降低IgG2a的水平。在小鼠中，IMO化合物阻止和逆转已建立的Th2介导的免疫应答。联合给予小鼠IMO化合物和OVA/明矾会减少IL-4IL-5和IL-13的生成，也会诱导受抗原反复刺激的脾细胞培养物分泌IFN-γ。此外，在这些小鼠中IMO化合物抑制抗原特异性IgE和总IgE，增强IgG2a的生成。
在小鼠中注入OVA/明矾和IMO化合物会诱导淋巴细胞产生抗原记忆应答(Th1型)，这种免疫应答主要表现为低水平的Th2细胞因子、IgE和IgG1以及高水平的Th1细胞因子和IgG2a。在活体外和活体内的研究中，联合注入IMO化合物和其它类型的抗原(如：S.masoni卵和鸡卵溶菌酶(S.masoniegg and hen egg lysozyme))也会使Th2应答转换为Th1应答。综上所述，IMO化合物能够有效阻止Th2免疫应答并允许强烈的Th1免疫应答。
Th2细胞因子刺激Ig同型转换而生成IgE和IgG1，而Th1细胞因子IFN-γ则诱导B细胞生成IgG2a。与单独注入OVA/明矾的小鼠对比，注入OVA/明矾和IMO化合物的小鼠产生更低水平的IL-4、IL-5和IL-13和更高水平的IFN-γ，同时伴有更低水平的IgE和IgG1以及更高水平的IgG2a。这表明接受抗原和IMO化合物的小鼠中Th1细胞因子诱导与免疫球蛋白同型转换间有着密切的关系。
同单独接受OVA/明矾的小鼠对比，接受OVA/明矾和IMO化合物的小鼠血清中抗原特异性IgE和总IgE水平明显更低。与此相反，同单独注入OVA/明矾的小鼠对比，OVA特异性IgG1有明显改变而总IgG1水平只有轻微降低(数据未列出)。所述不同免疫应答可能由不同机制引起，这些机制涉及IgE和IgG1类型转换的控制，但这二者的同型都受到IL-4和IL-13的影响，例如：在有IL-4时，IL-6刺激B细胞合成IgG1。
第六方面，本发明提供了疾病预防方法，用于预防如下脊椎动物疾病：癌症，自身免疫性疾病，气道炎症，炎性疾病，皮肤病，过敏症，哮喘或病原体引起的疾病。该方法包括单独或联合给予脊椎动物本发明第一，第二和第三方面所公开的任一组合物。病原体包括细菌、寄生虫、真菌、病毒、类病毒和朊病毒。具体给药方法已在本发明第四方面阐述。
在本发明的任何方法中，免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸或其偶联物可以与可用于治疗该疾病但不降低所述寡核苷酸或免疫核酸的免疫刺激效果的其它任意因子(agent)联合给药。基于本发明所述方面的目的，术语“联合”是指在治疗同一病人同一疾病的过程中联合，且包括按任何顺序给予所述免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫核酸及因子(agent)，包括同时给药，也可以按任何时间间隔顺序给药，例如：从一种药紧接着另一种药连续给药到分隔数天给药。这样的联合治疗也包括不止一次给予免疫核酸，及独立地给予因子(agent)。寡核苷酸和/或免疫核酸与因子(agent)的给药途径可相同也可不相同。
在本发明的任何方法中，可用于治疗疾病或病症的因子(agent)包括但不限于：疫苗、抗原、抗体、细胞毒性剂、变应原、抗生素、反义寡核苷酸、肽、蛋白、基因治疗载体、DNA疫苗和/或提高免疫应答特异性或强度的佐剂、或共刺激分子诸如细胞因子、趋化因子、蛋白配体、反式激活因子、肽和含有修饰氨基酸的肽。另外，这样的因子(agent)可包括编码抗原或变应原的DNA载体。在这些实施方案中，本发明的免疫核酸可以发挥不同的作用如佐剂和/或产生直接的免疫刺激效果。
下述实施例意在进一步说明本发明一些优选的实施方案，并不作为本发明的范围限定。
实施例
实施例1：寡核苷酸合成，纯化和热解链曲线图
应用β-氰乙基亚磷酰胺(β-cyanoethylphosphoramidites)在PerSeptiveBiosystem 8909 Expedite DNA合成器(PerSeptive Biosystem，Boston，MA)上合成CpG寡核苷酸(免疫刺激性寡核苷酸/免疫核酸)，合成量：1-2μmole。dA、dG、dC和T中的亚磷酰胺来自PE Biosystems(Foster City，CA)。Iyer R.P等报道：碘氧化剂可用来修饰硫代磷酸酯主链(J.Am.Chem.Soc.112：1253-1254(1990))。所有寡核苷酸按标准程序进行脱保护，经HPLC纯化，并经USP品质无菌冲洗水透析。将寡核苷酸低温冻干，在蒸馏水中重新溶解，并按照260nm处紫外线吸光率测定浓度。所有寡核苷酸的纯度和分子量分别用CGE和MALDI-TOF质谱分析仪(Applied Biosystem’s Voyager-DETM STRBiospectrometryTM Workstation)分析。用CGE和/或变性PAGE测得全长寡核苷酸的纯度为90-96％，其余的少一或两个核苷酸(n-1和n-2)。通过鲎实验(Bio-Whittaker，现为Cambrex Bio Science Walkersville，Inc.，Walkersville，MD)检测到所有寡核苷酸含有内毒素<0.1EU/mL。
热解链研究在含10mM磷酸氢二钠，pH7.2±0.2，150mM NaCl和2mMMgCl2的1mL溶液中进行。将所述溶液加热到95℃维持10分钟，缓慢恢复至室温，4℃贮藏过夜。寡核苷酸链的终浓度为2.0μM。在波长260nm用连接Peltier热量控制器和电脑的分光光度计(Perkin-Elmer Lambda 20)进行UV热解链测量，石英杯宽径为1cm，加热速率为0.5℃/分。解链温度(Tm)为半解离温度，可以从首次导数图(first derivative plot)中读出。每个Tm值取自两或三次独立实验的平均值，误差在±1.0℃以内。
实施例2：细胞培养条件和试剂
取自4-8周龄的BALB/c、C57BL/6或C3H/HeJ小鼠的脾细胞在RPMI完全培养基中培养，方法见Zhao，Q.，et al.(Biochem Pharmacol.51：173-182(1996))和Branda，R.F.，et al.(Biochem.Pharmacol.45：2037-2043(1993))。鼠J774巨噬细胞(American Type Culture Collection，Manassas，VA)在添加了10％(v/v)胎牛血清和抗生素(100IU/mL青霉素G/链霉素)的Dulbecco改良Eagles培养基中培养。所有其它培养试剂购自Mediatech(Gaithersburg，MD)。
实施例3：脾细胞增殖试验
通常，小鼠(Balb-C)脾细胞与为0.1、1.0和10.0μg/ml免疫核酸化合物共培养48小时，通过检测3H-尿嘧啶的掺入来确定细胞增殖，方法见Zhao，Q.，etal.(Biochem Pharmacol.51：173-182(1996))。
实施例4：细胞因子诱导试验
将小鼠脾细胞或J774细胞分别按5 x 106或1 x 106细胞/mL接种于24孔板。在细胞培养物中加入溶于TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA)的免疫核酸化合物，直到其终浓度为0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0μg/mL。细胞在37℃孵育24小时，收集上清用于ELISA检测。实验用每种免疫核酸化合物重复二或三次，每个浓度做平行三份。IL-12和IL-6的分泌用夹心ELISA测定，参见Bhagat L.，et al.(Biochem.Biophys.Res.Commun.300：853-861(2003))。所需试剂，包括细胞因子抗体和标准品，都购自BDBiosciences Pharmingen(San Diego，CA)。
实施例5：小鼠脾肿大试验
将雌性BALB/c小鼠(4-6周龄，19-21gm)分组，每组3只小鼠。将免疫核酸化合物溶于无菌磷酸缓冲盐水(PBS)，按5mg/kg剂量对小鼠进行皮下(SC)给药。48小时后处死小鼠，按照Zhao，Q.，et al.(Biochem Pharmacol.51：173-182(1996))和Branda，R.F.，et al.(Biochem.Pharmacol.45：2037-2043(1993))所述收集脾脏并称重。
实施例6：NF-κB信号通路的激活
Toll样受体9(TLR 9)已显示出能识别细菌、质粒和合成来源的DNA中的未甲基化CpG-二核苷酸(Hemmi H.，et al.Nature 408：740-745(2000))，并激活应激激酶(Yi A.K.，et al.J.Immunol.161：4493-4497(1998))和NF-κB信号通路(Stacey K.J.，et al.J.Immunol.157：2116-2122(1996))。经免疫核酸化合物处理的J774细胞中的NF-κB激活，按照Yu D.，et al.(Biochem.Biophys.Res.Commun.297：83-90(2002))和Bhagat L.，et al.(Biochem.Biophys.Res.Commun.300：853-861(2003))所述通过EMSA进行并分析。
实施例7：人类B细胞和浆细胞样树突状细胞(pDC)的分离
从新鲜采集的健康志愿者血液(来自CBR Laboratories，Boston，MA)获得的外周血单核细胞(PBMC)通过Ficoll密度梯度离心法(Histopaque-1077，Sigma)分离，用CD19细胞分离试剂盒(来自Miltenyi Biotec)按厂家建议通过阳性筛选从PBMC中分离出B细胞。表1显示C57BL/6A脾细胞试验中本发明免疫核酸化合物的免疫刺激活性。
表1：免疫核酸结构和C57BL/6A脾细胞试验(24小时)
Figure A200580027790D00251
Figure A200580027790D00252
正体表示硫代磷酸酯连接，斜体表示磷酸二酯连接。
G1＝2’-脱氧-7-去氮鸟苷
G2＝阿糖鸟苷
C1＝1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-去氮-8-甲基嘌呤
X＝丙三醇连接子
Y＝C3连接子
实施例8：人pDC培养和IFN-α及IFN-β ELISA
按操作说明运用BDCA-4细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)分离人PBMC中的pDC。pDC按1 x 106细胞/mL、200μL/孔接种于96孔板。在细胞培养物中加入免疫核酸化合物，终浓度分别为0.3、1.0、3.0或10.0μg/mL，37℃孵育24小时。接着收集上清，用ELISA试剂盒(PBL)检测IFN-α和IFN-β。表2A-2D显示10.0μg/mL本发明免疫核酸化合物的IFN-α和IFN-β的平均值±SD。
表2A：免疫核酸结构和人DC免疫刺激活性检测(24小时)
Figure A200580027790D00262
Figure A200580027790D00263
正体表示硫代磷酸酯连接
G1＝2’-脱氧-7-去氮鸟苷
G2＝阿糖鸟苷
X＝丙三醇连接子
表2B：免疫核酸结构和人DC免疫刺激活性检测(24小时)
Figure A200580027790D00271
正体表示硫代磷酸酯连接
G1＝2’-脱氧-7-去氮鸟苷
G2＝阿糖鸟苷
G3＝2’-脱氧肌苷
C1＝1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-去氮-8-甲基嘌呤
C2＝阿糖胞苷
C3＝2’-脱氧-5-羟基胞苷
表2C：免疫核酸结构和人DC免疫刺激活性分析(24小时)
Figure A200580027790D00283
Figure A200580027790D00284
Figure A200580027790D00291
正体表示硫代磷酸酯连接
G1＝2’-脱氧-7-去氮鸟苷
G2＝阿糖鸟苷
C1＝1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-去氮-8-甲基嘌呤
X＝丙三醇连接子
表2D：免疫核酸结构和人DC免疫刺激活性检测(24小时)
Figure A200580027790D00292
Figure A200580027790D00293
Figure A200580027790D00301
Figure A200580027790D00302
Figure A200580027790D00303
Figure A200580027790D00311
正体表示硫代磷酸酯连接；斜体表示磷酸二酯连接。
G1＝2’脱氧-7-去氮鸟苷
G2＝阿糖鸟苷
C1＝1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-去氮-8-甲基嘌呤
X＝丙三醇连接子
Y＝C3连接子
实施例9：细胞因子分析
脊椎动物细胞(优选BALB/c小鼠脾细胞或人PBMC)中IFN-α的分泌用夹心ELISA检测。所需试剂，包括细胞因子抗体和细胞因子标准品，购自PharMingen，San Diego，CA。ELISA板(Costar)中加入5μg/mL合适抗体的PBSN缓冲液(PBS/0.05％叠氮化钠，pH9.6)溶液，4℃孵育过夜，37℃用PBS/1％ BSA封闭30分钟。细胞培养上清和细胞因子标准品经PBS/10％ FBS适当稀释，一式三份加入平板，25℃孵育2小时。用1μg/mL生物素化适宜抗体覆盖平板，25℃孵育1.5小时。然后用大量的PBS-T缓冲液(PBS/0.05％ Tween 20)洗板，加入链亲和素偶联的过氧化酶(Sigma，St.Louis，MO)，25℃孵育1.5小时。用Sure BlueTM(Kirkegaard and Perry)显色剂对平板进行显色，加入Stop Solution(Kirkegaard and Perry)终止反应。用Ceres 900HDI分光光度计(Bio-Tek Instruments)检测颜色变化。
人外周血单核细胞(PBMC)用Ficoll-Paque密度梯度离心(Histopaque-1077，Sigma，St.Louis.，MO)从健康志愿者外周血分离。简单说，将添加了肝素的血液在室温圆锥体离心机中以400xg离心30分钟，使之在Histopaque-1077(等体积)上分层。小心移出含有单核细胞的血沉棕黄色层，用等渗的PBS冲洗两次，以250xg离心10分钟。将形成的细胞团悬于含有L-谷氨酰胺、并加入10％热灭活FCS和青霉素-链霉素(100U/ml)的RPMI 1640培养基(MediaTech，Inc.，Herndon，VA)中。在24孔板中，以1 X 106细胞/ml/孔将细胞培养不同的时间，孔中存在或不存在寡核苷酸。孵育结束时收集上清，-70℃冻存，直到以夹心ELISA检测各种细胞因子包括IFN-α(BioSourceInternational)。结果见下表3A-3D。
在所有实例中，细胞培养上清中的IFN-α水平是通过相同实验条件下构建的标准曲线计算得到的。
表3A：免疫核酸结构和人PBMC免疫刺激活性分析(24小时)
Figure A200580027790D00321
Figure A200580027790D00322
正体表示硫代磷酸酯连接
G1＝2’-脱氧-7-去氮鸟苷
G2＝阿糖鸟苷
X＝丙三醇连接子
表3B：免疫核酸结构和人PBMC免疫刺激活性分析(24小时)
Figure A200580027790D00331
正体表示硫代磷酸酯连接
G1＝2’-脱氧-7-去氮鸟苷
G2＝阿糖鸟苷
G3＝2’-脱氧肌苷
C1＝1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-去氮-8-甲基嘌呤
C2＝阿糖胞苷
C3＝2’-脱氧-5-羟基胞苷
表3C：免疫核酸结构和人PBMC免疫刺激活性检测(24小时)
Figure A200580027790D00333
Figure A200580027790D00341
Figure A200580027790D00342
Figure A200580027790D00343
正体表示硫代磷酸酯连接
G1＝2’-脱氧-7-去氮鸟苷
G2＝阿糖鸟苷
C1＝1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-去氮-8-甲基嘌呤
X＝丙三醇连接子
表3D：免疫核酸结构和人PBMC免疫刺激活性分析(24小时)
Figure A200580027790D00351
 
SEQ IDNO 序列及修饰(5’-3’) IFN-α(pg/ml) IL-10(pg/ml) IL-10(pg/ml)
10μg/mlDN4 10μg/mlDN5 10μg/mlDN6
19 5’-TCG1AACG2TTCG1-X-G1CTTG2CAAG1CT-5’ 1446±7
20 5’-TCG1AAC1GTTCG1-X-G1CTTGC1AAG1CT-5’ 942±1
21 5’-TCG1AACG1TTCG1-Y-TCTTG1CTGTCT-5’ 126±2 159±13
22 5’-TCG1AACG1TTCG1-Y-TCTTG2CTGTCT-5’ 239±23 356±109
23 5’-TCG1AACG1TTCG1-Y-TCTTGC1TGTCT-5’ 147±23 185±46
24 5’-TCG1AACG1TTCG1-Y-TCTTCCACTCT-5’ 107±15 148±37
25 5’-TG1CAAG1CTTG1C-Y-TCTTG1CTGTCT-5’
26 5’-TG1CAAG1CTTG1C-Y-TCTTCCACTCT-5’
27 5’-TG1CAAG1CTTG1C-X-CG1TTCG1AACG1T-5’
28 5’-CTGTCG2TTCTC-X-CTCTTG2CTGTC-5’
29 5’-CTGTCG2TTCTC-X-CTCTTG2CTGTC-5’
30 5’-TCG1TGTCG1TTT-X-TTTG1CTGTG1CT-5’
31 5’-TG1CTGTG1CTTT-X-TTTCG1TGTCG1T-5’
32 5’-TCG1AACG1TTCG1-Y-GACAG1CTGTCT-5’
33 5’-TG1CAACG1CTTG1C-Y-GACACG1TGTCT-5’
培养基 0±0 68±5 67±0
Figure A200580027790D00361
正体表示硫代磷酸酯连接；斜体表示磷酸二酯连接。
G1＝2’-脱氧-7-去氮鸟苷
G2＝阿糖鸟苷
C1＝1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-去氮-8-甲基嘌呤
X＝丙三醇连接子
Y＝C3连接子
实施例10：流式细胞计数检测
细胞表面标志CD69和CD86可用抗人CD69-Fitc和抗人CD86-Fitc(购自BD Pharmingen，San Diego，USA)通过Coulter Epics-XL流式细胞仪检测。以下为染色法的简介：用染色缓冲液(PBS，1％ BSA和0.1％ NaN3)中10％人AB血清(Sigma)对活化的培养细胞4℃封闭1小时，用上述抗体4℃染色过夜。PBMC(4 x 105)被CD69-Fitc和CD86-Fitc染色。PDC(2 x 105)被CD86-Fitc染色。获取细胞染色数据后用Coulter System II软件进行分析(见下表4A-4F)。
表4A：免疫核酸结构和人PBMC的BC表达(2 X 106细胞/ml)(24小时)
Figure A200580027790D00372
Figure A200580027790D00373
Figure A200580027790D00381
Figure A200580027790D00382
正体表示硫代磷酸酯连接
G1＝2’-脱氧-7-去氮鸟苷
G2＝阿糖鸟苷
X＝丙三醇连接子
表4B：免疫核酸结构和人PBMC的BC表达(2 X 106细胞/ml)(24小时)
Figure A200580027790D00383
Figure A200580027790D00384
Figure A200580027790D00391
Figure A200580027790D00392
Figure A200580027790D00393
正体表示硫代磷酸酯连接
G1＝2’-脱氧-7-去氮鸟苷
G2＝阿糖鸟苷
G3＝2’-脱氧肌苷
C1＝1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-去氮-8-甲基嘌呤
C2＝阿糖胞苷
C3＝2’-脱氧-5-羟基胞苷
表4C：免疫核酸结构和人PBMC的BC表达(2 X 106细胞/ml)(24小时)
Figure A200580027790D00394
Figure A200580027790D00401
Figure A200580027790D00403
Figure A200580027790D00404
Figure A200580027790D00411
Figure A200580027790D00412
Figure A200580027790D00413
正体表示硫代磷酸酯连接
G1＝2’-脱氧-7-去氮鸟苷
G2＝阿糖鸟苷
C1＝1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-去氮-8-甲基嘌呤
X＝丙三醇连接子
表4D：免疫核酸结构和人PBMC的BC表达(2 X 106细胞/ml)(24小时)
Figure A200580027790D00414
Figure A200580027790D00421
Figure A200580027790D00422
Figure A200580027790D00423
正体表示硫代磷酸酯连接
G1＝2’-脱氧-7-去氮鸟苷
G2＝阿糖鸟苷
C1＝1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-去氮-8-甲基嘌呤
X＝丙三醇连接子
表4E：免疫核酸结构和人PBMC的BC表达(24小时)
Figure A200580027790D00431
Figure A200580027790D00443
Figure A200580027790D00451
Figure A200580027790D00453
Figure A200580027790D00461
Figure A200580027790D00462
正体表示硫代磷酸酯连接，斜体表示磷酸二酯连接。
G1＝2’-脱氧-7-去氮鸟苷
G2＝阿糖鸟苷
C1＝1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-去氮-8-甲基嘌呤
X＝丙三醇连接子
Y＝C3连接子
表4F：免疫核酸结构和人PBMC的DC表达分析(24小时)
Figure A200580027790D00471
Figure A200580027790D00472
Figure A200580027790D00481
Figure A200580027790D00482
正体表示硫代磷酸酯连接，斜体表示磷酸二酯连接。
G1＝2’-脱氧-7-去氮鸟苷
G2＝阿糖鸟苷
C1＝1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-去氮-8-甲基嘌呤
X＝丙三醇连接子
Y＝C3连接子
实施例11：B细胞增殖试验
用本发明免疫核酸化合物(0.3、1.0、3.0、或10.0μg/mL)对1 X 105B细胞/200μl刺激16小时，之后用[3H]-胸苷(0.75μCi)脉冲，8小时后收集。掺入的放射活性用液体闪烁计数器测量。表5表示1.0μg/mL时的B细胞增殖的平均值±SD。
表5：免疫核酸结构和人B细胞增殖试验中的免疫活性(24小时)
Figure A200580027790D00491
Figure A200580027790D00501
正体表示硫代磷酸酯连接，斜体表示磷酸二酯连接。.
G1＝2’-脱氧-7-去氮鸟苷
G2＝阿糖鸟苷
C1＝1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-去氮-8-甲基嘌呤
X＝丙三醇连接子
Y＝C3连接子
等同发明
为了能够被清楚理解，前述已经详细描述了本发明，可以预计本领域技术人员阅读本发明公开内容后，在不脱离本发明及附加权利要求的真实范围下可以作出各种形式和细节的改变。

Claims (20)

1.免疫刺激性寡核苷酸，其含有至少一个选自CpG，C*pG，C*pG*和CpG*的二核苷酸，寡核苷酸的序列至少部分自补。
2.根据权利要求1的免疫刺激性寡核苷酸，其中寡核苷酸的长度为大约2到大约50个核苷酸。
3.根据权利要求1的免疫刺激性寡核苷酸，其中寡核苷酸的序列至少有40％自补。
4.治疗脊椎动物疾病的方法，其患有肿瘤、自身免疫性疾病、气道炎症、炎症、皮肤病、过敏症、哮喘或由病原体引起的疾病，该方法包括给予脊椎动物如权利要求1所述的免疫刺激性寡核苷酸。
5.根据权利要求4的方法，其中给药途径选自经胃肠外，经口，经舌下，经皮肤，经局部，经鼻内，经气雾，经眼内，经气管内，经直肠内，经阴道，经基因枪，经皮肤贴片，滴眼和漱口。
6.一种药剂，其包含权利要求1所述的寡核苷酸和生理上可接受的载体。
7.在脊椎动物中产生免疫应答的方法，其包括给予脊椎动物根据权利要求1所述的免疫刺激性寡核苷酸。
8.根据权利要求7的方法，其中给药途径选自经胃肠外，经口，经舌下，经皮肤，经局部，经鼻内，经气雾，经眼内，经气管内，经直肠内，经阴道，经基因枪，经皮肤贴片，滴眼和漱口。
9.用于预防脊椎动物肿瘤、自身免疫性疾病、气道炎症、炎症、皮肤病、过敏症、哮喘或由病原体引起的疾病的方法，其包括给予脊椎动物根据权利要求1所述的免疫刺激性寡核苷酸。
10.根据权利要求9的方法，其中给药途径选自经胃肠外，经口，经舌下，经皮肤，经局部，经鼻内，经气雾，经眼内，经气管内，经直肠内，经阴道，经基因枪，经皮肤贴片，滴眼和漱口。
11.含有至少两个以非核苷酸连接形成的寡核苷酸的免疫核酸，其中至少一个寡核苷酸含有选自CpG，C*pG，C*pG*和CpG*的至少一个二核苷酸，并且其中寡核苷酸的序列至少部分自补。
12.根据权利要求11的免疫核酸，其中寡核苷酸的长度为大约2到大约50个核苷酸。
13.根据权利要求11的免疫核酸，其中寡核苷酸的序列至少40％自补。
14.治疗脊椎动物疾病的方法，其患有肿瘤、自身免疫性疾病、气道炎症、炎症、皮肤病、过敏症、哮喘或由病原体引起的疾病，该方法包括给予脊椎动物如权利要求11所述的免疫核酸。
15.根据权利要求14的方法，其中给药途径选自经胃肠外，经口，经舌下，经皮肤，经局部，经鼻内，经气雾，经眼内，经气管内，经直肠内，经阴道，经基因枪，经皮肤贴片，滴眼和漱口。
16.一种药剂，其包含权利要求11所述的免疫核酸和生理上可接受的载体。
17.在脊椎动物中产生免疫应答的方法，其包括给予脊椎动物根据权利要求11所述的免疫核酸。
18.根据权利要求17的方法，其中给药途径选自经胃肠外，经口，经舌下，经皮肤，经局部，经鼻内，经气雾，经眼内，经气管内，经直肠内，经阴道，经基因枪，经皮肤贴片，滴眼，滴耳和漱口。
19.用于预防脊椎动物癌症、自身免疫性疾病、气道炎症、炎性疾病、皮肤病、过敏症、哮喘或由病原体引起的疾病的方法，其包括给予脊椎动物根据权利要求11所述的免疫核酸。
20.根据权利要求19的方法，其中给药途径选自经胃肠外，经口，经舌下，经皮肤，经局部，经鼻内，经气雾，经眼内，经气管内，经直肠内，经阴道，经基因枪，经皮肤贴片，滴眼，滴耳和漱口。
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