JPH02501535A - グリア瘢痕形成減少および軸索成長促進方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 グリア廠痕形成減少および軸索成長促進方法技術分野 本発明は、“活性”未熟アストロサイト、および関連血管および軸索成長および ／または再生を促進するとともに、脳およびを髄の障害における第２の壊死およ びグリア搬痕形成減少手段としての注入可能なまたはニトロセルロースポリマー 上で活性未熟アストロサイトを利用する方法に関する。同一物からなる活性未熟 アストロサイトおよび薬剤組成物は、何らかの方法で神経組成を損傷した出来事 または病気から生ずる神経系異常を処置するために使用される。

中枢神経系において、主要非神経細胞はダリア細胞型である。これらは、ある部 分から他への神経系の数および形態が変化するが、二つの基本的なりラスは、そ れらの大きさ及び胚起源、即ち神経板から誘導される相対的に大きな細胞である マクロダリア、および神経系を囲む中枢葉組織からステムする微小ミクロダリア によって区別し得る。

ミクロダリアは、二つの細胞型、アストロサイト（アストロダリア細胞ａｓｔｒ ｏｅｙｔｅ、ａｓｔｒｏｇｌｉａ）とオリゴデンドロサイト（オリゴデンドロダ リア細胞）からなる。本発明は、前者、即ちアストロサイト細胞の未熟活性状態 において第２細胞死およびグリア廠痕形成の両方を減少させ、そして軸索再生お よび血管成長を促進させる使用用途に関する。

アストロサイトは、分技樹状突起延長物を有する小細胞体（核は、ヒトでは直径 約８１１Ｉ１１である）である。アストロサイト細胞質突起、ニューロンと軸索 を部分的に巻き込み、かつ分離する微小葉状延長物を運搬し、しばしば血管、上 衣および中枢神経系軟膜表面上の板用延長物で終了する。

アストロサイトの機能は多い。それらは、神経系の支持成分として物理的に作用 する。ミクロフィラメント、微小細管、そして表面接触域は、作業のためにそれ らを合わせる。同様に、外来物質または細胞破片（ｃｅｌｌ　ｄｅｂｒｉｓ）を 貧食することによって防御的に作用する。それらはマクロファージに対する抗原 提供細胞として機能し、グリア癲痕組織を形成または変性ニューロンによって残 されるギャップを充填することによって修復を制限する手段を提供し得る。

加えて、それらは、ニューロンのバイオ化学環境の調節に必須の物質代謝機能を 有し、栄養分を提供し、かつ酸塩基レベルを調節する。

その上、アストロサイトは、未熟および成熟動物に分離可能であり、有基分裂後 、成熟状態に依存する一連の構造上の形質転換を通る。老弱動物の脳傷害域にお いて、それらは増殖（ｇｌｉｏｓｉｓ）　して神経支持体を産生ずる。成人動物 の中枢神経系（ＣＮＳ）に対する浸透傷害において、過酷な組織傷害と第２壊死 が創傷周辺域に生ずる。傷害によって生じた変性効果は、傷害部位に隣接する生 存ダリア細胞において応答を発生すると信じられている［ライアー等（ＲＲｅｇ ｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｎｅｒｖｏｕｓ　Ｓｙｓ ｔｅｍ、　５ｐｉｎａｌＣｏｒｄ　Ｒｅｅｏｎｓｔｒｕｅｔｉｏｎ、Ｒａｖｅｎ 　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、ｐｐ、１６３−１９５．１９８３）］、アストロサイト 応答は、若干の有形分裂の増加、大きさの増加（肥大）および中間体フィラメン トの定量的共存性からなる［マセウソン等（Ｍａｔｈｅｗｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ 、、　０ｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ　Ｒｅ５ ｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ａ　ＣｅｒｅｂｒａｌＳｔａｂ　Ｗｏｕｎｄ　ｉｎ　Ａｄｕ ｌｔ　Ｒａｔｓ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、、　３２７：６１−６９．１９８５） ］、単核細胞を侵略するとともに、アストロサイトは貧食細胞として作用して損 傷キャビティー内のデブリス（ｄｅｂｒｉｓ）を清掃する［シェルパー等（Ｓｃ ｈｅｌｐｅｒ、ｅｔ　ａｔ、、　Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ　ＢｅｃｏｍｅＭａｃｒｏ ｐｈａｇｅｓ：Ｔｈｅｙ　ｄｏ　ｎｏｔ　ｂｅｃｏｍｅ　Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ： 　Ａ　Ｌｊｇｈｔａｎｄ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ　Ａｕｔ ｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｆｃ　５ｔｕｄｙ　Ｌｌｓｉｎｇ　１２５−１ｏｄｏｄ ｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅＪ、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ、、　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒ、Ｎ ｅｕｒｏｌ、、４５：１−１９．１９８６）コ、損傷が脳のプリアル（Ｐｌｉａ ｌ）ライニングを破壊すると、線維芽細胞は損傷キャビティーおよびアストロサ イト表面上の基底形態の多重層に移動する［バーンスタイン等（Ｂｅｒｎｓｔｅ ｉｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ　５ｅｃｒｅｔＢａｓａｌ　Ｌ ａｍ１ｎａ　ａｆｔｅｒ　Ｈｅｍ１ｓｅｃｔｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒａｔ　５ｐ ｉｎａｌ　Ｃｏｒｄ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、、　３２７：１３５−１４１．１ ９８５）］、線線維芽胞は、同様に、コラーゲンを産生じ、該コラーゲンは、損 傷後数週間で、包囲細胞外空間内に濃密な束を形成する。このように、成人にお いて、アストロサイトは、他の細胞要素とともに、損傷域内の死亡または瀕死の 細胞によって除去された空間を満たす濃密な網目間廠痕を形成する。癲痕が有機 体を救助することを助けるけれども、同様に軸索再生をブロックし、かつ個々は 、損傷部位に依存するけれども非可逆機能的欠損またはてんかん二病巣とともに 残される。

本発明のある実施態様は、前記の如く産生されたグリア廠痕形成物を減少させる “活性°未熟アストロサイトの使用、用途に関する。本発明者及び他の者による 従来の研究では、新生哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）の浸透域が成人において 観察されたものと類似のグリア廠痕形成をまれに起し、そして損傷後代表的な成 人グリア廠痕産生は、鰯歯類動物において最初の生後２週間に増加したことが示 さｕｒｏｌ、　２５１：２３−４３．１９８６）］。

その上、本発明者達は、最近生後８日（ｐ８）前にセルロース　フィルターを大 脳皮質に移植した若い動物において、アストロサイトが移植片周辺に廠痕を産生 じないけれども、その代りにＣＮＳへ縫合するフィルター細胞中への多くの突起 を提供することを見い出した。反対に、老いたマウス（生後１４日またはその後 移植されたもである）中のアストロサイトは、脳内にフィルターを組み込むこと に失敗し、代わりに、軸索成長を支持しないフィルター周辺にダリア間葉廠痕を 産生じた。創傷および移植合体に対するＣＮＳ応答における年齢間？変化は、“ 活性°未熟アストロサイト（生後８日またはそれ以下である）が廠痕形成を抑圧 し、かつ、ポスト臨界アストロサイト（生後１４日またはそれ以上である）がグ リア癲痕を産生ずることを示した。本発明のある実施態様では、“細胞縫合”減 少の発見に関連するものであり、ここで活性未熟アストロサイトはポリマー上へ 移植され、または臨界期動物からの注射懸濁液としてグリア廠痕形成を減少させ るためポスト臨界期動物へ注射される。

本発明の他の実施態様は、関連軸索再生促進手段として活性未熟アストロサイト を利用する方法に関する。従前の研究は、ＣＸＳ軸索が抹消神経グラフトを介し て長尺物［フリートマン等（Ｐｒｉｅｄｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｊｕｒ ｅｄ　Ｎｅｕｒｏｎｓ　１ｎ　ｔｈｅ　０ｌｆａｃｔｏｒｙ　Ｂｕｌｂｏｆ　ｔ ｈｅ　Ａｄｕｌｔ　Ｒａｔ　Ｇｒｏｗ　Ａｘｏｎｓ　ａｌｏｎｇ　Ｇｒａｆｔｓ 　ｏｆ　Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　Ｎｅｒｖｒｅ、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　５： １６１６−１６２５．１９８５）］またはシュパン（Ｓｃｈｖａａｎ）　！］胞 橋を成長させる潜在能力を有することを示した。［クロマ−等（Ｋｒｏｎ＋ｅｒ 、　ｅｔＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８２：６３３０−６３３４． １９８５）コ、しかしながら、抹消神経要素に関する研究は、グラフト端におけ る廠痕形成のため、再生神経線維が、再入すると、短い物を最も好適にＣＮＳに 拡張することを示した。このように、損傷成人ＣＮＳが潜在的にかなり再生可能 であるけれども、新芽は通常頓挫性であり、軸索は、適切な標的を再神経支配に 失敗する。

加えて、本発明者達による研究は、展開軸索が配向“アストロダリア組織°によ って保護されることを示した［シルバー等（Ｓｉｌｖｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　 ５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐａ＋ｅｎｔｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｙ ｅ　Ｃｕｐ　ａｎｄ　０ｐｔｉｃ　Ｎｅｒｖｅ　ｉｎ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｍｉｃｅ 　ａｎｄ　Ｍｒｉｎｇ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｒｅａｔ　 Ｃｅｒｅｂｒａｌ　Ｃｏｍｍ１ｓｓｕｒｅｓＤｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ　ａｎｄ　 ＥｘｐｅｒｌｍｅｎｔａＪ　５ｔｕｄ１ｅｓ、ｉｎ　Ｖｉｖｏ、　ｏｎ　ｔｈｅ 　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ　Ｇ１１ａｌ　Ｐａｔｈｗａｙｓ、Ｊ、 　Ｃｏｍｐ、Ｎｅｕｒｏｌ、、２１０：１０−２９．１９８２）］。誘導系路を 欠く胚脳の損傷域において、形成軸索路は、大きなかたまりをなす神経腫に集ま る。多分、かかる軸索損傷の最も劇的な提示は、外科的誘導アカローザル（ａｃ ａｌ　Ｊｏｓａυ奇形を有するラットにより示される。

ダリア細胞間橋が胚芽的に損傷を受けると、哺乳動物における脳の最大軸索路線 維の全て、または大部分、即ち脳梁は反対の大脳半球へ交差しなかった。これら の軸索は死亡しなかった。代わりに、線維が半球中心溝（ｍｉｄｉｉｎｓ）にお けるスケジュールに到着すると、それらは縦軸大脳割れ目を隣接する大きなかた まりとなる１組の神経腫（プロブストの束）に集まった。

さらに、本発明者達は、生後初期の損傷誘導アカローザル（ａｃａｌ　１ｏｓａ ｌ）動物において、神経腫に隣接して配置され、かつ、損傷大脳中心溝を展開さ せる未処置、通常形態のニトロセルロース（ミリボアー）フィルターが未熟ダリ ア移動を支持することを示した［シルバー等（Ｓｉｌｖｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、。

、５ｃｉｅｎｃｅ、　２２０：１０６７−１０６９．１９８３）］］。ダリアは フィルター表面に付着して細胞様足場を産生ずる。ここで該足場は、順番の、神 経腫の異所性軸索に好適な形を与えて中心軸（ｍｉｄｌｉｎｓ）を越えて脳梁を 再形成する。

しかしながら、本発明者達は、最近、”臨界期”が誘導力ロザール（Ｃａｌｌｏ ｓａｌ）軸索成長形成を起こすために存在することを測定した。本発明者達は、 星形状、ＧＦＡＰ陽性“活性”未熟アストロサイトが、細胞質突起の足部をフィ ルター移植片細孔に挿入することによって、移植片へ移動または付着することに 注目した。グリオチック応答のこの形は、生後８日（Ｐ８）よりも若い動物にお いて発生し、そして移植２４〜４８時間以内に軸索成長促進下層を確立した。従 って、本発明のさらなる実施態様は、軸索再生促進用“活性°未熟［即ち、生後 ８日またはそれ以前］アストロサイトの使用、用途に関する。

同様に、本発明のさらなる実施態様は、中枢神経系の損傷を髄軸索における、関 連軸索再生促進およびダリア廠痕形成を減少させる注射可能な形態またはニトロ セルロース移植片上の“活性”未熟アストロサイトの使用・用途に関する。本発 明者達及び他の者は、を髄入口点付近の背側路を繰り返し粉砕しまたは切断した 後、末梢感覚線維がを髄の背側路入口域（ＤＲＥＺ）に関してのみ再生されるが 、それ以上は再生されないことを見い出した。ＤＲＥＺにおける問題は、ＣＮＳ 残部の至るところ軸索再生不全に類似する。を髄背側後角の神経を除去された樹 状突起で再生感覚線維を再連結するために必要な距離が相対的に短いけれども（ すなわち、成人ラットにおいてａｍのフラクションである）、この限られた距離 は成人動物の再生感覚線維で、通常は、決して枝分かれさせられていない。

を髄背側後角の感覚線維と神経を除去された樹状突起の間隔を測定するために、 本発明者達は、活性未熟アストロサイトで被覆した新しく設計した“ペナント形 ”ニトロセルロースポリマー（８μｍ径）で路索界面を橋かけする方法を開発し た。その結果は、活性未熟アストロサイトと特殊設計ポリマー移植片の組み合わ せがを髄背側路人口域に部分的に廠痕形成を発現し、そして橋表面に沿うＣＮＳ に入る軸索と血管を刺激することを示す。加えて、背側路域と挿入活性未熟アス トロサイトで被覆された移植片を有する動物は、多くの基本的な感覚運動性行動 の顕著な機能的回復を示、した。従って、本発明のさらなる実施態様は、中枢神 経系の関連軸索再生を促進し、かつ損傷を髄軸索の廠痕形成を抑圧する活性未熟 アストロサイトで被覆され、特別に設計されたニトロセルロース移植片の使用・ 用途に関ある態様において、本発明は関連軸索再生促進方法に関するものであり 、ここで該方法には、活性未熟アストロサイトを提供し、かつ、軸索再生促進の ため損傷軸索に有効量の活性未熟アストロサイトを投与する段階が含まれる。

他の態様において、本発明は、活性未熟アストロサイトを提供し、有効量の活性 未熟アストロサイトを移植片上に接種し、損傷軸索近傍に該移植片を挿入して関 連軸索再生を促進する段階を含む軸索再生促進方法に関する。

さらなる態様において、本発明は、活性未熟アストロサイトを提供し、有効量の 該活性未熟アストロサイトを活性未熟アストロサイトを欠く動物の損傷軸索に投 与して関連軸索再生を促進する段階を含む活性未熟アストロサイトを欠く動物の 関連軸索再生を促進する方法に関する。

他の態様において、本発明は、活性未熟アストロサイトを提供し、有効量の該活 性未熟アストロサイトを移植片上に接種し、そして該移植片を活性未熟アストロ サイトを欠く動物の損傷軸索に挿入して関連軸索再生を促進する段階を含む、活 性未熟アストロサイトを欠く動物の関連軸索再生を促進する方法に関する。

さらに他の態様において、本発明は、移植片を活性未熟アストロサイトを有する 動物の中枢神経系に接種し、有効量の該活性未熟アストロサイトが該移植片表面 に付着する充分な時間を用意し、活性未熟アストロサイトを有する動物から該移 植片と付着した活性未熟アストロサイトを未熟アストロサイトを欠く動物の損傷 軸索へ接種して関連軸索再生を促進する段階を含む、活性未熟アストロサイトを 欠く動物の関連軸索再生を促進する方法に関する。

加えて他の態様において、本発明は、活性未熟アストロサイトを提供し、有効量 の該活性未熟アストロサイトを損傷ニューロンと軸索に投与してグリア廠痕形成 を減少させる段階を含むグリア廠痕を形成減少方法に関する。

その他の態様において、本発明は、活性未熟アストロサイトを提供し、有効量の 活性未熟アストロサイトを移植片上に接種し、そして該移植片を損傷軸索に接種 してグリア搬痕形成を減少させる段階を含むグリア搬痕形成減少方法に関する。

他の態様において、本発明は、活性未熟アストロサイトを提供し、有効量の該活 性未熟アストロサイトを、活性未熟アストロサイトを欠く動物の損傷軸索に投与 してグリア廠痕形成を減少する段階を含む、活性未熟アストロサイトを欠く動物 のグリア廠痕形成減少方法に関する。

その他態様において、本発明は、活性未熟アストロサイトを提供し、有効量の該 活性未熟アストロサイトを移植片上に接種し、そして該移植片を活性未熟アスト ロサイトを欠く動物の損傷軸索に植え込んでグリア廠痕形成を減少させる段階を 含む、活性未熟アストロサイトを欠く動物のグリア搬痕形成減少方法に関する。

他の態様において、本発明は、移植片を活性未熟アストロサイトを有する動物の 中枢神経系に挿入し、有効量の活性未熟アストロサイトを該移植片表面に付着さ せるために十分な時間を用意し、移植片と付着活性未熟アストロサイトを活性ア ストロサイトを有する動物から除き、移植片と付着活性未熟アストロサイトを未 熟アストロサイトを欠く動物の損傷軸索に植え込んでグリア搬痕の減少させる段 階を含む、活性未熟アストロサイトを欠く動物のグリア廠痕形成減少方法に関す る。

他の態様において、本発明は、製薬上許容可能な担体中の、精製活性未熟アスト ロサイトからなる関連軸索再生を促進する治療用組成物に関する。

その他の態様において、本発明は、製薬上許容可能な担体中の、精製胚芽から生 後８日のアストロサイトからなる関連軸索再生促進用治療組成物に関する。

他の態様において、本発明は、製薬上許容可能な担体中の、精製活性未熟アスト ロサイトからなるグリア搬痕形成減少用治療組成物に関する。

他の態様において、本発明は、製薬上許容可能な担体中の、精製胚芽から生後８ 日のアストロサイトからなるダリア廠痕形成減少用治療組成物に関する。

図面の説明 次は、図面の簡単な説明であり、本発明の説明用であり、決して本発明を限定す る目的でなされるものでない。

第１ａｓｌｂｓｌｃおよび１６図は、生後２日に移植され、かつ２４時間後に検 査されたアカローザル（ａｃａｌ　１ｏｓａｌ）マウスの電顕写真である。第１ ａ図において、上から観察した脳は、各皮質半球に拡がる中心溝（ｍｉｄｌｉｎ ｅ）を水平に横切って置かれたフィルター（Ｉ）を示す。多くの付着細胞を示す フィルター表面の高倍率図は、第１６図に示される。第１（Ｃ）図に示されるよ うに、第１軸索（矢じり形のもの）は、非末生フィルター上をそして移植片に付 着しているダリアに沿って拡がっている。第１ｄ図は、アストロサイトが軸索を 円で囲む小さな突起（矢）を拡大することによって軸索（Ａｘ）の存在に対応す ることを示す。

各図の倍率は、次のようである。

（ａ）　Ｘ　２０　、（ｂ）　Ｘ７００　、（ｃ）　ｘ　２．０００、（ｄ）　 ＸｌＢ、０００第２ａ、２ｂ、２ｃｓ　２ｄおよび２ｅ図は、ニトロセルロース 橋ＣＩ）を通る冠状域およびアカローザル（ａｃａｌ　１ｏｓａｌ）マウスの半 球中心溝会合組織の顕微鏡写真である。第２ａ−２ａ図は、“臨界”段階におい て移植した動物を示す。例えば、生後２日（第２ａ図）および生後８日（第２ｂ ｓ２ｃ図）であり、両者は移植後４８時間後に観察された“臨界後”の段階。生 誕後１４日（第２ｄ図）と２１日（第２ｅ図）、両者は術後７日に観察されたも のである、に移植された動物と第２ａ−２ｃ図のものとの比較すると、第２ａ− ２ａ図においてダリアがより星形であり、多くの細胞質突起をフィルター細孔に 送り込み、一方、第２ｄおよび２ｅ図の移植片近くの細胞が平らであり、突起の 広範な浸潤を欠くことを示す。直接的に、“臨界”期間移植片の上記浸潤星形ダ リアは、大きくの軸索（アステリスク、第２ａ−２ａ図）であるが、かかる軸索 は、“臨界後°段階移植片であることは明らかではない（第２ｄ−２ｅ図）。

各図の倍率は、（ａ）　Ｘ　４００、（ｂ）　Ｘ　１２５、（ｅ）　Ｘ　４００ 、（ｄ）　Ｘ　４００、（ｅ）　Ｘ　４００である。

第３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄおよび３ｅ図は、生後５日にミリポアー移植片で予め 移植されたアカローザル（ａｃａｌ　１ｏｓａｌ）動物脳梁の顕微鏡写真である 。動物が５週間後に殺されたとき、新しい梁（ＣＣ）が移植片上に形成されてい た（第３ｂ図と第３Ｃ図）。さらに、くちばし状突起で、橋は、中心溝を補うこ とはできず、神経腫の唯一つに埋め込まれていた（第３ａ図）。この領域におい て、グループの軸索が神経腫を残し、背側中隔（ネ）内上衣下域に沿って異所的 ゛に成長した。まれに、動物は、異所的同側中隔突起と同様にセクションの同一 平面に大きな縦神経腫（Ｌ　Ｂ）と十分に発達した梁の両方を有した（第３ｂ図 と第３Ｃ図）。この独自性は、動物が移植時にアカローザル（ａｃａｌ　１ｏｓ ａｌ）であることを保障するマーカーを提供する。新たに形成された梁（矢）域 の１半球皮質に注射されたホースラデッシュノＶ−オキシダーゼは、大脳の反対 側ニューロンを標識化する（第３Ｃ図の支えられた領域、高倍率、第３ｄ図と第 ３ｅ図）。再生脳梁は、シナプス末端の適切な領域へ成長する（小さい矢）。各 図の倍率は、（ａ）　Ｘ　１００、（ｂ）　Ｘ　１００、（ｃ）　ｘ　ｌｏｏ、 （ｄ）　Ｘ　２５０、（ｅ）　Ｘ　４００である。

第４ａ、４ｂおよび４Ｃ図は、生後２日アカローザルマウスに移植され、かつ、 ２４時間後（第４ａ図）、４８時間（第４ｂ図）および７２時間（第４Ｃ図）に 観察されたフィルターを通る冠状域の顕微鏡写真である。第４ａ図において、移 植２４時間後、多くのダリア（矢じり形）は、その中のいくらかは食細胞性であ り、（挿入図）、半球外、かつ、移植片に沿って移動した。それらが、移植片（ Ｉ）に付着すると、細胞質突起をフィルター細孔へ拡張する（第４ｂ図および第 ４Ｃ図の小矢印）。誘導ダリア細胞（非常に右側）がほとんど突起を拡張しない ことに注目すべきである。第４ｂ図において、４８時間以内に、ダリアコート、 フィルター表面の大部分は、軸索（Ａｘ）と血管が伸張する基質を提供する。第 ４Ｃ図に示されるように、あるサンプルにおいて移植７２時間後に軸索は、フィ ルター上のダリア、正常発達脳梁配設物に類似のもの、および“スリング（Ｓｌ ｉｎｇ）”を末生ずる。しかしながら、第４Ｃ図において、ダリアの欠除が膜を 制限することに注目すべきである。各図の倍率は、（ａ）　Ｘ　５００、（ｂ） 　Ｘ　４００、（ｃ）Ｘ５００、挿入図Ｘ　４．４００である。

第５ａ図と第５ｂ図は、臨界およ臨界後金における移植動物のＧＦＡＰに対する 染色パターンを説明するための、冠状域の顕微鏡写真である。第５ａ図において 、フィルターで移植され（Ｐ）、かつ、５日後観察されたるアカローザル新生児 は、移植片（Ｉ）内および皮質（Ｃｘ）内に広範な星形細胞突起を示し、星形形 態を保有する。第５ｂ図において、臨界後段階（Ｐ２１）で移植され、かつ、１ 週間後に観察されたアカローザル動物の星形物は、移植片（Ｉ）上の廠痕内にお いて扁平に見える。各図の倍率は、（ａ）　Ｘ　３００、（ｂ）　Ｘ　３００で ある。

第６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｄ、６ｅおよび６ｆ図は、ラミニンタンパク質に対する 抗体によって産生された染色パターンを示す冠状域の顕微鏡写真である。第６ａ 図に示されるように、Ｐ８前に臨界的に移植された動物ラミニンは、血管及び柔 膜の基底板に閉じ込められるばかりでなくフィルター内のダリア突起（矢印）に 沿うように見える（第６ａ図と第６ｂ図）。動物に臨界後の段階（Ｐ２１）で移 植すると、抗ラミニンは、移植片（Ｉ）周辺に拡大し、かつ縦組織内で連続であ る廠痕内基底うミナを染色した（第６ａ図と第６ｂ図）。ラミニン産生細胞は扁 平である。Ｐ２新生児ダリア被覆フィルターを移植した臨界後動物Ｐ３４（第６ ｅ図と第６ｆ図）は、廠痕形成を示さ巷ない。このように、ラミニンは、裸の移 植片のみを与えられた臨界期動物と同じパターンを染色する（第６ａ図と第６ｂ 図を第６Ｃ図と第６ｆ図と比較する）。各図の倍率は、（ａ）　Ｘ　１００、（ ｂ）　Ｘ　２５０、（ｃ）　Ｘ　１００、（ｄ）　Ｘ　２５０、（ｅ）　Ｘ　１ ００、（ｆ）　Ｘ　２５０である。

第７ａ　％　７　ｂ　ｓ　７　ｃおよび７ｄ図は、生後８日に移植され、かつ４ ８時間後に犠牲にされたアカローザルマウスの透過型電顕写真である。第７ａ図 において、移植片に付着したダリアは、星形形態を有する。ミクロダリア（Ｍ） も同様に明らかである。突起（ｐｒｏｃｅｓｓ）をフィルター（矢印）へ送る前 記ダリアの中には軸索（Ａｘ）と血管（Ｂ　ｖ）がある。第７Ｂ図から明らかな ように、軸索（小矢印）は、基底ラミナ（ＢＬ矢じり形）が基底ラミナではなく てダリアに隣接して直接的に位置すると思われる領域に拡張する。

第７ｃ図と第７ｄ図の高倍率のものは、中間フィラメントとグリコーゲン顆粒を 含有する星形突起（Ｇ）と会合した軸索を示す。各図の倍率は、（ａ）　Ｘ　４ ．５００、（ｂ）　ｘ　５．０００、（ｅ）　Ｘ１２．０００、および（ｄ）　 Ｘ１２．０００である。

第８ａ、８ｂ、８ｃ、８ｄ、８ｅおよび８ｆ図は、部分破壊フィルターで生後２ 日に移植し、かつ、４８時間後に観察したアカローザルマウスの走査型電顕写真 である。第８ａ図において、フィルター（Ｃ）の砕壊部上のダリアは、扁平であ り、なめらかな表面をしており（第８ａ図と第８ｂ図）、一方、非砕壊部（ＮＣ ）に付着したダリアは、より星形である（第８ａ図、第８ｂ図と第８ｆ図）。同 じ場所で、砕壊移植片上のいくらかの扁平なダリアは、多くの非常に小さく波打 たせて拡大する（第８ｄ図）。これが生ずる領域において、他のダリアは、細胞 質パイルを確立する扁平細胞へ移動する（第８ｅ図）。各図の倍率は、（ａ）Ｘ ２００、（ｂ）　Ｘ　１．８００．　（ｃ）　Ｘ　６００、（ｄ）　Ｘ　３．５ ００、（ｅ）Ｘ　１．９００、（ｆ）　Ｘ　２，１００である。

第９ａ図と第９ｂ図は、３Ｈ−チミジン注射された新生児からのダリアで予め被 覆された移植フィルターを有する生後２７日（Ｐ　２７）の動物冠状部の顕微鏡 写真である。

第９ａ図において、大部分のダリアは、核上の銀粒標識化フィルターに付着した 。細胞は、移植片表面が血管に沿って移動し同様に３Ｈ−チミジン標識化されて いる（矢印）。

臨界期後動物（Ｐ３４）に載置されたミリポアー（Ｉ）上の移植新生ダリアは、 ＧＦＡＰの抗体で染色された場合に見られるように、星形形態学を保有する（第 ９ｂ図）。各図の倍率は、（ａ）　Ｘ　４５０、（ｂ）　Ｘ　３００である。

第１０ａ、１０ｂおよび１０ｄ図は、臨界後アカローザル動物（第１０ａ図と第 １０ｂ図）と新生児から収穫されたダリア被覆移植フィルター（第１０ｃ図と第 １０ｄ図）に載置した未処置移植片冠状部の顕微鏡写真である。未処置フィルタ ー（第１０ａ図と第１０ｂ図）に沿う反応性細胞は、シート状であり、移植片へ 拡張する突起をほとんど有しない扁平な形態を示す。反対に移植による臨界後の 脳に産生されたダリア性反応物は、臨界期移植動物に類似する。星形細胞から多 くの挿入突起（矢じり形）と、最小廠痕形成または壊死は明らかである（第１０ Ｃ図と第１０ｄ図）。各図の倍率は、（ａ）　Ｘ　１２５、（ｂ）　Ｘ　４００ 、（ｃ）　Ｘ　１２５、（ｄ）　Ｘ　４００である。

第１１図は、予め被覆されたダリア移植片（移植）を有し、かつ、６日後に観察 されたＰ１７アカローザル動物からのホストドナー界面（中心溝に対しより側方 にある）の透過型電顕写真である。移植片（Ｉ）に付着した星形物は、中間フィ ラメント（矢印）に富む挿入突起を保有する。付着ダリア上皮質は、はとんど組 織変性および廠痕形成を示さない。第１１図の倍率はＸ１２．８００である。

第１２ａ、１２ｂ、１２ｃおよび１２ｄ図は、２日新生児からの予めダリア被覆 移植片（Ｉ）を有し、かつ、ホスト帰属した後６日に観察した生後１７日アカロ ーザルマウス中心溝の透過型電顕写真である。第１２ａ図に示さるように、移植 片付着ダリアは、星形形態を保有し、かつ細胞質突起を浸潤した。搬痕化および 転移性基底ラミナは存在しない。ダリア内には多くの新たに形成された軸索束が ある（矢じり形）。より高い倍率では、弱い束状無髄軸索（第１２ｂ図）および 星形突起に隣接する他のもの（矢印）が示されている。移植片上の娘細胞（Ｂ） は、抗体を共有する（第１２ａ図に開いた矢印）。従って、移植細胞は分割し得 る。各図の倍率は、（ａ）　ＸｌＯ，０ＯＯ１（ｂ）　Ｘ２０．０００、（ｅ） 　ＸｌＯ，０００、（ｄ）　Ｘ　３．３００である。

第１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１３ｄ、１３ｅおよび１３ｆは、ＧＦＡＰ免疫ケイ 光検査の顕微鏡写真である。これらの写真は、未熟（第１３ａ図）と成熟（第１ ３ｂ図）の星形被覆移植片（Ｉ）の両方がそれらの表面に付着してＧＦＡＰ陽性 星形細胞を有することを示す。星形細胞は精製され、インビボ熟成される。未熟 （第１３ｃ図）または成熟（第１３ｄ図）アストロサイト（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ）被覆移植片のいずれかで移植したＰ６０アカローザルマウスのラミニン免疫反 応性の顕微鏡写真。未熟星形細胞を受けるホスト脳の基底ラミナ染色（すなわち 、廠痕化）欠如に注目すべきである（第１３ｃ図のブラケット）。しかしながら 、基底ラミナは成熟星形細胞被覆移植片を有するホスト脳で明らかである（第１ ３ｄ図の括弧）。全移植底上の基底ラミン染色は、それらが培養液中のフィルタ ー頂部に接種されているので、その領域における移植星形細胞の欠損によって生 ずる。培養液中において３Ｈ−チミジン標識化されたＰ６０マウスで移植された 星形細胞（矢印）は、移植片表面から移動する能力を有する（第１３ｅ図）。標 識化成熟星形細胞（矢じり形）は、移植片表面から移動する能力を、有するとは 考えられない（第１３ｆ図）。各図の倍率は、（ａ）　Ｘ　４００．　（ｂ）　 Ｘ　４００、（ｃ）　Ｘ　３００．　（ｄ）　Ｘ　３００、（ｅ）Ｘ４００、（ ｆ）　Ｘ　４００テある。

第１４ａ図および第１４ｂ図は、Ｐ６０７カローザルマウスに移植された未熟（ 第１４ａ図）および成熟（第１４ｂ図）星形細胞被覆フィルター（Ｉ）の顕微鏡 写真である。

未熟星形細胞（４日培！りで移植した動物のホスト脳は、最も少なく廠痕形成及 び組織変性する（第１４ａ図の括弧で囲んだ部分）。反対に、成熟星形細胞（培 養２８日以上）で被覆した移植片周辺の損傷部位は、非処置フィルターで移植し た成人ネズミで観察されたものと類似のダリア間葉廠痕を発達させた（第１４ｂ 図の括弧で囲んだ部分）。各図の倍率は、（ａ）　Ｘ　４００、（ｂ）　Ｘ　４ ００である。

第１５ａ図と第１５ｂ図は、Ｐ６０アカローザルマウスに移植された未熟被覆移 植片（Ｉ）表面の透過型電顕写真である。中間フィラメント（ｇｆ）含有星形細 胞は、移植片細胞表面の多くを被覆する（第１５ａ図と第１５ｂ図）。

しかしながら、少しの単核細胞（Ｍ）と小嚢の基底ラミナ（矢じり形）が存在す る。移植片上の冠状領域に非ミニリン化およびミニリン化軸索（矢印）を含有す るそのままの好中球がある成熟星形細胞被覆移植片（Ｉ）のＰ２Ｏのアカローザ ルマウスへの移植に応答して形成された廠痕の透過型電顕写真。グリア間葉廠痕 は、コラゲン（ｃｆ）、線維芽細胞（大きな矢じり形）と基底ラミナ（小さな矢 じり形および線維芽細胞を含んでいる（第１５ｂ図）。各図の倍率は、（ａ）　 Ｘ　４．４００、（ｂ）　Ｘ　４，４００である。

第１６ａ図と第１６ｂ図は、生後２日にアカローザルに移植され、かつ、４８時 間後に観察されたフィルターに付着したダリア（アスタリスク）上に拡がる軸索 の走査型電顕写真である。低出力挿入図（第１６ａ図）は、１つの半球、神経腫 （Ｌ　Ｂ）外部から移植片（Ｉ）を横切って拡大する脳梁軸索を示す。フィルタ ーの足先（ＣＴ）と縁は明らかである。倍率を高めた図（第１６ｂ図）は、反対 半球に向う移植片を横切る軸索の大きな束を示す。しかしながら、すべての軸索 は、配向を示すものではなく、中には、フィルター（矢印）中心をさまようもの もある。各図の倍率は、（ａ）　Ｘ８０、（ｂ）　Ｘ　７０Ｇである。

第１７ａ、１７ｂおよび１７ｃ図は、生後２日にアカローザルマウスへ移植され 、かつ、４８時間後に犠牲にされた部分的に砕かれたフィルターを通る冠状部の 顕微鏡写真である。第１７ａ図において、軸索（Ａｘ）は、突起をフィルターの 非破砕部（ＮＣ）に伸展させるが破砕（Ｃ）／非破砕（ＮＣ）界面において突然 に回転する星形“活性”ダリア（すなわち挿入された）に沿って移植片表面に横 切る。破砕部表面に付着した星形細胞は、非活性的に扁平にされ（矢じり形と上 部挿入）、核が存在する小丘を示し、そして周縁にラメリポディラム（第２挿入 のし）を有する。

第１７ｂ図に示されるように、軸索束（Ａｘ）は垂直に回転し、そして破砕／非 破砕界面に沿って移動する。第１７Ｃ図において、線維は、扁平細胞層（開矢印 ）を有するダリアマット上の移植片の破砕部を横切っている。その後、線維は、 破砕部他端上の他の挿入郡細胞上をくちばし状に成長した（第１７図す固有のＡ ｘ）。同様に、軸素のなかには挿入活性アストログリア突起上のフィルター内に 存在するものもある。各図の倍率は％　（ａ）　Ｘ　４００、（挿入図）Ｘ８２ ５、（ｂ）　Ｘ　３．３００．　（ｃ）　ｘ　４００である。

第１８ａ、１８ｂおよび１８ｃ図は、を髄の背側路入口領域における“ペナント ”ニトリロセルロース移植片配設を説明する図である。第１８ａ図は、活性未熟 アストロサイト（１２）を含有する“ペナント形”ニトロセルロース移植片（ｌ Ｏ）の正面図である。第１８ｂ図は、背側路を髄界面に挿入された活性未熟アス トロサイト（１２）で被覆された“ペナント形°移植片（１０）の断面図である 。

ペナントのポール域（１４）はを髄（１８）外部から背側路（２０）に突出する が、ペナント形移植片の周縁部（１６）はを髄（１８）プロパー中に横たわって いる。第１８Ｃ図は、背側路（２０）を髄（１８）界面に挿入された活性未熟ア ストロサイトで被覆された“ペナント形”移植片の平面図である。

第１９ａ、１９ｂ、１９ｃおよび１９ｄ図は、１８０日以上のラットのを髄のＬ ５背側路入口領域における”ペナント形”ニトロセルロース移植片配設を示す顕 微鏡写真である。第１９ａ〜１９ｃ図は、胚アストロサイトと配向ニトロセルロ ース移植片の組合せがＬ５背側路入口領域（第１９ｂ図）に局在する廠痕形成を 抑制し、そして軸索と血管が移植片表面に沿って中枢神経系に入ることを刺激す ることを示す（第１９ａ図と第１９ｃ図）。第１９ｄ図は、路損傷ラットの背側 路入口領域に生ずる正常な廠痕形成を示す。第１９ｄ図に示されるように、活性 未熟アストロサイト被覆ニトロセルロース移植片が背側路を髄界面に挿入されな いと、軸索再生は観察されない。各図の倍率は、（ａ）　Ｘ　４００、（ｂ）　 Ｘ２５、（ｃ）　Ｘ８０、（ｄ）　Ｘ　４００である。

発明の詳細な説明 本発明は、“活性”未熟アメトロサイト類（生後８日以内）およびある方法で神 経組織を傷つけた事件または病気から生ずる神経系障害を処置するために活性未 熟アストロサイトを利用する方法に関する。本発明によれば、グリア搬痕形成を 促進する正常な成人アストロサイトに対して、ある種の“臨界期”活性未熟アス トロサイト（生後８日以内）がグリア廠痕形成を減少し、広範な出血および第２ 壊死を阻害し、そして軸索再生を促進することを決定した。

このように、本発明は、“臨界期°活性未熟アストロサイトを単離、収穫、精製 、そして永遠性を賦与し、そして活性未熟アストロサイトを臨界期後動物の中枢 神経へ移植して軸索再生及び血管成長を促進し、および／またはグリア廠痕形成 及び壊死を減少させる方法に関する。

特にインビボ試験は、基質−担体軸索再生用臨界期の存在を示す。大脳中心溝を 横切る来迎軸索の新たな成長は、８日またはそれ以前であり、それより遅くはな い非処置ニトロセルロースフィルター紙（ボアー径０．４５ｍｍ）で移植したア カローザル動物において観察された。この臨界期の間に、アストロサイトダリア は、１２−２４時間以内に移植片上に移動した。活性未熟アストロサイトは、星 形かつＧＦＡＰ陽性であり、そして血管要素と同様に軸索成長支持能力を有する 。

これに対し、生誕後１４日またはそれ以後に移植された動物の反応性ダリア応答 は、新生児で観察されたグリオ−シスと顕著な相違を示した。ダリア細胞を移植 片表面に達成させる時間（５−７日）、２次的な新たな発症範囲、基底ラミナ産 生および線維芽細胞汚染の程度、移植片周辺の組織密度は、すべて年齢とともに 増加した。同様に、移植片を囲む細胞形態は、変性し、そしてより重要なことは 、１４日令以上のアストロサイトは軸索副生物刺激能力を失った。

前記発見の結果、活性未熟アストロサイト（生後８日以内）は、軸索再生に貢献 する環境が臨界後の動物において再確立されるかどうか決定するため、収穫され 、そして臨界期後動物（生後１４日以上）に移植された。その結果（詳細は後述 される）は、未熟アストロサイトが移植に耐え、かつ、大脳損傷の有害な後遺症 を減少することを示す。

観察された好適な効果には、刺激となり、かつ、別の再生されないことが観察さ れた臨界期後のアカローザル軸索再生用下層として役立つと同様に、損傷部位に おける壊死及びグリア廠痕形成の減少も含まれる。初期の研究では臨界期後マウ ス前脳に載置されたミリポアーフィルター上で収穫された活性未熟アストロサイ ト（生後８日以内）が使用されたけれども、最近の研究では活性未熟アストロサ イトが無気力動物のを髄領域のポリマー上に移植される場合に、同様の有効な効 果が観察されることが示されている。

加えて、活性未熟アストロサイトは、インビトロと同様にインビボ用にインビト ロにおいて単離、収穫、精製された。加えて、正常未熟なアストロサイトが培地 で成熟するので、精製活性未熟アストロサイトはインビボ治療用に永遠かつ未熟 であるように遺伝的に処理された。同様に、活性未熟アストロサイトは、バイオ 培地における軸索成長促進用にインビトロで使用されている。

さらに次の実施例は本発明の明確な例を示すものである。

妊娠時のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスをメーン州、バーハーバ−、ジャクソン　ラボ ラトリーズから得た。妊娠時のマウスの１６日胚（Ｅ　１６）のダリア“スリン グ（Ｓｌ　ｉｎｇ）”　（シルバー等、前記、１９８２）は、これは、大脳左右 皮質半球間に一過性軸索保護路を形成するものであり、微小針を胚頭蓋冠へ、約 １ｍｍ＜ちばしを約２ｍｍの深さが頭蓋目じるし“ラムダに挿入して傷つけられ た。技術効果を調べる一実験において、５０匹の動物は傷ついた５０のアカロー ザルであった。

障害胚は、生ずるとただちに、麻酔をかけられ、そして生後（Ｐ）２，５．８． １４および２１日、および８ケ月において特殊設計ニトロセルロースフィルター で移植した［１關２、“ホームプレート”型のセルロースメンブランフィルタ− （ミリポアー）、０．４５μｍ径］。新生児では頭蓋骨はまだ柔軟であり、ドリ ルは必要としなかった。

皮膚と頭蓋を通る切り目は、水平に目の間を結んでなされ、そして皮膚は引っこ んだ。頭蓋骨表面は、移植片が挿入された時に移植片上の他の細胞型不純物を最 小にするように組織のないようにすべすべにされた。その後、特殊な設計移植片 は、最初横に向けられ、２−５ｍｍ巻かれて挿入された。その後、動物は、２日 以上正常な成長環境で保持された。

加えて、星形（すなわち、挿入されたもの）から扁平なものへ、“活性°アスト ロサイト形態の変化が軸索伸張に貢献する基礎を提供するアストロサイト効率を 変化させるか否か決定するために、前記方法に従って新生児脳に挿入する前にポ アー径を減少するように移植片部分を予めつぶしたもので第２組の実験を行なっ た。

２、移植片とそれらの細胞被覆物の切除移植片とそれらの細胞被覆物は、生後２ 日（Ｐ２）移植後４８時間で断頭し、アカローザルマウスから切除された。

移植片周辺の組織は注意深く切断され、そして移植片は表面上の細胞を破砕また ははぎ取られることを防止するピンセットで除去された。その後、移植片とそれ らの細胞被覆物は、Ｎ−２培地に浸され［ボテンシュタイン等（Ｂｏｔｔｅｎｓ ｔｅｉｎ、Ｊ、Ｅ、ａｎｄ　Ｇ、Ｈ，５ａｔｏ、Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ａ　ｒａ ｔ　ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａｃｅｌｌ　１ｉｎｅ　ｉｎ　ｓｅｒｕｍ−ｆｒ ｅｅ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、ｓｃｌ、７９：５１４−５１７．１９８３）］、そして数分後移植される まで３７℃の湿ったチェンバーに載置された。

３、移植片とそれらの細胞被覆物の老いた臨界期後ホストへの移植 メーン州、バー　ハーバ−、ジャクソン　ラボラトリーズから得たホストＣ５７ ＢＬ／６Ｊ　マウス（生後１７．３４日または８ケ月）は、胚または生誕の日に 、アカローザルされた。移植片（すなわち移植片とそれらの細胞被覆物）は、前 記と同一方法で挿入された。

その後、動物は、移植後０．　５．１．２．３．４．５．６および７日および２ ケ月に、液を心臓に潅流させて殺された。潅流は二段階で行なわれた。すなわち 、最初に２−５ｍ１の０．１５Ｍリン酸緩衝液３７℃において左心室に注射され 、その後固定液が続いた（０．５％ＤＭＳＯを有する同一緩衝液中の０．５％グ リタルアルデヒド７２．０％ホルムアルデヒド）。脳は、頭骨からすばやく切断 され、そして４℃において一夜、同一固定液内に置かれた。そのフィルターと周 辺組織は、標準的方法でスプール（Ｓｐｕｒｒ）のプラスチックに埋め込まれた 。一連の１−μｍ部が移植片から取られ、そしてトルイジンブルーで染色された 。ある領域が極めて薄く区切られ、酢酸ウラニルとクエン酸塩で染色され、そし てツアイス１０９電子顕微鏡で観察された。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察 される試料として、移植片上の組織が穏やかに切断され、そして試料がオスミウ ム酸で染色され、かつ等級分けされた一連のアルコールで脱水された。試料はバ ルザーＣＰＯ０２０で臨界点乾燥され、そしてニドワード　Ｅ３０６装置でもっ て金でスパター被覆された。アルミニウム台に載置後、エテツヒ走査型電子顕微 鏡で観察された。

Ｂ、免疫組織化学 外科的にアカローザルされ、かつ、１週間移植片を含有するいろいろの年齢にお ける生後Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、麻酔をかけられ、そして２−５ｍ１のリン 酸緩衝液（ＰＢＳＳｐＨ７，５）中の４％ホルムアルデヒドで心臓を潅流させら れた。その脳は頭蓋上から切断され、２時間固定液に浸漬され、等級分けされた 一連のスクロースＰＢＳ溶液（１０％スクロースＰＢＳ溶液で３０分間、１５％ のもので３０分間、そして２０％のもので２時間４１夜）でクリオ（寒冷）保護 された。１０μｍセクションは、スリーＨＲマーク■クリオスタット　ミクロト ームにかけられた。

精製ラミニン及びフィブロネクチンに対するポリクローナル抗体をＤｒ、ジー、 マーチン（Ｇ、Ｍａｒｔｉｎ）　（ＮＩＨ）から得た。血清を１：５０で希釈使 用した。グリア原線維産生タンパク質（ＧＦＡＰ）に対する抗体は、Ｄｒ、ロバ ートミラー　（オハイオ州、フレバーランド、ケース　ウェスターン　リザーブ ）から供給された。それらは１：１．０ＰＢＳ　（３−１５分洗浄）ですすぎ、 パーオキシダーゼ共役ヤギ抗ラビットＩｇＧ（ペンシルバニア州、マルバールン 、クーパーバイオメディカル）を１　：　１００の割合が希釈して室温で３０分 間またはヤギ抗ラビットＦＬＴＣを１＝５０の割合で希釈して１時間インキュベ ート℃た。再度、セクションをＰＢＳですすぎ、そしてバーオキシダー共役物を 室温の暗所において３０−４５分間、１００ｍ１Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，５）当り １５ＥｇＤＡＢ　（ニューヨーク州　ローチェスター　イーストマン　コダック ＝３．３ジアミノベンジジン　テトラハイドロクロライド）を含有する溶液中で インキュベートした。

Ｃ，ホースラディツシュ　パーオキシダーゼ注射軸索を移植片表面に提供する細 胞体分布を測定するために、生後５日（Ｐ５）に移植され、５週間生存したアカ ローザルマウスには、移植片に極めて近い領域の脳半球皮質への極めて外層的に 挿入（を置針を用いて）される単一の小くさび状結晶性ホースラディツシュ　パ ーオキシダーゼ（シグマ■）が与えられた。翌日動物は殺され、そして０゜１５ ＭＰＢＳ中の０．５％グルタルアルデヒドと２％ホルムアルデヒドで潅流された 。脳は切除され、４時間同一固定液中に放置された。センジョンはビブラトーム で６５μｍに切断され、１００ｍ１Ｔｒｉｓバッフｙ−（ｐＨ７，５）中の５０ ■ＤＡＢで２０分間インキュベートされた。０゜６％ハイドロジエン　パーオキ シダーゼ溶液が加えられ、センジョンは１５−２０分間以上インキュベートされ た。

セクションはニュートラルレッドで対比染色され、そしてスライドに乗せられた 。

Ｄ、移植片の３Ｈ−チミジン　オートラジオグラフ生後２日（Ｐ２）のフィルタ ー移植されたアカローザル新生児は、移植６．１８および３０時間に３Ｈ−チミ ジン（５ｕＣｉ／体重１ｇ）注射を腹腔内に受けた。移植片は、最終注射後１８ 時間で切除され、シャクソン　ラボラトリーズから得られた生後２３日（Ｐ　２ ３）外科的誘導アカローザルマウスに移植された。マウスは移植後４日に潅流さ れ、プラスチック埋め込み用に準備された。１μｍ厚みのセクションはスライド 上に載せられ、そしてコダックＮＴＢ−２オートラジオグラフ　エマルジョンで 被覆された。

被覆スライドは光を通さない容器に入れ、−５℃で６週間貯蔵した。スライドは 、１８℃で写真用処理された。

種々の段階（Ｐ２．５．８．１４および２１、および８ケ月）で非処理ニトロセ ルロース橋を移植されたアカローザルマウスの走査型電子顕微鏡写真を分析する と、移植後２４−４８時間でダリア応答は生後８日（Ｐ８）前に移植された動物 の軸索延長にのみ好適なフィルターに沿って地形を形成することを示した。これ は、付着ダリア細胞（アストロサイト）中に配置された多くの熱燗軸索の存在に よって示された。第１図と第１６図を参照のこと。顕微鏡写真は、Ｐ２とＰ８移 植片のダリアが大部分の移植片表面を被覆し、軸索及び血管が延長する基質を提 供することを示した（ｍ４ａ〜４Ｃ図）。Ｐ２およびＰ８移植片において、フィ ルター上のダリア（アストロサイト）は星形であり線維周辺に多くの細胞質延長 を送って軸索の存在に応答するらしい。第１ｄ図参照のこと。

しかしながら、生後１４日（ＰＩ３）以降の動物移植によって生じるＣＮＳダリ ア応答は、軸索延長に直ちに好適な地形を産生じなかった。Ｐ１４動物のダリア は、扁平であり突起の広範な浸潤を欠いていた。生後２および３週および８ケ月 に裸の非処理移植片を受けた２７匹の動物は、移植後１週間及び２ケ月経過程度 に観察した際に、移植片上及び移植片への軸索成長をほぼあるいは全く示さなか った。第２図参照のこと。

Ｂ、軸索を移植片へ提供する細胞体分布の測定ホースラディツシュ　パーオキシ ダーゼ注射に関する顕微鏡写真を調べると、代表的なセクションが注射部位に対 側性および同位置の位置に退行性標識化皮質ニューロンを含むことが判る（第３ 図）。従って、これらの結果、いくらかの来迎軸索が脳のある領域から現れ、移 植片を路として使用し、中心溝を横切って脳の反対領域へ成長することを示した 。

Ｃ０種々の生後令で移植された ニトロセルロース橋へのホストダリア応答種々の段階でのアカローザルマウスの 移植は、軸索延長に十分な下層を提供するダリア被覆能力を評価するばかりでな くホストグリオチック（ｇｌｉｏｔｉｃ）応答の年齢関連変化を比較するために なされた。顕微鏡写真は、移植片がＰ２およびＰ８にアカローザルマウスの推定 脳梁路内に載置されると、ダリア細胞が移植後の初期１２−２４時間に急速にフ ィルター表面に移動することを示した（第４図参照のこと）。ダリア細胞、細胞 質突起を移植片の０．４５μｍポアーに深く延ばすことによって、それ自身が移 植片へ付着した。

人口器官および包囲組織の両方へ突起を広範に枝分かれさせると同様に、アスト ロサイトとしてフィルター上のダリア要素同定は、ＧＦＡＰ染色の節で劇的に示 された。第５図参照のこと。Ｐ２移植片において、移植４８時間後にフィルター 周辺に若干のマクロファージだけが存在し、そして組織壊死または持続性出血の 証拠はなかった（第４図参照のこと）。

加えて、ＧＦＡＰの結果は、フィルターのアストロサイトの急速移動及びフィル ターとの付着が移植年齢の増加とともに徐々に減少することを示した。４８時間 後に観察されたＰ８移植片において、多くのＧＦＡＰ陽性ダリアがすでに付着し ていた。

Ｐ２とＰ８新生物に対して、ＰＩ３とＰ２１に移植された動物は移植後若干のダ リア活性だけを示した。この段階で観察されたフィルターは、変性組織及び血管 要素で主の被覆されていた。従って、ＰＩ３およびそれ以降に移植された動物フ ィルターへのダリアの反応及び移動は、多くの時間を必要とし、細胞がフィルタ ー周辺へ達するのに十分に１週間を要した。

その上、反応性の年老いたアストロサイトは、星形（即ち挿入された）から扁平 な形（第２ａ図と第２ｅ図との比較、同様に第５ａ図と第５ｂ図との比較）へ特 異変化を示す。封入体、間葉組織および多くの壊死破片を有するマクロファージ は、常にこれらの発達廠痕内に残存する。年老いた動物におけるホストダリア反 応のその他の重要な変形は、突起が移植片に侵入する反応性アストロサイト成熟 体の相対的な無能である。遅い段階（Ｐ２１と８ケ月）で大脳内へ導入され、か つ、７日後に観察されたフィルターは、ダリア突起の細孔への侵入を制限した（ 第２図）。挿入するというよりはむしろダリアがフィルター表面上で扁平となり 、シート状の種々の細胞層を厚く形成して人工器官をカプセル化した。

Ｐ２１における抗ＧＦＡＰ染色パターンは、極めてみじかい突起のみが移植片へ 侵入する扁平なアストロサイトシートを示した（第５図）。この扁平なアストロ サイトは、初期段階よりもより多くの移植片を囲む細胞母集団からなる非染色ク モ膜細胞によってしばしば囲まれていた。

Ｄ、異なる年齢におけるグリオチック（ｇｌｉｏｔｉｃ）応答で会合した外部細 胞マトリックス Ｐ２新生児の移植後２−７日に生ずるグリオチック反応は、ＣＮＳ実質内のコラ ーゲン線維または基底ラミナ産生を刺激しなかった。毛細管周辺及び軟膜表面に 正常に生ずる基底ラミナだけが見い出された。しかしながら、Ｐ２移植動物のラ ミニン（基底ラミナの主要タンパク質成分）が調べられた場合に、不規則な染色 パターンが明らかにされた。期待されたように、ラミニンは、脳中の血管および 軟膜マター（ｍａｔｅｒ）の基底ラミナに濃縮されていると考えられた。しかし ながら、同様に、ラミニンは、グリア廠痕と会合したコラーゲン中と同様に挿入 ダリア突起観察不能な基底ラミナ（第６ａ、６ｂと第６ｃ、６ｄ図を比較のこと ）を有する部位を含有する領域におけるフィルター細孔内に見い出された。転移 性基底ラミナは、最初は、２−７日後に観察されたいくらかの２８個体の移植片 を囲む細胞内の小さな単離小片と考えられた。おもしろいことには、Ｐ８動物に おいて、軸索は転位性基底ラミナに近接して観察されなかった。しかしながら、 軸索は基底ラミナから１０μｍも離れていないアストロサイトのプラズマ膜に沿 ってかたまって観察された（第７ｂ−ｄ図）。フィルター細孔内の抗ラミニン染 色は、ＰＩ３およびそれ以降に移植された脳で大きく減少しまたは存在しなかっ た（第６ｄ図）。コラーゲン線維は廠痕を通じて観察され、細胞と細胞層の間の 空間を占めていた。

線維のバンディングパターンを透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で調べて、それらが タイプコラゲンからなると同定した。

Ｅ、移植片細孔を圧縮することにより誘導された生後２日の新生児における扁平 なアストロサイトへの軸索反応生後２日の破砕移植片の挿入後４８時間にとられ た走査型電子顕微鏡写真を観察すると、破砕領域におけるＧＦＡＰ陽性ア陽性ロ ストロサイトって扁平となり、そして、しばしば融合性発疹単一層を形成するこ とを示した。反対に、移植片の未破砕埴土の層に集まったアストロサイトは、多 くの波上物、水ぶくれおよび細胞質延長物を有する星形であった（第８図参照の こと）。

加えて、マクロファージは、成長軸索が移植片細孔部を浸潤する“活性”星形ア ストロサイトを越えて拡大するが、破砕部上の扁平なアメトロサイト中では成長 しないことを示した（第１７図参照のこと）。同様に、この実験は、ニトロセル ロース上に移植される場合に、“活性°形態のアストロサイトを保有するポリマ ーの通常の細孔径が重要であることを示した。

Ｆ、ダリア被覆移植片の新生児から臨界助役動物への移植３Ｈ−チミジン注射さ れた新生児からのダリアで予め被覆した移植フィルターを受けた臨界助役動物（ すなわちＰＩ３それ以降）冠状部を分析すると、多くの挿入ダリアが事実移転さ れ、そして移植片が生存することが示された（第９図参照のこと）。銀粒子は、 フィルターに付着したダリア上ばかりでなく移植片表面から十分に離れた血管に 沿ったダリア上にも観察された。従って、移植ダリアはフィルター表面から血管 上に移動し、そして出血を減少することができる。

加えて、顕微鏡写真では、移植片を有する動物の脳が非処理移植片を有する同一 年齢のものと比較すると、移植片周辺のダリア反応における顕著な変化を現すこ とが判る。

裸フィルターのＰＩ３若しくはそれ以降の動物への移植は、一定の激しい組織変 化を示し、広範な基底ラミナおよびコラゲン線維と会合したグリア廠痕の濃密な 偏細胞形態の形成が続いた（第１０図参照のこと）。

反対に、活性未熟ダリア（すなわち生後２日〜８日）移植を受けた大部分の動物 は、全く廠痕形成せず、はとんど基底ラミナを産生ぜず、そして組織壊死および 出血が無視できることを示した。要するに、移植動物におけるホストグリオチッ ク応答が、臨界段階に裸の移植片で移植を受けた動物から区別できなくなった（ 第１０ｃ図、第１０ｄ図）。同様に、移植動物は、Ｐ２で移植されたマウスに見 られるものと同一の抗ラミニン染色パターンを示した（第６ａ図、６ｂ図と第６ ｅ図、６ｆ図と比較のこと）。挿入後３−６日に観察した多くの移植体は、（ド ナーダリアが存在する領域において）はとんどあるいは全く細胞片を示さず、ド ナー／ホイス界面に少しのマクロファージだけを示した（第１０ｃ、１０ｄ、１ １図を参照のこと）。移植片表面に沿うアストロサイトは、障害皮質を組み合わ せる多重技を形成し、生存ホスト組織で人工物質を“編む°と考えられる。かか る動物（縦の裂に対する横）において、正常に発生する神経網は、移植片からの 一つの細胞層にできる限り隣接して存在した（第１１図）。これらの成功した移 植動物において最小数のクモ膜細胞が損傷部位に侵入していた。しかしながら、 数例において基底ラミナ、線維芽細胞および扁平ダリアを有する。濃密コラゲン 性廠痕は、移植片域に近接する組織の分離性領域に偏在していた。これは、アス トロサイトの侵入性、星形形態の不足する領域において主に発生した。

Ｇ、ダリア移植片上の誘導軸索成長 転移ダリア、数百の“再生”若しくは成長軸索を有する移植片を受けた多くの臨 界助役動物の冠状セクションは、移植片に付着した移植ダリア中で予め損傷を受 けた大脳中心溝において観察された（第１２図）。軸索は全て熱燗であり、ダリ アによって囲まれている小さな束にだばねられ前記実施例で実施された結果の要 約を第１表に示す。

第１表 臨界お、よび臨界後の段階において、ニトロセルロースフィルターでもって移植 したアカ（ローザルマウスの場合と新生児”から臨界助役動物へ移植された場合 に誘導されたグリオ挿入されたＧＦＡＰ　＋＋÷　＋十　−＋庫と細胞の数 フィルター中の　＋　今一＋ ダリア突起に沿う ）毫−ノ フィルター上の　＋＋＋＋十　−÷ 軸索副生物 壊死　−＋＋＋＋　÷ 血液包囲フィルターー　◆　＋＋＋十 基底ラミう　−　＋　◆＋＋　÷ コラゲン　−　＋＋＋＋　÷ アメトロサイト形　星形　扁平　星形 挿入ダリア突起　◆＋＋　＋÷　−＋＋移植片と反応する　２４−４８時間　５ −７日１、その系は記載された反応の観測可能な存在物または不存在物の全効果 を示す。

２、非処理移植片 ３、Ｐ２臨界期マウスからの移植片 本実施例は、基質担体軸索再生に対して生後８日以内の“臨界期”の存在を示す 。大脳中心溝を横切る来迎軸索の新しい成長は、生後８日以前に非処理ミリポア ー移植したアカローザル動物で観察された。加えて、ホースラディツシュ　パー オキシダーゼを使用する退行性標識化研究では、かかる線維が皮質細胞から現わ れ、そして脳の反対側半球における適切な同位置で終わることを示している。

その上、若いマウス（８日以前に移植された）においてアストロサイトは、フィ ルター周辺に廠痕を産生しなかったが、その代わり、血管および軸索成長を支持 する基質を未熟アストロサイトが産生ずるフィルター細孔へ多くの突起を挿入し た。しかしながら、それらの結果は、老いたマウスのアストロサイト（生後１４ 日以降に移植されたもの）が脳内のフィルターを組み込むことに失敗し、そして 、代わりに、軸索成長を支持しないグリア間葉廠痕を産生した。

損傷、移植片の組み込みおよび軸索成長支持に対する脳応答の変化は、軸索成長 を支持した基質用の“臨界期°の存在を示した。

臨界期間中、アストロサイトダリアの移植片上の移動及び突起の挿入は、１２〜 ２４時間内に生ずる極めて急速な事件である。活性アストロサイトは星形であり 、軸索成長を支持する。最初のダリア侵入相の間およびその後、移植片に向って 移動する細胞の母集団は、血管要素と同様に、軸索成長を支持する能力を有する 。これらの細胞の大部分は、ＧＦＡＰ＋アストロサイトであり、一方、若者の中 において、それらは広範な外部細胞空間によって分離された三次に網目状突起を 立てる能力だけを有するものではなく、それらは線維周辺に付加的な細胞質突起 を拡大することによって成長する軸索の存在に応答すると考えられる。

反対に、上記実験結果では、生誕１４日またはそれ以降に移植した動物の反応性 ダリア応答が新生児で観察されたグリオ−シスと極めて相違することが示される 。ダリア細胞を移植片部位表面へ到達させる時間、第２壊死の大きさ、基底ラミ ナ産生及び線維芽細胞汚染の程度、および移植片おび周辺の組織密度の全ては年 齢とともに増加した（第１表参照のこと）。移植片を囲む細胞形態は、同様に偏 性しく即ち星形に対して扁平となる）、そして最も重要なことは、これらの細胞 が軸索副生物刺激能力を失うことである。

このように、成人“反応性”グリオ−シス（即ち、生後１４日以降）に対して、 新生哺乳動物におけるグリオチック応答（即ち生後８日以前）は反応性減少より も活性であり、人工器官で幾何学的に制御される場合に、有効かつ建設的な方法 と考えられる。

上記発見の結果、活性未熟アストロサイト（生後８日以前のもの）、活性未熟ア ストロサイトが軸索再生に貢献する環境を再確立し得るか否かを決定すると同様 に、それらの“活性“効果が年上いた動物に移されて組織変性量およびグリア廠 痕量を減少し得るか否か決定するために老いた動物に移植された。３Ｈ−チミジ ン試験結果では、活性アストロサイトが新生児（ポリマー人工器官を有する構造 上の無欠性を保有する）から切除され、そしてより成熟したものまたは成人アカ ローザル動物に移されると、活性アストロサイトの大部分が変質し、生存するこ とが示された。

同様に、活性アストロサイトでもって移植された移植動物のホストグリオチック 応答は、裸の移植片でもって移植された“臨界°段階マウスから区別されなかっ た。従って、前記結果は、活性アストロサイトが成人アカローザル動物に移植さ れると、軸索再生に貢献する環境ホスト動物に再確立されることを示す。

その上、顕微鏡写真は、移植動物における組織壊死または永遠の出血または廠痕 の事実はなかった。移植動物における広範な組織変性、出血および廠痕の欠如は 、移植アストロサイトが損傷部位近辺の皮質組織の生存率を増加させることを示 唆する。このように、それらの結果は、°活性”アストロサイトの臨界期後動物 への移植が傷自体の外傷性効果を緩衝することを示す。

精製活性未熟アストロサイトの臨界期後動物への移植高純度母集団“活性”未熟 アストロサイト（生後８日アストロサイト）を次の方法に従って調製した。ジャ クソンラボラトリーズから得られた４匹の産まれたばかりのＣ５７ＢＬ／６Ｊマ ウスの大脳皮質を集め、カルシウム、マグネシウムを含まない最小必須培地（Ｍ ＥＭ−ＣＭＦ）５ｍ中で１關片に切断した。チロプシン（０，１０％において５ ０容積％）をその後加え、細胞を３７℃において３０分間インキュベートした。

その後、エチレンジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）を加え（０，０２５％ＥＤＴＡ 　１ｍｌ／ＭＥＭ−ＣＭＦ　５ｍ１）　、１０分間インキュベートした。

インキュベーション後、上澄を注意深く除去し、デルベコス（Ｄｅｌｂｅｃｏｓ ）修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）にソイビーントリプシン　インヒビター（Ｓ　 Ｂ　Ｔ　Ｉ　０．　５２ｍｇ／ｍｌ）、ＤＮａ　ｓ　ｅ　（０，０４ｍｇ／ｍｌ ）および牛血清アルブミン（３ｍｇ／ｍｌ）を含む混合物２−３　ｍｌで置換し た。この組織の塊を徐々に混合し、集めた。上澄を除去し、１０％脂性牛血清（ Ｆ　ＣＳ）を有するＤＭＥＭで置換した。その組織を火気研磨パスツール　ピペ ットで５分量計した。これは、開口部を最初の直径のほぼ１／３にするために火 気研磨第２ピペツトを用いてもう１度繰り返した。細胞懸濁液を氷上（密閉コニ カル遠心試験管１５ｍ１）に５分間放置し、その後１１００ｒｐで約１分間遠心 分離にかけた。単一細胞懸濁液含有細胞上澄を他の試験管へ移した。

その後、細胞数を数え、Ｏ，１ｍｇ／ｍｌポリリシンで予め被覆したフラスコに ２．０Ｘ１０７細胞／　２５　ｃｍ密度で植えた。細胞を１０００ｇで遠心分離 にかけてペレット化し、１０％ＦＣ５含有ＤＭＥＭ中の５０％アストロサイト状 態にある培地５ｍ１（即ちアストロサイトだけを含有する培地から４日後に採取 した培地）に再懸濁させた。アストロサイトの大部分は、通常６〜８時間以内に 培地プレートに付着した。この期間にほとんどのニューロンと非アストロサイト 細胞は皿に付着しなかった。非アストロ細胞は、フラスコを手で強くシェイクす ると簡単に除去し得た。その後、細胞懸濁液を除去し、そして新鮮な培地を加え た。

シェイクサイクルは、少量の丸い細胞が延びた細胞の間に現れるまで数回繰り返 された。培地は、シェイクし、丸細胞の全てが除かれるまで１日１回再供給され た。従って、この方法で得られた精製活性未熟アストロサイトは、通常、生後４ 日発達したものであった。

生後発達時のものとは対照的に、胚である活性未熟アストロサイトを得るため、 上記方法は胚の１８日（Ｅ１８）胎児ラットドナーを利用して繰り返された。

Ｂ、成熟（２１４以上）アストロサイトの調製法一部の前記未熟アストロサイト は、次の方法によって成熟アストロサイト成長させられた。最初の平板培養後５ −７日以内にアストロサイト培養は融合した。アストロサイトを再平板培養する ために、培地を除き、細胞を０．０２％ＥＤＴＡとトリプシン含有ＭＥＭ−ＣＭ Ｆで洗浄した。

この混合物を除去し、そして小滴の新しい培地を添加した。

その後、アストロサイトは、細胞がプレートカ蝙離するまで５−１０分間インキ ュベータされ、ＤＭＥＭと１０％ＦＣ８に再懸濁され、７５ｃｍ培養フラスコへ 移された。再平板培養２日後、培地はシトシン　アラビノサイドの２日パルス（ ２，５Ｘ１０−５Ｍ）で処理された。各再平板培養後にＡｒａ−Ｃ添加すると若 干の死亡細胞を残したが、線維芽細胞増殖を制御した。成熟アストロサイトは、 ２８日以降の培地から収穫された。

Ｃ，ニトロセルロース移植片の接種 前記の如（産生されたアストロサイトは、０．０２％ＥＤＴＡとトリプシン含有 ＭＥＭ−ＣＭＦを使用して培地から除去した。約１０分後、５ＢＴＩとＤＮａｓ ｅを有する冷ＤＭＥＭを細胞懸濁液に加えた。その後、細胞懸濁液を１０００ｇ で５分間遠心分離にかけてペレット化した。上澄を除去し、アストロサイトをＤ 　Ｍ　Ｅ　Ｍ　１　ｍｌに再懸濁させた。その後、アストロサイトはペレット化 され、全部で３回ＤＭＥＭへ再懸濁され、最後にＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　２００　ｍｌ へ再懸濁された。その後、細胞生活力および数量は、多くの細胞が生存する課程 を示すトリプシン　ブルー除外を使用して測定された。　ホスト動物の前脳及び を髄に挿入される移植片は、種々の細孔径のニトロセルロースフィルター紙から ｇ製された。生後６０日（Ｐ　６０’）アカローザルマウスの前脳へ挿入される 移植片は、０．４５μｍ細孔径ニトロセルロースフィルター紙から調製され、“ ホームプレート′形であり、実施例１（即ち１−＋ａｍ２）で規定された大きさ であった。路損傷成人ラットのを髄背側路入口領域（ＤＲＥＺ）へ挿入される移 植片は、０゜８μｍ細孔径ニトロセルロースフィルター紙から調製され、“ペナ ント°形であり、０．７５−１．０＋ｎ＋ｓＸ３．０ｍｍＸ２５０μｍの大きさ であった。第１８図参照のこと。

その後、約１０ｍ１の活性未熟アストロサイトは、１０７細胞／ｍｌ（約１０５ アストロサイト／移植片）密度でニトロセルロース移植片へ接種された。通常、 アストロサイト懸濁液はフィルター表面にビーズを形成し、３７℃において２時 間インキュベートされた。その後、１００ｍ１滴のＤＭＥＭを注意深くニトロセ ルロース移植片上に置き、アストロサイトを一夜インキユベーションして、それ 自身でフィルターに付着させた。

その後、上記方法を繰り返して成熟マウスアストロサイト含有対照移植片を生産 した。しかしながら、成熟（Ｐｉ４以降）マウスアストロサイトは、活性未熟ア ストロサトと置換した。

活性未熟アストロサイト被覆前脳“ホームプレート”形移植片は、実施例１に示 される方法に従って、８匹の生後６０日ののアカローザルマウスに挿入された。

比較目的で、成熟（Ｐ１４以降）移植片被覆“ホームプレート”形移植片は、同 様に、前記で利用したと同一方法によって同数の生後６０日のアカローザルマウ スへ移植された。

２、生後１８０日以降のラットを髄背側路入口領域において チャールス　リバー　ファシリテイーズから得た生後１８０日以降（２００−２ ５０ｇ）のラットは、麻酔にかけられた。ラミネクトミーは、背側路Ｌ４−Ｌ６ に対して行なわれ、それら及びそれらの入口点をを髄に対して露わにさせた。背 側路Ｌ４とＬ６は、対照手段として切断されて背側路Ｌ５のセンサー感覚を局在 させた。その後背側路Ｌ５は破砕された（１０秒間×３）。その後、背側路Ｌ５ は、１．５２ｍｍ（約０．５ＩＩｌ１以内の深さ）の表面の切開が背側路（Ｌ５ ）と後柱間のを髄に行なわれたを髄背側路入口領域ヘトレースされた。活性未熟 ラットアストロサイト被覆ペナント形移植片は、切開部へ表面的に挿入させられ た。

第１８図参照のこと。ペナント形移植片のボール部は、穏やかに路に押しつけら れた。このように、ペナントの辺縁部が背側灰白柱に好ましく、中間の索にある けれども、ペナント形移植片のポール部はを髄外側へ徐々に突出し、そして背側 路自体に入っていた。

その後、切開部とペナントは無菌ゲルフィルムで被覆され、そして筋肉と皮膚は 縫合して傷を被う。３週間〜１ケ月の間、２日間隔で、ラットは、Ｌ５背側路感 覚移動挙動のいずれかが回復したか否か調べるために試験された。加えて、２１ −３０日後、ラットは犠牲にされ、そして、移植片および包囲組織域の連結部は 、実施例１に示された方法に従って試験用に調製された。

Ｅ、移植片の免疫組織化学および３Ｈ−チミジンオートラジオグラフ 実施例１に示されたと同一の方法を、本実施例の未熟および成熟アストロサイト に適用した。

ウス前脳への移植は、試験した８匹のうち５匹が癲痕形成を抑制した。これらの 移植動物は、生後８日（Ｐ８）に非ダリア被覆移植片を受ける動物に似ていた。

廠痕形成は、移植片表面の大部分において抑制されていた。加えて、生後６０日 （Ｐ　６０）に移植された未熟アストロサイトの免疫組織化学染色は、移植片に 付着した細胞がＧＦＡＰ陽性であり、かつ多くのものがフィルター細孔内へ突起 を有することを示した。移植片の３Ｈ−チミジンオートラジオグラフ結果は、ア ストロサイトの脳への挿入７日後に標識化細胞がしばしば移植片表面から離れて 見つかることを示した（第１３図参照のこと）。

移植片を包囲する厭痕量を測定するために、第１３ａ図のそれに連続したセクシ ョンはラミニンタンパク質に対する抗体で染色された。移植片背側、それは培地 からのアストロサイトで被覆された側である、上のラミニン染色パターンは、ア ストロサイト突起包囲フィルターおよび血管を包囲する基底ラミナに限られてい た（第１３Ｃ図参照のこと）。この染色パターンは、新生児移植片および実施例 １の移植体で観察されたものと類似していた。フィルター底部（腹部）において 、廠痕内基底うミナが識別された。この領域は、移植片内のＧＦＡＰ陽性ア陽性 ロストロサイト突起なかった。アストロサイトがフィルター頂部にのみ接種され るので、フィルター底部にける廠痕形成は、移植片を有する全移植成人の一致す る特徴であった。同様に、フィルターの非被覆底部は、内部対照として役立った 。

アストロサイトが培地で２８日間成長した場合に、相対的な大きさは増加し、か つ、分割割合が減少した。成熟アストロサイト肥大後直ちに、アストロサイトが ５０〜１２０μｍになった。

未熟アストロサイト移植片に対して、フィルター上の成熟アストロサイト（培地 で２８日以上）移植は、廠痕形成抑圧に失敗した（第１４図参照のこと）。かか る動物において、厚く濃厚な廠痕が移植片表面の大部分を被覆した（第２表およ び第１４図参照のこと）。移植片の電子顕微鏡写真は、廠痕が、非処理フィルタ ーが成人前脳に移植された場合に生ずるものに、形態において類似することを示 した。この廠痕は、主に線維芽細胞とアストロサイトから構成されていた。基底 ラミナとコラゲンの様な細胞外マトリックス成分も同様に存在した（第１５ｂ図 ）。重要なことは、移植前に３Ｈチミジン標識化された成熟アストロサイトは搬 痕外へ移動せず、そして多くは移植片に付着してとどまった（第１３ｆ図参照の こと）。これは未熟アストロサイト移植片と著しく相違した（第１３ｃ図と第１ ３ｆ図と比較のこと）。

第２表 移植領域 年　齢　廠痕形成　ダリア組み込み Ｐ２−４８時間　ｎ＝２０　２．１５＋／−０，７８３８，６＋／−９，０７Ｐ ８−４８時間　＋ｒ１０　８．２　＋／−２．７１　３０．６＋／−９，０５Ｐ １４−７日　ｎ−６２８，８＋／−１１，０７１７，０＋／−７，０２Ｐ２１− ７日　ｒｒ１６３５．７５＋／−９，０２５，３＋／−１７０トランスＰ２−Ｐ ３４　ｒｒ１５　５．４＋／−１，８１３５，５＋／−８，９４インビトｏ　ｒ ｒ８　１２．５＋／−１，１９３８，０＋／−０，７５２日−Ｐ２Ｏ インビトロｎ＝１０　４３．６＋／−４，９５，２＋／−５，０２８日−Ｐ２Ｏ この表は、異なる年齢または条件下で移植片表面に形成される廠痕口を定量的に 示す。廠痕形成は、フィルター表面の背側部を多くのグリッド（各々約５０μｍ ）に分割することによって定量された。各グリッドは評価され、そして廠痕形成 または上記定義に従って移植片をホスト脳へ組み込むダリアの能力に対して計数 された。Ｐ２．８またはＰ３４移植体への移植後形成された廠痕量は、Ｐ１４以 降に移植された動物と比較すると非常に減少している。Ｐ２１に移植されたアカ ローザルマウスとＰ２．８または移植された埋没したものとの相違は、０．０１ 未満のＰに重要を髄背側へ挿入された、精製活性未熟ラットアストロサイト被覆 ペナント形ニトロセルロース移植片から得られた顕微鏡写真から、胚アストロサ イトと配向ニトロセルロース移植片の組み合せがを髄背側路入口領域（ＤＲＥＺ ）に局在する搬痕形成を抑制し、かつ、軸索及び血管が移植片表面に沿って中枢 神経系に入ることを刺激することが判る。

（第１９ａ〜１９ｃ図参照のこと）。加えて、予め傷つけたＬ５路のＨＲＰ標識 化研究は、多くの線維および背側固自柱内のラミナル２と３の正常な位置にボタ ンを有する終末を示す。副集団軸索内の移植片を有し入ってくる線維と多くの新 規終末樹奇形の存在との正確な関係は、索線維が実際に再生されるという納得さ せる事実を提供する。

その上、活性未熟ラットアストロサイト被覆ペナント形ニトロセルロース移植片 で移植した１９匹のラットのうち６匹のラットは、移植片挿入後約５〜７日に多 くの基礎的感覚運動挙動の機能的回復を示した。従って、前記結果は、特殊設計 ニトロセルロース移植片上に接種された活性未熟移植片が関連軸索及び血管再生 を促進し、がっ、を髄におけるダリア廠痕形成を抑制することを示す。

実施例２に示される方法に従って生産された精製活性未熟（胚生後８日）アスト ロサイトは、次の方法によって、５Ｖ４０Ｔ抗原をコードする不完全レトロウィ ルスおよび細菌ネオマイシン耐性遺伝子で不死化された。精製活性未熟アストロ サイトは、１日に５Ｘ１０５／６０ｍｍ皿へ接種された。２日に、培地は、５Ｖ ４０Ｔ抗原をコードする不完全レトロウィルスおよび細菌ネオマイシン耐性遺伝 子含有ウィルス性上澄２ｍｌで置換された（英国、ロンドン、ロンドンの二二パ ーシティカレッジ、Ｄｒ、ピー、ニス、ジャックから得たものである）。細胞は 、２〜３時間インキュベートされ、その後ウィルスは除去され、そして新しい培 地が再び供給された。ネオマイシン耐性コロニーは、Ｇ４１８含有培地で選択さ れたにューヨーク州、グランド、アイランド、ギプコから得られたネオマイシン 類似物）。

培地中で正常な表現型、即ちアストロサイト形態学および成長の目視抑制を示す 、コロニーは、選択され、がっ１ケ月以上培養され、そて顕微鏡的観察変化を受 けることなく継代する。その後、クローンは、グリア原線維タン、＜り質に対し て染色され、軸索成長促進が試験された。クローンは、ＧＦＡＰ陽性であり、軸 索成長を促進した。

本発明は、好適な実施態様を引用して記載されている。

明らかに、修正および変更は、前記詳細な詳述を読み力）つ理解すると生ずるで あろう。添付の請求の範囲及びその等偽物の範囲内にある限りかかる変更および 修正は本発明に含まれるように構成されている。

ＦＩＧ、３ｄ ＦＩＧ、４ａ ＦＪＧ、４ｂ ＦＩＧ、５ａ ＦＩＧ、６ａ　ＦＩＧ、６ｂ ＦＩＧ、６ｃ　ＦＩＧ、６ｄ ＦＩＧ、Ｉ３ａ　ＦＩＧ、ｆ３ｂ ＦＩＧ、Ｉ３ｃ　ＦＩＧ、　ｆ３ｄ ＦＩＧ、Ｉ５ａ ＦＩＧ、ｌ７ａ ＦＩＧＪ７ｂ ＦｆＧ、Ｉ９ａ 国際調査報告 一′＃″１−＾−”−−ｗｒ〒ｔｖｖｃｏ口Ｉ＾１１１ζＸ、　Ｃｌａｉｍｓ　 ｌ−８，２３−３１，６１−６８，８２−９０ａｎｄ　１２８−ユコｌ。

ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　ａｘｐｎ 　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ。

ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　Ｃ１ａｓｓ　４３５，５ｕｂｃｌａｓｓ　２４０ ．１＋。

Ｈ，Ｃｌａｉｍｓ　９−２２．３２−４６．６９−８１　ａｎ＋５　９１−１０ ５．ｄｒａｗｎ　＝Ｏａ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　ａｘｏ ｎ　ｒｅｇｅｒ＋ｅｒａｔｉｏｎ、　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　１ｎＣ１ａｓｓ　 ４３５，５ｕｂｃｌａｓｓ　２４０．ｌ＋。

ＺＩＬ　Ｃｌａｉｍｓ　４７−６０　ａｎｄ　１０６−１１９．　ｄｒａｗｎ　 Ｌｏ　ａ　ｐｒｃｃｅｓｓｏｆ　ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　ａｘｏｎ　ｒｅｇｅｒ＋ ｅｒａｔｉｏｎ、　ｃＬａｓｓｉｆｉｅ４　ｉｎ　Ｃ１ａｓｓ４３５．５ｕｂｃ ｌａｓｓ　２４０．Ｌ＋−ＩＶ、　Ｃ１ａｆｓ　１２０−１２７．　ｄｒａｗｎ 　ｔｏ　ａ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ　ａ　ｃａｒｒｉｅ ｒ　ａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｃｔｌｖａｔｅｄ　ｉ＋ｎ＋ｎａセｕｒｅＪＩ ＳｔｒＯ（：ｙｏｓ、ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　Ｃ１ａｓｓ　４２４．５ｕ ｂｃｌａｓｓ　９５＋。

Ｖ、　Ｃ１ａｉ＋ａ　１３２．　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｃａｒｒｉｅｒ　ａｎ ｄ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｐｏｓセｎａｔａｌ　ｄｙ＠８　ａｓｔｒｏｃｙセｅｓ 、　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｉｎ　Ｃ１ａｓｓ　４２４゜５ｕｂｃｌａｓｓ　９５ ＋。

Ｖｌ、　Ｃｌａｉｍ　１３３．ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ヒｏ　ａ　ｐｒｏｃｅｓｓ　 ｏｆ　ｐｒｅｐａｒｉｎｇＶＸｌ、Ｃｌａｉｍｓ　３４　ａｎｄ　３５．ｄｒａ ｗｎ　ｔｏ　ｉ＋＋＋ｍｏｒｔａｌ　ａｃｔｉｖａｔｅｄｉｍｍａｔｕｒｅ　ａ ｓｔｒｏｃｙｔｅｓ、ｃｌａｓｓｉｆｉｅ４　ｉｎ　Ｃ１ａｓｓ　４３５，５ｕ ｂｃｌａｓｓ２４０．１◆。

Ａ　６１　Ｋ　３５／１２　ＡＤＴ Ｃ１２Ｎ　５１０６ オハイオ州　４４１０６、クリーブランド、コーネルオハイオ州　４４０２６、 チェスターランド、スペリ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）活性未熟アストロサイトを実質的に精製し、そして ｂ）有効量の該活性未熟アストロサイトを損傷軸索に投与して軸索再生を促進さ せる ステップからなる軸索再生促進方法。 ２．該活性未熟アストロサイトが星形、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトである請求 の範囲第１項に記載の方法。 ３．該活性未熟アストロサイトが胚から生後８日のアストロサイトである請求の 範囲第１項に記載の方法。 ４．該活性未熟アストロサイトが生後２日〜生後８日のアストロサイトである請 求の範囲第３項に記載の方法。 ５．該損傷軸索が前脳軸索である請求の範囲第１項に記載の方法。 ６．該前脳軸索が交連軸索である請求の範囲第５項に記載の方法。 ７．該損傷軸索が脊髄軸索である請求の範囲第１項に記載の方法。 ８．該脊髄軸索が感覚軸索である請求の範囲第７項に記載の方法。 ９．ａ）活性未熟アストロサイトを実質的に精製し、ｂ）有効量の該活性未熟ア ストロサイトを移植片へ接種し、そして ｃ）該接種移植片を損傷軸索末端近傍へ挿入して関連軸索再生を促進させる ステップからなる関連軸索再生促進方法。 １０．該活性未熟アストロサイトが星形、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトである請 求の範囲第９項に記載の方法。 １１．該活性未熟アストロサイトが胚から生後８日のアストロサイトである請求 の範囲第９項に記載の方法。 １２．該活性未熟アストロサイトが生後２日〜生後８日のアストロサイトである 請求の範囲第１１項に記載の方法。 １３．該損傷軸索が前脳軸索である請求の範囲第９項に記載の方法。 １４．該前脳軸索が交連軸索である請求の範囲第１３項に記載の方法。 １５．該損傷軸索が脊髄軸索である請求の範囲第９項に記載の方法。 １６．該脊髄軸索が感覚軸索である請求の範囲第１５項に記載の方法。 １７．該移植片がニトロセルロースフィルター紙である請求の範囲第９項に記載 の方法。 １８．該ニトロセルロースフィルター紙が約０．４５μｍの細孔径を有する請求 の範囲第１７項に記載の方法。 １９．該ニトロセルロースフィルター紙が約８．０μｍの細孔径を有する請求の 範囲第１７項に記載の方法。 ２０．該０．４５μｍ細孔径ニトロセルロースフィルター紙が１ｍｍ２ホームプ レート形片のフィルター紙である請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２１．該８．０μｍ細孔径ニトロセルロースフィルター紙がペナント形片のフィ ルター紙である請求の範囲第１９項に記載の方法。 ２２．該ペナント形片フィルター紙が約３ｍｍ×０．７５ｍｍ×２５０μｍであ る請求の範囲第２１項に記載の方法。 ２３．ａ）活性未熟アストロサイトを実質的に精製し、そして ｂ）有効量の該活性未熟アストロサイトを活性未熟アストロサトを欠く動物の損 傷軸索に投与して関連軸索再生を促進させる ステップからなる活性未熟アストロサイトを欠く動物における関連軸索再生促進 方法。 ２４．該活性未熟アストロサイトが星形、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトである請 求の範囲第２３項に記載の方法。 ２５．該活性未熟アストロサイトが胚から生後８日のアストロサイトである請求 の範囲第２３項に記載の方法。 ２６．該活性未熟アストロサイトが生後２日〜生後８日のアストロサイトである 請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２７．該損傷軸索が前脳軸索である請求の範囲第２３項に記載の方法。 ２８．核前脳軸索が交連軸索である請求の範囲第２７項に記載の方法。 ２９．該損傷軸索が脊髄軸索である請求の範囲第２３項に記載の方法。 ３０．該脊髄軸索が感覚軸索である請求の範囲第２９項に記載の方法。 ３１．該活性未熟アストロサイトを欠く動物が１４日齢以上の動物である請求の 範囲第２３項に記載の方法。 ３２．ａ）活性未熟アストロサイトを実質的に精製し、ｂ）有効量の該活性未熟 アストロサイトを移植片に接種し、そして ｃ）該接種移植片を活性未熟アストロサイトを欠く動物の損傷軸索へ挿入して関 連軸索再生を促進させるステップからなる活性未熟アストロサイトを欠く動物に おける関連軸索再生促進方法。 ３３．該活性未熟アストロサイトが星形、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトである請 求の範囲第３２項に記載の方法。 ３４．該活性未熟アストロサイトが胚から生後８日のアストロサイトである請求 の範囲第３２項に記載の方法。 ３５．該活性未熟アストロサイトが生後２日〜生後８日のアストロサイトである 請求の範囲第３４項に記載の方法。 ３６．該損傷軸索が前脳軸索である請求の範囲第３２項に記載の方法。 ３７．該前脳軸索が交連軸索である請求の範囲第３６項に記載の方法。 ３８．該損傷軸索が脊髄軸索である請求の範囲第３２項に記載の方法。 ３９．該脊髄軸索が感覚軸索である請求の範囲第３８項に記載の方法。 ４０．該活性未熟アストロサイトを欠く動物が１４日齢以上の動物である請求の 範囲第３２項に記載の方法。 ４１．該移植片がニトロセルロースフィルター紙である請求の範囲第３２項に記 載の方法。 ４２．該ニトロセルロースフィルター紙が約０．４５μｍの細孔径を有する請求 の範囲第４１項に記載の方法。 ４３．該０．４５μｍ細孔径ニトロセルロースフィルター紙が１−ｍｍ２ホーム プレート形片のフィルター紙である請求の範囲第４２項に記載の方法。 ４４．該ニトロセルロースフィルター紙が約８．０μｍの細孔径を有する請求の 範囲第４１項に記載の方法。 ４５．該８．０ｍｍ細孔径ニトロセルロースフィルター紙がペナント形片のフィ ルター紙である請求の範囲第４４項に記載の方法。 ４６．該ペナント形片のフィルター紙が約３ｍｍｔ×０．７５ｍｍ×２５０μｍ である請求の範囲第４５項に記載の方法。 ４７．ａ）移植片を活性未熟アストロサイトを有する動物の中枢神経系へ挿入し 、 ｂ）有効量の該活性未熟アストロサイトが該移植片表面に付着する十分な時間を 用意し、 ｃ）該移植片および付着活性未熟アストロサイトを活性未熟アストロサイトを有 する動物から切除し、そして ｄ）該移植片および付着活性未熟アストロサイトを未熟アストロサイトを欠く動 物の損傷軸索へ挿入して関連軸索再生を促進させる ステップからなる活性未熟アストロサイトを欠く動物における関連軸索再生促進 方法。 ４８．該活性未熟アストロサイトが星形、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトである請 求の範囲第４７項に記載の方法。 ４９．該活性未熟アストロサイトが胚から生後８日のアストロサイトである請求 の範囲第４７項に記載の方法。 ５０．該活性未熟アストロサイトが生後２日〜生後８日のアストロサイトである 請求の範囲第４９項に記載の方法。 ５１．該損傷軸索が前脳軸索である請求の範囲第４７項に記載の方法。 ５２．該前脳軸索が交連軸索である請求の範囲第５１項に記載の方法。 ５３．該損傷軸索が脊髄軸索である請求の範囲第４７項に記載の方法。 ５４．該脊髄軸索が感覚軸索である請求の範囲第５３項に記載の方法。 ５５．該活性未熟アストロサイトを欠く動物が１４日齢以上の動物である請求の 範囲第４７項に記載の方法。 ５６．該移植片がニトロセルロースフィルター紙である請求の範囲第４７項に記 載の方法。 ５７．該ニトロセルロース紙が約０．４５μｍの細孔径を有する請求の範囲第５ ６項に記載の方法。 ５８．該０．４５μｍ細孔径ニトロセルロース紙が１−ｍｍ２ホームプレート形 片のフィルター紙である請求の範囲第５７項に記載の方法。 ５９．該ニトロセルロースフィルター紙が約８μｍの細孔を有する請求の範囲第 ５６項に記載の方法。 ６０．該８．０μｍ細孔径ニトロセルロースフィルター紙がペナント形片のフィ ルター紙である請求の範囲第５９項に記載の方法。 ６１．ａ）活性未熟アストロサイトを実質的に精製し、そして ｂ）有効量の該活性未熟アストロサイトを中枢神経系の損傷組織へ投与してダリ ア瘢痕形成を減少させる 段階からなる損傷中枢神経系組織におけるダリア瘢痕形成減少方法。 ６２．該活性未熟アストロサイトが星形、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトである請 求の範囲第６１項に記載の方法。 ６３．該活性未熟アストロサイトが胚から生後８日のアストロサイトである請求 の範囲第６２項に記載の方法。 ６４．該活性未熟アストロサイトが生後２日〜生後８日のアストロサイトである 請求の範囲第６３項に記載の方法。 ６５．該中枢神経の損傷組織が前脳軸索である請求の範囲第６１項に記載の方法 。 ６６．該前脳軸索が交連軸索である請求の範囲第６５項に記載の方法。 ６７．該中枢神経系の損傷組織が脊髄軸索である請求の範囲第６１項に記載の方 法。 ６８．該脊髄軸索が感覚軸索である請求の範囲第６７項に記載の方法。 ６９．ａ）活性未熟アストロサイトを実質的に精製し、ｂ）有効量の該活性未熟 アストロサイトを移植片に移植し、そして ｃ）該接種移植片を中枢神経系の損傷組織へ挿入しダリア瘢痕形成を減少させる ステップからなる損傷中枢神経系組織おけるダリア瘢痕形成減少方法。 ７０．該活性未熟アストロサイトが星形、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトである請 求の範囲第６９項に記載の方法。 ７１．該活性未熟アストロサイトが胚から生後８日のアストロサイトである請求 の範囲第６９項に記載の方法。 ７２．該活性未熟アストロサイトが生後２日〜生後８日のアストロサイトである 請求の範囲第７１項に記載の方法。 ７３．該中枢神経系の損傷組織が前脳軸索である請求の範囲第６９項に記載の方 法。 ７４．該前脳軸索が交連軸索である請求の範囲第７３項に記載の方法。 ７５．該中枢神経系の損傷組織が脊髄軸索である請求の範囲第６９項に記載の方 法。 ７６．該脊髄軸索が感覚軸索である請求の範囲第７５項に記載の方法。 ７７．該移植片がニトロセルローズフィルター紙である請求の範囲第６９項に記 載の方法。 ７８．該ニトロセルロースフィルター紙が約０．４５μｍの細孔径を有する請求 の範囲第７７項に記載の方法。 ７９．該０．４５μｍ細孔径ニトロセルロースフィルター紙が１ｍｍ２ホームプ レート形片のフィルター紙である請求の範囲第７８項に記載の方法。 ８０．該ニトロセルロース紙が約８．０μｍの細孔径を有する請求の範囲第７７ 項に記載の方法。 ８１．該８．０μｍ細孔径ニトロセルロースフィルター紙がペナント形片のフィ ルター紙である請求の範囲第８０項に記載の方法。 ８２．ａ）活性未熟アストロサイトを実質的に精製し、そして ｂ）有効量の該活性未熟アストロサイトを活性未熟アストロサイトを欠く動物の 中枢神経系の損傷組織へ投与してダリア瘢痕形成を減少させる ステップからなる活性未熟アストロサイトを欠く動物における損傷中枢神経系組 織におけるダリア瘢痕形成減少方法。 ８３．該活性未熟アストロサイトが星形、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトである請 求の範囲第８２項に記載の方法。 ８４．該活性未熟アストロサイトが胚から生後８日のアストロサイトである請求 の範囲第８２項に記載の方法。 ８５．該活性未熟アストロサイトが生後２日〜生後８日のアストロサイトである 請求の範囲第８４項に記載の方法。 ８６．該中枢神経系の損傷組織が前脳軸索である請求の範囲第１項に記載の方法 。 ８７．該前脳軸索が交連軸索である請求の範囲第８６項に記載の方法。 ８８．該中枢神経系の損傷組織が脊髄軸索である請求の範囲第８２項に記載の方 法。 ８９．該脊髄軸索が感覚軸索である請求の範囲第８８項に記載の方法。 ９０．該活性未熟アストロサイトを欠く動物が１４日齢以上の動物である請求の 範囲第８２項に記載の方法。 ９１．ａ）活性未熟アストロサイトを実質的に精製し、ｂ）有効量の該活性未熟 アストロサイトを移植片へ接種し、そして ｃ）該接種移植片を活性未熟アストロサイトを欠く動物の中枢神経系損傷組織へ 挿入してダリア瘢痕形成を減少させる ステップからなる活性未熟アストロサイトを欠く動物の損傷中枢神経系組織にお けるダリア瘢痕形成減少方法。 ９２．該活性未熟アストロサイトが星形、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトである請 求の範囲第９１項に記載の方法。 ９３．該活性未熟アストロサイトが胚から生後８日のアストロサイトである請求 の範囲第９１項に記載の方法。 ９４．該活性未熟アストロサイトが生後２日〜生後８日のアストロサイトである 請求の範囲第９３項に記載の方法。 ９５．該中枢神経系の損傷組織が前脳軸索である請求の範囲第９１項に記載の方 法。 ９６．該前脳軸索が交連軸索である請求の範囲第９５項に記載の方法。 ９７．該中枢神経系の損傷組織が脊髄軸索である請求の範囲第９１項に記載の方 法。 ９８．該脊髄軸索が感覚軸索である請求の範囲第９７項に記載の方法。 ９９．該活性未熟アストロサイトを欠く動物が１４日齢以上の動物である請求の 範囲第９１項に記載の方法。 １００．該移植片がニトロセルロースフィルター紙である請求の範囲第９１項に 記載の方法。 １０１．該ニトロセルロースフィルター紙が約０．４５μｍの細孔径を有する請 求の範囲第１００項に記載の方法。 １０２．該０．４５μｍ細孔径ニトロセルロースフィタ−紙が１−ｍｍ２ホーム プレート形片のフィルター紙である請求の範囲第１０１項に記載の方法。 １０３．該ニトロセルロースフィルター紙が約８．０μｍの細孔径を有する請求 の範囲第１００項に記載の方法。 １０４．該８．０μｍ細孔径ニトロフィルター紙がペナント形片のフィルター紙 である請求の範囲第１０３項に記載の方法。 １０５．該ペナント形片のフィルター紙が約３ｍｍ×０．７５ｍｍ×２５０μｍ の大きさである請求の範囲第１０４項に記載の方法。 １０６．ａ）移植片を活性未熟アストロサイトを有する動物の中枢神経系へ挿入 し、 ｂ）有効量の該活性未熟アストロサイトを該移植片表面に付着するために十分な 時間を用意し、ｃ）移植片と付着活性未熟アストロサイトを該活性未熟アストロ サイトを有する動物から切除し、そして ｄ）移植片と付着活性未熟アストロサイトを活性未熟アストロサイトを欠く動物 の中枢神経系損傷組織へ挿入してダリア瘢痕形成を減少させるステップからなる 活性未熟アストロサイトを欠く動物の損傷中枢神経系組織におけるダリア瘢痕形 成減少方法。 １０７．該活性未熟アストロサイトが星形、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトである 請求の範囲第１０６項に記載の方法。 １０８．該活性未熟アストロサイトが胚から生後８日のアストロサイトである請 求の範囲第１０６項に記載の方法。 １０９．該活性未熟アストロサイトが生後２日〜生後８日のアストロサイトであ る請求の範囲第１０８項に記載の方法。 １１０．該中枢神経系の損傷組織が前脳軸索である請求の範囲第１０６項に記載 の方法。 １１１．該前脳軸索が交連軸索である請求の範囲第１１０項に記載の方法。 １１２．該中枢神経系の損傷組織が脊髄軸索である請求の範囲第１０６項に記載 の方法。 １１３．該活性未熟アストロサイトを欠く動物が１４日齢以上の動物である請求 の範囲第１０６項に記載の方法。 １１４．該移植片がニトロセルロースフィルター紙である請求の範囲第１０６項 に記載の方法。 １１５．該ニトロセルロースフィルター紙が約０．４５μｍの細孔径を有する請 求の範囲第１１４項に記載の方法。 １１６．該０．４５μｍ細孔径ニトロセルロースフィルター紙が１−ｍｍ２ホー ムプレート形片のフィルター紙である請求の範囲第１１５項に記載の方法。 １１７．該ニトロセルロースフィルター紙が約８．０μｍの細孔径を有する請求 の範囲第１１４項に記載の方法。 １１８．該８．０μｍ細孔径ニトロセルロースフィルター紙がペナント形片のフ ィルター紙である請求の範囲第１１７項に記載の方法。 １１９．該ペナント形片のフィルター紙が約３ｍｍ×０．７５ｍｍ×２５０μｍ の大きさである請求の範囲第１１８項に記載の方法。 １２０．製薬上許容可能な担体中の精製活性未熟アストロサイトからなる関連軸 索再生促進用治療組成物。 １２１．該活性未熟アストロサイトが星形、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトである 請求の範囲第１２０項に記載の組成物。 １２２．製薬上許容可能な担体中の精製胚から生後８日のアストロサイトからな る関連軸索再生促進用治療組成物。 １２３．製薬上許容可能な担体中の精製活性未熟アストロサイトからなる損傷中 枢神経系組織におけるダリア瘢痕形成減少用治療組成物。 １２４．該活性未熟アストロサイトが星形、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトである 請求の範囲第１２３項に記載の組成物。 １２５．製薬上許容可能な担体中の精製胚から生後８日のアストロサイトからな る損傷神経系組織におけるダリア瘢痕形成減少用治療組成物。 １２６．活性未熟アストロサイトが脳から抽出される請求の範囲第１２０項に記 載の治療組成物。 １２７．活性未熟アストロサイトが脳から抽出される請求の範囲第１２３項に記 載の治療組成物。 １２８．ａ）活性未熟アストロサイトを実質的に精製し、そして ｂ）有効量の該活性未熟アストロサイトを中枢神経系の損傷血管に投入して血管 再生を促進させるステップからなる中枢神経系における関連血管再生促進方法。 １２９．該活性未熟アストロサイトが星形、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトである 請求の範囲第１２８項に記載の方法。 １３０．該活性未熟アストロサイトが胚から生後８日のアストロサイトである請 求の範囲第１２８項に記載の方法。 １３１．該活性未熟アストロサイトが生後２日〜生後８日のアストロサイトであ る請求の範囲第１３０項に記載の方法。 １３２．製薬上許容可能な担体中の精製胚から生後８日のアストロサイトからな る中枢神経系における関連血管再生促進用治療組成物。 １３３．ａ）新生児マウスの大脳皮質を集め、ｂ）新生児マウスの大脳皮質を１ ｍｍ片に切断し、そして該片をカルシウムとマグネシウムを含まない最少必須培 地（ＭＥＭ−ＣＭＦ）約５ｍｌへ加え、ｃ）トリプシン（０．１％で５０容量％ ）を大脳皮質−カルシウムとマグネシウムを含まない最少必須培地混合物に加え 、そして約３７℃において約３０分間混合物をインキュベートし、ｄ）約０．０ ２５％エチレンジアミン−四酢酸約１ｍＩをＭＥＭ−ＣＭＦ約５ｍｌに加えて混 合し、そして混合物を約０１分間インキュベートし、ｅ）上澄を混合物から除き 、 ｆ）デルベロス修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中にソイビーントリプシンインヒ ビター（ＳＢＴＩ約０．５２ｍｇ／ｍｌ）、ＤＮａｓｅ（約０．０４ｍｇ／ｍｌ ）と牛血清アルブミン（約３ｍｇ／ｍｌ）を含む混合液約２−３ｍｌを混合物組 織塊に加え、ｇ）溶液中で組織塊を緩やかに混合し、ｈ）組織塊を十分に沈降さ せ、 ｉ）溶液から上澄を除き、そして１０％胎性牛血清（ＦＣＳ）を組織塊に加え、 ｊ）組織塊一胎性牛血清溶液を火研磨ピペットで滴定し、 ｋ）滴定液を最初のピペットのほぼ１／３直径の開口部を有する第２ピペットて 滴定し、ｌ）滴定液を氷上で約５分間冷却し、 ｍ）冷却した滴定液を約１分間、１００ｒｐｍで遠心分離し、 ｎ）遠心分離液から上澄含有アストロサイトを除去し、 ｏ）上澄液含有アストロサイトを約２０×１０７細胞／２５ｃｍ密度で、ポリリ シン約０．１ｍｇ／ｍｌ被覆フラスコで平板培養し、 ｐ）アストロサイトを１０００ｇの遠心分離でペレット化し、そして ｑ）ペレット化アストロサイトを、約１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中で約５０％ア ストロサイト条件培地約５ｍｌに懸濁させる ステップからなる精製母集団活性未熟アストロサイトの調製方法。 １３４．不死化活性未熟アストロサイト１３５．該アストロサイトが不死化胚か ら生後８日のアストロサイトである請求の範囲第１３４項に記載の不死化活性未 熟アストロサイト。 １３６．ａ）活性未熟アストロサイトを提供し、そしてｂ）有効量の該活性未熟 アストロサイトを脊髄の損傷血管に投与して血管再生を促進させるステップから なる脊髄における関連血管再生促進方法。 １３７．ａ）活性未熟アストロサイトを提供し、そしてｂ）有効量の該活性未熟 アストロサイトを脊髄の損傷軸索に投与して軸索再生を促進させるステップから なる脊髄における軸索再生促進方法。 １３８．ａ）活性未熟アストロサイトを提供し、ｂ）有効量の該活性未熟アスト ロサイトを移植片へ接種し、そして ｃ）該接種移植片を活性アストロサイトを欠く動物の脊髄損傷軸索へ挿入して関 連軸索再生を促進させる ステップからなる活性未熟アストロサイトを欠く動物の脊髄関連軸索再生促進方 法。 １３９．ａ）活性未熟アストロサイトを提供し、そしてｂ）有効量の該活性未熟 アストロサイトを損傷脊髄組織に投与してダリア瘢痕形成を減少させるステップ からなる損傷脊髄組織におけるダリア瘢痕形成減少方法。 １４０．該損傷血管が脊髄背側入口領域（ｄｏｒｓａｌｒｏｏｔｅｎｔｒｙｚｏ ｎｅ）にある請求の範囲第１３６項に記載の方法。 １４１．該損傷軸索が脊髄背側路入口領域にある請求の範囲第１３７項に記載の 方法。 １４２．該損傷軸索が脊髄背側路入口領域にある請求の範囲第１３８項に記載方 法。 １４３．核損傷脊髄組織が背側路入口領域の組織である請求の範囲第１３９項に 記載の方法。 １４４．該活性未熟アストロサイトが星形、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトである 請求の範囲第１３６項に記載の方法。 １４５．該活性未熟アストロサイトが星形、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトである 請求の範囲第１３７項に記載の方法。 １４６．該活性未熟アストロサイトが星形、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトである 請求の範囲第１３８項に記載の方法。 １４７．該活性未熟アストロサイトが星形、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトである 請求の範囲第１３項に記載の方法。 １４８．該活性未熟アストロサイトが胚から生後８日のアストロサイトである請 求の範囲第１３６項に記載の方法。 １４９．該活性未熟アストロサイトが胚から生後８日のアストロサイトである請 求の範囲第１３７項に記載の方法。 １５０．該活性未熟アストロサイトが胚から生後８日のアストロサイトである請 求の範囲第１３８項に記載の方法。 １５１．該活性未熟アストロサイトが胚から生後８日のアストロサイトである請 求の範囲第１３９項に記載の方法。 １５２．該移植片がニトロセルロースフィルター紙である請求の範囲第１３８項 に記載の方法。 １５３．該移植片がペナント形である請求の範囲第１３８項に記載の方法。 １５４．製薬上許容可能な担体中の活性未熟アストロサイトからなる中枢神経系 における関連血管再生促進用治療組成物。