JP7066609B2 - 霊長類種に由来する標準化された神経細胞アッセイ - Google Patents
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Description
この特許出願は、例えば薬物候補のハイスループットスクリーニングに適した、標準化されたロバストな神経細胞培養アッセイを霊長類種から作るための方法に関する。本方法は、ヒトおよび/または非ヒト霊長類の神経前駆細胞(NPC)を神経細胞(NC)に分化させる工程、ならびに分化NCに対して行われる解離および再播種工程に基づいて一様なNC培養物を作製することで、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングするための、ハイスループット薬物スクリーニングアッセイに適したロバストな培養物をもたらす工程を含む。
中枢神経系(CNS)の疾患を含むさまざまな疾患の病態生理を呈する多様な細胞タイプまたは細胞培養モデルに基づくハイスループットスクリーニングアッセイは、開発の初期に薬物候補の有効性プロファイルおよび毒性プロファイルを評価するために、広く使用されている。限られたタイプの細胞への制約または胚性幹細胞に由来する細胞への制約は、体細胞から多能性細胞を生成させるプロトコールの確立により、過去十年間で克服された。山中ら(Takahashi, K. & Yamanaka, S. Cell. 2006; 126:663-676(非特許文献1))が体細胞を人工多能性幹細胞(IPSC)へとリプログラムできることを実証して以来、さまざまな細胞供給源から多能性細胞を生成させることが可能になった。線維芽細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞および血球を含む、異なるタイプの体細胞がIPSC多能性状態へとリプログラムされている。さらに最近になって、特別な体細胞タイプを、ニューロンなどの全く異なる体細胞タイプへと分化転換することができた。Vierbuchenらは、3つの決定的な遺伝子: Mash1、Brn2およびMyt1lの形質導入による、機能的ニューロンへのマウス線維芽細胞の直接変換を実証した(Vierbuchen et al. Nature. 2010; 463:1035-41(非特許文献2))。注目すべきことに、US2010/0021437(特許文献1)には、線維芽細胞から人工多能性幹細胞を作製し、それらの細胞をNPCに分化誘導するための方法が開示されている。さらに最近になって、NPCへの分化体細胞の直接変換が記載されている(WO2012/022725(特許文献2))。そのような神経細胞は、さまざまなCNS疾患の病態生理をモデル化するための貴重なツールであると考えられる。
(a)神経前駆細胞(NPC)を用意する工程;
(b)NPCをNCに分化させる工程であって、以下を含む、工程:
(i)約20日~約45日の分化後に、分化NCをその支持体から解離する工程;および
(ii)前記細胞を適切な細胞培養フォーマットで再播種し、約4日~約15日にわたってNCの分化を継続する工程。
[本発明1001]
一様に分布した分化神経系細胞(NC)の標準化された細胞培養物を異なる霊長類種から作製するためのインビトロ法であって、以下を含む方法:
(a)神経前駆細胞(NPC)を用意する工程;
(b)NPCを神経系細胞(NC)に分化させる工程であって、以下を含む、工程:
(i)約20日~約45日の分化後に、分化NCをその支持体から解離する工程;および
(ii)前記細胞を適切な細胞培養フォーマットで再播種し、約4日~約15日にわたってNCの分化を継続する工程。
[本発明1002]
霊長類種が、ヒト(ホモ・サピエンス(Homo sapiens))、カニクイザル(マカカ・ファシキュラリス(Macaca fascicularis))およびアカゲザル(マカカ・ムラタ(Macaca mulatta))からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
分化NCの標準化された細胞培養物が2つの霊長類種について個別に作製され、第1の霊長類種がヒト(ホモ・サピエンス)であり、第2の霊長類種がカニクイザル(マカカ・ファシキュラリス)である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
NPCが人工多能性幹細胞(IPSC)に由来する、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
工程(b)(i)が、Shh、FGF8およびアスコルビン酸リン酸エステルを含む基本培地中で細胞を約5~約10日間にわたって培養した後、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステルを含む基本培地中で細胞をさらに約15日~約35日間にわたって培養してから、分化NCをその支持体から解離することを含む、本発明1001~1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
工程(b)(i)が、細胞剥離溶液で細胞を解離することを含む、本発明1001~1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
細胞剥離溶液がAccutaseである、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記細胞が96ウェルプレートまたは384ウェルプレートに再播種される、本発明1001~1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
工程(b)(ii)が、前記細胞を再播種した後に、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸を補足した基本培地中で細胞を培養することによって、分化を継続することを含む、本発明1001~1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
分化NCが、細胞核染色で評価した場合に、細胞培養エリア上に本質的に一様に分布している、本発明1001~1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
薬物候補の毒性のインビトロ試験のための、本発明1001~1010のいずれかに従って得られた細胞培養物の使用。
[本発明1012]
薬物候補の有効性のインビトロ試験のための、本発明1001~1010のいずれかに従って得られた細胞培養物の使用。
[本発明1013]
薬物候補を選択するための、特に、さらなる開発のために薬物候補を選択するための、本発明1001~1010のいずれかに従って得られた細胞培養物の使用。
[本発明1014]
薬物候補がポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドの特異的配列を標的とする、本発明1011~1013のいずれかの使用のための細胞培養物。
[本発明1015]
薬物候補が少なくとも1種類の核酸分子、例えばRNAi作用物質またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、本発明1011~1013のいずれかの使用のための細胞培養物。
[本発明1016]
本質的に、本明細書に記載するとおりである、方法および使用。
(図2)実施例2で試験したオリゴヌクレオチドの、ヒト神経細胞培養物におけるUBE3Aの再発現を誘発する能力を図示している。ヒトSNHG14長鎖ノンコーディングRNAのうち、SNORD109BとUBE3Aコーディング領域上流の領域との間にある領域(SEQ ID NO:1の位置1~55318)に相補的なオリゴヌクレオチドは、
非オーバーラップで示されている。UBE3AプレmRNAに対してアンチセンスであるヒトSNHG14長鎖ノンコーディングRNAの領域(SEQ ID NO:1の位置55319~141053)に相補的なオリゴヌクレオチドは、
オーバーラップで示されている。ヒトおよびアカゲザルに保存されている表3のオリゴヌクレオチドは、各プロットの下に
で示されている。ヒト:アカゲザル:マウス間での保存は
で示されている。オリゴヌクレオチド濃度は、各プロットの右側に示されているとおり、0.2、1および5μMであった。
(図3)ヒトで薬物有効性を評価する前に、まず霊長類インビトロ細胞培養モデルで、次に霊長類種でのインビボ研究で、薬物候補の有効性を評価するための、スクリーニング戦略の模式図。カニクイザルとヒトのIPSC由来ニューロンを、UBE3Aアンチセンスを標的とするオリゴヌクレオチドのターゲット・エンゲージメントおよび有効性を評価するためのインビトロモデルとして使用する。インビボ研究に先だって、好ましい有効性プロファイルを持つ候補に優先順位を付ける。
(図4)カニクイザルIPSCから神経系始原細胞を誘導するために実行されるさまざまな工程の概観。霊長類IPSC株の神経化には二重SMAD阻害プロトコールの変法を使用する。MTはMT培地を指し、N2B27+SB+LDNはSB-431542およびLDN-193189を補足したN2B27培地を指し、N2B27+FEBはFGF、EGFおよびBDNFを補足したN2B27培地を指す。
(図5)カニクイザルおよびヒトの神経系前駆体は、Sox2およびネスチンに関して陽性のよく似た染色、およびMap2に関して陽性の各分化ニューロン染色を呈する。
(図6)適用された定方向分化方法は、同等な、異種間でのニューロン分化を誘発する。(図5A)カニクイザルIPSCを、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステル(BGAA)を補足した基本培地中で、14日間分化させた。カニクイザルIPSCおよび14日目のNCからRNAを単離し、表示したマーカーの発現をqPCRによって分析した。データをハウスキーピング遺伝子GAPDHに対応させて正規化し、カニクイザルIPSCにおける発現レベルとの比として表す。(図5B)ヒトPSCと、BGAAを補足した基本培地中で14日にわたって分化させたヒトNCとから、RNAを単離し、表示したマーカーの発現をRNAシーケンシングによって分析した。データをRPKM値として表す。(図5C)ヒトPSCと、BGAAを補足した基本培地中で14日間分化させたヒトNCとから、RNAを単離し、表示したマーカーの発現をqPCRによって分析した。データをハウスキーピング遺伝子GAPDHに対応させて正規化し、ヒトPSCにおける発現レベルとの比として表す。(図5D)BGAAを補足した基本培地中で14日間分化させたカニクイザルNC(左パネル)およびヒトNC(右パネル)からRNAを単離し、UBE3A転写産物およびUBE3A-ATS転写産物の発現をqPCRによって分析した。左パネル:データをハウスキーピング遺伝子TBPに対応させて正規化し、カニクイザルIPSCとの比として表す。右パネル:データをハウスキーピング遺伝子GAPDHに対応させて正規化し、ヒトPSCとの比として表す。
(図7)化合物スクリーニングに適する、カニクイザル神経系前駆体からロバストなニューロン培養物を得るための4つの分化方法(A~D)を比較するための実験レイアウトの模式的描写。MIは有糸分裂阻害剤を指す。
(図8)図7に記載する4つのニューロン分化方法の画像ベースの比較。分化の35日目にNCを固定し、マゼンタで描写されるSox2(グリアおよびNSCのマーカー)および緑色で描写されるMap2(NCのマーカー)について染色した。
(図9)ヒトiPSC由来分化NCの解離および再播種の実行可能性を試験するために、2つの細胞株を並行して分化させた。それぞれについて、細胞を6週間にわたって直接(すなわち再プレーティングなしで)分化させるか、21日目に解離し、再播種してから、さらに3週間にわたって培養した。ニューロンマーカー(MAP2)およびグリアマーカー(GFAP)に関する免疫蛍光染色は、解離および再播種(再プレーティング)が、細胞の分化能を妨害しないことを示している。
(図10)解離および再播種(再プレーティング)ありならびになしでの、2つの異なるiPSC由来細胞株における分化の程度の定量。HuC/Dは、ニューロンによって発現されるマーカーであり、これを、合計6週にわたって分化させた培養物において、免疫蛍光染色によって検出し、ハイコンテントイメージングによって定量した。このデータは、再プレーティングがニューロン分化の程度を有意に変化させないことを示している。
(図11)微小管関連タンパク質タウおよびそのリン酸化型のうちの2つの発現を分析した。2つの細胞株における発現およびリン酸化の程度が再プレーティングの有無によって変化しないことは、再プレーティング(解離および再播種)がヒトiPSC由来NCの細胞骨格特徴を破壊しないことを証明しており、生理学的特徴はNCを解離し再播種することによって改変されないことが示唆される。
(図12)ハイスループットフォーマットにおけるスクリーニングのためのロバストな霊長類ニューロン培養物の安定的な供給を可能にするワークフローの模式的図解。SFAは、Shh、FGF8およびアスコルビン酸リン酸エステルを補足した基本培地を指し、BGAAは、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステルを補足した基本培地を指し、矢印は解離および再播種(再プレーティング)を表す。
(図13)ヒトおよびカニクイザルに由来する一様に分布した神経系細胞(NC)の標準化された細胞培養物での、試験した化合物のターゲット・エンゲージメント。ヒトでのターゲット・エンゲージメントが知られているUBE3Aアンチセンス転写産物(アンチセンス)に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、2つの濃度(低: 0.02μM; 高: 2μM)で試験した。AおよびBにおけるカニクイザルに由来するNC培養物は、CおよびDにおけるヒトに由来するNC培養物と比較して同等なターゲット・エンゲージメントを呈する。カニクイザルNCおよびヒトNCを表示の濃度で処理すると、UBE3A転写産物(センス)のアップレギュレーションを伴って、UBE3Aアンチセンス転写産物の低減が起こる。細胞培養物は図12に含まれるワークフローに従って作製した。
本明細書において使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸にハイブリダイズすることによって、特に標的核酸上の連続した配列にハイブリダイズすることによって、標的遺伝子の発現を調節する能力を有するオリゴヌクレオチドと定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、それゆえにsiRNAではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。
(a)神経前駆細胞(NPC)を用意する工程、ならびに
(b)以下を含む、NPCをNCに分化させる工程:
(i)分化の20日目と45日目との間に分化NCをその支持体から解離させる工程、および
(ii)細胞を適切な細胞培養フォーマットで再播種し、4~15日にわたってNCの分化を継続する工程。
一様に分布した分化ニューロンの細胞培養物をヒト(ホモ・サピエンス)およびカニクイザル(マカカ・ファシキュラリス)から個別に作製する工程であって、以下を含む、工程:
(a)ヒトおよびカニクイザルの両方について個別に、IPSCに由来する神経前駆細胞(NPC)を、約30000細胞/cm2の密度で用意する工程;
(b)前記NPCを神経系細胞(NC)に分化させる工程であって、以下を含む、工程:
(i)前記NPCを、Shh、FGF8およびアスコルビン酸リン酸エステルを補足した基本培地と共に、約7日にわたってインキュベートし、前記細胞を約45000細胞/cm2の密度で再プレーティングし、再プレーティングされた細胞を、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステルを補足した基本培地と共に、約21日~約23日にわたってインキュベートした後、分化NCをその支持体から解離する工程、および
(ii)前記細胞を、約200000細胞/cm2の密度で、個別に、適切な細胞培養フォーマットで再播種し、細胞をBDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸を補足した基本培地と共にインキュベートすることによりNCの分化を約7日にわたって継続した後、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸を補足した基本培地に加えた薬物候補と共に細胞を約5日にわたってインキュベートする工程;ならびに
ヒトおよびカニクイザルの両方で薬物候補の有効性プロファイルを確立する工程;ならびに
有効性プロファイルが好ましければ、さらなる開発のために薬物候補を選択する工程。
一態様において、有効性プロファイルを確立する工程は、ターゲット・エンゲージメントを評価する工程を含む。一態様において、さらなる開発は、NHP種における薬物候補のインビボ試験および/またはヒトにおけるインビボ試験を含む。
(a)約20日間~約45日間の分化後に、分化NCをその支持体から解離し、該分化NCをハイスループット細胞培養フォーマットで再播種する工程、
(b)再播種されたNCを分化培地中でインキュベートする工程;
(c)再播種されたNCを薬物候補と接触させる工程;および
(d)薬物候補のインビトロ有効性プロファイルを決定する工程。
式中、
Wは、-O-、-S-、-N(Ra)-、-C(RaRb)-から選択され、例えばいくつかの態様では-O-であり;
Bは、核酸塩基部分または修飾核酸塩基部分を示し;
Zは、隣接ヌクレオシドへのヌクレオシド間連結、または5'末基を示し;
Z*は、隣接ヌクレオシドへのヌクレオシド間連結または3'末基を示し;
Xは、-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、-(Ra)=N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-、および>C=Zからなるリストより選択される基を示す。
1.一様に分布した分化神経系細胞(NC)の標準化された細胞培養物を異なる霊長類種から作製するためのインビトロ法であって、以下を含む、方法:
(a)神経前駆細胞(NPC)を用意する工程;
(b)NPCを神経系細胞(NC)に分化させる工程であって、以下を含む、工程:
(i)約20日~約45日の分化後に、分化NCをその支持体から解離する工程;および
(ii)前記細胞を適切な細胞培養フォーマットで再播種し、約4日~約15日にわたってNCの分化を継続する工程。
2.霊長類種が、ヒト(ホモ・サピエンス)、カニクイザル(マカカ・ファシキュラリス)およびアカゲザル(マカカ・ムラタ)からなる群より選択される、態様1の方法。
3.霊長類種が、ヒト(ホモ・サピエンス)およびカニクイザル(マカカ・ファシキュラリス)からなる群より選択される、態様1の方法。
4.分化NCの標準化された細胞培養物が2つの霊長類種について個別に作製され、第1の霊長類種がヒト(ホモ・サピエンス)であり、第2の霊長類種がカニクイザル(マカカ・ファシキュラリス)である、態様1の方法。
5.NPCが人工多能性幹細胞(IPSC)に由来する、態様1~4のいずれか一態様の方法。
6.工程(b)が、Shh、FGF8、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステルからなる群より選択される1種類または複数種類の分化作用物質と共にNPCを培養することを含む、態様1~5のいずれか一態様の方法。
7.工程(b)(i)が、Shh、FGF8およびアスコルビン酸リン酸エステルを含む基本培地中で細胞を約5~約10日間にわたって培養した後、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステルを含む基本培地中で細胞をさらに約15日~約35日間にわたって培養してから、分化NCをその支持体から解離することを含む、態様1~6のいずれか一態様の方法。
8.基本培地中の前記1種類または複数種類の分化作用物質の濃度が、Shhについて50~500ng/ml、FGF8について25~250ng/ml、BDNFについて1~50ng/ml、GDNFについて1~50ng/ml、cAMPについて0.1~10mM、およびアスコルビン酸リン酸エステルについて20~200μMである、態様6または7の方法。
9.基本培地中の前記1種類または複数種類の分化作用物質の濃度が、Shhについて200ng/ml、FGF8について100ng/ml、BDNFについて20ng/ml、GDNFについて10ng/ml、cAMPについて0.5mM、およびアスコルビン酸リン酸エステルについて100μMである、態様6~8のいずれか一態様の方法。
10. Shh、FGF8およびアスコルビン酸リン酸エステルとの培養期間が約7日であり、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステルとの培養期間が約20~約40日である、態様6~9のいずれか一態様の方法。
11. NPCがラミニン521支持体上に用意される、態様1~10のいずれか一態様の方法。
12.工程(b)(i)が、細胞剥離溶液で細胞を解離することを含む、態様1~11のいずれか一態様の方法。
13.細胞剥離溶液がAccutaseである、態様12の方法。
14.工程(b)(ii)が、ラミニン521支持体上に200000細胞/cm2で細胞を再播種することを含む、態様1~13のいずれか一態様の方法。
15.前記細胞が96ウェルプレートまたは384ウェルプレートに再播種される、態様1~14のいずれか一態様の方法。
16.工程(b)(ii)がROCK阻害剤の存在下で細胞を再播種することを含む、態様1~15のいずれか一態様の方法。
17.ROCK阻害剤がY-27632である、態様16の方法。
18.工程(b)(ii)が、細胞を再播種した後に、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸を補足した基本培地中で細胞を培養することによって、分化を継続することを含む、態様1~17のいずれか一態様の方法。
19.分化NCがMAP2を発現する、態様1~18のいずれか一態様の方法。
20.分化NCがMAP2陽性神経突起を含む、態様1~19のいずれか一態様の方法。
21.NPCがニューロン障害を持つ個体に由来する、態様1~20のいずれか一態様の方法。
22.NPCが健常個体に由来する、態様1~21のいずれか一態様の方法。
23.細胞培養物が異なる種から逐次的に作製される、態様1~22のいずれか一態様の方法。
24.前記細胞が、細胞核染色で評価した場合に、細胞培養エリア上に本質的に一様に分布している、態様1~23のいずれか一態様の方法。
25.細胞の分布がDNA染色、特にヘキスト染色によって評価される、態様1~24のいずれか一態様の方法。
26.態様1~25のいずれか一態様の方法によって得られる細胞培養系。
27.薬物候補の毒性のインビトロ試験のための、態様1~26のいずれか一態様に従って得られた細胞培養物の使用。
28.薬物候補の有効性のインビトロ試験のための、態様1~27のいずれか一態様に従って得られた細胞培養物の使用。
29.前記有効性が、態様21の方法に由来する細胞培養物および態様22の方法に由来する細胞培養物において試験される、態様28の使用。
30.薬物候補を選択するための、特に、さらなる開発のために薬物候補を選択するための、態様1~25のいずれか一態様に従って得られた細胞培養物の使用。
31.薬物候補がポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドの特異的配列を標的とする、態様27~30のいずれか一態様の使用のための細胞培養物。
32.薬物候補が少なくとも1種類の核酸分子、例えばRNAi作用物質またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、態様27~31のいずれか一態様の使用のための細胞培養物。
33.前記核酸分子が、2'-O-アルキル-RNA、2'-O-メチル-RNA、2'-アルコキシ-RNA、2'-O-メトキシエチル-RNA、2'-アミノ-DNA、2'-フルオロ-DNA、アラビノ核酸(ANA)、2'-フルオロ-ANA、およびLNAヌクレオシドからなる群より独立して選択される1つまたは複数の2'糖修飾ヌクレオシドを含む、態様32の使用のための細胞培養物。
34.前記1つまたは複数の2'糖修飾ヌクレオシドがLNAヌクレオシドである、態様33の使用のための細胞培養物。
35.LNAヌクレオシドが、ベータ-D-オキシ-LNA、アルファ-L-オキシ-LNA、ベータ-D-アミノ-LNA、アルファ-L-アミノ-LNA、ベータ-D-チオ-LNA、アルファ-L-チオ-LNA、(S)cET、(R)cET、ベータ-D-ENAまたはアルファ-L-ENAから選択される、態様34の使用のための細胞培養物。
36.前記核酸分子が少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間連結を含む、態様32~35のいずれか一態様の使用のための細胞培養物。
37.連続したヌクレオチド配列内のヌクレオシド間連結がホスホロチオエートヌクレオシド間連結である、態様36の使用のための細胞培養物。
38.アンチセンスオリゴヌクレオチドがRNase Hを動員する能力を有する、態様32~37のいずれか一態様の使用のための細胞培養物。
39.アンチセンスオリゴヌクレオチドがギャップマーである、態様32~38のいずれか一態様の使用のための細胞培養物。
40.前記オリゴヌクレオチドが式5'-F-G-F'-3'のギャップマーであり、式中、領域FおよびF'は、独立して1~7個の修飾ヌクレオシドを含み、Gは、RNaseHを動員する能力を有する6~16ヌクレオシドの領域である、態様38または39の使用のための細胞培養物。
41.本質的に、本明細書に記載するとおりである、方法および使用。
オリゴヌクレオチド合成は当技術分野において広く公知である。以下は適用することができるプロトコールである。本発明のオリゴヌクレオチドは、使用される装置、支持体、および濃度の点でわずかに相違する方法によって作製されたものでありうる。
β-シアノエチル-ホスホラミダイト(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-メチル-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)、LNA-Tまたはアミノ-C6リンカー)のカップリングは、アセトニトリル中0.1Mの5'-O-DMT-保護アミダイト溶液および活性化剤としてのアセトニトリル中のDCI(4,5-ジシアノイミダゾール)(0.25M)を使用して行われる。最終サイクルについては、所望の修飾を持つホスホラミダイト、例えばコンジュゲート基を取り付けるためのC6リンカー、またはコンジュゲート基そのものを使用することができる。ホスホルチオエート連結を導入するためのチオール化はキサンタンヒドリド(アセトニトリル/ピリジン9:1中、0.01M)を使用して実行される。ホスホルジエステル連結は、THF/ピリジン/水7:2:1中の0.02Mヨウ素を使用して導入することができる。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成に典型的に使用されるものである。
粗化合物は、Phenomenex Jupiter C18 10μ 150×10mmカラムでの分取用RP-HPLCによって精製する。0.1M酢酸アンモニウムpH8およびアセトニトリルを緩衝液として5mL/分の流速で使用する。収集したフラクションを凍結乾燥することで、精製された化合物を典型的には白色固形物として得る。
略号:
DCI: 4,5-ジシアノイミダゾール
DCM:ジクロロメタン
DMF:ジメチルホルムアミド
DMT: 4,4'-ジメトキシトリチル
THF:テトラヒドロフラン
Bz:ベンゾイル
Ibu:イソブチリル
RP-HPLC:逆相高速液体クロマトグラフィー
オリゴヌクレオチドおよびRNA標的二重鎖を500mlのRNaseフリー水に3mMまで希釈し、500mlの2×Tm緩衝液(200mM NaCl、0.2mM EDTA、20mM リン酸Na、pH7.0)と混合する。その溶液を95℃に3分間加熱してから、室温で30分間アニールさせる。二重鎖融解温度(Tm)は、PE Templabソフトウェア(Perkin Elmer)を使用して、ペルチェ温度プログラマーPTP6を装備したラムダ40UV/VIS分光測光器で測定する。260nmでの吸光を記録しながら、温度を20℃から95℃まで上昇させた後、25℃まで降下させる。融解とアニーリングの両方の一次導関数および極大を使用して、二重鎖Tmを評価する。
初代皮質ニューロン培養物は、標準的手順に従って、15日齢のマウス胎児脳から調製した。簡単に述べると、培養プレートを、ポリ-L-リジン(50μg/mlポリ-L-リジン、10mM四ホウ酸塩Na、pH8緩衝液)により、室温で2~3時間コーティングした。プレートを使用前に1×PBSで洗浄した。採取したマウス胎児脳をカミソリの刃で切離、ホモジナイズし、38mlの切離培地(HBSS、0.01M Hepes、ペニシリン/ストレプトマイシン)に浸漬した。次に、2mlトリプシンを加え、細胞を37℃で30分間インキュベートし、遠沈した。細胞を20ml DMEM(+10%FBS)に溶解し、さらにホモジナイズするためにシリンジに通した。次に500rpmで15分間遠心分離した。細胞をDMEM(+10%FBS)に溶解し、96ウェルプレートに播種した(100μl中に0.1×10^6細胞/ウェル)。神経細胞培養物は、播種後すぐに使用できる状態になった。
96ウェルプレートにおいて、細胞を成長培地(Gibco Neurobasal培地、B27サプリメント、Glutamax、ペニシリン-ストレプトマイシン)中で培養し、所望の濃度で3日間、オリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。全RNAを細胞から単離し、Quanta Bioscience製のqScript(商標)XLT One-Step RT-qPCR ToughMix(登録商標)、Low ROX(商標)キット(95134-500)を使用して、qPCR分析により、ノックダウン有効性を測定した。Thermo Fisher Scientific製の市販taqmanアッセイを使用して、正規化のためのGAPDHを含めて、Ube3a_ATSを測定した。
記載したどの時点でも、すべての細胞株を、37℃、5%CO2濃度、相対湿度95%でインキュベートした。
アンジェルマン症候群と診断された患者からヒト全血試料を得た。以後の初代末梢血単核球(PBMC)の培養では赤芽球が濃縮された。CytoTune-iPSセンダイリプログラミングキット(Thermo Fisher Scientific)で赤芽球をリプログラムすることによって、患者特異的IPSC株を作製した。誘導IPSC株は、mTESR1(STEMCELL Technologies)中、hESC-qualified Matrigel(Corning)を使用して、毎日培地交換をしながら、フィーダーフリー条件で維持した。コンフルエントになったら、Gentle Cell Dissociation Reagent(STEMCELL Technologies)を使用してコロニーを50~200μmサイズの細胞クラスターに解離し、10μM Y-27632(Calbiochem)の存在下、1:10~1:20の比で継代培養した。
神経系分化の誘導後は、1×B27(Gibco, Invitrogen)、1×N2(Gibco, Invitrogen)、0.1mMベータ-メルカプトエタノール(Gibco, Invitrogen)および表示のサプリメントを補足した等体積のDMEM:F12 Glutamax培地およびNeurobasal培地(Gibco, Invitrogen)で構成される基本培地中で、IPSC由来細胞を維持した。
NPC培養の条件は以前に記載されており、それにわずかな変更を加えて使用した(Boissart et al., 2013 Transl Psychiatry. 3:e294)。簡単に述べると、細胞をラミニン521(BioLamina)でコーティングしたディッシュに維持し、10ng/ml FGF(Peprotech)、10ng/ml EGF(RnD)、および20ng/ml BDNF(Peprotech)を補足した基本培地[1×B27(Gibco, Invitrogen)、1×N2(Gibco, Invitrogen)、0.1mMベータ-メルカプトエタノール(Gibco, Invitrogen)を補足した等体積のDMEM:F12 Glutamax培地およびNeurobasal培地(Gibco, Invitrogen)で構成されるもの]中で培養した。
NPCのニューロン分化を誘導するために、細胞を0.05%トリプシン/EDTA(Gibco, Invitrogen)で単一細胞懸濁液に解離し、ラミニン521(BioLamina)コートディッシュに12,000細胞/cm2の密度で播種し、200ng/ml Shh(Peprotech)、100ng/ml FGF8(Peprotech)、および100μMアスコルビン酸リン酸エステル(Sigma)を補足した基本培地中で7日間維持した。次に、20ng/ml BDNF(Peprotech)、10ng/ml GDNF(Peprotech)、0.5mM cAMP(BIOLOG Life Science)、および100μMアスコルビン酸リン酸エステル(Sigma)を補足した基本培地に、細胞を45000細胞/cm2の密度で再プレーティングし、21日間、分化させた。分化の21日目に、分化ニューロン培養物を、スクリーニングに適合したプレートフォーマットに再プレーティングした。再プレーティングは、培養をAccutase(Innovative Cell Technologies Inc.)で単一細胞懸濁液に解離することによって行った。最終オリゴヌクレオチドスクリーニングアッセイのために、細胞を、384ウェルマイクロタイタープレートに、10μM Y-27632(Calbiochem製の細胞透過性で可逆的なRhoキナーゼ阻害剤)の存在下、200,000細胞/cm2の密度で播種した。20ng/ml BDNF(Peprotech)、10ng/ml GDNF(Peprotech)、0.5mM cAMP(BIOLOG Life Science)、および100μMアスコルビン酸リン酸エステル(Sigma)を補足した基本培地中で、さらに7日にわたって、ニューロン培養物をさらに分化させた。分化培地は週に2回交換した。神経細胞培養物は、35日の全分化期間後に、オリゴヌクレオチド処理の準備が整った。
スクリーニングのために、オリゴヌクレオチドストックを、384ウェルマイクロタイタープレート(化合物プレート)に、表示した濃度まで水で事前希釈した。このプレートレイアウトを処理テンプレートとした。化合物プレートから各培養プレートに、各ウェルから2マイクロリットルのオリゴヌクレオチド希釈液を移した。液体のハンドリングはすべて、半自動実験ロボットシステム(Beckmancoulter)を使用して、層流中、滅菌条件下で行った。神経細胞培養物をオリゴヌクレオチドと共に培地を変えずに5日にわたってインキュベートした。次に、RealTime ready Cell lysisキットおよびRealTime ready RNA Virus Masterキット(Roche)を使用して、qPCRアッセイのために、ニューロン培養物を溶解し、加工した。液体のハンドリングは半自動実験ロボットシステム(Beckmancoulter)を使用して行った。Lightcycler480リアルタイムPCRシステム(Roche)によって試料を分析した。
UBE3a-センス:フォワードプライマー:
リバースプライマー:
色素FAMで標識された内部プローブ:
、およびUBE3A mRNAのアップレギュレーションをもたらすリファレンスオリゴヌクレオチドCMP ID NO:41_1を含む。
フォワードプライマー:
リバースプライマー:
色素FAMで標識された内部プローブ:
フォワードプライマー:
リバースプライマー:
色素FAMで標識された内部プローブ:
スクリーニングのために、オリゴヌクレオチドストックを、96ウェルマイクロタイタープレート(化合物プレート)に、表示した濃度まで水で事前希釈した。このプレートレイアウトを処理テンプレートとした。化合物プレートから各培養プレートに、各ウェルから2マイクロリットルのオリゴヌクレオチド希釈液を移した。液体のハンドリングはすべて、半自動実験ロボットシステム(Beckman Coulter)を使用して、層流中、滅菌条件下で行った。神経細胞培養物をオリゴヌクレオチドと共に培地を変えずに5日にわたってインキュベートした。次に、ニューロン培養物を溶解し、RNA精製キットPure Link Pro96(12173011A)Life Technologiesを使用して、RNAを精製した。液体のハンドリングは半自動実験ロボットシステム(Beckmancoulter)を使用して行った。Ube3aおよびUbe3a-ATSのqPCR分析は、ViiA(商標)7リアルタイムPCRシステム(Thermo Fisher Scientific)で、Quanta製のqScript(商標)XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix Low ROX(95134-50)を使用して行った。
Thermo Fisher製の市販プライマーおよびプローブセット: Hs01372957_m1。これらのプライマーは、Genbank転写産物AF400500.1中の87bpエクソン-エクソンスパニング配列を増幅する。
Thermo Fisher製の市販プライマーおよびプローブセット:遺伝子記号:アッセイの詳細は次のとおり: RefSeq: NM_002046.3、プローブエクソン位置: 3、アンプリコンサイズ:122 bp。対応TaqManアッセイID: Hs99999905_m1。
、およびUBE3A mRNAのアップレギュレーションをもたらすリファレンスオリゴヌクレオチドCMP ID NO:21_1を含む。さらに、アッセイノイズおよび偽陽性検出リスクをモニタリングするために、Ub3a転写産物もSNORD109B下流のSNHG14転写産物(UBE3Aサプレッサーとも呼ばれる)も標的としない対照オリゴヌクレオシドのパネルを含めた。これらはプレート上にランダムに分布させた。
記載したどの時点でも、すべての細胞株を、37℃、5%CO2濃度、相対湿度95%でインキュベートした。
すべての動物実験は米国国立衛生研究所のガイドラインに従って行い、Roche(米国07110ニュージャージー州ナトリー、キングスランドストリート340(2014年に閉鎖))に所属する施設内動物実験委員会(IACUC)によって承認された。カニクイザルIPSCを、雌14歳モーリシャスカニクイザルの腎線維芽細胞から、山中因子(Oct4、Sox2、Klf4、およびC-Myc)(Takahashi, K. & Yamanaka, S., 2006)を保因するセンダイウイルス粒子(CytoTune-iPSセンダイリプログラミングキット、Thermo Fisher Scientific)を使用して樹立した。トランスフェクションの5日後に、細胞をマイトマイシンC不活化フィーダー上に、さまざまな密度で移し、hESC培地(20%ノックアウト血清代替物、0.1mM非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン、0.1mM 2-メルカプトエタノール、および8ng/ml bFGFを補足したノックアウトDMEM:F12、いずれもLife Technologies製)中で培養した。トランスフェクションの20日後に、ES様の形態を持つクローンをさらなる継代のために選択した。3~4日ごとに、コロニーを手作業で解離することにより、細胞を定期的に継代した。Ono et al.; 2014に基づき、細胞をMatrigel(BD Bioscience)コートプレート上で培養し、細胞が単一細胞懸濁液の状態にある場合はチアゾビビンの代わりにY-27632(Calbiochem)を使用するという変更を加えることで、少なくとも10継代後には、cIPSCは、フィーダーフリー培養条件(15ng/ml FGF2(Peprotech)および10ng/mlアクチビンA(Peprotech)を補足したMT培地)に適応した。MT培地は、2.5mM GlutaMAX(商標)、7μg/mlインスリン、450μMモノチオグリセロール、1×脂質濃縮物、5mg/ml BSA、14ng/ml亜セレン酸ナトリウム、1×非必須アミノ酸、2mg/mlヘパリン、15μg/mlトランスフェリン、および220μMアスコルビン酸-2-リン酸を含む、ハムのF12栄養混合物を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM/F12)を含有する合成培地である。Gentle Cell Dissociation Reagent(STEMCELL Technologies)を使用して細胞を2~4日ごとに継代した。さらなる実験のために1つのクローンを選び、以後のすべてのアッセイにそれを使用した。
神経系分化の誘導後は、1×B27(Gibco, Invitrogen)、1×N2(Gibco, Invitrogen)、0.1mMベータ-メルカプトエタノール(Gibco, Invitrogen)および表示のサプリメントを補足した等体積のDMEM:F12 Glutamax培地およびNeurobasal培地(Gibco, Invitrogen)で構成される基本培地中で、cIPSC由来細胞(図4、1日目参照)を維持した。
NPC培養の条件は以前に記載されており、それにわずかな変更を加えて使用した(Boissart et al., 2013 Transl Psychiatry. 3:e294)。簡単に述べると、細胞をラミニン521(BioLamina)でコーティングしたディッシュに維持し、10ng/ml FGF(Peprotech)、10ng/ml EGF(RnD)、および20ng/ml BDNF(Peprotech)を補足した基本培地[1×B27(Gibco, Invitrogen)、1×N2(Gibco, Invitrogen)、0.1mMベータ-メルカプトエタノール(Gibco, Invitrogen)を補足した等体積のDMEM:F12 Glutamax培地およびNeurobasal培地(Gibco, Invitrogen)で構成されるもの]中で培養した。
NPCのニューロン分化を誘導するために、細胞を0.05%トリプシン/EDTA(Gibco, Invitrogen)で単一細胞懸濁液に解離し、ラミニン521(BioLamina)コートディッシュに30,000細胞/cm2の密度で播種し、200ng/ml Shh(Peprotech)、100ng/ml FGF8(Peprotech)、および100μMアスコルビン酸リン酸エステル(Sigma)を補足した基本培地中で7日間維持した。次に、20ng/ml BDNF(Peprotech)、10ng/ml GDNF(Peprotech)、0.5mM cAMP(BIOLOG Life Science)、および100μMアスコルビン酸リン酸エステル(Sigma)を補足した基本培地に、細胞を45000細胞/cm2の密度で再プレーティングし、21日間、分化させた。分化の21日目に、分化NCを解離し、スクリーニングに適合したプレートフォーマットに再プレーティングした。再プレーティングは、培養をAccutase(Innovative Cell Technologies Inc.)で単一細胞懸濁液に解離することによって行った。最終オリゴヌクレオチドスクリーニングアッセイのために、細胞を、384ウェルマイクロタイタープレートに、10μM Y-27632(Calbiochem製の細胞透過性で可逆的なRhoキナーゼ阻害剤)の存在下、200000細胞/cm2の密度で播種した。20ng/ml BDNF(Peprotech)、10ng/ml GDNF(Peprotech)、0.5mM cAMP(BIOLOG Life Science)、および100μMアスコルビン酸リン酸エステル(Sigma)を補足した基本培地中で、さらに7日にわたって、ニューロン培養物をさらに分化させた。分化培地は週に2回交換した。神経細胞培養物は、35日の全分化期間後に、オリゴヌクレオチド処理の準備が整った。
スクリーニングのために、オリゴヌクレオチドストックを、96ウェルマイクロタイタープレート(化合物プレート)に、表示した濃度まで水で事前希釈した。このプレートレイアウトを処理テンプレートとした。化合物プレートから各培養プレートに、各ウェルから2マイクロリットルのオリゴヌクレオチド希釈液を移した。液体のハンドリングはすべて、半自動実験ロボットシステム(Beckmancoulter)を使用して、層流中、滅菌条件下で行った。神経細胞培養物をオリゴヌクレオチドと共に培地を変えずに5日にわたってインキュベートした。次に、ニューロン培養物を溶解し、PureLink(登録商標)Pro96全RNA精製キット(Thermo Fisher)を使用して精製した後、qScript XLT One-Step RT-qPCR Tough Mix, Low ROX(Quanta Biosciences)でqPCRアッセイ用に加工した。液体のハンドリングは半自動実験ロボットシステム(Integra Assist およびIntegra Viaflo)を使用して行った。Lightcycler480リアルタイムPCRシステム(Roche)によって試料を分析した。
UBE3a-センス: HS00166580_VIC Taqmanアッセイ(Thermo Fisher)
UBE3a-アンチセンス: HS01372957_VIC Taqmanアッセイ(Thermo Fisher)
を含む。
細胞を4%PFAで固定し、PBS(Ca2+およびMg2+含有)中の0.1% TritonX(Sigma)で透過処理した。ブロッキングは0.1% TritonXを補足したSuperBlock溶液(Thermo Fisher Scientific)を使用して行った。細胞を以下の一次抗体で染色した:抗SOX2(Milipore AB5603)、抗GFAP(Dako Z033401)、抗HuC/D(Invitrogen A21271)、抗ネスチン(Millipore mab5326)および抗Map2(Neuromics CH22103)。次に、細胞を染色し、Alexa488、Alexa555またはAlexa647(すべてMolecular Probes)のいずれかにコンジュゲートされた二次抗体で染色した。核をヘキスト1:1000(Molecular Probes)で染色した。Axiovert顕微鏡(Zeiss)またはOperettaハイコンテントイメージングシステム(Perkin Elmer)を使用して細胞を撮像した。ImageJソフトウェアを使用して画像を分析した。
miRNeasy Miniキット(QIAGEN)を使用してcIPSC、カニクイザル分化NC、hESCおよびヒト分化NCからRNAを単離し、qPCR分析を行った(ヒト細胞にはAg-Path-ID One-Step RT-PCRキット(Ambion)を使用;カニクイザル細胞については、Transcriptor第1鎖cDNA合成キット(Roche)を使用して逆転写を行い、LightCycler 480 Probes Master(Roche)を使用してqPCRを行った)。以下のプライマーおよびプローブを使用した。ヒト細胞用: NES Hs04187831_g1; MAP2 Hs00258900_m1; ASCL1 Hs00269932_m1; SOX2 Hs01053049_s1; ELAVL3 Hs00154959_m1; GAPDH 4352665、すべてThermo Fisher/Applied Biosystems製;
UBE3A-ATS Fwプライマー:
、RVプライマー:
、内部オリゴ:
; UBE3A Fwプライマー:
、RVプライマー:
、内部オリゴ
。カニクイザル細胞用: NANOG アッセイID 700103、POU5F1 アッセイID 113034、SOX2 アッセイID 111867、ネスチン アッセイID 138150、PAX6 アッセイID 136139、SOX1 アッセイID 136988、ZIC1 アッセイID 112077、ASCL1 アッセイID 700027、TUBB3 アッセイID 700047、GAPDH カタログ番号04694333001、プローブ番号147; TBP アッセイID 101145、すべてRocheから購入。
UBE3A-ATS Fwプライマー:
、Rvプライマー:
、内部オリゴ
;
UBE3A センス: Fwプライマー:
Rvプライマー:
内部オリゴ:
RNA単離はmiRNeasy Miniキット(QIAGEN)を使用して行った。ライブラリー調製は、Ribo-Zero Goldによる除去を含めてTruSeq Stranded Total RNA LTキット(illumina)を使用して行った。クラスター生成はcBOT装置およびHiSeq PE Clusterキットv4を使用して行った。シーケンシングは、以下の試薬を使用し、ペアエンドシングルインデックスシーケンシングラン(2×125サイクル)として、HiSeq 2500装置で行った:HiSeq SBSキットv4 250サイクル(illumina)。
タンパク質発現研究のために、スクレイピングによって細胞を収集し、瞬間凍結した。ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤およびDNAse(すべてRoche製)を補完したCytobuster(Millipore)でペレットを溶解した。抽出物中のタンパク質濃度をBCAアッセイ(Thermo Scientific)によって測定し、溶液をポリアクリルアミドゲル(Invitrogen)にローディングした。電気泳動後に、iBlotシステム(Invitrogen)を使用してタンパク質をニトロセルロースメンブレンにブロットした。関心対象のタンパク質を検出するために使用した抗体は、抗hTau HT7(Pierce MN1000)、抗pTauS422(Roche)抗pTauS404(Abcam ab92676)であり、これらを適当なHRPコンジュゲート二次抗体で検出した。SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate(Thermo Fisher)を使用し、イメージャー(Biorad)を使用して、複合体をルミネセンスで検出した。
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UBE3AプレmRNA(SEQ ID NO:1の位置55319~141053)に対してアンチセンスであるSNHG14長鎖ノンコーディングRNAの一部を標的とするオリゴヌクレオチドを、上記「材料および方法」の項で述べたように得たマウス初代皮質神経細胞培養物において、UBE3A発現を妨げるSNHG14長鎖ノンコーディングRNA転写産物(データ表ではUBE3AサプレッサーまたはUBE3A-SUPとも呼ぶ)を低減するそれらの能力、およびUBE3A mRNA再発現を誘導するそれらの能力について試験した。オリゴヌクレオチド濃度は5μMとした。「材料および方法」の項で述べたマウス皮質神経細胞培養物におけるスクリーニングのためのプロトコールに従って、オリゴヌクレオチドをスクリーニングした。結果を表4に示す。
15番染色体上の位置25278410~25419462(SEQ ID NO:1)に対応するSNRD109B下流の領域においてヒトSNHG14を標的とするオリゴヌクレオチドを、患者由来ヒト神経細胞培養物において試験した(「材料および方法」の項のプロトコール参照)。SNORD115の発現に影響を及ぼすことなく、SNORD109B下流の領域においてSNHG14転写産物(データ表ではUBE3AサプレッサーまたはUBE3A-SUPとも呼ぶ)を低減するオリゴヌクレオチドの能力を分析した。さらにまた、UBE3A mRNA再発現を誘導する能力も分析した。
材料および方法の項で説明し、図4に図示するプロトコールに従って、NPCに分化するように、カニクイザルIPSCを誘導した。このプロトコールにより、FGF、EGFおよびBDNFを補足した基本培地中で維持し、拡大培養することができるNPCを得ることができる。効率のよいカニクイザルNPCの誘導を検証するために、神経系幹細胞マーカーSOX2およびネスチンの発現を免疫染色によって評価した(図5参照)。カニクイザルNPCはSOX2およびネスチンを発現し、発現パターンはヒトNPCとよく似ている。
幹細胞由来細胞は、薬物スクリーニングのためのインビトロ系として、とりわけ対応する初代細胞タイプが利用できないか、ニューロンがそうであるように限られた量でしか利用できない場合に、大きな潜在的可能性を有する。しかし、薬物スクリーニングには、適切なプレートフォーマットで利用できるロバストな細胞スクリーニング系が必要になる。この目的のために、本発明者らは、NHP-IPSCに由来するNPCを神経細胞(NC)に分化させるための異なる戦略を試験した。NCが一様に分布したロバストな細胞系を同定するために、拡大培養中のNPCを解離し、2つの方法のうちの一方で分化培地に曝露した。すなわち、それらを最終アッセイフォーマットで直接プレーティングするか、あるいは、細胞を細胞培養フラスコにプレーティングし、その後、さらなる分化後に、解離して、最終アッセイフォーマットに再播種した(図7参照)。方法Aおよび方法Bでは、NPCをフラスコ中で23日にわたって分化させてから、解離し、アッセイフォーマットで再播種した。7日間のさらなる分化期間後に細胞をオリゴヌクレオチドで処理した。あるいは、方法Cおよび方法Dでは、NPCを解離し、96ウェルプレートに直接プレーティングした。方法Aおよび方法Cにおける分化培地には、細胞増殖を阻害するために有糸分裂阻害剤カクテル(ウリジン35μg/mlおよび15μg/ml 5-フルオロ-2'-デオキシウリジン)を補足した。35日目に、培養物を固定し、神経系始原細胞およびグリア細胞マーカーSOX2ならびにニューロンマーカーMAP2について染色した(図8参照)。方法B(再プレーティングあり、有糸分裂阻害剤なし)は、MAP2陽性細胞を含み、他の方法よりSOX2陽性細胞が少ない、より一様に分布した細胞培養物をもたらした。そのため、以後の記載するオリゴヌクレオチド処理には、ニューロン分化方法Bを選んだ。
実施例4で述べたように、本発明者らは、分化中のカニクイザルニューロンを再プレーティングすることは、これらの細胞をスクリーニング目的に適するようにするために必要な工程であることを立証した。そこで本発明者らは、ヒトIPSC由来ニューロンにも同様の手順を利用することが可能かどうかを検証しようと試みた。この目的のために、2つのIPSC株(ED4およびSFC808)から以前に樹立された神経系始原細胞(NPC)を、材料および方法の項に記載した手順に従って分化させた。簡単に述べると、拡大培養中のNPCを解離し、SFA培地で1週間プレーティングした。その後、細胞を2つの方法の一方で分化培地(BGAA)に曝露した。すなわち、それらをアッセイフォーマットで直接プレーティングするか、または細胞培養フラスコにプレーティングした。後者の場合は、細胞を21日にわたって分化させた後、解離し、アッセイフォーマットで再播種した。どちらの実験群も(すなわち直接分化させた群も、解離して再播種した群も)、加工前に、合計6週にわたって分化させた(それぞれ、アッセイフォーマットで6週、またはフラスコ中で3週およびアッセイフォーマットで3週)。
上述の霊長類IPSC由来ニューロン培養物は、スクリーニング目的での使用に適した融通性と再現性の高い系である。本発明者らは、細胞をオリゴヌクレオチドで処理し、定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)によって標的および関連遺伝子の発現を検証するためのワークフローを開発した(図12参照)。この目的のために、ヒトまたはカニクイザルの神経系始原細胞を上述のように処理した。スクリーニングのために、3週間の分化後に細胞を解離し、96ウェルプレートに200'000細胞/cm2の密度で再播種した。さらに1週間の分化後に、細胞をオリゴヌクレオチドで5日にわたって処理し、次に、材料および方法の項で述べたように、発現分析のために加工した。この方法により、試料をハイスループットで試験することが常に可能になる。
Claims (9)
- 一様に分布した分化神経細胞(NC)の標準化された細胞培養物を2つの霊長類種から個別に作製するためのインビトロ法であって、第1の霊長類種がヒト(ホモ・サピエンス)であり、かつ第2の霊長類種がカニクイザル(マカカ・ファシキュラリス)であり、以下を含む、方法:
(a)神経前駆細胞(NPC)を用意する工程であって、前記NPCが人工多能性幹細胞(IPSC)に由来する、工程;
(b)NPCを神経細胞(NC)に分化させる工程であって、以下を含む、工程:
(i)Shh、FGF8およびアスコルビン酸リン酸エステルを含む基本培地中で細胞を5~10日間にわたって培養した後、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステルを含む基本培地中で細胞をさらに15日~35日間にわたって培養する工程;
約20日~約45日の分化後に、分化NCをその支持体から解離する工程;および
(ii)前記細胞を適切な細胞培養フォーマットで再播種し、約4日~約15日にわたって、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸を補足した基本培地中で細胞を培養することによって、NCの分化を継続する工程であって、前記細胞が96ウェルプレートまたは384ウェルプレートに再播種される、工程。 - 工程(b)(i)が、細胞剥離溶液で細胞を解離することを含む、請求項1記載の方法。
- 細胞剥離溶液がAccutaseである、請求項2記載の方法。
- 分化NCが、細胞核染色で評価した場合に、細胞培養エリア上に本質的に一様に分布している、請求項1~3のいずれか一項記載の方法。
- 薬物候補の毒性のインビトロ試験のための、請求項1~4のいずれか一項に従って得られた細胞培養物の使用。
- 薬物候補の有効性のインビトロ試験のための、請求項1~4のいずれか一項に従って得られた細胞培養物の使用。
- さらなる開発のために薬物候補を選択するための、請求項1~4のいずれか一項に従って得られた細胞培養物の使用。
- 薬物候補がポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドの特異的配列を標的とする、請求項5~7のいずれか一項記載の使用のための、請求項1~4のいずれか一項に従って得られた細胞培養物。
- 薬物候補が少なくとも1種類の核酸分子、例えばRNAi作用物質またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項5~7のいずれか一項記載の使用のための、請求項1~4のいずれか一項に従って得られた細胞培養物。
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