BR112019027692A2

BR112019027692A2 - gene ube3a modificado para uma abordagem terapêutica genética para a síndrome de angelman

Info

Publication number: BR112019027692A2
Application number: BR112019027692-0A
Authority: BR
Inventors: Kevin Ron Nash; Edwin John Weeber
Original assignee: University Of South Florida
Priority date: 2017-06-28
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2020-11-24
Also published as: AU2018291137A1; CN110869031A; CO2020000679A2; EP3645012A4; US20200113955A1; CA3068304A1; AU2018291137A2; EP3645012A1; JP2023055906A; WO2019006107A1; JP2020528739A; RU2019143627A3; RU2019143627A

Abstract

É apresentado um novo vetor, composição e método de tratamento de um distúrbio neurológico qualificado por deficiência de UBE3A. O gene UBE3A, que codifica para E6- AP, uma ubiquitina ligase, foi considerado responsável pela síndrome de Angelman (AS). Uma característica única desse gene é que ele sofre impressão materna de maneira específica para os neurônios. Na maioria dos casos de EA, há uma mutação ou exclusão no gene UBE3A herdado pela mãe, embora outros casos sejam resultado de disomia uniparental ou desmetilação do gene materno. Uma construção da proteína UBE3A foi gerada com sequências adicionais que permitem a secreção das células e a captação pelas células neuronais vizinhas. Este vetor UBE3A pode ser usado em terapia gênica para conferir uma proteína funcional E6-AP aos neurônios e resgatar a patologia da doença.

Description

1 / 51 “GENE UBE3A MODIFICADO PARA ABORDAGEM DE TERAPIA GENÉTICA DE SÍNDROME DE ANGELMAN.” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido é não provisório e reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório Norte‐Americano com número de série 62/525.787, intitulado “Modified UBE3A gene for a gene therapy approach for Angelman syndrome”, depositado em 28 de junho de 2017, cujo conteúdo é incorporado ao presente relatório descritivo como referência. CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere‐se ao tratamento da síndrome de Angelman. Mais especificamente, a presente invenção fornece composições e métodos terapêuticos para o tratamento da síndrome de Angelman. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] A síndrome de Angelman (AS) é um distúrbio genético que afeta os neurônios, que se estima afetar cerca de um a cada 15.000 nascimentos (Clayton‐Smith, Clinical research on Angelman syndrome in the United Kingdom: observations on 82 affected individuals, Am. J. Med. Genet., 1° de abril de 1993; 46 (1): 12‐5), embora o número real de casos de AS diagnosticados seja maior, provavelmente devido a erros de diagnóstico.

[004] A síndrome de Angelman é um continuum de impedimento, que se apresenta com avanço de desenvolvimento e intelectual reduzido e retardado, mais notadamente com relação às capacidades motoras e de linguagem. Particularmente, AS é definida por pouca ou nenhuma comunicação verbal, com alguma comunicação não verbal, ataxia e disposição que inclui risadas e sorrisos frequentes e movimentos excitáveis.

[005] Casos mais avançados resultam em retardo mental severo, convulsões que podem ser de difícil controle, que começam tipicamente aos três anos de idade ou antes, risadas frequentes (Nicholls, New insights reveal complex mechanisms involved in genomic imprinting, Am. J. Hum. Genet., maio de 1994; 54 (5): 733‐40), microencefalia e EEG anormal. Em casos severos, os pacientes podem não desenvolver

2 / 51 linguagem ou podem utilizar apenas 5‐10 palavras. Os movimentos muitas vezes são bruscos e o caminhar é comumente associado ao bater das mãos e passos rígidos. Os pacientes comumente são epilépticos, especialmente no início da vida, e sofrem de apneia do sono, frequentemente dormindo por apenas cinco horas de cada vez. Eles são sociáveis e desejam contato humano. Em alguns casos, a pele e os olhos podem ter pouco ou nenhum pigmento, eles podem apresentar problemas para sugar e engolir, sensibilidade ao calor e fixação com corpos d’água. Estudos em camundongos com deficiência de UBE3A exibem distúrbios da plasticidade sináptica a longo prazo. Atualmente não há cura para a síndrome de Angelman e o tratamento é paliativo. Utiliza‐se, por exemplo, medicação anticonvulsiva para reduzir as convulsões epilépticas e terapia física e da fala para aprimorar as habilidades motoras e de linguagem.

[006] O gene UBE3A é responsável pela AS e é único por ser um dentre uma pequena família de genes impressos humanos. UBE3A, encontrado no cromossomo 15, codifica a proteína terminal E6AP C homóloga (HECT) proteína associada a E6 (E6AP) (Kishino et al, UBE3A/E6‐AP mutations cause Angelman syndrome, Nat. Gen., 15 de janeiro de 1997, 15 (1): 70‐3). UBE3A sofre impressão materna definida de forma espacial no cérebro; a cópia paternal é, portanto, silenciada por meio de metilação de DNA (Albrecht et al, Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons, Nat. Genet., setembro de 1997; 17 (1): 75‐8). Por isso, apenas a cópia materna é ativa e o cromossomo paterno possui pouco ou nenhum efeito sobre o proteossoma dos neurônios naquela região do cérebro. A desativação, translocação ou exclusão de partes do cromossomo 15 resulta, portanto, em perda de função descompensada. Alguns estudos sugerem níveis de proteína E3‐ AP inadequados após contato de neurites em pacientes com síndrome de Angelman (Tonazzini et al, Impaired neurite contract guidance in ubiquitin ligase E3a (Ube3a)‐ deficient hippocampal neurons on nanostructured substrates, Adv. Health Mater., abril de 2016; 5 (7): 850‐62).

[007] A maior parte dos casos de síndrome de Angelman (70%) ocorre por meio de exclusão desde o princípio de cerca de 4 Mb de 15q11‐q13 do cromossomo materno

3 / 51 que incorpora o gene UBE3A (Kaplan et al, Clinical heterogeneity associated with deletions in the long arm of chromosome 15: report of 3 new cases and their possible significance, Am. J. Med. Genet., setembro de 1987; 28 (1): 45‐53), mas pode também ocorrer como resultado de metilação anormal da cópia materna, evitando sua expressão (Buiting et al, Inherited microdeletions in the Angelman and Prader‐Willi syndromes define an imprinting centre on human chromosome 15, Nat. Genet., abril de 1995; 9 (4): 395‐400; Gabriel et al, A transgene insertion creating a heritable chromosome deletion mouse model of Prader‐Willi and Angelman syndrome, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., agosto de 1999; 96 (16): 9258‐63) ou dissomia uniparental, na qual são herdadas duas cópias do gene paterno (Knoll et al, Angelman and Prader‐Willi syndromes share a common chromosome 15 deletion but differ in parental origin of the deletion, Am. J. Med. Genet., fevereiro de 1989; 32 (2): 285‐90; Malcolm et al, Uniparental paternal disomy in Angelman’s syndrome, Lancet., 23 de março de 1991; 337 (8743): 694‐7). Os casos de AS restantes surgem por meio de diversas mutações de UBE3A do cromossomo materno ou são diagnosticados sem causa genética (12‐ 15UBE3A codifica a proteína associada a E6 (E6‐AP) ubiquitina ligase). E6‐AP é uma ubiquitina ligase E3 e, portanto, exibe especificidade para os seus alvos de proteína, que incluem a molécula supressora de tumores p53 (Huibregtse et al, A cellular protein mediates association of p53 with the E6 oncoprotein of human papillomavirus types 16 or 18, EMBO J., dezembro de 1991; 10 (13): 4129‐35), homólogo humano da proteína de reparo de DNA de levedura Rad23 (Kumar et al, Identification of HHR23A as a substrate for E6‐associated protein‐mediated ubiquitination, J. Biol. Chem. 25 de junho de 1999; 274 (26): 18785‐92), o próprio E6‐AP e Arc, o alvo identificado mais recentemente (Nuber et al, The ubiquitin‐protein ligase E6‐associated protein (E6‐AP) serves as its own substrate, Eur. J. Biochem. 15 de junho de 1998; 254 (3): 643‐9; Greer et al, The Angelman Syndrome protein Ube3A regulates synapse development by ubiquitinating arc, Cell, 5 de março de 2010; 140 (5): 704‐16).

[008] Casos suaves provavelmente devem‐se a uma mutação no gene UBE3A no cromossomo 15q11‐13, que codifica a proteína ubiquitina ligase E6‐AP do processo de ubiquitina e casos mais severos resultam de exclusões maiores de cromossomo 15.

4 / 51 Normalmente, a perda do gene UBE3A no hipocampo e no cerebelo resulta em síndrome de Angelman, embora mutações de perda de função isoladas possam também resultar no distúrbio.

[009] A anatomia do cérebro com AS humano e de camundongos não exibe alterações importantes em comparação com o cérebro normal, o que indica que os déficits cognitivos podem ter natureza bioquímica e não de desenvolvimento (Jiang et al, Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long‐term potentiation, Neuron, outubro de 1998; 21 (4): 799‐811; Davies et al, Imprinted gene expression in the brain, Neurosci. Biobehav. Rev., maio de 2005; 29 (3): 421–430). Utilizou‐se um modelo de camundongo com síndrome de Angelman que possui rompimento do gene UBE3A materno por meio de mutação nula do exon 2 (Jiang et al, Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long‐term potentiation, Neuron, outubro de 1998; 21 (4): 799‐811). Este modelo foi incrivelmente benéfico para o campo de pesquisa de AS devido à sua capacidade de recapitulação dos principais fenótipos característicos de pacientes com AS. O camundongo com AS, por exemplo, apresenta convulsões indutíveis, má coordenação motora, déficits de aprendizado dependentes do hipocampo e defeitos de LTP do hipocampo. Demonstrou‐se anteriormente que déficits cognitivos do modelo de camundongo com AS são associados a anormalidades do estado de fosforilação de proteína quinase dependente de calmodulina/cálcio II (CaMKII) (Weeber et al, Derangements of hippocampal calcium/calmodulin‐dependent protein kinase II in a mouse model for Angelman mental retardation syndrome, J. Neurosci., abril de 2003; 23 (7): 2634‐44). Houve aumento significativo da fosforilação no local Thr286 de ativação, bem como no local Thr305 inibidor de αCaMKII sem qualquer alteração do nível total de enzimas, o que resulta em redução geral da sua atividade. Houve também redução da quantidade total de CaMKII à densidade pós‐sináptica, o que indica redução da quantidade de CaMKII ativo. O cruzamento de um modelo de camundongo mutante que possui mutação pontual no local Thr305 evitando a fosforilação com o camundongo com AS recuperou o fenótipo de AS, ou seja, a

5 / 51 atividade convulsiva, coordenação motora, aprendizado dependente do hipocampo e LTP foram restaurados a níveis similares aos do tipo selvagem. A expressão pós‐natal de αCaMKII sugere, portanto, que os fenótipos principais do modelo de camundongo com AS devem‐se a alterações bioquímicas pós‐natais e não a um defeito de desenvolvimento global (Bayer et al, Developmental expression of the CaM kinase II isoforms: ubiquitous γ‐ and δ‐CaM kinase II are the early isoforms and most abundant in the developing nervous system, Brain Res. Mol. Brain Res., 18 de junho de 1999; 70 (1): 147‐54).

[010] Deficiências de Ube3a são também relacionadas a mal de Huntington (Maheshwari et al, Deficiency of Ube3a in Huntington’s disease mice brain increases aggregate load and accelerates disease pathology, Hum. Mol. Genet., 1° de dezembro de 2014: 23 (23): 6235‐45).

[011] Matentzoglu observou que E6‐AP possui atividade não de E3 relativa à sinalização hormonal (Matentzoglu, EP 2.724.721 A1). Desta forma, a administração de esteroides, tais como andrógenos, estrógenos e glicocorticoides, foi utilizada para o tratamento de diversos distúrbios de E6‐AP, incluindo síndrome de Angelman, autismo, epilepsia, síndrome de Prader‐Willi, câncer do colo do útero, síndrome do X frágil e síndrome de Rett. Philpot sugeriu o uso de um inibidor da topoisomerase para desmetilar genes silenciados, de forma a corrigir deficiências de Ube3A (Philpot et al, Patente Pré‐Concedida US 2013/0317018 A1). O trabalho no campo e produtos terapêuticos propostos, entretanto, não abordam o distúrbio subjacente, como no uso de esteroides, ou podem resultar em outros distúrbios, tais como autismo, nos quais são utilizados compostos de desmetilação. Consequentemente, o que é necessário é um produto terapêutico que aborde a causa subjacente de distúrbios da deficiência de UBE3A, de forma segura e eficaz.

[012] Nash e Weeber (WO 2016/179584) demonstraram que vetores de vírus adeno‐ associados recombinantes (rAAV) podem ser um método eficaz de fornecimento genético em modelos de camundongos. Apenas uma pequena população de neurônios, entretanto, sofre transdução com sucesso e, portanto, expressa a proteína, evitando a distribuição global da proteína no cérebro conforme o necessário para

6 / 51 terapia eficaz. Desta forma, é necessário um produto terapêutico que forneça suplementação de proteína Ube3a ao longo de todo o cérebro. DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[013] Embora a maior parte dos distúrbios humanos caracterizados por retardo mental severo envolva anormalidades da estrutura cerebral, nenhuma alteração anatômica grave é associada a AS. Foi gerada uma proteína Ube3a que contém um anexo a uma sequência de secreção celular que permite a secreção de Ube3a de células e uma sequência de captação de células que fornece absorção por células neuronais vizinhas. Isso fornece uma proteína E6‐AP funcional para os neurônios que, desta forma, recuperam‐se da patologia da doença.

[014] Foi examinada a eficácia de construções de plasmídeos inovadoras que contêm um gene Ube3A modificado com sinais de secreção para promover sinais de peptídeos de penetração celular (CPP) e secreção de E6‐AP para promover a reabsorção de E6‐AP em células vizinhas. Isso permite maior distribuição global de E6‐AP mediante transdução para o cérebro de um camundongo, como terapia genética para AS.

[015] Desta maneira, formou‐se um vetor UBE3A utilizando uma sequência de iniciação da transcrição e uma construção UBE disposta a jusante da sequência de iniciação da transcrição. A construção UBE é formada de uma sequência UBE3A, sequência de secreção e sequência de captação de células. Exemplos não limitadores da sequência UBE3A incluem UBE3A de Mus musculus, UBE3A de Homo sapiens variante 1, variante 2 ou variante 3. Exemplos não limitadores da sequência de captação de células incluem penetratina, R6W3, HIV TAT, HIV TATk e pVEC. Exemplos não limitadores da sequência de secreção incluem insulina, GDNF e IgK.

[016] Em algumas variações da presente invenção, a sequência de iniciação da transcrição é um promotor híbrido de beta‐actina de galinha e citomegalovírus ou promotor humano de ubiquitina c. A presente invenção inclui opcionalmente uma sequência intensificadora. Um exemplo não limitador da sequência intensificadora é uma sequência intensificadora imediata‐precoce de citomegalovírus disposta a montante da sequência de iniciação da transcrição. O vetor também inclui opcionalmente um elemento regulador pós‐transcricional para hepatite por marmota.

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[017] Em algumas variações, o vetor é inserido em um plasmídeo, tal como um plasmídeo com duas bases do serótipo do vírus adeno‐associado recombinante. Em variações específicas, o plasmídeo com duas bases do serótipo do vírus adeno‐ associado recombinante não contém elementos de integração de DNA. Um exemplo não limitador do plasmídeo com duas bases do serótipo do vírus adeno‐associado recombinante é um plasmídeo pTR.

[018] Em algumas variações, a sequência de secreção é disposta a montante da sequência UBE3A. A sequência de captação de células pode ser disposta a montante da sequência UBE3A e a jusante da sequência de secreção.

[019] É também apresentado um método de tratamento de distúrbios neurodegenerativos caracterizados por deficiência de UBE3A, tais como síndrome de Angelman e mal de Huntington, por meio da administração de quantidade terapeuticamente eficaz de vetor UBE3A, conforme descrito anteriormente, ao cérebro do paciente, a fim de corrigir a deficiência de UBE3A. O vetor pode ser administrado por meio de injeção no cérebro, tal como por meio de injeção intra‐ hipocampal ou intraventricular. Em alguns casos, o vetor pode ser injetado bilateralmente. Exemplos de dosagens podem variar de 5,55 x 1011 a 2,86 x 1012 genomas/g de massa cerebral.

[020] É também apresentada uma composição para uso no tratamento de distúrbios neurodegenerativos caracterizados pela deficiência de UBE3A. A composição pode ser composta de um vetor UBE3A conforme descrito acima e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em alguns casos, o veículo farmaceuticamente aceitável pode ser um permeabilizante da barreira hematoencefálica, tal como manitol. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[021] Para compreensão mais completa da presente invenção, dever‐se‐á fazer referência à descrição detalhada a seguir, tomada em conjunto com as figuras anexas, nas quais:

[022] A Fig. 1 é Dot Blot de anti‐GFP sobre meios de células HEK293 transfectadas com clones de GFP que contêm peptídeos de sinal conforme indicado.

[023] A Fig. 2 é um mapa da construção de vetor UBE3A de camundongo de acordo

8 / 51 com a presente invenção. Os genes principais estão indicados.

[024] A Fig. 3 é Western Blot que exibe secreção de proteína E6‐AP de células HEK293 transfectadas com plasmídeos. Meios de cultivo retirados de meios de cultivo celular transfectados com células de controle (cnt txn), meios de células transfectadas com Ube3a (Ube3a txn); e meios de células não transfectadas (cnt untxn) foram conduzidos em gel de acrilamida e anticorpo anti‐E6‐AP.

[025] A Fig. 4 é um gráfico do percentual de área de manchas para proteína E6‐AP. Camundongos controle não transgênicos (Ntg) exibem o nível de expressão de Ube3a em cérebros de camundongos normais. Camundongos com síndrome de Angelman (AS) exibem nível de manchas nesses camundongos (também conhecidas como manchas de fundo). Injeção de AAV4‐STUb nos ventrículos laterais de camundongos com AS demonstra que o nível de manchas de proteína E6‐AP aumenta em comparação com camundongos AS. n=2.

[026] A Fig. 5 é uma imagem microscópica de manchas anti‐E6‐AP em camundongos não transgênicos. GFP (proteína fluorescente verde) é uma proteína citosólica que não é secretada. Isso sugere que Ube3a está sendo liberado das células ependimais e absorvido no parênquima.

[027] A Fig. 6 é uma imagem microscópica de manchas anti‐E6‐AP em camundongos não transgênicos que exibe imagens com maior ampliação do sistema ventricular (ventrículo lateral (LV), terceiro ventrículo). GFP (proteína fluorescente verde) é uma proteína citosólica que não é secretada. Isso sugere que Ube3a está sendo liberado das células ependimais e absorvido no parênquima.

[028] A Fig. 7 é uma imagem microscópica de manchas anti‐E6‐AP em camundongos AS que não receberam injeção.

[029] A Fig. 8 é uma imagem microscópica de manchas anti‐E6‐AP em camundongos AS que não receberam injeção, que exibe imagens com maior ampliação do sistema ventricular (ventrículo lateral (LV), terceiro ventrículo).

[030] A Fig. 9 é uma imagem microscópica de manchas anti‐E6‐AP em camundongos AS injetados no ventrículo lateral com AAV4‐STUb. Pode‐se observar expressão nas células ependimais, mas também foram observadas manchas no parênquima

9 / 51 imediatamente adjacente aos ventrículos (indicados com setas). GFP (proteína fluorescente verde) é uma proteína citosólica que não é secretada. Isso sugere que Ube3a está sendo liberado das células ependimais e absorvido no parênquima.

[031] A Fig. 10 é uma imagem microscópica de manchas anti‐E6‐AP em camundongos AS injetados no ventrículo lateral com AAV4‐STUb, que exibe imagens com maior ampliação do sistema ventricular (ventrículo lateral (LV), terceiro ventrículo). Pode‐se observar expressão nas células ependimais, mas são também observadas manchas no parênquima imediatamente adjacente aos ventrículos (indicados com setas). GFP (proteína fluorescente verde) é uma proteína citosólica que não é secretada. Isso sugere que Ube3a está sendo liberado das células ependimais e absorvido no parênquima.

[032] A Fig. 11 é uma imagem microscópica de manchas anti‐E6‐AP em camundongos com AS injetados no ventrículo lateral com AAV4‐STUb. Imagens com maior ampliação do sistema ventricular (ventrículo lateral (LV)) de expressão de Ube3a após fornecimento de AAV4‐STUb. Pode‐se observar expressão nas células ependimais, mas também foram observadas manchas no parênquima imediatamente adjacente aos ventrículos (indicados com setas). GFP (proteína fluorescente verde) é uma proteína citosólica que não é secretada. Isso sugere que Ube3a está sendo liberado das células ependimais e absorvido no parênquima.

[033] A Fig. 12 é uma imagem microscópica de manchas anti‐E6‐AP em camundongos com AS injetados no ventrículo lateral com AAV4‐STUb. Imagens com maior ampliação do sistema ventricular (terceiro ventrículo) de expressão de Ube3a após fornecimento de AAV4‐STUb. Pode‐se observar expressão nas células ependimais, mas também foram observadas manchas no parênquima imediatamente adjacente aos ventrículos (indicados com setas). GFP (proteína fluorescente verde) é uma proteína citosólica que não é secretada. Isso sugere que Ube3a está sendo liberado das células ependimais e absorvido no parênquima.

[034] A Fig. 13 é uma imagem microscópica de manchas anti‐E6‐AP em camundongos não transgênicos transfectados com GFP. Não se observa expressão com as injeções de AAV4‐GFP, o que demonstra apenas transdução das células do plexo coroidal e

10 / 51 ependimal. GFP (proteína fluorescente verde) é uma proteína citosólica que não é secretada. Isso sugere que Ube3a está sendo liberado das células ependimais e absorvido no parênquima.

[035] A Fig. 14 é uma imagem microscópica de manchas anti‐E6‐AP em camundongos com AS injetados no ventrículo lateral com AAV4‐STUb. Corte transversal em forma de seta do cérebro da expressão de Ube3a após fornecimento de AAV4‐STUb.

[036] A Fig. 15 é uma imagem microscópica de manchas anti‐E6‐AP em camundongos AS injetados no ventrículo lateral com AAV4‐STUb. Corte transversal em forma de seta do ventrículo lateral (LV) no cérebro que exibe expressão de Ube3a após fornecimento de AAV4‐STUb.

[037] A Fig. 16 é uma imagem microscópica de manchas anti‐E6‐AP em camundongos AS injetados no ventrículo lateral com AAV4‐STUb. Corte transversal em forma de seta do terceiro ventrículo (3V) no cérebro que exibe expressão de Ube3a após fornecimento de AAV4‐STUb.

[038] A Fig. 17 é uma imagem microscópica de manchas anti‐E6‐AP em camundongos com AS injetados no ventrículo lateral com AAV4‐STUb. Corte transversal em forma de seta do chifre interior do ventrículo lateral (LV) no cérebro que exibe expressão de Ube3a após fornecimento de AAV4‐STUb.

[039] A Fig. 18 é uma imagem microscópica de manchas anti‐E6‐AP em camundongos com AS injetados no ventrículo lateral com AAV4‐STUb. Corte transversal em forma de seta do ventrículo lateral (4V) no cérebro que exibe expressão de Ube3a após fornecimento de AAV4‐STUb.

[040] A Fig. 19 é uma imagem microscópica de manchas anti‐E6‐AP em camundongos com AS injetados no ventrículo lateral com AAV4‐STUb. Corte transversal em forma de seta do quarto ventrículo (LV) no cérebro que exibe expressão de Ube3a após fornecimento de AAV4‐STUb.

[041] A Fig. 20 é uma imagem microscópica de manchas anti‐E6‐AP em camundongos com AS injetados no ventrículo lateral com AAV4‐STUb. Corte transversal em forma de seta do cérebro com imagens com maior ampliação do sistema ventricular sobre o ventrículo lateral (LV) e (C) terceiro ventrículo (3V) da expressão de Ube3a após

11 / 51 fornecimento de AAV4‐STUb.

[042] A Fig. 21 é um mapa da construção de vetor UBE3A humano de acordo com a presente invenção. Os genes principais estão indicados.

[043] A Fig. 22 é Western Blot de lisato de células HEK293 transfectado com construção de hSTUb. As proteínas foram manchadas com anti‐E6AP.

[044] A Fig. 23 é Dot Blot com anti‐E6AP de células HEK293 transfectadas com construção hSTUb com sinal de GDNF ou sinal de insulina, que demonstra que o sinal de insulina funciona melhor para expressão e secreção.

[045] A Fig. 24 é Dot Blot que confirma a secreção de sinais de insulina utilizando anticorpo de marca anti‐HA.

[046] A Fig. 25(A) é uma ilustração da construção de plasmídeo f para a proteína GFP.

[047] A Fig. 25(B) é uma imagem de resultado de eletroforese de gel para a proteína GFP.

[048] A Fig. 25(C) é Dot Blot para diferentes sinais de secreção utilizando a construção GFP. A construção com o sinal de secreção sofreu transdução para cultivos celulares e dois clones foram obtidos de cada um. Os clones foram cultivados e os meios foram coletados.

[049] A Fig. 26(A) é uma ilustração da construção de plasmídeo f para a proteína E6‐ AP.

[050] A Fig. 26(B) é uma imagem de resultado de eletroforese de gel para a proteína E6‐AP.

[051] A Fig. 26(C) é Dot Blot para diferentes sinais de secreção utilizando a construção E6‐AP. A construção com o sinal de secreção sofreu transdução para cultivos celulares e dois clones foram obtidos de cada um. Os clones foram cultivados e os meios foram coletados.

[052] A Fig. 27 é Western Blot que exibe a eficácia de sinais de absorção de peptídeos celulares na indução da reabsorção da proteína por neurônios em células HEK293 transfectadas. As lises celulares foram adicionadas a novos cultivos celulares de células HEK293 e a concentração de E6‐AP nessas células após incubação foi medida por meio de Western Blot.

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[053] A Fig. 28(A) é um gráfico que exibe potenciais pós‐sinápticos excitantes de campo. Construção de Ube3A versão 1 (hUbev1), sinal de secreção e CPP TATk sofreram transdução por meio de um vetor rAAV em modelos de AS de camundongo. A potencialização a longo prazo do cérebro murino foi medida por meio de eletrofisiologia post‐mortem e comparada com camundongos controle modelo de AS com transfecção de GFP e camundongos controle do tipo selvagem.

[054] A Fig. 28(B) é um gráfico que exibe potenciais pós‐sinápticos excitantes de campo. Construção de Ube3A versão 1 (hUbev1), sinal de secreção e CPP TATk sofreram transdução por meio de um vetor rAAV em modelos de AS de camundongo. A potencialização a longo prazo do cérebro murino foi medida por meio de eletrofisiologia post‐mortem e comparada com camundongos controle modelo de AS com transfecção de GFP e camundongos controle do tipo selvagem. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[055] Da forma utilizada no presente, as formas no singular “um”, “uma” e “o/a” incluem referências ao plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Referência, por exemplo, a “polipeptídeo” inclui, portanto, misturas de dois ou mais polipeptídeos e similares.

[056] A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente possuem o mesmo significado compreendido comumente pelos técnicos comuns no assunto ao qual pertence a presente invenção. Embora possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos no presente, são descritos no presente alguns métodos e materiais potenciais e preferidos. Todas as publicações mencionadas no presente são integralmente incorporadas ao presente como referência para descrever e revelar os métodos e/ou materiais com relação aos quais as publicações são mencionadas. Compreende‐se que a presente invenção substitui qualquer revelação de publicações incorporadas quando houver contradições.

[057] Todas as designações numéricas, tais como pH, temperatura, tempo, concentração e peso molecular, incluindo faixas, são aproximações que variam para cima ou para baixo em intervalos de 1,0 ou 0,1, conforme apropriado. Deve‐se

13 / 51 compreender que, mesmo se nem sempre for indicado explicitamente, todas as designações numéricas são precedidas pela expressão “cerca de”. Deve‐se também compreender que, mesmo se nem sempre for indicado explicitamente, os reagentes descritos no presente são meros exemplos e seus equivalentes são conhecidos na técnica e podem ser substituídos pelos reagentes indicados explicitamente no presente.

[058] Da forma utilizada no presente, a expressão “que compreende” destina‐se a indicar que os produtos, composições e métodos incluem os componentes ou etapas indicadas, mas sem exclusão de outros. “Consiste essencialmente de”, quando utilizado para definir produtos, composições e métodos, deverá indicar a exclusão de outros componentes ou etapas com qualquer significado essencial. Composições que consistem essencialmente dos componentes indicados, portanto, não excluiriam contaminantes de traço e veículos farmaceuticamente aceitáveis. “Consiste de” deverá indicar a exclusão de mais que os elementos de traço ou outros componentes ou etapas.

[059] Da forma utilizada no presente relatório descritivo e nas reivindicações, as formas no singular “um”, “uma” e “o/a” incluem referências ao plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. “Um vetor”, por exemplo, inclui uma série de vetores.

[060] Da forma utilizada no presente, “cerca de” inclui aproximadamente ou próximo de e, no contexto de valor numérico ou faixa estabelecida, indica ±15% do número.

[061] “Vetor de vírus adeno‐associado (AAV)”, da forma utilizada no presente, indica um vetor de vírus adeno‐associado que pode ser elaborado para funcionalidade específica na terapia genética. Em alguns casos, AAV pode ser um vetor de vírus adeno‐associado recombinante, denominado rAAV. Embora AAV4 seja descrito para uso no presente, pode‐se utilizar qualquer AAV apropriado conhecido na técnica, incluindo, mas sem limitações, AAV9, AAV5, AAV1 e AAV4.

[062] “Administração” ou “administrar” é utilizado para descrever o processo no qual compostos de acordo com a presente invenção, isoladamente ou em combinação com outros compostos, são fornecidos ao paciente. A composição pode ser administrada de

14 / 51 diversas formas, incluindo injeção no sistema nervoso central que inclui o cérebro, incluindo, mas sem limitações, injeção intrastratial, intra‐hipocampal, na área tegmental ventral (VTA), intracerebral, intracerebelar, intramedular, intranigral, intraventricular, intracisterna, intracraniana, intraparenquimal, incluindo na medula espinhal e no tronco encefálico; oral; parenteral (incluindo intravenosa, intra‐arterial e outras vias parenterais apropriadas); intratecal; intramuscular; subcutânea; retal; e nasal, entre outras. Cada uma dessas condições pode ser facilmente tratada utilizando outras vias de administração de compostos de acordo com a presente invenção para tratar doenças ou condições.

[063] “Tratamento” ou “tratar”, da forma utilizada no presente, indica qualquer um dentre: alívio, melhoria, eliminação e/ou estabilização de sintomas, bem como atraso na progressão de sintomas de distúrbios específicos. “Tratamento” de doenças neurodegenerativas pode incluir, por exemplo, qualquer um ou mais dos seguintes: melhoria e/ou eliminação de um ou mais sintomas associados à doença neurodegenerativa, redução de um ou mais sintomas da doença neurodegenerativa, estabilização de sintomas da doença neurodegenerativa e atraso na progressão de um ou mais sintomas da doença neurodegenerativa.

[064] “Prevenção” ou “prevenir”, da forma utilizada no presente, indica qualquer um dentre: suspensão dos efeitos da doença neurodegenerativa, redução dos efeitos da doença neurodegenerativa, redução da incidência da doença neurodegenerativa, redução do desenvolvimento da doença neurodegenerativa, atraso do início dos sintomas da doença neurodegenerativa, aumento do tempo até o início dos sintomas da doença neurodegenerativa e redução do risco de desenvolvimento da doença neurodegenerativa.

[065] As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem ser formuladas de acordo com métodos conhecidos de preparação de composições farmaceuticamente úteis. Além disso, conforme utilizado no presente, a expressão “veículo farmaceuticamente aceitável” indica qualquer um dos veículos farmaceuticamente aceitáveis padrão. O veículo farmaceuticamente aceitável pode incluir diluentes, adjuvantes e veículos, bem como veículos de implante, e diluentes,

15 / 51 cargas líquidas ou sólidas não tóxicas e inertes ou material encapsulante que não reage com os ingredientes ativos de acordo com a presente invenção. Exemplos incluem, mas sem limitações, solução salina tamponada com fosfato, solução salina fisiológica, água e emulsões, tais como emulsões de óleo em água. Em algumas realizações, o veículo farmaceuticamente aceitável pode ser um permeabilizante hematoencefálico, incluindo, mas sem limitações, manitol. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão que contém, por exemplo, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido e similares), suas misturas apropriadas e óleos vegetais. As formulações são descritas em uma série de fontes que são bem conhecidas e facilmente disponíveis para os técnicos no assunto. Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E. W. (1995), Easton, Pensilvânia, Mack Publishing Company, 19ª ed.), por exemplo, descreve formulações que podem ser utilizadas em conjunto com a presente invenção.

[066] Da forma utilizada no presente, “animal” indica um organismo eucariótico multicelular classificado no reino Animalia ou Metazoa. O termo inclui, mas sem limitações, mamíferos. Exemplos não limitadores incluem roedores, mamíferos, mamíferos aquáticos, animais domésticos tais como cães e gatos, animais de criação como carneiros, porcos, vacas e cavalos, e seres humanos. Quando forem utilizados os termos “animal” ou o plural “animais”, contempla‐se que eles também se apliquem a quaisquer animais.

[067] Da forma utilizada no presente, a expressão “substituição conservadora” designa a substituição de aminoácidos por outros aminoácidos que possuem propriedades similares (por exemplo, ácidos, básicos, com carga positiva ou negativa, polares ou não polares). Cada um dos seis grupos a seguir contém aminoácidos que são substituições conservadoras entre si: 1) alanina (A), serina (S), treonina (T); 2) ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E); 3) asparagina (N), glutamina (Q); 4) arginina (R), lisina (K); 5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V); e 6) fenilalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W).

[068] Da forma utilizada no presente, “mutação conservadora” designa substituição de um nucleotídeo por outro que resulta em ausência de alteração da codificação de

16 / 51 aminoácido, ou seja, alteração para sequência redundante nos códons degenerados ou substituição que resulta em substituição conservadora. Um exemplo de redundância de códons é exibido nas Tabelas 1 e 2. Tabela 1

[069] Aminoácidos (com base em categoria) e aminoácidos codificados correspondentes redundantes e com código triplo (com base em categoria de grupo funcional): Não polar, Polar, não alifático carregado GGT AGT GGC AGC GGA TCT Gly G Ser S GGG TCC TCA TCG GCT ACT GCC ACC Ala A Thr T GCA ACA GCG ACG GTT TGT GTC TGC Val V Cys C GTA GTG TTA CCT TTG CCC CTT CCA Leu L Pro P CTC CTA CCG CTG AAT Met M ATG Asn N AAC ATT CAA Ile I ATC Gln Q CAG ATA Carga Aromático positiva TTT AAA Phe F Lys K TTC AAG TAT CAT Tyr Y His H TAC CAC

17 / 51 CGT CGC CGA Trp W TGG Arg R CGG AGA AGG Carga Outros negativa TTA GAT Asp D parada TAG GAC TGA GAA Glu E GAG Tabela 2

[070] Código triplo redundante e aminoácidos codificados correspondentes: U C A G UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Cys UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Cys U UUA Leu UCA Ser UAA END UGA END UUG Leu UCG Ser UAG END UGG Trp CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg C CUA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser A AUA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg AUG Met ACG The AAG Lys AGG Arg GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly G GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly

[071] Segundo a Tabela 2, portanto, mutações conservadoras do códon UUA incluem UUG, CUU, CUC, CUA e CUG.

[072] Da forma utilizada no presente, o termo “homólogo” indica uma sequência de nucleotídeos que possui identidade de sequências de pelo menos 80%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 90%, de maior preferência identidade de sequências de pelo menos 95% e, de preferência ainda maior,

18 / 51 identidade de sequências de pelo menos 98% com a sequência alvo. Variações da sequência de nucleotídeos podem ser mutações conservadoras na sequência de nucleotídeos, ou seja, mutações do código triplo que codificam o mesmo aminoácido observado na Tabela 2.

[073] Da forma utilizada no presente, a expressão “quantidade terapeuticamente eficaz” indica a quantidade de terapia (por exemplo, agente terapêutico ou vetor) suficiente para resultar na melhoria da síndrome de Angelman, outro distúrbio relativo a UBE3A ou um ou mais de seus sintomas, evitar o avanço da síndrome de Angelman ou outro distúrbio relativo a UBE3A, ou causar regressão da síndrome de Angelman ou outro distúrbio relativo a UBE3A. Segundo a presente invenção, o tamanho de dose única apropriado é a dose que seja capaz de evitar ou aliviar (reduzir ou eliminar) sintomas em pacientes quando administrada uma ou mais vezes ao longo de um período de tempo apropriado. Os técnicos no assunto podem determinar facilmente tamanhos de dose única apropriados para administração sistêmica com base no tamanho do mamífero e na via de administração.

[074] A dosagem de compostos e composições de acordo com a presente invenção para obter efeito terapêutico ou profilático é determinada pelas circunstâncias do paciente, como é conhecido na técnica. A dosagem de pacientes no presente pode ser realizada por meio de doses individuais ou unitárias dos compostos ou composições do presente, ou por meio de uma dose combinada, previamente embalada ou pré‐ formulada de compostos ou composições. O cérebro de camundongos médios de 40 g pesa 0,416 g, o cérebro de camundongos de 160 g pesa 1,02 g e o cérebro de camundongos de 250 g pesa 1,802 g. O cérebro humano médio pesa 1508 g, o que pode ser utilizado para determinar a quantidade de produto terapêutico necessária ou útil para realizar o tratamento descrito no presente.

[075] Exemplos não limitadores de dosagens incluem, mas sem limitações: 5,55 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 5,75 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 5,8 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 5,9 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 6,0 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 6,1 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 6,2 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 6,3 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 6,4 x 1011

19 / 51 genomas/g de massa cerebral, 6,5 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 6,6 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 6,7 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 6,8 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 6,9 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 7,0 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 7,1 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 7,2 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 7,3 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 7,4 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 7,5 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 7,6 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 7,7 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 7,8 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 7,9 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 8,0 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 8,1 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 8,2 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 8,3 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 8,4 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 8,5 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 8,6 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 8,7 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 8,8 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 8,9 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 9,0 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 9,1 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 9,2 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 9,3 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 9,4 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 9,5 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 9,6 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 9,7 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 9,80 x 1011 genomas/g de massa cerebral, 1,0 x 1012 genomas/g de massa cerebral, 1,1 x 1012 genomas/g de massa cerebral, 1,2 x 1012 genomas/g de massa cerebral, 1,3 x 1012 genomas/g de massa cerebral, 1,4 x 1012 genomas/g de massa cerebral, 1,5 x 1012 genomas/g de massa cerebral, 1,6 x 1012 genomas/g de massa cerebral, 1,7 x 1012 genomas/g de massa cerebral, 1,8 x 1012 genomas/g de massa cerebral, 1,9 x 1012 genomas/g de massa cerebral, 2,0 x 1012 genomas/g de massa cerebral, 2,1 x 1012 genomas/g de massa cerebral, 2,2 x 1012 genomas/g de massa cerebral, 2,3 x 1012 genomas/g de massa cerebral, 2,40 x 1012 genomas/g de massa cerebral, 2,5 x 1012 genomas/g de massa cerebral, 2,6 x 1012 genomas/g de massa cerebral, 2,7 x 1012 genomas/g de massa cerebral, 2,75 x 1012 genomas/g de massa cerebral, 2,8 x 1012 genomas/g de massa cerebral ou 2,86 x 1012 genomas/g de massa cerebral.

[076] As composições de acordo com a presente invenção podem ser administradas individualmente, em combinação ou simultaneamente com um ou mais produtos

20 / 51 terapêuticos diferentes para distúrbios neurodegenerativos, especificamente distúrbios de deficiência de UBE3A.

[077] Da forma utilizada no presente, “paciente” é empregado para descrever animais, preferencialmente seres humanos, a quem é administrado tratamento, incluindo tratamento profilático, com as composições de acordo com a presente invenção.

[078] “Distúrbio neurodegenerativo” ou “doença neurodegenerativa”, da forma utilizada no presente, indica qualquer experiência ou comportamento mental ou físico anormal, no qual a morte ou disfunção de células neuronais é envolvida na etiologia do distúrbio. Além disso, a expressão “doença neurodegenerativa”, da forma utilizada no presente, descreve “doenças neurodegenerativas” que são associadas a deficiências de UBE3A. Exemplos de doenças neurodegenerativas incluem síndrome de Angelman, mal de Huntington, mal de Alzheimer, mal de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, distúrbios do espectro autista, epilepsia, esclerose múltipla, síndrome de Prader‐Willi, síndrome do X frágil, síndrome de Rett e mal de Pick.

[079] “Deficiência de UBE3A”, da forma utilizada no presente, indica mutação ou exclusão no gene UBE3A.

[080] O termo “normal” ou “controle”, da forma utilizada no presente, indica uma amostra, células ou paciente que se determinou não serem portadores de síndrome de Angelman, nenhuma outra doença neurodegenerativa ou nenhum outro distúrbio neurológico de deficiência de UBE3A.

[081] Geralmente, formou‐se um vetor UBE3A utilizando‐se uma sequência de iniciação da transcrição e uma construção UBE disposta a jusante da sequência de iniciação da transcrição. A construção UBE é formada de uma sequência UBE3A, sequência de secreção e sequência de captação de células. Exemplos não limitadores da sequência UBE3A são SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 17, cDNA de SEQ ID N° 10, cDNA de SEQ ID N° 16 ou sequência homóloga. Variações da sequência de DNA incluem mutações conservadoras do código triplo de DNA, conforme observado nas Tabelas 1 e 2. Em variações específicas, a sequência UBE3A é UBE3A de Mus musculus ou UBE3A de Homo sapiens variante 1, variante 2 ou variante

21 / 51

3.

[082] Exemplos não limitadores da sequência de secreção são SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 12, cDNA de SEQ ID N° 3, cDNA de SEQ ID N° 7, cDNA de SEQ ID N° 18, cDNA de SEQ ID N° 19 ou sequência homóloga, com variações da sequência de DNA que incluem as mutações conservadoras mencionadas acima.

[083] Exemplos não limitadores da sequência de captação de células são SEQ ID N° 6, cDNA de SEQ ID N° 8, cDNA de SEQ ID N° 13, cDNA de SEQ ID N° 20, cDNA de SEQ ID N° 21, cDNA de SEQ ID N° 22 ou sequência homóloga. Variações da sequência de DNA incluem as mutações conservadoras mencionadas acima.

[084] Em variações específicas da presente invenção, a sequência de secreção é disposta a montante da sequência UBE3A e, mais especificamente, é opcionalmente disposta a montante da sequência UBE3A e a jusante da sequência de secreção. Outras proteínas de absorção possíveis incluem penetratina, TATk, pVEC, transportan, MPG, Pep‐1, poliargininas, MAP e R6W3.

[085] Em algumas variações da presente invenção, a sequência de iniciação da transcrição é um promotor híbrido de beta‐actina de galinha e citomegalovírus ou promotor humano de ubiquitina c. A presente invenção inclui opcionalmente uma sequência intensificadora. Um exemplo não limitador da sequência intensificadora é uma sequência intensificadora imediata‐precoce de citomegalovírus disposta a montante da sequência de iniciação da transcrição. O vetor também inclui opcionalmente um elemento regulador pós‐transcricional para hepatite por marmota. Os promotores, sequências facilitadoras e elementos reguladores pós‐transcricional relacionados são bem conhecidos na técnica (Garg, S. et al, The hybrid cytomegalovirus enhancer/chicken beta‐actin promotor along with woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances the protective efficacy of DNA vaccines, J. Immunol., 1º de julho de 2004; 173 (1): 550‐558; Higashimoto, T. et al, The woodchuck hepatitis virus post‐transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors, setembro de 2007; 14 (17): 1298‐304; Cooper, A. R. et al, Rescue of splicing‐mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter, Nucleic Acids Res., janeiro de 2015;

22 / 51 43 (1): 682‐90).

[086] Em algumas variações, o vetor é inserido em um plasmídeo, tal como um plasmídeo com duas bases do serótipo do vírus adeno‐associado recombinante. Em variações específicas, o plasmídeo com duas bases do serótipo do vírus adeno‐ associado recombinante não contém elementos de integração de DNA. Um exemplo não limitador do plasmídeo com duas bases do serótipo do vírus adeno‐associado recombinante é um plasmídeo pTR.

[087] Um método de síntese do vetor UBE3A inclui a inserção de uma construção de UBE3A em um plasmídeo de cadeia principal que possui uma sequência de iniciação da transcrição. A construção TBE3A é formada de uma sequência UBE3A, sequência de secreção e sequência de captação de células, conforme descrito acima. O gene Ube3a, por exemplo, foi clonado e fundido em quadro com a sequência de DNA 3’ (terminal N com duas outras sequências de peptídeos), peptídeo de sinal e sequências HIV TAT, que foram clonadas em um vetor viral adeno‐associado recombinante para expressão da proteína E6‐AP secretada no cérebro e na medula espinhal de pacientes com AS. A construção UBE é opcionalmente inserida por meio de divisão do plasmídeo de cadeia principal com pelo menos uma endonuclease e a construção UBE3A é ligada às extremidades divididas do plasmídeo de cadeia principal.

[088] O vetor foi opcionalmente inserido em seguida em um hospedeiro de amplificação, que possui um gene de resistência a antibióticos, e submetido a uma seleção de antibióticos correspondente ao gene de resistência a antibióticos. O hospedeiro de amplificação foi expandido em seguida em um meio que contém a seleção de antibióticos e o hospedeiro de amplificação expandido coletado. O vetor foi isolado em seguida do hospedeiro de amplificação. Em variações específicas da presente invenção, o gene de resistência a antibióticos é um gene de resistência à ampicilina, com a seleção de antibiótico correspondente, ampicilina.

[089] Em realização preferida, o vetor UBE3A é formado a partir de cDNA clonado a partir de um gene UBE3A de Homo sapiens para formar o gene UBE3A, versão 1 (SEQ ID N° 9), que é fundido a um gene codificador de peptídeo de sinalização de secreção, tal como GDNF, insulina ou IgK. Em realização preferida, utiliza‐se GDNF. A construção

23 / 51 é inserida no vetor hSTUb, sob promotor híbrido de beta‐actina de galinha e CMV (preferido) ou promotor humano de ubiquitina c. Elemento regulador pós‐ transcricional para hepatite por marmota (WPRE) está presente para aumentar os níveis de expressão.

[090] A construção de sinal de secreção de UBE3A é fixada em seguida a um peptídeo de absorção celular (peptídeo da penetração celular ou CPP), tal como HIV TAT ou HIV TATk (preferido). O vetor UBE3A humano é transformado em seguida em hospedeiro de amplificação, tal como E. coli, utilizando o método de choque de calor descrito no Exemplo 2. O E. coli transformado foi expandido em caldo que contém ampicilina para selecionar o vetor e coletar grandes quantidades de vetor. Doses de vetor terapeuticamente eficazes podem ser administradas ao paciente em seguida como terapia genética para o tratamento de síndrome de Angelman ou outro distúrbio neurológico que possui deficiência de UBE3A. O vetor pode ser administrado por meio de injeção no hipocampo ou ventrículos, em alguns casos de forma bilateral. As dosagens do produto terapêutico podem variar de cerca da 5,55 x 1011 a 2,86 x 1012 genomas/g de massa cerebral. Exemplo 1

[091] Eficiência do sinal de secreção:

[092] Para testar a eficácia do sinal de secreção, GFP (SEQ ID N° 1) (XM 013480425.1) foi clonado em quadro com insulina humana, GDNF (SEQ ID N° 2) (AB675653.1) ou peptídeos de sinal IgK: ATGGCTCGTC TTTCTTTTGT TTCTCTTCTT TCTCTGTCAC TGCTCTTCGG GCAGCAAGCA GTCAGAGCTC AGAATTACAC CATGGTGAGC AAGGGCGAGG AGCTGTTCAC CGGGGTGGTG CCCATCCTGG TCGAGCTGGA CGGCGACGTA AACGGCCACA AGTTCAGCGT GTCCGGCGAG GGCGAGGGCG ATGCCACCTA CGGCAAGGAC TGCCTGAAGT TCATCTGCAC CACCGGCAAG CTGCCCGTGC CCTGGCCCAC CCTCGTGACC ACCTTCGGCT ACGGCCTGAT GTGCTTCGCC CGCTACCCCG ACCACATGAA GCAGCACGAC TTCTTCAAGT CCGCCATGCC CGAAGGCTAC GTCCAGGAGC GCACCATCTT CTTCAAGGAC GACGGCAACT ACAAGACCCG CGCCGAGGTG AAGTTCGAGG GCGACACCCT GGTGAACCGC ATCGAGCTGA AGGGCATCGA CTTCAAGGAG GACGGCAACA TCCTGGGGCA CAAGCTGGAG TACAACTACA

24 / 51 ACAGCCACAA CGTCTATATC ATGGCCGACA AGCAGAAGAA CGGCATCAAG GTGAACTTCA AGATCCGCCA CAACATCGAG GACGGCAGCG TGCAGCTCGC CGACCACTAC CAGCAGAACA CCCCCATCGG CGACGGCCCC GTGCTGCTGC CCGACAACCA CTACCTGAGC TACCAGTCCG CCCTGAGCAA AGACCCCAAC GAGAAGCGCG ATCACATGGT CCTGCTGGAG TTCGTGACCG CCGCCGGGAT CACTCTCGGC ATGGACGAGC TATACAAGTG GGCGCGCCAC TCGAGACGAA TCACTAGTGA ATTCGCGGCC GCCTGCAGGT CGAGGTTTGC AGCAGAGTAG (SEQ ID N° 1); fundidos com proteína de secreção com base em GDNF: ATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCTGTCTGCCTGGTGCTGCTCCACACCGCGTCCGCC (SEQ ID N° 2) (XM 017009337.2), que codifica: MKLWDVVAVCLVLLHTASA (SEQ ID N° 3) (AAC98782.1).

[093] A construção foi inserida em plasmídeo pTR e transfectada em células HEK293 (Coleção Norte‐Americana de Cultivos de Tipos, Manassas VA). Células HEK293 foram cultivadas a CO2 a 5% e 37 °C em Meio Essencial Modificado da Dulbecco (DMEM) com 10% de FBS e 1% Pen/Strep e subcultivada a 80% de confluência.

[094] O vetor (2 µg/cavidade em placa com seis cavidades) foi transfectado nas células utilizando‐se método de transfecção PEI. As células foram subcultivadas a 0,5 x 106 células por cavidade em placas com seis cavidades com meio DMEM dois dias antes da transfecção. O meio foi substituído na noite antes da transfecção. dH2O livre de endotoxinas foi aquecida a cerca de 80 °C e dissolveu‐se polietilenoimina (Sigma‐ Aldrich Co. LLC, St. Louis MO, Estados Unidos). A solução foi resfriada a cerca de 25 °C e neutralizada utilizando‐se hidróxido de sódio. Adicionou‐se vetor AAV4‐STUb ou controle negativo (somente meio) a DMEM livre de soro a 2 µg a cada 200 µl para cada cavidade transfectada e foram adicionados 9 µl de 1 µg/µl de polietilenoimina à mistura para cada cavidade. A mistura de transfecção foi incubada à temperatura ambiente por 15 minutos, adicionada em seguida a cada cavidade de células a 210 µl por cavidade e incubada por 48 horas.

[095] Foram coletados meios de cada cavidade de cultivo e 2 µl foram manchados sobre uma membrana de nitrocelulose utilizando‐se uma pipeta pontiaguda. Após a secagem das amostras, a membrana foi bloqueada por meio da aplicação de BSA a 5% em TBS‐T à membrana e incubação à temperatura ambiente por trinta minutos a uma

25 / 51 hora, seguida pela incubação da membrana com anti‐GFP de galinha (5 µg/ml, Abcam PLC, Cambridge, Reino Unido; n° ab13970) em BSA/TBS‐T por 30 minutos à temperatura ambiente. A membrana foi lavada com TBS‐T por três vezes, cinco minutos para cada lavagem. A membrana foi incubada com anticorpo secundário conjugado anti‐HRP de galinha (Southern Biotechnology, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham MA, Estados Unidos; n° 6100‐05, 1/3000) conjugado com HRP por 30 minutos à temperatura ambiente, seguido por lavagem da membrana por três vezes com TBS‐T, uma vez por 15 minutos e lavagens subsequentes a cada cinco minutos. A membrana foi lavada com TBS por cinco minutos à temperatura ambiente e incubada com reagente de luminescência por um minuto (Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha; n° WBKLS0100). A membrana foi registrada em um Formador de Imagens GE Amersham 600 (General Electric, Fairfield CA, Estados Unidos), exibido na Fig. 1.

[096] Conforme observado na Fig. 1, todos os três sinais de secreção resultaram na liberação de proteína marcada com GFP de células conforme observado por meio de comparação com células controle não transfectadas. Das três construções de secreção, a construção de IgK exibiu o nível mais alto de secreção, embora o clone 2 da construção de GDNF realmente exibisse secreção alta similar de proteína marcada com GFP. Exemplo 2

[097] Construção de vetor UBE3A de camundongo:

[098] Foi gerada uma construção de vetor UBE3A de camundongo utilizando‐se um plasmídeo pTR. O gene UBE3A de camundongo (Mus musculus) foi formado a partir de cDNA (U82122.1): ATGAAGCGAG CAGCTGCAAA GCATCTAATA GAACGCTACT ACCATCAGTT AACTGAGGGC TGTGGAAATG AGGCCTGCAC GAATGAGTTT TGTGCTTCCT GTCCAACTTT TCTTCGTATG GATAACAATG CAGCAGCTAT TAAAGCCCTT GAGCTTTATA AAATTAATGC AAAACTCTGT GATCCTCATC CCTCCAAGAA AGGAGCAAGC TCAGCTTACC TTGAGAACTC AAAAGGTGCA TCTAACAACT CAGAGATAAA AATGAACAAG AAGGAAGGAA AAGATTTTAA AGATGTGATT TACCTAACTG AAGAGAAAGT ATATGAAATT TATGAATTTT GTAGAGAGAG TGAGGATTAT TCCCCTTTAA TTCGTGTAAT TGGAAGAATA TTTTCTAGTG CTGAGGCACT GGTTCTGAGC

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TTTCGGAAAG TCAAACAGCA CACAAAGGAG GAATTGAAAT CTCTTCAAGA AAAGGATGAA GACAAGGATG AAGATGAAAA GGAAAAAGCT GCATGTTCTG CTGCTGCTAT GGAAGAAGAC TCAGAAGCAT CTTCTTCAAG GATGGGTGAT AGTTCACAGG GAGACAACAA TGTACAAAAA TTAGGTCCTG ATGATGTGAC TGTGGATATT GATGCTATTA GAAGGGTCTA CAGCAGTTTG CTCGCTAATG AAAAATTAGA AACTGCCTTC CTGAATGCAC TTGTATATCT GTCACCTAAC GTGGAATGTG ATTTGACATA TCATAATGTG TATACTCGAG ATCCTAATTA TCTCAATTTG TTCATTATTG TAATGGAGAA TAGTAATCTC CACAGTCCTG AATATCTGGA AATGGCGTTG CCATTATTTT GCAAAGCTAT GTGTAAGCTA CCCCTTGAAG CTCAAGGAAA ACTGATTAGG CTGTGGTCTA AATACAGTGC TGACCAGATT CGGAGAATGA TGGAAACATT TCAGCAACTT ATTACCTACA AAGTCATAAG CAATGAATTT AATAGCCGAA ATCTAGTGAA TGATGATGAT GCCATTGTTG CTGCTTCAAA GTGTTTGAAA ATGGTTTACT ATGCAAATGT AGTGGGAGGG GATGTGGACA CAAATCATAA TGAGGAAGAT GATGAAGAAC CCATACCTGA GTCCAGCGAA TTAACACTTC AGGAGCTTCT GGGAGATGAA AGAAGAAATA AGAAAGGTCC TCGAGTGGAT CCACTAGAAA CCGAACTTGG CGTTAAAACT CTAGACTGTC GAAAACCACT TATCTCCTTT GAAGAATTCA TTAATGAACC ACTGAATGAT GTTCTAGAAA TGGACAAAGA TTATACCTTT TTCAAAGTTG AAACAGAGAA CAAATTCTCT TTTATGACAT GTCCCTTTAT ATTGAATGCT GTCACAAAGA ATCTGGGATT ATATTATGAC AATAGAATTC GCATGTACAG TGAAAGAAGA ATCACTGTTC TTTACAGCCT AGTTCAAGGA CAGCAGTTGA ATCCGTATTT GAGACTCAAA GTCAGACGTG ACCATATTAT AGATGATGCA CTGGTCCGGC TAGAGATGAT TGCTATGGAA AATCCTGCAG ACTTGAAGAA GCAGTTGTAT GTGGAATTTG AAGGAGAACA AGGAGTAATG AGGGAGGCGT TTCCAAAGAG TTTTTTCAGT TGGGTTGTGG AGGAAATTTT TAATCCAAAT ATTGGTATGT TCACATATGA TGAAGCTACG AAATTATTTT GGTTTAATCC ATCTTCTTTT GAAACTGAGG GTCAGGTTTA CTCTGATTGG CATATCCTGG GTCTGGCTAT TTACAATAAT TGTATACTGG ATGTCCATTT TCCCATGGTT GTATACAGGA AGCTAATGGG GAAAAAAGGA ACCTTTCGTG ACTTGGGAGA CTCTCACCCA GTTTTATATC AGAGTTTAAA GGATTTATTG GAATATGAAG GGAGTGTGGA AGATGATATG ATGATCACTT TCCAGATATC ACAGACAGAT CTTTTTGGTA ACCCAATGAT GTATGATCTA AAAGAAAATG GTGATAAAAT TCCAATTACA AATGAAAACA GGAAGGAATT TGTCAATCTC TATTCAGACT ACATTCTCAA TAAATCTGTA GAAAAACAAT TCAAGGCATT TCGCAGAGGT TTTCATATGG TGACTAATGA ATCGCCCTTA AAATACTTAT TCAGACCAGA AGAAATTGAA TTGCTTATAT GTGGAAGCCG GAATCTAGAT

27 / 51 TTCCAGGCAC TAGAAGAAAC TACAGAGTAT GACGGTGGCT ATACGAGGGA ATCTGTTGTG ATTAGGGAGT TCTGGGAAAT TGTTCATTCG TTTACAGATG AACAGAAAAG ACTCTTTCTG CAGTTTACAA CAGGCACAGA CAGAGCACCT GTTGGAGGAC TAGGAAAATT GAAGATGATT ATAGCCAAAA ATGGCCCAGA CACAGAAAGG TTACCTACAT CTCATACTTG CTTTAATGTC CTTTTACTTC CGGAATATTC AAGCAAAGAA AAACTTAAAG AGAGATTGTT GAAGGCCATC ACATATGCCA AAGGATTTGG CATGCTGTAA (SEQ ID N° 4) (U82122.1).

[099] O cDNA foi subclonado e sequenciado. O gene UBE3A de camundongo (SEQ ID N° 4) foi fundido a sequências de DNA que codificam o peptídeo de sinalização de secreção GDNF (SEQ ID N° 5) e a sequência HIV TAT de peptídeo de absorção celular (SEQ ID N° 6). O peptídeo de sinalização de secreção possui a sequência de DNA: ATG GCC CTG TTG GTG CAC TTC CTA CCC CTG CTG GCC CTG CTT GCC CTC TGG GAG CCC AAA CCC ACC CAG GCT TTT GTC (SEQ ID N° 5) (NM 008386.4), que codifica a sequência de proteínas: MALLVHFLPLLALLALWEPKPTQAFV (SEQ ID N° 7) (NP 032412.3); enquanto a sequência HIV TAT é: TAC GGC AGA AAG AAG AGG AGG CAG AGA AGG AGA (SEQ ID N° 6), que codifica a sequência de proteínas: YGRKKRRQRRR (SEQ ID N° 8) (AIW51918.1).

[100] A sequência de construção de SEQ ID N° 4 fundida com SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6 foi inserida em um plasmídeo pTR. O plasmídeo foi dividido utilizando‐se endonucleases Age I e Xho I e a sequência de construção foi ligada utilizando ligase. O vetor contém duas repetições terminais de serótipo AAV, promotor híbrido de beta‐ actina de galinha‐CMF e WPRE, observados na Fig. 2. O plasmídeo recombinante não contém os elementos Rep e Cap, o que limita a integração do plasmídeo em DNA hospedeiro.

[101] O vetor (vetor AAV4‐STub) foi transformado em seguida em Escherichia coli (E. coli, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham MA, Estados Unidos; células SURE2). Resumidamente, as células foram equilibradas em gelo, adicionou‐se 1 pg a 500 ng do vetor ao E. coli e foi mantida a incubação por cerca de um minuto. As células sofreram eletroporação com Pulsador Genético BioRad em uma cubeta de 0,1 cm (1,7

28 / 51 V, 200 Ohms). Os E. coli foram cultivados em seguida em meios por 60 minutos antes da colocação em placas sobre agar, tal como meio ATCC 1065 (Coleção Norte‐ Americana de Cultivos de Tipos, Manassas VA, Estados Unidos) com ampicilina (50 µg/ml). E. coli foi expandido em caldo que contém ampicilina para coletar grandes quantidades de vetor. Exemplo 3

[102] Teste in vitro de construção de vetor UBE3A de camundongo:

[103] As propriedades de vetor de camundongo da construção gerada no Exemplo 2 foram testadas em células HEK293 (Coleção Norte‐Americana de Cultivos de Tipos, Manassas VA, Estados Unidos). Células HEK293 foram cultivadas a CO2 a 5% e 37 °C em Meio Essencial Modificado da Dulbecco (DMEM) com 10% de FBS e 1% Pen/Strep e subcultivadas a 80% de confluência.

[104] O vetor (2 µg/cavidade em placa com seis cavidades) foi transfectado nas células utilizando‐se método de transfecção PEI. As células foram subcultivadas a 0,5 x 106 células por cavidade em placas com seis cavidades com meio DMEM dois dias antes da transfecção. O meio foi substituído na noite antes da transfecção. dH2O livre de endotoxinas foi aquecida a cerca de 80 °C e dissolveu‐se polietilenoimina (Sigma‐ Aldrich Co. LLC, St. Louis MO, Estados Unidos). A solução foi mantida em resfriamento a cerca de 25 °C e neutralizada utilizando‐se hidróxido de sódio. Adicionou‐se vetor AAV4‐STUb ou controle negativo (somente meio) a DMEM livre de soro a 2 µg a cada 200 µl para cada cavidade transfectada e foram adicionados 9 µl de 1 µg/µl de polietilenoimina à mistura para cada cavidade. A mistura de transfecção foi incubada à temperatura ambiente por 15 minutos, adicionada em seguida a cada cavidade de células a 210 µl por cavidade e incubada por 48 horas.

[105] Meios foram coletados de células transfectadas com vetor AAV4‐STUb, células controle transfectadas somente com meio e células controle não transfectadas. O meio foi conduzido sobre Western Blot e manchado com anticorpo anti‐E6‐AP de coelho (A300‐351A, Bethyl Labs, Montgomery TX, Estados Unidos), que é reativo contra E6‐AP humano e de camundongos, a 0,4 µg/ml. Realizou‐se conjugação secundária com peroxidase de rabanete silvestre conjugado com coelho (Southern

29 / 51 Biotechnology, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham MA, Estados Unidos). Os resultados foram determinados de forma densiométrica e demonstram que as células HEK293 transfectadas com AAV4‐STUb secretam proteína E6‐AP no meio, conforme observado na Fig. 3. Exemplo 4

[106] Teste in vivo de construção de vetor UBE3A de camundongo:

[107] Camundongos transgênicos foram formados por meio de retrocruzamento de camundongos que possuem exclusão no UBE3A materno (Jiang et al, Mutation of the Angelman ubiquitin ligase em mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long‐term potentiation, Neuron, outubro de 1998; 21 (4): 799‐ 811; Gustin et al, Tissue‐specific variation of Ube3a protein expression in rodents and in a mouse model of Angelman syndrome, Neurobiol. Dis., setembro de 2010; 39 (3): 283‐ 91; Heck et al, Analysis of cerebellar function in Ube3a‐deficient mice reveals novel genotype‐specific behaviors, Hum. Mol. Genet., 15 de julho de 2008; 17 (14): 2181‐9) e GABARB3. Os camundongos foram abrigados em um ciclo de 12 horas de luz do dia e receberam alimento e água à vontade. Camundongos com três meses de idade foram tratados com o vetor.

[108] Os camundongos foram anestesiados com isoflurano e colocados no aparelho estereotáxico (Instrumento Estereotáxico Somente para Camundongos Digital 51725D, Stoelting, Wood Dale IL, Estados Unidos). Foi realizada uma incisão em forma de seta no meio do crânio e a pele circunvizinha foi empurrada para trás, para aumentar a abertura. As coordenadas a seguir foram utilizadas para localizar o hipocampo esquerdo e direito: AP 22,7 mm, L 62,7 mm e V 23,0 mm. Os camundongos receberam injeções intra‐hipocampais bilaterais de partículas de AAV4‐STUb em concentração de 1x1012 genomas/ml (N=2) em 10 µl de manitol a 20% ou veículo (10 µl de manitol a 20%) utilizando‐se uma seringa Hamilton de 10 ml em cada hemisfério. A ferida foi limpa com salmoura e fechada utilizando Vetbond (NC9286393 Fisher Scientific, Pittsburgh PA, Estados Unidos). Animais controle incluíram camundongos AS que não receberam injeção e ninhadas de camundongos do tipo selvagem (n=2). Os camundongos foram recuperados em uma gaiola limpa e vazia sobre uma almofada de

30 / 51 aquecimento quente e abrigados isoladamente em seguida até o sacrifício. Os camundongos foram monitorados ao longo do experimento.

[109] No dia 30 após o tratamento, os camundongos sofreram eutanásia por meio de injeção de solução de eutanásia comercial, Somnasol® (0,22 ml/kg), por via intraperitoneal. Após a eutanásia dos animais, CSF foi recolhido, os animais sofreram perfusão com PBS e o cérebro foi removido. O cérebro foi fixado em solução de paraformaldeído a 4% por uma noite, antes da crioproteção em soluções de sacarose. Os cérebros foram seccionados a 25 µm utilizando um micrótomo.

[110] A maior parte dos estudos com vetores de vírus adeno‐associado recombinantes injeta o vetor diretamente no parênquima, o que resulta tipicamente em transdução celular limitada (Li et al, Intra‐ventricular infusion of rAAV‐1‐EGFP resulted in transduction in multiple regions of adult rat brain: a comparative study with rAAV2 and rAAV5 vectors, Brain Res., 29 de novembro de 2006; 1122 (1): 1‐9). Anexar uma sequência de sinalização de secreção e sequência TAT à proteína Ube3A permite, entretanto, a secreção da proteína HECT (ou seja, UBE3A) de células que sofreram transfecção e absorção do peptídeo por neurônios adjacentes, permitindo a injeção em um local discreto para servir de fonte de proteína para outros locais em todo o cérebro.

[111] Cérebros de camundongos sacrificados foram fatiados utilizando‐se um micrótomo e manchados para proteína E6‐AP utilizando‐se anticorpo anti‐E6‐AP (A300‐351A, Bethyl Labs, Montgomery TX, Estados Unidos) com um anticorpo secundário anticoelho biotinilado (Vector Labs n° AB‐1000). As manchas foram completadas com ABC (Vector Labs) e reação de DAB. As seções foram montadas e varridas utilizando‐se microscópio Zeiss Axio Scan. O percentual em área de manchas foi quantificado utilizando‐se software de análise de imagens IAE‐NearCYTE (Instituto de Transplantes Starzl da Universidade de Pittsburgh, Pittsburgh PA, Estados Unidos).

[112] Camundongos controle não transgênicos (Ntg) exibem o nível de expressão de UBE3a em cérebros de camundongos normais, que foi de cerca de 40%, conforme observado na Fig. 4. Comparativamente, camundongos com síndrome de Angelman (AS) exibem níveis de manchas de proteína Ube3a de cerca de 25%. A inserção do

31 / 51 vetor AAV4‐STUb nos ventrículos laterais de camundongos com AS demonstra que o vetor aumentou o nível de E6‐AP para cerca de 30‐35%.

[113] Análise imuno‐histoquímica de fatias do cérebro indica que os camundongos não transgênicos possuem níveis relativamente altos de E6‐AP, com manchas específicas de regiões, observadas nas Figs. 5 e 6. Em camundongos modelos de síndrome de Angelman, os padrões de manchas de E6‐AP são similares, mas os níveis de E6‐AP são reduzidos drasticamente, observados nas Figs. 7 e 8, conforme esperado. A administração do vetor UBE3A de camundongo a camundongos modelos de síndrome de Angelman realmente aumentou os níveis de E6‐AP, mas não ao nível de camundongos não transgênicos, conforme observado nas Figs. 9 e 10. Análise detalhada do ventrículo lateral demonstra que a injeção de vetor UBE3A resultou em absorção do vetor por células ependimais, conforme observado na Fig. 11. Além da absorção de vetor UBE3A e da expressão de E6‐AP por células ependimais, entretanto, células adjacentes no parênquima também apresentaram manchas positivas para E6‐ AP, conforme observado por setas na Figura. Adicionalmente, foram observadas manchas em locais mais distantes, tais como o ventrículo 3d, observado na Fig. 12. Isso indica que E6‐AP estava sendo secretado pelas células que sofreram transfecção e absorvido com sucesso pelas células adjacentes, o que confirma que a construção pode ser utilizada para introduzir E6‐AP e que a construção E6‐AP pode ser utilizada como produto terapêutico para o tratamento de deficiências cerebrais globais na expressão de E6‐AP, tais como síndrome de Angelman. Tratamento de controle utilizando vetor AAV4‐GFP não exibiu absorção da proteína de controle, conforme observado na Fig. 13, mas apenas transdução das células do plexo coroidal e ependimal.

[114] Análise detalhada dos cortes transversais coronais de camundongos modelos de síndrome de Angelman confirmou que a administração da construção UBE3A aumentou os níveis de E6‐AP no ventrículo lateral e em volta dele, conforme exibido nas Figs. 14 a 20. Exemplo 5

[115] Construção de vetor UBE3A humano:

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[116] Foi gerada uma construção de vetor humano utilizando‐se um plasmídeo pTR. Foi formado um gene UBE3A de Homo sapiens a partir de cDNA (AH005553.1): GGAGTAGTTT ACTGAGCCAC TAATCTAAAG TTTAATACTG TGAGTGAATA CCAGTGAGTA CCTTTGTTAA TGTGGATAAC CAATACTTGG CTATAGGAAG TTTTTTAGTT GTGTGTTTTA TNACACGTAT TTGACTTTGT GAATAATTAT GGCTTATAAT GGCTTGTCTG TTGGTATCTA TGTATAGCGT TTACAGTTTC CTTTAAAAAA CATGCATTGA GTTTTTTAAT AGTCCAACCC TTAAAATAAA TGTGTTGTAT GGCCACCTGA TCTGACCACT TTCTTTCATG TTGACATCTT TAATTTTAAA ACTGTTTTAT TTAGTGCTTA AATCTTGTTN ACAAAATTGT CTTCCTAAGT AATATGTCTA CCTTTTTTTT TGGAATATGG AATATTTTGC TAACTGTTTC TCAATTGCAT TTTACAGATC AGGAGAACCT CAGTCTGACG ACATTGAAGC TAGCCGAATG TAAGTGTAAC TTGGTTGAGA CTGTGGTTCT TATTTTGAGT TGCCCTAGAC TGCTTTAAAT TACGTCACAT TATTTGGAAA TAATTTCTGG TTAAAAGAAA GGAATCATTT AGCAGTAAAT GGGAGATAGG AACATACCTA CTTTTTTTCC TATCAGATAA CTCTAAACCT CGGTAACAGT TTACTAGGTT TCTACTACTA GATAGATAAA TGCACACGCC TAAATTCTTA GTCTTTTTGC TTCCCTGGTA GCAGTTGTAG GGAAATAGGG AGGTTGAGGA AAGAGTTTAA CAGTCTCAAC GCCTACCATA TTTAAGGCAT CAAGTACTAT GTTATAGATA CAGAGATGCG TAATAATTAG TTTTCACCCT ACAGAAATTT ATATTATACT CAAGAGTGAA AGATGCAGAA GCAAATAATT TCAGTCACTG AGGTAGAATG GTATCCAAAA TACAATAGTA ACATGAAGGA GTACTGGAGT ACCAGGTATG CAATAGGAAT CTAGTGTAGA TGGCAGGGAA GTAAGAGTGG CCAGGAAATG CTAAGTTCAG TCTTGAAATG TGACTGGGAA TCAGGCAGCT ATCAACTATA AGTCAAATGT TTACAAGCTG TTAAAAATGA AATACTGATT ATGTAAAAGA AAACCGGATT GATGCTTTAA ATAGACTCAT TTTCNTAATG CTAATTTTTA AAATGATAGA ATCCTACAAN TCTTAGCTGT AAACCTTGTG ATTTTTCAGC TGTTGTACTA AACAACTTAA GCACATATAC CATCAGACAA GCCCCCNTCC CCCCTTTTAA ACCAAAGGAA TGTATACTCT GTTAATACAG TCAGTAAGCA TTGACATTCT TTATCATAAT ATCCTAGAAA ATATTTATTA ACTATTTCAC TAGTCAGGAG TTGTGGTAAA TAGTGCATCT CCATTTTCTA CTTCTCATCT TCATACACAG GTTAATCACT TCAGTGCTTG ACTAACTTTT GCCTTGATGA TATGTTGAGC TTTGTACTTG AGAGCTGTAC TAATCACTGT GCTTATTGTT TGAATGTTTG GTACAGGAAG CGAGCAGCTG CAAAGCATCT AATAGAACGC TACTACCACC AGTTAACTGA GGGCTGTGGA AATGAAGCCT GCACGAATGA GTTTTGTGCT TCCTGTCCAA CTTTTCTTCG TATGGATAAT AATGCAGCAG CTATTAAAGC

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CCTCGAGCTT TATAAGATTA ATGCAAAACT CTGTGATCCT CATCCCTCCA AGAAAGGAGC AAGCTCAGCT TACCTTGAGA ACTCGAAAGG TGCCCCCAAC AACTCCTGCT CTGAGATAAA AATGAACAAG AAAGGCGCTA GAATTGATTT TAAAGGTAAG ATGTTTTATT TTCAATTGAG AATTGTTGCC TGAAAACCAT GTGGGAGATT TAAATGTATT AGTTTTTATT TGTTTTTTCT TCTGTGACAT AAAGACATTT TGATATCGTA GAACCAATTT TTTATTGTGG TAACGGACAG GAATAATAAC TACATTTTAC AGGTCTAATC ATTGCTAATT AGAAGCAGAT CATATGCCAA AAGTTCATTT GTTAATAGAT TGATTTGAAC TTTTTAAAAT TCTTAGGAAA AATGTATTAA GTGGTAGTGA ATCTCCAAAA CTATTTAAGA GCTGTATTAT GATTAATCAG TACATGACAT ATTGGTTCAT ATTTATAATT AAAGCTATAC ATTAATAGAT ATCTTGATTA TAAAGAAAGT TTAAACTCAT GATCTTATTA AGAGTTATAC ATTGTTGAAA GAATGTAAAA GCATGGGTGA GGTCATTGGT ATAGGTAGGT AGTTCATTGA AAAAAATAGG TAAGCATTAA ATTTTGTTTG CTGAATCTAA GTATTAGATA CTTTAAGAGT TGTATATCAT AAATGATATT GAGCCTAGAA TGTTTGGCTG TTTTACTTTT AGAACTTTTT GCAACAGAGT AAACATACAT ATTATGAAAA TAAATGTTCT CTTTTTTCCT CTGATTTTCT AGATGTGACT TACTTAACAG AAGAGAAGGT ATATGAAATT CTTGAATTAT GTAGAGAAAG AGAGGATTAT TCCCCTTTAA TCCGTGTTAT TGGAAGAGTT TTTTCTAGTG CTGAGGCATT GGTACAGAGC TTCCGGAAAG TTAAACAACA CACCAAGGAA GAACTGAAAT CTCTTCAAGC AAAAGATGAA GACAAAGATG AAGATGAAAA GGAAAAAGCT GCATGTTCTG CTGCTGCTAT GGAAGAAGAC TCAGAAGCAT CTTCCTCAAG GATAGGTGAT AGCTCACAGG GAGACAACAA TTTGCAAAAA TTAGGCCCTG ATGATGTGTC TGTGGATATT GATGCCATTA GAAGGGTCTA CACCAGATTG CTCTCTAATG AAAAAATTGA AACTGCCTTT CTCAATGCAC TTGTATATTT GTCACCTAAC GTGGAATGTG ACTTGACGTA TCACAATGTA TACTCTCGAG ATCCTAATTA TCTGAATTTG TTCATTATCG TAATGGAGAA TAGAAATCTC CACAGTCCTG AATATCTGGA AATGGCTTTG CCATTATTTT GCAAAGCGAT GAGCAAGCTA CCCCTTGCAG CCCAAGGAAA ACTGATCAGA CTGTGGTCTA AATACAATGC AGACCAGATT CGGAGAATGA TGGAGACATT TCAGCAACTT ATTACTTATA AAGTCATAAG CAATGAATTT AACAGTCGAA ATCTAGTGAA TGATGATGAT GCCATTGTTG CTGCTTCGAA GTGCTTGAAA ATGGTTTACT ATGCAAATGT AGTGGGAGGG GAAGTGGACA CAAATCACAA TGAAGAAGAT GATGAAGAGC CCATCCCTGA GTCCAGCGAG CTGACACTTC AGGAACTTTT GGGAGAAGAA AGAAGAAACA AGAAAGGTCC TCGAGTGGAC CCCCTGGAAA CTGAACTTGG TGTTAAAACC CTGGATTGTC GAAAACCACT TATCCCTTTT GAAGAGTTTA

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AAGGTAATAA ATGTTTTTAT GTCACATTTT GTCTCTTCAT TAACACTTTC AAAGCATGTA TGCTTATAAT TTTTAAAGAA GTATCTAATA TAGTCTGTAC AAAAAAAAAA CAAGTAACTA AGTTTATGTA AATGCTAGAG TCCACTTTTC TAAATCTTGG ATATAAGTTG GTATGAAAGC ACACAGTTGG GCACTAAAGC CCCTTTTAGA GAAAGAGGAC ATGAAGCAGG AGATAGTTAA TAGCTAAGTG TGGTTGTAGT ATAAAGCAAG AAGCAGGGTG TTTCTTGTAT TAAGCTGTAA GCAGGAACCT CATGATTAAG GTCTTTATCA CAGAACAAAT AAAAATTACA TTTAATTTAC ACATGTATAT CCTGTTTGTG ATAAAAATAC ATTTCTGAAA AGTATACTTT ACGTCAGATT TGGGTTCTAT TGACTAAAAT GTGTTCATCG GGAATGGGAA TAACCCAGAA CATAACAAGC AAAAAATTAT GACAAATATA TAGTATACCT TTAAGAAACA TGTTTATATT GATATAATTT TTTGATTAAA TATTATACAC ACTAAGGGTA CAANGCACAT TTTCCTTTTA TGANTTNGAT ACAGTAGTTT ATGTGTCAGT CAGATACTTC CACATTTTTG CTGAACTGGA TACAGTAAGC AGCTTACCAA ATATTCTATG GTAGAAAACT NGGACTTCCT GGTTTGCTTA AATCAAATAT ATTGTACTCT CTTAAAACGG TTGGCATTTA TAAATAGATG GATACATGGT TTAAATGTGT CTGTTNACAT ACCTAGTTGA GAGAACCTAA AGAATTTTCT GCGTCTCCAG CATTTATATT CAGTTCTGTT TAATACATTA TCGAAATTGA CATTTATAAG TATGACAGTT TTGTGTATAT GGCCTTTTCA TAGCTTAATA TTGGCTGTAA CAGAGAATTG TGAAATTGTA AGAAGTAGTT TTCTTTGTAG GTGTAAAATT GAATTTTTAA GAATATTCTT GACAGTTTTA TGTATATGGC CTTTTCATAG CTTAATATTG GCTATAACAG AGAATTGTGA AATTGTTAAG AAGTAGGTGT AAAATTGAAT TTTTAAGAAT ATTCTTGAAT GTTTTTTTCT TGGAAAAATT AAAAAGCTAT GCAGCCCAAT AACTTGTGTT TTGTTTGCAT AGCATATTAT AAGAAGTTCT TGTGATTAAT GTTTTCTACA GGAATTTGTC AATCTTTATT CTGACTACAT TCTCAATAAA TCAGTAGAAA AACAGTTCAA GGCTTTTCGG AGAGGTTTTC ATATGGTGAC CAATGAATCT CCCTTAAAGT ACTTATTCAG ACCAGAAGAA ATTGAATTGC TTATATGTGG AAGCCGGGTA AGAAAGCAGG TGTCTGCAAA AAGTCATGTA TCGATTTATT GTTTGTAATG ATACAGTAGT ATAGCAGATA ACTAAGACAT ATTTTCTTGA ATTTGCAGAA TCTAGATTTC CAAGCACTAG AAGAAACTAC AGAATATGAC GGTGGCTATA CCAGGGACTC TGTTCTGATT AGGTGAGGTA CTTAGTTCTT CAGAGGAAGA TTTGATTCAC CAAAGGGGTG TGTGATTTTG CTTCAGACCT TTATCTCTAG GTACTAATTC CCAAATAAGC AAACTCACAA ATTGTCATCT ATATACTTAG ATTTGTATTT GTAATATAAT CACCATTTTT CAGAGCTAAT CTTGTGATTT ATTTCATGAA TGAAGTGTTG TTATATATAA GTCTCATGTA ATCTCCTGCA TTTGGCGTAT GGATTATCTA GTATTCCTCA

37 / 51

CTGGTTAGAG TATGCTTACT GCTGGTTAGA AGATAATTAA AATAAGGCTA CCATGTCTGC AATTTTTCCT TTCTTTTGAA CTCTGCATTT GTGAACTGTT ACATGGCTTC CCAGGATCAA GCACTTTTTG AGTGAAATGG TAGTCTTTTA TTTAATTCTT AAGATAATAT GTCCAGATAC ATACTAGTAT TTCCATTTTA CACCCTAAAA AACTAAGCCC TGAATTCTCA CAGAAAGATG TAGAGGTTCC CAGTTCTATC TGCTTTTAAA CAAATGCCCT TACTACTCTA CTGTCTACTT CTGTGTACTA CATCATCGTA TGTAGTTGTT TGCATTTGGG CCAGTTGGTT GGGGCAGGGG TCTTTTTTTC TTTTGTCCCT TAATCTGTAT CACTTTTTCC TCCCAAAGTT GAGTTAAAGG ATGAGTAGAC CAGGAGAATA AAGGAGAAAG GATAAATAAA ATATATACCC AAAGGCACCT GGAGTTAATT TTTCCAAATA TTCATTTCAG TCTTTTTCAA TTCATAGGAT TTTGTCTTTT GCTCATTACT GACTGCATAA TGTGATTATA CCATAGTTTA AATAGTCACT TCCTGTTACT ACACACTTGG GTTTTCTCAA TTTTTTACTA TTGTAGTACT AATATTTTAC TATATTGTAA TCTAATCCAA ATTTTTACGT ATTCAGAGCT GTTCAGGATA AATTTGCTTG GAAATTTTTA AATCACCAGA AGTGATACTA TCCTGATAAT TAACTTCCAA GTTGTCTCTT AATATAGTTT TAATGCAAAT CATAAGCTTA TGTTAGTACC AGTCATAATG AATGCCAAAC TGAAACCAGT ATTGTATTTT TTCTCATTAG GGAGTTCTGG GAAATCGTTC ATTCATTTAC AGATGAACAG AAAAGACTCT TCTTGCAGTT TACAACGGGC ACAGACAGAG CACCTGTGGG AGGACTAGGA AAATTAAAGA TGATTATAGC CAAAAATGGC CCAGACACAG AAAGGTAGGT AATTATTAAC TTGTGACTGT ATACCTACCG AAAACCTTGC ATTCCTCGTC ACATACATAT GAACTGTCTT TATAGTTTCT GAGCACATTC GTGATTTTAT ATACAAATCC CCAAATCATA TTAGACAATT GAGAAAATAC TTTGCTGTCA TTGTGTGAGG AAACTTTTAA GAAATTGCCC TAGTTAAAAA TTATTATGGG GCTCACATTG GTTTGGAATC AAATTAGTGT GATTCATTTA CTTTTTTGAT TCCCAGCTTG TTAATTGAAA GCCATATAAC ATGATCATCT ATTTAGAATG GTTACATTGA GGCTCGGAAG ATTATCATTT GATTGTGCTA GAATCCTGTT ATCAAATCAT TTTCTTAGTC ATATTGCCAG CAGTGTTTCT AATAAGCATT TAAGAGCACA CACTTTGCAG TCTTGTAAAA CAGGTTTGAG TATTTTCTCC ACCTTAGAGG AAGTTACTTG ACTTCTCAGT GACCTAACCT CTAAAGTGCA TTTACTGATG TCCTCTCTGT GGTTTTGTTG TGGAAAGATT TAGTTAAATG AACTGTAAGA ATTCAGTACC TAAAATGGTA TCTGTTATGT AGTAAAAACT CAATGGATAC AGTATCTTAT CATCGTCACT AGCTTTGAGT AATTTATAGG ATAAAGGCAA CTTGGTAGTT ACACAACAAA AAGTTTATGA TTTGCATTAA TGTATAGTTT GCATTGCAGA CCGTCTCAAC TATATACAAT CTAAAAATAG GAGCATTTAA TTCTAAGTGT ATTTCCCATG ACTTACAGTT

38 / 51 TTCCTGTTTT TTTCCCCTTT TCTCTATTTA GGTTACCTAC ATCTCATACT TGCTTTAATG TGCTTTTACT TCCGGAATAC TCAAGCAAAG AAAAACTTAA AGAGAGATTG TTGAAGGCCA TCACGTATGC CAAAGGATTT GGCATGCTGT AAAACAAAAC AAAACAAAAT AAAACAAAAA AAAGGAAGGA AAAAAAAAGA AAAAATTTAA AAAATTTTAA AAATATAACG AGGGATAAAT TTT (SEQ ID N° 9) (AH005553.1), que codifica:

MKRAAAKHLIERYYHQLTEGCGNEACTNEFCASCPTFLRMDNNAAAIKALELYKINAKLCDPHPSK KGASSAYLENSKGAPNNSCSEIKMNKKGARIDFKDVTYLTEEKVYEILELCREREDYSPLIRVIGRVFS SAEALVQSFRKVKQHTKEELKSLQAKDEDKDEDEKEKAACSAAAMEEDSEASSSRIGDSSQGDNN LQKLGPDDVSVDIDAIRRVYTRLLSNEKIETAFLNALVYLSPNVECDLTYHNVYSRDPNYLNLFIIVME NRNLHSPEYLEMALPLFCKAMSKLPLAAQGKLIRLWSKYNADQIRRMMETFQQLITYKVISNEFNS RNLVNDDDAIVAASKCLKMVYYANVVGGEVDTNHNEEDDEEPIPESSELTLQELLGEERRNKKGP RVDPLETELGVKTLDCRKPLIPFEEFINEPLNEVLEMDKDYTFFKVETENKFSFMTCPFILNAVTKNL GLYYDNRIRMYSERRITVLYSLVQGQQLNPYLRLKVRRDHIIDDALVRLEMIAMENPADLKKQLYVE FEGEQGVDEGGVSKEFFQLVVEEIFNPDIGMFTYDESTKLFWFNPSSFETEGQFTLIGIVLGLAIYNN CILDVHFPMVVYRKLMGKKGTFRDLGDSHPVLYQSLKDLLEYEGNVEDDMMITFQISQTDLFGNP MMYDLKENGDKIPITNENRKEFVNLYSDYILNKSVEKQFKAFRRGFHMVTNESPLKYLFRPEEIELLI

CGSRNLDFQALEETTEYDGGYTRDSVLIREFWEIVHSFTDEQKRLFLQFTTGTDRAPVGGLGKLKMI IAKNGPDTERLPTSHTCFNVLLLPEYSSKEKLKERLLKAITYAKGFGML (SEQ ID N° 10) (NP

570853.1).

[117] O cDNA foi subclonado e sequenciado. O gene UBE3A versão 1 (hUBEv1) (SEQ ID N° 9) foi fundido a um dos três genes que codificam um peptídeo de sinalização da secreção, com base em GDNF: ATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCTGTCTGCCTGGTGCTGCTCCACACCGCGTCCGCC (SEQ ID N° 2); de proteína insulina:

ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCA GCCGCAGCC (SEQ ID N° 11) (AH002844.2); ou de IgK: ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT (SEQ ID N° 12) (NG 000834.1).

39 / 51

[118] A construção foi inserida no vetor hSTUb, sob promotor híbrido de beta‐actina de galinha e CMV ou promotor humano de ubiquitina c. Elemento regulador pós‐ transcricional para hepatite por marmota (WPRE) está presente para aumentar os níveis de expressão.

[119] A construção de sinal de secreção de UBE3A foi fixada em seguida a um peptídeo de absorção celular (peptídeo da penetração celular); sequência HIV TAT: YGRKKRRQRRR (SEQ ID N° 8); ou sequência HIV TATk: YARKAARQARA (SEQ ID N° 13).

[120] O vetor UBE3A humano, observado na Fig. 21, é transformado em seguida em E. coli, utilizando‐se o método de choque de calor descrito no Exemplo 2. O E. coli transformado foi expandido em caldo que contém ampicilina para selecionar o vetor e coletar grandes quantidades de vetor.

[121] Outras sequências de UBE3A incluem variantes 1, 2 ou 3, observadas abaixo:

[122] H. sapiens UBE3A, variante 1: ACAGTATGAC ATCTGATGCT GGAGGGTCGC ACTTTCACAA ATGAGTCAGC TGGTACATGG GGTTATCATC AATTTTTAGC TCTTCTGTCT GGGAGATACA AGTTTGGAAG CAATCTTGGG GTACTTACCC ACAAGGCTGG TGGAGACCAG ATCAGGAGAA CCTCAGTCTG ACGACATTGA AGCTAGCCGA ATGAAGCGAG CAGCTGCAAA GCATCTAATA GAACGCTACT ACCACCAGTT AACTGAGGGC TGTGGAAATG AAGCCTGCAC GAATGAGTTT TGTGCTTCCT GTCCAACTTT TCTTCGTATG GATAATAATG CAGCAGCTAT TAAAGCCCTC GAGCTTTATA AGATTAATGC AAAACTCTGT GATCCTCATC CCTCCAAGAA AGGAGCAAGC TCAGCTTACC TTGAGAACTC GAAAGGTGCC CCCAACAACT CCTGCTCTGA GATAAAAATG AACAAGAAAG GCGCTAGAAT TGATTTTAAA GATGTGACTT ACTTAACAGA AGAGAAGGTA TATGAAATTC TTGAATTATG TAGAGAAAGA GAGGATTATT CCCCTTTAAT CCGTGTTATT GGAAGAGTTT TTTCTAGTGC TGAGGCATTG GTACAGAGCT TCCGGAAAGT TAAACAACAC ACCAAGGAAG AACTGAAATC TCTTCAAGCA AAAGATGAAG ACAAAGATGA GGATGAAAAG GAAAAAGCTG CATGTTCTGC TGCTGCTATG GAAGAAGACT CAGAAGCATC TTCCTCAAGG ATAGGTGATA GCTCACAGGG AGACAACAAT TTGCAAAAAT TAGGCCCTGA TGATGTGTCT GTGGATATTG ATGCCATTAG AAGGGTCTAC ACCAGATTGC TCTCTAATGA AAAAATTGAA ACTGCCTTTC TCAATGCACT

40 / 51

TGTATATTTG TCACCTAACG TGGAATGTGA CTTGACGTAT CACAATGTAT ACTCTCGAGA TCCTAATTAT CTGAATTTGT TCATTATCGT AATGGAGAAT AGAAATCTCC ACAGTCCTGA ATATCTGGAA ATGGCTTTGC CATTATTTTG CAAAGCGATG AGCAAGCTAC CCCTTGCAGC CCAAGGAAAA CTGATCAGAC TGTGGTCTAA ATACAATGCA GACCAGATTC GGAGAATGAT GGAGACATTT CAGCAACTTA TTACTTATAA AGTCATAAGC AATGAATTTA ACAGTCGAAA TCTAGTGAAT GATGATGATG CCATTGTTGC TGCTTCGAAG TGCTTGAAAA TGGTTTACTA TGCAAATGTA GTGGGAGGGG AAGTGGACAC AAATCACAAT GAAGAAGATG ATGAAGAGCC CATCCCTGAG TCCAGCGAGC TGACACTTCA GGAACTTTTG GGAGAAGAAA GAAGAAACAA GAAAGGTCCT CGAGTGGACC CCCTGGAAAC TGAACTTGGT GTTAAAACCC TGGATTGTCG AAAACCACTT ATCCCTTTTG AAGAGTTTAT TAATGAACCA CTGAATGAGG TTCTAGAAAT GGATAAAGAT TATACTTTTT TCAAAGTAGA AACAGAGAAC AAATTCTCTT TTATGACATG TCCCTTTATA TTGAATGCTG TCACAAAGAA TTTGGGATTA TATTATGACA ATAGAATTCG CATGTACAGT GAACGAAGAA TCACTGTTCT CTACAGCTTA GTTCAAGGAC AGCAGTTGAA TCCATATTTG AGACTCAAAG TTAGACGTGA CCATATCATA GATGATGCAC TTGTCCGGCT AGAGATGATC GCTATGGAAA ATCCTGCAGA CTTGAAGAAG CAGTTGTATG TGGAATTTGA AGGAGAACAA GGAGTTGATG AGGGAGGTGT TTCCAAAGAA TTTTTTCAGC TGGTTGTGGA GGAAATCTTC AATCCAGATA TTGGTATGTT CACATACGAT GAATCTACAA AATTGTTTTG GTTTAATCCA TCTTCTTTTG AAACTGAGGG TCAGTTTACT CTGATTGGCA TAGTACTGGG TCTGGCTATT TACAATAACT GTATACTGGA TGTACATTTT CCCATGGTTG TCTACAGGAA GCTAATGGGG AAAAAAGGAA CTTTTCGTGA CTTGGGAGAC TCTCACCCAG TTCTATATCA GAGTTTAAAA GATTTATTGG AGTATGAAGG GAATGTGGAA GATGACATGA TGATCACTTT CCAGATATCA CAGACAGATC TTTTTGGTAA CCCAATGATG TATGATCTAA AGGAAAATGG TGATAAAATT CCAATTACAA ATGAAAACAG GAAGGAATTT GTCAATCTTT ATTCTGACTA CATTCTCAAT AAATCAGTAG AAAAACAGTT CAAGGCTTTT CGGAGAGGTT TTCATATGGT GACCAATGAA TCTCCCTTAA AGTACTTATT CAGACCAGAA GAAATTGAAT TGCTTATATG TGGAAGCCGG AATCTAGATT TCCAAGCACT AGAAGAAACT ACAGAATATG ACGGTGGCTA TACCAGGGAC TCTGTTCTGA TTAGGGAGTT CTGGGAAATC GTTCATTCAT TTACAGATGA ACAGAAAAGA CTCTTCTTGC AGTTTACAAC GGGCACAGAC AGAGCACCTG TGGGAGGACT AGGAAAATTA AAGATGATTA TAGCCAAAAA TGGCCCAGAC ACAGAAAGGT TACCTACATC TCATACTTGC TTTAATGTGC TTTTACTTCC GGAATACTCA AGCAAAGAAA

41 / 51 AACTTAAAGA GAGATTGTTG AAGGCCATCA CGTATGCCAA AGGATTTGGC ATGCTGTAAA ACAAAACAAA ACAAAAT (SEQ ID N° 14) (AK291405.1);

[123] H. sapiens UBE3A, variante 2: AGCCAGTCCT CCCGTCTTGC GCCGCGGCCG CGAGATCCGT GTGTCTCCCA AGATGGTGGC GCTGGGCTCG GGGTGACTAC AGGAGACGAC GGGGCCTTTT CCCTTCGCCA GGACCCGACA CACCAGGCTT CGCTCGCTCG CGCACCCCTC CGCCGCGTAG CCATCCGCCA GCGCGGGCGC CCGCCATCCG CCGCCTACTT ACGCTTCACC TCTGCCGACC CGGCGCGCTC GGCTGCGGGC GGCGGCGCCT CCTTCGGCTC CTCCTCGGAA TAGCTCGCGG CCTGTAGCCC CTGGCAGGAG GGCCCCTCAG CCCCCCGGTG TGGACAGGCA GCGGCGGCTG GCGACGAACG CCGGGATTTC GGCGGCCCCG GCGCTCCCTT TCCCGGCCTC GTTTTCCGGA TAAGGAAGCG CGGGTCCCGC ATGAGCCCCG GCGGTGGCGG CAGCGAAAGA GAACGAGGCG GTGGCGGGCG GAGGCGGCGG GCGAGGGCGA CTACGACCAG TGAGGCGGCC GCCGCAGCCC AGGCGCGGGG GCGACGACAG GTTAAAAATC TGTAAGAGCC TGATTTTAGA ATTCACCAGC TCCTCAGAAG TTTGGCGAAA TATGAGTTAT TAAGCCTACG CTCAGATCAA GGTAGCAGCT AGACTGGTGT GACAACCTGT TTTTAATCAG TGACTCAAAG CTGTGATCAC CCTGATGTCA CCGAATGGCC ACAGCTTGTA AAAGAGAGTT ACAGTGGAGG TAAAAGGAGT GGCTTGCAGG ATGGAGAAGC TGCACCAGTG TTATTGGAAA TCAGGAGAAC CTCAGTCTGA CGACATTGAA GCTAGCCGAA TGAAGCGAGC AGCTGCAAAG CATCTAATAG AACGCTACTA CCACCAGTTA ACTGAGGGCT GTGGAAATGA AGCCTGCACG AATGAGTTTT GTGCTTCCTG TCCAACTTTT CTTCGTATGG ATAATAATGC AGCAGCTATT AAAGCCCTCG AGCTTTATAA GATTAATGCA AAACTCTGTG ATCCTCATCC CTCCAAGAAA GGAGCAAGCT CAGCTTACCT TGAGAACTCG AAAGGTGCCC CCAACAACTC CTGCTCTGAG ATAAAAATGA ACAAGAAAGG CGCTAGAATT GATTTTAAAG ATGTGACTTA CTTAACAGAA GAGAAGGTAT ATGAAATTCT TGAATTATGT AGAGAAAGAG AGGATTATTC CCCTTTAATC CGTGTTATTG GAAGAGTTTT TTCTAGTGCT GAGGCATTGG TACAGAGCTT CCGGAAAGTT AAACAACACA CCAAGGAAGA ACTGAAATCT CTTCAAGCAA AAGATGAAGA CAAAGATGAA GATGAAAAGG AAAAAGCTGC ATGTTCTGCT GCTGCTATGG AAGAAGACTC AGAAGCATCT TCCTCAAGGA TAGGTGATAG CTCACAGGGA GACAACAATT TGCAAAAATT AGGCCCTGAT GATGTGTCTG TGGATATTGA TGCCATTAGA AGGGTCTACA CCAGATTGCT CTCTAATGAA AAAATTGAAA CTGCCTTTCT CAATGCACTT GTATATTTGT CACCTAACGT GGAATGTGAC TTGACGTATC ACAATGTATA

42 / 51

CTCTCGAGAT CCTAATTATC TGAATTTGTT CATTATCGTA ATGGAGAATA GAAATCTCCA CAGTCCTGAA TATCTGGAAA TGGCTTTGCC ATTATTTTGC AAAGCGATGA GCAAGCTACC CCTTGCAGCC CAAGGAAAAC TGATCAGACT GTGGTCTAAA TACAATGCAG ACCAGATTCG GAGAATGATG GAGACATTTC AGCAACTTAT TACTTATAAA GTCATAAGCA ATGAATTTAA CAGTCGAAAT CTAGTGAATG ATGATGATGC CATTGTTGCT GCTTCGAAGT GCTTGAAAAT GGTTTACTAT GCAAATGTAG TGGGAGGGGA AGTGGACACA AATCACAATG AAGAAGATGA TGAAGAGCCC ATCCCTGAGT CCAGCGAGCT GACACTTCAG GAACTTTTGG GAGAAGAAAG AAGAAACAAG AAAGGTCCTC GAGTGGACCC CCTGGAAACT GAACTTGGTG TTAAAACCCT GGATTGTCGA AAACCACTTA TCCCTTTTGA AGAGTTTATT AATGAACCAC TGAATGAGGT TCTAGAAATG GATAAAGATT ATACTTTTTT CAAAGTAGAA ACAGAGAACA AATTCTCTTT TATGACATGT CCCTTTATAT TGAATGCTGT CACAAAGAAT TTGGGATTAT ATTATGACAA TAGAATTCGC ATGTACAGTG AACGAAGAAT CACTGTTCTC TACAGCTTAG TTCAAGGACA GCAGTTGAAT CCATATTTGA GACTCAAAGT TAGACGTGAC CATATCATAG ATGATGCACT TGTCCGGCTA GAGATGATCG CTATGGAAAA TCCTGCAGAC TTGAAGAAGC AGTTGTATGT GGAATTTGAA GGAGAACAAG GAGTTGATGA GGGAGGTGTT TCCAAAGAAT TTTTTCAGCT GGTTGTGGAG GAAATCTTCA ATCCAGATAT TGGTATGTTC ACATACGATG AATCTACAAA ATTGTTTTGG TTTAATCCAT CTTCTTTTGA AACTGAGGGT CAGTTTACTC TGATTGGCAT AGTACTGGGT CTGGCTATTT ACAATAACTG TATACTGGAT GTACATTTTC CCATGGTTGT CTACAGGAAG CTAATGGGGA AAAAAGGAAC TTTTCGTGAC TTGGGAGACT CTCACCCAGT TCTATATCAG AGTTTAAAAG ATTTATTGGA GTATGAAGGG AATGTGGAAG ATGACATGAT GATCACTTTC CAGATATCAC AGACAGATCT TTTTGGTAAC CCAATGATGT ATGATCTAAA GGAAAATGGT GATAAAATTC CAATTACAAA TGAAAACAGG AAGGAATTTG TCAATCTTTA TTCTGACTAC ATTCTCAATA AATCAGTAGA AAAACAGTTC AAGGCTTTTC GGAGAGGTTT TCATATGGTG ACCAATGAAT CTCCCTTAAA GTACTTATTC AGACCAGAAG AAATTGAATT GCTTATATGT GGAAGCCGGA ATCTAGATTT CCAAGCACTA GAAGAAACTA CAGAATATGA CGGTGGCTAT ACCAGGGACT CTGTTCTGAT TAGGGAGTTC TGGGAAATCG TTCATTCATT TACAGATGAA CAGAAAAGAC TCTTCTTGCA GTTTACAACG GGCACAGACA GAGCACCTGT GGGAGGACTA GGAAAATTAA AGATGATTAT AGCCAAAAAT GGCCCAGACA CAGAAAGGTT ACCTACATCT CATACTTGCT TTAATGTGCT TTTACTTCCG GAATACTCAA GCAAAGAAAA ACTTAAAGAG AGATTGTTGA AGGCCATCAC

43 / 51

GTATGCCAAA GGATTTGGCA TGCTGTAAAA CAAAACAAAA CAAAATAAAA CAAAAAAAAG GAAGGAAAAA AAAAGAAAAA ATTTAAAAAA TTTTAAAAAT ATAACGAGGG ATAAATTTTT GGTGGTGATA GTGTCCCAGT ACAAAAAGGC TGTAAGATAG TCAACCACAG TAGTCACCTA TGTCTGTGCC TCCCTTCTTT ATTGGGGACA TGTGGGCTGG AACAGCAGAT TTCAGCTACA TATATGAACA AATCCTTTAT TATTATTATA ATTATTTTTT TGCGTGAAAG TGTTACATAT TCTTTCACTT GTATGTACAG AGAGGTTTTT CTGAATATTT ATTTTAAGGG TTAAATCACT TTTGCTTGTG TTTATTACTG CTTGAGGTTG AGCCTTTTGA GTATTTAAAA AATATATACC AACAGAACTA CTCTCCCAAG GAAAATATTG CCACCATTTG TAGACCACGT AACCTTCAAG TATGTGCTAC TTTTTTGTCC CTGTATCTAA CTCAAATCAG GAACTGTATT TTTTTTAATG ATTTGCTTTT GAAACTTGAA GTCTTGAAAA CAGTGTGATG CAATTACTGC TGTTCTAGCC CCCAAAGAGT TTTCTGTGCA AAATCTTGAG AATCAATCAA TAAAGAAAGA TGGAAGGAAG GGAGAAATTG GAATGTTTTA ACTGCAGCCC TCAGAACTTT AGTAACAGCA CAACAAATTA AAAACAAAAA CAACTCATGC CACAGTATGT CGTCTTCATG TGTCTTGCAA TGAACTGTTT CAGTAGCCAA TCCTCTTTCT TAGTATATGA AAGGACAGGG ATTTTTGTTC TTGTTGTTCT CGTTGTTGTT TTAAGTTTAC TGGGGAAAGT GCATTTGGCC AAATGAAATG GTAGTCAAGC CTATTGCAAC AAAGTTAGGA AGTTTGTTGT TTGTTTATTA TAAACAAAAA GCATGTGAAA GTGCACTTAA GATAGAGTTT TTATTAATTA CTTACTTATT ACCTAGATTT TAAATAGACA ATCCAAAGTC TCCCCTTCGT GTTGCCATCA TCTTGTTGAA TCAGCCATTT TATCGAGGCA CGTGATCAGT GTTGCAACAT AATGAAAAAG ATGGCTACTG TGCCTTGTGT TACTTAATCA TACAGTAAGC TGACCTGGAA ATGAATGAAA CTATTACTCC TAAGAATTAC ATTGTATAGC CCCACAGATT AAATTTAATT AATTAATTCA AAACATGTTA AACGTTACTT TCATGTACTA TGGAAAAGTA CAAGTAGGTT TACATTACTG ATTTCCAGAA GTAAGTAGTT TCCCCTTTCC TAGTCTTCTG TGTATGTGAT GTTGTTAATT TCTTTTATTG CATTATAAAA TAAAAGGATT ATGTATTTTT AACTAAGGTG AGACATTGAT ATATCCTTTT GCTACAAGCT ATAGCTAATG TGCTGAGCTT GTGCCTTGGT GATTGATTGA TTGATTGACT GATTGTTTTA ACTGATTACT GTAGATCAAC CTGATGATTT GTTTGTTTGA AATTGGCAGG AAAAATGCAG CTTTCAAATC ATTGGGGGGA GAAAAAGGAT GTCTTTCAGG ATTATTTTAA TTAATTTTTT TCATAATTGA GACAGAACTG TTTGTTATGT ACCATAATGC TAAATAAAAC TGTGGCACTT TTCACCATAA TTTAATTTAG TGGAAAAAGA AGACAATGCT TTCCATATTG TGATAAGGTA ACATGGGGTT TTTCTGGGCC AGCCTTTAGA ACACTGTTAG GGTACATACG CTACCTTGAT GAAAGGGACC

44 / 51 TTCGTGCAAC TGTAGTCATC TTAAAGGCTT CTCATCCACT GTGCTTCTTA ATGTGTAATT AAAGTGAGGA GAAATTAAAT ACTCTGAGGG CGTTTTATAT AATAAATTCG TGAAGA (SEQ ID N° 15) (NM 000462.4), que codifica a proteína: MEKLHQCYWK SGEPQSDDIE ASRMKRAAAK HLIERYYHQL TEGCGNEACT NEFCASCPTF LRMDNNAAAI KALELYKINA KLCDPHPSKK GASSAYLENS KGAPNNSCSE IKMNKKGARI DFKDVTYLTE EKVYEILELC REREDYSPLI RVIGRVFSSA EALVQSFRKV KQHTKEELKS LQAKDEDKDE DEKEKAACSA AAMEEDSEAS SSRIGDSSQG DNNLQKLGPD DVSVDIDAIR RVYTRLLSNE KIETAFLNAL VYLSPNVECD LTYHNVYSRD PNYLNLFIIV MENRNLHSPE YLEMALPLFC KAMSKLPLAA QGKLIRLWSK YNADQIRRMM ETFQQLITYK VISNEFNSRN LVNDDDAIVA ASKCLKMVYY ANVVGGEVDT NHNEEDDEEP IPESSELTLQ ELLGEERRNK KGPRVDPLET ELGVKTLDCR KPLIPFEEFI NEPLNEVLEM DKDYTFFKVE TENKFSFMTC PFILNAVTKN LGLYYDNRIR MYSERRITVL YSLVQGQQLN PYLRLKVRRD HIIDDALVRL EMIAMENPAD LKKQLYVEFE GEQGVDEGGV SKEFFQLVVE EIFNPDIGMF TYDESTKLFW FNPSSFETEG QFTLIGIVLG LAIYNNCILD VHFPMVVYRK LMGKKGTFRD LGDSHPVLYQ SLKDLLEYEG NVEDDMMITF QISQTDLFGN PMMYDLKENG DKIPITNENR KEFVNLYSDY ILNKSVEKQF KAFRRGFHMV TNESPLKYLF RPEEIELLIC GSRNLDFQAL EETTEYDGGY TRDSVLIREF WEIVHSFTDE QKRLFLQFTT GTDRAPVGGL GKLKMIIAKN GPDTERLPTS HTCFNVLLLP EYSSKEKLKE RLLKAITYAK GFGML (SEQ ID N° 16) (NP 000453.2);

[124] H. sapiens UBE3A, variante 3: TTTTTCCGGA TAAGGAAGCG CGGGTCCCGC ATGAGCCCCG GCGGTGGCGG CAGCGAAAGA GAACGAGGCG GTGGCGGGCG GAGGCGGCGG GCGAGGGCGA CTACGACCAG TGAGGCGGCC GCCGCAGCCC AGGCGCGGGG GCGACGACAG GTTAAAAATC TGTAAGAGCC TGATTTTAGA ATTCACCAGC TCCTCAGAAG TTTGGCGAAA TATGAGTTAT TAAGCCTACG CTCAGATCAA GGTAGCAGCT AGACTGGTGT GACAACCTGT TTTTAATCAG TGACTCAAAG CTGTGATCAC CCTGATGTCA CCGAATGGCC ACAGCTTGTA AAAGATCAGG AGAACCTCAG TCTGACGACA TTGAAGCTAG CCGAATGAAG CGAGCAGCTG CAAAGCATCT AATAGAACGC TACTACCACC AGTTAACTGA GGGCTGTGGA AATGAAGCCT GCACGAATGA GTTTTGTGCT TCCTGTCCAA CTTTTCTTCG TATGGATAAT AATGCAGCAG CTATTAAAGC CCTCGAGCTT TATAAGATTA ATGCAAAACT CTGTGATCCT CATCCCTCCA AGAAAGGAGC AAGCTCAGCT TACCTTGAGA ACTCGAAAGG TGCCCCCAAC AACTCCTGCT

45 / 51

CTGAGATAAA AATGAACAAG AAAGGCGCTA GAATTGATTT TAAAGATGTG ACTTACTTAA CAGAAGAGAA GGTATATGAA ATTCTTGAAT TATGTAGAGA AAGAGAGGAT TATTCCCCTT TAATCCGTGT TATTGGAAGA GTTTTTTCTA GTGCTGAGGC ATTGGTACAG AGCTTCCGGA AAGTTAAACA ACACACCAAG GAAGAACTGA AATCTCTTCA AGCAAAAGAT GAAGACAAAG ATGAAGATGA AAAGGAAAAA GCTGCATGTT CTGCTGCTGC TATGGAAGAA GACTCAGAGG CATCTTCCTC AAGGATAGGT GATAGCTCAC AGGGAGACAA CAATTTGCAA AAATTAGGCC CTGATGATGT GTCTGTGGAT ATTGATGCCA TTAGAAGGGT CTACACCAGA TTGCTCTCTA ATGAAAAAAT TGAAACTGCC TTTCTCAATG CACTTGTATA TTTGTCACCT AACGTGGAAT GTGACTTGAC GTATCACAAT GTATACTCTC GAGATCCTAA TTATCTGAAT TTGTTCATTA TCGTAATGGA GAATAGAAAT CTCCACAGTC CTGAATATCT GGAAATGGCT TTGCCATTAT TTTGCAAAGC GATGAGCAAG CTACCCCTTG CAGCCCAAGG AAAACTGATC AGACTGTGGT CTAAATACAA TGCAGACCAG ATTCGGAGAA TGATGGAGAC ATTTCAGCAA CTTATTACTT ATAAAGTCAT AAGCAATGAA TTTAACAGTC GAAATCTAGT GAATGATGAT GATGCCATTG TTGCTGCTTC GAAGTGCTTG AAAATGGTTT ACTATGCAAA TGTAGTGGGA GGGGAAGTGG ACACAAATCA CAATGAAGAA GATGATGAAG AGCCCATCCC TGAGTCCAGC GAGCTGACAC TTCAGGAACT TTTGGGAGAA GAAAGAAGAA ACAAGAAAGG TCCTCGAGTG GACCCCCTGG AAACTGAACT TGGTGTTAAA ACCCTGGATT GTCGAAAACC ACTTATCCCT TTTGAAGAGT TTATTAATGA ACCACTGAAT GAGGTTCTAG AAATGGATAA AGATTATACT TTTTTCAAAG TAGAAACAGA GAACAAATTC TCTTTTATGA CATGTCCCTT TATATTGAAT GCTGTCACAA AGAATTTGGG ATTATATTAT GACAATAGAA TTCGCATGTA CAGTGAACGA AGAATCACTG TTCTCTACAG CTTAGTTCAA GGACAGCAGT TGAATCCATA TTTGAGACTC AAAGTTAGAC GTGACCATAT CATAGATGAT GCACTTGTCC GGCTAGAGAT GATCGCTATG GAAAATCCTG CAGACTTGAA GAAGCAGTTG TATGTGGAAT TTGAAGGAGA ACAAGGAGTT GATGAGGGAG GTGTTTCCAA AGAATTTTTT CAGCTGGTTG TGGAGGAAAT CTTCAATCCA GATATTGGTA TGTTCACATA CGATGAATCT ACAAAATTGT TTTGGTTTAA TCCATCTTCT TTTGAAACTG AGGGTCAGTT TACTCTGATT GGCATAGTAC TGGGTCTGGC TATTTACAAT AACTGTATAC TGGATGTACA TTTTCCCATG GTTGTCTACA GGAAGCTAAT GGGGAAAAAA GGAACTTTTC GTGACTTGGG AGACTCTCAC CCAGTTCTAT ATCAGAGTTT AAAAGATTTA TTGGAGTATG AAGGGAATGT GGAAGATGAC ATGATGATCA CTTTCCAGAT ATCACAGACA GATCTTTTTG GTAACCCAAT GATGTATGAT CTAAAGGAAA ATGGTGATAA AATTCCAATT

46 / 51 ACAAATGAAA ACAGGAAGGA ATTTGTCAAT CTTTATTCTG ACTACATTCT CAATAAATCA GTAGAAAAAC AGTTCAAGGC TTTTCGGAGA GGTTTTCATA TGGTGACCAA TGAATCTCCC TTAAAGTACT TATTCAGACC AGAAGAAATT GAATTGCTTA TATGTGGAAG CCGGAATCTA GATTTCCAAG CACTAGAAGA AACTACAGAA TATGACGGTG GCTATACCAG GGACTCTGTT CTGATTAGGG AGTTCTGGGA AATCGTTCAT TCATTTACAG ATGAACAGAA AAGACTCTTC TTGCAGTTTA CAACGGGCAC AGACAGAGCA CCTGTGGGAG GACTAGGAAA ATTAAAGATG ATTATAGCCA AAAATGGCCC AGACACAGAA AGGTTACCTA CATCTCATAC TTGCTTTAAT GTGCTTTTAC TTCCGGAATA CTCAAGCAAA GAAAAACTTA AAGAGAGATT GTTGAAGGCC ATCACGTATG CCAAAGGATT TGGCATGCTG TAAAACAAAA CAAAACAAAA TAAAACAAAA AAAAGGAAGG (SEQ ID N° 17) (AK292514.1). Exemplo 6

[125] Teste in vitro de construção de vetor UBE3A humano:

[126] As propriedades do vetor humano foram testadas em células HEK293 (Coleção Norte‐Americana de Cultivos de Tipos, Manassas VA, Estados Unidos), cultivadas em CO2 a 5% e 37 °C em DMEM com 10% FBS e 1% Pen/Strep e subcultivadas em confluência de 80%.

[127] O vetor (2 µg/cavidade em placa com seis cavidades) foi transfectado nas células utilizando‐se método de transfecção PEI. As células foram subcultivadas a 0,5 x 106 células por cavidade em placas com seis cavidades com meio DMEM dois dias antes da transfecção. O meio foi substituído na noite antes da transfecção. dH2O livre de endotoxinas foi aquecida a cerca de 80 °C e dissolveu‐se polietilenoimina (Sigma‐ Aldrich Co. LLC, St. Louis MO, Estados Unidos). A solução foi mantida em resfriamento a cerca de 25 °C e neutralizada utilizando‐se hidróxido de sódio. Adicionou‐se vetor AAV4‐STUb ou controle negativo (somente meio) a DMEM livre de soro a 2 µg a cada 200 µl para cada cavidade transfectada e foram adicionados 9 µl de 1 µg/µl de polietilenoimina à mistura para cada cavidade. A mistura de transfecção foi incubada à temperatura ambiente por 15 minutos, adicionada em seguida a cada cavidade de células a 210 µl por cavidade e incubada por 48 horas. As células e os meios foram colhidos por meio de raspagem das células das placas. O meio e as células foram centrifugados em seguida a 5000 X g por cinco minutos.

47 / 51

[128] Para Western Blot dos extratos, pelotas celulares foram novamente suspensas em 50 µl de tampão hipo‐osmótico e as células foram lisadas por três congelamentos/descongelamentos repetidos. 15 µl de lisato foram aquecidos com tampão de amostra Lamelli e conduzidos em gel de acrilamida a 4‐20% BioRad. Ele foi transferido para membrana de nitrocelulose utilizando TransBlot. O Blot foi bloqueado com 5% de leite e a proteína foi detectada utilizando‐se um anticorpo anti‐E6AP.

[129] Conforme observado na Fig. 22, as células que sofreram transfecção com a construção expressam o gene UBE3A, ou seja, E6‐AP. Além disso, fixar o gene aos diversos sinais de secreção exibiu resultados misturados, com base no peptídeo de sinal de secreção. Transfecção utilizando construções com base no sinal de secreção de GDNF, por exemplo, exibiu menos expressão e não exibiu secreção detectável das células que sofreram transfecção, conforme observado na Fig. 23. O uso do sinal de secreção de insulina resultou em secreção moderada de E6AP de células que sofreram transfecção, em conjunto com alta expressão da construção no interior da célula. Os resultados da secreção de sinal de insulina foram confirmados utilizando‐se uma construção marcada com HA, conforme exibido na Fig. 24. Exemplo 7

[130] Eficácia de peptídeos de secreção:

[131] A eficácia de peptídeos de secreção na promoção de secreção extracelular da proteína por neurônios foi medida por meio da criação de construções de plasmídeos que contêm os diversos sinais de secreção, GFP ou gene Ube3A humano versão 1 (hUBEv1) e CPP TATk, conforme observado nas Figs. 25(A) e 26(A). GFP foi gerado para uso como gene relator para testes in vivo e para agir como controle para hUbev1 em estudos de AS futuros. Os sinais de secreção testados neste experimento foram sinal de secreção de GDNF, sinal de secreção de insulina humana e sinal de secreção de IgK. As sequências de aminoácidos para os sinais de secreção são as seguintes: ‐ para insulina: MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA (SEQ ID N° 18) (CAA08766.1); para GDNF: MKLWDVVAVCLVLLHTASA (SEQ ID N° 3); e para IgK: METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID N° 19) (AAH80787.1).

[132] Foram geradas as construções de plasmídeos que contêm os diversos sinais de

48 / 51 secreção e conduziu‐se eletroforese de gel para confirmar a inserção genética bem sucedida para cada plasmídeo. Conforme observado nas Figs. 25(B) e 26(B), GFP e hUbev1 foram integrados aos plasmídeos com sucesso. A eficácia dos sinais de secreção selecionados na indução da secreção de peptídeos por neurônios foi medida por meio de transfecção das construções de plasmídeos em células HEK293 e medição da concentração de GFP nos meios por meio de Dot Blot. Extratos dos meios foram coletados e X µl foram colocados sobre papel de nitrocelulose, seguidos por imunomanchas. Os resultados indicam que o sinal de insulina resultou em níveis de proteína extracelular moderados e níveis de proteína extracelular fortes a altos com sinais IgK e GDNF, conforme exibido nas Figs. 25(C) e 26(C). Cada sinal é, portanto, eficaz na indução da secreção de peptídeos em neurônios e o plasmídeo que contém sinais hUbev1/GDNF foi particularmente eficaz na indução da secreção de E6‐AP. Exemplo 8

[133] Eficácia de peptídeos que penetram em células:

[134] A eficácia dos sinais CPP selecionados na indução da reabsorção da proteína por neurônios foi medida por meio da criação de construções de plasmídeos que contêm o sinal de secreção (GDNF), o gene hUbev1 e os diversos sinais de CPP, indicados abaixo, e sua transfecção para células HEK293: ‐ para penetratina: RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID N° 20); para TATk: YARKAARQARA (SEQ ID N° 12); para R6W3: RRWWRRWRR (SEQ ID N° 21); e ‐ para pVEC: LLIILRRRIRKQAHAHSK (SEQ ID N° 22).

[135] As lises celulares dessas células foram retiradas e adicionadas a novos cultivos celulares de células HEK293 e a concentração de E6‐AP nessas células após incubação foi medida por meio de Western Blot. Os resultados da absorção para os sinais de CPP penetratina, TATk, R6RW e pVEC são observados na Fig. 27. Exemplo 9

[136] Teste in vivo de construção de vetor UBE3A humano em modelos de camundongos:

[137] Para garantir que o gene Ube3A modificado para incluir sinais de secreção e

49 / 51 reabsorção mantivesse a sua capacidade de aumentar déficits cognitivos associados a AS, uma construção de plasmídeo (hSTUb) que contém Ube3A versão 1 humano (hUbev1), um sinal de secreção e o CPP TATk sofreu transdução por meio de um vetor rAAV em modelos de AS em camundongos. A potencialização a longo prazo do cérebro murino foi medida por meio de eletrofisiologia post‐mortem e comparada com camundongos controle modelo de AS com transfecção de GFP e camundongos controle do tipo selvagem. Os resultados indicam que o plasmídeo hSTUb recuperou com sucesso os déficits de LTP, conforme observado nas Figs. 28(A) e (B). Exemplo 10

[138] Construção de vetor UBE3A humano como terapia genética em modelo de camundongo:

[139] O potencial de peptídeos de sinal CPP e de secreção foi analisado para determinar sua capacidade de promover maior distribuição global de E6‐AP em neurônios para uso em terapia genética para AS. A recuperação de LTP pelo plasmídeo hSTUb no modelo de camundongo sugere que o gene UBE3A retém a sua eficácia de tratamento de déficits cognitivos em AS após a adição de sinais de CPP e secreção, o que sustenta o potencial da construção em terapia genética. O sinal GDNF apresenta‐ se como sinal ideal para uso nesta terapia proposta, conforme indicado pela sua construção de plasmídeo, que exibe a maior secreção de E6‐AP em meios após a transdução. Falha de indução, pelos sinais CPP, de reabsorção mensurável de E6‐AP após a aplicação de lises celulares às células pode dever‐se a vários fatores, que incluem concentração insuficiente de E6‐AP nas lises. Exemplo 11

[140] Terapia com genes humanos profética:

[141] Crianças humanas apresentam severos atrasos de desenvolvimento que se tornam evidentes com a idade de cerca de 12 meses. A criança apresenta posteriormente ausência de fala, convulsões, hipotonia, ataxia e microcefalia. A criança move‐se com marcha brusca, similar a um boneco, e exibe expressão incomumente alegre, acompanhada por períodos de riso. A criança possui características faciais dismórficas, caracterizadas por queixo proeminente, sorriso

50 / 51 incomumente largo e olhos profundos. A criança é diagnosticada com síndrome de Angelman. A criança é tratada com quantidade terapeuticamente eficaz de vetor UBE3A que é injetado bilateralmente nos hemisférios hipocampais direito e esquerdo do cérebro. Observa‐se melhoria dos sintomas após tratamento, com redução das convulsões, aumento do tônus muscular, aumento da coordenação dos movimentos musculares e melhoria da fala.

[142] O vetor UBE3A é formado a partir de cDNA clonado de um gene UBE3A de Homo sapiens. O gene UBE3A versão 1 (SEQ ID N° 9) é fundido a um gene que codifica um peptídeo de sinalização de secreção, neste caso GDNF, embora insulina ou IgK possam também ser utilizados. A construção é inserida no vetor hSTUb, sob promotor híbrido de beta‐actina de galinha e CMV ou promotor humano de ubiquitina c. Elemento regulador pós‐transcricional para hepatite por marmota (WPRE) está presente para aumentar os níveis de expressão.

[143] A construção de sinal de secreção de UBE3A é fixada a um peptídeo de absorção celular (peptídeo da penetração celular ou CPP), tal como HIV TAT ou HIV TATk. O vetor UBE3A humano é transformado em seguida em E. coli, utilizando o método de choque de calor descrito no Exemplo 2. O E. coli transformado foi expandido em caldo que contém ampicilina para selecionar o vetor e coletar grandes quantidades de vetor.

[144] No presente relatório descritivo, todos os documentos, atos ou informações descritos não constituem admissão de que o documento, ato ou informação, ou qualquer de suas combinações, era disponível ao público, conhecido pelo público, parte do estado da técnica ou conhecidamente relevante para a solução de qualquer problema na época da prioridade.

[145] As descrições de todas as publicações mencionadas acima são expressamente incorporadas ao presente como referência, cada qual integralmente, como se cada qual fosse individualmente incorporada como referência.

[146] Embora tenham sido descritas e ilustradas realizações específicas de um método de tratamento de deficiências de UBE3A, será evidente para os técnicos no assunto que são possíveis variações e modificações sem abandonar o espírito e

51 / 51 princípio amplo da presente invenção.

Também se deve compreender que as reivindicações a seguir destinam‐se a cobrir todas as características genéricas e específicas da presente invenção e todas as declarações do escopo da presente invenção que, por questão de linguagem, poder‐se‐á afirmar que se enquadram entre elas.

Claims

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REIVINDICAÇÕES 1) “VETOR UBE3A”, caracterizado por compreender: ‐ uma sequência de iniciação da transcrição; ‐ uma sequência UBE3A disposta a jusante da sequência de iniciação da transcrição, ou uma sequência homóloga; ‐ uma sequência de secreção disposta a jusante da sequência de iniciação da transcrição ou uma sequência homóloga; e ‐ uma sequência de captação de células disposta a jusante da sequência de iniciação da transcrição ou uma sequência homóloga.

2) “VETOR” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por sequência de iniciação da transcrição ser um promotor híbrido de beta‐actina de galinha e citomegalovírus ou promotor humano de ubiquitina c.

3) “VETOR” de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender ainda uma sequência intensificadora imediata‐precoce do citomegalovírus disposta a montante da sequência de iniciação da transcrição.

4) “VETOR” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda um elemento regulador pós‐transcricional para hepatite por marmota.

5) “VETOR” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda um plasmídeo, em que o plasmídeo é um plasmídeo baseado no serótipo 2 do vírus adeno‐associado recombinante e em que o plasmídeo baseado no serótipo 2 do vírus adeno‐associado recombinante não possui elementos de integração de DNA.

6) “VETOR” de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por plasmídeo baseado no serótipo 2 do vírus adeno‐associado recombinante ser plasmídeo pTR.

7) “VETOR” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por sequência de secreção ser disposta a montante da sequência UBE3A.

8) “VETOR” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por sequência de captação de células ser disposta a montante da sequência UBE3A e a jusante da sequência de secreção.

9) “VETOR” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por sequência de captação de células ser penetratina, R6W3, HIV TAT, HIV TATk ou pVEC.

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10) “VETOR” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por sequência de secreção ser insulina, GDNF ou IgK. 11) “MÉTODO DE TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS NEURODEGENERATIVOS”, caracterizado por compreender as etapas de: ‐ administração de um vetor UBE3A a paciente que sofre de distúrbio neurodegenerativo, em que o vetor UBE3A compreende: ‐ uma sequência de iniciação da transcrição; ‐ uma sequência UBE3A disposta a jusante da sequência de iniciação da transcrição, ou uma sequência homóloga; ‐ uma sequência de secreção disposta a jusante da sequência de iniciação da transcrição ou uma sequência homóloga; e ‐ uma sequência de captação de células disposta a jusante da sequência de iniciação da transcrição ou uma sequência homóloga. 12) “MÉTODO” de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por sequência de iniciação da transcrição ser um promotor híbrido de beta‐actina de galinha e citomegalovírus ou promotor humano de ubiquitina c. 13) “MÉTODO” de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por sequência de captação de células ser penetratina, R6W3, HIV TAT, HIV TATk ou pVEC. 14) “MÉTODO” de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por sequência de secreção ser insulina, GDNF ou IgK. 15) “MÉTODO” de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por distúrbio neurodegenerativo ser síndrome de Angelman. 16) “MÉTODO” de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por vetor UBE3A ser administrado ao paciente por meio de injeção no cérebro do paciente. 17) “COMPOSIÇÃO PARA USO NO TRATAMENTO DE UM DISTÚRBIO NEURODEGENERATIVO QUALIFICADO POR DEFICIÊNCIA DE UBE3A”, caracterizado por compreender: ‐ um vetor UBE3A; e ‐ um veículo farmaceuticamente aceitável. 18) “COMPOSIÇÃO” de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por veículo

3 / 3 farmaceuticamente aceitável ser manitol. 19) “COMPOSIÇÃO” de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por vetor UBE3A compreender: ‐ uma sequência de iniciação da transcrição, em que a sequência de iniciação da transcrição é um promotor híbrido de beta‐actina de galinha e citomegalovírus ou promotor humano de ubiquitina c; ‐ uma sequência UBE3A disposta a jusante da sequência de iniciação da transcrição, ou uma sequência homóloga; ‐ uma sequência de secreção disposta a jusante da sequência de iniciação da transcrição ou uma sequência homóloga, em que a sequência de secreção é insulina, GDNF ou IGK; e ‐ uma sequência de captação de células disposta a jusante da sequência de iniciação da transcrição ou uma sequência homóloga, em que a sequência de captação de células é penetratina, R6W3, HIV TAT, HIV TATk ou pVEC. 20) “COMPOSIÇÃO” de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por distúrbio neurodegenerativo ser a síndrome de Angelman.