BR112021001980A2 - rnai variante contra alfa-sinucleína - Google Patents

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Brenda RICHARDS
Martine Latta-Mahieu
Maria Carmen Obinu
Véronique TAUPIN
Véronique Blanchard
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Abstract

RNAi VARIANTE CONTRA ALFA-SINUCLEÍNA. A presente invenção refere-se a moléculas de RNAi para o tratamento de sinucleinopatias neurodegenerativas. Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi têm como alvo a expressão de alfa-sinucleína (SNCA). Além disso, são fornecidos no presente documento construções de expressão, vetores (por exemplo, rAAV), células, partículas virais e composições farmacêuticas que contêm o RNAi. São ainda fornecidos no presente documento métodos e kits relacionados ao uso de RNAi, por exemplo, para tratar sinucleinopatias neurodegenerativas, incluindo mal de Parkinson, atrofia de múltiplos sistemas e demência com corpos de Lewy.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "RNAi VARIANTE CONTRA ALFA-SINUCLEÍNA".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade do Pe- dido Provisório Norte-Americano Nº 62/714.616, depositado em 3 de agosto de 2018, o qual é incorporado ao presente documento a título de referência na íntegra.
APRESENTAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS NO ARQUIVO DE TEXTO ASCII
[0002] O conteúdo da apresentação a seguir em arquivo de texto ASCII é incorporado ao presente documento a título de referência na íntegra: uma forma legível em computador (Computer Readable Form, CRF) da Listagem de Sequências (nome do arquivo: 159792016540SE- QLIS.TXT, data de registro: 31 de julho de 2019, tamanho: 19 KB).
CAMPO DA INVENÇÃO
[0003] A presente invenção refere-se a moléculas de RNAi varian- tes. Em alguns aspectos, a invenção refere-se a um RNAi variante con- tra alfa-sinucleína.
ANTECEDENTES
[0004] A terapia neuroprotetora de longo prazo é de considerável interesse para o tratamento de sinucleinopatias neurodegenerativas, tais como mal de Parkinson ou atrofia de múltiplos sistemas (Multiple System Atrophy, MSA). O RNA interferente (RNAi) é um mecanismo pelo qual mRNAs alvo são reduzidos pela introdução de RNA (siRNA) que é complementar ao alvo. A sequência de siRNA também pode ser inserida em um scaffold de miRNA artificial ("shmiRNA") que permite a expressão constitutiva com base em polimerase II, ao mesmo tempo que elimina a toxicidade neuronal associada à introdução de siRNA ou shRNA no cérebro (1).
[0005] Um obstáculo para o desenvolvimento clínico de RNAi é o potencial para silenciamento fora do alvo, onde a região de semente do RNAi (normalmente nucleotídeos 1-7 ou 1-8) se emparelha com se- quências em mRNAs não alvo na região não traduzida (UnTranslated Region, UTR) 3', levando à desestabilização do transcrito. Tentativas de reduzir o silenciamento fora do alvo incluem o uso de algoritmos para identificar sequências de sementes candidatas com alta especificidade pelo mRNA alvo com potencial mínimo fora do alvo (Boudreau RL et al., (2012) Nucl. Acids Res. 41 (1): e9) e colocar uma protuberância interna na região guia do RNAi (Terasawa et al., (2011) Journal of Nucleic Acid 2011: 131579).
[0006] Várias linhas de evidência demonstram que níveis elevados de alfa-sinucleína (SNCA) são neurotóxicos, enquanto que a redução é neuroprotetora (2-9). Portanto, estratégias terapêuticas que reduzem os níveis de SNCA podem interromper potencialmente a progressão e ali- viar os sintomas de doenças neurodegenerativas. Permanece uma ne- cessidade por tal estratégia terapêutica usando o mecanismo de RNAi.
[0007] O presente pedido atende a esta necessidade ao fornecer moléculas de RNAi variantes contra SNCA e métodos para seu uso no tratamento e prevenção de doenças neurodegenerativas. O presente pedido também fornece métodos para rastrear ou identificar moléculas de RNAi contra SNCA e construções para preparar estas moléculas de RNAi.
BREVE SUMÁRIO
[0008] Em alguns aspectos, a invenção fornece um RNAi que com- preende uma primeira fita e uma segunda fita, em que a) a primeira fita e a segunda fita formam um duplex; b) a primeira fita que compreende uma região guia, em que a região guia compreende um ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'- UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) ou pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGGGCA- CAUUG GAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8); e c) a segunda fita compre- ende uma região não guia. Em algumas modalidades, a região guia compreende a sequência de ácidos nucleicos 5'-UGCUCUUUGGU- CUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) e a região não guia compreende a sequência 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3' (SEQ ID NO: 53). Em al- gumas modalidades, a primeira fita que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem cerca de 90 % de identidade com SEQ ID NO: 24 ou cerca de 90 % de identidade com SEQ ID NO: 53. Em algumas modalidades, a região guia compreende a sequência de ácidos nuclei- cos 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e a região não guia compreende a sequência 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3' (SEQ ID NO: 37). Em algumas modalidades, a segunda fita compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem cerca de 90 % de identi- dade com SEQ ID NO: 37 ou cerca de 90 % de identidade com SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, a primeira fita e a segunda fita são ligadas através de um ligante de RNA capaz de formar uma estrutura de alça. Em algumas modalidades, o ligante de RNA compreende 4A 50 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a estrutura de alça compre- ende 4A 20 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o RNAi compre- ende, 5' para 3', a segunda fita, o ligante de RNA e a primeira fita. Em algumas modalidades, o RNAi compreende, 5' para 3', a primeira fita, o ligante de RNA e a segunda fita. Em algumas modalidades, o RNAi compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 61 ou SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma sequência de nucleotídeos cerca de 90 % idêntica à sequência de nu- cleotídeos de SEQ ID NO: 61 ou SEQ ID NO: 63. Em algumas modali- dades, o RNAi é um pequeno RNA inibidor (siRNA), um microRNA (miRNA) ou um pequeno RNA em gancho (shRNA).
[0009] Em algumas modalidades do aspecto e modalidades acima, o RNAi tem como alvo o RNA que codifica um polipeptídeo as- sociado a uma sinucleinopatia neurodegenerativa. Em algumas modali- dades, o polipeptídeo é alfa-sinucleína (SNCA). Em algumas modalida- des, a alfa-sinucleína é alfa-sinucleína humana. Em algumas modalida- des, a sinucleinopatia neurodegenerativa é mal de Parkinson (PD), atro- fia de múltiplos sistemas (MSA) ou demência com corpos de Lewy (DLB).
[0010] Em algumas modalidades do aspecto e modalidades acima, a invenção fornece uma construção de expressão que compreende um ácido nucleico que codifica o RNAi descrito no presente documento. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o RNAi compre- ende uma scaffold de miRNA. Em algumas modalidades, o ácido nu- cleico que codifica o RNAi está operativamente ligado a um promotor. Em algumas modalidades, o promotor é selecionado a partir de um pro- motor precoce imediato de citomegalovírus (CMV), um LTR de RSV, um LTR de MoMLV, um promotor de fosfoglicerato quinase-1 (PGK), um promotor de vírus símio 40 (SV40), um promotor CK6, um promotor de transtirretina (TTR), um promotor TK, um promotor responsivo à te- traciclina (TRE), um promotor de HBV, um promotor hAAT, um promotor LSP, um promotor específico para o fígado quimérico (LSP), um promo- tor E2F, um promotor de telomerase (hTERT); um intensificador de cito- megalovírus/promotor de beta-actina de galinha/promotor de β-globina de coelho (CAG), um promotor de fator de alongamento 1-alfa (EF1- alfa), um promotor de β-glucuronidase humana, um promotor de β-ac- tina de galinha (CBA), um promotor de LTR do vírus do sarcoma de Rous retroviral (RSV), um promotor de di-hidrofolato redutase e um pro- motor de -actina. Em algumas modalidades, a construção de expres- são compreende ainda um íntron. Em algumas modalidades, o íntron é um íntron de CBA ou um íntron de hEF1alfa. Em algumas modalida- des, o íntron é um íntron quimérico. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor autocomplementar e o íntron é um íntron qui- mérico delta. Em algumas modalidades, a construção de expressão compreende ainda um sinal de poliadenilação. Em algumas modalida- des, o sinal de poliadenilação é um sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino, um sinal de poliadenilação de SV40 ou um sinal de poliadenilação TK de HSV.
[0011] Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor que compreende qualquer um dos componentes de expressão descritos no presente documento. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de vírus adeno-associado recombinante (rAAV). Em algumas modalida- des, a construção de expressão é flanqueada por uma ou mais sequên- cias de repetição terminal invertida (Inverted Terminal Repeat, ITR) de AAV. Em algumas modalidades, a construção de expressão é flanque- ada por duas ITRs de AAV. Em algumas modalidades, as ITRs de AAV são ITRs de sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV, DJ, AAV bovino, AAV de cabra ou AAV de camun- dongo. Em algumas modalidades, as ITRs de AAV são ITRs de AAV2. Em algumas modalidades, o vetor compreende ainda um ácido nucleico de enchimento (stuffer). Em algumas modalidades, o ácido nucleico de enchimento está localizado a montante ou a jusante do ácido nucleico que codifica o RNAi. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de rAAV autocomplementar. Em algumas modalidades, o vetor compre- ende a primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica o RNAi e uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica um comple- mento do RNAi, em que a primeira sequência de ácidos nucleicos pode formar pares de bases intra fitas com a segunda sequência de ácidos nucleicos ao longo da maioria ou todo o seu comprimento. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos e a segunda se- quência de ácidos nucleicos são ligadas através de uma ITR de AAV mutante, em que a ITR de AAV mutante compreende uma eliminação da região D e compreende uma mutação da sequência de resolução terminal.
[0012] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma célula que compreende qualquer um dos vetores de rAAV conforme descrito no presente documento.
[0013] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma partícula de AAV recombinante que compreende qualquer um dos vetores de rAAV conforme descrito no presente documento. Em algumas modali- dades, a partícula de AAV viral compreende uma capsídeo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/DJ8 2- 7mAV, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV2- HBKO, AAVDJ8, AAVPHP.B, AAVPHP.eB, AAVBR1, AAVHSC15, AA- VHSC17, um AAV de cabra, AAV1/AAV2 quimérico, uma capsídeo de AAV2 bovino ou uma capsídeo de AAV de camundongo de sorotipo HBoV1. Em algumas modalidades, a ITR e a capsídeo da partícula viral de rAAV são derivadas do mesmo sorotipo de AAV. Em algumas moda- lidades, a ITR e a capsídeo da partícula viral de rAAV são derivadas de diferentes sorotipos de AAV. Em algumas modalidades, a ITR é deri- vada de AAV2 e a capsídeo da partícula de rAAV é derivada de AAV1.
[0014] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma compo- sição que compreende qualquer uma das partículas de rAAV descritas no presente documento. Em algumas modalidades, a composição com- preende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0015] Em algumas modalidades, a invenção fornece um kit que compreende qualquer um dos RNAi's descritos no presente docu- mento. Em algumas modalidades, a invenção fornece um kit que com- preende qualquer uma das partículas de AAV descritas no presente do- cumento. Em algumas modalidades, a invenção fornece um kit que compreende qualquer uma das composições descritas no presente do- cumento. Em algumas modalidades, o kit compreende ainda instruções para uso.
[0016] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para o tra- tamento de uma sinucleinopatia neurodegenerativa em um mamífero que compreende administrar ao mamífero um RNAi que compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGCU- CUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) ou uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGGGCACAUUGGAACU- GAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico. Em algumas modalidades, o segundo ácido nu- cleico compreende um ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3' (SEQ ID NO: 53) ou um ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-E1passageiro-3' (SEQ ID NO: 37).
[0017] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para o tra- tamento de uma sinucleinopatia neurodegenerativa em um mamífero que compreende administrar ao mamífero um RNAi que compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGCU- CUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA- 3' (SEQ ID NO: 53) ou uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGCUCA- GUCAAUGUGCCUA-3' (SEQ ID NO: 37).
[0018] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para inibir a expressão de alfa-sinucleína em um mamífero que tem uma doença neurodegenerativa que compreende administrar ao mamífero um RNAi que compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a se- quência 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) ou uma primeira fita que compreende um ácido nucleico que tem pelo me- nos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGGGCACAUUG- GAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico. Em algumas modalidades, o segundo ácido nucleico compreende um ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA- 3' (SEQ ID NO: 53) ou um ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA- 3' (SEQ ID NO: 37).
[0019] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para inibir a expressão de alfa-sinucleína em um mamífero que tem uma doença neurodegenerativa que compreende administrar ao mamífero um RNAi que compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a se- quência 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90% de identidade com a sequência 5'-GGCU- GAGAACCAAAGAGUA-3' (SEQ ID NO: 53) ou uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90% de identidade com a sequência 5'-UGGGCACAUUGGAACU- GAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identi- dade com a sequência 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3' (SEQ ID NO: 37).
[0020] Em algumas modalidades dos métodos acima, a primeira fita compreende a sequência de ácidos nucleicos que tem a sequência de SEQ ID NO: 24 ou um ácido nucleico que tem a sequência de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, a segunda fita compreende o ácido nucleico que tem a sequência de SEQ ID NO: 53 ou o ácido nucleico que tem a sequência de SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, a primeira fita e a segunda fita são ligadas através de um ligante de RNA capaz de formar uma estrutura de alça. Em algumas modalidades, o li- gante de RNA compreende 4A 50 nucleotídeos. Em algumas modalida- des, a estrutura de alça compreende 4A 20 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o RNAi compreende, 5' para 3', a segunda fita, o ligante de RNA e a primeira fita. Em algumas modalidades, o RNAi compre- ende, 5' para 3', a primeira fita, o ligante de RNA e a segunda fita. Em algumas modalidades, o RNAi compreende a sequência de ácidos nu- cleicos de SEQ ID NO: 61 ou SEQ ID NO: 63. Em algumas modalida- des, o RNAi compreende uma sequência de nucleotídeos cerca de 90 % idêntica à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 61 ou SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, o RNAi é um pequeno RNA inibidor (siRNA), um microRNA (miRNA) ou um pequeno RNA em gancho (shRNA).
[0021] Em algumas modalidades dos métodos acima, o RNAi tem como alvo o RNA que codifica um polipeptídeo associado a uma sinu- cleinopatia neurodegenerativa. Em algumas modalidades, o polipeptí- deo é alfa-sinucleína (SNCA). Em algumas modalidades, a alfa-sinucle- ína é alfa-sinucleína humana. Em algumas modalidades, a sinucleino- patia neurodegenerativa é mal de Parkinson (PD), atrofia de múltiplos sistemas (MSA) ou demência com corpos de Lewy (DLB).
[0022] Em algumas modalidades dos métodos acima, a invenção fornece uma construção de expressão que compreende um ácido nu- cleico que codifica o RNAi descrito no presente documento. Em algu- mas modalidades, o ácido nucleico que codifica o RNAi compreende uma scaffold de miRNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o RNAi está operativamente ligado a um promotor. Em algumas modalidades, o promotor é selecionado a partir de um promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMV), um LTR de RSV, um LTR de MoMLV, um promotor de fosfoglicerato quinase-1 (PGK), um promo- tor de vírus símio 40 (SV40), um promotor CK6, um promotor de trans- tirretina (TTR), um promotor TK, um promotor responsivo à tetraciclina (TRE), um promotor de HBV, um promotor hAAT, um promotor LSP, um promotor específico para o fígado quimérico (LSP), um promotor E2F, um promotor de telomerase (hTERT); um intensificador de citomegalo- vírus/promotor de beta-actina de galinha/promotor de β-globina de coe- lho (CAG), um promotor de fator de alongamento 1-alfa (EF1-alfa), um promotor de β-glucuronidase humana, um promotor de β-actina de gali- nha (CBA), um promotor de LTR do vírus do sarcoma de Rous retroviral (RSV), um promotor de di-hidrofolato redutase e um promotor de -ac- tina. Em algumas modalidades, a construção de expressão compreende ainda um íntron. Em algumas modalidades, o íntron é um íntron de CBA ou um íntron de hEF1alfa. Em algumas modalidades, o íntron é um ín- tron quimérico. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor autocomplementar e o íntron é um íntron quimérico delta. Em al- gumas modalidades, a construção de expressão compreende ainda um sinal de poliadenilação. Em algumas modalidades, o sinal de polia- denilação é um sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bo- vino, um sinal de poliadenilação de SV40 ou um sinal de poliadenilação TK de HSV.
[0023] Em algumas modalidades dos métodos acima, a invenção fornece um vetor que compreende qualquer um dos componentes de expressão descritos no presente documento. Em algumas modalida- des, o vetor é um vetor de vírus adeno-associado recombinante (rAAV). Em algumas modalidades, a construção de expressão é flanqueada por uma ou mais sequências de repetição terminal invertida (ITR) de AAV. Em algumas modalidades, a construção de expressão é flanqueada por duas ITRs de AAV. Em algumas modalidades, as ITRs de AAV são ITRs de sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AA- Vrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV, DJ, AAV bovino, AAV de cabra ou AAV de camundongo. Em algu- mas modalidades, as ITRs de AAV são ITRs de AAV2. Em algumas mo- dalidades, o vetor compreende ainda um ácido nucleico de enchimento. Em algumas modalidades, o ácido nucleico de enchimento está locali- zado a montante ou a jusante do ácido nucleico que codifica o RNAi. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de rAAV autocomplemen- tar. Em algumas modalidades, o vetor compreende a primeira sequên- cia de ácidos nucleicos que codifica o RNAi e uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica um complemento do RNAi, em que a primeira sequência de ácidos nucleicos pode formar pares de bases in- tra fitas com a segunda sequência de ácidos nucleicos ao longo da mai- oria ou todo o seu comprimento. Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos e a segunda sequência de ácidos nuclei- cos são ligadas através de uma ITR de AAV mutante, em que a ITR de AAV mutante compreende uma eliminação da região D e compreende uma mutação da sequência de resolução terminal.
[0024] Em algumas modalidades dos métodos acima, a invenção fornece uma partícula de AAV recombinante que compreende qualquer dos vetores de rAAV conforme descrito no presente documento. Em al- gumas modalidades, a partícula de AAV viral compreende uma capsí- deo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8,
AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/DJ8 2-7mAV, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV2-HBKO, AAVDJ8, AAVPHP.B, AAVPHP.eB, AAVBR1, AAVHSC15, AAVHSC17, uma capsídeo de AAV de cabra, AAV1/AAV2 quimérico, uma capsídeo de AAV2 bovino ou uma capsídeo de AAV de camundongo de sorotipo HBoV1. Em algumas modalidades, a ITR e a capsídeo da partícula viral de rAAV são derivadas do mesmo sorotipo de AAV. Em algumas modalidades, a ITR e a capsídeo da partícula viral de rAAV são derivadas de diferentes sorotipos de AAV. Em algumas modalidades, a ITR é derivada de AAV2 e a capsídeo da partícula de rAAV é derivada de AAV1. Em algumas modalidades, a partícula de rAAV está em uma composição. Em algumas modalidades, a com- posição compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0025] Todas as referências citadas no presente documento, inclu- indo pedidos de patentes e publicações, são incorporadas a título de referência na íntegra.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0026] A Figura 1A mostra a estrutura se ShmiRNA D1 (SEQ ID NO: 61) e a Figura 1B mostra a estrutura de ShmiRNA E1 (SEQ ID NO: 63).
[0027] A Figura 2 mostra a redução mediada por RNAi de SNCA humana in vitro. Quantificação de SNCA em extratos de células inteiras de células HEK293T 72 horas após transfecção com plasmídeos que codificam as sequências de RNAi indicadas no formato shmiRNA e cDNA de SNCA humana. Os níveis de SNCA foram normalizados para o controle de carregamento de GAPDH e normalizados para o controle (RNAi de controle de não direcionamento) para calcular a porcentagem de silenciamento (knockdown).
[0028] A Figura 3 mostra a redução mediada por RNAi de SNCA de camundongo in vitro. Quantificação de SNCA em extratos de células in- teiras de células HEK293T 72 horas após transfecção com plasmídeos que codificam as sequências de RNAi indicadas em formato de miRNA e cDNA de SNCA de camundongo. Os níveis de SNCA foram normalizados para o controle de carregamento de GAPDH e normaliza- dos para o controle (RNAi de controle de não direcionamento) para cal- cular a porcentagem de silenciamento.
[0029] As Figuras 4A-D mostram a redução mediada por RNAi da proteína alfa-sinucleína de camundongo ou humana in vitro. Diagra- mas de análise quantitativa de SNCA em extratos de células inteiras de células HEK293T 72 horas após transfecção com plasmídeos que codi- ficam as sequências de RNAi indicadas em formato de siRNA e cDNA de SNCA humana (Figura 4A) ou dcDNA de SNCA de camundongo (Fi- gura 4B). Os níveis de proteína SNCA foram normalizados para beta tubulina e normalizados para o controle (RNAi de controle de não dire- cionamento) para calcular a porcentagem de silenciamento, conforme mostrado nas imagens de Western blotting para SNCA humana (Figura 4C) e SNCA de camundongo (Figura 4D).
[0030] As Figuras 5A-B mostram a toxicidade das sequências de RNAi indicadas em células LUHMES transfectadas. As células LUH- MES foram transfectadas com as sequências de RNAi indicadas no for- mato de miRNA e, em seguida, tratadas com rotenona para induzir À toxicidade celular. (Figura 5A) A viabilidade celular medida através do ensaio Cell Titer Blue 48 horas após o tratamento com rotenona e demonstrou neuroproteção significativa por ambas as sequências de RNAi D1 e E1 (38 % e 40 %, respectivamente), mas não a sequência de RNAi de controle. A % média de neuroproteção é calculada como % de variação em relação ao controle. (Figura 5B) Espécies reativas de oxigênio medidas como uma leitura adicional da toxicidade induzida por rotenona.
[0031] A Figura 6 mostra a correlação positiva do silenciamento de SNCA com a neuroproteção. A neuroproteção percentual (como viabili- dade celular) da Figura 5 foi representada graficamente contra o nível de silenciamento por D1 ou E1 em cada respectivo experimento. Ambas as sequências de RNAi mostraram correlação positiva significativa (Pe- arson) do percentual de silenciamento com o nível de neuroproteção em células LUHMES tratadas com rotenona.
[0032] A Figura 7 mostra o silenciamento de mRNA alvo por RNAi indicado em formato de miRNA in vivo. As barras indicam a média +/- SEM. Os círculos representam animais individuais. Significância avali- ada por meio de ANOVA unidirecional com múltiplas comparações.
[0033] A Figura 8 mostra a redução de mRNA de SNCA em todo o mesencéfalo em camundongos após injeção do vetor de AAV-D1. Os camundongos foram injetados unilateralmente com controle 1e10 GC ou vírus D1. O tecido foi coletado e processado para hibridização in situ 1 mês depois. A sonda antissenso de SNCA mostra claramente a redu- ção do alvo em três níveis anatômicos diferentes, rostal a caudal, em relação ao hemisfério contralateral. O vírus de RNAi de controle não mostrou qualquer diminuição no mRNA de SNCA em relação ao hemis- fério não injetado.
[0034] A Figura 9 mostra a redução da proteína SNCA e mRNA de SNCA em camundongos por meio de imuno-histoquímica do SNc e hi- bridização in situ.
[0035] A Figura 10 mostra a redução da proteína SNCA e mRNA de SNCA em camundongos por meio de imuno-histoquímica do SNc e hibridização in situ após distribuição de um vetor de AAV.rh10-E1.
[0036] A Figura 11 mostra a expressão normalizada de α-sinucle- ína em réplicas biológicas individuais para cada grupo de amostra; EV significa "vetor vazio".
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0037] Em alguns aspectos, a invenção fornece um RNAi para o tra- tamento de sinucleinopatias neurodegenerativas.
Em algumas modali- dades, a sinucleinopatia neurodegenerativa é mal de Parkinson ou atro- fia de múltiplos sistemas (MSA). Em algumas modalidades, o RNAi tem como alvo a alfa-sinucleína.
Em algumas modalidades, o RNAi reduz a expressão de alfa-sinucleína.
Em algumas modalidades, o RNAi com- preende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que compreende a sequência 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID N O: 24). Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que compre- ende a sequência 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID N O: 24) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nu- cleico que compreende a sequência 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA- 3' (SEQ ID NO: 53). Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que com- preende a sequência 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que compreende a se- quência 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que compre- ende a sequência 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3' (SEQ ID NO: 37). Em alguns aspectos, a invenção fornece construções de ex- pressão, vetores (por exemplo, vetores de AAV recombinantes), célu- las, partículas virais (por exemplo, partículas de AAV) e composições farmacêuticas que compreendem um RNAi da presente invenção.
Em outros aspectos, a invenção fornece métodos para o tratamento de si- nucleinopatias neurodegenerativas ao inibir a expressão de SNCA e ini- bir o acúmulo de SNCA em uma célula em um mamífero que compre- endem administrar ao mamífero uma composição farmacêutica que compreende um RNAi da presente invenção.
Em ainda outros aspectos,
a invenção fornece o uso de uma composição farmacêutica que com- preende um RNAi da presente invenção para tratar sinucleinopatias neurodegenerativas (por exemplo, melhorar os sintomas de sinucleino- patias neurodegenerativas), inibir a expressão de SNCA ou inibir o acú- mulo de SNCA em uma célula em um mamífero que tem uma sinu- cleinopatia neurodegenerativa. Em algumas modalidades, a sinucleino- patia é mal de Parkinson, atrofia de múltiplos sistemas ou demência com corpos de Lewy. I. Técnicas Gerais
[0038] As técnicas e procedimentos descritos ou citados no pre- sente documento são geralmente bem compreendidos e comumente empregados usando a metodologia convencional por aqueles versados na técnica tais como, por exemplo, as metodologias amplamente usa- das descritas em Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); a série Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6ª ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Mo- lecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather e P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tis- sue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths e D.G. Ne- well, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immu- nology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vec- tors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR:
The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Pro- tocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immu- nobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); An- tibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Labo- ratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); e Cancer: Principles and Practice of Onco- logy (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011). II. Definições
[0039] Um "vetor", conforme usado no presente documento, refere- se a um plasmídeo ou vírus recombinante que compreende um ácido nucleico a ser distribuído a uma célula hospedeira, in vitro ou in vivo.
[0040] O termo "polinucleotídeo" ou "ácido nucleico", conforme usado no presente documento, refere-se a uma forma polimérica de nu- cleotídeos de qualquer comprimento, seja ribonucleotídeos ou desoxir- ribonucleotídeos. Assim, este termo inclui, porém sem limitações, DNA ou RNA fita simples, dupla ou múltipla, DNA genômico, cDNA, híbridos de DNA-RNA ou um polímero que compreende bases de purina e piri- midina, ou outras bases de nucleotídeos naturais, química ou bioquimi- camente modificadas, não naturais ou derivatizadas. O esqueleto do po- linucleotídeo pode compreender açúcares e grupos fosfato (conforme pode ser tipicamente encontrado em RNA ou DNA) ou grupos açúcar ou fosfato modificados ou substituídos. Alternativamente, o esqueleto do polinucleotídeo pode compreender um polímero de subunidades sin- téticas, tais como fosforamidatos e, portanto, pode ser um oligodesoxi- nucleosídeo de fosforamidato (P-NH2) ou um oligômero misto de fosfo- ramidato-fosfodiéster. Além disso, um polinucleotídeo fita dupla pode ser obtido a partir do produto da síntese química de um polinucleotídeo fita simples, seja ao sintetizar a fita complementar e emparelhar as fitas sob condições apropriadas ou ao sintetizar a fita complementar de novo usando uma DNA polimerase com um iniciador apropriado.
[0041] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados indistinta- mente para referir-se a um polímero de resíduos de aminoácidos e não estão limitados a um comprimento mínimo. Estes polímeros de resíduos de aminoácidos podem conter resíduos de aminoácidos naturais ou não naturais e incluem, porém sem limitações, peptídeos, oligopeptídeos, dímeros, trímeros e multímeros de resíduos de aminoácidos. Tanto pro- teínas de comprimento total quanto fragmentos das mesmas são abran- gidos pela definição. Os termos também incluem modificações pós-ex- pressão do polipeptídeo, por exemplo, glicosilação, sialilação, acetila- ção, fosforilação e assim por diante. Além disso, para fins da pre- sente invenção, um "polipeptídeo" refere-se a uma proteína que inclui modificações, tais como eliminações, adições e substituições (geral- mente de natureza conservativa) na sequência nativa, contanto que a proteína mantenha a atividade desejada. Estas modificações podem ser deliberadas, tal como por meio de mutagênese sítio dirigida, ou podem ser acidentais, tal como por meio de mutações de hospedeiros que pro- duzem as proteínas ou erros em virtude de amplificação por PCR.
[0042] Um "vetor viral recombinante" refere-se a um vetor de poli- nucleotídeos recombinante que compreende uma ou mais sequências heterólogas (isto é, sequência de ácidos nucleicos não de origem vi- ral). No caso de vetores de AAV recombinantes, o ácido nucleico recom- binante é flanqueado por pelo menos uma e, em algumas modalida- des, duas sequências de repetição terminal invertida (ITRs).
[0043] Um "vetor de AAV recombinante (vetor de rAAV)" refere-se a um vetor de polinucleotídeos que compreende uma ou mais sequên- cias heterólogas (isto é, sequência de ácidos nucleicos não originária de AAV) que são flanqueadas por pelo menos uma e, em algumas mo- dalidades duas, sequências de repetição terminal invertida (ITRs) de AAV. Estes vetores de rAAV podem ser replicados e engolfados em partículas virais infecciosas quando presentes em uma célula hospe- deira que foi infectada com um vírus auxiliar adequado (ou que expressa funções auxiliares adequadas) e que expressa produtos dos genes rep e cap de AAV (isto é, Proteínas Rep e Cap de AAV). Quando um vetor de rAAV é incorporado em um polinucleotídeo maior (por exemplo, em um cromossomo ou em outro vetor, tal como um plasmídeo usado para clonagem ou transfecção), então, o vetor de rAAV pode ser denominado como um "pró-vetor" o qual pode ser "resgatado" por meio de replicação e encapsidação na presença de funções de engolfamento de AAV e fun- ções auxiliares adequadas. Um vetor de rAAV pode estar em qualquer uma de uma série de formas incluindo, porém sem limitações, plasmí- deos, cromossomos artificiais lineares, em complexo com lipídios, en- capsulados em lipossomas e encapsulados em uma partícula viral, par- ticularmente uma partícula de AAV. Um vetor de rAAV pode ser engol- fado em uma capsídeo de vírus AAV para gerar uma "partícula viral adeno-associada recombinante (partícula de rAAV)".
[0044] "Heterólogo" significa derivado de uma entidade genotipica- mente distinta daquela do restante da entidade com à qual ela é com- parada ou na qual ela é introduzida ou incorporada. Por exemplo, um polinucleotídeo introduzido por meio de técnicas de engenharia genética em um tipo de célula diferente é um polinucleotídeo heterólogo (e, quando expresso, pode codificar um polipeptídeo heterólogo). Da mesma forma, uma sequência celular (por exemplo, um gene ou porção do mesmo) que é incorporada a um vetor viral é uma sequência de nu- cleotídeos heteróloga em relação ao vetor.
[0045] O termo "transgene" refere-se a um polinucleotídeo que é in-
troduzido em uma célula e é capaz de ser transcrito em RNA e, opcio- nalmente, traduzido e/ou expresso sob condições apropriadas. Em as- pectos, ele confere uma propriedade desejada a uma célula na qual foi introduzido ou, de outra forma, leva a um resultado terapêutico ou diag- nóstico desejado. Em outro aspecto, ele pode ser transcrito em uma mo- lécula que media a interferência de RNA, tal como miRNA, siRNA ou shRNA.
[0046] "Promotor de β-actina de galinha (CBA)" refere-se a uma se- quência de polinucleotídeos derivada de um gene de β-actina de galinha (por exemplo, beta actina de Gallus gallus, representada pela GenBank Entrez Gene ID 396526). Conforme usado no presente documento, "promotor de β-actina de galinha" pode referir-se a um promotor que contém um elemento intensificador precoce de citomegalovírus (CMV), o promotor e o primeiro éxon e íntron do gene de β-actina de galinha e o aceitador de emendas (splice) do gene de beta-globina de coelho, tais como as sequências descritas em Miyazaki, J. et al. (1989) Gene 79 (2): 269-77. Conforme usado no presente documento, o termo "promo- tor de CAG" pode ser usado indistintamente. Conforme usado no pre- sente documento, o termo "promotor de intensificador precoce de CMV/promotor de beta-actina de galinha (CAG)" pode ser usado indis- tintamente.
[0047] Os termos "partículas genômicas (gp)", "equivalentes genô- micos" ou "cópias genômicas", conforme usado em referência a uma titulação viral, referem-se ao número de vírions que contêm o genoma do DNA de AAV recombinante, independentemente da infectividade ou funcionalidade. O número de partículas genômicas em uma preparação de vetor em particular pode ser medido por meio de procedimentos tais conforme descrito nos Exemplos no presente documento ou, por exem- plo, em Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10: 1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6: 272-278.
[0048] O termo "genoma de vetor (vg)", conforme usado no pre- sente documento, pode referir-se a um ou mais polinucleotídeos que compreendem um conjunto de sequências polinucleotídicas de um ve- tor, por exemplo, um vetor viral. Um genoma de vetor pode ser encap- sidado em uma partícula viral. Dependendo do vetor viral em particular, um genoma de vetor pode compreender DNA fita simples, DNA fita du- pla ou RNA fita simples ou RNA fita dupla. Um genoma de vetor pode incluir sequências endógenas associadas a um vetor viral específico e/ou quaisquer sequências heterólogas inseridas em um vetor viral es- pecífico por meio de técnicas recombinantes. Por exemplo, um genoma de vetor de AAV recombinante pode incluir pelo menos uma sequência ITR que flanqueia um promotor, um ácido nucleico de enchimento, uma sequência de interesse (por exemplo, um RNAi) e uma sequência de poliadenilação. Um genoma de vetor completo pode incluir um conjunto completo de sequências polinucleotídicas de um vetor. Em algumas mo- dalidades, a titulação de ácidos nucleicos de um vetor viral pode ser medida em termos de vg/mL. Métodos adequados para medir esta titu- lação são conhecidos na técnica (por exemplo, PCR quantitativa).
[0049] Conforme usado no presente documento, o termo "inibir" pode referir - se ao ato de bloquear, reduzir, eliminar ou, de outra forma, antagonizar a presença ou a atividade de um alvo específico. Inibição pode referir-se à inibição parcial ou inibição completa. Por exemplo, ini- bição da expressão de um gene pode referir-se a qualquer ato que leve a um bloqueio, redução, eliminação ou qualquer outro antagonismo da expressão do gene, incluindo redução da abundância de mRNA (por exemplo, silenciamento da transcrição de mRNA), degradação de mRNA, inibição de tradução do mRNA e assim por diante. Em algumas modalidades, inibição da expressão de SNCA pode referir-se a um blo- queio, redução, eliminação ou qualquer outro antagonismo de expres- são de SNCA, incluindo redução da abundância de Mrna de SNCA (por exemplo, silenciamento da transcrição de mRNA de SNCA), degrada- ção de mRNA de SNCA, inibição da tradução de mRNA de SNCA e as- sim por diante. Como outro exemplo, inibição do acúmulo de uma pro- teína em uma célula pode referir-se a qualquer ato que leve a um blo- queio, redução, eliminação ou outro antagonismo da expressão da pro- teína, incluindo redução da abundância de mRNA (por exemplo, silenci- amento da transcrição de mRNA), degradação de mRNA, inibição da tradução de mRNA, degradação da proteína e assim por diante. Em al- gumas modalidades, inibição do acúmulo da proteína SNCA em uma célula refere-se a um bloqueio, redução, eliminação ou outro antago- nismo da expressão da proteína SNCA em uma célula, incluindo redu- ção da abundância de mRNA de SNCA (por exemplo, silenciamento da transcrição de mRNA de SNCA), degradação do mRNA de SNCA, inibição de tradução do mRNA de SNCA, degradação da prote- ína SNCA e assim por diante.
[0050] Os termos "unidade de infecção (iu)", "partícula infecciosa" ou "unidade de replicação", quando usados em referência a uma titula- ção viral, referem-se ao número de partículas infecciosas de vetor de AAV recombinante e competentes para replicação, conforme medido por meio do ensaio de centro infeccioso, também conhecido como en- saio de centro de replicação conforme descrito, por exemplo, em McLa- ughlin et al. (1988) J. Virol., 62: 1963-1973.
[0051] O termo "unidade de transdução (tu)", quando usado em re- ferência a uma titulação viral, refere-se ao número de partículas infecci- osas de vetor de AAV recombinante que resultam na produção de um produto transgênico funcional, conforme medido em ensaios funcionais como descrito nos Exemplos no presente documento ou, por exemplo, em Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144: 113-124; ou em Fisher et al. (1996) J. Virol., 70: 520-532 (ensaio LFU).
[0052] Uma "repetição terminal invertida" ou sequência "ITR" é um termo bem conhecido na técnica e refere-se a sequências relativamente curtas encontradas nos términos de genomas virais que estão em ori- entação oposta.
[0053] Uma sequência de "repetição terminal invertida (ITR) de AAV", um termo bem conhecido na técnica, é uma sequência de apro- ximadamente 145 nucleotídeos que está presente em ambos os térmi- nos do genoma nativo de AAV fita simples. Os 125 nucleotídeos mais externos da ITR podem estar presentes em qualquer uma das duas ori- entações alternativas, levando à heterogeneidade entre diferentes ge- nomas de AAV e entre as duas extremidades de um único genoma de AAV. Os 125 nucleotídeos mais externos também contêm várias regi- ões mais curtas de autocomplementaridade (designadas regiões A, A', B, B', C, C' e D), permitindo que o emparelhamento de bases intra fita ocorra dentro desta porção da ITR.
[0054] Uma "sequência de resolução terminal" ou "trs" é uma se- quência na região D da ITR de AAV que é clivada por proteínas rep de AAV durante replicação do DNA viral. Uma sequência de resolução ter- minal mutante é refratária à clivagem pelas proteínas rep de AAV.
[0055] "Funções auxiliares de AAV" referem-se a funções que per- mitem que o AAV seja replicado e engolfado por uma célula hospe- deira. As funções auxiliares de AAV podem ser fornecidas em qualquer uma de várias formas incluindo, porém sem limitações, vírus auxiliares ou genes de vírus auxiliares que auxiliam na replicação e engolfamento de AAV. Outras funções auxiliares de AAV são conhecidas na técnica, tais como agentes genotóxicos.
[0056] Um "vírus auxiliar" para AAV refere-se a um vírus que per- mite que o AAV (o qual é um parvovírus defeituoso) seja replicado e engolfado por uma célula hospedeira. Um vírus auxiliar confere "fun- ções auxiliares" que permitem a replicação do AAV. Vários destes vírus auxiliares foram identificados, incluindo adenovírus, herpesvírus e pox- vírus, tais como vaccinia e baculovírus. Os adenovírus abrangem vários subgrupos diferentes, embora o adenovírus de tipo 5 do subgrupo C (Ad5) seja o mais comumente usado. Numerosos adenovírus de origem humana, de mamíferos não humanos e de aves são conhecidos e estão disponíveis em depositários tal como a ATCC. Os vírus da família do herpes, os quais também estão disponíveis em depositários tal como a ATCC incluem, por exemplo, vírus do herpes simplex (HSV), vírus de Epstein-Barr (EBV), citomegalovírus (CMV) e vírus da pseudo-raiva (PRV). Exemplos de funções auxiliares de adenovírus para a replicação de AAV incluem funções E1A, funções E1B, funções E2A, funções VA e funções E4orf6. Os baculovírus disponíveis em depositários incluem o vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica.
[0057] Uma preparação de rAAV é considerada "substancialmente isenta" de vírus auxiliar se a proporção de partículas infecciosas de AAV para partículas infecciosas de vírus auxiliar for de pelo menos cerca de 102:1; pelo menos cerca de 104:1, pelo menos cerca de 106:1; ou pelo menos cerca de 108:1 ou mais. Em algumas modalidades, as prepara- ções também são isentas de quantidades equivalentes de proteínas do vírus auxiliar (isto é, proteínas que estariam presentes como um resul- tado de tal nível de vírus auxiliar se as impurezas da partícula viral au- xiliar observadas acima estivessem presentes na forma fragmentada). A contaminação por proteína viral e/ou celular pode, em geral, ser obser- vada como a presença de bandas de coloração de Coomassie em géis de SDS (por exemplo, o aparecimento de bandas diferentes daquelas que correspondem às proteínas VP1, VP2 e VP3 da capsídeo de AAV).
[0058] "Porcentagem (%) de identidade de sequência", em relação a um polipeptídeo ou sequência de ácidos nucleicos de referência, é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos ou nucleotí- deos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos no polipeptídeo ou sequência de ácidos nucleicos de referência após alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de se- quência e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência.
O alinhamento para fins de de- terminação do percentual de identidade de sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usando programas de sof- tware de computador publicamente disponíveis, por exemplo, aqueles descritos em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Eds., 1987), Sup. 30, seção 7.7.18, Tabela 7.7.1 e incluindo o sof- tware BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Um pro- grama de alinhamento preferido é o ALIGN Plus (Scientific and Educa- tional Software, Pennsylvania). Aqueles versados na técnica podem de- terminar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências que estão sendo compara- das.
Para fins do presente documento, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma determinada sequência de aminoácidos A com, ou contra, uma determinada sequência de aminoácidos B (a qual pode ser alternativamente expressa como uma dada sequência de aminoáci- dos A que tem ou compreende uma determinada % de identidade de sequência de aminoácidos por, com ou contra uma determinada se- quência de aminoácidos B) é calculada da seguinte forma: 100 vezes a fração X/Y, onde X é o número de resíduos de aminoácidos marcados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de se- quência neste programa alinhamento de A e B e onde Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B.
Será reconhecido que, onde o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao compri- mento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos de A para B não será igual à % de identidade de se- quência de aminoácidos de B para A. Para fins no presente documento, a % de identidade de sequência de ácidos nucleicos de uma determi- nada sequência de ácidos nucleicos C para, com ou contra uma dada sequência de ácidos nucleicos D (a qual pode ser alternativamente ex- pressa como uma dada sequência de ácidos nucleicos C que tem ou compreende uma determinada % de identidade de sequência de ácidos nucleicos por, com ou contra uma dada sequência de ácidos nucleicos D) é calculada da seguinte forma: 100 vezes a fração W/Z, onde W é o número de nucleotídeos marcados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequência no alinhamento deste pro- grama de C e D e onde Z é o número total de nucleotídeos em D. Será reconhecido que, onde o comprimento da sequência de ácidos nuclei- cos C não é igual ao comprimento de sequência de ácidos nucleicos D, a % de identidade de sequência de ácidos nucleicos de C para D não será igual à % de identidade de sequência de ácidos nucleicos de D para C.
[0059] Uma molécula (por exemplo, ácido nucleico ou proteína) ou célula "isolada" significa que ela foi identificada e separada e/ou recu- perada a partir de um componente de seu ambiente natural.
[0060] Uma "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para obter resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos (por exemplo, melhora dos sintomas, obtenção de desfechos clínicos e assim por diante). Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Em termos de um estado patológico, uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para melhorar, estabili- zar ou retardar o desenvolvimento de uma doença.
[0061] Um "indivíduo" ou "pessoa" é um mamífero. Mamíferos in- cluem, porém sem limitações, animais domesticados (por exemplo, va-
cas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, seres hu- manos e primatas não humanos, tais como macacos), coelhos e roedo- res (por exemplo, camundongos e ratos). Em determinadas modalida- des, o indivíduo ou pessoa é um ser humano.
[0062] Conforme usado no presente documento, "tratamento" é uma abordagem para obter resultados clínicos benéficos ou deseja- dos. Para fins da presente invenção, os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, porém sem limitações, alívio dos sintomas, diminui- ção da extensão da doença, estado patológico estabilizado (por exem- plo, sem agravamento), prevenção de disseminação (por exemplo, me- tástase) da doença, retardo ou desaceleração de progressão da do- ença, melhoria ou paliação do estado patológico e remissão (seja par- cial ou total), quer detectável ou indetectável. "Tratamento" também pode significar prolongar a sobrevida comparado com a sobrevida es- perada se não receber tratamento.
[0063] Conforme usado no presente documento, o termo "trata- mento profilático" refere-se ao tratamento em que um indivíduo é conhe- cido ou suspeito de ter ou está em risco de ter um transtorno, mas não apresentou sintomas ou sintomas mínimos do transtorno. Um indivíduo sob tratamento profilático pode ser tratado antes do início dos sintomas.
[0064] Conforme usado no presente documento, o termo "sinu- cleinopatia neurodegenerativa" refere-se a transtornos neurodegenera- tivos caracterizados por agregados fibrilares da proteína alfa-sinucleína no citoplasma de populações seletivas de neurônios e glia em tanto no sistema nervoso central como periférico. Exemplos incluem, porém sem limitações, mal de Parkinson (PD), atrofia de múltiplos sistemas (MSA- P e MSA-C), demência com corpos de Lewy (DLB), insuficiência auto- nômica pura (PAF), variante com corpos de Lewy em mal de Alzheimer (LBVAD), disfagia por corpos de Lewy e doença incidental por corpos de Lewy.
[0065] Conforme usado no presente documento, um "RNAi" pode referir-se a qualquer molécula de RNA que induz à interferência de RNA em uma célula. Exemplos de RNAi incluem, sem limitação, pequenos RNAs inibidores (siRNAs), microRNAs (miRNAs) e pequenos RNAs em gancho (shRNAs).
[0066] "Scaffold de miRNA" pode referir-se a um polinucleotídeo que contém (i) uma sequência fita dupla direcionada a um gene de inte- resse para silenciamento por RNAi e (ii) sequências adicionais que for- mam uma estrutura de haste-alça similar àquela de miRNAs endóge- nos. Uma sequência direcionada a um gene de interesse para RNAi (por exemplo, uma sequência curta de ~ 20 nt) pode ser ligada a sequências que criam uma haste-alça de tipo miRNA e uma sequência que empa- relha com a sequência de interesse para formar um duplex quando o polinucleotídeo é montado na estrutura secundária similar a miRNA. Conforme descrito no presente documento, este duplex pode hibridizar imperfeitamente, por exemplo, pode conter uma ou mais bases desem- parelhadas ou mal emparelhadas. Após clivagem deste polinucleotídeo por Dicer, este duplex que contém a sequência que tem como alvo um gene de interesse pode ser desenrolado e incorporado no complexo RISC. Um scaffold de miRNA pode referir-se ao próprio miRNA ou a um polinucleotídeo de DNA que codifica o miRNA. Um exemplo de um scaf- fold de miRNA é a sequência miR-155 (Lagos-Quintana, M. et al. (2002) Curr. Biol. 12: 735-9). Kits comercialmente disponíveis para clo- nagem de uma sequência em um scaffold de miRNA são conhecidos na técnica (por exemplo, o kit de vetor de expressão de RNAi BLOCK-iT™ Pol II miR Invitrogen™ da Life Technologies, Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA).
[0067] Conforme usado no presente documento, uma "protuberân- cia" refere-se a uma região de ácidos nucleicos que não é complemen- tar ao ácido nucleico oposta a ela em um ácido nucleico duplex. Por exemplo, uma protuberância pode referir-se a uma sequência de ácidos nucleicos que não é complementar ao ácido nucleico oposto em um ácido nucleico duplex onde a protuberância é flanqueada por regiões de ácido nucleico que são complementares ao ácido nucleico oposto em um ácido nucleico duplex. Em alguns exemplos, a protuberância pode ter qualquer um de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais de 10 bases de comprimento. Em alguns exemplos, a protuberância pode ser o resul- tado de emparelhamento incorreto (por exemplo, a fita oposta contém uma base que não é complementar) ou a protuberância pode ser o re- sultado de não emparelhamento (por exemplo, a fita oposta compre- ende um ácido nucleico complementar ao ácido nucleico que flanqueia a protuberância, mas a fita oposta não contém ácido nucleico oposto à protuberância).
[0068] Conforme usado no presente documento, o termo ácido nu- cleico "senso" é um ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica a totalidade ou parte de um transgene. Em alguns exemplos, o mRNA para um transgene é um ácido nucleico senso.
[0069] Conforme usado no presente documento, o ácido nucleico "antissenso" é uma sequência de ácidos nucleicos que é complementar a um ácido nucleico "senso". Por exemplo, um ácido nucleico antis- senso pode ser complementar a um mRNA que codifica um transgene.
[0070] Conforme usado no presente documento, a "região guia" de um RNAi é a fita do RNAi que se liga ao mRNA alvo, tipicamente com base na complementaridade. A região de complementaridade pode abranger a totalidade ou uma parte da região guia. Normalmente, a re- gião de complementaridade inclui pelo menos a região de semente. Em muitos casos, a região antissenso de um RNAi é a região guia.
[0071] Conforme usado no presente documento, a "região passa- geira" ou "região não guia", usada indistintamente no presente docu- mento, de um RNAi é a região do RNAi que é complementar à região guia. Em muitos casos, a região sendo de um RNAi é a região passa- geira.
[0072] Conforme usado no presente documento, a "região de se- mente" de um RNAi (por exemplo, miRNA) é uma região de cerca de 1- 8 nucleotídeos de comprimento de um microRNA. Em alguns exemplos, a região de semente e a 3'-UTR de seu mRNA alvo podem ser um fator determinante no reconhecimento de RNAi.
[0073] Conforme usado no presente documento, "silenciamento de gene fora do alvo" refere-se ao emparelhamento de uma região de se- mente de um RNAi com sequências em 3′-UTRs de mRNAs não inten- cionais e controla a repressão traducional e desestabilização destes transcritos (por exemplo, reduz expressão dos mRNAs indesejados).
[0074] Referência a "cerca de" um valor ou parâmetro no presente documento inclui (e descreve) modalidades que são dirigidas a este va- lor ou parâmetro per se. Por exemplo, descrição referente a "cerca de X" inclui a descrição de "X."
[0075] Conforme usado no presente documento, a forma no singu- lar dos artigos "um", "uma", "o" e "a" inclui as referências no plural, salvo indicação em contrário.
[0076] Deve ser entendido que os aspectos e modalidades da in- venção descritos no presente documento incluem "que compre- ende(m)", "que consiste(m)" e/ou "que consiste(m) essencialmente em" aspectos e modalidades. III. RNAi
[0077] Em alguns aspectos, a invenção fornece um RNAi aprimo- rado. Em algumas modalidades, o RNAi é um pequeno RNA inibidor (siRNA), um microRNA (miRNA) ou um pequeno RNA em gancho (shRNA). Um pequeno RNA inibidor ou interferente (siRNA) é conhe- cido na técnica como uma molécula de RNA fita dupla de aproximada- mente 19-25 (por exemplo, 19-23) pares de bases de comprimento que induz ao RNAi em uma célula. Em algumas modalidades, a sequência de siRNA também pode ser inserida em um scaffold de miRNA artificial ("shmiRNA"). Um pequeno RNA em gancho (shRNA) é conhecido na técnica como uma molécula de RNA que compreendem aproximada- mente 19-25 (por exemplo, 19-23) pares de bases de RNA fita dupla ligados por uma alça curta (por exemplo, ~ 4-11 nucleotídeos) que induz ao RNAi em uma célula.
[0078] Um microRNA (miRNA) é conhecido na técnica como uma molécula de RNA que induz ao RNAi em uma célula que compreende uma sequência curta (por exemplo, 19-25 pares de bases) de RNA fita dupla ligado por uma alça e que contém uma ou mais sequências de RNA fita dupla adicionais que compreendem uma ou mais protuberân- cias (por exemplo, pares de bases mal emparelhados ou não empare- lhados). Conforme usado no presente documento, o termo "miRNA" abrange miRNAs endógenos, bem como miRNAs exógenos ou heteró- logos. Em algumas modalidades, "miRNA" pode referir-se a um pri- miRNA ou um pré-miRNA. Durante o processamento de miRNA, um transcrito de pri-miRNA é produzido. O pri-miRNA é processado por Drosha-DGCR8 para produzir um pré-miRNA através da excisão de uma ou mais sequências para deixar um pré-miRNA com uma região de flanqueamento 5', uma fita guia, uma região de alça, uma fita não guia e uma região de flanqueamento 3'; ou uma região de flanqueamento 5', uma fita não guia, uma região de alça, uma fita guia e uma região de flanqueamento 3'. O pré-miRNA é, então, exportado para o citoplasma e processado pela Dicer para produzir um siRNA com uma fita guia e uma fita não guia (ou passageira). A fita guia é, então, usada pelo com- plexo RISC para catalisar o silenciamento do gene, por exemplo, ao re- conhecer uma sequência de RNA alvo complementar à fita guia. Uma descrição adicional de miRNAs pode ser encontrada, por exemplo, no documento WO 2008/150897. O reconhecimento de uma sequência alvo por um miRNA é principalmente determinado pelo emparelhamento entre o alvo e a sequência de semente de miRNA, por exemplo, nucle- otídeos 1-8 (5' para 3') da fita guia (consulte, por exemplo, Boudreau, R.L. et al. (2013) Nucleic Acids Res. 41: e9).
[0079] Na estrutura pri/pré-miRNA, a interface de fita guia:fita não guia em um duplex é formada em parte por meio de emparelhamento de base complementar (por exemplo, emparelhamento de base de Wat- son-Crick). No entanto, em algumas modalidades, este par de bases complementar não se estende por todo o duplex. Em algumas modali- dades, uma protuberância na interface pode existir em uma ou mais po- sições de nucleotídeos. Conforme usado no presente documento, o termo "protuberância" pode referir-se a uma região de ácidos nucleicos que não é complementar ao ácido nucleico oposto a ela em um du- plex. Em algumas modalidades, a protuberância é formada quando as regiões de ácidos nucleicos complementares se ligam umas às outras, enquanto que as regiões da região central não complementar não se ligam. Em algumas modalidades, a protuberância é formada quando as duas fitas de ácidos nucleicos posicionadas entre as duas regiões com- plementares são de comprimentos diferentes. Conforme descrito abaixo, uma protuberância pode ter 1 ou mais nucleotídeos. Em algu- mas modalidades, o miRNA compreende uma protuberância interna ge- rada pela exclusão de 2 bases na fita passageira do miRNA - bases 9- 10, contando a partir do início da fita passageira.
[0080] Em outro aspecto, o RNAi descrito na presente invenção é inibidor contra alfa-sinucleína (SNCA). Em algumas modalidades, a SNCA é SNCA de camundongo. Em algumas modalidades, a SNCA é SNCA humana. Em algumas modalidades, o RNAi tem como alvo o RNA que codifica SNCA. Em algumas modalidades, o RNAi inibe a ex- pressão de SNCA em um indivíduo. Em algumas modalidades, o RNAi inibe o acúmulo de SNCA em um indivíduo. Em algumas modalidades,
o indivíduo é um mamífero. Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano.
[0081] A segurança das terapias com base em RNAi pode ser pre- judicada pela capacidade de pequenos RNAs inibidores (siRNAs) de se ligarem a mRNAs não intencionais e reduzir sua expressão, um efeito conhecido como silenciamento de genes fora do alvo. O silenciamento fora do alvo ocorre principalmente quando a região de semente (nucle- otídeos 2–8 do pequeno RNA) emparelha com sequências em 3′-UTRs de mRNAs não intencionais e controla a repressão traducional e a de- sestabilização destes transcritos. RNAi fora do alvo reduzido pode ser concebido através da substituição de bases no interior das sequên- cias guia e não guia; por exemplo, ao criar motivos CpG. Substituições potenciais que podem resultar em uma pontuação fora do alvo significa- tivamente mais baixa podem ser avaliadas usando o algoritmo SiS- POTR, um algoritmo de design de siRNA focado na especificidade que identifica sequências candidatas com potenciais mínimos fora de alvo e capacidades de silenciamento potentes (Boudreau et al, Nucleic Acids Res. 2013 Jan; 41 (1) e9. Uma pontuação no SiSPOTR reduzida prevê sequências que têm um número menor de potenciais fora de alvo humanos comparado com as moléculas de RNAi precursoras. Em algu- mas modalidades da invenção, o RNAi é aprimorado para reduzir o si- lenciamento gênico fora do alvo. Em algumas modalidades, o RNAi compreende um ou mais motivos CpG. Em algumas modalidades, o RNAi compreende um ou mais motivos CpG em uma região de se- mente.
[0082] Em algumas modalidades, a primeira fita e a segunda fita são ligadas por meio de um RNA (por exemplo, um ligante de RNA) ca- paz de formar uma estrutura de alça. Conforme é comumente conhecido na técnica, uma estrutura de alça de RNA (por exemplo, uma haste-alça ou gancho) é formada quando uma molécula de RNA compreende duas sequências de RNA que formam emparelham juntas separadas por uma sequência de RNA que não emparelha junto. Por exemplo, uma estru- tura de alça pode se formar na molécula de RNA A-B-C se as sequên- cias A e C forem complementares ou parcialmente complementares de modo a formar pares de bases, mas as bases na sequência B não for- mam pares de bases. Em algumas modalidades, a sequência de alça é 5'-GTTTTGGCCACTGACTGAC-3' (SEQ ID NO: 59) na forma de DNA ou 5'-G UUUUGGCCACUGACUGAC-3' (SEQ ID NO: 60) na forma de RNA.
[0083] Em algumas modalidades, o RNA capaz de formar uma es- trutura de alça compreende 4 a 50 nucleotídeos. Em determinadas mo- dalidades, o RNA capaz de formar uma estrutura de alça compreende 13 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o número de nucleotídeos no RNA capaz de formar um alça é 4 a 50 nucleotídeos ou qualquer número inteiro entre eles. Em algumas modalidades, a partir de 0-50% da alça podem ser complementares à outra parte da alça. Conforme usado no presente documento, o termo "estrutura de alça" é uma se- quência que une duas fitas de ácidos nucleicos complementares. Em algumas modalidades, 1-3 nucleotídeos da estrutura de alça são contí- guos às fitas de ácidos nucleicos complementares e podem ser comple- mentares a 1-3 nucleotídeos da porção distal da estrutura de alça. Por exemplo, os três nucleotídeos na extremidade 5' da estrutura de alça podem ser complementares aos três nucleotídeos na extremidade 3' da estrutura de alça.
[0084] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica um RNAi da presente invenção compreende um scaffold de miRNA heteró- logo. Em algumas modalidades, o uso de um scaffold de miRNA hete- rólogo é usado para modular a expressão do miRNA; por exemplo, para aumentar a expressão de miRNA ou diminuir a expressão de miRNA. Qualquer scaffold de miRNA conhecido na técnica pode ser usado. Em algumas modalidades, o scaffold de miRNA é derivado de um scaffold de miR-155 (consulte, por exemplo, Lagos-Quintana, M. et al. (2002) Curr. Biol. 12: 735-9 e o Kit de vetor de expressão de RNAi BLOCK-iT™ Pol II miR da Invitrogen™ da Life Technologies, Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA).
[0085] Em algumas modalidades, o RNAi é selecionado a partir da Tabela 1.
[0086] Em algumas modalidades, a primeira fita compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem mais de cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com qual- quer uma das sequências guia. Em algumas modalidades, a primeira fita compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem mais de cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com qualquer sequência guia, mas mantém o motivo CpG. Em algumas modalidades, a segunda fita compreende uma se- quência de ácidos nucleicos que tem mais de cerca de 75 %, 80%, 85%, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a sequência passageira correspondente. Em algumas modalidades, a segunda fita compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem mais de cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de iden- tidade com a sequência passageira correspondente, mas mantém o mo- tivo CpG. TABELA 1
Sequência Guia Sequência Passageira Homologia entre Previsão Fora do alvo SEQ ID. SEQ ID. (Primeira Fita) (Segunda Fita) Espécies Humano 1 CAUCGGAACUGAGCACUUGUA 30 UACAAGUGCAGUUCCGAUG hs, mq, ms 562 2 AGGUUCGUAGUCUUGAUACCCU 31 AAGGUUAGAAUGGCGGUUAA hs 518 3 uUAACCGCCACUUUCUAACCUU 32 AAGGUUAGAAUGGCGGUUAA hs 530 4 ACGUUGGAACUGAGCACUUGU 33 ACAAGUGCAGUUCCAACGU hs, mq, ms 882 5 uUCCAACAUUUGUCACUUGCU 34 AGCAAGUGAAAUGUUGGAA hs, mq, ms 4016 6 UCGUCCAACAUUUGUCACUUG 35 CAAGUGACAUGUUGGACGA hs, mq, ms 1190 7 UGGGCGCAUUGGAACUGAGCA 36 UGCUCAGUCAAUGCGCCUA hs, mq, ms 1662 8 UGGGCACAUUGGAACUGAGCA 37 UGCUCAGUCAAUGUGCCUA hs, mq, ms 4335 9 GUCGUCGAAUGGCCACUCCCA 38 UGGGAGUGCAUUCGACGAU hs, mq nd 10 GGUUCGUAGUCUUGAUACCCUU 39 AAGGGUAUCAACUACGAACC hs 564 11 uAGCAGCAGCCACAACUCCCU 40 AGGGAGUUGGCUGCUGCUA hs, mq, ms 6390 12 uUCGAACAUUUGUCACUUGCU 41 AGCAAGUGAAAUGUUCGAA hs, mq, ms 852 13 uAGCCGCCACAACUCCCUCCU 42 AGGAGGGAUGUGGCGGCUA hs, mq, ms 1253 14 UGCGCUUUGGUCUUCUCAGCC 43 GGCUGAGAACCAAAGCGUA hs, mq, ms 798 15 uAGCCGCAGCCACAACUCCCU 44 AGGGAGUUGGCUGCGGCUA hs, mq, ms 1253 16 uAGCAGCCACAACUCCCUCCU 45 AGGAGGGAUGUGGCUGCUA hs, mq, ms 6390 17 UCGGCACAUUGGAACUGAGCA 46 UGCUCAGUCAAUGUGCCGA hs, mq, ms 1249 18 AUGACGGGGCACAUUGGAACU 47 AGUUCCAAUGCCCCGUCAU hs, mq, ms 1071 19 AUGACUGGGCACAUUGGAACU 48 AGUUCCAAUGCCCAGUCAU hs, mq, ms 4604 20 UAAGUCGUAGUCACUUAGGUG 49 CACCUAAGACUACGACUUA hs, mq, ms 866 21 CUCCGCAGCAGCCACAACUCC 50 GGAGUUGUCUGCUGCGGAG hs, mq, ms 995 22 UCAUGACUGGGCACAUUGGAA 51 UUCCAAUGCCCAGUCAUGA hs, mq, ms 3588 23 AAAUACGUGGUAGUCACUUAG 52 CUAAGUGAACCACGUAUUU hs, mq, ms 1152 24 UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC 53 GGCUGAGAACCAAAGAGUA hs, mq, ms 4560 25 AACGUUUGUCACUUGCUCUUU 54 AAAGAGCAUGACAAACGUU hs, mq, ms 1990 26 AAAUAAGUGGUAGUCACUUAG 55 CUAAGUGAACCACUUAUUU hs, mq, ms 5638 27 UUAGAAAUAAGUGGUAGUCAC 56 GUGACUACCUUAUUUCUAA hs, mq, ms 7503 28 AAUACGUGGUAGUCACUUAGG 57 CCUAAGUGUACCACGUAUU hs, mq, ms 1149 29 ACUGCGCACAUUGGAACUGAG 58 CUCAGUUCAUGUGCGCAGU hs, mq, ms 1355
[0087] Legenda: As sequências vão a partir de 5' para 3'. Letras mi- núsculas indicam incompatibilidades com a fita senso alvo, a fim de di- minuir a estabilidade do duplex processado na extremidade 5' da fita guia. Hs = ser humano; mq = macaco rhesus, ms = camundongo. As previsões fora do alvo humano são calculadas a partir do algoritmo siS- POTR (world wide web em https: //sispotr.icts.uiowa.edu/ sispotr/to- ols.html) e representa a complementaridade com base em transcrições fora do alvo previstas para a sequência de semente do miRNA. IV. Sinucleinopatias Neurodegenerativas
[0088] Sinucleinopatias neurodegenerativas são doenças neurode- generativas caracterizadas por níveis aumentados de proteína sinucle- ína-alfa (SNCA) nas células neuronais, fibras nervosas ou células gliais. Os principais tipos de sinucleinopatias neurodegenerativas incluem de- mência com corpos de Lewy (DLB), mal de Parkinson e atrofia de múl- tiplos sistemas (MSA).
[0089] Exemplos de sinucleinopatias neurodegenerativas incluem, porém sem limitações, mal de Parkinson (PD), atrofia de múltiplos sis- temas (MSA-P e MSA-C), demência com corpos de Lewy (DLB), insufi- ciência autonômica pura (PAF), variante com corpos de Lewy de mal de Alzheimer (LBVAD), disfagia por corpos de Lewy e doença incidental por corpos de Lewy.
[0090] Múltiplas linhas de evidência demonstram que níveis aumen- tados de alfa-sinucleína são neurotóxicos, enquanto que a redução é neuroprotetora (Dauer, 2002; Drolet, 2004; Alvarez-Fischer, 2008; Kli- venyi, 2005; Mittal, 2017; Javed, 2015; Cole, 2017; Ubhi, 2010; Lim, 2011). É fornecido na presente invenção um RNAi contra SNCA. V. Métodos para Tratar Sinucleinopatias Neurodegenerativas
[0091] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos e compo- sições para o tratamento de sinucleinopatias neurodegenerativas em um mamífero que compreende administrar ao mamífero uma composi- ção farmacêutica da presente invenção (por exemplo, uma composição farmacêutica que compreende uma partícula viral da presente inven- ção). Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos e composições para inibir a expressão de SNCA em um mamífero que tem uma sinu- cleinopatia neurodegenerativa que compreende administrar ao mamí- fero uma composição farmacêutica da presente invenção (por exem- plo, uma composição farmacêutica que compreende uma partícula viral da presente invenção). Em alguns aspectos, a invenção fornece méto- dos e composições para inibir o acúmulo de SNCA em uma célula de um mamífero que tem uma sinucleinopatia neurodegenerativa que compreende administrar ao mamífero uma composição farmacêutica da presente invenção (por exemplo, uma composição farmacêutica que compreende uma partícula viral da presente invenção).
[0092] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos e compo-
sições para melhorar um sintoma de uma sinucleinopatia neurodegene- rativa que compreendem administrar uma quantidade eficaz de partícu- las virais recombinantes que compreendem um vetor que codifica um RNAi da presente invenção ao sistema nervoso de um mamífero. Em algumas modalidades, os sintomas de uma sinucleinopatia neurodege- nerativa incluem, porém sem limitações, parkinsonismo, cognição pre- judicada, transtornos do sono, alucinações visuais, fala prejudicada, constipação, sinais piramidais ou cerebelares, anosmia, disfunção au- tonômica, tal como hipotensão ortostática, diminuição da sudorese, dis- função erétil, retenção ou incontinência urinária e disfunção pupilar.
[0093] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para pre- venir ou retardar a progressão de uma sinucleinopatia neurodegenera- tiva. Sinucleinopatias tal como PD são, tipicamente, diagnosticadas cli- nicamente pela presença de tremor, bradicinesia, rigidez e instabilidade postural. A diferenciação de PD é, tipicamente, realizada pela verifica- ção de sinais adicionais, tais como hipotensão ortostática, sinais pirami- dais, alterações cognitivas ou alucinações. Além disso, algumas sinu- cleinopatias podem ser diagnosticadas por imagiologia cerebral, por exemplo, procurando anormalidades em regiões do cérebro, tais como a ponte, cerebelo, putâmen em MSA. Algumas sinucleinopatias podem ser identificadas diretamente por meio de genotipagem para mutações comuns não necessariamente limitadas ao gene de SNCA. O retardo ou prevenção da progressão da doença pode ser definida pela melhora em qualquer um dos seguintes sintomas: função motora (bradicinesia, dis- cinesia, distonia, instabilidade postural, postura curvada, tremor, mioclo- nia, etc.), cognição, transtornos do sono, alucinações visuais, fala, cons- tipação, sinais piramidais, anosmia, disfunção autonômica, tal como hi- potensão ortostática, diminuição da sudorese, disfunção erétil, retenção de urina ou incontinência e disfunção pupilar.
[0094] Em alguns aspectos da invenção, os métodos e composi- ções são usados para o tratamento de seres humanos com uma sinu- cleinopatia neurodegenerativa. Em alguns aspectos, a invenção fornece um RNAi aprimorado para direcionar o mRNA de SNCA em um mamí- fero com uma sinucleinopatia neurodegenerativa. Em algumas modali- dades, o RNAi compreende uma primeira fita que compreende um pri- meiro ácido nucleico que compreende a sequência 5'-UGCUCUUUG- GUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) e uma segunda fita que com- preende um segundo ácido nucleico que compreende a sequência 5'- GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3' (SEQ ID NO: 53), em que a primeira fita e a segunda fita formam um duplex e em que o resíduo A no resíduo 19 de SEQ ID NO: 53 da segunda fita não forma um par de bases com um resíduo na primeira fita. Em algumas modalidades, o miRNA com- preende uma protuberância interna gerada pela eliminação de 2 nucle- otídeos nas bases 9-10 na fita passageira do miRNA, contando a partir do início da fita passageira. Em algumas modalidades, a primeira fita e a segunda fita são ligadas através de uma sequência de alça. Em algu- mas modalidades, a sequência de alça é 5'-GUUUUGGCCACUGACU- GAC-3' (SEQ ID NO: 60).
[0095] Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que compreende a se- quência 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que compre- ende a sequência 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3' (SEQ ID NO: 37), onde a primeira fita e a segunda fita formam um duplex e em que o resíduo A no resíduo 19 de SEQ ID NO: 37 da segunda fita não forma um par de bases com um resíduo na primeira fita. Em algumas modali- dades, o miRNA compreende uma protuberância interna gerada pela eliminação de 2 nucleotídeos nas bases 9-10 na fita passageira do miRNA, contando a partir do início da fita passageira. Em algumas mo- dalidades, a primeira fita e a segunda fita são ligadas através de uma sequência de alça. Em algumas modalidades, a sequência de alça é 5'- GUUUUGGCCACUGACUGAC-3' (SEQ ID NO: 60).
[0096] Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que compreende a se- quência 5'-UGCGCUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 14) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que com- preende a sequência 5'-GGCUGAGAACCAAAGCGUA-3' (SEQ ID NO: 43), onde a primeira fita e a segunda fita formam um duplex e em que o resíduo A no resíduo 19 de SEQ ID NO: 43 da segunda fita não forma um par de bases com um resíduo na primeira fita. Em algumas modali- dades, o miRNA compreende uma protuberância interna gerada pela eliminação de 2 pares de base na fita passageira do miRNA -bases 9- 10, contando a partir do início da fita passageira. Em algumas modali- dades, a primeira fita e a segunda fita são ligadas através de uma se- quência de alça. Em algumas modalidades, a sequência de alça é 5'- GUUUUGGCCACUGACUGAC-3' (SEQ ID NO: 60).
[0097] Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que compreende a se- quência 5'-UGGGCGCAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 7) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que compre- ende a sequência 5'-UGCUCAGUCAAUGCGCCUA-3' (SEQ ID NO: 36), em que a primeira fita e a segunda fita formam um duplex e em que o resíduo A no resíduo 19 de SEQ ID NO: 36 da segunda fita não forma um par de base com um resíduo na primeira fita. Em algumas modali- dades, o miRNA compreende uma protuberância interna gerada pela eliminação de 2 nucleotídeos nas bases 9-10 na fita passageira do miRNA, contando a partir do início da fita passageira. Em algumas mo- dalidades, a primeira fita e a segunda fita são ligadas através de uma sequência de alça. Em algumas modalidades, a sequência de alça é 5'- GUUUUGGCCACUGACUGAC-3' (SEQ ID NO: 60).
[0098] Em algumas modalidades, o RNAi compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que compreende a se- quência 5'-uUCCAACAUUUGUCACUUGCU-3' (SEQ ID NO: 5) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que compre- ende a sequência 5'-AGCAAGUGAAAUGUUCGAA-3' (SEQ ID NO: 34), onde a primeira fita e a segunda fita formam um duplex e em que o resíduo no resíduo 18 ou resíduo 19 de SEQ ID NO: 34 da segunda fita não forma um par de bases com um resíduo na primeira fita. Em algu- mas modalidades, o miRNA compreende uma protuberância interna ge- rada pela eliminação de 2 nucleotídeos nas bases 9-10 na fita passa- geira do miRNA, contando a partir do início da fita passageira. Em algu- mas modalidades, a primeira fita e a segunda fita são ligadas através de uma sequência de alça. Em algumas modalidades, a sequência de alça é 5'-GUUUUGGCCACUGACUGAC-3' (SEQ ID NO: 60).
[0099] Em algumas modalidades da invenção, o RNAi é aprimorado para reduzir o silenciamento gênico fora do alvo. Em algumas modali- dades, o RNAi compreende um ou mais motivos CpG. Em algumas mo- dalidades, o RNAi compreende um ou mais motivos CpG em uma região de semente.
[0100] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento de uma sinucleinopatia neurodegenerativa em um mamí- fero que compreendem administrar ao mamífero um RNAi que compre- ende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que compreende a sequência 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 24 ) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que compreende a sequência 5'-GGCUGAGAACCAAAGA- GUA-3' (SEQ ID NO: 53), onde a primeira fita e a segunda fita formam um duplex.
Em algumas modalidades, o miRNA compreende uma pro- tuberância interna gerada pela eliminação de 2 nucleotídeos nas bases 9-10 na fita passageira do miRNA, contando a partir do início da fita passageira.
Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para inibir a expressão de SNCA em um mamífero com uma sinucleino- patia neurodegenerativa que compreendem administrar ao mamífero um RNAi que compreende uma primeira fita que compreende um pri- meiro ácido nucleico que compreende a sequência 5'-UGCUCUUUG- GUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) e uma segunda fita que com- preende um segundo ácido nucleico que compreende a sequência 5'- GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3' (SEQ ID NO: 53), onde a primeira fita e a segunda fita formam um duplex.
Em algumas modalidades, a inven- ção fornece métodos para inibir o acúmulo de SNCA em uma célula de um mamífero com uma sinucleinopatia neurodegenerativa que compre- endem administrar ao mamífero um RNAi que compreende uma pri- meira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que compreende a sequência 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que com- preende a sequência 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3' (SEQ ID NO: 53), em que a primeira fita e a segunda fita formam um duplex.
Em al- gumas modalidades, o miRNA compreende uma protuberância interna gerada pela eliminação de 2 nucleotídeos nas bases 9-10 na fita passa- geira do miRNA, contando a partir do início da fita passageira.
Em algu- mas modalidades, a primeira fita compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem mais de cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96%, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com SEQ ID NO: 24 Em algu- mas modalidades, a segunda fita compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem mais de cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com SEQ ID NO: 24, mas mantém o motivo CpG.
Em algumas modalidades, a primeira fita e a segunda fita são ligadas através de uma sequência de alça. Em algumas modalida- des, a sequência de alça é 5'-GUUUUGGCCACUGACUGAC-3' (SEQ ID NO: 60).
[0101] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento de uma sinucleinopatia neurodegenerativa em um mamí- fero que compreendem administrar ao mamífero um RNAi que compre- ende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que compreende a sequência 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8 ) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nu- cleico que compreende a sequência 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA- 3' (SEQ ID NO: 37), em que a primeira fita e a segunda fita formam um duplex. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para ini- bir a expressão de SNCA em um mamífero com uma sinucleinopatia neurodegenerativa que compreendem administrar ao mamífero um RNAi que compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que compreende a sequência 5'-UGGGCACAUUGGAA- CUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que compreende a sequência 5'-UGCUCAGU- CAAUGUGCCUA-3' (SEQ ID NO: 37), em que a primeira fita e a se- gunda fita formam um duplex. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para inibir o acúmulo de SNCA em uma célula de um mamífero com uma sinucleinopatia neurodegenerativa que compreen- dem administrar ao mamífero um RNAi que compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que compreende a se- quência 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que compre- ende a sequência 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3' (SEQ ID NO: 37), em que a primeira fita e a segunda fita formam um duplex. Em al- gumas modalidades, o miRNA compreende uma protuberância interna gerada pela eliminação de 2 nucleotídeos nas bases 9-10 na fita passa- geira do miRNA, contando a partir do início da vertente de passageiros. Em algumas modalidades, a primeira fita compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem mais de cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com SEQ ID NO: 8 Em algumas modalidades, a segunda fita compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem mais de cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com SEQ ID NO: 37 Em algumas modalidades, a primeira fita e a segunda fita são ligadas atra- vés de uma sequência de alça. Em algumas modalidades, a sequência de alça é 5'-GUUUUGGCCACUGACUGAC-3' (SEQ ID NO: 60).
[0102] Em algumas modalidades, o RNAi é um pequeno RNA inibi- dor (siRNA), um microRNA (miRNA) ou um pequeno RNA em gancho (shRNA). Um pequeno RNA inibidor ou interferente (siRNA) é conhecido na técnica como uma molécula de RNA fita dupla de aproximadamente 19-25 (por exemplo, 19-23) pares de bases de comprimento que induz ao RNAi em uma célula. Um pequeno RNA em gancho (shRNA) é co- nhecido na técnica como uma molécula de RNA que compreende apro- ximadamente 19-25 (por exemplo, 19-23) pares de bases de RNA fita dupla ligados através de uma alça curta (por exemplo, ~ 4-11 nucleotí- deos) que induz ao RNAi em uma célula.
[0103] Em algumas modalidades, o miRNA compreende uma se- quência guia que é cerca de 90 % idêntica à SEQ ID NO: 24. Em algu- mas modalidades, o miRNA compreende uma sequência guia que é cerca de 90 % idêntica, 91 % idêntica, 92 % idêntica, 93 % idêntica, 94% idêntica, 95 % idêntica, 96 % idêntica, 97 % idêntica, 98 % idêntica, 99% idêntica ou 100 % idêntica à SEQ ID NO: 24.
[0104] Em algumas modalidades, o miRNA compreende uma se- quência não guia que é cerca de 90 % idêntica à SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, o miRNA compreende uma sequência não guia que é cerca de 90 % idêntica, 91 % idêntica, 92 % idêntica, 93 % idên- tica, 94 % idêntica, 95 % idêntica, 96 % idêntica, 97 % idêntica, 98% idêntica, 99 % idêntica ou 100 % idêntica à SEQ ID NO: 53. Qualquer RNAi descrito no presente documento (por exemplo, como parte de um vetor de rAAV) pode encontrar uso, inter alia, no tratamento de uma si- nucleinopatia neurodegenerativa. Em outro aspecto, qualquer RNAi descrito na Tabela 1 pode ser usado no tratamento de uma sinucleino- patia neurodegenerativa.
[0105] Em algumas modalidades, o miRNA compreende uma se- quência guia que é cerca de 90 % idêntica à SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o miRNA compreende uma sequência guia que é cerca de 90 % idêntica, 91 % idêntica, 92 % idêntica, 93 % idêntica, 94% idên- tica, 95 % idêntica, 96 % idêntica, 97 % idêntica, 98 % idêntica, 99% idêntica ou 100 % idêntica à SEQ ID NO: 8.
[0106] Em algumas modalidades, o miRNA compreende uma se- quência não guia que é cerca de 90 % idêntica à SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, o miRNA compreende uma sequência não guia que é cerca de 90 % idêntica, 91 % idêntica, 92 % idêntica, 93 % idên- tica, 94 % idêntica, 95 % idêntica, 96 % idêntica, 97 % idêntica, 98 % idêntica, 99 % idêntica ou 100 % idêntica à SEQ ID NO: 37. Qualquer RNAi descrito no presente documento (por exemplo, como parte de um vetor de rAAV) pode encontrar uso, inter alia, no tratamento de uma si- nucleinopatia neurodegenerativa. Em outro aspecto, qualquer RNAi descrito na Tabela 1 pode ser usado no tratamento de uma sinucleino- patia neurodegenerativa.
[0107] Em algumas modalidades, a primeira fita e a segunda fita são ligadas através de um RNA capaz de formar uma estrutura de alça. Conforme é comumente conhecido na técnica, uma estrutura de alça de RNA (por exemplo, uma haste-alça ou em gancho) é formada quando uma molécula de RNA compreende duas sequências de RNA que se combinam entre si, separadas por uma sequência de RNA que não se emparelha. Por exemplo, uma estrutura de alça pode se formar na mo- lécula de RNA A-B-C se as sequências A e C forem complementares ou parcialmente complementares, de modo a formar pares de bases, mas as bases na sequência B não formam pares de bases.
[0108] Em algumas modalidades, o RNA capaz de formar uma es- trutura de alça compreende a partir de 4 a 50 nucleotídeos. Em deter- minadas modalidades, o RNA capaz de formar uma estrutura de alça compreende 13 nucleotídeos. Em determinadas modalidades, o RNA capaz de formar uma estrutura de alça compreende a sequência de nu- cleotídeos de SEQ ID NO: 60. Em algumas modalidades, o genoma do vetor compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de SEQ ID NO: 60.
[0109] Em algumas modalidades, a distribuição de partículas virais recombinantes é através de injeção de partículas virais no cérebro. Em algumas modalidades, a distribuição de partículas virais recombinantes é através de injeção de partículas virais no corpo estriado. A adminis- tração intraestriatal distribui partículas virais recombinantes a uma área do cérebro, ao corpo estriado (incluindo o putâmen e o núcleo caudado), a qual é altamente afetada por uma sinucleinopatia neurodegenerativa. Além disso, e sem desejar estar limitado à teoria, acredita-se que as partículas virais recombinantes (por exemplo, partículas de rAAV) inje- tadas no corpo estriado também podem ser dispersas (por exemplo, por meio de transporte retrógrado) para outras áreas do cérebro incluindo, sem limitação, áreas de projeção (por exemplo, o córtex ou substância negra). Em algumas modalidades, as partículas virais recombinantes são distribuídas através de distribuição intensificada por convecção (por exemplo, distribuição intensificada por convecção ao corpo estriado).
[0110] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para o tra- tamento de uma sinucleinopatia neurodegenerativa em um mamífero que compreendem administrar ao mamífero a composição farmacêutica da presente invenção. Em alguns aspectos, a invenção fornece méto- dos para inibir o acúmulo de SNCA em uma célula de um mamífero com uma sinucleinopatia neurodegenerativa que compreendem administrar ao mamífero a composição farmacêutica da presente invenção. Em al- guns aspectos, a invenção fornece métodos para inibir a expressão de SNCA em um mamífero com uma sinucleinopatia neurodegenerativa que compreendem administrar ao mamífero a composição farmacêutica da presente invenção. Em algumas modalidades, a SNCA é uma SNCA mutante (por exemplo, mutações em SNCA humana que incluem uma ou mais de A53T, E46K, A30P, G51D, H50Q, A53E, A29S, A18T e du- plicações e triplicações do locus gênico). Em algumas modalidades, a expressão e/ou acúmulo de uma SNCA de tipo selvagem também é ini- bida. Conforme descrito no presente documento, e sem desejar estar limitado à teoria, acredita-se que a inibição da expressão e/ou acúmulo de SNCA mutante em um mamífero com sinucleinopatia neurodegene- rativa é altamente benéfica, porém, a inibição da expressão e/ou acú- mulo de SNCA de tipo selvagem no mesmo mamífero como um efeito colateral (por exemplo, de um RNAi da presente invenção) pode ser bem tolerada (por exemplo, produz poucos ou nenhum efeito colateral não intencional).
[0111] Em algumas modalidades, uma célula compreende um vetor (por exemplo, um vetor que compreende uma construção de expressão que codifica um RNAi da presente invenção). Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de rAAV. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor adenoviral recombinante, um vetor lentiviral recombinante ou um vetor do vírus do herpes simplex (HSV) recombinante. Em algumas mo- dalidades, a célula é uma célula do sistema nervoso central (SNC). Em algumas modalidades, a célula é uma célula HEK293.
[0112] Em algumas modalidades, a administração de uma quanti- dade eficaz de partículas virais recombinantes que compreendem um vetor que codifica um RNAi da presente invenção transduz neurônios (por exemplo, neurônios estriatais, tais como neurônios espinhosos) em ou próximo ao local de administração. Em algumas modalidades, mais de cerca de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50%, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % ou 100 % dos neurônios são trans- duzidos. Em algumas modalidades, cerca de 5 % a cerca de 100 %, cerca de 10 % a cerca de 50 %, cerca de 10 % a cerca de 30 %, cerca de 25 % a cerca de 75 %, cerca de 25 % a cerca de 50 % ou cerca de 30 % a cerca 50 % dos neurônios são transduzidos. Métodos para iden- tificar neurônios transduzidos por partículas virais recombinantes que expressam miRNA são conhecidos na técnica; por exemplo, imuno-his- toquímica, detecção de RNA (por exemplo, qPCR, Northern blotting, RNA-seq, hibridização in situ e assim por diante) ou o uso de um mar- cador coexpresso, tal como proteína fluorescente verde intensificada, podem ser usados para detectar a expressão.
[0113] Em algumas modalidades da invenção, os métodos compre- endem administrar ao cérebro de um mamífero uma quantidade eficaz de partículas virais recombinantes que compreendem um vetor que co- difica um RNAi da presente invenção para o tratamento de um mamí- fero, por exemplo, um ser humano, com uma sinucleinopatia neurode- generativa. Em algumas modalidades, a composição é injetada em um ou mais locais no cérebro para permitir a expressão de um RNAi da presente invenção pelo menos nos neurônios. Em algumas modalida- des, a composição é injetada em qualquer um de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais de dez locais no cérebro. Em algumas modalidades, a composição é injetada no corpo estriado. Em algumas modalidades, a composição é injetada no estriado dorsal. Em algumas modalidades, a composição é injetada no putâmen. Em algu- mas modalidades, a composição é injetada no núcleo caudado. Em al- gumas modalidades, a composição é injetada no putâmen e no núcleo caudado. Em algumas modalidades, as vias de administração podem incluir a distribuição ao CSF via injeção intracerebroventricular, cisterna magna ou intratecal. Em algumas modalidades, a administração tam- bém pode incluir a distribuição intravenosa do vetor viral.
[0114] Em algumas modalidades, as partículas virais recombinan- tes são administradas a um hemisfério cerebral. Em algumas modalida- des, as partículas virais recombinantes são administradas a ambos os hemisférios cerebrais.
[0115] Em algumas modalidades, as partículas virais recombinan- tes são administradas em mais de um local simultânea ou sequencial- mente. Em algumas modalidades, múltiplas injeções de partículas virais recombinantes não têm mais do que uma hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, nove horas, doze horas ou 24 horas de intervalo entre si.
[0116] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para o tratamento de um ser humano com uma sinucleinopatia neuro- degenerativa ao administrar uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um vetor viral recombinante que codifica um RNAi da presente invenção para suprimir a atividade de uma SNCA mutante. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica com- preende um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[0117] Em algumas modalidades, os métodos compreendem admi- nistrar uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um vetor viral recombinante que codifica um RNAi da pre- sente invenção para suprimir a atividade de uma SNCA mutante. Em algumas modalidades, a titulação viral das partículas virais (por exem- plo, partículas de rAAV) é pelo menos cerca de 5 × 1012, 6 × 1012, 7 ×
1012, 8 × 1012, 9 × 1012, 10 × 1012, 11 × 1012, 15 × 1012, 20 × 1012, 25 × 1012, 30 × 1012 ou 50 × 1012 cópias genômicas/mL.
Em algumas moda- lidades, a titulação viral das partículas virais (por exemplo, partículas de rAAV) é cerca de qualquer um de 5 × 1012 a 6 × 1012, 6 × 1012 a 7 × 1012, 7 × 1012 a 8 × 1012, 8 × 1012 a 9 × 1012, 9 × 1012 a 10 × 1012, 10 × 1012 a 11 × 1012, 11 × 1012 a 15 × 1012, 15 × 1012 a 20 × 1012, 20 × 1012 a 25 × 1012, 25 × 1012 a 30 × 1012, 30 × 1012 a 50 × 1012 ou 50 × 1012 a 100 × 1012 cópias genômicas/mL.
Em algumas modalidades, a titulação viral das partículas virais (por exemplo, partículas de rAAV) é cerca de qual- quer um de 5 × 1012 a 10 × 1012, 10 × 1012 a 25 × 1012 ou 25 × 1012 a 50 × 1012cópias genômicas/mL.
Em algumas modalidades, a titulação viral das partículas virais (por exemplo, partículas de rAAV) é pelo menos cerca de qualquer um de 5 × 109, 6 × 109, 7 × 109, 8 × 109, 9 × 109, 10 × 109, 11 × 109, 15 × 109, 20 × 109, 25 × 109, 30 × 109 ou 50 × 109 unidades de transdução/mL.
Em algumas modalidades, a titulação viral das partículas virais (por exemplo, partículas de rAAV) é cerca de qual- quer um de 5 × 109 a 6 × 109, 6 × 109 a 7 × 109, 7 × 109 a 8 × 109, 8 × 109 a 9 × 109, 9 × 109 a 10 × 109, 10 × 109 a 11 × 109, 11 × 109 a 15 × 109, 15 × 109 a 20 × 109, 20 × 109 a 25 × 109, 25 × 109 a 30 × 109, 30 × 109 a 50 × 109 ou 50 × 109 a 100 × 109 unidades de transdução/mL.
Em algumas modalidades, a titulação viral das partículas virais (por exem- plo, partículas de rAAV) é cerca de qualquer um de 5 × 109 a 10 × 109, 10 × 109 a 15 × 109, 15 × 109 a 25 × 109 ou 25 × 109 a 50 × 109 unidades de transdução/mL.
Em algumas modalidades, a titulação viral das partí- culas virais (por exemplo, partículas de rAAV) é pelo menos qualquer um de cerca de 5 × 1010, 6 × 1010, 7 × 1010, 8 × 1010, 9 × 1010, 10 × 1010, 11 × 1010, 15 × 1010, 20 × 1010, 25 × 1010, 30 × 1010, 40 × 1010 ou 50 × 1010 unidades infecciosas/mL.
Em algumas modalidades, a titulação vi- ral das partículas virais (por exemplo, partículas de rAAV) é pelo menos qualquer um de cerca de 5 × 1010 a 6 × 1010, 6 × 1010 a 7 × 1010, 7 × 1010 a 8 × 1010, 8 × 1010 a 9 × 1010, 9 × 1010 a 10 × 1010, 10 × 1010 a 11 × 1010, 11 × 1010 a 15 × 1010, 15 × 1010 a 20 × 1010, 20 × 1010 a 25 × 1010, 25 × 1010 a 30 × 1010, 30 × 1010 a 40 × 1010, 40 × 1010 a 50 × 1010 ou 50 × 1010 a 100 × 1010 unidades infecciosas/mL. Em algumas modalidades, a titulação viral das partículas virais (por exemplo, partículas de rAAV) é pelo menos qualquer um de cerca de 5 × 1010 a 10 × 1010, 10 × 1010 a 15 × 1010, 15 × 1010 a 25 × 1010 ou 25 × 1010 a 50 × 1010 unidades infecciosas/mL.
[0118] Em algumas modalidades, a dose de partículas virais admi- nistradas ao indivíduo é de pelo menos cerca de 1 × 108 a cerca de 1 × 1013 cópias genômicas/kg de peso corporal. Em algumas modalidades, a dose de partículas virais administradas ao indivíduo é cerca de 1 × 108 a cerca de 1 × 1013 cópias genômicas/kg de peso corporal.
[0119] Em algumas modalidades, a quantidade total de partículas virais administradas ao indivíduo é de pelo menos cerca de 1 × 109 a cerca de 1 × 1014 cópias genômicas. Em algumas modalidades, a quan- tidade total de partículas virais administradas ao indivíduo é cerca de 1 × 109 a cerca de 1 × 1014 cópias genômicas.
[0120] Em algumas modalidades da invenção, o volume da compo- sição injetada no corpo estriado é mais de cerca de 1 µl, 2 µl, 3 µl, 4 µl, 5 µl, 6 µl, 7 µl, 8 µl, 9 µl, 10 µl, 15 µl, 20 µl, 25 µl, 50 µl, 75 µl, 100 µl, 200 µl, 300 µl, 400 µl, 500 µl, 600 µl, 700 µl, 800 µl, 900 µl ou 1 mL ou qualquer quantidade intermediária.
[0121] Em algumas modalidades, um primeiro volume da composi- ção é injetado em uma primeira região do cérebro e um segundo volume da composição é injetado em uma segunda região do cérebro. Por exemplo, em algumas modalidades, um primeiro volume da composição é injetado no núcleo caudado e um segundo volume da composição é injetado no putâmen. Em algumas modalidades, um 1X o volume da composição é injetado no núcleo caudado e 1,5X, 2X, 2,5X, 3X, 3,5X ou
4X o volume da composição é injetado no putâmen, onde X é um volume que é mais de cerca de 1 µl, 2 µl, 3 µl, 4 µl, 5 µl, 6 µl, 7 µl, 8 µl, 9 µl, 10 µl, 15 µl, 20 µl, 25 µl, 50 µl, 75 µl, 100 µl, 200 µl, 300 µl, 400 µl, 500 µl, 600 µl, 700 µl, 800 µl, 900 µl ou 1 mL ou qualquer quantidade interme- diária.
[0122] As composições da invenção (por exemplo, partículas virais recombinantes que compreendem um vetor que codifica um RNAi da presente invenção) podem ser usadas individualmente ou em combina- ção com um ou mais agentes terapêuticos adicionais para o tratamento de uma sinucleinopatia neurodegenerativa. O intervalo entre a adminis- tração sequencial pode ser em termos de pelo menos (ou, alternativa- mente, menos de) minutos, horas ou dias.
[0123] Qualquer RNAi, construção de expressão, vetor ou célula descrito na presente invenção pode ser usado em qualquer método acima. Em algumas modalidades, qualquer RNAi descrito na Tabela 1, construção de expressão, vetor ou célula que compreende o RNAi na Tabela 1 pode ser usado em qualquer método descrito acima. VI. Construções e Vetores de Expressão de RNAi
[0124] A invenção fornece construções de expressão, vetores e par- tículas virais para a expressão do RNAi descrito no presente docu- mento.
[0125] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica um RNAi da presente invenção compreende um scaffold de miRNA heteró- logo. Em algumas modalidades, o uso de um scaffold de miRNA hete- rólogo é usado para modular a expressão de miRNA; por exemplo, para aumentar a expressão de miRNA ou diminuir a expressão de miRNA. Qualquer scaffold de miRNA conhecido na técnica pode ser usado. Em algumas modalidades, o scaffold de miRNA é derivado de um scaffold de miR-155 (consulte, por exemplo, Lagos-Quintana, M. et al. (2002) Curr. Biol. 12: 735-9 e o Kit de vetor de expressão de RNAi BLOCK-iT™
Pol II miR Invitrogen™ da Life Technologies, Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA). Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica um RNAi da presente invenção compreende um scaffold de miRNA. Em algumas modalidades, o scaffold de miRNA compreende a sequência ctggaggcttgctgaaggctgtatgctgcaggacacaaggcctgttactagcactcacatg- gaacaaatggc (SEQ ID NO: 67), em que o miRNA é inserido entre os resíduos gc em negrito.
[0126] Em algumas modalidades, o miRNA no scaffold compreende a sequência ctggaggcttgctgaaggctgtatgctgtacgatctaatatcgctcgttttgg- ccactgac- tgacgagcgatatgatcgtacgacaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaat ggc, onde o texto regular sublinhado representa o flanco 5', o texto em itálico representa a sequência guia, o texto em negrito representa a alça, o texto em itálico sublinhado representa a sequência não guia e o texto regular representa o flanco 3'.
[0127] Em algumas modalidades, o RNAi tem como alvo o RNA que codifica um polipeptídeo associado a uma sinucleinopatia neurodege- nerativa. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é alfa-sinucleína. Sem desejar estar limitado à teoria, acredita-se que um RNAi pode ser usado para reduzir ou eliminar a expressão e/ou atividade de um poli- peptídeo cujo ganho de função foi associado a uma sinucleinopatia neu- rodegenerativa. Exemplos não limitativos de uma sinucleinopatia neuro- degenerativa da invenção que pode ser tratada por um polipeptídeo te- rapêutico ou ácido nucleico terapêutico da invenção (genes exemplifica- tivos que podem ser direcionados ou alvejados são fornecidos entre pa- rênteses para cada transtorno) incluem mal de Parkinson (SNCA), atro- fia de múltiplos sistemas ou MSA (SNCA) e demência com corpos de Lewy (SNCA).
[0128] Em algumas modalidades, o transgene (por exemplo, um RNAi da presente invenção) está operativamente ligado a um promotor.
Promotores exemplificativos incluem, porém sem limitações, o promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMV), a LTR de RSV, a LTR de MoMLV, o promotor de fosfoglicerato quinase-1 (PGK), um promotor do vírus símio 40 (SV40) e um promotor CK6, um promotor de transtirretina (TTR), um promotor TK, um promotor responsivo à tetraciclina (TRE), um promotor de HBV, um promotor de hAAT, um promotor LSP, promo- tores específicos para o fígado quiméricos (LSPs), o promotor E2F, o promotor de telomerase (hTERT); o estimulador de citomegalovírus/pro- motor de beta-actina de galinha/β-globina de coelho (promotor CAG; Niwa et al., Gene, 1991, 108 (2): 193-9) e o promotor de fator de alon- gamento 1-alfa (EF1-alfa) (Kim et al., Gene, 1990, 91 (2): 217-23 e Guo et al., Gene Ther., 1996, 3 (9): 802-10). Em algumas modalidades, o promotor compreende um promotor de β-glucuronidase humana ou um intensificador de citomegalovírus ligado a um promotor de β-actina de galinha (CBA). O promotor pode ser um promotor constitutivo, indutível ou repressível. Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor recombinante que compreende um ácido nucleico que codifica um trans- gene heterólogo da presente invenção operativamente ligado a um pro- motor de CBA. Promotores exemplificativos e descrições podem ser en- contrados, por exemplo, na Publicação de Patente Norte-Americana N°
20140335054. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de CBA, um promotor de CBA mínimo, um promotor de CMV ou um pro- motor GUSB. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de hEF1a.
[0129] Exemplos de promotores constitutivos incluem, sem limita- ção, o promotor de LTR do vírus do sarcoma de Rous retroviral (RSV) (opcionalmente com o intensificador de RSV), o promotor de citomega- lovírus (CMV) (opcionalmente com o intensificador de CMV) [consulte, por exemplo, Boshart et al., Cell, 41: 521-530 (1985)], o promotor de SV40, o promotor de di-hidrofolato redutase, o promotor de -actina, o promotor de fosfoglicerol quinase (PGK) e o promotor de EF1a [Invitro- gen].
[0130] Promotores indutíveis permitem a regulação da expressão gênica e podem ser regulados por compostos fornecidos exogena- mente, fatores ambientais, tal como temperatura, ou a presença de um estado fisiológico específico, por exemplo, fase aguda, um estado de diferenciação particular da célula ou na replicação células apenas. Pro- motores e sistemas indutíveis estão disponíveis a partir de uma varie- dade de fontes comerciais incluindo, sem limitação, Invitrogen, Clontech e Ariad. Muitos outros sistemas foram descritos e podem ser facilmente selecionados por aqueles versados na técnica. Exemplos de promoto- res indutíveis regulados por promotores fornecidos exogenamente in- cluem o promotor de metalotionina de ovelha indutível por zinco (MT), o promotor do vírus do tumor mamário de camundongo indutível por de- xametasona (Dex) (MMTV), o sistema promotor de polimerase T7 (do- cumento WO 98/10088); o promotor de ecdisona de insetos (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3346-3351 (1996)), o sistema repressível de tetraciclina (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551 (1992)), o sistema indutível por tetraciclina (Gossen et al., Science, 268: 1766-1769 (1995); consulte também Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2: 512-518 (1998)), o sistema indutível por RU486 (Wang et al., Nat. Biotech., 15: 239-243 (1997) e Wang et al., Gene Ther., 4: 432-441 (1997)) e o sistema indutível por rapamicina (Magari et al., J. Clin. In- vest., 100: 2865-2872 (1997)). Ainda outros tipos de promotores indutí- veis que podem ser úteis neste contexto são aqueles que são regulados por um estado fisiológico específico, por exemplo, temperatura, fase aguda, um estado de diferenciação particular da célula ou apenas em células em replicação.
[0131] Em outra modalidade, será usado o promotor nativo, ou fra-
gmento do mesmo, para o transgene. O promotor nativo pode ser pre- ferido quando se deseja que a expressão do transgene imite a expres- são nativa. O promotor nativo pode ser usado quando a expressão do transgene deve ser regulada temporalmente ou pelo desenvolvimento ou de uma maneira específica para tecido ou em resposta a estímulos transcricionais específicos. Em uma outra modalidade, outros elemen- tos de controle de expressão nativa, tais como elementos intensificado- res, sítios de poliadenilação ou sequências de consenso de Kozak tam- bém podem ser usados para imitar a expressão nativa.
[0132] Em algumas modalidades, as sequências regulatórias con- ferem capacidades de expressão gênica específicas para tecido. Em al- guns casos, as sequências regulatórias específicas para tecido se ligam a fatores de transcrição específicos para tecido que induzem à transcri- ção de uma maneira específica para tecido. Estas sequências regulató- rias específicas para tecido (por exemplo, promotores, intensificadores, etc.) são bem conhecidas na técnica. Sequências regulatórias específi- cas para tecido exemplificativas incluem, porém sem limitações, os se- guintes promotores específicos para tecido: neuronal, tal como promotor de enolase específico para neurônios (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13: 503-15 (1993) )), promotor do gene da cadeia leve de neurofilamentos (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5611-5 (1991)) e o promotor do gene vgf específico para neurônios (Piccioli et al., Neuron, 15: 373-84 (1995)). Em algumas modalidades, o promotor específico para tecido é um promotor de um gene selecionado a partir de: núcleos neuronais (NeuN), proteína ácida fibrilar glial (GFAP), poli- pose adenomatosa coli (APC) e molécula 1 adaptadora de ligação a cálcio ionizado (Iba-1). Outros promotores específicos para tecido apro- priados serão evidentes para aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de Beta-actina de galinha.
[0133] Em algumas modalidades, o promotor expressa o ácido nu- cleico heterólogo em uma célula do SNC. Como tal, em algumas moda- lidades, um polipeptídeo terapêutico ou um ácido nucleico terapêutico da invenção pode ser usado para tratar um transtorno do SNC. Em al- gumas modalidades, o promotor expressa o ácido nucleico heterólogo em uma célula cerebral. Uma célula cerebral pode referir-se a qualquer célula cerebral conhecida na técnica incluindo, sem limitação, um neu- rônio (tal como um neurônio sensorial, neurônio motor, interneurônio, neurônio dopaminérgico, neurônio espinhoso médio, neurônio colinér- gico, neurônio GABAérgico, neurônio piramidal, etc.), uma célula glial (tal como microglia, macroglia, astrócitos, oligodendrócitos, células ependimárias, glia radial, etc.), uma célula do parênquima cerebral, cé- lula microglial, célula ependemática e/ou uma célula de Purkinje. Em algumas modalidades, o promotor expressa o ácido nucleico heterólogo em um neurônio e/ou célula glial. Em algumas modalidades, o neurônio é um neurônio espinhoso médio do núcleo caudado, um neurônio espi- nhoso médio do putâmen, um neurônio da camada IV do córtex IV e/ou um neurônio da camada V do córtex.
[0134] Vários promotores que expressam transcritos (por exemplo, um transgene heterólogo) em células do SNC, células cerebrais, neurô- nios e células gliais são conhecidos na técnica e descritos no presente documento. Tais promotores podem compreender sequências de con- trole normalmente associadas ao gene selecionado ou sequências de controle heterólogas. Frequentemente, sequências de controle heteró- logas úteis incluem aquelas derivadas de sequências que codificam ge- nes de mamíferos ou virais. Exemplos incluem, sem limitação, o promo- tor inicial de SV40, promotor de LTR do vírus do tumor mamário de ca- mundongo, o promotor tardio principal de adenovírus (Ad MLP), um pro- motor do vírus do herpes simplex (HSV), um promotor de citomegaloví- rus (CMV), tal como a região do promotor inicial imediato de CMV
(CMVIE), um promotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV), promotores sintéticos, promotores híbridos e assim por diante. Além disso, sequên- cias derivadas de genes não virais, tal como o gene de metalotioneína de murino, também podem ser usadas. Estas sequências promotoras estão comercialmente disponíveis, por exemplo, a partir da Stratagene (San Diego, CA). Podem ser usados promotores específicos para o SNC e promotores indutíveis. Exemplos de promotores específicos para o SNC incluem, sem limitação, aqueles isolados de genes específicos do SNC, tais como proteína básica mielina (MBP), proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e enolase específica para neurônios (NSE). Exemplos de promotores indutíveis incluem elementos responsivos ao DNA para ecdisona, tetraciclina, metalotioneína e hipóxia, dentre outros.
[0135] A presente invenção considera o uso de um genoma viral recombinante para a introdução de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam um RNAi conforme descrito no presente docu- mento ou engolfamento em uma partícula viral de AAV. O genoma viral recombinante pode incluir qualquer elemento para estabelecer a ex- pressão de um RNAi, por exemplo, um promotor, um ácido nucleico he- terólogo, uma ITR, um elemento de ligação ao ribossoma, terminador, intensificador, marcador de seleção, íntron, sinal de poliA e/ou origem de replicação. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV compreende um ou mais de um intensificador, um par de doador/aceitador de emenda, um sítio de fixação à matriz ou um sinal de poliadenilação.
[0136] Em algumas modalidades, a administração de uma quanti- dade eficaz de partículas de rAAV que compreendem um vetor que co- difica um RNAi transduz células (por exemplo, células do SNC, células cerebrais, neurônios e/ou células gliais) em ou próximo do local de ad- ministração (por exemplo, o estriado e/ou córtex) ou mais distal ao local de administração. Em algumas modalidades, mais de cerca de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65
%, 70 %, 75 % ou 100 % dos neurônios são transduzidos. Em algumas modalidades, cerca de 5 % a cerca de 100 %, cerca de 10 % a cerca de 50 %, cerca de 10 % a cerca de 30 %, cerca de 25 % a cerca de 75 %, cerca de 25 % a cerca de 50 %, ou cerca de 30 % a cerca 50 % dos neurônios são transduzidos. Métodos para identificar neurônios trans- duzidos por partículas virais recombinantes que expressam miRNA são conhecidos na técnica; por exemplo, imuno-histoquímica, detecção de RNA (por exemplo, qPCR, Northern blotting, RNA-seq, hibridização in situ e assim por diante) ou o uso de um marcador coexpresso, tal como proteína fluorescente verde intensificada, podem ser usados para de- tectar a expressão.
[0137] Em alguns aspectos, a invenção fornece partículas virais que compreendem um genoma de autocomplementação recombinante (por exemplo, um vetor de rAAV autocomplementar). Partículas virais de AAV com genomas de vetor autocomplementar e métodos de uso de genomas de AAV autocomplementar são descritos nas Patentes Norte- Americanas Nos 6.596.535; 7.125.717; 7.465.583; 7.785.888; 7.790.154;
7.846.729; 8.093.054; e 8.361.457; e Wang Z., et al. (2003) Gene Ther 10: 2105-2111, cada um dos quais é incorporado ao presente docu- mento a título de referência na íntegra. Um rAAV que compreende um genoma de autocomplementação formará rapidamente uma molécula de DNA fita dupla em virtude de suas sequências de complementação parcial (por exemplo, fitas complementares codificantes e não codifican- tes de um ácido nucleico heterólogo). Em algumas modalidades, o vetor compreende a primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica o ácido nucleico heterólogo e uma segunda sequência de ácidos nuclei- cos que codifica um complemento do ácido nucleico, onde a primeira sequência de ácidos nucleicos pode formar pares de bases intra fita com a segunda sequência de ácidos nucleicos ao longo da maioria ou todo o seu comprimento.
[0138] Em algumas modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos heteróloga que codifica um RNAi e uma segunda sequência de ácidos nucleicos heteróloga que codifica o complemento do RNAi estão ligadas através de uma ITR mutante (por exemplo, a ITR correta). Em algumas modalidades, a ITR compreende a sequência de polinucle- otídeos 5'-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCC GGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG-3' (SEQ ID NO: 69). A ITR mutante compreende uma eliminação da região D que compreende a sequência de resolução terminal. Como um resul- tado, ao replicar um genoma viral de AAV, as proteínas rep não clivarão o genoma viral na ITR mutante e, como tal, um genoma viral recombi- nante que compreende o seguinte, na ordem de 5' para 3', será engol- fado em uma capsídeo viral: uma ITR de AAV, a primeira sequência de polinucleotídeos heteróloga que inclui sequências regulatórias, a ITR de AAV mutante, a segunda sequência de polinucleotídeos heteróloga na orientação reversa à primeira sequência de polinucleotídeos heteróloga e uma terceira ITR de AAV. VII. Partículas Virais e Métodos de Produção de Partículas Virais
[0139] A invenção fornece, inter alia, partículas virais recombinan- tes que compreendem um ácido nucleico que codifica um RNAi da pre- sente invenção, bem como métodos de uso das mesmas para tratar uma doença ou transtorno em um mamífero; por exemplo, uma sinu- cleinopatia neurodegenerativa. Partículas Virais
[0140] A invenção fornece partículas virais que compreendem o RNAi conforme descrito no presente documento. Em algumas modali- dades, a invenção fornece partículas virais para a distribuição do RNAi da invenção conforme descrito no presente documento. Por exemplo, a invenção fornece métodos de uso de partículas virais recombinantes para distribuir um RNAi para tratar uma doença ou transtorno em um mamífero; por exemplo, partículas de rAAV que compreendem um RNAi para tratar uma sinucleinopatia neurodegenerativa.
Em algumas moda- lidades, a partícula viral recombinante é uma partícula de AAV recombi- nante.
Em algumas modalidades, a partícula viral é uma partícula de AAV recombinante que compreende um ácido nucleico que compre- ende uma sequência de um RNAi da presente invenção flanqueado por uma ou duas ITRs.
O ácido nucleico é encapsidado na partícula de AAV.
A partícula de AAV também compreende proteínas da capsídeo.
Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende a(s) sequência(s) codificantes de interesse (por exemplo, ácido nucleico e RNAi da pre- sente invenção) componente(s) operativamente ligada(s) na direção de transcrição, sequências de controle, incluindo sequências de início e tér- mino de transcrição, deste modo, formando uma construção de expres- são.
A construção de expressão é flanqueada nas extremidades 5' e 3' por pelo menos uma sequência de ITR de AAV funcional.
Por "sequên- cias de ITR de AAV funcionais" entenda-se que as sequências de ITR funcionam conforme pretendido para o resgate, replicação e engolfa- mento do vírion de AAV.
Consulte Davidson et al., PNAS, 2000, 97 (7) 3428-32; Passini et al., J.
Virol., 2003, 77 (12): 7034-40; e Pechan et al., Gene Ther., 2009, 16: 10-16, todos os quais são incorporados ao pre- sente documento a título de referência na íntegra.
Para praticar alguns aspectos da invenção, os vetores recombinantes compreendem pelo menos todas as sequências de AAV essenciais para encapsidação e as estruturas físicas para infecção pelo rAAV.
As ITRs de AAV para uso nos vetores da invenção não precisam ter uma sequência de nucleotí- deos de tipo selvagem (por exemplo, conforme descrito em Kotin, Hum.
Gene Ther., 1994, 5: 793-801), e podem ser alteradas pela inserção, eliminação ou substituição de nucleotídeos ou as ITRs de AAV podem ser derivadas de qualquer um dos vários sorotipos de AAV.
Mais de 40 sorotipos de AAV são atualmente conhecidos, e novos sorotipos e vari- antes de sorotipos existentes continuam a ser identificados. Consulte Gao et al., PNAS, 2002, 99 (18): 11854-6; Gao et al., PNAS, 2003, 100 (10): 6081-6; e Bossis et al., J. Virol., 2003, 77 (12): 6799-810. O uso de qualquer sorotipo de AAV é considerado dentro do escopo da presente invenção. Em algumas modalidades, um vetor de rAAV é um vetor deri- vado de um sorotipo de AAV que inclui, sem limitação, ITR de AAVs da capsídeo de sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV de cabra, AAV bovino ou AAV de camun- dongo ou similar. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende uma ITR da capsídeo de sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV, AAV de cabra, AAV bo- vino ou AAV de camundongo ou similar. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV codifica ainda um RNAi conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, a partícula de rAAV compreende uma capsídeo de AAV1, uma capsídeo de AAV2HBKO (por exemplo, conforme descrito no documento WO2015168666), uma capsídeo de AAV9, uma capsídeo de PHP.B, uma capsídeo de PHP.eB ou uma capsídeo de Olig001.
[0141] Por exemplo, o ácido nucleico no AAV pode compreender pelo menos uma ITR de qualquer sorotipo de AAV considerado no pre- sente documento e pode ainda codificar um RNAi que compreende uma primeira fita e uma segunda fita, em que a) a primeira fita e a segunda fita formam um duplex; b) a primeira fita compreende uma região guia, e c) a segunda fita compreende uma região não guia, em que a região não guia compreende uma eliminação de dois nucleotídeos nas bases 9 e 10 para criar uma protuberância na fita guia. Em algumas modalida- des, o rAAV pode compreender uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que compreende a sequência 5'-UGCUCUUUG- GUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) e uma segunda fita que com- preende um segundo ácido nucleico que compreende a sequência 5'- GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3' (SEQ ID NO: 53). Em algumas moda- lidades, o rAAV pode compreender uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que compreende a sequência 5'-UGGGCA- CAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita que com- preende um segundo ácido nucleico que compreende a sequência 5'- UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3' (SEQ ID NO: 37). Em algumas moda- lidades, o ácido nucleico no AAV compreende, a partir de 5' para 3', um ácido nucleico que codifica o seguinte: uma ITR (por exemplo, uma ITR de AAV2), um promotor, um ácido nucleico que codifica um RNAi con- forme descrito no presente documento, um sinal de poliadenilação e uma ITR de AAV (por exemplo, uma ITR de AAV2). Em algumas moda- lidades, o ácido nucleico no AAV compreende, a partir de 5' para 3', um ácido nucleico que codifica o seguinte: uma ITR (por exemplo, uma ITR de AAV2), um promotor, um ácido nucleico que codifica um RNAi que compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nu- cleico que compreende a sequência 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCA- GCC-3' (SEQ ID NO: 24) e uma segunda fita que compreende um se- gundo ácido nucleico que compreende a sequência 5'-GGCUGAGAAC- CAAAGAGUA-3' (SEQ ID NO: 53), um sinal de poliadenilação e uma ITR de AAV (por exemplo, uma ITR de AAV2). Em algumas modalida- des, o ácido nucleico no AAV compreende, a partir de 5' para 3', um ácido nucleico que codifica o seguinte: uma ITR (por exemplo, uma ITR de AAV2), um promotor, um ácido nucleico que codifica um RNAi que compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nu- cleico que compreende a sequência 5'-UGGGCACAUUGGAACU- GAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que compreende a sequência 5'-UGCUCAGU- CAAUGUGCCUA-3' (SEQ ID NO: 37), um sinal de poliadenilação e uma ITR de AAV (por exemplo, uma ITR de AAV2). Em algumas modalida- des, o ácido nucleico no AAV compreende, a partir de 5' para 3', um ácido nucleico que codifica o seguinte: uma ITR (por exemplo, uma ITR de AAV2), um promotor de CBA, um ácido nucleico que codifica um RNAi conforme descrito no presente documento, um sinal de poliadeni- lação (por exemplo, um poliA de hormônio de crescimento bovino) e uma ITR de AAV (por exemplo, uma ITR de AAV2). Em algumas moda- lidades, o RNAi é selecionado a partir da Tabela 1. Em algumas moda- lidades, o ácido nucleico no AAV compreende, a partir de 5' para 3', um ácido nucleico que codifica o seguinte: uma ITR (por exemplo, uma ITR de AAV2), um promotor de CBA, um nucleico ácido que codifica um RNAi que compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que compreende a sequência 5'-UGCUCUUUGGUCUU- CUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que compreende a sequência 5'-GGCU- GAGAACCAAAGAGUA-3' (SEQ ID NO: 53), um sinal de poliadenilação (por exemplo, um poliA de hormônio de crescimento bovino) e uma ITR de AAV (por exemplo, uma ITR de AAV2). Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende, a partir de 5' para 3', um ácido nu- cleico que codifica o seguinte: uma ITR (por exemplo, uma ITR de AAV2), um promotor de CBA, um ácido nucleico que codifica um RNAi que compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que compreende a sequência 5'-UGGGCACAUUGGAACU- GAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que compreende a sequência 5'-UGCUCAGU- CAAUGUGCCUA-3' (SEQ ID NO: 37), um sinal de poliadenilação (por exemplo, um poliA de hormônio de crescimento bovino) e uma ITR de AAV (por exemplo, uma ITR de AAV2). Em algumas modalidades, as primeira e segunda fitas são selecionadas a partir da Tabela 1.
[0142] Em algumas modalidades, um vetor pode incluir um ácido nucleico de enchimento. Em algumas modalidades, o ácido nucleico de enchimento pode codificar uma proteína fluorescente verde. Em algu- mas modalidades, o ácido nucleico de enchimento pode estar localizado entre o promotor e o ácido nucleico que codifica o RNAi. Em algumas modalidades, o ácido nucleico de enchimento é um ácido nucleico de enchimento A1AT.
[0143] Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compre- ende o ácido nucleico de SEQ ID NO: 65. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende um ácido nucleico que é pelo menos cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%, 98 % ou 99 % idêntico à SEQ ID NO: 65. Em outras modalidades, a partícula de rAAV compreende proteínas da capsídeo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh8R, AA- Vrh.10, AAV11, AAV12 ou mutantes destas proteínas da capsídeo. Em algumas modalidades, uma proteína da capsídeo mutante mantém a capacidade de formar uma capsídeo de AAV. Em algumas modalidades, a partícula de rAAV compreende uma capsídeo mutante de tirosina de AAV5 (Zhong L. et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105 (22): 7827-
7832. Em outras modalidades, a partícula de rAAV compreende proteí- nas da capsídeo de um sorotipo de AAV dos clados A-F (Gao et al., J. Virol. 2004, 78 (12): 6381).
[0144] Diferentes sorotipos de AAV são usados para otimizar a transdução de células alvo específicas ou para alvejar tipos de células específicos dentro de um tecido alvo específico (por exemplo, um tecido doente). Uma partícula de rAAV pode compreender proteínas virais e ácidos nucleicos virais do mesmo sorotipo ou um sorotipo misto. Por exemplo, em algumas modalidades, uma partícula de rAAV pode com- preender proteínas da capsídeo de AAV1 e pelo menos uma ITR de
AAV2 ou pode compreender proteínas da capsídeo de AAV2 e pelo me- nos uma ITR de AAV1. Qualquer combinação de sorotipos de AAV para a produção de uma partícula de rAAV é fornecida no presente docu- mento como se cada combinação tivesse sido expressamente indicada no presente documento. Em algumas modalidades, a invenção fornece partículas de rAAV que compreendem uma capsídeo de AAV1 e um ve- tor de rAAV da presente invenção (por exemplo, uma construção de ex- pressão que compreende um ácido nucleico que codifica um RNAi da presente invenção) flanqueada por pelo menos uma ITR de AAV2. Em algumas modalidades, a invenção fornece partículas de rAAV que com- preendem uma capsídeo de AAV2. Em algumas modalidades, a partí- cula de rAAV compreende uma capsídeo de AAV1, uma capsídeo de AAV2HBKO (por exemplo, conforme descrito no documento WO2015168666), uma capsídeo de AAV9, uma capsídeo de PHP.B, uma capsídeo de PHP.eB ou uma capsídeo de Olig001.
[0145] Em alguns aspectos, a invenção fornece partículas virais que compreendem um genoma de autocomplementação recombinante. Par- tículas virais de AAV com genomas de autocomplementação e métodos de uso de genomas de autocomplementação de AAV são descritos nas Patentes Norte-Americanas Nos 6.596.535; 7.125.717; 7.465.583;
7.785.888; 7.790.154; 7.846.729; 8.093.054; e 8.361.457; e Wang Z., et al. (2003) Gene Ther 10: 2105-2111, cada uma das quais é incorporada ao presente documento a título de referência na íntegra. Um rAAV que compreende um genoma de autocomplementação formará rapidamente uma molécula de DNA fita dupla em virtude de suas sequências parci- almente complementadoras (por exemplo, complementando as fitas co- dificantes e não codificantes de um transgene). Em algumas modalida- des, a invenção fornece uma partícula viral de AAV que compreende um genoma de AAV, em que o genoma de rAAV compreende uma primeira sequência de polinucleotídeos heteróloga (por exemplo, um RNAi da presente invenção) e uma segunda sequência de polinucleotídeos he- teróloga (por exemplo, fita antissenso de um RNAi da presente inven- ção), em que a primeira sequência de polinucleotídeos heteróloga pode formar pares de bases intra fita com a segunda sequência de polinucle- otídeos ao longo da maior parte ou todo o seu comprimento.
Em algu- mas modalidades, a primeira sequência de polinucleotídeos heteróloga e uma segunda sequência de polinucleotídeos heteróloga são ligadas através de uma sequência que facilita o emparelhamento intra bases; por exemplo, uma estrutura de DNA em gancho.
Estruturas em gancho são conhecidas na técnica, por exemplo, em moléculas de miRNA ou siRNA.
Em algumas modalidades, a primeira sequência de polinucleotí- deos heteróloga e uma segunda sequência de polinucleotídeos heteró- loga são ligadas através de uma ITR mutante (por exemplo, a ITR cor- reta). Em algumas modalidades, a ITR compreende a sequência de po- linucleotídeos 5'-ttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccggg- caaagcccgggcg- tcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggcca actccatcactaggggttcct-3' (SEQ ID NO: 70). A ITR mutante compreende uma eliminação da região D que compreende a sequência de resolução terminal.
Como um resultado, ao replicar um genoma viral de AAV, as proteínas rep não clivarão o genoma viral na ITR mutante e, como tal, um genoma viral recombinante que compreende o seguinte, na ordem a partir de 5' para 3', será engolfado em uma capsídeo viral: uma ITR de AAV, a primeira sequência de polinucleotídeos heteróloga incluindo sequências regulatórias, a ITR de AAV mutante, a segunda sequência de polinucleotídeos heteróloga na orientação reversa à primeira se- quência de polinucleotídeos heteróloga e uma terceira ITR de AAV.
Em algumas modalidades, a invenção fornece partículas virais de AAV que compreendem um genoma viral recombinante que compreende uma ITR de AAV2 funcional, uma primeira sequência de polinucleotídeos que codifica um RNAi da presente invenção, uma ITR de AAV2 mutante que compreende uma eliminação da região D e carece de uma sequência de resolução terminal funcional, uma segunda sequência de polinucleo- tídeos que compreende a sequência complementar à sequência que co- difica um RNAi da presente invenção, da primeira sequência de polinu- cleotídeos e uma ITR de AAV2 funcional. Produção de Partículas Virais
[0146] Partículas de rAAV podem ser produzidas usando métodos conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Patentes Norte-Ameri- canas Nos 6.566.118; 6.989.264; e 6.995.006. Na prática da invenção, as células hospedeiras para a produção de partículas de rAAV incluem células de mamíferos, células de insetos, células de plantas, micro-or- ganismos e leveduras. As células hospedeiras também podem ser cé- lulas de engolfamento nas quais os genes rep e cap de AAV são manti- dos de forma estável na célula hospedeira ou células produtoras nas quais o genoma do vetor de AAV é mantido de forma estável. Células de engolfamento e produtoras exemplificativas são derivadas de células 293, A549 ou HeLa. Os vetores de AAV são purificados e formulados usando métodos padrão conhecidos na técnica.
[0147] Métodos conhecidos na técnica para a produção de vetores de rAAV incluem, porém sem limitações, transfecção, produção de li- nhagem de células estável e sistemas de produção de vírus híbridos infecciosos que incluem híbridos de adenovírus-AAV, híbridos de her- pesvírus-AAV (Conway, J.E. et al. (1997) J. Virology 71 (11): 8780-8789) e híbridos de baculovírus-AAV. Todas as culturas de produção de rAAV para a produção de partículas de vírus rAAV; 1) células hospedeiras adequadas incluindo, por exemplo, linhagens de células derivadas de seres humanos, tais como células HeLa, A549 ou 293, ou linhagens de células derivadas de insetos, tal como SF-9, no caso de sistemas de produção de baculovírus; 2) função de vírus auxiliar adequada, confe- rida por adenovírus de tipo selvagem ou mutante (tal como adenovírus sensível à temperatura), vírus do herpes, baculovírus ou uma constru- ção de plasmídeo que fornece funções auxiliares; 3) genes rep e cap de AAV e produtos gênicos; 4) um ácido nucleico (tal como um ácido nu- cleico terapêutico) flanqueado por pelo menos uma sequência de ITR de AAV; e 5) meios e componentes de meio adequados para sustentar a produção de rAAV. Em algumas modalidades, os produtos do gene rep e cap de AAV podem ser de qualquer sorotipo de AAV. Em geral, mas não obrigatoriamente, o produto do gene rep de AAV é do mesmo sorotipo que as ITRs do genoma do vetor de rAAV, contanto que os produtos do gene rep possam funcionar para replicar e engolfar o ge- noma do rAAV. Meios adequados conhecidos na técnica podem ser usados para a produção de vetores de rAAV. Estes meios incluem, sem limitação, meios produzidos pela Hyclone Laboratories e JRH, incluindo Meio de Eagle Modificado (MEM), Meio de Eagle Modificado por Dul- becco (DMEM), formulações personalizadas, tais como aquelas descri- tas na Patente Norte-Americana N° 6.566.118, e meios Sf-900 II SFM, conforme descrito na Patente Norte-Americana N° 6.723.551, cada uma das quais é incorporada ao presente documento a título de referência na íntegra, particularmente em relação a formulações de meios perso- nalizados para uso na produção de vetores de AAV recombinantes. Em algumas modalidades, as funções auxiliares de AAV são fornecidas por adenovírus ou HSV. Em algumas modalidades, as funções auxiliares de AAV são fornecidas por baculovírus e a célula hospedeira é uma célula de inseto (por exemplo, células de Spodoptera frugiperda (Sf9)).
[0148] Em algumas modalidades, as partículas de rAAV podem ser produzidas por meio de um método de transfecção tripla, tal como o método de transfecção tripla exemplificativo fornecido infra. Resumida- mente, um plasmídeo que contém um gene rep e um gene da capsídeo,
juntamente com um plasmídeo adenoviral auxiliar, pode ser transfec- tado (por exemplo, usando o método de fosfato de cálcio) em uma li- nhagem de células (por exemplo, células HEK-293) e o vírus pode ser coletado e opcionalmente purificado. Como tal, em algumas modalida- des, a partícula de rAAV foi produzida por meio de transfecção tripla de um ácido nucleico que codifica o vetor de rAAV, um ácido nucleico que codifica rep e cap de AAV e um ácido nucleico que codifica funções de vírus auxiliar de AAV em uma célula hospedeira, em que a transfecção dos ácidos nucleicos para as células hospedeiras gera uma célula hos- pedeira capaz de produzir partículas de rAAV.
[0149] Em algumas modalidades, as partículas de rAAV podem ser produzidas por meio de um método de linhagem de células produtora, tal como o método de linhagem de células produtora exemplificativo for- necido infra (consulte também Martin et al. (2013) Human Gene Therapy Methods 24: 253 -269). Resumidamente, uma linhagem de células (por exemplo, uma linhagem de células HeLa) pode ser transfectada de forma estável com um plasmídeo que contém um gene rep, um gene de capsídeo e uma sequência de ácidos nucleicos de promotor heterólogo. As linhagens de células podem ser rastreadas para selecionar um clone principal para a produção de rAAV, o que pode então ser expandido para um biorreator de produção e infectado com um adenovírus (por exemplo, um adenovírus de tipo selvagem) como auxiliar para iniciar a produção de rAAV. O vírus pode ser subsequentemente coletado, o adenovírus pode ser inativado (por exemplo, pelo calor) e/ou removido e as partículas de rAAV podem ser purificadas. Como tal, em algumas modalidades, a partícula de rAAV foi produzida por uma linhagem de células produtora que compreende um ou mais de um ácido nucleico que codifica o vetor de rAAV, um ácido nucleico que codifica rep e cap de AAV e um ácido nucleico que codifica funções do vírus auxiliar de AAV.
[0150] Em alguns aspectos, é fornecido um método para a produ- ção de qualquer partícula de rAAV conforme descrito no presente docu- mento que compreende (a) cultivar uma célula hospedeira sob uma con- dição na qual as partículas de rAAV são produzidas, em que a célula hospedeira compreende (i) um ou mais genes de engolfamento de AAV, em que cada dito gene de engolfamento de AAV codifica uma replicação e/ou proteína de encapsidação de AAV; (ii) um pró-vetor de rAAV que compreende um ácido nucleico que codifica um RNAi da presente in- venção, conforme descrito no presente documento, flanqueado por pelo menos uma ITR de AAV e (iii) uma função auxiliar de AAV; e (b) recu- perar as partículas de rAAV produzidas pela célula hospedeira.
Em al- gumas modalidades, o RNAi compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 61 (Figura 1A) ou SEQ ID NO: 63 (Figura 1B). Em algu- mas modalidades, a dita pelo menos uma ITR de AAV é selecionada a partir do grupo que consiste em ITRs da capsídeo de AAV de sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AA- Vrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um AAV de cabra, AAV bovino ou AVV de camundongo ou similar.
Em algumas modalidades, a dita proteína de encapsidação é selecionada a partir do grupo que consiste em AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 (por exemplo, uma capsídeo de AAV6 de tipo selvagem ou uma capsídeo de AAV6 variante, tal como ShH10, conforme descrito na Pub. de Patente Norte-Americana N° 2012/0164106), AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9 (por exemplo, uma capsídeo de AAV9 de tipo selvagem ou uma capsídeo de AAV9 modificado, conforme descrito na Pub. de Patente Norte-Americana N° 2013/0323226), AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, uma capsídeo de tirosina mutante, uma capsídeo de ligação à heparina mutante, uma capsídeo de AAV2R471A, uma capsídeo de AA- VAAV2/2-7m8, uma capsídeo de AAV DJ (por exemplo, uma capsídeo de AAV-DJ/8, uma capsídeo de AAV-DJ/9 ou qualquer outra das capsí- deos descritas na Pub. de Patente Norte-Americana N° 2012/0066783), capsídeo de AAV2 N587A, capsídeo de AAV2 E548A, capsídeo de AAV2 N708A, capsídeo de AAV V708K, capsídeo de AAV de cabra, capsídeo quimérica de AAV1/AAV2, capsídeo de AAV bovino, capsídeo de AAV de camundongo, capsídeo de rAAV2/HBoV1 ou uma capsídeo de AAV descrita na Patente Norte-Americana N° 8.283.151 ou Publica- ção Internacional Nº WO/2003/042397. Em algumas modalidades, a capsídeo de AAV é uma capsídeo de AAV2HBKO, conforme descrito no documento WO2015168666. Em algumas modalidades, a capsídeo de AAV é uma capsídeo de AAV9. Em algumas modalidades, a capsídeo de AAV é uma capsídeo de PHP.B, PHP.eB ou Olig001. Em algumas modalidades, uma proteína da capsídeo mutante mantém a capacidade de formar uma capsídeo de AAV.
Em algumas modalidades, a proteína de encapsidação é uma proteína da capsídeo mutante de tirosina de AAV5. Em outras modalidades, a partícula de rAAV compreende prote- ínas da capsídeo de um sorotipo de AAV dos Clados A-F.
Em algumas modalidades, as partículas de rAAV compreendem uma capsídeo de AAV1 e um genoma recombinante que compreende ITRs de AAV2 e um ácido nucleico que codifica um RNAi da presente invenção.
Em uma outra modalidade, as partículas de rAAV são purificadas.
O termo "puri- ficado", conforme usado no presente documento, inclui uma preparação de partículas de rAAV desprovidas de pelo menos alguns dos outros componentes que também podem estar presentes onde as partículas de rAAV ocorrem naturalmente ou são inicialmente preparadas.
Assim, por exemplo, as partículas de rAAV isoladas podem ser preparadas usando uma técnica de purificação para enriquecê-las a partir de uma mistura de origem, tal como um lisato de cultura ou sobrenadante de cultura de produção.
O enriquecimento pode ser medido de várias ma- neiras tal como, por exemplo, pela proporção de partículas resistentes à DNase (DRPs) ou cópias genômicas (gc) presentes em uma solução, ou pela infectividade, ou pode ser medido em relação a uma segunda substância potencialmente interferente presente na mistura de origem, tais como contaminantes, incluindo contaminantes da cultura de produ- ção ou contaminantes em processo, incluindo vírus auxiliar, componen- tes de meio e assim por diante.
[0151] Numerosos métodos são conhecidos na técnica para a pro- dução de partículas de vetor adenoviral. Por exemplo, para um vetor adenoviral de intestino, o genoma do vetor adenoviral e um genoma de adenovírus auxiliar podem ser transfectados em uma linhagem de célu- las de engolfamento (por exemplo, uma linhagem de células 293). Em algumas modalidades, o genoma de adenovírus auxiliar pode conter sí- tios de recombinação que flanqueiam seu sinal de engolfamento e am- bos os genomas podem ser transfectados em uma linhagem de células de engolfamento que expressa uma recombinase (por exemplo, o sis- tema Cre/loxP pode ser usado), de modo que o vetor adenoviral de in- teresse seja engolfado de forma mais eficiente do que o adenovírus au- xiliar (consulte, por exemplo, Alba, R. et al. (2005) Gene Ther. 12 Supl. 1: S18-27). Os vetores adenovirais podem ser coletados e purificados usando métodos padrão, tais como aqueles descritos no presente do- cumento.
[0152] Numerosos métodos são conhecidos na técnica para a pro- dução de partículas de vetor lentiviral. Por exemplo, para um vetor len- tiviral de terceira geração, um vetor que contém o genoma lentiviral de interesse com os genes gag e pol pode ser cotransfectado em uma li- nhagem de células de engolfamento (por exemplo, uma linhagem de células 293) juntamente com um vetor que contém um gene rev. O ge- noma lentiviral de interesse também contém uma LTR quimérica que promove a transcrição na ausência de Tat (consulte Dull, T. et al. (1998)
J. Virol. 72: 8463-71). Os vetores lentivirais podem ser coletados e puri- ficados usando os métodos descritos no presente documento (por exemplo, Segura M.M. et al., (2013) Expert Opin Biol Ther. 13 (7): 987- 1011).
[0153] Numerosos métodos são conhecidos na técnica para a pro- dução de partículas de HSV. Os vetores de HSV podem ser coletados e purificados usando métodos padrão, tais como aqueles descritos no presente documento. Por exemplo, para um vetor de HSV com defeito de replicação, um genoma de HSV de interesse que carece de todos os genes iniciais imediatos (IE) pode ser transfectado em uma linhagem de células complementar que fornece os genes necessários para a produ- ção de vírus, tais como ICP4, ICP27 e ICP0 (consulte, por exemplo, Sa- maniego, L.A. et al. (1998) J. Virol. 72: 3307-20). Os vetores de HSV podem ser coletados e purificados usando os métodos descritos (por exemplo, Goins, W.F. et al. (2014) Herpes Simplex Virus Methods in Molecular Biology 1144: 63-79).
[0154] Também são fornecidas no presente documento composi- ções farmacêuticas que compreendem uma partícula viral recombinante que compreende um transgene que codifica um RNAi da presente in- venção e um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições far- macêuticas podem ser adequadas para qualquer modo de administra- ção descrito no presente documento. Uma composição farmacêutica de uma partícula viral recombinante que compreende um ácido nucleico que codifica um RNAi da presente invenção pode ser introduzida no cé- rebro. Por exemplo, uma partícula viral recombinante que compreende um ácido nucleico que codifica um RNAi da presente invenção pode ser administrada intraestriamente. Qualquer uma das partículas virais re- combinantes da presente invenção pode ser usada, incluindo partículas de rAAV, adenovirais, lentivirais e de HSV.
[0155] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas que compreendem uma partícula viral recombinante que compreende um transgene que codifica um RNAi da presente invenção descrito no presente documento e um veículo farmaceuticamente aceitável são adequadas para administração a seres humanos. Estes veículos são bem conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Remington's Phar- maceutical Sciences, 15ª edição, páginas 1035-1038 e 1570-1580). Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas que compreen- dem um rAAV descrito no presente documento e um veículo farmaceu- ticamente aceitável são adequadas para injeção no cérebro de um ma- mífero (por exemplo, administração intraestriatal). Em algumas modali- dades, as composições farmacêuticas que compreendem uma partícula lentiviral recombinante descrita no presente documento e um veículo farmaceuticamente aceitável são adequadas para injeção no cérebro de um mamífero (por exemplo, administração intraestriatal). Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas que compreendem uma partícula adenoviral recombinante descrita no presente documento e um veículo farmaceuticamente aceitável são adequadas para injeção no cé- rebro de um mamífero (por exemplo, administração intraestriatal). Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas que compreen- dem uma partícula de HSV recombinante descrita no presente docu- mento e um veículo farmaceuticamente aceitável são adequadas para injeção no cérebro de um mamífero (por exemplo, administração intra- estriatal).
[0156] Tais veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser líqui- dos estéreis, tais como água e óleo, incluindo aqueles originários de petróleo, animal, vegetal ou sintéticos, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral e assim por diante. Soluções salinas e dex- trose aquosa, polietileno glicol (PEG) e soluções de glicerol também po- dem ser empregadas como veículos líquidos, particularmente para so- luções injetáveis. A composição farmacêutica pode ainda compreender ingredientes adicionais, por exemplo, conservantes, tampões, agentes de tonicidade, antioxidantes e estabilizantes, agentes umectantes ou clarificantes não iônicos, agentes para aumento de viscosidade e assim por diante. As composições farmacêuticas descritas no presente docu- mento podem ser embaladas em dosagens unitárias únicas ou em for- mas de dosagem múltipla. As composições são, em geral, formuladas como uma solução estéril e substancialmente isotônica. VIII. Artigos de Manufatura e Kits
[0157] Também são fornecidos kits ou artigos de manufatura para uso nos métodos descritos no presente documento. Em alguns aspec- tos, os kits compreendem as composições descritas no presente docu- mento (por exemplo, uma partícula viral recombinante da presente in- venção, tal como uma partícula de rAAV que compreende um ácido nu- cleico que codifica um RNAi da presente invenção) em uma embalagem adequada. Embalagens adequadas para composições (tais como com- posições intraestriatais) descritas no presente documento são conheci- das na técnica e incluem, por exemplo, frascos (tais como frascos sela- dos), recipientes, ampolas, garrafas, vidros, embalagens flexíveis (por exemplo, Mylar selado ou sacos plásticos) e assim por diante. Estes artigos de manufatura podem ser posteriormente esterilizados e/ou se- lados.
[0158] A presente invenção também fornece kits que compreendem as composições descritas no presente documento e podem ainda com- preender instruções sobre os métodos de uso da composição, tais como os usos descritos no presente documento. Os kits descritos no presente documento podem incluir ainda outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções para realizar quaisquer méto- dos descritos no presente documento. Por exemplo, em algumas moda-
lidades, o kit compreende uma composição de partículas virais recom- binantes que compreendem um transgene que codifica um RNAi da pre- sente invenção para distribuição de pelo menos 1 × 109 cópias genômi- cas no cérebro de um mamífero (por exemplo, por meio de administra- ção intraestriatal) a um primata conforme descrito no presente docu- mento, um veículo farmaceuticamente aceitável adequado para injeção no cérebro de um primata e um ou mais dentre: um tampão, um diluente, um filtro, uma agulha, uma seringa e uma bula com instruções para re- alizar injeções no cérebro de um primata (por exemplo, administração intraestriatal). Em algumas modalidades, o kit compreende instruções para o tratamento de uma sinucleinopatia neurodegenerativa com as partículas virais recombinantes descritas no presente documento. Em algumas modalidades, o kit compreende instruções para usar as partí- culas virais recombinantes descritas no presente documento de acordo com qualquer um dos métodos descritos no presente documento. IX. MODALIDADES EXEMPLIFICATIVAS
[0159] 1. Um RNAi que compreende uma primeira fita e uma se- gunda fita, em que a) a primeira fita e a segunda fita formam um duplex; b) a primeira fita compreende uma região guia, em que a região guia compreende um ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) ou pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8); e c) a segunda fita compreende uma região não guia.
[0160] 2. O RNAi de acordo com a modalidade 1, em que a região guia compreende a sequência de ácidos nucleicos 5'-UGCUCUUUG- GUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) e a região não guia compreende a sequência 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3' (SEQ ID NO: 53).
[0161] 3. O RNAi de acordo com a modalidade 1, em que a primeira fita compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem cerca de
90 % de identidade com SEQ ID NO: 24 ou cerca de 90 % de identidade com SEQ ID NO: 53.
[0162] 4. O RNAi de acordo com a modalidade 1, em que a região guia compreende a sequência de ácidos nucleicos 5'-UGGGCA- CAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e a região não guia compre- ende a sequência 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3' (SEQ ID NO: 37).
[0163] 5. O RNAi de acordo com a modalidade 1, em que a segunda fita compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem cerca de 90 % de identidade com SEQ ID NO: 37 ou cerca de 90 % de identidade com SEQ ID NO: 37.
[0164] 6. O RNAi de acordo qualquer uma das modalidades 1-5, em que a primeira fita e a segunda fita estão ligadas através de um ligante de RNA capaz de formar uma estrutura de alça.
[0165] 7. O RNAi de acordo com a modalidade 6, em que o ligante de RNA compreende a partir de 4 a 50 nucleotídeos.
[0166] 8. O RNAi de acordo com a modalidade 6 ou 7, em que a estrutura de alça compreende a partir de 4 a 20 nucleotídeos.
[0167] 9. O RNAi de acordo com qualquer uma das modalidades 6- 8, em que o RNAi compreende, a partir de 5' para 3', a segunda fita, o ligante de RNA e a primeira fita.
[0168] 10. O RNAi de acordo com qualquer uma das modalidades 6-8, em que o RNAi compreende, a partir de 5' para 3', a primeira fita, o ligante de RNA e a segunda fita.
[0169] 11. O RNAi de acordo com a modalidade 10, em que o RNAi compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 61 ou SEQ ID NO: 63.
[0170] 12. O RNAi de acordo com a modalidade 11, em que o RNAi compreende uma sequência de nucleotídeos cerca de 90 % idêntica à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 61 ou SEQ ID NO: 63.
[0171] 13. O RNAi de acordo com qualquer uma das modalidades 1-12, em que o RNAi é um pequeno RNA inibidor (siRNA), um microRNA (miRNA) ou um pequeno RNA em gancho (shRNA).
[0172] 14. O RNAi de acordo com qualquer uma das modalidades 1-13, em que o RNAi tem como alvo o RNA que codifica um polipeptídeo associado a uma sinucleinopatia neurodegenerativa.
[0173] 15. O RNAi de acordo com a modalidade 14, em que o poli- peptídeo é alfa-sinucleína (SNCA).
[0174] 16. O RNAi de acordo com a modalidade 15, em que a alfa- sinucleína é alfa-sinucleína humana.
[0175] 17. O RNAi de acordo com qualquer uma das modalidades 14-16, em que a sinucleinopatia neurodegenerativa é mal de Parkinson (DP), atrofia de múltiplos sistemas (MSA) ou demência com corpos de Lewy (DLB).
[0176] 18. Uma construção de expressão que compreende um ácido nucleico que codifica o RNAi de acordo com qualquer uma das modalidades 1-17.
[0177] 19. A construção de expressão de acordo com a modalidade 18, em que o ácido nucleico que codifica o RNAi compreende um scaf- fold de miRNA.
[0178] 20. A construção de expressão de acordo com a modalidade 18 ou 19, em que o ácido nucleico que codifica o RNAi está operativa- mente ligado a um promotor.
[0179] 21. A construção de expressão de acordo com a modalidade 20, em que o promotor é selecionado a partir de um promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMV), uma LTR de RSV, uma LTR de MoMLV, um promotor de fosfoglicerato quinase-1 (PGK), um promotor do vírus de símio 40 (SV40), um promotor CK6, um promotor de trans- tirretina (TTR), um promotor TK, um promotor responsivo à tetraciclina (TRE), um promotor de HBV, um promotor de hAAT, um promotor LSP,
um promotor quimérico específico para o fígado (LSP), um promotor E2F, um promotor de telomerase (hTERT); um estimulador de citome- galovírus/promotor de beta-actina de galinha/promotor de β-globina de coelho (CAG), um promotor de fator de alongamento 1-alfa (EF1-alfa), um promotor de β-glucuronidase humana, um promotor de β-actina de galinha (CBA), um promotor de LTR do vírus do sarcoma de Rous re- troviral (RSV), um promotor de di-hidrofolato redutase e um promotor de -actina.
[0180] 22. A construção de expressão de acordo com qualquer uma das modalidades 18-21, em que a construção de expressão compre- ende ainda um íntron.
[0181] 23. A construção de expressão de acordo com a modalidade 22, em que o íntron é um íntron de CBA ou um íntron de hEF1alfa.
[0182] 24. A construção de expressão de acordo com a modalidade 22, em que o íntron é um íntron quimérico.
[0183] 25. A construção de expressão de acordo com a modalidade 22, em que o vetor de expressão é um vetor autocomplementar e o ín- tron é um íntron quimérico delta.
[0184] 26. A construção de expressão de acordo com qualquer uma das modalidades 18-25, em que a construção de expressão compre- ende ainda um sinal de poliadenilação.
[0185] 27. A construção de expressão de acordo com a modalidade 26, em que o sinal de poliadenilação é um sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino, um sinal de poliadenilação de SV40 ou um sinal de poliadenilação TK de HSV.
[0186] 28. Um vetor que compreende a construção de expressão de acordo com qualquer uma das modalidades 18-27.
[0187] 29. O vetor de acordo com a modalidade 28, em que o vetor é um vetor de vírus adeno-associado recombinante (rAAV).
[0188] 30. O vetor de rAAV de acordo com a modalidade 29, em que a construção de expressão é flanqueada por uma ou mais sequên- cias de repetição terminal invertida (ITR) de AAV.
[0189] 31. O vetor de rAAV de acordo com a modalidade 30, em que a construção de expressão é flanqueada por duas ITRs de AAV.
[0190] 32. O vetor de rAAV de acordo com a modalidade 30 ou 31, em que as ITRs de AAV são ITRs de sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV412, AAVA71R71, AAV DJ, AAV de cabra, AAV bovino ou AAV de camundongo.
[0191] 33. O vetor de rAAV de acordo com qualquer uma das mo- dalidades 30-32, em que as ITRs de AAV são ITRs de AAV2.
[0192] 34. O vetor de rAAV de acordo com qualquer uma das mo- dalidades 30-33, em que o vetor compreende ainda um ácido nucleico de enchimento.
[0193] 35. O vetor de rAAV de acordo com a modalidade 34, em que o ácido nucleico de enchimento está localizado a montante ou a jusante do ácido nucleico que codifica o RNAi.
[0194] 36. O vetor de rAAV de acordo com qualquer uma das mo- dalidades 30-35, em que o vetor é um vetor de rAAV autocomplementar.
[0195] 37. O vetor de rAAV de acordo com a modalidade 36, em que o vetor compreende a primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica o RNAi e uma segunda sequência de ácidos nucleicos que co- difica um complemento do RNAi, em que a primeira sequência de ácidos nucleicos pode formar pares de bases intra fita com a segunda sequên- cia de ácidos nucleicos ao longo da maior parte ou todo o seu compri- mento.
[0196] 38. O vetor de rAAV de acordo com a modalidade 37, em que a primeira sequência de ácidos nucleicos e a segunda sequência de ácidos nucleicos estão ligadas através de uma ITR de AAV mutante, em que a ITR de AAV mutante compreende uma eliminação da região
D e compreende uma mutação da sequência de resolução terminal.
[0197] 39. Uma célula que compreende o vetor de rAAV de acordo com qualquer uma das modalidades 29-38.
[0198] 40. Uma partícula de AAV recombinante que compreende o vetor de rAAV de acordo com qualquer uma das modalidades 29-38.
[0199] 41. A partícula de rAAV de acordo com a modalidade 40, em que a partícula viral de AAV compreende uma capsídeo de sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AA- Vrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV412, AAV271, AAV2/2- 7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV2-HBKO, AAVDJ8, AAVPHP.B, AAVPHP.eB, AAVBR1, AA- VHSC15, AAVHSC17, uma capsídeo de AAV/AAV2 quimérica, uma capsídeo de AAV2 de cabra, AAV bovino ou AAV de camundongo de sorotipo rAAV2/HBoV1.
[0200] 42. A partícula de rAAV de acordo com a modalidade 40 ou 41, em que a ITR e a capsídeo da partícula viral de rAAV são derivadas do mesmo sorotipo de AAV.
[0201] 43. A partícula de rAAV de acordo com a modalidade 40 ou 41, em que a ITR e a capsídeo da partícula viral de rAAV são derivadas de diferentes sorotipos de AAV.
[0202] 44. A partícula de rAAV de acordo com a modalidade 43, em que a ITR é derivada de AAV2 e a capsídeo da partícula de rAAV é derivada de AAV1.
[0203] 45. Uma composição que compreende a partícula de rAAV de acordo com qualquer uma das modalidades 40-44.
[0204] 46. A composição de acordo com a modalidade 45, em que a composição compreende ainda um veículo farmaceuticamente acei- tável.
[0205] 47. Um kit que compreende o RNAi de acordo com qualquer uma das modalidades 1-17.
[0206] 48. Um kit que compreende a partícula de AAV de acordo com qualquer uma das modalidades 40-44.
[0207] 49. Um kit que compreende a composição de acordo com a modalidade 45 ou 46.
[0208] 50. O kit de acordo com qualquer uma das modalidades 47- 49 que compreende ainda instruções de uso.
[0209] 51. Um método para tratar uma sinucleinopatia neurodege- nerativa em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao mamífero um RNAi que compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGCUCUUUGGUCUUCU- CAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) ou uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identi- dade com a sequência 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico.
[0210] 52. O método de acordo com a modalidade 51, em que o segundo ácido nucleico compreende ácido nucleico que tem pelo me- nos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-GGCUGAGAAC- CAAAGAGUA-3' (SEQ ID NO: 53) ou um ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-E1passageiro- 3' (SEQ ID NO: 37).
[0211] 53. Um método para tratar uma sinucleinopatia neurodege- nerativa em um mamífero caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao mamífero um RNAi que compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90% de identidade com a sequência 5'-UGCUCUUUGGUCUUCU- CAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90% de identi- dade com a sequência 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3' (SEQ ID
NO: 53) ou uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nu- cleico que tem pelo menos cerca de 90% de identidade com a sequência 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGCUCAGUCAAU- GUGCCUA-3' (SEQ ID NO: 37).
[0212] 54. Um método para inibir a expressão de alfa-sinucleína em um mamífero com uma doença neurodegenerativa caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao mamífero de um RNAi que com- preende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'- UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) ou uma primeira fita que compreende um ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGGGCACAUUGGAACU- GAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico.
[0213] 55. O método de acordo com a modalidade 54, em que o segundo ácido nucleico compreende um ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-GGCU- GAGAACCAAAGAGUA-3' (SEQ ID NO: 53) ou um ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UG- CUCAGUCAAUGUGCCUA-3' (SEQ ID NO: 37).
[0214] 56. Um método para inibir a expressão de alfa-sinucleína em um mamífero com doença neurodegenerativa caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao mamífero um RNAi que compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90% de identidade com a sequência 5'-UGCU- CUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-
3' (SEQ ID NO: 53) ou uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGCUCA- GUCAAUGUGCCUA-3' (SEQ ID NO: 37).
[0215] 57. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 51-56, em que a primeira fita compreende a sequência de ácidos nuclei- cos que tem a sequência de SEQ ID NO: 24 ou um ácido nucleico que tem a sequência de SEQ ID NO: 8.
[0216] 58. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 52, 53, 55 ou 56, em que a segunda fita compreende o ácido nucleico que tem a sequência de SEQ ID NO: 53 ou o ácido nucleico que tem a sequência de SEQ ID NO: 37
[0217] 59. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 51-58, em que a primeira fita e a segunda fita são ligadas através de um ligante de RNA capaz de formar uma estrutura de alça.
[0218] 60. O método de acordo com a modalidade 59, em que o ligante de RNA compreende a partir de 4 a 50 nucleotídeos.
[0219] 61. O método de acordo com a modalidade 59 ou 60, em que a estrutura da alça compreende a partir de 4 a 20 nucleotídeos.
[0220] 62. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 59-61, em que o RNAi compreende, a partir de 5' para 3', a segunda fita, o ligante de RNA e a primeira fita.
[0221] 63. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 59-61, em que o RNAi compreende, a partir de 5' para 3', a primeira fita, o ligante de RNA e a segunda fita.
[0222] 64. O método de acordo com a modalidade 63, em que o RNAi compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 61 ou SEQ ID NO: 63.
[0223] 65. O método de acordo com a modalidade 64, em que o RNAi compreende uma sequência de nucleotídeos cerca de 90 % idên- tica à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 61 ou SEQ ID NO: 63.
[0224] 66. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 51-65, em que o RNAi é codificado em uma construção de expressão.
[0225] 67. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 51-66, em que o ácido nucleico que codifica o RNAi compreende um scaffold de miRNA.
[0226] 68. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 51-67, em que o ácido nucleico que codifica o RNAi está operativamente ligado a um promotor.
[0227] 69. O método de acordo com a modalidade 68, em que o promotor é capaz de expressar o RNAi no cérebro de um mamífero.
[0228] 70. O método de acordo com a modalidade 69, em que o promotor é selecionado a partir de um promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMV), uma LTR de RSV, uma LTR de MoMLV, um promotor de fosfoglicerato quinase-1 (PGK), um promotor do vírus de símio 40 (SV40), um promotor CK6, um promotor de transtirretina (TTR), um promotor TK, um promotor responsivo à tetraciclina (TRE), um pro- motor de HBV, um promotor de hAAT, um promotor LSP, um promotor específico para o fígado quimérico (LSP), um promotor E2F, um promo- tor de telomerase (hTERT); um intensificador de citomegalovírus/pro- motor de beta-actina de galinha/β-globina de coelho (CAG), um promo- tor de fator de alongamento 1-alfa (EF1-alfa) e um promotor de β-glucu- ronidase humana.
[0229] 71. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 68-70, em que o promotor é um promotor híbrido de β-actina de galinha (CBA) que compreende um intensificador de CMV e um promotor de β- actina de galinha.
[0230] 72. O método de acordo com qualquer uma das modalidades
66-71, em que a construção de expressão compreende ainda um íntron.
[0231] 73. O método de acordo com a modalidade 72, em que o íntron é um íntron de CBA.
[0232] 74. O método de acordo com a modalidade 72, em que o íntron é um íntron quimérico.
[0233] 75. O método de acordo com a modalidade 74, em que a construção de expressão é um vetor autocomplementar e o íntron é um íntron quimérico delta.
[0234] 76. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 66-75, em que o ácido nucleico compreende ainda um sinal de poliade- nilação.
[0235] 77. O método de acordo com a modalidade 76, em que o sinal de poliadenilação é um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino.
[0236] 78. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 66-77, em que a construção de expressão é codificada por um vetor.
[0237] 79. O método de acordo com a modalidade 78, em que o vetor é um vetor de vírus adeno-associado recombinante (rAAV).
[0238] 80. O método de acordo com a modalidade 79, em que a construção de expressão é flanqueada por uma ou mais sequências de repetição terminal invertida (ITR) de AAV.
[0239] 81. O método de acordo com a modalidade 80, em que a construção de expressão é flanqueada por duas ITRs de AAV.
[0240] 82. O método de acordo com a modalidade 80 ou 81, em que as ITRs de AAV são ITRs de AAV de sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um AAV de cabra, AAV bovino ou AAV de camundongo.
[0241] 83. O método, de acordo com qualquer uma das modalida- des 80-82, em que as ITRs de AAV são ITRs de AAV2.
[0242] 84. O método de acordo com a modalidade 83, em que o vetor de rAAV compreende, a partir de 5' para 3', uma ITR de AAV2, um promotor, um íntron, ácido nucleico que codifica o RNAi, um sinal de poliadenilação e uma ITR de AAV2.
[0243] 85. O método de acordo com a modalidade 84, em que o promotor é um promotor de CBA.
[0244] 86. O método de acordo com a modalidade 84, em que o íntron é um íntron quimérico, um íntron quimérico delta ou um íntron quimérico abreviado quimérico.
[0245] 87. O método de acordo com a modalidade 86, em que o íntron quimérico é um íntron de beta globina de coelho CBA +.
[0246] 88. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 84-87, em que o sinal de poliadenilação é um sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino.
[0247] 89. O método de acordo com a modalidade 83, em que o vetor de rAAV compreende, a partir de 5' para 3', uma ITR de AAV2, o promotor de CBA, um íntron quimérico, um ácido nucleico que codifica o RNAi, um sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino e uma ITR de AAV2.
[0248] 90. O método de acordo com a modalidade 89, em que o vetor compreende ainda um ácido nucleico de enchimento.
[0249] 91. O método de acordo com a modalidade 90, em que o ácido nucleico de enchimento compreende o íntron 1 do gene A1AT hu- mano.
[0250] 92. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 79-91, em que o vetor é um vetor autocomplementar.
[0251] 93. O método de acordo com a modalidade 92, em que o vetor compreende a primeira sequência de ácidos nucleicos que codi- fica o RNAi e uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica um complemento do RNAi, em que a primeira sequência de ácidos nu- cleicos pode formar pares de bases intra fita com a segunda sequência de ácidos nucleicos ao longo da maior parte ou em todo o seu compri- mento.
[0252] 94. O método de acordo com a modalidade 93, em que a primeira sequência de ácidos nucleicos e a segunda sequência de áci- dos nucleicos estão ligadas através de uma ITR de AAV mutante, em que a ITR de AAV mutante compreende uma eliminação da região D e compreende uma mutação da sequência de resolução terminal.
[0253] 95. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 79-94, em que o vetor é encapsidado em uma partícula de rAAV.
[0254] 96. O método de acordo com a modalidade 95, em que a partícula viral de AAV compreende uma capsídeo de sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, AAV2-HBKO, AAVDJ8, AAVPHP.B, AAVPHP.eB, AAVBR1, AA- VHSC15, AAVHSC17, AAV bovino/AAV2 quimérico, AAV de camun- dongo ou capsídeo de rAAV2/HBoV1.
[0255] 97. O método de acordo com a modalidade 95 ou 96, em que a ITR e a capsídeo da partícula viral do rAAV são derivadas do mesmo sorotipo de AAV.
[0256] 98. O método de acordo com a modalidade 95 ou 96, em que a ITR e a capsídeo das partículas virais de rAAV são derivadas de dife- rentes sorotipos de AAV.
[0257] 99. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 95-98, em que a partícula viral de rAAV compreende a capsídeo de AAV2.
[0258] 100. O método de acordo com a modalidade 99, em que a partícula viral de rAAV compreende uma capsídeo de AAV1 e em que o vetor compreende ITRs de AAV2.
[0259] 101. Um método de acordo com qualquer uma das modali- dades 51-100, em que a partícula de rAAV de qualquer uma das moda- lidades 95-100 está em uma composição.
[0260] 102. O método de acordo com a modalidade 101, em que a composição compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitá- vel.
EXEMPLOS
[0261] A invenção será mais completamente entendida por meio de referência aos exemplos a seguir. Eles não devem, no entanto, ser in- terpretados como limitando o escopo da invenção. Deve ser entendido que os exemplos e modalidades descritos no presente documento são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou mudanças à luz dos mesmos serão sugeridas para aqueles versados na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance do presente pedido e escopo das reivindicações em anexo. Exemplo 1: shmiRNA reduz o alvo SNCA humana in vitro.
[0262] Para demonstrar a redução da expressão de SNCA in vitro, células HEK293T foram transfectadas com plasmídeos que codificam sequências de RNAi candidatas e um plasmídeo que codifica o cDNA de SNCA humana (NM_000345.3) sob o controle de um intensificador de citomegalovírus e promotor/íntron de hEF1a e seguido por uma se- quência poliA Tbgh. Os plasmídeos de cDNA de SNCA e miRNA foram cotransfectados. Métodos siRNAs e Plasmídeos
[0263] Sequências de RNAi foram concebidas internamente para ter homologia máxima com SNCA humana/macaco/camundongo, ao mesmo tempo em que equilibra isto com um baixo potencial de direcio- namento. Os siRNAs convencionais foram sintetizados pela Sigma.
Fora do alvo no transcriptoma humano foram previstos usando o algo- ritmo siSPOTR (world wide web em https://sispotr.icts.uiowa.edu/sis- potr/tools.html).
[0264] Os plasmídeos que expressam sequências de RNAi direcio- nadas à SNCA foram incorporados no scaffold de mir155 de murino con- trolado por um intensificador de citomegalovírus e promotor/íntron de hEF1a. As sequências de RNAi podem ser encontradas na Tabela 1. Cultura de Células In Vitro e Transfecções
[0265] As células HEK293T foram cultivadas até ~ 70-90 % de con- fluência em DMEM + FBS a 10 % + pen/strep. As células foram trans- fectadas com Lipfectamine 2000 (para plasmídeos com formato de miRNA) ou RNAiMAX (para formato de siRNA). Três dias após a trans- fecção, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato, os extratos de células inteiras foram preparados por meio de lise celular em tampão de Laemmli redutor e foram fervidos durante 5 minu- tos antes de armazenamento a -20°C. Western Blotting e Densitometria
[0266] Os lisatos celulares foram passados em SDS-PAGE a 4-12% (Bio-Rad TGX™). As proteínas foram transferidas para nitrocelulose (Bio-Rad Transblot), bloqueadas em leite desnatado a 5% e incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4°C. Os anticorpos primários foram lavados, incubados com anticorpo secundário marcado com HRP e a atividade de HRP foi detectada usando substrato Femto ECL (Bio- Rad) e fotografada em um Imager Bio-Rad GelDoc™. As bandas foram quantificadas usando o software ImageJ (NIH). Os níveis de proteína alfa-sinucleína foram normalizados para GAPDH ou beta-tubulina para controlar o carregamento de proteína. Anticorpos usados: Alfa-sinucle- ína (BD 610787), GAPDH (Sigma G8795), Tubulina (BioLegend MMS- 435P-100). HRP-de cabra anti-camundongo ou coelho (CST 7076). Resultados
[0267] Conforme mostrado na Figura 2, shmiRNAs reduziram os ní- veis de proteína SNCA humana in vitro, com 19/27 sequências mos- trando mais de 50% de redução nos níveis de proteína. Exemplo 2: shmiRNA reduz o alvo SNCA de camundongo in vitro.
[0268] Métodos análogos foram usados neste experimento con- forme no Exemplo 1, exceto que as células HEK293T foram transfecta- das com plasmídeos que codificam as sequências de RNAi indicadas e cDNA de SNCA de camundongo. Resultados
[0269] Conforme mostrado na Figura 3, os miRNAs indicados redu- ziram os níveis de proteína SNCA de camundongo in vitro, com sequên- cias 14/27 mostrando mais de 50 % de redução nos níveis de proteína. Exemplo 3: siRNA reduz o alvo SNCA humana e de camundongo in vitro.
[0270] Experimentos adicionais usando o formato de siRNA foram realizados para A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1 e E2 para fornecer dados adicionais sobre a redução no alvo, uma vez que estes foram concebidos com o recurso adicional de serem completos ou terem ho- mologia significativa com a SNCA de camundongo que permite flexibili- dade na escolha de futuros modelos animais de neurodegeneração que podem requerer redução de SNCA de camundongo. Métodos Cultura de Células In Vitro e Transfecções
[0271] As células HEK293T foram cultivadas até ~ 70-90 % de con- fluência em DMEM + FBS a 10 % + pen/step. As células foram transfec- tadas com Lipfectamine 2000 (para plasmídeos com formato de miRNA) ou RNAiMAX (para formato de siRNA). Três dias após a transfecção, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato, os extratos de células inteiras foram preparados por meio de lise celular em tampão de Laemmli redutor e foram fervidos durante 5 minutos antes de armazenamento a -20°C. Western Blotting e Densitometria
[0272] Os lisatos celulares foram passados em SDS-PAGE a 4-12% (Bio-Rad TGX™). As proteínas foram transferidas para nitrocelulose (Bio-Rad Transblot), bloqueadas em leite desnatado a 5% e incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4°C. Os anticorpos primários foram lavados, incubados com o anticorpo secundário marcado com HRP e a atividade de HRP foi detectada usando o substrato Femto ECL (Bio-Rad) e fotografada em um Imager Bio-Rad GelDoc™. As bandas foram quantificadas usando o software ImageJ (NIH). Os níveis de pro- teína alfa-sinucleína foram normalizados para GAPDH ou beta-tubulina para controlar o carregamento de proteína. Anticorpos usados: Alfa-si- nucleína (BD 610787), GAPDH (Sigma G8795), Tubulina (BioLegend MMS-435P-100). HRP-de cabra anti-camundongo ou coelho (CST 7076). Resultados
[0273] Conforme mostrado nas Figuras 4A-4D, os siRNAs indicados reduziram os níveis de SNCA humana e de camundongo in vitro como seria esperado com base em seu desempenho no formato de miRNA. Exemplo 4: Propriedades de toxicidade e neuroproteção de RNAi indicados.
[0274] A toxicidade e as propriedades de neuroproteção de shmiR- NAs candidatos foram avaliadas usando células mesencefálicas huma- nas de Lund (LUHMES) diferenciadas em neurônios maduros de tipo dopamina (10). Métodos Cultura de Células In Vitro e Transfecções
[0275] As células LUHMES (ATCC CRL-2927) foram cultivadas e diferenciadas conforme descrito em (10) com algumas modificações para permitir a eletroporação de DNA de plasmídeo. Resumidamente,
células LUHMES foram subcultivadas em meio de proliferação (10) em frascos revestidos com poli-L-ornitina e fibronectina. A diferenciação em células dopaminérgicas foi iniciada pela adição de meio de diferencia- ção (10). As células foram dissociadas 2 dias depois, eletroporadas (sis- tema LONZA 4D Nucleofector™ X de acordo com as instruções do fa- bricante) com o DNA desejado e recolocadas em placas com 96 cavi- dades em meio de recuperação para minimizar a toxicidade da eletro- poração. 4 horas após a transfecção, o meio foi trocado novamente para meio de diferenciação. As células foram tratadas e coletadas nos dias indicados após a transfecção para experimentos específicos. Ensaio de Neuroproteção In Vitro
[0276] Células LUHMES preparadas conforme acima foram trata- das com as concentrações indicadas de rotenona no Dia 6 de diferenci- ação (Dia 4 de transfecção). A viabilidade celular foi medida usando o ensaio Cell Titer Blue de acordo com as instruções do fabricante (Pro- mega) 48 horas após o tratamento com rotenona. A produção de espé- cies reativas de oxigênio (ROS) foi medida por meio do kit DCFDA (Ab- cam) 24 horas após o tratamento. Os valores foram normalizados para células não tratadas, transfectadas com controle. Análise Estatística
[0277] Os dados dos experimentos de viabilidade celular foram compilados para classificar a % de silenciamento de mRNA de SNCA usando sequências D1 e E1 em função da % de neuroproteção contra toxicidade induzida pela rotenona. A porcentagem de silenciamento de SNCA foi significativamente correlacionada com o grau de neuroprote- ção, conforme calculado usando o Graphpad Prism (v6). Resultados
[0278] Conforme mostrado nas Figuras 5A e 5B, o silenciamento de SNCA não é tóxico por si só e protege significativamente contra a morte celular (Figura 5A) e reduz a produção de ROS dependente de rotenona
(Figura 5B). As sequências de controle, D1 e E1, não alteraram a viabi- lidade celular em si. O tratamento com rotenona de células transfecta- das de controle resultou em ~ 75 % de morte celular, mas a transfecção com vetores de silenciamento de SNCA protegeu significativamente contra esta toxicidade.
[0279] Conforme mostrado na Figura 6, os dados dos experimentos de viabilidade celular foram compilados para classificar a % de silencia- mento de mRNA de SNCA usando as sequências D1 e E1 vs. porcen- tagem de neuroproteção contra toxicidade induzida por rotenona. O grau de silenciamento de SNCA foi significativamente correlacionado positivamente com o grau de neuroproteção, demonstrando que a redu- ção de mRNA de SNCA usando as sequências D1 e E1 é uma estraté- gia de neuroproteção válida. Exemplo 5: Silenciamento do alvo in vivo por vetores D1 e E1
[0280] Para determinar o silenciamento in vivo de SNCA, vetores de AAV que codificam D1, E1 ou sequências de RNAi de controle foram injetados no SNc de camundongos de tipo selvagem. Tecido do SNc foi coletado 1 mês após a injeção. O RNA foi isolado e os níveis de mRNA de SNCA quantificados via Taqman qPCR. Os níveis relativos de trans- crição foram normalizados para GAPDH. Métodos Vetores Virais
[0281] Para gerar vírus rAAV para testagem in vivo, o cassete mir155 foi clonado em um plasmídeo de ITR de AAV2 que contém o promotor de CAG de 1,6 kb para a produção de vírus AAV usando uma capsídeo de AAV2HBKO modificada (documento WO 2015168666 A2). Todos os vetores virais foram produzidos por meio do método de trans- fecção tripla em células 293 e purificados conforme descrito (11). As titulações foram determinadas via qPCR e são expressas como cópias genômicas (GC)/mL ou como genomas de vetor total (vg).
Animais
[0282] Camundongos C57BL/6J machos (10-12 semanas de idade) foram adquiridos da Charles River Laboratories, França. Os animais fo- ram alojados em grupos de quatro em cada gaiola, com livre acesso a comida e água, com temperatura ambiente e umidade controladas e ci- clo claro/escuro de 12:12 h. Injeção Estereotáxica
[0283] Os camundongos foram profundamente anestesiados com uma injeção intraperitoneal da mistura (volume 10 mL/kg): cetamina (100 mg/kg; Imalgene; Merial, França) e xilazina (10 mg/Kg; Rom- pun; Bayer, França). Antes de posicionar o animal na estrutura este- reotáxica (Kopf Instruments, EUA), o pelo do camundongo foi raspado e desinfetado com Vetidina (Vetoquinol, França), um anestésico local bupivacaína (2 mg/kg em um volume de 5 ml/kg; Aguetante, França) foi injetado por via subcutânea na pele do crânio e Emla (Lidocaína, Astra- zeneca) foi aplicada nas orelhas. Durante a cirurgia, os olhos foram pro- tegidos da luz por vitamina A Dulcis e a temperatura corporal mantida constante em 37 °C por uma manta térmica.
[0284] Um pequeno orifício foi feito no osso do crânio acima da co- ordenada de injeção. Uma cânula de calibre 33 (OD 0,254 mm; Phymep), conectada com um tubo de plástico flexível a uma seringa de 25 µL a qual, por sua vez, é conectada a uma bomba de microperfusão, foi inserida unilateralmente na substância nigra pars compacta es- querda (SNpc) nas seguintes coordenadas: AP = - 2,92 mm do bregma; ML = 1,25 mm; DV: -4,5 mm da dura-máter, de acordo com o Mouse Atlas de Paxinos e Watson (2008). Após randomização, os camundon- gos (n = 10/grupo) foram injetados com AAV. A infusão foi realizada em uma taxa de 0,2 μL/min e um volume final de 1 μL foi injetado.
[0285] Após a injeção final, a cânula foi mantida no SNpc por mais 5 min para evitar refluxo. Em seguida, ela foi lentamente removida do cérebro do rato e o pelo foi fechado por uma sutura. Os camundongos foram monitorados diariamente e, após a cirurgia, receberam injeção subcutânea de carprofeno (5 mg/kg s.c.; volume de 5 ml/kg; Rimadyl, Zoetis) e injeção intraperitoneal de cerca de 200 µL de solução salina estéril para prevenir a desidratação. Os animais são, então colocados na Câmara de Aquecimento MediHeat até que estejam completa- mente acordados. Um mês após a injeção, os animais foram anestesia- dos com isoflurano a 4 % e os cérebros foram processados para análi- ses imuno-histoquímicas e bioquímicas. Todos os experimentos foram feitos às cegas. Análise Estatística
[0286] As analises estatísticas foram realizadas usando o software Prism (Versão 6, Graphpad) usando ANOVA unilateral, com múltiplas comparações (teste de Dunnett) quando aplicável. Resultados
[0287] Conforme mostrado na Figura 7, os vetores D1 e E1 mostra- ram 55 % e 66 % de silenciamento de mRNA de SNCA, respectiva- mente, em relação ao RNAi de controle, demonstrando silenciamento de mRNA no alvo significativo in vivo na estrutura alvo usando a distri- buição mediada por AAV de miRNA de direcionamento de SNCA.
[0288] Conforme mostrado na Figura 8, A sonda antissenso de SNCA mostra claramente a redução no alvo em três níveis anatômicos diferentes, rostal a caudal, em relação ao hemisfério contralateral. O ví- rus de RNAi de controle não mostrou qualquer diminuição no mRNA de SNCA em relação ao hemisfério não injetado, demonstrando a especi- ficidade do efeito. Conforme mostrado na Figura 9, o sinal da proteína alfa-sinucleína no VTA precisava ser saturado para observar a expres- são da sinucleína somática, impedindo qualquer determinação de redu- ção de SNCA nesta região do cérebro.
Exemplo 6: Vetor AAV-D1 reduz o mRNA de SNCA em camundon- gos através de imuno-histoquímica do SNc
[0289] Os camundongos foram injetados unilateralmente com 1e9 GC de controle ou vetor de AVV D1, conforme descrito no Exemplo 5. O tecido foi coletado e as seções coronais foram processadas para imuno-histoquímica (IHC) um mês depois para avaliar os níveis de pro- teína alfa-sinucleína na substância negra compacta. Métodos Adicionais Imuno-histoquímica e ISH
[0290] Os cérebros foram fixados por meio de imersão em formal- deído a 4 % durante pelo menos 2 dias a 4 °C e criopreservados em solução de sacarose a 30 % e, então, congelados. Os cérebros conge- lados foram cortados em seções coronais em série ao longo de todo o eixo ântero-posterior da substância negra (sn). As seções foram coloca- das em pbs-azida de sódio 0,4 % e armazenadas a 4 °C.
[0291] Séries aleatoriamente selecionadas de seções de flutuação livre de 20 µm de espessura foram usadas para realizar a imunomarca- ção com anticorpo monoclonal de camundongo primário contra α-syn (monoclonal de camundongo, 1:2000, clone 42, BD Transductions La- boratories). Este anticorpo pode detectar níveis endógenos de proteína α-syn de camundongo predominantemente com localização em mem- branas sinápticas, mas também dentro de corpos celulares neuronais da área tegmental ventral (VTA) e SN.
[0292] As seções foram lavadas 3 vezes em solução de PBS a 1 M- Triton a 0,15 %, gelatina de pele bovina a 0,2 % (Sigma, G9391) e pré- tratadas em tampão de bloqueio (isto é, PBS a 1 M-albumina de soro bovino a 10 %, Sigma, A8022) durante 30 min. Elas foram, então, incu- badas durante a noite com solução de anticorpo primário em PBS a 1 M em temperatura ambiente. Após lavagem em PBS a 1 M-Triton a 0,15%, gelatina a 0,2 %, anticorpo conjugado com fluorocromo (anticorpo de cabra anti-camundongo 647, Abcam 150119) foi usado como anticorpo secundário (1:400 em PBS a 1 M, 90 min de incubação no escuro, tem- peratura ambiente). As seções foram enxaguadas 2 vezes em solução de PBS a 1 M-gelatina a 0,2 %, 1 vez em PBS a 1 M e montadas (lâmi- nas flexíveis, Dako). As seções foram cobertas com uma lamínula com reagente Prolong Gold Antifade (Invitrogen p36931).
[0293] A análise de imagem qualitativa de imunomarcação fluores- cente foi realizada em um sistema de scanner de lâmina (sistema Olym- pus DotSlide equipado com um microscópio BX61 com capacidade de fluorescência). Resultados
[0294] Conforme mostrado na Figura 9, comparado com o SNc con- tralateral do mesmo animal ou animal injetado com controle, a proteína SNCA no corpo celular é claramente reduzida por D1. Imagens ISH de seções cerebrais adjacentes (painéis inferiores, processados conforme no Exemplo 5) mostram a redução paralela no mRNA de SNCA pelo vetor de RNAi D1, mas não pelo vetor de controle. Estes dados demons- tram que a distribuição por AAV de miRNAs direcionados à SNCA mos- tram silenciamento de mRNA durável na região cerebral desejada. Exemplo 7: Silenciamento do alvo in vivo por E1 no vetor AAVrh.10
[0295] Para determinar o silenciamento in vivo de SNCA e demons- trar que o silenciamento de SNCA não é dependente do sorotipo de AAV, vetores de AAV.rh10 que codificam E1 ou sequências de RNAi de controle foram injetados no SNc de camundongos de tipo selvagem. Os camundongos foram injetados unilateralmente com 10e9 GC de con- trole ou vetor de AAV.rh10 E1 conforme descrito anteriormente. Tecido do SNc foi coletado 1 mês após a injeção. A expressão de mRNA de SNCA foi quantificada por meio de hibridização in situ e a proteína SNCA foi detectada através de imuno-histoquímica. Métodos
Vetores Virais
[0296] Para gerar vírus de rAAV para testagem in vivo, o cassete mir155 foi clonado em um plasmídeo de ITR de AAV2 que contém o promotor de CAG de 1,6 kb para a produção de vírus AAV usando uma capsídeo de sorotipo rh.10 de AAV (Gao, G.P. et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 11854 - 11859.). Todos os vetores virais foram pro- duzidos por meio do método de transfecção tripla em células 293 e pu- rificados conforme descrito (11). As titulações foram determinadas via qPCR e são expressas como cópias genômicas (GC)/mL ou como ge- nomas de vetor total (vg). Animais
[0297] Camundongos C57BL/6J machos (10-12 semanas de idade) foram adquiridos da Charles River Laboratories, França. Os animais fo- ram alojados em grupos de quatro em cada gaiola, com livre acesso a comida e água, com temperatura ambiente e umidade controladas e ci- clo claro/escuro de 12:12 h. Injeção Estereotáxica
[0298] Os camundongos foram profundamente anestesiados com uma injeção intraperitoneal da mistura (volume 10 mL/kg): cetamina (100 mg/kg; Imalgene; Merial, França) e xilazina (10 mg/Kg; Rom- pun; Bayer, França). Antes de posicionar o animal na estrutura este- reotáxica (Kopf Instruments, EUA), o pelo do camundongo foi raspado e desinfetado com Vetidina (Vetoquinol, França), um anestésico local bupivacaína (2 mg/kg em um volume de 5 ml/kg; Aguetante, França) foi injetado por via subcutânea na pele do crânio e Emla (Lidocaína, Astra- zeneca) foi aplicada nas orelhas. Durante a cirurgia, os olhos foram pro- tegidos da luz por vitamina A Dulcis e a temperatura corporal mantida constante em 37°C por uma manta térmica.
[0299] Um pequeno orifício foi feito no osso do crânio acima da co- ordenada de injeção. Uma cânula de calibre 33 (OD 0,254 mm;
Phymep), conectada com um tubo de plástico flexível (Tygon 0,254 * 0,762, ref. AAD04091) a uma seringa de 25 µL (Exmire, ref. MS*GF25) a qual, por sua vez, é conectada a uma bomba de microperfusão (CMA 4004), foi inserida unilateralmente na substância nigra pars compacta esquerda (SNpc) nas seguintes coordenadas: AP = - 2,92 mm do bregma; ML = 1,25 mm; DV: -4,5 mm da dura-máter, de acordo com o Mouse Atlas de Paxinos e Watson (2008). Após randomização, os ca- mundongos (n = 10/grupo) foram injetados com AAV. A infusão foi rea- lizada em uma taxa de 0,2 μL/min e um volume final de 1 μL foi injetado.
[0300] Após a injeção final, a cânula foi mantida no SNpc por mais 5 min para evitar refluxo. Em seguida, ela foi lentamente removida do cérebro do rato e o pelo foi fechado por uma sutura. Os camundongos foram monitorados diariamente e, após a cirurgia, receberam injeção subcutânea de carprofeno (5 mg/kg s.c.; volume de 5 ml/kg; Rimadyl, Zoetis) e injeção intraperitoneal de cerca de 200 µL de solução salina estéril para prevenir a desidratação. Os animais são, então colocados na Câmara de Aquecimento MediHeat até que estejam completa- mente acordados. Um mês após a injeção, os animais foram anestesia- dos com isoflurano a 4 % e os cérebros foram processados para análi- ses imuno-histoquímicas e bioquímicas. Todos os experimentos foram feitos às cegas Imuno-histoquímica e ISH
[0301] Os cérebros foram fixados por meio de imersão em formal- deído a 4 % durante pelo menos 2 dias a 4 °C e criopreservados em solução de sacarose a 30 % e, então, congelados. Os cérebros conge- lados foram cortados em seções coronais em série ao longo de todo o eixo ântero-posterior da substância negra (SN). As seções foram colo- cadas em PBS-azida de sódio a 0,4 % e armazenadas a 4 °C.
[0302] Séries aleatoriamente selecionadas de seções de flutuação livre de 20 µm de espessura foram usadas para realizar a imunomarca- ção com anticorpo monoclonal primário de camundongo contra α-Syn (monoclonal de camundongo, 1:2000, clone 42, BD Transductions La- boratories). Este anticorpo pode detectar níveis endógenos de proteína α-Syn de camundongo predominantemente com localização em mem- branas sinápticas, mas também dentro de corpos celulares neuronais da área tegmental ventral (VTA) e SN.
[0303] Para a revelação enzimática de IHC de α-syn, após incuba- ção em solução de anticorpo primário, as seções foram incubadas em temperatura ambiente com IgG de camundongo biotinilado (BA 9200 Vector, Lote S0913, diluição a 1/400) durante 90 min e depois com com- plexo de avidina acoplado a peroxidase (Vectastain ABC Kit Elite, Vec- tor PK 6100, diluição de 1/200) durante 30 min. As seções foram breve- mente incubadas em solução de substrato de peroxidase (contendo pe- róxido de hidrogênio a 0,003 %, tetra-hidrocloreto de diaminobenzidina a 0,05 % em PBS a 0,1 M) e finalmente enxaguadas em solução de NaCl a 0,9 %. As seções foram finalmente montadas em lâminas e se- cas em temperatura ambiente, desidratadas e cobertas com uma la- mínula usando Eukitt.
[0304] Para estudos de ISH de α-syn, o ensaio RNAscope total- mente automatizado (o qual melhora a proporção sinal-ruído de ISH de RNA ao amplificar sinais específicos do alvo, mas não o ruído de fundo de hibridização não específica). Sobre seções criostáticas de 20 µm de espessura montadas sobre lâminas foram passados Roche Ventana Medical Systems DISCOVERY XT (VS) Automate (RNAscope 2.5 VS Sonda Antissenso - Hs-SNCA (Cat. Nº 313289) e sonda senso de con- trole (Cat. Nº 511079) foram hibridizadas durante 2 h a 43 °C, seguido de amplificação no RNAscope e detecção de cromogênio vermelho usando reagentes de detecção VS. O design da sonda RNAscope foi conforme descrito no presente documento. Lâminas coloridas foram di- gitalizadas com o sistema VS120 Olympus usando uma objetiva de 40X. Análise Estatística
[0305] As analises estatísticas foram realizadas usando o software Prism (Versão 6, Graphpad) usando ANOVA unilateral, com múltiplas comparações (teste de Dunnett) quando aplicável. Resultados
[0306] Conforme mostrado na Figura 10, comparado com o SNc contralateral do mesmo animal ou animal injetado com controle, a pro- teína SNCA nos corpos celulares é claramente reduzida pela constru- ção E1 na capsídeo de AAVrh.10 (painel superior). Imagens de ISH de seções cerebrais adjacentes (painéis inferiores) mostram a redução do alvo paralelo no mRNA de SNCA por AAVrh.10, mas não no hemisfério contralateral. O vírus de RNAi de controle não mostrou qualquer dimi- nuição no mRNA de SNCA em relação ao hemisfério não injetado, de- monstrando a especificidade do efeito. Aqui, é demonstrado que a efici- ência de silenciamento de SNCA por E1 não é dependente do sorotipo da capsídeo, pelo menos após a injeção intranigral do vetor. Exemplo 8: Potenciais fora do alvo de D1 e E1
[0307] Células mesencefálicas humanas de Lund (LUHMES) foram diferenciadas em cultura, em seguida, transfectadas com plasmídeos que expressam o microRNA D1, E1 ou CTL3 (controle) no scaffold de miR-155 endógeno de murino otimizado (ThermoFisher). O RNA total foi isolado das células usando o kit miRNeasy (Qiagen) e as bibliote- cas de sequenciamento de próxima geração preparadas usando o kit TruSeq Total RNA Library Prep (Illumina), seguido de sequenciamento em um instrumento Illumina HiSeq (Genewiz, Plainfield NJ).
[0308] A análise de sequenciamento foi realizada no grupo Geno- mics na Sanofi usando Array Studio (Omicsoft, A Qiagen Company).
Leituras de baixa qualidade foram removidas e as leituras restantes ma- peadas para o genoma humano, seguido por ANOVA unidirecional para determinar genes expressos de forma significativamente diferencial (DEGs) entre os grupos de tratamento.
Genes negativamente regulados por D1 e E1 versus CTL3 com p valores menores do que 0,05 foram considerados como sendo consequências de silenciamento de alfa-Si- nucleína e os genes restantes negativamente regulados por pelo menos 1,2 vezes com p valores < 0,05 foram categorizados como potenciais fora do alvo.
A alfa-sinucleína foi silenciada em 22 % por D1 e 30 % por E1, com pontos de dados individuais mostrados abaixo na Figura 11. Potenciais fora do alvo para D1 e E1 estão listados nas Tabelas 2 e 3. TNFRSF6B na lista de D1 é um supressor de tumor previsto apenas no banco de dados NCKU, e nenhum dos genes na lista de E1 é conside- rado supressor de tumor no banco de dados NCKU ou TSGene.
Ambas as listas de D1 e E1 de potenciais fora do alvo foram sobrepostas com os alvos previstos para os microRNAs D1 e E1 identificados usando os algoritmos miRanda, siSPOTR e TargetRank (dados não incluídos). TABELA 2. POTENCIAL FORA DO ALVO PARA D1 Dl_CTL3_ve- p-va- Nome do Gene Descrição do Gene zes lor ACOQ5943.1 novo transcrito, leitura entre UQ.CR11 e MBD3 0,51 0,0478 LRRC43 Contendo repetições ricas em leucina, 4B 0,74 0,0139 Família da proteína de interação de complexo nuclear pura, membro NPIPA7 0,74 0,003 A7 SNURF Quadro de leitura a montante de SNRPN 0,75 0,0106 ZNF58G Proteína do dedo de zinco 580 0,77 0,0239 CBWD3 Contendo domínio C08W, 3 0,77 0,0072 Nova proteína de dedo de zinco 713 (ZNF713) e proteína ribossômica ACG92S47.S 0,73 0,0068 mitocondrial S17 (MRPS17) FAM71F2 Família com similaridade de sequência 71, membro F2 0,78 0,0157 HIST4H4 Agrupamento de histona 4H4 0,79 0,0028 RTEL1- Leitura RTEL1-TNFRSF6B (NMD candidato) 0,80 0,0028 TNFRSF68 PDF Peptídeo deformilase (mitocondrial) 0,80 0,0423 HAGHL Tipo hidroxiacilglutationa hidrolase 0,82 0,0426 KiSSIR Receptor KISS1 0,82 0,0203
TABELA 3. POTENCIAL FORA DO ALVO PARA E1
Nome do Gene Descrição do Gene El_CTL3_vezes p-valor AC010615.2 Nova proteína, leitura ATP1A3-RA8AC1 -2,21 0,0014 AC117378.1 Nova proteína -1,43 0,0362 ALS62899.2 Nova proteína -1,28 0,0099 NUDCD2 Contendo domínios NudC, 2 -1,24 0,0106 SYNJ2BP-COX16 Leitura SYNJ2BP-COX16 -1,23 0,0231 AL109811.4 Nova proteína -1,22 0,0104
REFERÊNCIAS
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3. R. E. Drolet, B. Behrouz, K. J. Lookingland, J. L. Goudreau, Mice lacking alpha-synuclein have an attenuated loss of striatal dopamine following prolonged chronic MPTP administration. Neurotoxicology 25, 761-769 (2004).
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SEQUÊNCIAS Todas as sequências polipeptídicas são apresentadas a par- tir do N-término para o C-término, a menos que indicado de outra forma. Todas as sequências de ácidos nucleicos são apresentadas a partir de 5' para 3', a menos que indicado de outra forma. D1-alça-passageira -RNA UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCCGUUUUGGCCACUGACUGACGGCUGAGAAC- CAAAGAGUA (SEQ ID NO: 61) D1-alça-passageira -DNA TGCTCTTTGGTCTTCTCAGCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGCTGAGAAC- CAAAGAGTA (SEQ ID NO: 62) E1-alça-passageira -RNA UGGGCACAUUGGAACUGAGCAGUUUUGGCCACUGACUGACUGCUCAGU- CAAUGUGCCUA (SEQ ID NO: 63) E1-alça-passageira -DNA TGGGCACATTGGAACTGAGCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGCTCAGTCAATG- TGCCTA (SEQ ID NO: 64) Sequência Genômica do Vetor D1
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGG- CAAAGCCCGGGCG- TCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG TGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTACGTACAATTGGGATCCCGGACCGTCGACA- TTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATAT ATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCG- CCCAACGAC- CCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTT CCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACAT- CAAGTG- TATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCA TTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAG- T- CATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCC CCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAG- CGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCG AGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCG- CG- CTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAA GCGCGCGGCGGGCGGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCG- CTCCGCCGCCG- CCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGC GGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTT- CTTTT- CTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAG CGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGG- CTCCGCGCTG- CCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGT GCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTG- CGAGGGGAA- CAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGT CGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGG- CCCGGCTT- CGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGG GTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGG- CTCGGGG- GAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCA GCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAA- TCTG- TGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGA AGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCG- CCGCGCCG- CCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCG GGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTC- TAGAGCCTCTG- CTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTG TGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTTCGAAAGATCTGCTAGCCTAGACTGGAGG- CTTGCTGAAGGCTGTATGCTGTGCTCTTTGGTCTTCTCAGCCGTTTTGGCCACTGACTG ACGGCTGAGAACCAAAGAGTACAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAA- CAAA- TGGCCCAGATCTGGCCGCACTCGAGATATCGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCC TTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGA- AGGTG- CCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGT GTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAA- GACAA- TAGCAGGCATGCTGGGGAGCTAGAGTCGACCGGACCGGTGGAAGTCCTCTTCCTCGG TGTCCTTGACTTCAAAGGGTCTCTCCCATTTGCCTGGAGAGAGGGGAAGGTGGGCAT- CACCA- GGGGTGAGTGAAGGTTTGGAAGAGTGTAGCAGAATAAGAAACCATGAGTCCCCTCCCT GAGAAGCCCTGAGCCCCCTTGACGACACACATCCCTCGAGGCTCAGCTTCATCATCTG- TAAAAGGTGCTGAAACTGACCATCCAAGCTGCCGAAAAAGATTGTGTGGGGATAATTCA AAACTAGAGGAAGATGCAGAATTTCTACATCGTGGCGATGTCAGGCTAAGAGATG- CCATCG- TGGCTGTGCATTTTTATTGGAATCATATGTTTATTTGAGGGTGTCTTGGATATTACAAATA AAATGTTGGAGCATCAGGCATATTTGGTACCTTCTGTCTAAGGCTCCCTGCCCCTTGT- TAA- TTGGCAGCTCAGTTATTCATCCAGGGCAAACATTCTGCTTACTATTCCTGAGAGCTTTCC TCATCCTCTAGATTGGCAGGGGAAATGCAGATGCCTGAGCAGCCTCCCCTCTGCCATA- CCAA- CAGAGCTTCACCATCGAGGCATGCAGAGTGGACAGGGGCCTCAGGGACCCCTGATCC CAGCTTTCTCATTGGACAGAAGGAGGAGACTGGGGCTGGAGAGGGACCTGGG- CCCCCAC- TAAGGCCACAGCAGAGCCAGGACTTTAGCTGTGCTGACTGCAGCCTGGCTTGCCTCCA CTGCCCTCCTTTGCCTCAAGAGCAAGGGAGCCTCAGAGTGGAGGAAGCAGCCCCTGG- CCTTG- CCTCCCACCTCCCCTCCCCTATGCTGTTTTCCTGGGACAGTGGGAGCTGGCTTAGAAT GCCCTGGGGCCCCCAGGACCCTGGCATTTTAACCCCTCAGGGGCAGGAAGGCAG- CCTGAGA- TACAGAAGAGTCCATCACCTGCTGTATGCCACACACCATCCCCACAGTCGACATTTAAA TTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCAC- TGAGG-
CCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGC GAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA (SEQ ID NO: 65).
Ácido Nucleico de Enchimento A1AT ATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAG- CAAGGGGGAG-
GATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGCTAGAGTCGACCGGACCGGTGGAA GTCCTCTTCCTCGGTGTCCTTGACTTCAAAGGGTCTCTCCCATTTGCCTGGA- GAGAGGGGA- AGGTGGGCATCACCAGGGGTGAGTGAAGGTTTGGAAGAGTGTAGCAGAATAAGAAACC ATGAGTCCCCTCCCTGAGAAGCCCTGAGCCCCCTTGACGACACACATCCCTCGAGG- CTCAG- CTTCATCATCTGTAAAAGGTGCTGAAACTGACCATCCAAGCTGCCGAAAAAGATTGTGT GGGGATAATTCAAAACTAGAGGAAGATGCAGAATTTCTACATCGTGGCGATGTCAGGC- TAAGAGATGCCATCGTGGCTGTGCATTTTTATTGGAATCATATGTTTATTTGAGGGTGTC TTGGATATTACAAATAAAATGTTGGAGCATCAGGCATATTTGGTACCTTCTGTCTAAGG- CTCCCTGCCCCTTGTTAATTGGCAGCTCAGTTATTCATCCAGGGCAAACATTCTGCTTAC TATTCCTGAGAGCTTTCCTCATCCTCTAGATTGGCAGGGGAAATGCAGATGCCTGAG- CAG- CCTCCCCTCTGCCATACCAACAGAGCTTCACCATCGAGGCATGCAGAGTGGACAGGGG CCTCAGGGACCCCTGATCCCAGCTTTCTCATTGGACAGAAGGAGGAGACTGGGGCTG- GA- GAGGGACCTGGGCCCCCACTAAGGCCACAGCAGAGCCAGGACTTTAGCTGTGCTGAC TGCAGCCTGGCTTGCCTCCACTGCCCTCCTTTGCCTCAAGAGCAAGGGAGCCTCA- GAGTGGA- GGAAGCAGCCCCTGGCCTTGCCTCCCACCTCCCCTCCCCTATGCTGTTTTCCTGGGAC AGTGGGAGCTGGCTTAGAATGCCCTGGGGCCCCCAGGACCCTGGCATTTTAACCCCT- CA-
GGGGCAGGAAGGCAGCCTGAGATACAGAAGAGTCCATCACCTGCTGTATGCCACACAC CATCCCCACAGTCGACATTTAAATT (SEQ ID NO: 66)

Claims (102)

REIVINDICAÇÕES
1. RNAi que compreende uma primeira fita e uma segunda fita, caracterizado pelo fato de que: a) a primeira fita e a segunda fita formam um duplex; b) a primeira fita compreende uma região guia, em que a re- gião guia compreende um ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCA- GCC-3' (SEQ ID NO: 24) ou pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8); e c) a segunda fita compreende uma região não guia.
2. RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região guia compreende a sequência de ácidos nucleicos 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) e a região não guia compreende a sequência 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3' (SEQ ID NO: 53).
3. RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira fita compreende uma sequência de ácidos nuclei- cos que tem cerca de 90 % de identidade com SEQ ID NO: 24 ou cerca de 90 % de identidade com SEQ ID NO: 53.
4. RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região guia compreende a sequência de ácidos nucleicos 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e a região não guia compreende a sequência 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3' (SEQ ID NO: 37).
5. RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a segunda fita compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem cerca de 90 % de identidade com SEQ ID NO: 37 ou cerca de 90 % de identidade com SEQ ID NO: 37.
6. RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a primeira fita e a segunda fita são ligadas através de um ligante de RNA capaz de formar uma estrutura de alça.
7. RNAi, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o ligante de RNA compreende a partir de 4 a 50 nucleotí- deos.
8. RNAi, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a estrutura de alça compreende a partir de 4 a 20 nu- cleotídeos.
9. RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o RNAi compreende, a partir de 5' para 3', a segunda fita, o ligante de RNA e a primeira fita.
10. RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o RNAi compreende, a partir de 5' para 3', a primeira fita, o ligante de RNA e a segunda fita.
11. RNAi, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o RNAi compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 61 ou SEQ ID NO: 63.
12. RNAi, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o RNAi compreende uma sequência de nucleotídeos cerca de 90% idêntica à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 61 ou SEQ ID NO: 63.
13. RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o RNAi é um pequeno RNA inibidor (siRNA), um microRNA (miRNA) ou um pequeno RNA em gancho (shRNA).
14. RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o RNAi tem como alvo o RNA que codifica um polipeptídeo associado a uma sinucleinopatia neurodege- nerativa.
15. RNAi, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é alfa-sinucleína (SNCA).
16. RNAi, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a alfa-sinucleína é alfa-sinucleína humana.
17. RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que a sinucleinopatia neurodegene- rativa é mal de Parkinson (PD), atrofia de múltiplos sistemas (MSA) ou demência com corpos de Lewy (DLB).
18. Construção de expressão, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico que codifica o RNAi como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.
19. Construção de expressão, de acordo com a reivindica- ção 18, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o RNAi compreende uma estrutura de miRNA.
20. Construção de expressão, de acordo com a reivindica- ção 18 ou 19, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codi- fica o RNAi está operativamente ligado a um promotor.
21. Construção de expressão, de acordo com a reivindica- ção 20, caracterizada pelo fato de que o promotor é selecionado a partir de um promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMV), uma LTR de RSV, uma LTR de MoMLV, um promotor de fosfoglicerato quinase-1 (PGK), um promotor de vírus símio 40 (SV40), um promotor CK6, um promotor de transtirretina (TTR), um promotor TK, um promotor respon- sivo à tetraciclina (TRE), um promotor HBV, um promotor hAAT, um pro- motor LSP, um promotor quimérico específico para fígado (LSP), um promotor E2F, um promotor de telomerase (hTERT); um estimula- dor de citomegalovírus/promotor de beta-actina de galinha/promotor de β-globina de coelho (CAG), um promotor de fator de alongamento 1-alfa (EF1-alfa), um promotor de β-glucuronidase humana, um promotor de β-actina de galinha (CBA), um promotor de LTR do vírus do sarcoma de Rous retroviral (RSV), um promotor de di-hidrofolato redutase e um promotor de 13-actina.
22. Construção de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizada pelo fato de que a construção de expressão compreende ainda um íntron.
23. Construção de expressão, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o íntron é um íntron de CBA ou um ín- tron de hEF1alfa.
24. Construção de expressão, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o íntron é um íntron quimérico.
25. Construção de expressão, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o vetor de expressão é um vetor au- tocomplementar e o íntron é um íntron quimérico delta.
26. Construção de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 25, caracterizada pelo fato de que a construção de expressão compreende ainda um sinal de poliadenilação.
27. Construção de expressão, de acordo com a reivindica- ção 26, caracterizada pelo fato de que o sinal de poliadenilação é um sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino, um sinal de poliadenilação SV40 ou um sinal de poliadenilação TK de HSV.
28. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a construção de expressão como definida em qualquer uma das reivindi- cações 18 a 27.
29. Vetor, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor de vírus adeno-associado recombi- nante (rAAV).
30. Vetor de rAAV, de acordo com a reivindicação 29, carac- terizado pelo fato de que a construção de expressão é flanqueada por uma ou mais sequências de repetição terminal invertida (ITR) de AAV.
31. Vetor de rAAV, de acordo com a reivindicação 30, carac- terizado pelo fato de que a construção de expressão é flanqueada por duas ITRs de AAV.
32. Vetor de rAAV, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que as ITRs de AAV são ITRs de sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AA- Vrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, uma AAV de cabra, AAV bovino ou AAV de camundongo.
33. Vetor de rAAV, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 30 a 32, caracterizado pelo fato de que as ITRs de AAV são ITRs de AAV2.
34. Vetor de rAAV, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 30 a 33, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende ainda um ácido nucleico de enchimento.
35. Vetor de rAAV, de acordo com a reivindicação 34, carac- terizado pelo fato de que o ácido nucleico de enchimento está a mon- tante ou a jusante do ácido nucleico que codifica o RNAi.
36. Vetor de rAAV, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 30 a 35, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor de rAVV autocomplementar.
37. Vetor de rAAV, de acordo com a reivindicação 36, ca- racterizado pelo fato de que o vetor compreende uma primeira sequên- cia de ácidos nucleicos que codifica o RNAi e uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica um complemento do RNAi, em que a primeira sequência de ácidos nucleicos pode formar pares de bases in- trafita com a segunda sequência de ácidos nucleicos ao longo da maio- ria ou todo o seu comprimento.
38. Vetor de rAAV, de acordo com a reivindicação 37, carac- terizado pelo fato de que a primeira sequência de ácidos nucleicos e a segunda sequência de ácidos nucleicos estão ligadas através de uma
ITR de AAV mutante, em que a ITR de AAV mutante compreende uma eliminação da região D e compreende uma mutação da sequência de resolução terminal.
39. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende o ve- tor de rAAV como definido em qualquer uma das reivindicações 29 a
38.
40. Partícula de AAV recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de rAAV como definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 38.
41. Partícula de rAAV, de acordo com a reivindicação 40, ca- racterizada pelo fato de que a partícula viral de AAV compreende um AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AA- Vrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2- 7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV2-HBKO, AAVDJ8, AAVPHP.B, AAVPHP.eB, AAVBR1, AA- VHSC15, AAVHSC17, um AAV caprino, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino ou cápside de AAV2 de camundongo de sorotipo rAAV2/HBoV1.
42. Partícula de rAAV, de acordo com a reivindicação 40 ou 41, caracterizada pelo fato de que a ITR e a cápside da partícula viral de rAAV são derivadas do mesmo sorotipo de AAV.
43. Partícula de rAVV, de acordo com a reivindicação 40 ou 41, caracterizada pelo fato de que a ITR e a cápside da partícula de rAVV viral são derivados de diferentes sorotipos de AAV.
44. Partícula de rAVV, de acordo com a reivindicação 43, ca- racterizada pelo fato de que a ITR é derivada de AAV2 e a cápside da partícula de rAAV é derivada de AAV1.
45. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a partícula de rAAV como definida em qualquer uma das reivindicações 40 a 44.
46. Composição, de acordo com a reivindicação 45, caracte- rizada pelo fato de que a composição compreende ainda um veículo far- maceuticamente aceitável.
47. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o RNAi como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.
48. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende a partí- cula AAV como definida em qualquer uma das reivindicações 40 a
44.
49. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende a com- posição como definida na reivindicação 45 ou 46.
50. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 49, caracterizado pelo fato de que compreende ainda instruções de uso.
51. Método para tratar uma sinucleinopatia neurodegenera- tiva em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende ad- ministrar ao mamífero um RNAi que compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCA- GCC-3' (SEQ ID NO: 24) ou uma primeira fita que compreende um pri- meiro ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico.
52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o segundo ácido nucleico compreende ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90% de identidade com a sequência 5'- GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3' (SEQ ID NO: 53) ou um ácido nu- cleico que tem pelo menos cerca de 90% de identidade com a sequência 5'-E1passageiro-3' (SEQ ID NO: 37).
53. Método para tratar uma sinucleinopatia neurodegenera-
tiva em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende ad- ministrar ao mamífero de um RNAi que compreende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'-UGCUCUUUGGUCUUCU- CAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identi- dade com a sequência 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3' (SEQ ID NO: 53) ou uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nu- cleico que tem pelo menos cerca de 90 % identidade com a sequência 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90% de identidade com a sequência 5'-UGCUCAGUCAAU- GUGCCUA-3' (SEQ ID NO: 37).
54. Método para inibir a expressão de alfa-sinucleína em um mamífero que tem uma doença neurodegenerativa, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao mamífero de um RNAi que com- preende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'- UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) ou uma primeira fita que compreende um ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90% de identidade com a sequência 5'-UGGGCACAUUGGAACU- GAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita que compreende um segundo nucleico ácido.
55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o segundo ácido nucleico compreende um ácido nu- cleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequên- cia 5'-GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3' (SEQ ID NO: 53) ou ácido nu- cleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequên- cia 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3' (SEQ ID NO: 37).
56. Método para inibir a expressão de alfa-sinucleína em um mamífero que tem uma doença neurodegenerativa, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao mamífero um RNAi que com- preende uma primeira fita que compreende um primeiro ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequência 5'- UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO: 24) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 90% de identidade com a sequência 5'-GGCUGAGAAC- CAAAGAGUA-3' (SEQ ID NO: 53) ou uma primeira fita que compreende um primeiro nucleico ácido que tem pelo menos cerca de 90 % de iden- tidade com a sequência 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) e uma segunda fita que compreende um segundo ácido nu- cleico que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade com a sequên- cia 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3' (SEQ ID NO: 37).
57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 51 a 56, caracterizado pelo fato de que a primeira fita compreende a sequência de ácidos nucleicos que tem a sequência de SEQ ID NO: 24 ou um ácido nucleico que tem a sequência de SEQ ID NO: 8.
58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52, 53, 55 ou 56, caracterizado pelo fato de que a segunda fita compre- ende o ácido nucleico que tem a sequência de SEQ ID NO: 53 ou o ácido nucleico que tem a sequência de SEQ ID NO: 37.
59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 58, caracterizado pelo fato de que a primeira fita e a segunda fita são ligadas através de um ligante de RNA capaz de formar uma es- trutura de alça.
60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracteri- zado pelo fato de que o ligante de RNA compreende a partir de 4 a 50 nucleotídeos.
61. Método, de acordo com a reivindicação 59 ou 60, carac- terizado pelo fato de que a estrutura de alça compreende a partir de 4 a
20 nucleotídeos.
62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 59 a 61, caracterizado pelo fato de que o RNAi compreende, a partir de 5' para 3', a segunda fita, o ligante de RNA e a primeira fita.
63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 61, caracterizado pelo fato de que o RNAi compreende, a partir de 5' para 3', a primeira fita, o ligante de RNA e a segunda fita.
64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o RNAi compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 61 ou SEQ ID NO: 63.
65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o RNAi compreende uma sequência de nucleotídeos cerca de 90 % idêntica à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 61 ou SEQ ID NO: 63.
66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 65, caracterizado pelo fato de que o RNAi é codificado em uma construção de expressão.
67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 66, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o RNAi compreende uma estrutura de miRNA.
68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 67, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o RNAi está operativamente ligado a um promotor.
69. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o promotor é capaz de expressar o RNAi no cérebro de um mamífero.
70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o promotor é selecionado a partir de um promotor pre- coce imediato de citomegalovírus (CMV), uma LTR de RSV, uma LTR de MoMLV, um promotor de fosfoglicerato quinase-1 (PGK), um promo- tor de vírus símio 40 (SV40), um promotor CK6, um promotor de trans- tirretina (TTR), um promotor TK, um promotor responsivo à tetraciclina (TRE), um promotor HBV, um promotor hAAT, um promotor LSP, um promotor quimérico específico para fígado (LSP), um promotor E2F, um promotor de telomerase (hTERT); um estimulador de citomegaloví- rus/promotor de beta-actina de galinha/promotor de β-globina de coelho (CAG), um promotor de fator de alongamento 1-alfa (EF1-alfa), um pro- motor de β-glucuronidase humana, um promotor de β-actina de gali- nha (CBA), um promotor de LTR do vírus do sarcoma de Rous retroviral (RSV), um promotor de di-hidrofolato redutase e um promotor de 13-ac- tina.
71. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 70, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor hí- brido de β-actina de galinha (CBA) que compreende um intensificador de CMV e um promotor de β-actina de galinha.
72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 71, caracterizado pelo fato de que a construção de expressão com- preende ainda um íntron.
73. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o íntron é um íntron CBA.
74. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o íntron é um íntron quimérico.
75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a construção de expressão é um vetor autocomplemen- tar e o íntron é um íntron quimérico delta.
76. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 75, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende ainda um sinal de poliadenilação.
77. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que o sinal de poliadenilação é um sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino.
78. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 66 a 77, caracterizado pelo fato de que a construção de expressão é codificada por um vetor.
79. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor de vírus adeno-associado recombi- nante (rAAV).
80. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que a construção de expressão é flanqueada por uma ou mais sequências de repetição terminal invertida (ITR) de AAV.
81. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que a construção de expressão é flanqueada por duas ITRs de AAV.
82. Método, de acordo com a reivindicação 80 ou 81, carac- terizado pelo fato de que as ITRs de AAV são ITRs de sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R71, AAV DJ, um AAV de cabra, AAV bovino ou AVV de camundongo.
83. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 80 a 82, caracterizado pelo fato de que as ITRs de AAV são ITRs de AAV2.
84. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV compreende, a partir de 5' para 3', uma ITR de AAV2, um promotor, um íntron, um ácido nucleico que codifica o RNAi, um sinal de poliadenilação e uma ITR de AAV2.
85. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor CBA.
86. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que o íntron é um íntron quimérico, um íntron quimérico delta ou um íntron quimérico abreviado.
87. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que o íntron quimérico é um íntron de beta globina de coelho CBA+.
88. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 87, caracterizado pelo fato de que o sinal de poliadenilação é um sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino.
89. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV compreende, a partir de 5' para 3', uma ITR de AAV2, o promotor CBA, um íntron quimérico, um ácido nucleico que codifica o RNAi, um sinal de poliadenilação do hormônio de cresci- mento bovino e uma ITR de AAV2.
90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende ainda um ácido nucleico de enchi- mento.
91. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracteri- zado pelo fato de que o ácido nucleico de enchimento compreende o ín- tron 1 do gene A1AT humano.
92. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 91, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor autocomple- mentar.
93. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende a primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica o RNAi e uma segunda sequência de ácidos nu- cleicos que codifica um complemento do RNAi, em que a primeira se- quência de ácidos nucleicos pode formar pares de bases intrafita com a segunda sequência de ácidos nucleicos ao longo da maioria ou todo o seu comprimento.
94. Método, de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo fato de que a primeira sequência de ácidos nucleicos e a segunda sequência de ácidos nucleicos são ligadas através de uma ITR de AAV mutante, em que a ITR de AAV mutante compreende uma eliminação da região D e compreende uma mutação da sequência de resolução terminal.
95. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 94, caracterizado pelo fato de que o vetor é encapsulado em uma partícula de rAAV.
96. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que a partícula viral de AAV compreende uma cápside de sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AA- Vrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2 -7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, AAV2 -HBKO, AAVDJ8, AAVPHP.B, AAVPHP.eB, AA- VBR1, AAVHSC15, AAVHSC17, AAV caprino, AVV bovino, AAV1/AAV2 quimérico ou rAAV2/HBoV1.
97. Método, de acordo com a reivindicação 95 ou 96, carac- terizado pelo fato de que a ITR e a cápside da partícula viral de Raav são derivadas do mesmo sorotipo de AAV.
98. Método, de acordo com a reivindicação 95 ou 96, carac- terizado pelo fato de que a ITR e a cápside das partículas virais de rAAV são derivados de diferentes sorotipos de AAV.
99. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 95 a 98, caracterizado pelo fato de que a partícula viral de rAAV com- preende a cápside de AAV2.
100. Método, de acordo com a reivindicação 99, caracteri- zado pelo fato de que a partícula viral de rAAV compreende uma cápside de AAV1 e em que o vetor compreende ITRs de AAV2.
101. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 51 a 100, caracterizado pelo fato de que a partícula de rAAV como definida em qualquer uma das reivindicações 95 a 100 está em uma composição.
102. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracteri- zado pelo fato de que a composição compreende ainda um veículo far- maceuticamente aceitável.
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