DE69737101T2

DE69737101T2 - Zusammensetzungen zur gentransfer in das zentrale nervensystem

Info

Publication number: DE69737101T2
Application number: DE69737101T
Authority: DE
Inventors: Bruce Hoboken CHERSKEY; R. Louis San Francisco BUCALO
Original assignee: New York University Medical Center; Titan Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Titan Pharmaceuticals Inc; New York University NYU
Priority date: 1996-04-08
Filing date: 1997-04-07
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2017-04-08
Also published as: US20010003585A1; WO1997037684A1; US6565845B2; EP0927043B8; JP2004337176A; EP0927043A4; PT927043E; AU724537C; EP0927043A1; TWI222870B; CA2251232C; AU724537B2; ES2277356T3; DK0927043T3; HK1021801A1; ATE347903T1; CA2251232A1; US6210664B1; DE69737101D1; ZA972971B

Description

1. EINFÜHRUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Element zur Implantierung von Produzentenzellen in das Säugergehirn. Die Produzentenzellen werden gentechnisch mit einem retroviral basierten rekombinanten Vektor verändert, der einen tumorizidalen Faktor oder Anfälligkeitsfaktor codiert, der den Tumorzellen eine Empfänglichkeit für chemotherapeutische oder radiotherapeutische Mittel verleiht. Vor der Transplantation in das Säugergehirn werden die Produzentenzellen zunächst in vitro an einer Trägermatrix kultiviert, um die langfristige Lebensfähigkeit der transplantierten Zellen zu erhöhen und einen langfristigen funktionalen Nutzen zu bieten.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gehirntumore stellen die Hauptursache von Krebstodesfällen bei Menschen unter 35 Jahren dar. Das Auftreten von Tumoren des zentralen Nervensystems ist mehr als doppelt so hoch wie das der Hodgkin-Krankheit, mehr als die Hälfte dessen von Melanom, und bei Frauen ist die Häufigkeit der durch Tumoren des zentralen Nervensystems verursachten Mortalität nahezu gleich der, die durch Eierstockkrebs hervorgerufen wird. Bei Kindern stellen Gehirntumoren den häufigsten festen Tumor dar und kommen an zweiter Stelle lediglich nach Leukämie als einer Gesamtursache von Krebs bei Kindern. (Dale, D.C. und Federman, D.D., 1995, Scientific American Medicine, Scientific American, Inc., New York, Kapitel 7). Die meisten Gehirntumoren sind inoperabel; und selbst bei jenen Gehirntumoren, die operabel sind, ist der chirurgische Eingriff extrem schwierig und führt häufig zu neurologischen Störungen.
Die in vivo-Anwendung der durch einen retroviralen Vektor vermittelten Gentherapie ist auf die Behandlung von Gehirntumoren angewendet werden (Oldfield et al., 1993, Hum. Gene Ther.; 4:39–69; Culver et al., 1992 Science 256:1550–2). Die möglicherweise am breitesten untersuchte Anwendung der Gentherapie nützt Retroviren aus, die gentechnisch verändert werden, um Proteine zu exprimieren, die eine relativ nicht-toxische Prodrug aktivieren, um ein hochgradig toxisches Agens zu bilden. Zum Beispiel sind retrovirale Produzentenzellen, die Anfälligkeitsfaktoren exprimieren, in das Gehirngewebe von Patienten transplantiert worden, um die Tumorzellen abzutöten (Barba, D. et al., WO 93/04167). Eine spezielle Anwendung des Systems nützt das Thymidinkinase-Gen des Herpes simplex-Virus aus, welches eine Empfindlichkeit gegenüber antiviralen Wirkstoffen wie Ganciclovir und Acyclovir verleiht (Barba et al., WO 93/04167; Moolten, F. L. et al., 1986, Cancer Research 46:5276–5281). Das HSV-TK-Genprodukt katalysiert die Phosphorylierung einer Anzahl von Nukleosid-Analoga, die schlechte Substrate für die TK der Säugerzellen sind. Zum Beispiel weist der Antiherpes-Wirkstoff Acyclovir eine minimale Toxizität gegenüber Zellen auf, denen die HSV-TK-Aktivität fehlt, wird aber in Zellen, die HSV-TK exprimieren, zu einer toxischen Form aktiviert, die zur Hemmung der DNA-Synthese fähig ist und von der gezeigt worden ist, dass sie eine selektive Zytotoxizität gegenüber Zellen aufweist, die das HSV-TK-Gen exprimieren.
Eine Sorge in Verbindung mit der Anwendung der durch einen retroviralen Vektor vermittelten Gentherapie ist die, dass die implantierten Produzentenzellen möglicherweise nicht fortgesetzt überleben und/oder die therapeutischen Gene für die Zeiträume exprimieren könnten, die zur Erzielung des maximalen therapeutischen Nutzens benötigt werden. Es ist allgemein bekannt, dass Zellen, die direkt in das Gehirn implantiert werden, innerhalb eines Zeitraums von etwa 2 bis 4 Wochen absterben (siehe zum Beispiel Itukura, T. et al., 1988, J. Neurosurg. 68:955–959). In einigen Fällen ist vom Heften der Zellen an Mikroträger vor der Implantation in vivo gezeigt worden, dass es die langfristige Lebensfähigkeit der transplantierten Zellen erhöht (Cherskey et al.; WO 9206702), doch ist diese Methode bis heute nicht erfolgreich auf retrovirale Produzentenzelllinien angewendet worden.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Elemente zum Übertragen von Genen, die einen tumorizidalen Faktor oder Anfälligkeitsfaktor codieren, auf Gehirntumorzellen. Das Element umfasst das Implantieren von Produzentenzellen, die mit einem retroviral basierten rekombinanten Vektor gentechisch hergestellt sind, der einen tumorizidalen Faktor oder Anfälligkeitsfaktor codiert, in das Säugergehirn. Die gentechnisch veränderten Produzentenzellen erzeugen infektiöse retrovirale Partikel, die zum Infizieren der benachbarten Gehirntumorzellen fähig sind und dabei die Tumorzellen empfindlich gegenüber chemotherapeutischen oder radiotherapeutischen Agenzien machen. Da das Gentransfersystem mit dem retroviralen Vektor eine proliferierende Zielzelle für die Integration und Genexpression im Gehirn erfordert, weist die Anwendung dieses Systems auf Gehirntumoren den Vorteil auf, dass die Retroviren auf die proliferierenden Zellen des Gehirntumors gezielt werden, während die normalen nicht-proliferierenden Gehirnzellen uninfiziert bleiben.
Eine Anzahl von Genen, die tumorizidale oder Anfälligkeitsfaktoren codieren, kann bei der Ausführung der Erfindung verwendet werden. Solche Gene codieren Enzyme, die eine relativ nicht-toxische Prodrug zu einem hochgradig toxischen Agens umwandeln können. Zellen, die gentechnisch verändert worden sind, um solche Gene zu exprimieren, begehen im Wesentlichen einen metabolischen Selbstmord in Gegenwart der entsprechenden Prodrug.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung kann das Herpes simplex-Thymidinkinase (HSV-TK)-Gen in die rekombinanten retroviralen Vektoren eingebaut werden. Jegliche Zellen, die anschließend mit den rekombinanten Retroviren infiziert werden, und die das HSV-TK-Gen exprimieren, würden gegenüber chemotherapeutischen Agenzien wie Acyclovir und Ganciclovir empfindlich werden. Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das Cytosindeaminase (CD)-Gen in rekombinante retrovirale Vektoren eingebaut werden. Zellen, die das CD-Gen exprimieren, metabolisieren die relativ nicht-toxische Prodrug 5-Fluorocytosin zu dem hochgradig toxischen 5-Fluorouracil (Mullen, CA et al., 1994, Cancer Res. 54.1503–6).
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner das Kultivieren der Produzentenzellen in vitro an einer Trägermatrix vor der Implantation in das Säugergehirn. Die vorherige Anheftung der Zellen an Mikroträger vor der Implantation in das Gehirn ist so designed, dass sie die langfristige Lebensfähigkeit der transplantierten Zellen erhöht und einen langfristigen funktionalen Nutzen bietet.
Die Erfindung basiert zum Teil auf dem Nachweis, dass die vorherige Anheftung der Produzentenzellen an Mikroträger vor der Transplantation in das Säugergehirn die Lebensfähigkeit der transplantierten Zellen erhöht. Bei einer speziellen, hierin beschriebenen Ausführungsform wurden Produzentenzellen in das Gehirn von Ratten transplantiert. Die transplantierten Produzentenzellen erzeugen infektiöse Retroviruspartikel, die gentechnisch verändert worden sind, um das Alkalische Phosphatase-Gen zu exprimieren. Die Ergebnisse weisen die erfolgreiche langfristige Expression des Alkalische Phosphatase-Gens im Gehirn der transplantierten Tiere nach.
4. BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Mikroskopische Schnitt aus den Gehirnen von Ratten, implantiert mit nicht-transfizierten Zellen auf Mikroträger-Kügelchen (20-fache Vergrößerung). Wenig oder keine Färbung ist in der Umgebung der Kügelchen erkennbar.
2. Schnitt aus den Gehirnen von Ratten, implantiert mit transfizierten Zellen, keine Mikroträger (20-fache Vergrößerung). Keine Färbung ist in der Sektion erkennbar.
3. Schnitt aus den Gehirnen von Ratten, 30 Tage vorher mit Zellen implantiert, die mit Alkalische Phosphatase-Gen-Plasmid auf Mikroträger-Kügelchen transfiziert sind (10-fache Vergrößerung). Eine hohe Dichte des dunkel gefärbten Materials (Zellen) ist erkennbar.
5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Behandlung von Gehirntumoren, umfassend die Implantation in das Säugergehirn von Produzentenzellen, die mit einem retroviral basierten rekombinanten Vektor, der einen tumorizidalen Faktor oder Anfälligkeitsfaktor codiert, gentechnisch verändert worden sind. Die Produzentenzellen erzeugen infektiöse retrovirale Partikel, die zum Infizieren von Gehirntumorzellen fähig sind, wodurch diese Tumorzellen empfindlich gegenüber chemotherapeutischen Agenzien gemacht werden. Die langfristige Lebensfähigkeit der Produzentenzellen kann durch die in vitro-Kultivierung der Produzentenzellen auf einer Trägermatrix vor der Implantation erhöht werden.
Insbesondere ist nachgewiesen worden, dass die DNA von Interesse wirksam und stabil in "Produzentenzellen" eingeführt werden kann, die anschließend auf eine Trägermatrix übertragen werden, die in ein Säugergehirn transplantiert oder implantiert werden kann. Die Produzentenzellen produzieren infektiöse Retroviruspartikel, die das Gehirngewebe infizieren können, das in dichter Nähe zu den implantierten Produzentenzellen lokalisiert ist. Von dem infizierten Gehirngewebe wurde gezeigt, dass es das Gen von Interesse bis zu 30 Tage nach der Transplantation exprimiert.
5.1. RETROVIRALE VEKTOREN
Um tumorizidale oder Anfälligkeitsfaktoren zu exprimieren, werden die Nukleotidsequenzen, die für solche Faktoren codieren, in einen geeigneten retroviralen Expressionsvektor inseriert. Methoden, die den Fachleuten des Gebiets wohlbekannt sind, können zur Konstruktion von rekombinanten retroviralen Vektoren angewendet werden, die Nukleotid-codierende Sequenzen des tumorizidalen oder Anfälligkeitsfaktors enthalten, die mit entsprechenden Transkriptions/Translations-Kontrollsignalen operativ verknüpft sind. Die Konstruktion der rekombinanten retroviralen Vektoren, die die codierenden Sequenzen des tumorizidalen oder Anfälligkeitsfaktors enthalten, können unter Anwendung standardmäßiger Ligations- und Restriktionstechniken generiert werden, die im Fachgebiet gut verstanden sind. Siehe zum Beispiel die Techniken, beschrieben bei Sambrook et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2. Aufl., 1989, und Auselbel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, N.Y.
Eine Vielzahl retroviral basierter rekombinanten Vektoren kann von Fachleuten des Gebiets ebenso gut verwendet werden. Die rekombinanten Vektoren können variierende Mengen an retroviralen Sequenzen enthalten, einschließlich retroviraler Long Terminal Repeats (LTRs), die für die Integration in das Wirtsgenom erforderlich sind, und Verpackungssignalen (psi), die für die Einkapselung der rekombinanten RNA-Transkripte des Provirus in reife Viruspartikel erforderlich sind. Zu besonders geeigneten retroviralen Vektoren zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, solche, die in den folgenden Literaturstellen beschrieben sind, von denen jede durch Bezugnahme mitaufgenommen ist: SAX-Vektoren (Kantoff P.W. et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6563); N2-Vektoren (D. Armentano et al., 1987, J. Virology 61:1647); LXSNA-Vektoren (Miller A.D. et al., 1989, Biotechnique 7:980–990); und LASN-Vektoren (Blood 72:876–81).
Die rekombinanten Vektoren können auch bakterielle Plasmidsequenzen enthalten, die zur Verleihung einer Resistenz gegenüber Antibiotika wie Ampic Ilin und Tetracyclin erforderlich sind, und Sequenzen, die für die Replikation in Bakterien erforderlich sind. Außerdem können die rekombinanten Vektoren selektierbare Markergene enthalten, die zum Identifizieren stabil transfizierter Zellen verwendet werden können. Der selektierbare Marker in den rekombinanten Vektoren verleiht Resistenz gegenüber der Selektion und ermöglicht den Zellen die stabile Integration des rekombinanten retroviralen Expressionsvektors in ihre Chromosomen. Diese Methode kann in vorteilhafter Weise zur Identifizierung erfolgreich transifizierter Produzentenzelllinien angewendet werden, die anschließend infektiöse Retroviruspartikel produzieren werden.
Eine Reihe von Selektionssystemen kann verwendet werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Hypoxanthin-Guaninphosphoribosyltransferase (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026), und Adeninphosphoribosyltransferase-(Lowy, et al. 1980, Cell 22:817)-Gene können in HGPRT- bzw. APRT- Zellen verwendet werden. Auch kann die Antimetabolit-Resistenz als der Grundlage der Selektion für DHFR verwendet werden, welche eine Resistenz gegenüber Methotrexat verleiht (Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); GPT, welche eine Resistenz gegenüber Mycophenolsäure verleiht (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, welches eine Resistenz gegenüber Aminoglykosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); und hygro, welches eine Resistenz gegenüber Hygromycin-(Santerre, et al., 1984, Gene: 30:147)-Genen verleiht. Vor kurzem sind weitere selektierbare Gene beschrieben worden, nämlich trpB, welches den Zellen die Nutzung von Indol anstelle von Tryptophan erlaubt; hisD, welches den Zellen die Nutzung von Histinol anstelle von Histidin erlaubt (Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047); und ODC (Ornithindecarboxylase), welche eine Resistenz gegenüber Ornithin-Decarboxylase-Inhibitor verleiht, 2-(Difluormethyl)-DL-Ornithin, DFMO (McConlogue L., 1987, in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Hrsg.).
Eine Anzahl tumorizidaler oder Anfälligkeitsfaktoren kann bei der Ausführung der Erfindung verwendet werden. Diese Faktoren sind als solche definiert, die Zellen eine Empfindlichkeit gegenüber chemotherapeutischen Agenzien verleihen. Bei einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird das HSV-TK-Gen in einen rekombinanten retroviralen Vektor eingeführt. Die HSV-TK-Codierungsregion kann von einer Vielzahl von öffentlich verfügbaren Klonen abgeleitet sein (Wigler et al., 1977, Cell 11:223). Die Infektion der Tumorzellen mit solchen retroviralen Vektoren verleiht diesen Zellen eine Empfindlichkeit gegenüber Wirkstoffen wie Acyclovir und Ganciclovir.
Gemäß der Erfindung können Nukleotidsequenzen, die tumorizidale oder Anfälligkeitsfaktoren codieren, mit retroviralen LTR-Promotor-Enhancer-Signalen operativ verknüpft werden. Eine operative Verknüpfung ist eine solche, in der die LTR-Promotor/Enhancer-Sequenzen und das tumorizidale oder Anfälligkeitsgen in solcher Weise assoziiert sind, dass die Genexpression ermöglicht wird. Alternativ können ebenso gut andere Promotor/Enhancer-Sequenzen durch Fachleute des Gebiets genützt werden, um für die Transkription der inserierten Sequenzen zu sorgen.
Zum Beispiel können Promotor/Enhancer-Elemente, die aus dem Genom von Säugerzellen isoliert sind, von Viren, die für das Wachstum in Säugerzellen permissiv sind, oder die durch rekombinante DNA- oder Synthesetechniken erzeugt sind, verwendet werden, um für die Transkription des Gens zu sorgen, das den tumorizidalen oder Anfälligkeitsfaktor codiert. Jegliches aus einer Anzahl geeigneter Promotor/Enhancer-Elemente, einschließlich konstitutiver und induzierbarer Promotoren, kann in den Expressionsvektoren verwendet werden.
Spezifische, für eine effiziente Translation des inserierten Gens erforderliche Initiationssignale können ebenso in den retroviralen Expressionsvektoren aufgenommen werden. Diese exogenen Translationskontrollsequenzen, die ein ATG-Initiationscodon und angrenzende Sequenzen umfassen können, können von einem vielfältigen Ursprung sein, also sowohl natürlich als auch synthetisch. In Fällen, in denen das gesamte tumorizidale oder Anfälligkeitsgen, einschließlich seines eigenen Initiationscodons und angrenzenden Sequenzen, in den entsprechenden Expressionsvektor inseriert wird, brauchen keine zusätzlichen Translationssignale erforderlich zu sein. In Fällen allerdings, bei denen lediglich ein Abschnitt der tumorizidalen oder Anfälligkeits-codierenden Sequenz inseriert wird, müssen exogene Translations-Kontrollsignale, einschließlich des ATG-Initiationscodons, in Phase mit dem Leserahmen der tumorizidalen oder Anfälligkeits-codierenden Sequenz sein, um die Translation des gesamten Inserts zu gewährleisten. Die Effizienz der Expression kann durch die Aufnahme geeigneter Transkriptions-Enhancerelemente, Transkriptionsterminatoren etc. erhöht werden (siehe Bitter et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516–544).
In einer spezifischen, hierin beschriebenen Ausführungsform wurden die Produzentenzellen mit einem retroviralen Vektor transfiziert, der gentechnisch so konstruiert worden ist, dass er das Alkalische Phosphatase codierende Gen, unter der Kontrolle des Vektor-LTR und der G418-Resistenz und gesteuert über den SV40-Promotor, enthält. Die transfizierten Produzentenzellen wurden an Collagen-beschichtete Dextran-Mikroträger gebunden, gefolgt durch die Transplantation in das Rattengehirn. Histologische Studien, die 30 Tage nach der Implantation vorgenommen wurden, zeigten die langfristige Expression des Alkalische Phosphatase-Gens in retroviral infizierten Zellen.
Obschon rekombinante retrovirale Vektoren die bevorzugten Vektoren zur Verwendung bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung sind, können auch andere virale Vektoren zum Exprimieren der tumorizidalen oder Anfälligkeits-Gene verwendet werden. Zum Beispiel können Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Epstein-Barr-Virus, Papilloma-Virus, Vaccinia-Virus, Herpes-Virus und weitere humane und animale Viren zur Expression von tumorizidalen oder Anfälligkeitsfaktoren in Zellen verwendet werden, die in das Säugergehirn transplantiert werden sollen. In Fällen beispielsweise, bei denen ein Adenovirus als ein Expressionsvektor verwendet wird, kann die tumorizidale oder Anfälligkeitsfaktor-codierende Sequenz an einen Adenovirus-Transkriptions/Translations-Kontrollkomplex, z.B. den späte Promotoren und die Tripartit-Leader-Sequenz, ligiert werden. Dieses chimäre Gen kann dann in das Adenovirus-Genom durch in vitro- oder in vivo-Rekombination eingeführt werden. Die Insertion in eine nicht-essenzielle Region des viralen Genoms (z.B. Region E1 und E3) wird zu einem rekombinanten Virus führen, das lebensfähig und zum Exprimieren tumorizidaler oder Anfälligkeitsgene in infizierten Wirtszellen fähig ist (z.B. siehe Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:3655–3659).
5.2. VERPACKUNGSZELLLINIEN
Um übertragbare Retroviruspartikel zu erzeugen, werden die rekombinanten retroviralen Expressionsvektoren in stabile "Produzenten"-Zelllinien transfiziert. Produzentenzelllinien enthalten ein stabil integriertes Provirus, das alle der retroviralen Funktionen exprimiert, die in trans zur Verpackung der viralen Transkripte in reife Viruspartikel erforderlich sind. Zu diesen zählen die gruppenspezifisches Antigen (gag), Envelope (env) und Polymerase (pol)-Gene. Das gag-Gen codiert die inneren Struktur-(Nukleocapsid)-Proteine; das pol-Gen codiert die RNA-gerichtete DNA-Polymerase (Reverse Transkriptase); und das env-Gen codiert virale Hüllglykoproteine. Ein wesentliches Merkmal des stabil integrierten Provirus ist das Fehlen von Verpackungssequenzen (den psi-Sequenzen), die normalerweise die erforderlichen Signale in cis zur Verpackung der virale Transkripten liefern. Daher sind Transkripte, die aus der Expression des Provirus entstehen, nicht in virale Partikel verpackt, sondern liefern vielmehr in trans die Genprodukte, die für die Verpackung der viralen Partikel erforderlich sind.
Da retrovirale Vektoren die Zellteilung und DNA-Synthese für eine effiziente Infektion, Integration und Genexpression erfordern, sind die "Produzenten"-Zellen vorzugsweise aktiv wachsende Zellen. Solche Produzentenzellen können Fibroblasten, Neuronen, Gliazellen, Keratinozyten, Hepatozyten oder jegliche andere Säugerzelle umfassen, die unter Anwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung transfizierbar und implantierbar sind.
Eine Vielzahl von Produzentenzelllinien kann zur Anwendung bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Zum Beispiel können bereits bestehende retrovirale Produzentenzelllinien in der Ausführung der Erfindung verwendet werden. Zu solchen Zelllinien können die BOSC23-(Pear, W.S. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:8392–8396), Psi2-(Cone, R.D. et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6349–6353), Psi am-(Hartley, J.W. et al., 1976, Journal of Virology 19:19–25)-Zelllinie oder jegliche andere funktional äquivalente Produzentenzelllinie zählen, die Genprodukte in trans ergeben, die für die virale Verpackung erforderlich sind.
Alternativ können weitere neuartige Produzentenzelllinien generiert werden. Um weitere Produzentenzelllinien zu schaffen, werden retrovirale Vektoren, die alle der Proteine synthetisieren, die in trans für den viralen Zusammenbau erforderlich sind, in aktiv wachsende Zellen transfiziert. Eine Vielfalt von Transfektionstechniken, die den Fachleuten des Gebiets wohlbekannt sind, kann zum Übertragen der retroviralen Expressionsvektoren in Produzentenzelllinien genützt werden. Zu diesen Techniken zählen die Calciumphosphat-DNA-Präzipitation, die DEAE-Dextran-Transfektion, die Elektroporation oder der Liposomen-vermittelte DNA-Transfer.
Die Produzentenzellen werden anschließend mit den rekombinanten retroviralen Vektoren transfiziert, die die tumorizidalen oder Anfälligkeitsgene und, wahlweise, die DNA, die für einen selektierbaren Marker codiert, enthalten. In Fällen, bei denen die rekombinanten Vektoren einen selektierbaren Marker enthalten, kann eine Selektion für transfizierte Zellen vor der Implantation durchgeführt werden.
5.3 IN VITRO-KULTIVIERUNG VON VERPACKUNGSZELLLINIEN
Um die langfristige Lebensfähigkeit der transplantierten Produzentenzellen zu erhöhen, wurden die Produzentenzellen zunächst in vitro an eine Trägermatrix gebunden. Zu Materialien, aus denen sich die Trägermatrix zusammensetzen kann, zählen solche Materialien, an denen Zellen nach einer in vitro-Inkubation haften, oder an denen Zellen wachsen können, und die in das Säugergehirn implantiert werden können, ohne eine toxische Reaktion oder eine entzündliche Reaktion hervorzurufen, die die implantierten Zellen zerstören oder anderweitig ihre biologische oder therapeutische Aktivität beeinträchtigen könnte. Solche Materialien können synthetische oder natürliche chemische Substanzen oder Substanzen mit einem biologischen Ursprung sein. Zu den Matrixmaterialien zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Glas und andere Siliziumoxide, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylidenfluorid, Polyurethan, Polyalginat, Polysulfon, Polyvinylalkohol, Acrylonitril-Polymere, Polyacrylamid, Polycarbonat, Polypenten, Nylon, Amylasen, Gelatine, Collagen, natürliche und modifizierte Polysaccharide, einschließlich Dextranen und Cellulosen (z.B. Nitrocellulose), Agar und Magnetit. Es können entweder resorbierbare oder nicht-resorbierbare Materialien verwendet werden. Ebenso umfasst sind extrazelluläre Matrixmaterialien, die im Fachgebiet wohlbekannt sind. Extrazelluläre Matrixmaterialien können kommerziell erhalten werden oder durch Züchten von Zellen präpariert werden, die eine solche Matrix sekretieren, Entfernen der sekretierenden Zellen und Ermöglichen, dass die zu transplantierenden Zellen mit der Matrix interagieren und daran haften. Das Matrixmaterial, an dem die zu implantierenden Zellen wachsen, oder mit dem die Zellen gemischt werden, kann ein innewohnendes Produkt der implantierten Produzentenzellen selbst sein. So kann das Matrixmaterial beispielsweise ein extrazelluläres Matrix- oder Basalmembranmaterial sein, welches durch die zu implantierenden Produzentenzellen produziert oder sekretiert wird.
Um die Zellhaftung, das Überleben und die Funktion zu verbessern, kann die feste Matrix wahlweise an ihrer äußeren Oberfläche mit im Fachgebiet bekannten Fakto ren beschichtet sein, um die Zellhaftung, das Wachstum oder Überleben zu fördern. Zu solchen Faktoren zählen Zelladhäsionsmoleküle, extrazelluläre Matrix, wie zum Beispiel Fibronektin, Laminin, Collagen, Elastin, Glykosaminoglykane, oder Proteoglykane oder Wachstumsfaktoren, wie zum Beispiel Nervenwachstumsfaktor (NGF). Wird alternativ die feste Matrix, an die die implantierten Zellen geheftet sind, aus porösem Material konstruiert, so kann der wachstums- oder überlebensfördernde Faktor oder Faktoren in das Matrixmaterial aufgenommen werden, aus dem er/sie nach der Implantation in vivo langsam freigesetzt werden würde.
Wenn an den Träger gemäß der vorliegenden Erfindung gebunden, so befinden sich die für die Transplantation verwendeten Zellen allgemein an der "äußeren Oberfläche" des Trägers. Der Träger kann fest oder porös sein. Allerdings sind die Zellen selbst in einem porösen Träger in direktem Kontakt mit der Außenumgebung ohne eine dazwischenliegende Membran oder andere Barriere. Somit werden die Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung als an der "äußeren Oberfläche" des Trägers befindlich erachtet, obschon die Oberfläche, an der sie haften, in Form von Innenfaltungen oder Windungen des porösen Trägermaterials vorliegen kann, die sich nicht an der Außenseite der Partikel oder Kügelchen selbst befinden.
Die Konfiguration des Trägers ist vorzugsweise kugelförmig, wie bei einem Kügelchen, kann aber auch zylindrisch, elliptisch, eine Flachschicht oder ein Streifen, in Nadel- oder Keilform und ähnliches sein. Eine bevorzugte Form der Trägermatrix ist die eines Glaskügelchens. Ein anderes bevorzugtes Kügelchen ist ein Polystyrolkügelchen. Die Kügelchengrößen können im Bereich von etwa 10 μm bis 1 cm im Durchmesser, vorzugsweise von etwa 90 bis 150 μm, liegen. Für eine Beschreibung der verschiedenen Mikroträger-Kügelchen, siehe zum Beispiel Fisher Biotech Source 87–88, Fisher Scientific Co., 1987, S. 72–75; Sigma Cell Culture Catalog, Sigma Chemical Co., St. Louis, 1991, S. 162–163; Ventrex Product Catalog, Ventrex Laboratories, 1989; diese Literaturnachweise sind hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen. Die Obergrenze der Kügelchengröße wird durch die Stimulierung durch die Kügelchen von unerwünschten Wirtsreaktionen, wie etwa einer Gliose, vorgegeben, welche die Funktion der transplantierten Zellen beeinträchtigen oder eine Schädi gung des umgebenden Gehirngewebes verursachen können. Diese Grenzen sind durch einen Fachmann des Gebiets ohne weiteres bestimmbar.
5.4 TRANSPLANTIERUNG VON VERPACKUNGSZELLEN
Die Produzentenzellen, die die tumorizidalen oder Anfälligkeitsgene exprimieren, werden in vitro gezüchtet und an eine Trägermatrix geheftet. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst die Intrazerebral-Implantation von Produzentenzellen, die das therapeutische Gen von Interesse enthalten, in den Bereich des Gehirns, der von dem Tumor betroffen ist. Verfahren für die Transplantierung von Zellen in das Gehirn sind beschrieben in Neural Grafting in the Mammalian CNS, 1985, Bjorklund und Stenevi, Hrsg. und Gage et al., Brain Research, die jeweils hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen sind. Zu den Verfahren für die Transplantierung von Zellen in das Gehirn zählen:

1) Injizieren der Produzentenzellen in das Wirtsgehirn oder
2) Erzeugen einer Höhle mittels operativer Maßnahmen zur Einlagerung der Produzentenzellen.

Die Produzentenzellen können in ausgewählte Regionen innerhalb des Gehirns in dichte Nähe zu dem Bereich des Gehirntumors injiziert werden. Die Produzentenzellen werden in einer Spritze aufgezogen und dem Patienten verabreicht. Mehrfache Injektionen können in den Bereich des Tumors vorgenommen werden. Alternativ kann eine Höhle nahe des Bereichs des Gehirns, der vom Tumor betroffen ist, operativ hergestellt werden und die Produzentenzellen in diese Höhle eingelagert werden.
Die Anzahl von Zellen, die zur Erzielung der Zwecke der vorliegenden Erfindung erforderlich ist, ist in Abhängigkeit von der Größe, Alter, Gewicht des Patienten und Größe des Gehirntumors variabel. Die Zahl der Zellen kann von einem Fachmann des Gebiets ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden. Bei einer hierin beschriebenen Ausführungsform der Erfindung wurden genetisch modifizierte Produzentenzellen in Bindung an eine Trägermatrix in die Gehirne von Ratten implantiert. Histologische Untersuchungen zeigten, dass die Retrovirus-vermittelte Genex pression 30 Tage nach der Transplantation nachgewiesen werden konnte, was die erfolgreiche langfristige Expression der Retrovirus-Gene anzeigt.
Nachdem die Erfindung, nun allgemein beschrieben worden ist, wird diese nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die als Veranschaulichung dienen sollen, nicht aber die vorliegende Erfindung einschränken sollen, außer, wo spezifiziert, besser verständlich werden.
6. BEISPIEL: LANGFRISTIGE RETROVIRAL VERMITTELTE GENEXPRESSION IM SÄUGERGEHIRN
Der nachstehende Unterabschnitt beschreibt die Transplantation von Produzentenzellen in Bindung an eine Trägermatrix in das Gehirn von Ratten. Die transplantierten Produzentenzellen produzieren infektiöse Retroviruspartikel, die gentechnisch verändert worden sind, um das Alkalische Phosphatase-Gen zu exprimieren. Die Ergebnisse demonstrieren die erfolgreiche langfristige Expression des Alkalische Phosphatase-Gens im Gehirn des transplantierten Tiers.
6.1. MATERIALIEN UND METHODEN
6.1.1. TIERE UND ZELLPRÄPARIERUNG
Männliche Spraque-Dawley-(SD)-Ratten wurden von Taconic Farms (Germantown, NY) mit einem Gewicht von 120 – 150 g erhalten. Die Bing-Zelllinie stellt ein amphotropes Gegenstück zu der BOSC23-Zelllinie dar (W. Pear, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 90, 8392–8396, 1993), isoliert aus der 293T (293tsa1609neo) humanen embryonalen Nierenzelllinie (R.B. DuBridge, et al., Mol. Cell Biol. 7, 379–387, 1987), die retrovirale Überstände produzierte, die zum Infizieren von NIH3T3-Zellen bei Titern größer als 10⁶/ml nach einer vorübergehenden Transfektion fähig sind. In der Bing-Zelllinie wurden amphotrope Retrovirus-Konstrukte eingeführt, um Replikationsdefekte retrovirale Vektoren, wie etwa die LXSN-basierten retroviralen Vektoren, zu verpacken. Die Zelllinien wurden in Hochglucose-DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (Hyclone) und Antibiotika (Penicillin-Streptomycin-Lösung, Sigma) gehalten.
Der Alkalische Phosphatase-Vektor basiert auf einem retroviralen LNSX-Konstrukt (A. D. Miller, Human Gene Ther., 1, 5–14, 1990). Er enthält Alkalische Phosphatasecodierende Gene, unter der Kontrolle des Vektor-LTR und der G418-Resistenz und gesteuert über den SV40-Promotor.
Um die Transfektion durchzuführen, wurden 10⁷ Bing-Zellen, ausplattiert auf einer p100-Petrischale, mit 10 μg des Alkalische Phosphatase-Plasmids (gereinigt an einer Quiagen Maxi-prep-Säule gemäß den Anleitungen des Herstellers) unter Anwendung des standardmäßigen Calcium-Phosphat-Transfektionsprotokolls transfiziert (J. Sambrook, et al., Molecular Cloning, 2. Aufl.).
Zweiundsiebzig Stunden nach Transfektion wurden die Zellen geerntet, in fötales Kälberserum mit 10 % DMSO (Sigma) aufgeteilt und bei –70°C für eine Langzeitlagerung platziert. Ein Anteil der transfizierten Zellen wurde auf Glasträger übertragen, mit 2 % Paraformaldehyd fixiert und für 1 Stunde mit Nitro Blue Tetrazolium (Sigma) bei pH 8,5 angefärbt. Eine positive Färbung für Alkalische Phosphatase wurde bei 30 % der Bing-Zellen, die mit dem Alkalische Phosphatase-Vektor transfiziert waren, beobachtet; keine spezifische Färbung wurde in den uninfizierten Kontroll-Bing-Zellen beobachtet.
6.1.2. HEFTUNG DER ZELLEN AN MIKROTRÄGER
Vor der Heftung an Mikroträger wurden die Zellen dreimal in PC-1 (Hycor), einem serumfreien Medium, gewaschen und in PC-1 resuspendiert. Collagen-beschichtete Dextran-Mikrokügelchen (Cytodex^® 3, 100–200 μm) wurden durch Platzieren der Kügelchen in 10 ml sterilem destilliertem Wasser pro 1 Gramm Kügelchen und Erhitzen auf 121 °C für 15 min. sterilisiert. Die Lösung durfte sich auf Raumtemperatur abkühlen und das Wasser wurde weggegossen. Die Mikrokügelchen wurden dann in ein kleines Volumen des Kulturmediums suspendiert und für 30 min. stehen gelassen. Das Medium wurde entfernt, und die Kügelchen (etwa 0,21 g) wurden dem zu vor beschriebenen Zellpräprarat zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde für 2 Stunden geschüttelt, und weitere 4 ml an PC-1 wurden zugegeben. Der Kulturkolben wurde dann unter periodischem Mischen über Nacht inkubiert, um den Zellen das Haften an den Mikrokügelchen zu ermöglichen. Nach der Inkubation und vor der Implantation wurde eine Teilmenge entnommen und mit Trypan Blau umgesetzt, um die Zelllebensfähigkeit zu bestimmen, und die Anzahl von Zellen, die an den Mikrokügelchen haftete, wurde durch mikroskopische Untersuchung bestimmt. Diese Verfahrensweise führte zur Bindung von etwa 5 bis 7 Zellen an jeden Mikroträger bei einer Zelllebensfähigkeit von 95 % oder besser.
6.1.3. VERABREICHUNG DER ZELLEN
Die Tiere wurden unter Verwendung von Natriumpentobarbital (40 mg/kg, ip) anästhesiert, und die Operation wurde unter aseptischen Bedingungen vorgenommen. Die Zellen wurden in die Caudat/Putamen-Region des Gehirns unter Anwendung einer stereotaktischen Injektion injiziert. Vier Gruppen von jeweils drei Tieren wurden implantiert mit 1) nicht-transfizierten Zellen alleine, 2) nicht-transfizierten Zellen an Mikroträgern, 3) transfizierten Zellen alleine, und 4) transfizierten Zellen an Mikroträgern. Das Implantat wurde (nach Korrektur) bei 1,5 mm vor dem Bregma, 2,0 mm seitlich und 5,0 mm unterhalb der Oberfläche der Dura platziert. Der Kieferknochen befand sich bei –3,3 mm. Die stereotaktischen Koordinaten wurden für jedes einzelne Tier unter Verwendung der Position direkt über dem Bregma als den Nullwert-Koordinaten korrigiert. Die dorsal-ventralen Werte waren von der Oberfläche der Dura mater aus bemessen. Sobald die Nadel korrekt platziert war, wurden die Zellen bei einer Rate von 1 μl/min. injiziert, bis ein Endvolumen von 5 μl injiziert worden war. Ein dicht sitzendes Stilett wurde in die Bohrung der Nadel eingeführt, um restliche Kügelchen durchzudrücken, die an der Nadel haften geblieben sein konnten. Die Operationsstelle wurde unter Verwendung von Clay-Adams 9 mm-Wundklammern geschlossen.
6.1.4. HISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNG
Die Ratten wurden mit Natriumpentobarbital, 60 mg/kg i.p., anästhesiert und die Tiere mit 400 ml heparinisierter Phosphat-gepufferter Salzlösung perfundiert, gefolgt von einer Perfussion mit 400 ml an 1 % Glutaraldehyd/4 % Paraformaldehyd/0,1 M Na-Phosphat, pH 7,2. Die Gehirne wurden entfernt und in 30 % Sucrose in PBS eingebracht, und gefrorene Schnitte von 28 μm oder 50 μm wurden präpariert. Die Schnitte wurden in nummerierte Reagenzröhrchen übertragen, die PBS enthielten, auf Gelatine-beschichtete Träger platziert und für Alkalische Phosphatase durch Reaktion für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat/Iodonitrotetrazolium (BCIP/INT) (Biomedia, Foster City, CA) angefärbt, was ein braunes Reaktionsprodukt erbrachte. Eine routinemäßige Histologie wurde an 10 μm-Paraffinsschnitten, angefärbt mit Hämatoxylin und Eosin, vorgenommen.
6.2. ERGEBNISSE
Die Tiere wurden 30 Tage nach der Implantation geopfert und histologische Untersuchungen wurden vorgenommen. 1–3 veranschaulichen die in diesen Studien erhaltenen Ergebnisse.
Schnitte aus den Gehirnen der Ratten, die mit nicht-transfizierten Zellen ohne Mikroträger implantiert waren, zeigten kein BCIP/INT-positives Material. Schnitte, die an der Transplantatstelle entnommen waren, der Gehirne von Ratten, denen transfizierte Zellen verabreicht worden waren, die ohne Mikroträger implantiert waren, zeigten wenig oder kein BCIP/INT-positives Material (2).
Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die Mikroträger selbst ein färbendes Artefakt produzierten, wurden nicht-transfizierte Zellen, die an Mikroträgern implantiert wurden, ebenfalls untersucht. 1 zeigt einen typischen Schnitt, der an der Implantatstelle entnommen war. Das Fehlen einer Färbung durch das Chromogen BCIP/INT zeigt, dass die Cytodex^®-Mikroträger nicht zum in 3 erkennbaren Färbungsmuster beitragen.
Wurden Zellen mit Cytodex^®-Mikroträgern implantiert und die Histologie 30 Tage später vorgenommen, so zeigte sich ein unterschiedliches Muster. 3 zeigt einen Schnitt bei 20-facher Vergrößerung aus dem Gehirn einer Ratte, die 30 Tage vorher mit CaK8p7-Zellen, transfiziert mit Alkalische Phosphatase-Gen-Plasmid, implantiert worden war. Die Färbung mit BCIP/INT lässt zahlreiche Zellen an oder nahe der Kügelchenoberfläche erkennen, die für Alkalische Phosphatase positiv sind. Dies steht in scharfem Kontrast zu Zellen, die ohne die Mikroträger implantiert sind (2).
Die in diesen Studien erhaltenen Ergebnisse weisen nach, dass die vorherige Adhäsion der Zellen an Mikroträger vor der Implantation die Lebensfähigkeit der implantierten Zellen erhöht und das therapeutische Fenster der Gentherapie vergrößert. Bei Anwendung auf die Produzentenzell-Methodologie sollte diese verlängerte Reaktion ihre therapeutische Wirksamkeit durch einen erhöhten Gentransfer an das ZNS maximieren.

Claims

Trägermatrix mit einer Viruspartikel-Produzentenzelle, die an ihre Oberfläche angeheftet ist, in welche Zelle ein viraler Expressionsvektor mit einer Nukleotidsequenz, die einen tumorizidalen oder Anfälligkeitsfaktor codiert, eingeführt worden ist, zum Übertragen des tumorizidalen oder Anfälligkeitsfaktors in Tumorzellen in einem Säugergehirn, durch Transplantieren der Trägermatrix in die umittelbare Nähe der Tumorzellen, wobei nach dem Transplantieren eine langfristige Expression des tumorizidalen oder Anfälligkeitsfaktors in der Viruspartikel-Produzentenzelle erfolgt.
Trägermatrix nach Anspruch 1, wobei die Produzentenzelle eine Retrovirus-Produzentenzelle ist, in welche Zelle ein retroviraler Expressionsvektor eingeführt worden ist.
Trägermatrix nach Anspruch 2, wobei der retrovirale Vektor intakte Packungssignale enthält.
Trägermatrix nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei der retrovirale Vektor ein selektierbares Markergen enthält.
Trägermatrix nach Anspruch 2, wobei die Produzentenzelle ein Provirus enthält, dem eine Packungssignalsequenz fehlt, die zur Einkapselung der RNA-Transkripte des Provirus in reife Viruspartikel erforderlich ist.
Trägermatrix nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die Produzentenzelle BOSC 23, Psi 2 oder Psi Am ist.
Trägermatrix nach Anspruch 1, wobei der virale Vektor ein Adenovirusvektor oder ein Adeno-assoziierter Virusvektor ist.
Trägermatrix nach jedem vorangehenden Anspruch, wobei die Nukleotidsequenz, die den tumorizidalen oder Anfälligkeitsfaktor codiert, Herpes simplex-Thymidinkinase codiert.
Trägermatrix nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Nukleotidsequenz, die den tumorizidalen oder Anfälligkeitsfaktor codiert, Cytosindeaminase-Gen codiert.
Trägermatrix nach jedem vorangehenden Anspruch, wobei die Trägermatrix ein poröses oder nichtporöses Mikrokügelchen ist.
Trägermatrix nach Anspruch 10, wobei das Mikrokügelchen einen Durchmesser von etwa 90 μm bis etwa 150 μm aufweist.
Trägermatrix nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Trägermatrix aus einem Material hergestellt ist, ausgewählt aus Siliconoxid, Polystryol, Polypropylen, Polyethylen, Polycarbonat, Polypenten, Acrylnitrilpolymer, Nylon, natürlichem Polysaccharid, modifiziertem Polysaccharid, Amylose, Gelatine, Collagen, Agar, Magnetit, Hyaluronsäure und extrazellulärer Matrix.
Trägermatrix nach Anspruch 2, wobei die Produzentenzelle eine Zelllinie ist, die durch stabiles Einführen in eine Säugerwirtszelle eines retroviralen Vektors erzeugt ist, dem eine Packungssignalsequenz fehlt, die zur Einkapselung der RNA-Transkripte des Provirus in reife Viruspartikel erforderlich ist.
Verwendung einer Trägermatrix mit einer Viruspartikel-Produzentenzelle, die an ihre Oberfläche angeheftet ist, in welche Zelle ein viraler Expressionsvektor mit einer Nukleotidsequenz, die einen tumorizidalen oder Anfälligkeitsfaktor codiert, eingeführt worden ist, für die Herstellung eines Medikaments zum Übertragen des tumorizidalen oder Anfälligkeitsfaktors in Tumorzellen in einem Säugergehirn, durch Transplantieren der Trägermatrix in unmittelbare Nähe der Tumorzellen, wobei nach dem Transplantieren eine langfristige Expression des tumorizidalen oder Anfälligkeitsfaktors in der Viruspartikel-Produzentenzelle erfolgt.
Verwendung einer Trägermatrix nach Anspruch 14, wobei die Produzentenzelle eine Retroviruspartikel-Produzentenzelle ist, in welche Zelle ein retroviraler Expressionsvektor eingeführt worden ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Trägermatrix mit einer assoziierten Viruspartikel-Produzentenzelle, wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definiert.