JP3657001B2 - 脳中への細胞の移植方法およびそのための治療的使用 - Google Patents

脳中への細胞の移植方法およびそのための治療的使用 Download PDF

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Description

発明の背景
発明の分野
神経科学と医学の分野の本発明は、神経学的疾患の治療に有用な、哺乳類の脳中への細胞の移植方法に関する。
背景技術の説明
神経細胞およびニューロン様細胞を脳中へ直接に移植することは、神経系の衰弱性疾患、例えばパーキンソン病（PD）、ハンチントン病（HD）、アルツハイマー病（AD）、てんかん、および家族性自律神経異常症、並びに神経系に対する損傷または外傷からの回復を促す具体的なアプローチであろう。脳中に入れられた細胞の神経伝達物質の表現型発現に影響を与える因子をキャラクタライズすることは、神経系の通常の細部に関与するプロセスのより良い理解につながるであろうし、異常な表現型の発現より起こる生まれながらの欠陥を治療により防止し矯正する手段を示すことにつながるであろう。
ニューロンまたはニューロン様細胞は、固体組織の塊または分散させた細胞のいずれかの形で、中枢神経系（CNS）、特に脳中に移植することができる。しかし、現在までのところ、技術的および倫理的性格の多くの問題が臨床的に実施可能な移植法の開発を抑制してきた。
パーキンソン病（PD）はドーパミン作動性ニグロ線条体（nigrostriatal）ニューロンの選択的欠損から起こり、異質から線条体へのインプットの欠如をもたらす。ドーパミンを産生しうる組織の固体移植片、例えば成人の副腎髄質および胚の黒質（SN）は、ドーパミン作動性細胞の破壊のため、６−ヒドロキシドーパミン（６−OHDA）で処置したラットおよび霊長類への実験的な移植に広く用いられている（Dunnett,S.B.et al.,Brain Res.215:147−161（1981）；同上、229:457−470（1981）;Morisha,J.M.et al.,Exp.Neurol.84:643−654（1984）;Perlow,M.J.et al.,Science 204:643−647（1979））。胚SNの移植も、PD様疾患を引き起こす神経毒の１−メチル−４−フェニル−1,2,3,4−テトラヒドロピリジン（MPTP）で損傷を受けた霊長類の治療に用いられた（Redmond,D.E.et al.,Lancet 8490:1125−27（1986））。
Steneviら（Brain Res.114:1−20（1976）は、神経移植片の生存のための最適条件を調べて、最上の結果が、（ａ）胎児CNSニューロンを用いたときと、（ｂ）移植細胞を豊富な血管供給部分に隣接して入れたときに得られることを発見した。実際、当文献の概説によれば、胎児脳のほとんど全ての部分からの組織は、手順の詳細に注意を払えばうまく移植できることを明らかにしている（例えば、Olson,L.A.et al.,In:Neural Transplants:Development and Function,Sladek,J.R.et al.,eds,Plenum Press,New York,1984,pp.125−165を参照）。
胚の組織は外来環境において分化を起こし、宿主組織と一体化する細胞のすぐれた供給源を提供する。例えば、６−OHDAで処置したラット中への胚SNの移植は、ドーパミンを産生し、アポモルフィン−またはアンフェタミン−誘導回転を減少させ、感覚欠損を緩和し、宿主の線条体中でシナプスを作ることがわかった（上記のDunnett et al.,Morisha et al.,Perlow et al.）。移植されたニューロンも自発的な活性があり、通常の成熟SNニューロンに似ている（Wuerthele,S.M.et al.,In:Catecholamines,Part B,（E.Usdin et al.,eds.）,A.R.Liss,Inc.,New York,pp.333−341）。
胎児神経組織の成功した移植とは対照的に、成熟CNSニューロンは移植組織中で生き続けられないことが判明した（Stenevi,U.et al.Brain Res.114:1−20（1976））。胎児CNSニューロンは移植処置に耐えるのに対し、成熟ニューロンは耐えない理由は確かでないが、おそらくいくつかの因子に関連している。第一に、胎児ニューロンは成熟ニューロンよりも低い酸素量により影響を受けることが少なく（Jilek,L.,In:Developmental Neurobiology,Himwich,W.A.,ed.,C.C.Thomas Publisher,Springfield,IL,1970,pp.331−369）、それに移植処置は移植片への十分な血液供給が確立するまで、酸素欠乏症の期間が必ず伴う。第二に、胎児ニューロンは、急速な成長期の間で、かつ標的組織との連結が確立される前に採取されるとき最もよく生き残るように思える（Boer,G.J.et al.,Neuroscience 15:1087−1109,（1985））。また、胎児組織は、損傷した宿主の脳の環境中に存在することが知られている成長（または「生存」）因子に特に応答するようだ（Nieto−Sampedro,M.et al.,Science 217:860−861（1982）;Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6250−6254（1984））。
しかし、胎児組織と細胞移植片の有望的期待にもかかわらず、当該技術は、人間医学で胎児組織の利用に付随する倫理的、道徳的および法律的問題のために、移植用のドナー組織の代わりとなる供給源に関心が向けられることになった。これらの供給源として、器官ドナーおよび培養細胞系からの神経細胞と傍神経細胞がある（例えば、Gash,D.M.et al.,In:Neural Grafting in the Mammalian CNS,Bjorklund,A.et al.,eds,Elsevier,Amsterdam,1985,pp.595−603;Gash,D.M.et al.,Science 233:1420−22（1986）を参照）。
移植法を用いる初期の臨床的実験は、長期にわたる効果をもたらさなかったが、ある研究の当初の報告は、より期待できるように思われた（Madrazo et al.,Soc.Neurosci.Abstr.12:563（1986）；大要に関しては、参照によりここに引用されるLieberman,A.et al.,Adv.Tech.Stand.Nerosurg.17:65−76（1990）を参照）。さらに別のいくつかの観察は、移植副腎細胞が実行可能なアプローチであることを示唆している。副腎髄質細胞は神経稜に由来するもので、交換神経系ニューロンのように、インビボまたはインビトロで突起を神経成長因子（NGF）に応答して成長させる（Unsicker,K.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3498−3502（1978））。幼若ラットからの副腎髄質の固体移植片は、６−OHDAで処置されたラットの脳中で少なくとも５カ月間生き続け、ドーパミンを作り、アポモルフィン誘導回転を減少させることができる（上記のDunnett et al.;Freed.W.J.et al.,Ann.Neurol.8:510−519（1980）;Freed,W.J.et al.Science 222:937−939（1983））。これらの観察から、適当な環境が与えられれば、副腎髄質細胞は脳組織中へカテコールアミン合成性の繊維を成長させる潜在能力を持つことが示唆される。
クロム親和性細胞の神経分化の潜在能力は、ラット線条体中に導入されると突起を成長させる解離した副腎クロム親和性細胞の移植によって更によく解明されている。培養された副腎髄質細胞もNGFの存在下で培養すると、突起を有するニューロン様細胞に分化する（上記のUnsicker）。副腎細胞のこの注目すべき適応性は、形態学的のみならず、神経伝達物質の表面型の発現においても観察されている。血管作動性腸ペプチド、ならびにモノアミン、セロトニンなどの多数の神経ペプチド群が副腎髄質細胞中にカテコールアミンとともに共存して局在している（Schultzberg,M.Neurosci,3:1169−1186（1978）;Lundberg,J.M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4079−4082（1979））。これら多様な表現型の発現は外因性シグナルにより調整することができる。例えば、エンケファリンおよびVIPの発現は、動物をニコチン遮断薬で処置することによるインビボでの副腎の神経除去の後、またはインビトロで副腎細胞を維持した後に増加する（Tischler,A.S.Life Sci.37:1881−1886（1985））。これらの観察は、神経稜に由来するニューロンが正常な発達の間に（Bohn,M.C.et al.,Devel.Biol.82:1−10（1981）;Jonakait,G.M.et al.Devel.Biol.88:288−296（1981））または微視的環境の実験的操作後に（LeDouarin,N.M.Science 231:1515−1522（1986））表現型を変えることができることを示す他の研究の観察と一緒に考えてみれば、将来的には、移植の前および／または後で、移植された細胞により発現される神経伝達物質の表現型をコントロールすることが可能になるこもしれないことを示唆するものである。
組織の塊に比較して、ばらばらにした細胞を移植することの別の利点は、移植前に成長因子などの多様な物質とともに細胞を前もって培養できること、または分化の特別なパラメータを促進する他の細胞もしくは物質とともに細胞移植を行なうことができることにある。さらに、グリア細胞は特別な局所的効果を持ち、神経成長因子を作ることができる（Barbin,G.et al.,Devel.Neurosci.7:296−307（1985）;Schurch−Rathgeb,Y.et al.,Nature 273:308−309（1978）;Unsicker,K.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:2242−2246（1984）;Whitaker−Azmitia,P.M.et al.,Brain Res.497:80−85（1989））。このことは、グリア由来の因子を産生する特定の型のグリアとともに所望の神経伝達物質を提供する細胞を共移植することが、神経成長と移植細胞の所望の分化を促進するかもしれないことを示唆している。
従って、移植方法の実施可能性は実験的に確立されている。しかし、この方法は、限定された利用性と大きな政治的結果を有する胎児組織の使用の必要性により厳しい限定を受けている。根本的に、中絶妊娠からのヒト胎児組織の移植はアメリカ合衆国では禁止されている。従って、もし、成熟組織の脳中への移植の成功のために、簡単で、日常的でしかも安全な方法が衰弱性神経疾患の治療に利用できたとしたら、大きな利益を持ったことであろう。
Aebischerと彼の共同研究者は、選択的透過性の生体適合性ポリマーカプセルを脳中に移植することに成功したが、これはこの環境において生き続けることのできる神経組織の断片をカプセル化したものである（Aebischer,P.et al.,Brain Res.448:364−368（1988）;Winn,S.R.et al.,J.Biomed Mater Res.23:31−44（1989）。ポリマーカプセルは、ポリ塩化ビニルのアクリル性共重合体XM−50からできていた。そのような選択透過性材料は、宿主細胞によるカプセル化組織への侵入とおそらくは抗体とウイルスによる侵入も膜の透過性に基づいて完全に防いだ。ドーパミン放出ポリマー・ロッドをそのような選択透過性ポリマー中にカプセル化して、神経除去されたラットの線条体に移植したときに、実験的に誘導されたパーキンソン病症候群の軽減が達成された（Winn S.R.et al.,Exp.Neurol.105:244−50（1989）。さらに、米国特許第4,892,538号（Aebischer et al.1990年１月９日に公布）は、外部環境に存在するウイルス、抗体および他の有害な薬剤を排除するが、神経伝達物質の拡散を可能にする半透性膜内の分泌細胞からなる、神経伝達物質の輸送のために被検者に移植する細胞培養装置を開示している。半透性の膜はアクリル性共重合体、ポリフッ化ビニリデン、ポリウレタン、ポリアルギネート、セルロースアセタール、ポリスルホン、ポリビニルアルコール、ポリアクリロニトリル、またはそれらの誘導体または混合物からなり、分子量が50kDまでの溶質の拡散を可能にするものである。この装置は、神経伝達物質、前駆体、アゴニスト、フラグメント等を標的領域、特に脳に、接続的に局所輸送することによって、パーキンソン病などの神経伝達物質欠損状態の治療に有用であるといわれている。この装置は、回収可能にすることができるので、内容物を新しくしたり、補給することができ、そして細胞は免疫学的応答およびウイルス感染に対して防御されている。
発明の要約
本発明者らは、最初に細胞をインビトロで支持体マトリックス、例えば直径90μｍのガラスビーズ上で培養することにより、成熟したCNSニューロンまたは培養細胞などの細胞を首尾よく哺乳類の脳に移植することができるという予期できない発見をした。細胞が付着するビーズをレシピエントの脳中に走触性的に注入する。このように注入された細胞は生存力を保ち、従って効果的に移植することができる。種の障壁を超えて移植されたときでさえ、細胞はインビボで長期の存在と生存力を示す。
本発明の目的は先行研究の上記の欠陥を克服することである。
本発明は、細胞が支持体マトリックスに付着するように細胞を支持体マトリックスとともに培養し、付着した細胞を有する支持体マトリックスを脳中に移植することからなる、哺乳類被検者の脳への細胞の移植方法を提供する。
本方法は、ガラスおよび他の酸化ケイ素、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ボリペンテン、アクリロニトリルポリマー、ナイロン、アミラーゼ、ゼラチン、コラーゲン、デキストランおよびセルロース（例えばニトロセルロース）などの天然および修飾多糖類、寒天およびマグネタイトから作られた支持体マトリックスを含むものである。好適な支持体マトリックスはビーズであり、特に直径が約90から約150μｍまでのマイクロビーズである。
本発明の方法は、多くの異なるタイプの細胞、好適には神経または傍神経由来の細胞、例えば副腎クロム親和性細胞を用いることができる。インビトロで生育させた細胞系も有用である。繊維芽細胞などの神経または傍神経に由来しない細胞も、神経ペプチド、または神経伝達物質の生産に寄与する酵素または一組の酵素、または神経成長因子をコードするDNAによるトランスフェクション後に用いてもよい。
本発明は、上記の方法により、疾患を治療できる効果的な数の細胞を移植することからなる、被検者の神経学的疾病の治療方法を包含するものである。本発明により治療できる疾病には、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、てんかん、家族性自律神経異常症、および外傷性の脳損傷があるが、これらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
図１は、ガラスマイクロビーズ上の成熟副腎髄質細胞を移植したラット脳の断面図の光学顕微鏡写真である。この断面図は、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）を西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて組織化学的に固定・染色したものである。暗く染色された部分は、THを含む細胞を示している。染色パターンは、切片に入ったニードル管を右側に示している。中央の大きな円形染色部分は、移植された細胞の塊を示している。注入された細胞は、一部がニードル管まで後方に延びて、「腺様」パターンを形成している。（厚さ:20ミクロン；倍率:100×）
好適な実施態様の説明
本発明は、通常は哺乳類の脳中に移植および生存のできない成熟細胞または培養細胞を最初に支持体マトリックスに付着させることにより生存させることができるという本発明者らの予期されなかった発見に基づいている。
多くの異なるタイプの細胞が本発明に有用である。典型的には、細胞はレシピエントの脳に欠落している物質を提供する能力に基づいて選択されるであろ。欠落物質とは、神経伝達物質か他の神経活性分子であり、それらの欠如が神経学的疾患か機能障害をもたらす物質である。移植された細胞は、一度レシピエントに挿入されると腫瘍として成長しないことが重要である。
以下に挙げる文献は、特別に引用されるかどうかにかかわらず、参照により全て本文中に引用されるものとする。
「神経または傍神経由来の」という用語は、胚神経稜に由来する細胞を意味する。傍神経由来の細胞の好適な例は、副腎髄質クロム親和性細胞である。哺乳類の副腎髄質の前駆体細胞は神経稜に由来し、ニューロン系もしくは内分泌系の分化に沿って発達する能力を有する（Bohn,M.C.et al.,1981,上記,Devel.Biol.89:299−308（1982）;Unsicker,K.,Develop,Biol.108:259−268（1985））。ラット、サル、およびヒトの副腎髄質からのクロム親和性細胞は、副腎皮質の影響から離されて、神経成長因子（NGF）にさらされると、内分泌腺表現型から神経表現型に変化する（Notter,M.F.et al.,Cell Tiss.Res.244:69−70（1986）;Stromberg,I.et al.,Exp.Brain Res.60:335−349（1985）;Unsicker,K.et al.,1978上記）。副腎クロム親和性細胞は、大脳皮質組織または海馬組織とともにラットの眼の前室に共移植すると、共移植を受けた近接の脳組織を刺激し発達させる神経繊維を形成する（Olson,L.A.et al.,Exp.Neurol.70:414−426（1980））。もう一つの別のタイプの傍神経細胞は網膜色素上皮細胞である（Song,M−K et al.,J.Cell.Physiol.148:196−203（1990））。
ドナー細胞の一つの供給源は、確立された神経細胞系である。発生のモデル系として広く用いられてきた多くのニューロンクローンが存在するが、これは、これらクローンが適当な表面レセプター、特異的な神経伝達物質、シナプス形成性および形態学的、生化学的に正常なニューロンに分化する能力を持って、電気的活性があるためである。神経系はCNSニューロンで見られる遺伝的発現に対応する膨大な量の遺伝情報を発現することができる。そのような細胞は以下の文献に記載がある:Kimhi,Y.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73:462−466（1976）,In:Excitable Cells in Tissue Culture,Nelson,P.G.et al.,eds.,Plenum Press,New York,1977,pp.173−245）;Prasad,K.M.et al.,In:Control of Proliferation of Animal Cells,Clarkson,B.et al.,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1974,pp.581−594）;Puro,D.G.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73:3544−3548（1976）;Notter,M.F.et al.,Devel.Brain Res.26:59−68（1986）;Schubert,D.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 67:247−254（1970）;Kaplan,B.B.et al.,In:Basic and Clinical Aspects of Molecular Neurobiology,Guffrida−Stella,A.M.et al.,eds.,Milano Fondozione International Manarini,1982））。
これら培養細胞の重要な利点は、表現型および遺伝子型をコントロールする際に、環境ならびに細胞それ自体を操作する能力にある。
例えば、IMR32細胞系からのヒト神経芽細胞腫細胞が、移植後９カ月間、霊長類の脳中で生き続けてコリン作動性マーカーを発現できる（Gash,D.M.et al.,Science 233:1420−22（1986））。これらの細胞は、好適には形態学的ならびに生化学的にインビトロで分化するように処置され、移植前に、永久に無糸分裂とされなければならないが、これは細胞の生存をさらに助けるものである（Gash et al.,上記;Gupta,M.et al.,Dev.Brain Res.19:21−29（1985））。
成熟ラットの線条体中に移植された未処理の褐色細胞腫／神経芽細胞腫の細胞（PC12細胞）は、インビボで２週間後の生存を示さなかった（Hefti,F.et al.,Brain Res.348:283−288（1985））が、ニューロン分化を促進するNGFでインビトロで処置した後に細胞増殖を抑制する抗有糸分裂剤にさらすことは、カテコールアミン神経伝達物質の発現にも生存力にも有害な影響を与えず、移植後の刺激促進に価値があるものである。従って、本発明の一つの実施態様において、細胞の生存を促しかつ悪性能力の発現を防ぐために、細胞系の細胞は、適当な成長因子もしくは分化因子により、および移植前に抗有糸分裂剤によりインビトロで調整される。
通常の方法を用いるインビトロのクローン細胞の神経細胞表面の試験により、本発明に従って使用される適当な細胞の選択が可能であることは当業者にとって明白であろう。正常な発生と分化の間に、ニューロン細胞の表面は、CNS中でのニューロンの移動、認識および一体化の原因となる著しい変化を受ける。例えば、マウスC1300クローンのニューロン細胞系を、プロスタグランジンE1および環状AMPなどの抗有糸分裂剤または成長調節剤で処置すると、低分子量の新しい細胞表面糖タンパク質が作られる（Bottenstein,J.E.,In:Functionally Differentiated Cell Lines,Sato,G.H.,ed.,Alan R.Liss,New York,1981）。破傷風毒素に結合するCNS表面ガングリオシドが誘導されるが（Notter,M.F.,1986、上記）、一方、通常の中枢神経系糖タンパク質に類似する特定のレクチン結合性糖タンパク質が現われる。さらに、神経伝達物質と神経ペプチドに対する神経芽細胞腫細胞上のレセプターは、CNS中に見られる細胞と類似する方法により修飾することができる（Costa,L.G.et al.,Biochem.Pharmacol.91:3407−3413（1982））。
可能な移植材料のもう一つの重要な供給源は、単一ニューロンを不死化することができる方法である体細胞ハイブリダイゼーションによって作られた細胞である。体細胞ハイブリダイゼーションは、多様な遺伝子型を持つ細胞系を作るためのみならず、分化の多様な表現型の発現を調節する機構を分析するためにも用いられる強力な細胞生物学的道具である。特定遺伝子の発現が異なる細胞を融合することは、遺伝子発現を調節する機構の研究を可能にするが、染色体の変更が遺伝学的に異なる細胞系を作る率で生じる。分化した細胞の性質を保持するハイブリッド細胞を形成することができる。交感神経節と神経芽腫細胞の融合から得られるハイブリッドはドーパミンを合成することができるが（Greene,L.A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:4923−4927（1975））、脳細胞ハイブリッドはコリンアセチルトランスフェラーゼを発現する（Minna,J.D.et al.,Genetics 79:373−383（1975））。従って、CNSからのドーパミン作動性ニューロンに対する胚前駆体は分裂細胞と融合して、経時的に余分な染色体を失う単一のゲノム中に両方のゲノムを取り込んで、新しいハイブリッド系となる。そのようなハイブリッドの神経または傍神経の細胞を過度の実験を行なうことなしに作り、それらを所望の特質、例えばドーパミン分泌についてスクリーニングし、移植に最高の能力を持つ細胞を選択することは当業者の技量の範囲内にある。
本発明による移植のための細胞のもう一つの供給源は、副腎髄質である。神経稜に由来するこの組織は、PDを治療するための臨床的試験に関与している（「背景」を参照）。成熟したサルの副腎髄質はインビトロで少なくとも約３週間、単一の細胞として培養することができる（Notter,M.F.et al.,Cell Tiss.Res.244:69−76）1986））。これら細胞は、上皮様、腺状の形態から、細胞が微細管アレイを含む広範な神経突起の分岐を示すニューロンの形態への表現型の変化により、NGFに応答する。このニューロンの表現型は、宿主CNS中でのラット髄質細胞の長期生存およびそれら細胞の宿主組織との一体化に重要であるように思われる（上記Stromberg,L.et al.）。移植された副腎髄質組織は、ラットにおけるニグロ線条体ドーパミン欠損から起こる機能的欠損を治すことができる（例えば、上記Freed et al.,1981を参照）。しかし、これは、移植の３〜６カ月後に減少する現象である移植片からのドーパミンの拡散によりもたらされると考えられる。移植細胞のNGF処理は、移植片から宿主への繊維成長を誘導して、さらに長く続く挙動の回復（少なくとも１年間）を誘導する。実際、NGF処理なしには、ラット（上記Feed et al.）またはアカゲザルの尾細胞核（Morihisia,J.M.et al.,Exp.Neurol.84:643−653（1984））のどちらかに先行技術の手法を用いて移植されたクロム親和性細胞は、ほとんどが生き続けることがない。同じように、網膜色素上皮細胞は、ドーパミンと他の因子を分泌し、本発明による脳移植に用いてもよい（Li,L.et al.,Exp.Eye Res.47:771−785（1988）;Lui,G.M.et al.,Proc.Int'l.Soc.Eve Res.6:172（1990）;Li,L.et al.,Inv.Ophthal.Vis.Sci.31（Suppl）:595（1990,abstr.2915−13）;Sheedlo,H.J.et al.,同論文中,abstr.2916−14;Fektorovich,E.G.et al.,同論文中（abstr.2917−15）；上記Song,M−K et al））。
本発明に従って哺乳類の脳中に移植された細胞は、成長因子の添加がない状態で生存を示した。しかし、本発明のさらに別の実施態様は、移植前にインビトロで、移植後にインビボで、またはその両方で、適当な成長／分化因子による処置と組み合わせた支持体マトリックス付着細胞の移植に向けられている。
ヒト副腎髄質細胞は、ニューロン表現型を有して少なくとも９週間インビトロで維持することができる（Notter,M.F.et al.,Schmitt Neurol.Sci.Symp.,Junu 30,1987,abstr.）。NGFはこの変換を腺状の状態から誘導する。C6神経膠腫細胞とともに培養された副腎髄質細胞は、広範な神経突起の分枝を示し、かつ神経膠腫細胞との密接な接触を示す。有糸分裂を抑制するために、抗有糸分裂剤で処理したこれらの星状膠細胞は、インビトロで交換神経ニューロンを支持するNGFに似た成長因子を産生することが知られている（Barde,Y.A.,Nature 274:818（1978））。移植されたグリア細胞は、ニューロンの機能回復に重要な役割を果たしているかもしれないし、栄養因子の重要な供給源かもしれない（Doering,L.C.et al.,J.Neurolog.Sci.63:183−196（1984）;Gumple,J.et al.,Neurosci.Lett.37:307−311（1984））。従って、本発明のもう一つの実施態様は、神経または傍神経の細胞をグリア細胞とともに培養し、それら細胞を支持体マトリックスとともにインキュベートして、その後に両方のタイプの細胞を有する支持体マトリックスを移植することからなるものである。
本発明のさらに別の実施態様では、神経もしくは傍神経に由来しないが、神経学的興味のある物質を産生するように変更された細胞を用いる。好適なタイプの細胞は入手および培養が簡単で、本発明の方法を用いたラット脳中への移植で生き続けるヒト包皮繊維芽細胞である（例IIIを参照）。本発明で使用するために、細胞は、公知の方法を用いて遺伝学的に変更して、神経成長因子、神経伝達物質、神経ペプチド、または脳の代謝に関与する酵素を発現させる。（例えば、Gage,F.H.et al.,Neuroscience 23:795−807（1987）;Rosenberg,M.B.et al.,Science 242:1575−1578（1988）;Shimohama,S.et al.,Mol.Brain Res.5:271−278（1989）を参照；これらは参照によりここに引用される）。参照によりここに引用される組換えDNA技術と細胞生物学の一般原理を説明する標準的な文献として、Watson,J.D.et al.,Molecular Biology of the Gene,Volumes I and II,Benjamin/Cummings Publishing Co.,Inc.,Menlo Park,CA（1987）;Darnell,J.E.et al.,Molecular Cell Biology,Scientific American Books,Inc.,New York,NY（1986）;Lewin,B.M.,Genes II,John Wiley ＆ Sons,New York,NY（1985）;Old,R.W.et al.,Principles of Gene Manipulation:An Introduction to Genetic Engineering,2nd Ed.,University of California Press,Berkeley,CA（1981）;Maniatis,T.,et al.（Molelcular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY（1982））;Sambrook,J.et al.（Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY（1989）and Albers,B.et al.,Molecular Biology of the Cell,2nd Ed.,Garland Publishing,Inc.,New York,NY（1989）などがある。
本発明の方法に有用な組換えDNA分子は、多様ないかなる手段、例えばDNAまたはRNA合成、またはより好適には組換えDNA技術の適用により作ることができる。そのような分子の合成技術は、例えば、Wu,R.,et al.（Prog.Nucl.Acid.Res.Molec.Biol.21:101−141（1978））に開示がある。組換え分子を構築する手順は、上記のSambrookらにより詳しく開示されている。
典型的には、対象の遺伝子または複数の遺伝子を（該遺伝子を発現することのできる細胞からの）DNA、より好適にはcDNAを発現ベクター中にクローニングすることにより作製した発現ベクターのライブラリーからクローン化する。次に、そのライブラリーから、対象の遺伝子産物に特異的な抗体と結合する抗体を用いて、遺伝子産物、例えば神経伝達物質合成酵素を発現することのできるメンバーのスクリーニングを行なう。対象の遺伝子産物を発現することのできる細胞から、DNA、より好適にはcDNAを抽出精製する。精製cDNAを断片化し（剪断、エンドヌクレアーゼ消化等による）、DNAまたはcDNAフラグメントのプールを作る。次に、このプールからのDNAまたはcDNAのフラグメントを発現ベクターにクローン化して、それぞれが唯一のクローン化DNAまたはcDNAのフラグメントを含む発現ベクターのライブラリーを作る。
「発現ベクター」とは、ベクター中にクローン化されたDNA（またはcDNA）分子を（適当な転写および／または翻訳調節配列の存在のために）発現することができ、それにより、ポリペプチドまたはタンパク質を生産することのできるベクターである。発現ベクターを適当な宿主細胞に導入すると、クローン化された配列の発現が起こる。適当な哺乳類の宿主細胞は、クローン化された配列を発現できればいかなる哺乳類の細胞であってもよい。cDNAの調製手順と遺伝子ライブラリーの作製手順は、Sambrookら（上記）により開示されている。
本発明のために発現が望まれる産物もしくは複数の産物をコードするDNA配列は、連結のための平滑末端または付着末端、適当な末端を作る制限酵素消化、適宜に付着末端の修復、望まれない連結を避けるためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および適当なリガーゼによる連結などの通常の手法に従ってベクターDNAに再結合できる。そのような操作技術は、上記のSambrookにより開示されており、当業者にはよく知られているものである。
DNAなどの核酸分子は、もし、それが転写および翻訳調節情報を含むヌクレオチド配列を含み、そのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「操作可能に連結されている（operably linked）」ならば、ポリペプチドを「発現することができる」と言われる。操作可能な連結とは、調節DNA配列と発現を望むDNA配列とが遺伝子発現を可能にするように結合している連結である。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は生物により異なるであろうが、原核生物においては、（RNA転写を開始させる）プロモーターとRNAに転写されたときにタンパク質合成開始のシグナルを出すDNA配列の両方を含むプロモーター領域から一般には成るものである。そのような領域としては、通常、転写および翻訳の開始に関与する5'−非コード配列、例えばTATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列などがある。
所望ならば、タンパク質をコードする遺伝子配列の3'側の非コード領域を上に記載の方法により得ることができる。この領域は、終止およびポリアデニル化のようなその転写終止調節配列のために保持されているようだ。従って、タンパク質をコードするDNA配列にもともと近接する3'−領域を保持することにより、転写終止シグナルが提供できよう。転写終止シグナルが、発現宿主細胞中で十分に機能しない場合は、宿主細胞中で機能する3'領域と置換してもよい。
２つのDNA配列（例えば、プロモーター領域配列とコード配列）は、もし、その２つのDNA配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさず、（２）コード配列の転写を指示するプロモーター領域配列の能力を妨げないか、（３）プロモーター領域配列により転写を受けるコード領域の能力を妨げないならば、操作可能に結合されていると言える。プロモーター領域は、もしそのプロモーターがDNA配列の転写に影響を与えることができたとすると、DNA配列に操作可能に結合されているといえよう。従って、タンパク質を発現するためには、宿主細胞により認識される転写および翻訳シグナルが必要である。
プロモーターは、RNAポリメラーゼに結合することができ、「操作可能に連結された」核酸配列の転写を促進することのできる２本鎖のDNAもしくはRNA分子である。ここで用いる場合、「プロモーター配列」は、RNAポリメラーゼにより転写されるDNAかRNA鎖上に存在するプロモーターの配列である。「プロモーター配列相補体」は、その配列が「プロモーター配列」の相補体である核酸分子である。従って、一本鎖「プロモーター配列相補体」に隣接するプライマーDNAもしくはRNAの伸長、すなわち「プロモーター配列」の伸長の際に、もし、その伸長が「プロモーター配列」または「プロモーター配列相補物」に向かって進むならば、機能的プロモーターを含む２本鎖分子が作られる。この機能的プロモーターは、「プロモーター配列」を含む２本鎖分子の鎖（「プロモーター配列相補体」を含む分子の鎖ではない）に操作可能に連結した核酸分子の転写を指示するであろう。
本発明のための細胞作製に有用なプロモーター配列は、真核細胞もしくはウイルス性のどちらかである。適当なプロモーターは抑制的か、または、より好適には構成的なものである。有用な真核細胞のプロモーターとして、マウス・メタロチオネインＩ遺伝子のプロモーターがある（Hamer,D.,et al.,J.Mol.Appl.Gen.1:273−288（1982））;the TK promoter of Herpes virus（McKnight,S.,Cell 31:355−365（1982））;the SV40 early promoter（Benoist,C.,et al.,Nature（London）290:304−310（1981））。好適なプロモーターは、特にヒト繊維芽細胞用としては、コラーゲンプロモーターである（Prockop,D.J.et al.,N.Eng.J.Med.301:13−23,77−85（1979）;Eyre,D.R.,Science 207:1315−1322（1980）;Martin,G.R.et al.,Trends Bioch.Sci.10:285−287（1985）；これら文献は参照によりここに引用される）。
本発明に従って支持体マトリックスに付着させた細胞も、本発明の範囲に入ることが意図されるもので、これらは公知の方法を用いて凍結して凍結状態で保存する。解凍後、マトリックスに結合した細胞はレシピエント脳中に移植する。
本発明の方法に有用な細胞は異種発生のもの（＝異種、すなわち宿主とは異なる種に由来するもの）、同種間のもの（＝相同、すなわちレシピエントと同じ種の遺伝的に異なるメンバーに由来するもの）または自己由来のもの（ここではレシピエントもドナーとしても役立つ）でもよい。
本発明の目的を達成するために必要とされる細胞の数は、被験者のサイズ、年令、体重、内在する病気の性質、同時に行なわれている他の治療等により変えることができる。このことは、過度の実験を必要とせずに当業者により決定することができる。ヒト成人において、支持体マトリックスに付着させた細胞の効果的な数は、約１×103〜約１×107細胞の範囲にあり、より好適には約５×103〜約１×106細胞の範囲にある。その代わりとしては、移植細胞の効果的な量は、ビーズの体積に加えられた細胞の量に基づいて決定することができ、例えばビーズ1mlにつき40mgの細胞量である。
支持体マトリックスを構成することのできる材料としては、インビトロのインキュベーション後に細胞が吸着し、その上で細胞が成長でき、移植細胞を破壊するか細胞の生物学的または治療的活性に干渉する毒性反応、炎症または神経膠症反応を起こさずに哺乳類の脳中に移植することができる材料がある。そのような材料として、ガラスおよび他の酸化シリコン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、フッ素化ポリビニリデン、ポリウレタン、ポリアルギネート、ポリスルフォン、ポリビニルアルコール、アクリロニトリルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ポリペンテン、ナイロン、アミラーゼ、ゼラチン、コラーゲン、デキストランおよびセルロース（例えばニトロセルロース）などの天然および修飾多糖類、寒天、およびマグネタイトがあるが、これらに限定されるものではない。再吸収性または非再吸収性の材料も用いることができる。
本発明の支持体マトリックスは、Aebischerと彼の共同研究者に記載されたもの（上記参照）とは以下の点において異なる：本発明に従うと、細胞は支持体の外側表面に付着する；細胞は、閉じられた室内にカプセル化されてはおらず、この室内においては、開示されたカプセル化支持体の排除容量を所与のものとすると、細胞の生存は疑わしいものとなるであろう。さらに、本発明の支持体マトリックスは、低分子量物質は通過させるが巨大分子（＞50kD）は排除させるAebischer装置の選択的透過性などの材料が特別な透過性を持つという必要要件を提出しない。
支持体の形状は、好適にはビーズなどの球状であるが、円柱状、長円形、平坦シートまたはストリップ、針またはピンの形等々であってもよい。支持体マトリックスの好適な形態はグラスビーズである。もう一つの好適なビーズはポリスチレンビーズである。ビーズの大きさは、直径が約10μｍ〜1cm、好適には約90〜150μｍの範囲にある。多様なマイクロキャリアー・ビーズの記載については、例えば、Fisher Biotech Source 87−88,Fisher Scientific Co.,1987,pp.72−75;Sigma Cell Culture Catalog,Sigma Chemical Co.,St.Louis,1991,pp.162−163;Ventrex Product Catalog,Ventrex Laboratories,1989を参照；これら引例は参照によりここに編入される。ビーズの大きさの上限は、移植された細胞の機能に干渉もしくは回りの脳組織に対する損傷を引き起こすかもしれない神経膠症などの望まれない宿主反応のビーズによる刺激・促進により決まる。そのような限定は当業者により容易に決定できるものである。
細胞の付着、生存および機能を向上させるために、細胞の吸着、生存および機能を向上させることが公知のファクターを固体マトリックスの外部表面に随意に被覆してもよい。そのようなファクターとして、細胞付着分子、細胞外マトリックス、例えばフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチン、グリコサミノグリカン、またはプロテオグリカン（上記のAlbers,B.pp.802−834を参照）または成長因子、例えばNGFなどがある。その代わりとしては、もし、移植された細胞が付着した固体マトリックスが多孔性材料から作られているのなら、成長または生存促進因子またはその複数の因子をマトリックス材料中に取り込むことができ、移植後にインビボで徐々に放出されるであろう。
本発明の別の実施態様において、再吸収性マトリックス（例えばコラーゲン）上で生育する細胞は、神経再成長か回復を促進するために、脳以外の神経学的に興味のある部位に移植することができる。例えば、本発明のマトリックスに結合した細胞は、脊髄中に移植してもよいし、視覚神経中もしくはそれに隣接して入れてもよい。
本発明の方法は、多くのヒト神経学的疾患の治療に有用である。パーキンソン病は、本発明に従いドーパミン生成細胞を宿主の線条体に移植することにより治療することができる。アルツハイマー病（AD）は、核バサリス（basalis）のコリン作動性細胞の欠損が関与する。従って、本発明により、ADを有するかその危険がある対象体にアセチルコリンを作る細胞を移植してもよい。
ハンチングトン病は、尾（caudate）の核と被殻（putamen）のヘッドの全体的な消耗が関与するもので、通常は脳回の中程度の病気を伴う。ハンチングトン病に苦しむ被験者は、神経伝達物質であるガンマアミノ酪酸（GABA）、アセチルコリン、またはその混合物を作る細胞の移植により治療することができる。本発明によれば、そのような細胞が結合する支持体マトリックス材料は、好適には尾と被殻に移植される。
てんかんは実際は単一の病気ではなく、むしろ潜在的にある異常により起こされる症状である。当業者は、それぞれのてんかん被験者が個々にユニークな損傷もしくはてんかん病巣を持つことを理解するであろう。そのような病巣は、当業者によく知られている脳波記録法およびコンピューター化された軸断層撮影法および核磁気共鳴画像を含む診断方法の組み合わせを用いて場所の特定ができる。
てんかんに苦しむ患者は、本発明に従い、GABA生産細胞が付着した支持体マトリックス材料を影響を受けている部位に移植することにより治療することができる。脳中のグルタメート・レセプターおよびNMDAレセプターの遮断薬が実験的なてんかんをコントロールするために用いられてきたので、刺激性アミノ酸経路を遮断する分子を作る細胞を本発明に従って用いることができる。従って、スペルミジンなどのポリアミンを通常よりも多い量で作るように、ここに記載の通り修飾した細胞の移植は、てんかん治療に用いることができよう。
本発明の方法は、本発明の方法の有利な効果を経験できるどんな哺乳類への使用も意図されるものである。そのような哺乳類として、ヒトが最初に挙げられるが、本発明はそのような限定を意図するものではなく、獣医学使用にも応用できる。
ここまでに本発明の一般的な記載を行なったが、同じことが、実例として挙げられた以下の実施例を参照すれば容易に理解されるであろうが、本実施例は、特に断りのない限り本発明の限定を意図するものではない。
実施例Ｉ
成熟ラットからの副腎クロマフィン細胞を公知の方法に従って調製した（Inoue,M.et al.,A.J.Physiol.257（Cell Physiol.26）:C906−912（1989）を参照）。ネンブタールによる麻酔の後、頭を切除して殺し、副腎を除去した。注意深い顕微解剖により、髄質から被膜および皮質物質を取り除いた。組織を２片もしくは３片に切断して、140mM NaCl、5mM KCl、5.2mM MgCl2、5mM HEPES、10mM D−glucoseを含むpH7.4のカルシウムを含まない平衡塩類溶液中の0.2％コラゲナーゼとともに30分間インキュベートした。この酵素処理後、調製物を99.9％O2をあわ立たせることによりやさしく振とうした。消化後、組織を上記の塩溶液で３〜４回洗浄し、次にパスツールピペット中でやさしく粉砕した。
血清を含まない培地を入れた細胞培養用フラスコ（Ventrex PCl）に、ばらばらにしたクロマフィン細胞を移し、37℃で５％CO2雰囲気中で一晩培養した。これらの条件下では、細胞は２〜３日以内の生存度を維持する。滅菌したグラスビーズ（Ventrex、90ミクロン）を培養フラスコに入れた。細胞はビーズに付着し、基本的にはビーズ上に単層を形成した。インビトロでの調製の24時間以内に、細胞が付着したビーズ懸濁液の１〜５μｌのアリコートを麻酔した成熟ラットの脳中に注入した。その後の分析（細胞が培養では生存しなくなったとき）において、細胞はインビボで注入のまわりの部位で生存していることが見いだされ、これは、Weiner法によるチロシンヒドロキシラーゼの免疫細胞化学的染色（Kilpatrick,D.L.et al.,J.Neurochem.35:679（1980）;Hokfelt,R.et al.,Handbook of Chemical Nuroanatomy,Elsevier Science Publishers,Amsterdam（1985）を参照）によって決定された（図１を参照）。ガラスビーズは、注入自体に特有の壊死的損傷以上の損傷を引き起こさなかった。
実施例II
副腎髄質を成熟モルモットから実施例Ｉに記載の方法に従って取り出し、実施例Ｉに記載の方法を用いた。ガラスマイクロビーズ上に付着した細胞をラット脳に注入した。細胞は少なくとも21日間、完全な健康状態で生き続けた。どんな免疫学的拒絶の兆候も見られなかった。
実施例III
培養したヒト包皮繊維芽細胞を上記のようにガラスマイクロビーズに付着させて、これをラット脳に注入した。細胞の局在する場所は、繊維芽細胞に選択的に結合するヒトIgG、次にフルオレスセイン結合ヤギ抗ヒトIgG抗体を用いる免疫蛍光によって特定した。移植されたヒト細胞は少なくとも21日間完全な健康状態で生き続けた。どんな免疫学的拒絶の兆候も見られなかった。
これまでに本発明を完全に記載したので、同じことが本発明の精神と範囲を離れることなく、かつ過度な実験を持たずして広い範囲の同等のパラメーター、濃度、および条件内で行なえることを当業者は理解するであろう。
この発明はその具体的な実施態様に関連させて記載されているが、さらに修正変更が可能であることが理解されるであろう。一般的に、本発明の原理に従い、本発明が関連する技術において公知または慣用の実施に入り、かつ本特許請求の範囲に記載で述べているような既述の必須要件に適用される本発明からの離脱を含めて、本出願は、本発明のどんなバリエーション、使用、または適用の包含を意図するものである。
具体的な実施態様の前記記載は、本発明の一般的性質を十分に開示するであろうから、現在の知識を適用することにより、多様な応用のために、本来の概念から離れることなくそのような具体的な実施態様を容易に改変および／または適用できるであろうし、従って、そのような適用と改変は、開示された実施態様の等価物の意味と範囲内において理解されるべきであり、そのように意図されるものである。ここで用いられている表現または術語は、記載の目的のためであり、限定を目的とするものではないことを理解すべきである。

Claims (11)

  1. 哺乳類の脳又は脊髄に細胞を注入するための細胞が外側表面に付着した支持体マトリックスであって、
    （１）前記細胞は、神経活性分子又は神経伝達物質を発現又は産生できる細胞であり、
    （２）前記支持体マトリックスは、前記細胞がインビトロでのインキュベーション後に付着する材料で構成されたマイクロビーズである、
    外側表面に細胞が付着した支持体マトリックス。
  2. 前記支持体マトリックスは、注入された細胞を破壊するまたは前記細胞の生物活性を妨害する反応を示すことなく哺乳類の脳または脊髄に注入できる材料で構成された請求項１記載の外側表面に細胞が付着した支持体マトリックス。
  3. 前記細胞は、神経学的疾患または機能障害をもたらす欠乏または欠損している神経活性分子又は神経伝達物質を哺乳類の脳または脊髄に供給する、請求項１又は２に記載の外側表面に細胞が付着した支持体マトリックス。
  4. 前記支持体マトリックスが約90から約150μｍまでの直径を有するマイクロビーズである、請求項１〜３いずれか１項に記載の外側表面に細胞が付着した支持体マトリックス。
  5. 前記支持体マトリックスがガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリペンテン、アクリロニトリルポリマー、ナイロンおよびマグネタイト（磁鉄鋼）よりなる群から選択された材料でできている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の外側表面に細胞が付着した支持体マトリックス。
  6. 前記支持体マトリックスがゼラチン、天然の多糖類、修飾された多糖類およびコラーゲンよりなる群から選択された材料でできている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の外側表面に細胞が付着した支持体マトリックス。
  7. 前記細胞が、神経若しくは神経傍起源の細胞、副腎クロム親和性細胞、副腎髄質細胞、網膜色素上皮細胞、ニューロン細胞、体細胞融合により作られた細胞又は融合神経細胞若しくは融合神経傍細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の外側表面に細胞が付着した支持体マトリックス。
  8. 前記細胞が樹立された細胞系に由来するものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の外側表面に細胞が付着した支持体マトリックス。
  9. 前記細胞系が、神経活性分子又は神経伝達物質を発現又は産生する、神経細胞系、又は繊維芽細胞系である、請求項８に記載の外側表面に細胞が付着した支持体マトリックス。
  10. 前記細胞が１種以上のタンパク質をコードする遺伝物質のトランスフェクションにより遺伝的に修飾されており、該遺伝的に修飾された細胞が神経伝達物質、神経成長因子、または脳代謝に関与する酵素を産生できる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の外側表面に細胞が付着した支持体マトリックス。
  11. パーキンソン病またはドーパミンの欠乏もしくは欠損により特徴づけられる疾患または障害を患う哺乳類の脳にドーパミンを供給するために、
    細胞を注入するための外側表面に細胞が付着した支持体マトリックスであって、
    （１）前記細胞がドーパミンまたはドーパミン作動性物質を産生する細胞であり、
    （２）前記支持体が、前記細胞がインビトロでのインキュベーション後に付着する材料で構成されたゼラチンマイクロビーズである、
    外側表面に細胞が付着した支持体マトリックス。
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