JP2004337176A - 中枢神経系への遺伝子導入のための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 プロデューサー細胞は、化学療法剤または放射性治療薬剤への感受性を腫瘍細胞に与える殺腫瘍因子または感受性因子をコードするレトロウイルスベースの組換えベクターで操作される。哺乳動物の脳への移植の前に、まず、プロデューサー細胞は、移植された細胞の長期生存性を増加させるためにおよび長期の機能的有益性を提供するために、支持マトリクス上でインビトロで培養される。
【選択図】 なし
Description
本発明は、哺乳動物の脳にプロデューサー細胞を移植するための方法に関する。プロデューサー細胞は、化学療法剤または放射性治療薬剤への感受性を腫瘍細胞に与える殺腫瘍因子または感受性因子をコードするレトロウイルスベースの組換えベクターで操作される。哺乳動物の脳への移植の前に、まず、プロデューサー細胞は、移植された細胞の長期生存性を増加させるためにおよび長期の機能的有益性を提供するために、支持マトリクス上でインビトロで培養される。
脳腫瘍は、35歳よりも若いヒトにおけるガン死の主要な原因である。中枢神経系腫瘍の発生率は、ホジキン病の2倍以上、黒色腫の半分以上であり、そして婦人では、中枢神経系の腫瘍によって引き起こされる死亡率の頻度は、卵巣ガンによって引き起こされる頻度とほぼ等しい。子供では、脳腫瘍は、最も普通の充実性腫瘍であり、そして小児ガンの全体の原因として白血病に次いで2番目である。(Dale,D.C.およびFederman,D.D.,1995,Scientific American Medicine,Scientific American,Inc.,New York,第7章)。ほとんどの脳腫瘍は手術不可能である。そして手術可能な脳腫瘍についてでさえも、外科手術は非常に困難であり、そしてしばしば神経学的障害を生じる。
a)殺腫瘍または感受性遺伝子を有するウイルス発現ベクターを哺乳動物細胞に導入する工程;
b)哺乳動物細胞を、インビトロで支持マトリクスの表面に接着させる工程;および
c)哺乳動物腫瘍細胞に近接して、接着した哺乳動物細胞を有する支持マトリクスを移植する工程、
を包含する、方法、である。
d)殺腫瘍または感受性遺伝子を有するレトロウイルス発現ベクターをプロデューサー細胞に導入する工程;
e)プロデューサー細胞を、インビトロで支持マトリクスの表面に接着させる工程;および
f)哺乳動物腫瘍細胞に近接して、接着したプロデューサー細胞を有する支持マトリクスを移植する工程、
を包含する、方法、である。
本発明は、脳腫瘍細胞に殺腫瘍因子または感受性因子をコードする遺伝子を導入するための方法に関する。この方法は、哺乳動物の脳に殺腫瘍因子または感受性因子をコードするレトロウイルスベースの組換えベクターで操作されたプロデューサー細胞の移植を包含する。操作されたプロデューサー細胞は、隣接した脳腫瘍細胞に感染し、それによって腫瘍細胞が化学療法剤または放射性治療薬剤に感受性になる感染性レトロウイルス粒子を産生し得る。レトロウイルスベクター遺伝子導入システムは、脳における組込みおよび遺伝子発現のための増殖する標的細胞を必要とするので、このシステムの脳腫瘍への適用は、レトロウイルスが脳腫瘍の増殖する細胞に標的化されるが、正常な増殖しない脳細胞は感染されないままであるという利点を有する。
本発明は、殺腫瘍因子または感受性因子をコードするレトロウイルスベースの組換えベクターで操作されたプロデューサー細胞の、哺乳動物の脳への移植を包含する、脳腫瘍を処置するための方法に関する。プロデューサー細胞は、脳腫瘍細胞に感染し、それによって腫瘍細胞を化学療法剤に感受性にする、感染性レトロウイルス粒子を産生し得る。プロデューサー細胞の長期生存性は、移植前の支持マトリクス上でのプロデューサー細胞のインビトロ培養によって増大され得る。
殺腫瘍または感受性因子を発現させるために、このような因子をコードするヌクレオチド配列は、適切なレトロウイルス発現ベクターに挿入される。当業者に周知である方法を使用して、適切な転写/翻訳制御シグナルに作動可能に結合された殺腫瘍または感受性ヌクレオチドコード配列を含む組換えレトロウイルスベクターを構築する。殺腫瘍または感受性コード配列を含む組換えレトロウイルスベクターの構築物は、当該分野で十分に理解される標準的な連結および制限技術を使用して生成され得る。例えば、Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,第2版,1989、およびAuselbelら,1989,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates & Wiley Interscience,N.Y.に記載の技術を参照のこと。
伝染性レトロウイルス粒子を産生するために、組換えレトロウイルス発現ベクターは安定な「プロデューサー」細胞株にトランスフェクトされる。プロデューサー細胞株は、成熟ウイルス粒子へのウイルス転写物のパッケージングにトランスで必要とされるレトロウイルス機能のすべてを発現する、安定に組込まれたプロウイルスを含む。これらには、群特異的抗原(gag)、エンベロープ(env)、およびポリメラーゼ(pol)遺伝子が含まれる。gag遺伝子は、内部構造(ヌクレオキャプシド)タンパク質をコードする;pol遺伝子は、RNA指向性DNAポリメラーゼ(逆連写酵素)をコードする;そしてenv遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。安定に組み込まれたプロウイルスの1つの本質的な特徴は、通常ウイルス転写物のパッケージングにシスで必要なシグナルを提供するパッケージング配列(psi配列)を欠失することである。したがって、プロウイルスの発現から生じる転写物は、ウイルス粒子にパッケージされず、むしろウイルス粒子のパッケージングに必要とされる遺伝子産物をトランスで提供する。
移植プロデューサー細胞の長期生存性を増加させるために、プロデューサー細胞を、最初に、インビトロで支持マトリクス上に接着させる。支持マトリクスが構成され得る物質には、細胞がインビトロインキュベーション後に接着する物質、およびその上で細胞が増殖し得る物質が挙げられ得、そしてこれらは、移植された細胞の破壊あるいは生物学的または治療活性を妨害する傷害性反応または炎症性反応を生じることなく、哺乳動物の脳に移植され得るこのような物質は、合成または天然の化学物質、または生物学的起源を有する物質であり得る。このような物質には、ガラスおよび他の酸化シリコーン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニリデンフルオライド、ポリウレタン、ポリアルギネート、ポリスルホン、ポリビニルアルコール、アクリロニトリルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ポリペンテン(polypentent)、ナイロン、アミラーゼ、ゼラチン、コラーゲン、デキストランおよびセルロース(例えば、ニトロセルロース)を含む天然および改変多糖、寒天、および磁鉄鉱が含まれるが、これらに限定されない。再吸収可能かまたは再吸収可能でないかのいずれかの物質が使用され得る。細胞外マトリクス物質も意図されており、これは当該技術分野で周知である。細胞外マトリクス物質は、市販され得るか、またはこのようなマトリクスを分泌する細胞を増殖させ、分泌細胞を除去し、そして移植されるべき細胞をマトリクスと相互作用およびこれに接着させることによって調製され得る。移植されるべき細胞が増殖する、または細胞が混合されるマトリクス物質は、移植されたプロデューサー細胞自体の固有の産物であり得る。したがって、例えば、マトリクス物質は、移植されるべきプロデューサー細胞によって産生および分泌される細胞外マトリクスまたは基底膜物質であり得る。
殺腫瘍または感受性遺伝子を発現するプロデューサー細胞は、インビトロで増殖され、そして支持マトリクスに接着される。本発明の方法は、腫瘍によって影響を及される脳の領域に、目的の治療遺伝子を含むプロデューサー細胞の脳内移植を包含する。脳に細胞を移植するための方法は、Neural Grafting in the Mammalian CNS,1985,BjorklundおよびStenevi編、およびGageら,Brain Researchに記載され、これらのそれぞれは参考として本明細書に援用される。脳に細胞を移植するための手順には、1)宿主細胞内にプロデューサー細胞を注入する工程、または2)プロデューサー細胞を配置するための外科的手段によって腔を調製する工程が含まれる。
以下の小節は、支持マトリクスに接着したプロデューサー細胞の、ラットの脳への移植を記載する。移植されたプロデューサー細胞は、アルカリホスファターゼ遺伝子を発現するように遺伝子操作されている感染性レトロウイルス粒子を産生する。結果は、移植された動物の脳におけるアルカリホスファターゼ遺伝子の首尾良い長期発現を実証する。
(6.1.1.動物および細胞調製物)
120〜150gの体重の雄Sprague−Dawley(SD)ラットを、Taconic Farms (Germantown,NY)から得た。Bing細胞株は、一過性トランスフェクションに続いて、106/mlより大きい力価でNIH3T3細胞を感染させ得るレトロウイルス上清を産生した293T(293tsa1609neo)ヒト胚腎臓細胞株(R.B.DuBridgeら,Mol.Cell Biol.7,379−387,1987)から単離された、BOSC23細胞株(W.Pearら,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),90,8392−8396,1993)の両種指向性相対物である。Bing細胞株に、両種指向性レトロウイルス構築物を、LXSNベースのレトロウイルスベクターのような、複製欠陥レトロウイルスベクターをパッケージするために導入した。細胞株を、10%ウシ胎児血清(Hyclone)および抗生物質(ペニシリン−ストレプトマイシン溶液,Sigma)を補充した高グルコースDMEM培地中で維持した。
マイクロキャリアへの接着の前に、細胞をPC−1(Hycor)中で3回、無血清培地中で1回洗浄し、そしてPC−1に再懸濁した。コラーゲンコートしたデキストランマイクロキャリア(Cytodex(登録商標)、100〜200μm)を、1グラムのビーズ当たり10mlの滅菌蒸留水中にビーズを置き、そして121℃まで15分間加熱することによって滅菌した。溶液を室温まで冷却させ、そして水を捨てた。次いで、マイクロキャリアを少量の培養培地中に懸濁し、そして30分間放置した。培地を除去し、そしてビーズ(約0.21g)を上記の細胞調製物へ添加した。得られた混合物を2時間振盪し、そしてさらなる4mlのPC−1を添加した。次いで、培養フラスコを一晩周期的に混合しながらインキュベートして、細胞をマイクロキャリアに接着させた。インキュベーション後および移植の前に、アリコートを取り、そしてトリパンブルーと反応させて細胞生存性を決定し、そしてマイクロキャリアに接着した細胞の数を、顕微鏡検査によって決定した。この手順によって、95%以上の良好な細胞生存性で、各マイクロキャリアへの約5〜7個の細胞の接着を得た。
動物に、ペントバルビタールナトリウム(40mg/kg、ip)を用いて麻酔し、そして外科手術を無菌条件下で行った。細胞を、定位的注入を使用して脳の尾状/被殻領域に注入した。それぞれ3匹の動物の4つの群に、1)非トランスフェクト細胞単独、2)マイクロキャリア上の非トランスフェクト細胞、3)トランスフェクト細胞単独、および4)マイクロキャリア上のトランスフェクト細胞を移植した。移植物を、ブレグマの1.5mm後部、硬膜の表面の2.0mm側方および5.0mm下(補正後)に置いた。顎稜は−3.3mmにあった。定位的座標を、ゼロ値座標としてブレグマの直上の位置を使用して、個々の動物について補正した。背−腹値は、硬膜の表面からであった。一旦針を正確に置くと、細胞を、5μlの最終用量が注入されるまで、1μl/分の速度で注入した。堅く適合するスタイレットを、針の管腔に挿入して、針に接着し得る残りのビーズを押し出した。外科手術部位を、Clay−Adams 9mm創傷クリップを使用して閉じた。
ラットに、ペントバルビタールナトリウム、60mg/kg i.p.で麻酔し、そして動物を、400mlのヘパリン化リン酸緩衝化生理食塩水で灌流し、次いで400mlの1%グルタルアルデヒド/4%パラホルムアルデヒド/0.1M Naリン酸,pH 7.2で灌流した。脳を取り出してPBS中の30%スクロース中に置き、そして28μmまたは50μmの凍結切片を調製した。切片を、PBSを含む番号付けした試験管に移し、ゼラチンコートしたスライド上に置き、そして褐色の反応産物を産生する5−ブロモ,4−クロロ,3−インドリルリン酸/ヨードニトロテトラゾリウム(BCIP/INT)(Biomedia,Foster City,CA)との室温にて30分間の反応によってアルカリホスフェートについて染色した。日常的な組織学を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した10μmパラフィン切片で行った。
動物を、移植の30日後に屠殺し、そして組織学的研究を行った。図1〜3は、これらの研究で得られた結果を示す。
Claims (1)
- 細胞を殺すために哺乳動物腫瘍細胞に殺腫瘍または感受性遺伝子を導入するための方法であって、
a)殺腫瘍または感受性遺伝子を有するウイルス発現ベクターを哺乳動物細胞に導入する工程;
b)該哺乳動物細胞を、インビトロで支持マトリクスの表面に接着させる工程;および
c)該哺乳動物腫瘍細胞に近接して、該接着した哺乳動物細胞を有する該支持マトリクスを移植する工程、
を包含する、方法。
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