JP2014510537A - 神経分化のための多能性幹細胞の予備刺激 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2011年3月30日に出願された米国特許出願第61/469,527号の優先権を主張し、その開示全体が、放棄することなくその全体において参照により本明細書に明確に援用される。
多様な異なる方法および組成物が、本明細書において説明される。ある特定の実施形態は、幹細胞分化過程を向上させる、いくつかの重要な利点に関する。多能性幹細胞の神経分化能は、分化前の幹細胞の培養環境により影響され得ることが発見されている。いくつかの実施形態において、方法は、特に神経分化能を低減する増殖因子の不在下で予備刺激培地を使用することにより、多能性幹細胞の分化からの神経細胞の均一性および収率を増加させるために開発され得る。
II.多能性幹細胞の源
A.胚幹細胞
B.誘導多能性幹細胞
C.体細胞核移植に由来する胚幹細胞
III.多能性幹細胞の予備刺激および分化条件
A.予備刺激および分化のための培地
B.培養条件
C.多能性幹細胞の培養
D.ROCK阻害剤およびミオシンII阻害剤
E.単一細胞の継代
F.幹細胞の分化
IV.シグナル伝達阻害剤
V.非静的培養
VI.ニューロン系統の特性化
VII.細胞の遺伝子変化
VIII.神経細胞または神経細胞型の使用
以下の実施例は、本発明の好適な実施形態を実証するために含まれる。当業者であれば、以下の実施例に開示される技法が、本発明の実践において良好に機能することが本発明者により発見された技法を表し、したがって、その実践の好適な様式を構成すると考慮され得る。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、それでもなお同様または類似の結果を得ることができることを理解する。
(実施例1)
分化前のiPS細胞の予備刺激は優れた神経誘導をもたらす
(実施例2)
DMEM−F12およびN2サプリメントを用いた予備刺激による神経誘導は、bFGFおよびTGFβの除去に起因する
(実施例3)
ニューロン生成手順
(実施例4)
多能性幹細胞株およびクローン変動性
(実施例5)
星状細胞生成手順
***
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載されるものに補足的な例示的手順のまたは他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に明確に援用される。
米国特許第5,843,780号
米国特許第6,200,806号
米国特許第6,833,269号
米国特許第7,029,913号
米国特許出願第2008/0171385号
米国特許出願第61/058,858号
米国特許出願第61/172,079号
米国特許出願第61/184,546号
米国特許公開第2002/0168766号
米国特許公開第2003/0022367号
米国特許公開第2003/0211603号
米国特許公開第20030087919号
米国特許公開第20030125344号
米国特許公開第20040002507号
米国特許公開第20040002508号
米国特許公開第20040014755号
米国特許公開第20050192304号
米国特許公開第20050209261号
米国特許公開第2007/0116680号
米国特許公開第2007/0238170号
米国特許公開第2008/0171385号
米国特許公開第2011/0229441号
国際出願PCT/US2010/024487
国際出願PCT/US2011/046796
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国際公開第2005/123902号)。
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例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
神経細胞を生成するための方法であって、
a)外部から添加された形質転換増殖因子β(TGFβ)および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を本質的に含まない無血清培養培地内で、凝集体形成前に多能性幹細胞の集団を培養することと、
b)懸濁培養液中でステップa)の上記細胞から凝集体を形成することと、
c)上記凝集体を、神経細胞を含む細胞集団にさらに分化し、それにより神経細胞を生成することと、
を含む、方法。
(項目2)
上記多能性幹細胞が、誘導多能性幹(iPS)細胞である、項目1に記載の方法。
(項目3)
ステップa)の上記多能性幹細胞が、非細胞マトリックス成分上で培養される、項目1に記載の方法。
(項目4)
a)培養するステップ、b)凝集体を形成するステップ、および/またはc)さらなる分化のステップの最初の最大約1日、2日、3日、4日、または5日における上記培養培地が、外部から添加されたTGFβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および/またはFGF8を有する、項目1に記載の方法。
(項目5)
上記外部から添加されたTGFβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および/またはFGF8が、神経細胞への上記集団の分化に適切であると決定された量である、項目4に記載の方法。
(項目6)
上記神経分化効率を試験して、上記外部から添加されたTGFβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および/またはFGF8の上記適切な量を、上記集団からの細胞の最高神経分化効率と関連付けられた量として決定することをさらに含む、項目4に記載の方法。
(項目7)
a)培養するステップ、b)凝集体を形成するステップ、および/またはc)さらなる分化のステップにおける上記培養培地は、外部から添加されたTGFβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および/またはFGF8を有しない、項目1に記載の方法。
(項目8)
TGFβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤が、BMPシグナル伝達阻害剤および/またはアクチビン/ノーダル/TGFβ/GDFシグナル伝達阻害剤である、項目4〜7のいずれかに記載の方法。
(項目9)
ステップa)の上記培養培地が、化学的に定義される、項目1に記載の方法。
(項目10)
ステップa)の上記培養培地が、栄養混合物F−12を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM/F12)、B−27サプリメントを含むDMEM−F12培地、N2サプリメントを含むDMEM−F12培地、またはインスリン、トランスフェリン、およびセレニウム(ITS)サプリメントを含むDMEM−F12培地である、項目9に記載の方法。
(項目11)
ステップa)の上記培養は、凝集体形成前の約1日〜約5日の期間の間である、項目1に記載の方法。
(項目12)
凝集体を形成することが、ステップa)からの上記細胞を本質的に単一の細胞培養物に解離させることを含む、項目1に記載の方法。
(項目13)
上記凝集体が、外部から添加されたTGFβおよびbFGFを本質的に含まない凝集体形成培地内で形成される、項目1に記載の方法。
(項目14)
上記形成された凝集体が、平均寸法約10〜400μmの直径を有する、項目1に記載の方法。
(項目15)
上記凝集体が、外部から添加されたミオシンII阻害剤および/またはRho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤を含む、凝集体形成培地において形成される、項目1に記載の方法。
(項目16)
上記懸濁培養液が、約5ミリリットル〜約25リットルの体積を有する、項目1に記載の方法。
(項目17)
上記懸濁培養が、約15rpm〜約100rpmの速度で回転または振とうされる、項目1に記載の方法。
(項目18)
上記細胞集団が、神経細胞を少なくとも約90%含む、項目1に記載の方法。
(項目19)
上記細胞集団が、神経細胞を少なくとも約95%含む、項目18に記載の方法。
(項目20)
神経細胞を富化または単離することをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目21)
神経細胞を含む上記集団を、星状細胞を含む第2の集団にさらに分化することを含む、項目1に記載の方法。
(項目22)
神経細胞を含む上記集団が、星状細胞にさらに分化するために血清と接触させられる、項目21に記載の方法。
(項目23)
a)培養するステップ、b)凝集体を形成するステップ、およびc)さらなる分化のステップにおける上記培養培地が、外部から添加されたTGFβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および/またはFGF8を有しない、項目22に記載の方法。
(項目24)
上記第2の細胞集団が、分化の90日目前の時点で星状細胞を少なくとも約90%含む、項目21に記載の方法。
(項目25)
上記第2の細胞集団が、分化の50日目前の時点で星状細胞を少なくとも約90%含む、項目21に記載の方法。
(項目26)
星状細胞を富化または単離することをさらに含む、項目21に記載の方法。
(項目27)
神経疾患を有する対象を治療するための方法であって、治療上有効な量の項目1〜20のいずれかに記載の方法により調製される上記神経細胞または項目21〜26のいずれかに記載の方法により調製される星状細胞を上記対象に投与することを含む、方法。
Claims (27)
- 神経細胞を生成するための方法であって、
a)外部から添加された形質転換増殖因子β(TGFβ)および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を本質的に含まない無血清培養培地内で、凝集体形成前に多能性幹細胞の集団を培養することと、
b)懸濁培養液中でステップa)の前記細胞から凝集体を形成することと、
c)前記凝集体を、神経細胞を含む細胞集団にさらに分化し、それにより神経細胞を生成することと、
を含む、方法。 - 前記多能性幹細胞が、誘導多能性幹(iPS)細胞である、請求項1に記載の方法。
- ステップa)の前記多能性幹細胞が、非細胞マトリックス成分上で培養される、請求項1に記載の方法。
- a)培養するステップ、b)凝集体を形成するステップ、および/またはc)さらなる分化のステップの最初の最大約1日、2日、3日、4日、または5日における前記培養培地が、外部から添加されたTGFβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および/またはFGF8を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記外部から添加されたTGFβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および/またはFGF8が、神経細胞への前記集団の分化に適切であると決定された量である、請求項4に記載の方法。
- 前記神経分化効率を試験して、前記外部から添加されたTGFβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および/またはFGF8の前記適切な量を、前記集団からの細胞の最高神経分化効率と関連付けられた量として決定することをさらに含む、請求項4に記載の方法。
- a)培養するステップ、b)凝集体を形成するステップ、および/またはc)さらなる分化のステップにおける前記培養培地は、外部から添加されたTGFβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および/またはFGF8を有しない、請求項1に記載の方法。
- TGFβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤が、BMPシグナル伝達阻害剤および/またはアクチビン/ノーダル/TGFβ/GDFシグナル伝達阻害剤である、請求項4〜7のいずれかに記載の方法。
- ステップa)の前記培養培地が、化学的に定義される、請求項1に記載の方法。
- ステップa)の前記培養培地が、栄養混合物F−12を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM/F12)、B−27サプリメントを含むDMEM−F12培地、N2サプリメントを含むDMEM−F12培地、またはインスリン、トランスフェリン、およびセレニウム(ITS)サプリメントを含むDMEM−F12培地である、請求項9に記載の方法。
- ステップa)の前記培養は、凝集体形成前の約1日〜約5日の期間の間である、請求項1に記載の方法。
- 凝集体を形成することが、ステップa)からの前記細胞を本質的に単一の細胞培養物に解離させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記凝集体が、外部から添加されたTGFβおよびbFGFを本質的に含まない凝集体形成培地内で形成される、請求項1に記載の方法。
- 前記形成された凝集体が、平均寸法約10〜400μmの直径を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記凝集体が、外部から添加されたミオシンII阻害剤および/またはRho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤を含む、凝集体形成培地において形成される、請求項1に記載の方法。
- 前記懸濁培養液が、約5ミリリットル〜約25リットルの体積を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記懸濁培養が、約15rpm〜約100rpmの速度で回転または振とうされる、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞集団が、神経細胞を少なくとも約90%含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞集団が、神経細胞を少なくとも約95%含む、請求項18に記載の方法。
- 神経細胞を富化または単離することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 神経細胞を含む前記集団を、星状細胞を含む第2の集団にさらに分化することを含む、請求項1に記載の方法。
- 神経細胞を含む前記集団が、星状細胞にさらに分化するために血清と接触させられる、請求項21に記載の方法。
- a)培養するステップ、b)凝集体を形成するステップ、およびc)さらなる分化のステップにおける前記培養培地が、外部から添加されたTGFβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および/またはFGF8を有しない、請求項22に記載の方法。
- 前記第2の細胞集団が、分化の90日目前の時点で星状細胞を少なくとも約90%含む、請求項21に記載の方法。
- 前記第2の細胞集団が、分化の50日目前の時点で星状細胞を少なくとも約90%含む、請求項21に記載の方法。
- 星状細胞を富化または単離することをさらに含む、請求項21に記載の方法。
- 神経疾患を有する対象を治療するための方法であって、治療上有効な量の請求項1〜20のいずれかに記載の方法により調製される前記神経細胞または請求項21〜26のいずれかに記載の方法により調製される星状細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
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