ES2852998T3 - Oligonucleótidos para inducir la expresión de UBE3A paterno - Google Patents

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Abstract

Un oligonucleótido antisentido en el que el oligonucleótido es el compuesto oligonucleotídico (CMP ID NO: 626_7) en el que las letras mayúsculas representan nucleósidos de LNA beta-D- oxi, las letras minúsculas representan nucleósidos de ADN, todos los C de LNA son 5-metil-citosina y todos los enlaces internucleosídicos son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.

Description

DESCRIPCIÓN
Oligonucleótidos para inducir la expresión de UBE3A paterno
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a oligonucleótidos (oligómeros) que son complementarios a, y se hibridan a, SNHG14 en dirección 3' de SNORD109B, dando lugar a la inducción de la expresión paterna de la proteína ubiquitina ligasa E3A (UBE3A) en un animal o ser humano. La presente invención se refiere además a composiciones farmacéuticas y procedimientos para el tratamiento del síndrome de Angelman.
ANTECEDENTES
El síndrome de Angelman es un trastorno neurogenético provocado por la deleción o inactivación de los genes UBE3A en el cromosoma 15q 11.2 heredado por vía materna. La copia paterna del gen UBE3A está sujeta a sellado genómico y silenciamiento en neuronas por un transcrito antisentido endógeno de UBE3A, denominado SNHG14 (también conocido como UBE3A-ATS) (Meng et al., 2012 Hum Mol Genet., vol. 21 págs. 3001-12). Otros tipos de células además de las neuronas parecen expresar el gen UBE3A tanto del alelo materno como del paterno.
El síndrome de Angelman está caracterizado por una discapacidad intelectual y del desarrollo grave, trastornos del sueño, convulsiones, movimientos espasmódicos, alteraciones electroencefalográficas, risas o sonrisas frecuentes y deficiencias del lenguaje profundas.
El documento WO 2012/064806 divulga un procedimiento de inducción de la expresión de UBE3A en una célula usando un inhibidor de topoisomerasa. El procedimiento se puede usar para tratar el síndrome de Angelman. No existe ninguna divulgación de oligonucleótidos antisentido.
El documento WO 2014/004572 divulga oligonucleótidos con modificaciones de 2'-O-metoxietil-ARN (MOE) dirigidos a UBE3A-ATS de ratón. Los oligonucleótidos solo se someten a prueba en ensayos relacionados con ratones. En la región en dirección 3' del ARNpn MBII-52 (también conocida como SNORD115) y en dirección 5' del pre-ARNm de UBE3A no existe conservación entre el ratón y el ser humano. Por lo tanto, los oligonucleótidos dirigidos a UBE3A-ATS de ratón no se pueden traducir en oligonucleótidos que funcionarán en un ser humano. No existe ninguna divulgación de oligonucleótidos dirigidos a UBE3A-ATS humano.
OBJETIVO DE LA INVENCIÓN
La presente invención identifica oligonucleótidos novedosos que inducen la expresión de UBE3A paterno humano en la expresión neuronal sin afecto de los transcritos paternos SNORD115, SNORD116 y SNRPN significativamente.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, la presente invención es un oligonucleótido antisentido en el que el oligonucleótido es el compuesto oligonucleotídico TTAcActtaattatactTCC ¿e q m p n o- q26_7) en el que las letras mayúsculas representan nucleósidos de LNA beta-D-oxi, las letras minúsculas representan nucleósidos de ADN, todos los C de LNA son 5-metil-citosina y todos los enlaces internucleosídicos son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
En otro aspecto, la presente invención es una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido de la presente invención y un diluyente, disolvente, vehículo, sal y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la presente invención es una composición farmacéutica de la presente invención para su uso como medicamento.
En otro aspecto, la presente invención es un procedimiento in vitro para inducir la expresión de UBE3A en una célula diana donde se suprime la expresión de UBE3A paterno, comprendiendo dicho procedimiento administrar un oligonucleótido de la presente invención o la composición farmacéutica de una cualquiera de la presente invención en una cantidad eficaz a dicha célula.
En otro aspecto, la presente invención es el oligonucleótido de la presente invención o la composición farmacéutica de la presente invención para su uso en el tratamiento o prevención del síndrome de Angelman.
La presente invención se refiere a oligonucleótidos dirigidos a un ácido nucleico que puede suprimir la expresión de UBE3A y al tratamiento o prevención de enfermedades relacionadas con la actividad disminuida de UBE3A, en particular en células neuronales.
En el presente documento se describen oligonucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 98 % de complementariedad con la parte del ARN no codificante largo de SNHG14 humano correspondiente a la posición de 25278410 a 25419462 en el cromosoma 15 humano, versión GRCh38.p2. La SEQ ID NO: 1 también se parece a esta región. El oligonucleótido puede ser un oligonucleótido antisentido, preferentemente con un diseño de gápmero. Preferentemente, el oligonucleótido puede inducir la expresión de UBE3A, en particular la expresión de UBE3A paterno en una neurona, por degradación, reducción o retirada del supresor de UBE3A, en particular por reducción del transcrito de ARN no codificante largo SNHG14 en dirección 3' de SNORD109B. Se logra la reexpresión de UBE3A, sin afectar significativamente la expresión de SNORD115. La degradación del ácido nucleico diana se logra preferentemente por medio del reclutamiento de nucleasas.
En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el oligonucleótido de la invención y diluyentes, vehículos, sales y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.
En el presente documento se describen procedimientos para la inducción in vivo o in vitro de la expresión de UBE3A en una célula diana donde se suprime la expresión de UBE3A paterno, al administrar un oligonucleótido o composición de la invención en una cantidad eficaz a dicha célula.
En el presente documento se describen procedimientos para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o disfunción asociada con la actividad in vivo de UBE3A que comprenden administrar una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del oligonucleótido de la invención a un sujeto que padece o es susceptible a la enfermedad, trastorno o disfunción.
En otro aspecto, el oligonucleótido o la composición de la invención se usa para el tratamiento o la prevención del síndrome de Angelman.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: La hebra superior ilustra la región del transcrito SNHG14 en dirección 3' de SNORD109B (UBE3A-ATS) donde los cuadros negros indican la localización de los oligonucleótidos de ratón sometidos a prueba. La hebra inferior ilustra la región de codificación de UBE3A, donde los cuadros negros indican exones. El exón 1 está localizado alrededor de 160 kb. Los oligonucleótidos se disponen en la región antisentido del exón 9 (situado a ~97 kb), exón 10 (situado a ~92 kb), exón 13 (situado a ~77 kb) y el extremo 5' del exón 16 (situado a ~60 kb).
Figura 2: Representación de la capacidad de los oligonucleótidos, sometidos a prueba en el ejemplo 2, para inducir la reexpresión de UBE3A en cultivos de células neuronales humanas. Los oligonucleótidos complementarios a la región del ARN no codificante largo de SNHG14 humano entre SNORD109B y la región en dirección 5' de la región codificante de UBE3A (posición de 1 a 55318 de SEQ ID NO: 1) se indican con • no superposición. Los oligonucleótidos complementarios a la región del ARN no codificante largo de SNHG14 humano que es antisentido con respecto al pre-ARNm de UBE3A (posición de 55319 a 141053 de SEQ ID NO: 1) se indican con A superposición. Los oligonucleótidos de la tabla 3 con conservación para seres humanos y macacos de la India se indican en la parte inferior de cada gráfico como □. La conservación entre ser humano:macaco:ratón se indica por ■. Las concentraciones de oligonucleótido fueron 0,2, 1 y 5 microM como se indica en el lado derecho de cada gráfico.
DEFINICIONES
Oligonucleótido
El término "oligonucleótido", como se usa en el presente documento, se define como se entiende en general por el experto en la técnica como una molécula que comprende dos o más nucleósidos unidos covalentemente. Dichos nucleósidos unidos covalentemente también se pueden denominar moléculas u oligómeros de ácido nucleico. Los oligonucleótidos se preparan habitualmente en el laboratorio por síntesis química en fase sólida seguida de purificación. Cuando se hace referencia a una secuencia del oligonucleótido, se hace referencia a la secuencia u orden de los restos de nucleobases, o modificaciones de los mismos, de los nucleótidos o nucleósidos unidos covalentemente. El oligonucleótido de la invención es artificial, y se sintetiza químicamente, y típicamente se purifica o se aísla. El oligonucleótido de la invención puede comprender uno o más nucleósidos o nucleótidos modificados.
Oligonucleótidos antisentido
El término "oligonucleótido antisentido" como se usa en el presente documento se define como oligonucleótidos que pueden modular la expresión de un gen diana hibridando con un ácido nucleico diana, en particular con una secuencia contigua en un ácido nucleico diana. Los oligonucleótidos antisentido no son esencialmente bicatenarios y, por lo tanto, no son ARNip. Preferentemente, el oligonucleótido antisentido de la presente invención es monocatenario.
Secuencia de nucleótidos contiguos
El término "secuencia de nucleótidos contiguos" se refiere a la región del oligonucleótido que es complementaria al ácido nucleico diana. El término se usa de manera intercambiable en el presente documento con el término "secuencia de nucleobases contigua" y el término "secuencia de motivos oligonucleotídicos". En algunos modos de realización, todos los nucleótidos del oligonucleótido están presentes en la secuencia de nucleótidos contiguos. En algunos modos de realización, el oligonucleótido comprende la secuencia de nucleótidos contiguos y, opcionalmente, puede comprender otro(s) nucleótido(s), por ejemplo, una región conectora de nucleótidos que se puede usar para unir un grupo funcional a la secuencia de nucleótidos contiguos. La región conectora de nucleótidos puede ser o no complementaria al ácido nucleico diana.
Nucleótidos
Los nucleótidos son los bloques de construcción de oligonucleótidos y polinucleótidos, y para los propósitos de la presente invención incluyen nucleótidos tanto naturales como no naturales. En la naturaleza, los nucleótidos, tales como los nucleótidos de ADN y ARN, comprenden un resto glucídico ribosa, un resto de nucleobase y uno o más grupos fosfato (que están ausentes en los nucleósidos). Los nucleósidos y nucleótidos también se pueden denominar de manera intercambiable "unidades" o "monómeros".
Nucleósido modificado
El término "nucleósido modificado" o "modificación de nucleósido" como se usa en el presente documento se refiere a nucleósidos modificados en comparación con el nucleósido de ADN o ARN equivalente por la introducción de una o más modificaciones del resto glucídico o el resto de (núcleo)base. El nucleósido modificado comprende un resto glucídico modificado. El término nucleósido modificado también se puede usar en el presente documento de manera intercambiable con el término "análogo de nucleósido" o "unidades" modificadas o "monómeros" modificados.
Enlace internucleosídico modificado
El término "enlace internucleosídico modificado" se define como se entiende en general por el experto en la técnica como enlaces distintos de los enlaces fosfodiéster (PO), que acoplan covalentemente dos nucleósidos entre sí. Los nucleótidos con enlace internucleosídico modificado también se denominan "nucleótidos modificados". En algunos modos de realización, el enlace internucleosídico modificado incrementa la resistencia a las nucleasas del oligonucleótido en comparación con un enlace fosfodiéster. Para los oligonucleótidos naturales, el enlace internucleosídico incluye grupos fosfato que crean un enlace fosfodiéster entre nucleósidos contiguos. Los enlaces internucleosídicos modificados son en particular útiles para estabilizar oligonucleótidos para su uso in vivo, y pueden servir para proteger frente a la escisión de nucleasas en regiones de nucleósidos de ADN o ARN en el oligonucleótido de la invención, por ejemplo, dentro de la región de hueco de un oligonucleótido gápmero, así como en regiones de nucleósidos modificados.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende uno o más enlaces internucleosídicos modificados del fosfodiéster natural a un enlace que es, por ejemplo, más resistente al ataque de nucleasa. La resistencia a las nucleasas se puede determinar incubando el oligonucleótido en suero sanguíneo o usando un ensayo de resistencia a las nucleasas (por ejemplo, fosfodiesterasa de veneno de serpiente (SVPD)), ambos son bien conocidos en la técnica. Los enlaces internucleosídicos que pueden potenciar la resistencia a las nucleasas de un oligonucleótido se denominan enlaces internucleosídicos resistentes a las nucleasas. Como se describe en el presente documento, al menos un 50 % de los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contiguos del mismo, se modifican, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 o tal como al menos un 90 % de los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contiguos del mismo, se modifican. En algunos modos de realización, se modifican todos los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contiguos del mismo. Se reconocerá que, en algunos modos de realización, los nucleósidos que unen el oligonucleótido de la invención a un grupo funcional no nucleotídico, tal como un conjugado, pueden ser fosfodiéster. Como se describe en el presente documento, todos los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contiguos del mismo, son enlaces internucleosídicos resistentes a las nucleasas.
Los enlaces internucleosídicos modificados se pueden seleccionar del grupo que comprende fosforotioato, difosforotioato y boranofosfato. Como se describe en el presente documento, los enlaces internucleosídicos modificados son compatibles con el reclutamiento de RNasaH del oligonucleótido de la invención, por ejemplo, fosforotioato, difosforotioato o boranofosfato.
Como se describe en el presente documento, el enlace internucleosídico comprende azufre (S), tal como un enlace internucleosídico de fosforotioato.
Un enlace internucleosídico de fosforotioato es en particular útil debido a la resistencia a las nucleasas, la farmacocinética beneficiosa y la facilidad de fabricación. Como se describe en el presente documento, al menos un 50 % de los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contiguos del mismo, son fosforotioato, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 o tal como al menos un 90 % de los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contiguos del mismo, son fosforotioato. En algunos modos de realización, todos los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contiguos del mismo, son fosforotioato.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende uno o más enlaces internucleosídicos neutros, en particular un enlace internucleosídico seleccionado de fosfotriéster, metilfosfonato, MMI, amida-3, formacetal o tioformacetal.
En el documento WO2009/124238 se divulgan otros enlaces internucleosídicos. Como se describe en el presente documento, el enlace internucleosídico se selecciona de los conectores divulgados en el documento WO2007/031091. En particular, el enlace internudeosídico se puede seleccionar de -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S -P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -N R H-P(O)2-O-, -N R H-CO-O-, -N R H-CO-NRH- y/o el conector internudeosídico se puede seleccionar del grupo que consiste en: -O -CO-O-, -O-CO-NRH-, -N R h-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRh- , -O-CH2-CH2-NRh-, -CO-NRh-CH2-, -CH 2-NRhCO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH 2-SO2-CH2-, -CH 2-CO-NRh- , -O-CH2-CH2-NRh-CO-, -CH 2-NCH3-O-CH2-, donde RH se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-4.
Los enlaces resistentes a las nucleasas, tales como los enlaces de fosfotioato, son en particular útiles en regiones de oligonucleótidos que pueden reclutar nucleasas cuando forman un dúplex con el ácido nucleico diana, tal como la región G para gápmeros, o la región de nucleósidos no modificados de oligómeros de cabeza y oligómeros de cola. Sin embargo, los enlaces fosforotioato también pueden ser útiles en regiones de reclutamiento no de nucleasas y/o regiones potenciadoras de la afinidad tales como las regiones F y F' para gápmeros, o la región de nucleósidos modificados de oligómeros de cabeza y oligómeros de cola.
Sin embargo, cada una de las regiones de diseño puede comprender enlaces internucleosídicos distintos de fosforotioato, tales como enlaces fosfodiéster, en particular en regiones donde los nucleósidos modificados, tales como el LNA, protegen el enlace frente a la degradación por nucleasa. La inclusión de enlaces fosfodiéster, tales como uno o dos enlaces, en particular entre o contiguos a unidades de nucleósidos modificados (típicamente en las regiones de reclutamiento no de nucleasas) puede modificar la biodisponibilidad y/o biodistribución de un oligonucleótido; véase el documento WO2008/113832.
Como se describe en el presente documento, todos los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido son enlaces fosforotioato y/o boranofosfato. Preferentemente, todos los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido son enlaces fosforotioato.
Nucleobase
El término nucleobase incluye el resto purina (por ejemplo, adenina y guanina) y pirimidina (por ejemplo, uracilo, timina y citosina) presentes en nucleósidos y nucleótidos que forman enlaces de hidrógeno en la hibridación de ácidos nucleicos. En el contexto de la presente invención, el término nucleobase también engloba nucleobases modificadas que pueden diferir de las nucleobases naturales, pero que son funcionales durante la hibridación de ácidos nucleicos. En este contexto, "nucleobase" se refiere tanto a nucleobases naturales tales como adenina, guanina, citosina, timidina, uracilo, xantina e hipoxantina, como a variantes no naturales. Dichas variantes se describen, por ejemplo, en Hirao et al., (2012) Accounts of Chemical Research, vol. 45 página 2055 y Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1.
En algunos modos de realización, el resto de nucleobase se modifica cambiando la purina o pirimidina por una purina o pirimidina modificada, tal como purina sustituida o pirimidina sustituida, tal como una nucleobase seleccionada de isocitosina, seudoisocitosina, 5-metil-citosina, 5-tiozolo-citosina, 5-propinil-citosina, 5-propinil-uracilo, 5-bromouracilo 5-tiazolo-uracilo, 2-tio-uracilo, 2'tio-timina, inosina, diaminopurina, 6-aminopurina, 2-aminopurina, 2,6- diaminopurina y 2-cloro-6-aminopurina.
Los restos de nucleobase se pueden indicar por el código de letra para cada nucleobase correspondiente, por ejemplo, A, T, G, C o U, en el que cada letra puede incluir opcionalmente nucleobases modificadas de función equivalente. Por ejemplo, en los oligonucleótidos ejemplificados, los restos de nucleobase se seleccionan de A, T, G, C y 5-metilcitosina. Opcionalmente, para los gápmeros de LNA, se pueden usar nucleósidos de LNA 5-metil-citosina.
Oligonucleótido modificado
El término oligonucleótido modificado describe un oligonucleótido que comprende uno o más nucleósidos con glúcido modificado y/o enlaces internucleosídicos modificados. El término oligonucleótido quimérico" es un término que se ha usado en la literatura para describir oligonucleótidos con nucleósidos modificados.
Complementariedad
El término complementariedad describe la capacidad de emparejamiento de bases de Watson-Crick de nucleósidos/nucleótidos. Los pares de bases de Watson-Crick son guanina (G)-citosina (C) y adenina (A)-timina (T)/uracilo (U). Se entenderá que los oligonucleótidos pueden comprender nucleósidos con nucleobases modificadas, por ejemplo, la 5-metil-citosina se usa a menudo en lugar de citosina y, como tal, el término complementariedad engloba el emparejamiento de bases de Watson-Crick entre nucleobases no modificadas y modificadas (véase, por ejemplo, Hirao etal., (2012) Accounts of Chemical Research, vol. 45 página 2055 y Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Supl. 371.4.1).
El término "% complementario" como se usa en el presente documento, se refiere al número de nucleótidos en porcentaje de una secuencia de nucleótidos contiguos en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido) que, en una posición dada, son complementarios a (es decir, forman pares de bases de Watson-Crick con) una secuencia de nucleótidos contiguos, en una posición dada de una molécula de ácido nucleico separada (por ejemplo, el ácido nucleico diana). El porcentaje se calcula contando el número de bases alineadas que forman pares entre las dos secuencias, dividiendo por el número total de nucleótidos en el oligonucleótido y multiplicando por 100. En una comparación de este tipo, una nucleobase/un nucleótido que no se alinea (forma un par de bases) se denomina emparejamiento erróneo.
El término "completamente complementario" se refiere a una complementariedad de un 100 %.
Hibridación
El término "hibridar" o "hibrida" como se usa en el presente documento se ha de entender como dos hebras de ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido y un ácido nucleico diana) que forman enlaces de hidrógeno entre pares de bases en hebras opuestas formando de este modo un dúplex. La afinidad de la unión entre dos hebras de ácido nucleico es la fuerza de la hibridación. A menudo se describe en términos de la temperatura de fusión (Tm) definida como la temperatura a la que la mitad de los oligonucleótidos forman un dúplex con el ácido nucleico diana. En condiciones fisiológicas, Tm no es estrictamente proporcional a la afinidad (Mergny y Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13: 515-537). La energía libre de Gibbs AG° en estado estándar es una representación más exacta de la afinidad de unión y está relacionada con la constante de disociación (Kd) de la reacción por AG°=-RTIn(Kd), donde R es la constante de los gases y T es la temperatura absoluta. Por lo tanto, una AG° muy baja de la reacción entre un oligonucleótido y el ácido nucleico diana refleja una fuerte hibridación entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana. AG° es la energía asociada con una reacción donde las concentraciones acuosas son 1 M, el pH es 7 y la temperatura es de 37 °C. La hibridación de oligonucleótidos con un ácido nucleico diana es una reacción espontánea y para reacciones espontáneas, AG° es menor que cero. AG° se puede medir experimentalmente, por ejemplo, por el uso del procedimiento de calorimetría de valoración isotérmica (ITC) como se describe en Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38 y Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today. El experto en la técnica sabrá que están disponibles equipos comerciales para mediciones de AG°. AG° también se puede estimar numéricamente usando el modelo de vecino más cercano como se describe por Santa Lucía, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95:1460-1465 usando parámetros termodinámicos derivados de forma apropiada descritos por Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 y McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405. Para tener la posibilidad de modular su ácido nucleico diana previsto por hibridación, los oligonucleótidos de la presente invención se hibridan a un ácido nucleico diana con valores estimados de AG° por debajo de -10 kcal para oligonucleótidos que tienen una longitud de 10-30 nucleótidos. En algunos modos de realización, el grado o la fuerza de hibridación se mide por la energía libre de Gibbs AG° en estado estándar. Los oligonucleótidos se pueden hibridar a un ácido nucleico diana con valores estimados de AG° por debajo del intervalo de -10 kcal, tal como por debajo de -15 kcal, tal como por debajo de -20 kcal y tal como por debajo de -25 kcal para oligonucleótidos que tienen una longitud de 8-30 nucleótidos. En algunos modos de realización, los oligonucleótidos se hibridan a un ácido nucleico diana con un valor estimado de AG° de -10 a -60 kcal, tal como -12 a -40, tal como de -15 a -30 kcal o -16 a -27 kcal, tal como como -18 a -25 kcal.
La diana
La diana se refiere a la proteína que se desea modular.
Ácido nucleico diana
Un ácido nucleico diana es la diana prevista con la que se hibrida el oligonucleótido de la invención, y puede ser, por ejemplo, un gen, un ARN, un ARN no codificante, un ARN no codificante largo, un ARNm y pre-ARNm, un ARNm maduro o una secuencia de ADNc. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana es un ARN no codificante o un ARN no codificante largo o una subsecuencia del mismo. Para la aplicación in vivo o in vitro, el oligonucleótido de la invención puede disminuir el nivel del transcrito SNHG14 en dirección 3' de SNORD109B y de este modo, aliviar la supresión del transcrito de UBE3A paterno en la célula diana prevista. La secuencia contigua de nucleobases del oligonucleótido de la invención es complementaria al ácido nucleico diana, como se mide a lo largo de la longitud del oligonucleótido, opcionalmente con la excepción de uno o dos emparejamientos erróneos, y opcionalmente excluyendo las regiones conectoras basadas en nucleótidos que pueden unir el oligonucleótido a un grupo funcional opcional como un conjugado.
Secuencia diana
El oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos contiguos que es complementaria a, o se hibrida a, una subsecuencia de la molécula de ácido nucleico diana. El término "secuencia diana" como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de nucleótidos presente en el ácido nucleico diana que comprende la secuencia de nucleobases que es complementaria al oligonucleótido de la invención. En algunos modos de realización, la secuencia diana consiste en una región en el ácido nucleico diana que es complementaria a la secuencia de nucleótidos contiguos del oligonucleótido de la invención. En algunos modos de realización, la secuencia diana es más larga que la secuencia complementaria de un único oligonucleótido y, por ejemplo, puede representar una región preferente del ácido nucleico diana que se puede seleccionar por varios oligonucleótidos de la invención.
El oligonucleótido de la invención comprende una secuencia de nucleótidos contiguos que es complementaria al ácido nucleico diana, tal como una secuencia diana.
El oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos contiguos de al menos 8 nucleótidos que es complementaria a, o se hibrida a, una secuencia diana presente en la molécula de ácido nucleico diana. La secuencia de nucleótidos contiguos (y por lo tanto la secuencia diana) comprende al menos 8 nucleótidos contiguos, tal como 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos contiguos, tal como de 12 a 25, tal como de 14 a 18 nucleótidos contiguos.
Célula diana
El término célula diana, como se usa en el presente documento, se refiere a una célula que expresa el ácido nucleico diana. Como se describe en el presente documento, la célula diana puede ser in vivo o in vitro. En algunos modos de realización, la célula diana es una célula de mamífero, tal como una célula de roedor, tal como una célula de ratón o una célula de rata, o una célula de primate, tal como una célula de mono o una célula humana. En modos de realización preferentes, la célula diana es una célula neuronal.
Variante natural
El término "variante natural" se refiere a variantes del transcrito SNHG14 en dirección 3' del gen SNORD109B o transcritos que se originan en los mismos locus genéticos que el ácido nucleico diana, pero que pueden diferir, por ejemplo, en virtud de la degeneración del código genético provocando una multiplicidad de codones en el ARN no codificante largo. Por lo tanto, el oligonucleótido de la invención se puede diseñar para seleccionar al ácido nucleico diana y las variantes naturales del mismo.
Modulación de la expresión
El término "modulación de la expresión" como se usa en el presente documento se ha de entender como un término global para la capacidad de un oligonucleótido para alterar la cantidad de proteína UBE3A cuando se compara con la cantidad de UBE3A antes de la administración del oligonucleótido. De forma alternativa, la modulación de la expresión se puede determinar por referencia a un experimento de control donde no se administra el oligonucleótido de la invención. La modulación efectuada por el oligonucleótido está relacionada con su capacidad para reducir, retirar, evitar, decrecer, disminuir o terminar la supresión del transcrito de UBE3A paterno, por ejemplo, por degradación o retirada del transcrito SNHG14 no codificante en dirección 3' de SNORD109B o por bloqueo o prevención de la actividad polimerasa asociada con el transcrito SNHG14 en dirección 3' de SNORD109B. La modulación también se puede ver como la capacidad del oligonucleótido para restaurar, incrementar o potenciar la expresión de UBE3A paterno, por ejemplo, por la retirada o bloqueo de los mecanismos inhibidores afectados por el transcrito SNHG14 no codificante en dirección 3' de SNORD109B.
Nucleósidos modificados de alta afinidad
Un nucleósido modificado de alta afinidad es un nucleótido modificado que, cuando se incorpora en el oligonucleótido potencia la afinidad del oligonucleótido por su diana complementaria, por ejemplo como se mide por la temperatura de fusión (Tm). Un nucleósido modificado de alta afinidad de la presente invención preferentemente da como resultado un incremento en la temperatura de fusión entre 0,5 a 12 °C, más preferentemente entre 1,5 a 10 °C y lo más preferentemente entre+3 a 8 °C por nucleósido modificado. Son conocidos en la técnica numerosos nucleósidos modificados de alta afinidad e incluyen, por ejemplo, muchos nucleósidos sustituidos en 2' así como ácidos nucleicos bloqueados (LNA) (véase, por ejemplo, Freier y Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 y Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213).
Modificaciones de glúcido
El oligómero de la invención puede comprender uno o más nucleósidos que tienen un resto glucídico modificado, es decir, una modificación del resto glucídico en comparación con el resto glucídico ribosa encontrado en el ADN y el ARN.
Se han preparado numerosos nucleósidos con modificación del resto glucídico ribosa, principalmente con el objetivo de mejorar determinadas propiedades de los oligonucleótidos, tales como la afinidad y/o la resistencia a las nucleasas.
Dichas modificaciones incluyen aquellas donde se modifica la estructura del anillo de ribosa, por ejemplo, por reemplazo con un anillo de hexosa (HNA), o un anillo bicíclico, que típicamente tienen un puente birradicular entre los carbonos C2 y C4 en el anillo de ribosa (LNA), o un anillo de ribosa no unido que típicamente carece de un enlace entre los carbonos C2 y C3 (por ejemplo, UNA). Otros nucleósidos con glúcido modificado incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos de biciclohexosa (documento WO2011/017521) o ácidos nucleicos tricíclicos (documento WO2013/154798). Los nucleósidos modificados también incluyen nucleósidos donde el resto glucídico se reemplaza con un resto no glucídico, por ejemplo, en el caso de ácidos nucleicos peptídicos (ANP) o ácidos nucleicos morfolino.
Las modificaciones del glúcido también incluyen modificaciones realizadas por medio de la alteración de los grupos sustituyentes en el anillo de ribosa a grupos distintos del hidrógeno, o el grupo 2'-OH encontrado naturalmente en los nucleósidos de ADN y ARN. Los sustituyentes se pueden introducir, por ejemplo, en las posiciones 2', 3', 4' o 5'. Los nucleósidos con restos glucídicos modificados también incluyen nucleósidos modificados en 2', tales como nucleósidos sustituidos en 2'. De hecho, se ha prestado mucha atención al desarrollo de nucleósidos sustituidos en 2', y se ha descubierto que numerosos nucleósidos sustituidos en 2' tienen propiedades beneficiosas cuando se incorporan en oligonucleótidos, tales como una resistencia de nucleósido potenciada y una afinidad potenciada.
Nucleósidos modificados en 2'
Un nucleósido con glúcido modificado en 2' es un nucleósido que tiene un sustituyente distinto de H u -OH en la posición 2' (nucleósido sustituido en 2') o comprende una birradícula unida en 2', e incluye nucleósidos sustituidos en 2' y nucleósidos de LNA (con puente birradicular en 2' - 4'). Por ejemplo, el glúcido modificado en 2' puede proporcionar una afinidad de unión potenciada y/o una resistencia a las nucleasas incrementada al oligonucleótido. Los ejemplos de nucleósidos modificados sustituidos en 2' son 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, 2'-alcoxi-ARN, 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), 2'-amino-ADN, 2'-fluoro-ARN y 2'-fluoro-ANA (F-ANA). Para otros ejemplos, véase, por ejemplo, Freier y Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 y Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213; y Deleavey y Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937. A continuación se muestran ilustraciones de algunos nucleósidos modificados sustituidos en 2'.
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Los nucleósidos de LNA son nucleósidos modificados que comprenden un grupo conector (denominado birradícula o puente) entre C2' y C4' del anillo glucídico de ribosa de un nucleótido. Estos nucleósidos también se denominan ácido nucleico con puente o ácido nucleico bicíclico (BNA) en la literatura.
Como se describe en el presente documento, el nucleósido modificado o los nucleósidos de LNA del oligómero de la invención tiene una estructura general de fórmula I o II:
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Fórmula I Fórmula II
en la que W se selecciona de -O -, -S -, -N(R a)-, -C(RaRb)-, tal como, en algunos modos de realización -O -;
B designa una nucleobase o un resto de nucleobase modificado;
Z designa un enlace internucleosídico a un nucleósido contiguo, o un grupo de extremo 5';
Z* designa un enlace internucleosídico a un nucleósido contiguo, o un grupo de extremo 3';
X designa un grupo seleccionado de la lista que consiste en -C(R aRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O -, -Si(Ra)2-, -S -, -SO 2-, -N(Ra)- y >C=Z
En algunos modos de realización, X se selecciona del grupo que consiste en: -O -, -S -, NH-, NRaRb, -CH 2-, CRaRb, -C(=CH2) - y -C(=CRaRb)-
En algunos modos de realización, X es -O -
Y designa un grupo seleccionado del grupo que consiste en -C(R aRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O -, -S i(Ra)2-, -S -, -SO 2-, -N(Ra)- y >C=Z
En algunos modos de realización, Y se selecciona del grupo que consiste en: -C H 2-, -C(R aRb)-, -CH 2CH2-, -C(RaRb)-C(RaRb)-, -CH 2CH2CH2-, -C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb) - y -C(R a)=N-
En algunos modos de realización, Y se selecciona del grupo que consiste en: -CH 2-, -CHRa-, -CHCH3-, CRaRb-
o -X-Y- juntos designan un grupo conector bivalente (también denominado radícula) juntos designan un grupo conector bivalente que consiste en 1, 2, 3 o 4 grupos/átomos seleccionados del grupo que consiste en -C(R aRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(R a)=N-, -O -, -S i(Ra)2-, -S -, -SO 2-, -N(Ra) - y >C=Z,
En algunos modos de realización, -X-Y- designa una birradícula seleccionada del grupo que consiste en: -X-CH2-, -X-CRaRb-, -X-CHRa -, -X-C(HCH3)- , -O -Y -, -O-CH2-, -S-CH2-, -NH-CH2-, -O-CHCH3-, -CH 2-O-CH2, -O -CH(CH3CH3)-, -O-CH2-CH2-, OCH2-CH2-CH2-,-O-CH2OCH2-, -O-NCH2-, -C(=CH2)-CH2-, -NR a-CH2-, N-O-CH2, -S-CRaRb- y -S-CHRa-
En algunos modos de realización, -X -Y - designa -O-CH2- u -O-CH(CH3)-.
en la que Z se selecciona de -O -, -S - y -N(R a)-,
y Ra y, cuando está presente Rb, cada uno se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo C 1-6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-6 opcionalmente sustituido, hidroxi, alcoxi C1-6 opcionalmente sustituido, alcoxialquilo C2-6, alqueniloxi C2-6, carboxi, alcoxicarbonilo C1-6, alquilcarbonilo C1-6, formilo, arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo, heteroariloxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono- y di(alquil C1-6)amino, carbamoílo, mono- y di(alquil C1-6)-amino-carbonilo, aminoalquil C1-6-aminocarbonilo, mono- y di(alquil C1-6)amino-alquil C1-6-aminocarbonilo, alquil C1-6-carbonilamino, carbamido, alcanoiloxi C1-6, sulfono, alquil C1-6-sulfoniloxi, nitro, azido, sulfanilo, alquiltio C1-6, halógeno, donde arilo y heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos y donde dos sustituyentes geminales Ra y Rb juntos pueden designar metileno (=CH2) opcionalmente sustituido, en la que para todos los centros quirales, los grupos asimétricos se pueden encontrar en orientación R o bien S.
en la que R1, R2, R3, R5 y R5* se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: hidrógeno, alquilo C 1-6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2- 6 opcionalmente sustituido, hidroxi, alcoxi Ci - 6 , alcoxialquilo C2-6, alqueniloxi C2-6, carboxi, alcoxicarbonilo C i -6 ,alquilcarbonilo C1-6, formilo, arilo, ariloxicarbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo, heteroariloxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono- y di(alquil C i -6 )amino, carbamoílo, mono- y di(alquil Ci -6 )-amino-carbonilo, amino-alquil Ci -6 -aminocarbonilo, mono- y di(alquil C i -6 )amino-alquil Ci -6 -aminocarbonilo, alquil Ci -6 -carbonilamino, carbamido, alcanoiloxi C1-6, sulfono, alquil Ci -6 -sulfoniloxi, nitro, azido, sulfanilo, alquiltio C1-6, halógeno, donde arilo y heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos, y donde dos sustituyentes geminales juntos pueden designar oxo, tioxo, imino o metileno opcionalmente sustituido.
En algunos modos de realización, R1, R2, R3, R5 y R5* se seleccionan independientemente de alquilo C1-6, tal como metilo, e hidrógeno.
En algunos modos de realización, R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno.
En algunos modos de realización, R1, R2, R3 son todos hidrógeno, y cualquiera de R5 y R5* también es hidrógeno y el otro de R5 y R5* es distinto de hidrógeno, tal como alquilo C1-6, tal como metilo.
En algunos modos de realización, Ra es hidrógeno o bien metilo. En algunos modos de realización, cuando está presente, Rb es hidrógeno o bien metilo.
En algunos modos de realización, uno o ambos de Ra y Rb es hidrógeno
En algunos modos de realización, uno de Ra y Rb es hidrógeno y el otro es distinto de hidrógeno
En algunos modos de realización, uno de Ra y Rb es metilo y el otro es hidrógeno
En algunos modos de realización, tanto Ra como Rb son metilo.
En algunos modos de realización, la birradícula -X-Y- es -O-CH2-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. Dichos nucleósidos de LNA se divulgan en los documentos WO99/014226, WO00/66604, WO98/039352 y WO2004/046160, e incluyen los que son conocidos comúnmente como nucleósidos de LNA beta-D-oxi y LNA alfa-L-oxi.
En algunos modos de realización, la birradícula -X-Y- es -S-CH2-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. Dichos nucleósidos de LNA tio se divulgan en los documentos WO99/014226 y WO2004/046160.
En algunos modos de realización, la birradícula -X-Y- es -NH-CH2-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. Dichos nucleósidos de LNA amino se divulgan en los documentos WO99/014226 y WO2004/046160. En algunos modos de realización, la birradícula -X-Y- es -O-CH2-CH2- u -O-CH2-CH2-CH2-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. Dichos nucleósidos de LNA se divulgan en el documento WO00/047599 y Morita et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 1273-76, e incluyen los que son conocidos comúnmente como ácidos nucleicos con puente de etileno en 2'-O,4-'C (ENA).
En algunos modos de realización, la birradícula -X -Y - es -O-CH2-, W es O, y todos de R1, R2, R3 y uno de R5 y R5* son hidrógeno, y el otro de R5 y R5* es distinto de hidrógeno, tal como alquilo C1-6, tal como metilo. Dichos nucleósidos de LNA sustituidos en 5' se divulgan en el documento WO2007/134181.
En algunos modos de realización, la birradícula -X-Y- es -O-CRaRb-, en la que uno o ambos de Ra y Rb son distintos de hidrógeno, tal como metilo, W es O, y todos de R1, R2, R3 y uno de R5 y R5* son hidrógeno, y el otro de R5 y R5* es distinto de hidrógeno, tal como alquilo C1-6, tal como metilo. Dichos nucleósidos de LNA bis modificados se divulgan en el documento WO2010/077578.
En algunos modos de realización, la birradícula -X-Y- designa el grupo conector bivalente -O-CH(CH2OCH3)-(ácido nucleico bicíclico con 2'-O-metoxietilo - Seth et al., 2010, J. Org. Chem., vol 75(5) págs. 1569-81). En algunos modos de realización, la birradícula -X-Y- designa el grupo conector bivalente -O-CH(CH2CH3)-(ácido nucleico bicíclico con 2'-O-etilo -Seth et al., 2010, J. Org. Chem., vol 75(5) págs. 1569-81). En algunos modos de realización, la birradícula -X-Y- es -O-CHRa-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. Dichos nucleósidos de LNA sustituidos en 6' se divulgan en los documentos WO10036698 y WO07090071.
En algunos modos de realización, la birradícula -X-Y- es -O-CH(CH2OCH3)-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. Dichos nucleósidos de LNA también son conocidos como MOE cíclicos en la técnica (cMOE) y se divulgan en el documento WO07090071.
En algunos modos de realización, la birradícula -X-Y- designa el grupo conector bivalente -O-CH(CH3)-. - en la configuración R - o bien S-. En algunos modos de realización, la birradícula -X-Y- junta designa el grupo conector bivalente -O-CH2-O-CH2-(Seth et al., 2010, J. Org. Chem). En algunos modos de realización, la birradícula -X-Y- es O-CH(CH3)-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. Dichos nucleósidos de LNA 6'-metilo también son conocidos como nucleósidos cET en la técnica, y pueden ser estereoisómeros (S)cET o bien (R)cET, como se divulga en los documentos WO07090071 (beta-D) y WO2010/036698 (alfa-L).
En algunos modos de realización, la birradícula -X-Y- es -O-CRaRb-, en la que ninguno de Ra o Rb es hidrógeno, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. En algunos modos de realización, Ra y Rb son ambos metilo. Dichos nucleósidos de LNA disustituidos en 6' se divulgan en el documento WO2009006478.
En algunos modos de realización, la birradícula -X-Y- es -S-CHRa-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. Dichos nucleósidos de LNA tio sustituidos en 6' se divulgan en. En algunos modos de realización de LNA tio sustituido en 6', Ra es metilo.
En algunos modos de realización, la birradícula -X -Y - es -C(=CH2)-C(RaRb)-, tal como -C(=CH2)-CH2-, o -C(=CH2)-CH(CH3)-W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. Dichos nucleósidos de LNA vinil-carbono se divulgan en los documentos WO08154401 y WO09067647.
En algunos modos de realización, la birradícula -X-Y- es -N(-ORa)-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. En algunos modos de realización Ra es alquilo C1-6, tal como metilo. Dichos nucleósidos de LNA también son conocidos como LNA sustituidos con N y se divulgan en el documento WO2008/150729. En algunos modos de realización, la birradícula -X-Y- junta designa el grupo conector bivalente -O-NRa-CH3- (Seth et al., 2010, J. Org. Chem). En algunos modos de realización, la birradícula -X-Y- es -N(Ra)-, W es O, y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. En algunos modos de realización Ra es alquilo C1-6, tal como metilo.
En algunos modos de realización, uno o ambos de R5 y R5* es hidrógeno y, cuando está sustituido, el otro de R5 y R5* es alquilo C1-6, tal como metilo. En un modo de realización de este tipo, R1, R2, R3, pueden ser todos hidrógeno, y la birradícula -X -Y - se puede seleccionar de -O -CH2- u -OC(HCRa)-, tal como -OC(HCH3)-.
En algunos modos de realización, la birradícula es -CRaRb-O-CRaRb-, tal como CH2-O-CH2-, W es O y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. En algunos modos de realización Ra es alquilo C1-6, tal como metilo. Dichos nucleósidos de LNA también son conocidos como nucleótidos conformacionalmente restringidos (CRN) y se divulgan en el documento WO2013036868.
En algunos modos de realización, la birradícula es -O-CRaRb-O-CRaRb-, tal como O-CH2-O-CH2-, W es O y todos de R1, R2, R3, R5 y R5* son todos hidrógeno. En algunos modos de realización Ra es alquilo C1-6, tal como metilo. Dichos nucleósidos de LNA también son conocidos como nucleótidos COC y se divulgan en Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 200937(4), 1225-1238.
Se reconocerá que, a menos que se especifique, los nucleósidos de LNA pueden estar en la estereoisoforma beta-D o alfa-L.
En el esquema 1 se presentan determinados ejemplos de nucleósidos de LNA.
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Como se ilustra en los ejemplos, en modos de realización preferentes de la invención, los nucleósidos de LNA en los oligonucleótidos son nucleósidos beta-D-oxi-LNA.
Degradación mediada por nucleasa
La degradación mediada por nucleasa se refiere a un oligonucleótido que puede mediar la degradación de una secuencia de nucleótidos complementaria cuando forma un dúplex con una secuencia de este tipo.
En algunos modos de realización, el oligonucleótido puede actuar por medio de la degradación mediada por nucleasa del ácido nucleico diana, donde los oligonucleótidos de la invención pueden reclutar una nucleasa, en particular una endonucleasa, preferentemente endorribonucleasa (RNasa), tal como RNasa H. Los ejemplos de diseños de oligonucleótidos que actúan por medio de mecanismos mediados por nucleasas son oligonucleótidos que típicamente comprenden una región de al menos 5 o 6 nucleósidos de ADN y están flanqueados en un lado o en ambos lados por nucleósidos potenciadores de la afinidad, por ejemplo gápmeros, oligómeros de cabeza y oligómeros de cola.
Actividad y reclutamiento de RNasa H
La actividad RNasa H de un oligonucleótido antisentido se refiere a su capacidad para reclutar RNasa H cuando está en dúplex con una molécula de ARN complementaria. El documento WO01/23613 proporciona procedimientos in vitro para determinar la actividad RNasaH, que se pueden usar para determinar la capacidad de reclutar RNasaH. Típicamente, se considera que un oligonucleótido puede reclutar RNasa H si, cuando se le proporciona una secuencia de ácido nucleico diana complementaria, tiene una tasa inicial, medida en pmol/l/min, de al menos un 10 % o más de un 20 % del valor de la tasa inicial determinada cuando se usa un oligonucleótido que tiene la misma secuencia de bases que el oligonucleótido modificado que se está sometiendo a prueba, pero que contiene solo monómeros de ADN, con enlaces fosforotioato entre todos los monómeros en el oligonucleótido, y usando la metodología proporcionada por el ejemplo 91 - 95 del documento WO01/23613.
Gápmero
El término gápmero como se usa en el presente documento se refiere a un oligonucleótido antisentido que comprende una región de oligonucleótidos de reclutamiento de RNasa H (hueco) que está flanqueada en 5' y 3' por uno o más nucleósidos modificados potenciadores de la afinidad (flancos). En el presente documento se describen diversos diseños de gápmero. Los oligómeros de cabeza y los oligómeros de cola son oligonucleótidos que pueden reclutar RNasa H donde falta uno de los flancos, es decir, solo uno de los extremos del oligonucleótido comprende nucleósidos modificados potenciadores de la afinidad. Para los oligómeros de cabeza falta el flanco 3' (es decir, el flanco 5' comprende nucleósidos modificados potenciadores de la afinidad) y para los oligómeros de cola falta el flanco 5' (es decir, el flanco 3' comprende nucleósidos modificados potenciadores de la afinidad).
Gápmero de LNA
El término gápmero de LNA es un oligonucleótido gápmero en el que al menos uno de los nucleósidos modificados potenciadores de la afinidad es un nucleósido de LNA.
Gápmero de alas mixtas
El término gápmero de alas mixtas se refiere a un gápmero de LNA en el que las regiones de flanco comprenden al menos un nucleósido de LNA y al menos un nucleósido modificado no de LNA, tal como al menos un nucleósido modificado sustituido en 2', tal como, por ejemplo, el/los nucleósido(s) 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, 2'-alcoxi-ARN, 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), 2'-amino-ADN, 2'-fluoro-ARN y 2 '-F-AnA. En algunos modos de realización, el gápmero de alas mixtas tiene un flanco que comprende nucleósidos de LNA (por ejemplo, en 5' o en 3') y el otro flanco (en 3' o en 5', respectivamente) comprende el/los nucleósido(s) modificado(s) sustituido(s) en 2'.
Conjugado
El término conjugado, como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido que está unido covalentemente a un resto no nucleotídico (resto conjugado o región C o tercera región).
La conjugación del oligonucleótido de la invención con uno o más restos no nucleotídicos puede mejorar la farmacología del oligonucleótido, por ejemplo, afectando la actividad, distribución celular, absorción celular o estabilidad del oligonucleótido. En algunos modos de realización, el resto conjugado modifica o potencia las propiedades farmacocinéticas del oligonucleótido mejorando la distribución celular, biodisponibilidad, metabolismo, excreción, permeabilidad y/o absorción celular del oligonucleótido. En particular, el conjugado puede dirigir el oligonucleótido a un órgano, tejido o tipo de célula específico y de este modo potenciar la eficacia del oligonucleótido en ese órgano, tejido o tipo de célula. Al mismo tiempo, el conjugado puede servir para reducir la actividad del oligonucleótido en tipos de células, tejidos u órganos no diana, por ejemplo, actividad fuera de diana o actividad en tipos de células, tejidos u órganos no diana. Los documentos WO93/07883 y WO2013/033230 proporcionan restos conjugados adecuados. El documento WO2012/143379 proporciona un procedimiento de administración de un fármaco a través de la barrera hematoencefálica por conjugación con un fragmento de anticuerpo con afinidad por el receptor de transferrina.
Los conjugados de oligonucleótidos y su síntesis también se han informado en revisiones exhaustivas por Manoharan en Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., cap. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 y Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103.
En un modo de realización, el resto no nucleotídico (resto conjugado) se selecciona del grupo que consiste en carbohidratos, ligandos del receptor de superficie celular, sustancias farmacéuticas, hormonas, sustancias lipófilas, polímeros, proteínas, péptidos, toxinas (por ejemplo, toxinas bacterianas), vitaminas, proteínas víricas (por ejemplo, cápsides) o combinaciones de los mismos. En algunos modos de realización, el resto no nucleotídico es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que facilita el suministro a través de la barrera hematoencefálica, en particular un anticuerpo o fragmento de anticuerpo dirigido al receptor de transferrina.
Conectores
Un enlace o conector es una conexión entre dos átomos que une un grupo químico o segmento de interés con otro grupo químico o segmento de interés por medio de uno o más enlaces covalentes. Los restos conjugados se pueden unir al oligonucleótido directamente o a través de un resto de unión (por ejemplo, conector o enlazador). Los conectores sirven para conectar covalentemente una tercera región, por ejemplo, un resto conjugado (región C), a una primera región, por ejemplo, un oligonucleótido (región A).
En algunos modos de realización de la invención, el conjugado o conjugado de oligonucleótido de la invención puede comprender opcionalmente una región conectora (segunda región o región B y/o región Y) que se sitúa entre el oligonucleótido (región A o primera región) y el resto conjugado (región C o tercera región).
La región B se refiere a conectores bioescindibles que comprenden o consisten en un enlace fisiológicamente lábil que se puede escindir en condiciones normalmente encontradas o análogas a las que se encuentran dentro del cuerpo de un mamífero. Las condiciones en las que los conectores fisiológicamente lábiles experimentan transformación química (por ejemplo, escisión) incluyen condiciones químicas tales como pH, temperatura, condiciones o agentes oxidantes o reductores y concentración de sal encontradas o análogas a las encontradas en células de mamífero. Las condiciones intracelulares de mamífero también incluyen la presencia de actividad enzimática normalmente presente en una célula de mamífero tal como de peptidasas o hidrolasas o nucleasas. En un modo de realización, el conector bioescindible es susceptible a escisión por nucleasa S1. En un modo de realización preferente, el conector susceptible a nucleasa comprende entre 1 y 10 nucleósidos, tal como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleósidos, más preferentemente entre 2 y 6 nucleósidos y lo más preferentemente entre 2 y 4 nucleósidos unidos que comprenden al menos dos enlaces fosfodiéster consecutivos, tales como al menos 3 o 4 o 5 enlaces fosfodiéster consecutivos. Preferentemente, los nucleósidos son ADN o ARN. Los conectores bioescindibles que contienen fosfodiéster se describen con más detalle en el documento WO 2014/076195.
La región Y se refiere a conectores que no son necesariamente bioescindibles pero que sirven principalmente para conectar covalentemente un resto conjugado (región C o tercera región) a un oligonucleótido (región A o primera región). Los conectores de la región Y pueden comprender una estructura de cadena o un oligómero de unidades que se repiten tales como etilenglicol, unidades de aminoácido o grupos aminoalquilo Los conjugados de oligonucleótidos de la presente invención se pueden construir a partir de los siguientes elementos regionales A-C, A-B-C, A-B-Y-C, A-Y-B-C o A-Y-C. En algunos modos de realización, el conector (región Y) es un aminoalquilo, tal como un grupo aminoalquilo C2-C36, que incluye, por ejemplo, grupos aminoalquilo C6 a C12. En un modo de realización preferente, el conector (región Y) es un grupo aminoalquilo C6.
Control
Por el término "control", cuando se usa en relación con las mediciones del efecto de un oligonucleótido, se entiende en general que el control es un individuo o célula diana sin tratar o un individuo o célula diana tratado con un oligonucleótido no dirigido (simulación). Sin embargo, también puede ser un individuo tratado con el tratamiento de referencia.
Tratamiento
El término "tratamiento", como se usa en el presente documento, se refiere tanto al tratamiento de una enfermedad existente (por ejemplo, una enfermedad o trastorno como se denomina en el presente documento), como a la prevención de una enfermedad, es decir, profilaxis. Por lo tanto, se reconocerá que el tratamiento como se menciona en el presente documento, en algunos modos de realización, puede ser profiláctico.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La diana
Un aspecto de la invención es modular el nivel de expresión de la proteína UBE3A de cerdo, primate o humana, en particular para incrementar la expresión de la expresión de UBE3A paterno en células neuronales, en particular en células neuronales humanas. La proteína UBE3A humana existe en varias isoformas que se enumeran en Uniprot n.° Q05086. Varias mutaciones en el gen UBE3A materno pueden dar como resultado el síndrome de Angelman.
El ácido nucleico diana para el oligonucleótido de la invención es ARN, en particular un ARN no codificante largo. El ARN no codificante largo que se selecciona por los oligonucleótidos de la presente invención es SNHG14 humano (también conocido como UBE3A-ATS con el número de entrada Ensembl ENSG00000224078, versión GRCh38.p2). En particular, el ácido nucleico diana es la región en dirección 3' de SNORD109B correspondiente a la posición de 25278410 a 25419462 en el cromosoma 15 (SEQ ID NO: 1). En el macaco de la India (Macaca mulatta), el supresor de UBE3A se define como la región en dirección 3' de SNORD109A correspondiente a la posición de 4222848 a 4373084 (hebra sentido) en el cromosoma 7 usando el ensamblaje Ensembl MMUL1.0 (SEQ ID NO: 2).
En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana es SEQ ID NO: 1, o variantes naturales del mismo.
En determinados modos de realización, el ácido nucleico diana corresponde a regiones que se conservan entre humano (SEQ ID NO: 1) y macaco de la India (SEQ ID NO: 2). En determinados modos de realización, el ácido nucleico diana corresponde a regiones que se conservan entre humano (SEQ ID NO: 1), macaco de la India (SEQ ID NO: 2) y ratón (SEQ ID NO: 3).
En determinados modos de realización, el ácido nucleico diana es la región que es antisentido con respecto al pre-ARNm de UBE3A, esta región corresponde a la posición de 55319 a 141053 de SEQ ID NO: 1.
En determinados modos de realización, el ácido nucleico diana es la región que está en dirección 3' de SNORD109B y en dirección 5' de la región que es antisentido con respecto al pre-ARNm de UBE3A, esta región corresponde a la posición de 1 a 55319 de SEQ ID NO: 1.
En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana está presente en una célula, tal como una célula de mamífero, en particular una célula humana in vitro o in vivo (la célula diana). En determinados modos de realización, la célula diana es una neurona, preferentemente una célula neuronal humana.
La secuencia diana puede ser una subsecuencia del ácido nucleico diana. En algunos modos de realización, el oligonucleótido selecciona la subsecuencia seleccionada del grupo que consiste en la región antisentido del exón 9, exón 10, exón 13, exón 14, intrón 14, exón 15, intrón 15 y exón 16 de UBE3A. En algunos modos de realización, el oligonucleótido o la secuencia de nucleótidos contiguos se hibrida a, o es complementaria a, una molécula de ácido nucleico monocatenario seleccionada del grupo que consiste en las posiciones: 55319-76274, 77483-77573, 92157­ 93403 y 97056-97354 de la SEQ ID NO: 1. En algunos modos de realización, el oligonucleótido o la secuencia de nucleótidos contiguos se hibrida a, o es complementaria a, una molécula de ácido nucleico monocatenario seleccionada del grupo que consiste en las posiciones: 60821-60849, 77567-77583, 92323-92339 y 97156-97172 de la SEQ ID NO: 1.
En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana es una región correspondiente a las posiciones 9200-9250 de la SEQ ID NO: 1.
En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana es una región correspondiente a las posiciones 11505-11555 de la SEQ ID NO: 1.
En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana es una región correspondiente a las posiciones 15100-15150 de la SEQ ID NO: 1.
En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana es una región correspondiente a las posiciones 30590-30740 de la SEQ ID NO: 1.
En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana es una región correspondiente a las posiciones 46380-46430 de la SEQ ID NO: 1.
Los oligonucleótidos de la invención
La invención se refiere a oligonucleótidos que pueden modular la expresión de UBE3A paterno, en particular la inducción o regulación por incremento de UBE3A expresado por vía paterna en células neuronales. La modulación se logra por la hibridación a un ácido nucleico diana localizado en el transcrito SNHG14 de ARN no codificante largo en dirección 3' de SNORD109B. En determinados modos de realización, el oligonucleótido de la invención se hibrida a una subsecuencia del ácido nucleico diana de SEQ ID NO: 1 con una AG° por debajo de -10 kcal, tal como con un AG° entre -10 y -60 kcal, tal como de -12 a -40, como de -15 a -30 kcal o de -16 a -27 kcal, tal como de -18 a -25 kcal.
El oligonucleótido de la invención es un oligonucleótido antisentido que selecciona al transcrito SNHG14 de cerdo, de macaco de la India y/o humano en dirección 3' de SNORD109B.
En algunos modos de realización, el oligonucleótido antisentido de la invención puede modular la expresión de la diana retirando, interfiriendo con o disminuyendo el supresor de la diana. Preferentemente, el oligonucleótido de la invención induce la expresión de UBE3A en una célula, en particular la expresión de UBE3A paterno en una neurona, por degradación o retirada del transcrito SNHG14 en dirección 3' de SNORD109B. En algunos modos de realización, el oligonucleótido de la invención puede incrementar la expresión de UBE3A en al menos un 20 % en comparación con el nivel de expresión de UBE3A en una célula neuronal tratada con solución salina o un oligonucleótido no dirigido, más preferentemente en al menos un 30 % 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 80 %, 100 %, 120 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 210 %, 220 %, 230 %, 240 % o 250 % en comparación con el nivel de expresión de UBE3A en una célula neuronal tratada con solución salina o un oligonucleótido no dirigido. En modos de realización adicionales, el oligonucleótido de la invención puede disminuir el nivel del transcrito SNHG14 en dirección 3' de SNORD109B (en particular la parte del transcrito que es antisentido con respecto a la región de pre-ARNm de UBE3A) en al menos un 20 % en comparación con el nivel del transcrito SNHG14 en dirección 3' de SNORD109B en una célula neuronal tratada con solución salina o un oligonucleótido no dirigido, más preferentemente en al menos un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % en comparación con el nivel del transcrito SNHG14 en dirección 3' de SNORD109B en una célula neuronal tratada con solución salina o un oligonucleótido no dirigido, sin reducir los niveles de SNORD115 en más de un 0 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 12 %, 14 %, 16 %, 18 %, 20 %, 25 % o 30 % en comparación con el nivel de SNORD115 en una célula tratada con solución salina o un oligonucleótido no dirigido. Los transcritos SNRPN y SNORD116 se localizan en dirección 5' del transcrito SNORD115, en consecuencia, si el transcrito SNORD115 no se reduce por el oligonucleótido, es altamente probable que los transcritos SNRPN y SNORD116 tampoco se reduzcan. En otro modo de realización, los niveles de transcritos SNRPN y SNORD116 no se reducen en más de un 0 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 12 %, 14 %, 16 %, 18 %, 20 %, 25 % o 30 % en comparación con el nivel de SNRPN y SNORD116 en una célula tratada con solución salina o un oligonucleótido no dirigido.
La modulación diana se desencadena por la hibridación entre una secuencia de nucleótidos contiguos del oligonucleótido y el ácido nucleico diana. En algunos modos de realización, el oligonucleótido de la invención comprende emparejamientos erróneos entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana. A pesar de los emparejamientos erróneos, la hibridación al ácido nucleico diana todavía puede ser suficiente para mostrar una modulación deseada de la expresión de UBE3A. La afinidad de unión reducida resultante de los emparejamientos erróneos se puede compensar ventajosamente por el número incrementado de nucleótidos en el oligonucleótido y/o un número incrementado de nucleósidos modificados que pueden incrementar la afinidad de unión a la diana, tal como los nucleósidos modificados en 2', incluyendo el LNA, presentes dentro de la secuencia oligonucleotídica.
En el presente documento se describe un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 %, tal como un 95 %, tal como un 98 % tal como un 100 % de complementariedad con la posición de 25278410 a 25419462 en el cromosoma 15 humano.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende una secuencia contigua que es al menos un 90 % complementaria, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 92 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 94 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, o un 100 % complementario con una región del ácido nucleico diana mostrado como SEQ ID NO: 1,2 o 3.
En un modo de realización preferente, el oligonucleótido de la invención, o la secuencia de nucleótidos contiguos del mismo, es completamente complementario (100 % complementario) a una región del ácido nucleico diana mostrado como SEQ ID NO: 1, o en algunos modos de realización puede comprender uno o dos emparejamientos erróneos entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana.
Como se describe en el presente documento, la secuencia oligonucleotídica es un 100 % complementaria a una región de ácido nucleico diana correspondiente presente en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2. En algunos modos de realización, la secuencia oligonucleotídica es un 100 % complementaria a una región de ácido nucleico diana correspondiente presente en las SEQ ID NO: 1,2 y 3.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % complementaria, tal como un 100 % de complementariedad, a una región de ácido nucleico diana correspondiente presente en la SEQ ID NO: 1, en la que la región de ácido nucleico diana se selecciona del grupo que consiste en la región de A1 a A3649 en la tabla 1.
Tabla 1: Regiones de la SEQ ID NO 1 que se pueden seleccionar usando el oligonucleótido como se describe en el presente documento
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En algunos modos de realización, el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % complementaria, tal como un 100 % de complementariedad, a una región de ácido nucleico diana correspondiente presente en la SEQ ID NO: 1, en la que la región de ácido nucleico diana se selecciona del grupo que consiste en la región de B1 a B400 en la tabla 2
Tabla 2: Regiones de la SEQ ID NO 1 que se pueden seleccionar usando el oligonucleótido de la invención
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Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido o la secuencia de nucleótidos contiguos es complementaria a una región (o subsecuencia)(o subsecuencia) del ácido nucleico diana, en la que la región de ácido nucleico diana se selecciona del grupo que consiste en la posición 1589-10889, 46089-53989 y 60789-62489 de la SEQ ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 %, tal como un 100 % complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana de la posición 55319 a 141053 de la SEQ ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 %, tal como un 100 % complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana de la posición 1 a 55318 de la SEQ ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana seleccionado del grupo correspondiente a las posiciones: 55319-76274, 77483-77573, 92157-93403 y 97056­ 97354 de la SEQ ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana seleccionado del grupo correspondiente a las posiciones: 60821-60849, 77567-77583, 92323-92339 y 97156-97172 de la SEQ ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana correspondiente a las posiciones: 5218-5240 de la SEQ ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana correspondiente a las posiciones: 5782-5803 de la SEQ ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana correspondiente a las posiciones: 8113-8139 de la SEQ ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana correspondiente a las posiciones: 9200-9250 de la SEQ ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana correspondiente a las posiciones: 11505-11555 de la Se Q ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana correspondiente a las posiciones: 13223-13242 de la Se Q ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana correspondiente a las posiciones 15100-15150 de la SEQ ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana correspondiente a las posiciones 15113-15180 de la SEQ ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana correspondiente a las posiciones 29635-29705 de la SEQ ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana correspondiente a las posiciones 30590-30740 de la SEQ ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana correspondiente a las posiciones 39800-39855 de la SEQ ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana a las posiciones 44435-44460 de la SEQ ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana a las posiciones 45245-45270 de la SEQ ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana a las posiciones 46380-46430 de la SEQ ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contiguos de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana a las posiciones 68915-68940 de la SEQ ID NO: 1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende o consiste en de 8 a 35 nucleótidos de longitud, tal como de 10 a 30, tal como de 11 a 22, tal como de 12 a 18, tal como de 13 a 17 o de 14 a 16 nucleótidos contiguos de longitud. En un modo de realización preferente, el oligonucleótido comprende o consiste en de 15 a 20 nucleótidos de longitud.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido o la secuencia de nucleótidos contiguos del mismo comprende o consiste en 22 o menos nucleótidos, tal como 20 o menos nucleótidos, tal como 18 o menos nucleótidos, tal como 14, 15, 16 o 17 nucleótidos. Se ha de entender que cualquier intervalo dado en el presente documento incluye los puntos finales del intervalo. En consecuencia, si se dice que un oligonucleótido incluye de 10 a 30 nucleótidos, tanto 10 como 30 nucleótidos están incluidos.
Como se describe en el presente documento, la secuencia de nucleótidos contiguos comprende o consiste en 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos contiguos de longitud. En un modo de realización preferente, el oligonucleótido comprende o consiste en 16, 17, 18 o 19 nucleótidos de longitud.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contiguos comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 a 150 (véanse las secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de ejemplos).
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contiguos comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 a 818 (véanse las secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de ejemplos).
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contiguos comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 a 678 (véanse las secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de ejemplos).
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contiguos comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 166, 167, 167 o 169 (véanse las secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de ejemplos).
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contiguos comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 570, 571, 572, 679, 680, 681.682 y 683 (véanse las secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de ejemplos).
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contiguos comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 34, 186, 187, 188, 573, 574, 575, 576, 572, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691,692, 963, 964, 965 y 696 (véanse las secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de ejemplos).
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contiguos comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 35, 199, 200, 201.202, 203, 204, 205, 206, 207, 209 y 210 o SEQ ID NO: 582, 583 y 584 (véanse las secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de ejemplos).
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contiguos comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 221,222, 223, 224, 225, 585, 586, 587, 588, 589, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717 y 718 (véanse las secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de ejemplos).
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contiguos comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 236, 237, 238, 239, 240 y 590.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contiguos comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 241, 591 y 719 (véanse las secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de ejemplos).
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contiguos comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 46, 47, 48, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304.305, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621.622, 623, 624, 625, 626.627, 628, 629, 630, 631,632, 721,722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 800, 800, 800, 800, 801, 801, 802, 803, 804, 805, 806 y 807 (véanse las secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de ejemplos).
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contiguos comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 331, 332, 638, 639, 640, 808, 809, 810, 811, 812, 813, 814 y 815 (véanse las secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de ejemplos).
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contiguos comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 90 % de identidad, preferentemente un 100 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 409, 410, 411, 642, 643, 644, 645, 646, 816, 818 y 818 (véanse las secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de ejemplos).
Se entiende que las secuencias de nucleobases contiguas (secuencia de motivos) se pueden modificar para, por ejemplo, incrementar la resistencia a las nucleasas y/o la afinidad de unión al ácido nucleico diana. Las modificaciones se describen en las definiciones y en la sección "Diseño del oligonucleótido". La tabla 3 enumera los diseños preferentes de cada secuencia de motivos.
Diseño del oligonucleótido
El diseño del oligonucleótido se refiere al patrón de modificaciones del glúcido del nucleósido en la secuencia oligonucleotídica. Los oligonucleótidos como se describen en el presente documento comprenden nucleósidos con glúcido modificado y también pueden comprender nucleósidos de ADN o ARN. Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende nucleósidos con glúcido modificado y nucleósidos de ADN. La incorporación de nucleósidos modificados en el oligonucleótido de la invención puede potenciar la afinidad del oligonucleótido por el ácido nucleico diana. En ese caso, los nucleósidos modificados se pueden denominar nucleótidos modificados potenciadores de la afinidad.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende al menos 1 nucleósido modificado, tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o al menos 16 nucleósidos modificados. Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende de 1 a 10 nucleósidos modificados, tal como de 2 a 9 nucleósidos modificados, tal como de 3 a 8 nucleósidos modificados, tal como de 4 a 7 nucleósidos modificados, tal como 6 o 7 nucleósidos modificados. Como se describe en el presente documento, al menos 1 de los nucleósidos modificados es un ácido nucleico bloqueado (LNA), tal como al menos 2, tal como al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 o al menos al menos 8 de los nucleósidos modificados son LNA. Todavía en otro modo de realización, todos los nucleósidos modificados son LNA.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido de la invención puede comprender modificaciones, que se seleccionan independientemente de estos tres tipos de modificaciones (glúcido modificado, nucleobase modificada y enlace internucleosídico modificado) o una combinación de los mismos. Preferentemente, el oligonucleótido comprende uno o más nucleósidos con glúcido modificado, tal como nucleósidos con glúcido modificado en 2'. Preferentemente, el oligonucleótido de la invención comprende el uno o más nucleósidos con glúcido modificado en 2' seleccionados independientemente del grupo que consiste en nucleósidos de 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, 2'-alcoxi-ARN, 2'-O-metoxietil-ARN, 2'-amino-ADN, 2'-fluoro-ADN, ácido arabino-nucleico (ANA), 2'-fluoro-ANA y LNA. Incluso más preferentemente, el uno o más nucleósidos modificados es LNA.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleosídico modificado. En un modo de realización preferente, los enlaces internucleosídicos dentro de la secuencia de nucleótidos contiguos son enlaces internucleosídicos fosforotioato o boranofosfato.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido de la invención comprende al menos un nucleósido modificado que es un 2 '-Mo E-ARN, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 unidades de nucleósidos de 2'-MOE-ARN. Como se describe en el presente documento, al menos uno de dichos nucleósidos modificados es 2'-fluoro-ADN, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 unidades de nucleósidos de 2'-fluoro-ADN.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido de la invención comprende al menos una unidad de LNA, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 unidades de LNA, tal como de 2 a 6 unidades de LNA, tal como de 3 a 7 unidades de LNA, de 4 a 8 unidades de LNA o 3, 4, 5, 6 o 7 unidades de LNA. Como se describe en el presente documento, todos los nucleósidos modificados son nucleósidos de LNA. Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido puede comprender tanto beta-D-oxi-LNA, como una o más de las siguientes unidades de LNA: tio-LNA, amino-LNA, oxi-LNA y/o ENA en las configuraciones beta-D o bien alfa-L o combinaciones de las mismas. En otro modo de realización, todas las unidades citosina de LNA son 5-metil-citosina. Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido o la secuencia de nucleótidos contiguos tiene al menos 1 unidad de LNA en el extremo 5' y al menos 2 unidades de LNA en el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos.
El oligonucleótido como se describe en el presente documento comprende al menos una unidad de LNA y al menos un nucleósido modificado sustituido en 2'.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende tanto nucleósidos con glúcido modificado en 2' como unidades de ADN. Preferentemente, el oligonucleótido comprende tanto unidades de LNA como de ADN. Preferentemente, el total combinado de unidades de ADN y LNA es 8-30, tal como 10-25, preferentemente 12-22, tal como 12-18, incluso más preferentemente 11-16. Como se describe en el presente documento, la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido, tal como la secuencia de nucleótidos contiguos, consiste en al menos una o dos unidades de LNA y las unidades de nucleótidos restantes son unidades de ADN. Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido comprende solo nucleósidos de LNA y nucleósidos naturales (tales como ARN o ADN, más preferentemente nucleósidos de ADN), opcionalmente con enlaces internucleosídicos modificados tales como fosforotioato.
En un modo de realización de la invención, el oligonucleótido de la invención puede reclutar RNasa H.
Diseño del gápmero
En un modo de realización preferente, el oligonucleótido de la invención tiene un diseño o estructura de gápmero también denominado en el presente documento simplemente como "gápmero". En una estructura de gápmero, el oligonucleótido comprende al menos tres regiones estructurales distintas: un flanco en 5', un hueco y un flanco en 3', F-G-F', en orientación 5' -> 3'. En este diseño, las regiones flanqueadoras F y F' (también denominadas regiones de ala) comprenden un tramo contiguo de nucleósidos modificados, que son complementarios al ácido nucleico diana de UBE3A, mientras que la región de hueco, G, comprende un tramo contiguo de nucleótidos que pueden reclutar una nucleasa, preferentemente una endonucleasa tal como RNasa, por ejemplo RNasa H, cuando el oligonucleótido está en dúplex con el ácido nucleico diana. Los nucleósidos que pueden reclutar una nucleasa, en particular RNasa H, se pueden seleccionar del grupo que consiste en ADN, alfa-L-oxi-LNA, 2'-fluoro-ANA y UNA. Las regiones F y F', que flanquean los extremos 5' y 3' de la región G, comprenden preferentemente nucleósidos de reclutamiento no de nucleasas (nucleósidos con una estructura endo en 3'), más preferentemente uno o más nucleósidos modificados potenciadores de la afinidad. Como se describe en el presente documento, el flanco 3' comprende al menos un nucleósido de LNA, preferentemente al menos 2 nucleósidos de LNA. Como se describe en el presente documento, el flanco 5' comprende al menos un nucleósido de LNA. Como se describe en el presente documento, las regiones flanqueadoras tanto en 5' como en 3' comprenden un nucleósido de LNA. Como se describe en el presente documento, todos los nucleósidos en las regiones flanqueadoras son nucleósidos de LNA. Como se describe en el presente documento, las regiones flanqueadoras pueden comprender tanto nucleósidos de LNA como otros nucleósidos (flancos mixtos), tales como nucleósidos de ADN y/o nucleósidos modificados no de LNA, tales como nucleósidos sustituidos en 2'. En este caso, el hueco se define como una secuencia contigua de al menos 5 nucleósidos de reclutamiento de RNasa H (nucleósidos con una estructura endo en 2', preferentemente ADN) flanqueada en el extremo 5' y 3' por un nucleósido modificado potenciador de la afinidad, preferentemente LNA, tal como beta-D-oxi-LNA. En consecuencia, los nucleósidos de la región flanqueadora en 5' y la región flanqueadora en 3' que son contiguos a la región de hueco son nucleósidos modificados, preferentemente nucleósidos de reclutamiento no de nucleasas. En los oligonucleótidos con flancos mixtos donde los flancos comprenden ADN, los nucleósidos en 5' y en 3' son nucleósidos modificados.
Región F
La región F (flanco 5' o ala 5') unida al extremo '5 de la región G comprende, contiene o consiste en al menos un nucleósido modificado tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 nucleósidos modificados. Como se describe en el presente documento, F comprende o consiste en de 1 a 7 nucleósidos modificados, tal como de 2 a 6 nucleósidos modificados, tal como de 2 a 5 nucleósidos modificados, tal como de 2 a 4 nucleósidos modificados, tal como de 1 a 3 nucleósidos modificados, tal como 1, 2, 3 o 4 nucleósidos modificados. Como se describe en el presente documento, se pueden unir otros nucleósidos adicionales al extremo '5 de la región F, que representa una región D que comprende preferentemente 1, 2 o 3 unidades de nucleósidos, tales como nucleósidos de ADN. La región D puede adoptar la función de un conector bioescindible (B) descrito en la definición de "conectores".
Como se describe en el presente documento, los nucleósidos modificados en la región F tienen una estructura endo en 3'.
Como se describe en el presente documento, uno o más de los nucleósidos modificados en la región F son nucleósidos modificados en 2'.
Como se describe en el presente documento, uno o más de los nucleósidos modificados en 2' en la región F se seleccionan de unidades de 2'-O-alquil-ARN, unidades de 2'-O-metil-ARN, unidades de 2'-amino-ADN, unidades de 2'-fluoro-ADN, 2'-alcoxi-ARN, unidades de MOE, unidades de LNA, unidades de ácido arabino-nucleico (ANA) y unidades de 2'-fluoro-ANA.
Como se describe en el presente documento, todos los nucleósidos modificados en la región F son nucleósidos de LNA. En otro modo de realización, los nucleósidos de LNA en la región F se seleccionan independientemente del grupo que consiste en oxi-LNA, tio-LNA, amino-LNA, cET y/o ENA, en las configuraciones beta-D o bien alfa-L o combinaciones de los mismos. Como se describe en el presente documento, la región F tiene al menos 1 unidad de LNA beta-D-oxi, en el extremo 5' de la secuencia contigua.
Región G
La región G (región de hueco) preferentemente comprende, contiene o consiste en al menos 4, tal como al menos 5, tal como al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o al menos 16 nucleósidos consecutivos que pueden reclutar la nucleasa mencionada anteriormente, en particular RNasaH. Como se describe en el presente documento, la región G comprende, contiene o consiste en de 5 a 12, o de 6 a 10 o de 7 a 9, tal como 8 unidades nucleotídicas consecutivas que pueden reclutar la nucleasa mencionada anteriormente.
Las unidades de nucleósidos en la región G, que pueden reclutar nucleasa, como se describe en el presente documento, se seleccionan del grupo que consiste en ADN, alfa-L-LNA, ADN alquilado en C4' (como se describe en el documento PCT/EP2009/050349 y Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300), nucleósidos derivados de arabinosa como ANA y 2'F-ANA (Mangos et al., 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661), UNA (ácido nucleico desbloqueado) (como se describe en Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039). UNA es ácido nucleico desbloqueado, típicamente donde se ha eliminado el enlace entre C2 y C3 de la ribosa, formando un residuo de "glúcido" desbloqueado.
Como se describe en el presente documento, al menos una unidad de nucleósido en la región G es una unidad de nucleósido de ADN, tal como de 1 a 16 unidades de ADN, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 unidades de ADN, preferentemente de 2 a 13 unidades de ADN, tales como de 4 a 12 unidades de ADN, más preferentemente de 5 a 11, o de 10 a 16, 11 a 15 o 12 a 14 unidades de ADN. En algunos modos de realización, la región G consiste en un 100 % de unidades de ADN. Como se describe en el presente documento, G consiste en, lo más preferentemente, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 unidades de ADN.
Como se describe en el presente documento, la región G puede consistir en una mezcla de ADN y otros nucleósidos que pueden mediar la escisión de la RNasa H. La región G puede consistir en al menos un 50 % de ADN, más preferentemente un 60 %, 70 % u 80 % de ADN, e incluso más preferentemente un 90 % o 95 % de ADN.
Como se describe en el presente documento, al menos una unidad de nucleósido en la región G es una unidad de nucleósido de alfa-L-LNA, tal como al menos una unidad de alfa-L-LNA, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 unidades de alfa-L-LNA. Como se describe en el presente documento, la región G comprende la al menos una unidad de alfa-L-LNA que es alfa-L-oxi-LNA. Como se describe en el presente documento, la región G comprende una combinación de ADN y unidades de nucleósidos de alfa-L-LNA.
Como se describe en el presente documento, el tamaño de la secuencia contigua en la región G puede ser más largo, tal como de 15, 16, 17, 18, 19 o 20 unidades de nucleósidos.
Como se describe en el presente documento, los nucleósidos de la región G tienen una estructura endo en 2'.
Región F'
La región F' (flanco 3' o ala 3') unida al extremo '3 de la región G comprende, contiene o consiste en al menos un nucleósido modificado tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 nucleósidos modificados. Como se describe en el presente documento, la región F' comprende o consiste en de 1 a 7 nucleósidos modificados, tal como de 2 a 6 nucleósidos modificados, tal como de 2 a 4 nucleósidos modificados, tal como de 1 a 3 nucleósidos modificados, tal como 1, 2, 3 o 4 nucleósidos modificados. En otro modo de realización, otros nucleósidos adicionales unidos al extremo '3 de la región F', que representa una región D', comprende preferentemente 1, 2 o 3 unidades de nucleósidos, tales como nucleósidos de ADN. La región D' puede adoptar la función de un conector bioescindible (B) descrito en la sección "Conectores".
Como se describe en el presente documento, los nucleósidos modificados en la región F' tienen una estructura endo en 3'.
Como se describe en el presente documento, los nucleósidos modificados en la región F' son LNA.
Como se describe en el presente documento, los nucleósidos modificados en la región F' se seleccionan de unidades de 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, unidades de 2'-amino-ADN, unidades de 2'-fluoro-ADN, 2'-alcoxi-ARN, unidades de MOE, unidades de LNA, unidades de ácido arabino-nucleico (ANA) y unidades de 2'-fluoro-ANA.
Como se describe en el presente documento, todos los nucleósidos modificados en la región F' son nucleósidos de LNA. Como se describe en el presente documento, los nucleósidos de LNA en la región F' se seleccionan independientemente del grupo que consiste en oxi-LNA, tio-LNA, amino-LNA, cET y/o ENA, en las configuraciones beta-D o bien alfa-L o combinaciones de los mismos. Como se describe en el presente documento, la región F' tiene al menos 2 unidades de LNA beta-D-oxi, en el extremo 3' de la secuencia contigua.
Región D y D'
La región D y D' se pueden unir al extremo 5' de la región F o al extremo 3' de la región F', respectivamente.
La región D o D' puede comprender independientemente 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos adicionales, que pueden ser complementarios o no complementarios al ácido nucleico diana. A este respecto, el oligonucleótido de la invención, en algunos modos de realización, puede comprender una secuencia de nucleótidos contiguos que puede modular la diana que está flanqueada en el extremo 5' y/o 3' por nucleótidos adicionales. Dichos nucleótidos adicionales pueden servir como un conector bioescindible susceptible a nucleasa (véase la definición de conectores). En algunos modos de realización, los nucleótidos del extremo 5' y/o 3' adicionales están unidos con enlaces fosfodiéster, y pueden ser ADN o ARN. En otro modo de realización, los nucleótidos del extremo 5' y/o 3' adicionales son nucleótidos modificados que se pueden incluir, por ejemplo, para potenciar la estabilidad con respecto a las nucleasas o para facilitar la síntesis. En un modo de realización del oligonucleótido de la invención, comprende una región D y/o D' además de la secuencia de nucleótidos contiguos.
El oligonucleótido gápmero de la presente invención se puede representar por las siguientes fórmulas:
F-G-F'; en particular F1-7-G 4-12-F V 7
D-F-G-F', en particular D1-3-F 1-7-G 4-12-F V 7
F-G-F'-D', en particular F1-7-G 4-12-F V 7-D V 3
D-F-G-F'-D', en particular D1-3-F 1-7-G 4-12-F V 7-D V 3
El número y los tipos preferentes de nucleósidos en las regiones F, G y F', D y D' se han descrito anteriormente. El diseño del oligonucleótido individual también puede tener un impacto profundo en las propiedades del oligonucleótido en su uso para modular la expresión de UBE3a .
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un gápmero que consiste en 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos de longitud, en el que cada una de las regiones F y F' consiste independientemente en 2, 3 o 4 unidades de nucleósidos modificados complementarias a una parte del ARN no codificante largo de SNHG14 humano que es antisentido con respecto al pre-ARNm de UBE3A (el ácido nucleico diana) y la región G consiste en 10, 11, 12, 13, 14 o 15 unidades de nucleósidos, que pueden reclutar nucleasa cuando están en dúplex con el ácido nucleico diana.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un gápmero en el que cada una de las regiones F y F' consiste independientemente en 2, 3, 4 o 5 unidades de nucleósidos modificados, tales como unidades de nucleósidos que contienen un glúcido 2'-O-metoxietil-ribosa (2'-MOE) o unidades de nucleósidos que contienen un glúcido 2'-fluorodesoxirribosa y/o unidades de LNA, y la región G consiste en 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 unidades de nucleósidos, tales como unidades de ADN u otros nucleósidos de reclutamiento de nucleasas tales como alfa-L-LNA o una mezcla de ADN y de nucleósidos de reclutamiento de nucleasas.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un gápmero en el que cada una de las regiones F y F' consiste en dos unidades de LNA cada una, y la región G consiste en 10, 11, 12, 13, 14 o 15 unidades de nucleósidos, preferentemente unidades de ADN. Los diseños de gápmero específicos de esta naturaleza incluyen 2­ 10-2, 2-11-2, 2-12-2, 2-13-2, 2-14-2 y 2-15-2.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un gápmero en el que cada una de las regiones F y F' consiste independientemente en tres unidades de LNA, y la región G consiste en 10, 11, 12, 13, 14 o 15 unidades de nucleósidos, preferentemente unidades de ADN. Los diseños de gápmero específicos de esta naturaleza incluyen 3-10-3, 3-11-3, 3-12-3, 3-13-3, 3-14-3 y 3-15-3.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un gápmero en el que cada una de las regiones F y F' consiste en cuatro unidades de LNA cada una, y la región G consiste en 10, 11, 12, 13, 14 o 15 unidades de nucleósidos, preferentemente unidades de ADN. Los diseños de gápmero específicos de esta naturaleza incluyen 4­ 10-4, 4-11-4, 4-12-4, 4-13-4, 4-14-4 y 4-15-4.
Los diseños de gápmero específicos de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 10 nucleósidos e independientemente de 1 a 4 nucleósidos modificados en las alas que incluyen los gápmeros 1-10-1, 2-10-1, 1-10-2, 1-10-3, 3-10-1, 1-10-4, 4-10-1, 2-10-2, 2-10-3, 3-10-2, 2-10-4, 4-10-2, 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3 y 4-10-4.
Los diseños de gápmero específicos de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 11 nucleósidos e independientemente de 1 a 4 nucleósidos modificados en las alas que
incluyen los gápmeros 1-11-1, 2-11-1, 1-11-2, 1-11-3, 3-11-1, 1-11-4, 4-11-1, 2-11-2, 2-11-3, 3-11-2, 2-11-4, 4-11-2,
3-11-3, 3-11-4, 4-11-3 y 4-11-4.
Los diseños de gápmero específicos de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 12 nucleósidos que incluye los gápmeros 1-12-1, 2-12-1, 1-12-2, 1-12-3, 3-12-1, 1-12-4, 4­
12-1, 2-12-2, 2-12-3, 3-12-2, 2-12-4, 4-12-2, 3-12-3, 3-12-4, 4-12-3 y 4-12-4.
Los diseños de gápmero específicos de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 13 nucleósidos e independientemente de 1 a 4 nucleósidos modificados en las alas que
incluyen los gápmeros 1 -13-1, 1-13-2, 1-13-3, 3-13-1, 1 -13-4, 4-13-1,2-13-1,2-13-2, 2-13-3, 3-13-2, 2-13-4, 4-13-2, 3­
13-3, 3-13-4, 4-13-3 y 4-13-4.
Los diseños de gápmero específicos de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 14 nucleósidos e independientemente de 1 a 4 nucleósidos modificados en las alas que
incluyen los gápmeros 1-14-1, 1-14-2, 2-14-1, 1-14-3, 3-14-1, 1-14-4, 4-14-1,2-14-2, 2-14-3, 3-14-22-14-4, 4-14-2, 3­
14-3, 3-14-4 y 4-14-3.
Los diseños de gápmero específicos de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 15 nucleósidos e independientemente de 1 a 4 nucleósidos modificados en las alas que
incluyen los gápmeros 1-15-1, 1-15-2, 2-15-1, 1-15-3, 3-15-1, 1-15-4, 4-15-1,2-15-2, 2-15-3, 3-15-22-15-4, 4-15-2, 3­
15-3, 3-15-4 y 4-15-3.
Los diseños de gápmero específicos de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 16 nucleósidos e independientemente de 1 a 4 nucleósidos modificados en las alas que
incluyen los gápmeros 1-16-1, 1-16-2, 2-16-1, 1-15-3, 3-16-1, 1-16-4, 4-16-1,2-16-2, 2-16-3, 3-16-22-16-4, 4-16-2, 3­
16-3, 3-16-4 y 4-16-3.
Como se describe en el presente documento, el diseño F-G-F' se selecciona de 2-10-4, 3-10-3 y 4-10-2.
Como se describe en el presente documento, el diseño F-G-F' se selecciona de 2-11-4, 3-11-2, 3-11-3 y 4-11-2.
Como se describe en el presente documento, el diseño F-G-F' se selecciona de 2-12-2, 2-12-3, 2-12-4, 3-12-2, 3-12­
3 y 4-12-2.
Como se describe en el presente documento, el diseño F-G-F' se selecciona de 2-13-2, 2-13-3, 2-13-4, 3-13-3 y 4-13­
2.
Como se describe en el presente documento,
Figure imgf000045_0002
l diseño F-G-F' se
Figure imgf000045_0001
selecciona de 2-14-2, 2-14-4, 3-14-3 y 4-14-2. Como se describe en el presente documento,
Figure imgf000045_0004
l diseño F-G-F' se
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selecciona de 2-15-2 y 2-16-2.
Como se describe en el presente documento,
Figure imgf000045_0006
l diseño F-G-F' se
Figure imgf000045_0005
selecciona de los diseños indicados en la tabl En todos los casos, el diseño de F-G-F' puede incluir además la región D y/o D', que puede tener 1, 2 o 3 unidades de nucleósidos, tales como unidades de ADN. Preferentemente, los nucleósidos en la región F y F' son nucleósidos modificados, mientras que los nucleótidos en la región G son preferentemente nucleósidos no modificados.
En cada diseño, el nucleósido modificado preferente es LNA.
Como se describe en el presente documento, todos los enlaces internucleosídicos en el hueco en un gápmero son enlaces fosforotioato y/o boranofosfato. Como se describe en el presente documento, todos los enlaces internucleosídicos en los flancos (región F y F') en un gápmero son enlaces fosforotioato y/o boranofosfato. Como se describe en el presente documento, todos los enlaces internucleosídicos en la región D y D' en un gápmero son enlaces fosfodiéster.
Para gápmeros específicos como se divulga en el presente documento, cuando los residuos de citosina (C) se anotan
como 5-metil-citosina, como se describe en el presente documento, uno o más de los C presentes en el oligonucleótido
pueden ser residuos de C no modificados.
En los documentos WO2004/046160 y WO2007/146511 se divulgan otros diseños de gápmero.
C o m o se d e s c r ib e e n e l p re s e n te d o c u m e n to , e l o lig o n u c le ó t id o s e s e le c c io n a d e l g ru p o d e c o m p u e s to s
o lig o n u c le o t íd ic o s d e la ta b la 3.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos oligonucleotídicos con CMP-ID-NO: 4_1 a 150_2.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos oligonucleotídicos con CMP-ID-NO: 4_1 a 678_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos oligonucleotídicos con CMP-ID-NO: 4_1 a 818_1 (véanse las secuencias oligonucleotídicas enumeradas en la tabla 3 en la sección de ejemplos).
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un compuesto oligonucleotídico con CMP-ID-NO: 155_1 o 165_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos oligonucleotídicos con CMP-ID-NO: 169_52, 169_50 o 169_56.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos oligonucleotídicos con CMP-ID-NO: 172_1, 272_1, 572_7, 572_6 o 572_5.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un compuesto oligonucleotídico con CMP-ID-NO: 175_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un compuesto oligonucleotídico con CMP-ID-NO: 178_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos oligonucleotídicos con CMP-ID-NO: 573_8, 186_1 o 187_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un compuesto oligonucleotídico con CMP-ID-NO: 186_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos oligonucleotídicos con CMP-ID-NO: 200_1, 204_1, 206_1, 35_2 o 209_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos oligonucleotídicos con CMP-ID-NO: 585_1, 585_8, 586_9, 586_5, 586_8, 586_4 o 586_6.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un compuesto oligonucleotídico con CMP-ID-NO: 233_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un compuesto oligonucleotídico con CMP-ID-NO: 237_8 o 590_13.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un compuesto oligonucleotídico con CMP-ID-NO: 220_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos oligonucleotídicos con CMP-ID-NO: 591_1, 592_2, 592_4 o 241_9.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos oligonucleotídicos con CMP-ID-NO: 597_4, 598_4, 39_1 o 602_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un compuesto oligonucleotídico con CMP-ID-NO: 39_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un compuesto oligonucleotídico con CMP-ID-NO: 611_7.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un compuesto oligonucleotídico con CMP-ID-NO: 271_1 o 278_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos oligonucleotídicos con CMP-ID-NO: 616_4, 621_2, 621_1,622_3, 622_5, 622_4, 624_3, 624_5, 287_1,625_6, 626_7, 626_8, 626_9, 48_1, 631_6, 631_1, 303_1, 304_6 o 304_10.
C o m o se d e s c r ib e e n e l p re s e n te d o c u m e n to , e l o lig o n u c le ó t id o e s un c o m p u e s to o l ig o n u c le o t íd ic o c o n C M P - ID -N O : 636_8.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos oligonucleotídicos con CMP-ID-NO: 638_8, 639_5, 331_1 o 640_4.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos oligonucleotídicos con CMP-ID-NO: 359_1, 361_1, 361_5, 362_1 o 641_5.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos oligonucleotídicos con CMP-ID-NO: 378_1, 379_1, 399_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos oligonucleotídicos con CMP-ID-NO: 403_1, 405_1, 642_12, 642_13, 644_3 o 646_16.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un compuesto oligonucleotídico con CMP-ID-NO: 85_1 o 425_5.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un compuesto oligonucleotídico con CMP-ID-NO: 116_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un compuesto oligonucleotídico con CMP-ID-NO: 123_1 o 124_1.
Como se describe en el presente documento, el oligonucleótido es un compuesto oligonucleotídico con CMP-ID-NO: 126_2.
Procedimiento de fabricación
En el presente documento se describen procedimientos para fabricar los oligonucleótidos de la invención que comprenden hacer reaccionar unidades de nucleótidos y de este modo formar unidades de nucleótidos contiguos unidos covalentemente comprendidas en el oligonucleótido. Preferentemente, el procedimiento usa la química de la fosforamidita (véase, por ejemplo, Caruthers et al., 1987, Methods in Enzymology, vol. 154, páginas 287-313). Como se describe en el presente documento, el procedimiento comprende además hacer reaccionar la secuencia de nucleótidos contiguos con un resto de conjugación (ligando). Como se describe en el presente documento, se proporciona un procedimiento para fabricar la composición de la invención, que comprende mezclar el oligonucleótido o el oligonucleótido conjugado de la invención con un diluyente, disolvente, vehículo, sal y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
Composición farmacéutica
Como se describe en el presente documento, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los oligonucleótidos y/o conjugados de oligonucleótidos mencionados anteriormente y un diluyente, vehículo, sal y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS) y las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de sodio y potasio. El documento WO 2007/031091 proporciona ejemplos adecuados y preferentes de diluyentes, vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables. En el documento WO2007/031091 también se proporcionan dosificaciones, formulaciones, vías de administración, composiciones, formas farmacéuticas, combinaciones con otras sustancias terapéuticas, formulaciones de profármacos adecuadas.
Los oligonucleótidos o conjugados de oligonucleótidos de la invención se pueden mezclar con sustancias activas o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los procedimientos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de varios criterios, incluyendo la vía de administración, el grado de enfermedad o la dosis que se ha de administrar.
En algunos modos de realización, el oligonucleótido o conjugado de oligonucleótido de la invención es un profármaco. En particular, con respecto a los conjugados de oligonucleótidos, el resto conjugado se escinde del oligonucleótido una vez que el profármaco se administra al sitio de acción, por ejemplo, la célula diana.
Aplicaciones
Los oligonucleótidos de la invención se pueden utilizar como reactivos de investigación para, por ejemplo, tratamientos y profilaxis.
En investigación, dichos oligonucleótidos se pueden usar para modular específicamente la síntesis de la proteína UBE3A en células (por ejemplo, cultivos celulares in vitro) y animales de laboratorio, facilitando de este modo el análisis funcional de la diana o una valoración de su utilidad como diana para intervención terapéutica. La modulación de la diana se logra degradando o inhibiendo un modulador del gen o ARNm que produce la proteína.
Para los tratamientos, un animal o un ser humano que se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno que se puede tratar modulando la expresión de UBE3A.
En el presente documento se describen procedimientos para tratar o prevenir una enfermedad, que comprenden administrar una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un oligonucleótido, un conjugado de oligonucleótido o una composición farmacéutica de la invención a un sujeto que padece o es susceptible a la enfermedad.
La invención también se refiere a un oligonucleótido, una composición o un conjugado como se define en el presente documento para su uso como medicamento.
El oligonucleótido, conjugado de oligonucleótido o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención se administra típicamente en una cantidad eficaz.
En el presente documento se describe el uso del oligonucleótido o conjugado de oligonucleótido de la invención como se describe para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno como se menciona en el presente documento, o para un procedimiento del tratamiento de un trastorno como se menciona en el presente documento.
La enfermedad o trastorno, como se menciona en el presente documento, está asociado con la expresión de UBE3A. Como se describe en el presente documento, la enfermedad o trastorno puede estar asociado con una mutación en el gen UBE3A materno. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana es un regulador del gen UBE3A paterno.
Los procedimientos descritos en el presente documento se emplean preferentemente para el tratamiento o la profilaxis frente a enfermedades provocadas por niveles y/o actividad anómalos de UBE3A. La enfermedad se puede provocar, en particular, por niveles y/o actividad reducidos de la proteína UBE3A.
En el presente documento se describe el uso de un oligonucleótido, conjugado de oligonucleótido o una composición farmacéutica como se define en el presente documento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de niveles y/o actividad anómalos de UBE3A, en particular niveles y/o actividad bajos de UBE3A.
En un modo de realización, la invención se refiere a oligonucleótidos, conjugados de oligonucleótidos o composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento del síndrome de Angelman.
Administración
Los oligonucleótidos o composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de forma tópica (tal como, en la piel, por inhalación, oftálmica u ótica) o entérica (tal como, por vía oral o a través del tubo gastrointestinal) o parenteral (tal como, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular o intratecal).
En un modo de realización preferente, el oligonucleótido o las composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran por vía parenteral que incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular, administración intratecal o intracraneal, por ejemplo, intracerebral o intraventricular. En un modo de realización, el oligonucleótido o conjugado de oligonucleótido activo se administra de forma intracerebral o intracerebroventricular. En otro modo de realización, el oligonucleótido o conjugado de oligonucleótido activo se administra de forma intratecal.
En el presente documento se describe el uso del oligonucleótido o conjugado de oligonucleótido de la invención como se describe para la fabricación de un medicamento en el que el medicamento está en una forma farmacéutica para administración intratecal.
En el presente documento se describe el uso del oligonucleótido o conjugado de oligonucleótido de la invención como se describe para la fabricación de un medicamento en el que el medicamento está en una forma farmacéutica para administración intracerebral o intraventricular.
En el presente documento se describe el uso del oligonucleótido o conjugado de oligonucleótido de la invención como se describe para la fabricación de un medicamento en el que el medicamento está en una forma farmacéutica para administración intracerebroventricular.
Politerapias
E n a lg u n o s m o d o s d e re a liz a c ió n , e l o lig o n u c le ó t id o , e l c o n ju g a d o d e o lig o n u c le ó t id o o la c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a de la invención es para su uso en un tratamiento de combinación con otra sustancia terapéutica. La sustancia terapéutica puede ser, por ejemplo, un medicamento anticonvulsivo.
EJEMPLOS
Materiales y procedimientos
Tabla 3: Lista de oligonucleótidos o secuencias de nucleobases contiguas complementarias a la SEQ ID NO: 1 (secuencias de motivos indicadas por SEQ ID NO), diseños de oligonucleótidos elaborados a partir de estos, así como compuestos oligonucleotídicos específicos (indicados por CMP ID NO) diseñados en base a la secuencia de motivos.
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Los diseños se refieren al diseño de gápmero, F-G-F', donde cada número representa el número de nucleósidos modificados consecutivos, por ejemplo, nucleósidos modificados en 2' (primer número = flanco 5'), seguido del número de nucleósidos de ADN (segundo número = región de hueco), seguido del número de nucleósidos modificados, por ejemplo, nucleósidos modificados en 2' (tercer número = flanco 3'), opcionalmente precedidos o seguidos de regiones repetidas de ADN y LNA, que no son necesariamente parte de la secuencia contigua que es complementaria al ácido nucleico diana. Para algunos oligonucleótidos en la tabla 3, los flancos son flancos mixtos, dichos flancos comienzan y terminan con nucleósidos modificados en 2'; en estos casos, la región de hueco es el número por encima de 5 que no está localizado en el extremo 5' o 3'del diseño.
Para los compuestos oligonucleotídicos, las letras mayúsculas representan nucleósidos de LNA beta-D-oxi, las letras minúsculas representan nucleósidos de ADN, todos los C de LNA son 5-metil-citosina y las citosinas de ADN 5-metilo se presentan por "e", todos los enlaces internucleosídicos son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
Los oligonucleótidos con una indicación EX-EX como Inicio en SEQ ID NO: 1 son oligonucleótidos que abarcan exónexón diseñados para ser complementarios a través de las uniones exón-exón de SNHG14-023 (ENST00000554726). Los oligonucleótidos abarcan principalmente el exón 2 y el exón 3 (es decir, son complementarios a una región en el exón 2 y una región en el exón 3)
Síntesis de oligonucleótidos
La síntesis de oligonucleótidos es conocida, en general, en la técnica. A continuación se muestra un protocolo que se puede aplicar. Los oligonucleótidos de la presente invención se pueden haber producido por procedimientos ligeramente variados en términos de aparato, soporte y concentraciones usadas.
Los oligonucleótidos se sintetizan en soportes universales de uridina usando el enfoque de fosforamidita en un sintetizador de ADN/ARN MerMade12 u Oligomaker a una escala de 1-4 pmol. Al final de la síntesis, los oligonucleótidos se escinden del soporte sólido usando amoníaco acuoso durante 5-16 horas a 60 °C. Los oligonucleótidos se purifican por HPLC de fase inversa (RP-HPLC) o por extracciones en fase sólida y se caracterizan por UPLC, y la masa molecular se confirma además por ESI-EM.
Alargamiento del oligonucleótido:
El acoplamiento de p-cianoetilfosforamiditas (ADN-A(Bz), ADN-G(ibu), ADN-C(Bz), ADN-T, LNA-5-metil-C(Bz), LNA-A(Bz), LNA-G(dmf), LNA-T o conector amino-C6) se realiza usando una solución 0,1 M de la amidita protegida con 5'-O-DMT en acetonitrilo y DCI (4,5-dicianoimidazol) en acetonitrilo (0,25 M) como activador. Para el ciclo final, se puede usar una fosforamidita con las modificaciones deseadas, por ejemplo, un conector C6 para unir un grupo conjugado o un grupo conjugado como tal. La tiolación para la introducción de enlaces fosfortioato se lleva a cabo usando hidruro de xantano (0,01 M en acetonitrilo/piridina 9:1). Los enlaces fosfordiéster se pueden introducir usando yodo 0,02 M en THF/piridina/agua 7:2:1. El resto de los reactivos son los que se usan típicamente para la síntesis de oligonucleótidos.
Purificación por RP-HPLC:
Los compuestos brutos se purifican por RP-HPLC preparativa en una columna Phenomenex Jupiter C18 10 p 150x10 mm. Se usa acetato de amonio 0,1 M pH8 y acetonitrilo como tampones a un caudal de 5 ml/min. Las fracciones recogidas se liofilizan para dar el compuesto purificado típicamente como un sólido blanco.
Abreviaturas:
DCI: 4,5-dicianoimidazol
DCM: diclorometano
DMF: dimetilformamida
DMT: 4,4'-dimetoxitritilo
THF: tetrahidrofurano
Bz: benzoílo
Ibu: isobutirilo
RP-HPLC: cromatografía de líquidos de alto rendimiento en fase inversa
Ensayo de T m
Los dúplex diana de oligonucleótido y ARN se diluyen a 3 mM en 500 ml de agua sin RNasa y se mezclan con 500 ml de Tm-tampón 2x (NaCl 200 mM, e Dt A 0,2 mM, fosfato de sodio 20 mM, pH 7,0). La solución se calienta a 95 °C durante 3 min y a continuación, se deja hibridar a temperatura ambiente durante 30 min. Las temperaturas de fusión (Tm) del dúplex se miden en un espectrofotómetro UV/VIS Lambda 40 equipado con un programador de temperatura Peltier PTP6 usando el programa informático PE TempLAB (Perkin Elmer). La temperatura se aumenta de 20 °C a 95 °C y a continuación, se baja a 25 °C, registrando la absorción a 260 nm. La primera derivada y los máximos locales tanto de la fusión como de la hibridación se usan para evaluar la Tm del dúplex.
Preparación de cultivos de células de neuronas corticales primarias de ratón
Se prepararon cultivos de neuronas corticales primarias a partir de cerebros de embriones de ratón de 15 días de edad de acuerdo con el procedimiento estándar. En resumen, las placas de cultivo se recubrieron con poli-L-lisina (50 pg/ml de poli-L-lisina, tetraborato de sodio 10 mM, tampón de pH8) durante 2-3 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con 1xPBS antes de su uso. Los cerebros de embriones de ratón obtenidos se disecaron y homogeneizaron con una hoja de afeitar y se sumergieron en 38 ml de medio de disección (HBSS, Hepes 0,01 M, penicilina/estreptomicina). A continuación, se añadieron 2 ml de tripsina y se incubaron las células durante 30 min a 37 °C y se centrifugaron. Las células se disolvieron en 20 ml de DMEM (+ FBS al 10 %) y se pasaron a través de una jeringa para homogeneización adicional. Esto fue seguido de centrifugación a 500 rpm durante 15 min. Las células se disolvieron en DMEM (+ FBS al 10 %) y se sembraron en placas de 96 pocillos (0,1 x 10A6 células/pocillo en 100 pl). Los cultivos de células neuronales estaban listos para su uso directamente después de la siembra.
Cribado de oligonucleótidos en cultivos de células de neuronas corticales primarias de ratón
Las células se cultivaron en medio de crecimiento (medio Gibco Neurobasal, complemento B27, Glutamax, penicilinaestreptomicina) en placas de 96 pocillos y se incubaron con oligonucleótidos durante 3 días a las concentraciones deseadas. Se aisló el ARN total de las células y se midió la eficacia de atenuación por análisis de qPCR usando el kit qScript™ XLT One-Step RT-qPCR ToughMix®, Low ROX™ de Quanta Bioscience (95134-500). Se usó un ensayo taqman comercial de Thermo Fisher Scientific para medir Ube3a_ATS, incluyendo GAPDH, para la normalización.
Generación de cultivos de células neuronales primarias humanas
Cualquier línea celular en cualquier punto temporal descrito se incubó a 37 °C, concentración de CO2 al 5 % y humedad relativa de un 95 %.
Cultivo de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC)
Se obtuvieron muestras de sangre humana completa de pacientes diagnosticados con síndrome de Angelman. Los cultivos posteriores de leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PMCS) primarios se enriquecieron en eritroblastos. Las líneas de iPSC específicas del paciente se generaron reprogramando eritroblasto con el kit de reprogramación CytoTune-iPS Sendai (Thermo Fisher Scientific). Las líneas de iPSC derivadas se mantuvieron en condiciones libres de alimentador usando Matrigel (Corning) apto para hESC en mTESR1 (STEMCELL Technologies) con reemplazo diario de medio. Tras alcanzar la confluencia, las colonias se disociaron en grupos de células de 50 -200 pm de tamaño usando el reactivo de disociación celular suave (STEMCELL Technologies) y se subcultivaron en una proporción de 1:10 - 1:20 en presencia de Y-27632(Calbiochem) 10 pM.
Diferenciación en células progenitoras neurales (NPC)
Tras la inducción de la diferenciación neural, las células derivadas de iPSC se mantuvieron en un medio basal compuesto por volúmenes iguales de medio DMEM:F12 Glutamax y medio Neurobasal (Gibco, Invitrogen), complementado con 1x B27 (Gibco, Invitrogen), 1x N2 (Gibco, Invitrogen), beta-mercaptoetanol 0,1 mM (Gibco, Invitrogen) y los complementos indicados.
Las células progenitoras neurales (NPC) se derivaron de las hiPSC por inhibición dual de SMAD y de acuerdo con procedimientos publicados con ligeras modificaciones (Chambers et al., 2009 Nat Biotechnol., vol. 3 págs. 275-80, Boissart et al., 2013 Transl Psychiatry. 3:e294). Las hiPSC se disociaron con Accutase (Innovative Cell Technologies Inc.) para dar una suspensión de células sueltas y se resuspendieron en medio básico complementado además con Y-27632 (Calbiochem) 10 pM, 5 ng/ml de FGF (Peprotech), SB-431542 (Calbiochem) 10 pM y LDN (Calbiochem) 100 nM. La suspensión de células sueltas se transfirió a placas AggreWell800 (STEMCELl Technologies), lo que posibilitó la formación de agregados que consistían en 8000 células. Después de 5 días, los agregados neurales se transfirieron a placas recubiertas con poli-L-ornitina (Sigma) y laminina (Roche) y se dejaron formar rosetas neurales bajo inhibición dual de SMAD continua (SB-431542 y LDN) en medio básico complementado con FGF. Las rosetas neurales se aislaron selectivamente usando el reactivo de selección de rosetas neurales STEMdiff™ (STEMCELL Technologies), se volvieron a sembrar en placas recubiertas con poli-L-ornitina y Laminin521 (BioLamina) y se expandieron en medio básico complementado con 10 ng/ml de FGF (Peprotech), 10 ng/ml de EGF (RnD) y 20 ng/ml de B D N F (Peprotech). Cuando alcanzaron la confluencia, las célu las se disociaron enzim áticam ente con trip sin a /E D T A al 0,05 % (Gibco, Invitrogen) y se subcultivaron. El pase continuo en medio básico com plem entado con F G F , E G F y B D N F da lugar a una línea celular progenitora neural (línea N P C ) estable dentro de 10 a 20 pases. Una línea celu lar progenitora neural estable se define por su capacidad de autorrenovación y por la expresión de los m arcadores específicos de la fase de desarrollo So x2 y nestina. T ra s estím ulos específicos, las N P C se diferencian en progenies neuronales (M A P2+, T a u , H u C /D ) y astrogliales (G F A P ) (Dunkley e t al., 2015 Proteom ics Clin Appl., vol. 7-8, págs.684-94).
C u ltivo de N P C
La s condiciones para el cultivo de N P C se han descrito previam ente y se usaron con ligeras m odificaciones (Boissart e t al., 2013 Transl Psychiatry. 3:e294). En resumen, las célu las se mantuvieron en p lacas recubiertas con Lam inin521 (BioLam ina) y se cultivaron en medio básico [compuesto por volúm enes iguales de medio D M E M :F 12 Glutam ax y medio N eurobasal (Gibco, Invitrogen), com plem entado con 1x B 27 (Gibco, Invitrogen), 1x N2 (Gibco, Invitrogen), betamercaptoetanol 0,1 mM (Gibco, Invitrogen)] y com plem entado con 10 ng/ml de F G F (Peprotech), 10 ng/ml de E G F (RnD) y 20 ng/ml de B D N F (Peprotech).
D ife re n c ia c ió n en cu ltivo de cé lu la s n e u ro n a le s
Para inducir la diferenciación neuronal de N P C , las célu las se disociaron con tripsina al 0,05 % /E D T A (Gibco, Invitrogen) en una suspensión de célu las sueltas y se sem braron en p lacas recubiertas con Lam inin 521 (BioLam ina) a una densidad de 12.000 cé lu la s/cm 2 y se mantuvieron en medio básico com plem entado con 200 ng/ml de Shh (Peprotech), 100 ng/ml de F G F 8 (Peprotech) y fosfato de ácido ascórbico 100 pM (Sigm a) durante un período de 7 d ías. Posteriormente, las célu las se volvieron a sem brar en medio basal com plem entado con 20 ng/ml de B D N F (Peprotech), 10 ng/ml de G D N F (Peprotech), cA M P (B IO L O G Life Scien ce) 0,5 mM y fosfato de ácido ascórbico (Sigm a) 100 pM a una densidad de 45000 célu las/cm 2 y se diferenciaron durante un período de 21 d ías. El día 21 de la diferenciación, los cultivos neuronales diferenciados se volvieron a sem brar en el formato de placa com patible con el cribado. S e realizó una nueva siem bra disociando los cultivos con A ccutase (Innovative C ell Technologies Inc.) para dar una suspensión de célu las sueltas. La s célu las se sem braron a una densidad de 200.000 cé lu la s/cm 2 en presencia de Y -27632 10 pM (un inhibidor de R h o -c in a sa s reversible, perm eable a las célu las de Calbiochem ) en las p lacas de m icrovaloración de 384 pocillos para el ensayo de cribado de oligonucleótidos final. Los cultivos neuronales se diferenciaron adem ás durante 7 d ías ad icionales en medio basal com plem entado con 20 ng/ml de B D N F (Peprotech), 10 ng/ml de G D N F (Peprotech), cA M P (B IO L O G Life Scien ce) 0,5 mM y fosfato de ácido ascórbico (Sigm a) 100 pM. El medio de diferenciación se cam bió dos ve ce s por sem ana. D esp ués de un período de diferenciación total de 35 d ías, los cultivos de célu las neuronales estaban listos para el tratamiento con oligonucleótidos.
Cribado de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas - sistema de 384 pocillos
Para el cribado, se diluyeron previamente los oligonucleótidos concentrados a las concentraciones ind icadas con agua en p lacas de m icrovaloración de 384 pocillos (placa de compuesto). La disposición de la placa sirvió como molde de tratamiento. S e transfirió una dilución de oligonucleótidos de dos microlitros de cada pocillo de la placa de compuesto a una placa de cultivo respectiva. To da la m anipulación de líquidos se realizó en condiciones estériles en un flujo lam inar usando un sistem a robótico de laboratorio sem iautom ático (Beckm ancoulter). Los cultivos de célu las neuronales se incubaron con oligonucleótidos durante 5 d ías sin cam bio del medio. Posteriormente, los cultivos neuronales se lisaron y procesaron para el ensayo de q P C R con el kit R ea lT im e ready C ell lysis y R N A V irus M aster (Roche). La m anipulación de líquidos se realizó usando un sistem a robótico de laboratorio sem iautom ático (Beckm ancoulter). La s m uestras se analizaron por un sistem a de P C R en tiempo real Lightcycler480 (Roche).
La actividad de los oligonucleótidos se evaluó por q P C R vigilando la abundancia de transcritos de U B E 3 A usando los siguientes cebadores y sondas
U B E3a-sentido: cebador directo: A TA TG TGG AA GCCGQ A ATCT (S E Q ID NO: 837),
cebador inverso: t C C C A G M C T C C C t M TGAGAA (S E Q ID NO: 838),
sonda interna m arcada con tinte FAM: A TGACGGTGGCTATACCAGiG (S E Q ID NO: 839)
La R T -q P C R se multiplexó con P P IA (peptidilprolil isom erasa A) como gen constitutivo para la norm alización. Los cebadores de P P IA y la sonda m arcada con el tinte V IC se adquirieron de Therm o Fish er Scientific (ID de ensayo H s99999904_m 1). C a d a placa incluye un oligonucleótido no dirigido (sim ulación) como control negativo ( T T G a a ta a g tg g a T G T (S E Q ID NO: 846)) y un oligonucleótido de referencia C M P ID NO: 41 _ 1 , dando como resultado una regulación por incremento del A R N m de U B E3A .
La selectividad de los oligonucleótidos se verificó por contracribado del transcrito de S N O R D 115 , que está localizado en dirección 5' de S N O R D 109 B en el crom osom a 15. S e vigiló la expresión de S N O R D 115 por q P C R usando los siguientes cebadores y sonda
cebador directo: GGGTCAATGATGAGAAGCTTAT (SEQ ID NO: 840),
cebador inverso GGGCCTCAGCGTAATCCTATT (SEQ ID NO: 841),
sonda interna marcada con tinte FAM: TTCTGAAGAGAQGTGATGACTTAAAA (SEQ ID NO: 842)
La RT-qPCR se multiplexó con PPIA (Thermo Fisher Scientific) tras el tratamiento con oligonucleótido.
La reducción del transcrito SNHG14 en dirección 3' de SNORD109B (también denominado supresor de UBE3A) se midió por RT-qPCR usando los siguientes cebadores y sonda
cebador directo: ATCCGAGGCATGAATCTC AC (SEQ ID NO: 843),
cebador inverso: C AGGCC A AA ACCCTT G AT A A (SEQ ID NO: 844),
sonda interna marcada con tinte FAM: TTGCTGAGCATTTTTGCATC (SEQ ID NO: 845)
La RT-qPCR se multiplexó con PPIA (Thermo Fisher Scientific).
Los datos se presentan como % de expresión promedio en relación con la simulación en todas las placas y se normalizan con respecto al oligonucleótido de referencia para tener en cuenta la variación de placa a placa.
Cribado de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas - sistema de 96 pocilios
Para el cribado, se diluyeron previamente los oligonucleótidos concentrados a las concentraciones indicadas con agua en placas de microvaloración de 96 pocillos (placa de compuesto). La disposición de la placa sirvió como molde de tratamiento. Se transfirió una dilución de oligonucleótidos de dos microlitros de cada pocillo de la placa de compuesto a una placa de cultivo respectiva. Toda la manipulación de líquidos se realizó en condiciones estériles en un flujo laminar usando un sistema robótico de laboratorio semiautomático (Beckman Coulter). Los cultivos de células neuronales se incubaron con oligonucleótidos durante 5 días sin cambio del medio. Posteriormente, se lisaron los cultivos neuronales y se purificó el ARN usando el kit de purificación de ARN Pure Link Pro96 (12173011A) de LifeTechnologies. La manipulación de líquidos se realizó usando un sistema robótico de laboratorio semiautomático (Beckmancoulter). El análisis de qPCR de Ube3a y Ube3a-ATS se llevó a cabo en un sistema de PCR en tiempo real ViiA™ 7 Thermo Fisher Scientific usando qScriptTM XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix Low ROX, de Quanta (95134­ 50).
Se usaron los siguientes cebadores y sondas:
qPCR de UBE3a-sentido:
cebador directo: ATATGTGGAAGCCGGAATCT (SEQ ID NO: 697),
cebador inverso: TCCCAGAACTCCGTA ATC AG AA (SEQ ID NO: 698),
sonda interna marcada con tinte FAM: ATGACGGTGGCTATACCAGG (SEQ ID NO: 699)
qPCR de transcrito SNHG14 en dirección 3' de SNORD109B (también denominado supresor de UBE3A): Conjunto de sondas y cebadores disponible comercialmente de ThermoFisher: Hs01372957_m1. Estos cebadores amplifican una secuencia que abarca 87 pb de exón-exón en el transcrito de Genbank AF400500.1
qPCR de transcrito de GAPDH:
Conjunto de sondas y cebadores disponible comercialmente de Thermofisher: Símbolo del gen: con los siguientes detalles del ensayo: RefSeq: NM_002046.3, localizaciones del exón de la sonda: 3, tamaño del amplicón: 122 pb. ID del ensayo TaqMan correspondiente: Hs99999905_m1.
La RT-qPCR tanto para Ube3a como para Ube3a-ATS se multiplexó con GAPDH como gen constitutivo para la normalización. Cada placa incluye un oligonucleótido no dirigido (simulación) como control negativo ( I ryaataaglggalül (SEQ ID NO: 846)) y un oligonucleótido de referencia CMP ID NO: 21_1, dando como resultado una regulación por incremento del ARNm de UBE3A. Además, se incluyó un panel de oligonucleótidos no dirigidos a Ub3a o al transcrito SNHG14 en dirección 3' de SNORD109B (también denominado supresor de UBE3A) para vigilar el ruido del ensayo y el riesgo de detectar positivos falsos. Estos se distribuyeron aleatoriamente sobre las placas.
Oligonucleótidos de control:
CGAaccactgaaGAA (SEQ ID NO: 819)
CGAaccactgaacAAA (SEQ ID NO: 820)
CGAagtgcacaCG (SEQ ID NO: 821)
GCGtaaagagaGGT (SEQ ID NO: 822)
GAGAaggcacagaCGG (SEQ ID NO: 823)
GGGaaaigcacaCGG (SEQ ID NO: 824)
GAGaaggcacagaCGG (SEQ ID NO: 825)
CGAaccactgAACA (SEQ ID NO: 826)
G AAccactgaacAAA (SEQ ID NO: 827)
caGC GtaaagagaG G (SEQ ID NO: 828)
GCgtaaaqaqAGG (SEQ ID NO: 829)
CGAaccactgaAC (SEQ ID NO: 830)
CGAAcoactgaaCAAA (SEQ ID NO: 831)
AGCgaagigcacaGGG (SEQ ID NO: 832)
AGGtgaagogaAGTG (SEQ ID NO: 833)
T AG I aaadgagCCA (SEQ ID NO: 834)
AGAagcicacagaCGG (SEQ ID NO: 835)
CGGcagtatgga.T GG (SEQ ID NO: 836)
Ejemplo 1 - Actividad de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales primarias de ratón
Los oligonucleótidos dirigidos a la parte del ARN no codificante largo de SNHG14 que es antisentido con respecto al pre-ARNm de UBE3A (posición de 55319 a 141053 de la SEQ ID NO: 1) se sometieron a prueba para determinar su capacidad para reducir el transcrito de ARN no codificante largo SNHG14 que evita la expresión de UBE3A (también denominado supresor de UBE3A o UBE3A-SUP en la tabla de datos) y su capacidad para inducir la reexpresión de ARNm de UBE3a en cultivos de células de neuronas corticales primarias de ratón, obtenidos como se describe en la sección "Materiales y procedimientos" anterior. La concentración de oligonucleótidos fue de 5 microM.
Los oligonucleótidos se cribaron de acuerdo con el protocolo de cribado en cultivos de células de neuronas corticales de ratón descrito en la sección "Materiales y procedimientos". Los resultados se muestran en la tabla 4.
Tabla 4: Actividad de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales primarias de ratón.
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Ejemplo 2 - Actividad de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas
Los oligonucleótidos dirigidos a SNHG14 humano en la región en dirección 3' de SNORD109B correspondientes a la posición de 25278410 a 25419462 en el cromosoma 15 (SEQ ID NO: 1) se sometieron a prueba en cultivos de células neuronales humanas derivadas de pacientes (véase el protocolo en la sección "Materiales y procedimientos"). Se analizó la capacidad de los oligonucleótidos para reducir el transcrito SNHG14 en la región en dirección 3' de SNORD109B (también denominado supresor de UBE3A o UBE3A-SUP en la tabla de datos), sin afectar la expresión de SNORD115. Además, se analizó la capacidad para inducir la reexpresión de ARNm de UBE3A.
Los oligonucleótidos se cribaron de acuerdo con el protocolo para cribar oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas descrito en la sección "Materiales y procedimientos" anterior.
Los resultados se muestran en la tabla 5. Se ha medido la expresión de ARNm de UBE3A para todos los compuestos, si bien la atenuación del supresor de UBE3A y el mantenimiento de los niveles de SNORD1115 no se han analizado para todos los compuestos.
Tabla 5: Actividad de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas derivadas de pacientes.
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De los 187 compuestos sometidos a prueba, aproximadamente un 90 % mostró reexpresión de UBE3A en comparación con el oligonucleótido de simulación a la concentración de 5 microMolar. El número de oligonucleótidos que pueden inducir la reexpresión de UBE3A es mayor en la región entre la posición de 1 a 55318 de la SEQ ID NO: 1 (región no superpuesta), a continuación, en la región complementaria a la región codificante de UBE3A (región superpuesta. La figura 2 traza la distribución de los oligonucleótidos de acuerdo con su posición en el cromosoma 15 frente a la expresión de ARNm de UBE3A en relación con el oligonucleótido de simulación.
Para los oligonucleótidos donde se ha sometido a prueba SNORD115, no existe ninguna regulación por disminución significativa en comparación con la simulación a 1 y 5 microM.
Ejemplo 3 - Actividad de oligonucleótidos dirigidos al transcrito SNHG14 en la región en dirección 3' de SNORD109B y en dirección 5' de la región antisentido con respecto al pre-ARNm de UBE3A
Los oligonucleótidos dirigidos a la posición 4806-54939 de la SEQ ID NO: 1 se sometieron a prueba en cultivos de células neuronales humanas derivadas de pacientes (véase el protocolo en la sección "Materiales y procedimientos"). La capacidad de los oligonucleótidos para reducir el transcrito SNHG14 en la región en dirección 3' de SNORD109B (también denominado supresor de UBE3A o UBE3A-SUP en la tabla de datos. Además, se analizó la capacidad para inducir la reexpresión de ARNm de UBE3A.
Los oligonucleótidos se cribaron de acuerdo con el protocolo de cribado de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas descrito en la sección "Materiales y procedimientos" - "Cribado de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas - sistema de 96 pocillos"
Los resultados se muestran en la tabla 6.
Tabla 6: Actividad de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas derivadas de pacientes.
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Ejemplo 4 - Actividad de oligonucleótidos dirigidos al transcrito SNHG14 en la región antisentido con respecto al pre-ARNm de UBE3A
Los oligonucleótidos dirigidos a la posición 55337-136214 de la SEQ ID NO: 1 se sometieron a prueba en cultivos de células neuronales humanas derivadas de pacientes (véase el protocolo en la sección "Materiales y procedimientos"). La capacidad de los oligonucleótidos para reducir el transcrito SNHG14 en la región en dirección 3' de SNORD109B (también denominado supresor de UBE3A o UBE3A-SUP en la tabla de datos). Además, se analizó la capacidad para inducir la reexpresión de ARNm de UBE3A.
Los oligonucleótidos se cribaron de acuerdo con el protocolo de cribado de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas descrito en la sección "Materiales y procedimientos" - "Cribado de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas - sistema de 96 pocillos".
Los resultados se muestran en la tabla 7.
Tabla 7: Actividad de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas derivadas de pacientes.
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Ejemplo 5 - Actividad de oligonucleótidos dirigidos al transcrito SNHG14 en la región en dirección 3' de SNORD109B y en dirección 5' de la región antisentido con respecto al pre-ARNm de UBE3A
Los oligonucleótidos dirigidos a la posición 5224-51257 de la SEQ ID NO: 1 se sometieron a prueba en cultivos de células neuronales humanas derivadas de pacientes (véase el protocolo en la sección "Materiales y procedimientos"). La capacidad de los oligonucleótidos para reducir el transcrito SNHG14 en la región en dirección 3' de SNORD109B (también denominado supresor de UBE3A o UBE3A-SUP en la tabla de datos. Además, se analizó la capacidad para inducir la reexpresión de ARNm de UBE3A.
Los oligonucleótidos se cribaron de acuerdo con el protocolo de cribado de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas descrito en la sección "Materiales y procedimientos" "Cribado de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas - sistema de 96 pocillos" con las siguientes modificaciones:
Cebador UBE3a-sentido
Usando cebadores y sonda disponibles comercialmente de ThermoFisher: Hs00166580_m1 que amplifica una secuencia de 94 pb en la posición 838 de la secuencia de referencia ID NM_000462.3.
Cada placa incluye controles de PBS (en lugar de un oligonucleótido no dirigido) y un oligonucleótido de control positivo CMP ID NO: 271_1, lo que da como resultado una regulación por incremento del ARNm de UBE3A. No se incluyeron los oligonucleótidos de control adicionales.
Los datos se presentan como % de expresión promedio en relación con los controles de PBS en todas las placas y se normalizan con respecto al oligonucleótido de control positivo para controlar la variación de placa a placa a niveles de eficacia. Los resultados se muestran en la tabla 8.
Tabla 8: Actividad de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas derivadas de pacientes.
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Ejemplo 6 - Actividad de oligonucleótidos que abarcan exón-exón
Se sometió a prueba la capacidad de los oligonucleótidos diseñados para ser complementarios a través de las uniones exón-exón de SNHG14-023 (ENST00000554726) para reducir el transcrito SNHG14 en la región en dirección 3' de SNORD109B (también denominado supresor de UBE3A o UBE3A-SUP en la tabla de datos). Además, se analizó la capacidad para inducir la reexpresión de ARNm de UBE3A. Los oligonucleótidos abarcan principalmente el exón 2 y el exón 3 (es decir, son complementarios a una región en el exón 2 y una región en el exón 3).
Los oligonucleótidos se cribaron de acuerdo con el protocolo para cribar oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas descrito en la sección Ejemplo 5.
Los resultados se muestran en la tabla 9.
Tabla 9: Actividad de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas derivadas de pacientes.
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Ejemplo 7 - Pruebas in vitro de la eficacia y la potencia de oligonucleótidos seleccionados
En base a los cribados de los ejemplos 2 a 5 anteriores, se seleccionaron 52 oligonucleótidos para las pruebas de potencia y eficacia.
Los oligonucleótidos se cribaron en células derivadas de pacientes con AS humano como se describe en la sección de Materiales y procedimiento "Cribado de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas - sistema de 96 pocillos" con las siguientes modificaciones:
Para el cebador de UBE3a-sentido, cebadores y sonda disponibles comercialmente de ThermoFisher: Se usaron Hs00166580_m1 que amplificaban una secuencia de 94 pb en la posición 838 de la secuencia de referencia ID NM_000462.3.
Cada placa incluye controles de PBS (en lugar de un oligonucleótido no dirigido) y se incluyeron los oligonucleótidos de control positivo CMP ID NO: 186_1 y 39_1 identificados en cribados previos. No se incluyeron los oligonucleótidos de control adicionales descritos en la sección de materiales y procedimiento. Las concentraciones de prueba de oligonucleótidos fueron de 31,6 pM a 1 nM usando una dilución semilogarítmica de 10 puntos. Todos los oligonucleótidos se sometieron a prueba en 5 experimentos independientes en 5 semanas diferentes. En el procedimiento de CC de los datos, algunas placas se retiraron del análisis si estas eran valores atípicos obvios, por ejemplo, no se detectaba producto de PCR. Después de esta filtración, existe un mínimo de tres experimentos independientes que respaldan cada uno de los valores informados.
La CE50 (reexpresión de ARNm de UBE3A) y la CI50 (reducción del transcrito SNHG14 en la región en dirección 3' de SNORD109B, también denominado supresor de UBE3A o UBE3A-SUP en la tabla de datos) se determinaron después del ajuste de la curva usando un modelo de respuesta a la dosis sigmoideo de 4 parámetros. El ajuste se ejecutó usando el motor de ajuste disponible dentro del programa informático Biobook de IDBS (XLfit). A partir del ajuste de la curva, se determinó la regulación por incremento máxima obtenible de UBE3A (incremento máx. de UBE3A) y la atenuación máxima obtenible de UBE3A-SUP (Kd máx. de UBE3A-SUP). Ambos se muestran como % de control (células tratadas con PBS). Los resultados se muestran en la tabla 10, los valores se informan como medias geométricas de cada duplicado biológico.
Tabla 10: Valores de CE50 y CI50 de oligonucleótidos y regulación por incremento máxima de UBE3A y atenuación del supresor de UBE3A.
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Figure imgf000172_0001
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Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un oligonucleótido antisentido en el que el oligonucleótido es el compuesto oligonucleotídico TTAcActtaattatactTCC (CMP ID NO: 626_7) en el que las letras mayúsculas representan nucleósidos de LNA beta-D-oxi, las letras minúsculas representan nucleósidos de ADN, todos los C de LNA son 5-metil-citosina y todos los enlaces internucleosídicos son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
2. Una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido de la reivindicación 1 y un diluyente, disolvente, vehículo, sal y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
3. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS).
4. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en la que la sal farmacéuticamente aceptable es una sal de sodio.
5. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en la que la sal farmacéuticamente aceptable es una sal de potasio.
6. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 para su uso como medicamento.
7. Un procedimiento in vitro para inducir la expresión de UBE3A en una célula diana donde se suprime la expresión de UBE3A paterno, comprendiendo dicho procedimiento administrar un oligonucleótido de la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 en una cantidad eficaz a dicha célula.
8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la expresión de UBE3A se incrementa en al menos un 40 % en comparación con un control.
9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que el nivel del transcrito SNHG14 en dirección 3' de SNORD109B se reduce en al menos un 30 % en comparación con un control.
10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la célula diana es una célula neuronal.
11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la expresión de SNORD115 no se ve afectada significativamente en comparación con un control.
12. El oligonucleótido de la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 para su uso en el tratamiento o la prevención del síndrome de Angelman.
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