JP2021003113A - 父方ｕｂｅ３ａの発現を誘導するオリゴヌクレオチド - Google Patents

父方ｕｂｅ３ａの発現を誘導するオリゴヌクレオチド Download PDF

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Abstract

【課題】本発明は動物またはヒト神経細胞中の父方アレルからユビキチン−タンパク質リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ）の発現を誘導することができるオリゴヌクレオチドに関する。【解決手段】このオリゴヌクレオチドはＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流のＳＮＨＧ１４の長鎖非翻訳性ＲＮＡへのハイブリダイゼーションによりＵＢＥ３Ａ父方アレルの抑制因子を標的にする。本発明はさらに医薬組成物およびアンジェルマン症候群の治療方法に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流のＳＮＨＧ１４に相補的であり、ＳＮＨＧ１４にハイブリダイズして動物またはヒトでユビキチン−タンパク質リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ）の父方での発現を誘導するオリゴヌクレオチド（オリゴマー）に関する。本発明はさらに、アンジェルマン症候群の治療のための医薬組成物および方法に関する。
アンジェルマン症候群は、母親由来の染色体１５ｑ１１．２のＵＢＥ３Ａ遺伝子の欠失または不活性によって生じる神経遺伝性疾患である。ＵＢＥ３Ａ遺伝子の父方コピーが、ＳＮＨＧ１４（ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳとしても知られている）と表されるＵＢＥ３Ａの内因性アンチセンス転写物により神経細胞でゲノム刷り込みおよび発現抑制されている(Meng et al. 2012 Hum Mol Genet. Vol. 21 pp. 3001-12)。神経細胞以外の種類の細胞は、母方アレルと父方アレルの両方に由来するＵＢＥ３Ａ遺伝子を発現していると思われる。
アンジェルマン症候群は、重度の知的障害および発達障害、睡眠障害、発作、けいれん様の動き、脳波異常、頻繁な笑いや笑み、および深刻な言語障害により特徴付けられる。
ＷＯ２０１２／０６４８０６には、トポイソメラーゼ阻害剤を用いて細胞中でＵＢＥ３Ａ発現を誘導する方法が開示されている。この方法を用いてアンジェルマン症候群を治療することができる。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドについては何ら開示されていない。
ＷＯ２０１４／００４５７２には、マウスＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳを標的にする２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）修飾を有するオリゴヌクレオチドが開示されている。これらのオリゴヌクレオチドはマウスに関連したアッセイでのみ試験されている。MBII-52 snoRNA（ＳＮＯＲＤ１１５としても知られている）の下流およびＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡ前駆体の上流の領域では、マウスとヒトとの間に進化過程の保存がない。従って、マウスＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳを標的にするオリゴヌクレオチドは、ヒトで機能するオリゴヌクレオチドに翻訳することができない。また、ヒトＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳを標的にするオリゴヌクレオチドについて何ら開示されていない。
本発明の目的
本発明は、父方ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＯＲＤ１１６、およびＳＮＲＰＮ転写物の発現に大きく影響を及ぼさずに神経細胞においてヒト父方ＵＢＥ３Ａの発現を誘導する新規なオリゴヌクレオチドを同定する。
発明の概要
本発明は、ＵＢＥ３Ａの発現を抑制することができる核酸を標的にして、特に神経細胞でＵＢＥ３Ａ活性の低下に関連した病気を治療または予防するオリゴヌクレオチドに関する。
従って、第一の側面では、本発明はゲノムバージョンＧＲＣｈ３８．ｐ２のヒト染色体１５の位置２５２７８４１０から位置２５４１９４６２に対応するヒトＳＮＨＧ１４長鎖非翻訳性ＲＮＡの一部と少なくとも９８％の相補性を有し、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。この領域はまた、配列番号１と類似している。上記オリゴヌクレオチドは、好ましくはギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）設計を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。上記オリゴヌクレオチドは、ＵＢＥ３Ａ抑制因子の分解、低減、または除去、特にＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流のＳＮＨＧ１４長鎖非翻訳性ＲＮＡ転写物の低減によりＵＢＥ３Ａの発現、特に神経細胞での父方ＵＢＥ３Ａの発現を誘導することができることが好ましい。ＵＢＥ３Ａの再発現は、ＳＮＯＲＤ１１５の発現に大きな影響を及ぼさずに達成される。標的核酸の分解は、ヌクレアーゼの動員（recruitment）により達成されることが好ましい。
さらなる側面では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドおよび医薬的に許容される希釈剤、担体、塩、および／または補助剤（adjuvants）を含む医薬組成物を提供する。
さらなる側面では、本発明は、有効量の本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物を父方ＵＢＥ３Ａの発現が抑制されている標的細胞に投与して、前記細胞でＵＢＥ３Ａの発現を生体内または生体外で誘導する方法を提供する。
さらなる側面では、本発明は、病気、障害、または機能不全に罹っているあるいはその疑いがある治療対象に本発明のオリゴヌクレオチドを治療的もしくは予防的に有効量投与することを含む、ＵＢＥ３Ａの生体内活性に関連付けられる病気、障害、または機能不全を治療または予防する方法を提供する。
さらなる側面では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物は、アンジェルマン症候群の治療または予防に用いられる。
図１で、上の一本鎖は、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流のＳＮＨＧ１４転写物（ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ）の領域を示す。各黒四角の部分は試験したマウスのオリゴヌクレオチドの位置を示す。下の一本鎖は、ＵＢＥ３Ａコード領域を示し、各黒四角の部分はエクソンを示す。エクソン１は、１６０ｋｂあたりに位置する。これらのオリゴヌクレオチドは、エクソン９（約９７ｋｂに位置する）、エクソン１０（約９２ｋｂに位置する）、エクソン１３（約７７ｋｂに位置する）、および５‘末端のエクソン１６（約６０ｋｂに位置する）のアンチセンス領域に位置する。 図２は、実施例２で試験した、ヒト神経細胞培養物でＵＢＥ３Ａの再発現を誘導するオリゴヌクレオチドの能力を示すものである。ＳＮＯＲＤ１０９ＢとＵＢＥ３Ａコード領域の上流領域（配列番号１の位置１から位置５５３１８）の間のヒトＳＮＨＧ１４長鎖非翻訳性ＲＮＡの領域に相補的なオリゴヌクレオチドが「●（非オーバーラップ）」で示されている。ＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡ前駆体（配列番号１の位置５５３１９から位置１４１０５３）に対してアンチセンスである、ヒトＳＮＨＧ１４長鎖非翻訳性ＲＮＡの領域に相補的なオリゴヌクレオチドが「▲（オーバーラップ）」で示されている。表３のヒトとアカゲザルの保存を有するオリゴヌクレオチドは、□（グレーの四角）として各プロットの底部に示されている。ヒト：アカゲザル：マウス間の保存は■として示されている。オリゴヌクレオチド濃度は、各プロットの右側に示すように、０．２、１、および５マイクロＭであった。
定義
オリゴヌクレオチド
本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」は、一般に当業者によって理解されるように、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として定義される。このような共有結合ヌクレオシドはまた、核酸分子またはオリゴマーと言う場合がある。オリゴヌクレオチドは、一般に、実験室で固相化学合成により調製されて、精製される。オリゴヌクレオチドの配列と言う場合、共有結合ヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分またはそれらの修飾の配列あるいは順番を言う。本発明のオリゴヌクレオチドは人工のもので、化学的に合成され、典型的には精製または単離されている。本発明のオリゴヌクレオチドは、１種以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでいていてもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で用いられる用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、特に標的核酸の連続した配列にハイブリダイズすることで標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではないので、ｓｉＲＮＡではない。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖であることが好ましい。
連続ヌクレオチド配列
本明細書で用いられる用語「連続ヌクレオチド配列」は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を言う。この用語は、本明細書では用語「連続核酸塩基配列」および用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互いに言い換え可能に用いられる。態様によっては、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列に存在する。態様によっては、オリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を含み、任意でさらにヌクレオチド（例えば、連続ヌクレオチド配列に官能基を結合させるのに用いてもよいヌクレオチドリンカー領域）を含んでいてもよい。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であってもなくてもよい。
ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のため、天然由来のヌクレオチドおよび非天然由来のヌクレオチドのいずれも含む。本来、ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡヌクレオチドおよびＲＮＡヌクレオチド）は、リボース糖部分、核酸塩基部分、および１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、「単位」または「単量体」として交換可能に言及されてもよい。
修飾ヌクレオシド
本明細書で用いられる用語「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」は、糖部分または（核酸）塩基部分に１種以上の修飾を導入することで等価のＤＮＡヌクレオシドまたはＲＮＡヌクレオシドに比べて修飾されたヌクレオシドを言う。好ましい一態様では、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。用語「修飾ヌクレオシド」はまた、本明細書では、用語「ヌクレオシド類縁体」、修飾「単位」、あるいは修飾「単量体」として互いに言い換え可能に用いられてもよい。
修飾ヌクレオシド間結合
本明細書で用いられる用語「修飾ヌクレオシド間結合 (modified internucleoside linkage)」は、一般に、当業者によって理解されるように、２個のヌクレオシドを共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として定義される。修飾ヌクレオシド間結合を有するヌクレオチドはまた、「修飾ヌクレオチド」とも言う。態様によっては、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合に比べてオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を高める。天然由来のオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシド間のホスホジエステル結合を形成するリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、生体内での使用でオリゴヌクレオチドを安定化させるのに特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのＤＮＡヌクレオシドまたはＲＮＡヌクレオシド領域（例えば、ギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、修飾ヌクレオシドの領域内など）をヌクレアーゼによる切断から保護するように作用してもよい。
一態様では、オリゴヌクレオチドは、天然のホスホジエステルから、例えば、よりヌクレアーゼ攻撃に対する耐性がある結合に変化させた１つ以上のヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、血清中のオリゴヌクレオチドをインキュベートする、あるいは、ヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えば、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を用いて決定してもよい。いずれの方法も当該分野でよく知られている。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を高めることができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と言う。好ましい態様では、オリゴヌクレオチドまたはそれらの連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％は修飾されている。例えば、オリゴヌクレオチドまたはそれらの連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０、または少なくとも９０％は修飾されている。態様によっては、オリゴヌクレオチドまたはそれらの連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合はすべて修飾されている。態様によっては、本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基（例えば、複合体）に結合するヌクレオシドはホスホジエステルであってもよいことが認識されている。態様によっては、オリゴヌクレオチドまたはそれらの連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合はすべて、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオシド間結合である。
修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、およびボラノホスフェートを含む群から選択されてもよい。好ましい態様では、修飾ヌクレオシド間結合は、本発明のオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅＨ動員と両立するものであり、例えば、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、またはボラノホスフェートである。
態様によっては、ヌクレオシド間結合は硫黄（Ｓ）を含み、例えば、ホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合である。
ホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有用な薬物動態、および製造の容易さにより特に有用である。好ましい態様では、オリゴヌクレオチドまたはそれらの連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％は、ホスホロチオエートである。例えば、オリゴヌクレオチドまたはそれらの連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０、または少なくとも９０％はホスホロチオエートである。態様によっては、オリゴヌクレオチドまたはそれらの連続ヌクレオチド配列はすべて、ホスホロチオエートである。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、１種以上の中性ヌクレオシド間結合、特に、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、ＭＭＩ、アミド−３、ホルムアセタール、またはチオホルムアセタールより選択されるヌクレオシド間結合を含む。
さらに、ヌクレオシド間結合はＷＯ２００９／１２４２３８に開示されている（参照により本明細書に組み込まれる）。一態様では、ヌクレオシド間結合は、ＷＯ２００７／０３１０９１に開示されているリンカー（参照により本明細書に組み込まれる）より選択される。特に、上記ヌクレオシド間結合は−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（ＲＨ）−Ｏ−、Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＮＲＨ−より選択されてもよく、かつ／または上記ヌクレオシド間リンカーは−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＯ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＲＨＣＯ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−ＣＨ２−ＮＣＨ３−Ｏ−ＣＨ２−より選択されてもよい（ここで、ＲＨは水素およびＣ１−４アルキルより選択される）。
ヌクレアーゼ耐性結合（例えば、ホスホロチオエート結合）は、標的核酸（例えば、ギャップマーの領域Ｇなど）あるいはヘッドマー（ｈｅａｄｍｅｒ）およびテイルマー（ｔａｉｌｍｅｒ）の非修飾ヌクレオシド領域と二本鎖を形成する際にヌクレアーゼを動員することができるオリゴヌクレオチド領域で特に有用である。しかしながら、ホスホロチオエート結合はまた、非ヌクレアーゼ動員領域および／または親和性増強領域（例えば、ギャップマーの領域ＦおよびＦ’）、またはヘッドマーおよびテイルマーの修飾ヌクレオシド領域でも有用な場合がある。
しかしながら、設計領域のそれぞれは、特に、修飾ヌクレオシド（例えば、ＬＮＡ）がヌクレアーゼ分解から結合を保護する領域では、ホスホロチオエート以外のヌクレオシド間結合（例えば、ホスホジエステル結合）を含んでいてもよい。特に、（典型的には、非ヌクレアーゼ動員領域に）修飾ヌクレオシド単位間あるいはそれに隣接するホスホジエステル結合（例えば、１つまたは２つの結合）を含めると、オリゴヌクレオチドの生物学的利用能および／または生物分布を改変することができる。ＷＯ２００８／１１３８３２（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
一態様では、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合はすべて、ホスホロチオエートおよび／またはボラノホスフェート結合である。オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合はすべて、ホスホロチオエート結合であることが好ましい。
核酸塩基
用語「核酸塩基」は、ヌクレオシドおよび核酸ハイブリダイゼーションで水素結合を形成するヌクレオチドに存在するプリン（例えば、アデニンおよびグアニン）部分およびピリミジン（例えば、ラシル、チミン、およびシトシン）部分を含む。本発明の文脈で、用語「核酸塩基」はまた、天然由来の核酸塩基とは異なってもよいが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能的である修飾核酸塩基をも包含する。この文脈で、「核酸塩基」は、天然由来の核酸塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、およびヒポキサンチン）と非天然由来の多様体の両方を言う。そのような多様体は、例えば、Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 and Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1に記載されている。
態様によっては、プリンまたはピリミジンを修飾プリンまたはピリミジン（例えば、置換プリンまたは置換ピリミジン）に変化させることで核酸塩基部分は修飾されている。例えば、核酸塩基は、イソシトシン、偽イソシトシン、５−メチルシトシン、５−チオゾロシトシン、５−プロピニルシトシン、５−プロピニルウラシル、５−ブロモウラシル、５−チアゾロウラシル、２−チオウラシル、２’−チオチミン、イノシン、ジアミノプリン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、および２−クロロ−６−アミノプリンより選択される。
核酸塩基部分は、それぞれ対応する核酸塩基を表す文字コード（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、またはＵ）で表されてもよい。ここで、それぞれの文字は任意で等価の機能の修飾核酸塩基を含んでいてもよい。例えば、例示されたオリゴヌクレオチドで、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、および５−メチルシトシンより選択される。ＬＮＡギャップマーの場合、任意で５−メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドを用いてもよい。
修飾オリゴヌクレオチド
用語「修飾オリゴヌクレオチド」は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを言う。用語「キメラ」オリゴヌクレオチドは、文献で修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを言うのに用いられてきた。
相補性
用語「相補性」は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン−クリック塩基対形成能を言う。ワトソン−クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）−シトシン（Ｃ）、およびアデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。自明であるが、オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでいてもよく、例えば、５−メチルシトシンはシトシンの代わりに用いられることが多い。従って、用語「相補性」は、非修飾塩基と修飾核酸塩基のワトソン−クリック塩基対を包含する（例えば、Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 およびBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1を参照のこと）。
本明細書で用いられる用語「％相補的」は、個別の核酸分子（例えば、標的核酸）の所定の位置の連続ヌクレオチド配列に対して所定の位置で相補的である（すなわち、ワトソン−クリック塩基対を形成する）核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列に対するヌクレオチド数の割合（パーセント）を言う。この割合は、ヌクレオチドにおいて、２つの配列の間で対を形成する配列塩基数をそのオリゴヌクレオチドの総数で除して、１００を掛けて算出される。このような比較において、配列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、不一致と言う。
本明細書で用いられる用語「完全に相補的」は１００％の相補性を言う。
ハイブリダイゼーション
本明細書で用いられる用語「ハイブリダイジング」または「ハイブリダイズ」は、２本の核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチドと標的核酸）が互いの鎖の塩基対の間に水素結合を形成して、これにより二本鎖を形成することを意味する。２本の核酸鎖の間の結合親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。この結合親和性は、多くの場合、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸を有する二本鎖になる温度として定義される融解温度（Ｔｍ）で記述される。生理学的条件で、Ｔｍは厳密には親和性と比例しない(Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537)。標準状態のギブズ自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性のより正確な表現であり、ΔＧ°＝−ＲＴｌｎ（Ｋｄ）（ここで、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である）により反応の解離定数（Ｋｄ）に関係する。従って、オリゴヌクレオチドと標的核酸の反応のΔＧ°が非常に低い場合、オリゴヌクレオチドと標的核酸のハイブリダイゼーションの強度が高いことを反映している。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃の反応に関連付けられるエネルギーである。オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションは自発反応であり、自発反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38 and Holdgate et al., 2005, Drug Discov Todayに記載された等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）法を用いて実験で測定してもよい。当業者であれば、ΔＧ°測定に市販の装置を利用可能であることを知っている。ΔＧ°はまた、SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465に記載された近傍モデルにより、Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 and McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405に記載された適切に派生させた熱力学パラメータを用いて数値的に推定してもよい。ハイブリダイゼーションにより意図された核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド長が１０〜３０個のオリゴヌクレオチドについて、推定ΔＧ°値−１０ｋｃａｌ未満で標的核酸にハイブリダイズする。態様によっては、ハイブリダイゼーションの度合いすなわち強度は、標準状態のギブズ自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド長が８〜３０個のオリゴヌクレオチドについて、推定ΔＧ°値が−１０ｋｃａｌ未満、−１５ｋｃａｌ未満、−２０ｋｃａｌ未満、および−２５ｋｃａｌ未満の範囲で標的核酸にハイブリダイズしてもよい。態様によっては、推定ΔＧ°値が−１０から−６０ｋｃａｌ（例えば、−１２から−４０、−１５から−３０ｋｃａｌ）、または−１６から−２７ｋｃａｌ（例えば、−１８から−２５ｋｃａｌ）でオリゴヌクレオチドは標的核酸にハイブリダイズする。
標的
用語「標的」は、調節するのが望ましいタンパク質を言う。
標的核酸
標的核酸は、そこに本発明のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする対象とする標的であり、例えば、遺伝子、ＲＮＡ、非翻訳性ＲＮＡ、長鎖非翻訳性ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、成熟ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ配列であってもよい。態様によっては、標的核酸は、非翻訳性ＲＮＡ、長鎖非翻訳性ＲＮＡ、またはこれらの亜配列である。生体内または生体外で応用する場合、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流のＳＮＨＧ１４転写物の量を低減することができ、それにより、意図された標的細胞で父方ＵＢＥ３Ａ転写物の抑制を取り除くことができる。本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続した配列は、オリゴヌクレオチドの全長に亘って測定して、標的核酸に相補的である。この配列は、任意で１つまたは２つの不一致の例外を有していてもよく、また任意でオリゴヌクレオチドを任意の官能基（例えば、複合体）に結合し得るヌクレオチド系リンカー領域を排除してもよい。
標的配列
上記オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子の亜配列に相補的である、またはハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含む。本明細書で用いられる用語「標的配列」は、本発明のオリゴヌクレオチドに相補的である核酸塩基配列を含む標的核酸に存在するヌクレオチドの配列を言う。態様によっては、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的である標的核酸の領域からなる。態様によっては、標的配列は、単一のオリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば、本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドにより標的され得る標的核酸の好ましい領域を表していてもよい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸（例えば、標的配列）に相補的である連続ヌクレオチド配列を含む。
上記オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に存在する標的配列に相補的である、あるいはハイブリダイズする少なくとも８個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。連続ヌクレオチド配列（従って、標的配列）は、少なくとも８個の連続するヌクレオチド、例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の連続したヌクレオチド、例えば、１２〜２５個、例えば、１４〜１８個の連続したヌクレオチドを含む。
標的細胞
本明細書で用いられる用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を言う。態様によっては、標的細胞は生体内または生体外にあってもよい。態様によっては、標的細胞は、哺乳類の細胞、例えば、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞（例えば、サル細胞またはヒト細胞）である。好ましい態様では、標的細胞は神経細胞である。
天然由来の多様体
本明細書で用いられる用語「天然由来の多様体」は、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂ遺伝子の下流のＳＮＨＧ１４転写物の多様体、あるいは長鎖非翻訳性ＲＮＡで複数のコドンを生じる遺伝暗号の縮重のために異なっていてもよい標的核酸と同じ遺伝子座位に由来する転写物の多様体を言う。従って、本発明のオリゴヌクレオチドは標的核酸、およびこれらの天然由来の多様体を標的にするように設計されてもよい。
発現の調節
本明細書で用いられる用語「発現の調節」は、オリゴヌクレオチドの投与前のＵＢＥ３Ａの量と比較した時にＵＢＥ３Ａタンパク質の量を変えることができるオリゴヌクレオチドの能力を表す一般的な用語として理解される。あるいは、発現の調節は、本発明のオリゴヌクレオチドが投与されない対照実験を参照して決定されてもよい。オリゴヌクレオチドにより達成される調節は、例えば、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流の非翻訳性ＳＮＨＧ１４転写物の分解または除去により、あるいはＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流のＳＮＨＧ１４転写物に関連付けられるポリメラーゼ活性の阻害または防止により父方ＵＢＥ３Ａ転写物の抑制を低減、除去、予防、減少、あるいは解除するその能力に関連している。調節はまた、例えば、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流の非翻訳性ＳＮＨＧ１４転写物による影響が及ぶ阻害機構の除去または阻害により父方ＵＢＥ３Ａの発現を回復、増加、または向上させるオリゴヌクレオチドの能力として見なしてもよい。
高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに組み込まれた時にそのオリゴヌクレオチドに相補的な標的に対する親和性を高める修飾ヌクレオチドである。この親和性は、例えば、融解温度（Ｔｍ）により測定される。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、一修飾ヌクレオシドあたり、融解温度を＋０．５から＋１２℃、より好ましくは＋１．５から＋１０℃、最も好ましくは＋３から＋８℃上昇させることが好ましい。多種類の高親和性修飾ヌクレオシドが当該分野で知られており、例えば、多くの２’−置換ヌクレオシド、ロックされた核酸（ＬＮＡ）などが挙げられる（例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 and Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213を参照のこと）。
糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾糖部分、すなわちＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボ−ス糖部分と比較して糖部分の修飾を有する１個以上のヌクレオシドを含んでいてもよい。
主にオリゴヌクレオチドの特定の特性（例えば、親和性および／またはヌクレアーゼ耐性）を向上させる目的で、リボ−ス糖部分の修飾を有する多種のヌクレオシドが作製されている。
このような修飾としては、リボ−ス環構造が、例えば、六炭糖環（ＨＮＡ）、典型的には、リボ−ス環のＣ２炭素とＣ４炭素の間にビラジカル架橋を有する二環式環（ＬＮＡ）、または典型的にはＣ２炭素とＣ３炭素との間の結合がない、結合されていないリボ−ス環（例えばＵＮＡ）により置換されることで修飾されているものが挙げられる。その他の糖修飾ヌクレオシドとしては、例えば、ビシクロ六炭糖核酸（ＷＯ２０１１／０１７５２１）または三環式核酸（ＷＯ２０１３／１５４７９８）が挙げられる。修飾ヌクレオシドとしてはまた、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルホリノ核酸の場合、糖部分が非糖部分で置換されたヌクレオシドが挙げられる。
糖修飾はまた、リボ−ス環の置換基群を水素以外の基、あるいはＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオシドに天然に見られる２’−ＯＨ基に変えて作製された修飾をも含む。置換基は、例えば、２’位、３’位、４’位、または５’位に導入してもよい。修飾糖部分を有するヌクレオシドはまた、２’−修飾ヌクレオシド（例えば、２’−置換ヌクレオシド）を含む。実際、２’−置換ヌクレオシドの開発は大きく注目されており、多くの２’−置換ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに組み込まれると有用な特性（例えば、ヌクレオシド耐性および親和性の向上など）を有することが分かった。
２’−修飾ヌクレオシド
２’−糖修飾ヌクレオシドは、２’位（２’−置換ヌクレオシド）にＨまたは−ＯＨ以外の置換基を有する、あるいは２’−結合ビラジカルを含むヌクレオシドである。２’−糖修飾ヌクレオシドとしては、２’−置換ヌクレオシドおよびＬＮＡ（２’−４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドが挙げられる。例えば、２’−修飾糖は、オリゴヌクレオチドの結合親和性および／またはヌクレアーゼ耐性を高める場合がある。２’−置換修飾ヌクレオシドの例としては、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、および２’−フルオロ−ＡＮＡ（Ｆ−ＡＮＡ）が挙げられる。さらなる例は、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 and Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213; および Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を参照のこと。以下に、２’−置換修飾ヌクレオシドをいくつか例示する。
ロックされた核酸ヌクレオシド（ＬＮＡ）
ＬＮＡヌクレオシドは、ヌクレオチドのリボ−ス糖環のＣ２’−位とＣ４’−位の間にリンカー基（ビラジカルまたは架橋と言う）を含む修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドはまた、文献では架橋型核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも言われている。
態様によっては、本発明のオリゴマーの修飾ヌクレオシドまたはＬＮＡヌクレオシドは、式ＩまたはＩＩの一般的な構造を有する。
式中、Ｗは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒａ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−より選択され、態様によっては、−Ｏ−であり、
Ｂは核酸塩基または修飾核酸塩基部分を表し、
Ｚは、隣接するヌクレオシドまたは５’末端基とのヌクレオシド間結合を表し、
Ｚ＊は、隣接するヌクレオシドまたは３’末端基とのヌクレオシド間結合を表す。
Ｘは、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒａ）−、および＞Ｃ＝Ｚからなる群より選択される基を表す。
態様によっては、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、ＮＨ−、ＮＲａＲｂ、−ＣＨ２−、ＣＲａＲｂ、−Ｃ（＝ＣＨ２）−、および−Ｃ（＝ＣＲａＲｂ）−からなる群より選択される。
態様によっては、Ｘは−Ｏ−である。
Ｙは、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒａ）−、および＞Ｃ＝Ｚからなる群より選択される基を表す。
態様によっては、Ｙは、−ＣＨ２−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ（ＲａＲｂ）Ｃ（ＲａＲｂ）Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、および−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−からなる群より選択される。
態様によっては、Ｙは−ＣＨ２−、−ＣＨＲａ−、−ＣＨＣＨ３−、ＣＲａＲｂ−からなる群より選択される。
あるいは、−Ｘ−Ｙ−は共に、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒａ）−、および＞Ｃ＝Ｚからなる群より選択される１、２、３、または４個の基／原子からなる２価のリンカー基（ラジカルとも言う）を表す。
態様によっては、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｘ−ＣＨ２−、−Ｘ−ＣＲａＲｂ−、−Ｘ−ＣＨＲａ−、−Ｘ−Ｃ（ＨＣＨ３）−、−Ｏ−Ｙ−、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨＣＨ３−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３ＣＨ３）−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、ＯＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−，−Ｏ−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−Ｏ−ＮＣＨ２−、−Ｃ（＝ＣＨ２）−ＣＨ２−、−ＮＲａ−ＣＨ２−、Ｎ−Ｏ−ＣＨ２、−Ｓ−ＣＲａＲｂ−、および−Ｓ−ＣＨＲａ−からなる群より選択されるビラジカルを表す。
態様によっては、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−または−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−を表す。
式中、Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、および−Ｎ（Ｒａ）−より選択され、そして
ＲａおよびＲｂ（存在する場合）はそれぞれ独立して以下の群から選択される：水素、置換されていてもよいＣ１−６−アルキル、置換されていてもよいＣ２−６−アルケニル、置換されていてもよいＣ２−６−アルキニル、ヒドロキシ、置換されていてもよいＣ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルコキシアルキル、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル、Ｃ１−６−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノおよびジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキルアミノカルボニル、モノおよびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキルアミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲン（ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、２つの同じ原子に結合するジェミナル置換基ＲａおよびＲｂは共に置換されていてもよいメチレン（＝ＣＨ２）を表していてもよく、すべての対掌性中心について、不斉基はＲ配置またはＳ配置のいずれかで見られてもよい）。
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊ は独立して、以下からなる群より選択される：水素、置換されていてもよいＣ１−６−アルキル、置換されていてもよいＣ２−６−アルケニル、置換されていてもよいＣ２−６−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルコキシアルキル、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル、Ｃ１−６−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノおよびジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノカルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキルアミノカルボニル、モノおよびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキルアミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲン（ここで、アリールおよびヘテロアリールは置換基されていてもよく、２つの同じ原子に結合するジェミナル置換基は共にオキソ、チオキソ、イミノ、または置換基されていてもよいメチレンを表していてもよい）。
態様によっては、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊は独立して、Ｃ１−６アルキル（例えば、メチル）および水素より選択される。
態様によっては、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊はすべて水素である。
態様によっては、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はすべて水素であり、Ｒ５およびＲ５＊のどちらか一方も水素であり、Ｒ５およびＲ５＊の他方は水素以外、例えば、Ｃ１−６アルキル（例えば、メチル）である。
態様によっては、Ｒａは水素またはメチルのいずれかである。態様によっては、存在する場合、Ｒｂは水素またはメチルのいずれかである。
態様によっては、ＲａおよびＲｂの一方または両方は水素である。
態様によっては、ＲａおよびＲｂの一方は水素であり、他方は水素以外のものである。
態様によっては、ＲａおよびＲｂの一方はメチルであり、他方は水素である。
態様によっては、ＲａおよびＲｂはいずれもメチルである。
態様によってはビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊はすべて水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２、およびＷＯ２００４／０４６１６０に開示されており、引用によりそのすべてを本明細書に組み込む。これらの例としては、β−Ｄ−オキシＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシＬＮＡヌクレオシドとして一般に知られるものが挙げられる。
態様によっては、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｓ−ＣＨ２−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊はすべて水素である。このようなチオＬＮＡヌクレオシドはＷＯ９９／０１４２２６およびＷＯ２００４／０４６１６０で開示されており、その内容を参照により本明細書に組み込む。
態様によっては、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−ＮＨ−ＣＨ２−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊はすべて水素である。このようなアミノＬＮＡヌクレオシドはＷＯ９９／０１４２２６およびＷＯ２００４／０４６１６０に開示されており、その内容を参照により本明細書に組み込む。
態様によっては、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−または−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊はすべて水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ００／０４７５９９およびMorita et al, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12 73-76に開示されており、その内容を参照により本明細書に組み込む。これらの例としては、２’−Ｏ−４’−Ｃ−エチレン架橋型核酸（ＥＮＡ）として一般に知られているものが挙げられる。
態様によっては、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のすべてとＲ５およびＲ５＊の一方は水素であり、Ｒ５およびＲ５＊の他方は水素以外のもの、例えば、Ｃ１−６アルキル（例えば、メチル）である。このような５’−置換ＬＮＡヌクレオシドはＷＯ２００７／１３４１８１（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
態様によっては、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−である（式中、ＲａおよびＲｂの一方または両方は水素以外のもの、例えば、メチルであり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のすべてとＲ５およびＲ５＊の一方は水素であり、Ｒ５およびＲ５＊の他方は水素以外のもの、例えば、Ｃ１−６アルキル（例えば、メチル）である）。このようなビス修飾ＬＮＡヌクレオシドはＷＯ２０１０／０７７５７８（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
態様によっては、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、２価のリンカー基−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−を表す（２’−Ｏ−メトキシエチル二環式核酸−、Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81）。態様によっては、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、２価のリンカー基−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−を表す（２’−Ｏ−エチル二環式核酸−、Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81）。態様によっては、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨＲａ−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊はすべて水素である。このような６’−置換ＬＮＡヌクレオシドはＷＯ１００３６６９８およびＷＯ０７０９００７１（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）で開示されている。
態様によっては、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊はすべて水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドもまた当該分野で環式ＭＯＥ（ｃＭＯＥ）として知られており、ＷＯ０７０９００７１に開示されている。
態様によっては、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−はＲ−配置またはＳ−配置のいずれかで２価のリンカー基−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−を表す。態様によっては、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は共に、２価のリンカー基−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−を表す(Seth at al., 2010, J. Org. Chem)。態様によっては、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊はすべて水素である。このような６’−メチルＬＮＡヌクレオシドもまた当該分野でｃＥＴヌクレオシドとして知られており、ＷＯ０７０９００７１（β−Ｄ）およびＷＯ２０１０／０３６６９８（α−Ｌ）（いずれも、参照により本明細書に組み込まれる）で開示されているように（Ｓ）ｃＥＴまたは（Ｒ）ｃＥＴ立体異性体のいずかであってもよい。
態様によっては、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−である（式中、ＲａもＲｂも水素ではなく、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊はすべて水素である）。態様によっては、ＲａおよびＲｂはいずれもメチルである。このような６’−ジ−置換ＬＮＡヌクレオシドはＷＯ２００９００６４７８（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
態様によっては、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｓ−ＣＨＲａ−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊はすべて水素である。このような６’−置換チオＬＮＡヌクレオシドはＷＯ１１１５６２０２（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。６’−置換チオＬＮＡの態様によっては、Ｒａはメチルである。
態様によっては、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＲａＲｂ）−、例えば、−Ｃ（＝ＣＨ２）−ＣＨ２−、または−Ｃ（＝ＣＨ２）−ＣＨ（ＣＨ３）−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊はすべて水素である。このようなビニルカルボＬＮＡヌクレオシドはＷＯ０８１５４４０１およびＷＯ０９０６７６４７（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
態様によっては、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｎ（−ＯＲａ）−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊はすべて水素である。態様によっては、ＲａはＣ１−６アルキル（例えば、メチル）である。このようなＬＮＡヌクレオシドはまたＮ−置換ＬＮＡとして知られており、ＷＯ２００８／１５０７２９（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。態様によっては、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は共に、２価のリンカー基−Ｏ−ＮＲａ−ＣＨ３−を表す(Seth at al., 2010, J. Org. Chem)。態様によっては、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｎ（Ｒａ）−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊はすべて水素である。態様によっては、ＲａはＣ１−６アルキル（例えば、メチル）である。
態様によっては、Ｒ５およびＲ５＊の一方または両方は水素であり、置換されている場合、Ｒ５およびＲ５＊の他方はＣ１−６アルキル（例えば、メチル）である。このような態様では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はすべて水素であってもよく、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−または−Ｏ−Ｃ（ＨＣＲａ）−（例えば、−Ｏ−Ｃ（ＨＣＨ３）−）より選択されてもよい。
態様によっては、上記ビラジカルは−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−（例えば、ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−）であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊はすべて水素である。態様によっては、ＲａはＣ１−６アルキル（例えば、メチル）である。このようなＬＮＡヌクレオシドはまた、立体構造制限ヌクレオチド（ＣＲＮ）としても知られており、ＷＯ２０１３０３６８６８（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
態様によっては、上記ビラジカルは−Ｏ−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−（例えば、Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−）であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊はすべて水素である。態様によっては、ＲａはＣ１−６アルキル（例えば、メチル）である。このようなＬＮＡヌクレオシドはまた、ＣＯＣヌクレオチドとしても知られており、Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
特に断りがなければ、ＬＮＡヌクレオシドはβ−Ｄまたα−Ｌステレオアイソフォ−ム（stereoisoform）であってもよいことが認識される。
ＬＮＡヌクレオシドの特定の例をスキーム１に示す。
スキーム１
上記の例に示すように、本発明の好ましい態様では、オリゴヌクレオチドのＬＮＡヌクレオシドはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオシドである。
ヌクレアーゼ媒介分解
ヌクレアーゼ媒介分解は、相補的であるヌクレオチド配列と二本鎖を形成する際にそのような配列の分解を媒介することができるオリゴヌクレオチドに関する。
態様によっては、このオリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレアーゼ媒介分解により機能してもよい。ここで、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、好ましくはエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）（例えば、ＲＮａｓｅＨ）を動員することができる。ヌクレアーゼ媒介反応機構により働くオリゴヌクレオチド設計の例としては、典型的には少なくとも５個または６個のＤＮＡヌクレオシドの領域を含み、片側または両側で親和性が高められたヌクレオシド（例えば、ギャップマー、ヘッドマー、およびテイルマー）と隣接するオリゴヌクレオチドである。
ＲＮａｓｅＨの活性および動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅＨ活性は、相補的であるＲＮＡ分子と二本鎖になっている時にＲＮａｓｅを動員する能力を言う。ＷＯ０１／２３６１３は、ＲＮａｓｅＨ活性を決定する生体外での方法を提供する。これらを用いてＲＮａｓｅＨ動員能を決定してもよい。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的である標的核酸配列と共に供給された場合、その初期速度が実験対象の修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するがＤＮＡ単量体（すべての単量体はホスホロチオエート結合を有する）のみを含むオリゴヌクレオチドを用いて決定された初期速度（ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定される）の少なくとも１０％あるいは２０％を超えると、ＲＮａｓｅＨを動員することができると見なされる。この初期速度の決定は、ＷＯ０１／２３６１３の実施例９１〜９５に記載された手法（参照により本明細書に組み込む）を用いて行われる。
ギャップマー
本明細書で用いられる用語「ギャップマー」は、ＲＮａｓｅＨを動員するオリゴヌクレオチドの領域（ギャップ）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを言う。このギャップは、５’末端および３’末端で１つ以上の親和性増強修飾ヌクレオシド（隣接部、flank）と隣接している。様々なギャップマー設計が本明細書で記載される。ヘッドマーおよびテイルマーは、隣接部の一方がない、すなわち、オリゴヌクレオチドの両端の一方のみが親和性増強修飾ヌクレオシドを含むＲＮａｓｅＨを動員することができるオリゴヌクレオチドである。ヘッドマーは３’隣接部がない（すなわち、５’隣接部が親和性増強修飾ヌクレオシドを含む）のに対して、テイルマーは５’隣接部がない（すなわち、３’隣接部が親和性増強修飾ヌクレオシドを含む）。
ＬＮＡギャップマー
用語「ＬＮＡギャップマー」は、親和性増強修飾ヌクレオシドの少なくとも１つがＬＮＡヌクレオシドであるギャップマーオリゴヌクレオチドである。
混合ウィング型ギャップマー
用語「混合ウィング型ギャップマー」は、隣接部領域が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドと少なくとも１つの非ＬＮＡ修飾ヌクレオシドを含むＬＮＡギャップマーを言う。この非ＬＮＡ修飾ヌクレオシドは、例えば、少なくとも１つの２’−置換修飾ヌクレオシド（例えば、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、および２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシド）である。態様によっては、混合ウィング型ギャップマーは、ＬＮＡヌクレオシドを含む一方の隣接部（例えば、５’隣接部または３’隣接部）と、２’−置換修飾ヌクレオシドを含む他方の隣接部（３’隣接部または５’隣接部）を有する。
複合体
本明細書で用いられる用語「複合体」は、非ヌクレオチド部分（複合体部分、領域Ｃ、または第三の領域）に共有結合されたオリゴヌクレオチドを言う。
本発明のオリゴヌクレオチドを１つ以上の非ヌクレオチド部分に結合させると、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞の取り込み、または安定性に影響が及ぶことでオリゴヌクレオチドの薬効薬理が向上する場合がある。態様によっては、複合体部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、生物学的利用能、代謝、排出、透過率、および／または細胞取り込みを向上させることでオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を修飾または向上させてもよい。特に、複合体は、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織、または細胞種に向けて、これによりその器官、組織、または細胞種でオリゴヌクレオチドの有効性を向上させてもよい。同時に、複合体は、非標的細胞種、組織、または器官でオリゴヌクレオチドの活性（例えば、非標的の活性または非標的の細胞種組織、または器官の活性）を低下させる作用をしてもよい。ＷＯ９３／０７８８３およびＷＯ２０１３／０３３２３０は好適な複合体部分を提供しており、引用により本明細書に組み込まれる。ＷＯ２０１２／１４３３７９は、トランスフェリン受容体に対する親和性を有する抗体断片に結合させて、血液脳関門を越えて薬物を送達する方法が提供されており、引用により本明細書に組み込まれる。
オリゴヌクレオチド複合体およびこれらの合成はまた、Manoharan in Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 および Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103の総括で報告されており、それぞれ、引用により本明細書に組み込まれる。
一態様では、非ヌクレオチド部分（複合体部分）は、炭水化物、細胞表面受容体配位子、薬物物質、ホルモン、親油性物質、重合体、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、バクテリア毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）、あるいはこれらの組み合わせからなる群より選択される。態様によっては、非ヌクレオチド部分は、抗体または抗体断片、例えば、血液脳関門を越えての送達を容易にする抗体または抗体断片、特にトランスフェリン受容体を標的とする抗体または抗体断片である。
リンカー
結合またはリンカーは、１つ以上の共有結合を介して対象の一方の化学基または分節を対象の他方の化学基または分節に結合する２個の原子間の結合部を言う。結合部分は、オリゴヌクレオチドに直接あるいは結合部（例えば、リンカーまたはテザー（tether））を介して結合させることができる。リンカーは、第三の領域（例えば、複合体部分（領域Ｃ））を第一の領域（例えば、オリゴヌクレオチド（領域Ａ））に共有結合する作用がある。
本発明の態様によっては、本発明の複合体またはオリゴヌクレオチド複合体は、任意で、オリゴヌクレオチド（領域Ａすなわち第一の領域）と複合体部分（領域Ｃすなわち第三の領域）の間に位置するリンカー領域（第二の領域または領域Ｂおよび／または領域Ｙ）を含んでいてもよい。
領域Ｂは、通常、哺乳類の体内で曝される条件あるいはそれらに類似した条件下で切断可能な生理学的に不安定な結合を含む、またはそのような結合からなる生切断可能なリンカーを言う。生理学的に不安定なリンカーが化学変換（例えば、切断）を受ける条件としては、哺乳類細胞で見られるあるいは曝されるのに類似した、例えば、ｐＨ、温度、酸化または還元条件、酸化剤または還元剤、塩濃度などの化学条件が挙げられる。哺乳類の細胞内条件としてはまた、例えば、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、またはヌクレアーゼからなど、哺乳類細胞に通常存在する酵素活性の存在が挙げられる。一態様では、生切断可能なリンカーはＳ１ヌクレアーゼ切断を受けやすい。好ましい一態様では、ヌクレアーゼに敏感なリンカーは、１〜１０個のヌクレオシド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオシド、より好ましくは２〜６個のヌクレオシドを含む。最も好ましいのは、このリンカーは、少なくとも２つの連続したホスホジエステル結合（例えば、少なくとも３、４、または５つの連続したホスホジエステル結合）を含む２〜４個の結合ヌクレオシドを含む。ヌクレオシドはＤＮＡまたはＲＮＡであることが好ましい。生切断可能なリンカーを含むホスホジエステルについては、ＷＯ２０１４／０７６１９５（引用により本明細書に組み込まれる）でより詳細に記述されている。
領域Ｙは、必ずしも生切断可能ではないが、主に複合体部分（領域Ｃすなわち第三の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａすなわち第一の領域）に共有結合する作用をするリンカーを言う。領域Ｙリンカーは、繰り返し単位（例えば、エチレングリコール）の分子鎖構造あるいはオリゴマー、アミノ酸単位、またはアミノアルキル基を含んでいてもよい。本発明のオリゴヌクレオチド複合体は、以下の領域要素Ａ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｙ−Ｃ、Ａ−Ｙ−Ｂ−Ｃ、またはＡ−Ｙ−Ｃから構築されていてもよい。態様によっては、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ２−Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルであり、例えば、Ｃ６−Ｃ１２アミノアルキル基が挙げられる。好ましい一態様では、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。
対照
オリゴヌクレオチドの効果の測定に関連しても散られる場合の用語「対照」は、一般に、治療されない個体または標的細胞、あるいは標的しないオリゴヌクレオチド（模造物）で治療した個体または標的細胞を意味する。しかしながら、対照はまた、標準的な方法で治療した個体であってもよい。
治療
本明細書で用いられる用語「治療」は、既存病気（例えば、本明細書で言うところの病気または障害）の治療、または病気の防止すなわち予防を言う。従って、本明細書で言う治療は、態様によっては、予防的なものであってもよい。
発明の詳細な説明
標的
本発明の一側面は、ブタ、霊長類またはヒトＵＢＥ３Ａタンパク質の発現量を調節する、特に神経細胞、特にヒト神経細胞の父方ＵＢＥ３Ａの発現を増加させる。ヒトＵＢＥ３Ａタンパク質は、Uniprot nr. Q05086に示すいくつかのアイソフォ−ムで存在する。母方ＵＢＥ３Ａ遺伝子のいくつかの突然変異は、アンジェルマン症候群を発症させる場合がある。
本発明のオリゴヌクレオチドの標的核酸はＲＮＡ、特に、長鎖非翻訳性ＲＮＡである。本発明のオリゴヌクレオチドによって標的される長鎖非翻訳性ＲＮＡは、ヒトＳＮＨＧ１４（ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳとしても知られている、Ensembl entry number ENSG00000224078, バ−ジョンGRCh38.p2）である。特に、標的核酸は、染色体１５の位置２５２７８４１０から位置２５４１９４６２に対応するＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流の領域（配列番号１）である。アカゲザル(Macaca mulatta)では、ＵＢＥ３Ａ抑制因子は、Ensembl assembly MMUL 1.0を用いて染色体７の位置４２２２８４８から位置４３７３０８４（順方向一本鎖）に対応するＳＮＯＲＤ１０９Ａの下流の領域（配列番号２）として定義される。
態様によっては、標的核酸は配列番号１、またはその天然由来の多様体である。
特定の態様では、標的核酸は、ヒト（配列番号１）とアカゲザル（配列番号２）との間で保存されている領域に一致する。特定の態様では、標的核酸はヒト（配列番号１）、アカゲザル（配列番号２）、およびマウス（配列番号３）の間で保存されている領域に一致する。
特定の態様では、標的核酸は、ＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡ前駆体に対するアンチセンス領域である。この領域は、配列番号１の位置５５３１９から位置１４１０５３に対応する。
特定の態様では、標的核酸は、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流であり、ＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡ前駆体に対するアンチセンス領域の上流の領域である。この領域は配列番号１の位置１から位置５５３１９に対応する。
態様によっては、標的核酸は、生体外または生体内の細胞、例えば、哺乳類細胞、特に、ヒト細胞（標的細胞）に存在する。特定の態様では、標的細胞は神経細胞、好ましくはヒト神経細胞である。
標的配列は標的核酸の亜配列であってもよい。態様によっては、オリゴヌクレオチドは、ＵＢＥ３Ａのエクソン９、エクソン１０、エクソン１３、エクソン１４、イントロン１４、エクソン１５、イントロン１５、およびエクソン１６のアンチセンス領域からなる群より選択される亜配列を標的とする。態様によっては、このオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置５５３１９−７６２７４、７７４８３−７７５７３、９２１５７−９３４０３、および９７０５６−９７３５４からなる群より選択される一本鎖核酸分子にハイブリダイズする、あるいはそれと相補的である。態様によっては、このオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置６０８２１−６０８４９、７７５６７−７７５８３、９２３２３−９２３３９、および９７１５６−９７１７２からなる群より選択される一本鎖核酸分子にハイブリダイズする、あるいはそれと相補的である。
態様によっては、標的核酸は、配列番号１の位置９２００−９２５０に対応する領域である。
態様によっては、標的核酸は、配列番号１の位置１１５０５−１１５５５に対応する領域である。
態様によっては、標的核酸は、配列番号１の位置１５１００−１５１５０に対応する領域である。
態様によっては、標的核酸は、配列番号１の位置３０５９０−３０７４０に対応する領域である。
態様によっては、標的核酸は、配列番号１の位置４６３８０−４６４３０に対応する領域である。
本発明のオリゴヌクレオチド
本発明は、父方ＵＢＥ３Ａの発現、特に、神経細胞で発現する父方ＵＢＥ３Ａの誘導または上方調節を調節することができるオリゴヌクレオチドに関する。この調節は、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流の長鎖非翻訳性ＲＮＡのＳＮＨＧ１４転写物に位置する標的核酸にハイブリダイズすることで達成される。特定の態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは−１０ｋｃａｌ未満（例えば、−１０から−６０ｋｃａｌ、−１２から−４０、−１５から−３０ｋｃａｌ）あるいは−１６から−２７ｋｃａｌ（例えば、−１８から−２５ｋｃａｌ））のΔＧ°で配列番号１の標的核酸の亜配列にハイブリダイズする。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流のブタ、アカゲザル、および／またはヒトＳＮＨＧ１４転写物を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
態様によっては、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的の抑制因子を干渉または低減させることで標的の発現を調節することができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流のＳＮＨＧ１４転写物の分解または除去により細胞でＵＢＥ３Ａ発現、特に、神経細胞で父方ＵＢＥ３Ａ発現を誘導することが好ましい。態様によっては、本発明のオリゴヌクレオチドは、生理食塩水または標的しないオリゴヌクレオチドで治療した神経細胞のＵＢＥ３Ａの発現量と比べて少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、８０％、１００％、１２０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、または２５０％、ＵＢＥ３Ａの発現を増加させることができる。追加の態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、生理食塩水または標的しないオリゴヌクレオチドで治療した細胞のＳＮＯＲＤ１１５の量に比べて０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２５％、または３０％超、ＳＮＯＲＤ１１５の量を低減させずに、生理食塩水または標的しないオリゴヌクレオチドで治療した神経細胞のＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流のＳＮＨＧ１４転写物の量に比べて少なくとも２０％、より好ましくは、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流のＳＮＨＧ１４転写物（特に、ＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡ前駆体領域に対するアンチセンスである転写物の一部）の量を低減することができる。ＳＮＲＰＮおよびＳＮＯＲＤ１１６転写物は、ＳＮＯＲＤ１１５転写物の上流に位置する。その結果、ＳＮＯＲＤ１１５転写物がオリゴヌクレオチドによって低減されなければ、ＳＮＲＰＮおよびＳＮＯＲＤ１１６転写物もまた低減されない。さらなる一態様では、ＳＮＲＰＮおよびＳＮＯＲＤ１１６転写物の量は、生理食塩水または標的しないオリゴヌクレオチドで治療した細胞のＳＮＲＰＮおよびＳＮＯＲＤ１１６の量と比べて０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２５％、または３０％以上、低下しない。
標的の調節は、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列と標的核酸とのハイブリダイゼ−ションにより誘導される。態様によっては、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的核酸の不一致を含む。不一致にもかかわらず、それでも標的核酸へのハイブリダイゼ−ションは、ＵＢＥ３Ａ発現の所望の調節を示すには十分な場合がある。利点として、不一致による結合親和性の低下は、オリゴヌクレオチドヌクレオチド数の増加および／またはオリゴヌクレオチド配列内に存在して標的に対する結合親和性を高める修飾ヌクレオシド（例えば、ＬＮＡを含む２’−修飾ヌクレオシド）の数の増加で補える場合がある。
本発明の一側面は、ヒト染色体１５の位置２５２７８４１０から位置２５４１９４６２に少なくとも９０％（例えば、９５％、９８％、１００％）相補的である、１０〜３０個のヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、または３として示される標的核酸の領域と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または１００％）相補的な連続する配列を含む。
好ましい一態様では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１として示される標的核酸の領域に完全に相補的（１００％相補的）である。あるいは、態様によっては、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に１つまたは２つの不一致を含んでいてもよい。
態様によっては、オリゴヌクレオチド配列は、配列番号１および配列番号２に存在する対応する標的核酸領域と１００％相補的である。態様によっては、オリゴヌクレオチド配列は、配列番号１、２、および３に存在する対応する標的核酸領域と１００％相補的である。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１に存在する対応する標的核酸領域と少なくとも９０％、例えば、１００％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含み、この標的核酸領域は表１の領域Ａ１からＡ３６４９からなる群より選択される。

表１：本発明のオリゴヌクレオチドを用いて標的してもよい配列番号１の領域

態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１に存在する対応する標的核酸領域と少なくとも９０％、例えば、１００％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含み、この標的核酸領域は表２の領域Ｂ１からＢ４００からなる群より選択される。

表２：本発明のオリゴヌクレオチドを用いて標的してもよい配列番号１の領域

特定の態様では、オリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域（または亜配列）（または亜配列）に相補的であり、この標的核酸領域は配列番号１の位置１５８９〜１０８８９、４６０８９〜５３９８９、および６０７８９〜６２４８９からなる群より選択される。
一態様では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置５５３１９から位置１４１０５３の標的核酸配列に少なくとも９０％、例えば、１００％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
一態様では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置１から位置５５３１８の標的核酸配列に少なくとも９０％、例えば、１００％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置５５３１９〜７６２７４、７７４８３〜７７５７３、９２１５７〜９３４０３、および９７０５６〜９７３５４に対応する群より選択される標的核酸の亜配列と少なくとも９０％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置６０８２１〜６０８４９、７７５６７〜７７５８３、９２３２３〜９２３３９、および９７１５６〜９７１７２に対応する群より選択される標的核酸の亜配列に少なくとも９０％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置５２１８〜５２４０に対応する標的核酸の亜配列に少なくとも９０％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置５７８２〜５８０３に対応する標的核酸の亜配列に少なくとも９０％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置８１１３〜８１３９に対応する標的核酸の亜配列に少なくとも９０％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置９２００〜９２５０に対応する標的核酸の亜配列に少なくとも９０％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置１１５０５〜１１５５５に対応する標的核酸の亜配列に少なくとも９０％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置１３２２３〜１３２４２に対応する標的核酸の亜配列に少なくとも９０％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置１５１００〜１５１５０に対応する標的核酸の亜配列に少なくとも９０％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置１５１１３〜１５１８０に対応する標的核酸の亜配列に少なくとも９０％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置２９６３５〜２９７０５に対応する標的核酸の亜配列に少なくとも９０％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置３０５９０〜３０７４０に対応する標的核酸の亜配列に少なくとも９０％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置３９８００〜３９８５５に対応する標的核酸の亜配列に少なくとも９０％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置４４４３５〜４４４６０に対する標的核酸の亜配列に少なくとも９０％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置４５２４５〜４５２７０に対する標的核酸の亜配列に少なくとも９０％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置４６３８０〜４６４３０に対する標的核酸の亜配列に少なくとも９０％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置６８９１５〜６８９４０に対する標的核酸の亜配列に少なくとも９０％相補的である、ヌクレオチド長が１０〜３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド長が８〜３５個、例えば、連続するヌクレオチド長が１０〜３０個、１１〜２２個、１２〜１８個、１３〜１７個、または１４〜１６個のヌクレオチドを含む、あるいはそのようなヌクレオチドからなる。好ましい一態様では、オリゴヌクレオチドは、長さが１５〜２０個のヌクレオチド長を含む、あるいはそのようなヌクレオチドからなる。
態様によっては、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、２２個以下のヌクレオチド、例えば、２０個以下のヌクレオチド、１８個以下のヌクレオチド、例えば、１４、１５、１６、または１７個のヌクレオチドを含む、あるいはそのようなヌクレオチドからなる。本明細書で示す範囲はいずれも範囲の両終点を含むことを意味する。従って、オリゴヌクレオチドが１０〜３０個のヌクレオチドを含むと言う場合、１０個および３０個のヌクレオチドが含まれる。
態様によっては、連続ヌクレオチド配列は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の長さの連続するヌクレオチドを含む、あるいはそのようなヌクレオチドからなる。好ましい一態様では、オリゴヌクレオチドは、１６、１７、１８、または１９個の長さのヌクレオチドを含む、あるいはそのようなヌクレオチドからなる。
態様によっては、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、配列番号４〜１５０からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、１０〜３０個の長さのヌクレオチドを含む、あるいはそのようなヌクレオチドからなる（実施例の項の表３に示すモチーフ配列を参照のこと）。
態様によっては、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、配列番号４〜８１８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、１０〜３０個の長さのヌクレオチドを含む、あるいはそのようなヌクレオチドからなる（実施例の項の表３に示すモチーフ配列を参照のこと）。
態様によっては、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、配列番号４〜６７８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、１０〜３０個の長さのヌクレオチドを含む、あるいはそのようなヌクレオチドからなる（実施例の項の表３に示すモチーフ配列を参照のこと）。
態様によっては、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、配列番号１６６、１６７、１６７、または１６９からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、１０〜３０個の長さのヌクレオチドを含む、あるいはそのようなヌクレオチドからなる（実施例の項の表３に示すモチーフ配列を参照のこと）。
態様によっては、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、配列番号５７０、５７１、５７２、６７９、６８０、６８１、６８２、および６８３からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、１０〜３０個の長さのヌクレオチドを含む、あるいはそのようなヌクレオチドからなる（実施例の項の表３に示すモチーフ配列を参照のこと）。
態様によっては、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、配列番号３４、１８６、１８７、１８８、５７３、５７４、５７５、５７６、５７２、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、９６３、９６４、９６５、および６９６からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、１０〜３０個の長さのヌクレオチドを含む、あるいはそのようなヌクレオチドからなる（実施例の項の表３に示すモチーフ配列を参照のこと）。
態様によっては、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、配列番号３５、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０９、および２１０または配列番号５８２、５８３、および５８４からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、１０〜３０個の長さのヌクレオチドを含む、あるいはそのようなヌクレオチドからなる（実施例の項の表３に示すモチーフ配列を参照のこと）。
態様によっては、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、配列番号２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、６９８、６９９，７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、および７１８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、１０〜３０個の長さのヌクレオチドを含む、あるいはそのようなヌクレオチドからなる（実施例の項の表３に示すモチーフ配列を参照のこと）。
態様によっては、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、配列番号２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、および５９０からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、１０〜３０個の長さのヌクレオチドを含む、あるいはそのようなヌクレオチドからなる。
態様によっては、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、配列番号２４１、５９１、および７１９からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、１０〜３０個の長さのヌクレオチドを含む、あるいはそのようなヌクレオチドからなる（実施例の項の表３に示すモチーフ配列を参照のこと）。
態様によっては、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、配列番号（実施例の項の表３に示すモチーフ配列を参照のこと）４６、４７，４８、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６，６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、７８７、７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、７９４、７９５、７９６、７９７、７９８、７９９、８００、８００、８００、８００、８００、８０１、８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、および８０７からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、１０〜３０個の長さのヌクレオチドを含む、あるいはそのようなヌクレオチドからなる。
態様によっては、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、配列番号（実施例の項の表３に示すモチーフ配列を参照のこと）３３１、３３２、６３８、６３９、６４０、８０８、８０９、８１０、８１１、８１２、８１３、８１４、および８１５からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、１０〜３０個の長さのヌクレオチドを含む、あるいはそのようなヌクレオチドからなる。
態様によっては、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、配列番号（実施例の項の表３に示すモチーフ配列を参照のこと）４０９、４１０、４１１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、８１６、８１８、および８１８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、１０〜３０個の長さのヌクレオチドを含む、あるいはそのようなヌクレオチドからなる。
連続核酸塩基配列（モチーフ配列）は、例えば、ヌクレアーゼ耐性および／または標的核酸に対する結合親和性を高めるように修飾されていてもよいことを意味する。修飾は、定義および「オリゴヌクレオチド設計」の項で記述した通りである。表３は、各モチーフ配列の好ましい設計を示す。
オリゴヌクレオチド設計
オリゴヌクレオチド設計は、オリゴヌクレオチド配列でのヌクレオシド糖修飾のパタ−ンを言う。本発明のオリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドを含み、またＤＮＡヌクレオシドまたはＲＮＡヌクレオシドを含んでいてもよい。態様によっては、オリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドを含む。本発明のオリゴヌクレオチドに修飾ヌクレオシドを組み込むと、オリゴヌクレオチドの標的核酸に対する親和性が向上する場合がある。その場合、修飾ヌクレオシドは、親和性増強修飾ヌクレオチドと言う場合がある。
一態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の修飾ヌクレオシドを含む。一態様では、オリゴヌクレオチドは、１〜１０個の修飾ヌクレオシド、例えば、２〜９個、３〜８個、４〜７個、６〜７個の修飾ヌクレオシドを含む。態様によっては、これら修飾ヌクレオシドの少なくとも１個は、ロックされた核酸（ＬＮＡ）である。例えば、これら修飾ヌクレオシドの少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、または少なくとも８個はＬＮＡである。さらなる態様では、修飾ヌクレオシドはすべてＬＮＡである。
一態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、これら３種類の修飾（修飾糖、修飾核酸塩基、および修飾ヌクレオシド間結合）またはこれらの組み合わせより独立して選択される修飾を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、１種以上の糖修飾ヌクレオシド（例えば、２’−糖修飾ヌクレオシド）を含むことが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡ、およびＬＮＡヌクレオシドからなる群より独立して選択される１種以上の２’−糖修飾ヌクレオシドを含むことが好ましい。より好ましいのは、１種以上の修飾ヌクレオシドはＬＮＡである。
さらなる態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾ヌクレオシド間結合を含む。好ましい一態様では、連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合またはボラノホスフェート・ヌクレオシド間結合である。
態様によっては、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾ヌクレオシドを含み、この少なくとも１個の修飾ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の２’−ＭＯＥ−ＲＮＡヌクレオシド単位である。態様によっては、前記修飾ヌクレオシドの少なくとも１個は２’−フルオロＤＮＡ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の２’−フルオロ−ＤＮＡヌクレオシド単位である。
態様によっては、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のＬＮＡ単位、例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＬＮＡ単位、２〜６個のＬＮＡ単位、３〜７個のＬＮＡ単位、４〜８個のＬＮＡ単位、または３、４、５、６、または７個のＬＮＡ単位を含む。態様によっては、修飾ヌクレオシドはすべてＬＮＡヌクレオシドである。さらなる態様では、オリゴヌクレオチドは、β−Ｄ配置またはα−Ｌ配置のいずれか、またはこれらの組み合わせにおいてβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡと、以下のＬＮＡ単位、チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、および／またはＥＮＡの１つ種以上を共に含んでいてもよい。さらなる態様では、ＬＮＡシトシン単位はすべて５−メチルシトシンである。好ましい一態様では、オリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の５’末端に少なくとも１個のＬＮＡ単位を有し、３’末端に少なくとも２個のＬＮＡ単位を有する。
態様によっては、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のＬＮＡ単位と少なくとも１個の２’−置換修飾ヌクレオシドを含む。
本発明の態様によっては、オリゴヌクレオチドは、２’−糖修飾ヌクレオシドとＤＮＡ単位を両方含む。オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡおよびとＤＮＡ単位を両方含むことが好ましい。ＬＮＡおよびＤＮＡ単位の合計は、８〜３０個、例えば、１０〜２５個、好ましくは１２〜２２個、１２〜１８個、より好ましくは１１〜１６個であることが好ましい。本発明の態様によっては、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、連続ヌクレオチド配列）は、少なくとも１個または２個のＬＮＡ単位からなり、残りのヌクレオチド単位はＤＮＡ単位である。態様によっては、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオシドと天然由来のヌクレオシド（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ、最も好ましくはＤＮＡヌクレオシド）のみを含み、任意でホスホロチオエートなどの修飾ヌクレオシド間結合を有する。
本発明の一態様では、本発明のオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅＨを動員することができる。
ギャップマー設計
好ましい一態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマー設計または構造（本明細書では単に「ギャップマー」とも言う）を有する。ギャップマー構造では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの個別の構造領域、すなわち、５’→３’方向に５’隣接部、ギャップ、および３’隣接部のＦ−Ｇ−Ｆ’構造を有する。この設計では、隣接領域（ウィング領域とも言う）は、ＵＢＥ３Ａ標的核酸に相補的な、連続する修飾ヌクレオシド伸長部を含む。一方、ギャップ領域Ｇは、連続するヌクレオチド伸長部を含む。このヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが標的核酸と二本鎖になった時にヌクレアーゼ、好ましくはエンドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅＨなどのＲＮａｓｅ）を動員することができる。ヌクレアーゼ、特にＲＮａｓｅＨを動員することができるヌクレオシドは、ＤＮＡ、α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、２’−フルオロ−ＡＮＡ、およびＵＮＡからなる群より選択されてもよい。領域Ｇの５’末端および３’末端に隣接する領域ＦおよびＦ’は、好ましくは非ヌクレアーゼ動員ヌクレオシド（３’−エンド構造を有するヌクレオシド）、より好ましくは１つ以上の親和性増強修飾ヌクレオシドを含む。態様によっては、３’隣接部は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、好ましくは少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含む。態様によっては、５’隣接部は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む。態様によっては、５’−および３’隣接領域はいずれもＬＮＡヌクレオシドを含む。態様によっては、隣接領域のヌクレオシドはすべて、ＬＮＡヌクレオシドである。他の態様では、隣接領域は、ＬＮＡヌクレオシドと他のヌクレオシドの両方（例えば、ＤＮＡヌクレオシドおよび／または非ＬＮＡ修飾ヌクレオシド（例えば、２’−置換ヌクレオシド）を含んでいてもよい（混合型隣接部）。この場合、ギャップは、５’末端および３’末端で親和性増強修飾ヌクレオシド、好ましくはＬＮＡ（例えば、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ）と隣接する少なくとも５つのＲＮａｓｅＨ動員ヌクレオシド（２’−エンド構造を有するヌクレオシド、好ましくはＤＮＡ）の連続配列として定義される。その結果、ギャップ領域に隣接する５’隣接領域のヌクレオシドと３’隣接領域は修飾ヌクレオシド、好ましくは非ヌクレアーゼ動員ヌクレオシドである。隣接部がＤＮＡを含む混合型隣接部を有するオリゴヌクレオチドでは、５’ヌクレオシドおよび３’ヌクレオシドは修飾ヌクレオシドである。
領域Ｆ
領域Ｇの５’末端に結合した領域Ｆ（５’隣接部または５’ウィング）は、少なくとも１個の修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個の修飾ヌクレオシドを含む、含有する、あるいはそれらからなる。一態様では、領域Ｆは、１〜７個の修飾ヌクレオシド、例えば、２〜６個の修飾ヌクレオシド、２〜５個の修飾ヌクレオシド、２〜４個の修飾ヌクレオシド、１〜３個の修飾ヌクレオシド（例えば、１、２、３、または４個の修飾ヌクレオシド）を含む、またはそれらからなる。さらなる態様では、好ましくは１、２、または３個のヌクレオシド単位（例えば、ＤＮＡヌクレオシド）を含む領域Ｄを表すさらなるヌクレオシドを領域Ｆの５’末端に結合させてもよい。領域Ｄは、「リンカー」の定義で記載した生切断可能な（Ｂ）リンカーの機能を果たすことができる。
態様によっては、領域Ｆの修飾ヌクレオシドは３’−エンド構造を有する。
一態様では、領域Ｆの１つ以上の修飾ヌクレオシドは２’−修飾ヌクレオシドである。
さらなる態様では、領域Ｆの１つ以上の２’−修飾ヌクレオシドは、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、および２’−フルオロ−ＡＮＡ単位より選択される。
本発明の一態様では、領域Ｆの修飾ヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。さらなる態様では、領域ＦのＬＮＡヌクレオシドは独立して、β−Ｄ配置またはα−Ｌ配置のいずれか、あるいはこれらの組み合わせにおけるオキシ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、ｃＥＴ、および／またはＥＮＡからなる群より選択される。好ましい一態様では、領域Ｆは、連続配列の５’末端に少なくとも１個のβ−オキシＬＮＡ単位を有する。
領域Ｇ
領域Ｇ（ギャップ領域）は、少なくとも４個、例えば、少なくとも５個、例えば、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の上記ヌクレアーゼ、特にＲＮａｓｅＨを動員することができる連続したヌクレオシドを含む、含有する、またはこれらからなることが好ましい。さらなる態様では、領域Ｇは、上記ヌクレアーゼを動員することができる５〜１２個、６〜１０個、７〜９個（例えば、８個）の連続したヌクレオチド単位を含む、含有する、またはこれらからなる。
一態様では、ヌクレアーゼを動員することができる領域Ｇのヌクレオシド単位は、ＤＮＡ、α−Ｌ−ＬＮＡ、Ｃ４’−アルキル化ＤＮＡからなる群より選択される（PCT/EP2009/050349およびVester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296-2300, both incorporated herein by reference), arabinose derived nucleosides like ANA and 2'F-ANA (Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661), UNA (unlocked nucleic acid)（Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039に記載されている。これらは引用により本明細書に組み込まれる）。ＵＮＡは、ロックされていない核酸であり、典型的には、リボースのＣ２とＣ３の間の結合が除去されて、ロックされていない「糖」残基を形成している。
さらなる一態様では、領域Ｇの少なくとも１個のヌクレオシド単位は、ＤＮＡヌクレオシド単位、例えば、１〜１６個のＤＮＡ単位、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のＤＮＡ単位、好ましくは、２〜１３個のＤＮＡ単位（例えば、４〜１２個のＤＮＡ単位）、より好ましくは、５〜１１個、１０〜１６個、１１〜１５個、または１２〜１４個のＤＮＡ単位である。態様によっては、領域Ｇは１００％、ＤＮＡ単位からなる。好ましい一態様では、Ｇは、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のＤＮＡ単位からなる。
さらなる態様では、領域Ｇは、ＤＮＡおよびＲＮａｓｅＨ切断を媒介することができる他のヌクレオシドの混合物からなっていてもよい。領域Ｇは、少なくとも５０％のＤＮＡ、より好ましくは６０％、７０％、または８０％のＤＮＡ、さらにより好ましくは９０％または９５％のＤＮＡからなっていてもよい。
さらなる一態様では、領域Ｇの少なくとも１個のヌクレオシド単位は、α−Ｌ−ＬＮＡヌクレオシド単位、例えば、少なくとも１個のα−Ｌ−ＬＮＡ単位、例えば、２、３、４、５、６、７、８または９個のα−Ｌ−ＬＮＡ単位である。さらなる態様では、領域Ｇは上記少なくとも１個のα−Ｌ−ＬＮＡを含み、上記少なくとも１個のα−Ｌ−ＬＮＡはα−Ｌ−オキシＬＮＡ単位である。さらなる態様では、領域Ｇは、ＤＮＡとα−Ｌ−ＬＮＡヌクレオシド単位の組み合わせを含む。
態様によっては、領域Ｇの連続配列の大きさは、これより大きい１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のヌクレオシド単位であってもよい。
態様によっては、領域Ｇのヌクレオシドは２’−エンド構造を有する。
領域Ｆ’
領域Ｇの３’末端に結合させた領域Ｆ’（３’隣接部または３’ウィング）は、少なくとも１個の修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個の修飾ヌクレオシドを含む、含有する、あるいはそれらからなる。一態様では、領域Ｆ’は、１〜７個の修飾ヌクレオシド、例えば、２〜６個の修飾ヌクレオシド、２〜４個の修飾ヌクレオシド、１〜３個の修飾ヌクレオシド、１、２、３、または４個の修飾ヌクレオシドを含む、あるいはそれらからなる。さらなる態様では、領域Ｄを表す、領域Ｆ’の３’末端に結合させたさらなるヌクレオシドを含む。領域Ｄは、１、２、または３個のヌクレオシド単位（例えば、ＤＮＡヌクレオシド）を含むことが好ましい。領域Ｄ’は、「リンカー」の項で記載した生切断可能な（Ｂ）リンカーの機能を果たすことができる。
態様によっては、領域Ｆ’の修飾ヌクレオシドは３’−エンド構造を有する。
好ましい一態様では、領域Ｆ’の修飾ヌクレオシドはＬＮＡである。
さらなる態様では、領域Ｆ’の修飾ヌクレオシドは２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、および２’−フルオロ−ＡＮＡ単位より選択される。
本発明の一態様では、領域Ｆ’の修飾ヌクレオシドはすべてＬＮＡヌクレオシドである。さらなる態様では、領域Ｆ’のＬＮＡヌクレオシドは独立して、β−Ｄ配置またはα−Ｌ配置のいずれか、あるいはこれらの組み合わせにおけるオキシ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、ｃＥＴおよび／またはＥＮＡからなる群より選択される。好ましい一態様では、領域Ｆ’は連続配列の３’末端に少なくとも２個のβ−Ｄ−オキシＬＮＡ単位を有する。
領域ＤおよびＤ’
領域ＤおよびＤ’はそれぞれ、領域Ｆの５’末端または領域Ｆ’の３’末端に結合させてもよい。
領域ＤおよびＤ’は独立して、１、２、３、４、または５個の追加のヌクレオチドを含んでいてもよい。これらの追加のヌクレオチドは標的核酸に相補的であってもなくてもよい。この点で、態様によっては、本発明のオリゴヌクレオチドは、５’末端および／または３’末端に追加のヌクレオチドが隣接する標的を調節することができる連続ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。このような追加のヌクレオチドは、ヌクレアーゼに敏感な生切断可能なリンカー（リンカーの定義を参照のこと）として作用してもよい。態様によっては、追加の５’末端ヌクレオチドおよび／または３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で結合されており、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。他の態様では、追加の５’末端ヌクレオチドおよび／または３’末端ヌクレオチドは、例えば、ヌクレアーゼ安定性を向上させる、あるいは合成を容易にするために含まれていてもよい修飾ヌクレオチドである。一態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄおよび／またはＤ’を含む。
本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは下記式で表すことができる。
Ｆ−Ｇ−Ｆ’、特にＦ１−７−Ｇ４−１２−Ｆ’１−７
Ｄ−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、特にＤ１−３−Ｆ１−７−Ｇ４−１２−Ｆ’１−７
Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’、特にＦ１−７−Ｇ４−１２−Ｆ’１−７−Ｄ’１−３
Ｄ−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’、特にＤ１−３−Ｆ１−７−Ｇ４−１２−Ｆ’１−７−Ｄ’１−３
領域Ｆ、ＧおよびＦ’、ＤおよびＤ’のヌクレオシドの好ましい数および種類は上で記載した。また、ＵＢＥ３Ａの発現を調節するのに用いる場合、個別のオリゴヌクレオチド設計は、オリゴヌクレオチドの特性に大きな影響を及ぼす可能性がある。
態様によっては、オリゴヌクレオチドは長さが１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のヌクレオチドからなるギャップマーであり、領域ＦおよびＦ’のそれぞれは独立して、ＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡ前駆体（標的核酸）に対するアンチセンスであるヒトＳＮＨＧ１４長鎖非翻訳性ＲＮＡの一部に相補的な２、３、または４個の修飾ヌクレオシド単位からなる。領域Ｇは、標的核酸と二本鎖になっている時にヌクレアーゼを動員することができる１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のヌクレオシド単位からなる。
さらなる一態様では、オリゴヌクレオチドは、領域ＦおよびＦ’のそれぞれが独立して、２、３、４、または５個の修飾ヌクレオシド単位（例えば、２’−Ｏ−メトキシエチルリボース糖（２’−ＭＯＥ）を含むヌクレオシド単位）あるいは２’−フルオロ−デオキシリボース糖および／またはＬＮＡ単位を含むヌクレオシド単位からなり、領域Ｇが９、１０、１１、１２，１３、１４、または１５個のヌクレオシド単位（例えば、ＤＮＡ単位）、あるいは他のヌクレアーゼ動員ヌクレオシド（例えば、α−Ｌ−ＬＮＡ、またはＤＮＡとヌクレアーゼ動員ヌクレオシドの混合物）からなるギャップマーである。
特定の一態様では、オリゴヌクレオチドは、領域ＦおよびＦ’領域のそれぞれが２つのＬＮＡ単位からなり、領域Ｇが１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のヌクレオシド単位、好ましくはＤＮＡ単位からなるギャップマーである。このような性質の特定のギャップマー設計は、２−１０−２、２−１１−２、２−１２−２、２−１３−２、２−１４−２、および２−１５−２を含む。
特定の一態様では、オリゴヌクレオチドは、領域ＦおよびＦ’のそれぞれが独立して３個のＬＮＡ単位からなり、領域Ｇが１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のヌクレオシド単位、好ましくはＤＮＡ単位からなるギャップマーである。このような性質の特定のギャップマー設計は、３−１０−３、３−１１−３、３−１２−３、３−１３−３、３−１４−３、および３−１５−３を含む。
特定の一態様では、オリゴヌクレオチドは、領域ＦおよびＦ’のそれぞれが４個のＬＮＡ単位からなり、領域Ｇが１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のヌクレオシド単位、好ましくはＤＮＡ単位からなるギャップマーである。このような性質の特定のギャップマー設計は、４−１０−４、４−１１−４、４−１２−４、４−１３−４、４−１４−４、および４−１５−４を含む。
このような性質の特定のギャップマー設計は、１０個のヌクレオシドを有するギャップ、および独立して１〜４個の修飾ヌクレオシドのウィングにからなる群より選択されるＦ−Ｇ−Ｆ’設計を含み、例えば、１−１０−１、２−１０−１、１−１０−２、１−１０−３、３−１０−１、１−１０−４、４−１０−１、２−１０−２、２−１０−３、３−１０−２、２−１０−４、４−１０−２、３−１０−３、３−１０−４、４−１０−３、および４−１０−４ギャップマーが挙げられる。
このような性質の特定のギャップマー設計は、１１個ヌクレオシドを有するギャップ、および独立して１〜４個の修飾ヌクレオシドのウィングからなる群より選択されるＦ−Ｇ−Ｆ’設計を含み、例えば、１−１１−１、２−１１−１、１−１１−２、１−１１−３、３−１１−１、１−１１−４、４−１１−１、２−１１−２、２−１１−３、３−１１−２、２−１１−４、４−１１−２、３−１１−３、３−１１−４、４−１１−３、および４−１１−４ギャップマーが挙げられる。
このような性質の特定のギャップマー設計は、１２個のヌクレオシドを有するギャップからなる群より選択されるＦ−Ｇ−Ｆ’設計を含み、例えば、１−１２−１、２−１２−１、１−１２−２、１−１２−３、３−１２−１、１−１２−４、４−１２−１、２−１２−２、２−１２−３、３−１２−２、２−１２−４、４−１２−２、３−１２−３、３−１２−４、４−１２−３、および４−１２−４ギャップマーが挙げられる。
このような性質の特定のギャップマー設計は、１３個のヌクレオシドを有するギャップ、および独立して１〜４個の修飾ヌクレオシドのウィングからなる群より選択されるＦ−Ｇ−Ｆ’設計を含み、例えば、１−１３−１、１−１３−２、１−１３−３、３−１３−１、１−１３−４、４−１３−１、２−１３−１、２−１３−２、２−１３−３、３−１３−２、２−１３−４、４−１３−２、３−１３−３、３−１３−４、４−１３−３、および４−１３−４ギャップマーが挙げられる。
このような性質の特定のギャップマー設計は、１４個のヌクレオシドを有するギャップ、および独立して１〜４個の修飾ヌクレオシドのウィングからなる群より選択されるＦ−Ｇ−Ｆ’設計を含み、例えば、１−１４−１、１−１４−２、２−１４−１、１−１４−３、３−１４−１、１−１４−４、４−１４−１、２−１４−２、２−１４−３、３−１４−２、２−１４−４、４−１４−２、３−１４−３、３−１４−４、および４−１４−３ギャップマーが挙げられる。
このような性質の特定のギャップマー設計は、１５個のヌクレオシドを有するギャップ、および独立して１〜４個の修飾ヌクレオシドのウィングからなる群より選択されるＦ−Ｇ−Ｆ’設計を含み、例えば、１−１５−１、１−１５−２、２−１５−１、１−１５−３、３−１５−１、１−１５−４、４−１５−１、２−１５−２、２−１５−３、３−１５−２、２−１５−４、４−１５−２、３−１５−３、３−１５−４、および４−１５−３ギャップマーが挙げられる。
このような性質の特定のギャップマー設計は、１６個のヌクレオシドを有するギャップ、および独立して１〜４個の修飾ヌクレオシドのウィングからなる群より選択されるＦ−Ｇ−Ｆ’を含み、例えば、１−１６−１、１−１６−２、２−１６−１、１−１５−３、３−１６−１、１−１６−４、４−１６−１、２−１６−２、２−１６−３、３−１６−２、２−１６−４、４−１６−２、３−１６−３、３−１６−４、および４−１６−３ギャップマーが挙げられる。
態様によっては、Ｆ−Ｇ−Ｆ’設計は２−１０−４、３−１０−３、および４−１０−２より選択される。
態様によっては、Ｆ−Ｇ−Ｆ’設計は２−１１−４、３−１１−２、３−１１−３、および４−１１−２より選択される。
態様によっては、Ｆ−Ｇ−Ｆ’設計は２−１２−２、２−１２−３、２−１２−４、３−１２−２、３−１２−３、および４−１２−２より選択される。
態様によっては、Ｆ−Ｇ−Ｆ’設計は２−１３−２、２−１３−３、２−１３−４、３−１３−３、および４−１３−２より選択される。
態様によっては、Ｆ−Ｇ−Ｆ’設計は２−１４−２、２−１４−４、３−１４−３、および４−１４−２より選択される。
態様によっては、Ｆ−Ｇ−Ｆ’設計は２−１５−２および２−１６−２より選択される。
態様によっては、Ｆ−Ｇ−Ｆ’設計は表３に示す設計より選択される。
すべての例で、Ｆ−Ｇ−Ｆ’設計は、１、２、または３個のヌクレオシド単位（例えば、ＤＮＡ単位）を有していてもよい領域Ｄおよび／またはＤ’をさらに含んでいてもよい。領域ＦおよびＦ’のヌクレオシドは修飾ヌクレオシドであり、領域Ｇのヌクレオチドは好ましくは無修飾ヌクレオシドであることが好ましい。
各設計で、好ましい修飾ヌクレオシドはＬＮＡである。
他の態様では、ギャップマーのギャップのヌクレオシド間結合はすべてホスホロチオエート結合および／またはボラノホスフェート結合である。他の態様では、ギャップマーの隣接部（領域ＦおよびＦ’）のヌクレオシド間結合はすべてホスホロチオエート結合および／またはボラノホスフェート結合である。他の好ましい一態様では、ギャップマーの領域ＤおよびＤ’のヌクレオシド間結合はすべてホスホジエステル結合である。
本明細書で開示される特定のギャップマーでは、シトシン（Ｃ）残基は５−メチルシトシンとして示され、様々な態様において、オリゴヌクレオチドに存在する１つ以上のＣは無修飾Ｃ残基であってもよい。
さらに、ギャップマー設計は、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ２００７／１４６５１１に開示されており、引用により本明細書に組み込まれる。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、表３のオリゴヌクレオチド化合物の群より選択される。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号４＿１から１５０＿２を有するオリゴヌクレオチド化合物の群より選択される。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号４＿１から６７８＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物の群より選択される。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号４＿１から８１８＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物（実施例の表３に示すオリゴヌクレオチド配列を参照のこと）の群より選択される。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号１５５＿１または１６５＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物である。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号１６９＿５２、１６９＿５０、または１６９＿５６を有するオリゴヌクレオチド化合物の群より選択される。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号１７２＿１、２７２＿１、５７２＿７、５７２＿６、または５７２＿５を有するオリゴヌクレオチド化合物の群より選択される。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号１７５＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物である。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号１７８＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物である。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号５７３＿８、１８６＿１、または１８７＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物の群より選択される。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号１８６＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物である。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号２００＿１、２０４＿１、２０６＿１、３５＿２、または２０９＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物の群より選択される。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号５８５＿１、５８５＿８、５８６＿９、５８６＿５、５８６＿８、５８６＿４、または５８６＿６を有するオリゴヌクレオチド化合物の群より選択される。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号２３３＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物である。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号２３７＿８または５９０＿１３を有するオリゴヌクレオチド化合物である。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号２２０＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物である。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号５９１＿１、５９２＿２、５９２＿４、または２４１＿９を有するオリゴヌクレオチド化合物の群より選択される。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号５９７＿４、５９８＿４、３９＿１、または６０２＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物の群より選択される。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号３９＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物である。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号６１１＿７を有するオリゴヌクレオチド化合物である。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号２７１＿１または２７８＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物である。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号６１６＿４、６２１＿２、６２１＿１、６２２＿３、６２２＿５、６２２＿４、６２４＿３、６２４＿５、２８７＿１、６２５＿６、６２６＿７、６２６＿８、６２６＿９、４８＿１、６３１＿６、６３１＿１、３０３＿１、３０４＿６、または３０４＿１０を有するオリゴヌクレオチド化合物の群より選択される。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号６３６＿８を有するオリゴヌクレオチド化合物である。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号６３８＿８、６３９＿５、３３１＿１、または６４０＿４を有するオリゴヌクレオチド化合物の群より選択される。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号３５９＿１、３６１＿１、３６１＿５、３６２＿１、または６４１＿５を有するオリゴヌクレオチド化合物の群より選択される。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号３７８＿１、３７９＿１、３９９＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物の群より選択される。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号４０３＿１、４０５＿１、６４２＿１２、６４２＿１３、６４４＿３、または６４６＿１６を有するオリゴヌクレオチド化合物の群より選択される。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号８５＿１または４２５＿５を有するオリゴヌクレオチド化合物である。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号１１６＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物である。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号１２３＿１または１２４＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物である。
本発明の特定の態様で、オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号１２６＿２を有するオリゴヌクレオチド化合物である。
製造方法
さらなる側面では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供する。この方法は、ヌクレオチド単位を反応させて、これにより上記オリゴヌクレオチドに含まれる共有結合した連続ヌクレオチド単位を形成することを含む。この方法は、ホスホロアミダイト化学（例えば、Caruthers et al, 1987, Methods in Enzymology vol. 154, pages 287-313を参照のこと）を使用することが好ましい。さらなる態様では、この方法は、連続ヌクレオチド配列を結合部分（配位子）と反応させることをさらに含む。さらなる側面では、本発明の組成物を製造する方法が提供される。この方法は、本発明のオリゴヌクレオチドまたは複合オリゴヌクレオチドを医薬的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩、および／または補助剤と混合することを含む。
医薬組成物
さらなる側面では、本発明は、上記オリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド複合体のいずれか、ならびに医薬的に許容される希釈剤、担体、塩、および／または補助剤含む医薬組成物を提供する。医薬的に許容される希釈剤としてはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。医薬的に許容される塩としては、ナトリウム塩およびカリウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。
ＷＯ２００７／０３１０９１は、医薬的に許容される希釈剤、担体、および補助剤の好適で好ましい例を示す（参照により本明細書に組み込む）。好適な投与量、製剤、投与経路、組成、投与形態、他の治療薬との組み合わせ、プロドラッグ製剤もまた、ＷＯ２００７／０３１０９１に示されている。
医薬組成物または製剤の調製のため、本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド複合体を医薬的に許容される活性物質または不活性物質と混合してもよい。医薬組成物の製剤のための組成および方法は、複数の基準に依存する。そのような基準としては、例えば、投与経路、病気の程度、投与量などが挙げられるが、これらに限定されない。
態様によっては、本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド複合体はプロドラッグである。特に、オリゴヌクレオチド複合体に関して、一旦プロドラッグが作用部位（例えば、標的細胞）に送達されると、複合体部分はオリゴヌクレオチドから切断される。
用途
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、治療および予防のための研究用試薬として用いてもよい。
研究では、具体的には、そのようなオリゴヌクレオチドを用いて細胞（例えば、生体外での細胞培養物）および実験動物でのＵＢＥ３Ａタンパク質の合成を調節してもよく、これにより標的の機能分析または治療的介入のための標的としての有用性の評価を容易にする。標的の調節は、タンパク質を産生する遺伝子またはｍＲＮＡの調節剤を分解あるいは阻害することで達成される。
治療法としては、病気または障害を有すると疑われる動物またはヒトを、ＵＢＥ３Ａの発現を調節することで治療してもよい。
本発明は、病気を治療または予防する方法を提供する。この方法は、病気に罹っているあるいはその疑いがある治療対象に本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド複合体、または医薬組成物を治療的または予防的に有効量投与することを含む。
本発明はまた、薬剤として使用するための本明細書で規定したオリゴヌクレオチド、組成物、または複合体に関する。
本発明による、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド複合体、または医薬組成物は典型的には有効量投与される。
本発明はまた、本明細書で言うところの障害の治療のための薬剤の製造、あるいは本明細書で言うところの障害の治療方法について記載したような本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド複合体の使用を提供する。
本明細書で言うところの病気または障害は、ＵＢＥ３Ａの発現に関連付けられる。態様によっては、この病気または障害は、母方ＵＢＥ３Ａ遺伝子の突然変異に関連付けられる場合がある。態様によっては、標的核酸は父方ＵＢＥ３Ａ遺伝子の制御因子である。
本発明の方法は、ＵＢＥ３Ａの異常量および／または異常活性によって生じる病気に対する治療または予防に用いられることが好ましい。この病気は、特に、ＵＢＥ３Ａタンパク質の量および／または活性が低減することで生じる場合がある。
本発明はさらに、ＵＢＥ３Ａの異常量および／または異常活性、特にＵＢＥ３Ａの量および／または活性が小さい場合の治療のための薬剤を製造するために本明細書で規定されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド複合体、または医薬組成物の使用に関する。
一態様では、本発明は、アンジェルマン症候群の治療に用いるためのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド複合体、または医薬組成物の使用に関する。
投与
本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、局所投与（例えば、皮膚投与、吸入、経眼投与、または経耳投与）、腸内投与（例えば、経口投与または胃腸管を通して）、あるいは非経口投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、脳内投与、脳室内投与、または髄腔内投与）により投与されてもよい。
好ましい一態様では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、非経口投与経路で投与される。このような経路としては、静脈内注射あるいは点滴、動脈内注射あるいは点滴、皮下注射あるいは点滴、腹腔内注射あるいは点滴、または筋肉内注射あるいは点滴、髄腔内投与または頭蓋内投与（例えば、脳内投与または心室内投与）が挙げられる。一態様では、活性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド複合体は、脳内投与または脳室内投与で投与される。他の態様では、活性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド複合体は髄腔内投与で投与される。
本発明はまた、髄腔内投与用の投与形態である薬剤の製造で記載した本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド複合体の使用を提供する。
本発明はまた、脳内投与または心室内投与用の投与形態である薬剤の製造で記載した本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド複合体の使用を提供する。
本発明はまた、脳室内投与用の投与形態である薬剤の製造で記載した本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド複合体の使用を提供する。
組み合わせ治療
態様によっては、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド複合体、または医薬組成物は、他の治療薬との組み合わせ治療に用いられる。この治療薬は、例えば、鎮痙剤であってもよい。
実施態様
本発明の以下の実施態様は、本明細書に記載の全ての他の実施態様と組み合わせて用いてもよい。
１．特に神経細胞でのヒト父方ＵＢＥ３Ａ発現を含むことが可能な、１０から３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか、あるいはこの配列からなる、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
２．前記連続ヌクレオチド配列はヒト１５番染色体の位置２５２７８４１０から位置２５４１９４６２に相当するＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流のヒトのＳＮＨＧ１４長鎖非コードＲＮＡの部分と少なくとも９５％の相補性を持つ実施態様１のオリゴヌクレオチド。
３．前記オリゴヌクレオチドが１０ｋｃａｌ未満の△Ｇ°を持つ配列番号１の標的核酸にハイブリダイズ可能な、実施態様１または２のオリゴヌクレオチド。
４．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号１および／または配列番号２の標的核酸領域と少なくとも９５％、例えば９８％、例えば１００％相補性を持つ、実施態様１から３のオリゴヌクレオチド。
５．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置１から位置５５３１８の標的核酸の領域と１００％相補性を持つ実施態様１から３のオリゴヌクレオチド。
６．前記連続ヌクレオチド配列は、表１または表２に示された領域からなる群から選ばれる、標的核酸の部分配列と相補性を持つ、実施態様１から４のオリゴヌクレオチド。
７．前記連続ヌクレオチド配列は、ＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡ前駆体に対してアンチセンスであるヒトＳＮＨＧ１４長鎖非コードＲＮＡの部分と少なくとも９８％相補性を持つ、実施態様１から４のオリゴヌクレオチド。
８．オリゴヌクレオチドは１０ｋｃａｌ未満の△Ｇ°を持つ配列番号１の位置５５３１９から位置１４１０５３に相当する標的核酸にハイブリダイズ可能な、実施態様１から４、または７のオリゴヌクレオチド。
９．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置５５３１９から位置１４１０５３の標的核酸の領域と１００％相補性を持つ、実施態様１から４、または７から８のオリゴヌクレオチド。
１０．前記標的核酸はＲＮＡである、実施態様１から８のオリゴヌクレオチド。
１１．前記ＲＮＡは長鎖非コードＲＮＡである、実施態様１０のオリゴヌクレオチド。
１２．前記連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１０個の連続ヌクレオチド、特に１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９個の連続ヌクレオチドを含むか、この連続ヌクレオチドからなる、実施態様１から１１のオリゴヌクレオチド。
１３．前記連続ヌクレオチド配列は、１２から２２個のヌクレオチドを含むか、これらのヌクレオチドからなる、実施態様１から１２のオリゴヌクレオチド。
１４．前記連続ヌクレオチド配列が、１５から２０個のヌクレオチドを含むか、これらのヌクレオチドからなる、実施態様１３のオリゴヌクレオチド。
１５．前記オリゴヌクレオチドは、１０から３５ヌクレオチド長を含むか、このヌクレオチド長からなる、実施態様１から１４のオリゴヌクレオチド。
１６．前記オリゴヌクレオチドは、１５から２４ヌクレオチド長を含むか、このヌクレオチド長からなる、実施態様１５のオリゴヌクレオチド。
１７．前記オリゴヌクレオチドが、１７から２２ヌクレオチド長を含むか、このヌクレオチド長からなる、実施態様１５または１７のオリゴヌクレオチド。
１８．前記オリゴヌクレオチドまたは前記連続ヌクレオチド配列は１本鎖である実施態様１から１７のオリゴヌクレオチド。
１９．前記連続ヌクレオチド配列は、表１または２に示す領域からなる群から選ばれる標的核酸の部分配列と相補性を持つ実施態様１から１８のオリゴヌクレオチド。
２０．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置１５８９から位置１０８８９、位置４６０８９から位置５３９８９、および位置６０７８９から位置６２４８９からなる群から選ばれる標的核酸の部分配列と１００％相補性を持つ、実施態様１から１８のオリゴヌクレオチド。
２１．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置５２１８から位置５２４０に相当する標的核酸の部分配列と相補性を持つ、実施態様１から１８のオリゴヌクレオチド。
２２．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置５７８２から位置５８０３に相当する標的核酸の部分配列と相補性を持つ、実施態様１から１８のオリゴヌクレオチド。
２３．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置８１１３から位置８１３９に相当する標的核酸の部分配列と相補性を持つ、実施態様１から１８のオリゴヌクレオチド。
２４．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置９２００から位置９２５０に相当する標的核酸の部分配列と相補性を持つ、実施態様１から１８のオリゴヌクレオチド。
２５．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置１１５０５から位置１１５５５に相当する標的核酸の部分配列と相補性を持つ、実施態様１から１８のオリゴヌクレオチド。
２６．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置１３２２３から位置１３２４２に相当する標的核酸の部分配列と相補性を持つ、実施態様１から１８のオリゴヌクレオチド。
２７．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置１５１００から位置１５１５０に相当する標的核酸の部分配列と相補性を持つ、実施態様１から１８のオリゴヌクレオチド。
２８．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置１５１１３から位置１５１８０に相当する標的核酸の部分配列と相補性を持つ、実施態様１から１８のオリゴヌクレオチド。
２９．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置２９６３５から位置２９７０５に相当する標的核酸の部分配列と相補性を持つ、実施態様１から１８のオリゴヌクレオチド。
３０．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置３０５９０から位置３０７４０に相当する標的核酸の部分配列と相補性を持つ、実施態様１から１８のオリゴヌクレオチド。
３１．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置３９８００から位置３９８５５に相当する標的核酸の部分配列と相補性を持つ、実施態様１から１８のオリゴヌクレオチド。
３２．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置４４４３５から位置４４４６０に相当する標的核酸の部分配列と相補性を持つ、実施態様１から１８のオリゴヌクレオチド。
３３．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置４５２４５から位置４５２７０に相当する標的核酸の部分配列と相補性を持つ、実施態様１から１８のオリゴヌクレオチド。
３４．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置４６３８０から位置４６４３０に相当する標的核酸の部分配列と相補性を持つ、実施態様１から１８のオリゴヌクレオチド。
３５．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置６８９１５から位置６８９４０に相当する標的核酸の部分配列と相補性を持つ、実施態様１から１８のオリゴヌクレオチド。
３６．オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡでも自己相補的でもない実施態様１から３５のオリゴヌクレオチド。
３７．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、26、27、28、29、30、31、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、44、45、45、46、47、48、49、50、51、52、53、53、54、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、95、96、96、96、97、98、99、100、101、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817および818からなる群から選ばれる配列を含むか、この配列からなる、実施態様１から３６のオリゴヌクレオチド。
３８．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号166、167、167または169（実施例の項の表３に挙げたモチーフ配列を参照）からなる群から選ばれる配列を含むか、この配列からなる、実施態様１から３６のオリゴヌクレオチド。
３９．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号570、571、572、679、680、681、682および683（実施例の項の表３に挙げたモチーフ配列を参照）からなる群から選ばれる配列を含むか、この配列からなる、実施態様１から３６のオリゴヌクレオチド。
４０．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号570、571、572、679、680、681、682および683（実施例の項の表３に挙げたモチーフ配列を参照）からなる群から選ばれる配列を含むか、この配列からなる、実施態様１から３６のオリゴヌクレオチド。
４１．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号35、199から210または配列番号582から584（実施例の項の表３に挙げたモチーフ配列を参照）からなる群から選ばれる配列を含むか、あるいはこれらの配列からなる、実施態様１から３６のオリゴヌクレオチド。
４２．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号236、237、238、239、240および590（実施例の項の表３に挙げたモチーフ配列を参照）からなる群から選ばれる配列を含むか、あるいはこの配列からなる、実施態様１から３６のオリゴヌクレオチド。
４３．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号221から225または配列番号585から589（実施例の項の表３に挙げたモチーフ配列を参照）からなる群から選ばれる配列を含むか、この配列からなる、実施態様１から３６のオリゴヌクレオチド。
４４．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号241または591（実施例の項の表３に挙げたモチーフ配列を参照）からなる群から選ばれる配列を含むか、この配列からなる、実施態様１から３６のオリゴヌクレオチド。
４５．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号46から48、285から305、または配列番号613から632、または721から807（実施例の項の表３に挙げたモチーフ配列を参照）からなる群から選ばれる配列を含むか、この配列からなる、実施態様１から３６のオリゴヌクレオチド。
４６．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号331、332、638、639、640、808、809、810、811、812、813、814および815（実施例の項の表３に挙げたモチーフ配列を参照）からなる群から選ばれる配列を含むか、この配列からなる、実施態様１から３６のオリゴヌクレオチド。
４７．前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号409から411または配列番号642から646または816から818（実施例の項の表３に挙げたモチーフ配列を参照）からなる群から選ばれる配列を含むか、この配列からなる、実施態様１から３６のオリゴヌクレオチド。
４８．標的核酸と比較して、連続ヌクレオチド配列に０から３個の不一致がある実施態様１から４７のオリゴヌクレオチド。
４９．標的核酸と比較して、連続ヌクレオチド配列に１個の不一致がある、実施態様４８のオリゴヌクレオチド。
５０．標的核酸と比較して、連続ヌクレオチド配列に２個の不一致がある、実施態様４８のオリゴヌクレオチド。
５１．連続ヌクレオチド配列が標的ヌクレオチド配列に完全に相補性を持つ、実施態様４８のオリゴヌクレオチド。
５２．１種以上の修飾ヌクレオシドを含む、実施態様１から５１のオリゴヌクレオチド。
５３．前記１種以上の修飾ヌクレオシドは親和性修飾ヌクレオシドである実施態様５２のオリゴヌクレオチド。
５４．前記１種以上の修飾ヌクレオシドは２’糖修飾ヌクレオシドである、実施態様５２または５３のオリゴヌクレオチド。
５５．前記１種以上の２’糖修飾ヌクレオシドは２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＡＮＡおよびＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選ばれる、実施態様５４のオリゴヌクレオチド。
５６．前記１種以上の修飾ヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである、実施態様５４のオリゴヌクレオチド。
５７．前記修飾ＬＮＡヌクレオチドはオキシ−ＬＮＡである、実施態様５６のオリゴヌクレオチド。
５８．前記修飾ヌクレオシドはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、実施態様５７のオリゴヌクレオチド。
５９．前記修飾ヌクレオシドはα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡである、実施態様５７のオリゴヌクレオチド。
６０．前記修飾ＬＮＡヌクレオチドはチオ−ＬＮＡである、実施態様５６のオリゴヌクレオチド。 である、実施態様５６のオリゴヌクレオチド。
６１．前記修飾ＬＮＡヌクレオチドはアミノ−ＬＮＡである、実施態様５６のオリゴヌクレオチド。
６２．前記修飾ＬＮＡヌクレオチドはｃＥＴである、実施態様５６のオリゴヌクレオチド。
６３．前記修飾ＬＮＡヌクレオチドはＥＮＡである、実施態様５６のオリゴヌクレオチド。
６４．前記修飾ＬＮＡヌクレオチドは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡ、α−Ｌ−アミノ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ―ＬＮＡ、α−Ｌ−チオ―ＬＮＡ、（Ｓ）ｃＥＴ、（Ｒ）ｃＥＴ、β−Ｄ−ＥＮＡおよびα−Ｌ−ＥＮＡから選ばれる実施態様５６のオリゴヌクレオチド。
６５．オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施態様１から６４のいずれか1項のオリゴヌクレオチド。
６６．前記修飾ヌクレオシド間結合がヌクレアーゼ耐性である実施態様６５のオリゴヌクレオチド。
６７．前記連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％がホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合、またはボラノホスフェート・ヌクレオシド間結合である、実施態様６５または６６のオリゴヌクレオチド。
６８．前記連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合である、実施態様６５または６６のオリゴヌクレオチド。
６９．オリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅＨを動員可能である、実施態様１から６８のオリゴヌクレオチド。
７０．オリゴヌクレオチドはギャップマーである実施態様６９のオリゴヌクレオチド。
７１．オリゴヌクレオチドは、式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’のギャップマー（式中、領域ＦおよびＦ’は独立して１〜７個の修飾ヌクレオシドを含むか、これらの修飾ヌクレオシドからなり、ＧはＲＮａｓｅＨを動員可能な６〜１６ヌクレオシド間の領域である）である、実施態様６９または７０のオリゴヌクレオチド。
７２．前記修飾ヌクレオシドが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡおよびＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選ばれる２’糖修飾ヌクレオシドである、実施態様７１のオリゴヌクレオチド。
７３．領域ＦおよびＦ’の前記修飾ヌクレオシドのうちの１種以上はＬＮＡヌクレオシドである、実施態様７１または７２のオリゴヌクレオチド。
７４．領域ＦおよびＦ’の前記修飾ヌクレオシドすべてがＬＮＡヌクレオシドである、実施態様７３のオリゴヌクレオチド。
７５．領域ＦおよびＦ’はＬＮＡヌクレオシドからなる実施態様７４のオリゴヌクレオチド。
７６．領域ＦおよびＦ’のすべての修飾ヌクレオシドがオキシ−ＬＮＡヌクレオシドである、実施態様７３から７５オリゴヌクレオチド。
７７．領域ＦまたはＦ’のうちの少なくとも１つの領域は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡからなる群から独立して選ばれる少なくとも１種の２’置換修飾ヌクレオシドをさらに含む、実施態様７３のオリゴヌクレオチド。
７８．領域Ｇの前記ＲＮａｓｅＨを動員するヌクレオシドは、ＤＮＡ、α−Ｌ−ＬＮＡ、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ、ＡＮＡおよび２’Ｆ−ＡＮＡ、およびＵＮＡから独立して選ばれる、実施態様７３から７７のオリゴヌクレオチド。
７９．領域Ｇの前記ヌクレオシドはＤＮＡおよび／またはα−Ｌ−ＬＮＡヌクレオシドである実施態様７８のオリゴヌクレオチド。
８０．領域Ｇは少なくとも７５％ＤＮＡヌクレオシドからなる実施態様７８または７９のオリゴヌクレオチド。
８１．前記オリゴヌクレオチドはＵＢＥ３Ａの発現を対照に比べて少なくとも３０％増加可能な、実施態様１から８０のオリゴヌクレオチド。
８２．ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流のＳＮＨＧ１４転写物の水準は対照に比べて少なくとも２０％減少している、実施態様１から８１のオリゴヌクレオチド。
８３．ＳＮＯＲＤ１１５の発現は対照に比べて大きな影響を受けていない、実施態様１から８２のオリゴヌクレオチド。
８４．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号4_1から678_1までから選ばれる実施態様１から８３のオリゴヌクレオチド。
８５．前記オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号4_1、4_2、5_1、5_2、6_1、6_2、7_1、7_2、8_1、9_1、10_1、11_1、11_2、12_1、12_2、13_1、13_2、14_1、15_1、16_1、17_1、17_2、18_1、18_2、19_1、19_2、20_1、21_1、22_1、23_1、23_2、24_1、25_1、26_1、26_2、27_1、28_1、28_2、29_1、29_2、30_1、31_1、31_2、32_1、33_1、34_1、34_2、34_3、34_4、34_5、34_6、34_7、35_1、35_2、36_1、37_1、38_1、38_2、38_3、38_4、38_5、38_6、39_1、39_2、39_3、39_4、39_5、40_1、40_2、40_3、40_4、40_5、40_6、40_7、40_8、41_1、42_1、43_1、44_1、44_2、45_1、45_2、46_1、47_1、48_1、48_2、48_3、48_4、48_5、48_6、48_7、49_1、50_1、51_1、52_1、53_1、53_2、54_1、54_2、54_3、55_1、55_2、56_1、57_1、58_1、58_2、58_3、59_1、59_2、60_1、60_2、60_3、61_1、62_1、63_1、64_1、64_2、65_1、66_1、67_1、68_1、69_1、69_2、69_3、70_1、70_2、70_3、71_1、72_1、72_2、73_1、73_2、73_3、74_1、74_2、75_1、75_2、76_1、77_1、77_2、77_3、78_1、79_1、79_2、79_3、80_1、80_2、80_3、81_1、82_1、82_2、83_1、83_2、84_1、84_2、85_1、85_2、86_1、87_1、88_1、88_2、89_1、90_1、91_1、92_1、93_1、94_1、95_1、95_2、96_1、96_2、96_3、97_1、97_2、97_3、97_4、98_1、98_2、98_3、99_1、99_2、99_3、99_4、100_1、100_2、100_3、101_1、101_2、101_3、101_4、102_1、102_2、102_3、102_4、103_1、103_2、103_3、103_4、104_1、104_2、104_3、105_1、105_2、105_3、105_4、106_1、106_2、106_3、106_4、107_1、107_2、107_3、107_4、108_1、108_2、108_3、108_4、109_1、109_2、109_3、109_4、110_1、110_2、111_1、111_2、111_3、112_1、112_2、113_1、114_1、115_1、116_1、117_1、118_1、119_1、120_1、120_2、121_1、122_1、123_1、124_1、125_1、126_1、126_2、127_1、128_1、128_2、128_3、128_4、129_1、129_2、130_1、131_1、132_1、132_2、132_3、133_1、133_2、133_3、133_4、134_1、134_2、135_1、135_2、136_1、137_1、138_1、139_1、140_1、141_1、142_1、143_1、144_1、145_1、145_2、146_1、146_2、147_1、148_1、149_1、150_1、150_2、151_1、152_1、153_1、154_1、155_1、156_1、157_1、158_1、159_1、160_1、161_1、162_1、163_1、164_1、165_1、166_1、167_1、168_1、169_1、169_10、169_11、169_12、169_13、169_14、169_15、169_16、169_17、169_18、169_19、169_2、169_20、169_21、169_22、169_23、169_24、169_25、169_26、169_27、169_28、169_29、169_3、169_30、169_31、169_32、169_33、169_34、169_35、169_36、169_37、169_38、169_39、169_4、169_40、169_41、169_42、169_43、169_44、169_45、169_46、169_47、169_48、169_49、169_5、169_50、169_51、169_52、169_53、169_54、169_55、169_56、169_57、169_6、169_7、169_8、169_9、169_58、169_59、169_60、169_61、169_62、170_1、171_1、172_1、173_1、174_1、175_1、176_1、177_1、178_1、179_1、180_1、181_1、182_1、183_1、184_1、185_1、186_1、187_1、188_1、189_1、190_1、191_1、192_1、193_1、194_1、195_1、196_1、197_1、198_1、199_1、200_1、201_1、202_1、203_1、204_1、205_1、206_1、207_1、208_1、208_2、208_3、208_4、208_5、208_6、208_7、209_1、209_10、209_2、209_3、209_4、209_5、209_6、209_7、209_8、209_9、210_1、211_1、212_1、213_1、214_1、215_1、216_1、217_1、218_1、219_1、220_1、221_1、222_1、223_1、224_1、225_1、226_1、227_1、228_1、229_1、230_1、231_1、232_1、233_1、234_1、235_1、236_1、236_10、236_11、236_12、236_13、236_14、236_15、236_16、236_2、236_3、236_4、236_5、236_6、236_7、236_8、236_9、236_17、236_18、236_19、236_20、236_21、237_1、237_10、237_11、237_12、237_13、237_14、237_15、237_16、237_2、237_3、237_4、237_5、237_6、237_7、237_8、237_9、237_17、237_18、237_19、237_20、237_21、238_1、239_1、239_10、239_11、239_12、239_13、239_14、239_15、239_16、239_2、239_3、239_4、239_5、239_6、239_7、239_8、239_9、239_17、239_18、239_19、239_20、239_21、240_1、241_1、241_10、241_2、241_3、241_4、241_5、241_6、241_7、241_8、241_9、241_11、241_12、241_13、241_14、241_15、242_1、243_1、244_1、244_2、244_3、244_4、244_5、245_1、246_1、247_1、248_1、249_1、250_1、251_1、252_1、253_1、254_1、255_1、256_1、257_1、258_1、259_1、260_1、261_1、262_1、263_1、264_1、265_1、266_1、267_1、268_1、269_1、270_1、271_1、272_1、273_1、274_1、275_1、276_1、277_1、278_1、279_1、280_1、281_1、282_1、283_1、284_1、285_1、285_2、285_3、285_4、285_5、285_6、285_7、285_8、285_9、285_10、285_11、286_1、287_1、288_1、289_1、290_1、291_1、292_1、293_1、294_1、295_1、296_1、297_1、298_1、299_1、300_1、301_1、302_1、303_1、304_1、304_10、304_2、304_3、304_4、304_5、304_6、304_7、304_8、304_9、304_11、304_12、304_13、304_14、304_15、305_1、306_1、307_1、308_1、309_1、310_1、311_1、312_1、313_1、314_1、315_1、316_1、317_1、318_1、319_1、320_1、321_1、322_1、323_1、324_1、325_1、326_1、327_1、328_1、329_1、330_1、331_1、332_1、333_1、334_1、335_1、336_1、337_1、338_1、339_1、340_1、341_1、342_1、343_1、344_1、345_1、346_1、347_1、348_1、349_1、350_1、351_1、352_1、353_1、354_1、355_1、356_1、357_1、358_1、359_1、360_1、361_1、361_10、361_2、361_3、361_4、361_5、361_6、361_7、361_8、361_9、362_1、362_10、362_2、362_3、362_4、362_5、362_6、362_7、362_8、362_9、363_1、364_1、365_1、366_1、367_1、368_1、369_1、370_1、371_1、372_1、373_1、374_1、375_1、376_1、377_1、378_1、379_1、380_1、381_1、382_1、383_1、384_1、385_1、386_1、387_1、388_1、389_1、390_1、391_1、392_1、393_1、394_1、395_1、396_1、397_1、398_1、399_1、400_1、401_1、402_1、403_1、404_1、405_1、406_1、407_1、408_1、409_1、410_1、411_1、412_1、413_1、414_1、415_1、416_1、417_1、418_1、419_1、420_1、421_1、422_1、423_1、424_1、425_1、425_10、425_2、425_3、425_4、425_5、425_6、425_7、425_8、425_9、426_1、427_1、428_1、429_1、430_1、431_1、432_1、433_1、434_1、435_1、436_1、437_1、438_1、439_1、440_1、441_1、442_1、443_1、444_1、445_1、446_1、447_1、448_1、449_1、450_1、451_1、452_1、453_1、454_1、455_1、456_1、457_1、458_1、459_1、460_1、461_1、462_1、463_1、464_1、465_1、466_1、467_1、468_1、469_1、470_1、471_1、472_1、473_1、474_1、475_1、476_1、477_1、478_1、479_1、480_1、481_1、482_1、483_1、484_1、485_1、486_1、487_1、488_1、489_1、490_1、491_1、492_1、493_1、494_1、495_1、496_1、497_1、498_1、499_1、500_1、501_1、502_1、503_1、504_1、505_1、506_1、507_1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８６．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号155_1または165_1から選ばれる、実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
８７．前記オリゴヌクレオチドは化合物番号169_52、169_50または169_56からなる群から選ばれる、実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
８８．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号172_1、272_1、572_7、572_6または572_5からなる群から選ばれる実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
８９．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号175_1から選ばれる、実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
９０．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号178_1から選ばれる、実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
９１．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号573_8、186_1または187_1から選ばれる、実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
９２．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号186_1から選ばれる、実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
９３．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号200_1、204_1、206_1、35_2または209_1からなる群から選ばれる、実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
９４．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号585_1、585_8、586_9、586_5、586_8、586_4または586_6からなる群から選ばれる、実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
９５．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号233_1から選ばれる、実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
９６．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号237_8または590_13から選ばれる、実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
９７．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号220_1から選ばれる、実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
９８．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号591_1、592_2、592_4または241_9からなる群から選ばれる、実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
９９．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号597_4、598_4、39_1または602_1からなる群から選ばれる、実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
１００．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号39_1から選ばれる、実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
１０１．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号611_7から選ばれる、実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
１０２．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号271_1または278_1からなる群から選ばれる、実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
１０３．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号616_4、621_2、621_1、622_3、622_5、622_4、624_3、624_5、287_1、625_6、626_7、626_8、626_9、48_1、631_6、631_1、303_1、304_6または304_10からなる群から選ばれる、実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
１０４．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号636_8から選ばれる、実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
１０５．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号638_8、639_5、331_1または640_4からなる群から選ばれる実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
１０６．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号359_1、361_1、361_5、362_1または641_5からなる群から選ばれる実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
１０７．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号378_1、379_1または399_1からなる群から選ばれる実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
１０８．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号403_1、405_1、642_12、642_13、644_3または646_16からなる群から選ばれる実施態様８５のオリゴヌクレオチド。である実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
１０９．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号85_1または425_5から選ばれる実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
１１０．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号116_1から選ばれる実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
１１１．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号123_1または124_1から選ばれる実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
１１２．前記オリゴヌクレオチドは化合物識別番号126_2から選ばれる実施態様８５のオリゴヌクレオチド。である実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
１１３．実施態様１から１１２のいずれか１項に従うオリゴヌクレオチドおよび前記オリゴヌクレオチドに共有結合している少なくとも１つの複合部分を含む複合体。
１１４．前記複合部分は炭水化物、細胞表面受容体リガンド、製剤原料、ホルモン、親油性物質、高分子、タンパク質、ペプチド、毒素、ビタミン、ウィルスタンパク質またはそれらの組み合わせから選ばれる、実施態様１１３のオリゴヌクレオチド複合体。
１１５．前記複合部分は抗体または抗体断片である実施態様１１３または１１４のオリゴヌクレオチド複合体。
１１６．前記抗体または抗体断片はトランスフェリン受容体に親和性を持つ実施態様１１５のオリゴヌクレオチド複合体。
１１７．前記オリゴヌクレオチドと前記複合部分の間に位置するリンカーを含む、実施態様１１３から１１５のオリゴヌクレオチド複合体。
１１８．前記リンカーは生理学的に不安定なリンカーである実施態様１１７のオリゴヌクレオチド複合体。
１１９．前記生理学的に不安定なリンカーはヌクレアーゼ感受性リンカーである、実施態様１１８のオリゴヌクレオチド複合体。
１２０．前記オリゴヌクレオチドは式Ｄ−Ｆ−Ｇ−Ｆ’またはＦ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’（式中、Ｆ、Ｆ’、およびＧは実施態様７３から８０に定義された通りであり、ＤまたはＤ’はホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合を持つ１つ、２つ、または３つのＤＮＡヌクレオシドを含む）を持つ、実施態様１１８または１１９のオリゴヌクレオチド複合体。
１２１．前記複合オリゴヌクレオチドの脳への取り込みが非複合オリゴヌクレオチドに比べて改善されていることを示す実施態様１１３から１２０のオリゴヌクレオチド複合体。
１２２．実施態様１から１１２のオリゴヌクレオチドまたは実施態様１１３から１２１の複合体、ならびに医薬的に許容される希釈剤、担体、塩、および／または補助剤を含む医薬組成物。
１２３．ヌクレオチド単位を反応させそれによりオリゴヌクレオチドに含まれる共有結合した連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、実施態様１から１１２のオリゴヌクレオチドの製造方法。
１２４．連続ヌクレオチド配列を非ヌクレオチド複合部分と反応させることをさらに含む、実施態様１２３の方法。
１２５．オリゴヌクレオチドを医薬的に許容される希釈剤、担体、塩、および／または補助剤と混合することを含む、実施態様１２２の組成物の製造方法。
１２６．父方ＵＢＥ３Ａの発現が抑制されている標的細胞におけるＵＢＥ３Ａ発現を生体内または生体外で導入する方法であって、前記細胞に、実施態様１から１１２のいずれか一項のオリゴヌクレオチド、実施態様１１３から１２１のいずれか一項の複合体、または実施態様１２２の医薬組成物を有効量投与することを含む方法。
１２７．前記ＵＢＥ３Ａの発現が対照に比べて少なくとも４０％増加している、実施態様１２６の方法。
１２８．ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流のＳＮＨＧ１４転写物の水準が対照に比べて少なくとも３０％減少している、実施態様１２６または１２７の方法。
１２９．前記標的細胞が神経細胞である実施態様１２６から１２８の方法。
１３０．前記ＳＮＯＲＤ１１５の発現は対照に比べて大きな影響を受けていない、実施態様１２６から１２９の方法。
１３１．疾病に罹っているか疑いがある治療対象に、実施態様１から１１２のオリゴヌクレオチド、または実施態様１１３から１２１の複合体、または実施態様１２２の医薬組成物を治療的もしくは予防的に有効量投与することを含む疾病を治療または予防する方法。
１３２．治療対象の疾病の治療または予防に使用するための、実施態様１から１１２のオリゴヌクレオチド、または実施態様１１３から１２１の複合体、または実施態様１２２の医薬組成物。
１３３．治療対象の疾病の治療または予防のための薬剤の調製のための、実施態様１から１１２のオリゴヌクレオチド、または実施態様１１３から１２１の複合体の使用。
１３４．前記疾病はＵＢＥ３Ａの生体内の活性に関係している、実施態様１３１から１３３の方法、オリゴヌクレオチド、または使用。
１３５．前記疾病は神経細胞中のＵＢＥ３Ａの発現の減少および／またはＵＢＥ３Ａの活性の低下に関係している、実施態様１３１から１３４の方法、オリゴヌクレオチド、または使用。
１３６．前記ＵＢＥ３Ａの発現の減少および／またはＵＢＥ３Ａの活性の低下はＵＢＥ３Ａ遺伝子の母性対立遺伝子の変異に起因する実施態様１３５の方法、オリゴヌクレオチド、または使用。
１３７．前記ＵＢＥ３Ａの発現は、実施態様１から１１２のオリゴヌクレオチド、または実施態様１１３から１２１の複合体、または実施態様１２２の医薬組成物なしでの発現に比べて、少なくとも３０％、または少なくとも５０％、または少なくとも７０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１５０％または少なくとも２００％増加している実施態様１３４から１３６の方法、オリゴヌクレオチド、または使用。
１３８．前記疾病がアンジェルマン症候群である、実施態様１３１から１３７の方法、オリゴヌクレオチド、または使用。
１３９．前記治療対象は哺乳動物である、実施態様１３１から１３８の方法、オリゴヌクレオチド、または使用。
１４０．前記治療対象はヒトである、実施態様１３９の方法、オリゴヌクレオチド、または使用。
１４１．前記治療対象は幼児または年少者である、実施態様１３９または１４０の方法、オリゴヌクレオチド、または使用。
物質および方法
表３：配列番号１と相補性を持つオリゴヌクレオチドまたは連続核酸塩基配列（配列番号で示されるモチーフ配列）、これらから作製されるオリゴヌクレオチド設計、およびモチーフ配列に基づいて設計された具体的なオリゴヌクレオチド化合物（化合物識別番号で示す）のリスト。

設計はギャップマー設計、Ｆ−Ｇ−Ｆ’、を指す。式中、それぞれの数字は連続した修飾ヌクレオシドの数、例えば、２’修飾ヌクレオシドの数（１番目の数字＝５’隣接部）、続いてＤＮＡヌクレオシドの数（２番目の数字＝間隙領域）、続いて修飾ヌクレオシド、例えば２’修飾ヌクレオシドの数（３番目の数字＝３’隣接部）を表し、ＤＮＡ及びＬＮＡのさらなる繰り返し領域（これらは標的核酸に相補性を持つ連続配列の一部である必要はない）が先行するか後に続く場合がある。表３のいくつかのオリゴヌクレオチドでは、隣接部は混合隣接部であり、そのような隣接部は２’修飾ヌクレオシドで開始かつ終止し、この場合、間隙領域は５より大きい数で、設計の５’または３’末端に位置しない。
オリゴヌクレオチド化合物では、大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡ・Ｃは５−メチルシトシンであり、５−メチルＤＮＡシトシンは「ｅ」で表され、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合である。
配列番号１の開始としてのＥＸ−ＥＸ数値表示を持つオリゴヌクレオチドは、ＳＮＨＧ１４−０２３のエクソン−エクソン接合部（ＥＮＳＴ０００００５５４７２６）全体にわたって相補性を持つように設計されたエクソン−エクソン貫通オリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、もともとエクソン２とエクソン３を貫通している（すなわちエクソン２の領域およびエクソン３の領域に相補性を持つ）。
オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチド合成は一般に当業者に知られている。以下は採用した手順である。本発明のオリゴヌクレオチドは、用いる装置、担体および濃度に若干変更を加えて作製した。
オリゴヌクレオチドをウリジン万能坦体でMerMade12またはOligomaker・ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置でホスホラミダイト法を用いて、１から４μｍｏｌ規模で合成する。合成の最後に、オリゴヌクレオチドを固体坦体からアンモニア水を用いて６０℃で５から１６時間で解離する。このオリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）または固相抽出により精製し、ＵＰＬＣにより解析し、さらに分子量をＥＳＩ−ＭＳにより確認する。
オリゴヌクレオチドの伸長：
β−シアノエチルホスホラミダイト（ＤＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ−Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｔ、ＬＮＡ−５−メチル−Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ｇ（ｄｍｆ）、ＬＮＡ−Ｔまたはアミノ−Ｃ６リンカー）のカップリングを、活性化剤として５’−Ｏ−ＤＭＴで保護されたアミダイトの０．１Ｍアセトニトリル溶液およびＤＣＩ（４，５-ジシアノイミダゾール）アセトニトリル溶液（０．２５Ｍ）を用いて行う。最終サイクルで、所望の修飾を持つホスホラミダイト、例えば、複合基に結合するＣ６リンカーまたはそのような複合基を用いる。ホスホロチオエート結合導入のためのチオール化を、キサンタンヒドリド（０．０１Ｍアセトニトリル／ピリジン（９：１）溶液）を用いて行う。ホスホロジエステル結合はヨウ素の０．０２Ｍ・ＴＨＦ／ピリジン／水（７：２：１）溶液を用いて導入できる。残りの反応試薬はオリゴヌクレオチド合成に典型的に用いられるものである。
ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製：
粗生成物を、Phenomenex Jupiter C18 の１０μ、１５０×１０ｍｍカラムを用いた分取ＲＰ−ＨＰＬＣで緩衝液として０．１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ８およびアセトニトリルを用い、流量５ｍＬ／ｍｉｎで精製する。分取した画分を凍結乾燥すると、典型的には白色固体として精製された化合物が得られる。
略語：
ＤＣＩ：４，５−ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４’−ジメトキシトリチル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー
Ｔｍ評価
オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ標的二本鎖を、ＲＮａｓｅを含まない水５００ｍｌで３ｍＭに希釈し、５００ｍｌの２ｘＴｍ緩衝液（２００ｍＭのＮａＣｌ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と混合する。この溶液を９５℃で３分加熱し、次に室温で３０分アニールする。二本鎖融解温度（Ｔｍ）を、Peltier温度プログラマーPTP6を備えたLambda 40 ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計で、PE Templabソフトウェア（Perkin Elmer）を用いて測定する。温度を２０℃から９５℃まで上げ、その後、２５℃まで下げて、２６０ｎｍの吸収を記録する。融解とアニーリング両方の一次微分および局所最大値を二本鎖Ｔｍの評価に用いる。
マウス初代皮質神経細胞培養物の調製
初代皮質神経培養物を日齢１５日のマウス胎児脳から標準法に従って調製した。略述すると、培養プレートを、ポリ−Ｌ−リシン（５０μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リシン、１０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム、ｐＨ８緩衝液）で、室温で２から３時間コートした。プレートは使用前に１ｘＰＢＳで洗浄した。採取したマウス胎児脳をかみそりで切り取り、均質化し、解剖用培地（ＨＢＳＳ、０．０１ＭのＨｅｐｅｓ、ペニシリン／ストレプトマイシン）３８ｍｌに浸漬した。次に、トリプシン２ｍｌを加え、細胞を３７℃で３０分培養し、遠心分離した。得られた細胞をＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ）２０ｍｌに溶かし、さらにシリンジを通して均質化した。その後、５００ｒｐｍで１５分遠心分離した。得られた細胞をＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ）に溶かし、９６ウェルプレート（１００μｌ中細胞０．１×１０６個／ウェル）に播種した。この神経細胞培養物は播種後、直接使用可能状態であった。
マウス初代皮質神経細胞培養物中のオリゴヌクレオチドのスクリーニング
前記細胞を９６−ウェルプレートで、成長培地（Gibco Neurobasal培地、Ｂ２７サプリメント、Glutamax、ペニシリン−ストレプトマイシン）で培養し、オリゴヌクレオチドを用いて所望の濃度で３日間培養した。全ＲＮＡを細胞から単離し、ノックダウン効率を、Quanta Bioscience社製qScript（商標） XLT One-Step RT-qPCR ToughMix（登録商標）, Low ROX（商標） キット（９５１３４−５００）を用いてｑＰＣＲ分析で測定した。Thermo Fisher Scientific製の市販のタックマン試験を、正規化用のＧＡＰＤＨを含むＵｂｅ３ａ＿ＡＴＳの測定に用いた。
ヒト初代神経細胞培養物の発生
記載されたすべての時点でのすべての細胞株を３７℃、ＣＯ２濃度５％および相対湿度９５％で培養した。
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）培養物
ヒトの全血液試料を、アンジェルマン症候群と診断された患者から得た。続く初代末梢血単核細胞（ＰＭＣＳｓ）の培養で赤芽細胞を濃縮した。患者特有のｉＰＳＣ株を、CytoTune-iPS Sendai Reprogrammingキット(Thermo Fisher Scientific)で赤芽細胞の再プログラミングにより発生させた。誘導されたｉＰＳＣ株を、ｍＴＥＳＲ１(STEMCELL Technologies)中、ｈＥＳＣで正規化したMatrigel(Corning)を用い、培地を毎日交換して、フィーダーなしの条件に保持した。集密に達したら、コロニーを、穏やかな細胞解離試薬(STEMCELL Technologies)を用いて、５０から２００μｍの大きさの細胞クラスターに解離し、１０μＭのＹ−２７６３２(Calbiochem)の存在下で１：１０から１：２０の比で二次培養した。
神経前駆細胞（ＮＰＣ）への分化
神経分化の誘導では、ｉＰＳＣ−誘導細胞を１ｘＢ２７(Gibco, Invitrogen)、１ｘＮ２(Gibco, Invitrogen)、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール(Gibco, Invitrogen)および指示されたサプリメントを添加した同体積のＤＭＥＭ：Ｆ１２Glutamax培地およびNeurobasal培地(Gibco, Invitrogen)を含む基礎培地に保持した。
神経前駆細胞（ＮＰＣ）を、二重ＳＭＡＤ阻害により、若干修正した公知の手順に従って、ｈｉＰＳＣから誘導した(Chambers et al. 2009 Nat Biotechnol. Vol. 3 pp.275-80, Boissart et al., 2013 Transl Psychiatry. 3:e294)。ＨｉＰＳＣをAccutase（Innovative Cell Technologies Inc.）で単細胞懸濁液に解離し、１０μＭのＹ−２７６３２（Calbiochem）、５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ(Peprotech)、１０μＭのＳＢ−４３１５４２（Calbiochem）および１００ｎＭのＬＤＮ（Calbiochem）をさらに添加した塩基性培地に再懸濁した。単細胞懸濁液を８０００細胞からなる凝集体形成を可能にするAggreWell800プレート（STEMCELL Technologies）に移した。５日後、神経凝集体をポリ−Ｌ−オルニチン（Sigma）およびラミニン（Roche)でコートしたプレートに移し、FGFを添加した塩基性培地中で、継続した二重ＳＭＡＤ阻害（ＳＢ−４３１５４２およびＬＤＮ）下で、神経ロゼットを形成した。この神経ロゼットを、STEMdiff（商標） Neural Rosette Selection Reagent STEMCELL Technologies）を用いて選択的に単離し、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニン５２１（BioLamina）でコートした皿に再播種し、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ（Peprotech）、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（ＲｎＤ）、および２０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ（Peprotech）を添加した塩基性培地中で増やした。集密に達したら、細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Gibco, Invitrogen）で酵素的に解離し、二次培養した。ＦＧＦ、ＥＧＦおよびＢＤＮＦを添加した塩基性培地中での継続した継代培養で、１０から２０継代以内で安定な神経前駆細胞株（ＮＰＣ株）となった。安定な神経前駆細胞株は、その自己複製能、および、発育段階特異性標識Ｓｏｘ２およびネスチンの発現により決定した。特異的刺激では、ＮＰＣは、神経細胞後代（ＭＡＰ２＋、Ｔａｕ＋、ＨｕＣ／Ｄ＋）およびアストログリア（星状膠細胞）後代（ＧＦＡＰ＋）に分化する（Dunkley et al., 2015 Proteomics Clin Appl. Vol. 7-8 pp.684-94）。
ＮＰＣ培養の条件は既述の方法を、若干修正して用いた(Boissart et al., 2013 TransＮＰＣ培養
l Psychiatry. 3:e294)。略述すると、細胞をラミニン５２１（BioLamina）でコートした皿に保持し、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ(Peprotech)、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ(RnD)、および ２０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ(Peprotech)を添加した塩基性培地［１ｘＢ２７（Gibco, Invitrogen）、１ｘＮ２（Gibco, Invitrogen）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Gibco, Invitrogen）を添加した同体積のＤＭＥＭ：Ｆ１２Glutamax培地およびNeuro基礎培地（Gibco, Invitrogen）を含む］中で培養した。
神経細胞培養物への分化
ＮＰＣの神経分化を誘導するために、細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Gibco, Invitrogen）で単細胞懸濁液に解離し、ラミニン５２１(BioLamina)でコートした皿に密度１２．０００細胞／ｃｍ２で播種し、２００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８（Peprotech）、および１００μＭのアスコルビン酸リン酸エステル（Sigma）を添加した塩基性培地に７日間保持した。続いて、細胞を２０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ（Peprotech）、１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ（Peprotech）、０．５ｍＭのｃＡＭＰ（BIOLOG Life Science）、および１００μＭのアスコルビン酸リン酸エステル（Sigma）を添加した基礎培地に、密度４５０００細胞／ｃｍ２で再播種し、２１日間分化させた。分化の２１日目に、分化した神経細胞の培養物を、スクリーニング適合プレートフォーマットに再播種した。再播種は、培養物をAccutase（Innovative Cell Technologies Inc.）で単細胞懸濁液に解離させて行った。細胞を、最終オリゴヌクレオチドスクリーニング試験用に、密度２００．０００細胞／ｃｍ２で、１０μＭのＹ−２７６３２（Calbiochem製細胞透過性、可逆性、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤）の存在下、３８４ウェルのマイクロタイタープレートに播種した。神経細胞培養物をさらに７日間、２０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ（Peprotech）、１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ（Peprotech）、０．５ｍＭのｃＡＭＰ（BIOLOG Life Science）、および１００μＭのアスコルビン酸リン酸エステル（Sigma）を添加した基礎培地で分化させた。分化培地は１週間に２回交換した。全部で３５日間の分化の後、神経細胞培養物は、オリゴヌクレオチド処理可能となった。
ヒト神経細胞培養物中のオリゴヌクレオチドのスクリーニング−３８４ウェル系
スクリーニング用に、オリゴヌクレオチド原液を、３８４ウェルマイクロタイタープレート中（化合物プレート）で、水で所定の異なる濃度にあらかじめ希釈した。プレートの配置は処理テンプレートとして機能する。それぞれのウェルからの２マイクロリットルのオリゴヌクレオチド希釈液を化合物プレートからそれぞれの培養プレートに移した。すべての液体の取扱いは、半自動実験室ロボットシステム（Beckmancoulter）を用いて、無菌条件下、層流中で行った。神経細胞培養物をオリゴヌクレオチドと共に、培地の交換なしに５日間培養した。続いて、神経細胞培養物を溶解し、RealTime ready Cell lysis およびRNA Virus Masterキット(Roche)でｑＰＣＲ試験を行った。液体の取扱いは液状半自動実験室ロボットシステム（Beckmancoulter）を用いて行った。試料をLightcycler480リアルタイムＰＣＲシステム(Roche)で分析した。
オリゴヌクレオチドの活性を、ＵＢＥ３Ａの転写産物量を次のプライマーおよびプローブを用いてモニターするｑＰＣＲで評価した。
ＵＢＥ３ａセンス鎖：順方向プライマー：ATATGTGGAAGCCGGAATCT（配列番号837）、
逆方向プライマー：TCCCAGAACTCCCTAATCAGAA（配列番号838）、
色素ＦＡＭでラベルした内部プローブ：ATGACGGTGGCTATACCAGG（配列番号839）
ＲＴ−ｑＰＣＲは、正規化用ハウスキーピング遺伝子としてＰＰＩＡ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ）を用いて多重化した。ＰＰＩＡプライマーおよび色素ＶＩＣでラベルしたプローブはThermo Fisher Scientific (assay ID Hs99999904_m1)から購入した。それぞれのプレートは陰性対照として非標的オリゴヌクレオチド（模造物）（TTGaataagtggaTGT（配列番号846））および対照オリゴヌクレオチド化合物番号41_1を含み、ＵＢＥ３ＡｍＲＮＡの発現が増加（up-regulation）した。
オリゴヌクレオチドの選択率を１５番染色体のＳＮＯＲＤ１０９Ｂの上流に位置するＳＮＯＲＤ１１５ 転写物に対する逆スクリーニングで確認した。ＳＮＯＲＤ１１５の発現を次のプライマーおよびプローブを用いてｑＰＣＲでモニターした。
順方向プライマー：GGGTCAATGATGAGAACCTTAT（配列番号840）、
逆方向プライマー：GGGCCTCAGCGTAATCCTATT（配列番号841）、
色素ＦＡＭでラベルした内部プローブ：TTCTGAAGAGAGGTGATGACTTAAAA（配列番号842）
ＲＴ−ｑＰＣＲは、オリゴヌクレオチド処理でＰＰＩＡ（Thermo Fisher Scientific）を用いて多重化した。
ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流のＳＮＨＧ１４転写物（ＵＢＥ３Ａ抑制遺伝子とも言う）の減少を次のプライマーおよびプローブを用いてＲT−ｑＰＣＲで測定した。
順方向プライマー：ATCCGAGGCATGAATCTCAC（配列番号843）、
逆方向プライマー：CAGGCCAAAACCCTTGATAA（配列番号844）、
色素ＦＡＭでラベルした内部プローブ：TTGCTGAGCATTTTTGCATC（配列番号：845）
ＲＴ−ｑＰＣＲはＰＰＩＡ（Thermo Fisher Scientific）で多重化した。
データは、すべてのプレートに亘って模造物と比較した平均発現％で表し、プレート間のばらつきを考慮して対照オリゴヌクレオチドで正規化した。
ヒト神経細胞培養物中のオリゴヌクレオチドのスクリーニング−９６ウェル系
スクリーニング用に、オリゴヌクレオチド原液を、９６ウェルマイクロタイタープレート中（化合物プレート）で、水で所定の異なる濃度にあらかじめ希釈した。プレートの配置は処理テンプレートとして機能する。それぞれのウェルからの２マイクロリットルのオリゴヌクレオチド希釈液を、化合物プレートからそれぞれの培養プレートに移した。すべての液体の取扱いは、半自動実験室ロボットシステム（Beckmancoulter）を用いて、無菌条件下、層流中で行った。神経細胞培養物をオリゴヌクレオチドと共に、培地の交換なしに５日間培養した。続いて、神経細胞培養物を溶解し、ＲＮＡをＲＮＡ精製キットPure Link Pro96 (12173011A) LifeTechnologiesを用いて精製した。液体の取扱いは半自動実験室ロボットシステム（Beckmancoulter）を用いて行った。Ｕｂｅ３ａおよびＵｂｅ３ａ−ＡＴＳのｑＰＣＲ分析をViiA（商標）7リアルタイムＰＣＲシステム（Thermo Fisher Scientific）でQuanta社のqScriptTM XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix Low ROX（95134-50）を用いて行った。
次のプライマーおよびプローブを用いた：
ｑＰＣＲ ＵＢＥ３ａセンス鎖：
順方向プライマー：ATATGTGGAAGCCGGAATCT（配列番号697）、
逆方向プライマー：TCCCAGAACTCCCTAATCAGAA（配列番号698）、
色素ＦＡＭでラベルした内部プローブ： ATGACGGTGGCTATACCAGG（配列番号699）
ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流のｑＰＣＲ・ＳＮＨＧ１４転写物（ＵＢＥ３Ａ抑制遺伝子とも言う）：
ThermoFisher社製の市販のプライマーおよびプローブのセット：Hs01372957_m1。これらのプライマーはGenbank転写物AF400500.1の８７ｂｐエクソン−エクソン貫通配列を増幅する。
ＱＰＣＲ ＧＡＰＤＨ転写物：
ThermoFisher社製の市販のプライマーおよびプローブのセット：遺伝子信号：次の試験詳細を使用：参照配列：ＮM_002046.3、プローブエクソン位置：3、増幅産物サイズ：１２２ｂｐ。対応するTaqManアッセイＩＤ：Hs99999905_m1。
Ｕｂｅ３ａおよびＵｂｅ３ａ−ＡＴＳ両者のＲＴ−ｑＰＣＲを、正規化用のハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを用いて、多重化した。それぞれのプレートは陰性対照として非標的オリゴヌクレオチド（模造物）（TTGaataagtggaTGT（配列番号846））および対照オリゴヌクレオチド化合物番号21_1を含み、ＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡの発現が増加した。さらに、試験ノイズおよび偽陽性検出の危険性をモニターするために、オリゴＵｂ３ａまたはＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流のＳＮＨＧ１４転写物（ＵＢＥ３Ａ抑制遺伝子とも言う）を標的としないオリゴパネルを含めた。
対照オリゴヌクレオチド：

実施例１
マウス初代神経細胞培養物中のオリゴヌクレオチド活性
ＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡ前駆体（配列番号１の位置５５３１９から位置１４１０５３）に対してアンチセンスであるＳＮＨＧ１４長鎖非コードＲＮＡの部分を標的とするオリゴヌクレオチドの、ＵＢＥ３Ａ発現を阻害するＳＮＨＧ１４長鎖非コードＲＮＡ転写物（データ表ではＵＢＥ３Ａ抑制遺伝子又はＵＢＥ３Ａ−ＳＵＰとも示す）を減少させる能力、およびＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡ再発現を誘導する能力を、上記の「物質および方法」で述べた方法で得たマウス初代皮質神経細胞培養物で試験した。オリゴヌクレオチド濃度は５マイクロＭであった。
オリゴヌクレオチドを、「材料および方法」の項で述べたマウス皮質神経細胞培養物のスクリーニングの手順に従ってスクリーニングした。結果を表４に示す。

表４：初代マウス神経細胞培養物中のオリゴヌクレオチド活性

実施例２
ヒト神経細胞培養物中のオリゴヌクレオチド活性
ヒト１５番染色体（配列番号1）の位置２５２７８４１０から位置２５４１９４６２に相当するＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流領域のヒトＳＮＨＧ１４を標的とするオリゴヌクレオチドを、患者由来ヒト神経細胞培養物（「物質および方法」の項の手順参照）で試験した。ＳＮＯＲＤ１１５の発現への影響なしに、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂ下流領域のＳＮＨＧ１４転写物（データ表ではＵＢＥ３Ａ抑制遺伝子又はＵＢＥ３Ａ−ＳＵＰとも示す）を減少させるオリゴヌクレオチド能力を分析した。さらに、ＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡ再発現を誘導する能力を分析した。
オリゴヌクレオチドを、上記の「材料および方法」の項で述べたヒト神経細胞培養物のスクリーニングの手順に従ってスクリーニングした。
結果を表５に示す。ＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡの発現をすべての化合物について測定した。一方、ＵＢＥ３Ａ抑制遺伝子のノックダウンおよびＳＮＯＲＤ１１１５レベルの維持はすべての化合物について分析していない。

表５：患者由来の神経細胞培養物中のオリゴヌクレオチド活性

試験した１８７化合物の約９０％が、模造オリゴヌクレオチドに比べて、５マイクロモル濃度で、ＵＢＥ３Ａの再発現を示した。ＵＢＥ３Ａの発現を誘導できるオリゴヌクレオチドの数は、配列番号１の位置１から位置５５３１８の間の領域（非重複領域）の方が、ＵＢＥ３Ａコード領域相補性を持つ領域（重複領域）よりも多い。図２はヒト１５番染色体の位置によるオリゴヌクレオチドの分布を模造オリゴヌクレオチドに対するＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡ発現に対してプロットしたものである。
ＳＮＯＲＤ１１５を試験したオリゴヌクレオチドで、１マイクロＭおよび５マイクロＭで、模造物と比べて明らかな発現低下はない。
実施例３
ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流領域およびＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡ前駆体に対するアンチセンス領域の上流領域のＳＮＨＧ１４転写物を標的とするオリゴヌクレオチドの活性
配列番号１の位置４８０６から位置５４９３９を標的とするオリゴヌクレオチドを患者由来ヒト神経細胞培養物（「物質および方法」の項参照）で試験した。ＳＮＯＲＤ１０９Ｂ下流領域のＳＮＨＧ１４転写物（データ表ではＵＢＥ３Ａ抑制遺伝子又はＵＢＥ３Ａ−ＳＵＰとも示す）を減少させるオリゴヌクレオチド能力を分析した。さらに、ＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡ再発現を誘導する能力を分析した。
前記オリゴヌクレオチドを「材料および方法」−「ヒト神経細胞培養物中のスクリーニングオリゴヌクレオチド-９６ウェル系」の項で述べたヒト神経細胞培養物のスクリーニングの手順に従ってスクリーニングした。
結果を表６に示す。

表６：患者由来の神経細胞培養物中のオリゴヌクレオチド活性

実施例４
ＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡに対するアンチセンス領域のＳＮＨＧ１４転写物を標的とするオリゴヌクレオチドの活性
配列番号１の位置５５３３７から１３６２１４を標的とするオリゴヌクレオチドを、患者由来ヒト神経細胞培養物（「物質および方法」の項参照）で試験した。ＳＮＯＲＤ１０９Ｂ下流領域のＳＮＨＧ１４転写物（データ表ではＵＢＥ３Ａ抑制遺伝子又はＵＢＥ３Ａ−ＳＵＰとも示す）を減少させるオリゴヌクレオチド能力を分析した。さらに、ＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡ再発現を誘導する能力を分析した。
前記オリゴヌクレオチドを「材料および方法」−「ヒト神経細胞培養物中のスクリーニングオリゴヌクレオチド-９６ウェル系」の項で述べたヒト神経細胞培養物のスクリーニングの手順に従ってスクリーニングした。
結果を表７に示す。

表７：患者由来の神経細胞培養物中のオリゴヌクレオチド活性

実施例５
ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流領域およびＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡ前駆体に対するアンチセンス領域の上流領域のＳＮＨＧ１４転写物を標的とするオリゴヌクレオチドの活性
配列番号１の位置５２２４から５１２５７を標的とするオリゴヌクレオチドを、患者由来ヒト神経細胞培養物（「物質および方法」の項参照）で試験した。ＳＮＯＲＤ１０９Ｂ下流領域のＳＮＨＧ１４転写物（データ表ではＵＢＥ３Ａ抑制遺伝子又はＵＢＥ３Ａ−ＳＵＰとも示す）を減少させるオリゴヌクレオチド能力を分析した。さらに、ＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡ再発現を誘導する能力を分析した。
オリゴヌクレオチドを以下の修正を行った「材料および方法」−「ヒト神経細胞培養物中のスクリーニングオリゴヌクレオチド-９６ウェル系」の項で述べたヒト神経細胞培養物のスクリーニングの手順に従ってスクリーニングした。
ＵＢＥ３ａセンス鎖プライマー
ThermoFisher製の市販のプライマーおよびプローブを使用：参照配列番号NM_000462.3の位置８３８の９４ｂｐ配列を増幅するHs00166580_m1。
それぞれのプレートは、ＰＢＳ参照（非標的オリゴヌクレオチドの代替）および陽性対照オリゴヌクレオチド化合物番号271_1を含み、ＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡの発現が増加した。更なる参照オリゴヌクレオチドは含めなかった。
データは、すべてのプレートに亘ってＰＢＳ参照に対する平均発現％で示し、効率レベルのプレート間のばらつきを考慮して陽性対照オリゴヌクレオチドで正規化した。結果を表８に示す。

表８：患者由来の神経細胞培養物中のオリゴヌクレオチド活性

実施例６
エクソン−エクソン貫通オリゴヌクレオチドの活性
ＳＮＨＧ１４−０２３のエクソン−エクソン接合部（ＥＮＳＴ０００００５５４７２６）全体にわたって相補性を持つように設計されたオリゴヌクレオチドを、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂ下流領域のＳＮＨＧ１４転写物（データ表ではＵＢＥ３Ａ抑制遺伝子又はＵＢＥ３Ａ−ＳＵＰとも示す）を減少させるオリゴヌクレオチド能力について分析した。さらに、ＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡ再発現を誘導する能力を分析した。オリゴヌクレオチドはもともとエクソン２とエクソン３を貫通している（すなわちエクソン２の領域およびエクソン３の領域に相補性を持つ）。
オリゴヌクレオチドを、実施例５の項に述べたヒト神経細胞培養物中のオリゴヌクレオチドのスクリーニングの手順に従って、スクリーニングした。
結果を表９に示す。

表９：患者由来の神経細胞培養物中のオリゴヌクレオチド活性

実施例７
選択したオリゴヌクレオチドのインビトロ効率および有効性の試験
実施例２から５のスクリーニングに基づいて、５２超のオリゴヌクレオチドを有効性および効率試験用に選択した。
オリゴヌクレオチドを、以下の修正を行った「材料および方法」−「ヒト神経細胞培養物中のスクリーニングオリゴヌクレオチド-９６ウェル系」の項で述べた方法で、ヒトＡＳ患者由来の細胞中でスクリーニングした：
ＵＢＥ３ａセンス鎖プライマー用にThermoFisher製の市販のプライマーおよびプローブ。参照配列番号NM_000462.3の位置８３８の９４ｂｐ配列を増幅するHs00166580_m1を用いた。
それぞれのプレートは、ＰＢＳ参照（非標的オリゴヌクレオチドの代替）および前述のスクリーニングで同定した陽性対照オリゴヌクレオチド化合物番号186_1および39_1を含む。材料および方法の項に述べたさらなる参照オリゴヌクレオチドは含めなかった。オリゴヌクレオチド試験濃度は、１０点の１００．５(＝３．２倍)希釈（half-log dilution）を用いて３１．６μＭから１ｎＭとした。すべてのオリゴヌクレオチドを５つの独立した実験で異なる５週間で試験した。データＱＣ過程で、例えばＰＣＲ生成物が検出されないなどの明らかな異常値がある場合は、いくつかのプレートを分析から除外した。この除外の後、報告値の背後には最低３つの独立した実験が存在する。
ＥＣ５０（ＵＢＥ３Ａ・ｍＲＮＡ再発現）およびＩＣ５０（ＳＮＯＲＤ１０９Ｂ下流領域のＳＮＨＧ１４転写物（データ表ではＵＢＥ３Ａ抑制遺伝子又はＵＢＥ３Ａ−ＳＵＰとも示す）の減少）を、４パラメータＳ字型用量−応答モデルを用いた曲線適合後、決定した。適合は、IDBS (XLfit)のBiobookソフトウェアで入手可能な適合エンジンを用いて実施した。曲線適合から、ＵＢＥ３Ａの得られる限り最大の発現増加（ＵＢＥ３Ａ Ｍａｘ Ｕｐ）およびＵＢＥ３Ａ−ＳＵＰの得られる限り最大のノックダウン（ＵＢＥ３Ａ−ＳＵＰ ｍａｘ Ｋｄ）を決定した。両者とも参照（ＰＢＳ処理細胞）の％として示す。結果を表１０に示す。値はそれぞれの生物学的反復の幾何平均で報告する。

表１０：オリゴヌクレオチドＥＣ５０およびＩＣ５０値、および最大ＵＢＥ３Ａ発現増加およびＵＢＥ３Ａ抑制遺伝子ノックダウン。

Claims (24)

  1. １０〜３０のヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号46、47、48、221、222、223、224、225、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、304、305、585、586、587、588、589、625、627、628、629、630、631 632、698、699、700、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807からなる群から選ばれる配列を含む、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  2. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号５８５を含むか、又は配列番号５８５からなる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  3. １又は複数の２’糖修飾ヌクレオシドを含む、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
  4. 前記１種以上の２’糖修飾ヌクレオシドは、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡおよびＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選ばれる、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
  5. 前記１種以上の修飾ヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである、請求項２又は３に記載のオリゴヌクレオチド。
  6. 前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  7. 前記連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
  8. 前記オリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅＨを動員可能である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  9. 前記オリゴヌクレオチドはギャップマーである、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
  10. 前記オリゴヌクレオチドは、化合物識別番号46_1、47_1、48_1、48_2、48_3、48_4、48_5、48_6、48_7、221_1、222_1、223_1、224_1、225_1、289_1、290_1、291_1、292_1、293_1、294_1、295_1、296_1、297_1、298_1、299_1、300_1、301_1、302_1、303_1、304_1、304_10、304_2、304_3、304_4、304_5、304_6、304_7、304_8、304_9、304_11、304_12、304_13、304_14、304_15、305_1、585_1、585_2、585_3、585_4、585_5、585_6、585_7、585_8、585_9、585_10、585_11、585_12、585_13、585_14、586_1、586_2、586_3、586_4、586_5、586_6、586_7、586_8、586_9、586_10、586_11、586_12、586_13、586_14、587_1、587_2、587_3、587_4、587_5、587_6、587_7、587_8、587_9、587_10、587_11、587_12、587_13、587_14、588_1、588_2、588_3、588_4、588_5、588_6、588_7、588_8、588_9、588_10、588_11、588_12、588_13、588_14、589_1、589_2、589_3、589_4、589_5、589_6、589_7、589_8、589_9、589_10、589_11、589_12、589_13、589_14、625_1、625_2、625_3、625_4、625_5、625_6、625_7、625_8、625_9、625_10、625_11、625_12、625_13、625_14、627_1、627_2、627_3、627_4、627_5、627_6、627_7、627_8、627_9、627_10、627_11、627_12、627_13、627_14、628_1、628_2、628_3、628_4、628_5、628_6、628_7、628_8、628_9、628_10、628_11、628_12、628_13、628_14、629_1、629_10、629_11、629_2、629_3、629_4、629_5、629_6、629_7、629_8、629_9、629_12、629_13、629_14、629_15、629_16、630_1、630_2、630_3、631_1、631_10、631_2、631_3、631_4、631_5、631_6、631_7、631_8、631_9、631_11、631_12、631_13、631_14、631_15、632_1、632_2、632_3、632_4、632_5、632_6、632_7、632_8、632_9、632_10、632_11、632_12、632_13、632_14、698_1、698_2、698_3、698_4、698_5、699_1、699_2、699_3、699_4、699_5、700_1、700_2、700_3、700_4、700_5、701_1、701_2、701_3、701_4、701_5、702_1、702_2、702_3、702_4、702_5、703_1、703_2、703_3、703_4、703_5、704_1、704_2、704_3、704_4、704_5、705_1、705_2、705_3、705_4、705_5、706_1、706_2、706_3、706_4、706_5、707_1、707_2、707_3、707_4、707_5、708_1、708_2、708_3、708_4、708_5、709_1、709_2、709_3、709_4、709_5、710_1、710_2、710_3、710_4、710_5、711_1、711_2、711_3、711_4、711_5、712_1、712_2、712_3、712_4、712_5、713_1、713_2、713_3、713_4、713_5、714_1、714_2、714_3、714_4、714_5、715_1、715_2、715_3、715_4、715_5、716_1、716_2、716_3、716_4、716_5、717_1、717_2、717_3、717_4、717_5、718_1、718_2からなる群から選ばれる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  11. 前記オリゴヌクレオチドが、化合物識別番号585_1である、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
  12. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、及び当該オリゴヌクレオチドに共有結合された少なくとも１の複合部分を含む、複合体。
  13. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項１２に記載の複合体、ならびに
    医薬的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩、および／または補助剤
    を含む、医薬組成物。
  14. 前記医薬的に許容される希釈剤が、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 前記医薬的に許容される塩がナトリウム塩である、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。
  16. 前記医薬的に許容される塩がカリウム塩である、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。
  17. 医薬として使用するための、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  18. 父方ＵＢＥ３Ａの発現が抑制されている標的細胞におけるＵＢＥ３Ａ発現を導入するためのインビトロ方法であって、
    前記方法が、前記細胞に、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項１２に記載の複合体、または請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物を、有効量で投与すること
    を含む方法。
  19. 前記ＵＢＥ３Ａの発現が、対照に比べて少なくとも４０％増加している、請求項１８に記載の方法。
  20. ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流のＳＮＨＧ１４転写物の水準が対照に比べて少なくとも３０％減少している、請求項１８または１９に記載の方法。
  21. 前記標的細胞は神経細胞である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記ＳＮＯＲＤ１１５の発現は対照に比べて大きな影響を受けていない、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. アンジェルマン症候群の治療又は予防において使用するための、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  24. アンジェルマン症候群の治療または予防のための医薬の製造のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項１２に記載の複合体、又は請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
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