JPH06502406A

JPH06502406A - 脳中への細胞の移植方法およびそのための治療的使用

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Publication number: JPH06502406A
Application number: JP3518066A
Authority: JP
Inventors: ディー．チャークセイ，ブルース
Original assignee: ニューヨークユニバーシティー
Priority date: 1990-10-19
Filing date: 1991-10-09
Publication date: 1994-03-17
Anticipated expiration: 2020-06-08
Also published as: EP0554352B1; EP0554352A4; DK0554352T3; CA2094280C; WO1992006702A1; JP3657001B2; AU8923591A; DE69133205T2; ATE233809T1; DE69133205D1; EP0554352A1; AU665933B2; HK1013802A1; CA2094280A1; ES2193132T3; JP2004041757A; JP3766668B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】脳中への細胞の移植方法およびそのための治療的使用神経科学と医学の分野の本発明は、神経学的疾患の治療に有用な、補乳類の脳中への細胞の移植方法に関する。

背景技術の説明神経細胞およびニューロン様細胞を脳中へ直接に移植することは、神経系の衰弱性疾患、例えばパーキンソン病（ＰＤ）　、ハンチントン病ＣＨＤ）　、アルツハイマー病（Ａｆｔ）　、てんかん、および家族性自律神経異常症、並びに神経系に対する損傷または外傷からの回復を促す具体的なアプローチであろう。脳中に入れられた細胞の神経伝達物質の表現型発現に影響を与える因子をキャラクタライズすることは、神経系の通常の細部に関与するプロセスのより良い理解につながるであろうし、異常な表現型の発現より起こる生まれながらの欠陥を治療により防止し矯正する手段を示すことにつながるであろう。

ニューロンまたはニューロン様細胞は、固体組織の塊または分散させた細胞のいずれかの形で、中枢神経系（ＣＮＳ）、特に脳中に移植することができる。しかし、現在までのところ、技術的および倫理的性格の多くの問題が臨床的に実施可能な移植法の開発を抑制してきた。

パーキンソン病（ＰＤ）はドーパミン作動性ニグロ線条体（ｎｉｇｒ。

５ｔｒｉａｔａｌ）ニューロンの選択的欠損から起こり、原質から線条体へのインプットの欠如をもたらす。ドーパミンを産生しうる組織の固体移植片、例えば成人の副腎髄質および胚の原質（ＳＮ）は、ドーパミン作動性細胞の破壊のため、６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）で処置したラットおよび霊長類への実験的な移植に広く用いられている（Ｄｕｎｎｅｔｔ、　Ｓ、Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　２１５：１４７−１６１　（１９８１）：同上、２２９：４５７−４７０　（１９８１）；　Ｍｏｒｉｓｈａ、　Ｊ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｘｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ、　８４：６４３−６５４　（１９８４）；　Ｐｅｒｌｏｗ、　ＭＪ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２０４：６４３−６４７　（１９７９））　、胚ＳＮの移植も、ＰＤ様疾患を引き起こす神経毒の１−メチル−４−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）で損傷を受けた霊長類の治療に用いられた（Ｒｅｄｍｏｎｄ、　Ｄ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｌａｎ、：ｅｔ　８４９０：１１２５−２７　（１９８６））。

５ｔｅｎｅｖｉら（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　１１４：１−２０　（１９７６）は、神経移植片の生存のための最適条件を調べて、最上の結果が、（ａ）胎児ＣＮＳニューロンを用いたときと、（ｂ）移植細胞を豊富な血管供給部分に隣接して入れたときに得られることを発見した。実際、当文献の概説によれば、胎児脳のほとんど全ての部分からの組織は、手順の詳細に注意を払えばうまく移植できることを明らかにしている（例えば、０１ｓｏｎ、　Ｌ、Ａ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｉｎ：　Ｎｅｕｒａｌ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ：　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、　５ｌａｄｅｋ、　Ｊ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄｓ、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８４．　ｐｐ、１２５−１６５を参照）。

胚の組織は外来環境において分化を起こし、宿主組織と一体化する細胞のすぐれた供給源を提供する。例えば、６−０ＨＤＡで処置したラント中への胚ＳＮの移植は、ドーパミンを産生し、アポモルフイン−またはアンフェタミン−誘導回転を減少させ、感覚欠損を緩和し、宿主の線条体中でシナプスを作ることがわかった（上記のＤｕｎｎｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏｒｉｓｈａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｅｒｌｏｔｖ　ｅｔ　ａｌ、）　、移植されたニューロンも自発的な活性があり、通常の成熟ＳＮニューロンに似ている（Ｗｕｅｒｔｈｅｌｅ、　Ｓ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｉｎ：　Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓ、　ＰａｒｔＢ、　（Ｅ、υ５ｄｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄｓ。）、　Ａ、Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ３３３−３４１　）。

胎児神経組織の成功した移植とは対照的に、成熟ＣＮＳニューロンは移植組織中で生き続けられないことが判明した（Ｓｔｅｎｅｖｉ、　Ｕｅｔ　ａｌ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　１１４：１−２０　（１９７６））　ｏ胎児ＣＮＳ二ｘ　ｏンは移植処置に耐えるのに対し、成熟ニューロンは耐えない理由は確がでないが、おそらくいくつかの因子に関連している。第一に、胎児ニューロンは成熟ニューロンよりも低い酸素量により影響を受けることが少なく　（Ｊｉｌｅｋ、　Ｌ、、Ｉｎ＋　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｉｍｗｉｃｈ、Ｗ、Ａ、、ｅｄ、、Ｃ，Ｃ，Ｔｈｏｍａｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ。

ＪＬ、　１９７０．　ｐｐ、　３３１−３６９）　、それに移植処置は移植片への十分な血液供給が確立するまで、酸素欠乏症の期間が必ず伴う。第二に、胎児ニューロンは、急速な成長期の間で、かつ標的組織との連結が確立される前に採取されるとき最もよく生き残るように思える（Ｂｏｅｒ、　Ｇ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　１５：ｌ０８７−１１０９．　（１９８５））。

また、胎児組織は、損傷した宿主の脳の環境中に存在することが知られている成長（または「生存」）因子に特に応答するようだ（Ｎｉｅｔｏ−Ｓａｍｐｅｄｒｏ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２１７：８６０−８６１　（１９８２）；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１：６２５０−６２５４　（１９８４））。

しかし、胎児組織と細胞移植片の有望的期待にもがかわらず、当該技術は、人間医学で胎児組織の利用に付随する倫理的、道徳）　的および法律的問題のために、移植用のドナー組織の代わりとなる供給源に関心が向けられることになった。

これらの供給源として、器官ドナーおよび培養細胞系からの神経細胞と傍神経細胞がｔ　ある（例えば、Ｇａ５ｈ、　Ｄ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎ：　Ｎｅｕｒａｌ　Ｇｒａｆｔｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｐ、　ｅ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ＣＮＳ、Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、ｅｄｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、　１９８５．　ｐｐ、　５９５−６０３；　Ｇａ５ｈ、　Ｄ、Ｍ、　ｅｔ　ａＪ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３：１４２０−２２　（１９８６）を参照）。

」、　移植法を用いる初期の臨床的実験は、長期にわたる効果をもたらさなかったが、ある研究の当初の報告は、より期待できるように思われた（Ｍａｄｒａｚｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｓａｃ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ａｂｓｔｒ、　１２：５６３（１９８６）　、大要に関しては、参照によりここに引用されるＬｉｅｂｅｒｍａｎ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｄｖ、　Ｔｅｃｈ、　５ｔａｎｄ、　Ｎｅｒｏｓｕｒｇ、　１７：６５−７６　（１９９０）を参照）。さらに別のいくつかの観察は、移植副腎細胞が実行可能なアプローチであることを示唆している。副腎髄質細胞は神経稜に由来するもので、交換神経系ニューロンのように、インビボまたはインビトロで突起を神経成長因子（ＮＧＦ）に応答して成長させる（Ｕｎｓｉｃｋｅｒ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ　７５：３４９Ｂ−３５０２（１９７８））。幼若ラットがらの副腎髄質の固体移植片は、８−０）ＩＤＡで処置されたラットの脳中で少な（とも５カ月間生き続け、ドーパミンを作り、アポモルフイン誘導回転を減少させることができる（上記のＤｕｎｎｅｔｔ　ｅｔ　ａｔ、　：　Ｆｒｅｅｄ、　Ｗｊ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ａｎｎ、　Ｎｅｕｒｏｌ、　８：５１０−５１９　（１９８０）；　Ｆｒｅｅｄ、　Ｗ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ２２２：９３７−９３９　（１９８３））。これらの観察から、適当な環境が与えられれば、副腎髄質細胞は脳組織中ヘカテコールアミン合成性の繊維を成長させる潜在能力を持つことが示唆される。

クロム親和性細胞の神経分化の潜在能力は、ラット線条体中に導入されると突起を成長させる解離した副腎クロム親和性細胞の移植によって更によく解明されている。培養された副腎髄質細胞もＮＧＦの存在下で培養すると、突起を有するニューロン様細胞に分化する（上記のＵｎｓｉｃｋｅｒ）。副腎細胞のこの注目すべき適応性は、形態学的のみならず、神経伝達物質の表現型の発現においても観察されている。血管作動性腸ペプチド、ならびにモノアミン、セロトニンなどの多数の神経ペプチド群が副腎髄質細胞中にカテコールアミンとともに共存して局在している（Ｓｃｈｕｌｔｚｂｅｒｇ、　Ｍ。

Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　３：　１１６９−１１８６　（１９７８）；　Ｌｕｎｄｂｅｒｇ、　Ｊ、Ｍ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６：４０７９−４０８２　（１９７９））　、これら多様な表現型の発現は外因性シグナルにより調整することができる。例えば、エンケファリンおよびＶＩＰの発現は、動物をニコチン遮断薬で処置することによるインビボでの副腎の神経除去の後、またはインビトロで副腎細胞を維持した後に増加する（Ｔｉｓｃｈｌｅｒ、　Ａ、Ｓ、　ＬｉｆｅＳｃｉ、　３７：１８８１−１８８６　（１９８５））　、これらの観察は、神経稜に由来するニューロンが正常な発達の間に（Ｈａｈｎ、　Ｍ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　ＤｅＶｅｌ。

Ｂｉｏｌ、　８２：１−１０　（１９８１）；　Ｊｏｎａｋａｉｔ、　Ｇ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉｏｌ、　８８：２８８−２９６　（１９８１））または微視的環境の実験的操作後に（ＬｅＤｏｕａｒｉｎ、　Ｎ、Ｍ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３１：１５１５−１５２２　（１９８６））表現型を変えることができることを示す他の研究の観察と一緒に考えてみれば、将来的には、移植の前および／または後で、移植された細胞により発現される神経伝達物質の表現型をコントロールすることが可能になるこもしれないことを示唆するものである。

組織の塊に比較して、ばらばらにした細胞を移植することの別の利点は、移植前に成長因子などの多様な物質とともに細胞を前もって培養できること、または分化の特別なパラメータを促進する他の細胞もしくは物質とともに細胞移植を行なうことができることにある。さらに、ダリア細胞は特別な局所的効果を持ち、神経成長因子を作ることができる（Ｂａｒｂｉｎ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｄｅｖｅｌ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　７：２９６−３０７　（１９８５）：　Ｓｃｈｕｒｃｈ−Ｒａｔｈｇｅｂ、　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２７３：３０８−３０９　（１９７８）；　Ｕｎｓｉｃｋｅｒ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１：２２４２−２２４６　（１９８４）；　Ｗｈｉｔａｋｅｒ−Ａｚｍｉｔｉａ、　Ｐ、Ｍ、　ｅｔａｌ、、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　４９７：８０−８５　（１９８９））　。このことは、ダリア由来の因子を産生ずる特定の型のダリアとともに所望の神経伝達物質を提供する細胞を共移植することが、神経成長と移植細胞の所望の分化を促進するかもしれないことを示唆している。

従って、移植方法の実施可能性は実験的に確立されている。しかし、この方法は、限定された利用性と大きな政治的結果を有する胎児組織の使用の必要性により厳しい限定を受けている。根本的に、中絶妊娠からのヒト胎児組織の移植はアメリカ合衆国では禁止されている。従って、もし、成熟組織の脳中への移植の成功のために、簡単で、日常的でしかも安全な方法が衰弱性神経疾患　。

の治療に利用できたとしたら、大きな利益を持ったことであろう。

Ａｅｂｉｓｃｈｅｒと彼の共同研究者は、選択的透過性の生体適合性ポリマーカプセルを脳中に移植することに成功したが、これはこの環境において生き続けることのできる神経組織の断片をカプセル化したものである（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ、　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　４４８：３６４−３６８　（１９８８）；　Ｗｉｎｎ、　Ｓ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｍａｔｅｒ　Ｒｅｓ、　２３：３１−４４　（１９８９）。ポリマーカプセルは、ポリ塩化ビニルのアクリル性共重合体ＸＭ−５０からできていた。そのような選択透過性材料は、宿主細胞によるカプセル化組織への侵入とおそらくは抗体とウィルスによる侵入も膜の透過性に基づいて完全に防いだ。ドーパミン放出ポリマー・ロッドをそのような選択透過性ポリマー中にカプセル化して、神経除去されたラットの線条体に移植したときに、実験的に誘導されたパーキンソン病症候群の軽減が達成された（Ｗｉｎｎ　Ｓ、Ｒ，ｅｔ　ａｔ、、　Ｅｘｐ、　Ｎｅｕｒａｌ、　１０５：２４４−５０　（１９８９）。さらに、米国特許第４．８９２．５３８号（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９９０年１月９日に公布）は、外部環境に存在するウィルス、抗体および他の有害な薬剤を排除するが、神経伝達物質の拡散を可能にする半透性膜内の分泌細胞からなる、神経伝達物質の輸送のために被験者に移植する細胞培養装置を開示している。半透性の膜はアクリル性共重合体、ポリフッ化ビニリデン、ポリウレタン、ポリアルギネート、セルロースアセタール、ポリスルホン、ポリビニルアルコール、ポリアクリロニトリル、またはそれらの誘導体または混合物からなり、分子量が５０　ｋＤまでの溶質の拡散を可能にするものである。この装置は、神経伝達物質、前駆体、アゴニスト、フラグメント等を標的領域、特に脳に、持続的に局所輸送することによって、パーキンソン病などの神経伝達物質欠損状態の治療に有用であるといわれている。この装置は、回収可能にすることができるので、内容物を新しくしたり、補給することができ、そして細胞は免疫学的応答およびウィルス感染に対して防御されている。

発明の要約本発明者らは、最初に細胞をインビトロで支持体マトリックス、例えば直径９０ μｍのガラスピーズ上で培養することにより、成熟したＣＮＳニューロンまたは培養細胞などの細胞を首尾よく哺乳類の脳に移植することができるという予期できない発見をした。細胞が付着するビーズをレシピエンドの脳中に走触性的に注入する。

このように注入された細胞は生存力を保ち、従って効果的に移植することができる。種の障壁を超えて移植されたときでさえ、細胞はインビボで長期の生存と生存力を示す。

本発明の目的は先行研究の上記の欠陥を克服することである。

本発明は、細胞が支持体マトリックスに付着するように細胞を支持体マトリックスとともに培養し、付着した細胞を有する支持体マトリックスを脳中に移植することからなる、哺乳類被験者の脳への細胞の移植方法を提供する。

本方法は、ガラスおよび他の酸化ケイ素、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ポリペンテン、アクリロニトリルポリマー、ナイロン、アミラーゼ、ゼラチン、コラーゲン、デキストランおよびセルロース（例えばニトロセルロース）などの天然および修飾多糖類、寒天およびマグネタイトから作られた支持体マトリックスを含むものである。好適な支持体マトリックスはビーズであり、特に直径が約９０から約１５０μｍまでのマイクロビーズである。

本発明の方法は、多くの異なるタイプの細胞、好適には神経または傍神経由来の細胞、例えば副腎クロム親和性細胞を用いることができる。インビトロで生育させた細胞系も有用である。繊維芽細胞などの神経または傍神経に由来しない細胞も、神経ペプチド、または神経伝達物質の生産に寄与する酵素または一組の酵素、または神経成長因子をコードするＤＮＡによるトランスフェクション後に用いてもよい。

本発明は、上記の方法により、疾患を治療できる効果的な数の細胞を移植することからなる、被験者の神経学的疾病の治療方法を包含するものである。本発明により治療できる疾病には、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、てんかん、家族性自律神経異常症、および外傷性の脳損傷があるが、これらに限定されるものではない。

図面の簡単な説明図１は、ガラスマイクロビーズ上の成熟副腎髄質細胞を移植したラット脳の断面図の光学顕微鏡写真である。この断面図は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて組織化学的に固定・染色したものである。暗く染色された部分は、ＴＨを含む細胞を示している。染色パターンは、切片に入ったニードル管を右側に示している。中央の大きな円形染色部分は、移植された細胞の塊を示している。注入された細胞は、一部がニードル管まで後方に延びて、「腺様Ｊパターンを形成している。（厚さ、２０ミクロン；　倍率：１００ｘ）好適な実施態様の説明本発明は、通常は哺乳類の脳中に移植および生存のできない成熟細胞または培養細胞を最初に支持体マトリックスに付着させることにより生存させることができるという本発明者らの予期されなかった発見に基づいている。

多（の異なるタイプの細胞が本発明に有用である。典型的には、細胞はレシピエンドの脳に欠落している物質を提供する能力に基　゛づいて選択されるであろう。欠落物質とは、神経伝達物質か他の神経活性分子であり、それらの欠如が神経学的疾患か機能障害をもたらす物質である。移植された細胞は、一度しシピエントに挿入されると腫瘍として成長しないことが重要である。

以下に挙げる文献は、特別に引用されるかどうかにかかわらず、参照により全て本文中に引用されるものとする。

［神経または傍神経由来の」という用語は、胚神経稜に由来する細胞を意味する。傍神経由来の細胞の好適な例は、副腎髄質クロム親和性細胞である。哺乳類の副腎髄質の前駆体細胞は神経後に由来し、ニューロン系もしくは内分泌系の分化に沿って発達する能力を有する（Ｂｏｈｎ、　Ｍ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　１９８１．上記、　Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉｏｌ。

８９：２９９−３０８　（１９８２）；　Ｕｎｓｉｃｋｅｒ、　Ｋ、、　Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ、　１０８：２５９−２６８　（１９８５））。ラット、サル、およびヒトの副腎髄質からのクロム親和性細胞は、副腎皮質の影響から離されて、神経成長因子（ＮＧＦ）にさらされると、内分泌腺表現型から神経表現型に変化する（Ｎｏｔｔｅｒ、　Ｍ、Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓ、　Ｒｅｓ、　２４４：６９−７０　（１９８６）；　Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ、［、ｅｔ　ａｌ、、　ＥＸｐ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　６０：３３５−３４９　（１９８５）；　Ｕｎｓｉｃｋｅｒ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９７８上記）。副腎クロム親和性細胞は、大脳皮質組織または海鳥組織とともにラットの眼の前室に共移植すると、共移植を受けた近接の脳組織を刺激し発達させる神経繊維を形成する（Ｏｌｓｏｎ、　Ｌ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｘｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ、　７０：４１４−４２６　（１９８０））。もう一つの別のタイプの傍神経細胞は網膜色素上皮細胞である（Ｓｏｎｇ、　Ｍ−Ｋ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１４８：１９６−２０３　（１９９０））　。

ドナー細胞の一つの供給源は、確立された神経細胞系である。

発生のモデル系として広く用いられてきた多くのニューロンクローンが存在するが、これは、これらクローンが適当な表面レセプター、特異的な神経伝達物質、シナプス形成性および形態学的、生化学的に正常なニューロンに分化する能力を持って、電気的活性があるためである。神経系はＣＮＳニューロンで見られる遺伝的発現に対応する膨大な量の遺伝情報を発現することができる。そのような細胞は以下の文献に記載がある：　Ｋｉｍｈｉ、　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７３：４６２−４６６　（１９７６）、Ｉｎ：　ＥｘｃｉｔａｂｌｅＣｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　Ｎｅ１ｓｏｒ＋、　Ｐ、Ｇ、　ｅｔ　ａｔ、、　ｅｄｓ、、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７７、　ｐｐ、　１７３−２４５）；　Ｐｒａｓａｄ、　Ｋ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｉｎ：　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌｓ、　Ｃ１ａｒｋｓｏｎ、　Ｂ。

ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄｓ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　１９７４．　ｐｐ、　５８１−５９４）；　Ｐｕｒｏ、　Ｄ、Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７３：３５４４−３５４８　（１９７６）；　Ｎｏｔｔｅｒ、　Ｍ、Ｆ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　２６：５９−６８　（１９８６）；　５ｃｈｕｂｅｒｔ、　Ｄ、　ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　６７：２４７−２５４　（１９７０）；　Ｋａｐｌａｎ。

Ｂ、Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｉｎ：　Ｂａ５ｉｃ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｇｕｆｆｒｉｄａ−３ｔｅｌｌａ、　Ａ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、ｅｄｓ、、　Ｍｉｌａｎｏ　Ｆｏｎｄｏｚｉｏｎｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｍａｎａｒｉｎｉ、　１９８２乃。

これら培養細胞の主要な利点は、表現型および遺伝子型をコントロールする際に、環境ならびに細胞それ自体を操作する能力にある。

例えば、１）ＪＲ３２細胞系からのヒト神経芽細胞腫細胞が、移植後の９力月間、霊長類の脳中で生き続けてコリン作動性マーカーを発現できる（Ｇａｓｈ、　Ｄ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３：１４２０−２２　（１９８６））。これらの細胞は、好適には形態学的ならびに生化学的にインビトロで分化するように処置され、移植前に、永久に熱系分裂とされなければならないが、これは細胞の生存をさらに助けるものである（Ｇａｓｈ　ｅｔ　ａｌ、、上記；　Ｇｕｐｔａ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｄｅｖ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、１９：２１−２９　（１９８５））。

成熟ラットの線条体中に移植された未処理の褐色細胞腫／神経芽細胞腫の細胞（ＰＣ１２細胞）は、インビボで２週間後の生存を示さなかった（Ｈｅｆｔｉ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　３４８二２８３−２８８　（１９８５））が、ニューロン分化を促進するＮＧＦでインビトロで処置した後に細胞増殖を抑制する抗有糸分裂剤にさらすことは、カテコールアミン神経伝達物質の発現にも生存力にも有害な影響を与えず、移植後の刺激促進に価値があるものである。従って、本発明の一つの実施態様において、細胞の生存を促しかつ悪性能力９発現を防ぐために、細胞系の細胞は、適当な成長因子もしくは分化因子により、および移植前に抗有糸分裂剤によりインビトロで調整される。

通常の方法を用いるインビトロのクローン細胞の神経細胞表面の試験により、本発明に従って使用される適当な細胞の選択が可能であることは当業者にとって明白であろう。正常な発生と分化ノ間に、ニューロン細胞の表面は、ＣＮＳ中でのニューロンの移動、認識および一体化の原因となる著しい変化を受ける。例えば、マウスＣ１３００クローンのニューロン細胞系を、プロスタグランジンＥ、および環状ＡＭＰなどの抗有糸分裂剤または成長調節剤で処置すると、低分子量の新しい細胞表面糖タンパク質が作られる（ＢＯｔｔｅｎｓｔｅｉｎ、　Ｊ、Ｅ、、Ｉｎ：　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ。

５ａｔｏ、　Ｇ、Ｈ，、ｅｄ、、　Ａｉａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８１）　ｏ破傷風毒素に結合するＣＮＳ表面ガングリオシドが誘導されるが（Ｎｏｔｔｅｒ、　Ｍ。

Ｆ、、　１９８６、上記）、一方、通常の中枢神経果糖タンパク質に類似する特定のレクチン結合性糖タンパク質が現われる。さらに、神経伝達物質と神経ペプチドに対する神経芽細胞腫細胞上のレセプターは、ＣＮＳ中に見られる細胞と類似する方法により修飾することができる（Ｃｏｓｔａ、　Ｌ、Ｇ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒ＋＋＋ａｃｏ１．９１：３４０７−３４１３　（１９８２））。

可能な移植材料のもう一つの重要な供給源は、単一ニューロンを不死化することができる方法である体細胞ハイブリダイゼーションによって作られた細胞である。体細胞ハイブリダイゼーションは、多様な遺伝子型を持つ細胞系を作るためのみならず、分化の多様な表現型の発現を調節する機構を分析するためにも用いられる強力な細胞生物学的道具である。特定遺伝子の発現が異なる細胞を融合することは、遺伝子発現を調節する機構の研究を可能にするが、染色体の変更が遺伝学的に異なる細胞系を作る率で生じる。分化した細胞の性質を保持するハイブリッド細胞を形成することができる。交感神経節と神経芽腫細胞の融合から得られるハイブリッドはドーパミンを合成することができるが（Ｇｒｅｅｎｅ。

Ｌ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｃｌ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２：４９２３−４９２７　（１９７５））、脳細胞ハイブリッドはコリンアセチルトランスフェラーゼを発現する（Ｍｉｎｎａ、　Ｊ、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　７９：３７３−３８３　（１９７５））。従って、ＣＮＳからのドーパミン作動性ニューロンに対する胚前駆体は分裂細胞と融合して、経時的に余分な染色体を失う単一のゲノム中に両方のゲノムを取り込んで、新しいハイブリッド系となる。そのようなハイブリッドの神経または傍神経の細胞を過度の実験を行なうことなしに作り、それらを所望の特質、例えばドーパミン分泌についてスクリーニングし、移植に最高の能力を持つ細胞を選択することは当業者の技量の範囲内にある。

本発明による移植のための細胞のもう一つの供給源は、副腎髄質である。神経稜に由来するこの組織は、ＰＤを治療するための臨床的試験に関与している（「背景」を参照）。成熟したサルの副腎髄質はインビトロで少なくとも約３週間、単一の細胞として培養することができる（Ｎｏｔｔｅｒ、　Ｍ、Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓ、　Ｒｅｓ、　２４４：６９−７６　（１９８６））。これら細胞は、上皮様、線状の形態から、細胞が微細管アレイを含む広範な神経突起の分岐を示すニューロンの形態への表現型の変化により、ＮＧＦに応答する。このニューロンの表現型は、宿主ＣＮＳ中でのラット髄質細胞の長期生存およびそれら細胞の宿主組織との一体化に重要であるように思われる（上記Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、）　ｏ移植された副腎髄質組織は、ラットにおけるニグロ線条体ドーパミン欠損から起こる機能的欠損を治すことができる（例えば、上記Ｆｒｅｅｄ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８１を参照）。

しかし、これは、移植の３〜６力月後に減少する現象である移植片からのドーパミンの拡散によりもたらされると考えられる。移植細胞のＮＧＦ処理は、移植片から宿主への繊維成長を誘導して、さらに長く続く挙動の回復（少なくとも１年間）を誘導する。実際、ＮＧＦ処理なしには、ラット（上記Ｆｅｅｄ　ｅｔ　ａｌ、）またはアカゲザルの尾細胞核（Ｍｏｒｉｈｉｓｉａ、　Ｊ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｘｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ、　８４：６４３−６５３　（１９８４））のとちらかに先行技術の手法を用いて移植されたクロム親和性細胞は、はとんどが生き続けることがない。同じように、網膜色素上皮細胞は、ドーパミンと他の因子を分泌し、本発明による脳移植に用いてもよい（Ｌｉ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＸＩ）、　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ。

４７：７７１−７８５　（１９８８）：　Ｌｕｉ、　Ｇ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｉｎｔ’１．　Ｓｏｃ、　ＥｖｅＲｅｓ、　６：１７２　（１９９０）；　Ｌｉ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｖ、　０ｐｈｔｈａ１．　Ｖ’ ｓ、　Ｓｃｉ。

３１（Ｓｕｐｐｌ）：５９５　（１９９０，ａｂｓｔｒ、　２９１５−１３）；　５ｈｅｅｄｌｏ、　Ｈ，Ｊ、　ｅｔ　ａｌ。

、同論文中、　ａｂｓｔｒ、　２９１６−１４；　Ｆｅｋｔｏｒｏｖｉｃｈ、　Ｅ、Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、同論文中（ａｂｓｔｒ、　２９１７−１５）；上記Ｓｏｎｇ、　Ｍ−Ｋ　ｅｔ　ａｌ））。

本発明に従って哺乳類の脳中に移植された細胞は、成長因子の添加がない状態で生存を示した。しかし、本発明のさらに別の実施態様は、移植前にインビトロで、移植後にインビボで、またはその両方で、適当な成長／分化因子による処置と組み合わせた支持体マトリックス付着細胞の移植に向けられている。

ヒト副腎髄質細胞は、ニューロン表現型を有して少なくとも９週間インビトロで維持することができる（Ｎｏｔｔｅｒ、　Ｍ、Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、。

５ｃｈｔｎｉｔｔ　Ｎｅｕｒｏｌ、　Ｓｃｉ、　Ｓｙｍｐ、、　Ｊｕｎｅ　３０．１９８７．　ａｂｓｔｒ、）　。ＮＧＦはこの変換を線状の状態から誘導する。Ｃ６神経膠腫細胞とともに培養された副腎髄質細胞は、広範な神経突起の分校を示し、かつ神経膠腫細胞との密接な接触を示す。有糸分裂を抑制するために、抗有糸分裂剤で処理したこれらの星状膠細胞は、インビトロて交感神経ニューロンを支持するＮＧＦに似た成長因子を産生ずることが知られている（Ｂａｒｄｅ、　Ｙ、Ａ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２７４：８１８　（１９７８））　、移植されたダリア細胞は、ニューロンの機能回復に重要な役割を果たしているかもしれないし、栄養因子の重要な供給源かもしれない（Ｄｏｅｒｉｎｇ、　Ｌ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｎｅｔ＋ｒｏｌｏｇ、　Ｓｃｉ、　６３：１８３−１９８　（１９８４）；　Ｇｕｍｐｌｅ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、Ｌｅｔｔ、３７：３０７−３１１　（１９８４））。従って、本発明のもう一つの実施態様は、神経または傍神経の細胞をダリア細胞とともに培養し、それら細胞を支持体マトリックスとともにインキュベートして、その後に両方のタイプの細胞を有する支持体マトリックスを移植することからなるものである。

本発明のさらに別の実施態様では、神経もしくは傍神経に由来しないが、神経学的興味のある物質を産生ずるように変更された細胞を用いる。好適なタイプの細胞は入手および培養が簡単で、本発明の方法を用いたラット脳中への移植で生き続けるヒト包皮繊維芽細胞である（例Ｉ１１を参照）。本発明で使用するために、細胞は、公知の方法を用いて遺伝学的に変更して、神経成長因子、神経伝達物質、神経ペプチド、または脳の代謝に関与する酵素を発現させる。（例えば、Ｇａｇｅ、　Ｆ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　２３ニア９５ −８０７　（１９８７）；　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｍ、Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４２：１５７５−１５７８　（１９８８）；　Ｓｈｉｍｏｈａｍａ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　５：２７１−２７８（１９８９）を参照；　これらは参照によりここに引用される）。

参照によりここに引用される組換えＤＮＡ技術と細胞生物学の一般原理を説明する標準的な文献として、Ｗａｔｓｏｎ、　Ｊ、Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍ。

Ｉｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌｕｍｅｓ　Ｉ　ａｎｄ　ＩＩ、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／ＣｕＣｕｍｍ１ｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｉｎｃ、、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　ＣＡ　（１９８７）；　Ｄａｒｎｅｌｌ、　Ｊ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｏｏｋｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ　（１９８６）；　Ｌｅｗｉｎ、　Ｂ、Ｍ、、　Ｇｅｎｅｓ　ＩＩ。

Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ　（１９８５）；　Ｏｌｄ、　Ｒ，Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：　Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２ｎ４　Ｅｄ、、［Ｊｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｋｅ！ａｙ、ＣＡ　（１９８１）＋　Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、ｅｔ　ａｔ、（Ｍｏｌｅｌｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ　（１９８２））：　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ　（１９８９）　ａｎｄ　Ａｌｂｅｒｓ、Ｂ、ｅｔａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅ１ｌ、２ｎｄ　Ｅｄ、、Ｇａｒｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ　（１９８９）などがある。

本発明の方法に有用な組換えＤＮＡ分子は、多様ないかなる手段、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ合成、またはより好適には組換えＤＮＡ技術の適用により作ることができる。そのような分子の合成技術は、例えば、Ｗｕ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、　（Ｐｒｏｇ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ。

２１：１０１１４１　（１９７８））に開示がある。組換え分子を構築する手順は、上記のｓａｍｂｒｏｏｋらにより詳しく開示されている。

典型的には、対象の遺伝子または複数の遺伝子を（該遺伝子を発現することのできる細胞からの）　ＤＮＡ、より好適にはｃＤＮＡを発現ベクター中にクローニングすることにより作製した発現ベクターのライブラリーからクローン化する。

次に、そのライブラリーから、対象の遺伝子産物に特異的な抗体と結合する抗体を用いて、遺伝子産物、例えば神経伝達物質合成酵素を発現することのできるメンバーのスクリーニングを行なう。対象の遺伝子産物を発現することのできる細胞から、ＤＮＡ、より好適にはｃＤＮＡを抽出精製する。精製ｃＤＮＡを断片化しく剪断、エンドヌクレアーゼ消化等による）、ＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントのプールを作る。次に、このプールからのＤＮＡまたはｃＤＮＡのフラグメントを発現ベクターにクローン化して、それぞれが唯一のクローン化ＤＮＡまたはｃＤＮＡのフラグメントを含む発現ベクターのライブラリーを作る。

「発現ベクター」とは、ベクター中にクローン化されたＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）分子を（適当な転写および／または翻訳調節配列の存在のために）発現することができ、それにより、ポリペプチドまたはタンパク質を生産することのできるベクターである。発現ベクターを適当な宿主細胞に導入すると、クローン化された配列の発現が起こる。適当な哺乳類の宿主細胞は、クローン化された配列を発現できればいかなる哺乳類の細胞であってもよい。ｃＤＮＡの調製手順と遺伝子ライブラリーの作製手順は、ＳａｍｂｒＯＯｋら（上記）により開示されている。

本発明のために発現が望まれる産物もしくは複数の産物をコードするＤＮＡ配列は、連結のための平滑末端または付着末端、適当な末端を作る制限酵素消化、適宜に付着末端の修復、望まれない連結を避けるためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および適当なりガーゼによる連結などの通常の手法に従ってベクターＤＮＡに再結合できる。そのような操作技術は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらにより開示されており、当業者にはよく知られているものである。

ＤＮＡなどの核酸分子は、もし、それが転写および翻訳調節情報を含むヌクレオチド配列を含み、そのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「操作可能に連結されている（ｏｐｅｒａｂｌｙ　１ｉｎｋｅｄ）　Ｊならば、ポリペプチドを「発現することができる」と言われる。操作可能な連結とは、調節ＤＮＡ配列と発現を望むＤＮＡ配列とが遺伝子発現を可能にするように結合している連結である。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は生物により異なるであろうが、原核生物においては、（ＲＮＡ転写を開始させる）プロモーターとＲＮＡに転写されたときにタンパク質合成開始のシグナルを出すＤＮＡ配列の両方を含むプロモーター領域から一般には成るものである。そのような領域としては、通常、転写および翻訳の開始に関与する５°−非コード配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などがある。。

所望ならば、タンパク質をコードする遺伝子配列の３°側の非コード領域を上に記載の方法により得ることができる。この領域は、終止およびポリアデニル化のようなその転写終止調節配列のために保持されているようだ。従って、タンパク質をコードするＤＮＡ配列にもともと近接する３−領域を保持することにより、転写終止シグナルが提供できよう。転写終止シグナルが、発現宿主細胞中で十分に機能しない場合は、宿主細胞中で機能する３′領域と置換してもよい。

２つのＤＮＡ配列（例えば、プロモーター領域配列とコード配列）は、もし、その２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさず、（２）コード配列の転写を指示するプロモーター領域配列の能力を妨げないか、（３）プロモーター領域配列により転写を受けるコード領域の能力を妨げないならば、操作可能に結合されていると言える。プロモーター領域は、もしそのプロモーターがＤＮＡ配列の転写に影響を与えることができたとすると、ＤＮＡ配列に操作可能に結合されているといえよう。従って、タンパク質を発現するためには、宿主細胞により認識される転写および翻訳シグナルが必要である。

プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、「操作可能に連結された」核酸配列の転写を促進することのできる２本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子である。ここで用いる場合、「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるＤＮＡがＲＮＡＮ玉鎖上在するプロモーターの配列である。［プロモーター配列相補体」は、その配列が「プロモーター配列」の相補体である核酸分子である。従って、一本鎖「プロモーター配列相補体」に隣接するプライマーＤＮＡもしくはＲＮＡの伸長、すなわち「プロモーター配列Ｊの伸長の際に、もし、その伸長が「プロモーター配列」または「プロモーター配列相補物」に向がって進むならば、機能的プロモーターを含む２本鎖分子が作られる。この機能的プロモーターは、「プロモーター配列」を含む２本鎖分子の鎖（［プロモーター配列相補体」を含む分子の鎖ではない）に操作可能に連結した核酸分子の転写を指示するであろう。

本発明のための細胞作製に有用なプロモーター配列は、真核細胞もしくはウィルス性のどちらかである。適当なプロモーターは抑制的か、または、より好適には構成的なものである。有用な真核細胞のプロモーターとして、マウス・メタロチオネインＩ遺伝子のプロモーターがある（Ｈａｍｅｒ、　Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、　１：２７３−２８８　（１９８２））　；　ｔｈｅ　ＴＫ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｏｆ　Ｈｅｒｐｅｓ　ｖｉｒｕｓ　（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、　Ｓ、、　Ｃｅ１ｌ　３１：３５５−３６５　（１９８２））；　ｔｈｅ　ＳＶ４０　ｅａｒｌｙ　ｐｒｏｍ。

ｔｅｒ　（Ｂｅｎｏｉｓｔ、　Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　２９０：３０４−３１０　（１９８１））。好適なプロモーターは、特にヒト繊維芽細胞用としては、コラーゲンプロモーターである（Ｐｒｏｃｋｏｐ、　Ｄ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ、　Ｅｎｇ。

Ｊ、　Ｍｅｄ、　３０１：１３−２３．７７−８５　（１９７９）；　Ｅｙｒｅ、　Ｄ、Ｒ，、５ｃｉｅｎｃｅ　２０７：１３１５−１３２２　（１９８０）；　Ｍａｒｔｉｎ、Ｇ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈ、Ｓｃｉ、１０：２８５−２８７　（１９８５）　；これら文献は参照によりここに引用される）。

本発明に従って支持体マトリックスに付着させた細胞も、本発明の範囲に入ることが意図されるもので、これらは公知の方法を用いて凍結して凍結状態で保存する。解凍後、マトリックスに結合した細胞はレシピエンド脳中に移植する。

本発明の方法に有用な細胞は異種発生のもの（＝異種、すなわち宿主とは異なる種に由来するもの）、同種間のもの（＝相同、すなわちレシピエンドと同じ種の遺伝的に異なるメンバーに由来するもの）または自己由来のもの（ここではレシピエンドもドナーとしても役立つ）でもよい。

本発明の目的を達成するために必要とされる細胞の数は、被験者のサイズ、年令、体重、内在する病気の性質、同時に行なわれている他の治療等により変えることができる。このことは、過度の実験を必要とせずに当業者により決定することができる。ヒト成人において、支持体マトリックスに付着させた細胞の効果的な数は、約ｌＸＩＯ３〜約ｌＸｌ０’細胞の範囲にあり、より好適には約５×１０３〜約ｌＸｌ０’細胞の範囲にある。その代わりとしては、移植細胞の効果的な量は、ビーズの体積に加えられた細胞の量に基づいて決定することができ、例えばビーズ１　ｍｌにつき４０１０ｇの細胞Ｉである。

支持体マトリックスを構成することのできる材料としては、インビトロのインキュベーション後に細胞が吸着し、その上で細胞が成長でき、移植細胞を破壊するか細胞の生物学的または治療的活性に干渉する毒性反応、炎症または神経膠症反応を起こさすに哺乳類の脳中に移植することができる材料がある。そのような材料として、ガラスおよび他の酸化シリコン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、フッ素化ポリビニリデン、ポリウレタン、ポリアルギネート、ポリスルフォン、ポリビニルアルコ−ルボネート、ポリペンテン、ナイロン、アミラーゼ、ゼラチン、コラーゲン、デキストランおよびセルロース（例えばニトロセルロース）などの天然および修飾多糖類、寒天、およびマグネタイトがあるが、これらに限定されるものではない。再吸収性または非再吸収性の材料も用いることができる。

本発明の支持体マトリックスは、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒと彼の共同研究者に記載されたもの（上記参照）とは以下の点において異なる二本発明に従うと、細胞は支持体の外側表面に付着する；　細胞は、閉じられた室内にカプセル化されてはおらず、この室内においては、開示されたカプセル化支持体の排除容量を所与のものとすると、細胞の生存は疑わしいものとなるであろう。さらに、本発明の支持体マトリックスは、低分子量物質は通過させるが巨大分子（＞５０　ｋＤ）は排除させるＡｅｂｉＳＣｈｅｒ装置の選択的透過性などの材料が特別な透過性を持つという必要要件を提出しない。

支持体の形状は、好適にはビーズなどの球状であるが、円柱状、長円形、平坦シートまたはストリップ、針またはピンの形等々であってもよい。支持体マトリックスの好適な形態はグラスビーズである。もう一つの好適なビーズはポリスチレンビーズである。

ビーズの大きさは、直径が約１０μｍｘ１ｃｍ、好適には約９０〜１５０μｍの範囲にある。多様なマイクロキャリアー・ビーズの記載については、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　５ｏｕｒｃｅ　８７−８８．　Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、、　１９８７．　ｐｐ、７２−７５：　Ｓｉｇｒｎａ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃａｔａｌｏｇ、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、１９９１．　ｐｐ、１６２−１６３；　Ｖｅｎｔｒｅｘ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｃａｔａｌｏｇ、　Ｖｅｎｔｒｅｘ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　１９８９を参照：　これらを引き起こすかもしれない神経膠症などの望まれない宿主反応のビーズによる刺激・促進により決まる。そのような限定は当業者により容易に決定できるものである。

細胞の付着、生存および機能を向上させるために、細胞の吸着、生存および機能を向上させることが公知のファクターを固体マトリックスの外部表面に随意に被覆してもよい。そのようなファクターとして、細胞付着分子、細胞外マトリックス、例えばフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチン、グリコサミノグリカン、またはプロテオグリカン（上記のＡｌｂ−ｅｒｓ、　Ｂ、　ｐｐ、　８０２−８３４を参照）または成長因子、例えばＮＧＦなどがある。その代わまたはその複数の因子をマトリックス材料中に取り込むことができ、移植後にインビボで除々に放出されるであろう。

本発明の別の実施態様において、再吸収性マトリックス（例えばコラーゲン）上で生育する細胞は、神経再成長か回復を促進するために、脳以外の神経学的に興味のある部位に移植することができる。例えば、本発明のマトリックスに結合した細胞は、を社中に移植してもよいし、視覚神経中もしくはそれに隣接して入れてもよい。

本発明の方法は、多くのヒト神経学的疾患の治療に有用である。

パーキンソン病は、本発明に従いドーパミン生成細胞を宿主の線条体に移植することにより治療することができる。アルツハイマー病（ＡＤ）は、核バサリス（ｂａｓａｌｉｓ）のコリン作動性細胞の欠損が関与する。従って、本発明により、ＡＤを有するかその危険がある対象体にアセチルコリンを作る細胞を移植してもよい。

ハンチングトン病は、尾（ｃａｕｄａｔｅ）の核と被殻（ｐｕｔａｍｅｎ）のヘッドの全体的な消耗が関与するもので、通常は編目の中程度の病気を伴う。ハンチングトン病に苦しむ被験者は、神経伝達物質であるガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）　、アセチルコリン、またはその混合物を作る細胞の移植により治療することができる。本発明によれば、そのような細胞が結合する支持体マトリックス材料は、好適には尾と被殻に移植される。

てんかんは実際は単一の病気ではなく、むしろ潜在的にある異常により起こされる症状である。当業者は、それぞれのてんかん被験者が個々にユニークな損傷もしくはてんかん病巣を持つことを理解するであろう。そのような病巣は、当業者によく知られている脳波記録法およびコンピューター化された軸断層撮影法および核磁気共鳴画像を含む診断方法の組み合わせを用いて場所の特定ができる。

てんかんに苦しむ患者は、本発明に従い、ＧＡＢＡ生産細胞が付着した支持体マトリックス材料を影響を受けている部位に移植することにより治療することができる。脳中のグルタメート・レセプターおよびＮＭＤＡレセプターの遮断薬が実験的なてんかんをコントロールするために用いられてきたので、刺激性アミノ酸経路を遮断する分子を作る細胞を本発明に従って用いることができる。従って、スペルミジンなどのポリアミンを通常よりも多い量で作るように、ここに記載の通り修飾した細胞の移植は、てんかん治療に用いることができよう。

本発明の方法は、本発明の方法の有利な効果を経験できるどんな哺乳類への使用も意図されるものである。そのような哺乳類として、ヒトが最初に挙げられるが、本発明はそのような限定を意図するものではなく、獣医学使用にも応用できる。

ここまでに本発明の一般的な記載を行なったが、同じことが、実例として挙げられた以下の実施例を参照すれば容易に理解されるであろうが、本実施例は、特に断りのない限り本発明の限定を意図するものではない。

実施例Ｉ成熟ラットからの副腎クロマフィン細胞を公知の方法に従って調製した（Ｉｎｏｕｅ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａ、Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　２５７　（Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉ。

Ｉ、２６）：Ｃ９０６−９１２（１９８９）を参照）。ネンブタールによる麻酔の後、頭を切除して殺し、副腎を除去した。注意深い顕微解剖により、髄質から被膜および皮質物質を取り除いた。組織を２片もしくは３片に切断して、１４０　ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＫＣＩ、５．２　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、５　ｍＭＨＥＰＥＳ、　ｌｏｍＭ　Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅを含むｐＨ７，４のカルシウムを含まない平衡塩類溶液中の０．２％コラゲナーゼとともに３０分間インキュベートした。この酵素処理後、調製物を９９．９Ｎ　Ｏｘをあわ立たせることによりやさしく振とうした。消化後、組織を上記の塩溶液で３〜４回洗浄し、次にパスツールピペット中でやさしく粉砕した。

■）に、ばらばらにしたクロマフィン細胞を移し、３７℃で５％ＣＯ□雰囲気中で一晩培養した。これらの条件下では、細胞は２〜３日本的にはビーズ上に単層を形成した。インビトロでの調製の２４時が培養では生存しなくなったとき）において、細胞はインビボで定された（図１を参照）。ガラスピーズは、注入自体に特有の壊死的損傷以上の損傷を引き起こさなかった。

日間、完全な健康状態で生き続けた。どんな免疫学的拒絶の兆候も見られなかった。

実施例ＩＩＩ培養したヒト包皮繊維芽細胞を上記のようにガラスマイクロビーズに付着させて、これをラット脳に注入した。細胞の局在する場所は、繊維芽細胞に選択的に結合するヒトＩｇＧ、次にフルオレスセイン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を用いる免疫蛍光によって特定した。移植されたヒト細胞は少なくとも２１日間完全な健康状態で生き続けた。どんな免疫学的拒絶の兆候も見られなかった。

これまでに本発明を完全に記載したので、同じことが本発明の精神と範囲を離れることなく、かつ過度な実験を持たずして広い範囲の同等のパラメーター、濃度、および条件内で行なえることを当業者は理解するであろう。

この発明はその具体的な実施態様に関連させて記載されているが、さらに修正変更が可能であることが理解されるであろう。一般的に、本発明の原理に従い、本発明が関連する技術において公知または慣用の実施に入り、かつ本特許請求の範囲に記載で述べているような既述の必須要件に適用される本発明からの離脱を含めて、本出願は、本発明のどんなバリエーション、使用、または適用の包含を意図するものである。

具体的な実施態様の前記記載は、本発明の一般的性質を十分に開示するであろうから、現在の知識を適用することにより、多様な応用のために、本来の概念から離れることなくそのような具体的な実施態様を容易に改変および／または適用できるであろうし、従って、そのような適用と改変は、開示された実施態様の等価物の意味と範囲内において理解されるべきであり、そのように意図載の目的のためであり、限定を目的とするものではないことを理解すべきである。

国際調査報告　ＰＣＴ１０５９１１０７４４］フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０９Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．細胞を支持体マトリックスの外側表面にインビトロで付着させ、付着した細胞を有する支持体マトリックスを脳中に移植することからなる、哺乳類被験者の脳中へ細胞を移植する方法。
２．支持体マトリックスがマイクロビーズである、請求項１記載の方法。
３．マイクロビーズが約９０から約１５０μｍまでの直径を有する、請求項２記載の方法。
４．支持体マトリックスが酸化ケイ素、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリペンテン、アクリロニトリルポリマー、ナイロン、天然多糖類、修飾多糖類、アミラーゼ、コラーゲン、天然セルロース、修飾セルロース、寒天およびマグネタイトからなる群より選ばれた材料からつくられる、請求項１記載の方法。
５．支持体マトリックスが酸化ケイ素である、請求項４記載の方法。
６．細胞が神経もしくは傍神経に由来する、請求項１記載の方法。
７．細胞が副腎クロム親和性細胞である、請求項６記載の方法。
８．細胞が網膜色素上皮細胞である、請求項１記載の方法。
９．細胞がインビトロで培養された細胞系からのものである、請求項１記載の方法。
１０．培養細胞が繊維芽細胞である、請求項９記載の方法。
１１．培養細胞がタンパク質もしくは複数のタンパクをコードする遺伝物質のトランスフェクションにより遺伝的に修飾されており、遺伝的に修飾された該細胞が神経伝達物質もしくは神経成長因子を生産できるようにしてある、請求項９記載の方法。
１２．請求項１の方法により疾患を治療できる効果的な数の細胞を被験者の脳中に移植することからなる、被験者の神経学的疾患を治療する方法。
１３．疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンテントン病、てんかん、および外傷性脳損傷からなる群より選ばれる、請求項１２記載の方法。