BR112016021017B1 - Partículas de raav, composições e uso das mesmas no tratamento para retinite pigmentosa ou no tratamento do estresse do retículo endoplasmático - Google Patents

Abstract

TERAPIA GÊNICA PARA RETINITE PIGMENTOSA. A presente invenção refere-se a métodos fornecidos aqui para o tratamento de retinite pigmentosa usando uma partícula de AAV que codifica o miR-708. Em um aspecto, as partículas virais são administradas aos olhos de um sujeito humano; por exemplo, por injeção sub-retiniana. As partículas virais compreendendo os capsídeos de AAV5 ou mutantes dos mesmos são contemplados.

Description

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

[001] Este pedido reivindica prioridade ao pedido provisório de patente U.S. n° de série 61/969,027, depositado em 21 de março de 2014, que está aqui integralmente incorporado, por referência.

Listagem de Sequências

[002] O conteúdo da seguinte apresentação em arquivo de texto ASCII é aqui incorporado por referência em sua totalidade: uma forma legível por computador (CRF) da Listagem de sequências (nome do arquivo: 159792010040SeqList.txt, dados registrados em: 17 de março de 2015, tamanho: 63 KB).

Campo da Invenção

[003] A presente invenção refere-se a vetores AAV e métodos de utilização de vetores AAV para o tratamento de retinite pigmentosa.

Breve Sumário da Invenção

[004] A Retinite pigmentosa (RP) é a causa mais comum de degeneração retiniana hereditária, o que é clinicamente caracterizada por cegueira noturna e a perda de visão periférica. As mutações na rodopsina, pigmento visual dos bastonetes, são reconhecidas como a causa mais comum de doença autossômica dominante RP (ADRP), e apesar de uma série de tratamentos para rodopsina RP ter sido proposta e testada em modelos animais e estudos clínicos, a doença permanece incurável (Kalloniatis, M., et al. (2004) Clin. Exp. Optom. 87(2):65-80). Muitos dados apoiam o ponto de vista que a rodopsina RP é uma doença de desdobramento da proteína na qual o desdobramento ou montagem errada de uma proteína mutante altera o seu destino celular e induz a morte celular (Gregersen, N. et al. (2006) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 7:103-24). As mutações RP conhecidas no gene da rodopsina incluem mutações de deleções "inframe", de sentido incorreto e curtas, com uma única substituição de base no códon 23 (P23H) do gene da rodopsina contabilizando de ~7% de todos os casos de Retinite Pigmentosa dominante em EUA (Dryja, T.P., et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(22):10177- 81). Em cultura de células, a proteína mutante P23H, ao contrário da proteína do tipo selvagem (TS) é retida no ER, levando a indução da resposta da proteína desdobrada (UPR), inibição da proteassoma, e agregação da proteína mutante em espécies de alto peso molecular oligoméricas que formam inclusões intracelulares (Saliba, R.S., et al. (2002) J. Cell Sci. 115:2907-18). Da mesma forma, a rodopsina P23H se localiza de forma incorreta e/ou se agrega nas células bastonetes de modelos animais RP (Olsson, J.E., et al. (1992) Neuron 9(5):815- 30), sugerindo que os modelos de cultura celulares podem ser preditivos de modelos in vivo dessa doença. O que é necessário é um meio de atenuar os sintomas de RP.

[005] A invenção descrita neste documento fornece métodos para tratamento de retinose pigmentosa em um mamífero, compreendendo a administração ao olho do mamífero uma partícula viral do virus adeno-associado recombinante (rAAV) compreendendo um vetor de codificação de um miR-708. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV compreende um ácido nucleico que codifica um miR-708 e uma rodopsina. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento de retinite pigmentosa compreendendo administrar aos olhos dos mamíferos uma primeira partícula viral de rAAV compreendendo um primeiro vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica um miR-708 e uma segunda partícula viral de rAAV compreendendo um segundo vetor rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica uma rodopsina. Em outras modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento de retinite pigmentosa compreendendo administrar aos olhos dos mamíferos uma partícula viral de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica um miR-708 e uma rodopsina. Em algumas modalidades, o tratamento de retinite pigmentosa compreende a redução ou prevenção de sintomas associados com a retinite pigmentosa. Em algumas modalidades da invenção, métodos de tratamento de retinite pigmentosa incluem métodos de redução de um sintoma associado com RP, métodos de prevenção de degeneração retinal, métodos para parar a progressão da RP, métodos para aumentar a função do fotorreceptor, e similares. Sintomas e/ou patologia da RP incluem, mas não se limitam a, perda da visão, perda de visão noturna, perda de campo visual periférico, perda de função do ERG; perda da acuidade visual e sensibilidade ao contraste; perda de comportamento visualmente orientado, redução na função do fotorreceptor, morte celular do fotorreceptor do bastonete, diminuição da visão escotópica, redução das alterações celulares retinais (perda de estrutura ou função fotorreceptora; afinamento ou espessamento da camada nuclear externa (ONL); afinamento ou espessamento da camada plexiforme externa (OPL); desorganização seguida de perda dos segmentos externos do bastonete e do cone; encurtamento dos segmentos externos do bastonete haste e do cone; retração dos dendritos de células bipolares; afinamento ou espessamento das camadas retinais internas incluindo camada nuclear interna, camada plexiforme interna, camada de células do gânglio e camada de fibras nervosas; localização errada da opsina; superexpressão de neurofilamentos; e similares. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para evitar a deterioração da função celular do bastonete e a morte celular do bastonete e a função celular do cone e a morte celular do cone.

[006] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para o tratamento de estresse do retículo endoplasmático (RE) em uma célula compreendendo administrar aos mamíferos uma partícula viral de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica um miR-708. Em algumas modalidades, o mamífero tem ou está em risco de ter RP. Em algumas modalidades, o mamífero é um humano que tem ou está em risco de ter RP. Em algumas modalidades, a partícula de rAAV é administrada a um olho do mamífero. Em algumas modalidades, a célula é uma célula ocular. Em outras modalidades, a célula é uma célula fotoreceptora. Em ainda outras modalidades, a célula é uma célula fotoreceptora de bastonete. Em umas modalidades, o método compreende a redução de um ou mais marcadores celulares de estresse de RE. Em outras modalidades, um ou mais marcadores celulares de estresse de RE é XBP-1, CHP ou Grp78 submetidos a splicing. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV compreende um ácido nucleico que codifica um miR-708 e uma rodopsina. Em outras modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento do estresse do retículo endoplasmático (RE) em uma célula compreendendo administrar ao mamífero um primeiro vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica um miR-708 e uma segunda partícula viral de rAAV compreendendo um segundo vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica uma rodopsina.

[007] Em algumas modalidades da invenção, o ácido nucleico que codifica miR-708 está ligado de maneira funcional a um promotor. Em algumas modalidades, o promotor é capaz de expressar o miR- 708 nas células fotorreceptoras (por exemplo, uma célula fotorreceptora do bastonete). Em outras modalidades, o promotor compreende um promotor da rodopsina quinase (RK) ou um promotor da opsina. Em outras modalidades da invenção, o ácido nucleico que codifica a rodopsina está ligado de maneira funcional a um promotor. Em algumas modalidades, o promotor é capaz de expressar a rodopsina nas células fotorreceptoras (por exemplo, uma célula fotorreceptora do bastonete). Em outras modalidades, o promotor compreende um promotor da rodopsina quinase (RK) ou um promotor da opsina.

[008] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento de RP e/ou do estresse do RE compreendendo administrar aos mamíferos uma partícula de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica um miR-708 e uma rodopsina. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 e o ácido nucleico que codifica a rodopsina está ligado de maneira funcional a um promotor de RK. Em outras modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 está ligada de maneira funcional a um primeiro promotor de RK ou um primeiro promotor da opsina e o ácido nucleico que codifica a rodopsina está ligado de maneira funcional a um segundo promotor de RK ou um segundo promotor da opsina. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo promotor da opsina inclui um íntron do MVM (por exemplo, por um intrão da SEQ ID NO: 23). Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 é 5' para o ácido nucleico que codifica a rodopsina. Em outra modalidade, o ácido nucleico que codifica o miR-708 é 3' para o ácido nucleico que codifica a rodopsina. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica miR-708 está ligado de maneira funcional a um promotor de β-actina de galinha (CBA). Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a rodopsina está ligado de maneira funcional a um promotor de β-actina de galinha (CBA). Em algumas modalidades, uma sequência derivada de um íntron do vírus minuto de camundongo (MVM) está localizado 3' para o promotor. Em algumas modalidades, o íntron do MMV compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, o promotor compreende ainda i) um potencializador de CMV; ii) uma sequência derivada de um fator de transcrição específico fotorreceptor; iii) uma sequência derivada de um fator de transcrição específicos fotorreceptor de bastonete; iv) uma sequência derivada de um fator de zíper básico retinal neural; v) uma sequência derivada de uma sequência do fator de transcrição contendo homeobox de bastonetes e cones; vi) um potencializador CMV e pelo menos uma ou mais sequência derivada de um fator de transcrição específico fotorreceptor, uma sequência derivada de um fator de transcrição específico fotorreceptor de bastonete, uma sequência derivada de um fator de zíper básico retinal neural; uma sequência derivada de uma sequência do fator de transcrição contendo o homeobox de cones e bastonetes; vii) um fator de zíper de leucina básica retinal neural, um potencializador de CMV e um promotor de opsina (-500 a +17); viii) um fator de zíper de leucina básica retinal neural, um potencializador de CMV, um promotor de opsina (-500 a +17), e um íntron de MVM; ix) um potencializador de CMV compreendendo a SEQ ID NO: 29; x) uma sequência do fator de zíper de leucina básica retinal neural compreendendo a SEQ ID NO: 30; xi) uma sequência derivada de uma sequência do fator de transcrição contendo homeobox de cones e bastonetes compreendendo a SEQ ID NO: 28; xii) um potencializador de CMV compreendendo a SEQ ID NO: 29 e pelo menos uma ou mais de uma sequência derivada do fator de transcrição específico fotorreceptor, uma sequência derivada de um fator de zíper básico retinal neural compreendendo a SEQ ID NO: 30; uma sequência derivada de uma sequência do fator de transcrição contendo homeobox de cones e bastonetes compreendendo a SEQ ID NO: 28; xiii) um fator de zíper de leucina básica retinal neural compreendendo a SEQ ID NO: 30, um potencializador de CMV compreendendo a SEQ ID NO: 29 e um promotor de opsina (-500 a +17) compreendendo a SEQ ID NO: 22; ou xiv) um fator de zíper de leucina básico retinal neural compreendendo a SEQ ID NO: 28, um potencializador de CMV compreendendo a SEQ ID NO: 29, um promotor de opsina (-500 a +17) compreendendo a SEQ ID NO: 22 e um íntron de MVM compreendendo a SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR- 708 é embebido em um íntron. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 compreende uma estrutura endógena de miR-708 ou uma estrutura de miR-155.

[009] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento de RP e/ou do estresse do RE compreendendo administrar a um mamífero uma partícula de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica um miR-708. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 compreende o ácido nucleico da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 compreende um ácido nucleico que é pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico a SEQ ID NO: 1.

[0010] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento de RP e/ou do estresse do RE compreendendo administrar a um mamífero uma partícula de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica uma rodopsina. Em algumas modalidades, a rodopsina é a rodopsina de mamíferos ou equivalente funcional das mesmas. Em algumas modalidades, a rodopsina é a rodopsina humana ou equivalente funcional das mesmas. Em algumas modalidades, a rodopsina carece da região 3' não traduzida (UTR) da sequência alvo de miR- 708. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a rodopsina compreende uma substituição, inserção ou deleção de ácido nucleico na sequência alvo de miR-708. Em algumas modalidades, a substituição, inserção ou deleção reduz ou impede o reconhecimento por miR-708. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a rodopsina compreende uma substituição, inserção ou deleção de ácido nucleico na sequência alvo de miR-708, sendo que a sequência alvo de miR-708 é a SEQ ID NO: 19. Em algumas modalidades, a expressão da rodopsina é refratária à supressão por miR-708. Em algumas modalidades, a rodopsina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a rodopsina compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a rodopsina compreende o ácido nucleico da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a rodopsina compreende um ácido nucleico tendo pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 3.

[0011] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento de RP e/ou do estresse de RE compreendendo administração a um mamífero, uma partícula de rAAV compreendendo um polinucleotídeo de SEQ ID NO:5., SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:9. Em algumas modalidades, a partícula viral de AAV compreende um genoma viral recombinante compreendendo um polinucleotídeo, tendo em torno de pelo menos t 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com as SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 ou SEQ ID NO:27.

[0012] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento de RP e/ou do estresse do RE compreendendo administração a um mamífero, uma partícula de rAAV em que a partícula viral de AAV compreende um capsídeo de sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7M8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, um AAV de cabra, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino, ou capsídeo AAV de camundongo rAAV2/HBoV1. Em algumas modalidades, a partícula viral de rAAV compreende um capsídeo de AAV de sorotipo 5. Em algumas modalidades, a partícula viral de rAAV compreende um capsídeo mutante de tirosina de AAV de sorotipo 5.

[0013] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento de RP e/ou do estresse do RE compreendendo administrar a um mamífero uma primeira partícula viral de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica o miR-708 e uma segunda partícula viral de rAAV que codifica uma rodopsina. Em algumas modalidades, a partícula de rAAV e/ou a segunda partícula viral de rAAV compreende um capsídeo de sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7M8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, um AAV de cabra, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino, ou capsídeo AAV de camundongo rAAV2/HBoV1. Em algumas modalidades, a primeira partícula viral de rAAV e/ou a segunda partícula viral de rAAV compreende um capsídeo AAV de sorotipo 5. Em algumas modalidades, a primeira partícula viral de rAAV e/ou a segunda partícula viral de rAAV compreende um capsídeo mutante de tirosina de AAV de sorotipo 5.

[0014] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento de RP e/ou do estresse do RE compreendendo administração a um mamífero, uma partícula de rAAV em que o vetor de AAV compreendendo um AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um AAV de cabra, AAV bovino, ou AAV de camundongo de sorotipo ITR. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento de RP e/ou do estresse do RE compreendendo administrar a um mamífero uma primeira partícula viral de rAAV compreendendo um primeiro vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica o miR-708 e uma segunda partícula viral de rAAV compreendendo um segundo vetor de rAAV que codifica a rodopsina. Em algumas modalidades, o primeiro vetor de rAAV e/ou o segundo vetor viral de rAAV compreende um AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um AAV de cabra, AAV bovino, ou AAV de camundongo de sorotipo ITR.

[0015] Em algumas modalidades da invenção, os vetores de rAAV do método incluem ITRs de AAV de serotipo 2. Em algumas modalidades, o ITR e o capsídeo da partícula viral de rAAV são derivados do mesmo sorotipo de AAV. Em algumas modalidades, o ITR e o capsídeo da partícula viral de rAAV são derivados de diferentes sorotipos de AAV. Em algumas modalidades, a partícula viral de rAAV compreende um capsídeo AAV-5, e onde o vetor compreende ITRs de AAV2. Em algumas modalidades, a partícula viral de rAAV compreende um capsídeo mutante da tirosina de AAV-5, e onde o vetor compreende ITRs de AAV2.

[0016] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento de RP e/ou do estresse do RE em um mamífero onde as partículas de rAAV são injetadas no espaço sub-retiniano da retina dos mamíferos. Em algumas modalidades, o rAAV é administrado a mais de um local do espaço sub-retiniano da retina dos mamíferos. Em outras modalidades, as partículas de rAAV são injetadas intravitrealmente aos mamíferos. Em algumas modalidades, pelo menos 10-30% das células fotorreceptoras (por exemplo, células fotorreceptoras do bastonete) são transduzidas pelo AAV.

[0017] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento de RP e/ou do estresse do RE em um mamífero, em que o mamífero tem uma mutação no gene da rodopsina endógena. Em algumas modalidades, a mutação no gene da rodopsina endógena é uma mutação autossômica dominante. Em algumas modalidades, a retinite pigmentosa é retinite pigmentosa autossômica dominante. Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano. Em algumas modalidades, o ser humano tem uma mutação P23H no gene da rodopsina endógena.

[0018] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de tratamento de RP e/ou do estresse do RE compreendendo administração a um mamífero de uma primeira partícula viral de rAAV compreendendo o ácido nucleico que codifica miR-708 e uma segunda partícula viral de rAAV que codifica a rodopsina, onde a primeira partícula viral de rAAV codifica miR-708 e a segunda partícula viral de rAAV que codifica a rodopsina é administrada ao mamífero ao mesmo tempo. Em algumas modalidades, a primeira partícula viral de rAAV que codifica miR-708 e a partícula viral de rAAV que codifica a rodopsina são administradas ao mamífero sequencialmente. Em algumas modalidades, a partícula viral de rAAV que codifica miR-708 é administrada ao mamífero primeiro e a partícula viral de rAAV que codifica a rodopsina é administrada ao mamífero segundo. Em algumas modalidades, a partícula viral de rAAV que codifica a rodopsina é administrada ao mamífero primeiro e a partícula viral de rAAV que codifica miR-708 é administrada ao mamífero segundo.

[0019] Em algumas modalidades da invenção, as partículas virais de rAAV são em uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica inclui ainda um veículo farmacologicamente aceitável. Em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição compreendendo uma partícula de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo o ácido nucleico que codifica miR-708 utilizado nos métodos descritos neste documento. Em algumas modalidades, a invenção fornece uma partícula de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo o ácido nucleico que codifica miR708 para uso no tratamento de retinite pigmentosa ou reduzindo o estresse do RE de acordo com qualquer um dos métodos descritos neste documento. Em algumas modalidades, a invenção fornece uma primeira partícula de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo o ácido nucleico que codifica um miR708 e uma segunda partícula de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo o ácido nucleico que codifica a rodopsina para uso no tratamento de retinite pigmentosa ou reduzindo o estresse do RE de acordo com qualquer um dos métodos descritos neste documento. Em algumas modalidades, a partícula de rAAV compreende um vetor de rAAV compreendendo o ácido nucleico que codifica uma miR708 para uso no tratamento de retinite pigmentosa ou reduzindo o estresse do RE de acordo com qualquer um dos métodos descritos neste documento.

[0020] Em alguns aspectos, a invenção descrita neste documento fornece composições para tratamento de retinose pigmentosa em um mamífero, compreendendo uma partícula viral do virus adeno- associado recombinante (rAAV) compreendendo um vetor de codificação de um miR-708. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV compreende um ácido nucleico que codifica um miR-708 compreendendo ainda um ácido nucleico que codifica uma rodopsina.Em algumas modalidades, a invenção fornece composições para o tratamento de retinite pigmentosa compreendendo uma primeira partícula viral de rAAV compreendendo um primeiro vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica um miR-708 e uma segunda partícula viral de rAAV compreendendo um segundo vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica uma rodopsina. Em outras modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento de retinite pigmentosa compreendendo uma partícula viral de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica um miR-708 e uma rodopsina.

[0021] Em alguns aspectos, a invenção fornece composições para o tratamento de estresse do retículo endoplasmático (RE) em uma célula compreendendo uma partícula viral de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica um miR-708. Em alguns aspectos, a invenção fornece composições para o tratamento de estresse do retículo endoplasmático (RE) em uma célula compreendendo uma partícula viral de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica um miR-708 e a rodopsina. Em algumas modalidades, o mamífero com estresse do RE tem ou está em risco de ter RP. Em algumas modalidades, o mamífero com estresse do RE é um humano que tem ou está em risco de ter RP. Em algumas modalidades, a partícula de rAAV é administrada a um olho do mamífero. Em algumas modalidades, a célula é uma célula ocular. Em outras modalidades, a célula é uma célula fotoreceptora. Em ainda outras modalidades, a célula é uma célula fotoreceptora de bastonete. Em umas modalidades, a composição reduz um ou mais marcadores celulares de estresse do RE. Em outras modalidades, um ou mais marcadores celulares de estresse de RE é XBP-1, CHP ou Grp78 submetidos a splicing. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV compreende um ácido nucleico que codifica um miR-708 compreendendo ainda um ácido nucleico que codifica uma rodopsina. Em outras modalidades, a invenção fornece composições para o tratamento do estresse do retículo endoplasmático (RE) em uma célula compreendendo um primeiro vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica um miR-708 e uma segunda partícula viral de rAAV compreendendo um segundo vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica uma rodopsina.

[0022] Em algumas modalidades da invenção, o ácido nucleico que codifica miR-708 está ligado de maneira funcional a um promotor. Em algumas modalidades, o promotor é capaz de expressar o miR- 708 nas células fotorreceptoras (por exemplo, células fotorreceptoras do bastonete). Em outras modalidades, o promotor compreende um promotor da rodopsina quinase (RK) ou um promotor da opsina. Em outras modalidades da invenção, o ácido nucleico que codifica a rodopsina está ligado de maneira funcional a um promotor. Em algumas modalidades, o promotor é capaz de expressar a rodopsina nas células fotorreceptoras (por exemplo, células fotorreceptoras do bastonete). Em outras modalidades, o promotor compreende um promotor da rodopsina quinase (RK) ou um promotor da opsina.

[0023] Em algumas modalidades, a invenção fornece composições para o tratamento de RP e/ou do estresse do RE compreendendo uma partícula de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica um miR-708 e uma rodopsina. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 e o ácido nucleico que codifica a rodopsina está ligado de maneira funcional a um promotor de RK. Em outras modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 está ligada de maneira funcional a um primeiro promotor de RK ou um primeiro promotor da opsina e o ácido nucleico que codifica a rodopsina está ligado de maneira funcional a um segundo promotor de RK ou um segundo promotor da opsina. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo promotor da opsina inclui um íntron do MVM (por exemplo, por um intrão da SEQ ID NO: 23). Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR- 708 é 5' para o ácido nucleico que codifica a rodopsina. Em outra modalidade, o ácido nucleico que codifica o miR-708 é 3' para o ácido nucleico que codifica a rodopsina. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica miR-708 está ligado de maneira funcional a um promotor de β-actina de galinha (CBA). Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a rodopsina está ligado de maneira funcional a um promotor de β-actina de galinha (CBA). Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo promotor da opsina inclui um íntron do MVM (por exemplo, por um intrão da SEQ ID NO: 23). Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 é 5' para o ácido nucleico que codifica a rodopsina. Em outra modalidade, o ácido nucleico que codifica o miR-708 é 3' para o ácido nucleico que codifica a rodopsina. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica miR-708 está ligado de maneira funcional a um promotor de β- actina de galinha (CBA). Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a rodopsina está ligado de maneira funcional a um promotor de β-actina de galinha (CBA). Em algumas modalidades, uma sequência derivada de um íntron do vírus minuto de camundongo (MVM) está localizado 3' para o promotor. Em algumas modalidades, o íntron do MMV compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, o promotor compreende ainda i) um potencializador de CMV; ii) uma sequência derivada de um fator de transcrição específico fotorreceptor; iii) uma sequência derivada de um fator de transcrição específicos fotorreceptor de bastonete; iv) uma sequência derivada de um fator de zíper básico retinal neural; v) uma sequência derivada de uma sequência do fator de transcrição contendo homeobox de bastonetes e cones; vi) um potencializador CMV e pelo menos uma ou mais sequência derivada de um fator de transcrição específico fotorreceptor, uma sequência derivada de um fator de transcrição específico fotorreceptor de bastonete, uma sequência derivada de um fator de zíper básico retinal neural; uma sequência derivada de uma sequência do fator de transcrição contendo o homeobox de cones e bastonetes; vii) um fator de zíper de leucina básica retinal neural, um potencializador de CMV e um promotor de opsina (-500 a +17); viii) um fator de zíper de leucina básica retinal neural, um potencializador de CMV, um promotor de opsina (-500 a +17), e um íntron de MVM; ix) um potencializador de CMV compreendendo a SEQ ID NO: 29; x) uma sequência do fator de zíper de leucina básica retinal neural compreendendo a SEQ ID NO: 30; xi) uma sequência derivada de uma sequência do fator de transcrição contendo homeobox de cones e bastonetes compreendendo a SEQ ID NO: 28; xii) um potencializador de CMV compreendendo a SEQ ID NO: 29 e pelo menos uma ou mais de uma sequência derivada do fator de transcrição específico fotorreceptor, uma sequência derivada de um fator de zíper básico retinal neural compreendendo a SEQ ID NO: 30; uma sequência derivada de uma sequência do fator de transcrição contendo homeobox de cones e bastonetes compreendendo a SEQ ID NO: 28; xiii) um fator de zíper de leucina básica retinal neural compreendendo a SEQ ID NO: 30, um potencializador de CMV compreendendo a SEQ ID NO: 29 e um promotor de opsina (-500 a +17) compreendendo a SEQ ID NO: 22; ou xiv) um fator de zíper de leucina básico retinal neural compreendendo a SEQ ID NO: 28, um potencializador de CMV compreendendo a SEQ ID NO: 29, um promotor de opsina (-500 a +17) compreendendo a SEQ ID NO: 22 e um íntron de MVM compreendendo a SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR- 708 é embebido em um íntron. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 compreende uma estrutura endógena de miR-708 ou uma estrutura de miR-155.

[0024] Em algumas modalidades, a invenção fornece composições para o tratamento de RP e/ou do estresse do RE compreendendo uma partícula de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica um miR-708. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 compreende o ácido nucleico da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 compreende um ácido nucleico que é pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico a SEQ ID NO: 1.

[0025] Em algumas modalidades, a invenção fornece composições para o tratamento de RP e/ou do estresse do RE compreendendo uma partícula de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica uma rodopsina. Em algumas modalidades, a rodopsina é a rodopsina de mamíferos ou equivalente funcional das mesmas. Em algumas modalidades, a rodopsina é a rodopsina humana ou equivalente funcional das mesmas. Emalgumas modalidades, a rodopsina carece da região 3' não traduzida (UTR) da sequência alvo de miR-708. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a rodopsina compreende uma substituição, inserção ou deleção de ácido nucleico na sequência alvo de miR-708. Em algumas modalidades, a substituição, inserção ou deleção reduz ou impede o reconhecimento por miR-708. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a rodopsina compreende uma substituição, inserção ou deleção de ácido nucleico na sequência alvo de miR-708, sendo que a sequência alvo de miR-708 é a SEQ ID NO: 19. Em algumas modalidades, a expressão da rodopsina é refratária à supressão por miR-708. Em algumas modalidades, a rodopsina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a rodopsina compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a rodopsina compreende o ácido nucleico da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a rodopsina compreende um ácido nucleico tendo pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 3.

[0026] Em algumas modalidades, a invenção fornece composições para o tratamento de RP e/ou do estresse de RE compreendendo uma partícula de rAAV compreendendo um polinucleotídeo de SEQ ID NO:5., SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:9. Em algumas modalidades, a partícula viral de AAV compreende um genoma viral recombinante compreendendo um polinucleotídeo, tendo em torno de pelo menos t 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com as SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 ou SEQ ID NO:27.

[0027] Em algumas modalidades, a invenção fornece composições para o tratamento de RP e/ou do estresse do RE compreendendo uma partícula de rAAV em que a partícula viral de AAV compreende um capsídeo de sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7M8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, um AAV de cabra, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino, ou capsídeo AAV de camundongo rAAV2/HBoV1. Em algumas modalidades, a partícula viral de rAAV compreende um capsídeo de AAV de sorotipo 5. Em algumas modalidades, a partícula viral de rAAV compreende um capsídeo mutante de tirosina de AAV de sorotipo 5.

[0028] Em algumas modalidades, a invenção fornece composições para o tratamento de RP e/ou do estresse do RE compreendendo uma primeira partícula viral de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica o miR-708 e uma segunda partícula viral de rAAV que codifica uma rodopsina. Em algumas modalidades, a partícula de rAAV e/ou a segunda partícula viral de rAAV compreende um capsídeo de sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7M8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, um AAV de cabra, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino, ou capsídeo AAV de camundongo rAAV2/HBoV1. Em algumas modalidades, a primeira partícula viral de rAAV e/ou a segunda partícula viral de rAAV compreende um capsídeo AAV de sorotipo 5. Em algumas modalidades, a primeira partícula viral de rAAV e/ou a segunda partícula viral de rAAV compreende um capsídeo mutante de tirosina de AAV de sorotipo 5.

[0029] Em algumas modalidades, a invenção fornece composições para o tratamento de RP e/ou do estresse do RE compreendendo uma partícula de rAAV em que o vetor de AAV compreendendo um AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um AAV de cabra, AAV bovino, ou AAV de camundongo de sorotipo ITR. Em algumas modalidades, a invenção fornece composições para o tratamento de RP e/ou do estresse do RE compreendendo uma primeira partícula viral de rAAV compreendendo um primeiro vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica o miR-708 e uma segunda partícula viral de rAAV compreendendo um segundo vetor de rAAV que codifica a rodopsina. Em algumas modalidades, o primeiro vetor de rAAV e/ou o segundo vetor viral de rAAV compreende um AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um AAV de cabra, AAV bovino, ou AAV de camundongo de sorotipo ITR.

[0030] Em algumas modalidades da invenção, os vetores de rAAV da composição incluem ITRs de AAV de sorotipo 2. Em algumas modalidades, o ITR e o capsídeo da partícula viral de rAAV são derivados do mesmo sorotipo de AAV. Em algumas modalidades, o ITR e o capsídeo da partícula viral de rAAV são derivados de diferentes sorotipos de AAV. Em algumas modalidades, a partícula viral de rAAV compreende um capsídeo AAV-5, e onde o vetor compreende ITRs de AAV2. Em algumas modalidades, a partícula viral de rAAV compreende um capsídeo mutante da tirosina de AAV-5, e onde o vetor compreende ITRs de AAV2.

[0031] Em algumas modalidades, a invenção fornece composições para o tratamento de RP e/ou do estresse do RE em um mamífero, em que o mamífero tem uma mutação no gene da rodopsina endógena. Em algumas modalidades, a mutação no gene da rodopsina endógena é uma mutação autossômica dominante. Em algumas modalidades, a retinite pigmentosa é retinite pigmentosa autossômica dominante. Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano. Em algumas modalidades, o ser humano tem uma mutação P23H no gene da rodopsina endógena.

[0032] Em algumas modalidades, a invenção fornece kits para tratamento de RP ou para reduzir o estresse do RE em um mamífero compreendendo uma quantidade eficaz de partículas rAAV de acordo com os métodos descritos neste documento. Em algumas modalidades, os kits incluem uma quantidade eficaz de uma composição conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, o kit compreende uma quantidade eficaz de partículas de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo o ácido nucleico que codifica miR-708. Em algumas modalidades, o kit compreende uma quantidade eficaz de partículas de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo o ácido nucleico que codifica miR-708 e rodopsina. Em algumas modalidades, o kit compreende uma quantidade eficaz da primeira partícula de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo ácido nucleico que codifica miR-708 e uma quantidade eficaz da segunda partícula de rAAV compreendendo um segundo vetor de rAAV compreendendo o ácido nucleico que codifica a rodopsina. Em outras modalidades, o kit compreende instruções de uso de partículas de rAAV no tratamento da retinite pigmentosa e/ou redução do estresse do RE. Em outras modalidades, o kit compreende instruções de uso em qualquer um dos métodos descritos aqui.

[0033] Em alguns aspectos, a invenção fornece um artigo de fabricação compreendendo uma quantidade eficaz de partículas de rAAV de acordo com os métodos descritos neste documento. Em algumas modalidades, o artigo de fabricação compreende uma quantidade eficaz de qualquer uma da composição conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, o artigo de fabricação compreende uma quantidade eficaz de partículas de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo o ácido nucleico que codifica miR-708. Em algumas modalidades, o artigo de fabricação compreende uma quantidade eficaz de partículas de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo o ácido nucleico que codifica miR-708 e a rodopsina. Em algumas modalidades, o artigo de fabricação compreende uma quantidade eficaz da primeira partícula de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo ácido nucleico que codifica miR-708 e uma quantidade eficaz da segunda partícula de rAAV compreendendo um segundo vetor de rAAV compreendendo o ácido nucleico que codifica a rodopsina.

[0034] Em alguns aspectos, a invenção fornece um ácido nucleico compreendendo um íntron derivado de MVM. Em algumas modalidades, o íntron do MMV compreende a SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, o ácido nucleico inclui ainda um promotor. Em algumas modalidades, o ácido nucleico inclui ainda um potencializador. Em algumas modalidades, o promotor está localizado a 5' para o íntron de MVM. Em algumas modalidades, a invenção fornece uma constructo de expressão compreendendo o ácido nucleico. Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor compreendendo o ácido nucleico ou a constructo de expressão. Em algumas modalidades, a invenção fornece uma célula compreendendo o ácido nucleico ou a constructo de expressão, ou o vetor.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0035] As Figuras 1A & 1B mostram a localização do tipo selvagem (FIG. 1A) e a rodopsina mutante P23H (FIG. 1B) nas células epiteliais pigmentadas retinais humanas. As células são manchadas por rodopsina (verde), α-tubulina (vermelho) e DNA (azul). O padrão de coloração da rodopsina do tipo selvagem é característico de localização de membrana (seta sólida), considerando que o padrão de coloração da rodopsina mutante P23H seja característica de localização perinuclear/ reticular (seta tracejada).

[0036] As Figuras 2A e 2 B mostram que a rodopsina mutante P23H forma oligômeros não-nativos e retém oligossacarídeos específicos do RE. (Figura 2A) Western blot de extratos solúveis detergentes de células que expressam a rodopsina do tipo selvagem ("ts") ou mutante P23H. (Figura 2B) Western blot de extractos solúveis detergentes de células que expressam a rodopsina do tipo selvagem ("ts") ou mutante P23H. Os extratos foram tratados com Endoglicosidase H ("Endo-H") ou não foram tratados.

[0037] As Figuras 3A e 3 B mostram que células que expressam a rodopsina P23H têm maior expressão de marcadores UPR e uma maior propensão à apoptose. (Figura 3A) Expressão relativa de proteína homóloga C/EBP (CHOP; também conhecido por Ddit3), proteína imunoglobulina de ligação (BiP; também conhecido por Hspa5), e genes da rodopsina em células que expressam a rodopsina do tipo selvagem ("ts") ou mutante P23H. A expressão relativa de cada gene foi comparada com a expressão da beta-glucoronidase usando o método ΔΔCt. (Figura 3B) Percentagem de células apoptóticas em células que expressam controle (pcDNA), rodopsina do tipo selvagem, ou rodopsina mutante P23H, como medido pela coloração de TUNEL.

[0038] A Figura 4 mostra um diagrama da constructo de um vetor de expressão para expressar o miR-708 sob o controle de um promotor ubíquo (β-actina de galinha, CBA) ou um promotor específico fotorreceptor (rodopsina quinase, RK). O DNA codificando o caule de miR-708 e as sequências de alça foram sintetizados e clonados entre a sequência de estrutura de 5' e 3' miR-155. Esta sequência estrutural contém os locais alvo necessários para Drosha processar pri-miR-708 em pré-miR-708 no núcleo, permitindo o processamento subsequente de pré-miR-708 por Dicer no citoplasma.

[0039] A Figura 5 mostra a expressão da proteína rodopsina em células que expressam miR-708 ou um miRNA controle em relação às células não-transfectadas. Todas as células são células HEK-293 expressando a rodopsina mP23H que tem uma sequência alvo 3'UTR miR708. A expressão da proteína rodopsina é normalizada para a expressão de hGAPDH. Os níveis de proteína rodopsina são diminuídos na presença de miR708 em comparação ao controle miR.

[0040] A Figura 6 mostra que as células HEK-293 expressando a rodopsina mP23H reduziram os níveis de RNA dos genes marcadores UPR CHOP e BiP após a expressão de miR-708, em comparação com células que expressam um miRNA controle ("Embaralho").

[0041] As Figuras 7A e 7 B mostram que a regulação negativa da rodopsina endógena miR-708 é dependente da presença de uma sequência alvo miR-708 na rodopsina 3' UTR. As células HEK-293 foram transfectadas com um gene da rodopsina P23H de camundongo incluindo sequência alvo de miR-708 (FIG. 7A), ou com um gene da rodopsina P23H humana sem a sequência alvo de miR-708 (FIG. 7B). As células foram também transfectadas com um controle pré-miRNA ou um anti-miR-708 pré-miRNA para inibir miR-708 endógeno. A proteína rodopsina foi medida em relação à proteína hGAPDH e mRNA da rodopsina foi medido em relação ao mRNA da hGAPDH. Os níveis de miR-708 endógeno também são mostrados (eixo direito e duas colunas mais à direita nas FIGS. 7A & 7B).

[0042] A Figura 8 mostra um diagrama de um vetor AAV para expressar miR-708 em fotorreceptores do bastonete. As características dos vetores relevantes são identificadas.

[0043] As Figuras 9A e 9B mostram que a expressão de miR-708 usando um vetor AAV regula negativamente a rodopsina mutante P23H. (Figura 9A) Expressão de miR-708 em células WERI ou RPE mediante a transfecção de codificação de um vetor miR-708 direcionado pelo promotor RK ou um miRNA controle ("Embaralhado"). A expressão é representada em relação à expressão do miR-16. (Figura 9b) A expressão de mRNA da rodopsina P23H em células WERI transfectadas com um plasmídeo pRK-miR-708, em relação às células transfectadas com um plasmídeo controle.

[0044] As Figuras 10A-10C mostram que a aplicação sub-retiniana de um vetor de AAV5 miR-708 resulta em nocaute da rodopsina do camundongo. (Figura 10A) Expressão de mRodopsina nas retinas do camundongo injetadas com AAV5 miR-708 ou AAV5 miR-controle. (Figura 10B) Expressão de RdCVF nas retinas do camundongo injetadas com AAV5 miR-708 ou AAV5 miR-controle. (Figura 10C) Expressão de miR-708 nas retinas do camundongo injetadas com AAV5 miR-708 ou AAV5 miR-controle.

[0045] As Figuras 11A & 11B mostram que o tratamento dos olhos com AAV5 miR-708 reduz as respostas mediadas por bastonetes, mas não mediadas por cones. (Figura 11A) Três eletroretinogramas representativos representando respostas escotópicas nos olhos recebendo AAV5 miR-708 ou AAV5 miR-controle ("Embaralhado"). (Figura 11B) Três eletroretinogramas representativos representando respostas fotópica nos mesmos olhos como em (Fig. 11A) recebendo AAV5 miR-708 ou AAV5 miR-controle ("Embaralhado").

[0046] A Figura 12 fornece um diagrama do vetor de substituição/supressão da hrodopsina embebida com íntron de miR- 708.

[0047] A Figura 13 mostra que um vetor embebido com intrão de miR-708 diminui a expressão da mRodopsina, hCHOP e hBiP em células WERI transfectadas com mRodopsina P23H, comparado a um vetor de controle miR.

[0048] A Figura 14 mostra que a expressão do miR-708 do vetor embebido com o íntron tem expressão reduzida em comparação com o vetor não embebido em células WERI, a ressalva sendo de que o vetor embebido com o íntron pRK-hRHO-íntron miR-708 também co- expressa a hRodopsina. Todos os vetores dirigindo a expressão de miR-708 usando o promotor RK tiveram ordens de expressão de menor magnitude do que um vetor usando o promotor CBA.

[0049] A Figura 15 mostra que a expressão da hrodopsina do vetor de supressão/substituição embebido com o íntron é refratário ao nocaute pelo miR-708 co-expressado. Os níveis de RNA de hrodopsina são os mesmos em células transfectadas com vetores expressando miR-708 ou miR-controle.

[0050] A Figura 16 mostra que o vetor de supressão/substituição miR-708 reduz o splicing de XBP-1, um marcador de estresse do RE, células WERI que expressam rodopsina mutante. Esta redução é observada somente se a sequência alvo de 3'UTR miR-708 estiver presente na transcrição da rodopsina.

[0051] A Figura 17 mostra um diagrama de um vetor com a estrutura do íntron da β-globina humana miR-708 no 3' UTR do cDNA da rodopsina.

[0052] A Figura 18 mostra que um vetor com a estrutura do intron da β-globina humana miR-708 no 3' UTR do cDNA da rodopsina produz maior expressão da hRodopsina e miR-708 do que um vetor com a estrutura no 5' UTR.

[0053] A Figura 19 mostra um diagrama de um design de vetor alternativo usando os promotores separados pata dirigir a expressão do miR-708 (promotor RK) e hrhodopsina (promotor da oposina do camundongo).

[0054] A Figura 20 Mostra a expressão da hRhodopsin (esquerda) e miR-708 (direita) em células WERI transfectadas com o vetor especificado. A expressão é expressada como o número de cópia calculado contra um padrão de DNA.

[0055] As Figuras 21A-C mostram os níveis de miR-708 (Fig. 21A), rodopsina do camundongo (FIG. 21B) e rodopsina humana (FIG. 21C) nas retinas de camundongos três semanas após injeção subretiniana com um vetor do capsídeo AAV5 dirigindo a expressão da rodopsina humana e miR-708 (miR 708/708), ou rodopsina humana e miRNA controle (miR-Cont), em uma estrutura de miR-708 usando o promotor da opsina. Para cada experimento, a expressão é mostrada como expressão dobrada, em comparação ao olho contralateral, não injetado.

[0056] A Figura 22 mostra um esquema da constructo do promotor da opsina, incluindo a sequência do fator do zíper básico retinal neural (NRL), o potencializador de CMV, o promotor da opsina e a sequência do íntron do MVM, que inclui uma sequência híbrida do íntron de CBA exon 1 e um intrão do vírus minuto de camundongo (MVM).

[0057] A Figura 23A mostra um esquema da sequência de miR- 708 embebida em um íntron da beta-globina.

[0058] As Figuras 23B & 23C mostram os diagramas da seqência do miR-708 no contexto da estrutura endógena de miR-708 (Fig. 23B) ou a estrutura de miR-155 (FIG. 23C), embebida em um intron da beta globina. A "sequência de alça" do MiR-155 entre as sequências flanqueantes 5' e 3' miR é identificada na Fig. 23C.

[0059] A Figura 24 Mostra a avaliação dos vetores candidatos contendo a sequência miR-708, na estrutura miR-155 ou miR-708 (incorporada no íntron da beta-globina), e a sequência de codificação da rodopsina humana (hrodopsina; também faltando uma sequência alvo 3'UTR miR-708) dirigida pelo promotor da rodopsina quinase (GRK1) ou o promotor da opsina (Ops). Todas as quatro combinações foram testadas para efeitos sobre a expressão de miR-708 e hrodopsina, como mostrado.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0060] A presente invenção fornece métodos para tratamento de retinose pigmentosa (RP) em um mamífero, compreendendo a administração ao olho do mamífero uma partícula viral do virus adeno- associado recombinante (rAAV) compreendendo um vetor de codificação de um miR-708. MiR-708 direciona uma região na região 3' não traduzida do gene da rodopsina e, como tal, pode suprimir a atividade de uma rodopsina mutante associada com RP. Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para tratamento de retinose pigmentosa em um mamífero, compreendendo a administração ao olho do mamífero uma partícula viral do vírus adeno-associado recombinante (rAAV) compreendendo um vetor de codificação de um miR-708 e um ácido nucleico da rodopsina do tipo selvagem. Como tal, o vetor pode suprimir a atividade de uma rodopsina mutante associada com RP enquanto simultaneamente substitui a rodopsina mutante com uma rodopsina do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando a rodopsina do tipo selvagem não inclui o 3' UTR alvo de miR-708, de modo que o miR- 708 só direcionará a expressão da rodopsina mutante. A invenção também fornece composições compreendendo partículas rAAV codificando miR -708 e partículas rAAV codificando a rodopsina. Em algumas modalidades, a invenção fornece composições compreendendo partículas de rAAV codificando miR-708 e rodopsina.

I. Técnicas gerais

[0061] As técnicas e procedimentos descritos ou referenciados aqui geralmente são bem compreendidos e comumente empregados utilizando metodologia convencional por aqueles versados na técnica, como, por exemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011).

II. Definições

[0062] Um "vetor", como utilizado neste documento, refere-se a um plasmídeo recombinante ou vírus que compreende um ácido nucleico para ser entregue em uma célula hospedeira, in vitro ou in vivo.

[0063] O termo "polinucleotídeo" ou "ácido nucleico" como utilizado neste documento se refere a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, quer ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Assim, este termo inclui, mas não está limitado a, DNA ou RNA de fita simples, dupla fita ou múltipla, DNA genômico, cDNA, DNA-RNA híbridos, ou um polímero compreendendo bases purínicas e pirimidínicas, ou a outras bases maturais, modificadas química ou bioquimicamente, não-naturais ou derivadas de nucleotídeos. A cadeia principal do polinucleotídio pode compreender grupos de açúcares e de fosfato (como normalmente pode ser encontrada no RNA ou DNA), ou grupos de açúcares e de fosfato modificados ou substituídos. Alternativamente, a cadeia principal do polinucleotídio pode incluir um polímero de subunidades sintéticas como fosforamidatos e pode assim ser um oligodesoxinucleosídeo fosforamidato (P-NH2) ou um oligômero misto fosforamidato- fosfodiéster. Além disso, um polinucleotídio de fita dupla pode ser obtido a partir do produto de polinucleotídio de fita simples de síntese química ou por sintetizar a fita complementar e temperar as fitas sob condições adequadas, ou por sintetizar a fita complementar de novo usando um DNA polimerase com um primer adequado.

[0064] Os termos "polipeptídeo" e "proteínas" são usados de forma intercambiável para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos e não estão limitados a um comprimento mínimo. Tais polímeros de resíduos de aminoácidos podem conter resíduos de aminoácidos naturais ou não-naturais e incluem, mas não estão limitados a, peptídeos, oligopeptídeos, dímeros, trímeros e multímeros de resíduos de aminoácidos. Tanto as proteínas de comprimento total como os seus fragmentos são abrangidos pela definição. Os termos também incluem modificações pós-expressão do polipeptídeo, por exemplo, glicosilação, sialilação, acetilação, fosforilação e similares. Além disso, para efeitos da presente invenção, um "polipeptídeo" se refere a uma proteína que inclui modificações, tais como deleções, adições e substituições (geralmente conservadora em natureza), para a sequência nativa, desde que a proteína mantenha a atividade desejada. Estas modificações podem ser deliberadas, como através da mutagênese sítio- dirigida, ou pode ser acidental, como por meio de mutações de hospedeiros que produzem proteínas ou erros devido a amplificação da PCR.

[0065] Um "vetor viral recombinante" se refere a um vetor de polinucleotídeo recombinante compreendendo uma ou mais sequências heterólogas (isto é, sequência de ácido nucleico de não origem viral). No caso de vetores recombinantes AAV, o ácido nucleico recombinante é flanqueado por pelo menos uma, preferencialmente duas, sequências de repetição terminal invertida (ITRs).

[0066] Um "vetor recombinante AAV (vetor rAAV)" se refere a um vetor de polinucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências heterólogas (isto é, sequência de ácido nucleico não de origem AAV) que são acompanhadas por pelo menos uma, preferencialmente duas, sequências de repetição terminal invertida (ITRs) de AAV. Tais vetores rAAV podem ser replicados e embalados em partículas virais infecciosas quando presentes em uma célula hospedeira que foi infectada com um vírus ajudante adequado (ou que está expressando funções ajudantes adequadas) e que está expressando produtos de gene de AAV rep e cap (ou seja, proteínas de AAV Rep e Cap). Quando um vetor de rAAV é incorporado em um polinucleotídeo maior [(por exemplo, em um cromossomo ou em outro vetor como um plasmídeo utilizado para clonagem ou transfecção), então o vetor de rAAV pode ser referido como um "pró-vetor" que pode ser "resgatado" pela replicação e encapsidação na presença de funções de embalagem de AAV e funções ajudantes adequadas. Um vetor de rAAV pode ser em qualquer número de formas, incluindo, mas não limitado a, plasmídeos, cromossomos artificiais lineares, complexados com lipídios, encapsulados dentro de lipossomos e, mais preferível, encapsidados em partículas virais, particularmente uma partícula de AAV. Um vetor rAAV pode ser embalado em um capsídeo viral de AAV para gerar uma "partícula viral adeno-associado recombinante (partícula de rAAV)".

[0067] "Heterólogo" significa derivado de uma entidade genotipicamente distinta da do resto da entidade para a qual ela é comparada ou para a qual é introduzida ou incorporada. Por exemplo, um polinucleotídeo introduzido por técnicas de engenharia genética para um diferente tipo de célula é um polinucleotídeo heterólogo (e, quando expressado, pode codificar um polipeptídeo heterólogo). Da mesma forma, uma sequência celular (por exemplo, um gene ou parte do mesmo) que é incorporada em um vetor viral é uma sequência de nucleotídeos heteróloga em relação ao vetor.

[0068] O termo "transgene" se refere a um polinucleotídeo que é introduzido em uma célula e é capaz de ser transcrito em RNA e, opcionalmente, traduzido e/ou expressado em condições adequadas. Em aspectos, ele confere uma propriedade desejada a uma célula na qual foi introduzido, ou caso contrário leva a um resultado terapêutico ou de diagnóstico desejado. Em outro aspecto, ele pode ser transcrito em uma molécula que medeia a interferência do RNA, como siRNA.

[0069] Os termos "partículas do genoma (gp)", "genoma equivalentes" ou "cópias do genoma" como usado em referência a um título viral, se refere ao número de vírions contendo o genoma do DNA do AAV recombinante, independentemente de infecciosidade ou funcionalidade. O número de partículas de genoma em uma preparação específico do vetor pode ser medido por procedimentos como descritos nos exemplos aqui ou, por exemplo, em Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278.

[0070] Os termos "unidade de infecção (iu)", "partículas infecciosas", ou "unidade de replicação", conforme usado em referência a um título viral, se refere ao número de partículas de vetor de AAV recombinante competente de replicação como medido pelo ensaio de centro infeccioso, também conhecido como ensaio de centro de replicação, como descrito, por exemplo, em McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973.

[0071] O termo "unidade de transdução (tu)" como usado em referência a um título viral, refere-se ao número de partículas do vetor de AAV recombinante infeccioso que resultam na produção de um produto do transgene funcional como medido em ensaios funcionais como descrito nos Exemplos aqui ou, por exemplo, em Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124; or in Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (ensaio LFU).

[0072] Uma "repetição terminal invertida" ou sequência "ITR" é um termo bem entendido na técnica e se refere às sequências relativamente curtas encontradas nos términos ou genomas virais que estão na orientação oposta.

[0073] Uma sequência de "repetição terminal invertida de AAV (ITR)", um termo bem entendido na técnica, é uma sequência de aproximadamente 145 nucleotídeos que está presente em ambos os términos do genoma nativo de AAV de fita simples. Os 125 nucleotídeos externos da ITR podem estar presentes em qualquer uma das duas orientações alternativas, levando a heterogeneidade entre os diferentes genomas de AAV e entre as duas extremidades de um único genoma de AAV. Os 125 nucleotídeos externos também contêm várias regiões mais curtas de auto-complementaridade (designadas regiões A, A', B, B', C, C' e D), permitindo emparelhamento de base intra-cadeia para ocorrer dentro de esta porção do ITR.

[0074] Uma "sequência de resolução terminal" ou "trs" é uma sequência na região D da ITR de AAV que é clivada por proteínas rep de AAV durante a replicação do DNA viral. Uma sequência de resolução terminal mutante é refratária à clivagem por proteínas rep de AAV.

[0075] Um "vírus ajudante" para AAV se refere a um vírus que permite que o AAV (que é um parvovírus defeituoso) seja replicado e embalado por uma célula hospedeira. Um número de tais vírus ajudantes tem sido identificado, incluindo adenovírus, herpesvírus e poxvírus como vaccinia. O adenovírus abrange um certo número de diferentes subgrupos, embora o adenovírus tipo 5 do subgrupo C (Ad5) seja mais comumente usado. Numerosos adenovírus de origem humana, de mamífero não humano e aviária são conhecidos e estão disponíveis a partir de depositários, como a ATCC. Vírus da família do herpes, que também estão disponíveis a partir de depositários como ATCC, incluem, por exemplo, vírus da herpes simples (HSV), vírus Epstein-Barr (EBV), citomegalovírus (CMV) e vírus da pseudoraiva (PRV).

[0076] A "porcentagem (%) de identidade de sequência" em relação a uma sequência de referência de polipeptídeo ou aminoácidos é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos em uma sequência candidata que é idêntica com os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos em uma sequência de referência de polipeptídeo ou aminoácido, depois do alinhamento das sequências e apresentando lacunas, se necessário, para obter a porcentagem máxima de identidade de sequência e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. O alinhamento para efeitos de determinação da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos ou ácido nucleico pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro da especialidade na técnica, por exemplo, usando programa de software de computador disponível publicamente, por exemplo, aqueles descritos em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987), Supp. 30, seção 7.7.18, Tabela 7.7.1, e incluindo o software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Um programa de alinhamento preferencial é o ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pensilvânia). Os versados na técnica podem determinar parâmetros adequados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o máximo alinhamento ao longo de todo o comprimento das sequências a serem comparadas. Para efeitos deste documento, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma determinada sequência de aminoácidos A, com ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B (que também pode ser alternativamente expressada como uma determinada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende uma certo % de identidade de sequência de aminoácidos, com ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B) é calculada da seguinte forma: Cem vezes a fração X/Y, onde X é o número de resíduos de aminoácidos marcados como combinações idênticas pelo programa de alinhamento de sequência em que o alinhamento do programa de A e B e onde y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Será entendido que onde o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento de sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos de A para B não será igual a % de identidade de sequência de aminoácidos de B para A. Para efeitos deste documento, a % de identidade de sequência de ácido nucleico de uma determinada sequência de ácido nucleico C, com ou contra uma determinada sequência de aminoácidos D (que também pode ser alternativamente expressada como uma determinada sequência de ácido nucleico C que tem ou compreende uma certa % de identidade de sequência de ácidos nucleicos, com ou contra uma determinada sequência de ácidos nucleicos D) é calculada da seguinte forma: Cem vezes a fração W/Z, onde W é o número de nucleotídeos marcados como combinações idênticas pelo programa de alinhamento de sequência em que o alinhamento do programa de C e D e onde Z é o número total de nucleotídeos em D. Será entendido que onde o comprimento da sequência de ácido nucleico C não é igual ao comprimento de sequência de ácido nucleico D, a % de identidade de sequência de ácido nucleico de C para D não será igual a % de identidade de sequência de ácido nucleico de D para C.

[0077] Uma molécula "isolada" (por exemplo, ácido nucleico ou proteína) ou célula significa que ela tem sido identificada e separada e/ou recuperada a partir de um componente de seu ambiente natural.

[0078] Uma "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para efeitos benéficos ou resultados desejados, incluindo resultados clínicos (por exemplo, melhoria dos sintomas, realização de desfechos clínicos e similares). Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Em termos de um estado de doença, uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para melhorar, estabilizar ou atrasar o desenvolvimento de uma doença.

[0079] Um "indivíduo" ou "sujeito" é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não estão limitados a, animais domésticos (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, primatas humanos e não humanos como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em algumas modalidades, o indivíduo ou o sujeito é um ser humano.

[0080] Conforme usado neste documento, "tratamento" é uma abordagem para a obtenção de resultados clínicos benéficos ou desejados. Para efeitos da presente invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, melhoria de sintomas, diminuição da extensão da doença, estado de doença estabilizado (por exemplo, o não agravamento), evitando propagação (por exemplo, metástase) da doença, atraso ou desaceleração da progressão da doença, melhoramento ou paliação do estado de doença e remissão (se parcial ou total), se detectável ou não detectável. "Tratamento" pode significar também prolongar a sobrevida em relação à sobrevida esperada caso não receba tratamento.

[0081] "Retinite pigmentosa (RP)" se refere a um grupo heterogêneo de doenças caracterizadas pela perda progressiva da visão. Os sintomas geralmente resultam de degeneração ou anormalidades da retina, que podem incluir a perda de função das células fotorreceptoras.

[0082] "Rodopsina" se refere a um membro da família de receptores acoplados à proteína G que funciona na percepção da luz nas células fotorreceptoras dos bastonetes da retina. Um pigmento visual, a rodopsina contém um polipeptídeo opsina reversivelmente ligada ao seu cofator retinal. A luz provoca isomerização da retina de um 11-cis para uma forma todo trans. Isto por sua vez provoca uma mudança conformacional no polipeptídeo que leva à ativação da proteína G. Convertendo a presença da luz em uma resposta bioquímica, a rodopsina permite a percepção visual. A sua função é necessária para a visão escotópica (ou seja, visão sem cor em condições de luz fraca), e também é achado ser necessário para a viabilidade de células fotorreceptoras.

[0083] Conforme usado neste documento, "rodopsina" pode se referir ao pigmento visual completo incluindo retinal ou simplesmente o componente ou sequência de aminoácidos da molécula. A rodopsina também pode ser conhecida como OPN2, Opsina-2 ou RP4. Exemplos de proteínas da rodopsina podem incluir sem limitação rodopsina humana, de camundongo, cão e gato, por exemplo, sequências de referência NCBI NP_000530, NP_663358,NP_001008277 e NP_001009242. Exemplos de genes da rodopsina podem incluir, sem limitação, genes da rodopsina humana, de camundongo, cão e gato, por exemplo, GenBank Entrez Gene ID 6010 (RHO, também conhecido por RP4, RPO2 e CSNBAD1), GenBank Entrez Gene ID 212541 (Rho, também conhecido por Ops, RP4, RPO2 e Noerg1), GenBank Entrez Gene ID 493763 e GenBank Entrez Gene ID 493762. O termo rodopsina como utilizado neste documento também inclui equivalentes funcionais de rodopsina (por exemplo, variantes de rodopsina) incluindo mutações, truncamentos, deleções e/ou inserções, desde que o equivalente funcional mantenha pelo menos uma parte da atividade da rodopsina de tipo selvagem para melhorar os sintomas de retinite pigmentosa.

[0084] Conforme usado aqui "refratário" refere-se à resistência à modulação. Por exemplo, um gene da rodopsina que é refratário à supressão por miR-708 é substancialmente ou totalmente resistente à supressão por miR-708.

[0085] "Promotor da opsina" se refere a uma sequência de polinucleotídeos derivada de um gene da opsina (por exemplo, opsina do camundongo) que dirige a expressão especificamente nas células fotorreceptoras dos bastonetes (por exemplo, células fotorreceptoras dos bastonetes). Conforme usado aqui, "promotor da opsina" pode se referir a toda a sequência promotora ou um fragmento da sequência promotora suficiente para dirigir a expressão específica dos bastonetes, tais como as sequências descritas em Quiambao, A.B., et al. (1997) Vis. Neurosci. 14(4):617-25 e Le, Y.Z., et al. (2006) Mol. Vis. 12:389-98. Em algumas modalidades, o promotor da opsina contém um fragmento de 676pb de codificação de um potencializador de CMV 400bp a montante de uma porção da sequência do promotor da opsina (-500bp - +15bp). Além disso, a sequência NRL 65bp é incluída; este codifica um fator de zíper básico retinal neural (um fator de transcrição específico fotorreceptor de bastonetes).

[0086] "Promotor da rodopsina quinase (RK)" se refere a uma sequência de polinucleotídeos derivada de um gene da rodopsina quinase (por exemplo, RK humana, representada por GenBank Entrez Gene ID 6011) que dirige a expressão especificamente nas células fotorreceptor de bastonetes e cones, bem como linhagens celulares da retina como WERI Rb-1. Conforme usado aqui, "promotor da rodopsina quinase" pode se referir a toda a sequência promotora ou um fragmento da sequência promotora suficiente para dirigir a expressão específica de fotorreceptores, tais como as sequências descritas em Khani, S.C., et al. (2007) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48(9):3954-61 e Young, J.E., et al. (2003) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44(9):4076-85. Em algumas modalidades, o promotor de RK se estende de -112 a +180 em relação ao local de início da transcrição.

[0087] "miR-708" se refere a uma sequência de polinucleotídeos micro-RNA (miRNA), compreendendo as sequências de caule e de alça como mostrado na Fig. 4. Exemplos de polinucleotídeos de miR- 708 podem incluir sem limitação miR-708 humano, de camundongo, cão e gato, por exemplo, tal como representado pelas IDs do GenBank Entrez Gene 100126333, 735284 e 100885899. miRNAs são pequenas moléculas de RNA não codificadas que regulam a expressão de genes (por exemplo, pela regulação negativa da transcrição do gene) contendo um sítio alvo reconhecido pelo miRNA (Bartel, D.P. (2004) Cell 116(2):281-97). MiR-708 é conhecido por ser induzido por CHOP e pode estar envolvido na regulação da expressão da rodopsina (Behrman, S., et al. (2011) J. Cell Biol. 192(6):919-27). Conforme usado aqui, "miR-708" pode se referir ao polinucleotídeo miR-708 processado ou qualquer intermediário na via de processamento, por exemplo, pri-miRNA ou pré-miRNA. Conforme usado aqui, "miR-708" pode se referir a uma sequência de DNA que é transcrita para produzir o RNA de miR-708 ou a própria sequência de RNA.

[0088] Referência "sobre" um valor ou parâmetro aqui inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas para aquele valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição que se refere a "sobre X" inclui a descrição de "X".

[0089] Conforme usado aqui, a forma singular dos artigos "um/uma" e "a/o" inclui referências no plural salvo indicação em contrário.

[0090] Fica entendido que aspectos e modalidades da invenção descritas aqui incluem "compreendendo", "consistindo" e/ou "consistindo essencialmente de" aspectos e modalidades.

III. Retinite pigmentosa e modelos experimentais da mesma

[0091] Como descrito acima, a retinite pigmentosa (RP) refere-se a um grupo de doenças degenerativas doenças dos olhos que pode causar perda progressiva da visão, incluindo a perda de visão noturna, perda de campos visuais periféricos e cegueira total. Na América, a incidência de RP é de aproximadamente 1 em 4 mil pessoas. A RP é muitas vezes herdada, e desordens de RP autossômica dominante, autossômica recessiva e ligada ao X têm sido descritas. As mutações em mais de 50 genes diferentes têm sido associadas com RP, incluindo componentes envolvidos na cascata de fototransdução, ciclo da retina e fatores de splicing, bem como mais de cem mutações distintas na própria rodopsina. Em muitos casos, as mutações associadas com RP levam à perda de função fotorreceptora dos bastonetes e/ou a morte da célula. Esta perda resulta em diminuição da visão escotópica e pode se manifestar como cegueira noturna ou diminuição da visão periférica. A morte celular do bastonete também tem sido associada com morte celular do cone subsequente, causando perda de visão de alta acuidade e, combinadas com a morte da célula dos bastonetes, cegueira.

[0092] Uma variedade de modelos baseados em células e em animais foram estabelecidos para examinar a base celular de RP e para testar tratamentos experimentais. Um modelo baseado em células para RP é células epiteliais pigmentadas de retina humana (RPE) cultivadas (Adamowicz, M., et al. (2012) Adv. Exp. Med. Biol. 723:573-9). Este modelo pode ser usado para expressar proteínas mutantes implicadas na RP e testar o efeito destas mutações em função das proteínas, ou o efeito de proteínas mutantes na função e/ou viabilidade celular. Por exemplo, a rodopsina humana do tipo selvagem e mutante pode ser expressada através de qualquer promotor adequado (por exemplo, CMV). Sem querer estar vinculado à teoria, é pensado que o desenrolamento de polipeptídeos da opsina resulta em retenção e estresse do RE, a indução da resposta de proteína desdobrada (UPR) e aumento da morte celular. Este modelo pode ser usado para examinar o efeito de qualquer mutação associada à RP, por exemplo, uma mutação da rhodopsina como P23H.

[0093] Modelos de RP baseados em animal podem incluir mutações em camundongos conhecidas ou suspeitas de causar RP em camundongos ou mutações ortólogas às encontradas em humanos. Em algumas modalidades, os modelos de camundongos podem incluir camundongos projetados para expressar uma rodopsina, por exemplo, uma forma de camundongo ou humano mutante nas células fotorreceptoras. Exemplos de modelos de camundongo incluem a rodopsina P347S de camundongo (Li, T., et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93(24):14176-81), o camundongo Rho-/- (Humphries, M.M., et al. (1997) Nat. Genet. 15(2):216-9), e um camungonso expressando a rodopsina mutante P23H ("P23H de camundongo") (Olsson, J.E., et al. (1992) Neuron 9(5):815-30). No P23H de camundongo, a rodopsina humana mutante pode ser inserida na linha germinal do camundongo. Qualquer promotor conhecido na técnica para se expressar nas células fotorreceptoras pode ser utilizado (por exemplo, o promotor de RK humana ou de opsina do camundongo). Em algumas modalidades, a rodopsina pode ser expressada através de um vetor de AAV.

[0094] Outros modelos animais para RP também podem ser usados. Além de modelos de camundongo, rato, cão, porco, sapo (Tam, B.M. e Moritz, O.L. (2006) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47(8):3234-41), e modelos de primatas não humanos também podem ser utilizados.

IV. Métodos para o tratamento de retinite pigmentosa

[0095] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos e composições para tratamento de retinose pigmentosa em um mamífero, compreendendo administrar ao mamífero (por exemplo, na retina) uma quantidade eficaz de partícula viral de rAAV compreendendo um vetor de codificação de um miR-708. Os métodos podem ser utilizados para o tratamento de um ser humano com RP, para melhorar as patologias e comprometimento da visão associada com RP. Em algumas modalidades, a invenção inclui a administração de uma quantidade eficaz de partículas virais de rAAV compreendendo um vetor composto de ácido nucleico que codifica a rodopsina (por exemplo, uma rodopsina normal ou de tipo selvagem). Em algumas modalidades, o miR-708 serve para suprimir a atividade de uma rodopsina modificada associada com RP. Em algumas modalidades, a rodopsina normal ou de tipo selvagem serve para suplementar o olho com uma rodopsina funcional. Em algumas modalidades, a partícula viral compreende um capsídeo de AAV de sorotipo 5 (capsídeo de AAV5) e repetições de terminal invertido de AAV2 ou AAV5. Em algumas modalidades, a partícula viral compreende um capsídeo mutante de tirosina de AAV de sorotipo 5 e repetições de terminal invertido de AAV2 ou AAV5.

[0096] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos e composições para melhorar o sintoma de RP, compreendendo administrar ao olho do mamífero uma quantidade eficaz de partícula viral de rAAV compreendendo um vetor codificando um miR-708. Em outros aspectos, a invenção fornece métodos e composições para melhorar o sintoma de RP, compreendendo administrar ao olho do mamífero uma quantidade eficaz de partícula viral de rAAV compreendendo um vetor codificando um miR-708 e uma rodopsina. Em algumas modalidades, os sintomas de RP incluem, mas não estão limitados a, cegueira, cegueira noturna, diminuição da visão periférica e perda de visão de alta acuidade. Em algumas modalidades, o tratamento de retinite pigmentosa inclui redução ou prevenção de sintomas associados com RP, incluindo, sem se limitar a, métodos de prevenção de degeneração retinal, métodos para parar a progressão da RP, métodos para aumentar a função do fotorreceptor, e similares. Sintomas e/ou patologia da RP incluem, mas não se limitam a, perda da visão, perda de visão noturna, perda de campo visual periférico, perda de função do ERG; perda da acuidade visual e sensibilidade ao contraste; perda de comportamento visualmente orientado, redução na função do fotorreceptor, morte celular do fotorreceptor do bastonete, diminuição da visão escotópica, redução das alterações celulares retinais (perda de estrutura ou função fotorreceptora; afinamento ou espessamento da camada nuclear externa (ONL); afinamento ou espessamento da camada plexiforme externa (OPL); desorganização seguida de perda dos segmentos externos do bastonete e do cone; encurtamento dos segmentos externos do bastonete haste e do cone; retração dos dendritos de células bipolares; afinamento ou espessamento das camadas retinais internas incluindo camada nuclear interna, camada plexiforme interna, camada de células do gânglio e camada de fibras nervosas; localização errada da opsina; superexpressão de neurofilamentos; e similares. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para evitar a deterioração da função celular do bastonete e a morte celular do bastonete e a função celular do cone e a morte celular do cone.

[0097] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para prevenir ou retardar a progressão da RP. RP autossômica dominante é uma doença genética que pode ser genotipada. Início e progressão de RP podem ser determinados por tomografia de coerência óptica (OCT) que permite o exame de anormalidades da camada plexiforme externa (OPL).

[0098] Os meios para determinar a melhora dos sintomas de RP são conhecidos na técnica. Por exemplo, a medição dos campos visuais (por exemplo, campos visuais de Goldmann), determinação do eletrorretinograma (ERG), fotografias de fundo de olho, tomografia de coerência óptica e angiofluoresceinografia. Melhorias no comportamento evocado visualmente pode ser utilizado para determinar a melhoria dos sintomas de RP; por exemplo, declarações como "Posso encontrar coisas que caem", "Posso ver rostos durante um jantar a luz de velas," "Posso ver listras na minha camisa", "Posso ver estrelas à noite", "Posso ler livros comuns e sentar na frente da sala de aula", "Agora posso jogar futebol e não preciso de alguém próximo a mim para me ajudar a encontrar a bola", "Posso andar de bicicleta no meu bairro sozinho", "Alcancei meu sonho: Vi a minha filha acertar um homerun" e "quando posso ter o meu outro olho injetado?"

[0099] Em alguns aspectos da invenção, os métodos e as composições são usados para o tratamento de humanos com RP. A RP pode ser herdada de forma autossômica dominante, autossômica recessiva ou ligada ao X. A RP ligada ao X pode ser recessiva, afetando principalmente somente o sexo masculino, ou dominante, afetando tanto o sexo masculino como o sexo feminino. A RP pode ser causada por mutações no gene rho que codifica a proteína rodopsina. Em algumas modalidades da invenção, os métodos são utilizados para tratar os seres humanos com uma mutação no gene rho e/ou na proteína rodopsina. Em algumas modalidades da invenção, a mutação na proteína rodopsina é uma mutação P23H (substituição de histidina para prolina no resíduo de aminoácido 23 da proteína rodopsina). Em outras modalidades, a mutação na proteína rodopsina é uma T58R, P347L ou P347S ou uma deleção de resíduo I255. As mutações associadas com retinite pigmentosa são fornecidas por McWilliam, P et al., (1989) Genomics 5:619-622; Dryja, TP et al., (1990) Nature 343:364-266; Farrar, GJ et al., (1990) Genomics 8:3540; Farrar, GJ et al., (2002) EMBO J. 21:857-864; estando todos aqui incorporados, a título de referência.

[00100] MiR-708 é um RNA micro regulado por CHOP que regula a expressão da rodopsina (Behrman, S., et al. (2011) J. Cell Biol. 192(6):919-27). MiR-708 é um RNA micro intrônico residente no gene Odz4 induzível por CHOP (Tenurin-4). CHOP regula a expressão de miR-708 durante o estresse do RE. Existe uma sequência de miR - 708 putativa no 3' UTR do gene da rodopsina que é altamente conservada (ver Figura 4 de Behrman et al., ibid).

[00101] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para tratar um ser humano com RP. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para tratar um ser humano com RP autossômica dominante. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para tratar um ser humano com RP associada com uma mutação no gene da rodopsina. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para tratar um ser humano com RP por administração de uma quantidade eficaz de um vetor de AAV que codifica miR-708 para suprimir a atividade de uma rodopsina mutante. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para tratar um ser mamífero (por exemplo, um cão ou um gato) com RP. Em algumas modalidades, o ácido nucleico de miR-708 pode incluir sem limitação o ácido nucleico representado por GenBank Entrez Gene IDs 100126333, 735284, ou 100885899.

[00102] Em algumas modalidades da invenção, a supressão de uma rodopsina mutante é suplementada pela entrega de uma quantidade eficaz do vetor de AAV que codifica uma rodopsina de um tipo selvagem ou uma rodopsina com atividade essencialmente a mesma que uma rodopsina do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a rodopsina é uma rodopsina humana. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para tratar um ser humano com RP por administração de uma quantidade eficaz de um vetor de AAV que codifica miR-708 para suprimir a atividade de uma rodopsina mutante e uma quantidade eficaz de um vetor de AAV que codifica uma rodopsina humana com atividade do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o vetor de AAV que codifica o miR-708 e o vetor de AAV que codifica a rodopsina humana são os mesmos vetores de AAV. Em algumas modalidades, o vetor de AAV que codifica o miR-708 e o vetor de AAV que codifica a rodopsina humana são vetores diferentes de AAV. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a rodopsina pode incluir sem limitação o ácido nucleico fornecido e identificado pelas sequências de referência do NCBI NP_000530, NP_663358, NP_001008277 e NP_001009242.

[00103] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para o tratamento de estresse do retículo endoplasmático (RE) em uma célula compreendendo administrar aos mamíferos uma partícula viral de rAAV compreendendo um vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica um miR-708. Em algumas modalidades, a célula é uma célula ocular. Em outras modalidades, a célula é uma célula fotoreceptora. Em ainda outras modalidades, a célula é uma célula fotoreceptora de bastonete. Em umas modalidades, o método compreende a redução de um ou mais marcadores celulares de estresse de RE. Em outras modalidades, um ou mais marcadores celulares de estresse de RE é XBP-1, CHP ou Grp78 submetidos a splicing. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV compreende um ácido nucleico que codifica um miR-708 compreendendo ainda um ácido nucleico que codifica uma rodopsina. Em outras modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento do estresse do retículo endoplasmático (RE) em uma célula compreendendo administrar ao mamífero um primeiro vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica um miR-708 e uma segunda partícula viral de rAAV compreendendo um segundo vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica uma rodopsina.

[00104] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para entregar miR-708 ou miR-708 e rodopsina a um mamífero com RP, o método compreendendo administrar na retina dos mamíferos uma quantidade eficaz de partículas virais de rAAV compreendendo o vetor que codifica o miR-708 e/ou a rodopsina. A administração fornece o produto transgene para as células fotorreceptoras, onde o miR-708 e/ou a rodopsina medeia um efeito benéfico na célula fotorreceptora e células fotorreceptoras circundante. Em algumas modalidades, a entrega de partículas virais de AAV para a retina é pela injeção de partículas virais para o espaço sub-retinal da retina. Em algumas modalidades, entrega de partículas AAV para a retina é pela entrega intravítrea desde que a partícula AAV seja capaz de penetrar na parte de trás do olho e transduzir as células fotorreceptoras. Em algumas modalidades, as partículas de AAV são administradas em um ou mais locais no espaço sub-retiniano da retina.

[00105] Em algumas modalidades, a administração na retina de uma quantidade eficaz de partículas virais de rAAV compreendendo um vetor que codifica o miR-708 e/ou a rodopsina transduz células fotorreceptoras no ou perto do local de administração. Em algumas modalidades, mais do que cerca de qualquer uma das 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou 100% das células fotorreceptoras são transduzidas. Em algumas modalidades, cerca de 5% a cerca de 100%, cerca de 10% a cerca de 50%, cerca de 10% a cerca de 30%, cerca de 25% a cerca de 75%, cerca de 25% a cerca de 50% ou cerca de 30% a cerca de 50% das células fotorreceptoras são transduzidas. Métodos para identificar células fotorreceptoras transduzidas pelo AAV expressando miR-708 e/ou rodopsina são conhecidos na técnica; por exemplo, imunohistoquímica ou o uso de um marcador como proteína verde fluorescente melhorada pode ser utilizado para detectar a expressão de miR-708 e/ou da rodopsina.

[00106] Em algumas modalidades da invenção, os métodos compreendem a administração à retina (por exemplo, o espaço sub- retiniano) de um mamífero uma quantidade eficaz de partículas virais de AAV compreendendo um vetor que codifica um miR708 e/ou uma rodopsina para o tratamento de um mamífero, por exemplo, um ser humano, com RP. Em algumas modalidades, a composição é injetada a um ou mais espaços sub-retinianos para permitir a expressão de miR-708 e/ou da rodopsina nas células fotorreceptoras. Em algumas modalidades, a composição é injetada em qualquer um de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais de dez locais no espaço sub-retiniano da retina.

[00107] Em algumas modalidades, as partículas virais de rAAV são administradas para mais de um local de forma simultânea ou sequencial. Em algumas modalidades, injeções múltiplas de partículas virais de rAAV não são mais do que uma hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, nove horas, doze horas ou 24 horas à parte.

[00108] Em algumas modalidades, a primeira partícula viral de rAAV que codifica miR-708 e a segunda partícula viral de rAAV que codifica a rodopsina são administradas a um ou mais locais simultaneamente ou sequencialmente. Em algumas modalidades, injeções múltiplas de partículas virais de rAAV não são mais do que uma hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, nove horas, doze horas ou 24 horas à parte. Em algumas modalidades, as primeiras partículas virais de rAAV que codificam o miR-708 são administradas antes das segundas partículas virais de rAAV que codificam a rodopsina serem administradas. Em algumas modalidades, as primeiras partículas virais de rAAV que codificam o miR-708 são administradas depois das segundas partículas virais de rAAV que codificam a rodopsina serem administradas.

[00109] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para tratar um ser humano com RP por administração de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um vetor de AAV que codifica miR-708 para suprimir a atividade de uma rodopsina mutante. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para tratar um ser humano com RP por administração de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um vetor de AAV que codifica miR-708 para suprimir a atividade de uma rodopsina mutante e uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um vetor de AAV que codifica uma rodopsina para suplementar fotorreceptores com atividade da rodopsina do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreendendo um vetor de AAV que codifica o miR-708 e a composição farmacêutica compreendendo um vetor de AAV que codifica a rodopsina humana são as mesmas composições farmacêuticas. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreendendo um vetor de AAV que codifica o miR-708 e a composição farmacêutica compreendendo um vetor de AAV que codifica a rodopsina humana são diferentes composições farmacêuticas. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitável.

[00110] Em algumas modalidades da invenção, o volume da composição injetada ao espaço sub-retiniano da retina ou intravitreamente é mais do que qualquer um dos 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl, 5 μl, 6 μl, 7 μl, 8 μl, 9 μl, 10 μl, 15 μl, 20 μl, 25 μl, 50 μl, 75 μl, 100 μl, 200 μl, 300 μl, 400 μl, 500 μl, 600 μl, 700 μl, 800 μl, 900 μl, ou 1 ml, ou qualquer quantidade entre eles.

[00111] As composições da invenção (por exemplo, partículas virais de AAV compreendendo um vetor que codifica miR-708 e/ou rodopsina) pode ser utilizada isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais para o tratamento de RP. O intervalo entre a administração sequencial pode ser em termos de no mínimo (ou, alternativamente, menos) minutos, horas ou dias.

V. Constructos de expressão

[00112] Em algumas modalidades, o transgene (por exemplo, miRNA 708 e/ou rodopsina) está ligado de maneira funcional a um promotor. Os promotores exemplares incluem, mas não estão limitados a, o promotor de início imediato do citomegalovírus (CMV), o RSV LTR, o MoMLV LTR, o promotor da fosfoglicerato quinase-1 (PGK), um promotor do vírus símio 40 (SV40) e um promotor de CK6, um promotor da transtiretina (TTR), um promotor TK, um promotor responsivo à tetraciclina (TRE), um promotor HBV, um promotor hAAT, um promotor LSP, promotores específicos do fígado quimérico (LSPs), o promotor E2F, o promotor de telomerase (hTERT); o promotor potencializador do citomegalovírus/beta-actina da galinha/ beta-globina do coelho (promotor CAG; Niwa et al., Gene, 1991, 108(2):193-9) e o promotor do fator de alongamento 1-alfa (EFl-alfa) (Kim et al., Gene, 1990, 91(2):217-23 e Guo et al., Gene Ther., 1996, 3(9):802-10). Em algumas modalidades, o promotor compreende um promotor da β- glucuronidase humana ou um promotor do potencializador do citomegalovírus ligado a uma β-actina de galinha (CBA). O promotor pode ser um promotor constitutivo, induzível ou repressível. Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor de AAV compreendendo o ácido nucleico que codifica miR-708 ligado de maneira funcional a um promotor da CBA. Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor de AAV compreendendo o ácido nucleico que codifica a rodopsina (por exemplo, a rodopsina humana) ligada de maneira funcional a um promotor da CBA. Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor de AAV compreendendo o ácido nucleico que codifica o miR-708 e o ácido nucleico que codifica a rodopsina (por exemplo, a rodopsina humana) ligada de maneira funcional a um promotor da CBA.

[00113] Em algumas modalidades, o promotor é capaz de expressar o transgene nas células fotorreceptoras. Em modalidades, o promotor é o promotor da rodopsina quinase (RK), por exemplo, um promotor da RK humana. Em algumas modalidades, o promotor é o promotor da opsina, por exemplo, um promotor da opsina humana ou promotor da opsina do camundongo.

[00114] Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor de AAV compreendendo o ácido nucleico que codifica miR-708 ligado de maneira funcional a um promotor da RK. Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor de AAV compreendendo o ácido nucleico que codifica a rodopsina (por exemplo, a rodopsina humana) ligada de maneira funcional a um promotor da RK. Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor de AAV compreendendo o ácido nucleico que codifica o miR-708 e a rodopsina (por exemplo, a rodopsina humana) ligada de maneira funcional a um promotor da RK. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 é 5' para o ácido nucleico que codifica a rodopsina. Em outra modalidade, o ácido nucleico que codifica o miR-708 é 3' para o ácido nucleico que codifica a rodopsina. Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor de AAV compreendendo o ácido nucleico que codifica o miR- 708 ligado de maneira funcional a um primeiro promotor da RK e o ácido nucleico que codifica a rodopsina ligado de maneira funcional a um segundo promotor da RK Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 ligado de maneira funcional a um primeiro promotor da RK é 5’ para o ácido nucleico que codifica a rodopsina ligado de maneira funcional a um segundo promotor da RK Em outras modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 ligado de maneira funcional a um primeiro promotor da RK é 3’ para o ácido nucleico que codifica a rodopsina ligado de maneira funcional a um segundo promotor da RK Em algumas modalidades, o miR-708 compreende a sequência da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o miR-708 compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a rodopsina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a rodopsina compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a rodopsina é um equivalente funcional da rodopsina do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a expressão da rodopsina a partir do vetor de AAV é refratária à supressão por miR-708. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando a rodopsina carece do sítio alvo de miR-708 no 3' UTR do gene da rodopsina. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando a rodopsina compreende uma mutação (e.g., uma eliminação, uma substituição, uma inserção, etc) no sítio alvo de miR- 708 no 3' UTR do gene da rodopsina, de modo que ele seja refratário à supressão por miR-708.

[00115] Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor de AAV compreendendo o ácido nucleico que codifica miR-708 ligado de maneira funcional a um promotor da opsina. Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor de AAV compreendendo o ácido nucleico que codifica a rodopsina (por exemplo, a rodopsina humana) ligada de maneira funcional a um promotor da opsina. Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor de AAV compreendendo o ácido nucleico que codifica o miR-708 e o ácido nucleico que codifica a rodopsina (por exemplo, a rodopsina humana) ligada de maneira funcional a um promotor da opsina. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 é 5' para o ácido nucleico que codifica a rodopsina. Em outra modalidade, o ácido nucleico que codifica o miR-708 é 3' para o ácido nucleico que codifica a rodopsina. Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor de AAV compreendendo o ácido nucleico que codifica o miR-708 ligado de maneira funcional a um primeiro promotor da opsina e o ácido nucleico que codifica a rodopsina ligado de maneira funcional a um segundo promotor da opsina Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 ligado de maneira funcional a um primeiro promotor da opsina é 5’ para o ácido nucleico que codifica a rodopsina ligado de maneira funcional a um segundo promotor da opsina. Em outras modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR- 708 ligado de maneira funcional a um primeiro promotor da opsina é 3’ para o ácido nucleico que codifica a rodopsina ligado de maneira funcional a um segundo promotor da opsina. Em algumas modalidades, o miR-708 compreende a sequência da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o miR-708 compreende a sequência da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o miR-708 compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a rodopsina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a rodopsina compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a rodopsina é um equivalente funcional da rodopsina do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a expressão da rodopsina a partir do vetor de AAV é refratária à supressão por miR-708. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando a rodopsina carece do sítio alvo de miR-708 no 3' UTR do gene da rodopsina. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando a rodopsina compreende uma mutação (e.g., uma eliminação, uma substituição, uma inserção, etc) no sítio alvo de miR-708 no 3' UTR do gene da rodopsina, de modo que ele seja refratário à supressão por miR-708.

[00116] Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor de AAV compreendendo o ácido nucleico que codifica o miR-708 ligado de maneira funcional a um primeiro promotor da RK e o ácido nucleico que codifica a rodopsina ligado de maneira funcional a um promotor da opsina. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR- 708 ligado de maneira funcional a um promotor da RK é 5’ para o ácido nucleico que codifica a rodopsina ligado de maneira funcional a um promotor da opsina. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 ligado de maneira funcional a um promotor da RK é 3’ para o ácido nucleico que codifica a rodopsina ligado de maneira funcional a um promotor da opsina. Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor de AAV compreendendo o ácido nucleico que codifica o miR-708 ligado de maneira funcional a um primeiro promotor da opsina e o ácido nucleico que codifica a rodopsina ligado de maneira funcional a um promotor da RK. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 ligado de maneira funcional a um promotor da opsina é 5’ para o ácido nucleico que codifica a rodopsina ligado de maneira funcional a um promotor da RK. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 ligado de maneira funcional a um promotor da opsina é 3’ para o ácido nucleico que codifica a rodopsina ligado de maneira funcional a um promotor da RK. Em algumas modalidades, o miR-708 compreende a sequência da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o miR-708 compreende a sequência da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o miR-708 compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a rodopsina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a rodopsina compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a rodopsina é um equivalente funcional da rodopsina do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a expressão da rodopsina a partir do vetor de AAV é refratária à supressão por miR-708. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando a rodopsina carece do sítio alvo de miR-708 no 3' UTR do gene da rodopsina. Em alguas modalidades, o ácido nucleico codificando a rodopsina compreende uma mutação (e.g., uma eliminação, uma substituição, uma inserção, etc) no sítio alvo de miR-708 no 3' UTR do gene da rodopsina, de modo que ele seja refratário à supressão por miR-708.

[00117] Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor de AAV compreendendo o ácido nucleico que codifica o miR-708 ligado de maneira funcional a um promotor da CBA e o ácido nucleico que codifica a rodopsina ligado de maneira funcional a um promotor da RK. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 ligado de maneira funcional a um promotor da CBA é 5’ para o ácido nucleico que codifica a rodopsina ligado de maneira funcional a um promotor da RK. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 ligado de maneira funcional a um promotor da CBA é 3’ para o ácido nucleico que codifica a rodopsina ligado de maneira funcional a um promotor da RK. Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor de AAV compreendendo o ácido nucleico que codifica o miR-708 ligado de maneira funcional a um promotor da RK e o ácido nucleico que codifica a rodopsina ligado de maneira funcional a um promotor da CBA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 ligado de maneira funcional a um promotor da RK é 5’ para o ácido nucleico que codifica a rodopsina ligado de maneira funcional a um promotor da CBA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 ligado de maneira funcional a um promotor da RK é 3’ para o ácido nucleico que codifica a rodopsina ligado de maneira funcional a um promotor da CBA. Em algumas modalidades, o miR-708 compreende a sequência da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o miR-708 compreende a sequência da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o miR-708 compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos cerca de 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a rodopsina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a rodopsina compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a rodopsina é um equivalente funcional da rodopsina do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a expressão da rodopsina a partir do vetor de AAV é refratária à supressão por miR-708. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando a rodopsina carece do sítio alvo de miR-708 no 3' UTR do gene da rodopsina. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando a rodopsina compreende uma mutação (e.g., uma eliminação, uma substituição, uma inserção, etc) no sítio alvo de miR- 708 no 3' UTR do gene da rodopsina, de modo que ele seja refratário à supressão por miR-708.

[00118] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 compreende uma estrutura endógena de miR-708. Em algumas modalidades, a estrutura de miR-708 é fornecida pela SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 compreende uma estrutura heteróloga de miRNA. Em algumas modalidades, utilização de uma estrutura heteróloga de miRNA é utilizada para modular a expressão de miRNA; por exemplo, para aumentar ou diminuir a expressão de miRNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 compreende uma estrutura endógena de miR-155. Em algumas modalidades, a estrutura de miR-155 é fornecida pela SEQ ID NO: 14.

Vetor Viral Recombinante

[00119] A presente invenção contempla o uso de um genoma viral recombinante para a introdução de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codifica o miR-708 miRNA e/ou uma proteína da rodopsina descrita aqui para embalagem em uma partícula viral de AAV. O genoma viral recombinante pode incluir qualquer elemento para estabelecer a expressão de um miR-708 miRNA e/ou uma proteína rodopsina, por exemplo, um promotor, um miR-708 miRNA e/ou uma rodopsina transgene, um ITR, um elemento de ligação do ribossomo, terminador, potencializador, marcador de seleção, íntron, sinal polyA e/ou origem de replicação.

VI. Partículas virais e métodos de produção de partículas virais Partículas virais de rAAV

[00120] A invenção fornece métodos de utilização de partículas de rAAV para tratar a retinite pigmentosa e fornece composições compreendendo partículas de rAAV. Em algumas modalidades, a partícula viral é uma partícula de AAV recombinante compreendendo um ácido nucleico composto por uma sequência de codificação de miR-708 miRNA e/ou uma proteína rodopsina descrita aqui flanqueada por uma ou duas ITRs. O ácido nucleico é encapsidado na partícula de AAV. A partícula de AAV também compreende proteínas do capsídeo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende a(s) sequência(s) de codificação de interesse (por exemplo, ácido nucleico codificando miR-708 miRNA e/ou uma proteína rodopsina) que está ligado de forma operacional a componentes no sentido de transcrição, sequências de controle incluindo sequências de iniciação e terminação de transcrição, formando um cassete de expressão. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o miR-708 é embebido em um íntron. A cassete de expressão é flanqueada por terminação 5" e 3" por pelo menos uma sequência funcional de ITR de AAV. Por "sequência funcional de ITR de AAV" significava que as sequências de ITR funcionam como pretendido para o resgate, a replicação e a embalagem do vírion de AAV. Ver Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32; Passini et al., J. Virol., 2003, 77(12):7034- 40; e Pechan et al., Gene Ther., 2009, 16:10-16, todos os quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Para a prática de alguns aspectos da invenção, os vetores recombinantes compreendem pelo menos todas as sequências de AAV essencial para encapsidação e as estruturas físicas para infecção pelo rAAV. As ITR s de AAV para uso nos vetores da invenção não necessitam de ter uma sequência de nucleotídeos de tipo selvagem (por exemplo, como descrito em Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801) e podem ser alteradas pela inserção, deleção ou substituição de nucleotídeos ou as ITR de AAV podem ser derivadas a partir de qualquer um dos diversos sorotipos de AAV. Mais de 40 sorotipos de AAV são conhecidos atualmente e novos sorotipos e variantes de sorotipos existentes continuarão a ser identificados. Ver Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6; Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081-6; e Bossis et al., J. Virol., 2003,77(12):6799-810. O uso de qualquer sorotipo de AAV é considerado dentro do escopo da presente invenção. Em algumas modalidades, o vetor rAAV é um vetor derivado que qualquer serotipo de AAV, incluindo, sem limitação, ITRs de sorotipo do capsídeo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um AAV de cabra, AAV bovino, ou AAV de camundongo ou similares. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende uma ITR de ITRs de sorotipo do capsídeo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um AAV de cabra, AAV bovino, ou AAV de camundongo ou similares. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV codifica ainda miR-708, rodopsina ou miR-708 e rodopsina como descrito no presente documento. Por exemplo, o ácido nucleico no AAV pode compreender pelo menos uma ITR de qualquer sorotipo de AAV contemplado aqui e ainda pode codificar um miR-708 compreendendo o ácido nucleico de SEQ ID NO:1 e/ou o ácido nucleico que codifica uma rodopsina humana compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende ácido nucleico 5' a 3' codificando o seguinte: uma ITR de AAV, um fragmento do enchedor (por exemplo, SEQ ID NO:11), um intrão quimérico (por exemplo, SEQ ID NO:10), um miR-708, uma sequência de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino, um fragmento do enchedor e uma ITR de AAV. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende ácido nucleico 5' a 3' codificando o seguinte: uma ITR de AAV, um promotor de RK, um íntron de β-globina, um miR-708 embebido no íntron de β-globina, uma rodopsina humana, uma sequência de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino e uma ITR de AAV. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende ácido nucleico 5' a 3' codificando o seguinte: uma ITR de AAV, um fragmento do enchedor (por exemplo, SEQ ID NO:11), um promotor de RK, um intrão quimérico (por exemplo, SEQ ID NO:10), uma rodopsina humana, íntron de β-globina, um miR-708 embebido no íntron de β-globina, uma sequência de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino, um fragmento do enchedor e uma ITR de AAV. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende ácido nucleico 5' a 3' codificando o seguinte: uma ITR de AAV, um fragmento do enchedor (por exemplo, SEQ ID NO:11), um promotor de RK, um intrão quimérico (por exemplo, SEQ ID NO:10), um miR-708, um promotor de opsina de camundongo, uma rodopsina humana, uma sequência de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino e uma ITR de AAV. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende o ácido nucleico da SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende um ácido nucleico que tem pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende o ácido nucleico da SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende um ácido nucleico que tem pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende o ácido nucleico da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende um ácido nucleico que tem pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende o ácido nucleico da SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende um ácido nucleico que tem pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende o ácido nucleico da SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende um ácido nucleico que tem pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende o ácido nucleico da SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende um ácido nucleico que tem pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende o ácido nucleico da SEQ ID NO: 25. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende um ácido nucleico que tem pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 25. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende o ácido nucleico da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende um ácido nucleico que tem pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende o ácido nucleico da SEQ ID NO: 27. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende um ácido nucleico que tem pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 27. Em outras modalidades, a partícula de rAAV compreende proteínas de capsídeo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7M8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, um AAV de cabra, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino, capsídeo de AAV de camundongo, capsídeo do serotipo rAAV2/HBoV1 dessas proteínas do capsídeo. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo mutante mantém a capacidade para formar um capsídeo de AAV. Em algumas modalidades, a partícula de rAAV compreende capsídeo mutante da tirosina de AAV5 (Zhong L. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105(22):7827-7832. Em outras modalidades, a partícula de rAAV compreende partículas do capsídeo de um sorotipo de AAV de clades A-F (Gao et al., J. Virol. 2004, 78(12):6381). Em algumas modalidades, ácido nucleico no AAV compreende a sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs:5-8, e é flanqueado por pelo menos um ITR de AAV2. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende um ácido nucleico que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o ácido nucleico selecionado do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 5-9 e é flanqueado por pelo menos um ITR de AAV2.

[00121] Diferentes sorotipos de AAV são usados para otimizar a transdução de determinadas células alvo ou tipos celulares específicos alvo dentro de um determinado tecido alvo (por exemplo, um tecido doente). Uma partícula rAAV pode incluir proteínas virais e ácidos nucleicos virais do mesmo sorotipo ou sorotipos mistos. Por exemplo,em algumas modalidades, uma partícula de rAAV pode incluir proteínas do capsídeo de AAV5 e pelo menos uma ITR de AAV2 ou pode compreender proteínas do capsídeo de AAV2 e pelo menos uma ITR de AAV5. Em outras modalidades, uma partícula de rAAV pode incluir proteínas do capsídeo mutante da tirosina de AAV5 e pelo menos uma ITR de AAV2. Ainda em um outro exemplo, uma partícula de rAAV pode incluir tanto as proteínas do capsídeo de ambos AAV5 e AAV2, e compreender ainda pelo menos uma ITR de AAV2. Qualquer combinação de sorotipos de AAV para produção de uma partícula de rAAV é fornecida aqui como se cada combinação tivesse sido expressamente declarada neste documento. Em algumas modalidades, a invenção fornece partículas de rAAV compreendendo proteínas do capsídeo de AAV5 e um ácido nucleico codificando um miR-708 RNA e/ou um a rodopsina transgene, flanqueada por pelo menos uma ITR de AAV2.

Genomas Virais Auto-complementares de AAV

[00122] Em alguns aspectos, a invenção fornece partículas virais compreendendo um genoma auto-completar recombinante. As partículas virais de AAV com genomas auto-completares e métodos de utilização de genomas auto-completares de AAV são descritos em patentes dos EUA Nos: 6.596.535; 7.125.717; 7.765.583; 7.785.888; 7.790.154; 7.846.729; 8.093.054; e 8.361.457; e Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105-2111, cada um dos quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Um rAAV compreendendo um genoma auto-completar rapidamente formará uma molécula de DNA de fita dupla em virtude das suas sequências parcialmente complementares (por exemplo, fitas complementares de codificação e de não- codificação de um transgene). Em algumas modalidades, a invenção fornece uma partícula viral de AAV compreendendo um genoma de AAV, onde o genoma de rAAV compreende uma primeira sequência heteróloga de polinucleotídeos (por exemplo, uma cadeia de codificação de miR-708 e/ou da rodopsina) e uma segunda sequência heteróloga de polinucleotídeo (por exemplo, cadeia anti-senso do miR-708 e/ou uma cadeia não- codificante ou anti-senso da rodopsina) onde a primeira sequência heteróloga de polinucleotídeo pode formar pares de base intra-cadeia com a segunda sequência de polinucleotídeos junto a maior parte ou a totalidade do seu comprimento. Em algumas modalidades, a primeira sequência heteróloga de polinucleotídeo e a segunda sequência heteróloga e polinucleotídeo estão ligadas por uma sequência que facilita o pareamento de bases intra-cadeia; por exemplo, uma estrutura de grampo do DNA. Estruturas de grampo são conhecidas na técnica, por exemplo, em moléculas de siRNA. Em algumas modalidades, a primeira sequência heteróloga de polinucleotídeo e a segunda sequência heteróloga de polinucleotídeo estão ligadas por uma ITR modificada (por exemplo, a ITR direita). Em algumas modalidades, a ITR compreende a sequência de polinucleotídeos 5’- CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC CAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG - 3’ (SEQ ID NO:20). A ITR mutante compreende uma deleção da região D que compõem a sequência de resolução terminal. Como resultado, replicando um genoma viral de AAV, as proteínas rep não irá clivar o genoma viral na ITR mutante e como tal, um genoma viral recombinante compreendendo os seguintes na ordem 5' para 3' serão embaladas em um capsídeo viral: uma ITR de AAV, a primeira sequência de polinucleotídeo heterólogo incluindo sequências reguladoras, a ITR AAV modificada, a segunda orientação inversa de polinucleotídeo heterólogo para o primeiro polinucleotídeo heterólogo e uma terceira ITR de AAV. Em algumas modalidades, a invenção fornece partículas virais de AAV compreendendo um genoma viral recombinante compreendendo uma ITR de AAV2 funcional, uma primeira sequência de polinucleotídeos codificando miR-708 RNA e/ou uma rodopsina transgene, uma ITR de AAV2 modificada compreendendo uma deleção da região D e faltando uma sequência de resolução terminal funcional, uma segunda sequência de polinucleotídeo compreendendo a sequência complementar para a sequência de codificação de miR-708 RNA e/ou uma rodopsina da primeira sequência de polinucleotídeos e uma ITR de AAV2 funcional. Produção de Partículas de AAV

[00123] As partículas de rAAV podem ser produzidas utilizando os métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Pat. US Nos. 6.566.118; 6.989.264; e 6.995.006. Ao praticar a invenção, as células hospedeiras para produzir partículas de rAAV incluem células de mamíferos, células de inseto, células vegetais, microorganismos e levedura. Células hospedeiras também podem ser células de embalagem na qual os genes rep e cap do AAV são mantidos de forma estável na célula hospedeira ou nas células produtoras em que o genoma do vetor de AAV é mantido de forma estável. Embalagem e células produtoras exemplares são derivadas de células 293, A549 ou HeLa. Os vetores de AAV são purificados e formulados usando as técnicas padrão conhecidas na técnica.

[00124] Em alguns aspectos, um método é fornecido para a produção de qualquer partícula de rAAV divulgada aqui compreendendo (a) a cultura de uma célula hospedeira sob uma condição que as partículas de rAAV são produzidas, em que a célula hospedeira compreende (i) um ou mais genes de pacote de AAV, onde cada referido gene de pacote de AAV codifica um proteína de replicação e/ou encapsidação de AAV; (ii) um pro-vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica miR-708 RNA e/ou qualquer rodopsina transgene como descrito aqui flanqueado por pelo menos uma ITR de AAV, e (iii) um função ajudante de AAV; e (b) recuperar as partículas de rAAV produzidas pela célula hospedeira. Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica miR-708 RNA da SEQ ID NO:1 e/ou um transgene que codifica uma rodopsina; por exemplo, uma rodopsina com o aminoácido da SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, a referida pelo menos uma ITR de AAV é selecionada do grupo consistindo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um AAV de cabra, AAV bovino, ou AAV de camundongo do sorotipo AAV ou similares. Em algumas modalidades, a dita proteína de encapsidação é selecionada a partir do grupo constituído de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 (por exemplo, um capsídeo de AAV6 do tipo selvagem, ou um capsídeo AAV6 variante como ShH10, conforme descrito em US PG Pub. 2012/0164106), AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9 (por exemplo, um capsídeo de AAV9 do tipo selvagem, ou um capsídeo modificado de AAV9 conforme descrito em US PG Pub. 2013/0323226), AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, um capsídeo mutante da tirosina, um capsídeo mutante de ligação a heparina, um capsídeo de AAV2R471A, um capsídeo de AAVAAV2/2- 7M8, um capsídeo de AAV DJ (por exemplo um capsídeo de AAV- DJ/8, um capsídeo de AAV-DJ/9, ou qualquer outro dos capsídeos descritos em US PG Pub. 2012/0066783), capsídeo de AAV2 N587A, capsídeo de AAV2 E548A, capsídeo de AAV2 N708A, capsídeo de AAV V708K, capsídeo de AAV de cabra, capsídeo quimérico de AAV1/AAV2, capsídeo de AAV bovino, capsídeo de AAV de camundongo, capsídeo de rAAV2/HBoV1, um capsídeo de AAV descrito em US Pat. N° 8.283.151 ou publicação internacional No. WO/2003/042397, ou mutantes dos mesmos. Em algumas modalidades, a proteína de encapsidação é uma proteína de capsídeo mutante de tirosina de AAV5. Em outras modalidades, a partícula de rAAV compreende partículas do capsídeo de um sorotipo de AAV de clades A-F. Em algumas modalidades, as partículas de rAAV compreendem um capsídeo de AAV5 e um genoma recombinante compreendendo ITRs de AAV2, uma ITR de AAV2 mutante e ácido nucleico codificando miR-708 e/ou rodopsina. Em algumas modalidades, as partículas de rAAV compreendem um capsídeo mutante de tirosina de AAV5 e um genoma recombinante compreendendo ITRs de AAV2, uma ITR de AAV2 mutante e ácido nucleico codificando miR-708 e/ou rodopsina. Em outra modalidade, as partículas de rAAV são purificadas. O termo "purificada" como usado aqui inclui uma preparação de partículas de rAAV desprovida de pelo menos alguns dos outros componentes que podem também estar presentes onde as partículas de rAAV ocorrem naturalmente ou são inicialmente preparados destas. Assim, por exemplo, partículas de rAAV isoladas podem ser preparadas com a utilização de uma técnica de purificação para enriquecer a partir de uma mistura de fonte, tais como um lisado da cultura ou produção de sobrenadante da cultura. O enriquecimento pode ser medido em uma variedade de formas como, por exemplo, pela proporção de partículas resistentes a DNase (DRPs) ou cópias do genoma (gc) presentes em uma solução, ou pela infecciosidade, ou pode ser medido em relação a uma segunda substância potencialmente interferente presente na mistura de fonte, como contaminantes, incluindo a produção de contaminantes de cultura ou contaminantes em processo, incluindo vírus ajudante, componentes de meios e similares.

[00125] Também são fornecidas aqui composições farmacêuticas compreendendo uma partícula de rAAV compreendendo um transgene codificando o miR-708 e/ou uma rodopsina transgene da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição compreende partículas de rAAV compreendendo um transgene codificando o miR-708 e partículas de rAAV compreendendo uma rodopsina transgene. Em algumas modalidades, a composição compreende partículas de rAAV compreendendo um transgene codificando o miR-708 e uma rodopsina transgene. As composições farmacêuticas podem ser adequadas para qualquer modo de administração descrito aqui. Uma composição farmacêutica de rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica o miR-708 RNA e/ou uma rodopsina transgene, aqui descrita pode ser introduzida aos olhos; por exemplo, por administração subretinal ou administração intravítrea.

[00126] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendendo um rAAV descrito aqui e um veículo farmaceuticamente aceitável são adequadas para a administração a humanos. Tais veículos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15 edição, p. 10351038 e 1570-1580). Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendendo um rAAV descrito aqui e um veículo farmaceuticamente aceitável são adequadas para injeção ocular. Tais veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser líquidos estéreis, como água e óleo, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral e similares. As soluções salinas e dextrose aquosa, polietilenoglicol (PEG) e soluções de glicerol também podem ser empregadas como veículos de líquidos, especialmente para soluções injetáveis. A composição farmacêutica pode ainda incluir ingredientes adicionais, por exemplo, conservantes, tampões, agentes de tonicidade, antioxidantes e estabilizadores, agentes umectantes não iônicos ou clarificantes, agentes de aumento de viscosidade e similares. As composições farmacêuticas descritas aqui podem ser embaladas em dosagens únicas ou em formas de multidosagem. As composições são geralmente formuladas como solução estéril e substancialmente isotônica.

VII. Artigos de Fabricação e Kits

[00127] Também são fornecidos ou kits de artigos de fabricação para utilização nos métodos descritos aqui. Em alguns aspectos, os kits incluem as composições descritas aqui (por exemplo, partículas de rAAV compreendendo o ácido nucleico que codifica o miR-708 RNA e/ou uma rodopsina transgene) em embalagens adequadas. Embalagens adequadas para composições (tais como composições oculares) descritas aqui são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, frascos (tais como frascos selados), recipientes, ampolas, garrafas, frascos, embalagens flexíveis (por exemplo, Mylar selado ou sacos plásticos) e similares. Estes artigos de fabricação podem ainda ser esterilizados e/ou vedados.

[00128] A presente invenção também fornece kits compreendendo composições descritas neste documento e pode incluir ainda instruções(s) sobre os métodos de utilização da composição, como usos descritos aqui. Os kits descritos aqui podem incluir ainda outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções para a realização de qualquer um dos métodos descritos aqui. Por exemplo, em algumas modalidades, o kit inclui um rAAV compreendendo um transgene codificando o miR-708 RNA e/ou de uma rodopsina transgene para entrega intra-ocular de pelo menos 1 x 109 cópias do genoma a um primata como descrito aqui, um veículo farmaceuticamente aceitável adequado para injeção intraocular e um ou mais: um tampão, um diluente, um filtro, uma agulha, uma seringa e uma bula com instruções para realizar injeções oculares. Em algumas modalidades, o kit compreende instruções para tratamento de retinite pigmentosa com as partículas de rAAV descritas aqui. Em algumas modalidades, o kit compreende instruções para redução do estresse do RE em uma célula com as partículas de rAAV descritas aqui. Em algumas modalidades, o kit compreende as instruções para usar as partículas de rAAV descritas aqui de acordo com qualquer um dos métodos descritos aqui.

EXEMPLOS

[00129] A invenção será mais bem entendida por referência aos seguintes exemplos. Eles não devem, no entanto, ser interpretados como limitando o escopo da invenção. Fica entendido que os exemplos e as modalidades descritos aqui são apenas para fins ilustrativos e que diversas modificações ou alterações à luz destas serão sugeridas às pessoas qualificadas na técnica e não estão sendo incluídas dentro do espírito e da competência desta aplicação e escopo as reivindicações em anexo.

Exemplo 1: Desenvolvimento de um modelo celular da retinite pigmentosa

[00130] Uma estratégia terapêutica para RP autossômica dominante associada a Rho seria nocautear a rodopsina mutante e do tipo selvagem e aliviar o estresse do RE. Isto poderia ser alcançado através da co-fornecimento de um micro-RNA (miR) que iniba os alelos da rodopsina e opcionalmente co-fornecendo uma sequência da rodopsina do tipo selvagem refratária ao nocaute pelo miR fornecido exogenamente. Um miR regulado por CHOP, miR-708, regula a expressão da rodopsina (Behrman, S., et al. (2011) J. Cell Biol. 192(6):919-27). MiR-708 é um miR intrônico residente no gene Odz4 induzível por CHOP (Tenurin-4). O CHOP regula a expressão de miR- 708 durante o estresse do RE e existe uma sequência de miR-708 putativa no 3' UTR da rodopsina.

[00131] Os métodos descritos aqui são para o uso de um vetor de AAV para entregar miR-708 exógeno dirigindo a rodopsina do tipo selvagem e mutante através da sequência alvo de 3' UTR miR-708 presente em ambos os alelos. Em modalidades, uma sequência de substituição da rodopsina do tipo selvagem é também co-entregue. Esta sequência de substituição da rodopsina pode ser projetada para ter ligação diminuída a miR-708 (por exemplo, substituição, deleção ou adição de nucleotídeo em 3' UTR) e assim ser refratária ao nocaute pelo miR-708 exógeno. Em modalidades, a sequência de substituição da rodopsina carece de uma sequência alvo de 3' UTR miR-708. Em resumo, esses vetores de AAV nocauteariam a expressão da rodopsina que causa o estresse do RE (e, portanto, morte celular fotorreceptora) e opcionalmente suplementando o gene da rodopsina do tipo selvagem ou códon otimizado que é refratário ao nocaute induzido por miR-708, restaurando assim a expressão normal e função da rodopsina.

Métodos Cultura celulares

[00132] As células HEK-293 foram projetadas para expressar a rodopsina P23H humana ou de camundongo usando o sistema induzível de tetraciclina T-Rex de Invitrogen. Células confluentes em placas de 6 poços foram transfectadas com 4 μg do vetor de miR-708 (pcDNA) ou um vetor de miRNA controle utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. 48 horas pós- transfecção o meio foi substituído com meio contendo 2 μM de tetraciclina. As células foram incubadas mais vinte e quatro horas e o meio foi removido de cada poço.

Western blotting

[00133] As células foram lisadas em 400 μL de tampão RIPA (Thermo Scientific) contendo 1mM PMSF, e passado através de uma seringa de 25g várias vezes. O lisado foi centrifugado a 14.000 rpm por 10 min. As células foram mantidas a 4oC ao longo de todo o processo. 30 μl do sobrenadante foi carregado em um Bis/Tris gel a 412% e SDS-PAGE foi realizada em tampão MOPS (Invitrogen). As proteínas foram então transferidas para a membrana de nitrocelulose utilizando o sistema de I-blot da Invitrogen. A membrana foi bloqueada por uma hora à temperatura ambiente em PBS contendo Tween-20 a 0,05% (PBS-T) e I-Bloco a 0,1 % (Invitrogen). A membrana foi incubada durante uma noite a 4oC em PBS-T contendo 1 μg/ml anti rodopsina mAb 1D4 (Abcam). Depois de lavar em PBS-T várias vezes a membrana foi incubada em solução de anticorpo secundária contendo uma diluição 1:1000 de IgG anti-camundongo Ab conjugado com HRP (R&D Systems) durante uma hora à temperatura ambiente. A membrana foi lavada com PBS-T várias vezes e desenvolvida usando o reagente ECL (Thermo Scientific). Os níveis de proteína mRodopsina foram quantificados utilizando o software Image-J. A membrana foi removida de proteínas em PBS contendo glicina 0,1M, pH 2, e depois lavada várias vezes em PBS-T. A membrana foi então sondada para hGAPDH em PBS-T que contenha uma diluição de 1:20.000 de anti GAPDH pAb (Sigma) durante 2 horas à temperatura ambiente. Depois de lavar várias vezes em PBS-T, o anticorpo secundário (Anti-coelho IgG-HRP, R&D Systems) foi diluído a 1:1000 em PBS-T e incubado por 1 hora à temperatura ambiente. A membrana foi lavada várias vezes e desenvolvida usando o reagente ECL (Thermo Scientific). Os níveis de proteína mrodopsina foram então normalizados para os níveis de proteína hGAPDH usando o software Image J.

Nocaute de MiR-708 endógeno em células HEK-293

[00134] As células HEK-293 que expressam a rodopsina de camundongo ou humana (descrito acima) foram transfectadas com 100 pmol pré-miR-708, anti-miR-708 ou miRNA controle (Ambion) usando o protocolo Lipofectamine 2000 para a transfecção com moléculas de siRNA (Invitrogen). 48 horas pós-transfecção o meio foi substituído com meio contendo 2 μM de tetraciclina para induzir a expressão da rodopsina. 24 horas mais tarde cada poço foi dividido em 2 amostras. Um foi sondado para mrodopsina e hGAPDH utilizando o protocolo de western blot acima, e RNA foi extraído a partir de outro para análise TaqMan® (Life Technologies) da expressão do RNA da rodopsina e do miR-708. O RNA total (incluindo RNAs pequenos) foi extraído das células usando o kit de miRNeasy Qiagen, de acordo com as instruções do fabricante, incluindo o tratamento de DNAse das amostras. O cDNA foi sintetizado a partir de RNA total utilizando o sistema de transcrição inverso Quantitect de Qiagen. O cDNA foi adicionado aos ensaios expressão gênica TaqMan® de mrodopsina, hCHOP (Ddit3), hBiP (Hspa 5) ou hGAPDH (Life Technologies). A expressão gênica foi normalizada em relação ao hGAPDH usando o método ΔΔCt. A expressão de MiR-708 foi quantificada através do ensaio de expressão de miR-708 TaqMan® (Life Technologies). A expressão de MiR-708 foi exibida em relação à expressão endógena de miR-16 usando o método ΔΔCt.

Expressão dirigida pelo promotor da rodopsina quinase de miR- 708 em células WERI Rb-1

[00135] A sequência de miR-708 foi subclonada a jusante do promotor da rodopsina quinase (RK) após a excisão do vetor pcDNA 6,2 GW (sistema Block-iT, Invitrogen) em vetor pRK-MVM, que contém o promotor nativo de hRK e sequências de íntron de MVM. As células WERI Rb-1 (ATCC) foram transfectadas com 2 μg de pRK-miR-708 ou vetor de controle pRK-miR usando Fugene-HD (Promega), de acordo com as instruções do fabricante. Em 48 horas pós-transfecção, as células foram coletadas e o RNA total (incluindo RNAs pequenos) foi extraído utilizando o kit de protocol miRNeasy (Qiagen). MiR-708 foi quantificado em cada amostra com o ensaio de expressão gênica TaqMan® de miR-708 conforme descrito anteriormente (Life Technologies). Para quantificar o nocaute da mrodopsina no miR-708 expressando as células WERI Rb-1, as células foram co-transfectadas com 2 μg cada de pRK-miR-708 (ou controle) e pSport6 mrodopsina P23H usando Fugene-HD de acordo com as instruções do fabricante (Promega). O RNA foi extraído como descrito e níveis de RNA da mrodopsina foram quantificados como descrito acima usando o método ΔΔCt em relação aos níveis de RNA hGAPDH.

Extração de RNA a partir de retinas de camundongo injetadas com vetores de AAV

[00136] O RNA foi extraído das retinas de camundongos usando o kit miRNeasy de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen). As retinas individuaus de camundongo foram homogeneizadas em tampão de lise Qiazol com 1 mm de microesferas de zircônio/ sílica (Biospec) por 10 min. Após homogeneização o RNA foi extraído de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de miR-708 em cada retina foram quantificados utilizando o sistema de quantificação microRNA qStar (Origene). O cDNA foi sintetizado utilizando o primeiro kit de síntese de cDNA (Origene), seguido por amplificação específica de miR-708 e quantificação utilizando primers específicos de miR-708 e um padrão de cópia de miR -708 (Origene). Para quantificação de níveis de rodopsina nos olhos dos camundongos injetados, a mrodopsina foi amplificada utilizando primers específicos (Life Technologies) e quantificados contra um padrão de cDNA da rodopsina. Os níveis de RdCVF foram analisados de forma qualitativa contra a expressão de GAPDH usando o método ΔΔCt.

Vetor de supressão/ substituição da rodopsina

[00137] O cDNA da hrodopsina (sem sequências de UTR flanqueadas) foi clonado no vetor de pRK por excisão do vetor de pcDNA e realizando uma ligação extremidade cega em pRK-MCS. O cDNA foi sintetizado (Biobasic) contendo a sequência do promotor da rhodopsina quinase e o íntron da h"β" -globina com uma sequência de inserção de hmiR-708 (sequência adquirida do Genbank/NCBI) localizado entre os locais do aceitador/doador de splice do íntron. Esta seqüência foi subclonada do vetor de pUC57, ligado no vetor de pcDNA da hrodopsina e renomeado pRK-miR-708 hRho/tipo selvagem. Os níveis de proteína do MiRNA-708 e da hrodopsina foram ensaiados como descrito acima em células transfectadas WERI Rb-1.

Quantificação de XBP-1 splicing em células WERI Rb-1 transfectadas com P23H

[00138] As células hWERI Rb-1 foram co-transfectadas com o vetor de pcDNA codificando uma mrodopsina mutante P23H não-glicosilada e vetor de pRK-miR-708. Este cDNA da rodopsina P23H foi modificado usando a mutagênesede PCR sítio dirigida (Agilent Technologies) para alterar dois códons da asparagina (nas posições 2 e 5) para alanina. As células foram transfectadas como descrito com 2 μg de cada vetor e incubadas por 72 horas. O RNA total foi coletado a partir de células como descrito anteriormente. O cDNA foi sintetizado utilizando o kit de síntese de cDNA de alta capacidade (Invitrogen). O splicing de XBP-1 foi avaliado usando primers específicos para XBP-1 e PCR de alta fidelidade MasterMix (Roche). As sequências amplificadas foram analisadas em gel de agarose a 2% e as quantidades relativas de transcrição com splicing (~280 nt) versus sem splicing (~300 nt) XBP-1 foram quantificadas usando o software Image-J.

Métodos Adicionais

[00139] Métodos de imunofluorescência, Western blotting com e sem tratamento de endoglicosidase H, expressão do marcador UPR e coloração de TUNEL de células expressando a rodopsina do tipo selvagem ou P23H mutante foram realizados conforme descrito em Adamowicz, M., et al. (2012) Adv. Exp. Med. Biol. 723:573-9.

Resultados

[00140] As células epiteliais pigmentadas da retina humana (RPE) foram temporariamente transfectadas com um gene de codificação da rodopsina humana do tipo selvagem (TS) ou P23H humana mutante (uma mutação ligada à RP). A localização da rodopsina foi investigada por microscopia confocal de imunofluorescência utilizando anticorpo anti-rodopsina. No caso da proteína do tipo selvagem, a maioria da proteína foi processada para a membrana plasmática (Fig. 1A), indicando biogênese normal. Em contraste, a P23H mutante apresentou uma distribuição reticular/perinuclear característica da retenção do retículo endoplasmático (RE), com quase nenhuma expressão na superfície celular (Fig. 1B). Esses resultados demonstram que a rodopsina P23H mutante falha como sendo traficadas corretamente para a membrana plasmática e em vez disso é retida no RE.

[00141] A agregação da rodopsina foi avaliada por análise immunoblot SDS-PAGE de extratos solúveis detergentes de células RPE expressando de forma transiente a proteína de tipo selvagem ou P23H mutante (Fig. 2A). A rodopsina do tipo selvagem migra predominantemente como uma banda difusa em uma massa molecular de ~ 40 kDa. Esta espécie corresponde a rodopsina madura monomérica contendo glicanos N-ligados. A mobilidade da rodopsina P23H mutante divergiu marcadamente da rodopsina de tipo selvagem, com a maioria da P23H migrando como dímeros e oligômeros de maior peso (Fig. 2A). P23H também foi sensível a endoglicosidase H - observe que o tratamento com endoglicosidase H afeta a migração da rodopsina P23H, mas não do tipo selvagem, como mostrado na Fig. 2B. A endoglicosidase H é específica para núcleo glicosilado, estruturas de oligossacarídeos N-ligada de alta manose típica de proteínas que não tenham amadurecido além do RE.

[00142] Em conjunto, esses dados sugerem que as células RPE da rodopsina do tipo selvagem são capazes de dobrar e amadurecer além do RE, enquanto a P23H mutante está mais propensa a formar oligômeros não nativos e é mantida dentro do RE, talvez devido a uma incapacidade para se dobrar de forma produtiva.

[00143] Em seguida, a capacidade da rodopsina P23H de induzir o estresse do RE em células RPE transfectadas foi avaliada pela medição dos níveis dos dois marcadores do UPR, BiP e CHOP. O aumento dos níveis de BiP do mRNA foram detectados em células transitoriamente expressando tanto a rodopsina do TS e P23H (Fig. 3A), sugerindo que o aumento da carga dobrável do RE per se induziu UPR. No entanto, a expressão de BiP mRNA foi significativamente maior em células que expressam a rodopsina P23H (43 vezes sobre as células não-transfectadas) quando comparadas com as células que expressam a rodopsina do TS (14 vezes sobre as células não- transfectadas) (Fig. 3A). Os níveis de mRNA da rodopsina eram idênticos em células que expressam formas do TS ou mutante da proteína (Fig. 3A). Assim, a rodopsina P23H é um indutor mais potente de BiP do que a rodopsina do TS. Sem querer ser vinculado à teoria, essa discrepância pode ser devido ao defeito de dobramento da proteína mutante.

[00144] A expressão de CHOP foi examinada a seguir. As células que expressam a proteína rodopsina do TS mostraram uma indução de 15 vezes de CHOP em comparação com células não-transfectadas, enquanto as células expressando P23H mutante mostrou uma indução ainda maior que 23 vezes (Fig. 3A). Como CHOP é um fator de transcrição induzido por UPR que medeia a apoptose (Lee, E.S., et al. (2007) FEBS Lett. 581(22):4325-32), os níveis relativos de apoptose entre células expressando TS e P23H mutante foram medidos. De acordo com níveis de mRNA de CHOP, os resultados do ensaio de TUNEL sugeriram ainda que as células RPE expressando temporariamente a P23H mutante são mais propensas a apoptose do que as que expressam a rodopsina do tipo selvagem (Fig. 3B).

Exemplo 2: Modulação dos níveis de miR-708 regula a expressão da rodopsina e UPR em células HEK-293

[00145] Uma sequência de consenso correspondente a um local alvo de miR-708 tem sido encontrada em o 3' UTR de vários genes da rodopsina de mamíferos (Behrman, S., et al. (2011) J. Cell Biol. 192(6):919-27). Este exemplo demonstra que a regulação de miR-708 da rodopsina pode ser utilizada como uma ferramenta para modular a expressão da rodopsina em células de cultura.

[00146] As células HEK-293 que expressam um gene da mrodopsina P23H mutante que codifica uma sequência alvo de 3'UTR miR-708 foram transfectadas com um plasmídeo expressando miR- 708 ou miR-controle como representado na Fig. 4. Após 72 horas, as células foram coletadas e a expressão da proteína rodopsina mP23H foi analisada usando um Western blot (Fig. 5). A expressão da proteína mrodopsina P23H foi reduzida para ~ 30% em células transfectadas com o CBA-miR-708, em comparação às células transfectadas com um vetor de CBA-miR-controle.

[00147] A expressão dos genes alvo UPR (CHOP/BIP) também foi analisada pela análise de expressão do gene TaqMan® . As células HEK-293 que expressam miR-708 também mostraram redução da expressão de RNA de CHOP e BiP em comparação com células controle (Fig. 6). Estes resultados sugerem que a redução do nível de mrodopsina P23H desdobrada resulta em uma redução concomitante na expressão de genes UPR BiP e CHOP.

[00148] No experimento inverso, as células HEK-293 que expressam a rodopsina P23H de camundongo (incluindo uma sequência alvo 3' UTR miR-708) ou rodopsina P23H humana (faltando a sequência alvo 3' UTR miR-708) foram transfectadas com anti-miR- 708 pré-miRNA ou controle negativo pré-miRNA (Fig. 7). Neste experimento, anti-miR-708 exógeno foi usado para inibir HEK293 miR- 708 endógeno. Se o miR-708 endógeno regulou a expressão da rodopsina através de uma sequência alvo de miR-708 putativa, então as alterações nos níveis da rodopsina P23H seriam observadas apenas se houvesse uma sequência alvo de miR-708 no 3' UTR do gene da rodopsina. As células foram transfectadas com 100 pmol de cada RNA. Os lisados de células foram gerados e a proteína rodopsina foi quantificada em um Western blot enquanto os níveis de mRNA foram analisados por análise TaqMan® (Fig. 7). A inibição de miR-708 endógeno resultou em um aumento de ambos mRNA e proteínas rodopsina de camundongo (Fig. 7A), enquanto que os níveis de mRNA e da proteína da rodopsina humana permaneceram inalterados (Fig. 7B), apesar de níveis inferiores de miR-708 endógeno. Esses resultados mostram que a regulação da rodopsina por miR-708 requer a sequência alvo de miR-708 na rodopsina 3' UTR.

[00149] Juntos, esses resultados mostram que rodopsina é um alvo funcional de miR-708, e que a modulação da atividade de miR-708 pode ser usada como uma ferramenta de afetar a expressão da rodopsina.

Exemplo 3: Design de um plasmídeo de ITR de AAV expressando miR-708 sob o controle do promotor da rodopsina quinase específica de fotorreceptor

[00150] É pensado que o acúmulo de proteína rodopsina mutante no RE contribui para o estresse do RE subjacente a morte celular fotorreceptora na RP. O exemplo anterior demonstra que a expressão de miR-708 é capaz de regular os níveis globais da rodopsina. Um vetor baseado no virus adeno-associado (AAV) foi construído para expressão específica do miR-708 nas células fotorreceptoras da retina para determinar se baixando os níveis totais da rodopsina (incluindo as formas do tipo selvagem e mutante) pode aliviar o estresse do RE independente da mutação da rodopsina.

[00151] Figura 8 retrata um plasmídeo de repetição terminal invertida (ITR) de AAV concebido para expressar miR-708 especificamente nas células fotorreceptoras da retina. A expressão de miR-708 foi dirigida pelo promotor da rodopsina quinase (pRK), que se expressa especificamente nas células fotorreceptoras do bastonete. Neste vetor, o miR-708 foi expressado a partir da estrutura do miR-155 mostrada na Fig. 4.

[00152] Em seguida, este plasmídeo de ITR do AAV foi validado em células de cultura. As células WERI ou RPE foram transfectadas com o plasmídeo pré-viral descrito na Fig. 8, e os níveis de miR-708 foram quantificados por análise TaqMan®. Figura 9A mostra que as células WERI transfectadas com o plasmídeo de miR-708 dirigido por pRK tinha um aumento de mais de um 2000 vezes nos níveis de miR-708 em comparação com células WERI transfectadas com um plasmídeo expressando miR-embaralhado (controle). Em contraste, células RPE, nas quais o promotor RK não é significativamente expressado, não revelam um aumento significativo nos níveis de miR-708 (Fig. 9A).

[00153] A função do miR-708 na regulação da expressão da rodopsina foi confirmada por co-transfecção do plasmídeo de pRK- miR-708 (ou um plasmídeo de miR-controle) e um plasmídeo com o gene da rodopsina P23H de camundongo abrigando uma sequência alvo 3'miR708 em células WERI. Figura 9B mostra que o mRNA da mrodopsina P23H foi reduzido na presença do miR-708, em comparação com um miR-controle. Esses resultados demonstram que a expressão de miR-708 usando um vetor de ITR do AAV é eficaz na redução da expressão da rodopsina nas células fotorreceptoras.

Exemplo 4: Nocaute da rodopsina nas retinas do camundongo usando um vetor de miR-708 AAV5

[00154] Para testar se um vetor de AAV poderia ser utilizado para reduzir a expressão da rodopsina na retina in vivo, um plasmídeo pRK- miR-708 descrito na Fig. 8 foi embalado em um capsídeo de AAV5 para gerar AAV5-RK miR-708. Além disso, um vetor de AAV5 miR- controle foi gerado. Os camundongos C57BL do tipo selvagem receberam uma injeção subretinal de 1x108 vgs de AAV5-RK miR-708 ou AAV5 miR-controle no olho contralateral. No 1 mês pós-injeção, os camundongos foram sacrificados e a neuro retina foi extraída e congelada instantânea para análise qPCR da expressão gênica.

[00155] Figura 10A mostra que os olhos do camundongo que tinha sido injetado com um vetor de AAV5 expressando miR-708 reduziram a expressão da rodopsina, comparado aos olhos do camundongo injetados com um vetor de AAV5 miR-controle. Em contraste, a expressão de outro gene específico de bastonete, fator de viabilidade do cone derivado do bastonete (RdCVF), não foi afetada (Fig. 10B). Figura 10C confirma que os olhos injetados com o vetor AAV5miR708 mostrou um aumento significativo no número de cópia do miR-708, comparado com olhos que receberam AAV5miR controle. Estes resultados sugerem que os vetores a base de AAV expressando miR- 708 nos fotorreceptores dos bastonetes são eficazes em reduzir a expressão endógena da rodopsina in vivo.

[00156] Para demonstrar a relevância funcional do nocaute da rodopsina, os olhos do camundongo tratado com AAV5 miR-708 ou AAV5 miR-controle foram analisados pelo eletrorretinograma (ERG) para avaliar a função da retina. Os olhos que receberam o vetor AAV5 miR-708 mostrou uma diminuição da resposta escotópica, como esperado se níveis da rodopsina forem reduzidos (Fig. 11A). As respostas ERG escotópicas são uma avaliação da função do bastonete, e esta medição pode ser correlacionada com os níveis da rodopsina. No entanto, a função do cone nos mesmos animais, como avaliada pelo ERG fotópico, foi inalterada depois da aplicaçãode AAV5 miR-708 (Fig. 11B), confirmando que miR-708 teve um efeito biológico nas células fotorreceptoras dos bastonetes poupando as células do cone. Estes dados demonstram que a aplicação de AAV5 miR-708 resulta em um efeito biológico que é restrito à célula alvo do bastonete. Exemplo 5: Construção de um vetor de supressão/substituição da hrodopsina com um cassete de expressão de miR-708 embebido no íntron

[00157] O miR-708 é normalmente expressado in vivo a partir do primeiro íntron do gene ODZ4. Portanto, uma constructo nova foi projetada com base na sequência de miR-708 e sua estrutura endógena/sequência de flanqueamento. A sequência de miR-708 foi incorporada em um íntron sintético e clonada a jusante do promotor específico fotorreceptor da rodopsina quinase (RK), mas a montante do cDNA da hrodopsina. A sequência endógena de miR-708 incluindo sua sequência regulatória de flanqueamento/processamento foram clonadas na sequência de íntorn da β-globina a montante da sequência de cDNA da hrodopsina, mas a jusante do promotor da RK. Como tal, a sequência de miR-708 é 5’ em relação à sequência de codificação da rodopsina.

[00158] A Figura 12 fornece um diagrama deste vetor de supressão /substituição de 5’. A hrodopsina (faltando uma sequência alvo 3' UTR mir708) foi controlada pelo promotor da RK. A sequência endógena de miR-708 incluindo estrutura endógena (por exemplo, incluindo qualquer motivo de reconhecimento Drosha/Dicer) foi incorporada no íntron da β-globina. O cDNA da hrodopsina (sem a sequência alvo de 3' miR-708 UTR) foi incluído a jusante do local de junção de splice. O miR-708 foi embebido com a β-globina, que está localizada a jusante do promotor de RK e, por conseguinte, o miR-708 foi processado após o splicing da sequência intrônica da β-globina. Além disso, o vetor com uma estrutura semelhante abrigando um miR controle foi gerado.

[00159] O vetor descrito na Fig. 12, ou um vetor com um miRNA controle, foi utilizado para transfectar células WERI. Células WERI foram utilizadas porque elas expressam pouco, se qualquer, miR-708 endógeno, e elas são permissivas para o promotor de RK. As células WERI foram co-transfectadas com um cDNA codificando a mrodopsina P23H (com uma sequência 3'UTR miR-708). Ambos o nocaute da rodopsina (níveis de RNA) como os níveis dos genes UPR CHOP e BIP foram examinados em células transfectadas.

[00160] A Figura 13 mostra que as células co-transfectadas com a mrodopsina (P23H) e o vetor miR-708 tinham reduzido os níveis de mrodopsina comparado às células co-transfectadas com mrodopsina e vetor de miRNA controle. Além disso, os genes UPR CHOP e BiP também foram regulados negativamente nas células miR-708 transfectadas comparado ao controle. Estes dados sugerem que o uso da estrutura endógena de miR708 com expressão intrônica de miR708 fornece uma estrutura alternativa que suporta o processamento e a expressão de miR708.

Exemplo 6: Comparação de diferentes estruturas de miR-708

[00161] Níveis mais baixos da expressão de miR-708 podem ser benéficos na redução qualquer efeito potencial fora do alvo do miRNA em um ambiente clínico. Consequentemente, diferentes estruturas de miR foram testadas para força de expressão nas linhagens celulares de retinoblastoma humanas WERI.

[00162] A Figura 14 retrata níveis de miR-708 quantificados em células WERI transfectadas com o miR-708 dirigido para CBA, miR708 dirigido para RK usando a estrutura miR-155 mostrada na Fig. 4, ou o vetor de rodopsina miR-708 embebido no íntron da RK mostrada na Fig. 12. A expressão de miR-708 no sistema intrônico da RK não foi tão robusto quanto o sistema direcionado de CBA. No entanto, a expressão de miR-708 ainda era bem acima do fundo e cerca de 5 vezes menor que pRKmiR708 usando a estrutura de miR-155. Observe que a hrodopsina foi co-expressada a partir dos vetores embebidos de íntron, mas não nos vetores de estrutura do miR-155 de CBA ou RK.

[00163] Em seguida, os níveis de mRNA da hrodopsina foram comparados em células miR-155 que expressam o vetor de supressão/substituição embebido no íntron de miR-708 ou um vetor de miR controle. Figura 15 mostra que as células WERI transfectadas com o vetor de supressão/substituição embebido no íntron de miR-708 tinha um nível semelhante de hrodopsina comparado às células transfectadas com o vetor de controle. Estes resultados indicam que a expressão da hrodopsina do vetor de supressão/substituição, que carece da sequência alvo 3' UTR miR-708, é refratária à inibição pela expressão de miR-708. Ambas as células apresentaram maior expressão da hrodopsina do que as células WERI não-transfectadas.

Exemplo 7: Knockdown da rodopsina mutante pelo vetor de supressão/substituição do miR -708 reduz um marcador de estresse ER

[00164] A capacidade do vetor de supressão/substituição do miR - 708 para reduzir o estresse do RE em células que expressam a rodopsina mutante foi observada. As células WERI que expressam uma rodopsina mutante P23H não-glicosilada (N2K / N15K / P23H ), com ou sem uma sequência alvo 3'UTR miR708, foram transfectadas com o vetor de substituição de supressão descrito na FIG. 12. As células foram colhidas e o RNA extraído para medir X-box se ligando a um splicing da proteína 1 (XBP-1). XBP-1 é um fator de transcrição importante na regulação de genes de estresse do RE. Seu splicing é um marcador conhecido de estresse do RE celular/UPR; as células submetidas a UPR mostram aumento dos níveis de XBP- 1 spliced.

[00165] Como mostrado na Fig. 16, as células que expressam a rodopsina mutante com uma sequência alvo de 3' UTR tinham diminuição de splicing de XBP-1 quando transfectadas com o vetor de supressão/substituição de miR-708. Em contraste, as células que expressam a rodopsina mutante P23H sem a sequência alvo de 3'UTR miR-708 tinham níveis equivalentes de splicing XBP-1 em comparação com células transfectadas com a sequência de miR-controle. Estes resultados demonstram que o nocaute da rodopsina mutante utilizando o vetor de supressão/substituição de miR-708 é eficaz na redução do estresse do RE.

Exemplo 8: Expressão de miR-708 na estrutura do íntron da β- globina colocada na rodopsina 3' UTR aumenta a expressão da rodopsina e miR-708

[00166] A fim de testar se a posição da estrutura de miR-708 afeta a sua expressão, um vetor foi construído em que a sequência de miR- 708 (incluindo as suas sequências reguladoras que flanqueiam/ processamento) foi clonada na sequência do íntron da β -globina a jusante do cDNA da rodopsina, ou seja, dentro da 3' UTR. A Figura 17 mostra um diagrama de este vetor de substituição/supressão ‘3, que é semelhante ao mostrado na FIG. 12, exceto que a estrutura do íntron da β-globina humana do miR-708 é o 3' UTR do cDNA da rodopsina, em vez da 5' UTR.

[00167] Para determinar se a posição da estrutura do íntron da β- globina humana do miR-708 no vetor afeta a expressão de miR-708 ou hrodopsina a partir do vetor, as células WERI foram transfectadas com vetor 5' UTR da Fig. 12 ou o vetor 3' UTR da FIG. 17. A Figura 18 mostra a expressão da hrodopsina e miR-708 nestas células. O vetor com a estrutura de miR-708 na 3 'UTR foi encontrado para produzir níveis mais elevados de RNA da hrodopsins e miR-708 do que o vetor utilizando a configuração de 5' UTR.

Exemplo 9: Avaliação do vetor de supressão/substituição em um modelo de camundongo da P23H de degeneração da retina

[00168] Os constructos de supressão/substituição estão avaliados em um modelo de camundongo P23H de degeneração da retina. Neste modelo, a proteína mutante P23H expressada em células fotorreceptoras do bastonete induz o estresse do RE / RPU, causando apoptose e morte celular final dos bastonetes (Lee, E. S., et al. (2007) FEBS Lett 581 (22): 4325-32). Após a morte celular dos bastonetes há uma morte celular não-autônoma de células do cone.

[00169] O camundongo P23H é tratado com um vetor de AAV de supressão/substituição expressando o miR-708 e um gene da rodopsina humana refratário para nocaute por miR708 (devido à falta de uma sequência alvo de miR-708). Os resultados do vetor de supressão/ substituição em nocaute de ambas rodopsinas P23H do TS e P23H, mas o gene de substituição da rodopsina compensa para a redução nos níveis de TS da rodopsina. Portanto, o vetor fornece a rodopsina de bastonete necessária para manter a função celular e a integridade do bastonete.

[00170] Um design de constructo de supressão/substituição alternativo também é testado. Como mostrado na Fig. 19, este vetor alternativo dirige a expressão de miR-708 a partir do promotor de RK e co-expressa a hrodopsina (refratária ao nocaute do miR-708), utilizando o promotor da opsina do camundongo.

[00171] Estes vetores de supressão/substituição também são testados tal como descrito acima, em um modelo de camundongo P23H em que o gene da mrodopsina endógena abriga um alelo de única cópia de perda de função (por exemplo, o rato é heterozigótico em relação a um alelo de nocaute da mrodopsina). Este modelo de camundongo heterozigoto pode ser construído utilizando técnicas de genética do camundongo padrão a partir de um camundongo mRho-/- e o modelo P23H descrito acima. Sem se pretender ficar limitado pela teoria, pensa-se que este modelo de camundongo P23H mRho+/-, que contém uma cópia do alelo da hrodopsina P23H mutante e uma cópia do gene do camundongo do tipo selvagem, pode assemelhar-se a um genótipo ADRP humano no qual os pacientes têm cópias iguais dos alelos da rodopsina mutante e de tipo selvagem.

Exemplo 10: Avaliação dos vetores de supressão/substituição adicionais

[00172] Vários vetores foram clonados que expressam tanto o miR- 708 (ou uma sequência de miRNA controle) e hrodopsina a partir de um único vetor. Os vetores diferem uns dos outros em que as sequências que flanqueiam a sequência de miRNA são derivadas a partir de qualquer miR-155 (adquiridas do sistema "Block-it" de Invitrogen) ou sequências flanqueadora endógena miR-708 5’ e 3'. As sequências de miRNA são incorporadas no íntron da hβ-globina a jusante do promotor da rodopsina quinase e a montante da ORF hrodopsina. O objetivo foi testar se a expressão e o processamento de miRNA são semelhantes a partir de cada constructo. Um par adicional de vetores continha as sequências de miRNA (controle ou miR-708) a jusante da ORF hrodopsina, também incorporado no íntron da β- globina. Apenas os vetores contendo as sequências flanqueadoras endógenas do miR-708 5 'e 3', localizadas a jusante da ORF hrodopsina foram testadas nesta experiência, tanto as sequências flanqueadoras endógenas miR-708 e miR-155 foram testadas nos vetores, onde o íntron da β-globina está localizado a montante da ORF hrodopsina. As células WERI foram transfectadas com cada constructo e ambas a expressão de miR-708 como a expressão da hrodopsina foram determinadas.

[00173] Os resultados na Fig. 20 indicam que as sequências flanqueadoras de miR-155 geraram uma melhor expressão (ou processamento de miRNA) de miR-708 em comparação com as sequências flanqueadoras de miR-708 endógenas. A expressão de miR-708 era cerca de 10 vezes mais elevada nas células transfectadas com vetores contendo as sequências flanqueadoras de miR-155 em comparação com as sequências flanqueadoras de miR- 708. Os vetores contendo sequências flanqueadoras de miR-708 tiveram uma menor expressão de miR-708, independentemente de as sequências serem a montante ou a jusante em relação a hrodopsina ORF. A expressão da hrodopsina não foi afetada pela sobre- expressão de miR-708, como os seus níveis de expressão são aproximadamente iguais, independentemente da sequência de miRNA co-expressada no vetor. A expressão de miR-708 não foi detectada em vetores contendo sequências de miRNA de controle, como esperado.

Exemplo 11: Avaliação de vetores de supressão/substituição adicionais com uma sequência alvo de miR-708 modificada

[00174] Como descrito acima, uma sequência consenso correspondente a um local alvo putativo de miR-708 foi encontrada na UTR 3' de vários genes da rodopsina de mamífero (Behrman, S., et al. (2011) J. Cell Biol. 192 (6): 919-27). Este Exemplo demonstra que uma rodopsina com uma sequência alvo de miR-708 modificada pode ser utilizada em um vetor de supressão/substituição.

[00175] Um vetor de rAAV é construído compreendendo ácido nucleico que codifica o miR-708 e um gene da rodopsina humana. O gene da rodopsina humana é modificado na sequência alvo de miR- 708 (SEQ ID NO: 19) por substituição, deleção ou inserção de nucleotídeos para reduzir ou impedir o reconhecimento por miR-708. Em alguns exemplos, toda a sequência alvo de miR-708 é deletada. Em alguns exemplos, a redução ou a prevenção de miR-708 é medida em referência ao reconhecimento de miR-708 de uma rodopsina de tipo selvagem 3'UTR que compreende a sequência alvo de miR-708.

[00176] Para testar para a supressão da rodopsina autossômica dominante por miR-708 com a expressão concomitante da rodopsina do tipo selvagem, células HEK-293 que expressam um gene mutante da mrodopsina P23H que codifica uma sequência alvo 3'UTR miR-708 são transfectadas com um plasmídeo que expressa miR-708 e rodopsina humana com (CBA-miR-708-hRho-3'UTR-) ou sem (CBA- miR-708-hRho-3'UTR+) uma sequência alvo de miR-708 modificada. Um miR-controle, como descrito no Exemplo 2 também é utilizado. Após 72 horas, as células são recolhidas, e a expressão da rodopsina mP23H e da proteína rodopsina humana são analisadas utilizando um Western blot. Redução da expressão da proteína mrodopsina P23H em células transfectadas com o CBA-miR-708-hRho-3'UTR- ou CBA- miR-708-hRho-3'UTR+ em comparação com células transfectadas com um vetor de CBA-miR-controle indica a atividade de miR- 708. A expressão da rodopsina humana em células transfectadas com CBA- miR-708-hRho-3'UTR- mas não com CBA-miR-708-hRho-3'UTR+ indica que a rodopsina codificada pela CBA-miR-708-hRho-3'UTR- é refratária à supressão por miR-708.

Exemplo 12: Supressão mediada por AAV da rodopsina endógena e expressão da rodopsina humana na retina do camundongo

[00177] Com base nas experiências descritas acima, foram realizadas experiências adicionais para testar a estratégia de supressão/ substituição da rodopsina em um olho intacto. Este exemplo demonstra a eficácia de um vetor de AAV de supressão/ substituição construído usando uma estrutura de miR-708 na retina do camundongo.

[00178] Uma cápside de AAV5 com um vetor abrigando o promotor da opsina específico de bastonetes, a estrutura de miR-708 (por exemplo, as sequências endógenas de estrutura/flanquamento de miR-708) e um gene de substituição da rodopsina humana foi construído. Em uma versão deste vetor, a sequência de miR-708 (por exemplo, a sequência de miR-708 que se liga à sequência alvo de miR-708) foi inserida para dirigir a expressão de miR-708 no contexto da estrutura de miR708 e do gene de substituição da rodopsina humana (AAV5OPSmiR708708hRHO). Numa outra versão deste vetor, um vetor de controle foi gerado que abrigava uma sequência de controle de miR (AAV5OPSmiRcontrol708hRHO). Em ambos os vetores, a substituição do gene da rodopsina humana era refratária ao nocaute de miR-708 porque carece de uma sequência alvo de miR- 708. Ambos os vetores foram injetados subretinalmente nas retinas dos camundongos de tipo selvagem. Para cada camundongo, o olho naive contralateral foi não injetado, e a expressão em cada retina injetada foi normalizada, tal como a expressão de dobramento em comparação com a retina contralateral não injetada. Três semanas após a injeção, as retinas foram colhidas e analisadas para os níveis de miR-708 (FIG. 21A), níveis de mRNA da rodopsina de camundongo (FIG. 21B) e rodopsina humana (FIG. 21C).

[00179] A Figura 21A mostra um aumento em níveis de miR-708 na retina do camundongo depois da injeção com o vetor AAV5OPSmiR708708hRHO, em comparação com o olho contralateral naive. Uma redução significativa da rodopsina do camundongo foi medida no olho que recebeu AAV5OPSmiR708708hRHO, e nenhuma redução na rodopsina do camundongo foi medida em olhos que receberam o vetor de controle, AAV5OPSmiRcontrol708hRHO (FIG. 21B). Além disso, os níveis de rodopsina humana foram aumentados até 100 vezes por ambos os vetores, em comparação com o olho naive contralateral não injetado (FIG. 21C). Estes dados demonstram que o vetor AAV5OPSmiR708708hRHO foi eficaz in vivo.

[00180] Em resumo, o vetor de supressão/ substituição optimizado AAV5OPSmiR708708hRHO alcançou nocaute da rodopsina de camundongo por miR-708 (rodopsina endógena de camundongo tem uma sequência alvo 3'UTR) com expressão concomitante da rodopsina humana de substituição, que foi refratária ao nocaute de miR708 (o gene de substituição da rodopsina humana carece de uma sequência alvo de miR708 3'UTR). Estes resultados mostram a eficácia da estratégia de supressão/ substituição no olho do mamífero intacto.

Exemplo 13: Validação de vetores candidatos em células humanas

[00181] Os vetores baseados em AAV5 candidato foram em seguida ensaiados para a capacidade de promover a expressão de miR-708 e da rodopsina humana em células humanas (HeLa).

[00182] Dois promotores diferentes foram testados: rodopsina quinase (GRK1) e o promotor da opsina. O promotor da rodopsina quinase é descrito acima. O promotor da opsina (mostrado na SEQ ID NO: 22) contém um fragmento 676bp codificando um potenciador de CMV 400 pb a montante da sequência do promotor da opsina (-500bp - + 15 bp). Além disso, uma sequência NRL 65bp é incluída; esta codifica um fator de zíper básico da retina neural (um fator de transcrição específico fotorreceptor de bastonetes). A jusante da constructo do promotor está uma sequência de íntron híbrida de CBA exon1 e vírus minuto de camundongo (MVM) - chamado sequência de íntron de MVM (mostrado na SEQ ID NO: 23). Um diagrama desta constructo do promotor é ilustrado na Fig. 22.

[00183] Foram utilizadas duas estruturas diferentes: a estrutura miR-155 ou estrutura miR-708. Ambas foram embebidas em um íntron da beta globina. No total, 4 vetores candidatos foram testados: AAV5GRK1miR708_155hRho (vetor de AAV5 com promotor da rodopsina quinase dirigindo a expressão de miR-708 em uma estrutura miR-155 e a rodopsina humana menos a sequência alvo de miR-708; SEQ ID NO:24), AAV5GRK1miR708_708hRho (vetor de AAV5 com promotor da rodopsina quinase dirigindo a expressão de miR-708 em uma estrutura miR-708 e a rodopsina humana menos a sequência alvo de miR-708; SEQ ID NO:25), AAV5OPSmiR708_155hRho (vetor de AAV5 com promotor da opsina dirigindo a expressão de miR-708 em uma estrutura miR-155 e a rodopsina humana menos a sequência alvo de miR-708; SEQ ID NO:26), e AAV5OPSmiR708_708hRho (vetor de AAV5 com promotor da opsina dirigindo a expressão de miR-708 em uma estrutura miR-155 e a rodopsina humana menos a sequência alvo de miR-708; SEQ ID NO:27). Figura 23A mostra a sequência de miR- 708 embebida no íntron da beta-globina. As estruturas de miR-708 e miR-155 são mostradas nas Figuras 23B e 23C, respectivamente.

[00184] Cada um dos 4 vetores de AAV5 candidatos foi usado para infectar células HeLa (usando o vírus ajudante AdTs149), e níveis de miR-708 e hrodopsina foram medidos. Como mostrado na Fig. 24, todos os quatro vetores resultaram em expressão de miR-708 e da hrodopsina em células humanas in vivo, como comparado aos vetores de dirigindo a expressão de um miR controle a partir do promotor da opsina ou da rodopsina quinase (Ops miR-Cont e RK miR-Cont, respectivamente). Estes resultados demonstram a validação bem- sucedida de vários vetores que podem ser usados para estratégias de supressão/substituição (como as descritas acima) em células humanas.LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS sequência de nucleotídeos miR-708

Claims (33)

1. Partícula de rAAV, caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico que codifica um miR-708, ou que compreende um ácido nucleico que codifica um miR-708 e um ácido nucleico que codifica uma rodopsina, em que o ácido nucleico que codifica o miR-708 compreende o ácido nucleico da SEQ ID NO: 1 e em que a rodopsina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

2. Partícula de rAAV, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a partícula de rAAV compreende um ácido nucleico que codifica um miR-708 compreendendo o ácido nucleico da SEQ ID NO: 1 e um ácido nucleico que codifica uma rodopsina, em que a rodopsina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

3. Partícula de rAAV, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o miR-708 e/ou o ácido nucleico que codifica a rodopsina está operacionalmente ligado a um promotor.

4. Partícula rAAV, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o promotor expressa o miR-708 e/ou a rodopsina nas células fotorreceptoras.

5. Partícula rAAV, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que o promotor compreende um promotor RK, um promotor de opsina ou um promotor CBA.

6. Partícula de rAAV, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que (i) o ácido nucleico que codifica o miR- 708 e o ácido nucleico que codifica a rodopsina estão operacionalmente ligados a um promotor RK ou promotor de opsina; ou (ii) o ácido nucleico que codifica o miR-708 está operacionalmente ligado a um primeiro promotor RK ou a um primeiro promotor de opsina e o ácido nucleico que codifica a rodopsina está operacionalmente ligado a um segundo promotor RK ou a um segundo promotor de opsina.

7. Partícula de rAAV, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o miR-708 está 5' em relação ao ácido nucleico que codifica a rodopsina ou que o ácido nucleico que codifica o miR-708 está 3' em relação ao ácido nucleico que codifica a rodopsina.

8. Partícula de rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o miR-708 está incorporado em um íntron.

9. Partícula de rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o miR-708 compreende um arcabouço de miR-708 endógeno ou um arcabouço de miR-155.

10. Partícula de rAAV, de acordo qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica a rodopsina compreende uma substituição, inserção ou deleção de ácido nucleico na sequência alvo de miR-708 ou carece da sequência alvo 3' UTR de miR-708, em que a substituição, inserção ou deleção reduz ou impede o reconhecimento pelo miR-708.

11. Partícula de rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica a rodopsina compreende um ácido nucleico da SEQ ID NO: 3.

12. Partícula rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica a rodopsina não possui o sítio alvo de miR-708 na 3' UTR do gene da rodopsina, em que o sítio alvo de miR-708 tem a SEQ ID NO: 19.

13. Partícula rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica a rodopsina compreende uma mutação no sítio alvo de miR-708 da rodopsina, em que o sítio alvo de miR-708 tem a SEQ ID NO:19.

14. Partícula de rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizada pelo fato de que a partícula de rAAV compreende um genoma viral recombinante compreendendo um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 27.

15. Partícula de rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que a partícula de rAAV compreende AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV5 mutante de tirosina, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV de cabra, AAV1/AAV2 quimérico, AAV de bovino, ou capsídeo AAV de camundongo do capsídeo do sorotipo rAAV2/HBoV1; e em que o vetor rAAV compreende AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV de cabra, AAV de bovino, ou repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV de sorotipo de camundongo.

16. Partícula rAAV, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que compreende um capsídeo AAV-5 ou um capsídeo AAV-5 mutante de tirosina, e em que o vetor compreende AAV2 ITRs.

17. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a partícula de rAAV, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

18. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma primeira partícula de rAAV compreendendo um primeiro ácido nucleico que codifica um miR-708 compreendendo o ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 e uma segunda partícula de rAAV compreendendo um segundo ácido nucleico que codifica rodopsina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o segundo ácido nucleico que codifica a rodopsina compreende um ácido nucleico de SEQ ID NO: 3.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o segundo ácido nucleico que codifica a rodopsina não possui o sítio alvo de miR-708 na 3' UTR do gene da rodopsina, em que o sítio alvo de miR-708 tem a SEQ ID NO:19.

21. Composição, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o segundo ácido nucleico que codifica a rodopsina compreende uma mutação no sítio alvo do miR-708 da rodopsina, em que o sítio alvo do miR-708 tem a SEQ ID NO:19.

22. Composição, de acordo com quaçquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizada pelo fato de que o primeiro ácido nucleico que codifica miR-708 compreende um arcabouço de miR-708 endógeno ou um arcabouço de miR-155.

23. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizada pelo fato de que o primeiro ácido nucleico que codifica miR-708 e/ou o segundo ácido nucleico que codifica rodopsina está operacionalmente ligado a um promotor, opcionalmente em que o promotor expressa o miR-708 e/ou rodopsina em células fotorreceptoras e, opcionalmente em que o promotor compreende um promotor de rodopsina quinase (RK), um promotor de opsina ou um promotor de β-actina de galinha (CBA).

24. Composição, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que uma sequência derivada de um íntron de vírus minuto de camundongo (MVM) está localizada a 3' do promotor, em que opcionalmente o íntron de MMV compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 23.

25. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 24, caracterizada pelo fato de que o segundo ácido nucleico que codifica a rodopsina compreende uma substituição, inserção ou deleção de ácido nucleico na sequência alvo de miR-708 ou carece da sequência alvo 3' UTR de miR-708, em que a substituição, inserção ou deleção reduz ou evita o reconhecimento pelo miR-708.

26. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 25, caracterizada pelo fato de que a primeira partícula de rAAV e/ou a segunda partícula de rAAV compreende um capsídeo AAV-5 ou um capsídeo mutante de tirosina AAV-5, e em que a primeira partícula de rAAV e/ou a segunda partícula de rAAV compreende AAV2 ITRs.

27. Uso da partícula rAAV, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 17 a 26, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para o tratamento de retinite pigmentosa em um mamífero, em que a retinite pigmentosa está associada a uma mutação no gene da rodopsina endógena no mamífero.

28. Uso da partícula rAAV, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 17 a 26, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para o tratamento do estresse do retículo endoplasmático (ER) em uma célula de um mamífero, em que o estresse do ER está associado a uma mutação no gene da rodopsina endógena no mamífero.

29. Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula ocular ou uma célula fotorreceptora, opcionalmente uma célula fotorreceptora bastonete.

30. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizado pelo fato de que a partícula rAAV é formulada para injeção no espaço sub-retiniano da retina do mamífero em um ou mais locais.

31. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado pelo fato de que a partícula rAAV é formulada para injeção intravítrea no mamífero.

32. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 e 29 a 31, caracterizado pelo fato de que a retinite pigmentosa é retinite pigmentosa autossômica dominante ou retinite pigmentosa autossômica recessiva.

33. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 32, caracterizado pelo fato de que a partícula de rAAV que codifica o miR-708 e uma segunda partícula de rAAV que codifica rodopsina são para ser administradas ao mamífero ao mesmo tempo ou a partícula de rAAV que codifica o miR-708 e a partícula de rAAV que codifica a rodopsina são para ser administradas ao mamífero sequencialmente.