JP6126009B2 - α−シヌクレイン発現の調節 - Google Patents
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Description
本出願は、電子フォーマットの配列表と共に出願されている。配列表は、2011年11月7日に作成され、170KbのサイズであるBIOL0139WOSEQ.txtと表題を付けられたファイルとして提供される。配列表の電子フォーマットでの情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の定義がなされない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、医学および薬化学と関連して利用される命名法、ならびにその手順および技法は、当技術分野において公知であって、一般的に使用されるものである。標準的技法が、化学合成および化学分析のために使用されてもよい。許可される場合、あらゆる特許、出願、公開出願、および他の刊行物、米国立生物工学情報センター(NCBI)等のデータベースを通して入手可能なGENBANK登録番号および関連付けられた配列情報、ならびに本開示全体を通して参照される他のデータは、本明細書で論じられる文書の一部に対して、ならびにその全体として、参照することによって、本明細書に組み込まれる。
本発明の実施形態は、α−シヌクレインmRNAおよびタンパク質の発現を阻害するための方法、化合物、および組成物を提供する。
(i)結合されたデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメントと、
(ii)結合されたヌクレオシドから成る5’ウィングセグメントと、
(iii)結合されたヌクレオシドから成る3’ウィングセグメントと、
を含み、ギャップセグメントは、5’ウィングセグメントと3’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含む。
(i)10個の結合されたデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメントと、
(ii)5個の結合されたヌクレオシドから成る5’ウィングセグメントと、
(iii)5個の結合されたヌクレオシドから成る3’ウィングセグメントと、
を含み、ギャップセグメントは、5’ウィングセグメントと3’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、2’−O−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であって、各シトシンは、5−メチルシトシンである。
オリゴマー化合物として、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣体、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびsiRNAが挙げられるが、それらに限定されない。オリゴマー化合物は、標的核酸に「アンチセンス」であって、水素結合を通して、標的核酸にハイブリダイゼーションを起こすことが可能であることを意味し得る。
ある種の実施形態では、α−シヌクレイン核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物は、抑制活性の増強、標的核酸への結合親和性の増加、または体内ヌクレアーゼによる分解への抵抗性といった特性をそのアンチセンス化合物へ付与する、パターン配置された化学修飾サブユニットまたはモチーフを有する。
α−シヌクレインをコードするヌクレオチド配列は、限定ではないが、配列番号1として本明細書に組み込まれるGENBANK登録番号NM_000345.3、配列番号2として本明細書に組み込まれるヌクレオチド15140000から15255000が切断されたGENBANK登録番号NT_016354.17の相補体、配列番号3として本明細書に組み込まれるGENBANK登録番号NM_007308.1、配列番号4として本明細書に組み込まれるGENBANK登録番号L36674.1、配列番号5として本明細書に組み込まれるGENBANK登録番号BC013293.2、配列番号6として本明細書に組み込まれるGENBANK登録番号BG701026.1、または配列番号7として本明細書に組み込まれるGENBANK登録番号BM069769.1を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示のアンチセンス化合物とα−シヌクレイン核酸との間でハイブリダイゼーションが起こる。最も一般的なハイブリダイゼーションの機序は、核酸分子の相補的な核酸塩基間での水素結合(例、ワトソン−クリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン水素結合)を伴う。
アンチセンス化合物と標的核酸は、アンチセンス化合物の十分な数の核酸塩基が、所望の効果(例、α−シヌクレイン核酸のような標的核酸のアンチセンス阻害)が生じるように、標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合することができるとき、互いに相補的である。
本明細書に提供するアンチセンス化合物はまた、特別なヌクレオチド配列、配列番号、または特定のIsis番号によって表される化合物、あるいはその部分に対して一定の同一性パーセントを有し得る。本明細書で使用されるとき、アンチセンス化合物は、同一核酸塩基対合能力を有する場合、本明細書に開示される配列と同一である。例えば、開示されるDNA配列においてチミジンの代わりにウラシルを含有するRNAは、ウラシルとチミジンが共にアデニンと対合するので、そのDNA配列と同一であるとみなされよう。本明細書で説明されるアンチセンス化合物の短縮または延長バージョン、ならびに本明細書に提供するアンチセンス化合物に対して非同一の塩基を有する化合物も考慮される。この非同一の塩基は、互いに隣接していても、またはアンチセンス化合物全体に分散していてもよい。アンチセンス化合物の同一性パーセントは、比較される配列に対する、同一の塩基対合を有する塩基の数に従って計算される。
ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの核酸塩基(塩基としても知られる)部分は、通常、ヘテロ環塩基部分である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドでは、リン酸基は、糖の2’、3’または5’ヒドロキシル部分に結合することができる。オリゴヌクレオチドは、相互に隣接するヌクレオシドの共有結合を通して形成され、線状のポリマーオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチド構造の内部で、リン酸基は、一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結を形成すると称される。
RNAおよびDNAの天然に存在するヌクレオシド間結合は、3’から5’のホスホジエステル結合である。1つ以上の修飾、すなわち、非天然に存在する、ヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物は、多くの場合、例えば、細胞取り込みの増強、核酸標的への親和性の増強、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増加のような望ましい特性のために、天然に存在するヌクレオシド間連結を有するアンチセンス化合物に優って選択される。
本発明のアンチセンス化合物は、任意に、糖基が修飾された1つ以上のヌクレオシドを含有することができる。かかる糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の増強、結合親和性の増加、または他の何らかの有益な生物学的特性をアンチセンス化合物へ付与し得る。ある種の実施形態では、ヌクレオシドは、化学修飾リボフラノース環部分を含む。化学修飾リボフラノース環の例として、限定ではないが、置換基(5’および2’置換基を含む)の付加、ノンジェミナル環原子の架橋形成による二環式核酸(BNA)の形成、リボシル環酸素原子のS、N(R)、またはC(R1)(R)2(R=H、C1−C12アルキル、または保護基)での置き換え、およびそれらの組み合わせが挙げられる。化学修飾糖の例として、2’−F−5’−メチル置換ヌクレオシド(他の開示された5’,2’−ビス置換ヌクレオシドについての2008年8月21日公開のPCT国際出願第WO2008/101157号を参照されたい)、リボシル環酸素原子のSでの置き換えと2’位でのさらなる置換(公開された2005年6月16日公開の米国特許出願第US2005/0130923号を参照されたい)、または代替として、BNAの5’置換(2007年11月22日公開のPCT国際出願第WO2007/134181号を参照されたい。ここでLNAは、例えば5’−メチルまたは5’−ビニル基で置換される)が挙げられる。
式中、
xは、0、1、または2であり、
nは、1、2、3、または4であり、
各RaおよびRbは、独立して、H、保護基、ヒドロキシル、C1−C12アルキル、置換C1−C12アルキル、C2−C12アルケニル、置換C2−C12アルケニル、C2−C12アルキニル、置換C2−C12アルキニル、C5−C20アリール、置換C5−C20アリール、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、C5−C7脂環式ラジカル、置換C5−C7脂環式ラジカル、ハロゲン、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、アシル(C(=O)−H)、置換アシル、CN、スルホニル(S(=O)2−J1)、またはスルホキシル(S(=O)−J1)であり、
各J1およびJ2は、独立して、H、C1−C12アルキル、置換C1−C12アルキル、C2−C12アルケニル、置換C2−C12アルケニル、C2−C12アルキニル、置換C2−C12アルキニル、C5−C20アリール、置換C5−C20アリール、アシル(C(=O)−H)、置換アシル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、C1−C12アミノアルキル、置換C1−C12アミノアルキル、または保護基である。
を有し、式中、
Bxは、複素環式塩基部分であり、
−Qa−Qb−Qc−は、−CH2−N(Rc)−CH2−、−C(=O)−N(Rc)−CH2−、−CH2−O−N(Rc)−、−CH2−N(Rc)−O−、または−N(Rc)−O−CH2であり、
Rcは、C1−C12アルキルまたはアミノ保護基であり、
TaおよびTbは各々、独立して、H、ヒドロキシル保護基、複合基、反応リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合である。
を有し、式中、
Bxは、複素環式塩基部分であり、
TaおよびTbは各々、独立して、H、ヒドロキシル保護基、複合基、反応リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり、
Zaは、C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、置換C1−C6アルキル、置換C2−C6アルケニル、置換C2−C6アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオール、または置換チオである。
を有し、式中、
Bxは、複素環式塩基部分であり、
TaおよびTbは各々、独立して、H、ヒドロキシル保護基、複合基、反応リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり、
Zbは、C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、置換C1−C6アルキル、置換C2−C6アルケニル、置換C2−C6アルキニル、または置換アシル(C(=O)−)である。
を有し、式中、
Bxは、複素環式塩基部分であり、
TaおよびTbは各々、独立して、H、ヒドロキシル保護基、複合基、反応リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり、
Rdは、C1−C6アルキル、置換C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、置換C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、または置換C2−C6アルキニルであり、
各qa、qb、qc、およびqdは、独立して、H、ハロゲン、C1−C6アルキル、置換C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、置換C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニルもしくは置換C2−C6アルキニル、C1−C6アルコキシル、置換C1−C6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1−C6アミノアルキルもしくは置換C1−C6アミノアルキルである。
を有し、式中、
Bxは、複素環式塩基部分であり、
TaおよびTbは各々、独立して、H、ヒドロキシル保護基、複合基、反応リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり、
qa、qb、qe、およびqfは各々、独立して、水素、ハロゲン、C1−C12アルキル、置換C1−C12アルキル、C2−C12アルケニル、置換C2−C12アルケニル、C2−C12アルキニル、置換C2−C12アルキニル、C1−C12アルコキシ、置換C1−C12アルコキシ、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O−C(=O)NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)NJjJk、またはN(H)C(=S)NJjJkであるか、
あるいはqeおよびqfは一緒に、=C(qg)(qh)であり、
qgおよびqhは各々、独立して、H、ハロゲン、C1−C12アルキル、または置換C1−C12アルキルである。
を有し、式中、
Bxは、複素環式塩基部分であり、
TaおよびTbは各々、独立して、H、ヒドロキシル保護基、複合基、反応リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり、
各qi、qj、qk、およびqlは、独立して、H、ハロゲン、C1−C12アルキル、置換C1−C12アルキル、C2−C12アルケニル、置換C2−C12アルケニル、C2−C12アルキニル、置換C2−C12アルキニル、C1−C12アルコキシル、置換C1−C12アルコキシル、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O−C(=O)NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)NJjJkまたはN(H)C(=S)NJjJkであり、
qiおよびqjまたはqlおよびqkは一緒に、=C(qg)(qh)であり、式中、qg、およびqhは各々、独立して、H、ハロゲン、C1−C12アルキル、または置換C1−C12アルキルである。
式X:
を有する化合物が含まれるが、これらに限定されず、式中、式Xの該少なくとも1つのテトラヒドロピランヌクレオシド類似体の各々について独立して、
Bxは、複素環式塩基部分であり、
T3およびT4は各々、独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に結合するヌクレオシド間結合基であるか、あるいはT3およびT4の1つは、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり、T3およびT4のもう1つは、H、ヒドロキシル保護基、結合複合基、または5’もしくは3’末端基であり、
q1、q2、q3、q4、q5、q6、およびq7は各々、独立して、H、C1−C6アルキル、置換C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、置換C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、または置換C2−C6アルキニルであり、
R1およびR2の1つは、水素であり、もう1つは、ハロゲン、置換または非置換アルコキシ、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2、およびCNから選択され、式中、XはO、S、またはNJ1であり、各J1、J2、およびJ3は、独立して、HまたはC1−C6アルキルである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物または製剤のために薬学的に容認可能活性または不活性物質と混合されてもよい。組成物および医薬組成物の製剤化のための方法は、限定されないが、投与の経路、疾患の程度、投与すべき用量を含む、いくつかの判断基準に依存している。
アンチセンス化合物は、生じるアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを高める、1つ以上の部分または複合体へ共有結合されてもよい。典型的な複合基には、コレステロール部分と脂質部分が含まれる。追加の複合基には、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が含まれる。
α−シヌクレイン核酸のレベル、活性、または発現に対するアンチセンス化合物の効果について、多様な細胞種において体外で試験することができる。分析のために使用される細胞種は、市販ベンダー(例えば、American Type Culture Collection,Manassus,VA; Zen−Bio,Inc.,Research Triangle Park,NC; Clonetics Corporation,Walkersville,MD)より入手可能であり、ベンダーの説明書に従って、市販の試薬(例えば、Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)を使用して培養される。例証的細胞種として、HuVEC細胞およびSH−SY5Y細胞が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書に説明されるのは、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの細胞の処置についての方法であって、これは、他のアンチセンス化合物での処置のために適宜修飾することができる。
RNA分析は、全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAで実施することができる。RNA単離の方法は、当技術分野において公知である。RNAは、当技術分野において公知の方法を使用して、例えば、製造業者の推奨プロトコールに従って、TRIZOL試薬(Invitrogen,Carlsbad,CA)を使用して、調製される。
α−シヌクレイン核酸のレベルまたは発現の阻害は、当技術分野において公知の多様な方法でアッセイすることができる。例えば、標的核酸レベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、または定量的リアルタイムPCRによって定量化することができる。RNA分析は、全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAで実施することができる。RNA単離の方法は、当該技術分野において公知である。ノーザンブロット分析も、当該技術分野では、常法である。定量的リアルタイムPCRは、簡便には、市販のABI PRISM 7600、7700、または7900配列検出システム(PE−Applied Biosystems,Foster City,CAより入手可能)を使用して、そして製造業者の説明書に従って使用して達成することができる。
標的RNAレベルの定量は、ABI PRISM 7600、7700、または7900配列検出システム(PE−Applied Biosystems,Foster City,CA)を製造業者の説明書に従って使用する、定量的リアルタイムPCRによって達成することができる。定量的リアルタイムPCRの方法は、当該技術分野において公知である。
α−シヌクレインタンパク質レベルを測定することによって、α−シヌクレイン核酸のアンチセンス阻害を査定することができる。α−シヌクレインのタンパク質レベルは、免疫沈降、ウェスタンブロット分析(イムノブロッティング)、酵素結合免疫吸着法(ELISA)、定量的タンパク質アッセイ、タンパク質活性アッセイ(例えば、カスパーゼ活性アッセイ)、免疫組織化学、免疫細胞化学、または蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)のような、当該技術分野で公知の種々の方法で評価または定量化することができる。標的指向される抗体は、抗体のMSRSカタログ(Aerie Corporation,Birmingham,MI)のような多様な供給源より同定して入手するか、あるいは当該技術分野で公知の慣用のモノクローナルまたはポリクローナル抗体作製法により製造することができる。マウス、ラット、サル、およびヒトα−シヌクレインの検出に有用な抗体が市販されている。
アンチセンス化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて、α−シヌクレインの発現を阻害し、運動協調の改善、嗅覚の改善、空間記憶の改善、安静時震顫の発生の減少、運動緩徐(運動緩慢)の発生の減少、硬直化または不変性の減少、平衡感覚の改善、微細運動の器用度の改善、粗大運動協調の改善、α−シヌクレインの凝集の減少、および起立性低血圧の低下等の自律機能の改善のような表現型の変化をもたらすその能力を査定するために、動物において試験する。試験は、正常な動物において、または実験的な疾患モデルにおいて実施してもよい。動物への投与のために、リン酸緩衝化生理食塩水のような医薬的に許容される希釈剤でアンチセンスオリゴヌクレオチドを製剤化する。投与には、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、または頭蓋内投与、例えば、髄腔内または脳室内投与のような非経口の投与経路が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量および投薬頻度の計算は、投与経路や動物体重のような多くの要因に依存する。アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置の期間に続いて、肝臓組織よりRNAを単離して、α−シヌクレイン核酸発現の変化を測定する。α−シヌクレインタンパク質レベルの変化も測定する。
ある種の実施形態では、本発明は、本発明の1つ以上の医薬組成物を投与することを含む、個体を治療する方法、化合物、および組成物を提供する。ある種の実施形態では、個体は、神経変性疾患を有する。ある種の実施形態では、神経変性疾患は、パーキンソン病、認知症、多系統萎縮症(また、シャイ・ドレーガー症候群)、孤発性および家族性アルツハイマー病、アルツハイマー病レビー小体亜型、びまん性レビー小体病、またはレビー小体型認知症である。ある種の実施形態では、個体は、シヌクレイン病を有する。ある種の実施形態では、シヌクレイン病は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、または多系統萎縮症である。ある種の実施形態では、個体は、神経変性疾患および/またはシヌクレイン病を発症する危険がある。これは、個体が、老化、神経毒への暴露、および遺伝的素質を含む、神経変性疾患および/またはシヌクレイン病を発症する1つ以上の危険因子を有することを含む。ある種の実施形態では、個体は、神経変性疾患および/またはシヌクレイン病の治療を必要とするものとして同定されている。ある種の実施形態では、本発明は、個体において、α−シヌクレイン発現を予防的に減少させるための方法を提供する。ある実施形態は、個体に、α−シヌクレイン核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物の治療的有効量を投与することによって、それを必要とする個体を治療することを含む。
ある種の実施形態では、本明細書に記載される化合物および組成物は、非経口で投与される。
ある種の実施形態では、本発明の1つ以上の医薬組成物は、1つ以上の他の医薬品と同時に投与される。ある種の実施形態では、本発明の1つ以上の医薬組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある種の実施形態では、1つ以上の他の医薬品は、ペプチド、抗体、または小分子のいずれかである。ある種の実施形態では、ペプチド、抗体、または小分子は、本明細書の上記で説明されたもののいずれかである(例えば、上記のある種の実施形態を参照されたい)。
本明細書に記載されるある種の化合物、組成物、および方法が、ある種の実施形態に従って特異的に記載されている一方で、次の例は、本明細書に記載される化合物を例証するのみの役割を果たしており、それらを限定するようには意図されない。本出願に列挙される参考文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
SNCA核酸に対して標的指向されるアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、SNCA mRNAに対するその効果を体外で試験した。LipofectAMINE2000(登録商標)試薬を10nMアンチセンスオリゴヌクレオチドと併用して、5,000個の細胞/ウェルの密度の培養されたHuVEC細胞にトランスフェクトした。約24時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、SNCA mRNAレベルを、ヒトプライマープローブセットRTS2621(フォワード配列ACGAACCTGAAGCCTAAGAAATATCT、本明細書では配列番号8として指定される;リバース配列GAGCACTTGTACAGGATGGAACAT、本明細書では配列番号9として指定される、プローブ配列TGCTCCCAGTTTCTTGAGATCTGCTGACA、本明細書では配列番号10として指定される)を使用して、定量的リアルタイムPCRによって測定した。SNCA mRNAレベルは、RIBOGREENによって測定されるように、総RNA含有量に従って調節した。結果は、未処置対照細胞と比較して、SNCAの阻害パーセントとして提示される。
実施例1において説明された研究におけるヒトSNCAの84%以上の体外阻害を呈した11のギャップマーについて、HuVEC細胞において種々の用量で試験した。細胞を6,000の細胞/ウェルの密度でプレート培養して、LipofectAMINE2000(登録商標)試薬を、表4に規定されるように、0.08nM、0.25nM、0.74nM、2.22nM、6.67nM、および20.00nM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと併用して、トランスフェクトした。約16時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、およびSNCA mRNAレベルを定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトSNCAプライマープローブセットRTS2621(本明細書の実施例1において上述される)を使用して、mRNAレベルを測定した。SNCA mRNAレベルは、RIBOGREENによって測定されるように、総RNA含有量に従って調節された。結果は、未処置対照細胞と比較して、SNCAの阻害%として提示される。表4に図示されるように、SNCA mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置された細胞において、用量依存的に減少した。
ギャップマーは、実施例2において説明される研究から選択され、SH−SY5Y細胞において種々の用量で試験した。細胞を20,000の細胞/ウェルの密度でプレート培養して、エレクトロポレーションを使用して、表5に規定されるように、5μM、10μM、および20μM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約16時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、SNCA mRNAレベルを定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトSNCAプライマープローブセットRTS2620(フォワード配列GGTGCTTCCCTTTCACTGAAGT、本明細書では配列番号89として指定される;リバース配列ACATCGTAGATTGAAGCCACAAAA、本明細書では配列番号90として指定される、プローブ配列AATACATGGTAGCAGGGTCTTTGTGTGCTGTG、本明細書では配列番号91として指定される)を使用して、mRNAレベルを測定した。SNCA mRNAレベルは、RIBOGREENによって測定されるように、総RNA含有量に従って調節された。結果は、未処置対照細胞と比較して、SNCAの阻害%として提示される。表5に図示されるように、SNCA mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置された細胞において、用量依存的に減少した。
実施例2および3において本明細書で説明される研究で用量依存的阻害を実証したISISオリゴヌクレオチドについて、C57BL/6マウスにおける種々の代謝マーカーのレベルにおける変化を監視することによって、マウスモデルにおいて認容性を評価した。
C57BL/6マウスに、50mg/kgのISIS387973、ISIS387975、ISIS387978、ISIS387983、ISIS387984、ISIS387985、ISIS387986、ISIS388004、ISIS388008、ISIS388010、またはISIS388041を、週2回、3週間、皮下に注射投与した。対照群のマウスには、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を、週2回、3週間、皮下に注射投与した。最後の用量を受けてから48時間後に、マウスを犠牲にした。血漿をさらなる分析のために採取した。
肝機能に及ぼすISISオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、自動化臨床化学分析機(Hitachi Olympus AU400e,Melville,NY)を使用して、トランスアミナーゼの血漿濃度を測定した。ALT(アラニントランスアミナーゼ)およびAST(アスパラギン酸トランスアミナーゼ)の血漿濃度を処置期間の終了時に測定した。表6に提示される結果は、肝臓トランスアミナーゼが、ISIS387986以外、全ISISオリゴヌクレオチドに対して、正常パラメータ以内であったことを示す。
マウスの体重、ならびに肝臓、脾臓、および腎臓重量を、研究の終了時に測定した。測定された全重量は、PBS対照における対応する重量の13%以内であった。結果は、ISISオリゴヌクレオチドのいずれも、マウスの全体的健康にいかなる悪影響も及ぼさなかったことを実証する。
ISISオリゴヌクレオチドについて、さらにSNCA PAC(PAC−Tg(SNCAWT)Snca−/−)トランスジェニックマウスモデルにおいて、その有効性を評価した。これらのマウスは、ノックアウトSnca対立遺伝子と、PAC(P1人工染色体構造物)プロモーター下、ヒトSNCAをコードする導入遺伝子を内部に持つ。
4匹のSNCA PACマウス群は各々、100μgのISIS387973、ISIS387975、ISIS387978、ISIS387983、ISIS387984、ISIS387985、ISIS388004、ISIS388008、ISIS388010、またはISIS388041を線条体内ボーラス注射を介して注射投与された。対照群のマウスは、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を線条体内ボーラス注射を介して注射投与された。注射を受けてから2週間後に、マウスを犠牲にした。脳組織をさらなる分析のために採取した。
RNAは、ヒトSNCA mRNAのリアルタイムPCR分析のために、脳の線条体および皮質組織から抽出された。結果は、表7に提示されており、ISISオリゴヌクレオチドの大部分が、PBS対照と比較して、有意にヒトSNCA mRNAを阻害することを実証する。
付加的ギャップマーは、ISIS387984(配列番号1の開始部位404)とISIS387985(配列番号1の開始部位444)の標的部位間のSNCA遺伝子の領域を標的指向するように設計され、SNCA mRNAの有意な阻害を実証した。これらのギャップマーは、2つのギャップマー間の領域の相互から1個の核酸塩基だけシフトされた(すなわち、「マイクロウォーク」)ギャップマーを生成することによって設計された。新しいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5−10−5ギャップマーとして設計された。これらのギャップマーは、体外で試験した。ISIS387984およびISIS387985もまた、比較のためにアッセイに含めた。5,000個の細胞/ウェルの密度で培養されたSH−SY5Y細胞を、エレクトロポレーションを使用して、2,000nMアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約24時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、SNCA mRNAレベルを定量的リアルタイムPCRによって測定した。2つのヒトプライマープローブセット672(フォワード配列TGGCAGAAGCAGCAGGAAA、本明細書では配列番号95として指定される;リバース配列TCCTTGGTTTTGGAGCCTACA、本明細書では配列番号96として指定される;プローブ配列CAAAAGAGGGTGTTCTC、本明細書では配列番号97として指定される)およびプライマープローブセット673(フォワード配列GGAGCAGGGAGCATTGCA、本明細書では配列番号92として指定される;リバース配列CCTTCTTCATTCTTGCCCAACT、本明細書では配列番号93として指定される;プローブ配列CACTGGCTTTGTCAAAA、本明細書では配列番号94として指定される)を個々に使用し、SNCA mRNAレベルを測定した。SNCA mRNAレベルは、サイクロフィリンレベルによって測定されるように、総RNA含有量に従って調節された。結果は、未処置対照細胞と比較して、SNCAの阻害%として提示される。結果は、表8に提示される。
実施例6において本明細書で説明される研究において、有意な阻害を実証したISISオリゴヌクレオチドについて、さらに、SNCA PACマウスにおいて、その有効性を評価した。
12匹のSNCA PACマウス群に各々、50μgのISIS387985、ISIS489351、ISIS489352、ISIS489356、ISIS489357、ISIS489358、ISIS489359、ISIS489360、ISIS489373、ISIS489374、ISIS489381、またはISIS489383を線条体内ボーラス注射を介して注射投与した。対照群のマウスには、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を線条体内ボーラス注射を介して注射投与した。注射を受けてから2週間後に、マウスを犠牲にした。脳組織をさらなる分析のために採取した。
RNAを、プライマープローブセット673(前述の実施例6において本明細書で説明される)を使用して、ヒトSNCA mRNAのリアルタイムPCR分析のために、脳の海馬、線条体、および皮質組織から抽出した。結果は、表9に提示されており、ISISオリゴヌクレオチドの大部分が、PBS対照と比較して、ヒトSNCA mRNAを有意に阻害することを実証する。
実施例7において本明細書で説明される研究において、有意な阻害を実証したISISオリゴヌクレオチドについて、さらに、Thy1−aSYNマウスにおいて評価した。
4Thy1−aSYNマウス群に各々、50μgのISIS387985、ISIS489352、ISIS489356、およびISIS489357を、線条体内ボーラス注射を介して注射投与した。ペントバルビタール・ナトリウム(滅菌0.9%生理食塩水中66mg/kgネンブタール、腹腔内)でマウスに麻酔をかけた。次いで、マウスの頭皮を剃毛し、足反射の喪失後、マウスを定位固定フレーム(David Kopf Instruments,CA)に載置した。麻酔の外科的水準を維持するために、必要に応じて、ノーズコーンを介して、イソフルレン(0.5L/分で100%酸素中1−2%)をマウスに投与した。ベタジンおよび70%エタノールで3回代替払拭布を使用して、頭皮を滅菌した。頭皮を切開し、頭蓋骨表面を露出させ、ブレグマが明白に同定された。ブレグマに対して、0.5mm AP、2mm MLで、頭蓋骨に穴を穿孔した。0.2uL/分の流速で、微量注射器ポンプコントローラ(KD Scientific 310)に接続された27ゲージ針を伴う10uLのHamilton注射器を使用して、2μL溶液中50μgの用量で、ISIS387985、ISIS489352、ISIS489356、およびISIS489357を右側線条体中に一方的に注射した。頭蓋骨表面下3mmにおいて、DV座標を測定した。注射後、さらに3分間、針を定位置に残し、脳内に溶液を拡散させた。注射器をゆっくりと引き抜いた後、頭蓋骨を縫合し、マウスに、0.5mLの加温された滅菌生理食塩水を皮下注射し、補水を支援し、温水加温パッド上に載置し、意識および運動能力を回復するまで監視した。4匹のマウス群に、PBSを同様に注射した。マウスをそのホームケージに戻し、ケージの床上に、粉砕した食料を供給した。術後、毎日、マウスの体重および健康を監視した。注射を受けてから2週間後、マウスを犠牲にした。脳組織をさらなる分析のために採取した。4匹のマウス群に、PBSを同様に注射した。
サイクロフィリンA mRNAに正規化されたヒトSNCA mRNAのリアルタイムPCR分析のために、RNAを脳の線条体および皮質組織から抽出した。結果は、表10に提示される。
タンパク質を脳の線条体および皮質組織の細胞溶解物から抽出し、抗α−シヌクレイン、クローンSyn211(Millipore,NY)を使用して、ウェスタンブロット分析によって定量化した。結果は、α−チューブリンに正規化され、表11に提示される。
脳の線条体および皮質組織の吻側および尾側領域を個々に、アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する免疫蛍光抗体(Ab6653,ISIS Pharmaceuticals,CA)またはマウス抗SNCA(BD Transduction Laboratories,CA)を使用して、染色した。染色された区画の画像は、マイクロアレイスキャナ(Agilent Technologies,CA)を使用して取得した。免疫蛍光強度は、ImageJ(NIH)を使用して定量化した。免疫蛍光の定量化の結果は、表12および13に提示される。表12からの結果は、ゼロ強度と指定されたPBS対照レベルと比較して、脳の異なる領域に対して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの均等分布を実証する。表13は、対応する脳区画内のSNCAタンパク質レベルを提示し、ISISオリゴヌクレオチドのいくつかによって、SNCAの阻害を実証する。
脳の線条体および皮質組織の吻側および尾側領域もまた、個々に、免疫蛍光抗体ウサギ抗GFAP(Dako Inc,CA)または抗NeuN(Chemicon Inc)で染色した。染色された区画の画像は、マイクロアレイスキャナ(Agilent Technologies,CA)を使用して取得した。免疫蛍光強度は、ImageJ(NIH)を使用して定量化した。定量化の結果は、表14および15に提示される。表14は、アンチセンスオリゴヌクレオチド投与の結果、非特異的に中等度に増加される、グリア細胞繊維性酸性タンパク質(GFAP)のレベルを示す。これは、予期される転帰であって(Chiasson et al.,Cell.Mol.Neurobiol.1994.14:507−521)、結果は、増加が、有意ではないことを実証する。表15は、ニューロン毒性を示す、ニューロンマーカーであるNeuNに関するデータを提示する。結果は、ISISオリゴヌクレオチドのいずれも、PBS対照と比較して、NeuNレベルの増加を誘発しないことを示す。
実施例5において本明細書で説明される研究からのISISオリゴヌクレオチドのいくつかについて、さらに、ヒトSNCA(Rockenstein et al.,J.Neurosci.Res.68:568−578,2002)を過剰発現する、Thy1−aSYNマウスにおいて評価した。ISIS387978、ISIS387983、ISIS387984、およびISIS387985はすべて、Thy−aSYNマウスにおける導入遺伝子mRNAを標的指向し、本モデルにおいて処置された。
4Thy1−aSYNマウス群に各々、50μgのISIS387978、ISIS387983、ISIS387984、またはISIS387985を、線条体内ボーラス注射を介して、注射投与した。ペントバルビタール・ナトリウム(滅菌0.9%生理食塩水中66mg/kgネンブタール、腹腔内)でマウスに麻酔をかけた。次いで、マウスの頭皮を剃毛し、足反射の喪失後、マウスを定位固定フレーム(David Kopf Instruments,CA)に載置した。麻酔の外科的水準を維持するために、必要に応じて、ノーズコーンを介して、イソフルレン(0.5L/分で100%酸素中1−2%)をマウスに投与した。術中を通して、および術後30分間、酸素を投与した。直腸プローブ体温計(Physitemp)を使用して、マウスの体温を監視した。ベタジンおよび70%エタノールで3回代替払拭布を使用して、頭皮を滅菌した。頭皮を切開し、頭蓋骨表面を露出させ、ブレグマが明白に同定された。頭蓋骨表面が平坦である、すなわち、ブレグマ+/−2mm前後方向(AP)において、背腹(DV)偏差<0.2mmであることを確証後、ブレグマに対して、0.5mmAP、2mm内外方向(ML)で、頭蓋骨に穴を穿孔した。0.2uL/分の流速で、微量注射器ポンプコントローラ(KD Scientific 310)に接続された27ゲージ針を伴う10uLのHamilton注射器を使用して、2μL溶液中50μgの濃度で、ISISオリゴヌクレオチドの各々を右側線条体中に一方的に注射した。頭蓋骨表面下3mmにおいて、DV座標を測定した。注射後、さらに3分間、針を定位置に残し、脳内に溶液を拡散させた。注射器をゆっくりと引き抜いた後、頭蓋骨を縫合し、マウスに、0.5mLの加温された滅菌PBSを皮下注射し、補水を支援した。マウスを温水加温パッド上に載置し、意識および運動能力を回復するまで監視した。4匹のマウス群に、PBSを同様に注射した。次いで、動物をそのホームケージに戻し、ケージの床上に、粉砕した食料を供給した。術後、毎日、マウスの体重および健康を監視した。注射を受けてから2週間後、頚椎脱臼によって、マウスを犠牲にした。
mRNA精製のために、脳組織を0.5mL GITC/BMEおよび滅菌セラミックビーズを含有する2mL管中のドライアイス上で急冷した。サイクロフィリンA mRNAに正規化されたヒトSNCA mRNAのリアルタイムPCR分析のために、RNAを脳の線条体および皮質組織から抽出した。ヒトSNCA mRNAレベルを、ヒトプライマープローブセットRTS2618(フォワード配列AGACCAAAGAGCAAGTGACAAATG、本明細書では配列番号138として指定される;リバース配列CCTCCACTGTCTTCTGGGCTACT、本明細書では配列番号139として指定される;プローブ配列TGGAGGAGCAGTGGTGACGGGTG、配列番号140として指定される)を使用して測定した。結果は、表18に提示され、PBS対照と比較して、阻害%として表される。マウスSNCA mRNAレベルもまた、マウスプライマープローブセットRTS2956(フォワード配列GTCATTGCACCCAATCTCCTAAG、本明細書では配列番号141として指定される;リバース配列GACTGGGCACATTGGAACTGA、本明細書では配列番号142として指定される;プローブ配列CGGCTGCTCTTCCATGGCGTACAA、本明細書では配列番号143として指定される)を使用して測定した。結果は、表19に提示され、PBS対照と比較して、阻害%として表される。ISIS387978およびISIS387985は両方とも、配列番号137を標的指向するため、いずれかのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置も、マウスSNCA mRNA発現を阻害する。
タンパク質分析のための組織資料を、滅菌セラミックビーズを含有する管内に急冷した。SNCAのタンパク質レベルを、ヒトおよびマウスSNCAの両方を標的指向する抗SNCA抗体(Signet,#4D6)を使用して、ウェスタンブロット分析によって測定した。結果は、表20に提示され、PBS対照と比較した阻害%として表される。
各脳から1つの冠状断面を、尾側線条体のレベルにおいて採取した。PBS中で洗浄後、1時間、M.O.M.マウスIgG遮断試薬(Vector Laboratories,PK−2200)中で断面をインキュベートした。次いで、一次抗体である、マウス抗NeuN(1:500希釈;Chemicon MAB377)および6653Abウサギ抗ASO(1:3,000希釈;ISIS Pharmaceuticals)によって、PBS中2%NGS、0.5%Triton X−100において、4℃で一晩断面をインキュベートした。PBS中で洗浄後、二次抗体である、Cy3複合化ヤギ抗ウサギ(1:250希釈;Millipore)およびCy5複合化ヤギ抗マウス(1:250希釈;Jackson Immunoresearch)によって、PBS中5%NGSにおいて、2時間、断面をインキュベートした。いくつかの断面を二次抗体のみでインキュベートし、一次抗体インキュベーションを省略し、対照としての役割を果たすようにした。PBS中で洗浄後、水中において、ガラス顕微鏡スライド上に断面を搭載し、一晩乾燥させた。Cy3およびCy5蛍光色素を励起するために、レーザを使用する、高分解能マイクロアレイスキャナ(Agilent)を使用して、スライドをスキャンした。次いで、スキャンした断面の画像を、ImageJ(NIH)を使用して分析し、免疫蛍光染色の強度を定量化した。ASOを受けたマウスの脳から同側および対側半球の線条体および皮質中の染色の平均強度を計算し、対照マウスのものと比較した。PBS対照の免疫蛍光強度を基準値とし、任意に、1.00として指定した。結果は、表21に提示され、試験されたISISオリゴヌクレオチドの大部分において、軽微なニューロン毒性が存在したことを示す。
前述に説明される研究における有意な有効性を実証したISIS387985をThy1−aSYNマウスに投与する。運動機能、嗅覚、および空間記憶をマウスにおいて試験する。
3.5月齢の16匹のオスのThy1−aSYNマウス群各々に、脳注入キットを伴うAlzetミニポンプモデル#2002を使用して、2週間、50μg/日のISIS387985または滅菌PBSをICV注入した。この後、2週間の排出が続き、そこで、ミニポンプを除去し、マウスを回復させた。マウスは、4.5月齢からおよび5月齢において、挙動に関して試験する。挙動を分析するために使用される試験は、課題的梁および支柱のタスクを含む、運動試験(Fleming,S.M.etal.,JNeurosci.24:9434−9440,2004)、埋設ペレットを使用した嗅覚試験(Fleming,S.M.etal.,Eur.J.Neurosci.28:247−256,2008)、および新規場所認識を使用した空間作業記憶試験(Magenetal.,提出済み)である。マウスは、5月齢で安楽死させた。脳および周辺組織を生化学的および組織学的分析のために採取した。
Claims (22)
- ヒトα−シヌクレイン核酸に対して100%相補的な核酸塩基配列を有する、18、19または20個の結合されたヌクレオシドからなる1本鎖修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、当該修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号11、12、13、14、15、または16の少なくとも18個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有し、そしてここで当該オリゴヌクレオチドはα−シヌクレインmRNAレベルを減少させることができる、前記化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号11、12、13、14、15、または16に示される核酸塩基配列を含むかまたはそれからなる、請求項1に記載の化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも1個の修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項1または2に記載の化合物。
- 前記少なくとも1個の修飾ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項3に記載の化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも1個のヌクレオシドが、修飾糖を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記修飾糖が、二環式糖である、請求項5に記載の化合物。
- 前記二環式糖が、4’−CH(CH3)−O−2’架橋を含む、請求項6に記載の化合物。
- 少なくとも1個のテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドを含み、テトラヒドロピラン環は前記フラノース環を置換する、請求項5に記載の化合物。
- 前記少なくとも1個のテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドの各々が、以下の構造:
を有する、請求項8に記載の化合物。 - 前記修飾糖が、2’−O−メトキシエチル基を含む、請求項5に記載の化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも1個のヌクレオシドが、修飾核酸塩基を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記修飾核酸塩基が、5−メチルシトシンである、請求項11に記載の化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、
結合されたデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメントと、
結合されたヌクレオシドから成る5’ウィングセグメントと、
結合されたヌクレオシドから成る3’ウィングセグメントと、
を含み、前記ギャップセグメントは、前記5’ウィングセグメントと前記3’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の化合物。 - 前記修飾オリゴヌクレオチドが20個の結合されたヌクレオシドを含み、そして前記修飾オリゴヌクレオチドが、
10個の結合されたデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメントと、
5個の結合されたヌクレオシドから成る5’ウィングセグメントと、
5個の結合されたヌクレオシドから成る3’ウィングセグメントと、
を含み、前記ギャップセグメントは、前記5’ウィングセグメントと前記3’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、2’−O−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であって、各シトシンは5−メチルシトシンである、請求項13に記載の化合物。 - 修飾したオリゴヌクレオチドが複合体化したアンチセンス化合物である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の化合物。
- 神経変性疾患を有する動物を治療するための、請求項1〜15のいずれか1項に記載の化合物を含む医薬組成物。
- 前記治療することが、以下:
i)α−シヌクレインの発現を減少させること、
ii)運動協調を改善すること、
iii)嗅覚を改善すること、
iv)空間記憶を改善すること、または
v)α−シヌクレインの凝集を減少させること、
を含む、請求項16に記載の医薬組成物。 - 配列番号23、98、99、103、104、105、106、107、120および121から成る群から選択される核酸塩基配列から成る1本鎖修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、
10個の結合されたデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメントと、
5個の結合されたヌクレオシドから成る5’ウィングセグメントと、
5個の結合されたヌクレオシドから成る3’ウィングセグメントと、
を含み、前記ギャップセグメントは、前記5’ウィングセグメントと前記3’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、2’−O−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であって、各シトシンは5−メチルシトシンである、請求項18に記載の化合物。 - 前記修飾オリゴヌクレオチドが複合体化したアンチセンス化合物である、請求項18または19に記載の化合物。
- 神経変性疾患を有する動物を治療するための、請求項18〜20のいずれか1項に記載の化合物を含む医薬組成物。
- 前記治療することが、以下:
i)α−シヌクレインの発現を減少させること、
ii)運動協調を改善すること、
iii)嗅覚を改善すること、
iv)空間記憶を改善すること、または
v)α−シヌクレインの凝集を減少させること、
を含む、請求項21に記載の医薬組成物。
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