KR20210062627A - 알파-시뉴클레인에 대한 변이형 RNAi - Google Patents

알파-시뉴클레인에 대한 변이형 RNAi Download PDF

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Abstract

본 명세서에는 신경 퇴행성 시뉴클레인병증(neurodegenerative synucleinopathy)을 치료하기 위한 RNAi 분자가 제공된다. 일부 구현예에서, RNAi 분자는 알파-시뉴클레인(SNCA)의 발현을 표적화한다. 또한, 본 명세서에는 RNAi를 함유하는 발현 작제물, 벡터(예를 들어, rAAV), 세포, 바이러스 입자, 및 약제학적 조성물이 제공된다. 추가로 본 명세서에는, 예를 들어 파킨슨병, 다계통 위축증, 및 루이 소체 치매를 포함하는 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하기 위한, RNAi의 용도와 관련된 방법 및 키트가 제공된다.

Description

알파-시뉴클레인에 대한 변이형 RNAi
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2018년 8월 3일자로 출원된 미국 가출원 제62/714,616호의 우선권 이익을 주장하며, 이 가출원은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일 형식의 서열 목록의 제출
ASCII 텍스트 파일 형식의 하기 제출물의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다: 컴퓨터 판독 가능한 형태(CRF)의 서열 목록(파일명: 159792016540SEQLIST.TXT, 기록일: 2019년 7월 31일, 크기: 19 KB).
기술분야
본 개시는 변이형 RNAi 분자에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 개시는 알파-시뉴클레인에 대한 변이형 RNAi에 관한 것이다.
장기(long-term) 신경 보호 치료법은 파킨슨병 또는 다계통 위축증(MSA)과 같은 신경 퇴행성 시뉴클레인병증(neurodegenerative synucleinopathy)의 치료에 관하여 상당한 관심을 받고 있다. RNA 간섭(RNAi)은 표적에 상보적인 RNA(siRNA)를 도입하여 표적 mRNA를 감소시키는 메커니즘이다. 또한 siRNA 서열은 구성적 중합효소 II 기반 발현을 가능하게 하면서 뇌에서 siRNA 또는 shRNA의 도입과 관련된 신경 독성도 제거하는 인공 miRNA 스캐폴드에 삽입될 수 있다("shmiRNA")(1).
RNAi의 임상적 개발의 장애물은, RNAi의 시드(seed) 영역(전형적으로 뉴클레오티드 1-7 또는 1-8)이 3' 비번역 영역(UTR)에 있는 비-표적 mRNA의 서열과 쌍을 형성하여 전사체 불안정화를 일으키는 오프-타겟(off-target) 침묵의 가능성이다. 오프-타겟 침묵을 감소시키려는 시도는, 오프-타겟 가능성은 최소이면서 표적 mRNA에 대해 높은 특이성을 갖는 후보 시드 서열을 확인하기 위해 알고리즘을 이용하는 것(문헌[Boudreau RL et al., (2012) Nucl. Acids Res. 41(1):e9]) 및 RNAi의 가이드(guide) 영역에 내부 벌지(bulge)를 위치시키는 것(문헌[Terasawa et al., (2011) Journal of nucleic acids 2011:131579])을 포함한다.
다수의 일련의 증거는 알파-시뉴클레인(SNCA) 수준의 증가가 신경 독성인 한편, 감소가 신경 보호적임을 보여준다(2 내지 9). 그러므로, SNCA 수준을 낮추는 치료 전략은 잠재적으로 신경 퇴행성 질병의 진행을 중지시키고 그 증상을 완화시킬 수 있다. RNAi 메커니즘을 활용하는 그러한 치료 전략이 필요한 실정이다.
본 출원은 SNCA에 대한 변이형 RNAi 분자 및 이를 신경 퇴행성 질병의 치료 및 예방에 사용하는 방법을 제공함으로써 그러한 필요를 충족시킨다. 본 출원은 또한 SNCA에 대한 RNAi 분자를 스크리닝하거나 확인하는 방법 및 이러한 RNAi 분자를 제조하기 위한 작제물을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 제공하며, 여기서 a) 제1 가닥과 제2 가닥은 이중체를 형성하고; b) 제1 가닥은 가이드 영역을 포함하고, 여기서 가이드 영역은 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)와 적어도 약 90% 동일성을 갖거나 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산을 포함하고; c) 제2 가닥은 비-가이드(non-guide) 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 영역은 핵산 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)를 포함하고, 비-가이드 영역은 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 가닥은 SEQ ID NO: 24와 약 90% 동일성을 갖거나 SEQ ID NO: 53과 약 90% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 영역은 핵산 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)를 포함하고, 비-가이드 영역은 서열 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 가닥은 SEQ ID NO: 37과 약 90% 동일성을 갖거나 SEQ ID NO: 37과 약 90% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 가닥과 제2 가닥은 루프 구조를 형성할 수 있는 RNA 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, RNA 링커는 4개 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 루프 구조는 4개 내지 20개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi는 5'에서 3'로 제2 가닥, RNA 링커, 및 제1 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi는 5'에서 3'로 제1 가닥, RNA 링커, 및 제2 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi는 SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 63의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi는 SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 63의 뉴클레오티드 서열과 약 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi는 작은 저해성 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 또는 작은 헤어핀 RNA(shRNA)이다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, RNAi는 신경 퇴행성 시뉴클레인병증과 관련된 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA를 표적화한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 알파-시뉴클레인(SNCA)이다. 일부 구현예에서, 알파 시뉴클레인은 인간 알파-시뉴클레인이다. 일부 구현예에서, 신경 퇴행성 시뉴클레인병증은 파킨슨병(PD), 다계통 위축증(MSA), 또는 루이 소체 치매(DLB)이다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 RNAi를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 작제물을 제공한다. 일부 구현예에서, RNAi를 인코딩하는 핵산은 miRNA 스캐폴드를 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi를 인코딩하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시형 초기 프로모터, RSV LTR, MoMLV LTR, 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, CK6 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터(TTR), TK 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), HBV 프로모터, hAAT 프로모터, LSP 프로모터, 키메라 간 특이적 프로모터(LSP), E2F 프로모터, 텔로머라제(hTERT) 프로모터; 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴/토끼 β-글로빈 프로모터(CAG) 프로모터, 신장 인자 1-알파 프로모터(EFl-알파) 프로모터, 인간 β-글루쿠로니다제 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, 및 13-액틴 프로모터로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 발현 작제물은 인트론을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 CBA 인트론 또는 hEF1알파 인트론이다. 일부 구현예에서, 인트론은 키메라 인트론이다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 자기 상보성 벡터이고, 인트론은 델타 키메라 인트론이다. 일부 구현예에서, 발현 작제물은 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리아데닐화 신호, 또는 HSV TK 폴리아데닐화 신호이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 발현 작제물 중 임의의 것을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 벡터는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 벡터이다. 일부 구현예에서, 발현 작제물은 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat, ITR) 서열에 의해 플랭킹되어 있다. 일부 구현예에서, 발현 작제물은 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹되어 있다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR이다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다. 일부 구현예에서, 벡터는 스터퍼(stuffer) 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 RNAi를 인코딩하는 핵산의 업스트림 또는 다운스트림에 위치한다. 일부 구현예에서, 벡터는 자기 상보성 rAAV 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 RNAi를 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 RNAi의 상보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 그 길이의 대부분 또는 전부를 따라 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되어 있으며, 여기서 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열(terminal resolution sequence)의 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터 중 임의의 것을 포함하는 세포를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터 중 임의의 것을 포함하는 재조합 AAV 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV2-HBKO, AAVDJ8, AAVPHP.B, AAVPHP.eB, AAVBR1, AAVHSC15, AAVHSC17, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV 또는 마우스 AAV 캡시드 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 바이러스 입자의 캡시드 및 ITR은 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, rAAV 바이러스 입자의 캡시드 및 ITR은 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR은 AAV2로부터 유래되고, rAAV 입자의 캡시드는 AAV1로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 rAAV 입자 중 임의의 것을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 RNAi 중 임의의 것을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 AAV 입자 중 임의의 것을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 조성물 중 임의의 것을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 사용 설명서를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은, 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 또는 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥, 및 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 제2 핵산은 서열 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산 또는 서열 5'-E1패신저(passenger)-3'(SEQ ID NO: 37)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은, 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하거나, 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은, 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 또는 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 제1 가닥, 및 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 신경 퇴행성 질병에 걸린 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 알파-시뉴클레인의 발현을 저해하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 제2 핵산은 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산 또는 서열 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은, 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하거나, 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 신경 퇴행성 질병에 걸린 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 알파-시뉴클레인의 발현을 저해하는 방법을 제공한다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 제1 가닥은 SEQ ID NO: 24의 서열을 갖는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 8의 서열을 갖는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 가닥은 SEQ ID NO: 53의 서열을 갖는 핵산 또는 SEQ ID NO: 37의 서열을 갖는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 가닥과 제2 가닥은 루프 구조를 형성할 수 있는 RNA 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, RNA 링커는 4개 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 루프 구조는 4개 내지 20개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi는 5'에서 3'로 제2 가닥, RNA 링커, 및 제1 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi는 5'에서 3'로 제1 가닥, RNA 링커, 및 제2 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi는 SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 63의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi는 SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 63의 뉴클레오티드 서열과 약 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi는 작은 저해성 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 또는 작은 헤어핀 RNA(shRNA)이다.
상기 방법의 일부 구현예에서, RNAi는 신경 퇴행성 시뉴클레인병증과 관련된 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA를 표적화한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 알파-시뉴클레인(SNCA)이다. 일부 구현예에서, 알파 시뉴클레인은 인간 알파-시뉴클레인이다. 일부 구현예에서, 신경 퇴행성 시뉴클레인병증은 파킨슨병(PD), 다계통 위축증(MSA), 또는 루이 소체 치매(DLB)이다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 RNAi를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 작제물을 제공한다. 일부 구현예에서, RNAi를 인코딩하는 핵산은 miRNA 스캐폴드를 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi를 인코딩하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시형 초기 프로모터, RSV LTR, MoMLV LTR, 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, CK6 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터(TTR), TK 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), HBV 프로모터, hAAT 프로모터, LSP 프로모터, 키메라 간 특이적 프로모터(LSP), E2F 프로모터, 텔로머라제(hTERT) 프로모터; 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴/토끼 β-글로빈 프로모터(CAG) 프로모터, 신장 인자 1-알파 프로모터(EFl-알파) 프로모터, 인간 β-글루쿠로니다제 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, 및 13-액틴 프로모터로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 발현 작제물은 인트론을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 CBA 인트론 또는 hEF1알파 인트론이다. 일부 구현예에서, 인트론은 키메라 인트론이다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 자기 상보성 벡터이고, 인트론은 델타 키메라 인트론이다. 일부 구현예에서, 발현 작제물은 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리아데닐화 신호, 또는 HSV TK 폴리아데닐화 신호이다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 발현 작제물 중 임의의 것을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 벡터는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 벡터이다. 일부 구현예에서, 발현 작제물은 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복부(ITR) 서열에 의해 플랭킹되어 있다. 일부 구현예에서, 발현 작제물은 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹되어 있다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR이다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다. 일부 구현예에서, 벡터는 스터퍼 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 RNAi를 인코딩하는 핵산의 업스트림 또는 다운스트림에 위치한다. 일부 구현예에서, 벡터는 자기 상보성 rAAV 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 RNAi를 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 RNAi의 상보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 그 길이의 대부분 또는 전부를 따라 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되어 있으며, 여기서 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함한다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터 중 임의의 것을 포함하는 재조합 AAV 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV2-HBKO, AAVDJ8, AAVPHP.B, AAVPHP.eB, AAVBR1, AAVHSC15, AAVHSC17, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV 또는 마우스 AAV 캡시드 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 바이러스 입자의 캡시드 및 ITR은 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, rAAV 바이러스 입자의 캡시드 및 ITR은 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR은 AAV2로부터 유래되고, rAAV 입자의 캡시드는 AAV1로부터 유래된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 조성물 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
특허 출원 및 간행물을 비롯한 본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다.
도 1a는 D1 shmiRNA(SEQ ID NO: 61)의 구조를 도시하고, 도 1b는 E1 shmiRNA(SEQ ID NO: 63)의 구조를 도시한다.
도 2는 시험관내에서 인간 SNCA의 RNAi 매개 감소를 도시한다. 표시된 RNAi 서열을 shmiRNA 포맷(format) 및 인간 SNCA cDNA로 인코딩하는 플라스미드에 의한 트랜스펙션 후 72시간째의 HEK293T 세포의 전 세포 추출물에서의 SNCA의 정량화. SNCA 수준을 GAPDH 로딩 대조군에 대해 정규화하고, 대조군(비-표적화 대조 RNAi)에 대해 정규화하여 녹다운(knockdown) 퍼센트를 계산하였다.
도 3은 시험관내에서 마우스 SNCA의 RNAi 매개 감소를 도시한다. 표시된 RNAi 서열을 miRNA 포맷 및 마우스 SNCA cDNA로 인코딩하는 플라스미드에 의한 트랜스펙션 후 72시간째의 HEK293T 세포의 전 세포 추출물에서의 SNCA의 정량화. SNCA 수준을 GAPDH 로딩 대조군에 대해 정규화하고, 대조군(비-표적화 대조 RNAi)에 대해 정규화하여 녹다운 퍼센트를 계산하였다.
도 4a 내지 도 4d는 시험관내에서 마우스 또는 인간 알파-시뉴클레인 단백질의 RNAi 매개 감소를 도시한다. 표시된 RNAi 서열을 siRNA 포맷 및 인간 SNCA cDNA(도 4a) 또는 마우스 SNCA cDNA(도 4b)로 인코딩하는 플라스미드에 의한 트랜스펙션 후 72시간째의 HEK293T 세포의 전 세포 추출물에서의 SNCA의 정량 분석 다이어그램. SNCA 단백질 수준을 베타 튜불린에 대해 정규화하고, 대조군(비-표적화 대조 RNAi)에 대해 정규화하여 인간 SNCA(도 4c) 및 마우스 SNCA(도 4d)에 대한 웨스턴 블롯팅 이미지로 나타낸 바와 같은 녹다운 퍼센트를 계산하였다.
도 5a 및 도 5b는 트랜스펙션된 LUHMES 세포에서의, 표시된 RNAi 서열의 독성을 도시한다. LUHMES 세포를 miRNA 포맷의 표시된 RNAi 서열로 트랜스펙션시키고, 이어서 로테논(rotenone)으로 처리하여 세포 독성을 유도했다. (도 5a) 로테논 처리 후 48시간째에 Cell Titer Blue® 검정을 통해 측정된 세포 생존율로서, D1 및 E1 RNAi 서열 둘 모두에 의해 유의한 신경 보호(각각 38% 및 40%)를 나타냈지만, 대조 RNAi 서열의 경우에는 그렇지 않았다. 평균 신경 보호 %는 대조군으로부터의 변화 %로 계산된다. (도 5b) 반응성 산소 종은 로테논 유도 독성의 추가 판독 값(readout)으로 측정된다.
도 6은 SNCA 녹다운과 신경 보호의 양의 상관 관계를 도시한다. 도 5로부터의 (세포 생존율로서의) 신경 보호 퍼센트를 각각의 실험에서 D1 또는 E1으로부터의 녹다운 수준에 대해 플롯팅하였다. 두 RNAi 서열 모두는 로테논 처리된 LUHMES 세포에서 녹다운 퍼센트와 신경 보호 수준의 유의한 양의 상관 관계(Pearson)를 보여주었다.
도 7은 생체내에서 miRNA 포맷의 표시된 RNAi에 의한 표적 mRNA 녹다운을 도시한다. 막대는 평균 +/- SEM을 나타낸다. 원은 개별 동물을 나타낸다. 유의성은 다중 비교와 함께 일원 분산 분석을 통해 평가되었다.
도 8은 AAV-D1 벡터의 주입 후 마우스의 중뇌 전반에 걸친 SNCA mRNA의 감소를 도시한다. 마우스에 1e10 GC 대조군 또는 D1 바이러스를 편측으로(unilaterally) 주입했다. 조직을 수집하고, 1개월 후 원위치 하이브리드화(in situ hybridization)를 위해 처리했다. SNCA 안티센스 프로브는 대측(contralateral) 반구에 비해 머리에서 꼬리쪽으로의 3군데의 상이한 해부학적 레벨에서 표적 감소를 명확히 보여준다. 대조 RNAi 바이러스는 주입되지 않은 반구에 비해 SNCA mRNA의 어떠한 감소도 나타내지 않았다.
도 9는 SNc 면역조직화학 및 원위치 하이브리드화를 통한 마우스에서의 SNCA 단백질 및 mRNA의 감소를 도시한다.
도 10은 AAV.rh10-E1 벡터의 전달 후 SNc 면역조직화학 및 원위치 하이브리드화를 통한 마우스에서의 SNCA 단백질 및 mRNA의 감소를 도시한다.
도 11은 각각의 샘플 그룹에 대한 개별 생물학적 복제물(replicate)에서 α-시뉴클레인 정규화된 발현을 도시하며; EV는 "빈 벡터(empty vector)"를 의미한다.
일부 양태에서, 본 개시는 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하기 위한 RNAi를 제공한다. 일부 구현예에서, 신경 퇴행성 시뉴클레인병증은 파킨슨병 또는 다계통 위축증(MSA)이다. 일부 구현예에서, RNAi는 알파-시뉴클레인을 표적화한다. 일부 구현예에서, RNAi는 알파-시뉴클레인의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, RNAi는 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi는 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi는 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi는 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시는 본 개시의 RNAi를 포함하는 발현 작제물, 벡터(예를 들어, 재조합 AAV 벡터), 세포, 바이러스 입자(예를 들어, AAV 입자), 및 약제학적 조성물을 제공한다. 추가의 양태에서, 본 개시는 본 개시의 RNAi를 포함하는 약제학적 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하고, SNCA의 발현을 저해하고, 포유동물의 세포에서 SNCA의 축적을 저해하는 방법을 제공한다. 다른 추가의 양태에서, 본 개시는 신경 퇴행성 시뉴클레인병증에 걸린 포유동물에서 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료(예를 들어, 신경 퇴행성 시뉴클레인병증의 증상을 개선)하거나, SNCA의 발현을 저해하거나, 세포에서 SNCA의 축적을 저해하기 위한 본 개시의 RNAi를 포함하는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 시뉴클레인병증은 파킨슨병, 다계통 위축증 또는 루이 소체 치매이다.
I. 일반 기법
본 명세서에 기재되거나 언급된 기법 및 절차는 당업자에게 의해 일반적으로 잘 이해되어 있고, 예를 들어, 하기 문헌에 기재된 널리 이용되는 방법과 같은 종래의 방법을 사용하여 통상적으로 이용된다: 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012)]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003)]; 문헌[the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)]; 문헌[PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995)]; 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988)]; 문헌[Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010)]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)]; 문헌[Methods in Molecular Biology, Humana Press]; 문헌[Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998)]; 문헌[Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998)]; 문헌[Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8)]; 문헌[Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996)]; 문헌[Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)]; 문헌[PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; 문헌[Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)]; 문헌[Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002)]; 문헌[Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004)]; 문헌[Antibodies (P. Finch, 1997)]; 문헌[Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; 문헌[Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; 문헌[Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; 문헌[The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]; 및 문헌[Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011)].
II. 정의
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "벡터"는 시험관내 또는 생체내에서 숙주 세포 내로 전달될 핵산을 포함하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드인 임의의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 이러한 용어는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 다중 가닥 DNA 또는 RNA, 유전체 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 염기와 피리미딘 염기, 다른 천연 뉴클레오티드 염기, 화학적 또는 생화학적으로 변형된 뉴클레오티드 염기, 비천연 뉴클레오티드 염기 또는 유도체화 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 폴리뉴클레오티드의 백본(backbone)은 당 및 포스페이트기(RNA 또는 DNA에서 전형적으로 발견될 수 있는 바와 같음), 또는 변형되거나 치환된 당 또는 포스페이트기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드의 백본은 포스포라미데이트와 같은 합성 서브유닛의 중합체를 포함할 수 있고, 이에 따라 올리고데옥시뉴클레오시드 포스포라미데이트(P-NH2) 또는 혼합형 포스포라미데이트-포스포디에스테르 올리고머일 수 있다. 또한, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는, 상보적 가닥을 합성하고 적절한 조건 하에서 가닥을 어닐링하거나, 적절한 프라이머와 함께 DNA 중합효소를 이용하여 상보적 가닥을 새로 합성함으로써 화학적 합성의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 생성물로부터 얻을 수 있다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용되며, 최소 길이로 한정되지 않는다. 이러한 아미노산 잔기의 중합체는 천연 또는 비천연 아미노산 잔기를 함유할 수 있으며, 아미노산 잔기의 펩티드, 올리고펩티드, 이합체, 삼합체 및 다합체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 전장 단백질 및 이의 단편 둘 모두가 정의에 포함된다. 이러한 용어는 또한 폴리펩티드의 발현후 변형, 예를 들어, 당화, 시알화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 또한, 본 개시의 목적상, "폴리펩티드"는 단백질이 요망되는 활성을 유지하는 한 천연 서열에 대한 변형, 예를 들어 결실, 첨가 및 치환(일반적으로 사실상 보존성 치환)을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이러한 변형은 부위 특이적 돌연변이유발을 통해 이루어지는 것과 같이 계획적일 수 있거나, 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오류를 통해 이루어지는 것과 같이 우발적일 수 있다.
"재조합 바이러스 벡터"는 하나 이상의 이종성 서열(즉, 바이러스 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 벡터를 지칭한다. 재조합 AAV 벡터의 경우, 재조합 핵산은 적어도 하나의, 그리고 일부 구현예에서는 2개의, 역위 말단 반복부 서열(ITR)에 의해 플랭킹되어 있다.
"재조합 AAV 벡터(rAAV 벡터)"는 적어도 하나의, 그리고 구현예에서는 2개의, AAV 역위 말단 반복부 서열(ITR)에 의해 플랭킹되어 있는 하나 이상의 이종성 서열(즉, AAV 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 벡터를 지칭한다. 이러한 rAAV 벡터는, 적합한 헬퍼 바이러스로 감염되었고(또는 적합한 헬퍼 기능을 발현하고) AAV rep 및 cap 유전자 생성물(즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 발현하는, 숙주 세포에 존재하는 경우 복제되어 감염성 바이러스 입자 내로 패키징될 수 있다. rAAV 벡터가 더 큰 폴리뉴클레오티드 내로(예를 들어, 염색체 또는 또 다른 벡터, 예를 들어, 클로닝 또는 트랜스펙션에 사용되는 플라스미드에) 혼입되는 경우, rAAV 벡터는 AAV 패키징 기능 및 적합한 헬퍼 기능의 존재 하에 복제 및 캡시드화에 의해 "구제(rescue)"될 수 있는 "프로-벡터(pro-vector)"로 지칭될 수 있다. rAAV 벡터는 플라스미드, 선형 인공 염색체, 지질과 복합체화된 형태, 리포솜 내에 캡슐화된 형태, 및 바이러스 입자, 예를 들어 AAV 입자에 캡시드화된 형태를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 형태 중 임의의 형태로 존재할 수 있다. rAAV 벡터는 AAV 바이러스 캡시드 내로 패키징되어 "재조합 아데노 관련 바이러스 입자(rAAV 입자)"를 생성시킬 수 있다.
"이종성"은 비교되거나, 또는 도입되거나 혼입되는 나머지 엔티티(entity)와 유전자형적으로 별개인 엔티티로부터 유래됨을 의미한다. 예를 들어, 상이한 세포 유형 내로 유전 공학 기법에 의해 도입된 폴리뉴클레오티드는 이종성 폴리뉴클레오티드이다(그리고, 발현된 경우, 이종성 폴리펩티드를 인코딩할 수 있음). 유사하게, 바이러스 벡터 내로 혼입된 세포 서열(예를 들어, 유전자 또는 이의 일부)은 벡터에 대하여 이종성 뉴클레오티드 서열이다.
용어 "트랜스진"은 세포 내로 도입되어 RNA로 전사될 수 있고, 선택적으로, 적절한 조건 하에서 번역되고/되거나 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 양태에서, 이는 그것이 도입된 세포에 요망되는 특성을 부여하거나, 그렇지 않은 경우 요망되는 치료 또는 진단 결과를 생성시킨다. 또 다른 양태에서, 이는 RNA 간섭을 매개하는 분자, 예를 들어 miRNA, siRNA, 또는 shRNA로 전사될 수 있다.
"닭 β-액틴(CBA) 프로모터"는 닭 β-액틴 유전자(예를 들어, GenBank Entrez Gene ID 396526으로 표시되는 갈루스 갈루스(Gallus gallus) 베타 액틴)로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "닭 β-액틴 프로모터"는 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서 요소, 닭 β-액틴 유전자의 프로모터 및 제1 엑손과 인트론, 및 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체를 함유하는 프로모터, 예를 들어 문헌[Miyazaki, J., et al. (1989) Gene 79(2):269-77]에 기재된 서열을 지칭할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CAG 프로모터"가 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CMV 초기 인핸서/닭 베타 액틴(CAG) 프로모터"가 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
바이러스 역가와 관련하여 사용되는 바와 같은 용어 "유전체 입자(gp)", "유전체 당량" 또는 "유전체 카피"는 감염성 또는 기능성과 무관하게 재조합 AAV DNA 유전체를 함유하는 비리온의 개수를 지칭한다. 특정 벡터 제조물 내의 유전체 입자의 개수는 본 명세서의 실시예, 또는 예를 들어, 문헌[Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039]; 문헌[Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278]에 기재된 바와 같은 절차에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "벡터 유전체(vg)"는 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터의 일련의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. 벡터 유전체는 바이러스 입자에 캡시드화될 수 있다. 특정 바이러스 벡터에 따라, 벡터 유전체는 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 또는 단일 가닥 RNA, 또는 이중 가닥 RNA를 포함할 수 있다. 벡터 유전체는 특정 바이러스 벡터와 관련된 내인성 서열 및/또는 재조합 기법을 통해 특정 바이러스 벡터 내로 삽입되는 임의의 이종성 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 AAV 벡터 유전체는 프로모터를 플랭킹하는 적어도 하나의 ITR 서열, 스터퍼, 관심 서열(예를 들어, RNAi) 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 완전한 벡터 유전체는 벡터의 완전한 세트의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 핵산 역가는 vg/㎖로 측정될 수 있다. 이러한 역가를 측정하기에 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 정량 PCR).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "저해"는 특정 표적을 차단하거나, 감소시키거나, 제거하거나, 그의 존재 또는 활성을 다른 방식으로 길항하는 행위를 지칭할 수 있다. 저해는 부분적 저해 또는 완전한 저해를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 유전자의 발현을 저해한다는 것은 mRNA 존재비(abundance)의 감소(예를 들어, mRNA 전사를 침묵시킴), mRNA의 분해, mRNA 번역의 저해 등을 포함하는, 유전자 발현의 차단, 감소, 제거, 또는 임의의 다른 길항작용을 일으키는 임의의 행위를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, SNCA의 발현을 저해한다는 것은 SNCA mRNA 존재비의 감소(예를 들어, SNCA mRNA 전사를 침묵시킴), SNCA mRNA의 분해, SNCA mRNA 번역의 저해 등을 포함하는, SNCA 발현의 차단, 감소, 제거, 또는 임의의 다른 길항작용을 일으키는 임의의 행위를 지칭할 수 있다. 또 다른 예로서, 세포에서 단백질의 축적을 저해한다는 것은 mRNA 존재비의 감소(예를 들어, mRNA 전사를 침묵시킴), mRNA의 분해, mRNA 번역의 저해, 단백질의 분해 등을 포함하는, 단백질 발현의 차단, 감소, 제거, 또는 임의의 다른 길항작용을 일으키는 임의의 행위를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포에서 SNCA 단백질의 축적을 저해한다는 것은 SNCA mRNA 존재비의 감소(예를 들어, SNCA mRNA 전사를 침묵시킴), SNCA mRNA의 분해, SNCA mRNA 번역의 저해, SNCA 단백질의 분해 등을 포함하는, 세포에서의 SNCA 단백질 발현의 차단, 감소, 제거, 또는 임의의 다른 길항작용을 지칭한다.
바이러스 역가와 관련하여 사용되는 바와 같은 용어 "감염 단위(iu)", "감염성 입자" 또는 "복제 단위"는, 예를 들어, 문헌[McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973]에 기재된 바와 같이 복제 중심 검정으로도 알려진 감염성 중심 검정에 의해 측정되는 바와 같은 감염성 및 복제 능력이 있는 재조합 AAV 벡터 입자의 개수를 지칭한다.
바이러스 역가와 관련하여 사용되는 바와 같은 용어 "형질도입 단위(tu)"는 본 명세서의 실시예 또는 예를 들어, 문헌[Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124]; 또는 문헌[Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (LFU assay)]에 기재된 바와 같은 기능 검정에서 측정되는 바와 같은 기능성 트랜스진 생성물을 생성시키는 감염성 재조합 AAV 벡터 입자의 개수를 지칭한다.
"역위 말단 반복부" 또는 "ITR" 서열은 당업계에서 잘 이해되어 있는 용어로서, 반대 배향으로 존재하는 바이러스 유전체의 말단에서 발견되는 비교적 짧은 서열을 지칭한다.
당업계에서 잘 이해되어 있는 용어인 "AAV 역위 말단 반복부(ITR)" 서열은 천연 단일 가닥 AAV 유전체의 양 말단에 존재하는 대략 145개의 뉴클레오티드 서열이다. ITR의 가장 바깥쪽의 125개의 뉴클레오티드는 2가지의 택일적 배향 중 어느 하나로 존재하여 다양한 AAV 유전체 사이에 그리고 단일 AAV 유전체의 2개의 말단 사이에 이질성을 가져올 수 있다. 가장 바깥쪽의 125개의 뉴클레오티드는 또한 여러 개의 더 짧은 자기 상보성 영역(A, A', B, B', C, C' 및 D 영역으로 표시됨)을 함유하여, ITR의 이러한 부분 내에서 가닥내 염기쌍 형성이 일어날 수 있게 한다.
"말단 분해 서열" 또는 "trs"는 바이러스 DNA 복제 동안 AAV rep 단백질에 의해 절단되는 AAV ITR의 D 영역에 있는 서열이다. 돌연변이 말단 분해 서열은 AAV rep 단백질에 의한 절단이 어렵다.
"AAV 헬퍼 기능"은 AAV가 숙주 세포에 의해 복제되고 패키징될 수 있게 하는 기능을 지칭한다. AAV 헬퍼 기능은, AAV 복제 및 패키징을 돕는 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 형태 중 임의의 형태로 제공될 수 있다. 유전독성인자(genotoxic agent)와 같은 다른 AAV 헬퍼 기능이 당업계에 알려져 있다.
AAV에 대한 "헬퍼 바이러스"는 AAV(결손 파보바이러스임)가 숙주 세포에서 복제되고 패키징될 수 있게 하는 바이러스를 지칭한다. 헬퍼 바이러스는 AAV의 복제를 가능하게 하는 "헬퍼 기능"을 제공한다. 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 폭스바이러스, 예를 들어, 백시니아 및 바큘로바이러스를 비롯한 다수의 이러한 헬퍼 바이러스가 확인되었다. 아데노바이러스는 다수의 상이한 서브그룹을 포함하지만, 서브그룹 C의 아데노바이러스 5형(Ad5)이 가장 통상적으로 사용된다. 인간, 비-인간 포유동물 및 조류 기원의 많은 아데노바이러스가 공지되어 있으며, ATCC와 같은 기탁기관으로부터 이용 가능하다. ATCC와 같은 기탁기관으로부터 또한 이용 가능한 헤르페스과의 바이러스는, 예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 사이토메갈로바이러스(CMV) 및 가성광견병 바이러스(PRV)를 포함한다. AAV의 복제를 위한 아데노바이러스 헬퍼 기능의 예는 E1A 기능, E1B 기능, E2A 기능, VA 기능 및 E4orf6 기능을 포함한다. 기탁기관으로부터 이용 가능한 바큘로바이러스는 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 다각체병 바이러스(nuclear polyhedrosis virus)를 포함한다.
rAAV의 제조물은, 감염성 AAV 입자 대 감염성 헬퍼 바이러스 입자의 비가 적어도 약 102:1; 적어도 약 104:l, 적어도 약 106:l; 또는 적어도 약 108:l 또는 그 이상인 경우 헬퍼 바이러스가 "실질적으로 없다"고 한다. 일부 구현예에서, 제조물은 등가량의 헬퍼 바이러스 단백질(즉, 상기 언급된 헬퍼 바이러스 입자 불순물이 붕괴된 형태로 존재하는 경우 그러한 수준의 헬퍼 바이러스의 결과로서 존재할 것인 단백질)이 또한 없다. 바이러스 및/또는 세포 단백질 오염은 일반적으로 SDS 겔 상의 쿠마시 염색 밴드의 존재(예를 들어, AAV 캡시드 단백질 VPl, VP2 및 VP3에 상응하는 밴드가 아닌 밴드의 출현)로서 관찰될 수 있다.
참조 폴리펩티드 또는 핵산 서열에 대한 "서열 동일성 퍼센트(%)"는, 서열들을 정렬시키고, 필요에 따라, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 갭을 도입하고, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존성 치환을 고려하지 않은 후의, 참조 폴리펩티드 또는 핵산 서열의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율로 정의된다. 아미노산 또는 핵산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 비롯해 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987), Supp. 30, section 7.7.18, Table 7.7.1]에 기재된 것을 이용하여 달성될 수 있다. 정렬 프로그램의 바람직한 예는 ALIGN Plus(Scientific and Educational Software, Pennsylvania)이다. 당업자는 비교되는 서열들의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 본 개시의 목적상, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 또는 이와의, 또는 이에 비한, 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 %(이는 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 또는 이와, 또는 이에 비해 특정한 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 대안적으로 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다: 100 × 분율 X/Y, 여기서 X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일한 매치로 기록된 아미노산 잔기의 개수이고, Y는 B 의 총 아미노산 잔기 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임이 인식될 것이다. 본 개시의 목적상, 주어진 핵산 서열 D에 대한, 또는 이와의, 또는 이에 비한, 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 %(이는 주어진 핵산 서열 D에 대해, 또는 이와, 또는 이에 비해 특정한 핵산 서열 동일성 %를 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 대안적으로 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다: 100 × 분율 W/Z, 여기서 W는 C 및 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일한 매치로 기록된 뉴클레오티드의 개수이고, Z는 D의 총 뉴클레오티드 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않은 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 %는 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임이 인식될 것이다.
"단리된" 분자(예를 들어, 핵산 또는 단백질) 또는 세포는 이것이 확인되고, 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리되고/되거나 회수된 것을 의미한다.
"유효량"은 임상 결과(예를 들어, 증상의 개선, 임상 종점의 달성 등)를 포함하는 유익하거나 요망되는 결과를 가져오기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 질병 상태의 측면에서, 유효량은 질병을 개선하거나, 안정시키거나, 질병의 발달을 지연시키기에 충분한 양이다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 랫트)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료"는 유익하거나 요망되는 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 개시의 목적상, 유익하거나 요망되는 임상 결과는 검출 가능하거나 검출 가능하지 않건 간에 증상의 경감, 질병 정도의 감소, 질병의 안정된(예를 들어, 악화되지 않은) 상태, 질병 확산(예를 들어, 전이)의 예방, 질병 진행의 지연 또는 둔화, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 관해(remission)(부분적 또는 전체적)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우의 예상 생존기간에 비해 생존기간을 연장시킴을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방적 치료"는 치료를 지칭하며, 여기서 개체는 장애를 갖거나 장애에 걸릴 위험이 있는 것으로 알려져 있거나 의심되지만, 장애의 증상을 나타내지 않거나 최소의 증상을 나타내는 개체이다. 예방적 치료를 받는 개체는 증상의 발생 전에 치료될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "신경 퇴행성 시뉴클레인병증"은 중추 및 말초 신경계 둘 모두에서 신경세포(neuron) 및 신경교의 선택적 집단의 세포질에서 알파-시뉴클레인 단백질의 원섬유 응집체를 특징으로 하는 신경 퇴행성 장애를 지칭한다. 예에는 파킨슨병(PD), 다계통 위축증(MSA-P 및 MSA-C), 루이 소체 치매(DLB), 순수 자율 신경 부전(PAF), 알츠하이머병의 루이 소체 변이형(LBVAD), 루이 소체 연하 곤란, 및 우발적 루이 소체 질병(incidental Lewy body disease)이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "RNAi"는 세포에서 RNA 간섭을 유도하는 임의의 RNA 분자를 지칭할 수 있다. RNAi의 예는 제한 없이 작은 저해성 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA) 또는 작은 헤어핀 RNA(shRNA)를 포함한다.
"miRNA 스캐폴드"는 (i) RNAi에 의한 녹다운을 위한 관심 유전자를 표적화하는 이중 가닥 서열 및 (ii) 내인성 miRNA와 유사한 스템-루프(stem-loop) 구조를 형성하는 추가의 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. RNAi를 위한 관심 유전자를 표적화하는 서열(예를 들어, 짧은 약 20-nt의 서열)은 miRNA 유사 스템-루프를 생성시키는 서열, 및 폴리뉴클레오티드가 miRNA 유사 2차 구조로 조립될 때 관심 서열과 염기쌍을 형성하여 이중체를 형성하는 서열에 리게이션될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이러한 이중체는 불완전하게 하이브리드화될 수 있는데, 예를 들어 이는 쌍을 형성하지 않거나 쌍 형성 오류가 일어난 하나 이상의 염기를 함유할 수 있다. 다이서(Dicer)에 의한 이러한 폴리뉴클레오티드의 절단 시, 관심 유전자를 표적화하는 서열을 함유하는 이러한 이중체는 풀려서 RISC 복합체 내로 혼입될 수 있다. miRNA 스캐폴드는 miRNA 그 자체 또는 miRNA를 인코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. miRNA 스캐폴드의 예는 miR-155 서열이다(문헌[Lagos-Quintana, M. et al. (2002) Curr. Biol. 12:735-9]). miRNA 스캐폴드 내로 서열을 클로닝하기 위한 상업적으로 이용 가능한 키트는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Life Technologies, Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA로부터의 InvitrogenTM BLOCK-iTTM Pol II miR RNAi 발현 벡터 키트)
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "벌지"는 이중체 핵산 내의 반대쪽에 있는 핵산과 상보적이지 않은 핵산의 영역을 지칭한다. 예를 들어, 벌지는 이중체 핵산 내의 반대쪽에 있는 핵산에 비상보적인 핵산 서열을 지칭할 수 있으며, 여기서 벌지는 이중체 핵산 내의 반대쪽에 있는 핵산에 상보적인 핵산의 영역에 의해 플랭킹되어 있다. 일부 예에서, 벌지는 길이가 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 초과의 염기 중 임의의 것일 수 있다. 일부 예에서, 벌지는 쌍 형성오류(mispairing)(예를 들어, 반대쪽 가닥은 비상보적인 염기를 함유함)의 결과일 수 있거나 벌지는 쌍 미형성(nonpairing)(예를 들어, 반대쪽 가닥은 벌지를 플랭킹하는 핵산에 상보적인 핵산을 포함하지만 반대쪽 가닥은 벌지의 반대쪽에 있는 핵산을 함유하지 않음)의 결과일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "센스" 핵산은 트랜스진의 전부 또는 일부를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산이다. 일부 예에서, 트랜스진에 대한 mRNA는 센스 핵산이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "안티센스" 핵산은 "센스" 핵산에 상보적인 핵산의 서열이다. 예를 들어, 안티센스 핵산은 트랜스진을 인코딩하는 mRNA에 상보적일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, RNAi의 "가이드 영역"은 전형적으로 상보성을 기초로 하여 표적 mRNA와 결합하는 RNAi의 가닥이다. 상보성 영역은 가이드 영역의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 전형적으로, 상보성 영역은 적어도 시드 영역을 포함한다. 많은 경우, RNAi의 안티센스 영역은 가이드 영역이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되는 RNAi의 "패신저 영역" 또는 "비-가이드 영역"은 가이드 영역에 상보적인 RNAi의 영역이다. 많은 경우, RNAi의 센스 영역은 패신저 영역이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, RNAi(예를 들어, miRNA)의 "시드 영역"은 길이가 약 1개 내지 8개의 뉴클레오티드인 마이크로RNA의 영역이다. 일부 예에서, 이의 표적 mRNA의 시드 영역과 3'-UTR은 RNAi 인식에서 주요 결정인자일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "오프-타겟 유전자 침묵"은 RNAi의 시드 영역이 의도하지 않은 mRNA의 3'-UTR의 서열과 쌍을 형성하여 그러한 전사체의 번역 억제 및 불안정화를 유도하는 것(예를 들어, 의도하지 않은 mRNA의 발현을 감소시킴)을 지칭한다.
본 명세서에서 값 또는 파라미터 앞의 "약"에 대한 언급은 그러한 값 또는 파라미터 자체에 관한 구현예를 포함(및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"와 관련된 설명은 "X"의 설명을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 달리 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 개시의 양태 및 구현예는 양태 및 구현예를 "포함하고/하거나", 이로 "구성되고/되거나", "이를 필수적으로 포함하는" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
III. RNAi
일부 양태에서, 본 개시는 개선된 RNAi를 제공한다. 일부 구현예에서, RNAi는 작은 저해성 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 또는 작은 헤어핀 RNA(shRNA)이다. 작은 저해성 또는 간섭성 RNA(siRNA)는, 세포에서 RNAi를 유도하는, 길이가 대략 19개 내지 25개(예를 들어, 19개 내지 23개) 염기쌍인 이중 가닥 RNA 분자로 당업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, siRNA 서열은 또한 인공 miRNA 스캐폴드 내로 삽입될 수 있다("shmiRNA"). 작은 헤어핀 RNA(shRNA)는, 세포에서 RNAi를 유도하는, 짧은 루프(예를 들어, 약 4개 내지 약 11개의 뉴클레오티드)에 의해 연결된 대략 19개 내지 25개(예를 들어, 19개 내지 23개) 염기쌍의 이중 가닥 RNA를 포함하는 RNA 분자로서 당업계에 알려져 있다.
마이크로RNA(miRNA)는 루프에 의해 연결된 짧은(예를 들어, 19개 내지 25개의 염기쌍) 이중 가닥 RNA 서열을 포함하고, 하나 이상의 벌지(예를 들어, 쌍 형성오류가 일어나거나 쌍을 형성하지 않은 염기쌍)를 포함하는 하나 이상의 추가의 이중 가닥 RNA 서열을 함유하는, 세포에서 RNAi를 유도하는 RNA 분자로서 당업계에 알려져 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "miRNA"는 내인성 miRNA뿐만 아니라 외인성 또는 이종성 miRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, "miRNA"는 pri-miRNA 또는 pre-miRNA를 지칭할 수 있다. miRNA 프로세싱 동안, pri-miRNA 전사체가 생성된다. pri-miRNA는 드로샤(Drosha)-DGCR8에 의해 프로세싱되는데, 하나 이상의 서열을 절제하여, 5'플랭킹 영역, 가이드 가닥, 루프 영역, 비-가이드 가닥 및 3'플랭킹 영역; 또는 5'플랭킹 영역, 비-가이드 가닥, 루프 영역, 가이드 가닥 및 3'플랭킹 영역을 갖는 pre-miRNA를 남김으로써 pre-miRNA를 생성시킨다. 그 후, pre-miRNA는 세포질로 내보내지고, 다이서에 의해 프로세싱되어 가이드 가닥과 비-가이드(또는 패신저) 가닥을 갖는 siRNA를 생성시킨다. 그 후, 가이드 가닥은 RISC 복합체에 의해 이용되어, 예를 들어 가이드 가닥에 상보적인 표적 RNA 서열을 인식함으로써, 유전자 침묵을 촉매한다. miRNA의 추가 설명은, 예를 들어 WO 2008/150897호에서 찾아볼 수 있다. miRNA에 의한 표적 서열의 인식은 표적과, miRNA 시드 서열, 예를 들어 가이드 가닥의 뉴클레오티드 1-8(5'에서 3'로) 사이의 쌍 형성에 의해 주로 결정된다(예를 들어, 문헌[Boudreau, R.L. et al. (2013) Nucleic Acids Res. 41:e9] 참조).
pri/pre-miRNA 구조에서, 이중체의 가이드 가닥:비-가이드 가닥 계면은 상보적인 염기쌍 형성(예를 들어, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성)을 통해 부분적으로 형성된다. 그러나, 일부 구현예에서, 이러한 상보적 염기쌍 형성은 전체 이중체를 통해 확대되지 않는다. 일부 구현예에서, 계면의 벌지는 하나 이상의 뉴클레오티드 위치에 존재할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벌지"는 이중체 내의 이와 반대쪽에 있는 핵산에 비상보적인 핵산의 영역을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 벌지는 상보적인 핵산들의 영역은 서로 결합하는 반면 중심의 비상보적인 영역의 영역들은 결합하지 않는 경우에 형성된다. 일부 구현예에서, 벌지는 두 상보적인 영역 사이에 위치한 두 가닥의 핵산이 상이한 길이를 갖는 경우에 형성된다. 하기 설명되는 바와 같이, 벌지는 1개 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, miRNA는 miRNA의 패신저 가닥으로부터 2개의 염기(패신저 가닥의 개시점부터 카운팅하여 9번 내지 10번 염기)를 결실시킴으로써 생성된 내부 벌지를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시에 기재된 RNAi는 알파-시뉴클레인(SNCA)에 대해 저해성이다. 일부 구현예에서, SNCA는 마우스 SNCA이다. 일부 구현예에서, SNCA는 인간 SNCA이다. 일부 구현예에서, RNAi는 SNCA를 인코딩하는 RNA를 표적으로 한다. 일부 구현예에서, RNAi는 대상체에서 SNCA의 발현을 저해한다. 일부 구현예에서, RNAi는 대상체에서 SNCA의 축적을 저해한다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 구현예에서, 포유동물은 인간이다.
RNAi 기반 치료법의 안전성은 오프-타겟 유전자 침묵으로 알려져 있는 효과인 의도하지 않은 mRNA와 결합하여 이의 발현을 감소시키는 작은 저해성 RNA(siRNA)의 능력에 의해 방해받을 수 있다. 오프-타겟팅은 시드 영역(작은 RNA의 뉴클레오티드 2-8)이 의도하지 않은 mRNA의 3'-UTR의 서열과 쌍을 형성하여 그러한 전사체의 번역 억제 및 불안정화를 유도하는 경우에 주로 발생한다. 감소된 오프-타겟팅 RNAi는 가이드 및 비가이드 서열 내의 염기를 치환함으로써, 예를 들어 CpG 모티프를 생성시킴으로써 설계될 수 있다. 유의하게 더 낮은 오프-타겟 스코어를 생성시킬 수 있는 잠재적인 치환은 최소의 오프-타겟팅 가능성 및 강력한 침묵 능력을 갖는 후보 서열을 확인하는 특이성 중심의(specificity-focused) siRNA 설계 알고리즘인 SiSPOTR 알고리즘을 이용하여 평가될 수 있다(문헌[Boudreau et al, Nucleic Acids Res. 2013 Jan; 41(1) e9]). 감소된 SiSPOTR 스코어는 모(parent) RNAi 분자에 비해 더 적은 수의 잠재적인 인간 오프 타겟을 갖는 서열을 예측해준다. 본 개시의 일부 구현예에서, RNAi는 오프-타겟 유전자 침묵을 감소시키도록 개선된다. 일부 구현예에서, RNAi는 하나 이상의 CpG 모티프를 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi는 시드 영역에 하나 이상의 CpG 모티프를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 가닥과 제2 가닥은 루프 구조를 형성할 수 있는 RNA(예를 들어, RNA 링커)에 의해 연결되어 있다. 당업계에 통상적으로 알려져 있는 바와 같이, RNA 루프 구조(예를 들어, 스템-루프 또는 헤어핀)는 RNA 분자가 염기쌍을 함께 형성하지 않는 RNA 서열에 의해 분리된 염기쌍을 함께 형성하는 2개의 RNA 서열을 포함하는 경우에 형성된다. 예를 들어, 루프 구조는, 서열 A와 서열 C는 함께 염기쌍을 형성하도록 상보적이거나 부분적으로 상보적이지만 서열 B의 염기들은 함께 염기쌍을 형성하지 않는 경우에, RNA 분자 A-B-C에서 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 루프 서열은 DNA 형태의 5'-GTTTTGGCCACTGACTGAC-3'(SEQ ID NO: 59) 또는 RNA 형태의 5'-GUUUUGGCCACUGACUGAC-3'(SEQ ID NO: 60)이다.
일부 구현예에서, 루프 구조를 형성할 수 있는 RNA는 4개 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 루프 구조를 형성할 수 있는 RNA는 13개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 루프를 형성할 수 있는 RNA의 뉴클레오티드 개수는 4개 내지 50개의 뉴클레오티드 또는 그 사이의 임의의 정수 개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 루프의 0 내지 50%가 루프의 또 다른 부분에 상보적일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "루프 구조"는 2개의 상보적인 핵산 가닥을 결합시키는 서열이다. 일부 구현예에서, 루프 구조의 1개 내지 3개의 뉴클레오티드는 상보적인 핵산 가닥들에 연속해 있으며, 루프 구조의 원위 부분의 1개 내지 3개의 뉴클레오티드에 상보적일 수 있다. 예를 들어, 루프 구조의 5' 말단의 3개의 뉴클레오티드는 루프 구조의 3' 말단의 3개의 뉴클레오티드에 상보적일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 핵산은 이종성 miRNA 스캐폴드를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 miRNA 스캐폴드의 사용은 miRNA 발현을 조절하기 위해, 예를 들어 miRNA 발현을 증가시키거나 miRNA 발현을 감소시키기 위해 이용된다. 당업계에 알려진 임의의 miRNA 스캐폴드가 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, miRNA 스캐폴드는 miR-155 스캐폴드로부터 유래된다(예를 들어, 문헌[Lagos-Quintana, M. et al. (2002) Curr. Biol. 12:735-9] 및 Life Technologies, Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA로부터의 Invitrogen™ BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 발현 벡터 키트 참조).
일부 구현예에서, RNAi는 표 1로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 제1 가닥은 임의의 가이드 서열과 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 중 어느 하나 초과의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 가닥은 임의의 가이드 서열과 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 중 어느 하나 초과의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지만 CpG 모티프를 유지한다. 일부 구현예에서, 제2 가닥은 상응하는 패신저 서열과 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 중 어느 하나 초과의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 가닥은 상응하는 패신저 서열과 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 초과의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지만 CpG 모티프를 유지한다.
[표 1]
Figure pct00001
범례: 서열은 5'에서 3' 방향이다. 소문자는 가이드 가닥의 5' 말단에서 프로세싱된 이중체의 안정성을 감소시키기 위한 표적 센스 가닥과의 불일치를 나타낸다. Hs = 인간; mq = 레서스 마카크(rhesus macaque), ms = 마우스. 인간 오프 타겟 예측은 siSPOTR 알고리즘(월드 와이드 웹 (https://sispotr.icts.uiowa.edu/sispotr/ tools.html))으로부터 계산되며 miRNA의 시드 서열에 대한 상보성에 기초한 예측된 오프 타겟 표적 전사체를 나타낸다.
IV. 신경 퇴행성 시뉴클레인병증
신경 퇴행성 시뉴클레인병증은 신경세포, 신경 섬유 또는 신경아교세포에서의 증가된 수준의 알파-시뉴클레인(SNCA) 단백질을 특징으로 하는 신경 퇴행성 질병이다. 신경 퇴행성 시뉴클레인병증의 주요 유형에는 루이 소체 치매(DLB), 파킨슨병, 및 다계통 위축증(MSA)이 포함된다.
신경 퇴행성 시뉴클레인병증의 예에는 파킨슨병(PD), 다계통 위축증(MSA-P 및 MSA-C), 루이 소체 치매(DLB), 순수 자율 신경 부전(PAF), 알츠하이머병의 루이 소체 변이형(LBVAD), 루이 소체 연하 곤란, 및 우발적 루이 소체 질병이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
다수의 일련의 증거는 알파-시뉴클레인(SNCA) 수준의 증가가 신경 독성인 한편, 감소가 신경 보호적임을 보여준다(문헌[Dauer, 2002]; 문헌[Drolet, 2004]; 문헌[Alvarez-Fischer, 2008]; 문헌[Klivenyi, 2005]; 문헌[Mittal, 2017]; 문헌[Javed, 2015]; 문헌[Cole, 2017]; 문헌[Ubhi, 2010]; 문헌[Lim, 2011]). 본 개시에 제공되는 것은 SNCA에 대한 RNAi이다.
V. 신경 퇴행성 시뉴클레인병증의 치료 방법
일부 양태에서, 본 개시는 본 개시의 약제학적 조성물(예를 들어, 본 개시의 바이러스 입자를 포함하는 약제학적 조성물)을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여 그 포유동물에서 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하는 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 본 개시의 약제학적 조성물(예를 들어, 본 개시의 바이러스 입자를 포함하는 약제학적 조성물)을 신경 퇴행성 시뉴클레인병증에 걸린 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여 그 포유동물에서 SNCA의 발현을 저해하는 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 본 개시의 약제학적 조성물(예를 들어, 본 개시의 바이러스 입자를 포함하는 약제학적 조성물)을 신경 퇴행성 시뉴클레인병증에 걸린 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여 그 포유동물의 세포에서 SNCA의 축적을 저해하는 방법 및 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시는 유효량의, 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 입자를, 포유동물의 신경계에 투여하는 단계를 포함하여 신경 퇴행성 시뉴클레인병증의 증상을 개선시키는 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 신경 퇴행성 시뉴클레인병증의 증상에는 파킨슨증, 인지 장애, 수면 장애, 환시, 언어 장애, 변비, 추체로 또는 소뇌 징후, 후각상실증, 기립성 저혈압과 같은 자율 신경 기능 장애, 발한 감소, 발기 부전, 소변 정체 또는 요실금, 및 동공 기능 장애가 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
일부 양태에서, 본 개시는 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 예방하거나 그 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. PD와 같은 시뉴클레인병증은 일반적으로 떨림, 운동완만증, 경직 및 자세 불안정의 존재에 의해 임상적으로 진단된다. PD와의 구별은 일반적으로 기립성 저혈압, 추체로 징후, 인지력 변화 또는 환각과 같은 추가 징후를 확인함으로써 수행된다. 또한, 일부 시뉴클레인병증은 뇌 영상화에 의해, 예를 들어 교뇌, 소뇌, MSA의 경우 피각과 같은 뇌 영역에서 비정상을 찾아봄으로써 진단될 수 있다. 일부 시뉴클레인병증은 반드시 SNCA 유전자를 제한하는 것은 아닌 공통적인 돌연변이에 대한 유전자형 분석을 통해 직접 확인될 수 있다. 질병 진행의 지연 또는 예방은 다음 증상 중 임의의 것의 개선으로 규정될 수 있다: 운동 기능(운동완만증, 운동이상증, 근긴장 이상, 자세 불안정, 구부러진 자세, 떨림, 간대성근경련증 등), 인지, 수면 장애, 환시, 언어, 변비, 추체로 징후, 후각상실증, 기립성 저혈압과 같은 자율 신경 기능 장애, 발한 감소, 발기 부전, 소변 정체 또는 요실금, 및 동공 기능 장애.
본 개시의 일부 양태에서, 방법 및 조성물은 신경 퇴행성 시뉴클레인병증에 걸린 인간의 치료에 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시는 신경 퇴행성 시뉴클레인병증에 걸린 포유동물에서 SNCA mRNA를 표적화하기 위한 개선된 RNAi를 제공한다. 일부 구현예에서, RNAi는 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하며, 여기서 제1 가닥과 제2 가닥은 이중체를 형성하고, 제2 가닥의 SEQ ID NO: 53 중 잔기 19에 있는 A 잔기는 제1 가닥에 있는 잔기와 염기쌍을 형성하지 않는다. 일부 구현예에서, miRNA는 miRNA의 패신저 가닥으로부터 2개의 염기(패신저 가닥의 개시점부터 카운팅하여 9번 내지 10번 염기)를 결실시킴으로써 생성된 내부 벌지를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 가닥과 제2 가닥은 루프 서열에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 루프 서열은 5'-GUUUUGGCCACUGACUGAC-3'(SEQ ID NO: 60)이다.
일부 구현예에서, RNAi는 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하며, 여기서 제1 가닥과 제2 가닥은 이중체를 형성하고, 제2 가닥의 SEQ ID NO: 37 중 잔기 19인 A는 제1 가닥에 있는 잔기와 염기쌍을 형성하지 않는다. 일부 구현예에서, miRNA는 miRNA의 패신저 가닥으로부터 2개의 염기(패신저 가닥의 개시점부터 카운팅하여 9번 내지 10번 염기)를 결실시킴으로써 생성된 내부 벌지를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 가닥과 제2 가닥은 루프 서열에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 루프 서열은 5'-GUUUUGGCCACUGACUGAC-3'(SEQ ID NO: 60)이다.
일부 구현예에서, RNAi는 서열 5'-UGCGCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 14)를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGCGUA-3'(SEQ ID NO: 43)를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하며, 여기서 제1 가닥과 제2 가닥은 이중체를 형성하고, 제2 가닥의 SEQ ID NO: 43 중 잔기 19에 있는 A 잔기는 제1 가닥에 있는 잔기와 염기쌍을 형성하지 않는다. 일부 구현예에서, miRNA는 miRNA의 패신저 가닥으로부터 2개의 염기(패신저 가닥의 개시점부터 카운팅하여 9번 내지 10번 염기)를 결실시킴으로써 생성된 내부 벌지를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 가닥과 제2 가닥은 루프 서열에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 루프 서열은 5'-GUUUUGGCCACUGACUGAC-3'(SEQ ID NO: 60)이다.
일부 구현예에서, RNAi는 서열 5'-UGGGCGCAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 7)를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-UGCUCAGUCAAUGCGCCUA-3'(SEQ ID NO: 36)를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하며, 여기서 제1 가닥과 제2 가닥은 이중체를 형성하고, 제2 가닥의 SEQ ID NO: 36 중 잔기 19에 있는 A 잔기는 제1 가닥에 있는 잔기와 염기쌍을 형성하지 않는다. 일부 구현예에서, miRNA는 miRNA의 패신저 가닥으로부터 2개의 염기(패신저 가닥의 개시점부터 카운팅하여 9번 내지 10번 염기)를 결실시킴으로써 생성된 내부 벌지를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 가닥과 제2 가닥은 루프 서열에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 루프 서열은 5'-GUUUUGGCCACUGACUGAC-3'(SEQ ID NO: 60)이다.
일부 구현예에서, RNAi는 서열 5'-uUCCAACAUUUGUCACUUGCU-3'(SEQ ID NO: 5)를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-AGCAAGUGAAAUGUUCGAA-3'(SEQ ID NO: 34)을 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하며, 여기서 제1 가닥과 제2 가닥은 이중체를 형성하고, 제2 가닥의 SEQ ID NO: 34 중 잔기 18 또는 잔기 19에 있는 A 잔기는 제1 가닥에 있는 잔기와 염기쌍을 형성하지 않는다. 일부 구현예에서, miRNA는 miRNA의 패신저 가닥으로부터 2개의 염기(패신저 가닥의 개시점부터 카운팅하여 9번 내지 10번 염기)를 결실시킴으로써 생성된 내부 벌지를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 가닥과 제2 가닥은 루프 서열에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 루프 서열은 5'-GUUUUGGCCACUGACUGAC-3'(SEQ ID NO: 60)이다.
본 개시의 일부 구현예에서, RNAi는 오프-타겟 유전자 침묵을 감소시키도록 개선된다. 일부 구현예에서, RNAi는 하나 이상의 CpG 모티프를 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi는 시드 영역에 하나 이상의 CpG 모티프를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는, 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 가닥과 제2 가닥은 이중체를 형성한다. 일부 구현예에서, miRNA는 miRNA의 패신저 가닥으로부터 2개의 염기(패신저 가닥의 개시점부터 카운팅하여 9번 내지 10번 염기)를 결실시킴으로써 생성된 내부 벌지를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시는, 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)을 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경 퇴행성 시뉴클레인병증에 걸린 포유동물에서 SNCA의 발현을 저해하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 가닥과 제2 가닥은 이중체를 형성한다. 일부 구현예에서, 본 개시는, 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)을 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경 퇴행성 시뉴클레인병증에 걸린 포유동물의 세포에서 SNCA의 축적을 저해하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 가닥과 제2 가닥은 이중체를 형성한다. 일부 구현예에서, miRNA는 miRNA의 패신저 가닥으로부터 2개의 염기(패신저 가닥의 개시점부터 카운팅하여 9번 내지 10번 염기)를 결실시킴으로써 생성된 내부 벌지를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 가닥은 SEQ ID NO: 24와 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 중 어느 하나 초과의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 가닥은 SEQ ID NO: 24와 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 중 어느 하나 초과의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지만 CpG 모티프를 유지한다. 일부 구현예에서, 제1 가닥과 제2 가닥은 루프 서열에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 루프 서열은 5'-GUUUUGGCCACUGACUGAC-3'(SEQ ID NO: 60)이다.
일부 구현예에서, 본 개시는, 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'- UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 가닥과 제2 가닥은 이중체를 형성한다. 일부 구현예에서, 본 개시는, 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'- UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경 퇴행성 시뉴클레인병증에 걸린 포유동물에서 SNCA의 발현을 저해하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 가닥과 제2 가닥은 이중체를 형성한다. 일부 구현예에서, 본 개시는, 서열 5'-5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'-3'(SEQ ID NO: 8)를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'- UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경 퇴행성 시뉴클레인병증에 걸린 포유동물의 세포에서 SNCA의 축적을 저해하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 가닥과 제2 가닥은 이중체를 형성한다. 일부 구현예에서, miRNA는 miRNA의 패신저 가닥으로부터 2개의 염기(패신저 가닥의 개시점부터 카운팅하여 9번 내지 10번 염기)를 결실시킴으로써 생성된 내부 벌지를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 가닥은 SEQ ID NO: 8과 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 중 어느 하나 초과의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 가닥은 SEQ ID NO: 37과 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 중 어느 하나 초과의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 가닥과 제2 가닥은 루프 서열에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 루프 서열은 5'-GUUUUGGCCACUGACUGAC-3'(SEQ ID NO: 60)이다.
일부 구현예에서, RNAi는 작은 저해성 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 또는 작은 헤어핀 RNA(shRNA)이다. 작은 저해성 또는 간섭성 RNA(siRNA)는, 세포에서 RNAi를 유도하는, 길이가 대략 19개 내지 25개(예를 들어, 19개 내지 23개) 염기쌍인 이중 가닥 RNA 분자로 당업계에 알려져 있다. 작은 헤어핀 RNA(shRNA)는, 세포에서 RNAi를 유도하는, 짧은 루프(예를 들어, 약 4개 내지 약 11개의 뉴클레오티드)에 의해 연결된 대략 19개 내지 25개(예를 들어, 19개 내지 23개) 염기쌍의 이중 가닥 RNA를 포함하는 RNA 분자로서 당업계에 알려져 있다.
일부 구현예에서, miRNA는 SEQ ID NO: 24와 약 90% 동일한 가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, miRNA는 SEQ ID NO: 24와 약 90% 동일하거나, 약 91% 동일하거나, 약 92% 동일하거나, 약 93% 동일하거나, 약 94% 동일하거나, 약 95% 동일하거나, 약 96% 동일하거나, 약 97% 동일하거나, 약 98% 동일하거나, 약 99% 동일하거나, 약 100% 동일한 것 중 임의의 %로 동일한 가이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, miRNA는 SEQ ID NO: 24와 약 90% 동일한 비-가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, miRNA는 SEQ ID NO: 53과 약 90% 동일하거나, 약 91% 동일하거나, 약 92% 동일하거나, 약 93% 동일하거나, 약 94% 동일하거나, 약 95% 동일하거나, 약 96% 동일하거나, 약 97% 동일하거나, 약 98% 동일하거나, 약 99% 동일하거나, 약 100% 동일한 것 중 임의의 %로 동일한 비-가이드 서열을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 RNAi(예를 들어, rAAV 벡터의 일부로서)는, 특히 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 표 1에 기재된 임의의 RNAi는 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, miRNA는 SEQ ID NO: 8과 약 90% 동일한 가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, miRNA는 SEQ ID NO: 8과 약 90% 동일하거나, 약 91% 동일하거나, 약 92% 동일하거나, 약 93% 동일하거나, 약 94% 동일하거나, 약 95% 동일하거나, 약 96% 동일하거나, 약 97% 동일하거나, 약 98% 동일하거나, 약 99% 동일하거나, 약 100% 동일한 것 중 임의의 %로 동일한 가이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, miRNA는 SEQ ID NO: 37과 약 90% 동일한 비-가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, miRNA는 SEQ ID NO: 37과 약 90% 동일하거나, 약 91% 동일하거나, 약 92% 동일하거나, 약 93% 동일하거나, 약 94% 동일하거나, 약 95% 동일하거나, 약 96% 동일하거나, 약 97% 동일하거나, 약 98% 동일하거나, 약 99% 동일하거나, 약 100% 동일한 것 중 임의의 %로 동일한 비-가이드 서열을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 RNAi(예를 들어, rAAV 벡터의 일부로서)는, 특히 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 표 1에 기재된 임의의 RNAi는 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 가닥과 제2 가닥은 루프 구조를 형성할 수 있는 RNA에 의해 연결되어 있다. 당업계에 통상적으로 알려져 있는 바와 같이, RNA 루프 구조(예를 들어, 스템-루프 또는 헤어핀)는 RNA 분자가 염기쌍을 함께 형성하지 않는 RNA 서열에 의해 분리된 염기쌍을 함께 형성하는 2개의 RNA 서열을 포함하는 경우에 형성된다. 예를 들어, 루프 구조는, 서열 A와 서열 C는 함께 염기쌍을 형성하도록 상보적이거나 부분적으로 상보적이지만 서열 B의 염기들은 함께 염기쌍을 형성하지 않는 경우에, RNA 분자 A-B-C에서 형성될 수 있다.
일부 구현예에서, 루프 구조를 형성할 수 있는 RNA는 4개 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 루프 구조를 형성할 수 있는 RNA는 13개의 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 루프 구조를 형성할 수 있는 RNA는 SEQ ID NO: 60의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 유전체는 SEQ ID NO: 60의 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 것 중 임의의 %로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 바이러스 입자의 전달은 뇌로의 바이러스 입자의 주입에 의해 이루어진다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 입자의 전달은 선조체로의 바이러스 입자의 주입에 의해 이루어진다. 선조체내 투여는 재조합 바이러스 입자를 신경 퇴행성 시뉴클레인병증에 의해 크게 영향을 받는 뇌의 영역인 선조체(피각 및 꼬리핵을 포함함)에 전달한다. 추가로 그리고 이론에 구속하고자 함이 없이, 선조체 내로 주입된 재조합 바이러스 입자(예를 들어, rAAV 입자)는 제한 없이 투사 영역(projection area)(예를 들어, 피질 또는 흑질(substantia nigra))을 포함하는 뇌의 다른 영역으로 (예를 들어, 역행(retrograde) 수송을 통해) 또한 분산될 수 있는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 입자는 대류 강화 전달(convection enhanced delivery)(예를 들어, 선조체로의 대류 강화 전달)에 의해 전달된다.
일부 양태에서, 본 개시는 본 개시의 약제학적 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 본 개시의 약제학적 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 신경 퇴행성 시뉴클레인병증에 걸린 포유동물의 세포에서 SNCA의 축적을 저해하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 본 개시의 약제학적 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 신경 퇴행성 시뉴클레인병증에 걸린 포유동물에서 SNCA의 발현을 저해하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, SNCA는 돌연변이 SNCA(예를 들어, A53T, E46K, A30P, G51D, H50Q, A53E, A29S, A18T, 및 유전자좌의 듀플리케이션(duplication) 및 트리플리케이션(triplication) 중 하나 이상을 포함하는 인간 SNCA 돌연변이)이다. 일부 구현예에서, 야생형 SNCA의 발현 및/또는 축적이 또한 저해된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 그리고 이론에 구속하고자 함이 없이, 신경 퇴행성 시뉴클레인병증에 걸린 포유동물에서의 돌연변이 SNCA의 발현 및/또는 축적의 저해는 매우 유익하지만, (예를 들어, 본 개시의 RNAi의) 부작용으로서 동일한 포유동물에서의 야생형 SNCA의 발현 및/또는 축적의 저해는 잘 견뎌질 수 있는 것으로(예를 들어, 의도하지 않은 부작용을 거의 생성시키지 않거나 전혀 생성시키지 않음) 여겨진다.
일부 구현예에서, 세포는 벡터(예를 들어, 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 발현 작제물을 포함하는 벡터)를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 rAAV 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 재조합 아데노바이러스 벡터, 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 재조합 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터이다. 일부 구현예에서, 세포는 중추 신경계(CNS) 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 HEK293 세포이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 벡터를 포함하는 유효량의 재조합 바이러스 입자의 투여는 투여 부위 또는 그 근처에 있는 신경세포(예를 들어, 가시 신경세포와 같은 선조체 신경세포)를 형질도입시킨다. 일부 구현예에서, 신경세포의 약 5% 초과, 약 10% 초과, 약 15% 초과, 약 20% 초과, 약 25% 초과, 약 30% 초과, 약 35% 초과, 약 40% 초과, 약 45% 초과, 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과 또는 약 100% 중 임의의 %가 형질도입된다. 일부 구현예에서, 신경세포의 약 5% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 75%, 약 25% 내지 약 50%, 또는 약 30% 내지 약 50%가 형질도입된다. miRNA를 발현하는 재조합 바이러스 입자에 의해 형질도입된 신경세포를 확인하는 방법은 당업계에 알려져 있으며; 예를 들어, 면역조직화학, RNA 검출(예를 들어, qPCR, 노던 블롯팅, RNA-seq, 원위치 하이브리드화 등) 또는 강화 녹색 형광 단백질과 같은 공동 발현되는 마커의 사용을 이용하여 발현을 검출할 수 있다.
본 개시의 일부 구현예에서, 방법은 신경 퇴행성 시뉴클레인병증에 걸린 포유동물, 예를 들어 인간을 치료하기 위한 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 벡터를 포함하는 유효량의 재조합 바이러스 입자의 포유동물의 뇌로의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 뇌의 하나 이상의 위치에 주입되어 적어도 신경세포에서 본 개시의 RNAi의 발현을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 조성물은 뇌의 1개 위치, 2개 위치, 3개 위치, 4개 위치, 5개 위치, 6개 위치, 7개 위치, 8개 위치, 9개 위치, 10개 위치 또는 10개 초과의 위치 중 어느 하나 내로 주입된다. 일부 구현예에서, 조성물은 선조체 내로 주입된다. 일부 구현예에서, 조성물은 등쪽 선조체 내로 주입된다. 일부 구현예에서, 조성물은 피각 내로 주입된다. 일부 구현예에서, 조성물은 꼬리핵 내로 주입된다. 일부 구현예에서, 조성물은 피각 및 꼬리핵 내로 주입된다. 일부 구현예에서, 투여 경로는 뇌실내, 소뇌숨뇌수조(cisterna magna) 또는 척수강내 주입을 통한 CSF 전달을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 또한 바이러스 벡터의 정맥내 전달을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 바이러스 입자는 뇌의 한쪽 반구에 투여된다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 입자는 뇌의 양쪽 반구에 투여된다.
일부 구현예에서, 재조합 바이러스 입자는 1개 초과의 위치에 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 입자의 다중 주입은 1시간 이하, 2시간 이하, 3시간 이하, 4시간 이하, 5시간 이하, 6시간 이하, 9시간 이하, 12시간 이하 또는 24시간 이하의 간격이다.
일부 구현예에서, 본 개시는 돌연변이 SNCA의 활성을 억제하는 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 투여함으로써 신경 퇴행성 시뉴클레인병증에 걸린 인간을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 돌연변이 SNCA의 활성을 억제하는 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예를 들어, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 1012개, 적어도 약 6 × 1012개, 적어도 약 7 × 1012개, 적어도 약 8 × 1012개, 적어도 약 9 × 1012개, 적어도 약 10 × 1012개, 적어도 약 11 × 1012개, 적어도 약 15 × 1012개, 적어도 약 20 × 1012개, 적어도 약 25 × 1012개, 적어도 약 30 × 1012개, 또는 적어도 약 50 × 1012개의 유전체 카피/㎖ 중 임의의 개수의 유전체 카피/㎖이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예를 들어, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 약 5 × 1012개 내지 약 6 × 1012개, 약 6 × 1012개 내지 약 7 × 1012개, 약 7 × 1012개 내지 약 8 × 1012개, 약 8 × 1012개 내지 약 9 × 1012개, 약 9 × 1012개 내지 약 10 × 1012개, 약 10 × 1012개 내지 약 11 × 1012개, 약 11 × 1012개 내지 약 15 × 1012개, 약 15 × 1012개 내지 약 20 × 1012개, 약 20 × 1012개 내지 약 25 × 1012개, 약 25 × 1012개 내지 약 30 × 1012개, 약 30 × 1012개 내지 약 50 × 1012개, 또는 약 50 × 1012개 내지 약 100 × 1012개의 유전체 카피/㎖ 중 임의의 개수의 유전체 카피/㎖이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예를 들어, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 약 5 × 1012개 내지 약 10 × 1012개, 약 10 × 1012개 내지 약 25 × 1012개, 또는 약 25 × 1012개 내지 약 50 × 1012개의 유전체 카피/㎖ 중 임의의 개수의 유전체 카피/㎖이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예를 들어, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 109개, 적어도 약 6 × 109개, 적어도 약 7 × 109개, 적어도 약 8 × 109개, 적어도 약 9 × 109개, 적어도 약 10 × 109개, 적어도 약 11 × 109개, 적어도 약 15 × 109개, 적어도 약 20 × 109개, 적어도 약 25 × 109개, 적어도 약 30 × 109개, 또는 적어도 약 50 × 109개의 형질도입 단위/㎖ 중 임의의 개수의 형질도입 단위/㎖이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예를 들어, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 약 5 × 109개 내지 약 6 × 109개, 약 6 × 109개 내지 약 7 × 109개, 약 7 × 109개 내지 약 8 × 109개, 약 8 × 109개 내지 약 9 × 109개, 약 9 × 109개 내지 약 10 × 109개, 약 10 × 109개 내지 약 11 × 109개, 약 11 × 109개 내지 약 15 × 109개, 약 15 × 109개 내지 약 20 × 109개, 약 20 × 109개 내지 약 25 × 109개, 약 25 × 109개 내지 약 30 × 109개, 약 30 × 109개 내지 약 50 × 109개, 또는 약 50 × 109개 내지 약 100 × 109개의 형질도입 단위/㎖ 중 임의의 개수의 형질도입 단위/㎖이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예를 들어, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 약 5 × 109개 내지 약 10 × 109개, 약 10 × 109개 내지 약 15 × 109개, 약 15 × 109개 내지 약 25 × 109개, 또는 약 25 × 109개 내지 약 50 × 109개의 형질도입 단위/㎖ 중 임의의 개수의 형질도입 단위/㎖이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예를 들어, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 1010개, 적어도 약 6 × 1010개, 적어도 약 7 × 1010개, 적어도 약 8 × 1010개, 적어도 약 9 × 1010개, 적어도 약 10 × 1010개, 적어도 약 11 × 1010개, 적어도 약 15 × 1010개, 적어도 약 20 × 1010개, 적어도 약 25 × 1010개, 적어도 약 30 × 1010개, 적어도 약 40 × 1010개, 또는 적어도 약 50 × 1010개의 감염 단위/㎖ 중 임의의 개수의 감염 단위/㎖이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예를 들어, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 1010개 내지 적어도 약 6 × 1010개, 적어도 약 6 × 1010개 내지 적어도 약 7 × 1010개, 적어도 약 7 × 1010개 내지 적어도 약 8 × 1010개, 적어도 약 8 × 1010개 내지 적어도 약 9 × 1010개, 적어도 약 9 × 1010개 내지 적어도 약 10 × 1010개, 적어도 약 10 × 1010개 내지 적어도 약 11 × 1010개, 적어도 약 11 × 1010개 내지 적어도 약 15 × 1010개, 적어도 약 15 × 1010개 내지 적어도 약 20 × 1010개, 적어도 약 20 × 1010개 내지 적어도 약 25 × 1010개, 적어도 약 25 × 1010개 내지 적어도 약 30 × 1010개, 적어도 약 30 × 1010개 내지 적어도 약 40 × 1010개, 적어도 약 40 × 1010개 내지 적어도 약 50 × 1010개, 또는 적어도 약 50 × 1010개 내지 적어도 약 100 × 1010개의 감염 단위/㎖ 중 임의의 개수의 감염 단위/㎖이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예를 들어, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 1010개 내지 적어도 약 10 × 1010개, 적어도 약 10 × 1010개 내지 적어도 약 15 × 1010개, 적어도 약 15 × 1010개 내지 적어도 약 25 × 1010개, 또는 적어도 약 25 × 1010개 내지 적어도 약 50 × 1010개의 감염 단위/㎖ 중 임의의 개수의 감염 단위/㎖이다.
일부 구현예에서, 개체에 투여되는 바이러스 입자의 용량은 체중 kg당 적어도 약 1 × 108개 내지 적어도 약 1 × 1013개의 유전체 카피 중 임의의 개수의 유전체 카피이다. 일부 구현예에서, 개체에 투여되는 바이러스 입자의 용량은 체중 kg당 약 1 × 108개 내지 약 1 × 1013개의 유전체 카피 중 임의의 개수의 유전체 카피이다.
일부 구현예에서, 개체에 투여되는 바이러스 입자의 총량은 적어도 약 1 × 109 내지 적어도 약 1 × 1014개의 유전체 카피 중 임의의 개수의 유전체 카피이다. 일부 구현예에서, 개체에 투여되는 바이러스 입자의 총량은 약 1 × 109 내지 약 1 × 1014개의 유전체 카피 중 임의의 개수의 유전체 카피이다.
본 개시의 일부 구현예에서, 선조체에 주입되는 조성물의 부피는 약 1 ㎕ 초과, 약 2 ㎕ 초과, 약 3 ㎕ 초과, 약 4 ㎕ 초과, 약 5 ㎕ 초과, 약 6 ㎕ 초과, 약 7 ㎕ 초과, 약 8 ㎕ 초과, 약 9 ㎕ 초과, 약 10 ㎕ 초과, 약 15 ㎕ 초과, 약 20 ㎕ 초과, 약 25 ㎕ 초과, 약 50 ㎕ 초과, 약 75 ㎕ 초과, 약 100 ㎕ 초과, 약 200 ㎕ 초과, 약 300 ㎕ 초과, 약 400 ㎕ 초과, 약 500 ㎕ 초과, 약 600 ㎕ 초과, 약 700 ㎕ 초과, 약 800 ㎕ 초과, 약 900 ㎕ 또는 약 1 ㎖ 초과, 또는 그 사이의 임의의 양 중 어느 하나의 양이다.
일부 구현예에서, 조성물의 제1 부피가 뇌의 제1 영역 내로 주입되고, 조성물의 제2 부피가 뇌의 제2 영역 내로 주입된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조성물의 제1 부피가 꼬리핵 내로 주입되고, 조성물의 제2 부피가 피각 내로 주입된다. 일부 구현예에서, 조성물의 1X 부피가 꼬리핵 내로 주입되고, 조성물의 1.5X, 2X, 2.5X, 3X, 3.5X 또는 4X 부피가 피각 내로 주입되며, 여기서 X는 약 1 ㎕ 초과, 2 ㎕, 약 3 ㎕ 초과, 약 4 ㎕ 초과, 약 5 ㎕ 초과, 약 6 ㎕ 초과, 약 7 ㎕ 초과, 약 8 ㎕ 초과, 약 9 ㎕ 초과, 약 10 ㎕ 초과, 약 15 ㎕ 초과, 약 20 ㎕ 초과, 약 25 ㎕ 초과, 약 50 ㎕ 초과, 약 75 ㎕ 초과, 약 100 ㎕ 초과, 약 200 ㎕ 초과, 약 300 ㎕ 초과, 약 400 ㎕ 초과, 약 500 ㎕ 초과, 약 600 ㎕ 초과, 약 700 ㎕ 초과, 약 800 ㎕ 초과, 약 900 ㎕ 또는 약 1 ㎖ 초과, 또는 그 사이의 임의의 양 중 어느 하나의 부피이다.
본 개시의 조성물(예를 들어, 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 입자)은 단독으로 사용되거나 신경 퇴행성 시뉴클레인병증를 치료하기 위한 하나 이상의 추가의 치료제와 병용하여 사용될 수 있다. 순차적 투여 사이의 간격은 적어도 수 분, 수 시간 또는 수 일(또는 대안적으로 그 미만) 단위일 수 있다.
본 개시에 기재된 임의의 RNAi, 발현 작제물, 벡터, 또는 세포는 상기 임의의 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 표 1에 개시된 임의의 RNAi, 표 1에 있는 RNAi를 포함하는 발현 작제물, 벡터, 또는 세포는 상기 기재된 임의의 방법에서 사용될 수 있다.
V. RNAi 발현 작제물 및 벡터
본 개시는 본 명세서에 기재된 RNAi의 발현을 위한 발현 작제물, 벡터 및 바이러스 입자를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 핵산은 이종성 miRNA 스캐폴드를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 miRNA 스캐폴드의 사용은 miRNA 발현을 조절하기 위해, 예를 들어 miRNA 발현을 증가시키거나 miRNA 발현을 감소시키기 위해 이용된다. 당업계에 알려진 임의의 miRNA 스캐폴드가 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, miRNA 스캐폴드는 miR-155 스캐폴드로부터 유래된다(예를 들어, 문헌[Lagos-Quintana, M. et al. (2002) Curr. Biol. 12:735-9] 및 Life Technologies, Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA로부터의 Invitrogen™ BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 발현 벡터 키트 참조). 일부 구현예에서, 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 핵산은 miRNA 스캐폴드를 포함한다. 일부 구현예에서, miRNA 스캐폴드는 서열 ctggaggcttgctgaaggctgtatgctgcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggc(SEQ ID NO:67)을 포함하며, 여기서 miRNA는 볼드체의 gc 잔기 사이에 삽입된다.
일부 구현예에서, 스캐폴드 내의 miRNA는 서열 ctggaggcttgctgaaggctgtatgctg tacgatctaatatcgctc gttttggccactgac tgacgagcgatatgatcgtacga caggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggc(SEQ ID NO:68)를 포함하며, 여기서 밑줄이 그어진 일반 텍스트는 5'-플랭크를 나타내고, 이탤릭체 텍스트는 가이드 서열을 나타내고, 볼드체 텍스트는 루프를 나타내고, 밑줄이 그어진 이탤릭체는 비-가이드 서열을 나타내고, 일반 텍스트는 3' 플랭크를 나타낸다.
일부 구현예에서, RNAi는 신경 퇴행성 시뉴클레인병증과 관련된 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA를 표적화한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 알파-시뉴클레인이다. 이론에 구속하고자 함이 없이, 기능 획득이 신경 퇴행성 시뉴클레인병증과 관련된 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성을 감소시키거나 제거하기 위해 RNAi가 사용될 수 있는 것으로 생각된다. 본 개시의 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산(표적화되거나 공급될 수 있는 예시적인 유전자는 각 장애에 대해 괄호 내에 제공됨)에 의해 치료될 수 있는 본 개시의 신경 퇴행성 시뉴클레인병증의 비제한적인 예에는 파킨슨병(SNCA), 다계통 위축 또는 MSA(SNCA), 및 루이 소체 치매(SNCA)가 포함된다.
일부 구현예에서, 트랜스진(예를 들어, 본 개시의 RNAi)은 프로모터에 작동가 능하게 연결되어 있다. 예시적인 프로모터에는 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시형 초기 프로모터, RSV LTR, MoMLV LTR, 포스포글리세레이트 키나제- 1(PGK) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터 및 CK6 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터(TTR), TK 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), HBV 프로모터, hAAT 프로모터, LSP 프로모터, 키메라 간 특이적 프로모터(LSP), E2F 프로모터, 텔로머라제(hTERT) 프로모터; 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴/토끼 β-글로빈 프로모터(CAG 프로모터; 문헌[Niwa et al., Gene, 1991, 108(2):193-9]) 및 신장 인자 1-알파 프로모터(EFl-알파) 프로모터(문헌[Kim et al., Gene, 1990, 91(2):217-23] 및 문헌[Guo et al., Gene Ther., 1996, 3(9):802-10])가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 프로모터는 인간 β-글루쿠로니다제 프로모터, 또는 닭 β-액틴(CBA) 프로모터에 연결된 사이토메갈로바이러스 인핸서를 포함한다. 프로모터는 구성적, 유도성 또는 억제성 프로모터일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시는 CBA 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 개시의 이종성 트랜스진을 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 예시적인 프로모터 및 설명은 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제20140335054호에서 찾아볼 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CBA 프로모터, 최소 CBA 프로모터, CMV 프로모터 또는 GUSB 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 hEF1a 프로모터이다.
구성적 프로모터의 예에는 제한 없이 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서를 가짐), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서를 가짐)[예를 들어, 문헌[Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)] 참조], SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, 13-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 및 EFla 프로모터[Invitrogen]가 포함된다.
유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 가능하게 하며, 외인적으로 공급된 화합물, 환경 요인, 예를 들어 온도, 또는 특정 생리학적 상태의 존재, 예를 들어, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의해, 또는 복제하는 세포에서만 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 제한 없이 Invitrogen, Clontech 및 Ariad를 포함하는 다양한 상업적 공급처로부터 구입 가능하다. 많은 다른 시스템이 기술되어 있으며, 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 외인적으로 공급된 프로모터에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예는 아연 유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex) 유도성 마우스 유암 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 중합효소 프로모터 시스템(WO 98/10088호); 탈피호르몬 곤충 프로모터(문헌[No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,93:3346-3351 (1996)]), 테트라사이클린 억제성 시스템(문헌[Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)]), 테트라사이클린 유도성 시스템(문헌[Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)], 또한 문헌[Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)]을 참조함), RU486 유도성 시스템(문헌[Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)] 및 문헌[Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)]) 및 라파마이신 유도성 시스템(Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997))을 포함한다. 이와 관련하여 유용할 수 있는 유도성 프로모터의 또 다른 유형은 특정 생리학적 상태, 예를 들어 온도, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의해, 또는 복제하는 세포에서만 조절되는 프로모터이다.
또 다른 구현예에서, 트랜스진에 대한 천연 프로모터 또는 이의 단편이 사용될 것이다. 천연 프로모터는 트랜스진의 발현이 천연 발현을 모방해야 하는 것이 요망되는 경우에 바람직할 수 있다. 천연 프로모터는 트랜스진의 발현이 일시적 또는 발달적으로, 또는 조직 특이적 방식으로, 또는 특정 전사 자극에 반응하여 조절되어야 하는 경우에 사용될 수 있다. 추가의 구현예에서, 다른 천연 발현 제어 요소, 예를 들어, 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 코작(Kozak) 컨센서스 서열을 또한 사용하여 천연 발현을 모방할 수 있다.
일부 구현예에서, 조절 서열은 조직 특이적 유전자 발현 능력을 부여한다. 일부 경우에, 조직 특이적 조절 서열은 조직 특이적 방식으로 전사를 유도하는 조직 특이적 전사 인자와 결합한다. 이러한 조직 특이적 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서 등)은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예시적 조직 특이적 조절 서열은 다음과 같은 조직 특이적 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 신경세포성, 예를 들어, 신경세포 특이적 에놀라제(NSE) 프로모터(문헌[Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)]), 신경미세섬유 경쇄 유전자 프로모터(문헌[Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)]), 및 신경세포 특이적 vgf 유전자 프로모터(문헌[Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)]). 일부 구현예에서, 조직 특이적 프로모터는 신경세포 핵(NeuN), 아교 섬유 산성 단백질(GFAP), 선종성 결장폴립증(APC), 및 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1(Iba-1)로부터 선택된 유전자의 프로모터이다. 다른 적절한 조직 특이적 프로모터는 당업자에게 명백할 것이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 닭 베타-액틴 프로모터이다.
일부 구현예에서, 프로모터는 CNS의 세포에서 이종성 핵산을 발현시킨다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 본 개시의 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산은 CNS 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 뇌 세포에서 이종성 핵산을 발현시킨다. 뇌 세포는 제한 없이 신경세포(예를 들어, 감각 신경세포, 운동 신경세포, 사이신경세포(interneuron), 도파민성 신경세포, 중형 가시 신경세포, 콜린성 신경세포, GABA성(GABAergic) 신경세포, 피라미드 신경세포 등), 신경아교세포(예를 들어, 미세아교세포, 큰아교세포, 별아교세포, 희소돌기아교세포, 뇌실막세포, 방사 아교세포(radial glia) 등), 뇌 실질 세포(brain parenchyma cell), 미세아교세포, 뇌실막세포, 및/또는 푸르킨예(Purkinje) 세포를 포함하는 당업계에 공지된 임의의 뇌세포를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 신경세포 및/또는 신경아교세포에서 이종성 핵산을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 신경세포는 꼬리핵의 중형 가시 신경세포, 피각의 중형 가시 신경세포, 피질 IV층의 신경세포 및/또는 피질층 V의 신경세포이다.
CNS 세포, 뇌 세포, 신경세포 및 신경아교세포에서 전사체(예를 들어, 이종성 트랜스진)를 발현시키는 다양한 프로모터가 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서에 기재되어 있다. 이러한 프로모터는 선택된 유전자와 통상적으로 관련된 제어 서열 또는 이종성 제어 서열을 포함할 수 있다. 흔히, 유용한 이종성 제어 서열은 포유동물 또는 바이러스 유전자를 인코딩하는 서열로부터 유래된 것을 포함한다. 예는 제한 없이 SV40 초기 프로모터, 마우스 유암 바이러스 LTR 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(Ad MLP), 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예를 들어 CMV 즉시형 초기 프로모터 영역(CMVIE), 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 합성 프로모터, 하이브리드 프로모터 등을 포함한다. 또한, 뮤린 메탈로티오네인 유전자와 같은 비바이러스 유전자로부터 유래된 서열이 또한 사용될 수 있다. 이러한 프로모터 서열은, 예를 들어 Stratagene(San Diego, CA)으로부터 상업적으로 구입 가능하다. CNS 특이적 프로모터 및 유도성 프로모터가 사용될 수 있다. CNS 특이적 프로모터의 예는 제한 없이 CNS 특이적 유전자, 예를 들어 미엘린 염기성 단백질(MBP), 아교 섬유 산 단백질(GFAP) 및 신경세포 특이적 에놀라제(NSE)로부터 단리된 것을 포함한다. 유도성 프로모터의 예에는, 특히 탈피호르몬, 테트라사이클린, 메탈로티오네인 및 저산소증에 대한 DNA 반응성 요소가 포함된다.
본 개시는 AAV 바이러스 입자 내로의 본 명세서에 기재된 바와 같은 RNAi를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열의 도입 또는 패키징을 위한 재조합 바이러스 유전체의 사용을 고려한다. 재조합 바이러스 유전체는 RNAi의 발현을 확립하기 위한 임의의 요소, 예를 들어 프로모터, 이종성 핵산, ITR, 리보솜 결합 요소, 종결인자, 인핸서, 선택 마커, 인트론, polyA 신호 및/또는 복제 원점을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 인핸서, 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체 쌍, 매트릭스 부착 부위 또는 폴리아데닐화 신호 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, RNAi를 인코딩하는 벡터를 포함하는 유효량의 rAAV 입자의 투여는 투여 부위(예를 들어, 선조체 및/또는 피질) 또는 그 근처에 있거나 투여 부위로부터 더 멀리 떨어져 있는 세포(예를 들어, CNS 세포, 뇌 세포, 신경세포 및/또는 신경아교세포)를 형질도입시킨다. 일부 구현예에서, 신경세포의 약 5% 초과, 약 10% 초과, 약 15% 초과, 약 20% 초과, 약 25% 초과, 약 30% 초과, 약 35% 초과, 약 40% 초과, 약 45% 초과, 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과 또는 약 100% 중 임의의 %가 형질도입된다. 일부 구현예에서, 신경세포의 약 5% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 75%, 약 25% 내지 약 50%, 또는 약 30% 내지 약 50%가 형질도입된다. miRNA를 발현하는 재조합 바이러스 입자에 의해 형질도입된 신경세포를 확인하는 방법은 당업계에 알려져 있으며; 예를 들어, 면역조직화학, RNA 검출(예를 들어, qPCR, 노던 블롯팅, RNA-seq, 원위치 하이브리드화 등) 또는 강화 녹색 형광 단백질과 같은 공동 발현되는 마커의 사용을 이용하여 발현을 검출할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시는 재조합 자기 보완성(self-complementing) 유전체(예를 들어, 자기 상보성 rAAV 벡터)를 포함하는 바이러스 입자를 제공한다. 자기 보완성 벡터 유전체를 갖는 AAV 바이러스 입자 및 자기 보완성 AAV 유전체의 사용 방법은 미국 특허 제6,596,535호; 미국 특허 제7,125,717호; 미국 특허 제7,465,583호; 미국 특허 제7,785,888호; 미국 특허 제7,790,154호; 미국 특허 제7,846,729호; 미국 특허 제8,093,054호; 및 미국 특허 제8,361,457호; 및 문헌[Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105-2111]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함되어 있다. 자기 보완성 유전체를 포함하는 rAAV는 이의 부분적으로 보완성인 서열(예를 들어, 이종성 핵산의 코딩 및 비코딩 가닥을 보완함)에 의해 이중 가닥 DNA 분자를 신속히 형성할 것이다. 일부 구현예에서, 벡터는 이종성 핵산을 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 그 핵산의 상보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 그 길이의 대부분 또는 전부를 따라 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, RNAi를 인코딩하는 제1 이종성 핵산 서열과 RNAi의 상보체를 인코딩하는 제2 이종성 핵산 서열은 돌연변이된 ITR(예를 들어, 우측 ITR)에 의해 연결되어 있다. 일부 구현예에서, ITR은 폴리뉴클레오티드 서열 5'-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCC GGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG-3'(SEQ ID NO: 69)를 포함한다. 돌연변이된 ITR은 말단 분해 서열을 포함하는 D 영역의 결실을 포함한다. 결과적으로, AAV 바이러스 유전체의 복제 시에, rep 단백질은 돌연변이된 ITR에서 바이러스 유전체를 절단하지 않을 것이며, 따라서 5'에서 3' 순서로 하기를 포함하는 재조합 바이러스 유전체가 바이러스 캡시드에 패키징될 것이다: AAV ITR, 조절 서열을 포함하는 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열, 돌연변이된 AAV ITR, 제1 이종성 폴리뉴클레오티드에 대해 역배향인 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 및 제3 AAV ITR.
VI. 바이러스 입자 및 바이러스 입자를 생성시키는 방법
본 개시는, 특히 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 입자뿐만 아니라 포유동물의 질병 또는 장애, 예를 들어 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하기 위한 이의 사용 방법을 제공한다.
바이러스 입자
본 개시는 본 명세서에 개시된 바와 같은 RNAi를 포함하는 바이러스 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 본 명세서에 개시된 바와 같은 본 개시의 RNAi를 전달하기 위한 바이러스 입자를 제공한다. 예를 들어, 본 개시는 재조합 바이러스 입자를 사용하여 RNA를 전달하여 포유동물의 질병 또는 장애를 치료하는 방법, 예를 들어 RNAi를 포함하는 rAAV 입자를 사용하여 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 입자는 재조합 AAV 입자이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 1개 또는 2개의 ITR에 의해 플랭킹된 본 개시의 RNAi의 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 입자이다. 핵산은 AAV 입자에 캡시드화된다. AAV 입자는 또한 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 관심 코딩 서열(들)(예를 들어, 본 개시의 RNAi의 핵산)과 전사 방향으로 작동적으로 연결된 성분, 전사 개시 서열과 전사 종결 서열을 포함하는 제어 서열을 포함하여 발현 작제물을 형성한다. 발현 작제물은 적어도 하나의 기능적 AAV ITR 서열에 의해 5' 및 3' 말단에서 플랭킹되어 있다. "기능적 AAV ITR 서열"이란 ITR 서열이 AAV 비리온의 구제, 복제 및 패키징을 위해 의도된 바와 같이 기능함을 의미한다. 문헌[Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32]; 문헌[Passini et al., J. Virol., 2003, 77(12):7034-40]; 및 문헌[Pechan et al., Gene Ther., 2009, 16:10-16]을 참조하며, 이들 문헌은 모두 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함되어 있다. 본 개시의 일부 양태를 실시하기 위해, 재조합 벡터는 캡시드화에 필수적인 AAV의 모든 서열 및 rAAV에 의한 감염을 위한 물리적 구조를 적어도 포함한다. 본 개시의 벡터에 사용하기 위한 AAV ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 문헌[Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801]에 기재된 바와 같음)를 가질 필요가 없고, 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있거나 AAV ITR은 여러 AAV 혈청형 중 임의의 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 현재 40가지가 넘는 AAV 혈청이 알려져 있고, 새로운 혈청 및 기존 혈청형의 변이형이 계속 확인되고 있다. 문헌[Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6]; 문헌[Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081-6]; 및 문헌[Bossis et al., J. Virol., 2003, 77(12):6799-810]을 참조한다. 임의의 AAV 혈청형의 사용이 본 개시의 범주 내에서 고려된다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV 혈청형으로부터 유래된 벡터이고, 이 AAV 혈청형은 제한 없이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV 또는 마우스 AAV 캡시드 혈청형 등인 AAV ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV의 핵산은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV 또는 마우스 AAV 캡시드 혈청형 등의 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV의 핵산은 본 명세서에 기재된 바와 같은 RNAi를 추가로 인코딩한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2HBKO 캡시드(예를 들어, WO2015168666에 기재된 바와 같음), AAV9 캡시드, PHP.B 캡시드, PHP.eB 캡시드, 또는 Olig001 캡시드를 포함한다.
예를 들어, AAV의 핵산은 본 명세서에서 고려되는 임의의 AAV 혈청형의 적어도 하나의 ITR을 포함할 수 있고, 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 추가로 인코딩할 수 있으며, 여기서 a) 제1 가닥과 제2 형태는 이중체를 형성하고; b) 제1 가닥은 가이드 영역을 포함하고, c) 제2 가닥은 비-가이드 영역을 포함하며, 여기서 비-가이드 영역은 가이드 가닥에서 벌지를 생성하기 위해 9번 염기 및 10번 염기에서 2개의 뉴클레오티드 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV는 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV는 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, AAV의 핵산은 5'에서 3'로 다음을 인코딩하는 핵산을 포함한다: ITR(예를 들어, AAV2 ITR), 프로모터, 본 명세서에 개시된 바와 같은 RNAi를 인코딩하는 핵산, 폴리아데닐화 신호, 및 AAV ITR(예를 들어, AAV2 ITR). 일부 구현예에서, AAV의 핵산은 5'에서 3'로 다음을 인코딩하는 핵산을 포함한다: ITR(예를 들어, AAV2 ITR), 프로모터, 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 인코딩하는 핵산, 폴리아데닐화 신호, 및 AAV ITR(예를 들어, AAV2 ITR). 일부 구현예에서, AAV의 핵산은 5'에서 3'로 다음을 인코딩하는 핵산을 포함한다: ITR(예를 들어, AAV2 ITR), 프로모터, 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 인코딩하는 핵산, 폴리아데닐화 신호, 및 AAV ITR(예를 들어, AAV2 ITR). 일부 구현예에서, AAV의 핵산은 5'에서 3'로 다음을 인코딩하는 핵산을 포함한다: ITR(예를 들어, AAV2 ITR), CBA 프로모터, 본 명세서에 개시된 바와 같은 RNAi를 인코딩하는 핵산, 폴리아데닐화 신호(예를 들어, 소 성장 호르몬 폴리A), 및 AAV ITR(예를 들어, AAV2 ITR). 일부 구현예에서, RNAi는 표 1로부터 선택된다. 일부 구현예에서, AAV의 핵산은 5'에서 3'로 다음을 인코딩하는 핵산을 포함한다: ITR(예를 들어, AAV2 ITR), CBA 프로모터, 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 인코딩하는 핵산, 폴리아데닐화 신호(예를 들어, 소 성장 호르몬 폴리A), 및 AAV ITR(예를 들어, AAV2 ITR). 일부 구현예에서, AAV의 핵산은 5'에서 3'로 다음을 인코딩하는 핵산을 포함한다: ITR(예를 들어, AAV2 ITR), CBA 프로모터, 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 인코딩하는 핵산, 폴리아데닐화 신호(예를 들어, 소 성장 호르몬 폴리A), 및 AAV ITR(예를 들어, AAV2 ITR). 일부 구현예에서, 제1 가닥 및 제2 가닥은 표 1로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 벡터는 스터퍼 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 녹색 형광 단백질을 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 프로모터와, RNAi를 인코딩하는 핵산 사이에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 A1AT 스터퍼 핵산이다.
일부 구현예에서, AAV의 핵산은 SEQ ID NO: 65의 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV의 핵산은 SEQ ID NO: 65와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산을 포함한다. 추가의 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh8R, AAVrh.10, AAV11, AAV12의 캡시드 단백질, 또는 이러한 캡시드 단백질의 돌연변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이 캡시드 단백질은 AAV 캡시드를 형성하는 능력을 유지한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV5 티로신 돌연변이 캡시드를 포함한다(문헌[Zhong L. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105(22):7827-7832]). 추가의 구현예에서, rAAV 입자는 클레이드(Clade) A 내지 F로부터의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다(문헌[Gao, et al., J. Virol. 2004, 78(12):6381)].
다양한 AAV 혈청형을 사용하여 특정 표적 세포의 형질도입을 최적화하거나 특정 표적 조직(예를 들어, 질병 조직) 내의 특정 세포 유형을 표적화한다. rAAV 입자는 동일한 혈청형 또는 혼합 혈청형의 바이러스 단백질 및 바이러스 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1 캡시드 단백질과 적어도 하나의 AAV2 ITR을 포함할 수 있거나 AAV2 캡시드 단백질과 적어도 하나의 AAV1 ITR을 포함할 수 있다. rAAV 입자의 생성을 위한 AAV 혈청형의 임의의 조합은 각각의 조합이 본 명세서에 명확히 언급되어 있기라도 한 것처럼 본 명세서에 제공된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 적어도 하나의 AAV2 ITR에 의해 플랭킹된 본 개시의 rAAV 벡터(예를 들어, 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 작제물) 및 AAV1 캡시드를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 AAV2 캡시드를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2HBKO 캡시드(예를 들어, WO2015168666에 기재된 바와 같음), AAV9 캡시드, PHP.B 캡시드, PHP.eB 캡시드, 또는 Olig001을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 재조합 자기 보완성 유전체를 포함하는 바이러스 입자를 제공한다. 자기 보완성 유전체를 갖는 AAV 바이러스 입자 및 자기 보완성 AAV 유전자의 사용 방법은 미국 특허 제6,596,535호; 미국 특허 제7,125,717호; 미국 특허 제7,465,583호; 미국 특허 제7,785,888호; 미국 특허 제7,790,154호; 미국 특허 제7,846,729호; 미국 특허 제8,093,054호; 및 미국 특허 제8,361,457호; 및 문헌[Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105-2111]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함되어 있다. 자기 보완성 유전체를 포함하는 rAAV는 이의 부분적으로 보완성인 서열(예를 들어, 트랜스진의 코딩 및 비코딩 가닥을 보완함)에 의해 이중 가닥 DNA 분자를 신속히 형성할 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 AAV 유전체를 포함하는 AAV 바이러스 입자를 제공하고, 여기서 rAAV 유전체는 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 본 개시의 RNAi)와 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 본 개시의 RNAi의 안티센스 가닥)을 포함하며, 여기서 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 그 길이의 대부분 또는 전부를 따라 제2 폴리뉴클레오티드 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열과 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 가닥내 염기쌍형성, 예를 들어 헤어핀 DNA 구조를 용이하게 하는 서열에 의해 연결되어 있다. 헤어핀 구조는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 miRNA 또는 siRNA 분자에 존재한다. 일부 구현예에서, 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열과 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 돌연변이된 ITR(예를 들어, 우측 ITR)에 의해 연결되어 있다. 일부 구현예에서, ITR은 폴리뉴클레오티드 서열 5'-ttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct-3'(SEQ ID NO: 70)를 포함한다. 돌연변이된 ITR은 말단 분해 서열을 포함하는 D 영역의 결실을 포함한다. 결과적으로, AAV 바이러스 유전체의 복제 시에, rep 단백질은 돌연변이된 ITR에서 바이러스 유전체를 절단하지 않을 것이며, 따라서 5'에서 3' 순서로 하기를 포함하는 재조합 바이러스 유전체가 바이러스 캡시드에 패키징될 것이다: AAV ITR, 조절 서열을 포함하는 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열, 돌연변이된 AAV ITR, 제1 이종성 폴리뉴클레오티드에 대해 역배향인 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 및 제3 AAV ITR. 일부 구현예에서, 본 발명은 기능적 AAV2 ITR, 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열, D 영역의 결실을 포함하며 기능적 말단 분해 서열이 결여되어 있는 돌연변이된 AAV2 ITR, 제1 폴리뉴클레오티드 서열인 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 서열에 대한 상보적 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열 및 기능적 AAV2 IR을 포함하는, 재조합 바이러스 유전체를 포함하는 AAV 바이러스 입자를 제공한다.
바이러스 입자의 생성
rAAV 입자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,566,118호; 미국 특허 제6,989,264호; 및 미국 특허 제6,995,006호를 참조한다. 본 발명을 실시함에 있어서, rAAV 입자를 생성하기 위한 숙주 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 미생물 및 효모를 포함한다. 또한, 숙주 세포는 AAV rep 및 cap 유전자가 숙주 세포에서 안정하게 유지되는 패키징 세포이거나 AAV 벡터 유전체가 안정하게 유지되는 생산 세포일 수 있다. 예시적인 패키징 세포 및 생산 세포는 293 세포, A549 세포 또는 HeLa 세포로부터 유래된다. AAV 벡터는 당업계에 공지된 표준 기법을 사용하여 정제되고 제형화된다.
rAAV 벡터의 생성을 위해 당업계에 공지된 방법은 트랜스펙션, 안정한 세포주 생성, 및 아데노바이러스-AAV 하이브리드, 헤르페스바이러스-AAV 하이브리드(문헌[Conway, JE et al., (1997) J. Virology 71(11):8780-8789]) 및 바큘로바이러스-AAV 하이브리드를 포함하는 감염성 하이브리드 바이러스 생성 시스템을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. rAAV 바이러스 입자의 생성을 위한 rAAV 생성 배양물은 모두 1) 예를 들어, 인간 유래 세포주, 예컨대 HeLa, A549 또는 293 세포, 또는 바큘러바이러스 생성 시스템의 경우에는 곤충 유래 세포주, 예컨대 SF-9를 포함하는 적합한 숙주 세포; 2) 야생형 또는 돌연변이 아데노바이러스(예를 들어, 온도 민감성 아데노바이러스), 헤르페스 바이러스, 바큘로바이러스, 또는 헬퍼 기능을 제공하는 플라스미드 작제물에 의해 제공되는, 적합한 헬퍼 바이러스 기능; 3) AAV rep 및 cap 유전자 및 유전자 생성물; 4) 적어도 하나의 AAV ITR 서열에 의해 플랭킹된 핵산(예를 들어, 치료용 핵산); 및 5) rAAV 생성을 지지하기 위한 적합한 배지 및 배지 성분을 필요로 한다. 일부 구현예에서, AAV rep 및 cap 유전자 생성물은 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, AAV rep 유전자 생성물은 rep 유전자 생성물이 복제하여 rAAV 유전체를 패키징하도록 기능할 수 있는 한 rAAV 벡터 유전체의 ITR과 동일한 혈청형을 갖지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 당업계에 공지된 적합한 배지가 rAAV 벡터의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이러한 배지는 제한 없이, 변형 이글 배지(MEM), 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 미국 특허 제6,566,118호에 기재된 것과 같은 맞춤형 제형(custom formulation) 및 미국 특허 제6,723,551호에 기재된 바와 같은 Sf-900 II SFM 배지를 비롯한 Hyclone Laboratories 및 JRH에 의해 생산되는 배지를 포함하고, 이들 미국 특허는 각각 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함되며, 특히 재조합 AAV 벡터의 생성에 사용하기 위한 맞춤형 배지 제형에 관하여 그러하다. 일부 구현예에서, AAV 헬퍼 기능은 아데노바이러스 또는 HSV에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, AAV 헬퍼 기능은 바큘로바이러스에 의해 제공되며, 숙주 세포는 곤충 세포(예를 들어, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(Sf9) 세포)이다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 삼중 트랜스펙션법, 예를 들어 하기 제공되는 예시적인 삼중 트랜스펙션법에 의해 생성될 수 있다. 간략하게 말하면, 헬퍼 아데노바이러스 플라스미드과 함께 rep 유전자 및 캡시드 유전자를 함유하는 플라스미드를 (예를 들어, 칼슘 포스페이트법을 사용하여) 세포주(예를 들어, HEK-293 세포) 내로 트랜스펙션시킬 수 있고, 바이러스를 수집하고 선택적으로 정제할 수 있다. 이와 같이, 일부 구현예에서, rAAV 입자는 숙주 세포 내로의, rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap를 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산의 삼중 트랜스펙션에 의해 생성되었으며, 여기서 숙주 세포로의 핵산의 트랜스펙션은 rAAV 입자를 생성할 수 있는 숙주 세포를 발생시킨다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 생산 세포주 방법, 예를 들어 하기 제공되는 예시적인 생산 세포주 방법(또한, 문헌[Martin et al., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269]에서 언급된 방법 참조)에 의해 생성될 수 있다. 간략하게 말하면, 세포주(예를 들어, HeLa 세포주)를 rep 유전자, 캡시드 유전자 및 프로모터 이종성 핵산 서열을 함유하는 플라스미드로 안정하게 트랜스펙션시킬 수 있다. 세포주를 스크리닝하여 rAAV 생성을 위한 선도 클론(lead clone)을 선택할 수 있고, 이어서 이를 생산용 생물반응기로 증식시키고, 헬퍼로서 아데노바이러스(예를 들어, 야생형 아데노바이러스)로 감염시켜 rAAV 생성을 개시할 수 있다. 후속하여 바이러스를 수거할 수 있고, 아데노바이러스를 (예를 들어, 열에 의해) 비활성화시키고/시키거나 제거할 수 있고, rAAV 입자를 정제할 수 있다. 이와 같이, 일부 구현예에서, rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap을 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산 중 하나 이상을 포함하는 생산 세포주에 의해 rAAV 입자를 생성하였다.
일부 양태에서, (a) rAAV 입자가 생성되는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 숙주 세포는 (i) 하나 이상의 AAV 패키지 유전자(여기서, 상기 각각의 AAV 패키징 유전자는 AAV 복제 및/또는 캡시드화 단백질을 인코딩함); (ii) 적어도 하나의 AAV ITR에 의해 플랭킹된 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV 프로-벡터, 및 (iii) AAV 헬퍼 기능을 포함하는, 단계; 및 (b) 숙주 세포에 의해 생성된 rAAV 입자를 회수하는 단계를 포함하여 본 개시에 개시된 바와 같은 임의의 rAAV 입자를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, RNAi는 SEQ ID NO: 61(도 1a) 또는 SEQ ID NO: 63(도 1b)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 캡시드 혈청형 ITR 등의 AAV ITR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 캡시드화 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6(예를 들어, 야생형 AAV6 캡시드, 또는 미국 특허 출원 공개 제2012/0164106호에 기재된 바와 같은, ShH10과 같은 변이체 AAV6 캡시드), AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9(예를 들어, 야생형 AAV9 캡시드, 또는 미국 특허 출원 공개 제2013/0323226호에 기재된 바와 같은 변형된 AAV9 캡시드), AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, 티로신 캡시드 돌연변이체, 헤파린 결합 캡시드 돌연변이체, AAV2R471A 캡시드, AAVAAV2/2-7m8 캡시드, AAV DJ 캡시드(예를 들어, AAV-DJ/8 캡시드, AAV-DJ/9 캡시드, 또는 미국 특허 출원 공개 제2012/0066783호에 기재된 임의의 다른 캡시드), AAV2 N587A 캡시드, AAV2 E548A 캡시드, AAV2 N708A 캡시드, AAV V708K 캡시드, 염소 AAV 캡시드, AAV1/AAV2 키메라 캡시드, 소 AAV 캡시드, 마우스 AAV 캡시드, rAAV2/HBoV1 캡시드, 또는 미국 특허 제8,283,151호 또는 국제특허 공개 WO/2003/042397호에 기재된 AAV 캡시드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드는 WO2015168666에 기재된 바와 같은 AAV2HBKO 캡시드이다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드는 AAV9 캡시드이다. 일부 구현예태에서, AAV 캡시드는 PHP.B, PHP.eB 또는 Olig001 캡시드이다. 일부 구현예에서, 돌연변이 캡시드 단백질은 AAV 캡시드를 형성하는 능력을 유지한다. 일부 구현예에서, 캡시드화 단백질은 AAV5 티로신 돌연변이 캡시드 단백질이다. 추가의 구현예에서, rAAV 입자는 클레이드 A 내지 클레이드 F로부터의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1 캡시드, 및 AAV2 ITR 및 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 유전체를 포함한다. 추가의 구현예에서, rAAV 입자는 정제된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "정제된"은 rAAV 입자가 자연적으로 발생하거나 처음 제조되는 경우에 또한 존재할 수 있는 다른 성분 중 적어도 일부가 없는 rAAV 입자의 제조물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 단리된 rAAV 입자는 공급원 혼합물, 예를 들어, 배양물 용해질 또는 생성 배양물 상층액으로부터 이를 농축시키는 정제 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 농축은 다양한 방식, 예를 들어, 용액에 존재하는 DNase 내성 입자(DRP) 또는 유전체 카피(gc)의 비율, 또는 감염도에 의해 측정될 수 있거나, 이는 공급원 혼합물에 존재하는 제2의 잠재적 방해 물질, 예를 들어, 생성 배양물 오염물질 또는 헬퍼 바이러스를 포함하는 공정내(in-process) 오염물질을 포함하는 오염물질, 배지 성분 등과 관련하여 측정될 수 있다.
아데노바이러스 벡터 입자의 생성을 위한 많은 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 내용물이 제거된 아데노바이러스 벡터의 경우, 아데노바이러스 벡터 유전체 및 헬퍼 아데노바이러스 유전체가 패키징 세포주(예를 들어, 293 세포주) 내로 트랜스펙션될 수 있다. 일부 구현예에서, 헬퍼 아데노바이러스 유전체는 이의 패키징 신호를 플랭킹하는 재조합 부위들을 함유할 수 있으며, 둘 모두의 유유전체가 재조합효소(예를 들어, Cre/loxP 시스템이 사용될 수 있음)를 발현하는 패키징 세포주 내로 트랜스펙션되어 관심 아데노바이러스 벡터가 헬퍼 아데노바이러스보다 더 효율적으로 패키징되게 할 수 있다(예를 들어, 문헌[Alba, R. et al. (2005) Gene Ther. 12 Suppl 1:S18-27] 참조). 아데노바이러스 벡터는 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법과 같은 표준 방법을 사용하여 수거되고 정제될 수 있다.
렌티바이러스 벡터 입자의 생성을 위한 많은 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 3세대 렌티바이러스 벡터의 경우, gag 및 pol 유전자와 함께 관심 렌티바이러스 유전체를 함유하는 벡터가, rev 유전자를 함유하는 벡터와 함께 패키징 세포주(예를 들어, 293 세포주) 내로 공동 트랜스펙션될 수 있다. 관심 렌티바이러스 유전체는 Tat의 부재 하에 전사를 촉진하는 키메라 LTR을 또한 함유한다(문헌[Dull, T. et al. (1998) J. Virol. 72:8463-71] 참조). 렌티바이러스 벡터는 본 명세서에 기재된 방법(예를 들어, 문헌[Segura MM, et al., (2013) Expert Opin Biol Ther. 13(7):987-1011])을 사용하여 수거되고 정제될 수 있다.
HSV 입자의 생성을 위한 많은 방법이 당업계에 공지되어 있다. HSV 벡터는 본 명세서에 기재된 방법과 같은 표준 방법을 사용하여 수거되고 정제될 수 있다. 예를 들어, 복제 결함성 HSV 벡터의 경우, 즉시형 초기(IE) 유전자의 전부가 결여되어 있는 관심 HSV 유전체가 바이러스 생성에 필요한 유전자, 예를 들어 ICP4, ICP27 및 ICP0를 제공하는 보완성 세포주 내로 트랜스펙션될 수 있다(예를 들어, 문헌[Samaniego, L.A. et al. (1998) J. Virol. 72:3307-20] 참조). HSV 벡터는 기재된 방법(예를 들어, 문헌[Goins, WF et al., (2014) Herpes Simplex Virus Methods in Molecular Biology 1144:63-79])을 사용하여 수거되고 정제될 수 있다.
또한, 본 명세서에는 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 재조합 바이러스 입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 투여 방식에 적합할 수 있다. 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 입자의 약제학적 조성물은 뇌에 도입될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 입자는 선조체내로 투여될 수 있다. rAAV 입자, 아데노바이러스 입자, 렌티바이러스 입자 및 HSV 입자를 포함하는 임의의 본 개시의 재조합 바이러스 입자가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 재조합 바이러스 입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물은 인간으로의 투여에 적합하다. 이러한 담체는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, pp. 1035-1038 and 1570-1580] 참조). 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 rAAV과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물은 포유동물의 뇌 내로의 주입(예를 들어, 선조체내 투여)에 적합하다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 재조합 렌티바이러스 입자와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물은 포유동물의 뇌 내로의 주입(예를 들어, 선조체내 투여)에 적합하다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 재조합 아데노바이러스 입자와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물은 포유동물의 뇌 내로의 주입(예를 들어, 선조체내 투여)에 적합하다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 재조합 HSV 입자와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물은 포유동물의 뇌 내로의 주입(예를 들어, 선조체내 투여)에 적합하다.
이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 멸균 액체, 예를 들어 물 및 오일, 예컨대 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유 등일 수 있다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체, 특히 주사용 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 약제학적 조성물은 추가 성분, 예를 들어 보존제, 완충제, 장성(tonicity) 작용제, 항산화제 및 안정제, 비이온성 습윤제 또는 정화제, 점도 증가제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 단일 단위 투여량 또는 다회투여량 형태로 패키징될 수 있다. 일반적으로 조성물은 멸균성이고 실질적으로 등장성인 용액으로 제형화된다.
VII. 제조 물품 및 키트
또한, 본 명세서에 기재된 방법에 사용하기 위한 키트 또는 제조 물품이 제공된다. 양태에서, 키트는 적합한 패키징 내에 본 명세서에 기재된 조성물(예를 들어, 본 개시의 재조합 바이러스 입자, 예를 들어 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV 입자)를 포함한다. 본 명세서에 기재된 조성물(예를 들어, 선조체내용 조성물)을 위한 적합한 패키징은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 바이알(예를 들어, 밀봉 바이알), 용기(vessel), 앰풀, 병, 자아(jar), 가요성 패키징(예를 들어, 밀봉 Mylar 또는 플라스틱 백) 등을 포함한다. 이러한 제조 물품은 추가로 멸균되고/되거나 밀봉될 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 조성물을 포함하는 키트를 또한 제공하며, 이는 본 명세서에 기재된 용도와 같은 조성물을 사용하는 방법에 관한 설명서(들)을 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 키트는, 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 설명서가 함유된 패키지 삽입물을 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 포유동물(예를 들어, 선조체내 투여를 통함) 내지 영장류의 뇌 내로의 적어도 1 × 109개의 유전체 카피의 전달을 위한 본 개시의 RNAi를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 재조합 바이러스 입자의 조성물, 영장류의 뇌 내로의 주입에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체, 및 하기 중 하나 이상을 포함한다: 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 영장류의 뇌 내로의 주입(예를 들어, 선조체내 투여)을 수행하기 위한 설명서가 함유된 패키지 삽입물. 일부 구현예에서, 키트는 본 명세서에 기재된 재조합 바이러스 입자를 사용하여 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하기 위한 설명서를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 본 명세서에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 본 명세서에 기재된 재조합 바이러스 입자를 사용하기 위한 설명서를 포함한다.
VIII. 예시적 구현예
1. 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi로서, a) 제1 가닥과 제2 가닥은 이중체를 형성하고; b) 제1 가닥은 가이드 영역을 포함하고, 여기서 가이드 영역은 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)와 적어도 약 90% 동일성을 갖거나 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산을 포함하고; c) 제2 가닥은 비-가이드 영역을 포함하는, RNAi.
2. 구현예 1에 있어서, 가이드 영역은 핵산 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)를 포함하고, 비-가이드 영역은 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)를 포함하는, RNAi.
3. 구현예 1에 있어서, 제1 가닥은 SEQ ID NO: 24와 약 90% 동일성을 갖거나 SEQ ID NO: 53과 약 90% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, RNAi.
4. 구현예 1에 있어서, 가이드 영역은 핵산 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)를 포함하고, 비-가이드 영역은 서열 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)를 포함하는, RNAi.
5. 구현예 1에 있어서, 제2 가닥은 SEQ ID NO: 37과 약 90% 동일성을 갖거나 SEQ ID NO: 37과 약 90% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, RNAi.
6. 구현예 1 내지 구현예 5 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 가닥과 제2 가닥은 루프 구조를 형성할 수 있는 RNA 링커에 의해 연결되어 있는, RNAi.
7. 구현예 6에 있어서, RNA 링커는 4개 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함하는, RNAi.
8. 구현예 6 또는 구현예 7에 있어서, 루프 구조는 4개 내지 20개의 뉴클레오티드를 포함하는, RNAi.
9. 구현예 6 내지 구현예 8 중 어느 한 구현예에 있어서, RNAi는 5'에서 3'로 제2 가닥, RNA 링커, 및 제1 가닥을 포함하는, RNAi.
10. 구현예 6 내지 구현예 8 중 어느 한 구현예에 있어서, RNAi는 5'에서 3'로 제1 가닥, RNA 링커, 및 제2 가닥을 포함하는, RNAi.
11. 구현예 10에 있어서, RNAi는 SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 63의 핵산 서열을 포함하는, RNAi.
12. 구현예 11에 있어서, RNAi는 SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 63의 뉴클레오티드 서열과 약 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, RNAi.
13. 구현예 1 내지 구현예 12 중 어느 한 구현예에 있어서, RNAi는 작은 저해성 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 또는 작은 헤어핀 RNA(shRNA)인, RNAi.
14. 구현예 1 내지 구현예 13 중 어느 한 구현예에 있어서, RNAi는 신경 퇴행성 시뉴클레인병증과 관련된 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA를 표적화하는, RNAi.
15. 구현예 14에 있어서, 폴리펩티드는 알파-시뉴클레인(SNCA)인, RNAi.
16. 구현예 15에 있어서, 알파 시뉴클레인은 인간 알파-시뉴클레인인, RNAi.
17. 구현예 14 내지 구현예 16 중 어느 한 구현예에 있어서, 신경 퇴행성 시뉴클레인병증은 파킨슨병(PD), 다계통 위축증(MSA), 또는 루이 소체 치매(DLB)인, RNAi.
18. 구현예 1 내지 구현예 17 중 어느 한 구현예의 RNAi를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 작제물.
19. 구현예 18에 있어서, RNAi를 인코딩하는 핵산은 miRNA 스캐폴드를 포함하는, 발현 작제물.
20. 구현예 18 또는 구현예 19에 있어서, RNAi를 인코딩하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있는, 발현 작제물.
21. 구현예 20에 있어서, 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시형 초기 프로모터, RSV LTR, MoMLV LTR, 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, CK6 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터(TTR), TK 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), HBV 프로모터, hAAT 프로모터, LSP 프로모터, 키메라 간 특이적 프로모터(LSP), E2F 프로모터, 텔로머라제(hTERT) 프로모터; 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴/토끼 β-글로빈 프로모터(CAG) 프로모터, 신장 인자 1-알파 프로모터(EFl-알파) 프로모터, 인간 β-글루쿠로니다제 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, 및 13-액틴 프로모터로부터 선택되는, 발현 작제물.
22. 구현예 18 내지 구현예 21 중 어느 한 구현예에 있어서, 발현 작제물은 인트론을 추가로 포함하는, 발현 작제물.
23. 구현예 22에 있어서, 인트론은 CBA 인트론 또는 hEF1알파 인트론인, 발현 작제물.
24. 구현예 22에 있어서, 인트론은 키메라 인트론인, 발현 작제물.
25. 구현예 22에 있어서, 발현 벡터는 자기 상보성 벡터이고, 인트론은 델타 키메라 인트론인, 발현 작제물.
26. 구현예 18 내지 구현예 25 중 어느 한 구현예에 있어서, 발현 작제물은 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함하는, 발현 작제물.
27. 구현예 26에 있어서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리아데닐화 신호, 또는 HSV TK 폴리아데닐화 신호인, 발현 작제물.
28. 구현예 18 내지 구현예 27 중 어느 한 구현예의 발현 작제물을 포함하는 벡터.
29. 구현예 28에 있어서, 벡터는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 벡터인, 벡터.
30. 구현예 29에 있어서, 발현 작제물은 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복부(ITR) 서열에 의해 플랭킹되어 있는, rAAV 벡터.
31. 구현예 30에 있어서, 발현 작제물은 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹되어 있는, rAAV 벡터.
32. 구현예 30 또는 구현예 31에 있어서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR인, rAAV 벡터.
33. 구현예 30 내지 구현예 32 중 어느 한 구현예에 있어서, AAV ITR은 AAV2 ITR인, rAAV 벡터.
34. 구현예 30 내지 구현예 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 벡터는 스터퍼 핵산을 추가로 포함하는, rAAV 벡터.
35. 구현예 34에 있어서, 스터퍼 핵산은 RNAi를 인코딩하는 핵산의 업스트림 또는 다운스트림에 위치하는, rAAV 벡터.
36. 구현예 30 내지 구현예 35 중 어느 한 구현예에 있어서, 벡터는 자기 상보성 rAAV 벡터인, rAAV 벡터.
37. 구현예 36에 있어서, 벡터는 RNAi를 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 RNAi의 상보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 그 길이의 대부분 또는 전부를 따라 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있는, rAAV 벡터.
38. 구현예 37에 있어서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되어 있으며, 여기서 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함하는, rAAV 벡터.
39. 구현예 29 내지 구현예 38 중 어느 한 구현예의 rAAV 벡터를 포함하는 세포.
40. 구현예 29 내지 구현예 38 중 어느 한 구현예의 rAAV 벡터를 포함하는 재조합 AAV 입자.
41. 구현예 40에 있어서, AAV 바이러스 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV2-HBKO, AAVDJ8, AAVPHP.B, AAVPHP.eB, AAVBR1, AAVHSC15, AAVHSC17, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV 또는 마우스 AAV 캡시드 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함하는, rAAV 입자.
42. 구현예 40 또는 구현예 41에 있어서, rAAV 바이러스 입자의 캡시드 및 ITR은 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래되는, rAAV 입자.
43. 구현예 40 또는 구현예 41에 있어서, rAAV 바이러스 입자의 캡시드 및 ITR은 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래되는, rAAV 입자.
44. 구현예 43에 있어서, ITR은 AAV2로부터 유래되고, rAAV 입자의 캡시드는 AAV1로부터 유래되는, rAAV 입자.
45. 구현예 40 내지 구현예 44 중 어느 한 구현예의 rAAV 입자를 포함하는 조성물.
46. 구현예 45에 있어서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
47. 구현예 1 내지 구현예 17 중 어느 한 구현예의 RNAi를 포함하는 키트.
48. 구현예 40 내지 구현예 44 중 어느 한 구현예의 AAV 입자를 포함하는 키트.
49. 구현예 45 또는 구현예 46의 조성물을 포함하는 키트.
50. 구현예 47 내지 구현예 49 중 어느 한 구현예에 있어서, 사용 설명서를 추가로 포함하는 키트.
51. 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 또는 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥, 및 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하는 방법.
52. 구현예 51에 있어서, 제2 핵산은 서열 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산 또는 서열 5'-E1패신저-3'(SEQ ID NO: 37)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는, 방법.
53. 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하거나, 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하는 방법.
54. 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 또는 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 제1 가닥, 및 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 신경 퇴행성 질병에 걸린 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 알파-시뉴클레인의 발현을 저해하는 방법.
55. 구현예 54에 있어서, 제2 핵산은 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산 또는 서열 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는, 방법.
56. 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하거나, 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 신경 퇴행성 질병에 걸린 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 알파-시뉴클레인의 발현을 저해하는 방법.
57. 구현예 51 내지 구현예 56 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 가닥은 SEQ ID NO: 24의 서열을 갖는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 8의 서열을 갖는 핵산을 포함하는, 방법.
58. 구현예 52, 구현예 53, 구현예 55, 또는 구현예 56 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 가닥은 SEQ ID NO: 53의 서열을 갖는 핵산 또는 SEQ ID NO: 37의 서열을 갖는 핵산을 포함하는, 방법.
59. 구현예 51 내지 구현예 58 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 가닥과 제2 가닥은 루프 구조를 형성할 수 있는 RNA 링커에 의해 연결되어 있는, 방법.
60. 구현예 59에 있어서, RNA 링커는 4개 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
61. 구현예 59 또는 구현예 60에 있어서, 루프 구조는 4개 내지 20개의 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
62. 구현예 59 내지 구현예 61 중 어느 한 구현예에 있어서, RNAi는 5'에서 3'로 제2 가닥, RNA 링커, 및 제1 가닥을 포함하는, 방법.
63. 구현예 59 내지 구현예 61 중 어느 한 구현예에 있어서, RNAi는 5'에서 3'로 제1 가닥, RNA 링커, 및 제2 가닥을 포함하는, 방법.
64. 구현예 63에 있어서, RNAi는 SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 63의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
65. 구현예 64에 있어서, RNAi는 SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 63의 뉴클레오티드 서열과 약 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
66. 구현예 51 내지 구현예 65 중 어느 한 구현예에 있어서, RNAi는 발현 작제물 상에서 인코딩되는, 방법.
67. 구현예 51 내지 구현예 66 중 어느 한 구현예에 있어서, RNAi를 인코딩하는 핵산은 miRNA 스캐폴드를 포함하는, 방법.
68. 구현예 51 내지 구현예 67 중 어느 한 구현예에 있어서, RNAi를 인코딩하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있는, 방법.
69. 구현예 68에 있어서, 프로모터는 포유동물의 뇌에서 RNAi를 발현할 수 있는, 방법.
70. 구현예 69에 있어서, 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시형 초기 프로모터, RSV LTR, MoMLV LTR, 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, CK6 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터(TTR), TK 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), HBV 프로모터, hAAT 프로모터, LSP 프로모터, 키메라 간 특이적 프로모터(LSP), E2F 프로모터, 텔로머라제(hTERT) 프로모터; 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴/토끼 β-글로빈(CAG) 프로모터, 신장 인자 1-알파 프로모터(EFl-알파) 프로모터 및 인간 β-글루쿠로니다제 프로모터로부터 선택되는, 방법.
71. 구현예 68 내지 구현예 70 중 어느 한 구현예에 있어서, 프로모터는 CMV 인핸서와 닭 β-액틴 프로모터를 포함하는 하이브리드 닭 β-액틴 프로모터(CMA)인, 방법.
72. 구현예 66 내지 구현예 71 중 어느 한 구현예에 있어서, 발현 작제물은 인트론을 추가로 포함하는, 방법.
73. 구현예 72에 있어서, 인트론은 CBA 인트론인, 방법.
74. 구현예 72에 있어서, 인트론은 키메라 인트론인, 방법.
75. 구현예 74에 있어서, 발현 작제물은 자기 상보성 벡터이고, 인트론은 델타 키메라 인트론인, 방법.
76. 구현예 66 내지 구현예 75 중 어느 한 구현예에 있어서, 핵산은 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함하는, 방법.
77. 구현예 76에 있어서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인, 방법.
78. 구현예 66 내지 구현예 77 중 어느 한 구현예에 있어서, 발현 작제물은 벡터에 의해 인코딩되는, 방법.
79. 구현예 78에 있어서, 벡터는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 벡터인, 방법.
80. 구현예 79에 있어서, 발현 작제물은 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복부(ITR) 서열에 의해 플랭킹되어 있는, 방법.
81. 구현예 80에 있어서, 발현 작제물은 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹되어 있는, 방법.
82. 구현예 80 또는 구현예 81에 있어서, AAV ITR은 AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR인, 방법.
83. 구현예 80 내지 구현예 82 중 어느 한 구현예에 있어서, AAV ITR은 AAV2 ITR인, 방법.
84. 구현예 83에 있어서, rAAV 벡터는 5'에서 3'로 AAV2 ITR, 프로모터, 인트론, RNAi를 인코딩하는 핵산, 폴리아데닐화 신호, 및 AAV2 ITR을 포함하는, 방법.
85. 구현예 84에 있어서, 프로모터는 CBA 프로모터인, 방법.
86. 구현예 84에 있어서, 인트론은 키메라 인트론, 델타 키메라 인트론 또는 단축형(abbreviated) 키메라 인트론 키메라인, 방법.
87. 구현예 86에 있어서, 키메라 인트론은 CBA + 토끼 베타 글로빈 인트론인, 방법.
88. 구현예 84 내지 구현예 87 중 어느 한 구현예에 있어서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인, 방법.
89. 구현예 83에 있어서, rAAV 벡터는 5'에서 3'로 AAV2 ITR, CBA 프로모터, 키메라 인트론, RNAi를 인코딩하는 핵산, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, 및 AAV2 ITR을 포함하는, 방법.
90. 구현예 89에 있어서, 벡터는 스터퍼 핵산을 추가로 포함하는, 방법.
91. 구현예 90에 있어서, 스터퍼 핵산은 인간 A1AT 유전자의 인트론 1을 포함하는, 방법.
92. 구현예 79 내지 구현예 91 중 어느 한 구현예에 있어서, 벡터는 자기 상보성 벡터인, 방법.
93. 구현예 92에 있어서, 벡터는 RNAi를 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 RNAi의 상보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 그 길이의 대부분 또는 전부를 따라 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있는, 방법.
94. 구현예 93에 있어서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되어 있으며, 여기서 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함하는, 방법.
95. 구현예 79 내지 구현예 94 중 어느 한 구현예에 있어서, 벡터는 rAAV 입자에 캡시드화되는, 방법.
96. 구현예 95에 있어서, AAV 바이러스 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, AAV2-HBKO, AAVDJ8, AAVPHP.B, AAVPHP.eB, AAVBR1, AAVHSC15, AAVHSC17, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 마우스 AAV, 또는 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함하는, 방법.
97. 구현예 95 또는 구현예 96에 있어서, rAAV 바이러스 입자의 캡시드 및 ITR은 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래되는, 방법.
98. 구현예 95 또는 구현예 96에 있어서, rAAV 바이러스 입자의 캡시드 및 ITR은 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래되는, 방법.
99. 구현예 95 내지 구현예 98 중 어느 한 구현예에 있어서, rAAV 바이러스 입자는 AAV2 캡시드를 포함하는, 방법.
100. 구현예 99에 있어서, rAAV 바이러스 입자는 AAV1 캡시드를 포함하고, 벡터는 AAV2 ITR을 포함하는, 방법.
101. 구현예 51 내지 구현예 100 중 어느 한 구현예에 있어서, 구현예 95 내지 구현예 100 중 어느 한 구현예의 rAAV 입자는 조성물 내에 존재하는, 방법.
102. 구현예 101에 있어서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 방법.
실시예
본 개시는 하기 실시예를 참조로 하여 더욱 충분히 이해될 것이다. 그러나, 이러한 실시예는 본 개시의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 명세서에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시 목적을 위한 것으로, 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 암시될 것이고, 이는 본 출원의 사상 및 범위 및 첨부된 청구항의 범주 내에 포함되는 것으로 이해된다.
실시예 1: shmiRNA는 시험관내에서 인간 SNCA 표적을 감소시킴.
시험관내에서 SNCA 발현의 감소를 입증하기 위해, 사이토메갈로바이러스 인핸서 및 hEF1a 프로모터/인트론에 이은 Tbgh 폴리A 서열의 제어 하에 인간 SNCA cDNA A(NM_000345.3)를 인코딩하는 플라스미드 및 후보 RNAi 서열을 인코딩하는 플라스미드로 HEK293T 세포를 트랜스펙션시켰다. SNCA cDNA 및 miRNA 플라스미드를 동시 트랜스펙션시켰다.
방법
siRNA 및 플라스미드
인간/마카크/마우스 SNCA와 최대 상동성을 갖는 한편 이것이 낮은 오프 타겟팅(low-off targeting) 잠재력과 균형을 이루도록 RNAi 서열을 내부적으로 설계하였다. 통상적인 siRNA는 Sigma에 의해 합성되었다. 인간 트랜스크립톰에서의 오프 타겟을 siSPOTR 알고리즘(월드 와이드 웹(https://sispotr.icts.uiowa.edu/sispotr/tools.html))을 사용하여 예측하였다.
SNCA를 표적화하는 RNAi 서열을 발현하는 플라스미드를, 사이토메갈로바이러스 인핸서 및 hEF1a 프로모터/인트론에 의해 구동되는 뮤린 mir155 스캐폴드 내로 끼워 넣었다(embed). RNAi 서열은 표 1에서 찾을 수 있다.
시험관내 세포 배양 및 트랜스펙션
HEK293T 세포를 DMEM + 10% FBS + 펜/스트렙(pen/strep)에서 대략 70% 내지 90% 밀집도(confluency)까지 성장시켰다. 세포를 Lipfectamine 2000(miRNA 포맷 플라스미드의 경우) 또는 RNAiMAX(siRNA 포맷의 경우)로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 3일째에, 세포를 포스페이트 완충 식염수로 헹구고, 전 세포 추출물을 환원 Laemmli 완충액에서 세포 용해에 의해 준비하고, 5분 동안 비등시킨 후, -20℃에서 보관하였다.
웨스턴 블롯팅 및 밀도 측정
세포 용해물을 4% 내지 12% SDS-PAGE(Bio-Rad TGXTM)로 러닝(running)시켰다. 단백질을 니트로셀룰로스(Bio-Rad Transblot®)로 옮기고, 5% 무지방 우유로 차단시키고, 4℃에서 밤새 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 1차 항체를 씻어 내고, HRP 태깅된 2차 항체와 함께 인큐베이션하고, Femto ECL 기질(Bio-Rad)을 사용하여 HRP 활성을 검출하고 Bio-Rad GelDocTM 이미저(imager)로 이미지화했다. ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 밴드를 정량화하였다. 알파-시뉴클레인 단백질 수준을, 단백질 로딩을 위한 대조군에 대한 GAPDH 또는 베타-튜불린에 대해 정규화하였다. 사용된 항체: 알파-시뉴클레인(BD 610787), GAPDH(Sigma G8795), 튜불린(BioLegend MMS-435P-100). HRP-염소 항-마우스 또는 토끼(CST 7076).
결과
도 2에 도시된 바와 같이, shmiRNA는 시험관내에서 인간 SNCA 단백질 수준을 감소시켰다. 27개 서열 중 19개가, 50%를 초과하는 단백질 수준 감소를 보였다.
실시예 2: shmiRNA는 시험관내에서 마우스 SNCA 표적을 감소시킴.
표시된 RNAi 서열 및 마우스 SNCA cDNA를 인코딩하는 플라스미드로 HEK293T 세포를 트랜스펙션시킨 것을 제외하고는 실시예 1에서와 유사한 방법을 본 실험에서 사용하였다.
결과
도 3에 도시된 바와 같이, 표시된 miRNA는 시험관내에서 마우스 SNCA 단백질 수준을 감소시켰으며, 27개 서열 중 14개가, 50%를 초과하는 단백질 수준 감소를 보였다.
실시예 3: siRNA는 시험관내에서 인간 및 마우스 SNCA 표적을 감소시킴.
A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1 및 E2에 대해 siRNA 포맷을 사용하는 추가 실험을 수행하여 표적 감소에 대한 추가 데이터를 제공했는데, 이는 이들이 랫트 SNCA 감소를 필요로 할 수 있는 향후 신경 퇴행 동물 모델을 선택함에 있어서 유연성을 가능하게 하는 랫트 SNCA에 대한 완전한 또는 유의한 상동성을 갖는 추가의 특징을 사용하여 설계되었기 때문이다.
방법
시험관내 세포 배양 및 트랜스펙션
HEK293T 세포를 DMEM + 10% FBS + 펜/스텝(pen/step)에서 대략 70% 내지 90% 밀집도까지 성장시켰다. 세포를 Lipfectamine 2000(miRNA 포맷 플라스미드의 경우) 또는 RNAiMAX(siRNA 포맷의 경우)로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 3일째에, 세포를 포스페이트 완충 식염수로 헹구고, 전 세포 추출물을 환원 Laemmli 완충액에서 세포 용해에 의해 준비하고, 5분 동안 비등시킨 후, -20℃에서 보관하였다.
웨스턴 블롯팅 및 밀도 측정
세포 용해물을 4% 내지 12% SDS-PAGE(Bio-Rad TGXTM)로 러닝시켰다. 단백질을 니트로셀룰로스(Bio-Rad Transblot®)로 옮기고, 5% 무지방 우유로 차단시키고, 4C에서 밤새 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 1차 항체를 씻어 내고, HRP 태깅된 2차와 함께 인큐베이션하고, Femto ECL 기질(Bio-Rad)을 사용하여 HRP 활성을 검출하고 Bio-Rad GelDocTM 이미저로 이미지화했다. ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 밴드를 정량화하였다. 알파-시뉴클레인 단백질 수준을, 단백질 로딩을 위한 대조군에 대한 GAPDH 또는 베타-튜불린에 대해 정규화하였다. 사용된 항체: 알파-시뉴클레인(BD 610787), GAPDH(Sigma G8795), 튜불린(BioLegend MMS-435P-100). HRP-염소 항-마우스 또는 토끼(CST 7076).
결과
도 4a 내지 도 4d에 도시된 바와 같이, 표시된 siRNA는 miRNA 포맷에서의 성능에 기초하여 예상되는 바와 같이 시험관내에서 인간 및 마우스 SNCA 수준을 감소시켰다.
실시예 4: RNAi의 독성 및 신경 보호 특성을 나타냄.
성숙한 도파민 유사 신경세포(10)로 분화된 룬드 인간 중간뇌(Lund human mesencephalic)(LUHMES) 세포를 사용하여 후보 shmiRNA의 독성 및 신경 보호 특성을 평가하였다.
방법
시험관내 세포 배양 및 트랜스펙션
LUHMES 세포(ATCC CRL-2927) 세포를 플라스미드 DNA의 전기 천공을 가능하게 하도록 약간 변형하여 (10)에 기재된 바와 같이 성장시키고 분화시켰다. 간략하게 말하면, LUHMES 세포를 폴리-L-오르니틴 및 피브로넥틴으로 코팅된 플라스크 상의 증식 배지(10)에서 계대 배양하였다. 분화 배지(10)를 첨가하여 도파민성 세포로의 분화를 개시하였다. 세포를 2일 후에 해리시키고, 원하는 DNA로 전기 천공(제조업체의 지침에 따른 LONZA 4D NucleofectorTM X 시스템)하고, 전기 천공 독성을 최소화하기 위해 회수 배지에서 96 웰 플레이트에 리플레이팅(replating)했다. 트랜스펙션 후 4시간째에, 배지를 분화 배지로 다시 변경하였다. 특정 실험을 위해 트랜스펙션 후 지시된 날에 세포를 처리하고 수집하였다.
시험관내 신경 보호 검정
상기와 같이 준비된 LUHMES 세포를 분화 6일(트랜스펙션 4일)차에 지시된 농도의 로테논으로 처리하였다. 로테논으로 처리한 후 48시간째에 제조업체의 지침(Promega)에 따라 Cell Titer Blue® 검정을 이용하여 세포 생존율을 측정했다. 반응성 산소 종(ROS) 생성은 처리 후 24시간째에 DCFDA 키트(Abcam)를 통해 측정했다. 값을 처리되지 않은 대조군 트랜스펙션된 세포에 대해 정규화하였다.
통계 분석
세포 생존율 실험으로부터의 데이터를 집계하여 로테논 유도 독성에 대한 신경 보호 %에 비한 D1 및 E1 서열을 사용하는 SNCA mRNA 녹다운 %의 순위를 매겼다. Graphpad Prism®(v6)을 사용하여 계산된 바와 같이 SNCA 녹다운 퍼센트는 신경 보호 정도와 유의한 상관 관계가 있었다.
결과
도 5a 및 도 5b에 도시된 바와 같이, SNCA 녹다운은 그 자체로 독성이 없으며, 세포 사멸에 대해 유의한 보호를 제공하고(도 5a) 로테논 의존성 ROS 생성을 감소시킨다(도 5b). 대조, D1 및 E1 서열은 그 자체로 세포 생존율을 변경시키지 않았다. 대조군 트랜스펙션된 세포의 로테논 처리는 대략 75%의 세포 사멸을 초래하였지만, SNCA 녹다운 벡터를 사용한 트랜스펙션은 이 독성에 대해 유의한 보호를 제공하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, 세포 생존율 실험으로부터의 데이터를 집계하여 로테논 유도 독성에 대한 신경 보호 퍼센트에 비한 D1 및 E1 서열을 사용하는 SNCA mRNA 녹다운 %의 순위를 매겼다. SNCA 녹다운 정도는 신경 보호 정도와 유의하게 양의 상관 관계가 있었으며, 이는 D1 및 E1 서열을 사용하는 SNCA mRNA의 감소가 유효한 신경 보호 전략임을 나타낸다.
실시예 5: D1 및 E1 벡터에 의한 생체내 표적 녹다운
SNCA의 생체내 녹다운을 결정하기 위해, D1, E1 또는 대조 RNAi 서열을 인코딩하는 AAV 벡터를 야생형 마우스의 SNc에 주입하였다. SNc 조직을 주입 후 1개월째에 수집하였다. RNA를 분리하고, SNCA mRNA의 수준을 Taqman qPCR을 통해 정량화했다. 전사체의 상대적인 수준을 GAPDH에 대해 정규화하였다.
방법
바이러스 벡터
생체내 테스트를 위한 rAAV 바이러스를 생성하기 위해, mir155 카세트를 변형된 AAV2HBKO 캡시드(WO 2015168666 A2)를 사용하는 AAV 바이러스 생산을 위한 1.6 kb CAG 프로모터를 함유하는 AAV2 ITR 플라스미드에 클로닝하였다. 모든 바이러스 벡터를 293 세포에서 삼중 트랜스펙션 방법에 의해 생성하고, 설명된 바와 같이 정제하였다(11). 역가를 qPCR을 통해 결정하였고, 이를 유전체 카피(GC)/mL 또는 총 벡터 유전체(vg)로 표현한다.
동물
수컷 C57BL/6J 마우스(10 내지 12주령)는 프랑스의 Charles River Laboratories에서 구입했다. 동물을 제어된 실온, 습도를 사용하고 12:12 시간의 명암 주기 하에서 음식과 물에 자유롭게 접근하게 하면서, 각 우리에 4마리의 그룹으로 수용하였다.
정위(stereotaxic) 주입
마우스를 케타민(100 mg/kg; Imalgene®; 프랑스의 Merial)과 자일라진(10 mg/Kg; Rompun®; 프랑스의 Bayer)의 혼합물(부피 10 mL/Kg)의 복강내 주입으로 심부 마취시켰다. 동물을 정위 프레임(미국의 Kopf Instruments)에 배치하기 전에, 마우스 두피를 면도하고 Vetidine(프랑스의 Vetoquinol®)으로 소독하였고, 국소 마취제인 부피바카인(5 ml/kg 부피로 2 mg/kg; 프랑스의 Aguettant)을 두개골 피부에 피하 주입하고, Emla(
Figure pct00002
, Astrazeneca)를 귀에 도포하였다. 수술 중에는, 비타민 A Dulcis로 빛으로부터 눈을 보호하고, 온열 담요로 체온을 37℃로 일정하게 유지했다.
주입 좌표 위의 두개골에 작은 구멍을 냈다. 25 μL의 주사기에 유연한 플라스틱 튜브로 연결된(차례로 미세관류 펌프에 연결됨) 캐뉼러 33 게이지(OD 0.254 mm; Phymep)를 좌측 흑질 치밀부(SNpc)에 다음 좌표로 편측으로 삽입했다: AP = 정수리점(bregma)으로부터 - 2.92 mm; ML = 1.25 mm; DV: 경질막(dura)으로부터 -4.5 mm(Paxinos 및 Watson(2008)의 마우스 아틀라스(mouse atlas)에 따름). 무작위화 후, 마우스(n = 10마리/그룹)에 AAV를 주입했다. 주입을 0.2 μL/분의 속도로 수행하고, 1 μL의 최종 부피를 주입했다.
최종 주입 후, 역류를 피하기 위해 캐뉼러를 SNpc에서 추가 5분 동안 유지했다. 이어서, 캐뉼러를 마우스 뇌로부터 천천히 제거하고, 봉합하여 두피를 닫았다. 마우스를 매일 모니터링하였으며, 마우스는 수술 후 카프로펜(5 mg/kg sc; 부피 5 ml/kg; Rimadyl®, Zoetis)의 피하 주입, 및 탈수를 방지하기 위한 약 200 μL의 멸균 식염수의 복강내 주입을 제공받았다. 이어서, 동물이 완전히 깨어날 때까지 MediHeat® 워밍 캐비닛(Warming Cabinet)에 두었다. 주입 후 1개월째에, 동물을 이소플루란 4%로 마취하고, 면역조직화학 및 생화학 분석을 위해 뇌를 처리했다. 모든 실험을 맹검 방식으로 수행하였다.
통계 분석
적용 가능한 경우 다중 비교(Dunnett의 테스트)와 함께, 일원 분산 분석을 이용하는 Prism 소프트웨어(버전 6, Graphpad®)를 이용하여 통계를 수행하였다.
결과
도 7에 도시된 바와 같이, D1 및 E1 벡터는 대조 RNAi에 비해 각각 SNCA mRNA의 55% 및 66% 녹다운을 나타냈으며, 이는 SNCA-표적화 miRNA의 AAV 매개 전달을 사용하는 표적 구조에서의 유의한 생체내 표적 mRNA 녹다운을 입증한다.
도 8에 도시된 바와 같이, SNCA 안티센스 프로브는 대측 반구에 비해 머리에서 꼬리쪽으로의 3군데의 상이한 해부학적 레벨에서 표적 감소를 명확히 보여준다. 대조 RNAi 바이러스는 주입되지 않은 반구에 비해 SNCA mRNA의 어떠한 감소도 나타내지 않았으며, 이는 효과의 특이성을 입증한다. 도 9에 도시된 바와 같이, VTA 내의 알파-시뉴클레인 단백질 신호는 체세포 시뉴클레인 발현을 관찰하기 위해 포화되어야 하며, 이는 그 뇌 영역에서의 SNCA 감소의 어떠한 결정도 배제한다.
실시예 6: AAV-D1 벡터는 SNc 면역조직화학에 의해 마우스에서 SNCA mRNA를 감소시킴
실시예 5에 기재된 바와 같이 대조군인 1e9 GC 또는 D1 AAV 벡터를 마우스에 편측으로 주입하였다. 조직을 수집하고, 관상 절편을 면역조직화학(IHC)을 위해 1개월 후에 처리하여 흑질 치밀부에서 알파-시뉴클레인 단백질 수준을 평가했다.
추가 방법
면역조직화학 및 ISH
뇌를 4℃에서 적어도 2일 동안 4% 포름알데히드에 침수-고정시키고, 30% 수크로스 용액에 동결 보존하고, 이어서 동결시켰다. 동결된 뇌를 흑질(sn)의 전체 전후 축을 따라 연속 관상 절편으로 절단하였다. 절편을 pbs-0.4% 아지드화나트륨에 넣고 4℃에서 보관했다.
무작위로 선택된 일련의 20 ㎛ 두께의 자유-부유(free-floating) 절편을 사용하여, α-syn에 대한 1차 마우스 모노클로날 항체(마우스 모노클로날, 1:2000, 클론 42, BD transductions laboratories)로 면역 표지화를 수행하였다. 이 항체는 시냅스 막에서뿐만 아니라 복측 피개 영역(VTA) 및 SN의 da 신경 세포체 내에서도 주로 국재화를 이용하여 마우스 α-syn 단백질의 내인성 수준을 검출할 수 있다.
절편을 0.1 m pbs-0,15% 트리톤, 소 피부로부터의 0.2% 젤라틴(Sigma, G9391) 용액으로 3회 헹구고, 차단 완충액(즉, 소 혈청으로부터의 0.1 m PBS-10% 알부민, Sigma, A8022)으로 30분 동안 전처리하였다. 이어서, 이를 실온에서 0.1 m PBS에서 1차 항체 용액과 함께 밤새 인큐베이션하였다. 0.1 m PBS-0.15% 트리톤, 0.2% 젤라틴에서 헹군 후, 플루오로크롬-접합 항체(염소 항-마우스 647, Abcam 150119)를 2차 항체로 사용하였다(0.1 m PBS 중 1:400, 실온, 암실에서 90분 인큐베이션). 절편을 0.1 m PBS-0.2% 젤라틴 용액으로 2회, PBS 0.1 m로 1회 헹구고, 마운팅했다(플렉스 슬라이드(flex slide), Dako). 절편을 프롤롱 골드 안티페이드(prolong gold antifade) 시약(Invitrogen p36931)으로 커버슬립 처리하였다.
형광 면역 표지화의 정성적 이미지 분석을 슬라이드 스캐너 시스템(형광 능력이 있는 BX61 현미경이 장착된 Olympus DotSlide 시스템)으로 수행하였다.
결과
도 9에 도시된 바와 같이, 동일한 동물 또는 대조군 주입 동물의 대측 SNc와 비교하여, 세포체 내의 SNCA 단백질은 D1에 의해 명확히 감소한다. 인접 뇌 섹션(하단 패널, 실시예 5에 따라 처리됨)의 ISH 이미지는 대조 벡터가 아닌 D1 RNAi 벡터에 의한 SNCA mRNA의 유사한 감소를 보여준다. 이들 데이터는 SNCA를 표적화하는 miRNA의 AAV 전달이 원하는 뇌 영역에서 항구적(durable) mRNA 녹다운을 보여줌을 입증한다.
실시예 7: 벡터 AAVrh.10에서 E1에 의한 생체내 표적 녹다운
SNCA의 생체내 녹다운을 결정하고 SNCA의 녹다운이 AAV 혈청형에 의존하지 않음을 입증하기 위해, E1 또는 대조 RNAi 서열을 인코딩하는 AAV.rh10 벡터를 야생형 마우스의 SNc에 주입하였다. 앞서 기술된 바와 같이 대조군인 10e9 GC 또는 AAV.rh10 E1 벡터를 마우스에 편측으로 주입하였다. SNc 조직을 주입 후 1개월째에 수집하였다. SNCA mRNA 발현을 원위치 하이브리드화에 의해 정량화하고, SNCA 단백질을 면역조직화학에 의해 검출했다.
방법
바이러스 벡터
생체내 테스트를 위한 rAAV 바이러스를 생성하기 위해, mir155 카세트를 AAV의 rh.10 혈청형의 캡시드를 사용하는 AAV 바이러스 생산을 위한 1.6 kb CAG 프로모터를 함유하는 AAV2 ITR 플라스미드에 클로닝하였다(문헌[Gao, G. P. et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 11854 - 11859]). 모든 바이러스 벡터를 293 세포에서 삼중 트랜스펙션 방법에 의해 생성하고, 설명된 바와 같이 정제하였다(11). 역가를 qPCR을 통해 결정하였고, 이를 유전체 카피(GC)/mL 또는 총 벡터 유전체(vg)로 표현한다.
동물
수컷 C57BL/6J 마우스(10 내지 12주령)는 프랑스의 Charles River Laboratories에서 구입했다. 동물을 제어된 실온, 습도를 사용하고 12:12 시간의 명암 주기 하에서 음식과 물에 자유롭게 접근하게 하면서, 각 우리에 4마리의 그룹으로 수용하였다.
정위 주입
마우스를 케타민(100 mg/kg; Imalgene®; 프랑스의 Merial)과 자일라진(10 mg/Kg; Rompun®; 프랑스의 Bayer)의 혼합물(부피 10 mL/Kg)의 복강내 주입으로 심부 마취시켰다. 동물을 정위 프레임(미국의 Kopf Instruments)에 배치하기 전에, 마우스 두피를 면도하고 Vetidine(프랑스의 Vetoquinol®)으로 소독하였고, 국소 마취제인 부피바카인(5 ml/kg 부피로 2 mg/kg; 프랑스의 Aguettant)을 두개골 피부에 피하 주입하고, Emla(
Figure pct00003
, Astrazeneca)를 귀에 도포하였다. 수술 중에는, 비타민 A Dulcis로 빛으로부터 눈을 보호하고, 온열 담요로 체온을 37℃로 일정하게 유지했다.
주입 좌표 위의 두개골에 작은 구멍을 냈다. 25 μL의 주사기(Exmire, ref.MS*GF25)에 유연한 플라스틱 튜브(Tygon 0.254*0.762, ref.AAD04091)로 연결된(차례로 미세관류 펌프(CMA 4004)에 연결됨) 캐뉼러 33 게이지(OD 0.254 mm; Phymep)를 좌측 흑질 치밀부(SNpc)에 다음 좌표로 편측으로 삽입했다: AP = 정수리점으로부터 - 2.92 mm; ML = 1.25 mm; DV: 경질막으로부터 -4.5 mm(Paxinos 및 Watson(2008)의 마우스 아틀라스에 따름). 무작위화 후, 마우스(n = 10마리/그룹)에 AAV를 주입했다. 주입을 0.2 μL/분의 속도로 수행하고, 1 μL의 최종 부피를 주입했다. 최종 주입 후, 역류를 피하기 위해 캐뉼러를 SNpc에서 추가 5분 동안 유지했다. 이어서, 캐뉼러를 마우스 뇌로부터 천천히 제거하고, 봉합하여 두피를 닫았다. 마우스를 매일 모니터링하였으며, 마우스는 수술 후 카프로펜(5 mg/kg sc; 부피 5 ml/kg; Rimadyl, Zoetis)의 피하 주입, 및 탈수를 방지하기 위한 약 200 μL의 멸균 식염수의 복강내 주입을 제공받았다. 이어서, 동물이 완전히 깨어날 때까지 MediHeat® 워밍 캐비닛(Peco services)에 두었다. 주입 후 1개월째에, 동물을 이소플루란 4%로 마취하고, 면역조직화학 및 생화학 분석을 위해 뇌를 처리했다. 모든 실험을 맹검 방식으로 수행하였다.
면역조직화학 및 ISH
뇌를 4℃에서 적어도 2일 동안 4% 포름알데히드에 침수-고정시키고, 30% 수크로스 용액에 동결 보존하고, 이어서 동결시켰다. 동결된 뇌를 흑질(SN)의 전체 전후 축을 따라 연속 관상 절편으로 절단하였다. 절편을 PBS-0.4% 아지드화나트륨에 넣고 4℃에서 보관했다.
무작위로 선택된 일련의 20 ㎛ 두께의 자유-부유 절편을 사용하여, α-Syn에 대한 1차 마우스 모노클로날 항체(마우스 모노클로날, 1:2000, 클론 42, BD Transductions laboratories)로 면역 표지화를 수행하였다. 이 항체는 시냅스 막에서뿐만 아니라 복측 피개 영역(VTA) 및 SN의 DA 신경 세포체 내에서도 주로 국재화를 이용하여 마우스 α-Syn 단백질의 내인성 수준을 검출할 수 있다.
α-syn IHC의 효소적 표출(revelation)을 위해, 1차 항체 용액에서의 인큐베이션 후, 절편을 90분 동안 비오티닐화된 마우스 IgG(BA 9200 Vector Lot S0913, 희석률 1/400)와 함께 실온에서 인큐베이션하고, 이어서 30분 동안 퍼옥시다제-결합 아비딘 복합체(Vectastain® ABC kit Elite, Vector PK 6100, 희석률 1/200)와 함께 인큐베이션하였다. 절편을 퍼옥시다제 기질 용액(0.1 M PBS 중 0.003% 과산화수소, 0.05% 디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드를 함유함)에서 잠시 인큐베이션하고, 최종적으로 NaCl 0.9% 용액으로 헹구었다. 절편을 최종적으로 슬라이드에 마운팅하고, 실온에서 건조하고, 탈수시키고, Eukitt를 사용하여 커버슬립 처리했다.
α-syn ISH 연구의 경우, 슬라이드 위에 마운팅된 20 μm 두께의 크리오스탯(cryostat) 절편에 대한 완전 자동화된 RNAscope 검정(이는 비특이적 하이브리드화로부터의 백그라운드 잡음이 아닌 표적 특이적 신호를 증폭하여 RNA ISH의 신호 대 잡음비를 개선함)을 Roche Ventana Medical Systems DISCOVERY XT (VS) automate에서 실행하였다. (RNAscope® 2.5 VS 안티센스 프로브- Hs-SNCA(Cat No. 313289) 및 대조 센스 프로브(Cat No. 511079)를 43℃에서 2시간 동안 하이브리드화한 다음, RNAscope 증폭 및 VS 검출 시약을 사용하는 적색 발색체(Red chromogen) 검출을 수행하였다. RNAscope 프로브 설계는 본 명세서에 기재된 바와 같다. 염색된 슬라이드를 40X 대물렌즈를 사용하는 VS120 Olympus 시스템으로 스캔하였다.
통계 분석
적용 가능한 경우 다중 비교(Dunnett의 테스트)와 함께, 일원 분산 분석을 이용하는 Prism 소프트웨어(버전 6, Graphpad®)를 이용하여 통계를 수행하였다.
결과
도 10에 도시된 바와 같이, 동일한 동물 또는 대조군 주입 동물의 대측 SNc와 비교하여, 세포체 내의 SNCA 단백질은 AAVrh.10 캡시드(상부 패널) 내의 작제물 E1에 의해 명확히 감소한다. 인접 뇌 섹션(하단 패널)의 ISH 이미지는 AAVrh.10에 의한 SNCA mRNA의 유사한 표적 감소를 보여주지만 대측 반구에서는 그렇지 않았다. 대조 RNAi 바이러스는 주입되지 않은 반구에 비해 SNCA mRNA의 어떠한 감소도 나타내지 않았으며, 이는 효과의 특이성을 입증한다. 여기서, E1에 의한 SNCA의 녹다운 효율은 적어도 벡터의 흑질내(intranigral) 주입 후 캡시드의 혈청형에 의존하지 않는다는 것이 입증된다.
실시예 8: D1 및 E1의 잠재적 오프-타겟
룬드 인간 중간뇌(LUHMES) 세포를 배양에서 분화시키고, 이어서 최적화된 뮤린 내인성 miR-155 스캐폴드(ThermoFisher) 상에서 D1, E1, 또는 CTL3(대조군) 마이크로RNA를 발현하는 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. miRNeasy® 키트(Qiagen)를 사용하여 총 RNA를 세포로부터 분리하고, TruSeq stranded Total RNA Library Prep 키트(Illumina)를 사용하여 차세대 시퀀싱 라이브러리를 준비하고, 이어서 Illumina HiSeq 기기(미국 뉴저지주 플레인필드 소재의 Genewiz)로 시퀀싱했다.
Array Studio(Omicsoft, A Qiagen Company)를 사용하여 Sanofi의 Genomics 그룹에서 시퀀싱 분석을 수행하였다. 저품질 판독값을 제거하고, 나머지 판독값을 인간 유전체에 매핑한 다음, 일원 분산 분석으로 처리 그룹 간에 유의하게 차별적으로 발현된 유전자(DEG)를 결정했다. 0.05 미만의 p-값으로 CTL3에 비해 D1과 E1 둘 모두에 의해 하향 조절된 유전자는 알파-시뉴클레인을 녹다운시킨 결과로 간주되었고, 0.05 미만의 p-값으로 적어도 1.2배 하향 조절된 나머지 유전자는 잠재적 오프-타겟으로 분류되었다. 알파-시뉴클레인은 D1에 의해 22%, 그리고 E1에 의해 30%가 녹다운되었으며, 개별 데이터 포인트는 도 11에 도시되어 있다. D1 및 E1에 대한 잠재적 오프-타겟은 표 2 및 표 3에 나열되어 있다. D1 목록의 TNFRSF6B는 오로지 NCKU 데이터베이스에서 예측된 종양 억제인자이고, E1 목록의 어떤 유전자도 NCKU 또는 TSGene 데이터베이스에서 종양 억제인자로 예측되지 않는다. 잠재적 오프-타겟의 D1 및 E1 목록 둘 모두는 miRanda, siSPOTR, 및 TargetRank(데이터는 포함되지 않음) 알고리즘을 사용하여 확인된 D1 및 E1 마이크로RNA에 대한 예측 표적과 중복되었다.
[표 2]
잠재적 D1 오프-타겟
Figure pct00004
[표 3]
잠재적 E1 오프-타겟
Figure pct00005
참고 문헌
Figure pct00006
서열
모든 폴리펩티드 서열은 달리 지시되지 않은 한 N-말단에서 C-말단으로 제시된다. 모든 핵산 서열은 달리 지시되지 않는 한 5'에서 3'로 제시된다.
D1-루프-패신저-RNA
Figure pct00007
D1-루프-패신저-DNA
Figure pct00008
E1-루프-패신저-RNA
Figure pct00009
E1-루프-패신저-DNA
Figure pct00010
D1 벡터 유전체 서열
Figure pct00011
Figure pct00012
A1AT 스터퍼 핵산
Figure pct00013
SEQUENCE LISTING <110> Genzyme Corporation <120> VARIANT RNAi AGAINST ALPHA-SYNUCLEIN <130> 15979-20165.40 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/714,616 <151> 2018-08-03 <160> 70 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 caucggaacu gagcacuugu a 21 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 agguucguag ucuugauacc cu 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 uuaaccgcca cuuucuaacc uu 22 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 acguuggaac ugagcacuug u 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 uuccaacauu ugucacuugc u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 ucguccaaca uuugucacuu g 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 ugggcgcauu ggaacugagc a 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 ugggcacauu ggaacugagc a 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 gucgucgaau ggccacuccc a 21 <210> 10 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 gguucguagu cuugauaccc uu 22 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 uagcagcagc cacaacuccc u 21 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 uucgaacauu ugucacuugc u 21 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 uagccgccac aacucccucc u 21 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 ugcgcuuugg ucuucucagc c 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 uagccgcagc cacaacuccc u 21 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 uagcagccac aacucccucc u 21 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 ucggcacauu ggaacugagc a 21 <210> 18 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 augacggggc acauuggaac u 21 <210> 19 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 augacugggc acauuggaac u 21 <210> 20 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 uaagucguag ucacuuaggu g 21 <210> 21 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 cuccgcagca gccacaacuc c 21 <210> 22 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 ucaugacugg gcacauugga a 21 <210> 23 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 aaauacgugg uagucacuua g 21 <210> 24 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 ugcucuuugg ucuucucagc c 21 <210> 25 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 aacguuuguc acuugcucuu u 21 <210> 26 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 aaauaagugg uagucacuua g 21 <210> 27 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 uuagaaauaa gugguaguca c 21 <210> 28 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 aauacguggu agucacuuag g 21 <210> 29 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 acugcgcaca uuggaacuga g 21 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 uacaagugca guuccgaug 19 <210> 31 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 aagguuagaa uggcgguuaa 20 <210> 32 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 aagguuagaa uggcgguuaa 20 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 acaagugcag uuccaacgu 19 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 agcaagugaa auguuggaa 19 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 caagugacau guuggacga 19 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 ugcucaguca augcgccua 19 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 37 ugcucaguca augugccua 19 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 ugggagugca uucgacgau 19 <210> 39 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 39 aaggguauca acuacgaacc 20 <210> 40 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 40 agggaguugg cugcugcua 19 <210> 41 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 41 agcaagugaa auguucgaa 19 <210> 42 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 42 aggagggaug uggcggcua 19 <210> 43 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 43 ggcugagaac caaagcgua 19 <210> 44 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 44 agggaguugg cugcggcua 19 <210> 45 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 45 aggagggaug uggcugcua 19 <210> 46 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 46 ugcucaguca augugccga 19 <210> 47 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 47 aguuccaaug ccccgucau 19 <210> 48 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 48 aguuccaaug cccagucau 19 <210> 49 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 49 caccuaagac uacgacuua 19 <210> 50 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 50 ggaguugucu gcugcggag 19 <210> 51 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 51 uuccaaugcc cagucauga 19 <210> 52 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 52 cuaagugaac cacguauuu 19 <210> 53 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 53 ggcugagaac caaagagua 19 <210> 54 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 54 aaagagcaug acaaacguu 19 <210> 55 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 55 cuaagugaac cacuuauuu 19 <210> 56 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 56 gugacuaccu uauuucuaa 19 <210> 57 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 57 ccuaagugua ccacguauu 19 <210> 58 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 58 cucaguucau gugcgcagu 19 <210> 59 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 59 gttttggcca ctgactgac 19 <210> 60 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 60 guuuuggcca cugacugac 19 <210> 61 <211> 59 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 61 ugcucuuugg ucuucucagc cguuuuggcc acugacugac ggcugagaac caaagagua 59 <210> 62 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 62 tgctctttgg tcttctcagc cgttttggcc actgactgac ggctgagaac caaagagta 59 <210> 63 <211> 59 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 63 ugggcacauu ggaacugagc aguuuuggcc acugacugac ugcucaguca augugccua 59 <210> 64 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 64 tgggcacatt ggaactgagc agttttggcc actgactgac tgctcagtca atgtgccta 59 <210> 65 <211> 3455 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 65 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg 60 cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttccttacgt acaattggga tcccggaccg tcgacattga 180 ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg 240 gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc 300 cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat 360 tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat 420 catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat 480 gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc 540 gctattacca tggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 600 tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 660 gggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg 720 aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg 780 gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc ggggagtcgc 840 tgcgacgctg ccttcgcccc gtgccccgct ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc 900 tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga gcgggcggga cggcccttct cctccgggct 960 gtaattagcg cttggtttaa tgacggcttg tttcttttct gtggctgcgt gaaagccttg 1020 aggggctccg ggagggccct ttgtgcgggg ggagcggctc ggggggtgcg tgcgtgtgtg 1080 tgtgcgtggg gagcgccgcg tgcggctccg cgctgcccgg cggctgtgag cgctgcgggc 1140 gcggcgcggg gctttgtgcg ctccgcagtg tgcgcgaggg gagcgcggcc gggggcggtg 1200 ccccgcggtg cggggggggc tgcgagggga acaaaggctg cgtgcggggt gtgtgcgtgg 1260 gggggtgagc agggggtgtg ggcgcgtcgg tcgggctgca accccccctg cacccccctc 1320 cccgagttgc tgagcacggc ccggcttcgg gtgcggggct ccgtacgggg cgtggcgcgg 1380 ggctcgccgt gccgggcggg gggtggcggc aggtgggggt gccgggcggg gcggggccgc 1440 ctcgggccgg ggagggctcg ggggaggggc gcggcggccc ccggagcgcc ggcggctgtc 1500 gaggcgcggc gagccgcagc cattgccttt tatggtaatc gtgcgagagg gcgcagggac 1560 ttcctttgtc ccaaatctgt gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta 1620 gcgggcgcgg ggcgaagcgg tgcggcgccg gcaggaagga aatgggcggg gagggccttc 1680 gtgcgtcgcc gcgccgccgt ccccttctcc ctctccagcc tcggggctgt ccgcgggggg 1740 acggctgcct tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg 1800 gctctagagc ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca 1860 acgtgctggt tattgtgctg tctcatcatt ttggcaaaga attcttcgaa agatctgcta 1920 gcctagactg gaggcttgct gaaggctgta tgctgtgctc tttggtcttc tcagccgttt 1980 tggccactga ctgacggctg agaaccaaag agtacaggac acaaggcctg ttactagcac 2040 tcacatggaa caaatggccc agatctggcc gcactcgaga tatcgagctc gctgatcagc 2100 ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 2160 gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 2220 ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 2280 ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggagctagag tcgaccggac cggtggaagt 2340 cctcttcctc ggtgtccttg acttcaaagg gtctctccca tttgcctgga gagaggggaa 2400 ggtgggcatc accaggggtg agtgaaggtt tggaagagtg tagcagaata agaaaccatg 2460 agtcccctcc ctgagaagcc ctgagccccc ttgacgacac acatccctcg aggctcagct 2520 tcatcatctg taaaaggtgc tgaaactgac catccaagct gccgaaaaag attgtgtggg 2580 gataattcaa aactagagga agatgcagaa tttctacatc gtggcgatgt caggctaaga 2640 gatgccatcg tggctgtgca tttttattgg aatcatatgt ttatttgagg gtgtcttgga 2700 tattacaaat aaaatgttgg agcatcaggc atatttggta ccttctgtct aaggctccct 2760 gccccttgtt aattggcagc tcagttattc atccagggca aacattctgc ttactattcc 2820 tgagagcttt cctcatcctc tagattggca ggggaaatgc agatgcctga gcagcctccc 2880 ctctgccata ccaacagagc ttcaccatcg aggcatgcag agtggacagg ggcctcaggg 2940 acccctgatc ccagctttct cattggacag aaggaggaga ctggggctgg agagggacct 3000 gggcccccac taaggccaca gcagagccag gactttagct gtgctgactg cagcctggct 3060 tgcctccact gccctccttt gcctcaagag caagggagcc tcagagtgga ggaagcagcc 3120 cctggccttg cctcccacct cccctcccct atgctgtttt cctgggacag tgggagctgg 3180 cttagaatgc cctggggccc ccaggaccct ggcattttaa cccctcaggg gcaggaaggc 3240 agcctgagat acagaagagt ccatcacctg ctgtatgcca cacaccatcc ccacagtcga 3300 catttaaatt aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg 3360 ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca 3420 gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaa 3455 <210> 66 <211> 1091 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 66 attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg 60 aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggagctaga gtcgaccgga ccggtggaag 120 tcctcttcct cggtgtcctt gacttcaaag ggtctctccc atttgcctgg agagagggga 180 aggtgggcat caccaggggt gagtgaaggt ttggaagagt gtagcagaat aagaaaccat 240 gagtcccctc cctgagaagc cctgagcccc cttgacgaca cacatccctc gaggctcagc 300 ttcatcatct gtaaaaggtg ctgaaactga ccatccaagc tgccgaaaaa gattgtgtgg 360 ggataattca aaactagagg aagatgcaga atttctacat cgtggcgatg tcaggctaag 420 agatgccatc gtggctgtgc atttttattg gaatcatatg tttatttgag ggtgtcttgg 480 atattacaaa taaaatgttg gagcatcagg catatttggt accttctgtc taaggctccc 540 tgccccttgt taattggcag ctcagttatt catccagggc aaacattctg cttactattc 600 ctgagagctt tcctcatcct ctagattggc aggggaaatg cagatgcctg agcagcctcc 660 cctctgccat accaacagag cttcaccatc gaggcatgca gagtggacag gggcctcagg 720 gacccctgat cccagctttc tcattggaca gaaggaggag actggggctg gagagggacc 780 tgggccccca ctaaggccac agcagagcca ggactttagc tgtgctgact gcagcctggc 840 ttgcctccac tgccctcctt tgcctcaaga gcaagggagc ctcagagtgg aggaagcagc 900 ccctggcctt gcctcccacc tcccctcccc tatgctgttt tcctgggaca gtgggagctg 960 gcttagaatg ccctggggcc cccaggaccc tggcatttta acccctcagg ggcaggaagg 1020 cagcctgaga tacagaagag tccatcacct gctgtatgcc acacaccatc cccacagtcg 1080 acatttaaat t 1091 <210> 67 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 67 ctggaggctt gctgaaggct gtatgctgca ggacacaagg cctgttacta gcactcacat 60 ggaacaaatg gc 72 <210> 68 <211> 128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 68 ctggaggctt gctgaaggct gtatgctgta cgatctaata tcgctcgttt tggccactga 60 ctgacgagcg atatgatcgt acgacaggac acaaggcctg ttactagcac tcacatggaa 120 caaatggc 128 <210> 69 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <210> 69 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 69 cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccacgc 60 ccgggctttg cccgggcg 78 <210> 70 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 70 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg 60 cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcct 145

Claims (102)

  1. 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 RNAi로서,
    a) 상기 제1 가닥과 상기 제2 가닥은 이중체를 형성하고;
    b) 상기 제1 가닥은 가이드(guide) 영역을 포함하고, 여기서 상기 가이드 영역은 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)와 적어도 약 90% 동일성을 갖거나 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산을 포함하고;
    c) 상기 제2 가닥은 비-가이드(non-guide) 영역을 포함하는, RNAi.
  2. 제1항에 있어서, 상기 가이드 영역은 핵산 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)를 포함하고, 상기 비-가이드 영역은 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)를 포함하는, RNAi.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 가닥은 SEQ ID NO: 24와 약 90% 동일성을 갖거나 SEQ ID NO: 53과 약 90% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, RNAi.
  4. 제1항에 있어서, 상기 가이드 영역은 핵산 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)를 포함하고, 상기 비-가이드 영역은 서열 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)를 포함하는, RNAi.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제2 가닥은 SEQ ID NO: 37과 약 90% 동일성을 갖거나 SEQ ID NO: 37과 약 90% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, RNAi.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가닥과 상기 제2 가닥은 루프 구조를 형성할 수 있는 RNA 링커에 의해 연결되어 있는, RNAi.
  7. 제6항에 있어서, 상기 RNA 링커는 4개 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함하는, RNAi.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 루프 구조는 4개 내지 20개의 뉴클레오티드를 포함하는, RNAi.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi는 5'에서 3'로 상기 제2 가닥, 상기 RNA 링커, 및 상기 제1 가닥을 포함하는, RNAi.
  10. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi는 5'에서 3'로 상기 제1 가닥, 상기 RNA 링커, 및 상기 제2 가닥을 포함하는, RNAi.
  11. 제10항에 있어서, 상기 RNAi는 SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 63의 핵산 서열을 포함하는, RNAi.
  12. 제11항에 있어서, 상기 RNAi는 SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 63의 뉴클레오티드 서열과 약 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, RNAi.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi는 작은 저해성 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 또는 작은 헤어핀 RNA(shRNA)인, RNAi.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi는 신경 퇴행성 시뉴클레인병증(neurodegenerative synucleinopathy)과 관련된 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA를 표적화하는, RNAi.
  15. 제14항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 알파-시뉴클레인(SNCA)인, RNAi.
  16. 제15항에 있어서, 상기 알파 시뉴클레인은 인간 알파-시뉴클레인인, RNAi.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 퇴행성 시뉴클레인병증은 파킨슨병(PD), 다계통 위축증(MSA), 또는 루이 소체 치매(DLB)인, RNAi.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 RNAi를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 작제물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 RNAi를 인코딩하는 핵산은 miRNA 스캐폴드를 포함하는, 발현 작제물.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 RNAi를 인코딩하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있는, 발현 작제물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시형 초기 프로모터, RSV LTR, MoMLV LTR, 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, CK6 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터(TTR), TK 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), HBV 프로모터, hAAT 프로모터, LSP 프로모터, 키메라 간 특이적 프로모터(LSP), E2F 프로모터, 텔로머라제(hTERT) 프로모터; 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴/토끼 β-글로빈 프로모터(CAG) 프로모터, 신장 인자 1-알파 프로모터(EFl-알파) 프로모터, 인간 β-글루쿠로니다제 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, 및 13-액틴 프로모터로부터 선택되는, 발현 작제물.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 작제물은 인트론을 추가로 포함하는, 발현 작제물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 인트론은 CBA 인트론 또는 hEF1알파 인트론인, 발현 작제물.
  24. 제22항에 있어서, 상기 인트론은 키메라 인트론인, 발현 작제물.
  25. 제22항에 있어서, 상기 발현 벡터는 자기 상보성 벡터이고, 상기 인트론은 델타 키메라 인트론인, 발현 작제물.
  26. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 작제물은 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함하는, 발현 작제물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리아데닐화 신호, 또는 HSV TK 폴리아데닐화 신호인, 발현 작제물.
  28. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항의 발현 작제물을 포함하는 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 상기 벡터는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 벡터인, 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 상기 발현 작제물은 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat, ITR) 서열에 의해 플랭킹되어 있는, rAAV 벡터.
  31. 제30항에 있어서, 상기 발현 작제물은 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹되어 있는, rAAV 벡터.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR인, rAAV 벡터.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV ITR은 AAV2 ITR인, rAAV 벡터.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 스터퍼(stuffer) 핵산을 추가로 포함하는, rAAV 벡터.
  35. 제34항에 있어서, 상기 스터퍼 핵산은 상기 RNAi를 인코딩하는 핵산의 업스트림 또는 다운스트림에 위치하는, rAAV 벡터.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 자기 상보성 rAAV 벡터인, rAAV 벡터.
  37. 제36항에 있어서, 상기 벡터는 상기 RNAi를 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 상기 RNAi의 상보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 상기 제1 핵산 서열은 그 길이의 대부분 또는 전부를 따라 상기 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있는, rAAV 벡터.
  38. 제37항에 있어서, 상기 제1 핵산 서열과 상기 제2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되어 있으며, 여기서 상기 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열(terminal resolution sequence)의 돌연변이를 포함하는, rAAV 벡터.
  39. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터를 포함하는 세포.
  40. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터를 포함하는 재조합 AAV 입자.
  41. 제40항에 있어서, 상기 AAV 바이러스 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV2-HBKO, AAVDJ8, AAVPHP.B, AAVPHP.eB, AAVBR1, AAVHSC15, AAVHSC17, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV 또는 마우스 AAV 캡시드 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함하는, rAAV 입자.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 rAAV 바이러스 입자의 캡시드 및 상기 ITR은 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래되는, rAAV 입자.
  43. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 rAAV 바이러스 입자의 캡시드 및 상기 ITR은 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래되는, rAAV 입자.
  44. 제43항에 있어서, 상기 ITR은 AAV2로부터 유래되고, 상기 rAAV 입자의 캡시드는 AAV1로부터 유래되는, rAAV 입자.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항의 rAAV 입자를 포함하는 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
  47. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 RNAi를 포함하는 키트.
  48. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항의 AAV 입자를 포함하는 키트.
  49. 제45항 또는 제46항의 조성물을 포함하는 키트.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 사용 설명서를 추가로 포함하는 키트.
  51. 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 또는 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥, 및 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 제2 핵산은 서열 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산 또는 서열 5'-E1패신저(passenger)-3'(SEQ ID NO: 37)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는, 방법.
  53. 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하거나, 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서 신경 퇴행성 시뉴클레인병증을 치료하는 방법.
  54. 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 또는 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 제1 가닥, 및 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 신경 퇴행성 질병에 걸린 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서 알파-시뉴클레인의 발현을 저해하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 제2 핵산은 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산 또는 서열 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는, 방법.
  56. 서열 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3'(SEQ ID NO: 24)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3'(SEQ ID NO: 53)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하거나, 서열 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3'(SEQ ID NO: 8)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제1 핵산을 포함하는 제1 가닥 및 서열 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3'(SEQ ID NO: 37)와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 제2 핵산을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 RNAi를 신경 퇴행성 질병에 걸린 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서 알파-시뉴클레인의 발현을 저해하는 방법.
  57. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가닥은 SEQ ID NO: 24의 서열을 갖는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 8의 서열을 갖는 핵산을 포함하는, 방법.
  58. 제52항, 제53항, 제55항, 또는 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 가닥은 SEQ ID NO: 53의 서열을 갖는 핵산 또는 SEQ ID NO: 37의 서열을 갖는 핵산을 포함하는, 방법.
  59. 제51항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가닥과 상기 제2 가닥은 루프 구조를 형성할 수 있는 RNA 링커에 의해 연결되어 있는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 RNA 링커는 4개 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 루프 구조는 4개 내지 20개의 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  62. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi는 5'에서 3'로 상기 제2 가닥, 상기 RNA 링커, 및 상기 제1 가닥을 포함하는, 방법.
  63. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi는 5'에서 3'로 상기 제1 가닥, 상기 RNA 링커, 및 상기 제2 가닥을 포함하는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 RNAi는 SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 63의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 RNAi는 SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 63의 뉴클레오티드 서열과 약 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  66. 제51항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi는 발현 작제물 상에서 인코딩되는, 방법.
  67. 제51항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi를 인코딩하는 핵산은 miRNA 스캐폴드를 포함하는, 방법.
  68. 제51항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi를 인코딩하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있는, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 프로모터는 포유동물의 뇌에서 상기 RNAi를 발현할 수 있는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시형 초기 프로모터, RSV LTR, MoMLV LTR, 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, CK6 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터(TTR), TK 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), HBV 프로모터, hAAT 프로모터, LSP 프로모터, 키메라 간 특이적 프로모터(LSP), E2F 프로모터, 텔로머라제(hTERT) 프로모터; 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴/토끼 β-글로빈(CAG) 프로모터, 신장 인자 1-알파 프로모터(EFl-알파) 프로모터 및 인간 β-글루쿠로니다제 프로모터로부터 선택되는, 방법.
  71. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 CMV 인핸서와 닭 β-액틴 프로모터를 포함하는 하이브리드 닭 β-액틴 프로모터(CMA)인, 방법.
  72. 제66항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 작제물은 인트론을 추가로 포함하는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 인트론은 CBA 인트론인, 방법.
  74. 제72항에 있어서, 상기 인트론은 키메라 인트론인, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 발현 작제물은 자기 상보성 벡터이고, 상기 인트론은 델타 키메라 인트론인, 방법.
  76. 제66항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함하는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인, 방법.
  78. 제66항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 작제물은 벡터에 의해 인코딩되는, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 벡터는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 벡터인, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 발현 작제물은 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복부(ITR) 서열에 의해 플랭킹되어 있는, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 발현 작제물은 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹되어 있는, 방법.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, 상기 AAV ITR은 AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR인, 방법.
  83. 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV ITR은 AAV2 ITR인, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 rAAV 벡터는 5'에서 3'로 AAV2 ITR, 프로모터, 인트론, 상기 RNAi를 인코딩하는 핵산, 폴리아데닐화 신호, 및 AAV2 ITR을 포함하는, 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 프로모터는 CBA 프로모터인, 방법.
  86. 제84항에 있어서, 상기 인트론은 키메라 인트론, 델타 키메라 인트론 또는 단축형(abbreviated) 키메라 인트론 키메라인, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 키메라 인트론은 CBA + 토끼 베타 글로빈 인트론인, 방법.
  88. 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인, 방법.
  89. 제83항에 있어서, 상기 rAAV 벡터는 5'에서 3'로 AAV2 ITR, 상기 CBA 프로모터, 키메라 인트론, 상기 RNAi를 인코딩하는 핵산, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, 및 AAV2 ITR을 포함하는, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 벡터는 스터퍼 핵산을 추가로 포함하는, 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 스터퍼 핵산은 인간 A1AT 유전자의 인트론 1을 포함하는, 방법.
  92. 제79항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 자기 상보성 벡터인, 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 벡터는 상기 RNAi를 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 상기 RNAi의 상보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 상기 제1 핵산 서열은 그 길이의 대부분 또는 전부를 따라 상기 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있는, 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 제1 핵산 서열과 상기 제2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되어 있으며, 여기서 상기 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함하는, 방법.
  95. 제79항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 rAAV 입자에 캡시드화되는, 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 AAV 바이러스 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, AAV2-HBKO, AAVDJ8, AAVPHP.B, AAVPHP.eB, AAVBR1, AAVHSC15, AAVHSC17, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 마우스 AAV, 또는 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함하는, 방법.
  97. 제95항 또는 제96항에 있어서, 상기 rAAV 바이러스 입자의 캡시드 및 상기 ITR은 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래되는, 방법.
  98. 제95항 또는 제96항에 있어서, 상기 rAAV 바이러스 입자의 캡시드 및 상기 ITR은 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래되는, 방법.
  99. 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 바이러스 입자는 AAV2 캡시드를 포함하는, 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 rAAV 바이러스 입자는 AAV1 캡시드를 포함하고, 상기 벡터는 AAV2 ITR을 포함하는, 방법.
  101. 제51항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 제95항 내지 제100항 중 어느 한 항의 rAAV 입자는 조성물 내에 존재하는, 방법.
  102. 제101항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 방법.
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