JP2004337176A

JP2004337176A - 中枢神経系への遺伝子導入のための方法

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Publication number: JP2004337176A
Application number: JP2004234879A
Authority: JP
Inventors: Bruce Cherskey; チェースキイブルース; Louis R Bucalo; アール．ブカロルイス
Original assignee: New York University Medical Center; Titan Pharmaceuticals Inc
Current assignee: New York University Medical Center; Titan Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-04-08
Filing date: 2004-08-11
Publication date: 2004-12-02
Also published as: CA2251232A1; DE69737101T2; EP0927043A1; ZA972971B; EP0927043B1; EP0927043B8; US6210664B1; DK0927043T3; US6565845B2; US20010003585A1; HK1021801A1; PT927043E; WO1997037684A1; DE69737101D1; AU724537B2; EP0927043A4; ES2277356T3; JP2000508641A; ATE347903T1; CA2251232C

Abstract

【課題】哺乳動物の脳にプロデューサー細胞を移植するための方法を提供すること。
【解決手段】プロデューサー細胞は、化学療法剤または放射性治療薬剤への感受性を腫瘍細胞に与える殺腫瘍因子または感受性因子をコードするレトロウイルスベースの組換えベクターで操作される。哺乳動物の脳への移植の前に、まず、プロデューサー細胞は、移植された細胞の長期生存性を増加させるためにおよび長期の機能的有益性を提供するために、支持マトリクス上でインビトロで培養される。
【選択図】なし

Description

（１．序説）
本発明は、哺乳動物の脳にプロデューサー細胞を移植するための方法に関する。プロデューサー細胞は、化学療法剤または放射性治療薬剤への感受性を腫瘍細胞に与える殺腫瘍因子または感受性因子をコードするレトロウイルスベースの組換えベクターで操作される。哺乳動物の脳への移植の前に、まず、プロデューサー細胞は、移植された細胞の長期生存性を増加させるためにおよび長期の機能的有益性を提供するために、支持マトリクス上でインビトロで培養される。

（２．本発明の背景）
脳腫瘍は、３５歳よりも若いヒトにおけるガン死の主要な原因である。中枢神経系腫瘍の発生率は、ホジキン病の２倍以上、黒色腫の半分以上であり、そして婦人では、中枢神経系の腫瘍によって引き起こされる死亡率の頻度は、卵巣ガンによって引き起こされる頻度とほぼ等しい。子供では、脳腫瘍は、最も普通の充実性腫瘍であり、そして小児ガンの全体の原因として白血病に次いで２番目である。（Ｄａｌｅ，Ｄ．Ｃ．およびＦｅｄｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｄ．，１９９５，ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，第７章）。ほとんどの脳腫瘍は手術不可能である。そして手術可能な脳腫瘍についてでさえも、外科手術は非常に困難であり、そしてしばしば神経学的障害を生じる。

レトロウイルスベクター媒介遺伝子治療のインビボ適用は、脳腫瘍の処置に適用されている（Ｏｌｄｆｉｅｌｄら，１９９３，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．；４：３９−６９；Ｃｕｌｖｅｒら，１９９２Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１５５０−２）。おそらく、遺伝子治療の最も広く研究された適用は、比較的非傷害性のプロドラッグを活性化して高傷害性の薬剤を形成するタンパク質を発現するように遺伝子操作されたレトロウイルスを利用する。例えば、感受性因子を発現するレトロウイルスプロデューサー細胞は、腫瘍細胞を殺すために患者の脳組織に移植されている（Ｂａｒｂａ，Ｄ．ら，ＷＯ９３／０４１６７）。この系のある特定の適用は、ガンシクロビルおよびアシクロビルのような抗ウイルス剤への感受性を与える単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子を利用する（Ｂａｒｂａら，ＷＯ９３／０４１６７；Ｍｏｏｌｔｅｎ，Ｆ．Ｌ．ら，１９８６，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ４６：５２７６−５２８１）。ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子産物は、哺乳動物細胞のＴＫに対して不十分な基質である多くのヌクレオシドアナログのリン酸化を触媒する。例えば、抗ヘルペス剤のアシクロビルは、ＨＳＶ−ＴＫ活性のない細胞に対して最小の傷害性を示すが、ＨＳＶ−ＴＫを発現する細胞においてＤＮＡ合成を阻害し得る傷害性形態へ活性化され、そしてＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を発現する細胞への選択的細胞傷害性を示すことが示されている。

レトロウイルスベクター媒介性遺伝子治療の使用に関連する１つの問題は、移植されたプロデューサー細胞が、最大治療利益を達成するために必要とされる期間にわたって治療遺伝子を生存および／または発現し続け得ないことである。一般的に、脳に直接移植された細胞が約２〜４週間以内に死ぬことが知られている（例えば、Ｉｔｕｋｕｒａ，Ｔ．ら，１９８８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．６８：９５５−９５９を参照のこと）。いくつかの場合には、インビボでの移植前の、細胞のマイクロキャリアへの接着は、移植された細胞の長期生存性を増大させることが示されている（Ｃｈｅｒｓｋｅｙら；ＷＯ９２０６７０２）が、現在この方法はレトロウイルスプロデューサー細胞株にうまく適用されていない。

本発明の目的は、哺乳動物の脳にプロデューサー細胞を移植するための方法を提供することである。

本発明は、細胞を殺すために哺乳動物腫瘍細胞に殺腫瘍または感受性遺伝子を導入するための方法であって、
ａ）殺腫瘍または感受性遺伝子を有するウイルス発現ベクターを哺乳動物細胞に導入する工程；
ｂ）哺乳動物細胞を、インビトロで支持マトリクスの表面に接着させる工程；および
ｃ）哺乳動物腫瘍細胞に近接して、接着した哺乳動物細胞を有する支持マトリクスを移植する工程、
を包含する、方法、である。

本発明はまた、細胞を殺すために哺乳動物腫瘍細胞に殺腫瘍または感受性遺伝子を導入するための方法であって、
ｄ）殺腫瘍または感受性遺伝子を有するレトロウイルス発現ベクターをプロデューサー細胞に導入する工程；
ｅ）プロデューサー細胞を、インビトロで支持マトリクスの表面に接着させる工程；および
ｆ）哺乳動物腫瘍細胞に近接して、接着したプロデューサー細胞を有する支持マトリクスを移植する工程、
を包含する、方法、である。

好適な実施形態においては、上記腫瘍細胞が脳腫瘍細胞である。

好適な実施形態においては、上記殺腫瘍または感受性遺伝子が、単純ヘルペスチミジンキナーゼをコードする。

好適な実施形態においては、前記殺腫瘍または感受性遺伝子が、シトシンデアミナーゼ遺伝子をコードする。

好適な実施形態においては、前記レトロウイルスベクターが、インタクトなパッケージングシグナルを含む。

好適な実施形態においては、上記レトロウイルスベクターが、選択マーカー遺伝子を含む。

好適な実施形態においては、前記プロデューサー細胞が、プロウイルスのＲＮＡ転写物の成熟ウイルス粒子へのキャプシド形成に必要とされるパッケージングシグナル配列を欠失するプロウイルスを含む。

好適な実施形態においては、上記プロデューサー細胞がＢＯＳＣ２３である。

好適な実施形態においては、上記プロデューサー細胞がＰｓｉ２である。

好適な実施形態においては、上記プロデューサー細胞がＰｓｉＡｍである。

好適な実施形態においては、上記支持マトリクスが、多孔性または非多孔性マイクロビーズである。

好適な実施形態においては、前記マイクロビーズが、約９０μｍ〜約１５０ｃｍの直径を有する。

好適な実施形態においては、上記支持マトリクスが、酸化シリコーン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリペンテン、アクリロニトリルポリマー、ナイロン、天然多糖、改変多糖アミラーゼ、コラーゲン、天然セルロース、改変セルロース、寒天、磁鉄鉱、ヒアルロン酸、および細胞内マトリクスからなる群より選択される物質から作成される。

好適な実施形態においては、上記プロデューサー細胞が、成熟ウイルス粒子へのプロウイルスのＲＮＡ転写物のキャプシド形成に必要とされるパッケージングシグナル配列を欠失するレトロウイルスベクターを、哺乳動物宿主細胞に安定に導入することによって生成される細胞株である。

（３．発明の要旨）
本発明は、脳腫瘍細胞に殺腫瘍因子または感受性因子をコードする遺伝子を導入するための方法に関する。この方法は、哺乳動物の脳に殺腫瘍因子または感受性因子をコードするレトロウイルスベースの組換えベクターで操作されたプロデューサー細胞の移植を包含する。操作されたプロデューサー細胞は、隣接した脳腫瘍細胞に感染し、それによって腫瘍細胞が化学療法剤または放射性治療薬剤に感受性になる感染性レトロウイルス粒子を産生し得る。レトロウイルスベクター遺伝子導入システムは、脳における組込みおよび遺伝子発現のための増殖する標的細胞を必要とするので、このシステムの脳腫瘍への適用は、レトロウイルスが脳腫瘍の増殖する細胞に標的化されるが、正常な増殖しない脳細胞は感染されないままであるという利点を有する。

殺腫瘍または感受性因子をコードする多くの遺伝子は、本発明の実施において使用され得る。このような遺伝子は、比較的非傷害性な産物を高傷害性な薬剤へ変換し得る酵素をコードする。このような遺伝子を発現するように遺伝子操作された細胞は、適切なプロドラッグの存在下で、本質的に代謝的自殺をする。

本発明の１つの実施態様において、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子は、組換えレトロウイルスベクターに操作され得る。続いて、組換えレトロウイルスで感染されそしてＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を発現する任意の細胞は、アシクロビルおよびガンシクロビルのような化学療法剤に感受性になる。本発明の他の実施態様において、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子は、組換えレトロウイルスベクターに操作され得る。ＣＤ遺伝子を発現する細胞は、比較的非傷害性産生５−フルオロシトシンを高傷害性５−フルオロウラシルに代謝する（Ｍｕｌｌｅｎ，ＣＡら，１９９４，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５４：１５０３−６）。

本発明の方法は、哺乳動物の脳への移植の前の支持マトリクス上でのプロデューサー細胞のインビトロ培養をさらに包含する。脳での移植前のマイクロキャリアへの細胞の予備接着は、移植された細胞の長期生存性を増大しそして長期の機能的利点を提供するように設計される。

本発明は、一部は、哺乳動物の脳への移植前のプロデューサー細胞のマイクロキャリアへの予備接着が、移植された細胞の生存性を増大させるという実証に基づく。本明細書に記載される特定の実施態様では、プロデューサー細胞はラットの脳に移植された。移植されたプロデューサー細胞は、アルカリホスファターゼ遺伝子を発現するように遺伝子操作されている感染性レトロウイルス粒子を産生する。結果は、移植された動物の脳におけるアルカリホスファターゼ遺伝子の首尾よい長期発現を実証する。

（５．発明の詳細な説明）
本発明は、殺腫瘍因子または感受性因子をコードするレトロウイルスベースの組換えベクターで操作されたプロデューサー細胞の、哺乳動物の脳への移植を包含する、脳腫瘍を処置するための方法に関する。プロデューサー細胞は、脳腫瘍細胞に感染し、それによって腫瘍細胞を化学療法剤に感受性にする、感染性レトロウイルス粒子を産生し得る。プロデューサー細胞の長期生存性は、移植前の支持マトリクス上でのプロデューサー細胞のインビトロ培養によって増大され得る。

特に、目的のＤＮＡが、「プロデューサー細胞」に効率的および安定に導入され、これは後に哺乳動物の脳に移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）または移植（ｇｒａｆｔ）され得る支持マトリクスに移され得ることが実証されている。プロデューサー細胞は、移植されたプロデューサー細胞に密接して位置する脳組織を感染させ得る感染性レトロウイルス粒子を産生する。感染した脳組織は、移植後３０日まで目的の遺伝子を発現することが示された。

（５．１．レトロウイルスベクター）
殺腫瘍または感受性因子を発現させるために、このような因子をコードするヌクレオチド配列は、適切なレトロウイルス発現ベクターに挿入される。当業者に周知である方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルに作動可能に結合された殺腫瘍または感受性ヌクレオチドコード配列を含む組換えレトロウイルスベクターを構築する。殺腫瘍または感受性コード配列を含む組換えレトロウイルスベクターの構築物は、当該分野で十分に理解される標準的な連結および制限技術を使用して生成され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，第２版，１９８９、およびＡｕｓｅｌｂｅｌら，１９８９，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ＆ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．に記載の技術を参照のこと。

種々のレトロウイルスベースの組換えベクターは、当業者によって同様に十分に利用され得る。組換えベクターは、種々の量のレトロウイルス配列を含み得、これには、宿主ゲノムへの組込みに必要とされるレトロウイルス長末端反復配列（ＬＴＲＳ）、および成熟ウイルス粒子へのプロウイルスの組換えＲＮＡ転写物のキャプシド形成に必要なパッケージングシグナル（ｐｓｉ）が含まれる。特に適切なレトロウイルスベクターには、参考として援用される以下の参考文献のそれぞれに記載されるものが含まれるが、これらに限定されない：ＳＡＸベクター（Ｋａｎｔｏｆｆ，Ｐ．Ｗ．ら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：６５６３）；Ｎ２ベクター（Ｄ．Ａｒｍｅｎｔａｎｏら，１９８７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６１：１６４７）；ＬＸＳＮＡベクター（ＭｉｌｌｅｒＡ．Ｄ．ら，１９８９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ７：９８０−９９０）；およびＬＡＳＮベクター（Ｂｌｏｏｄ７２：８７６−８１）。

組換えベクターはまた、アンピシリンおよびテトラサイクリンのような抗生物質への耐性を与えるために必要な細菌プラスミド配列、および細菌での複製に必要とされる配列を含み得る。さらに、組換えベクターは、安定にトランスフェクトされた細胞を同定するために使用され得る選択マーカー遺伝子を含み得る。組換えベクター中の選択マーカーは、選択に対する耐性を与え、そして細胞がその染色体へ組換えレトロウイルス発現ベクターを安定に組み込むことを可能にする。この方法は、後に感染性レトロウイルス粒子を産生する首尾よくトランスフェクトされたプロデューサー細胞株を同定するために、有利に使用され得る。

以下を含むがこれらに限定されない多くの選択システムが使用され得る：ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ，１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４８：２０２６）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら，１９８０，Ｃｅｌｌ２２：８１７）遺伝子が、それぞれＨＧＰＲＴ⁻およびＡＰＲＴ⁻細胞において用いられ得る。また、メトトレキセートへの耐性を与えるＤＨＦＲ（Ｗｉｇｌｅｒら，１９８０，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：１５２７）；ミコフェノール酸への耐性を与えるＧＰＴ（ＭｕｌｌｉｎｇａｎおよびＢｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１）；およびハイグロマイシンへの耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら，１９８４，Ｇｅｎｅ３０：１４７）遺伝子についての選択の基礎として、抗代謝物耐性が使用され得る。最近、さらなる選択遺伝子が記載されている：すなわち、細胞にトリプトファンの代わりにインドールを利用させるｔｒｐＢ；細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用させるｈｉｓＤ（ＨａｒｔｍａｎおよびＭｕｌｌｉｇａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８０４７）；およびオルニチンデカルボキシラーゼインヒビターである２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯへの耐性を与えるＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅＬ．，１９８７，ＣｕｒｒｅｎｔＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ編）。

多くの殺腫瘍または感受性因子が、本発明の実施に使用され得る。このような因子は、細胞に化学療法剤への感受性を与えるものとして定義される。本発明の１つの特定の実施態様では、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子が、組換えレトロウイルスベクターに挿入される。ＨＳＶ−ＴＫコード領域は、種々の公衆に入手可能なクローンに由来し得る（Ｗｉｇｌｅｒら，１９７７，Ｃｅｌｌ１１：２２３）。このようなレトロウイルスベクターでの腫瘍細胞の感染は、細胞にアシクロビルおよびガンシクロビルのような薬物への感受性を与える。

本発明によれば、殺腫瘍または感受性因子をコードするヌクレオチド配列は、レトロウイルスＬＴＲプロモーター−エンハンサーシグナルに作動可能に結合され得る。作動可能な連結は、ＬＴＲプロモーター／エンハンサー配列および殺腫瘍または感受性遺伝子が、遺伝子発現を可能にするように結合される連結である。あるいは、他のプロモーター／エンハンサー配列は、挿入された配列の転写を提供するために、当業者に同様に十分に利用され得る。例えば、哺乳動物細胞のゲノムから単離された、哺乳動物細胞での増殖許容性ウイルスから単離された、または組換えＤＮＡもしくは合成技術によって産生されたプロモーター／エンハンサーエレメントは、殺腫瘍または感受性因子をコードする遺伝子の転写を提供するために使用され得る。構成性および誘導性プロモーターを含む多数の適切なプロモーター／エンハンサーエレメントのいずれかが、発現ベクターにおいて使用され得る。

挿入された遺伝子の効率的な翻訳に必要とされる特定の開始シグナルもまた、レトロウイルス発現ベクターに含まれ得る。ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含み得るこれらの外因性翻訳制御配列は、天然および合成の両方の種々の起源であり得る。それ自体の開始コドンおよび隣接配列を含む殺腫瘍または感受性因子全体が適切な発現ベクターに挿入される場合、追加の翻訳シグナルは必要ではない。しかし、殺腫瘍または感受性コード配列の一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始を含む外因性翻訳制御シグナルは、全体のインサートの翻訳を確実にするために、殺腫瘍または感受性コード配列のリーディングフレームと一致しなければならない。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの包含によって増大され得る（Ｂｉｔｔｅｒら，１９８７，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照のこと）。

本明細書に記載の特定の実施態様においては、プロデューサー細胞は、ＳＶ４０プロモーターによって駆動されるベクターＬＴＲおよびＧ４１８耐性の制御下で、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子を含むように遺伝子操作したレトロウイルスベクターでトランスフェクトされた。トランスフェクトプロデューサー細胞を、コラーゲンコートしたデキストランマイクロキャリアに接着させ、次いでラット脳へ移植した。移植後３０日に行った組織学的研究は、レトロウイルス感染した細胞でのアルカリホスファターゼ遺伝子の長期発現を示した。

組換えレトロウイルスベクターは、本発明の方法での使用に好ましいベクターであるが、他のウイルスベクターもまた、殺腫瘍または感受性遺伝子を発現するために使用され得る。例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、パピローマウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ならびに他のヒトおよび動物ウイルスが、哺乳動物の脳に移植されるべき細胞において、殺腫瘍または感受性因子を発現するために使用され得る。例えば、アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、殺腫瘍または感受性因子コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御配列複合体（例えば、後期プロモーターおよび３つからなる（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列）に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１およびＥ３）における挿入は、感染した宿主細胞において生存可能でありそして殺腫瘍または感受性遺伝子を発現し得る組換えウイルスを生じる（例えば、ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：３６５５−３６５９を参照のこと）。

（５．２．パッケージング細胞株）
伝染性レトロウイルス粒子を産生するために、組換えレトロウイルス発現ベクターは安定な「プロデューサー」細胞株にトランスフェクトされる。プロデューサー細胞株は、成熟ウイルス粒子へのウイルス転写物のパッケージングにトランスで必要とされるレトロウイルス機能のすべてを発現する、安定に組込まれたプロウイルスを含む。これらには、群特異的抗原（ｇａｇ）、エンベロープ（ｅｎｖ）、およびポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子が含まれる。ｇａｇ遺伝子は、内部構造（ヌクレオキャプシド）タンパク質をコードする；ｐｏｌ遺伝子は、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（逆連写酵素）をコードする；そしてｅｎｖ遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。安定に組み込まれたプロウイルスの１つの本質的な特徴は、通常ウイルス転写物のパッケージングにシスで必要なシグナルを提供するパッケージング配列（ｐｓｉ配列）を欠失することである。したがって、プロウイルスの発現から生じる転写物は、ウイルス粒子にパッケージされず、むしろウイルス粒子のパッケージングに必要とされる遺伝子産物をトランスで提供する。

レトロウイルスベクターは、効果的な感染のために細胞分裂およびＤＮＡ合成を必要とするので、組込みおよび遺伝子発現「プロデューサー」細胞は、好ましくは、活発に増殖する細胞である。このようなプロデューサー細胞は、線維芽細胞、ニューロン、グリア細胞、角質細胞、肝細胞、または本発明の方法を使用してトランスフェクトおよび移植され得る任意の他の哺乳動物細胞を含み得る。

種々のプロデューサー細胞株が、本発明の方法での使用に用いられ得る。例えば、既に存在しているレトロウイルスプロデューサー細胞株は、本発明の実施で利用され得る。このような細胞株には、ＢＯＳＣ２３（Ｐｅａｒ，Ｗ．Ｓ．ら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：８３９２−８３９６）、Ｐｓｉ２（Ｃｏｎｅ，Ｒ．Ｄ．ら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６３４９−６３５３）、Ｐｓｉａｍ（Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｊ．Ｗ．ら，１９７６，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ１９：１９−２５）細胞株、またはウイルスパッケージングに必要な遺伝子産物をトランスで提供する任意の他の機能的に等価なプロデューサー細胞株が含まれ得る。

あるいは、さらなる新規のプロデューサー細胞株が生成され得る。さらなるプロデューサー細胞株を生成するために、ウイルスアセンブリにトランスで必要とされるタンパク質をすべて合成するレトロウイルスベクターが、活発に増殖する細胞にトランスフェクトされる。当業者に周知である種々のトランスフェクション技術が、プロデューサー細胞株にレトロウイルス発現ベクターを移入するために利用され得る。このような技術には、リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎトランスフェクションエレクトロポレーション、またはリポソーム媒介ＤＮＡ移入が含まれる。

次に、プロデューサー細胞は、殺腫瘍または感受性遺伝子、および必要に応じて選択マーカーをコードするＤＮＡを含む組換えレトロウイルスベクターでトランスフェクトされる。組換えベクターが選択マーカーを含む場合、トランスフェクトした細胞についての選択は、移植前に行われ得る。

（５．３．パッケージング細胞株のインビトロ培養）
移植プロデューサー細胞の長期生存性を増加させるために、プロデューサー細胞を、最初に、インビトロで支持マトリクス上に接着させる。支持マトリクスが構成され得る物質には、細胞がインビトロインキュベーション後に接着する物質、およびその上で細胞が増殖し得る物質が挙げられ得、そしてこれらは、移植された細胞の破壊あるいは生物学的または治療活性を妨害する傷害性反応または炎症性反応を生じることなく、哺乳動物の脳に移植され得るこのような物質は、合成または天然の化学物質、または生物学的起源を有する物質であり得る。このような物質には、ガラスおよび他の酸化シリコーン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニリデンフルオライド、ポリウレタン、ポリアルギネート、ポリスルホン、ポリビニルアルコール、アクリロニトリルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ポリペンテン（ｐｏｌｙｐｅｎｔｅｎｔ）、ナイロン、アミラーゼ、ゼラチン、コラーゲン、デキストランおよびセルロース（例えば、ニトロセルロース）を含む天然および改変多糖、寒天、および磁鉄鉱が含まれるが、これらに限定されない。再吸収可能かまたは再吸収可能でないかのいずれかの物質が使用され得る。細胞外マトリクス物質も意図されており、これは当該技術分野で周知である。細胞外マトリクス物質は、市販され得るか、またはこのようなマトリクスを分泌する細胞を増殖させ、分泌細胞を除去し、そして移植されるべき細胞をマトリクスと相互作用およびこれに接着させることによって調製され得る。移植されるべき細胞が増殖する、または細胞が混合されるマトリクス物質は、移植されたプロデューサー細胞自体の固有の産物であり得る。したがって、例えば、マトリクス物質は、移植されるべきプロデューサー細胞によって産生および分泌される細胞外マトリクスまたは基底膜物質であり得る。

細胞接着、生存、および機能を改良するために、固体マトリクスは、必要に応じて、細胞接着、増殖、または生存を促進するために当該技術分野で公知の因子で、その外部表面上をコートされ得る。このような因子には、細胞接着分子、細胞外マトリクス（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチン、グリコサミノグリカン、またはプロテオグリカンなど）、あるいは増殖因子（例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）など）が含まれる。あるいは、移植された細胞が接着される固体マトリクスが多孔性物質から構築される場合、１つまたは複数の増殖または生存促進因子は、マトリクス物質に組込まれ、インビボ移植後にそこから除放され得る。

本発明による支持体に接着される場合、移植に使用される細胞は、一般的に、支持体の「外表面」上にある。支持体は固体または多孔性であり得る。しかし、多孔性支持体においても、細胞は、介在する膜または他の障壁なしに外部環境と直接的に接触する。したがって、本発明によれば、細胞は、たとえそれらが接着する表面が粒子またはビーズ自体の外部にない、多孔性支持体物質の内部フォールドまたは屈曲の形態であり得る場合でも、支持体の「外表面」上にあると考えられる。

支持体の形状は、ビーズにおける場合、好ましくは球状であるが、円柱状、楕円状、平板または細片、針またはピン形態などであり得る。支持マトリクスの好ましい形態はガラスビーズである。別の好ましいビーズはポリスチレンビーズである。ビーズサイズは、約１０μｍ〜１ｃｍ、好ましくは約９０〜約１５０μｍの直径の範囲であり得る。種々のマイクロキャリアビーズの記載については、例えば、ＦｉｓｈｅｒＢｉｏｔｅｃｈＳｏｕｒｃｅ８７−８８，ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏ．，１９８７，７３７２−７５頁；ＳｉｇｍａＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＣａｔａｌｏｇ，ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ，．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，１９９１，１６２−１６３頁；ＶｅｎｔｒｅｘＰｒｏｄｕｃｔＣａｔａｌｏｇ，ＶｅｎｔｒｅｘＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１９８９を参照のこと；これらの参考文献は参考として本明細書に援用される。ビーズサイズの上限は、移植された細胞の機能を妨害しまたは周囲の脳組織に傷害を生じ得る神経膠症のような、望ましくない宿主反応のビーズの刺激によって指示される。このような限定は、当業者によって容易に決定可能である。

（５．４．パッケージング細胞の移植）
殺腫瘍または感受性遺伝子を発現するプロデューサー細胞は、インビトロで増殖され、そして支持マトリクスに接着される。本発明の方法は、腫瘍によって影響を及される脳の領域に、目的の治療遺伝子を含むプロデューサー細胞の脳内移植を包含する。脳に細胞を移植するための方法は、ＮｅｕｒａｌＧｒａｆｔｉｎｇｉｎｔｈｅＭａｍｍａｌｉａｎＣＮＳ，１９８５，ＢｊｏｒｋｌｕｎｄおよびＳｔｅｎｅｖｉ編、およびＧａｇｅら，ＢｒａｉｎＲｅｓｅａｒｃｈに記載され、これらのそれぞれは参考として本明細書に援用される。脳に細胞を移植するための手順には、１）宿主細胞内にプロデューサー細胞を注入する工程、または２）プロデューサー細胞を配置するための外科的手段によって腔を調製する工程が含まれる。

プロデューサー細胞は、脳腫瘍の領域に密接する脳内の選択された領域に注入され得る。プロデューサー細胞は、シリンジ中に吸い上げられ、そして患者に投与される。複数回の注入が腫瘍の領域に行われ得る。あるいは、腔が腫瘍によって影響を及ぼされる脳の領域に隣接して外科的に調製され得、そしてプロデューサー細胞は腔内に配置され得る。

本発明の目的を達成するために必要とされる細胞の数は、被験体のサイズ、年齢、体重、および脳腫瘍のサイズに依存して変化する。細胞の数は、過度の実験なしに当業者によって決定され得る。本明細書に記載される本発明の実施態様においては、支持マトリクスに接着された遺伝子改変されたプロデューサー細胞が、ラットの脳に移植された。組織学的研究は、レトロウイルス遺伝子の首尾良い長期発現を示す移植後３０日に、レトロウイルス媒介遺伝子発現が検出され得たことを示す。

本発明をここで一般的に記載すると、同様のことが、例示のために提供されそして特定しない限り本発明の限定を意図しない、以下の実施例を参考にしてより容易に理解される。

（６．実施例：哺乳動物の脳における長期レトロウイルス媒介遺伝子）
以下の小節は、支持マトリクスに接着したプロデューサー細胞の、ラットの脳への移植を記載する。移植されたプロデューサー細胞は、アルカリホスファターゼ遺伝子を発現するように遺伝子操作されている感染性レトロウイルス粒子を産生する。結果は、移植された動物の脳におけるアルカリホスファターゼ遺伝子の首尾良い長期発現を実証する。

（６．１．材料および方法）
（６．１．１．動物および細胞調製物）
１２０〜１５０ｇの体重の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを、ＴａｃｏｎｉｃＦａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から得た。Ｂｉｎｇ細胞株は、一過性トランスフェクションに続いて、１０^６／ｍｌより大きい力価でＮＩＨ３Ｔ３細胞を感染させ得るレトロウイルス上清を産生した２９３Ｔ（２９３ｔｓａ１６０９ｎｅｏ）ヒト胚腎臓細胞株（Ｒ．Ｂ．ＤｕＢｒｉｄｇｅら，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．７，３７９−３８７，１９８７）から単離された、ＢＯＳＣ２３細胞株（Ｗ．Ｐｅａｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９０，８３９２−８３９６，１９９３）の両種指向性相対物である。Ｂｉｎｇ細胞株に、両種指向性レトロウイルス構築物を、ＬＸＳＮベースのレトロウイルスベクターのような、複製欠陥レトロウイルスベクターをパッケージするために導入した。細胞株を、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および抗生物質（ペニシリン−ストレプトマイシン溶液，Ｓｉｇｍａ）を補充した高グルコースＤＭＥＭ培地中で維持した。

アルカリホスファターゼベクターは、ＬＮＳＸレトロウイルス構築物に基づく（Ａ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒ．，１，５−１４，１９９０）。これは、ＳＶ４０プロモーターによって駆動されるベクターＬＴＲおよびＧ４１８耐性の制御下で、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子を含む。

トランスフェクションを行うために、ｐ１００ペトリディッシュ上にプレーティングした１０^７個のＢｉｎｇ細胞を、標準的なリン酸カルシウムトランスフェクションプロトコル（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，第２版）を使用して、１０μｇのアルカリホスファターゼプラスミド（製造者の指示に従ってＱｕｉａｇｅｎＭａｘｉ−ｐｒｅｐカラム上で精製した）でトランスフェクトした。

トランスフェクションの７２時間後、細胞を採取し、１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を含むウシ胎児血清中にアリコートし、そして長期保存のために−７０℃に置いた。トランスフェクトした細胞の一部を、ガラススライド上に移し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、そしてＮｉｔｒｏＢｌｕｅＴｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ）でｐＨ８．５にて１時間染色した。アルカリホスファターゼについての陽性染色を、アルカリホスファターゼベクターでトランスフェクトしたＢｉｎｇ細胞の３０％で観察した；特異的染色は、コントロールの感染していないＢｉｎｇ細胞では観察されなかった。

（６．１．２．マイクロキャリアへの細胞の接着）
マイクロキャリアへの接着の前に、細胞をＰＣ−１（Ｈｙｃｏｒ）中で３回、無血清培地中で１回洗浄し、そしてＰＣ−１に再懸濁した。コラーゲンコートしたデキストランマイクロキャリア（Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）、１００〜２００μｍ）を、１グラムのビーズ当たり１０ｍｌの滅菌蒸留水中にビーズを置き、そして１２１℃まで１５分間加熱することによって滅菌した。溶液を室温まで冷却させ、そして水を捨てた。次いで、マイクロキャリアを少量の培養培地中に懸濁し、そして３０分間放置した。培地を除去し、そしてビーズ（約０．２１ｇ）を上記の細胞調製物へ添加した。得られた混合物を２時間振盪し、そしてさらなる４ｍｌのＰＣ−１を添加した。次いで、培養フラスコを一晩周期的に混合しながらインキュベートして、細胞をマイクロキャリアに接着させた。インキュベーション後および移植の前に、アリコートを取り、そしてトリパンブルーと反応させて細胞生存性を決定し、そしてマイクロキャリアに接着した細胞の数を、顕微鏡検査によって決定した。この手順によって、９５％以上の良好な細胞生存性で、各マイクロキャリアへの約５〜７個の細胞の接着を得た。

（６．１．３．細胞の投与）
動物に、ペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）を用いて麻酔し、そして外科手術を無菌条件下で行った。細胞を、定位的注入を使用して脳の尾状／被殻領域に注入した。それぞれ３匹の動物の４つの群に、１）非トランスフェクト細胞単独、２）マイクロキャリア上の非トランスフェクト細胞、３）トランスフェクト細胞単独、および４）マイクロキャリア上のトランスフェクト細胞を移植した。移植物を、ブレグマの１．５ｍｍ後部、硬膜の表面の２．０ｍｍ側方および５．０ｍｍ下（補正後）に置いた。顎稜は−３．３ｍｍにあった。定位的座標を、ゼロ値座標としてブレグマの直上の位置を使用して、個々の動物について補正した。背−腹値は、硬膜の表面からであった。一旦針を正確に置くと、細胞を、５μｌの最終用量が注入されるまで、１μｌ／分の速度で注入した。堅く適合するスタイレットを、針の管腔に挿入して、針に接着し得る残りのビーズを押し出した。外科手術部位を、Ｃｌａｙ−Ａｄａｍｓ９ｍｍ創傷クリップを使用して閉じた。

（６．１．４．組織学的研究）
ラットに、ペントバルビタールナトリウム、６０ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．で麻酔し、そして動物を、４００ｍｌのヘパリン化リン酸緩衝化生理食塩水で灌流し、次いで４００ｍｌの１％グルタルアルデヒド／４％パラホルムアルデヒド／０．１ＭＮａリン酸，ｐＨ７．２で灌流した。脳を取り出してＰＢＳ中の３０％スクロース中に置き、そして２８μｍまたは５０μｍの凍結切片を調製した。切片を、ＰＢＳを含む番号付けした試験管に移し、ゼラチンコートしたスライド上に置き、そして褐色の反応産物を産生する５−ブロモ，４−クロロ，３−インドリルリン酸／ヨードニトロテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＩＮＴ）（Ｂｉｏｍｅｄｉａ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）との室温にて３０分間の反応によってアルカリホスフェートについて染色した。日常的な組織学を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した１０μｍパラフィン切片で行った。

（６．２．結果）
動物を、移植の３０日後に屠殺し、そして組織学的研究を行った。図１〜３は、これらの研究で得られた結果を示す。

マイクロキャリアの非存在下で非トランスフェクト細胞を移植したラットの脳からの切片は、ＢＣＩＰ／ＩＮＴ陽性物質を示さなかった。マイクロキャリアの非存在下で移植されたトランスフェクト細胞を投与されているラットからの脳の、移植部位から取った切片は、ＢＣＩＰ／ＩＮＴ陽性物質をほとんどまたは全く示さなかった（図２）。

マイクロキャリア自体が染色人工産物を生じた可能性を除外するために、マイクロキャリア上の移植された非トランスフェクト細胞も検査した。図１は、移植部位で取った代表的切片を示す。色素原ＢＣＩＰ／ＩＮＴによる染色の欠失は、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）マイクロキャリアが、図３で見られる染色パターンに寄与しないことを示す。

細胞をＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）マイクロキャリアの存在下で移植し、そして組織学を３０日後に行った場合、異なるパターンが出現した。図３は、アルカリホスファターゼ遺伝子プラスミドでトランスフェクトしたＣａＫ８ｐ７細胞を３０日前に移植したラットの脳からの２０×倍率での切片を示す。ＢＣＩＰ／ＩＮＴでの染色は、アルカリホスファターゼについて陽性である多くの細胞をビーズ表面でまたはその近くで示す。これは、マイクロキャリアの非存在下で移植した細胞と明確に対照をなす（図２）。

これらの研究で得られた結果は、移植前のマイクロキャリアへの細胞の予備接着が、移植された細胞の生存性を増強し、そして遺伝子治療の治療窓を延長することを示す。プロデューサー細胞方法論に適用する場合、この延長された応答は、ＣＮＳへの遺伝子送達を増加させることによって治療効率を最大にするであろう。

マイクロキャリアビーズ上の非トランスフェクト細胞を移植したラットの脳由来の切片（２０×倍率）。ビーズのまわりにほとんどまたは全く染色が見られない。マイクロキャリアなしのトランスフェクト細胞を移植したラットの脳からの切片（２０×倍率）。切片には全く染色が見られない。マイクロキャリアビーズ上のアルカリホスファターゼ遺伝子プラスミドでトランスフェクトした細胞で３０日前に移植したラットの脳からの切片（１０×倍率）。高濃度の暗い染色物質（細胞）が見られる。

Claims

細胞を殺すために哺乳動物腫瘍細胞に殺腫瘍または感受性遺伝子を導入するための方法であって、
ａ）殺腫瘍または感受性遺伝子を有するウイルス発現ベクターを哺乳動物細胞に導入する工程；
ｂ）該哺乳動物細胞を、インビトロで支持マトリクスの表面に接着させる工程；および
ｃ）該哺乳動物腫瘍細胞に近接して、該接着した哺乳動物細胞を有する該支持マトリクスを移植する工程、
を包含する、方法。