CN108350431A - 用于确定候选药物的功效特征的方法 - Google Patents

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V·科斯塔
M·赫纳
C·帕奇
E·C·托马
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F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

本申请涉及使用来自至少两种灵长类物种的均一分布的分化的神经细胞(NC)的标准化细胞培养物，确定候选药物体外功效特征的方法，其中基于对分化的NC进行的解离和再接种步骤，分化的NC培养物胜任高通量筛选。该方法包括将人和/或非人灵长类神经元前体细胞(NPC)分化成神经元细胞(NC)，随后将分化的NC从其支持物解离并以高通量细胞培养模式再接种分化的NC，产生适于高通量药物筛选测定法、尤其适于筛选反义寡核苷酸的稳健培养物。

Description

用于确定候选药物的功效特征的方法
发明领域
本专利申请涉及一种使用来自至少两种灵长类物种的均一分布的分化的神经细胞(NC)的标准化细胞培养物，确定候选药物体外功效特征的方法，其中基于对分化的NC进行的解离和再接种步骤，分化的NC培养物胜任高通量筛选。该方法包括将人和/或非人灵长类神经元前体细胞(NPC)分化成神经元细胞(NC)，随后将分化的NC从其支持物解离并以高通量细胞培养模式再接种分化的NC，产生适于高通量药物筛选测定法、尤其适于筛选反义寡核苷酸的稳健培养物。
发明背景
在开发早期，广泛使用基于展示多种疾病(包括中枢神经系统(CNS)疾病)的病理生理学的多样细胞类型或细胞培养模型的高通量筛选测定法评估候选药物的功效特征和毒性特征。过去十年间已经通过建立从体细胞产生多潜能细胞的方案克服了有限类型细胞的局限或衍生自胚胎干细胞的细胞的局限。因为Yamanaka和同事们(Takahashi,K.和Yamanaka,S.Cell.2006；126:663–676)显示可以将体细胞再编程为诱导的多潜能干细胞(IPSC)，故而从多种细胞来源产生多潜能细胞变得可能。已经将不同类型的体细胞(包括成纤维细胞、角质形成细胞、脂肪细胞和血细胞)再编程为IPSC多潜能状态。最近，特定体细胞类型可以转分化成完全不同的体细胞类型如神经元。Vierbuchen和同事们展示了通过转导三个关键基因：Mash1、Brn2和Myt1l，使小鼠成纤维细胞直接转化成功能性神经元(Vierbuchen等人,Nature.2010；463:1035-41)。值得注意地，US2010/0021437公开一种从成纤维细胞产生诱导的多潜能干细胞并诱导这些细胞分化成NPC的方法。最近已经描述将分化的体细胞直接转化成NPC(WO2012/022725)。认为这类神经元细胞是用于各种CNS疾病的病理生理学建模的有用工具。
NPC是多潜能干细胞并在特定条件下扩增。它们可以生长为单层贴壁培养物或在非贴壁细胞培养平板中生长为悬浮的神经球。两个类型的NPC培养物(神经球、贴壁培养物)似乎完全相互可转化。NPC可以无限培育并仍真实保持多潜能。一旦具备特定条件，它们分化为构成成体脑的神经元细胞类型，包括分化的NC。分化的NC培养物是筛选有效和安全药物的有用疾病模型。实际上，NC培养物对药物开发环境下评估候选药物的毒性和功效重要。
在人类患者中首次施用之前，需要在体外细胞培养系统中全面评估候选药物，随后在啮齿类和非人灵长类(NHP)物种中体内测试。如今，针对不同物种使用不同方案，以不同测定模式进行新候选药物的毒性和功效评估。尽管体外测试候选药物允许减少为药物测试所处死的实验室动物的数目，但它还带来结果从体外至体内和至人生理的可转化性的难题。实际上，候选药物功效特征和毒性特征从啮齿类物种到人的可转化性可以有挑战性，原因在于物种之间遗传关系不密切。值得注意地，小鼠和人类基因组的蛋白质编码区约85％同一。遗传组成的差异可以解释对药物的不同生理反应并且还解释对毒素或诱变剂的不同耐受性。迄今，对于靶向特定DNA或RNA序列的新药物类别，例如反义寡核苷酸或者基因或基因产物的基因变体，物种之间的可转化性甚至变得更重要。因此，就密切的遗传相关性(>90％)而言，NHP物种代表了产生功效和毒性数据以预测人类中反应和不良事件率的最有意义的模型系统。在不受理论约束的情况下，假定在全部药物类别的人体首次试验之前，NHP物种(例如食蟹猴)中的体内试验是优选的，不过尤其对靶向确定的人类遗传组成的药物类别是这样。在另一方面，药物研发中使用NHP物种仍是争议话题。NHP物种遗传上接近于人类的确切事实提出了伦理学问题。因此，应当尽可能降低NHP实验室动物(例如食蟹猴)的数目。
筛选新候选药物功效和毒性的全面计划因此应当包括在NHP物种上的体外和体内试验和使用IPSC衍生的人细胞的平行体外试验。测试顺序应当包括在NHP物种和人细胞上的平行体外试验，其先于NHP物种(例如食蟹猴中)的体内试验。功效和/或毒性特征低劣的候选药物应当已经在NHP物种中启动体内试验之前，在NHP和/或人细胞上体外评估时在早期阶段落选。实际上，这个顺序确保NHP实验室动物的数目可以尽可能低。
但是，存在从干细胞衍生的分化的NC体外获得这类灵长类物种间可转移性功效和毒性数据的强大障碍：首先，物种特异的细胞培养方案并且灵长类物种之间细胞培养条件的不可转移性，并且其次，正在分化的NPC非均匀性分布导致存活条件非最佳或分化作用受阻，原因在于细胞和自分泌及旁分泌信号传导局部浓集，这导致药物效应的表型评估难题。当培养物不得不长时间分化以获得所需的细胞分化状态时，这变得最明显。最值得注意地，分化的灵长类NC是对细胞培养条件天生敏感并且不耐受用这些细胞产生标准化测定法时作为内在障碍的苛刻处理。
因此，仍需要从不同灵长类物种(包括人)产生均匀NC测定法用于高通量筛选候选药物的容易获得和可重复的技术。
发明概述
本文中提供一种使用来自至少两种灵长类物种的均一分布的分化的神经细胞(NC)的标准化细胞培养物，确定候选药物体外功效特征的方法，其中分化的NC培养物胜任高通量筛选，所述方法包括步骤：
a)在约20天至约45天分化后将分化的NC从其支持物解离并以高通量细胞培养模式再接种分化的NC；
b)在分化培养基中温育再接种的NC；
c)使再接种的NC与候选药物接触；和
d)确定候选药物的体外功效特征。
在一个实施方案中，灵长类物种选自人(Homo sapiens)、食蟹猴(Macacafascicularis)和恒河猴(Macaca mulatta)。
在一个实施方案中，灵长类物种之一是人(Homo sapiens)。
在一个实施方案中，灵长类物种之一是食蟹猴。
在一个实施方案中，分化的NC衍生自诱导的多潜能干细胞(iPSC)。
在一个实施方案中，如通过细胞核染色所评估，分化的NC遍及细胞培养区域均匀分布。
在一个实施方案中，通过DNA染色，尤其通过Hoechst染色评估分化的NC的分布。
在一个实施方案中，步骤d)额外地包括监测细胞培养物的毒性迹象。
在一个实施方案中，步骤d)包括监测细胞培养物的表型改变，所述细胞培养物的表型改变指示候选药物的功效。
在一个实施方案中，确定的候选药物体外功效特征用于候选药物功效特征的物种间比较，其中从至少两种灵长类物种的细胞单独产生细胞培养物，其中基本上相同的条件应用于全部灵长类物种的培养物并且其中针对全部灵长类物种确定和比较功效特征。
在一个实施方案中，提供用于选择候选药物用于进一步开发的方法，所述方法包括步骤：
(i)根据如本文所述的方法，确定候选药物对第一和第二物种的体外功效特征；并且
(ii)如果候选药物的功效特征有利，则选择候选药物用于进一步开发。
在一个实施方案中，第一和第二物种之间的遗传相似性高，尤其超过90％。
在一个实施方案中，第一物种是食蟹猴(Macaca fascicularis)并且第二物种是人(Homo sapiens)。
在一个实施方案中，候选药物包含核酸分子或靶向特定核酸序列。
在一个实施方案中，候选药物包含至少一种核酸分子如RNAi剂或反义寡核苷酸。
在一个实施方案中，进一步开发包括确定候选药物的体内功效和/或毒性特征。
在一个实施方案中，提供一种用于确定候选药物潜在体内功效的方法，其中如本文所述确定候选药物的体外功效特征并且其中体外功效特征指示体内功效。
在一个实施方案中，候选药物的体外功效特征指示在人(Homo sapiens)中的体内功效。
在一个实施方案中，候选药物的体外功效特征指示在食蟹猴中的体内功效。
在一个实施方案中，在至少一个物种中确定体内功效特征。
在一个实施方案中，在食蟹猴中确定体内功效特征。
在一个实施方案中，确定的候选药物体外功效特征和/或体内功效特征指示在人(Homo sapiens)中的体内功效。
在一个实施方案中，食蟹猴中评估确定的候选药物体外功效特征和体内功效特征指示在人(Homo sapiens)中的体内功效。
在一个实施方案中，分化培养基是补充有20ng/ml BDNF、10ng/ml GDNF、0.5mMcAMP和100μM抗坏血酸磷酸酯的基础培养基。
在一个实施方案中，依次产生不同物种的细胞培养物。
在一个实施方案中，提供基本上如本文所述的方法和用途。
附图简述
图1：上部链显示SNORD109B下游的SNHG14转录物的区域(UBE3A-ATS)，其中黑框表示受检小鼠寡核苷酸的位置。下部链显示UBE3A编码区，其中黑框表示外显子。外显子1位于160kb附近。这些寡核苷酸位于外显子9(位于约97kb处)、外显子10(位于约92kb处)、外显子13(位于约77kb处)的反义区和外显子16的5'末端(位于约60kb处)。
图2：实施例2中所测试的寡核苷酸在人神经元细胞培养物中诱导UBE3A再表达的能力展示。与人SNHG14非编码性长RNA在SNORD109B和UBE3A编码区上游区域之间的区域(SEQ ID NO:1的位置1至55318)互补的寡核苷酸以·非重叠指示。与人SNHG14非编码性长RNA的反义于UBE3A前mRNA的区域(SEQ ID NO:1的位置55319至141053)互补的寡核苷酸以▲重叠指示。来自表3相对于人和恒河猴保守的寡核苷酸在每条曲线底部显示为通过指示人:恒河猴:小鼠之间的保守。如右手侧每个小块中所示，寡核苷酸浓度是0.2、1和5μM。
图3：在灵长类体外细胞培养模型上评估候选药物的功效随后在灵长类物种上进行体内研究，之后在人体上评估药物功效的筛选策略示意图。使用食蟹猴衍生和人IPSC衍生的神经元作为体外模型评估靶接合作用和靶向UBE3A反义的寡核苷酸的功效。具备有利功效特征的候选物在体内研究之前按优先序排列。
图4：为了从食蟹猴IPSC衍生神经祖细胞所实施的不同步骤的概览。双重SMAD抑制方案的改良形式用于中和灵长类IPSC系。MT指MT培养基；N2B27+SB+LDN指补充有SB-431542和LDN-193189的N2B27培养基；N2B27+FEB指补充有FGF、EGF和BDNF的N2B27培养基。
图5：食蟹猴神经前体细胞和人神经前体细胞显示相似的Sox2和巢蛋白(Nestin)染色阳性及Map2的相应的分化的神经元染色阳性。
图6：应用的定向分化方法诱导可比较的跨物种神经元分化。图5A)食蟹猴IPSC在补充有BDNF、GDNF、cAMP和抗坏血酸磷酸酯(BGAA)的基础培养基中分化14天。从食蟹猴IPSC和第14天NC分离RNA并通过qPCR分析所示标志物的表达。数据对持家基因GAPDH归一化并且相对于食蟹猴IPSC中的表达水平展示。图5B)从补充有BGAA的基础培养基中分化14天的人PSC和人NC分离RNA并通过RNA测序法分析所示标志物的表达。数据表示为RPKM值。图5C)从补充有BGAA的基础培养基中分化14天的人PSC和人NC分离RNA并通过qPCR分析所示标志物的表达。数据对持家基因GAPDH归一化并且相对于人PSC中的表达水平展示。图5D)从补充有BGAA的基础培养基中分化14天的食蟹猴NC(左小图)和人NC(右小图)分离RNA并且已经通过qPCR分析UBE3A和UBE3A-ATS转录物的表达。左小图：数据对持家基因TBP归一化并且相对于食蟹猴IPSC展示。右小图：数据对持家基因GAPDH归一化并且相对于人PSC表示。
图7：比较4种从食蟹猴神经前体细胞衍生稳健神经元培养物的分化方法(A-D)的实验布局示意性图，其适用于筛选化合物。MI指有丝分裂抑制剂。
图8：基于图像比较如图7中所述的4种神经元分化方法。将NC在分化第35天固定并针对品红所示的Sox2(神经胶质和NSC的标志物)和绿色所示的Map2(NC的标志物)染色。
图9：为了检验解离和再接种人iPSC衍生的分化的NC的可行性，二个细胞系平行地分化。对于每个细胞系，将细胞直接(即，不作再铺板)分化6周或在第21天解离并再接种并且随后进一步培养3周。神经元标志物(MAP2)和神经胶质标志物(GFAP)的免疫荧光染色显示解离和再接种(再铺板)不阻碍细胞分化的能力。
图10：对iPSC衍生的二种不同细胞系中进行和不进行解离和再接种(再铺板)的情况下分化过程延长的定量。HuC/D是神经元表达的标志物并且在分化总计6周的培养物中通过免疫荧光染色法检出及通过高容量成像定量。数据显示再铺板并未显著地改变神经元分化的程度。
图11：分析微管相关蛋白质Τau及其两种磷酸化形式的表达。二种细胞系中进行和不进行再铺板情况下恒定的表达和磷酸化程度证明，再铺板(解离和再接种)不破坏人iPSC衍生的NC的细胞骨架特征，从而显示生理特征将不受解离和再接种NC改变。
图12：实现恒定供应稳健灵长类神经元培养物供高通量模式筛选的工作流程示意图。SFA指补充有Shh、FGF8和抗坏血酸磷酸酯的基础培养基；BGAA指补充有BDNF、GDNF、cAMP和抗坏血酸磷酸酯的基础培养基；箭头表示解离和再接种(再铺板)。
图13：受检化合物在来自人和食蟹猴的均匀分布的神经细胞(NC)的标准化细胞培养物上的靶接合作用。测试了两种浓度(低：0.02μM；高：2μM)的在人类中具有已知靶接合作用的针对UBE3A-反义转录物(反义)的反义寡核苷酸。如与C和D中衍生自人的NC培养物相比，在A和B中衍生自食蟹猴的NC培养物显示可比较的靶接合作用。按所示浓度处理食蟹猴NC和人NC导致UBE3A-反义转录物减少，伴随UBE3A转录物(有义)上调。根据如图12中包含的工作流程产生细胞培养物。
发明详述
如本文所用的术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸、尤其与靶核酸上的连续序列杂交调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的并因此不是siRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸是单链的。
如本文所用，术语“基础培养基”指由以下组成的确定成分培养基：等体积的DMEM:F12Glutamax培养基和Neurobasal培养基(Gibco,Invitrogen)，补充有1x B27(Gibco,Invitrogen)、1x N2(Gibco,Invitrogen)、0.1mMβ-巯基乙醇(Gibco,Invitrogen)。术语“BGAA”指补充有20ng/ml BDNF(Peprotech)、10ng/ml GDNF(Peprotech)、0.5mM cAMP(BIOLOG Life Science)和100μM抗坏血酸磷酸酯(Sigma)的基础培养基。术语“SFA”指补充有200ng/ml Shh、100ng/ml FGF8和100μM抗坏血酸磷酸酯的基础培养基。
如本文所用的术语“连续核苷酸序列”指与靶核酸互补的寡核苷酸区域。本文中该术语与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”可互换使用。在一些实施方案中，寡核苷酸的全部核苷酸均存在于连续核苷酸序列中。在一些实施方案中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列并且可以任选地包含其他核苷酸，例如可以用来将官能团接合至连续核苷酸序列的核苷酸接头区。核苷酸接头区可以互补于或可以不互补于所述靶核酸。
如本文所用，术语“确定成分培养基”或“化学成分确知培养基”指其中已知全部各个组分及其相应浓度的细胞培养基。确定成分培养基可以含有重组组分和化学定义的组分。
如本文所用，术语“分化”和“分化过程”指将分化程度较低的细胞转化成分化程度较高的细胞、尤其有丝分裂后组织特异性细胞类型(例如，将NPC转化成NC)的一个或多个步骤。尤其通过添加一种或几种分化剂至细胞培养基，可以诱导NPC分化成NC。
如本文所用，术语“功效特征”或“功效”如技术人员通常理解那样定义成包括对候选药物的功效评估，所述评估基于测试系统(例如，细胞培养物或生物体)暴露于候选药物、尤其暴露于不同浓度的候选药物和/或暴露于不同施用途径，随后确定与候选药物的所需作用相关的所产生的细胞作用和/或生理作用。在相应候选药物的背景下定义参数来确定细胞作用和/或生理作用，包括与候选药物对测试系统或生物的所需表型影响相关的参数。优选地，记录多于一种参数，包括但不限于存活、细胞活力、形态、特定基因的表达和/或表达水平及蛋白质合成，以建立候选药物的功效特征。在本发明的一个方面，建立功效特征包括评估靶接合作用。
“表达标志物”或“标志物”可以用来确定细胞类型的身份。细胞特异性基因的某个提供信息的DNA序列转录成mRNA并且通常随后翻译成在细胞中发挥某种功能的蛋白质(其基因产物)。可以通过本领域已知的方法在RNA水平或在蛋白质水平检测并定量标志物的表达。IPSC细胞标志物是本领域已知的并且包括但不限于TRA-1-60、TRA-1-81、Ecat1、Nanog、Oct4/POU5F1、Sox2、Rex1/Zfp-42和UTF1或其任意组合。NPC细胞标志物是本领域已知的并且包括但不限于Sox2、巢蛋白、Sox1、Pax6、Dach1。NC细胞标志物是本领域已知的并且包括但不限于MAP2、β-III-微管蛋白、DCX/双皮层蛋白、SYN 1/突触蛋白1和GPHN/桥连蛋白(Gephyrin)。
如本文所用，术语“遗传距离”应当理解为二个物种、二个基因组或二个群体之间遗传趋异性的度量。可以通过本领域已知的方法测定例如不同物种之间的遗传距离，所述方法包括但不限于测定Nei标准距离、Goldstein距离或Rynolds/Weir/Cockerham遗传距离。可以使用本领域已知的软件(包括但不限于POPTREE2或DISPAN)计算遗传距离。当遗传距离低时，“遗传相似性”高。
如本文所用，使用以下缩略语：成纤维细胞生长因子(FGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、音猬因子(shh)、成纤维细胞生长因子8(FGF8)、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、环状腺苷单磷酸(cAMP)、形成Rho-相关卷曲螺旋的蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶(ROCK)。
如本文所用，术语“生长因子”意指引起细胞增殖的生物活性多肽或小分子化合物，并且包括生长因子及其类似物。
如本文所用的“高通量筛选”应当理解成表示，可以用本文所述的新测定法分析并比较数目相对巨大的不同疾病模型条件和/或化学化合物。一般，这类高通量筛选在多孔微量滴定板中(例如，在96孔平板或384孔平板或具有1536孔或3456孔的平板中)进行。
“LNA核苷”是在核苷酸的核糖糖环C2’和C4’之间包含接头基团(称作双基或桥)的修饰的核苷。在文献中这些核苷也称作桥接核酸或双环核酸(BNA)。
如本文所用，术语“均匀分布”、“均匀分布状态”或“均一分布”如技术人员通常理解那样，指实体在1维、2维或多维空间中的分布、尤其指细胞在细胞培养支持物的2维表面上的分布。如果每个区域的平均细胞计数实质上恒定遍及整个细胞培养表面，则在2维细胞培养表面上建立均匀分布。可以例如通过胞核着染并使用荧光显微术确定每个区域的细胞核数目，评估细胞的分布。细胞未均一分布的指标例如包括细胞丛生、明显数目的细胞核重叠或细胞培养区域中缺少细胞的部分明显。如本文所用，细胞均匀分布的一个或多个细胞类型的细胞培养物称作“标准化”。“标准化细胞培养物”或“标准化NC培养物”指根据本发明产生的细胞培养物，其中细胞的分布实质上均匀，即，细胞均匀分布并且细胞培养物以细胞均匀分布为特征，其中细胞培养物可以包括一个或多个细胞类型。因此，如果细胞显示均一分布，如通过例如胞核着染并确定每个区域的细胞核数目所评估，则认定细胞培养物为标准化。
如本文所用的术语“修饰的核苷间键”如技术人员通常理解定义为除了将二个核苷共价连接在一起的磷酸二酯(PO)键之外的键。具有修饰的核苷间键的核苷酸也称作“修饰的核苷酸”。与磷酸二酯键相比，修饰的核苷间键增加寡核苷酸的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间键包括在相邻核苷之间产生磷酸二酯键的磷酸酯基团。修饰的核苷间键特别可用于稳定体内使用的寡核苷酸，并且可以在本发明寡核苷酸中的DNA核苷或RNA核苷区域(例如在缺口聚物寡核苷酸的缺口区域内部)以及在修饰的核苷区域起到防范核酸酶剪切的作用。
如本文所用，术语“MT培养基”指一种确定成分的培养基，其含有Dulbecco改良Eagle培养基连同Ham’s F12养分混合物(DMEM/F12)及2.5mM GlutaMAXTM、7μg/ml胰岛素、450μM一硫代甘油、1x脂质浓缩物、5mg/ml BSA、14ng/ml亚硒酸钠、1x非必需氨基酸、2mg/ml肝素、15μg/ml转铁蛋白和220μM抗坏血酸-2-磷酸酯。
如本文所用，“神经元前体细胞”或“NPC”指多潜能细胞亚群，其衍生自IPSC并且表达一些神经祖细胞标志物，例如包括巢蛋白。NPC可以尤其根据如通过引用方式完整并入本文的Costa等人,Cell Rep 2016；15:86-95和Dunkley等人,Proteomics Clin Appl 2015；7-8:684-94中所述的方法或根据如本文所述的方法产生。NPC可以无限扩充并可以分化成神经元或神经胶质细胞(例如，星形细胞和少突胶质细胞)。术语“患者特异性NPC”指从患者IPSC获得的NPC，其中所述患者IPSC已经从患者体细胞经再编程。如本文所用，“从健康个体获得的NPC”指分化自IPSC的NPC，所述IPSC从表观健康并且不疑似患有任何病症或疾病的个体的体细胞获得。
如本文所用，“神经元细胞”或“NC”指来自神经元谱系的组织特异性细胞。可以使用特定细胞培养条件，如本文所述，例如，通过撤除生长因子或通过添加一种或多种分化剂，从NPC体外分化NC。
如本文所用，术语“非人灵长类”或“NHP”指属于灵长目的物种，Homo sapiens例外。特别地，根据本发明中公开的方法的NHP物种包括但不限于黑猩猩(Pan troglodytes)、倭黑猩猩(Pan paniscus)、白掌长臂猿(Hylobates lar)、大猩猩(Gorilla gorilla)、苏门答腊猩猩(Pongo abelii)、婆罗洲猩猩(Pongo pygmaeus)、青长尾猴(Cercopithecusmitis)、白臀长尾猴(Cercopithicus neglectus)、黑脸绿猴(Chlorocebus aethiops)、绿猴(Chlorocebus sabaeus)、东非黑白疣猴(Colobus guereza)、黑冠白睑猴(Lophocebusaterrimus)、短尾猴(Macaca arctoides)、熊猴(Macaca assamensis)、食蟹猴、日本猴(Macaca fuscata)、恒河猴、豚尾猴(Macaca nemestrina)、狮尾猴(Macaca silenus)、鬼狒(Mandrillus leucophaeus)、山魈(Mandrillus sphinx)、藏酋猴(Macaca thibetana)、东非狒狒(Papio anubis)、草原狒狒(Papio cynocephalus)、阿拉伯狒狒(Papiohamadryas)、几内亚狒狒(Papio papio)、豚尾狒狒(Papio ursinus)、长尾叶猴(Presbytisentellus)、狮尾狒狒(Theropithecus gelada)、阿氏夜猴(Aotus azarae)、秘鲁夜猴(Aotus nancymaae)、黑夜猴(Aotus nigriceps)、夜猴(Aotus trivirgatus)、巴西夜猴(Aotus vociferans)、长毛蛛猴(Ateles belzebuth)、棕头蜘蛛猴(Ateles fusciceps)、普通狨(Callithrix jacchus)、暗黑伶猴(Callicebus moloch)、侏儒狨(Cebuellapygmaea)、黑帽卷尾猴(Cebus apella)、金狮面狨(Leontopithecus rosalia)、白面僧面猴(Pithecia pithecia)、棕须柽柳猴(Saguinus fuscicollis)、斑柽柳猴(Saguinusgeoffroyi)、白唇柽柳猴(Saguinus labiatus)、长须柽柳猴(Saguinus mystax)、绒顶柽柳猴(Saguinus Oedipus)和松鼠猴(Saimiri sciureus)。
如本文所用的术语“cyno”是食蟹猴的缩写和/或指衍生自食蟹猴的材料，包括但不限于细胞、组织、器官、血液或源自其中的细胞。
“核苷酸”是寡核苷酸和多核苷酸的结构单位并且出于本发明目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。自然界中，核苷酸如DNA和RNA核苷酸包含核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸酯基团(它们不存在于核苷中)。核苷和核苷酸还可以可互换地称作“单位”或“单体”。
如本文所用，术语“衍生自人类基因组的核苷酸序列”意指衍生自人类基因组参照物的相应核苷酸序列，即全球人群的至少一个亚群包含基因组中的相应核苷酸序列。另外，如本文所用的术语“衍生自人类基因组的核苷酸序列”用于使用NCBI/Blast数据库和算法与人类基因组比对的具有最高最大评分的序列(Zheng Zhang,Scott Schwartz,LukasWagner和Webb Miller(2000),"A greedy algorithm for aligning DNA sequences",JComput Biol 2000；7(1-2):203-14)。在不受理论约束的情况下，认为如果查询序列衍生自人类基因组，则与非人类参考序列相比，人参考序列的查询序列比对评分较高。
如本文所用的术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”指与等同DNA核苷或RNA核苷相比，通过引入一个或多个糖部分或(核)碱基部分修饰而修饰的核苷。在一个优选的实施方案中，修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语“修饰的核苷”也可以在本文中与术语“核苷类似物”或修饰的“单位”或修饰的“单体”互换使用。
术语“修饰的核苷间键”如技术人员通常理解定义为除了将二个核苷共价连接在一起的磷酸二酯(PO)键之外的键。具有修饰的核苷间键的核苷酸也称作“修饰的核苷酸”。在一些实施方案中，与磷酸二酯键相比，修饰的核苷间键增加寡核苷酸的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间键包括在相邻核苷之间产生磷酸二酯键的磷酸酯基团。修饰的核苷间键特别可用于稳定体内使用的寡核苷酸，并且可以在本发明寡核苷酸中的DNA核苷或RNA核苷区域(例如在缺口聚物寡核苷酸的缺口区域内部)以及在修饰的核苷区域起到防范核酸酶剪切的保护作用。
如本文所用，术语“N2B27”指由补充了N2和B27(二者均来自Gibco,Invitrogen)的等体积DMEM:F12(Gibco,Invitrogen)组成的确定成分培养基。
如本文所用的术语“寡核苷酸”定义为，它如技术人员通常理解那样为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。这类共价结合的核苷也可以称作核酸分子或寡聚体。寡核苷酸常在实验室中通过固相化学合成法产生，随后纯化。当提到寡核苷酸的序列时，指核碱基部分或其修饰物、共价连接的核苷酸或核苷的序列或顺序。寡核苷酸可以包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸。如本文所用的术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸、尤其与靶核酸上的连续序列杂交调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的并因此不是siRNA。优选地，反义寡核苷酸是单链的。
如本文所用，术语“再编程”指为了将体细胞转化成分化程度较低的细胞，例如将成纤维细胞、脂肪细胞、角质形成细胞或白细胞转化成NPC所需要的一个或多个步骤。“再编程的”细胞指通过如本文所述那样再编程体细胞所衍生的细胞。
如本文所用，术语“小分子”、或“小化合物”、或“小分子化合物”指合成或自然界中存在的有机或无机分子，通常具有小于10,000克/摩尔、任选地小于5,000克/摩尔和任选地小于2,000克/摩尔的分子量。
术语“体细胞”如本文所用，指形成生物躯体的不是种系细胞(例如，精子和卵细胞、从中产生它们的细胞(配子母细胞))和非分化的干细胞的任何细胞。
如本文所用的术语“干细胞”指具有自我更新和分化能力的细胞。如本文所用“未分化的干细胞”指没有发生分化的干细胞。如本文所用，“多潜能干细胞”或“PSC”指可以产生三种胚层(内胚层、外胚层、中胚层)以及种系的细胞类型的干细胞。多潜能干细胞(PSC)包括但不限于“胚胎干细胞”(“ESC”)和“诱导的多潜能干细胞”(“IPSC”)。术语“hIPSC”和“cIPSC”分别指衍生自人细胞的IPSC和衍生自食蟹猴细胞的IPSCS。
如本文所用的术语“细胞活力实质地丢失”指当应用不同细胞培养条件或在确定的过程中、尤其与从细胞培养支持物解离细胞相关而操纵细胞时细胞活力降低。在一个实施方案中，细胞活力实质地丢失意指多于5％的细胞变得无活力和/或发生凋亡。在其他实施方案中，细胞活力实质地丢失意指多于10％、多于15％、多于20％或多于25％的细胞变得无活力和/或发生凋亡。因此，在一个实施方案中，术语“基本上保持活力”意指多于95％的细胞保持活力。在其他实施方案中，基本上保持活力意指多于90％、多于85％、多于80％或多于75％的细胞保持活力。
如本文所用的“分化适用的培养基”(还称作“分化培养基”)指可用于NPC分化成NC的任何化学成分确知培养基。如本文所述的分化培养基含有至少一种“分化剂”。分化剂包括但不限于引起细胞分化的生物活性多肽或小分子化合物。
“靶”指需要调节的蛋白质。“靶核酸”是与本发明的寡核苷酸杂交的预期靶，并且可以例如是基因、RNA、非编码性RNA、非编码性长RNA、mRNA和前mRNA、成熟mRNA或cDNA序列。在一些实施方案中，靶核酸是非编码性RNA或非编码性长RNA或其子序列。对于特定的体内或体外应用，本发明的寡核苷酸能够降低SNORD109B下游的SNHG14转录物的水平并且因而减轻对预期靶细胞中父系UBE3A转录物的阻抑。本发明寡核苷酸的连续序列核碱基与靶核酸互补，如跨寡核苷酸长度所测量，任选地例外是一个或两个错配，并且任选地不包括基于核苷酸的接头区域，所述接头区域可以将寡核苷酸连接至任选的官能团如缀合物。寡核苷酸包含与靶核酸分子的子序列互补或杂交的连续核苷酸序列。
如本文所用的术语“靶序列”指靶核酸中存在的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与本发明寡核苷酸互补的核碱基序列。在一些实施方案中，靶序列由靶核酸上与本发明寡核苷酸的连续核苷酸序列互补的区域组成。在一些实施方案中，靶序列长于单个寡核苷酸的互补序列，并且例如可以代表可以被本发明的几种寡核苷酸靶向的靶核酸的优选区域。本发明的寡核苷酸包含与靶核酸互补的连续核苷酸序列，如靶序列。寡核苷酸包含与靶核酸分子中存在的靶序列互补或杂交的至少8个核苷酸的连续核苷酸序列。连续核苷酸序列(和因此靶序列)包含至少8个连续核苷酸，如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸，如12-25个，如14-18个连续核苷酸。
如本文所用的术语“靶细胞”指表达靶核酸的细胞。在一些实施方案中，靶细胞可以是在体内或体外。在一些实施方案中，靶细胞是哺乳动物细胞如啮齿类细胞，如小鼠细胞或大鼠细胞、或灵长类细胞如猴细胞或人细胞。在一个实施方案中，靶细胞是神经元细胞(NC)。
如本文所用，术语“毒性特征”或“毒性”如本领域中通常理解那样定义成包括对潜在有害或无害物质的毒理学评估，所述评估毒理学基于测试系统(例如，细胞培养物或生物)暴露于该物质、尤其暴露于不同浓度的该物质和/或暴露于不同施用途径，随后确定所产生的细胞影响和/或生理影响，例如，细胞存活或健康。确定细胞影响和/或生理影响的参数是本领域熟知的，包括但不限于存活、细胞活力、形态、某些基因的表达和/或表达水平和蛋白质合成。优选地，记录多于一种参数以建立毒性未知的物质的毒性特征。本领域使用候选药物的毒性特征选择候选药物用于进一步开发，例如，在灵长类或人类上体内测试。
本发明提供用于从不同灵长类物种(包括人)产生可重复和标准化的分化的NC培养物的新方法，所述培养物可以用于候选药物的体外高通量测试。该方法包括提供灵长类NPC，使NPC分化成NC，并在细胞活力无显著损失的情况下，通过解离分化的灵长类NC并且以合适的细胞培养模式再接种细胞，赋予细胞培养物用于候选药物高通量筛选的能力，并且继续NC的分化。灵长类NPC可以衍生自IPSC或转分化的细胞，二者均可以从体细胞产生。优选地，所述体细胞是灵长类细胞，包括人体细胞。
在一个实施方案中，提供一种从不同灵长类物种产生均匀分布的分化的神经元细胞(NC)的细胞培养物的体外方法，所述方法包括步骤
a)提供神经元前体细胞(NPC)；和
b)使NPC分化成NC，这包括步骤
(i)将分化的NC在分化第20和第45天之间从其支持物解离；和
(ii)以合适的细胞培养模式再接种细胞并继续NC的分化4至15天。
为了实现在此描述的本发明方法，需要绕过NC培养物的一些现有限制。广泛接受的是，与可以无限扩充为贴壁培养物或悬浮培养物的NPC相反，分化的NC严重依赖于与基质相互作用，所述基质通常由细胞培养平板的生物聚合物涂层组成。另外，分化的NC变得对细胞应激敏感，并且因此，认为分化细胞的传代有损于细胞。本发明的创新性方法公开了这样的细胞培养条件，籍此可以从不同灵长类物种产生均匀NC培养物，其中NC在分化第10和第40天之间从其支持物解离，活力未实质地丧失。NC可以按合适的细胞培养模式再接种并且分化过程继续。解离和再接种导致分化的NC遍及细胞培养区域均一分布。另外，本发明的方法允许在NC分化的晚期阶段改变细胞培养模式。在其他实施方案中，步骤b)(i)包括在分化的约第25天和约第40天之间、约第28天和约第30天之间、约第28天或约第30天，将分化的NC从其支持物解离。
因此，本发明的一个方面是如本文所述的产生均匀分化的NC培养物的方法。在一个实施方案中，步骤b)包括使NPC分化成神经细胞(NC)，其包括步骤(i)将分化的NC在分化第20天和第45天之间从其支持物解离；和(ii)以合适的细胞培养模式再接种细胞并且继续NC的分化4至10天，其中NC基本上保持活力。所述解离步骤和再接种步骤对获得分化的灵长类NC遍布细胞培养表面(例如，细胞培养孔)的区域均匀分布和/或收获活力未实质地丧失的分化的灵长类NC至关重要。因此，与没有进行解离和接种情况下产生的细胞培养物相比，根据本发明产生的分化的灵长类NC培养物测定法显示细胞分布更均匀并且更好适用于高通量测定法。重要地，可以在NC分化的晚期阶段改变细胞培养模式。这与现有技术的方法相反，其中不得不在早期时间点采用最终细胞培养模式。实际上，能够变化细胞培养模式允许可观的符合逻辑的灵活性。
高度可重复的灵长类NC细胞培养物经充分标准化并且可以用于化合物筛选测定法，包括但不限于候选药物的体外功效评估。另外，如本文所述的细胞培养物可以用于选择如本文所述的候选药物，尤其选择候选药物用于进一步开发。在一个实施方案中，本发明的细胞培养物用来确定如本文所述的候选药物的体外功效特征。在又一个实施方案中，在确定如本文所述的体内功效特征之前，确定候选药物的体外功效特征。在又一个实施方案中，本发明的细胞培养物用来确定如本文所述的候选药物的体外毒性特征。
因此，在一个实施方案中，分化的灵长类NC解离自细胞培养容器，其中NC基本上保持活力。解离的NC可以按照针对给定细胞培养测定法优化的细胞密度以所需的细胞培养模式再接种。在一个实施方案中，如本发明中所述的解离条件和再接种条件可以应用于不同的灵长类物种。在一个实施方案中，本发明的方法用于候选药物功效特征的物种间比较，其中从至少两个物种的细胞单独产生细胞培养物，其中基本上相同的条件应用于全部物种的培养物并且其中针对全部物种确定和比较功效特征。以下处于本发明范围内：使用基本上相同的细胞培养条件，产生衍生自至少一种灵长类物种、至少两种灵长类物种或至少三种灵长类物种的标准化细胞培养测定法，并且比较和整合如通过测定法读出所测定的结果以确定至少一种候选药物的全面功效特征。
在一个实施方案中，NPC生成自IPSC，后者衍生自再编程的体细胞。可以通过引入参与维持IPSC特性的特定基因实现体细胞再编程为IPSC。适于体细胞再编程为IPSC的基因包括但不限于Oct4、Sox2、Klf4和C-Myc及其组合。在一个实施方案中，用于再编程的基因是Oct4、Sox2、Klf4和C-Myc。WO2012/022725中描述了用于使体细胞转分化为NPC的基因的组合，所述文献通过引用的方式纳入本文作为参考。
内脏、皮肤、骨、血液和结缔组织均由体细胞组成。用来产生IPSC的体细胞包括但不限于成纤维细胞、脂肪细胞和角质形成细胞并且可以从皮肤活检获得。其他合适的体细胞是从血液样品获得的白细胞、成红细胞或从血液样品或尿样品获得的上皮细胞或其他细胞并通过本领域已知及如本文所述的方法被再编程为IPSC。体细胞可以从健康个体或从患病个体获得。通过本领域已知的方法，通过再编程载体递送入细胞或通过小分子激活所述基因，将如本文所述的用于再编程的基因引入体细胞。用于再编程的方法尤其包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、质粒和转座子、微RNA、小分子、修饰的RNA和重组蛋白。在一个实施方案中，慢病毒用于递送如本文所述的基因。在另一个实施方案中，使用仙台(Sendai)病毒粒子，将Oct4、Sox2、Klf4和C-Myc递送至体细胞。此外，体细胞可以在至少一种小分子存在下培养。在一个实施方案中，所述小分子包含蛋白激酶的形成Rho-相关卷曲螺旋的蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶(ROCK)家族的抑制剂。ROCK抑制剂的非限制性例子包括法舒地尔(fasudil)(1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪)、Thiazovivin(N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺)和Y-27632((+)-(R)-反-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐)。可以诱导所得的IPSC以分化成NPC。在一个实施方案中，诱导IPSC以分化成NPC。
在一个实施方案中，通过双重SMAD抑制作用，从IPSC产生灵长类NPC。在一个实施方案中，通过使IPSC细胞与SB-431542(Calbiochem)和LDN-193189(Calbiochem)接触，从IPSC产生NPC。在一个具体实施方案中，通过使IPSC细胞与5ng/ml FGF(Peprotech)、10μMSB-431542(Calbiochem)和100nM LDN-193189(Calbiochem)接触，从IPSC产生NPC。所得的灵长类NPC可以在补充有FGF、EGF和BDNF的基础培养基中扩充。在一个实施方案中，在补充有10ng/ml FGF(Peprotech)、10ng/ml EGF(RnD)和20ng/ml BDNF(Peprotech)的基础培养基中扩充NPC。在补充有FGF、EGF和BDNF的基础培养基中连续传代导致稳定的神经祖细胞系(NPC系)。稳定的NPC系由其自我更新能力和表达发育阶段特异性标志物Sox2和巢蛋白定义。因此，在一个实施方案中，灵长类NPC表达Sox2和巢蛋白。
为了扩大NPC增殖，将细胞在包含无血清培养基的扩充培养基中培育，所述无血清培养基补充有生长因子。在一个实施方案中，所述生长因子包含FGF、BDNF和EGF。因此，在一个实施方案中，该方法额外地包括在适于增殖NPC的条件下温育步骤a)的细胞，例如，直至达到每个区域定义的细胞数目。本文中描述了扩充培养基的非限制性例子。在一个实施方案中，扩充培养基补充有10-50ng/ml FGF、10-50ng/ml EGF和1-20ng/ml BDNF。在一个具体实施方案中，NPC扩充培养基是补充有10ng/ml FGF2、10ng/ml EGF和20ng/ml BDNF的基础培养基。NPC可以按无限制的量产生并且因此最适用于需要大量测定平板的高通量细胞培养测定法。培养过程处于本领域技术人员的能力范围内。
在一个实施方案中，将灵长类NPC在启动分化之前用合适的缓冲液或培养基洗涤以移除任何死细胞。优选地，在细胞培养方案的每个步骤之间更换培养基，例如，通过抽吸或将细胞离心并抛弃上清液，移除培养基，并且随后添加后续步骤中所用的培养基至细胞。在一个实施方案中，将细胞在添加后续步骤的培养基之前用合适的缓冲液或培养基洗涤以移除任何死细胞和任何残余培养基或在先前步骤中施加的生长因子或细胞因子。可用于洗涤细胞的缓冲液或培养基是本领域已知的。洗涤细胞的合适缓冲液的一个例子是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一个实施方案中，灵长类NPC培养物按约5000个细胞/cm2至约100000个细胞/cm2的密度提供。在其他实施方案中，灵长类NPC培养物按约10000个细胞/cm2至约50000个细胞/cm2的密度提供。在一个实施方案中，贴壁灵长类NPC培养物按约20000个细胞/cm2至约40000个细胞/cm2的密度提供。在一个实施方案中，贴壁灵长类NPC培养物按约30000个细胞/cm2的密度提供。在一个实施方案中，贴壁灵长类NPC培养物在层粘连蛋白521支持物上提供。
在一个实施方案中，依据本领域已知和如本文所述的方法获得的灵长类NPC在随后的步骤中，通过使灵长类NPC细胞与Shh(音猬因子)、FGF8(成纤维细胞生长因子8)和抗坏血酸磷酸酯接触，经诱导以分化成NC。在一个实施方案中，NPC与如本文所述的包含Shh、FGF8和抗坏血酸磷酸酯的化学成分确知培养基温育。在一个实施方案中，该培养基补充有50-1000ng/ml Shh、25-500ng/ml FGF8和20-200μM抗坏血酸磷酸酯。在其他实施方案中，细胞与Shh、FGF8和抗坏血酸磷酸酯接触约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天。在又一个实施方案中，细胞与Shh、FGF8和抗坏血酸磷酸酯接触约5天至约10天。在一个具体实施方案中，灵长类NPC在补充有200ng/ml Shh、100ng/ml FGF8和100μM抗坏血酸磷酸酯的基础培养基中培养约7天。
在一个实施方案中，诱导神经元分化后以约10000个细胞/cm2至约80000个细胞/cm2、约20000个细胞/cm2至约70000个细胞/cm2、约30000个细胞/cm2至约60000个细胞/cm2或约40000个细胞/cm2至约50000个细胞/cm2的密度再铺板细胞。在一个具体实施方案中，诱导神经元分化后以45000个细胞/cm2的密度再铺板细胞。
在一个实施方案中，在下一个步骤中将受诱导成发生神经元分化的细胞在补充有BDNF、GDNF、cAMP和抗坏血酸磷酸酯的基础培养基中分化约另外15天、约另外16天、约另外17天、约另外18天、约另外19天、约另外20天、约另外21天、约另外22天、约另外23天、约另外24天、约另外25天、约另外26天、约另外27天、约另外28天、约另外29天、约另外30天、约另外31天、约另外32天、约另外33天、约另外34天或约另外35天。在一个具体实施方案中，将细胞在补充有20ng/ml BDNF(Peprotech)、10ng/ml GDNF(Peprotech)、0.5mM cAMP(BIOLOGLife Science)和100μM抗坏血酸磷酸酯(Sigma)的基础培养基中进一步培养约19天至约35天。
在一个实施方案中，根据本发明，将分化的NC从其支持物解离并按照如本文所述的合适细胞培养模式再接种。在其他实施方案中，将NC在补充有BDNF、GDNF、cAMP和抗坏血酸的基础培养基中分化至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天或至少约28天，之后解离并且按合适的细胞培养测定模式再接种。在其他实施方案中，将灵长类NC在补充有BDNF、GDNF、cAMP和抗坏血酸的基础培养基中分化约15至约30天、约20至约25天、约21至约23天，之后解离并且按合适的细胞培养测定模式再接种。
在本发明的一个方面，在细胞活力不实质地丢失的情况下，从细胞培养物基材解离通过如本文所述的方法获得的分化的NC。因此，在一个实施方案中，在细胞活力不实质地丢失的情况下，收获分化的NC。可以根据本领域使用的常规方法确定细胞数目，所述方法包括但不限于在血球计中或使用流式细胞术计数细胞数目。可以根据本领域使用的常规方法确定细胞活力，所述方法包括但不限于台盼蓝染色法和赤藓红B染色法。在解离后，细胞可以根据基于NC的所需测定法的具体需求或实验参数，以合适的细胞密度再接种于合适的细胞培养孔中。
因此，在一个实施方案中，通过使用细胞脱离溶液，从细胞培养表面分离分化的NC。在一个实施方案中，将分化的NC从其支持物解离并以合适的细胞培养模式再接种。在又一个实施方案中，将分化的NC在分化约第20天和约第45天之间从其支持物解离。分化天数从启动分化(例如，与Shh、FGF8和抗坏血酸磷酸酯温育)的当天计数，其中添加Shh、FGF8和抗坏血酸的当天计为第0天。在其他实施方案中，将分化的NC在约第15天和约第50天之间、在约第28天和约第30天之间、在分化约第25天、在分化约第26天、在分化约第27天、在分化约第28天、在分化第29天、在分化约第30天、在分化约第31天、在分化约第32天、在分化约第33天或在分化约第34天从其支持物解离。在一个实施方案中，通过将细胞与细胞脱离溶液温育，从其支持物解离分化的NC。在一个实施方案中，细胞脱离溶液是Accutase。Accutase是具有蛋白酶解性活性和溶胶原活性的海洋源酶。在一个实施方案中，将细胞脱离溶液添加至分化的NC培养物并温育1至5分钟、2至4分钟、优选地3分钟。在完成温育时间后，将Accutase溶液用培养基、尤其基础培养基稀释。在再接种之前，移除含有Accutase的培养基并回补如本文所述的补充有生长因子的新鲜基础培养基。
在脱离后，可以在新细胞培养容器(如，例如，合适平板样式下的细胞培养孔)中再接种灵长类NC。NC可以按任何所需密度(包括低密度、中等密度和高密度)再接种。因此，均匀分布的分化的NC的培养物可以按定义的和所需的密度(包括低密度、中等密度和高密度)生成。这与其中细胞密度在培养伊始固定并且其中细胞密度可能因细胞增殖或细胞死亡而随时间明显变化的常规细胞培养方法相反。在一个实施方案中，以高密度再接种NC。在其他实施方案中，NC以约50000个细胞/cm2至约500000个细胞/cm2的密度、以约75000个细胞/cm2至约400000个细胞/cm2的密度或以约100000个细胞/cm2至约300000个细胞/cm2的密度再接种。在一个具体实施方案中，将分化的NC在步骤b)(ii)中以约200000个细胞/cm2的密度再接种。在一个实施方案中，在用BDNF、GDNF、cAMP和抗坏血酸磷酸酯分化后将细胞解离并且以约50000个细胞/cm2至约500000个细胞/cm2、约75000个细胞/cm2至约400000个细胞/cm2或约100000个细胞/cm2至约300000个细胞/cm2的密度再接种。在一个具体实施方案中，在用BDNF、GDNF、cAMP和抗坏血酸磷酸酯分化后将细胞解离并且以约200000个细胞/cm2的密度再接种。在解离和再接种(再铺板)后，将细胞在补充有BDNF、GDNF、cAMP和抗坏血酸的基础培养基中进一步分化约另外1天、约另外2天、约另外3天、约另外4天、约另外5天、约另外6天、约另外7天、约另外8天、约另外9天、约另外10天、约另外11天、约另外12天、约另外13天、约另外14天或约另外15天。
分化的NC培养物的解离和再接种可以根据本发明用于测试候选药物的功效。在一个具体实施方案中，将细胞在补充有20ng/ml BDNF(Peprotech)、10ng/ml GDNF(Peprotech)、0.5mM cAMP(BIOLOG Life Science)和100μM抗坏血酸磷酸酯(Sigma)的基础培养基中进一步分化约7天，之后施加候选药物至细胞。因此，在约10天至约50天、约15天至约45天、约30至约40天、约35天或约37天的总分化期间后，NC细胞为筛选候选药物做好准备。在一个具体实施方案中，在约30至约40天的总分化期间后，NC细胞为筛选候选寡核苷酸做好准备。
在其他实施方案中，在约28天、约29天、约30天、约31天、约32天、约33天、约34天、约35天、约36天、约37天、约38天、约39天、约40天、约41天、约42天、约43天、约44天、约45天、约46天、约47天、约48天、约49天、约50天、约51天、约52天、约53天、约54天或约55天的总分化期间后，分化的NC培养物为候选药物处理做好准备。在又一个实施方案中，在如本文所述的细胞培养方案的任何步骤进行候选药物处理。
在一个具体实施方案中，解离和再接种之前，灵长类NPC在包含20ng/ml BDNF、10ng/ml GDNF、0.5mM cAMP和100μM抗坏血酸磷酸酯的无血清分化培养基中约21至约23天分化成NC。在又一个实施方案中，在如本文所述的再接种后，将分化的NC与如本文所述的分化培养基温育另外约1天、另外约2天、另外约3天、另外约4天、另外约5天、另外约6天、另外约7天、另外约8天、另外约9天、另外约10天、另外约11天、另外约12天、另外约13天、另外约14天、或另外约15天。在一个具体实施方案中，在再接种之后，将分化的NC在包含20ng/mlBDNF、10ng/ml GDNF、0.5mM cAMP和100μM抗坏血酸磷酸酯的无血清分化培养基中温育约7天。此后，分化的NC为候选药物处理做好准备。
在本发明的一个方面，解离和再接种的NC的分化在添加候选药物至细胞培养基之前继续。因此，在其他实施方案中，将再接种的NC在如本文所述的分化培养基中温育约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天或约15天，之后添加候选药物。在其他实施方案中，步骤b)(ii)包括在再接种后另外约1至约20天、另外约5至约10天、约7天，使用包含1至50ng/ml BDNF、1至50ng/ml GDNF和0.1-10mM cAMP和20至200μM抗坏血酸磷酸酯的基础培养基分化NC，之后添加候选药物。在一个具体实施方案中，步骤b)(ii)包括再接种后，用包含20ng/ml BDNF、10ng/ml GDNF和0.5mM cAMP和100μM抗坏血酸磷酸酯的基础培养基分化NC另外约7天，之后添加候选药物。
在一个实施方案中，在解离和再接种分化的NC后，添加候选药物至细胞培养基。在其他实施方案中，在再接种分化的NC后约1日至约15天、约5天至约10天或约7天，添加候选药物至细胞培养基。在一个具体实施方案中，在再接种分化的NC后约7天，添加候选药物至细胞培养基。
在一个实施方案中，将灵长类NPC根据如本文所述的方法分化成NC。在一个实施方案中，用与神经元的细胞功能和/或代谢功能相关的表达标志物评估神经元身份。常见的神经元标志物包括但不限于MAP2、HuC/D、巢蛋白、β-III-微管蛋白、DCX/双皮层蛋白、SYN 1/突触蛋白1和GPHN/桥连蛋白。与原代神经元或神经组织中的表达水平相比，与神经元身份相关的表达标志物可以在衍生自NPC的NC中以较低水平表达。与原代神经元或神经组织中相应标志物的表达水平相比，神经元表达标志物在NSC衍生的NC中的归一化表达水平可以是10000倍较低、或1000倍较低、或100倍较低、或10倍较低、或2倍较低。在NPC衍生的NC和原代神经元之间神经元表达标志物的表达水平倍数变化可以对不同的表达标志物不同。可以通过将给定标志物的绝对表达水平与合适的持家基因(例如，GAPDH或TBP)相关，实现归一化。
在一个实施方案中，本发明的创新性方法用来产生稳健的分化的NC培养物，其对于不同灵长类物种(包括但不限于人(Homo sapiens)、食蟹猴和恒河猴)具有均一的NC分布。基本上相同的细胞培养条件可以应用于全部灵长类物种。
在不受理论约束的情况下，本发明沿多潜能干细胞至充分分化的NC(其为NPC和分化的NC)的轴区分了细胞的二个不同阶段。多潜能NPC可以如本文中公开那样获得并且可以扩充至任何合适的细胞数目，例如，用于样式合乎需要的细胞培养测定法。冷冻和解冻健康个体特异性和患者特异性NPC等分样是可能的。因此，所述NPC可以扩充至合适的细胞数目、冷冻储存或直接分化以根据本发明产生稳健的分化的NC培养测定法。出乎意料地，发明人发现，使用如本申请中公开的具体条件，可以收获分化的灵长类NC并用作神经元身份固定的细胞源。分化的灵长类NC可以在分化晚期阶段在活力未实质地丧失的情况下从细胞培养基质脱离。收获的分化的灵长类NC可以按定义的测定模式再接种，其中细胞粘附至细胞培养支持物并且可以在施加待测试的候选药物之前或与之平行地继续分化过程。本发明的方法解决了来自不同灵长类物种的NC培养物的不均匀问题。因此，用本文所述方法获得的灵长类NC培养物是筛选有效和安全药物和为多种神经系统疾病精制新治疗药的有用模型。
因此，在本发明的又一个方面，根据本发明产生的NC培养物用于测试至少一种候选药物的功效。候选药物可以在本发明方法的任何阶段添加至细胞培养基。在一个实施方案中，添加候选药物至分化的NC。在一个实施方案中，添加候选药物至解离和再接种的分化的NC以确定候选药物的功效特征。在其他实施方案中，将候选药物在分化约第1天、在约第2天、在约第3天、在约第4天、在约第5天、在约第6天、在约第7天、在约第8天、在约第9天、在约第10天、在约第11天、在约第12天、在约第13天、在约第14天、在约第15天、在约第16天、在约第17天、在约第18天、在约第19天、在约第20天、在约第21天、在约第22天、在约第23天、在约第24天、在约第25天、在约第26天、在约第27天、在约第28天、在约第29天、在约第30天、在约第31天、在约第32天、在约第33天、在约第34天、在约第35天、在约第36天、在约第37天、在约第38天、在约第39天或在约第40天添加至细胞培养基。
在一个具体实施方案中，步骤b)(i)在这个顺序中包括：将分化的NC在约第28天至约第30天后从其支持物解离，并且步骤b)(ii)包括以合适的细胞培养模式再接种细胞，继续NC的分化约7天，添加候选药物至细胞培养基，继续NC的分化约另外5天并评估候选药物的功效特征。
本发明的灵长类NC培养物以均匀的细胞分布为特征，并且因此，测试新候选药物的功效直截了当并充分标准化。可以通过本领域已知的方法确定候选药物的功效，所述方法包括但不限于测量与候选药物的功效相关的表型标志物，例如，测量标志物的表达。在一个实施方案中，通过测定疾病相关标志物的表达，测试候选药物的功效。在一个实施方案中，通过测定疾病相关蛋白质的表达，测试候选药物的功效。在一个实施方案中，通过定量实时PCR测定相关标志物的表达，测试候选药物的功效。功效的测定在添加候选药物后定义的时间点进行。在其他实施方案中，功效的测定在添加候选药物后在约第1天、在约第2天、在约第3天、在约第4天、在约第5天、在约第6天、在约第7天、在约第8天、在约第9天、在约第10天、在约第11天、在约第12天、在约第13天或在约第14天进行。在一个具体实施方案中，步骤b)(ii)包括在解离和再接种后约第7天，添加候选药物至细胞培养基，并且在添加候选药物至细胞培养基后约第5天，确定候选药物的功效。可以对不同灵长类物种产生稳健和均匀的本发明分化的NC培养物并且用来测试候选药物的功效特征。在一个实施方案中，该方法适用于在各灵长类物种之间、尤其NHP物种和人之间进行功效的物种间比较。
本发明的又一个方面是通过如本文所述的方法获得的均匀分布的分化的灵长类NC的用途。在一个优选的实施方案中，使用通过本发明方法获得的分化的灵长类NC作为体外模型以研究CNS疾病的病理生理学。例如，通过本发明方法获得的分化的灵长类NC可以用于筛选逆转、抑制或防止神经系统疾病的化合物。在一个实施方案中，均匀分布的分化的灵长类NC用于筛选逆转、抑制或防止药物(例如糖尿病药物)的神经副作用的化合物。
在一个实施方案中，根据步骤a)至b)的均匀分布的分化的灵长类NC用于高通量筛选选自小分子、蛋白质、肽和核酸的化合物和/或候选药物。在又一个实施方案中，本发明的分化的NC用于高通量筛选核酸分子如RNAi剂或反义寡核苷酸。
在一个具体实施方案中，提供了选择至少一种候选药物用于进一步开发的体外方法，所述方法包括分别从人(Homo sapiens)和食蟹猴产生均匀分布的分化的神经元的细胞培养物，这包括步骤
a)分别以约30000个细胞/cm2的密度提供人和食蟹猴的神经元前体细胞(NPC)，其中NPC衍生自IPSC；
b)使NPC分化成神经细胞(NC)，这包括步骤
(i)将NPC与补充有Shh、FGF8和抗坏血酸磷酸酯的基础培养基温育约7天，以约45000个细胞/cm2的密度再铺板所述细胞，将再铺板的细胞用补充有BDNF、GDNF、cAMP和抗坏血酸磷酸酯的基础培养基温育约21天至约23天，随后将分化的NC从其支持物解离；和
(ii)按合适的细胞培养模式以约200000个细胞/cm2的密度分别再接种细胞并且通过将细胞与补充有BDNF、GDNF、cAMP和抗坏血酸的基础培养基温育，继续NC的分化约7天，随后将细胞与候选药物温育约5天，其中添加候选药物至补充有BDNF、GDNF、cAMP和抗坏血酸的基础培养基；并且
建立候选药物对人和食蟹猴的功效特征并且如果功效特征有利，则选择候选药物用于进一步开发。在一个实施方案中，建立功效特征包括评估靶接合作用。在一个实施方案中，进一步开发包括在NHP物种中体内测试候选药物和/或在人类中体内测试。
在一个实施方案中，提供通过前述任一方法产生的分化的灵长类NC的群体。在一个实施方案中，将分化的灵长类NC解离并再接种，并且进一步分化以获得均匀和标准化的分化的NC培养物。在一个实施方案中，灵长类NC衍生自健康个体。在另一个实施方案中，患者衍生的灵长类NC用来产生疾病相关的体外模型以研究CNS疾病的病理生理学。患者特异性体细胞转化成分化的NC代表了一项容易获得和可重复的产生患者特异性NC源的技术，供疾病建模用或化合物筛选用高通量细胞测定法。
在一个实施方案中，来自Angelman综合征患者的体细胞用来产生NPC。衍生自一位或几位Angelman综合征患者的NPC可以用来产生Angelman综合征的疾病模型。可以通过本领域已知的方法，将病因性基因突变引入相应的NHP基因组中，例如，通过将相应突变引入NHP NPC，在NHP物种中重现人单基因疾病模型。
在又一个实施方案中，使用本发明细胞测定法生成的数据意图用于研究目的，目的在于对付神经疾病如神经变性病如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化(ALS/Lou Gehrig病)、卒中和脊髓损伤，或意图用于治疗所述神经系统疾病。重要地，本发明导致一致和可重复的细胞培养测定法。实际上，衍生自灵长类干细胞的既往细胞培养测定法的重大缺陷是分化的细胞遍及细胞培养区域表面不均一分布。本发明通过引入出人意料由分化的灵长类NC耐受的解离和再接种步骤解决了这个问题，所述细胞保持活力并适合以定义的和均匀的细胞密度接种细胞培养测定法。细胞遍及给定细胞培养容器表面的均一分布导致改善的和可重复性更高的细胞培养测定法。因此，提供一种产生标准化灵长类NC培养物测定法的方法，其中根据步骤a)至b)获得的分化的NC培养物以细胞分布均一、高通量平板孔中细胞均匀分布、团簇和/或团块的形成减少和细胞分布更均等为特征。因此，所得到的测定法显示稳健性增加、均匀性增加和测定法重复之间变异性降低。在一个实施方案中，细胞均一分布遍及细胞培养区域，尤其如通过细胞核染色所评估。
一个实施方案是使用通过本发明方法获得的标准化NC培养物确定候选药物的功效。在本发明的又一个方面，标准化灵长类NC培养物用于体外测试候选药物的毒性。在本发明的又一个方面，标准化灵长类NC培养物用于体外测试候选药物的功效。培养物可以衍生自健康个体和/或衍生自患病个体，并且来自功效和/或毒性的结果，所述结果经整合以预测候选药物的疾病相关和/或疗法相关的生理影响。在一个实施方案中，评估候选药物的体外功效特征并且选择具有有利功效特征的候选药物用于进一步开发。进一步开发可以包括在NHP物种中体内测试候选药物和/或在人类中体内测试。
在一个具体实施方案中，提供一种使用来自至少两种灵长类物种的均一分布的分化的神经细胞(NC)的标准化细胞培养物，确定候选药物体外功效特征的方法，其中分化的NC培养物胜任高通量筛选，所述方法包括步骤：
a)在约20天至约45天分化后将分化的NC从其支持物解离并以高通量细胞培养模式再接种分化的NC；
b)在分化培养基中温育再接种的NC；
c)使再接种的NC与候选药物接触；和
d)确定候选药物的体外功效特征。
由于NHP物种和人之间的遗传距离小，所以在人体中体内测试之前对NHP物种体外和/或体内评估功效数据是令人信服的。这与例如相比NHP物种在遗传上距人类更远的啮齿类物种相反。当评估靶向人多核苷酸序列的候选药物时或如果候选药物本身包含具有衍生自人类基因组的序列或与衍生自人类基因组的序列接近的多核苷酸，NHP物种和人之间的遗传距离小特别重要。在一个实施方案中，提供一种如本文所述的方法，其中确定的候选药物体外功效特征用于候选药物功效特征的物种间比较，其中从至少两种灵长类物种的细胞单独产生细胞培养物，其中基本上相同的条件应用于全部灵长类物种的培养物并且其中针对全部灵长类物种确定和比较功效特征。在一个实施方案中，提供一种用于选择候选药物用于进一步开发的方法，所述方法包括步骤：(i)根据如本文所述的方法，确定候选药物对第一和第二物种的体外功效特征；和(ii)如果候选药物的功效特征是有利的，则选择候选药物用于进一步开发。在一个实施方案中，第一和第二物种之间编码蛋白质的区域的遗传相似性高。在一个实施方案中，第一和第二物种之间编码蛋白质的区域的遗传相似性高于人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)之间编码蛋白质的区域的遗传相似性。在其他实施方案中，第一和第二物种之间编码蛋白质的区域的遗传相似性高于85％、高于90％或高于95％。在一个实施方案中，第一和第二物种之间编码蛋白质的区域的遗传相似性高于90％。在一个具体实施方案中，第一物种是食蟹猴并且第二物种是人(Homo sapiens)。可以对不同物种依次产生本发明的分化的NC培养物。
因此，在一个实施方案中，本发明的来自一种或多种灵长类物种的分化的NC的标准化细胞培养物用于候选药物的体外功效测试，其中候选药物包含多核苷酸或靶向多核苷酸的特定序列，其中所述多核苷酸序列衍生自人类基因组。在又一个实施方案中，候选药物包含核酸分子如RNAi剂或反义寡核苷酸。
在本发明的又一个实施方案中，体外功效试验和/或毒性试验中评估的候选药物包含一种或多种反义寡核苷酸。在其他实施方案中，反义寡核苷酸包含与衍生自人类基因组的序列具有至少90％同一性、优选地100％同一性的10至30个核苷酸长度或由其组成。可以理解，可以修饰反义寡核苷酸序列(基序序列)，以例如增加核酸酶抗性和/或对靶核酸的结合亲和力。在一个方面，反义寡核苷酸包含糖修饰的核苷并且还可以包含DNA核苷或RNA核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸包含糖修饰的核苷和DNA核苷。在另一个方面，修饰的核苷掺入寡核苷酸增强了寡核苷酸对靶核酸的亲和力。在这种情况下，修饰的核苷可以称作增强亲和力的修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，反义寡核苷酸包含至少1个修饰的核苷，如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个修饰的核苷。在一个实施方案中，寡核苷酸包含1至10个修饰的核苷，如2至9个修饰的核苷，如3至8个修饰的核苷，如4至7个修饰的核苷，如6或7个修饰的核苷。在一些实施方案中，至少1个修饰的核苷是锁核酸(LNA)，如至少2、如至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8个修饰的核苷是LNA。在又一个实施方案中，全部修饰的核苷均是LNA。
在一个实施方案中，反义寡核苷酸包含修饰，所述修饰独立地选自这三个类型的修饰(修饰的糖、修饰的核碱基和修饰的核苷间键)或其组合。优选地，反义寡核苷酸包含一个或多个糖修饰的核苷，如2’糖修饰的核苷。优选地。反义寡核苷酸包含一个或多个2’糖修饰的核苷，其独立地选自2’-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧乙基-RNA、2’-氨基-DNA、2'-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA和LNA核苷。甚至更优选地，一个或多个修饰的核苷是LNA。
在又一个实施方案中，反义寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键。在一个优选的实施方案中，连续核苷酸序列内部的核苷间键是硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯(boranophosphate)核苷间键。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含至少一个作为2’-MOE-RNA的修饰的核苷，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个2’-MOE-RNA核苷单位。在一些实施方案中，所述修饰的核苷中至少一个是2'-氟DNA，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个2'-氟-DNA核苷单位。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含至少一个LNA单位，如1、2、3、4、5、6、7、或8个LNA单位，如2至6个LNA单位，如3至7个LNA单位、4至8个LNA单位或3、4、5、6或7个LNA单位。在一些实施方案中，全部修饰的核苷均是LNA核苷。在又一个实施方案中，寡核苷酸可以包含β-D-氧基-LNA和以下一种或多种LNA单位：处于β-D构型或α-L构型的硫代-LNA、氨基-LNA、氧基-LNA和/或ENA或其组合。在又一个实施方案中，全部LNA胞嘧啶单位均是5-甲基-胞嘧啶。在一个优选的实施方案中，寡核苷酸或连续核苷酸序列具有至少1个在核苷酸序列5'末端的LNA单位和至少2个在核苷酸序列3'末端的LNA单位。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含至少一个LNA单位和至少一个2’取代的修饰的核苷。
在本发明的一些实施方案中，反义寡核苷酸包含2’糖修饰的核苷和DNA单位。优选地，反义寡核苷酸包含LNA单位和DNA单位。优选地，LNA单位和DNA单位的合并总数是8-30个，如10–25个、优选地12-22个，如12–18个、甚至更优选地11-16个。在本发明的一些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷酸序列，如连续核苷酸序列，由至少一个或二个LNA单位组成并且剩余的核苷酸单位是DNA单位。在一些实施方案中，反义寡核苷酸仅包含LNA核苷和天然存在的核苷(如RNA或DNA核苷、最优选地DNA核苷)、任选地具有修饰的核苷间键如硫代磷酸酯。
在本发明的一个实施方案中，反义寡核苷酸能够召集RNA酶H。
在一个优选的实施方案中，反义寡核苷酸具有缺口聚物(gapmer)设计或结构，本文中又仅称作“Gapmer”。在缺口聚物结构中，反义寡核苷酸按‘5->3’取向包含至少三个不同的结构区：5’-侧翼、缺口和3’-侧翼，即F-G-F’。在这种设计中，侧翼区F和F’(也称作翼区)包含连续的修饰核苷片段，所述片段互补于靶核酸，而缺口区域G包含连续的核苷酸片段，所述片段能够在反义寡核苷酸与靶核酸处于双链体时召集核酸酶、优选地核酸内切酶如RNA酶，例如RNA酶H。能够召集核酸酶、尤其RNA酶H的核苷可以选自DNA、α-L-氧基-LNA、2’-氟-ANA和UNA。分布于区域G的5’和3’末端旁侧的区域F和F’优选地包含无核酸酶召集作用的核苷(具有3’内切结构的核苷)、更优选地一个或多个增强亲和力的修饰的核苷。在一些实施方案中，3’侧翼包含至少一个LNA核苷、优选地至少2个LNA核苷。在一些实施方案中，5’侧翼包含至少一个LNA核苷。在一些实施方案中，5’和3’侧翼区均包含LNA核苷。在一些实施方案中，侧翼区中的全部核苷均是LNA核苷。在其他实施方案中，侧翼区可以包含LNA核苷和其他核苷(混合型侧翼)，如DNA核苷和/或非LNA修饰的核苷，如2’取代的核苷。在这种情况下，缺口定义为具有至少5个召集RNA酶H的核苷(具有2’内切结构的核苷、优选地DNA)的连续序列，其在5’和3’末端旁侧分布有增强亲和力的修饰的核苷、优选地LNA，如β-D-氧基-LNA。因此，5’侧翼区和3’侧翼区的毗邻缺口区域的核苷是修饰的核苷、优选地无核酸酶召集作用的核苷。
在一些实施方案中，本发明寡聚体的修饰的核苷或LNA核苷具有式I或II的通式结构：
其中W选自-O-、-S-、-N(Ra)-、-C(RaRb)-，如在一些实施方案中–O-；
B指核碱基或修饰的核碱基部分；
Z指至相邻核苷的核苷间键或5'末端基团；
Z*指至相邻核苷的核苷间键或3'末端基团；
X指选自-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z的基团。
在一些实施方案中，X选自：–O-、-S-、NH-、NRaRb、-CH2-、CRaRb、-C(＝CH2)-和-C(＝CRaRb)-。
在一些实施方案中，X是-O-并且Y指选自-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z的基团。
在一些实施方案中，Y选自：–CH2-、-C(RaRb)-、–CH2CH2-、-C(RaRb)-C(RaRb)-、–CH2CH2CH2-、-C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-和-C(Ra)＝N-。
在一些实施方案中，Y选自：-CH2-、-CHRa-、-CHCH3-、CRaRb-，或者-X-Y-一起指双价接头基团(也称作基)，是由1个、2个、3个或4个选自-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z的基团/原子组成的双价接头基团。
在一些实施方案中，-X-Y-指双基，所述双基选自：-X-CH2-、-X-CRaRb-、-X-CHRa-、-X-C(HCH3)-、-O-Y-、-O-CH2-、-S-CH2-、-NH-CH2-、-O-CHCH3-、-CH2-O-CH2、-O-CH(CH3CH3)-、-O-CH2-CH2-、OCH2-CH2-CH2-、-O-CH2OCH2-、-O-NCH2-、-C(＝CH2)-CH2-、-NRa-CH2-、N-O-CH2、-S-CRaRb-和-S-CHRa-。
在一些实施方案中，–X-Y-指–O-CH2-或–O-CH(CH3)-，其中Z选自-O-、-S-和-N(Ra)-，并且Ra和当存在Rb时各自独立地选自氢、任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-链烯基、任选取代的C2-6-炔基、羟基、任选取代的C1-6-烷氧基、C2-6-烷氧烷基、C2-6-链烯氧基、羧基、C1-6-烷氧羰基、C1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基-羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单和二(C1-6-烷基)氨基、氨甲酰基、单和二(C1-6-烷基)氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨羰基、单和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨羰基、C1-6-烷基-羰氨基、脲基、C1-6-烷酰氧基、砜基(sulphono)、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基(sulphanyl)、C1-6-烷硫基、卤素，其中芳基和杂芳基可以是任选取代的并且其中二个孪位取代基Ra和Rb一起可以指任选取代的亚甲基(＝CH2)，其中全部手性中心、非对称基团可以按R或S取向存在，其中R1、R2、R3、R5和R5*独立地选自：氢、任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-链烯基、任选取代的C2-6-炔基、羟基、C1-6-烷氧基、C2-6-烷氧烷基、C2-6-链烯氧基、羧基、C1-6-烷氧羰基、C1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基-羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单和二(C1-6-烷基)氨基、氨甲酰基、单和二(C1-6-烷基)氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨羰基、单和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨羰基、C1-6-烷基-羰氨基、脲基、C1-6-烷酰氧基、砜基(sulphono)、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、卤素，其中芳基和杂芳基可以是任选取代的并且其中二个孪位取代基一起可以指氧代、硫代、亚胺基或任选取代的亚甲基。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R5和R5*独立地选自C1-6烷基(如甲基)和氢。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R5和R5*均是氢。
在一些实施方案中，R1、R2、R3均是氢并且R5和R5*之一也是氢并且R5和R5*的另一个不是氢，如C1-6烷基如甲基。
在一些实施方案中，Ra是氢或甲基。在一些实施方案中，当存在时，Rb是氢或甲基。
在一些实施方案中，Ra和Rb之一者或二者是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb之一是氢并且另一个不是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb之一是甲基并且另一个是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb均是甲基。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–O-CH2-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。这类LNA核苷在WO99/014226、WO00/66604、WO98/039352和WO2004/046160中公开，所述文献均因而通过引用的方式并入，并且包括所通称的β-D-氧基LNA和α-L-氧基LNA核苷。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–S-CH2-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。这类硫代LNA核苷在WO99/014226和WO2004/046160中公开，所述文献因而通过引用的方式并入本文作为参考。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–NH-CH2-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。这类氨基LNA核苷在WO99/014226和WO2004/046160中公开，所述文献因而通过引用的方式并入本文作为参考。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–O-CH2-CH2-或–O-CH2-CH2-CH2-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。这类LNA核苷在WO00/047599和Morita等人,Bioorganic&Med.Chem.Lett.12 73-76中公开，所述文献均因而通过引用的方式并入，并且包括所通称的2’-O-4’C-乙烯桥接的核酸(ENA)。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–O-CH2-，W是O，且R1、R2、R3全部以及R5和R5*之一是氢并且R5和R5*的另一个不是氢，是如C1-6烷基，如甲基。这类5’取代的LNA核苷在WO2007/134181中公开，所述文献因而通过引用的方式并入本文作为参考。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–O-CRaRb-，其中Ra和Rb中一者或二者不是氢，是如甲基，W是O，且R1、R2、R3全部以及R5和R5*之一是氢并且R5和R5*的另一个不是氢，是如C1-6烷基，如甲基。这类双修饰的LNA核苷在WO2010/077578中公开，所述文献因而通过引用的方式并入本文作为参考。
在一些实施方案中，双基–X-Y-指双价接头基团–O-CH(CH2OCH3)-(2’O-甲氧乙基双环核酸-Seth等人,2010,J.Org.Chem.Vol 75(5)第1569-81页)。在一些实施方案中，双基–X-Y-指双价接头基团–O-CH(CH2CH3)-(2’O-乙基双环核酸-Seth等人,2010,J.Org.Chem.Vol75(5)第1569-81页)。在一些实施方案中，双基–X-Y-是–O-CHRa-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。这类6’取代的LNA核苷在WO10036698和WO07090071中公开，所述文献均因而通过引用的方式并入本文作为参考。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–O-CH(CH2OCH3)-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。这类LNA核苷在本领域中也称作环状的MOE(cMOE)并在WO07090071中公开。
在一些实施方案中，双基–X-Y-指处于R构型或S构型的双价接头基团–O-CH(CH3)-。在一些实施方案中，双基–X-Y-一起指双价接头基团–O-CH2-O-CH2-(Seth等人,2010,J.Org.Chem)。在一些实施方案中，双基–X-Y-是–O-CH(CH3)-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。这类6’甲基LNA核苷在本领域也称作cET核苷并且可以是(S)cET或(R)cET立体异构体，如WO07090071(β-D)和WO2010/036698(α-L)中公开，所述文献均因而通过引用的方式并入本文作为参考。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–O-CRaRb-，其中Ra或Rb均不是氢，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。在一些实施方案中，Ra和Rb均是甲基。这类6’双取代的LNA核苷在WO2009006478中公开，所述文献因而通过引用的方式并入本文作为参考。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–S-CHRa-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。这类6’取代的硫代LNA核苷在WO11156202中公开，所述文献因而通过引用的方式并入本文作为参考。在某些6’取代的硫代LNA实施方案中，Ra是甲基。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–C(＝CH2)-C(RaRb)-，如–C(＝CH2)-CH2-或–C(＝CH2)-CH(CH3)-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。这类乙烯基羰LNA核苷(vinyl carboLNA nucleosides)在WO08154401和WO09067647中公开，所述文献均因而通过引用的方式并入本文作为参考。
在一些实施方案中，双基–X-Y-是–N(-ORa)-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基如甲基。这类LNA核苷也称作N取代的LNA并且在WO2008/150729中公开，所述文献因而通过引用的方式并入本文作为参考。在一些实施方案中，双基–X-Y-一起指双价接头基团–O-NRa-CH3-(Seth等人,2010,J.Org.Chem)。在一些实施方案中，双基–X-Y-是–N(Ra)-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基如甲基。
在一些实施方案中，R5和R5*中一者或二者是氢并且当取代时，R5和R5*的另一个是C1-6烷基如甲基。在这种实施方案中，R1、R2、R3可以全部是氢并且双基–X-Y-可以选自–O-CH2-或–O-C(HCRa)-如–O-C(HCH3)-。
在一些实施方案中，双基是–CRaRb-O-CRaRb-，如CH2-O-CH2-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基如甲基。这类LNA核苷也称作构象限制的核苷酸(CRN)并且在WO2013036868中公开，所述文献因而通过引用的方式并入本文作为参考。
在一些实施方案中，双基是–O-CRaRb-O-CRaRb-，如O-CH2-O-CH2-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部均是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基如甲基。这类LNA核苷也称作COC核苷酸并且在Mitsuoka等人,Nucleic Acids Research 2009 37(4),1225-1238中公开，所述文献因而通过引用的方式并入本文作为参考。
将认识到，除非具体说明，否则LNA核苷可以处于β-D或α-L立体同工型。
其他缺口聚物设计在WO2004/046160、WO2007/146511中公开并通过引用的方式并入本文作为参考。
本发明的一个方面是调节猪、灵长类或人UBE3A蛋白表达水平、尤其增加神经元细胞中、尤其人神经元细胞中父方UBE3A的表达。人UBE3A蛋白以列于Uniprot nr.Q05086之下的几种同工型存在。母方UBE3A基因中的几个突变可以导致Angelman综合征。
本发明这个方面的寡核苷酸的靶核酸是RNA、尤其非编码性长RNA。本发明寡核苷酸靶向的非编码性长RNA是人SNHG14(也称作UBE3A-ATS，Ensembl进入编号ENSG00000224078，版本GRCh38.p2)。特别地，靶核酸是SNORD109B下游与第15号染色体上位置25278410至25419462相对应的区域(SEQ ID NO:1)。在恒河猴中，UBE3A抑制物定义为使用Ensembl装配MMUL 1.0，SNORD109A下游与第7号染色体上位置4222848至4373084(正义链)相对应的区域(SEQ ID NO:2)。
在一些实施方案中，靶核酸是SEQ ID NO:1或其天然存在的变体。在某些实施方案中，靶核酸对应于人(SEQ ID NO:1)和恒河猴(SEQ ID NO:2)之间保守的区域。在某些实施方案中，靶核酸对应于人(SEQ ID NO:1)、恒河猴(SEQ ID NO:2)和小鼠(SEQ ID NO:3)之间保守的区域。
在某些实施方案中，靶核酸是与UBE3A前mRNA反义的区域，这个区域对应于SEQ IDNO:1的位置55319至141053。
在一些实施方案中，靶核酸存在于体外或体内的细胞，如哺乳动物细胞、尤其人细胞中(靶细胞)。在某些实施方案中，靶细胞是神经元，优选地是人神经元细胞。
靶序列可以是靶核酸的子序列。在一些实施方案中，寡核苷酸靶向子序列，其选自UBE3A的外显子9、外显子10、外显子13、外显子14、内含子14、外显子15、内含子15和外显子16的反义区。在一些实施方案中，寡核苷酸或连续核苷酸序列与选自SEQ ID NO:1的位置55319-76274、77483-77573、92157-93403和97056-97354的单链核酸分子杂交或互补。在一些实施方案中，寡核苷酸或连续核苷酸序列与选自SEQ ID NO:1的位置60821-60849、77567-77583、92323-92339和97156-97172的单链核酸分子杂交或互补。
具体实施方案
1.使用来自至少两种灵长类物种的均一分布的分化的神经细胞(NC)的标准化细胞培养物，确定候选药物体外功效特征的方法，其中分化的NC培养物胜任高通量筛选，所述方法包括步骤：
a)在约20天至约45天分化后将分化的NC从其支持物解离并以高通量细胞培养模式再接种分化的NC；
b)在分化培养基中温育再接种的NC；
c)使再接种的NC与候选药物接触；和
d)确定候选药物的体外功效特征。
2.根据实施方案1的方法，其中灵长类物种选自人(Homo sapiens)、食蟹猴和恒河猴(Macaca mulatta)。
3.根据实施方案1的方法，其中灵长类物种之一是人(Homo sapiens)。
4.根据实施方案1或2中任一者的方法，其中灵长类物种之一是食蟹猴。
5.实施方案1至4中任一者的方法，其中分化的NC衍生自诱导的多潜能干细胞(IPSC)。
6.根据实施方案1至5中任一者的方法，其中如通过细胞核染色所评估，分化的NC遍及细胞培养区域均匀分布。
7.根据实施方案1至6中任一者的方法，其中通过DNA染色，尤其通过Hoechst染色评估分化的NC的分布。
8.根据实施方案1至7中任一者的方法，其中步骤d)额外地包括监测细胞培养物的毒性迹象。
9.根据实施方案1至8中任一者的方法，其中步骤d)包括监测细胞培养物的表型改变，所述细胞培养物的表型改变指示候选药物的功效。
10.根据实施方案1至9中任一者的方法，其中确定的候选药物体外功效特征用于候选药物功效特征的物种间比较，其中从至少两种灵长类物种的细胞单独产生细胞培养物，其中基本上相同的条件应用于全部灵长类物种的培养物并且其中针对全部灵长类物种确定和比较功效特征。
11.用于选择候选药物用于进一步开发的方法，包括步骤：
(i)根据实施方案1至10中任一者的方法，对第一和第二物种确定候选药物的体外功效特征；和
(ii)如果候选药物的功效特征有利，则选择候选药物用于进一步开发。
12.根据实施方案11的方法，其中第一和第二物种之间的遗传相似性高，尤其超过90％。
13.根据实施方案11或12中任一者的方法，其中第一物种是食蟹猴并且第二物种是人(Homo sapiens)。
14.根据实施方案11至13中任一者的方法，其中候选药物包含核酸分子或靶向特定核酸序列。
15.根据实施方案11至14中任一者的方法，其中候选药物包含至少一种核酸分子如RNAi剂或反义寡核苷酸。
16.根据实施方案11至15中任一者的方法，其中进一步开发包括确定候选药物的体内功效和/或毒性特征。
17.用于确定候选药物潜在体内功效的方法，其中根据实施方案1至10中任一者而确定候选药物的体外功效特征并且其中体外功效特征指示体内功效。
18.根据实施方案17的方法，其中候选药物的体外功效特征指示在人(Homosapiens)中的体内功效。
19.根据实施方案17的方法，其中候选药物的体外功效特征指示在食蟹猴中的体内功效。
20.根据实施方案17至19的方法，其中在至少一个物种中确定体内功效特征。
21.根据实施方案17至20的方法，其中在食蟹猴中确定体内功效特征。
22.根据实施方案17至21中任一者的方法，其中确定的候选药物体外功效特征和/或体内功效特征指示在人(Homo sapiens)中的体内功效。
23.根据实施方案21的方法，其中食蟹猴中评估确定的候选药物体外功效特征和体内功效特征指示在人(Homo sapiens)中的体内功效。
24.根据实施方案1至23中任一者的方法，其中分化培养基是补充有20ng/mlBDNF、10ng/ml GDNF、0.5mM cAMP和100μM抗坏血酸磷酸酯的基础培养基。
25.根据实施方案1至24中任一者的方法，其中依次产生不同物种的细胞培养物。
26.基本上如本文所述的方法和用途。
如本文所述的任何实施方案可以单独或组合使用。以下实施例更详细地解释本发明。给出以下制备物和实施例以令本领域技术人员更清晰地理解并实施本发明。然而，本发明在范围方面不受例举的实施方案限制，所述实施方案仅意图作为本发明各个方面的说明，并且功能上等同的方法处于本发明的范围内。实际上，除了本文公开的那些改变之外，对本发明的各种改变将因先前描述和附图而对本领域技术人员显而易见。这类改变意在落于所附权利要求书的范围内。
实施例
材料和方法
表3:与SEQ ID NO:1互补的寡核苷酸或连续核碱基序列(以SEQ ID NO表示基序序列)、从这些序列产生的寡核苷酸设计、以及基于基序序列设计的特定寡核苷酸化合物(以CMP ID NO表示)的列表。
设计指缺口聚物设计F-G-F’，其中每个数字表示连续的修饰的核苷的数目，例如，2’修饰的核苷(第一个数字＝5’侧翼)，随后是DNA核苷的数目(第二个数字＝缺口区域)，随后修饰的核苷的数目，例如2’修饰的核苷(第三个数字＝3’侧翼)，任选地前置有或后接其他的DNA和LNA重复区域，这些区域不必是与靶核酸互补的连续序列的部分。
对于寡核苷酸化合物，大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母代表DNA核苷，全部LNA C均是5-甲基胞嘧啶，并且5-甲基DNA胞嘧啶由“e”展示，全部核苷间键均是硫代磷酸酯核苷间键。
寡核苷酸合成
本领域公知寡核苷酸合成。下文是可以应用的方案。可以通过就所用装置、支持物和浓度而言略微不同的方法产生本发明的寡核苷酸。
在MerMade12或寡聚制备物DNA/RNA合成仪上按1-4μmol规模，在尿苷通用支持物上使用磷酰亚胺方案合成寡核苷酸。在合成结束时，使用氨水在60℃持续5-16小时，从固相支持物切下寡核苷酸。通过反相HPLC(RP-HPLC)或通过固相提取纯化寡核苷酸并通过UPLC表征，并且通过ESI-MS进一步确认分子质量。
寡核苷酸的延伸：
通过使用乙腈中0.1M 5’-O-DMT保护的亚酰胺(amidite)溶液和乙腈中的DCI(4,5–二氰基咪唑)(0.25M)作为激活物，进行β-氰基乙基-磷酰亚胺(phosphoramidites)(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)、LNA-T或氨基-C6接头)的偶联。对于最终循环，可以使用具有所需修饰的磷酰亚胺，例如用于接合缀合物基团的C6接头或缀合物基团本身。通过使用(乙腈/吡啶9:1中的0.01M)氢化苍耳烷，实施用于引入硫代磷酸酯键的硫化。可以使用THF/吡啶/水7:2:1中的0.02M碘，引入磷酸二酯键。其余试剂是通常用于寡核苷酸合成的那些试剂。
RP-HPLC纯化：
在Phenomenex Jupiter C18 10μ150x10mm柱上通过制备性RP-HPLC纯化粗制化合物。以流速5mL/分钟使用0.1M乙酸铵pH 8和乙腈作为缓冲液。冻干收集的级分以产生一般为白色固体的纯化化合物。
缩写：
DCI：4,5-二氰基咪唑
DCM：二氯甲烷
DMF：二甲基甲酰胺
DMT：4,4’-二甲氧基三苯甲基
THF：四氢呋喃
Bz：苯甲酰基
Ibu：异丁酰基
RP-HPLC：反相高效液相色谱
Tm测定法
将寡核苷酸和RNA靶双链体在500ml无RNA酶水中稀释至3mM并且与500ml 2x Tm-缓冲液(200mM NaCl、0.2mM EDTA、20mM磷酸钠，pH 7.0)混合。将溶液加热到95℃持续3分钟并且随后允许在室温复性30分钟。在配备了使用PE Templab软件的Peltier温度编程器PTP6的Lambda 40UV/VIS分光光度计(Perkin Elmer)上测量双链体解链温度(Tm)。温度从20℃逐渐升高至95℃并且随后下降到25℃，记录在260nm的吸收。熔化和复性的一阶导数和局部最大值用来评估双链体Tm。
小鼠原代皮质神经元细胞培养物的制备
根据标准方法从15日龄小鼠胚胎脑制备原代皮质神经元培养物。简言之，将培养板用聚-L-赖氨酸(50μg/ml聚-L-赖氨酸、10mM四硼酸钠，pH 8缓冲液)在室温包被2-3小时。使用前，用1xPBS洗涤平板。将收获的小鼠胚胎脑通过剃须刀片剖分并均化并淹没入中38ml解剖培养基(HBSS，0.01M Hepes，青霉素/链霉素)。随后，添加2ml胰蛋白酶并将细胞在37℃温育30分钟并离心下来。将细胞溶解于20ml DMEM(+10％FBS)中并穿过注射器供进一步均化。这之后是500转/分钟离心15分钟。将细胞溶解于DMEM(+10％FBS)中并在96孔平板(100μl中0.1x 106个细胞/孔)中接种。神经元细胞培养物为接种后直接使用做好准备。
在小鼠原代皮质神经元细胞培养物中筛选寡核苷酸
将细胞在96孔板中的生长培养基(Gibco Neurobasal培养基、B27补充物、Glutamax、青霉素-链霉素)中培养并且按所需的浓度与寡核苷酸温育3天。从细胞分离总RNA，并且使用来自Quanta Bioscience的qScriptTMXLT One-Step RT-qPCRLow ROXTM试剂盒(95134-500)，通过qPCR分析测量敲减功效。来自Thermo FisherScientific的商业Taqman测定法用来测量Ube3a_ATS，包括测定GAPDH用于归一化。
人原代神经元细胞培养物的产生
任何细胞系在任何所述时间点均在37℃，5％CO2浓度和95％相对湿度温育。
人诱导的多潜能干细胞(hIPSC)培养物
从诊断患有Angelman综合征的患者获得人全血样品。对原代外周血单个核细胞(PBMC)的后续培养物富集成红细胞。通过用CytoTune-iPS仙台再编程试剂盒(ThermoFisher Scientific)再编程成红细胞，产生患者特异性IPSC系。在无饲养细胞条件下使用检定过hESC的基质胶(Corning)在mTESR1(STEMCELL Technologies)中维持衍生的IPSC系，每天更换培养基。一旦达到汇合，使用Gentle Cell Dissociation Reagent(STEMCELLTechnologies)，将集落解离成大小50-200μm的细胞团簇，并且按比率1:10–1:20在10μM Y-27632(Calbiochem)存在下继代培养。
分化成神经祖细胞(NPC)
一旦诱导神经分化，将IPSC衍生的细胞在基础培养基中维持，所述基础培养基包含等体积的DMEM:F12Glutamax培养基和Neurobasal培养基(Gibco,Invitrogen)，补充有1xB27(Gibco,Invitrogen)、1x N2(Gibco,Invitrogen)、0.1mMβ-巯基乙醇(Gibco,Invitrogen)和所示的补充物。
通过双重SMAD抑制作用并根据略微修改的已发表方法(Chambers等人，2009NatBiotechnol.Vol.3第275-80页；Boissart等人,2013Transl Psychiatry.3:e294)，从hIPSC衍生神经祖细胞(NPC)。将HIPSC用Accutase(Innovative Cell Technologies Inc.)解离成单细胞悬液并重悬于还补充有10μM Y-27632(Calbiochem)、5ng/ml FGF(Peprotech)、10μM SB-431542(Calbiochem)和100nM LDN(Calbiochem)的MT培养基中。将单细胞悬液转移至AggreWell800平板(STEMCELL Technologies)，使得由8000个细胞组成的聚集物的形成。在5天后，将神经聚集物转移到聚-L-鸟氨酸(Sigma)和层粘连蛋白(Roche)包被的平板上并允许其在持续双重SMAD抑制作用(SB-431542和LDN)下在补充有FGF的基础培养基中形成神经花结(neural rosettes)。使用STEMdiffTM神经花结选择试剂(STEMCELL Technologies)，选择性分离神经花结，再铺板到聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白521(BioLamina)包被的培养皿上并且在补充有10ng/ml FGF(Peprotech)、10ng/ml EGF(RnD)和20ng/ml BDNF(Peprotech)的基础培养基中扩充。当达到汇合时，用0.05％胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Invitrogen)酶促解离细胞并传代培养。在补充有FGF、EGF和BDNF的基础培养基中连续传代导致在10至20代内稳定的神经祖细胞系(NPC系)。稳定的神经祖细胞系由其自我更新能力和表达发育阶段特异性标志物Sox2和巢蛋白定义。一旦特异性刺激，NPC分化成神经元子代(MAP2+、Tau+、HuC/D+)和星形胶质子代(GFAP+)(Dunkley等人,2015Proteomics ClinAppl.Vol.7-8第684-94页)。
NPC培养物
先前已经描述用于NPC培养物的条件并且在略微修改下使用(Boissart等人,2013Transl Psychiatry.3:e294)。简言之，将细胞在层粘连蛋白521(BioLamina)包被的培养皿中维持并在补充有10ng/ml FGF(Peprotech)、10ng/ml EGF(RnD)和20ng/ml BDNF(Peprotech)的基础培养基[包含等体积的DMEM:F12Glutamax培养基和Neurobasal培养基(Gibco,Invitrogen)，补充有1x B27(Gibco,Invitrogen)、1x N2(Gibco,Invitrogen)、0.1mMβ-巯基乙醇(Gibco,Invitrogen)]中维持。
分化成神经元细胞培养物
为了诱导NPC的神经元分化，将细胞用0.05％胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Invitrogen)解离成单细胞悬液并以12000个细胞/cm2的密度接种到层粘连蛋白521(BioLamina)包被的培养皿上并且在补充有200ng/ml Shh(Peprotech)、100ng/ml FGF8(Peprotech)和100μM抗坏血酸磷酸酯(Sigma)的基础培养基中维持7天时间。随后，将细胞以45000个细胞/cm2的密度再铺板于补充20ng/ml BDNF(Peprotech)、10ng/ml GDNF(Peprotech)、0.5mM cAMP(BIOLOG Life Science)和100μM抗坏血酸磷酸酯(Sigma)的基础培养基中并分化21天时间。在分化第21天，将分化的神经元培养物以筛选相容性平板模式再铺板。通过将培养物用Accutase(Innovative Cell Technologies Inc.)解离成单细胞悬液，进行再铺板。将细胞以200000个细胞/cm2的密度在10μM Y-27632(来自Calbiochem的细胞可透过性、可逆性Rho激酶抑制剂)存在下接种入384孔微量滴定板，用于最终的寡核苷酸筛选测定法。将神经元培养物在补充有20ng/ml BDNF(Peprotech)、10ng/ml GDNF(Peprotech)、0.5mM cAMP(BIOLOG Life Science)和100μM抗坏血酸磷酸酯(Sigma)的基础培养基中进一步分化另外7天。每周更换分化培养基两次。在35天总分化期间后，神经元细胞培养物备用于寡核苷酸处理。
在人神经元细胞培养物中筛选寡核苷酸
为了筛选，将寡核苷酸母液用水预先稀释入384孔微量滴定板(化合物平板)至所示浓度。平板布局充当处理模板。来自每个孔的两微升寡核苷酸稀释液从化合物平板转移至相应的培养板。在无菌条件下在层流中使用半自动化实验室机器人系统(Beckmancoulter)进行全部液体操作。在不更换培养基的情况下，神经元细胞培养物与寡核苷酸温育5天。随后，用实时即用型细胞裂解和RNA病毒主试剂盒(Roche)裂解并处理神经元培养物用于qPCR测定法。使用半自动化实验室机器人系统(Beckmancoulter)执行液体操作。通过Lightcycler 480实时PCR系统(Roche)分析样品。
通过使用以下引物和探针监测UBE3A的转录物丰度的qPCR，评估寡核苷酸的活性
UBE3a-有义：正向引物：ATATGTGGAAGCCGGAATCT，
反向引物：TCCCAGAACTCCCTAATCAGAA，
FAM染料标记的内部探针：ATGACGGTGGCTATACCAGG
RT-qPCR以PPIA(肽酰基脯氨酰异构酶A)作为用于归一化的持家基因进行多路复合。染料VIC标记的PPIA引物和探针购自Thermo Fisher Scientific(测定法IDHs99999904_m1)。每块平板包括无靶向作用的寡核苷酸(模拟)作为阴性对照(TTGaataagtggaTGT)和导致UBE3A mRNA上调的参考寡核苷酸CMP ID NO:41_1。
通过计数器筛选位于第15号染色体上SNORD109B上游的SNORD 115转录物，验证寡核苷酸的选择性。通过使用以下引物和探针的qPCR监测SNORD115的表达
正向引物：GGGTCAATGATGAGAACCTTAT，
反向引物：GGGCCTCAGCGTAATCCTATT，
FAM染料标记的内部探针：TTCTGAAGAGAGGTGATGACTTAAAA
当寡核苷酸处理时，RT-qPCR以PPIA(Thermo Fisher Scientific)多路复合。
通过使用以下引物和探针的RT-qPCR，测量SNORD109B下游的SNHG14转录物(也称作UBE3A阻抑物)的减少
正向引物：ATCCGAGGCATGAATCTCAC，
反向引物：CAGGCCAAAACCCTTGATAA，
FAM染料标记的内部探针：TTGCTGAGCATTTTTGCATC)
RT-qPCR以PPIA(Thermo Fisher Scientific)多路复合。
数据表示为全部平板范围相对于模拟的平均表达％并且对参考寡核苷酸归一化以解释平板间变异
在人神经元细胞培养物中筛选寡核苷酸–96孔系统
为了筛选，将寡核苷酸母液用水预先稀释入96孔微量滴定板(化合物平板)至所示浓度。平板布局充当处理模板。来自每个孔的两微升寡核苷酸稀释液从化合物平板转移至相应的培养板。在无菌条件下在层流中使用半自动化实验室机器人系统(BeckmanCoulter)进行全部液体操作。在不更换培养基的情况下，神经元细胞培养物与寡核苷酸温育5天。随后，使用RNA纯化试剂盒Pure Link Pro96(12173011A)LifeTechnologies，对神经元培养物进行裂解和RNA纯化。使用半自动化实验室机器人系统(Beckmancoulter)执行液体操作。在ViiATM 7实时PCR系统Thermo Fisher Scientific上使用来自Quanta的qScriptTM XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix Low ROX(95134-50)，实施Ube3a和Ube3a-ATS的qPCR分析。
使用以下引物和探针：
qPCR UBE3a-有义：
正向引物：ATATGTGGAAGCCGGAATCT，
反向引物：TCCCAGAACTCCCTAATCAGAA，
FAM染料标记的内部探针：ATGACGGTGGCTATACCAGG
SNORD109B下游的qPCR SNHG14转录物(也称作UBE3A阻抑物)：
来自Thermo Fisher的市售引物和探针组：Hs01372957_m1。这些引物扩增了Genbank转录物AF400500.1中的一个87bp外显子-外显子跨越序列
QPCR GAPDH转录物：
来自Thermo Fisher的市售引物和探针组：基因符号：后续测定法细节：参考序列：NM_002046.3，探针外显子位置：3，扩增子大小：122bp。相应的TaqMan测定法ID：Hs99999905_m1。
Ube3a和Ube3a-ATS的RT-qPCR与GAPDH作为用于归一化的持家基进行多路复合。每块平板包括无靶向作用的寡核苷酸(模拟)作为阴性对照(TTGaataagtggaTGT)和导致UBE3AmRNA上调的参考寡核苷酸CMP ID NO:21_1。另外，包括不靶向SNORD109B下游的Ub3a或SNHG14转录物(也称作UBE3A阻抑物)的对照寡核苷酸组以监测测定法噪声和检出假阳性的风险。这些随机地分布遍及平板。
对照寡核苷酸：
序列
CGAaccactgaaCAA
CGAaccactgaacAAA
CGAagtgcacaCG
GCGtaaagagaGGT
GAGAaggcacagaCGG
GCGaagtgcacaCGG
GAGaaggcacagaCGG
CGAaccactgAACA
GAAccactgaacAAA
caGCGtaaagagaGG
GCgtaaagagAGG
CGAaccactgaAC
CGAAccactgaaCAAA
AGCgaagtgcacaCGG
AGGtgaagcgaAGTG
TAGTaaactgagCCA
AGAaggcacagaCGG
CCGcagtatggaTCG
产生食蟹猴原代神经元细胞培养物
任何细胞系在任何所述时间点均在37℃，5％CO2浓度和95％相对湿度温育。
食蟹猴诱导的多潜能干细胞(cIPSC)培养物
全部动物程序均根据美国国家卫生研究院指南执行并由附属于Roche340Kingsland Street Nutley NJ 07110,USA(2014关闭)的研究机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。使用携带Yamanaka因子(Oct4、Sox2、Klf4和C-Myc)(Takahashi,K.和Yamanaka,S.,2006)的仙台病毒粒子(CytoTune-iPS仙台再编程试剂盒,Thermo FisherScientific)，从来自一只雌性14岁毛里求斯食蟹猴的肾成纤维细胞建立食蟹猴IPSC。转染后五天，将细胞以不同密度传代到丝裂霉素C灭活的饲养细胞上并且在hESC培养基(补充有20％敲除血清替代物、0.1mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM 2-巯基乙醇和8ng/mlbFGF的敲除DMEM:F12，均来自Life Technologies)中培养。转染后二十天，选择具有ES样形态的克隆进一步传代。每3–4天通过手工解离集落，常规传代细胞。在至少10代后，cIPSC适应于根据Ono等人,2014连同下述修改的无饲养细胞培养条件(补充有15ng/ml FGF2(Peprotech)和10ng/ml活化素A(Peprotech)的MT培养基)：在基质胶(BD Bioscience)包被的平板上培养细胞，并且当细胞处于单细胞悬浮时，使用Y-27632(Calbiochem)替代Thiazovivin。MT培养基是确定成分培养基，其含有Dulbecco改良Eagle培养基连同Ham’sF12养分混合物(DMEM/F12)及2.5mM GlutaMAXTM、7μg/ml胰岛素、450μM一硫代甘油、1x脂质浓缩物、5mg/ml BSA、14ng/ml亚硒酸钠、1x非必需氨基酸、2mg/ml肝素、15μg/ml转铁蛋白和220μM抗坏血酸-2-磷酸酯。使用Gentle细胞解离试剂(Stem Cell Technologies)，每2–4天传代细胞。选择一个克隆供进一步实验并用于全部以下测定法。
分化成神经祖细胞(NPC)
一旦诱导神经分化，将cIPSC衍生的细胞(参见图4：第1天)在基础培养基中维持，所述基础培养基包含等体积的DMEM:F12Glutamax培养基和Neurobasal培养基(Gibco,Invitrogen)，补充有1x B27(Gibco,Invitrogen)、1x N2(Gibco,Invitrogen)、0.1mMβ-巯基乙醇(Gibco,Invitrogen)和所示的补充物。
通过双重SMAD抑制作用并根据略微修改的已发表方法(Chambers等人，2009NatBiotechnol.Vol.3第275-80页；Boissart等人,2013Transl Psychiatry.3:e294)，从cIPSC衍生神经祖细胞(NPC)。将食蟹猴IPSC用Accutase(Innovative Cell Technologies Inc.)解离成单细胞悬液并重悬于补充有10μM Y-27632(Calbiochem)的MT培养基中。将单细胞悬液转移至AggreWell800平板(STEMCELL Technologies)，使得由12000个细胞组成的聚集物的形成(参见图4：EB形成)。接下来连续五天，将1.5ml培养基/AggreWell更换为补充有5ng/ml FGF(Peprotech)、10μM SB-431542(Calbiochem)和100nM LDN-193189(Calbiochem)的基础培养基。在5天后，将神经聚集物转移到聚-L-鸟氨酸(Sigma)和层粘连蛋白(Roche)包被的平板上并允许其在持续双重SMAD抑制作用(SB-431542和LDN-193189)下在补充有FGF的基础培养基中形成神经花结(参见图4：收获)。通过手工剖分，选择性分离神经花结，此后再铺板到来自BioLamina的聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白521包被的培养皿上(参见图4：神经花结分离)并且在补充有10ng/ml FGF(Peprotech)、10ng/ml EGF(RnD)和20ng/ml BDNF(Peprotech)的基础培养基中扩充。当达到汇合时，用0.05％胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Invitrogen)酶促解离细胞并传代培养。在补充有FGF、EGF和BDNF的基础培养基中连续传代导致在5至10代内稳定的神经祖细胞系(NPC系)(参见图4，第24-45天)。稳定的神经祖细胞系由其自我更新能力和表达发育阶段特异性标志物Sox2和巢蛋白定义。一旦特异性刺激，食蟹猴NPC分化成神经元MAP2+细胞。
NPC培养物
先前已经描述用于NPC培养物的条件并且在略微修改下使用(Boissart等人,2013Transl Psychiatry.3:e294)。简言之，将细胞在层粘连蛋白521(BioLamina)包被的培养皿中维持并在补充有10ng/ml FGF(Peprotech)、10ng/ml EGF(RnD)和20ng/ml BDNF(Peprotech)的基础培养基[包含等体积的DMEM:F12Glutamax培养基和Neurobasal培养基(Gibco,Invitrogen)，补充有1x B27(Gibco,Invitrogen)、1x N2(Gibco,Invitrogen)、0.1mMβ-巯基乙醇(Gibco,Invitrogen)]中维持。
分化成神经元细胞培养物
为了诱导NPC的神经元分化，将细胞用0.05％胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Invitrogen)解离成单细胞悬液并以30000个细胞/cm2的密度接种到层粘连蛋白521(BioLamina)包被的培养皿上并且在补充有200ng/ml Shh(Peprotech)、100ng/ml FGF8(Peprotech)和100μM抗坏血酸磷酸酯(Sigma)的基础培养基中维持7天时间。随后，将细胞以45000个细胞/cm2的密度再铺板于补充有20ng/ml BDNF(Peprotech)、10ng/ml GDNF(Peprotech)、0.5mM cAMP(BIOLOG Life Science)和100μM抗坏血酸磷酸酯(Sigma)的基础培养基中并分化21天时间。在分化第21天，将分化的NC解离并且以筛选相容性平板模式再铺板。通过将培养物用Accutase(Innovative Cell Technologies Inc.)解离成单细胞悬液，进行再铺板。将细胞以200000个细胞/cm2的密度在10μM Y-27632(来自Calbiochem的细胞可透过性、可逆性Rho激酶抑制剂)存在下接种入384孔微量滴定板用于最终寡核苷酸筛选测定法。将神经元培养物在补充有20ng/ml BDNF(Peprotech)、10ng/ml GDNF(Peprotech)、0.5mM cAMP(BIOLOGLife Science)和100μM抗坏血酸磷酸酯(Sigma)的基础培养基中进一步分化另外7天。每周更换分化培养基两次。在35天总分化期间后，神经元细胞培养物备用于寡核苷酸处理。
在食蟹猴神经元细胞培养物中筛选寡核苷酸–96孔系统
为了筛选，将寡核苷酸母液用水预先稀释入96孔微量滴定板(化合物平板)至所示浓度。平板布局充当处理模板。来自每个孔的两微升寡核苷酸稀释液从化合物平板转移至相应的培养板。在无菌条件下在层流中使用半自动化实验室机器人系统(Beckmancoulter)进行全部液体操作。在不更换培养基的情况下，将神经元细胞培养物与寡核苷酸温育5天。随后，使用Pro96总RNA纯化试剂盒(Thermo Fisher)，裂解并纯化神经元培养物并且随后加工供采用qScript XLT One-Step RT-qPCR Tough Mix,Low ROX(QuantaBiosiences)的qPCR测定法。使用半自动化实验室机器人系统(Integra Assist andIntegra Viaflo)执行液体操作。通过Lightcycler 480实时PCR系统(Roche)分析样品。
通过使用以下引物和探针监测UBE3A-有义和UBE3A-反义的转录物丰度的qPCR，评估寡核苷酸的活性：
UBE3a-有义：HS00166580_VIC Taqman测定法(Thermo Fisher)
UBE3A-反义：HS01372957_VIC Taqman测定法(Thermo Fisher)
RT-qPCR以TBP(TATA框结合蛋白)作为用于归一化的持家基因进行多路复合。TBP引物和FAM标记探针购自Roche(REF.:05532957001，测定法ID.101145)。每块平板包括无靶向作用的寡核苷酸(模拟)作为阴性对照(TTGaataagtggaTGT)。
数据表示为相对于模拟处理条件的平均表达百分数。
免疫荧光染色
细胞用4％PFA固定并用PBS(含Ca2+和Mg2+)中的0.1％TritonX(Sigma)透化。使用补充有0.1％TritonX的SuperBlock溶液(Thermo Fisher Scientific)进行封闭。细胞用以下第一抗体染色：抗SOX2(Milipore AB5603)、抗GFAP(Dako Z033401)、抗HuC/D(Invitrogen A21271)、抗Nestin(Millipore mab5326)和抗Map2(Neuromics CH22103)。随后，洗涤细胞并用缀合至Alexa488、Alexa555或Alexa647的第二抗体(均来自MolecularProbes)染色。用Hoechst 1:1000(Molecular Probes)着染胞核。使用Axiovert显微镜(Zeiss)或Operetta大容量成像系统(Perkin Elmer)对细胞成像。使用ImageJ软件分析图像。
qPCR分析
使用miRNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)，从cIPSC、食蟹猴分化的NC、hESC和人分化的NC分离RNA并且进行qPCR分析(对于人细胞，使用Ag-Path-ID One-Step RT-PCR试剂盒，Ambion；对于食蟹猴细胞，使用Roche转录物第一链cDNA合成试剂盒进行逆转录并且使用LightCycler 480Probes Master,Roche)进行qPCR。使用以下引物和探针：对于人细胞：NESHs04187831_g1；MAP2Hs00258900_m1；ASCL1Hs00269932_m1；SOX2 Hs01053049_s1；ELAVL3Hs00154959_m1；GAPDH 4352665，均来自Thermo Fisher/Applied Biosystems；UBE3A-ATS正向引物：CAA ATG CCT CAC CCA CTC TT；反向引物：CCA GCT GTC AAC ATG TGCTT；内部寡聚物：AAG TGC GCT CCT GTG AAA AG；UBE3A正向引物：TCT GGG AAA TCG TTCATT CA；反向引物：TGT AGG TAA CCT TTC TGT GTC TGG，内部寡聚物：TAC AAC GGG CACAGA CAG A。对于食蟹猴细胞：NANOG测定法ID 700103、POU5F1测定法ID 113034、SOX2测定法ID 111867、NESTIN测定法ID 138150、PAX6测定法ID 136139、SOX1测定法ID 136988、ZIC1测定法ID 112077、ASCL1测定法ID 700027、TUBB3测定法ID 700047、GAPDH目录号N.04694333001、探针#147；TBP测定法ID 101145，均购自Roche。UBE3A-ATS正向引物：AATGCAAAGGCAGCAGTACA，反向引物：TTGGGGAGTTGGTTATTGGA，内部寡聚物：TGACACCACCAGAAGAACACA；
UBE3A有义：正向引物：ATATGTGGAAGCCGGAATCT，
Rv引物：TCCCAGAACTCCCTAATCAGAA，
内部寡聚物：ATGACGGTGGCTATACCAGG。
RNA测序分析
使用miRNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)进行RNA分离。使用TruSeq Stranded TotalRNA LT试剂盒(illumina)连同Ribo-Zero Gold消耗法进行文库制备。使用cBOT仪和HiSeqPE Cluster试剂盒v4进行簇生成。测序在HiSeq2500仪上作为双端单索引测序轮次(2x 125个循环)用以下试剂：HiSeq SBS Kit v4 250个循环(illumina)进行。
蛋白质印迹分析
对于蛋白质表达研究，通过刮擦和急冻收集细胞。使用补全有磷酸酶和蛋白酶抑制剂和DNA酶(均来自Roche)的Cytobuster(Millipore)，裂解沉淀物。通过BCA测定法(Thermo Scientific)测量提取物的蛋白质浓度并将溶液加载到聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上。在电泳后，使用iBlot系统(Invitrogen)，将蛋白质在硝酸纤维素膜上印迹。用来检测目的蛋白的抗体是抗hTau HT7(Pierce MN1000)、抗pTauS422(Roche)、抗pTauS404(Abcam ab92676)；通过HRP缀合的适宜第二抗体检测这些抗体。使用SuperSignalWest Dura Extended Duration Substrate(Thermo Fisher)，使用成像仪(Biorad)，通过发光检测复合物。
参考文献：
Ono,T.等人.A single-cell and feeder-free culture system for monkeyembryonic stem cells.PLoS One 9,e88346,doi:10.1371/journal.pone.0088346(2014).
Takahashi,K.&Yamanaka,S.Induction of pluripotent stem cells frommouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell 126,663–676,doi:10.1016/j.cell.2006.07.024(2006).
实施例1–小鼠原代神经元细胞培养物中的寡核苷酸活性。
对靶向与UBE3A前mRNA反义的SNHG14非编码性长RNA的组成部分(SEQ ID NO:1的位置55319至141053)的寡核苷酸测试其减少SNHG14非编码性长RNA转录物阻止UBE3A表达(数据表中也称作UBE3A阻抑物或UBE3A-SUP)的能力及其在如上文“材料和方法”部分中所述那样获得的小鼠原代皮质神经元细胞培养物中诱导UBE3A mRNA再表达的能力。寡核苷酸浓度是5μM。
根据“材料和方法”部分中描述的小鼠皮质神经元细胞培养物中的筛选方案，筛选寡核苷酸。表4中显示结果。
表4：原代小鼠神经元细胞培养物中的寡核苷酸活性。
实施例2–人神经元细胞培养物中的寡核苷酸活性。
在患者衍生的人神经元细胞培养物中测试了靶向SNORD109B下游与第15号染色体上位置25278410至25419462相对应的区域(SEQ ID NO:1)中的人SNHG14的寡核苷酸(参见“材料和方法”部分中的方案)。分析了寡核苷酸在不影响SNORD115表达的情况下减少SNORD109B下游区域中SNHG14转录物(数据表中也称作UBE3A阻抑物或UBE3A-SUP)的能力。另外，分析了诱导UBE3A mRNA再表达的能力。
根据上文“材料和方法”部分中描述的人神经元细胞培养物中筛选寡核苷酸的方案，筛选寡核苷酸。
表5中显示结果。已经对全部化合物测量了UBE3A mRNA表达，而尚未对全部化合物分析UBE3A阻抑物敲减作用和SNORD1115水平的维持情况。
表5：患者衍生的人神经元细胞培养物中的寡核苷酸活性。
测试的187种化合物当中，在5微摩尔浓度时与模拟寡核苷酸相比，大约90％显示再表达UBE3A。能够诱导UBE3A再表达的寡核苷酸的数目在SEQ ID NO:1的位置1至55318之间的区域(非重叠区域)内较高，随后在互补于UBE3A编码区的区域(重叠区域)内较高。相对于模拟寡核苷酸，图2将寡核苷酸根据其在第15号染色体上位置的分布对UBE3A mRNA表达作图。
对于测试SNORD115的寡核苷酸，与1和5μM的模拟相比时，不存在显著下调。
实施例3–食蟹猴神经元分化体外系统的产生和验证
遵循如材料和方法部分中所述和图4中描述的方案，诱导食蟹猴IPSC分化成NPC。该方案允许衍生可以在补充有FGF、EGF和BDNF的基础培养基中维持和扩充的NPC。为了验证对食蟹猴NPC的有效诱导，通过免疫染色评价神经干细胞标志物SOX2和NESTIN的表达(参见图5)。食蟹猴NPC表达SOX2和NESTIN，并且表达模式高度可比于人NPC。
为了衍生分化的NC，解离扩充的NPC并在SFA培养基中铺种一周。此后，将细胞暴露于分化培养基(BGAA)。为了评价食蟹猴NPC的神经元分化潜力，进行转录分析并且将结果与分化的人NPC的转录谱比较(参见图6)。在BGAA培养基中分化14天后，如果与cIPSC相比，食蟹猴培养物显示，多潜能性标志物如NANOG和POU5F1的表达减少并且外胚层标志物和神经元标志物如PAX6、SOX1、ZIC1、ASCL1、TUBB3的表达增加(参见图6A)。类似地，对BGAA中分化14天的人多潜能干细胞衍生NC的转录分析(图6B中RNA测序和图6C中qPCR)揭示如果与hESC相比，BGAA分化的第14天NC中多潜能性标志物的表达减少并且外胚层标志物和神经元标志物的表达增加。重要地，在分化的食蟹猴NC和人NC之间(涉及Angelman综合征的疾病基因)UBE3A表达和UBE3A-ATS(描述为在神经元中表达的非编码性转录物)的变化是可比较的(参见图6D)。这些数据显示，食蟹猴IPCS分化成NC并且特定标志物的表达谱类似于分化的人NC。
实施例4–分化的食蟹猴NC的解离和再接种
干细胞衍生的细胞具有巨大潜力作为药物筛选用体外系统，尤其如果相应的原代细胞类型不可获得或仅以有限量可获得，如神经元那样。但是，药物筛选需要稳健的细胞筛选系统，所述系统以合适的平板样式可获得。为此目的，我们测试了将衍生自NHP-IPSC的NPC分化成神经元细胞(NC)的不同策略。为了鉴定NC均匀分布的稳健细胞系统，将扩充的NPC以两种方式之一解离并暴露于分化培养基：将它们直接以最终测定模式铺种，或备选地，在细胞培养瓶中铺种细胞并且此后在进一步分化后解离并再接种成最终测定模式(参见图7)。在方法A和B中，将NPC在培养瓶中分化23天，然后解离并以测定模式再接种。在额外的7天分化时间后，用寡核苷酸处理细胞。备选地，在方法C和D中，将NPC解离并直接铺种在96孔平板上。方法A和C中的分化培养基补充了有丝分裂抑制剂混合物(尿苷35μg/ml和15μg/ml 5-氟-2'-脱氧尿苷)以抑制细胞增殖。在第35天，将培养物固定并针对神经祖细胞和胶质细胞标志物SOX2和神经元标志物MAP2染色(参见图8)。方法B(进行再铺板并且无有丝分裂抑制剂)导致细胞培养物分布更均匀连同MAP2阳性细胞及SOX2阳性细胞比其他方法中更少。出于这个原因，选择神经元分化方法B用于后续描述的寡核苷酸处理。
实施例5-分化的人NC的解离和再接种
如实施例4中所述，我们确立了，再铺板分化的食蟹猴神经元是令这些细胞可用于筛选目的的必需步骤。我们因此着手验证是否可能将相似方法用于人IPSC衍生的神经元。为此目的，遵循材料和方法部分中描述的方法，分化先前从二个IPSC系(ED4和SFC808)建立的神经祖细胞(NPC)。简而言之，解离扩充的NPC并在SFA培养基中铺种一周。此后，细胞以两种方式之一暴露于分化培养基(BGAA)：它们以测定模式直接铺种或在细胞培养瓶中铺种。在后一种情况下，将细胞分化21天并且随后解离并以测定模式再接种。将两个实验组(即，直接分化、或者解离和再接种)分化总计6周(分别是测定模式下6周、或者在烧瓶中3周和测定模式下3周)，之后处理。
对于第一组实验，通过免疫荧光法和大容量成像法分析神经元。使用的标志物对神经祖细胞(SOX2)、神经胶质细胞(GFAP)或神经元(MAP2和HuC/D)是特异的。如图9中例举，再铺板过程似乎不影响人IPSC衍生的神经元的分化或形态。通过定量染色进一步验证这点，所述定量染色显示在HuC/D阳性细胞存在下直接分化组和再铺板组中无显著差异(图10；对于ED4，p＝0.542，对于SFC808，p＝0.579)。
为了进一步证实在不改变其特征的情况下解离和再铺板分化的人IPSC衍生的神经元是可能的，我们想要证实细胞骨架相关蛋白不受解离过程扰动。我们分析了微管相关蛋白Τau的表达，因为它对神经元功能至关重要并直接涉及神经变性病如额颞叶痴呆和阿尔茨海默病。细胞如上文所述那样(进行和不进行解离和再接种)培养并且通过蛋白质印迹法分析蛋白质提取物。如图11中所示，Τau及其二种磷酸化形式的恒定表达证实再铺板令人惊讶地不扰动人IPSC衍生的神经元的细胞骨架特征，显示该过程不改变生理特征。
这些结果显示，人IPSC衍生的神经元可以在分化期间承受解离和再接种并且维持其关键特征，显示再铺板步骤(解离和再接种)可用于灵长类干细胞衍生神经元的分化。
实施例6-使用灵长类IPSC衍生的解离和再接种的分化的NC进行高通量筛选
上文描述的灵长类IPSC衍生的神经元培养物是可操作用于筛选目的的高度灵活和可重复的系统。我们开发了用寡核苷酸处理细胞并通过定量聚合酶链反应(qPCR)验证靶基因和相关基因表达的工作流程(参见图12)。为此目的，如上文所述处理人或食蟹猴神经祖细胞。为了筛选，将细胞在3周分化后解离并以200000个细胞/cm2的密度再接种于96孔平板中。在额外一周分化后，细胞用寡核苷酸处理5天并且随后处理供如材料和方法部分中所述的表达分析。这种方法允许恒定可获得以高通量方式待测试的样品。
对于这个实施例，我们在8个浓度利用5种靶向Ube3A反义(Ube3A_ATS)转录物的不同寡核苷酸，始于20μM并在每个步骤降低3倍，产生剂量20.000、6.325、2.000、0.632、0.200、0.063、0.020和0.006μM。我们对分化自Angelman综合征患者IPSC(人)或食蟹猴IPSC(食蟹猴)的神经元测试了这些化合物。
在处理后，裂解细胞，提取RNA并通过使用市售TaqMan测定法对Ube3A和Ube3A_ATS进行qPCR反应；利用人细胞中的GAPDH和食蟹猴细胞中的TBP作为持家基因以归一化表达数据。在全部情况下，处理导致Ube3A_ATS明显下降，这伴以有义转录物的表达增加。这种影响以剂量-反应方式显而易见；为了观察的简便性，我们在图13中报道了高剂量(2μM)和低剂量(0.02μM)时的表达水平。
在剂量2μM，反义转录物以载体(PBS)处理的细胞的约50％水平表达；这对人细胞和食蟹猴细胞均如此。敲减Ube3A_ATS导致Ube3A的表达增加，对人和食蟹猴分别增至约250％和约130％载体的水平。这种不一致性并不令人惊讶，因为患者衍生的神经元因Ube3A基因的一个等位体缺失而表达很低水平的有义转录物。
这些实验展示了针对人和食蟹猴神经元中Ube3A_ATS的寡核苷酸的靶接合作用。因此，所述的方法适于灵长类IPSC衍生的神经元中高通量筛选治疗性寡核苷酸。

Claims (16)

1.使用来自至少两种灵长类物种的均一分布的分化的神经细胞(NC)的标准化细胞培养物，确定候选药物体外功效特征的方法，其中所述分化的NC培养物胜任高通量筛选，所述方法包括步骤：
a)在约20天至约45天分化后将分化的NC从其支持物解离并以高通量细胞培养模式再接种分化的NC；
b)在分化培养基中温育再接种的NC；
c)使再接种的NC与候选药物接触；和
d)确定候选药物的体外功效特征。
2.根据权利要求1所述的方法，其中灵长类物种选自人(Homo sapiens)、食蟹猴(Macaca fascicularis)和恒河猴(Macaca mulatta)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中分化的NC衍生自诱导的多潜能干细胞(iPSC)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中如通过细胞核染色所评估，分化的NC遍及细胞培养区域均匀分布。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤d)额外地包括监测细胞培养物的毒性迹象。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤d)包括监测细胞培养物的表型改变，所述细胞培养物的表型改变指示候选药物的功效。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中确定的候选药物体外功效特征用于候选药物功效特征的物种间比较，其中分别从至少两种灵长类物种的细胞产生细胞培养物，其中基本上相同的条件应用于全部灵长类物种的培养物并且其中针对全部灵长类物种确定和比较功效特征。
8.用于选择候选药物用于进一步开发的方法，包括步骤：
(i)根据权利要求1至7中任一项所述的方法，确定候选药物对第一和第二物种的体外功效特征；和
(ii)如果候选药物的功效特征有利，则选择候选药物用于进一步开发。
9.根据权利要求8所述的方法，其中第一物种是食蟹猴并且第二物种是人。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中候选药物包含核酸分子或靶向特定核酸序列。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中候选药物包含至少一种核酸分子如RNAi剂或反义寡核苷酸。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中进一步开发包括确定候选药物的体内功效和/或毒性特征。
13.用于确定候选药物潜在体内功效的方法，其中根据权利要求1至7中任一项所述确定候选药物的体外功效特征并且其中体外功效特征指示体内功效。
14.根据权利要求13所述的方法，其中在食蟹猴中确定体内功效特征。
15.根据权利要求14所述的方法，其中确定的候选药物体外功效特征和/或体内功效特征指示在人中的体内功效。
16.基本上如本文所述的方法和用途。
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0923225A2 (pt) 2008-12-02 2016-10-04 Chiralgen Ltd metodo para sintese de acidos nucleicos modificados no atomo de fosforo
KR101885383B1 (ko) 2009-07-06 2018-08-03 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 신규한 핵산 프로드러그 및 그의 사용 방법
JP5868324B2 (ja) 2010-09-24 2016-02-24 株式会社Ｗａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｊａｐａｎ 不斉補助基
CN103796657B (zh) 2011-07-19 2017-07-11 波涛生命科学有限公司 合成官能化核酸的方法
SG11201500239VA (en) 2012-07-13 2015-03-30 Wave Life Sciences Japan Asymmetric auxiliary group
EP4219516A3 (en) 2012-07-13 2024-01-10 Wave Life Sciences Ltd. Chiral control
WO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
JPWO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
KR102423317B1 (ko) 2014-01-16 2022-07-22 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 디자인
WO2016086104A1 (en) 2014-11-25 2016-06-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of ube3a-ats expression
PE20210451A1 (es) 2015-11-12 2021-03-08 Hoffmann La Roche Oligonucleotidos para inducir la expresion paterna de ube3a
JP7297320B2 (ja) * 2017-12-01 2023-06-26 ザ テキサス エイ・アンド・エム ユニヴァーシティ システム アンジェルマン症候群アンチセンス治療
EP3752612A4 (en) 2018-02-12 2021-11-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. MODIFIED COMPOUNDS AND USES THEREOF
CN108795935B (zh) * 2018-05-23 2022-06-21 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 日本血吸虫SjELAV-like 1基因的siRNA及其应用
US20210332368A1 (en) * 2018-09-21 2021-10-28 University Of Connecticut Compositions and methods to restore paternal ube3a gene expression in human angelman syndrome
WO2020148310A1 (en) 2019-01-17 2020-07-23 F. Hoffmann-La Roche Ag E3 ubiquitin ligase (ube3a) protein targets
JOP20210261A1 (ar) * 2019-03-29 2023-01-30 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتعديل ube3a-ats
CA3139678A1 (en) * 2019-05-22 2020-11-26 The University Of North Carolina At Chapel Hill Ube3a genes and expression cassettes and their use
WO2020239714A1 (en) 2019-05-28 2020-12-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method to generate monocytic progenitor cells
EP4162047A1 (en) * 2020-06-09 2023-04-12 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Guanosine analogues for use in therapeutic polynucleotides
EP4282651A1 (en) 2021-01-21 2023-11-29 Fujimori Kogyo Co., Ltd. Layered film and packaging bag
WO2023217890A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antisense oligonucleotides targeting cfp-elk1 intergene region

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4373084A (en) 1981-07-07 1983-02-08 E. I. Du Pont De Nemours And Company Sulfur-modified polypropylene ether glycols, a method for preparing them, and polyurethanes prepared therefrom
JP2823959B2 (ja) 1991-10-24 1998-11-11 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 改良された取り込みおよびその他の性質を持つ誘導化オリゴヌクレオチド
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6617162B2 (en) 2001-12-18 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of estrogen receptor alpha expression
NZ503765A (en) 1997-09-12 2002-04-26 Exiqon As Bi-cyclic and tri-cyclic nucleotide analogues
US6238921B1 (en) 1998-03-26 2001-05-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of human mdm2 expression
WO2000040749A2 (en) * 1999-01-06 2000-07-13 Genenews Inc. Method for the detection of gene transcripts in blood and uses thereof
ID30093A (id) 1999-02-12 2001-11-01 Sankyo Co Analog-analog nukleosida dan oligonukleotida baru
JP2002543214A (ja) 1999-05-04 2002-12-17 エクシコン エ／エス Ｌ−リボ−ｌｎａ類縁体
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
CA2396460A1 (en) 1999-12-02 2001-06-07 Myriad Genetics, Inc. Protein-protein interactions
US6300132B1 (en) 1999-12-17 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of telomeric repeat binding factor 2 expression
AU2001268163A1 (en) * 2000-06-01 2001-12-11 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Haplotypes of the ube3a gene
US20030087855A1 (en) 2001-09-13 2003-05-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of protein kinase R expression
AU2002315393A1 (en) * 2001-06-21 2003-01-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
US20050124572A1 (en) * 2002-06-17 2005-06-09 Freier Susan M. Compositions and their uses directed to signal tranducers
WO2004016754A2 (en) 2002-08-14 2004-02-26 Pharmacia Corporation ANTISENSE MODULATION OF Nav1.3 EXPRESSION
EP1575498A2 (en) * 2002-09-25 2005-09-21 Pharmacia Corporation Antisense modulation of microsomal prostaglandin e2 synthase expression
DK2752488T3 (da) 2002-11-18 2020-04-20 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense-design
KR20060115351A (ko) 2003-08-29 2006-11-08 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 영장류 배아 줄기 세포 기원의 신경 줄기 세포, 운동 뉴런및 도파민 뉴런의 시험관내 분화 방법
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
EP1976567B1 (en) 2005-12-28 2020-05-13 The Scripps Research Institute Natural antisense and non-coding rna transcripts as drug targets
CA2640171C (en) 2006-01-27 2014-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
ES2471978T3 (es) 2006-05-05 2014-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compuestos y procedimientos para modular la expresión de ApoB
WO2007134181A2 (en) 2006-05-11 2007-11-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-modified bicyclic nucleic acid analogs
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
US8580756B2 (en) 2007-03-22 2013-11-12 Santaris Pharma A/S Short oligomer antagonist compounds for the modulation of target mRNA
PE20090064A1 (es) 2007-03-26 2009-03-02 Novartis Ag Acido ribonucleico de doble cadena para inhibir la expresion del gen e6ap humano y composicion farmaceutica que lo comprende
US8278425B2 (en) 2007-05-30 2012-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
EP2173760B2 (en) 2007-06-08 2015-11-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
CA2692579C (en) 2007-07-05 2016-05-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs
WO2009067647A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic alpha-l-bicyclic nucleic acid analogs
WO2009090182A1 (en) 2008-01-14 2009-07-23 Santaris Pharma A/S C4'-substituted - dna nucleotide gapmer oligonucleotides
DK2285819T3 (da) 2008-04-04 2013-12-02 Isis Pharmaceuticals Inc Oligomere forbindelser omfattende neutralt bundne, terminale bicykliske nukleosider
DK2356129T3 (da) 2008-09-24 2013-05-13 Isis Pharmaceuticals Inc Substituerede alpha-L-bicykliske nukleosider
US8642334B2 (en) * 2009-02-17 2014-02-04 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods of neural conversion of human embryonic stem cells
WO2011017521A2 (en) 2009-08-06 2011-02-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
CN102762718B (zh) 2009-10-13 2015-06-17 干细胞技术公司 用于分化干细胞的重量克分子渗透压浓度控制
EP2516648B1 (en) 2009-12-23 2017-11-08 CuRNA, Inc. Treatment of hepatocyte growth factor (hgf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to hgf
US8846637B2 (en) 2010-06-08 2014-09-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2′-amino and 2′-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
EP2593547B1 (en) 2010-07-14 2017-11-15 CuRNA, Inc. Treatment of discs large homolog (dlg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlg
EP2595664B1 (en) 2010-07-19 2018-10-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of nuclear-retained rna
EP2606126B1 (en) * 2010-08-19 2016-05-18 F.Hoffmann-La Roche Ag Conversion of somatic cells to induced reprogrammed neural stem cells (irnscs)
US9714427B2 (en) 2010-11-11 2017-07-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for unsilencing imprinted genes
WO2012068405A2 (en) 2010-11-17 2012-05-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of alpha synuclein expression
US9487752B2 (en) 2011-03-30 2016-11-08 Cellular Dynamics International, Inc. Priming of pluripotent stem cells for neural differentiation
AU2012244816B2 (en) 2011-04-20 2015-12-10 Roche Glycart Ag Method and constructs for the pH dependent passage of the blood-brain-barrier
EP2751270B1 (en) 2011-08-29 2018-08-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
WO2013036868A1 (en) 2011-09-07 2013-03-14 Marina Biotech Inc. Synthesis and uses of nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers
US9221864B2 (en) 2012-04-09 2015-12-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
ES2809199T3 (es) 2012-06-25 2021-03-03 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulación de la expresión de UBE3A-ATS
PL2920304T3 (pl) 2012-11-15 2019-07-31 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Koniugaty oligonukleotydowe
WO2014077693A1 (en) 2012-11-16 2014-05-22 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Means and methods for reducing an effect of aging in a mammalian cell
WO2015143342A1 (en) * 2014-03-21 2015-09-24 Cellular Dynamics International, Inc. Production of midbrain dopaminergic neurons and methods for the use thereof
PE20210451A1 (es) 2015-11-12 2021-03-08 Hoffmann La Roche Oligonucleotidos para inducir la expresion paterna de ube3a
WO2019006107A1 (en) 2017-06-28 2019-01-03 University Of South Florida MODIFIED UBE3A GENE FOR GENE THERAPY APPROACH TO ANGELMAN'S SYNDROME
JP7297320B2 (ja) 2017-12-01 2023-06-26 ザ テキサス エイ・アンド・エム ユニヴァーシティ システム アンジェルマン症候群アンチセンス治療
AU2019212849B2 (en) 2018-01-26 2024-02-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Radiolabelled oligonucleotides and process for their preparation
JOP20210261A1 (ar) 2019-03-29 2023-01-30 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتعديل ube3a-ats

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EFTHYMIOU A: "Functional screening assays with neurons generated from pluripotent stem cell-derived neural stem cells", 《JOURNAL OF BIOMOLECULAR SCREENING SOCIETY FOR LABORATORY AUTOMATION AND SCREENING》 *
JUN CUI等: "Quantification of dopaminergic neuron differentiation and neurotoxicity via a genetic reporter", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
LEONARDO D"AIUTO等: "Large-scale generation of human iPSC-derived neural stem cells/early neural progenitor cells and their neuronal differentiation", 《ORGANOGNESIS》 *
RICHARD L.CARTER等: "Reversal of Cellular Phenotypes in Neural Cells Derived from Huntington"s Disease Monkey-Induced Pluripotent Stem Cells", 《STEM CELL REPORTS》 *
TOM DUNKLEY等: "Chatacterization of a human pluripotent stem cell-derived model of neuronal development using multiplexed targeted proteomics", 《PROTEOMICS-CLINICAL APPLICATIONS》 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2020203573A1 (en) 2020-06-18
HRP20210227T1 (hr) 2021-03-19
PE20210451A1 (es) 2021-03-08
US20200348286A1 (en) 2020-11-05
EP3374509A1 (en) 2018-09-19
JP2018533362A (ja) 2018-11-15
NZ741585A (en) 2024-01-26
PE20181157A1 (es) 2018-07-19
US20190154664A1 (en) 2019-05-23
LT3374509T (lt) 2021-03-10
ES2852998T3 (es) 2021-09-14
KR20230008233A (ko) 2023-01-13
US20200057052A1 (en) 2020-02-20
US20240085402A1 (en) 2024-03-14
AU2016352836A1 (en) 2018-04-26
US20220146496A1 (en) 2022-05-12
RS61529B9 (sr) 2024-04-30
IL281211B2 (en) 2024-01-01
KR20180070611A (ko) 2018-06-26
US10718753B2 (en) 2020-07-21
US11320421B2 (en) 2022-05-03
AU2023200410A1 (en) 2023-02-23
US11852627B2 (en) 2023-12-26
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DK3374509T3 (da) 2021-02-15
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MX2022016377A (es) 2023-01-30
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WO2017081223A1 (en) 2017-05-18
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