PT1569695E - Modulação anti-sentido da expressão de apolipoproteína - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MODULAÇÃO ΑΝΤΙ—SENTIDO DA EXPRESSÃO DE APOLIPOPROTEÍNA B"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona composições e métodos para a modulação da expressão de apolipoproteina B. Esta invenção refere-se a oligonucleótidos especificamente hibridáveis com ácidos nucleicos codificando apolipoproteina B. Mostrou-se que esses compostos modulam a expressão de apolipoproteina B.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As lipoproteínas são partículas globulares, semelhantes a micelas que consistem num núcleo não polar de acilgliceróis e ésteres de colesterilo, rodeado por um revestimento anfifílico de proteína, fosfolípido e colesterol. As lipoproteínas foram classificadas em cinco categorias amplas, com base nas suas propriedades funcionais e físicas: quilomícrones, as quais transportam lípidos dietéticos do intestino para tecidos; lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL); lipoproteínas de densidade intermédia (IDL); lipoproteínas de baixa densidade (LDL); todos estas transportam triacilgliceróis e colesterol do fígado para tecidos; e lipoproteínas de alta densidade (HDL), que transportam colesterol endógeno de tecidos para o fígado.

As partículas de lipoproteína sofrem processamento metabólico contínuo e têm propriedades e composições variáveis. 1

As densidades de lipoproteína aumentam sem diminuição do diâmetro de partícula, porque a densidade dos seus revestimentos externos é inferior à do núcleo interno. Os componentes proteicos das lipoproteínas são conhecidos como apolipoproteínas. Pelo menos nove apolipoproteínas estão distribuídas em quantidades significativas entre as diversas lipoproteínas humanas. A apolipoproteína B (também conhecida como ApoB, apolipoproteína B-100; ApoB-100, apolipoproteína B-48; ApoB-48 e antigénio Ag(x)), é uma glicoproteína de grandes dimensões que serve um papel indispensável no agrupamento e secreção de lípidos e no transporte e absorção e distribuição mediadas por receptor de classes distintas de lipoproteínas. A importância da apolipoproteína B abrange uma variedade de funções, desde a absorção e processamento de lípidos dietéticos, até à regulação dos níveis de lipoproteína em circulação (Davidson e Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193). Esta última propriedade sublinha a sua relevância em termos de susceptibilidade à aterosclerose, a qual está altamente correlacionada com a concentração ambiente de lipoproteínas contendo apolipoproteína B (Davidson e Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193).

Existem duas formas de apolipoproteína B nos mamíferos. A ApoB-100 representa a proteína de comprimento completo, contendo 4536 resíduos de aminoácido, sintetizada, exclusivamente, no fígado humano (Davidson e Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193). Uma forma truncada, conhecida como apoB-48, é colinear com os 2152 resíduos aminoterminais e é sintetizada no intestino delgado de todos os mamíferos (Davidson e Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193). 2 A ApoB-100 é o principal componente proteico de LDL e contém o domínio requerido para a interacção desta espécie de lipoproteína com o receptor de LDL. Além disso, a ApoB-100 contém um resíduo de cisteína desemparelhado que medeia uma interacção com apolipoproteína(a) e produz outra lipoproteína aterogénica distinta, denominada Lp(a) (Davidson e Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193).

Em humanos, a ApoB-48 circula em associação com quilomícrones e restos de quilomícrones e estas partículas são eliminadas por um receptor distinto, conhecido como a proteína relacionada com receptor de LDL (Davidson e Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193) . A ApoB-48 pode ser vista como uma adaptação crucial, pela qual o lípido dietético é distribuído do intestino delgado para o fígado, enquanto a ApoB-100 participa no transporte e distribuição de colesterol plasmático endógeno (Davidson e Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193). A base pela qual o gene estrutural comum para a apolipoproteína B produz duas isoformas distintas de proteína é um processo conhecido como edição de ARN. Uma reacção de edição de citosina em uracilo, específica de local, produz um codão de paragem UAA e a terminação de tradução da apolipoproteína B para produzir ApoB-48 (Davidson e Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193) . A apolipoproteína B foi clonada em 1985 (Law et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 1985, 82, 8340-8344) e mapeada no cromossoma 2p23-2p24 em 1986 (Deeb et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 1986, 83, 419-422). 3

Na patente US 5786206 são divulgados e reivindicados métodos e composições para determinar o nível de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) no plasma, que incluem sequências de ADN isoladas codificando regiões epitópicas de apolipoproteína B-100 (Smith et al., 1998).

Verificou-se que murganhos transgénicos expressando apolipoproteína B humana e alimentados com uma dieta de elevado teor de gordura desenvolvem elevados níveis de colesterol plasmático e exibiam um aumento de 11 vezes nas lesões ateroscleróticas em relação a ninhadas não transgénicas (Kim e Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723; Nishina et al., J. Lipid Res., 1990, 31, 859-869).

Além disso, foram empregues murganhos transgénicos expressando formas truncadas de apolipoproteína B humana para identificar as características estruturais carboxilo-terminais de ApoB-100 que são requeridas para interacções com apolipoproteína(a), para produzir a partícula de lipoproteína Lp(a) e para investigar características estruturais da região de ligação de receptor de LDL de ApoB-100 (Kim e Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723; McCormick et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 23616-23622).

Foram produzidos murganhos nocaute em apolipoproteína B (contendo disrupções de ApoB-100 e ApoB-48) que estão protegidos do desenvolvimento de hipercolesterolemia quando alimentados com uma dieta de elevado teor de gordura (Farese et al., Proc. Natl.

Acad. Sei. U. S. A., 1995, 92, 1774-1778; Kim e Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723) . A incidência da aterosclerose foi investigada em murganhos expressando exclusivamente ApoB-100 ou ApoB-48 e verificou-se que a susceptibilidade está dependente 4 dos níveis de colesterol total. Quer os murganhos sintetizassem ApoB-100 ou ApoB-48, tal não afectava a extensão da aterosclerose, indicando que provavelmente não há uma diferença importante na aterogenicidade intrínseca da ApoB-100 versus ApoB-48 (Kim e Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723; Veniant et al., J. Clin. Invest., 1997, 100, 180-188).

Os elevados níveis plasmáticos da lipoproteína Lp(a) contendo ApoB-100 estão associados a risco aumentado para aterosclerose e suas manifestações, que podem incluir hipercolesterolemia (Seed et al. , N. Engl. J. Med., 1990, 322, 1494-1499), enfarte do miocárdio (Sandkamp et al., Clin. Chem., 1990, 36, 20-23) e trombose (Nowak-Gottl et al., Pediatrics, 1997, 99, Eli). A concentração plasmática de Lp(a) é fortemente influenciada por factores hereditários e é refractária à maior parte dos fármacos e manipulação dietética (Katan e Beynen, Am. J. Epidemiol., 1987, 125, 387-399; Vessby et al. , Atherosclerosis, 1982, 44, 61-71). A terapia farmacológica de níveis elevados de Lp(a) tem sido apenas modestamente bem sucedida e a aferese permanece a modalidade terapêutica mais eficaz (Hajjar e Nachman, Annu. Rev. Med., 1996, 47, 423-442).

Na patente US 6156315 e correspondente publicação PCT WO 99/18986 é divulgado e reivindicado um método para a inibição da ligação de LDL à matriz de vasos sanguíneos num indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo ou um seu fragmento, o qual é capaz de se ligar à região amino-terminal de apolipoproteína B inibindo, desse modo, a ligação de lipoproteína de baixa densidade à matriz de vasos 5 sanguíneos (Goldberg e Pillarisetti, 2000; Goldberg e Pillarisetti, 1999).

Na patente US 6096516 são divulgados e reivindicados vectores contendo ADNc codificando anticorpos recombinantes murinos gue se ligam a ApoB-100 humana, para efeitos de diagnóstico e tratamento de doenças cardiovasculares (Kwak et al., 2000) .

No pedido de patente Europeia EP 911344, publicado a 28 de Abril de 1999 (e correspondente à Patente U.S. 6309844), é divulgado e reivindicado um anticorpo monoclonal gue se liga especificamente a ApoB-48 e não se liga especificamente a ApoB-100, o gual é útil para o diagnóstico e terapia de hiperlipidemia e esclerose arterial (Uchida e Kurano, 1998).

Na publicação PCT WO 01/30354 são divulgados e reivindicados métodos de tratamento de um doente com um distúrbio cardiovascular, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto ao referido doente, em que o referido composto actua durante um período de tempo a concentrações plasmáticas inferiores de apolipoproteína B ou lipoproteínas contendo apolipoproteína B, pela estimulação de uma via para a degradação de apolipoproteína B (Fisher e Williams, 2001).

Na patente US 5220006 é divulgada e reivindicada uma sequência de ADN clonada actuando em cis que medeia a supressão de apolipoproteína B aterogénica (Ross et al., 1993). 6

Na publicação PCT WO 01/12789 é divulgada e reivindicada uma ribozima que cliva ARNm de ApoB-100 especificamente na posição 6679 (Chan et al., 2001).

Tang et al., Chinese Journal of Arteriosclerosis, 1999, 7(4), descrevem experiências utilizando oligodesoxinucleótidos anti-sentido direccionados para apolipoproteína B em células hepáticas de rato.

Eggerman et al., Federal Register, 2000, 65(110), discutem experiências utilizando oligodesoxinucleótidos anti-sentido direccionados para apolipoproteína B em células hepáticas humanas.

Até à data, as estratégias visando a inibição da função de apolipoproteína B têm estado limitadas a aferese de Lp(a), anticorpos, fragmentos de anticorpo e ribozimas. Contudo, com a excepção de aferese de Lp(a), estas estratégias de investigação não estão testadas como protocolos terapêuticos. Consequentemente, permanece uma necessidade há muito sentida de agentes adicionais capazes de inibirem eficazmente a função de apolipoproteína B. A tecnologia anti-sentido tem vindo a afirmar-se como um meio eficaz de redução da expressão de produtos génicos específicos e, por conseguinte, pode provar ser útil de um modo único num número de aplicações terapêuticas, de diagnóstico e investigação envolvendo a modulação da expressão de apolipoproteína B. 7 A presente invenção proporciona composições e métodos para a modulação da expressão de apolipoproteína B, incluindo a inibição da isoforma alternativa de apolipoproteína B, ApoB-48.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona um oligonucleótido anti-sentido de 12 a 30 nucleobases de comprimento direccionado para uma molécula de ácido nucleico codificando apolipoproteína B, em que o referido oligonucleótido é 100% complementar ao referido ácido nucleico e inibe a expressão da apolipoproteína B, o referido oligonucleótido compreendendo, pelo menos, 8 nucleobases contíguas da SEQ ID N°: 247. A invenção proporciona um oligonucleótido anti-sentido de 20 a 30 nucleobases de comprimento direccionado para uma molécula de ácido nucleico codificando apolipoproteína B, em que o referido oligonucleótido hibrida com o referido ácido nucleico e inibe a expressão da apolipoproteína B, em que o oligonucleótido tem uma sequência compreendendo a SEQ ID N°: 247. A invenção também proporciona uma composição compreendendo um oligonucleótido anti-sentido da invenção e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. A invenção também proporciona um método de inibição ex vivo da expressão de apolipoproteína B em células ou tecidos, compreendendo a colocação das referidas células ou tecidos em contacto com um oligonucleótido anti-sentido sob condições de modo que a expressão de apolipoproteína B seja inibida. A invenção também proporciona um oligonucleótido anti-sentido da invenção ou uma composição da invenção, para utilização em terapia ou profilaxia de doença. A invenção também proporciona o composto oligonucleótido anti-sentido da invenção ou uma composição da invenção, para utilização no tratamento de hipercolesterolemia; doença cardiovascular; hiperlipidemia; diabetes; ou obesidade num humano. A invenção também proporciona a utilização do composto oligonucleótido anti-sentido da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento da hipercolesterolemia; doença cardiovascular; hiperlipidemia; diabetes; ou obesidade num humano.

SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO A presente divulgação refere-se a compostos, particularmente oligonucleótidos anti-sentido, os quais são direccionados para um ácido nucleico codificando apolipoproteina B e os quais modulam a expressão de apolipoproteina B. Também são divulgadas composições farmacêuticas e outras compreendendo os compostos da divulgação. São ainda divulgados métodos de modulação da expressão de apolipoproteina B em células ou tecidos, compreendendo a colocação das referidas células ou tecidos em contacto com um ou mais dos compostos ou composições anti-sentido da divulgação. São ainda divulgados métodos de tratamento de um animal, particularmente um humano, suspeito de ter ou ser propenso a uma doença ou estado associado à expressão de apolipoproteina B, 9 pela administração de uma quantidade terapeuticamente ou profilacticamente eficaz de um ou mais dos compostos ou composições anti-sentido da divulgação.

Em particular, é aqui divulgado um composto de 8 a 50 nucleobases de comprimento, direccionado para uma molécula de ácido nucleico codificando apolipoproteína B, em que o referido composto se híbrida e inibe especificamente a expressão de uma molécula de ácido nucleico codificando apolipoproteína B, o referido composto compreendendo, pelo menos, 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das SEQ ID N°: 127-134, 136, 138-174, 176-317, 319-321, 323-333, 335-339, 341-374, 376-416, 418-500, 502-510, 512-804, 815, 816, 819-821, 824, 825, 827, 828, 830, 831, 833-835, 837-839, 842, 843 e 845-854.

Também é aqui divulgado um composto de 8 a 50 nucleobases de comprimento que se híbrida especificamente com, pelo menos, uma porção de 8 nucleobases de um sítio activo numa molécula de ácido nucleico codificando apolipoproteína B, o referido composto compreendendo, pelo menos, 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das SEQ ID N°: 127-134, 136, 138-174, 176-317, 319-321, 323-333, 335-339, 341-374, 376-416, 418-500, 502-510, 512-804, 815, 816, 819-821, 824, 825, 827, 828, 830, 831, 833-835, 837-839, 842, 843 e 845-854, o referido sítio activo sendo uma região no referido ácido nucleico, em que a ligação do referido composto ao referido sítio inibe significativamente a expressão de apolipoproteína B, em comparação com um controlo.

Também é aqui divulgado um composto de 8 a 50 nucleobases de comprimento direccionado para uma molécula de ácido nucleico codificando apolipoproteína B, em que o referido composto se híbrida especificamente com o referido ácido nucleico e inibe a 10 expressão de apolipoproteína B, em que a apolipoproteína B é codificada por um polinucleótido seleccionado do grupo consistindo de: (a) SEQ ID N° : 3 e (b) um polinucleót ido codificando apolipoproteína B variante de ocorrência natural que se híbrida ao complemento do polinucleótido de (a) sob condições estringentes, o referido composto compreendendo, pelo menos, 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das SEQ ID N° : 127-134, 136, 138-174, 176-317, 319-321, 323-333, 335-339, 341-374, 376-416, 418-500, 502-510, 512-804, 815, 816, 819-821, 824, 825, 827, 828, 830, 831, 833-835, 837-839, 842, 843 e 845-854.

Também é aqui divulgado um composto de 8 a 50 nucleobases de comprimento, direccionado para uma molécula de ácido nucleico codificando apolipoproteína B, em que o referido composto se híbrida especificamente com o referido ácido nucleico e inibe a expressão de apolipoproteína B, em que a apolipoproteína B é codificada por um polinucleótido seleccionado do grupo consistindo nas SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 17, o referido composto compreendendo, pelo menos, 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das SEQ ID N°: 127-134, 136, 138-174, 176-317, 319-321, 323-333, 335-339, 341-374, 376-416, 418-500, 502-510, 512-804, 815, 816, 819-821, 824, 825, 827, 828, 830, 831, 833-835, 837-839 842, 843 e 845-854.

Também é aqui divulgado um composto de 8 a 50 nucleobases de comprimento direccionado para uma molécula de ácido nucleico codificando apolipoproteína B, em que o referido composto se híbrida especificamente com um sítio activo no referido ácido nucleico e inibe a expressão de apolipoproteína B, o referido composto compreendendo, pelo menos, 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das SEQ ID N°: 127-134, 136, 138-174, 176-317, 319-321, 323-333, 335-339, 341-374, 376-416, 418-500, 502-510, 11 512-804, 815, 816, 819-821, 824, 825, 827, 828, 830, 831, 833-835, 837-839, 842, 843 e 845-854, o referido sítio activo sendo uma região no referido ácido nucleico, em que a ligação do referido composto ao referido sítio inibe significativamente a expressão de apolipoproteína B, em comparação com um controlo.

Também é aqui divulgado um composto mimético de oligonucleótido de 8 a 50 nucleobases de comprimento, direccionado para uma molécula de ácido nucleico codificando apolipoproteína B, em que o referido composto se híbrida especificamente com o referido ácido nucleico e inibe a expressão de apolipoproteína B, o referido composto compreendendo, pelo menos, 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das SEQ ID N°: 127-134, 136, 138-174, 176-317, 319-321, 323-333, 335-339, 341-374, 376-416, 418-500, 502-510, 512-804, 815, 816, 819-821, 824, 825, 827, 828, 830, 831, 833-835, 837-839, 842, 843 e 845-854.

Também é aqui divulgado um composto anti-sentido de 8 a 50 nucleobases de comprimento, em que o referido composto se híbrida especificamente com os nucleótidos 2920-3420, como mostrados na SEQ ID N°: 3 e inibe a expressão de ARNm codificando apolipoproteína B humana após 16 a 24 horas em, pelo menos, 30% em células HepG2 80% confluentes em cultura, a uma concentração de 150 nM. Em determinados aspectos, o composto anti-sentido de 8 a 50 nucleobases de comprimento hibrida-se especificamente com os nucleótidos 3230-3288, como mostrado na SEQ ID N°: 3 e inibe a expressão de ARNm codificando apolipoproteína B humana após 16 a 24 horas em, pelo menos, 30% em células HepG2 80% confluentes em cultura, a uma concentração de 150 nM. Noutro aspecto, os compostos inibem a expressão de ARNm codificando apolipoproteína B em, pelo menos, 50%, após 16 12 a 24 horas em células HepG2 80% confluentes em cultura, a uma concentração de 150 nM.

Num aspecto, os compostos da divulgação são direccionados para uma molécula de ácido nucleico codificando apolipoproteína B, em que o referido composto se hibrida especificamente e inibe a expressão da forma longa de apolipoproteína B, ApoB-100. Noutro aspecto, os compostos hibridam-se especificamente com o referido ácido nucleico e inibem a expressão de ARNm codificando apolipoproteína B em, pelo menos, 5% em células HepG2 80% confluentes em cultura, a uma concentração óptima. Ainda noutro aspecto, os compostos inibem a expressão de ARNm codificando apolipoproteína B em, pelo menos, 10%, pelo menos, 15%, pelo menos, 20%, pelo menos, 25%, pelo menos, 30%, pelo menos, 35%, pelo menos, 40% ou, pelo menos, 50%.

Num aspecto, os compostos são oligonucleótidos anti-sentido e, num aspecto, o composto tem uma sequência compreendendo SEQ ID N°: 224, o oligonucleótido anti-sentido hibrida-se com uma região complementar a SEQ ID N° : 224, o composto compreende a SEQ ID N°: 224, o composto consiste essencialmente na SEQ ID N°: 224 ou o composto consiste na SEQ ID N°: 224.

Noutro aspecto, o composto tem uma sequência compreendendo a SEQ ID N°: 247, o oligonucleótido anti-sentido hibrida-se com uma região complementar a SEQ ID N° : 247, o composto compreende a SEQ ID N°: 247, o composto consiste essencialmente na SEQ ID N°: 247 ou o composto consiste na SEQ ID N°: 247.

Noutro aspecto, o composto tem uma sequência compreendendo a SEQ ID N°: 319, o oligonucleótido anti-sentido hibrida-se com 13 uma região complementar a SEQ ID N°: 319, o composto compreende a SEQ ID N° : 319, o composto consiste essencialmente na SEQ ID N°: 319 ou o composto consiste na SEQ ID N°: 319.

Num aspecto, os compostos compreendem, pelo menos, uma ligação internucleósido modificada e, noutro aspecto, a ligação internucleósido modificada é uma ligação fosforotioato.

Noutro aspecto, os compostos compreendem, pelo menos, uma fracção de açúcar modificada e, num aspecto, a fracção de açúcar modificada é uma fracção de açúcar 2'-O-metoxietilo.

Noutro aspecto, os compostos compreendem, pelo menos, uma nucleobase modificada e, num aspecto, a nucleobase modificada é uma 5-metilcitosina.

Ainda noutro aspecto, os compostos são oligonucleótidos quiméricos. Os compostos quiméricos preferidos incluem aqueles tendo uma ou mais ligações fosforotioato e compreendendo, ainda, asas nucleotidicas de 2'-metoxietoxilo e uma lacuna de 2’-desoxinucleótido de dez nucleobases.

Noutro aspecto, os compostos hibridam-se especificamente e inibem a expressão de uma molécula de ácido nucleico codificando uma forma alternativamente excisada de apolipoproteína B.

Também são aqui divulgadas composições compreendendo um composto da divulgação e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Num aspecto, a composição compreende ainda um sistema de dispersão coloidal e, noutro aspecto, o composto na composição é um oligonucleótido anti-sentido. Em determinados aspectos, a composição compreende 14 um composto anti-sentido da divulgação hibridado a uma cadeia complementar. A hibridação da cadeia anti-sentido pode formar uma ou mais extremidades rombas ou uma ou mais extremidades protuberantes. Em alguns aspectos, a extremidade protuberante compreende uma base modificada.

Também são aqui divulgados métodos de inibição da expressão de apolipoproteina B em células ou tecidos, compreendendo a colocação das referidas células ou tecidos em contacto com um composto da divulgação, de modo que a expressão de apolipoproteina B seja inibida. Também são divulgados métodos para o tratamento de um animal tendo uma doença ou estado associado a apolipoproteina B, compreendendo administrar ao referido animal uma quantidade terapeuticamente ou profilacticamente eficaz de um composto da divulgação, de modo que a expressão da apolipoproteina B seja inibida. Em diversos aspectos, o estado está associado a metabolismo lipídico anormal, o estado está associado a metabolismo de colesterol anormal, o estado é aterosclerose, o estado é um estado metabólico anormal, o estado metabólico anormal é hiperlipidemia, a doença é diabetes, a diabetes é diabetes Tipo 2, o estado é obesidade e/ou a doença é doença cardiovascular.

Também são aqui divulgados métodos de modulação dos níveis de glucose num animal, compreendendo administrar ao referido animal um composto da divulgação e, num aspecto, o animal é um humano. Em diversos aspectos, os níveis de glucose são níveis de glucose plasmáticos, os níveis de glucose são níveis de glucose séricos e/ou o animal é uma animal diabético. 15

Também são aqui divulgados métodos de prevenir ou retardar o começo de uma doença ou estado associado a apolipoproteina B num animal, compreendendo administrar ao referido animal uma quantidade terapeuticamente ou profilacticamente eficaz de um composto da divulgação. Num aspecto, o animal é um humano. Noutros aspectos, o estado é um estado metabólico anormal, o estado metabólico anormal é hiperlipidemia, a doença é diabetes, a diabetes é diabetes Tipo 2, o estado é obesidade, o estado é aterosclerose, o estado envolve metabolismo lipídico anormal e/ou o estado envolve metabolismo de colesterol anormal.

Também são aqui divulgados métodos de prevenir ou retardar o começo de um aumento nos níveis de glucose num animal, compreendendo administrar ao referido animal uma quantidade terapeuticamente ou profilacticamente eficaz de um composto da divulgação. Num aspecto, o animal é um humano. Noutros aspectos, os níveis de glucose são níveis de glucose séricos e/ou os níveis de glucose são níveis de glucose plasmáticos.

Também são aqui divulgados métodos de modulação dos níveis séricos de colesterol num animal, compreendendo administrar ao referido animal uma quantidade terapeuticamente ou profilacticamente eficaz de um composto da divulgação. Num aspecto, o animal é um humano.

Também são aqui divulgados métodos de modulação dos níveis de lipoproteína num animal, compreendendo administrar ao referido animal uma quantidade terapeuticamente ou profilacticamente eficaz de um composto da divulgação. Num aspecto, o animal é um humano. Noutros aspectos, a lipoproteína é VLDL, a lipoproteína é HDL e/ou a lipoproteína é LDL. 16

Também são aqui divulgados métodos de modulação de níveis de triglicéridos séricos num animal, compreendendo administrar ao referido animal uma quantidade terapeuticamente ou profilacticamente eficaz de um composto da divulgação. Num aspecto, o animal é um humano.

Também é aqui divulgada a utilização de um composto da divulgação para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou estado associado à expressão de apolipoproteína B, um medicamento para o tratamento de um estado associado ao metabolismo lipídico anormal, um medicamento para o tratamento de um estado associado ao metabolismo de colesterol anormal, um medicamento para o tratamento de aterosclerose, um medicamento para o tratamento de hiperlipidemia, um medicamento para o tratamento da diabetes, um medicamento para o tratamento da diabetes Tipo 2, um medicamento para o tratamento da obesidade, um medicamento para o tratamento de doença cardiovascular, um medicamento para prevenir ou retardar o início de níveis de glucose aumentados, um medicamento para prevenir ou retardar o início de níveis de glucose séricos aumentados, um medicamento para prevenir ou retardar o início de níveis de glucose plasmáticos aumentados, um medicamento para a modulação de níveis séricos de colesterol, um medicamento para a modulação de níveis de lipoproteína séricos, um medicamento para a modulação de níveis de VLDL séricos, um medicamento para a modulação de níveis de HDL séricos e/ou um medicamento para a modulação de níveis de LDL séricos, um medicamento para a modulação de níveis de triglicéridos séricos.

Noutro aspecto, são aqui divulgados métodos de diminuição de níveis de lipoproteína em circulação, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade, de um composto da 17 divulgação, suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteina B. Noutro aspecto, são aqui divulgados métodos de redução do transporte de lipoproteina, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteina B. Também são aqui divulgados métodos de redução da absorção/adsorção de lipoproteina, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteina B.

Noutro aspecto, são aqui divulgados métodos de diminuição de níveis de triglicéridos em circulação, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteina B. Também são aqui divulgados métodos de redução do transporte de triglicéridos, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteina B. Também são aqui divulgados métodos de redução da absorção/adsorção de triglicéridos, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteina B.

Noutro aspecto, são aqui divulgados métodos de diminuição de níveis de colesterol em circulação, incluindo ésteres de colesterilo e/ou colesterol não esterifiçado, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteina B. Também estão contemplados métodos de redução do transporte de colesterol, incluindo ésteres de colesterilo 18 e/ou colesterol não esterifiçado, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B. Também são aqui divulgados métodos de redução da absorção/adsorção de colesterol, incluindo ésteres de colesterilo e/ou colesterol não esterifiçado, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B.

Também são aqui divulgados métodos de diminuição de níveis lipídicos em circulação, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B. Também são aqui divulgados métodos de redução do transporte de lípidos no plasma, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B. Além disso, são aqui divulgados métodos de redução da absorção/adsorção de lípido, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B.

Também são aqui divulgados métodos de diminuição de níveis lipídicos dietéticos em circulação, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B. Também são divulgados métodos de redução do transporte de lípidos dietéticos, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B, assim como métodos de redução da 19 absorção/adsorção de lípidos dietéticos, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B.

Também são aqui divulgados métodos de diminuição de níveis de ácidos gordos em circulação, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B. Também são aqui divulgados métodos de redução do transporte de ácidos gordos, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B. Também são aqui divulgados métodos de redução da absorção de ácidos gordos, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B.

Também são aqui divulgados métodos de diminuição de reagentes de fase aguda em circulação, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B. Noutro aspecto, são divulgados métodos de redução do transporte de reagentes de fase aguda, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B, assim como métodos de redução da absorção de reagentes de fase aguda, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B. 20

Também são aqui divulgados métodos de diminuição de quilomícrones em circulação, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B, métodos de redução do transporte de quilomícrones, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B e métodos de redução da absorção de quilomícrones, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B.

Também são aqui divulgados métodos de diminuição de partículas remanescentes de quilomícrones em circulação, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B, métodos de redução do transporte de partículas remanescentes de quilomícrones, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B e métodos de redução da absorção de remanescentes de quilomícrones, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B.

Também são aqui divulgados métodos de diminuição de VLDL, IDL, LDL e/ou HDL em circulação, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B. Do mesmo modo, são aqui divulgados métodos de 21 redução do transporte de VLDL, IDL, LDL e/ou HDL, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B, além de métodos de redução da absorção de VLDL, IDL, LDL e/ou HDL, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para reduzir a expressão de apolipoproteína B.

Ainda noutro aspecto, são aqui divulgados métodos de tratamento de um estado associado à expressão de apolipoproteína B, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para inibir a expressão de apolipoproteína B, o referido estado seleccionado de hiperlipoproteinemia, hiperlipoproteinemia de tipo 3 familiar (disbetalipoproteinemia familiar) e hiperalfalipoproteinemia familiar; hiperlipidemia, hiperlipidemias mistas, hiperlipidemia de tipo lipoproteína múltipla e hiperlipidemia combinada familiar; hipertrigliceridemia, hipertrigliceridemia familiar e lipase de lipoproteína familiar; hipercolesterolemia, hipercolesterolemia familiar, hipercolesterolemia poligénica e apolipoproteína B anómala familiar; distúrbios cardiovasculares, incluindo aterosclerose e doença arterial coronária; doença vascular periférica; doença de von Gierke (doença de armazenamento de glicogénio, tipo I); lipodistrofias (formas congénitas e adquiridas); síndrome de Cushing; nanismo ateloítico sexual (deficiência de hormona do crescimento isolada); diabetes Mellitus; hipertiroidismo; hipertensão; anorexia nervosa; síndrome de Werner; porfíria intermitente aguda; cirrose biliar primária; obstrução biliar extra-hepática; hepatite aguda; hepatoma; lúpus eritematoso sistémico; gamopatias monoclonais (incluindo mieloma, mieloma múltiplo, macroglobulinemia e 22 linfoma); endocrinopatias; obesidade; síndrome nefrótica; síndrome metabólica; inflamação; hipotiroidismo; uremia (hiperurecemia); impotência; doença hepática obstrutiva; hipercalcemia idiopática; disglobulinemia; níveis elevados de insulina; Síndrome X; contractura de Dupuytren; e doença de Alzheimer e demência.

Também são aqui divulgados métodos de redução do risco de um estado, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para inibir a expressão de apolipoproteína B, o referido estado seleccionado de gravidez; claudicação intermitente; gota; e toxicidade de mercúrio e enfermidade de amálgama.

Também são aqui divulgados métodos de inibição da ligação de partículas de colesterol ao endotélio vascular, compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para inibir a expressão de apolipoproteína B e, como resultado, também são aqui divulgados métodos de redução do risco de: (i) oxidação de partículas de colesterol; (i i) ligação de monócitos ao endotélio vascular; (iii) diferenciação de monócitos em macrófagos; (iv) ingestão de macrófago de partículas de lípido oxidado e libertação de citocinas (incluindo mas limitadas a IL-1, TNF alfa, TGF beta); (v) formação de plaquetas de lesões fibrogordas fibrosas e inflamação; (vi) lesões de endotélio conduzindo a coágulos; e (vii) coágulos conduzindo a enfarte do miocárdio ou acidente vascular cerebral, compreendendo também o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para inibir a expressão de apolipoproteína B. 23

Também são aqui divulgados métodos de redução de hiperlipidemia associada a alcoolismo, tabagismo, utilização de contraceptivos orais, utilização de glucocorticóides, utilização de agentes de bloqueio beta-adrenérgico ou utilização de isotretinião (ácido 13-cis-retinóico), compreendendo o passo de administrar a um indivíduo uma quantidade de um composto da divulgação suficiente para inibir a expressão de apolipoproteína B.

Também é aqui divulgado um composto oligonucleótido anti-sentido de 8 a 50 nucleobases de comprimento, compreendendo, pelo menos, 8 nucleótidos contíguos da SEQ ID N°: 247 e tendo um comprimento de, pelo menos, 12 ou, pelo menos, 14 a 30 nucleobases. A invenção proporciona um composto oligonucleótido anti-sentido de 20 nucleobases de comprimento, tendo uma sequência de nucleobases como mostrada na SEQ ID N°: 247 e compreendendo 5-metilcitidina nas nucleobases 2, 3, 5, 9, 12, 15, 17, 19 e 20, em que cada ligação internucleósido é uma ligação fosfotioato, as nucleobases 1-5 e 16-20 compreendem uma modificação de 2'-metoxietoxilo e as nucleobases 6-15 são desoxinucleótidos.

Também é aqui divulgado um composto compreendendo uma primeira cadeia de nucleobases, de 8 a 50 nucleobases de comprimento e compreendendo uma sequência de, pelo menos, 8 nucleobases contíguas de uma sequência mostrada na SEQ ID N° : 3, hibridada a uma segunda cadeia de nucleobase, de 8 a 50 nucleobases de comprimento e compreendendo uma sequência suficientemente complementar à primeira cadeia, de modo a permitir hibridação estável, o referido composto inibindo a expressão de ARNm codificando apolipoproteína B humana após 16 a 24 24 horas em, pelo menos, 30% ou em, pelo menos, 50% em células HepG2 80% confluentes em cultura, a uma concentração de 100 nM. É ainda divulgada uma vesícula, tal como um lipossoma, compreendendo um composto ou composição da divulgação.

Os métodos preferidos de administração dos compostos ou composições da divulgação a um animal são intravenosamente, subcutaneamente ou oralmente. As administrações podem ser repetidas.

Também é aqui divulgado um método de redução de secreção de lipoproteína (a) pelos hepatócitos, compreendendo (a) a colocação de hepatócitos em contacto com uma quantidade de uma composição compreendendo um composto não catalítico, de 8 a 50 nucleobases de comprimento, que se híbrida especificamente com ARNm codificando apolipoproteína B humana e inibe a expressão do ARNm após 16 a 24 horas em, pelo menos, 30% ou, pelo menos, 50% em células HepG2 80% confluentes em cultura, a uma concentração de 150 nM, em que a referida quantidade é eficaz para inibir a expressão de apolipoproteína B nos hepatócitos; e (b) medição da secreção de lipoproteína (a) pelos hepatócitos.

Também é aqui divulgado um método de um tratamento de um estado associado à expressão de apolipoproteína B numa primata, tal como um humano, compreendendo administrar ao primata uma quantidade terapeuticamente ou profilacticamente eficaz de um composto não catalítico, de 8 a 50 nucleobases de comprimento que se híbrida especificamente com ARNm codificando apolipoproteína B humana e inibe a expressão do ARNm após 16 a 25 24 horas em, pelo menos, 30% ou em, pelo menos, 50% em células HepG2 80% confluentes em cultura, a uma concentração de 150 nM.

Também é aqui divulgado um método de redução da expressão de apolipoproteína B no fígado de um animal, compreendendo administrar ao animal entre 2 mg/kg e 20 mg/kg de um composto não catalítico, de 8 a 50 nucleobases de comprimento, que se híbrida especificamente com ARNm codificando apolipoproteína B humana em, pelo menos, 30% ou em, pelo menos, 50% em células HepG2 80% confluentes em cultura, a uma concentração de 150 nM.

Também é divulgado um método de preparação de um composto da divulgação, compreendendo hibridar especificamente in vitro uma primeira cadeia de nucleobases compreendendo uma sequência de, pelo menos, 8 nucleobases contíguas de uma sequência mostrada na SEQ ID N°: 3 a uma segunda cadeia de nucleobases, compreendendo uma sequência suficientemente complementar à referida primeira cadeia, de modo a permitir hibridação estável.

Também é aqui divulgada a utilização de um composto da divulgação na preparação de um medicamento para o tratamento de todos e quaisquer dos estados aqui discutidos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção utiliza compostos oligoméricos, especificamente oligonucleótidos anti-sentido, para utilização na modulação da função de moléculas de ácido nucleico codificando apolipoproteína B modulando, em última análise, a quantidade de apolipoproteína B produzida. Isto é alcançado pelo provimento de compostos anti-sentido que se hibridam 26 especificamente com um ou mais ácidos nucleicos codificando apolipoproteina B. Como aqui utilizado, as expressões "ácido nucleico alvo" e "ácido nucleico codificando apolipoproteina B" abrangem ADN codificando apolipoproteina B, ARN (incluindo pré-ARNm e ARNm) transcrito a partir desse ADN e também ADNc derivado desse ARN. A hibridação especifica de um composto oligomérico com o seu ácido nucleico alvo interfere com a função normal do ácido nucleico. Esta modulação de função de um ácido nucleico alvo por compostos que se hibridam especificamente ao mesmo é, em geral, referida como "anti-sentido". As funções de ADN a serem interferidas incluem replicação e transcrição. As funções de ARN a serem interferidas incluem todas as funções vitais, tais como, por exemplo, translocação do ARN para o local de tradução de proteina, tradução de proteina a partir do ARN, excisão do ARN para produzir uma ou mais espécies de ARNm e actividade catalítica que podem ser desencadeadas ou facilitadas pelo ARN. 0 efeito global dessa interferência com a função de ácido nucleico alvo é a modulação da expressão de apolipoproteina B. No contexto da presente invenção, "modulação" significa um aumento (estimulação) ou uma diminuição (inibição) na expressão de um gene. No contexto da presente invenção, inibição é a forma preferida de modulação da expressão génica e o ARNm é um alvo preferido.

Prefere-se direccionar ácidos nucleicos específicos para anti-sentido. "Direccionar" um composto anti-sentido para um ácido nucleico particular, no contexto desta invenção, é um processo multietápico. 0 processo começa, habitualmente, com a identificação de uma sequência de ácidos nucleicos cuja função se destina a ser modular. Este pode ser, por exemplo, um gene celular (ou ARNm transcrito a partir do gene) cuja expressão está associada a um distúrbio ou estado de doença particular, ou 27 uma molécula de ácido nucleico de um agente infeccioso. Na presente invenção, o alvo é uma molécula de ácido nucleico codificando apolipoproteína B. 0 processo de direccionamento também inclui a determinação de um sitio ou sitios neste gene para que a interacção anti-sentido ocorra, de modo que o efeito desejado, e. g., detecção ou modulação da expressão da proteína, resulte. No contexto da presente divulgação, um sítio intragénico preferido é a região abrangendo o codão de iniciação ou terminação de tradução da fase de leitura aberta (ORF) do gene. Dado que, como é conhecido na técnica, o codão de iniciação de tradução é tipicamente 5'-AUG (em moléculas de ARNm transcritas; 5'-ATG na correspondente molécula de ADN), o codão de iniciação de tradução também é referido como o "codão AUG", o "codão de partida" ou o "codão de partida AUG". Uma minoria de genes tem um codão de iniciação de tradução tendo a sequência de ARN 5'-GUG, 5'-UUG ou 5'-CUG e mostrou-se que 5'-AUA, 5'-ACG e 5'-CUG funcionam in vivo. Deste modo, os termos "codão de iniciação de tradução" e "codão de partida" podem abranger muitas sequências de codões, ainda que o aminoácido iniciador em cada caso seja tipicamente metionina (em eucariotas) ou formilmetionina (em procariotas). Também é conhecido na técnica que os genes eucarióticos e procarióticos podem ter dois ou mais codões de partida alternativos, qualquer deles podendo ser utilizado de modo preferido para iniciação de tradução num tipo de célula ou tecido particular, ou sob um conjunto particular de condições. No contexto da invenção, "codão de partida" e "codão de iniciação de tradução" referem-se ao codão ou codões que são utilizados in vivo para iniciar a tradução de uma molécula de ARNm transcrita a partir de um gene codificando apolipoproteína B, independentemente da(s) sequência(s) desses codões. 28

Também é conhecido na técnica que um codão de terminação de tradução (ou "codão de paragem") de um gene pode ter uma de três sequências, i. e., 5'-UAA, 5'-UAG e 5'-UGA (as correspondentes sequências de ADN são 5'-TAA, 5'-TAG e 5'-TGA, respectivamente). Os termos "região de codão de partida" e "região de codão de iniciação de tradução" referem-se a uma porção desse ARNm ou gene que abrange desde cerca de 25 a cerca de 50 nucleótidos contíguos em qualquer direcção (i. e., 5' ou 3') de um codão de iniciação de tradução. De modo semelhante, as expreesões "região de codão de paragem" e "região de codão de terminação de tradução" referem-se a uma porção desse ARNm ou gene que abrange desde cerca de 25 a cerca de 50 nucleótidos contíguos em qualquer direcção (i. e., 5' ou 3') de um codão de terminação de tradução. A fase de leitura aberta (ORF) ou "região codificante", a qual é conhecida na técnica como referindo-se à região entre o codão de iniciação de tradução e o codão de terminação de tradução, também é uma região que pode ser direccionada eficazmente. Outras regiões alvo incluem a região não traduzida 5' (5'UTR), conhecida na técnica como referindo-se à porção de um ARNm na direcção 5' desde o codão de iniciação de tradução e, deste modo, incluindo nucleótidos entre o sítio da cápsula de 5' e o codão de iniciação de tradução de um ARNm ou nucleótidos correspondentes no gene e a região não traduzida 3' (3'UTR), conhecida na técnica com referindo-se à porção de um ARNm na direcção 3' desde o codão de terminação de tradução e, deste modo, incluindo nucleótidos entre o codão de terminação de tradução e a extremidade 3' de um ARNm ou nucleótidos correspondentes no gene. A cápsula de 5' de um ARNm compreende um resíduo de guanosina metilado em N7 unido ao resíduo mais em 5' do ARNm por meio de uma ligação trifosfato 5'-5'. 29

Considera-se que a região de cápsula de 5' de um ARNm inclui a própria estrutura da cápsula de 5', assim como os primeiros 50 nucleótidos adjacentes à cápsula. A região de cápsula de 5' também pode ser uma região alvo preferida.

Embora alguns transcritos de ARNm eucariótico sejam traduzidos directamente, muitos contêm uma ou mais regiões, conhecidas como "intrões", as quais são excisadas de um transcrito antes de ser traduzido. As regiões restantes (e, por conseguinte, traduzidas) são conhecidas como "exões" e são excisadas em conjunto para formar uma sequência contínua de ARNm. Os sítios de excisão de ARNm, i. e., junções intrão-exão, também podem ser regiões alvo preferidas e são particularmente úteis em situações onde a excisão aberrante esteja implicada em doença, ou onde uma sobreprodução de um produto de excisão de ARNm particular esteja implicado em doença. As junções de fusão aberrante, devido a rearranjos ou deleções, também são alvos preferidos. Também se verificou que os intrões também podem ser eficazes e, por conseguinte, regiões alvo preferidas para compostos anti-sentido direccionados, por exemplo, para ADN ou pré-ARNm.

Assim que um ou mais alvos tenham sido identificados, são escolhidos oligonucleótidos que sejam suficientemente complementares ao alvo, i. e., hibridam-se suficientemente bem e com especificidade suficiente, para proporcionar o efeito desejado.

No contexto desta invenção, "hibridação" significa ligações de hidrogénio, que podem ser Watson-Crick, Hoogsteen ou ligações de hidrogénio de Hoogsteen inversas, entre bases de nucleósido ou nucleótido complementares. Por exemplo, adenina e timina são 30 nucleobases complementares que se emparelham através da formação de ligações de hidrogénio. "Complementar", como aqui utilizado, refere-se à capacidade para emparelhamento preciso entre dois nucleótidos. Por exemplo, se um nucleótido, numa determinada posição de um oligonucleótido, for capaz de ligações de hidrogénio com um nucleótido na mesma posição de uma molécula de ADN ou ARN, então, o oligonucleótido e o ADN ou ARN são considerados como sendo complementares entre si nessa posição. 0 oligonucleótido e o ADN ou ARN são complementares entre si quando um número suficiente de posições correspondentes em cada molécula está ocupado por nucleótidos que podem formar ligações de hidrogénio entre si. Deste modo, "especificamente hibridável" e "complementar" são expressões/termos que são utilizados para indicar um grau suficiente de complementaridade ou emparelhamento preciso, de modo que ocorra ligação estável e especifica entre o oligonucleótido e o ADN ou ARN alvo. Compreende-se na técnica que a sequência de um composto anti-sentido não necessita de ser 100% complementar à do seu ácido nucleico alvo a ser especificamente hibridável. Um composto anti-sentido é especificamente hibridável quando a ligação do composto à molécula de ADN ou ARN alvo interfere com a função normal do ADN ou ARN alvo para causar uma perda de utilidade e há um grau suficiente de complementaridade para evitar ligação não especifica do composto anti-sentido a sequências não alvo, sob condições nas quais a ligação especifica é desejada, i. e., sob condições fisiológicas, no caso de ensaios in vivo ou tratamento terapêutico e, no caso de ensaios in vitro, sob condições nas quais os ensaios são realizados.

Os compostos anti-sentido e outros da invenção que se hibridam ao alvo e inibem a expressão do alvo são identificados através de experimentação e as sequências destes compostos são 31 identificadas abaixo como formas de realização preferidas da invenção. Os sítios alvo a que estas sequências preferidas são complementares são abaixo referidos como "sítios activos" e são, por conseguinte, sítios preferidos para direccionamento. Por conseguinte, outra forma de realização da invenção abrange compostos que se hibridam a estes sítios activos.

Os compostos anti-sentido são geralmente utilizados como reagentes de investigação e de diagnóstico. Por exemplo, os oligonucleótidos anti-sentido, os quais são capazes de inibir a expressão génica com excelente especificidade, são frequentemente utilizados por alguém com conhecimentos gerais para elucidar a função de genes particulares. Os compostos anti-sentido também são utilizados, por exemplo, para distinguir entre funções de diversos membros de uma via biológica. A modulação anti-sentido tem, por conseguinte, sido aproveitada para utilização de investigação.

Para utilização em kits e diagnóstico, os compostos anti-sentido da presente invenção, isoladamente ou em combinação com outros compostos anti-sentido ou terapêuticos, podem ser utilizados como ferramentas em análises diferenciais e/ou combinatórias para elucidar padrões de expressão de uma porção ou o complemento integral de genes expressos nas células e tecidos.

Os padrões de expressão nas células ou tecidos tratados com um ou mais compostos anti-sentido são comparados com células de controlo ou tecidos não tratados com compostos anti-sentido e os padrões produzidos são analisados em termos de níveis diferenciais de expressão génica, dado que se relacionam, por exemplo, com associação a doença, via de sinalização, 32 localização celular, nível de expressão, tamanho, estrutura ou função dos genes examinados. Estas análises podem ser realizadas em células estimuladas ou não estimuladas e na presença ou ausência de outros compostos que afectam padrões de expressão.

Os exemplos de métodos de análise de expressão génica conhecidos na técnica incluem matrizes ou micromatrizes de ADN (Brazma e Vilo, FEBS Lett., 2000, 480, 17-24; Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16), SAGE (análise serial de expressão génica) (Madden, et al., Drug Discov. Today, 2000, 5, 415-425),

READS (amplificação de enzimas de restrição de ADNc digeridos) (Prashar e Weissman, Methods Enzymol., 1999, 303, 258-72), TOGA (análise de expressão génica total) (Sutcliffe, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 2000, 97, 1976-81), matrizes de proteína e proteómica (Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Jungblut, et al., Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), sequenciação de cauda de sequência expressa (EST) (Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larsson, et al., J.

Biotechnol., 2000, 80, 143-57), impressão digital de ARN subtractiva (SuRF) (Fuchs, et al., Anal. Biochem., 2000, 286, 91-98; Larson, et al., Cytometry, 2000, 41, 203-208), clonagem subtractiva, apresentação diferencial (DD) (Jurecic e Belmont, Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21), hibridação genómica comparativa (Carulli, et ai., J. Cell Biochem. Suppl., 1998, 31, 286-96), técnicas de FISH (hibridação in situ fluorescente) (Going e Gusterson, Eur. J. Câncer, 1999, 35, 1895-904) e métodos de espectrometria de massa (redado em (To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3, 235-41). A especificidade e sensibilidade do anti-sentido também é aproveitada pelos especialistas na técnica para utilizações terapêuticas. Os oligonucleótidos anti-sentido têm sido 33 empregues como fracções terapêuticas no tratamento de estados de doença em animais e no homem. Os fármacos de oligonucleótidos anti-sentido, incluindo ribozimas, têm sido administrados, de modo seguro e eficaz, a humanos e numerosos ensaios clínicos estão presentemente em curso. Está, deste modo, estabelecido que os oligonucleótidos podem ser modalidades terapêuticas úteis que podem ser configuradas para serem úteis em regimes de tratamento para tratamento de células, tecidos e animais, especialmente humanos.

No contexto desta invenção, o termo "oligonucleótido" refere-se a um oligómero ou polímero de ácido ribonucleico (ARN) ou ácido desoxirribonucleico (ADN) ou os seus miméticos. Deste modo, este termo inclui oligonucleótidos compostos por nucleobases de ocorrência natural, açúcares e ligações internucleósido covalentes (esqueleto) (ARN e ADN), assim como oligonucleótidos tendo porções de ocorrência não natural que funcionam de modo semelhante (miméticos oligonucleotídicos) . Os miméticos oligonucleotídicos são frequentemente preferidos às formas nativas, devido a propriedades desejáveis, tais como, por exemplo, absorção celular melhorada, afinidade melhorada para ácido nucleico alvo e estabilidade aumentada na presença de nucleases.

Embora os oligonucleótidos anti-sentido sejam uma forma preferida de composto anti-sentido, a presente divulgação inclui outros compostos anti-sentido oligoméricos, incluindo mas não limitados a miméticos oligonucleotídicos, tal como são descritos abaixo. Os compostos anti-sentido de acordo com esta divulgação compreendem desde cerca de 8 a cerca de 50 nucleobases (i. e., desde cerca de 8 a cerca de 50 nucleósidos ligados) . São compostos anti-sentido particularmente preferidos os 34 oligonucleótidos anti-sentido, de um modo ainda mais preferido, aqueles compreendendo desde cerca de 12, cerca de 14, cerca de 20 a cerca de 30 nucleobases. Os compostos anti-sentido incluem ribozimas, oligonucleótidos de sequência guia externa (EGS) (oligozimas) e outros ARN catalíticos curtos ou oligonucleótidos catalíticos que se hibridam ao ácido nucleico alvo modulam a sua expressão. Em formas de realização preferidas, o composto anti-sentido é oligonucleótido não catalítico, i. e., não está dependente de uma propriedade catalítica do oligonucleótido para a sua actividade de modulação. Os compostos anti-sentido da invenção podem incluir moléculas de cadeia dupla, em que uma primeira cadeia está hibridada, de um modo estável, a uma segunda cadeia.

Como é conhecido na técnica, um nucleósido é uma combinação de base-açúcar. A porção de base do nucleósido é, normalmente, uma base heterocíclica. As duas classes mais comuns dessas bases heterocíclicas são as purinas e as pirimidinas. Os nucleótidos são nucleósidos que incluem, ainda, um grupo fosfato covalentemente ligado à porção açúcar do nucleósido. Para os nucleósidos que incluem um açúcar pentofuranosilo, o grupo fosfato pode estar ligado à fracção hidroxilo 2', 3' ou 5' do açúcar. Na formação de oligonucleótidos, os grupos fosfato ligam covalentemente nucleósidos adjacentes entre si para formar um composto polimérico linear. Por sua vez, as respectivas extremidades desta estrutura polimérica linear podem estar, ainda, ligadas para formar uma estrutura circular, contudo, as estruturas lineares abertas são, em geral, preferidas. Na estrutura de oligonucleótido, os grupos fosfato são geralmente referidos como formando o esqueleto de internucleósido do oligonucleótido. A ligação ou esqueleto normal de ARN e ADN é uma ligação fosfodiéster 3' para 5'. 35

Os exemplos específicos de compostos anti-sentido preferidos úteis nesta invenção incluem oligonucleótidos contendo esqueletos modificados ou ligações internucleósido não naturais. Como definido nesta descrição, os oligonucleótidos tendo esqueletos modificados incluem os que retêm um átomo de fósforo no esqueleto e os que não têm um átomo de fósforo no esqueleto. Para efeitos desta descrição e, como por vezes referenciado na técnica, os oligonucleótidos modificados que não têm um átomo de fósforo no seu esqueleto de internucleósido também podem ser considerados como sendo oligonucleósidos.

Os esqueletos de oligonucleótido modificados preferidos incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirais, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquil-fosfotriésteres, fosfonatos de metilo e outros fosfonatos de alquilo, incluindo fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno e fosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos, incluindo 3'-aminofosforamidato e aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos e boranofosfatos tendo ligações 3^-57, normais, análogos ligados 2'-5' destes e aqueles tendo polaridade invertida, em que uma ou mais ligações internucleótido é uma ligação 3' para 3', 5' para 5' ou 2' para 2' . Os oligonucleótidos preferidos tendo polaridade invertida compreendem uma única ligação de 3' para 3' na ligação internucleótido mais em 3', i. e., um único resíduo de nucleósido invertido que pode ser abásico (a nucleobase está ausente ou tem um grupo hidroxilo no seu lugar) . Também estão incluídos diversos sais, sais mistos e formas de ácido livre. 36

As patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação das ligações contendo fósforo acima incluem mas nao 5023243; 5321131; 5519126; 5194599; estão limitadas a U.S.: 3687808; 4469863; 4476301; 5177196; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5536821; 5541306; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361; 5565555; 5527899; 5721218; 5672697 e 5625050.

Os esqueletos de oligonucleótidos modificados preferidos que não incluem um átomo de fósforo nestes têm esqueletos que são formados por ligações internucleósido de alquilo ou cicloalquilo de cadeia curta, ligações internucleósido de alquilo ou cicloalquilo de heteroátomo mistas ou uma ou mais ligações internucleósido heteroatómicas ou heterocíclicas de cadeia curta. Estes incluem aquelas tendo ligações morfolino (formadas, em parte, a partir da porção de açúcar de um nucleósido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfureto, sulfóxido e sulfona; esqueletos de formacetilo e tioformacetilo; esqueletos de formacetilo e tioformacetilo de metileno; esqueletos de riboacetilo; esqueletos contendo alceno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenoimino e metileno-hidrazino; esqueletos de sulfonato e sulfonamida; esqueletos de amida; e outros tendo partes de componentes de N, O, S e CH2 mistas.

As patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação dos oligonucleósidos acima incluem mas não estão limitadas a U.S. : 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033;5264562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5610289; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437; 5792608; 5646269 e 5677439. 37

Em outros miméticos oligonucleotídicos preferidos, a ligação de açúcar e internucleósido, i. e., o esqueleto, das unidades nucleotidicas estão substituídas com grupos novos. As unidades de base são mantidas para hibridação com um composto alvo de ácido nucleico apropriado. Um desses compostos oligoméricos, um mimético oligonucleotídico que se demonstrou ter excelentes propriedades de hibridação, é referido como um ácido nucleico peptídico (PNA). Nos compostos de PNA, o esqueleto de açúcar de um oligonucleotido é substituído com um esqueleto contendo amida, em particular um esqueleto de aminoetilglicina. As nucleobases estão retidas e estão ligadas, directamente ou indirectamente, a átomos de azoto aza da porção amida do esqueleto. As patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de compostos de PNA incluem mas não estão limitadas a U.S.: 5539082; 5714331; e 5719262. Ensinamento adicional de compostos de PNA pode consultar-se em Nielsen et ai., Science, 1991, 254, 1497-1500. São formas de realização muito preferidas da invenção os oligonucleótidos com esqueletos de fosforotioato e oligonucleósidos com esqueletos de heteroátomos e, em particular, -CH2-NH-0-CH2-, -CH2-N (CH3)-0-CH2- [conhecido como um esqueleto de metileno (metilimino) ou MMI], -CH2-0-N (CH3)-CH2-, -CH2-N (CH3) -N (CH3) -CH2- e -O-N (CH3) -CH2-CH2- [em que o esqueleto de fosfodiéster nativo está representado como -0-P-0-CH2-] da patente U.S. 5489677 acima referenciada e os esqueletos de amida da patente U.S. 5602240 acima referenciada. Também são preferidos oligonucleótidos tendo estruturas de esqueleto de morfolino da patente U.S. 5034506 acima referenciada. 38

Os oligonucleótidos modificados também podem conter uma ou mais fracções de açúcar substituídas. Os oligonucleótidos preferidos compreendem um dos seguintes na posição 2': OH; F; 0-, S- ou N-alquilo; 0-, S- ou N-alcenilo; 0-, S- ou N-alcinilo; ou O-alquil-O-alquilo, em que o alquilo, alcenilo e alcinilo podem ser alquilo (Ci a Cio) ou alcenilo (C2 a Ci0) e alcinilo, substituídos ou não substituídos. São particularmente preferidos 0[ (CH2)nO]mCH3, 0 (CH2)nOCH3, 0 (CH2)nNH2, 0 (CH2)nCH3, 0(CH2)nONH2 e 0 (CH2) n0N [ (CH2) nCH3) ] 2, onde nem são desde 1 a cerca de 10. Outros oligonucleótidos preferidos compreendem um dos seguintes na posição 2': alquilo(C2 a Cio) inferior , alquilo inferior substituído, alcenilo, alcinilo, alcarilo, aralquilo, 0-alcarilo ou 0-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, 0CF3, S0CH3, S02CH3, 0N02, N02, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo substituído, um grupo de clivagem de ARN, um repórter grupo, um intercalante, um grupo para melhoramento das propriedades farmacocinéticas de um oligonucleótido ou um grupo para melhoramento das propriedades farmacodinâmicas de um oligonucleótido e outros substituintes tendo propriedades semelhantes. Uma modificação preferida inclui 2'-metoxietoxi (2'-0-CH2CH20CH3, também conhecido como 2'-0-(2-metoxietilo) ou 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), i. e., um grupo alcoxialcoxi. Uma modificação preferida adicional inclui 2'-dimetilaminoxietoxi, i. e., um grupo 0(CH2) 20N(CH3) 2, também conhecido como 2'-DMA0E, como descrito nos exemplos abaixo e 2'-dimetilaminoetoxietoxi (também conhecido na técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo ou 2'-DMAEOE), i. e., 2 '-0-CH2-0-CH2-N(CH2) 2, também descrito nos exemplos abaixo. 39

Uma modificação preferida adicional inclui Ácidos Nucleicos Fechados (LNA), nos quais o grupo 2'-hidroxilo está ligado ao átomo de carbono 3' ou 4' do anel de açúcar formando, desse modo, uma fracção de açúcar biciclica. A ligação é, de um modo preferido, um grupo de metileno (-CH2-)n ligando o átomo de oxigénio 2' e o átomo de carbono 4', em que n é 1 ou 2. Os LNA e a sua preparação são descritos nos documentos WO 98/39352 e WO 99/14226.

Outras modificações preferidas incluem 2'-metoxi (2'-0-CH3), 2 '-aminopropoxi (2 '-OCH2CH2CH2NH2) , 2'-alquil (2 '-CH2-CH=CH2) , 2'-0-alil (2'-0-CH2-CH=CH2) e 2'-fluoro (2'-F). A modificação 2' pode ser na posição arabino (cima) ou posição ribo (baixo) . Uma modificação de 2'-arabino preferida é 2'-F. Modificações semelhantes também podem ser realizadas noutras posições no oligonucleótido, particularmente a posição 3' do açúcar no nucleótido terminal 3' ou em oligonucleótidos ligados 2'-5' e a posição 5' do nucleótido terminal 5'. Os oligonucleótidos também podem ter miméticos de açúcar, tal como fracções de ciclobutilo, em vez do açúcar de pentofuranosilo. As patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação dessas estruturas de açúcar modificadas incluem mas não estão limitadas a U.S.: 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137;5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633; 5792747; e 5700920.

Os oligonucleótidos também podem incluir modificações ou substituições de nucleobases (frequentemente referidas na técnica simplesmente como "base"). Como aqui utilizado, nucleobases "não modificadas" ou "naturais" incluem as bases purinicas adenina (A) e guanina (G) e as bases pirimidínicas 40 timina (T), citosina (C) e uracilo (U) . As nucleobases modificadas incluem outras nucleobases sintéticas e naturais, tais como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, β-metil e outros derivados alquilo de adenina e guanina, 2-propil e outros derivados alquilo de adenina e guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina e 2- tiocitosina, 5-halouracilo e citosina, 5-propinil (-C^c-Clh) uracilo e citosina e outros derivados alcinilo de bases pirimidinicas, β-azouracilo, citosina e timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo e outras adeninas e guaninas 8-substituídas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo e outros uracilos e citosinas 5-substituídas, 7- metilguanina e 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8- azaguanina e 8-azaadenina, 7-desazaguanina e 7-desazaadenina e 3- desazaguanina e 3-desazaadenina. Nucleobases modificadas adicionais incluem pirimidinas triciclicas, tais como fenoxazina citidina(lH-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (lH-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazin-2(3H)-ona) , garras de G, tal como uma fenoxazina citidina substituída (e. g., 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)- ona), carbazole citidina (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona), piridoindole citidina (H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[2,3- d]pirimidin-2-ona). As nucleobases modificadas também podem incluir aquelas nas quais a base purínica ou pirimidínica é substituída com outros heterociclos, por exemplo 7-desazaadenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina e 2-piridona. Nucleobases adicionais incluem aquelas divulgadas na Patente dos Estados Unidos N° 3687808, as divulgadas em The

Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, as divulgadas por Englisch et al., Angewandte Chemie, Edição 41

Internacional, 1991, 30, 613 e as divulgadas por Sanghvi, Y.S., Capitulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S.T. e Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Determinadas destas nucleobases são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos oligoméricos da invenção. Estas incluem pirimidinas 5-substituidas, 6-azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e 0-6 substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo e 5-propinilcitosina. Mostrou-se que as substituições de 5-metilcitosina aumentam a estabilidade de dúplice de ácido nucleico em 0,6-1,2 °C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. e Lebleu, B., ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, p. 276-278) e são as substituições de bases presentemente preferidas, de um modo ainda mais particular, quando combinadas com modificações de açúcar de 2'-O-metoxietilo.

As Patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de determinadas nucleobases modificadas acima notadas, assim como outras nucleobases modificadas incluem mas não estão limitadas às acima notadas U.S. 3687808, assim como U.S.: 4845205; 5130302; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121; 5596091; 5614617; 5645985; 5830653; 5763588; 6005096; e 5681941, e patente dos Estados Unidos 5750692.

Outra modificação dos oligonucleótidos da invenção envolve a ligação química ao oligonucleótido de uma ou mais fracções ou conjugados que melhoram a actividade, distribuição celular ou absorção celular do oligonucleótido. Os compostos da invenção podem incluir grupos de conjugados ligados covalentemente a grupos funcionais, tais como grupos hidroxilo primários ou 42 secundários. Os grupos de conjugados da invenção incluem intercalantes, moléculas repórter, poliaminas, poliamidas, polietilenoglicóis, poliéteres, grupos que melhoram as propriedades farmacodinâmicas de oligómeros e grupos que melhoram as propriedades farmacocinéticas de oligómeros. Os grupos de conjugados típicos incluem colesteróis, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, coumarinas e corantes. Os grupos que melhoram as propriedades farmacodinâmicas, no contexto desta invenção, incluem grupos que melhoram a absorção de oligómero, melhoram a resistência de oligómero à degradação e/ou fortalecem a hibridação específica de sequência com ARN. Os grupos que melhoram as propriedades farmacocinéticas, no contexto desta invenção, incluem grupos que melhoram a absorção, distribuição, metabolismo ou excreção de oligómero. Os grupos de conjugados representativos são divulgados no Pedido de Patente Internacional PCT/US92/09196, apresentado em 23 de Outubro de 1992. As fracções de conjugados incluem mas não estão limitadas a fracções lipídicas, tal como um fracção de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido eólico (Manoharan et al.,

Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), um tioéter, e. g hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N. Y. Acad. Sei 1992, 660, 306-309; Manoharan et al. , Bioorg, , Med. Chem. Let 1993, 3, 2765-2770), um tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl.

Acids Res., 1992, 20, 533- 538) , uma cadeia alifática, e. g., resíduos de dodecandiol ou undecilo (Saison- -Behmoaras et al., EMBO J. , 1991, 10, 1111- -1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327- -33 0; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), um fosfolípido, e. g., di-hexadecil-rac-glicerol ou trietilamónio 1,2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids 43

Res. , 1990, 18, 3777-3783), uma poliamina ou uma cadeia de polietilenoglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) ou ácido acético de adamantano (Manoharan et ai., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), uma fracção de palmitilo (Mishra et ai., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237) ou uma fracção de octadecilamina ou hexilaminocarbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937. Os oligonucleótidos da invenção também podem ser conjugados a substâncias activas de fármacos, por exemplo, aspirina, varfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, cetoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triiodobenzóico, ácido flufenâmico, ácido folinico, uma benzotiadiazida, clorotiazida, uma diazepina, indometicina, um barbiturato, uma cefalosporina, um sulfofármaco, um antidiabético, um antibacteriano ou um antibiótico. Os conjugados de oligonucleótido-fármaco e a sua preparação são descritos no Pedido de Patente dos Estados Unidos 09/334130 (apresentado em 15 de Junho de 1999).

As patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação desses conjugados oligonucleotidicos incluem mas nao estão limitadas a U.S. : 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717; 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098 ; 5371241 5391723; 5416203 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 e 5688941. 44 Não é necessário que todas as posições num dado composto sejam uniformemente modificadas e, de facto, mais que uma das modificações mencionadas acima pode ser incorporada num único composto ou até num único nucleósido num oligonucleótido. A presente invenção também inclui compostos anti-sentido que são compostos quiméricos. Os compostos anti-sentido "quiméricos" ou "quimeras", no contexto desta invenção, são compostos anti-sentido, particularmente oligonucleótidos, os quais contêm duas ou mais regiões químicas distintas, cada composta por, pelo menos, uma unidade monomérica, i. e., um nucleótido no caso de um composto oligonucleotídico. Estes oligonucleótidos tipicamente contêm, pelo menos, uma região em que o oligonucleótido é modificado de modo a conferir ao oligonucleótido resistência aumentada à degradação de nuclease, absorção celular aumentada e/ou afinidade de ligação aumentada para o ácido nucleico alvo. Uma região adicional do oligonucleótido pode servir como um substrato para enzimas capazes de clivarem híbridos de ARN:ADN ou ARN:ARN. A título exemplificativo, a RNase H é uma endonuclease celular que cliva a cadeia de ARN de um dúplice de ARN:ADN. A activação de RNase H, por conseguinte, resulta em clivagem do alvo de ARN, desse modo melhorando grandemente a eficiência de inibição oligonucleotídica da expressão génica. Consequentemente, resultados comparáveis podem ser frequentemente obtidos com oligonucleótidos mais curtos, quando são utilizados oligonucleótidos quiméricos, em comparação com desoxioligonucleótidos de fosforotioato que se hibridam à mesma região alvo. A clivagem do alvo de ARN pode ser rotineiramente detectada por electroforese em gel e, se necessário, técnicas de hibridação de ácido nucleico associadas conhecidas na matéria. 45

Os oligonucleótidos anti-sentido quiméricos da invenção podem ser formados como estruturas compostas de dois ou mais oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos e/ou miméticos oligonucleotidicos, como descrito acima. Esses compostos também foram referidos na técnica como híbridos ou gapmeros. As patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação dessas estruturas híbridas incluem mas não estão limitadas a U.S.: 5013830; 5149797; 5220007; 5256775; 5366878; 5403711; 5491133; 5565350; 5623065; 5652355; 5652356; e 5700922 .

Os compostos anti-sentido utilizados de acordo com esta invenção podem ser convenientemente e rotineiramente preparados através da técnica bem conhecida de síntese de fase sólida. O equipamento para essa síntese é comercializado por vários vendedores incluindo, por exemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA) . Qualquer outro meio para essa síntese conhecido na técnica pode ser, adicionalmente ou alternativamente, empregue. É bem conhecida a utilização de técnicas semelhantes para preparar oligonucleótidos, tais como os fosforotioatos e derivados alquilados.

Os compostos anti-sentido da invenção são sintetizados in vitro e não incluem composições anti-sentido de origem biológica, ou construções de vector genéticas concebidas para dirigir a síntese in vivo de moléculas anti-sentido.

Os compostos da invenção também podem ser misturados, encapsulados, conjugados ou, de outro modo, associados a outras moléculas, estruturas de moléculas ou misturas de compostos como, por exemplo, lipossomas, moléculas direccionadas a receptores, formulações orais, rectais, tópicas ou outras, para 46 auxiliar na absorção, distribuição e/ou absorção. As patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação dessas formulações auxiliando a absorção, distribuição e/ou absorção incluem mas não estão limitadas a U.S.: 5108921; 5354844; 5416016; 5459127; 5521291; 5543158; 5547932; 5583020; 5591721; 4426330; 4534899; 5013556; 5108921; 5213804; 5227170; 5264221; 5356633; 5395619; 5416016; 5417978; 5462854; 5469854; 5512295; 5527528; 5534259; 5543152; 5556948; 5580575; e 5595756.

Os compostos anti-sentido da invenção abrangem quaisquer sais, ésteres ou sais desses ésteres farmaceuticamente aceitáveis, ou qualquer outro composto que, após administração a um animal, incluindo um humano, é capaz de proporcionar (directamente ou indirectamente) o metabolito biologicamente activo ou seu resíduo. Consequentemente, por exemplo, a divulgação também envolve profármacos e sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da invenção, sais farmaceuticamente aceitáveis desses profármacos e outros bioequivalentes. O termo "profármaco" indica um agente terapêutico que é preparado numa forma inactiva que é convertida numa forma activa (i. e., fármaco) no corpo, ou suas células, pela acção de enzimas endógenas ou outros químicos e/ou condições. Em particular, as versões de profármaco dos oligonucleótidos da invenção são preparadas como derivados de SATE [fosfato de (S-acetil-2-tioetilo)], de acordo com os métodos divulgados no documento WO 93/24510 para Gosselin et al., publicado a 9 de Dezembro de 1993 ou nos documentos WO 94/26764 e U.S. 5770713 para Imbach et al. 47 A expressão "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais fisiologicamente e farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da invenção: i. e., sais que retêm a actividade biológica desejada do composto parental e não lhe conferem efeitos toxicológicos não desejados.

Os sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis são formados com metais ou aminas, tais como metais alcalinos e alcalino-terrosos ou aminas orgânicas. Os exemplos de metais utilizados como catiões são sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes. Os exemplos de aminas adequadas são N, N'-dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, diciclo-hexilamina, etilenodiamina, N-metilglucamina e procaína (ver, por exemplo, Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. of Pharma Sei., 1977, 66, 1-19). Os sais de adição de base dos referidos compostos acídicos são preparados pela colocação da forma de ácido livre em contacto com uma quantidade suficiente da base desejada, para produzir o sal no modo convencional. A forma de ácido livre pode ser regenerada pela colocação da forma de sal em contacto com um ácido e o isolamento do ácido livre no modo convencional. As formas de ácido livre diferem um pouco das suas respectivas formas de sal em determinadas propriedades físicas, tal como solubilidade em solventes polares mas, de outro modo, para efeitos da presente invenção, os sais são equivalentes ao seu respectivo ácido livre. Como aqui utilizado, um "sal de adição farmacêutico" inclui um sal farmaceuticamente aceitável de uma forma de ácido de um dos componentes da composição da invenção. Estes incluem sais de ácido, orgânicos ou inorgânicos, das aminas. São sais preferidos os cloridratos, acetatos, salicilatos, nitratos e fosfatos. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis adequados são bem conhecidos dos especialistas na 48 técnica e incluem sais básicos de uma variedade de ácidos inorgânicos e orgânicos, tal como, por exemplo, com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico ou ácido fosfórico; com ácidos orgânicos carboxílicos, sulfónicos, sulfo ou fosfo ou ácidos sulfâmicos N-substituídos, por exemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido glucurónico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido salicílico, ácido 4-aminossalicílico, ácido 2-fenoxibenzóico, ácido 2-acetoxibenzóico, ácido embónico, ácido nicotínico ou ácido isonicotínico; e com aminoácidos, tal como os 20 alfa-aminoácidos envolvidos na síntese de proteínas na natureza, por exemplo ácido glutâmico ou ácido aspártico e também com ácido fenilacético, ácido metanossulfónico, ácido etanossulfónico, ácido 2-hidroxietanossulfónico, ácido etano-1,2-dissulfónico, ácido benzenossulfónico, ácido 4-metilbenzenossulfónico, ácido naftaleno-2-sulfónico, ácido naftaleno-1,5-dissulfónico, 2- ou 3-fosfoglicerato, glucose-6-fosfato, ácido N-ciclo-hexilsulfâmico (com a formação de ciclamatos) ou com outros compostos de ácido orgânico, tal como ácido ascórbico. Os sais farmaceuticamente aceitáveis de compostos também podem ser preparados com um catião farmaceuticamente aceitável. Os catiões farmaceuticamente aceitáveis adequados são bem conhecidos dos especialistas na técnica e incluem catiões alcalinos, alcalino-terrosos, amónio e amónio quaternário. Também são possíveis carbonatos ou hidrogenocarbonatos. 49

Para oligonucleótidos, os exemplos preferidos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem mas não estão limitados a (a) sais formados com catiões, tais como sódio, potássio, amónio, magnésio, cálcio, poliaminas, tais como espermina e espermidina, etc.; (b) sais de adição de ácido formados com ácidos inorgânicos, por exemplo ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico e semelhantes; (c) sais formados com ácidos orgânicos, tais como, por exemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzóico, ácido tânico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácido naftalenossulfónico, ácido metanossulfónico, ácido p-toluenossulfónico, ácido naftalenodissulfónico, ácido poligalacturónico e semelhantes; e (d) sais formados a partir de aniões elementares, tais como cloro, bromo e iodo.

Os compostos anti-sentido da presente invenção podem ser utilizados para diagnóstico, terapêutica, profilaxia e como reagentes de investigação e kits. Para terapêutica, um animal, de um modo preferido um humano, suspeito de ter uma doença ou distúrbio que pode ser tratado pela modulação da expressão de apolipoproteína B, é tratado pela administração de compostos anti-sentido de acordo com esta invenção. Os compostos da invenção podem ser utilizados em composições farmacêuticas pela adição de uma quantidade eficaz de um composto anti-sentido a um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável adequado. A utilização dos compostos anti-sentido e métodos da invenção também pode ser útil profilacticamente, e. g., para prevenir ou retardar a infecção, inflamação ou formação de tumor, por exemplo. 50

Os compostos anti-sentido da invenção são úteis para investigação e diagnóstico, porque estes compostos se hibridam a ácidos nucleicos codificando apolipoproteína B, possibilitando que ensaios de sandwich e outros sejam facilmente construídos para explorar este facto. A hibridação dos oligonucleótidos anti-sentido da invenção com um ácido nucleico codificando apolipoproteína B pode ser detectada por meios conhecidos na técnica. Esses meios podem incluir conjugação de uma enzima ao oligonucleótido, marcação radioactiva do oligonucleótido ou qualquer outro meio de detecção adequado. Também podem ser preparados kits utilizando esses meios de detecção para detecção do nível de apolipoproteína B numa amostra. A presente invenção também inclui composições e formulações farmacêuticas que incluem os compostos anti-sentido da invenção. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de diversos modos, consoante se deseje tratamento local ou sistémico e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica (incluindo oftálmica e a membranas mucosas, incluindo distribuição vaginal e rectal), pulmonar, e. g., por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica), oral ou parentérica. A administração parentérica inclui intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou injecção intramuscular ou infusão; ou administração intracraniana, e. g., intratecal ou intraventricular. Considera-se que os oligonucleótidos com, pelo menos, uma modificação de 2'-O-metoxietilo são particularmente úteis para administração oral. 51

As composições e formulações farmacêuticas para administração tópica podem incluir adesivos transdérmicos, pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos e pós. Podem ser necessários ou desejáveis veículos, aquosos, pós ou bases oleosas, espessantes e semelhantes farmacêuticos convencionais. Também podem ser úteis preservativos revestidos, luvas e semelhantes. As formulações tópicas preferidas incluem aquelas nas quais os oligonucleótidos da invenção estão em mistura com um agente de distribuição tópica, tais como lípidos, lipossomas, ácidos gordos, ésteres de ácidos gordos, esteróides, agentes quelantes e surfactantes. Os lípidos e lipossomas preferidos incluem neutros (e. g. , dioleoilfosfatidiletanolamina DOPE, dimiristoilfosfatidilcolina DMPC, distearolifosfatidilcolina) negativos (e. g., dimiristoilfosfatidilglicerol DMPG) e catiónicos (e. g., dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP e dioleoilfosfatidiletanol DOTMA). Os oligonucleótidos da invenção podem estar encapsulados em lipossomas ou podem formar complexos com estes, em particular com lipossomas catiónicos. Alternativamente, os oligonucleótidos podem estar complexados com lípidos, em particular com lípidos catiónicos. Os ácidos gordos e ésteres preferidos incluem mas não estão limitados a ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanóico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, gliceril 1-monocaprato, l-dodecilazaciclo-heptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina ou um éster de alquilo (Ci_i0) (e. g. , isopropilmiristato IPM), monoglicérido, diglicérido ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. As formulações tópicas são descritas em detalhe no pedido de patente dos Estados Unidos 09/315298 apresentado em 20 de Maio de 1999. 52

As composições e formulações para administração oral incluem pós ou grânulos, microparticulados, nanoparticulados, suspensões ou soluções em água ou meios não aquosos, cápsulas, cápsulas de gel, saquetas, comprimidos ou minicomprimidos. Podem ser desejáveis espessantes, agentes aromatizantes, diluentes, emulsionantes, óleos dispersantes ou aglutinantes. As formulações orais preferidas são aquelas nas quais os oligonucleótidos da invenção são administrados em conjunto com um ou mais intensificadores de penetração, surfactantes e quelantes. Os surfactantes preferidos incluem ácidos gordos e/ou ésteres ou seus sais, ácidos biliares e/ou seus sais. Os ácidos/sais biliares preferidos incluem ácido quenodesoxicólico (CDCA) e ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA), ácido eólico, ácido desidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24,25-di-hidro-fusidato de sódio, glicodi-hidrofusidato de sódio. Os ácidos gordos preferidos incluem ácido araquidónico, ácido undecanóico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, gliceril 1-monocaprato, l-dodecilazaciclo-heptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina ou um monoglicérido, um diglicérido ou um seu sal farmaceuticamente aceitável (e. g., sódio). Também são preferidas combinações de intensificadores de penetração, por exemplo, ácidos gordos/sais, em combinação com ácidos/sais biliares. Uma combinação particularmente preferida é o sal de sódio do ácido láurico, ácido cáprico e UDCA. Intensificadores de penetração adicionais incluem éter de polioxietileno-9-laurilo, éter de polioxietileno-20-cetilo. Os oligonucleótidos da invenção podem ser distribuídos oralmente na forma granular, incluindo partículas secas por pulverização, ou 53 complexados para formar micro ou nanopartículas. Os agentes de complexação de oligonucleótidos incluem poliaminoácidos; poliiminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polioxetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationizadas, albuminas, amidos, acrilatos, polietilenoglicóis (PEG) e amidos; polialquilcianoacrilatos; poliiminas derivatizadas com DEAE, polulanos, celuloses e amidos. Os agentes de complexação particularmente preferidos incluem quitosano, N-trimetilquitosano, poli-L-lisina, poli-histidina, poliornitina, polisperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P(TDAE), poliaminostireno (e. g., p-amino) , poli (metilcianoacrilato) , poli(etilcianoacrilato) , poli(butilcianoacrilato), poli(isobutilcianoacrilato) , poli(isso-hexilcinaoacrilato), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-albumina e DEAE-dextrano, polimetilacrilato, poli-hexilacrilato, ácido poli(D,L-láctico), ácido poli(DL-lactic-co-glicólico (PLGA), alginato e polietilenoglicol (PEG). As formulações orais para oligonucleótidos e sua preparação são descritas em detalhe nos pedidos dos Estados Unidos 08/886829 (apresentado em 1 de Julho de 1997), 09/108673 (apresentado em 1 de Julho de 1998), 09/256515 (apresentado em 23 de Fevereiro de 1999), 09/082624 (apresentado em 21 de Maio de 1998) e 09/315298 (apresentado em 20 de Maio de 1999) .

As composições e formulações para administração parentérica, intratecal ou intraventricular podem incluir soluções aquosas estéreis, que também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados, tais como, mas não limitados a intensificadores de penetração, compostos veículo e outros veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. 54

As composições farmacêuticas da presente invenção incluem mas não estão limitadas a soluções, emulsões e formulações contendo lipossomas. Estas composições podem ser geradas a partir de uma variedade de componentes que incluem mas não estão limitados a líquidos pré-formados, sólidos auto-emulsionantes e semi-sólidos auto-emulsionantes.

As formulações farmacêuticas da presente invenção, que podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica. Essas técnicas incluem o passo de colocar em associação os ingredientes activos com o(s) veículo(s) ou excipiente(s) farmacêutico(s). Em geral, as formulações são preparadas colocando uniformemente e intimamente em associação os ingredientes activos com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos e, depois, se necessário, dar forma ao produto.

As composições da presente invenção podem ser formuladas em qualquer de muitas formas de dosagem possíveis, tais como, mas não limitadas a comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líquidos, géis macios, supositórios e enemas. As composições da presente invenção também podem ser formuladas como suspensões em meios aquosos, não aquosos ou mistos. As suspensões aquosas podem, ainda, conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão também pode conter estabilizantes. 55

Numa forma de realização da presente invenção, as composições farmacêuticas podem ser formuladas e utilizadas como espumas. As espumas farmacêuticas incluem formulações, tais como, mas não limitadas a emulsões, microemulsões, cremes, gelatinas e lipossomas. Embora basicamente semelhantes em natureza, estas formulações variam nos componentes e na consistência do produto final. A preparação dessas composições e formulações é, em geral, conhecida dos especialistas nas técnicas farmacêutica e de formulação e podem ser aplicadas à formulação das composições da presente invenção.

Emulsões

As composições da presente invenção podem ser preparadas e formuladas como emulsões. As emulsões são tipicamente sistemas heterogéneos de um liquido disperso noutro na forma de goticulas, habitualmente excedendo 0,1 pm em diâmetro (Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Ed.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 199; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e

Banker (Ed .), 1988, Mareei Dekker, Inc. , Nova Iorque, N. I., Volume 1, p. 2 45; Block em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Ed. ) , 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 2, p. 335; Higuch i et al ., em

Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 301). As emulsões são frequentemente sistemas bifásicos, compreendendo duas fases liquidas imisciveis infimamente misturadas e dispersas entre si. Em geral, as emulsões podem ser da variedade de água-em-óleo (a/o) ou óleo-em-água (o/a). Quando uma fase aquosa é finamente dividida e dispersa como goticulas mínimas numa fase oleosa em bruto, a 56 composição resultante é denominada uma emulsão de água-em-óleo (a/o) . Alternativamente, quando uma fase aquosa é finamente dividida e dispersa como gotículas mínimas numa fase aquosa em bruto, a composição resultante é denominada uma emulsão de óleo-em-água (o/a). As emulsões podem conter componentes adicionais, além das fases dispersas e do fármaco activo, que podem estar presentes como uma solução na fase aquosa, fase oleosa ou propriamente como uma fase separada. Os excipientes farmacêuticos, tais como emulsionantes, estabilizantes, corantes e antioxidantes, também podem estar presentes em emulsões, conforme necessário. As emulsões farmacêuticas também podem ser emulsões múltiplas, que são compreendidas por mais de duas fases, tais como, por exemplo, no caso de emulsões de óleo-em-água-em-óleo (o/a/o) e água-em-óleo-em-água (a/o/a) Essas formulações complexas proporcionam, frequentemente, determinadas vantagens que as emulsões binárias simples não proporcionam. As emulsões múltiplas, nas quais gotículas de óleo individuais de uma emulsão de o/a encerram pequenas gotículas de água, constituem uma emulsão de a/o/a. Do mesmo modo, um sistema de gotículas de óleo encerradas em glóbulos de água estabilizados num oleoso proporcionam continuamente uma emulsão de o/a/o.

As emulsões são caracterizadas por pouca ou nenhuma estabilidade termodinâmica. Frequentemente, a fase dispersa ou descontinua da emulsão está bem dispersa na fase externa ou contínua e mantida nesta forma através dos meios de emulsionantes ou da viscosidade da formulação. Qualquer das fases da emulsão pode ser um semi-sólido ou um sólido, como é o caso de bases e cremes de pomadas de estilo de emulsão. Outros meios de estabilizar emulsões implicam a utilização de emulsionantes que podem estar incorporados em qualquer das fases 57 da emulsão. Os emulsionantes podem ser, em traços largos, classificados em quatro categorias: surfactantes sintéticos, emulsionantes de ocorrência natural, bases de absorção e sólidos finamente dispersos (Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Ed.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 199).

Os surfactantes sintéticos, também conhecidos como agentes tensioactivos, encontraram ampla aplicabilidade na formulação de emulsões e foram redados na literatura (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Ed.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 285; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Ed.), Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., 1988, volume 1, p. 199). Os surfactantes são tipicamente anfifilicos e compreendem uma porção hidrófila e uma hidrófoba. A razão da natureza hidrófila para a hidrófoba do surfactante foi designada equilíbrio hidrófilo/lipófilo (HLB) e é uma valiosa ferramenta na categorização e selecção de surfactantes na preparação de formulações. Os surfactantes podem ser classificados em diferentes classes com base na natureza do grupo hidrófilo: não iónico, aniónico, catiónico e anfotérico (Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Ed.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 285).

Os emulsionantes de ocorrência natural utilizados em formulações de emulsão incluem lanolina, cera de abelhas, fosfatideos, lecitina e acácia. As bases de absorção possuem propriedades hidrófilas, de modo que possam absorver água para formar emulsões de a/o retendo, todavia, consistências de semi-sólido, tais como lanolina anidra e petrolato hidrófilo. Os sólidos finamente divididos também foram utilizados como bons 58 emulsionantes, especialmente em combinação com surfactantes e em preparações viscosas. Estes incluem sólidos inorgânicos polares, tais como hidróxidos de metais pesados, argilas não expansivas, tais como bentonita, atapulgita, hectorita, caulino, montmorilonita, silicato de alumínio coloidal e silicato de alumínio e magnésio coloidal, pigmentos e sólidos não polares, tais como carbono ou tristearato de glicerilo.

Uma grande variedade de materiais não emulsionantes também está incluída em formulações de emulsão e contribui para as propriedades das emulsões. Estes incluem gorduras, óleos, ceras, ácidos gordos, álcoois gordos, ésteres gordos, humectantes, colóides hidrófilos, conservantes e antioxidantes (Block, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Ed.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 335; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Ed.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 199).

Os colóides hidrófilos ou hidrocolóides incluem gomas de ocorrência natural e polímeros sintéticos, tais como polissacáridos (por exemplo, acácia, ágar, ácido algínico, carragenina, goma de guar, goma karaya e tragacanto), derivados de celulose (por exemplo, carboximetilcelulose e carboxipropilcelulose) e polímeros sintéticos (por exemplo, carbómeros, éteres de celulose e polímeros de carboxivinilo). Estes dispersam ou expandem em água para formar soluções coloidais que estabilizam emulsões, pela formação de filmes interfaciais fortes em redor das gotículas de fase dispersa, pelo aumento da viscosidade da fase externa. 59

Dado que as emulsões contêm, frequentemente, um número de ingredientes, tais como hidratos de carbono, proteínas, esteróis e fosfatídeos, que podem suportar facilmente o crescimento de micróbios, estas formulações incorporam frequentemente conservantes. Os conservantes geralmente utilizados incluídos em formulações de emulsão incluem metilparabeno, propilparabeno, sais de amónio quaternário, cloreto de benzalcónio, ésteres de ácido p-hidroxibenzóico e ácido bórico. Os antioxidantes também são geralmente adicionados a formulações de emulsão para prevenir a deterioração da formulação. Os antioxidantes utilizados podem ser captadores de radicais livres, tais como tocoferóis, gaiatos de alquilo, hidroxianisole butilado, hidroxitolueno butilado ou agentes de redução, tais como ácido ascórbico e metabissulfito de sódio e sinérgicos de antioxidantes, tais como ácido cítrico, ácido tartárico e lecitina. A aplicação de formulações de emulsão por meio das vias dermatológica, oral e parentérica e métodos para a sua preparação foram redados na literatura (Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Ed.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 199). As formulações de emulsão para distribuição oral têm sido muito largamente utilizadas, devido a razões de facilidade de formulação, eficácia de um ponto de vista de absorção e biodisponibilidade. (Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Ed.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 245; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Ed.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 199). Os laxantes à base de óleo mineral, vitaminas solúveis em óleo e preparações nutritivas de alto teor de gordura estão entre os materiais 60 que têm sido geralmente administrados oralmente como emulsões de o/a.

Numa forma de realização da presente invenção, as composições de oligonucleótidos e ácidos nucleicos são formuladas como microemulsões. Uma microemulsão pode ser definida como um sistema de água, óleo e anfifilo que é uma solução liquida simples opticamente isotrópica e termodinamicamente estável (Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Ed.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 245). Tipicamente, as microemulsões são sistemas que são preparados pela dispersão, em primeiro lugar, de um óleo numa solução aquosa de surfactante e, depois, adição de uma quantidade suficiente de um quarto componente, em geral um álcool de comprimento de cadeia intermédio, para formar um sistema transparente. Por conseguinte, as microemulsões também foram descritas como dispersões termodinamicamente estáveis, isotropicamente claras, de dois líquidos imiscíveis que estão estabilizados por filmes interfaciais de moléculas tensioactivas (Leung e Shah, em: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, Nova Iorque, páginas 185-215). As microemulsões são, geralmente, preparadas por meio de uma combinação de três a cinco componentes que incluem óleo, água, surfactante, co-surfactante e electrólito. Quer a microemulsão seja do tipo água-em-óleo (a/o) ou óleo-em-água (o/a), está dependente das propriedades do óleo e surfactante utilizados e da estrutura e empacotamento geométrico das cabeças polares e caudas de hidrocarboneto das moléculas de surfactante (Schott, em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 271). 61 A abordagem fenomenológica utilizando diagramas de fase foi extensamente estudada e tem produzido um conhecimento abrangente, para um especialista na técnica, de como formular microemulsões (Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Ed.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 245; Block, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Ed.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 335). Em comparação com as emulsões convencionais, as microemulsões oferecem a vantagem de solubilizarem fármacos insolúveis em água numa formulação de goticulas termodinamicamente estáveis que são formadas espontaneamente.

Os surfactantes utilizados na preparação de microemulsões incluem mas não estão limitados a surfactante iónicos, surfactantes não iónicos, Brij 96, éteres de polioxietileno oleilico, ésteres de ácidos gordos de poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (P0500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sequioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DA0750), isoladamente ou em combinação com co-surfactantes. 0 co-surfactante, habitualmente um álcool de cadeia curta, tais como etanol, 1-propanol e 1-butanol, serve para aumentar a fluidez interfacial pela penetração no filme de surfactante e, consequentemente, criando um filme desordenado, devido ao espaço vazio produzido entre as moléculas de surfactante. As microemulsões podem, contudo, ser preparadas sem a utilização de co-surfactantes e os sistemas de microemulsão auto-emulsionantes isentos de álcool são conhecidos na técnica. A fase aquosa pode ser tipicamente, mas não está limitada a água, um solução aquosa do fármaco, glicerol, PEG300, 62 PEG400, poligliceróis, propilenoglicóis e derivados de etilenoglicol. A fase oleosa pode incluir, mas não está limitada a materiais, tais como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos gordos, mono, di e triglicéridos de cadeia média (C8-C12), ésteres de ácidos gordos de glicerilo polioxietilado, álcoois gordos, glicéridos poliglicolizados, glicéridos (C8-C10) poliglicolizados saturados, óleos vegetais óleo de silicone.

As microemulsões são particularmente de interesse do ponto de vista da solubilização de fármacos e da absorção melhorada de fármacos. As microemulsões de base lipidica (o/a e a/o) foram propostas para melhorar a biodisponibilidade oral de fármacos, incluindo péptidos (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol. , 1993, 13, 205). As microemulsões proporcionam vantagens de solubilização de fármaco melhorada, protecção do fármaco da hidrólise enzimática, possivel melhoramento da absorção de fármaco, devido a alterações induzidas por surfactante na fluidez e permeabilidade de membrana, facilidade de preparação, facilidade de administração oral em relação a formas de dosagem sólida, potência clinica melhorada e toxicidade diminuída (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sei., 1996, 85, 138-143). Frequentemente, as microemulsões podem formar-se espontaneamente quando os seus componentes são colocados em conjunto à temperatura ambiente. Isto pode ser particularmente vantajoso quando se formulam fármacos termolábeis, péptidos ou oligonucleótidos. As microemulsões também foram eficazes na distribuição transdérmica de componentes activos em aplicações cosméticas e farmacêuticas. É esperado que as composições e formulações de microemulsão da presente invenção facilitem a 63 absorção sistémica aumentada de oligonucleótidos e ácidos nucleicos do aparelho gastrointestinal, assim como melhorem a absorção celular local de oligonucleótidos e ácidos nucleicos no aparelho gastrointestinal, vagina, cavidade bucal e outras áreas de administração.

As microemulsões da presente invenção também podem conter componentes e aditivos adicionais, tais como monoestearato de sorbitano (Grill 3), Labrasol e intensificadores de penetração, para melhorar as propriedades da formulação e para melhorar a absorção dos oligonucleótidos e ácidos nucleicos da presente invenção. Os intensificadores de penetração utilizados nas microemulsões da presente invenção podem ser classificados como pertencendo a uma de cinco categorias amplas - surfactantes, ácidos gordos, sais biliares, agentes quelantes e não surfactantes não quelantes (Lee et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92) . Cada destas classes foi discutida acima.

Lipossomas Há muitas estruturas de surfactante organizadas, além das microemulsões, que foram estudadas e utilizadas para a formulação de fármacos. Estas incluem monocamadas, micelas, bicamadas e vesículas. As vesículas, tal como lipossomas, atraíram grande interesse devido à sua especificidade e à duração da acção que oferecem do ponto de vista da distribuição de fármacos. Como utilizado na presente invenção, o termo "lipossoma" significa uma vesícula composta por lípidos anfifílicos, dispostos numa bicamada ou bicamadas esféricas. 64

Os lipossomas são vesículas unilamelares ou multilamelares que têm uma membrana formada a partir de um material lipofílico e um interior aquoso. A porção aquosa contém a composição a ser distribuída. Os lipossomas catiónicos possuem a vantagem de serem capazes de se fundir à parede celular. Os lipossomas não catiónicos, embora incapazes de se fundirem tão eficientemente com a parede celular, são absorvidos por macrófagos in vivo.

De modo a cruzarem pele intacta de mamífero, as vesículas lipídicas devem passar através de uma série de poros finos, cada com um diâmetro inferior a 50 nm, sob a influência de um gradiente transdérmico adequado. Por conseguinte, é desejável utilizar um lipossoma que seja altamente deformável e capaz de passar através desses poros finos.

As vantagens adicionais dos lipossomas incluem: os lipossomas obtidos de fosfolípidos naturais são biocompatíveis e biodegradáveis; os lipossomas podem incorporar uma ampla gama de fármacos solúveis em água e lípido; os lipossomas podem proteger fármacos encapsulados nos seus compartimentos internos do metabolismo e degradação (Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Ed.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 245). São considerações importantes na preparação de formulações lipossomais a carga de superfície lipídica, tamanho de vesícula e o volume aquoso dos lipossomas.

Os lipossomas são úteis para a transferência e distribuição de ingredientes activos no local de acção. Devido à membrana lipossomal ser estruturalmente semelhante às membranas biológicas, quando os lipossomas são aplicados a um tecido, os lipossomas começam a fundir-se com as membranas celulares. À 65 medida que a fusão do lipossoma e célula avança, os conteúdos lipossomais são esvaziados na célula onde o agente activo pode actuar.

As formulações lipossomais foram o foco de extensa investigação como modo de distribuição para muitos fármacos. Há uma evidência crescente de que, para administração tópica, os lipossomas apresentam várias vantagens em relação a outras formulações. Essas vantagens incluem reduzidos efeitos secundários relacionados com elevada absorção sistémica do fármaco administrado, acumulação aumentada do fármaco administrado no alvo desejado e a capacidade de administrar uma ampla variedade de fármacos, hidrófilos e hidrófobos, na pele. Várias referências detalharam a capacidade de os lipossomas distribuírem agentes, incluindo ADN de elevado peso molecular, na pele. Os compostos incluindo analgésicos, anticorpos, hormonas e ADN de elevado peso molecular, foram administrados na pele. A maioria das aplicações resultou no direccionamento da epiderme superior.

Os lipossomas dividem-se em duas classes amplas. Os lipossomas catiónicos são lipossomas carregados positivamente que interagem com as moléculas de ADN carregadas negativamente para formar um complexo estável. 0 complexo de ADN/lipossoma carregado positivamente liga-se à superfície celular carregada negativamente e é internalizado num endossoma. Devido ao pH acídico no endossoma, os lipossomas são rebentados, libertando os seus conteúdos no citoplasma celular (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985). 66

Os lipossomas que são sensíveis a pH ou carregados negativamente, aprisionam ADN, em vez de se complexarem com ele. Dado que o ADN e o lípido estão carregados de modo semelhante, a repulsão, em vez da formação de complexo, ocorre. Não obstante, algum ADN é aprisionado no interior aquoso destes lipossomas. Os lipossomas sensíveis a pH foram utilizados para distribuírem ADN codificando o gene da timidina cinase nas monocamadas celulares em cultura. A expressão do gene exógeno foi detectada nas células alvo (Zhou et ai., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274) .

Um tipo principal de composição lipossomal inclui fosfolípidos diferentes de fosfatidilcolina derivada naturalmente. As composições lipossomais neutras, por exemplo, podem ser formadas a partir de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) oi dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC). As composições lipossomais aniónicas são, em geral, formadas a partir de dimiristoilfosfatidilglicerol, enquanto os lipossomas fusogénicos aniónicos são formados, principalmente, a partir de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). Outro tipo de composição lipossomal é formado a partir de fosfatidilcolina (PC) tais como, por exemplo, PC de soja e PC de ovo. Outro tipo é formado a partir de misturas de fosfolípido e/ou fosfatidilcolina e/ou colesterol. Vários estudos avaliaram a distribuição tópica de formulações lipossomais de fármaco na pele. A aplicação de lipossomas contendo interferão a pele de cobaio resultou numa redução de feridas de herpes de pele, enquanto a distribuição de interferão via outros meios (e. g., como uma solução ou como uma emulsão) foi ineficaz (Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). Além disso, um estudo adicional testou a 67 eficácia de interferão administrado como parte de uma formulação lipossomal com administração de interferão utilizando um sistema aquoso e concluiu que a formulação lipossomal foi superior à administração aquosa (du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).

Os sistemas lipossomais não iónicos também foram examinados para determinar a sua utilidade na distribuição de fármacos na pele, em particular sistemas compreendendo surfactantes não iónicos e colesterol. As formulações lipossomais não iónicas compreendendo Novasome™ I (éter de dilaurato de glicerilo/colesterol/polioxietileno-10-estearilo) e Novasome™ II (éter de diestearato de glicerilo/colesterol/polioxietileno-10-estearilo) foram utilizadas para distribuir ciclosporina A na derme de pele de murganho. Os resultados indicaram que esses sistemas lipossomais não iónicos eram eficazes em facilitar a deposição de ciclosporina A em diferentes camadas da pele (Hu et al. S. T.P.Pharma. Sei., 1994, 4, 6, 466).

Os lipossomas também incluem lipossomas "estereoquimicamente estabilizados", uma expressão que, como aqui utilizada, se refere a lipossomas compreendendo um ou mais lipidos especializados que, quando incorporados em lipossomas, resultam em tempos de vida de circulação melhorados, em relação a lipossomas desprovidos desses lipidos especializados. Os exemplos de lipossomas estereoquimicamente estabilizados são aqueles nos quais parte da porção de lipido formando vesicula do lipossoma (A) compreende um ou mais glicolípidos, tal como monosialogangliósido GMi ou (B) é derivatizado com um ou mais polímeros hidrófilos, tal como uma fraeção de polietilenoglicol (PEG). Embora não se deseje ficar ligado a qualquer teoria particular, considera-se na técnica que, pelo menos, para 68 lipossomas estereoquimicamente estabilizados contendo gangliósidos, esfingomielina ou lípidos derivatizados com PEG, a meia-vida de circulação melhorada destes lipossomas estereoquimicamente estabilizados deriva de uma absorção reduzida nas células do sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Câncer Research, 1993, 53, 3765).

Diversos lipossomas compreendendo um ou mais glicolípidos são conhecidos na técnica. Papahadjopoulos et ai. (Ann. N.I. Acad. Sei., 1987, 507, 64) referiram a capacidade de os monosialogangliósido GMi, sulfato de galactocerebrósido e fosfatidilinositol melhorarem as meias-vidas sanguíneas dos lipossomas. Estas verificações foram apresentadas por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1988, 85, 6949). A Patente U.S. N° 4837028 e documento WO 88/04924, ambos de Allen et al., divulgam lipossomas compreendendo (1) esfingomielina e (2) o gangliósido GMi ou um éster de sulfato de galactocerebrósido. A Patente U.S. N° 5543152 (Webb et al.) divulga lipossomas compreendendo esfingomielina. Os lipossomas compreendendo 1,2-sn-dimiristoilfosfatidileolina são divulgados no documento WO 97/13499 (Lim et al.).

Muitos lipossomas compreendendo lípidos derivatizados com um ou mais polímeros hidrófilos e métodos da sua preparação, são conhecidos na técnica. Sunamoto et al. (Buli. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) descreveram lipossomas compreendendo um detergente não iónico, 2Ci2l5G, que contém uma fraeção de PEG. Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) notaram que o revestimento hidrófilo de partículas de poliestireno com glicóis poliméricos resulta em meias-vidas sanguíneas significativamente melhoradas. Os fosfolípidos sintéticos modificados pela 69 conjugação de grupos carboxílicos de polialquilenoglicóis (e. g., PEG) são descritos por Sears (Patentes U.S. N° 4426330 e 4534899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) descreveram experiências demonstrando que lipossomas compreendendo fosfatidiletanolamina (PE) derivatizada com PEG ou estearato de PEG têm aumentos significativos nas meias-vidas em circulação no sangue. Blume et ai. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) alargaram essas observações a outros fosfolipidos derivatizados com PEG, e. g. , DSPE-PEG, formados a partir da combinação de distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) e PEG. Os lipossomas tendo fracções de PEG ligadas covalentemente na sua superfície externa são descritos na Patente Europeia N° EP 0445131B1 e documento WO 90/04384 de Fisher. As composições lipossomais contendo 1-20 por cento, em mole, de PE derivatizado com PEG e os seus métodos de utilização, são descritos por Woodle et al. (Patentes U.S. N° 5013556 e 5356633) e Martin et al. (Patente U.S. N° 5213804 e Patente Europeia N° EP0496813B1). Os lipossomas compreendendo um número de outros conjugados de lípido-polímero são divulgados no documento WO 91/05545 e Patente U.S. N° 5225212 (ambas de Martin et al.) e no documento WO 94/20073 (Zalipsky et al.). Os lipossomas compreendendo lípidos de ceramida modificados com PEG são descritos no documento WO 96/10391 (Choi et al.). As Patentes U.S. N° 5540935 (Miyazaki et al.) e 5556948 (Tagawa et al.) descrevem lipossomas contendo PEG que podem ser ainda derivatizados com fracções funcionais nas suas superfícies.

Um número limitado de lipossomas compreendendo ácidos nucleicos é conhecido na técnica. O documento WO 96/40062 de Thierry et al., divulga métodos para encapsulação de ácidos nucleicos de elevado peso molecular em lipossomas. A Patente U.S. N° 5264221 de Tagawa et al., divulga lipossomas ligados a 70 proteína e afirma que o conteúdo desses lipossomas pode incluir um ARN anti-sentido. A Patente U.S. N° 5665710 de Rahman et al., descreve determinados métodos de encapsulação de oligodesoxinucleótidos em lipossomas. 0 documento WO 97/04787 de Love et al., divulga lipossomas compreendendo oligonucleótidos anti-sentido direccionados para o gene raf.

Os transfersomas são ainda outro tipo de lipossomas e são agregados lipídicos altamente deformáveis que são candidatos atractivos para transportadores de distribuição de fármacos. Os transfersomas podem ser descritos como gotículas lipídicas que são tão altamente deformáveis que são facilmente capazes de penetrar através de poros que são mais pequenos do que a gotícula. Os transfersomas são adaptáveis ao ambiente no qual são utilizados, e. g., são auto-optimizáveis (adaptáveis à forma dos poros na pele), auto-reparáveis, frequentemente atingem os seus alvos sem fragmentação e, frequentemente, de auto-carregamento. Para preparar transfersomas, é possível adicionar activadores de bordo de superfície, habitualmente surfactantes, a uma composição lipossomal padrão. Os transfersomas têm sido utilizados para distribuir albumina sérica na pele. Demonstrou-se que a distribuição mediada por transfersoma de albumina sérica é tão eficaz como a injecção subcutânea de uma solução contendo albumina sérica.

Os surfactantes encontram ampla aplicação em formulações, tais como emulsões (incluindo microemulsões) e lipossomas. O modo mais comum de classificação e ordenação das propriedades dos muitos tipos diferentes de surfactantes, naturais e sintéticos, é pela utilização do equilíbrio hidrófilo/lipófilo (HLB) . A natureza do grupo hidrófilo (também conhecido como a "cabeça") proporciona o meio mais útil para a categorização dos 71 diferentes surfactantes utilizados em formulações (Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N. I., 1988, p. 285) .

Se a molécula de surfactante não for ionizada, é classificada como um surfactante não iónico. Os surfactantes não iónicos encontram ampla aplicação em produtos farmacêuticos e cosméticos e são utilizáveis ao longo de uma ampla gama de valores de pH. Em geral, os seus valores de HLB variam desde 2 a cerca de 18, dependendo da sua estrutura. Os surfactantes não iónicos incluem ésteres não iónicos, tais como ésteres de etilenoglicol, ésteres de propilenoglicol, ésteres de glicerilo, ésteres de poliglicerilo, ésteres de sorbitano, ésteres de sacarose e ésteres etoxilados. As alcanolamidas e éteres não iónicos, tais como etoxilados de álcool gordo, álcoois propoxilados e polímeros de bloco etoxilados/propoxilados, também estão incluídos nesta classe. Os surfactantes de polioxietileno são os membros mais populares da classe de surfactantes não iónicos.

Se a molécula de surfactante transportar uma carga negativa quando é dissolvida ou dispersa em água, o surfactante é classificado como aniónico. Os surfactantes aniónicos incluem carboxilatos, tais como sabões, lactilatos de acilo, amidas de acilo de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico, tais como sulfatos de alquilo e sulfatos de alquilo etoxilados, sulfonatos, tais como sulfonatos de alquilbenzeno, isotionatos de acilo, tauratos de acilo e sulfossuccinatos e fosfatos. Os membros mais importantes da classe de surfactantes aniónicos são os sulfatos de alquilo e os sabões. 72

Se a molécula de surfactante transportar uma carga positiva quando é dissolvida ou dispersa em água, o surfactante é classificado como catiónico. Os surfactantes catiónicos incluem sais de amónio quaternário e aminas etoxiladas. Os sais de amónio quaternário são os membros mais utilizados desta classe.

Se a molécula de surfactante tiver a capacidade de transportar uma carga positiva ou negativa, o surfactante é classificado como anfotérico. Os surfactantes anfotéricos incluem derivados de ácido acrílico, alquilamidas substituídas, N-alquilbetaínas e fosfatídeos. A utilização de surfactantes em produtos de fármacos, formulações e em emulsões foi revista (Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., 1988, p. 285).

Intensificadores de Penetração

Numa forma de realização, a presente invenção emprega diversos intensificadores de penetração para efectuar a distribuição eficiente de ácidos nucleicos, particularmente oligonucleótidos, na pele de animais. A maioria dos fármacos está presente em solução nas formas ionizadas e não ionizadas. Contudo, habitualmente apenas os fármacos solúveis em lípido ou lipofílicos atravessam facilmente as membranas celulares. Foi descoberto que até os fármacos não lipofílicos podem atravessar as membranas celulares, se a membrana a ser atravessada for tratada com um intensificador de penetração. Além de auxiliarem a difusão de fármacos não lipofílicos através das membranas 73 celulares, os intensificadores de penetração também melhoram a permeabilidade de fármacos lipofílicos.

Os intensificadores de penetração podem ser classificados como pertencendo a uma de cinco categorias amplas, i. e., surfactantes, ácidos gordos, sais biliares, agentes quelantes e não surfactantes não quelantes (Lee et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada das classes acima mencionadas de intensificadores de penetração é descrita abaixo em maior detalhe.

Surfactantes: Em relação à presente invenção, os surfactantes (ou "agentes tensioactivos") são entidades químicas que, quando dissolvidas numa solução aquosa, reduzem a tensão de superfície da solução ou a tensão interfacial entre a solução aquosa e outro líquido, com o resultado de que a absorção de oligonucleótidos através da mucosa é melhorada. Além de sais biliares e ácidos gordos, estes intensificadores de penetração incluem, por exemplo, laurilssulfato de sódio, éter de polioxietileno-9-laurilo e éter de polioxietileno-20-cetilo (Lee et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92); e emulsões perfluoroquímicas, tal como FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252). Ácidos gordos: Diversos ácidos gordos e seus derivados que actuam como intensificadores de penetração incluem, por exemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanóico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, glicerol 1-monocaprato, 1-dodecilazaciclo-heptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, seus ésteres de alquilo (Ci-io) 74 (e. g., metilo, isopropilo e t-butilo) e seus mono- e di-glicéridos (i. e., oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92; Muranishi, Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; EI Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654) .

Sais biliares: 0 papel fisiológico da bílis inclui a facilitação da dispersão e absorção de lípidos e vitaminas solúveis em gorduras (Brunton, Capítulo 38 em: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a Ed., Hardman et al. Ed., McGraw-Hill, Nova Iorque, 1996, p. 934-935). Diversos sais biliares naturais e os seus derivados sintéticos, actuam como intensificadores de penetração. Deste modo, a expressão "sais biliares" inclui qualquer dos componentes de ocorrência natural da bílis, assim como qualquer dos seus derivados sintéticos. Os sais biliares da invenção incluem, por exemplo, ácido célico (ou seu sal de sódio farmaceuticamente aceitável, colato de sódio), ácido desidrocólico (desidrocolato de sódio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sódio), ácido glucólico (glucolato de sódio), ácido glicólico (glicocolato de sódio), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sódio), ácido taurocólico (taurocolato de sódio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sódio) , ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato de sódio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-di-hidrofusidato de sódio (STDHF), glicodi-hidrofusidato de sódio e éter de polioxietileno-9-laurilo (POE) (Lee et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swinyard, Capítulo 39 Em: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, páginas 75 782-783; Muranishi, Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sei., 1990, 79, 579- 583) .

Agentes Quelantes: Os agentes quelantes, como utilizados em relação à presente invenção, podem ser definidos como compostos que removem iões metálicos de solução, pela formação de complexos com esta, com o resultado de que a absorção de oligonucleótidos através da mucosa é melhorada. Com respeito à sua utilização como intensificadores de penetração na presente invenção, os agentes quelantes têm a vantagem adicional de servirem também como inibidores de DNase, dado que a maioria das ADN nucleases caracterizadas requer um ião metálico divalente para catálise e são, deste modo, inibidas por agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Os agentes quelantes da invenção incluem mas não estão limitados a etilenodiaminotetraacetato dissódico (EDTA), ácido citrico, salicilatos (e. g., salicilato de sódio, 5-metoxisalicilato e homovanilato) , derivados N-acilo de colagénio, laureth-9 e derivados N- amino acilo de beta-dicetonas (enaminas) (Lee et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rei., 1990, 14, 43-51). Não surfactantes não quelantes: Como aqui utilizado, os compostos intensificadores de penetração não surfactantes não quelantes podem ser definidos como compostos que demonstram actividade insignificante como agentes quelantes ou como surfactantes mas que, não obstante, melhoram a absorção de oligonucleótidos através da mucosa alimentar (Muranishi, 76

Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta classe de intensificadores de penetração inclui, por exemplo, ureias cíclicas insaturadas, 1-alquil- e derivados de 1-alcenilazaciclo-alcanona (Lee et ai., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); e agentes anti-inflamatórios não-esteróides, tais como diclofenac sódico, indometacina e fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).

Os agentes que melhoram a absorção de oligonucleótidos ao nível celular também podem ser adicionados às composições farmacêuticas e outras da presente invenção. Por exemplo, lípidos catiónicos, tais como lipofectina (Junichi et al., Patente U.S. N° 5705188), derivados catiónicos de glicerol e moléculas policatiónicas, tal como polilisina (Lollo et al., Pedido PCT WO 97/30731), também são conhecidos por melhorarem a absorção celular de oligonucleótidos.

Podem ser utilizados outros agentes para melhorar a penetração dos ácidos nucleicos administrados, incluindo glicóis, tais como etilenoglicol e propilenoglicol, pirróis, tais como 2-pirrol, azonas e terpenos, tais como limoneno e mentona.

Veículos

Determinadas composições da presente invenção também incorporam compostos veículos na formulação. Como aqui utilizado, "composto veículo" ou "veículo" pode referir-se a um ácido nucleico, ou seu análogo, o qual é inerte (i. e., não possui actividade biológica per se) mas é reconhecido como um 77 ácido nucleico por processos in vivo que reduzem a biodisponibilidade de um ácido nucleico tendo actividade biológica, por exemplo, pela degradação do ácido nucleico biologicamente activo ou promoção da sua remoção da circulação. A co-administração de um ácido nucleico e um composto veiculo, tipicamente com um excesso da última substância, pode resultar numa redução substancial da quantidade de ácido nucleico recuperado no fígado, rim ou outros reservatórios extracirculatórios, presumivelmente devido a competição entre o composto veículo e o ácido nucleico por um receptor comum. Por exemplo, a recuperação de um oligonucleótido parcialmente fosforotioato em tecido hepático pode ser reduzida quando é co-administrado com ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico ou ácido 4-acetamido-4'isotiociano-estilbeno-2,2'-dissulfónico (Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5; 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).

Excipientes

Em contraste com um composto veículo, um "veículo farmacêutico" ou "excipiente" é um solvente farmaceuticamente aceitável, agente de suspensão ou qualquer outro veículo farmacologicamente inerte para distribuição de um ou mais oligonucleótidos a um animal. 0 excipiente pode ser líquido ou sólido e é seleccionado, com o modo de administração planeado em mente, de modo a proporcionar o volume, consistência, etc., desejados, quando combinado com um ácido nucleico e os outros componentes de uma dada composição farmacêutica. Os veículos farmacêuticos típicos incluem mas não estão limitados a agentes de ligação (e. g., amido de milho pré-gelatinizado, 78 polivinilpirrolidona ou hidroxipropilmetilcelulose, etc.); espessantes (e. g., lactose e outros açúcares, celulose microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de cálcio, etilcelulose, poliacrilatos ou hidrogenofosfato de cálcio, etc.); lubrificantes (e. g., estearato de magnésio, talco, sílica, dióxido de silício coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, óleos vegetais hidrogenados, amido de milho, polietilenoglicóis, benzoato de sódio, acetato de sódio, etc.); desagregantes (e. g., amido, glicolato sódico de amido, etc.); e agentes molhantes (e. g., laurilsulfato de sódio, etc.).

Excipiente farmaceuticamente aceitável, orgânico ou inorgânico, adeguado para administração não parentérica gue não reage de modo deletério com ácidos nucleicos também pode ser utilizado para formular as composições da presente invenção. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis adeguados incluem mas não estão limitados a água, soluções salinas, álcoois, polietilenoglicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silicico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e semelhantes.

As formulações para administração tópica de ácidos nucleicos podem incluir soluções aguosas, estéreis e não estéreis, soluções não aquosas em solventes comuns, tal como álcoois, ou soluções dos ácidos nucleicos em bases oleosas líquidas ou sólidas. As soluções também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados. Podem ser utilizados excipientes farmaceuticamente aceitáveis, orgânicos ou inorgânicos, adequados para administração não parentérica que não reajam de modo deletério com ácidos nucleicos. 79

Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem mas não estão limitados a água, soluções salinas, álcool, polietilenoglicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silicico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e semelhantes.

Distribuição Pulsátil

Os compostos da presente invenção também podem ser administrados por distribuição pulsátil. "Distribuição pulsátil" refere-se a uma formulação farmacêutica que distribui um primeiro pulso de fármaco combinado com um intensificador de penetração e um segundo pulso de intensificador de penetração para promover a absorção de fármaco que não é absorvido após libertação com o primeiro pulso de intensificador de penetração.

Uma forma de realização da presente invenção é uma formulação oral de libertação retardada para absorção de fármaco intestinal melhorada, compreendendo: (a) uma primeira população de partículas veículo compreendendo o referido fármaco e um intensificador de penetração, em que o referido fármaco e referido intensificador de penetração são libertados numa primeira localização no intestino; e (b) uma segunda população de partículas veículo compreendendo um intensificador de penetração e um revestimento ou matriz de libertação retardada, em que o intensificador de penetração é libertado numa segunda localização no intestino, a jusante da primeira 80 localização, pelo que a absorção do fármaco é melhorada quando o fármaco atinge a segunda localização.

Alternativamente, o intensificador de penetração em (a) e (b) é diferente.

Este melhoramento é obtido pela encapsulação de, pelo menos, duas populações de partículas veiculo. A primeira população de partículas veículo compreende uma substância biologicamente activa e um intensificador de penetração e a segunda (e, opcionalmente, adicional) população de partículas veículo compreende um intensificador de penetração e um revestimento ou matriz de libertação retardada.

Um "primeiro efeito de passagem" que se aplica a fármacos oralmente administrados é a degradação devido à acção de ácido gástrico e diversas enzimas digestivas. Um meio de melhoramento dos efeitos de eliminação de primeira passagem é aumentar a dose de fármaco administrado, compensando, desse modo, para a proporção do fármaco perdido para a eliminação de primeira passagem. Embora isto possa ser facilmente alcançado com administração i.v., por exemplo, proporcionando simplesmente mais do fármaco a um animal, outros factores influenciam a biodisponibilidade dos fármacos administrados via meios não parentéricos. Por exemplo, um fármaco pode ser enzimaticamente ou quimicamente degradado no canal alimentar ou corrente sanguínea e/ou pode ser impermeável ou semipermeável a diversas membranas mucosais.

Também está contemplado que estas composições farmacêuticas são capazes de melhorarem a absorção de substâncias biologicamente activas, quando administradas por meio das vias 81 rectal, vaginal, nasal ou pulmonar. Também está contemplado que a libertação da substância biologicamente activa pode ser alcançada em qualquer parte do aparelho gastrointestinal.

As composições farmacêuticas líquidas de oligonucleótido podem ser preparadas pela combinação do oligonucleótido com um veículo adequado, por exemplo água apirogénica estéril ou solução salina. Opcionalmente, podem estar incluídos outros compostos terapêuticos. A presente invenção também contempla a utilização de composições particuladas sólidas. Essas composições compreendem, de um modo preferido, partículas de oligonucleótido que sejam de tamanho respirável. Essas partículas podem ser preparadas, por exemplo, pela trituração de oligonucleótido seco ou por meios convencionais, por exemplo com um almofariz e pilão e, depois, passagem da composição de pó resultante através de uma tela de malha 400 para segregar partículas e aglomerados de grandes dimensões. Uma composição de particulado sólido constituída por um oligonucleótido activo pode conter, opcionalmente, um dispersante que serve para facilitar a formação de um aerossol, por exemplo, lactose.

De acordo com a presente invenção, as composições de oligonucleótido podem ser aerossolizadas. A aerossolização de partículas líquidas pode ser produzida por qualquer meio adequado, tal como com um nebulizador. Ver, por exemplo, a Patente U.S. N° 4501729. Os nebulizadores são dispositivos comercialmente disponíveis que transformam soluções ou suspensões numa névoa de aerossol terapêutica, por meio de aceleração de um gás comprimido, tipicamente ar ou oxigénio, através de um estreito tubo de Venturi, ou por meio de agitação 82 ultrassónica. Os nebulizadores adequados incluem os comercializados por Blairex®, sob o nome PARI LC PLUS, PARI DURA-NEB 2000, PARI-BABY Size, Compressor PARI PRONEB com LC PLUS, Sistema Compressor/Nebulizador PARI WALKHALER, Nebulizador Reutilizável PARI LC PLUS e Nebulizador PARI LC Jet+ ®.

As formulações exemplificativas para utilização em nebulizadores consistem num oligonucleótido num liquido, tais como água estéril, apirogénica, ou solução salina, em que o oligonucleótido compreende até cerca de 40%, p/p, da formulação. De um modo preferido, o oligonucleótido compreende menos de 20%, p/p. Se desejado, aditivos adicionais, tais como agentes conservantes (por exemplo, hidroxibenzoato de metilo) antioxidantes e aromatizantes podem ser adicionados à composição.

As partículas sólidas compreendendo um oligonucleótido também podem ser aerossolizadas, utilizando qualquer gerador de aerossol de medicamento particulado sólido conhecido na técnica. Esses geradores de aerossol produzem partículas respiráveis, como descrito acima e produzem, ainda, dose calibrada reproduzível por unidade de volume de aerossol. Os geradores de aerossol de particulado sólido adequados incluem insufladores e inaladores de dose calibrada. Os inaladores de dose calibrada são utilizados na técnica e são úteis na presente invenção.

De um modo preferido, os aerossóis líquidos ou sólidos são produzidos a uma taxa de cerca de 10 a 150 litros por minuto, de um modo mais preferido desde cerca de 30 a 150 litros por minuto e, de um modo muito preferido, cerca de 60 litros por minuto. 83 A biodisponibilidade melhorada de substâncias biologicamente activas também é alcançada por meio da administração oral das composições e métodos da presente invenção. 0 termo "biodisponibilidade" refere-se a uma medição de que porção de um fármaco administrado atinge o sistema circulatório, quando um modo não parentérico de administração é utilizado para introduzir o fármaco num animal.

Os intensificadores de penetração incluem mas não estão limitados a membros de classes moleculares, tais como surfactantes, ácidos gordos, sais biliares, agentes quelantes e moléculas não surfactantes não quelantes. (Lee et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Os veiculos são moléculas inertes que podem estar incluídas nas composições da presente invenção para interferirem com processos que conduzem à redução nos níveis de fármaco biodisponível.

Outros Componentes

As composições da presente invenção podem, ainda, conter outros componentes adjuntos convencionalmente verificados em composições farmacêuticas, nos seus níveis de utilização estabelecidos na técnica. Deste modo, por exemplo, as composições podem conter materiais farmaceuticamente activos compatíveis adicionais, tais como, por exemplo, antipruriginosos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes anti-inflamatórios, ou podem conter materiais adicionais úteis na formulação física de diversas formas de dosagem das composições da presente invenção, tais como corantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes de espessamento e estabilizantes. Contudo, esses 84 materiais, quando adicionados, não devem interferir indevidamente com as actividades biológicas dos componentes das composições da presente invenção. As formulações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, e. g., lubrificantes, conservantes, estabilizantes, agentes molhantes, emulsionantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, corantes, aromatizantes e/ou substâncias aromáticas e semelhantes, que não interagem de modo deletério com o(s) ácido(s) nucleico(s) da formulação.

As suspensões aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão também pode conter estabilizantes.

Determinadas formas de realização da invenção proporcionam composições farmacêuticas contendo (a) um ou mais compostos anti-sentido e (b) um ou vários outros agentes quimioterapêuticos que funcionam por um mecanismo não anti-sentido. Os exemplos desses agentes quimioterapêuticos incluem mas não estão limitados a daunorrubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarubicina, esorrubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina arabinósida, bis-cloroetilnitrosureia, bussulfano, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclo-hexilnitrosureia, iperites de azoto, melfalano, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiureia, desoxicoformicina, 4- hidroxiperoxiciclofosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5- fluorodesoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colquicina, 85 taxol, vincristina, vinblastina, etoposido (VP-16), trimetrexato, irinotecano, topotecano, gemcitabina, teniposido, cisplatina e dietilestilbestrol (DES). Ver, de uma maneira geral, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15a Ed. 1987, p. 1206-1228, Berkow et al., ed., Rahway, N.J. Quando utilizados com os compostos da invenção, esses agentes quimioterapêuticos podem ser utilizados individualmente (e. g., 5-FU e oligonucleótido), sequencialmente (e. g., 5-FU e oligonucleótido durante um período de tempo, seguido de MTX e oligonucleótido) ou em combinação com um ou vários outros desses agentes quimioterapêuticos (e. g., 5-FU, MTX e oligonucleótido ou 5-FU, radioterapia e oligonucleótido). Os fármacos anti-inflamatórios, incluindo mas não limitados a fármacos anti-inflamatórios não esteróides e corticosteróides e fármacos antivíricos, incluindo mas não limitados a ribivirina, vidarabina, aciclovir e ganciclovir, também podem ser combinados em composições da invenção. Ver, de uma maneira geral, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15a Ed., Berkow et al., ed., 1987, Rahway, N.J., páginas 2499-2506 e 46-49, respectivamente). Outros agentes quimioterapêuticos não anti-sentido também estão no âmbito desta invenção. Dois ou mais compostos combinados podem ser utilizados em conjunto ou sequencialmente.

Noutra forma de realização relacionada, as composições da invenção podem conter um ou mais compostos anti-sentido, particularmente oligonucleótidos, direccionados para um primeiro ácido nucleico e um ou mais compostos anti-sentido adicionais direccionados para um segundo alvo de ácido nucleico. Numerosos exemplos de compostos anti-sentido são conhecidos na técnica. Dois ou mais compostos combinados podem ser utilizados em conjunto ou sequencialmente. 86

Pensa-se que a formulação de composições terapêuticas e a sua subsequente administração está dentro da especialidade na técnica. A dosagem está dependente da gravidade e responsividade do estado de doença a ser tratado, com o curso de tratamento durando de vários dias a vários meses, ou até que uma cura seja efectuada ou uma diminuição do estado de doença seja alcançada. Os programas de dosagem óptima podem ser calculados a partir de medições de acumulação de fármaco no corpo do doente. As pessoas com conhecimentos gerais podem facilmente determinar dosagens óptimas, metodologias de dosagem e taxas de repetição. As dosagens óptimas podem variar, dependendo da potência relativa de oligonucleótidos individuais e podem ser, em geral, estimadas com base nas EC5o verificadas como sendo eficazes em modelos animais in vitro e in vivo. Em geral, a dosagem é desde 0,01 pg a 100 g por kg de peso corporal e pode ser administrada uma ou mais vezes diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente, ou até uma vez a cada 2 a 20 anos. Alguém com conhecimentos gerais na técnica pode facilmente estimar taxas de repetição para doseamento, baseadas nos tempos de residência e concentrações medidos do fármaco em fluidos ou tecidos corporais. Após tratamento bem sucedido, pode ser desejável que o doente seja submetido a terapia de manutenção para prevenir a recorrência do estado de doença, em que o oligonucleótido é administrado em doses de manutenção, variando entre 0,01 pg e 100 g, por kg de peso corporal, uma ou mais vezes diariamente, até uma vez de 20 em 20 anos.

Terapia de Combinação A invenção também proporciona métodos de terapia de combinação, em que um ou mais compostos da invenção e um ou 87 vários outros compostos terapêuticos/profilácticos são administrados para tratar um estado e/ou estado de doença, como aqui descrito. Em diversos aspectos, o(s) composto(s) da invenção e o(s) composto(s) terapêutico(s)/profiláctico(s) são co-administrados como uma mistura ou administrados individualmente. Num aspecto, a via de administração é a mesma para o(s) composto(s) da invenção e o(s) composto(s) terapêutico(s)/profiláctico (s), enquanto, noutros aspectos, o(s) composto(s) da invenção e o(s) composto(s) terapêutico(s)/profiláctico(s) são administrados por vias diferentes. Numa forma de realização, as dosagens do(s) composto(s) da invenção e o(s) composto(s) terapêutico(s)/profiláctico(s) são quantidades que são terapeuticamente ou profilacticamente eficazes para cada composto, quando administrado individualmente. Alternativamente, a administração combinada permite a utilização de dosagens inferiores às que seriam requeridas para alcançar um efeito terapêutico ou profiláctico, se administradas individualmente e esses métodos são úteis na diminuição de um ou mais efeitos secundários do composto de dose reduzida.

Num aspecto, um composto da presente invenção e um ou vários outros composto(s) terapêuticos/profilácticos eficazes no tratamento de um estado são administrados, em que ambos os compostos actuam através do mesmo ou diferentes mecanismos. 0(s) composto(s) terapêutico(s)/profiláctico (s) inclui (incluem) mas não está (estão) limitado(s) a resinas de sequestração de sais biliares (e. g., colestiramina, colestipol e cloridrato de colesevelam), inibidores de redectase de HMGCoA (e. g., lovastatina, cerivastatina, prevastatina, atorvastatina, sinvastatina e fluvastatina), ácido nicotinico, derivados de ácido fíbrico (e. g., clofibrato, gemfibrozil, fenofibrato, 88 bezafibrato e ciprofibrato), probucol, neomicina, dextrotiroxina, ésteres de estanol vegetal, inibidores de absorção de colesterol (e. g., ezetimiba), implitapida, inibidores de transportadores de ácido biliar (transportadores de ácido biliar dependentes de sódio apical), reguladores de CYP7a hepático, terapêutica de substituição de estrogénio (e. g., tamoxigen) e anti-inflamatórios (e. g., glucocorticóides).

Consequentemente, a invenção proporciona ainda a utilização de um composto da invenção e um ou vários outros compostos terapêuticos/profilácticos, como aqui descrito, na preparação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou estado, como aqui descrito.

Distribuição Direccionada

Noutro aspecto, são proporcionados métodos para direccionar um composto da invenção para um tecido, órgão ou localização específicos no corpo. Os alvos exemplificativos incluem fígado, pulmão, rim, coração e placas ateroscleróticas num vaso sanguíneo. Os métodos de direccionamento de compostos são bem conhecidos na técnica.

Numa forma de realização, o composto é direccionado por administração directa ou local. Por exemplo, quando se visa um vaso sanguíneo, o composto é administrado directamente na porção relevante do vaso desde o interior do lúmen do vaso, e. g., cateter de balão único ou balão duplo, ou através da adventícia com material auxiliando a libertação lenta do composto, e. g., um sistema de gel plurónico, como descrito por Simons et al., 89

Nature 359: 67-70 (1992) . Outras técnicas de libertação lenta para distribuição local do composto num vaso incluem o revestimento de um stent com o composto. Os métodos de distribuição de compostos anti-sentido num vaso sanguíneo são divulgados na Patente U.S. N° 6159946.

Quando se visa um tecido ou órgão particulares, o composto pode ser administrado no tecido ou órgão ou na sua vizinhança. Por exemplo, a Patente U.S. N° 6547787, divulga métodos e dispositivos para o direccionamento de agentes terapêuticos para o coração. Num aspecto, a administração ocorre por injecção directa ou por injecção num vaso sanguíneo associado ao tecido ou órgão. Por exemplo, quando se visa o fígado, o composto pode ser administrado por injecção ou infusão através da veia porta.

Noutro aspecto, são proporcionados métodos de direccionamento de um composto que incluem a associação do composto com um agente que dirige a absorção do composto por um ou mais tipos de células. Os agentes exemplificativos incluem lípidos e estruturas baseadas em lípido, tal como lipossomas, em geral em combinação com uma fracção de direccionamento específica de órgão ou tecido, tais como, por exemplo, um anticorpo, um receptor de superfície celular, um ligando para um receptor de superfície celular, um polissacárido, um fármaco, uma hormona, um hapteno, um lípido especial e um ácido nucleico, como descrito na Patente U.S. N° 6495532. A Pat. U.S. N° 5399331 descreve a ligação de proteínas a lipossomas, através da utilização de um agente de reticulação tendo, pelo menos, um grupo maleimido e uma função reactiva de amina; As Pat. U.S. N° 4885172, 5059421 e 5171578 descrevem a ligação de proteínas a lipossomas, através da utilização da glicoproteína estreptavidina e lipossomas de direccionamento de revestimento 90 com polissacáridos. Outros agentes de direccionamento baseados em lípido incluem, por exemplo, produtos micelares e cristalinos, como descrito na Patente U.S. N° 6217886.

Noutro aspecto, os agentes de direccionamento incluem microsferas poliméricas porosas que são derivadas de poliésteres copoliméricos e homopoliméricos, contendo ligações éster hidrolizáveis que são biodegradáveis, como descrito na Patente U.S. N° 4818542. Os poliésteres típicos incluem os ácidos poliglicólico (PGA) e poliláctico (PLA) e copolímeros de glicolida e L(-lactida) (PGL), os quais são particularmente adequados para os métodos e composições da presente invenção, na medida em que exibem baixa toxicidade humana e são biodegradáveis. 0 poliéster particular ou outro polímero, oligómero ou copolímero utilizados como a matriz polimérica microsférica não são críticos e pode ser utilizada uma variedade de polímeros, dependendo da porosidade, consistência, forma e distribuição de tamanhos desejadas. Outros polímeros ou copolímeros, biodegradáveis ou bioerodíveis, incluem, por exemplo, gelatina, ágar, amido, arabinogalactano, albumina, colagénio, materiais ou polímeros naturais e sintéticos, tais como, poli(ε-caprolactona), poli(ácido ε-caprolactona-CO-láctico) , poli(ácido ε-caprolactona-CO-glicólico), poli(ácido β-hidroxibutírico), óxido de polietileno, polietileno, poli(alquil-2-cianoacrilato), (e. g., metil-, etil-, butil-), hidrogéis, tais como poli(hidroxietilmetacrilato), poliamidas (e. g., poliacrilamida), poli(aminoácidos) (i. e., L-leucina, ácido L-aspártico, β-metil-L-aspartato, β-benzil-L-aspartato, ácido glutâmico), poli(2-hidroxietil DL-aspartamida), poli(éster ureia), poli(L-fenilalanina/etilenoglicol/1,6-diisocianato-hexano) e poli(metacrilato de metilo). Os polímeros naturais e sintéticos exemplificativos adequados para distribuição 91 direccionada estão facilmente disponíveis comercialmente ou são obteníveis por reacções de polimerização de condensação dos monómeros adequados ou co-monómeros ou oligómeros.

Ainda noutra forma de realização, a Patente U.S. N° 6562864 descreve catequinas, incluindo isómeros epicatiónicos e outros isómeros carbocatiónicos e seus derivados que, como monómeros, dímeros e multímeros superiores, podem formar complexos com agentes bioactivos nucleofílicos e catiónicos e para utilização como agentes de distribuição. Os multímeros de catequinas têm uma forte afinidade para proteínas polares, tais como aquelas residindo no endotélio vascular e em membranas celulares/organelos e são particularmente úteis para a distribuição direccionada de agentes bioactivos para seleccionar sítios in vivo. No tratamento de doenças e distúrbios vasculares, tais como aterosclerose e doença arterial coronária, os agentes de distribuição incluem multímeros de catequina substituídos, incluindo multímeros de catequina amidados que são formados a partir de reacção entre catequina e fracções contendo azoto, tal como amónia.

Outras estratégias de direccionamento da invenção incluem ADEPT (terapia de profármaco dirigida a anticorpo), GDEPT (EPT dirigido a gene) e VDEPT (EPT dirigido a vírus), como descrito na Patente U.S. N° 6433012. A presente invenção proporciona, ainda, dispositivos médicos e kits para a distribuição direccionada, em que o dispositivo é, por exemplo, uma seringa, stent ou cateter. Os kits incluem um dispositivo para administrar um composto e um recipiente compreendendo um composto da invenção. Num aspecto, o composto é pré-carregado no dispositivo. Noutras formas de 92 realização, o kit proporciona instruções para métodos de administração do composto e dosagens. As Patentes U.S. descrevendo dispositivos médicos e kits para a distribuição de compostos anti-sentido incluem as Patentes U.S. N° 6368356; 6344035; 6344028; 6287285; 6200304; 5824049; 5749915; 5674242; 5670161; 5609629; 5593974; e 5470307.

Embora a presente invenção tenha sido descrita com especificidade de acordo com determinadas formas de realização, os exemplos seguintes servem apenas para ilustrar a invenção e não se destinam a limitar a mesma.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Fosforamiditos de Nucleósido para a Síntese de

Oligonucleótido Amiditos Desoxi e 2'-alcoxi

Os fosforamiditos de 2'-desoxi e 2'-metoxi beta-cianoetildiisopropilo foram adquiridos de fontes comerciais (e. g., Chemgenes, Needham MA ou Glen Research, Inc. Sterling VA). Outros amiditos de nucleósido de 2'-0-alcoxi substituídos são preparados como descrito na Patente U.S. 5506351. Para oligonucleótidos sintetizados utilizando amiditos de 2'-alcoxi, foi utilizado o ciclo padrão para oligonucleótidos não modificados, excepto o passo de espera após a distribuição pulsada de tetrazole e a base foi aumentada para 360 segundos. 93

Os oligonucleótidos contendo nucleótidos de 5-metil-2'-desoxicitidina (5-Me-C) foram sintetizados de acordo com métodos publicados [Sanghvi, et al., Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203] utilizando fosforamiditos comercialmente disponíveis (Glen Research, Sterling VA ou ChemGenes, Needham MA).

Amiditos de 2'-fluoro

Amiditos de 2'-Fluorodesoxiadenosina

Os 2'-fluorooligonucleótidos foram sintetizados como descrito anteriormente [Kawasaki, et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841] e patente dos Estados Unidos 5670633.

Resumidamente, o nucleósido protegido N6-benzoil-2'-desoxi-2'-fluoroadenosina foi sintetizado utilizando 9-beta-D-arabinofuranosiladenina comercialmente disponível como material de partida e pela modificação de processos de literatura, pelo que o átomo 2'-alfa-fluoro é introduzido por uma deslocação de SN2 de um grupo 2'-beta-tritilo. Deste modo, a N6-benzoil-9-beta-D-arabinofuranosiladenina foi selectivamente protegida em rendimento moderado como o intermediário 3',5'-ditetra-hidropiranilo (THP). A desprotecção dos grupos THP e N6-benzoílo foi conseguida utilizando metodologias padrão e foram utilizados métodos padrão para se obter os intermediários 5'-dimetoxitritil-(DMT) e 5'-DMT-3'-fosforamidito. 94 2'-Fluorodesoxiguanosina A síntese de 2'-desoxi-2'-fluoroguanosina foi conseguida utilizando 9-beta-D-arabinofuranosilguanina protegida por tetraisopropildisiloxanilo (TPDS) como material de partida e conversão do intermediário diisobutiril- arabinofuranosilguanosina. A desprotecção do grupo TPDS foi seguida de protecção do grupo hidroxilo com THP para proporcionar arabinofuranosilguanina protegida por diisobutiril di-THP. A O-desacilação selectiva e triflação foram seguidas de tratamento do produto em bruto com fluoreto, depois, desprotecção do grupo THP.

Foram utilizadas metodologias padrão para se obter os 5'-DMT- e 5'-DMT-3'-fosforamiditos. 2'-Fluorouridina A síntese de 2'-desoxi-2'-fluorouridina foi conseguida pela modificação de um processo de literatura, no qual o 2,2'-anidro-l-beta-D-arabinofuranosiluracilo foi tratado com piridina de fluoreto de hidrogénio a 70%. Foram utilizados processos padrão para se obter os 5'-DMT- e 5'-DMT-3'fosforamiditos. 2'-Fluorodesoxicitidina A 2'-desoxi-2'-fluorocitidina foi sintetizada por meio de aminação de 2'-desoxi-2'-fluorouridina, seguida de protecção selectiva para proporcionar N4-benzoil-2'-desoxi-2'- 95 fluorocitidina. Foram utilizados processos padrão para se obter os 5'-DMT- e 5 '-DMT-3'fosforamiditos.

Amiditos de 2'-O-(2-Metoxietil) modificados

Os amiditos de nucleósido substituídos por 2'-O-Metoxietilo são preparados como se segue ou, alternativamente, conforme o método de Martin, P., Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504. 2,2'-Anidro[1-(beta-D-arabinofuranosil)-5-metiluridina] 5-metiluridina (ribosiltimina, comercialmente disponível através de Yamasa, Choshi, Japão) (72,0 g, 0,279 M) , difenilcarbonato (90,0 g, 0,420 M) e bicarbonato de sódio (2,0 g, 0,024 M) foram adicionados a DMF (300 mL). A mistura foi aquecida até refluxo, com agitação, permitindo que o gás de dióxido de carbono emitido fosse libertado de um modo controlado. Após 1 hora, a solução ligeiramente escurecida foi concentrada sob pressão reduzida. O xarope resultante foi vertido em éter dietílico (2,5 L), com agitação. O produto formou uma goma. O éter foi decantado e o resíduo foi dissolvido numa quantidade mínima de metanol (ca. 400 mL) .A solução foi vertida em éter fresco (2,5 L) para produzir uma goma rígida. O éter foi decantado e a goma foi seca numa estufa a vácuo (60 °C, a 1 mm de Hg, durante 24 h), para proporcionar um sólido que foi triturado até um pó de tom claro (57 g, 85% de rendimento em bruto). O espectro de RMN foi consistente com a estrutura, contaminado com fenol como seu sal de sódio (ca. 5%). O material foi utilizado tal como estava para reacções adicionais (ou pode ser purificado posteriormente por cromatografia de coluna 96 utilizando um gradiente de metanol em acetato de etilo (10-25%) para proporcionar um sólido branco, p.f. 222-4 °C). 2'-O-Metoxietil-5-metiluridina 2,2'-Anidro-5-metiluridina (195 g, 0,81 M) , tris(2-metoxietil)borato (231 g, 0,98 M) e 2-metoxietanol (1,2 L) foram adicionados a um recipiente pressurizado de ácido inoxidável de 2 L e colocado num banho de óleo pré-aquecido, a 160 °C. Após aquecimento durante 48 horas, a 155-160 °C, o recipiente foi aberto e a solução evaporada até à secura e triturada com MeOH (200 mL) . O resíduo foi suspenso em acetona quente (1 L) . Os sais insolúveis foram filtrados, lavados com acetona (150 mL) e o filtrado evaporado. O resíduo (280 g) foi dissolvido em CH3CN (600 mL) e evaporado. Uma coluna de sílica gel (3 kg) foi compactada em CH2Cl2/acetona/MeOH (20:5:3) contendo EtsNH a 0,5%. O resíduo foi dissolvido em CH2CI2 (250 mL) e adsorvido sobre sílica (150 g), antes de carregamento na coluna. O produto foi eluído com o solvente de empacotamento para proporcionar 160 g (63%) de produto. O material adicional foi obtido pela remanipulação de fracções impuras. 2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina A 2’-O-metoxietil-5-metiluridina (160 g, 0,506 M) foi co-evaporada com piridina (250 mL) e o resíduo seco dissolvido em piridina (1,3 L). Uma primeira alíquota de cloreto de dimetoxitritilo (94,3 g, 0,278 M) foi adicionada e a mistura agitada, à temperatura ambiente, durante uma hora. Uma segunda alíquota de cloreto de dimetoxitritilo (94,3 g, 0,278 M) foi 97 adicionada e a reacção agitada durante uma hora adicional. Metanol (170 mL) foi, depois, adicionado para parar a reacção. O HPLC mostrou a presença de, aproximadamente, 70% de produto. O solvente foi evaporado e triturado com CH3CN (200 mL) . O residuo foi dissolvido em CHC13 (1,5 L) e extraído com 2x500 mL de NaHC03 saturado e 2x500 mL de NaCl saturado. A fase orgânica foi seca sobre Na3S04, filtrada e evaporada. Foram obtidos 275 g de resíduo. O resíduo foi purificado numa coluna de sílica gel de 3,5 kg, compactado e eluído com EtOAc/hexano/acetona (5:5:1) contendo Et3NH a 0,5%. As fracções puras foram evaporadas para proporcionar 164 g de produto. Foram obtidos, aproximadamente, 20 g adicionais as fracções impuras, para proporcionar um rendimento total de 183 g (57%) . 3'-O-Acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina 2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina (106 g, 0,167 M) , DMF/piridina (750 mL de um mistura 3:1 preparada a partir de 562 mL de DMF e 188 mL de piridina) e anidrido acético (24,38 mL, 0,258 M) foram combinados e agitados, à temperatura ambiente, durante 24 horas. A reacção foi monitorizada por TLC, em primeiro lugar, pela neutralização da amostra de TLC com a adição de MeOH. Após conclusão da reacção, como avaliado por TLC, MeOH (50 mL) foi adicionado e a mistura evaporada a 35 °C. O resíduo foi dissolvido em CHC13 (800 mL) e extraído com 2x200 mL de bicarbonato de sódio saturado e 2x200 mL de NaCl saturado. As camadas de água foram novamente extraídas com 200 mL de CHC13. Os orgânicos combinados foram secos com sulfato de sódio e evaporados para proporcionar 122 g de resíduo (aprox. 90% de produto). O resíduo foi purificado numa coluna de 98 sílica gel de 3,5 kg e eluído utilizando EtOAc/hexano (4:1). As fracções de produto puro foram evaporadas para produzir 96 g (84%). Foram recuperados 1,5 g adicionais das últimas fracções. 3'-O-Acetil-2'-O-metoxietil-5'-0-dimetoxitritil-5-metil-4-triazoleuridina

Foi preparada uma primeira solução pela dissolução de 3'-0-acetil-2' - O-metoxiet il-5 ' -0-dimetoxitritil-5-metiluridina (96 g, 0,144 M) em CH3CN ( 700 mL) e reservada. Trietilamina (189 mL, 1,44 M) foi adicionada a uma solução de triazole (90 g, 1,3 M) em CH3CN (1 L) , arrefecida para -5 °C e agitada, durante 0,5 h, utilizando um agitador suspenso. POCI3 foi adicionado, gota a gota, ao longo de um período de 30 minutos, à solução agitada mantida aa 0-10 °C e a mistura resultante agitada durante 2 horas adicionais. A primeira solução foi adicionada, gota a gota, ao longo de um período de 45 minutos, à última solução. A mistura reaccional resultante foi armazenada, de um dia para o outro, numa câmara frigorífica. Os sais foram filtrados da mistura reaccional e a solução foi evaporada. O resíduo foi dissolvido em EtOAc (1 L) e os sólidos insolúveis foram removidos por filtração. O filtrado foi lavado com 1x300 mL de NaHC03 e 2x300 mL de NaCl saturado, seco sobre sulfato de sódio e evaporado. O resíduo foi triturado com EtOAc para proporcionar o composto de título. 2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina

Uma solução de 3'-O-acetil-2'-O-metoxietil-5'-0- dimetoxitritil-5-metil-4-triazoleuridina (103 g, 0,141 M) em 99 dioxano (500 mL) e NH4OH (30 mL) foi agitada, à temperatura ambiente, durante 2 horas. A solução de dioxano foi evaporada e o resíduo tornado azeotrópico com MeOH (2x200 mL). O resíduo foi dissolvido em MeOH (300 mL) e transferido para um recipiente pressurizado de aço inoxidável de 2 litros. MeOH (400 mL) saturado com gás de NH3 foi adicionado e o recipiente aquecido a 100 °C, durante 2 horas (a TLC mostrou conversão completa). O conteúdo do recipiente foi evaporado até à secura e o resíduo foi dissolvido em EtOAc (500 mL) e lavado uma vez com NaCl saturado (200 mL). Os orgânicos foram secos sobre sulfato de sódio e o solvente foi evaporado para proporcionar 85 g (95%) do composto de título. N4-Benzoil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metil-citidina 2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina (85 g, 0,134 M) foi dissolvido em DMF (800 mL) e anidrido benzóico (37,2 g, 0,165 M) foi adicionado com agitação. Após agitação, durante 3 horas, a TLC mostrou que a reacção estava, aproximadamente, 95% completa. O solvente foi evaporado e o resíduo tornado azeotrópico com MeOH (200 mL) . O resíduo foi dissolvido em CHC13 (700 mL) e extraído com NaHC03 saturado (2x300 mL) e NaCl saturado (2x300 mL) , seco sobre MgS04 e evaporado para proporcionar um resíduo (96 g) . 0 resíduo foi submetido a cromatografia numa coluna de sílica de 1,5 kg, utilizando EtOAc/hexano (1:1) contendo Et3NH a 0,5% como o solvente de eluição. As fracções de produto puro foram evaporadas para proporcionar 90 g (90%) do composto de título. 100 N4-Benzoil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metil-citidina-3'-amidito N4-Benzoil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina (74 g, 0,10 M) foi dissolvido em CH2CI2 (1 L) . Diisopropilamina de tetrazole (7.1 g) e 2-cianoetoxi-tetra-(isopropil)fosfito (40,5 mL, 0,123 M) foram adicionados, com agitação, sob atmosfera de azoto. A mistura resultante foi agitada, durante 20 horas, à temperatura ambiente (a TLC mostrou que a reacção estava 95% completa). A mistura reaccional foi extraida com NaHCCd saturado (1x300 mL) e NaCl saturado (3x300 mL). As lavagens aquosas foram novamente extraídas com CH2CI2 (300 mL) e os extractos foram combinados, secos sobre MgSCd e concentrados. O resíduo obtido foi submetido a cromatografia numa coluna de sílica de 1,5 kg, utilizando EtOAc/hexano (3:1) como o solvente de eluição. As fracções puras foram combinadas para proporcionar 90,6 g (87%) do composto de título.

Amiditos de nucleósido de 2'-O-(aminooxietilo) e amiditos de nucleósido de 2'-O-(dimetilaminooxietilo)

Amiditos de nucleósido de 2'-(dimetilaminooxietoxilo)

Os amiditos de nucleósido de 2(dimetilaminooxietoxilo) [também conhecidos na técnica como amiditos de nucleósido de 2'-O-(dimetilaminooxietilo)] são preparados como descrito nos seguintes parágrafos. Os amiditos de nucleósido de adenosina, citidina e guanosina são preparados de modo semelhante a timidina (5-metiluridina), excepto que as aminas exocíclicas 101 estão protegidas com uma fracção de benzoílo, no caso de adenosina e citidina e com isobutirilo, no caso de guanosina. 5' -0-terc-butildifenilsilil-02-2' -anidro-5-metiluridina 02-2'-anidro-5-metiluridina (Pro. Bio. Sint., Varese, Itália, 100,0 g, 0,416 mmol), dimetilaminopiridina (0,66 g, 0,013 eq, 0,0054 mmol) foram dissolvidas em piridina seca (500 mL) , à temperatura ambiente, sob uma atmosfera de árgon e com agitação mecânica. terc-Butildifenilclorossilano (125,8 g, 119,0 mL, 1,1 eq, 0,458 mmol) foi adicionado numa porção. A reacção foi agitada, durante 16 h, à temperatura ambiente. A TLC (Rf 0,22, acetato de etilo) indicou uma reacção completa. A solução foi concentrada sob pressão reduzida até um óleo espesso. Este foi particionado entre diclorometano (1 L) e bicarbonato de sódio saturado (2x1 L) e solução saturada de cloreto de sódio (1 L) . A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e concentrada sob pressão reduzida até um óleo espesso. O óleo foi dissolvido numa mistura 1:1 de acetato de etilo e éter etílico (600 mL) e a solução foi arrefecida para -10 °C. O produto cristalino resultante foi recolhido por filtração, lavado com éter etílico (3x200 mL) e seco (40 °C, 1 mm de Hg, 24 h) até 149 g (74,8%) de sólido branco. A TLC e a RMN foram consistentes com produto puro. 5' -O-terc-Butildifenilsilil-2'-O-(2-hidroxietil)-5-metiluridina

Num reactor pressurizado de aço inoxidável de 2 L, não agitado, foi adicionado borano em tetra-hidrofurano (1,0 M, 102 2,0 eq., 622 mL) . Numa hote e com agitação manual, foi adicionado etilenoglicol (350 mL, excesso) cautelosamente, a principio, até que a evolução de gás de hidrogénio abrandou. 5'-0-terc-Butildifenilsilil-02-2'-anidro-5-metiluridina (149 g, 0,311 mol) e bicarbonato de sódio (0,074 g, 0,003 eq) foram adicionados com agitação manual. O reactor foi selado e aquecido num banho de óleo até que uma temperatura interna de 160 °C fosse atingida e, depois, mantido durante 16 h (pressão < 100 psig). O recipiente reaccional foi arrefecido para ambiente e aberto. A TLC (Rf de 0,67 para o produto desejado e Rf de 0,82 para produto lateral ara-T, acetato de etilo) indicou cerca de 70% de conversão para o produto. De modo a evitar formação adicional de produto lateral, a reacção foi interrompida, concentrada sob pressão reduzida (10 a 1 mm de Hg) num banho-maria quente (40-100 °C) , com as condições mais extremas utilizadas para remover o etilenoglicol. [Alternativamente, uma vez desaparecido o solvente de baixa ebulição, a solução restante pode ser particionada entre acetato de etilo e água. O produto estará na fase orgânica]. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna (2 kg de sílica gel, gradiente de acetato de etilo-hexanos de 1:1 a 4:1). As fracções apropriadas foram combinadas, lavadas e secas num produto como uma espuma encrespada branca (84 g, 50%), material de partida contaminado (17,4 g) e 20 g de material de partida reutilizável puro. O rendimento, baseado em material de partida menos puro de material de partida recuperado, foi 58%. A TLC e a RMN foram consistentes com produto 99% puro. 103 2'-Ο-([2-ftalimidoxi)etil]-5'-t-butildifenilsilil-5-metiluridina 5'-0-terc-Butildifenilsilil-2'-0-(2-hidroxietil)-5-metiluridina (20 g, 36,98 mmol) foi misturado com trifenilfosfina (11,63 g, 44,36 mmol) e N-hidroxiftalimida (7,24 g, 44,36 mmol). Foi, depois, seco sobre P2O5 sob elevado vácuo, durante dois dias, a 40 °C. A mistura reaccional foi lavada com árgon e THF seco (369,8 mL, Aldrich, frasco Sure Seal) foi adicionada para se obter uma solução clara. Foi adicionado dietil-azodicarboxilato (6,98 mL, 44,36 mmol), gota a gota, à mistura reaccional. A taxa de adição é mantida, de modo que a coloração de vermelho vivo resultante seja descartada imediatamente antes da adição da gota seguinte. Depois de a adição estar completa, a reacção foi agitada durante 4 h. Nessa altura, a TLC mostrou a conclusão da reacção (etilacetatothexano, 60:40). O solvente foi evaporado em vácuo. O resíduo obtido foi colocado numa coluna flash e eluído com acetato de etilo:hexano (60:40), para se obter 2'-O-([2-ftalimidoxi)etil]-5'-t-butildifenilsilil-5-metiluridina como uma espuma branca (21,819 g, 86%). 5'-O-terc-butildifenilsilil-2'-O-[(2-formadoximinooxi)etil]-5-metiluridina 2'-O-([2-ftalimidoxi)etil]-5'-t-butildifenilsilil-5-metiluridina (3,1 g, 4,5 mmol) foi dissolvida em CH2CI2 seco (4,5 mL) e metil-hidrazina (300 mL, 4,64 mmol) foi adicionada, gota a gota, a -10 °C a 0 °C. Após 1 h, a mistura foi filtrada, o filtrado foi lavado com CH2CI2 gelado e a fase orgânica combinada foi lavada com água, solução saturada de cloreto de 104 sódio e seca sobre Na2S04 anidro. A solução foi concentrada para se obter 2'-0-(aminooxietil) timidina que foi, depois, dissolvida em MeOH (67,5 mL). A este formaldeido (solução aquosa a 20%, p/p, 1,1 eq. ) foi adicionado e a mistura resultante foi agitada durante 1 h. O solvente foi removido sob vácuo; o resíduo submetido a cromatografia para se obter 5'-0-terc-butildifenilsilil-2'-0-[(2-formadoximinooxi)etil]-5-metiluridina como uma espuma branca (1,95 g, 78%). 5'-O-terc-Butildifenilsilil-2'-O-[N,N-dimetilaminooxietil]-5-metiluridina 5'-0-terc-butildifenilsilil-2'-0-[(2-formadoximinooxi) etil]-5-metiluridina (1,77 g, 3,12 mmol) foi dissolvida numa solução de p-toluenossulfonato de piridínio a 1 M (PPTS) em MeOH seco (30,6 mL) . Cianoboro-hidreto de sódio (0,39 g, 6,13 mmol) foi adicionado a esta solução, a 10 °C, sob atmosfera inerte. A mistura reaccional foi agitada, durante 10 minutos, a 10 °C. Após o recipiente reaccional ter sido removido do banho de gelo e agitado à temperatura ambiente, durante 2 h, a reacção foi monitorizada por TLC (MeOH a 5% em CH2C12) . Solução aquosa de NaHC03 (5%, 10 mL) foi adicionada e extraída com acetato de etilo (2x20 mL) . A fase de acetato de etilo foi seca sobre Na2S04 anidro, evaporada até à secura. O resíduo foi dissolvido numa solução de PPTS a 1 M em MeOH (30,6 mL). Foi adicionado formaldeido (20%, p/p, 30 mL, 3,37 mmol) e a mistura reaccional foi agitada, à temperatura ambiente, durante 10 minutos. A mistura reaccional arrefeceu para 10 °C num banho de gelo, foi adicionado cianoboro-hidreto de sódio (0,39 g, 6,13 mmol) e a mistura reaccional agitada, a 10 °C, durante 10 minutos. Após 10 minutos, a mistura reaccional foi removida do banho de gelo e 105 agitada, à temperatura ambiente, durante 2 h. À mistura reaccional, foi adicionada solução de NaHCCb a 5% (25 mL) e extraída com acetato de etilo (2x25 mL) . A camada de acetato de etilo foi seca sobre Na2S04 anidro e evaporada até à secura. 0 resíduo obtido foi purificado por cromatografia de coluna flash e eluído com MeOH a 5% em CH2CI2, para se obter 5'-0 -terc-butildifenilsilil-2'-0-[N,N-dimetilaminooxietil]-5-metiluridina como uma espuma branca (14,6 g, 80%). 2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina

Tri-hidrofluoreto de trietilamina (3,91 mL, 24,0 mmol) foi dissolvido em THF seco e trietilamina (1,67 mL, 12 mmol, seca, mantida sobre KOH). Esta mistura de trietilamina-2HF foi, depois, adicionada a 5'-O-terc-butildifenilsilil-2'-O-[N, N-dimetilaminooxietil]-5-metiluridina (1,40 g, 2,4 mmol) e agitada, à temperatura ambiente, durante 24 h. A reacção foi monitorizada por TLC (MeOH a 5% em CH2C12) . O solvente foi removido sob vácuo e o resíduo colocado numa coluna flash e eluído com MeOH a 10% em CH2C12, para se obter 2'-O-(dimetilaminooxietili-5-metiluridina (766 mg, 92,5%). 5'-O-DMT-2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina 2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina (750 mg, 2,17 mmol) foi seca sobre P205 sob elevado vácuo, de um dia para o outro, a 40 °C. Foi, depois, co-evaporada com piridina anidra (20 mL). O resíduo obtido foi dissolvido em piridina (11 mL) sob atmosfera de árgon. 4-Dimetilaminopiridina (26,5 mg, 2,60 mmol), cloreto de 4, 4'-dimetoxitritilo (880 mg, 2,60 mmol) foram 106 adicionados à mistura e a mistura reaccional foi agitada, à temperatura ambiente, até que a totalidade do material de partida desaparecesse. A piridina foi removida sob vácuo e o residuo submetido a cromatografia e eluido com MeOH a 10% em CH2CI2 (contendo algumas gotas de piridina), para se obter 5'-O-DMT-2'-O-(dimetilamino-oxietil)-5-metiluridina (1,13 g, 80%) . 5'-O-DNT-2'-O-(2-N,N-dimetilaminooxietil)-5-metiluridina-3'-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidito] 5'-O-DMT-2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina (1,08 g, 1.67 mmol) foi co-evaporada com tolueno (20 mL) . Ao residuo foi adicionada tetrazonida de N,N-diisopropilamina (0,29 g, 1.67 mmol) e seca sobre P2O5 sob elevado vácuo, de um dia para o outro, a 40 °C. Depois, a mistura reaccional foi dissolvida em acetonitrilo anidro (8,4 mL) e 2-cianoetil-N,N,N1, N1-tetraisopropilfosforamidito (2,12 mL, 6,08 mmol) foi adicionado. A mistura reaccional foi agitada, à temperatura ambiente, durante 4 h, sob atmosfera inerte. O progresso da reacção foi monitorizado por TLC (hexano:acetato de etilo 1:1). O solvente foi evaporado, depois, o residuo foi dissolvido em acetato de etilo (70 mL) e lavado com NaHC03 aquoso a 5% (40 mL) . A camada de acetato de etilo foi seca sobre Na2S04 anidro e concentrada. O residuo obtido foi submetido a cromatografia (acetato de etilo como eluente), para se obter 5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-dimetilaminooxietil)-5-metiluridina-3'-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidito] como uma espuma (1,04 g, 74,9%). 107

Amiditos de nucleósido de 2'-(aminooxietoxi)

Os amiditos de nucleósido de 2'-(aminooxietoxilo) [também conhecidos na técnica como amiditos de nucleósido de 2'-0-(aminooxietilo)] são preparados como descrito nos seguintes parágrafos. Os amiditos de nucleósido de adenosina, citidina e timidina são preparados de modo semelhante. N2-isobutiril-6-0-difenilcarbamoil-2'-O-(2-etilacetil)-5' -0-(4,4'-dimetoxitritil)guanosina-3'-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidito] 0 análogo de guanosina de 2'-O-aminooxietilo pode ser obtido por 2 '-0- -alquilação selectiva de ribósido de diaminopurina. Quantidades multigrama de ribósido de diaminopurina podem ser adquiridas à Schering AG (Berlin), para proporcionar ribósido de diaminopurina de 2'-0-(2-etilacetilo) , juntamente com uma quantidade menor do 3'-0-isómero. 0 ribósido de diaminopurina de 2'-0-(2-etilacetilo) pode ser resolvido e convertido em 2'-0-(2-etilacetil)guanosina, por tratamento com adenosina desaminase. (McGee, D. P. C., Cook, P. D., Guinosso, C. J., documento WO 94/02501 AI 940203). Os processos de protecção padrão devem proporcionar 2'-0-(2-etilacetil)-5'-0-(4,4'-dimetoxitritil)guanosina e 2-N-isobutiril-6-0-difenilcarbamoil-2'-0-(2-etilacetil)-5'-0-(4,4'- dimetoxitritil)guanosina que podem ser reduzidos para proporcionar 2-N-isobutiril-6-0-difenilcarbamoil-2'-0-(2-hidroxietil)-5'-0-(4,4'-dimetoxitritil)guanosina. Como antes, o grupo hidroxilo pode ser deslocado por N-hidroxiftalimida por meio de uma reacção de Mitsunobu e o nucleósido protegido pode ser fosfitilado como habitualmente, para produzir 108 2-N-isobutiril-6-0-difenilcarbamoil-2'-Ο-([2-ftalmidoxi]etil)-5'-0-(4,4'-dimetoxitritil)guanosina-3'-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidito].

Amiditos de nucleósido de 2'-dimetilaminoetoxietoxilo (2'—DMAEOE)

Os amiditos de nucleósido de 2'-dimetilaminoetoxietoxi (também conhecidos na técnica como amiditos de nucleósido de 2 O-dimetilaminoetoxietilo, i. e., 2 '-O-CH2-O-CH2-N- (CH2) 2 ou 2'—DMAEOE) são preparados como se segue. Outros amiditos de nucleósido são preparados de modo semelhante. 2'-0-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)etil]-5-metil uridina 2[2-(Dimetilamino)etoxi]etanol (Aldrich, 6,66 g, 50 mmol) é lentamente adicionado a uma solução de borano em tetra-hidrofurano (1 M, 10 mL, 10 mmol), com agitação, numa bomba de 100 mL. 0 gás de hidrogénio é emitido à medida que o sólido se dissolve. O2-, 2'-anidro-5-metiluridina (1,2 g, 5 mmol) e bicarbonato de sódio (2,5 mg) são adicionados e a bomba é selada, colocada num banho de óleo e aquecida a 155 °C, durante 26 horas. A bomba é arrefecida à temperatura ambiente e aberta. A solução em bruto é concentrada e o resíduo particionado entre água (200 mL) e hexanos (200 mL) . O fenol em excesso é extraído na camada de hexano. A camada aquosa é extraída com acetato de etilo (3x200 mL) e as camadas orgânicas combinadas são lavadas, uma vez, com água, secas sobre sulfato de sódio anidro e concentradas. O resíduo é submetido a coluna de sílica gel utilizando metanol/cloreto de metileno 1:20 (que tem 109 trietilamina a 2%) como o eluente. À medida que as fracções de coluna são concentradas, forma-se um sólido incolor que é recolhido para proporcionar o composto de titulo como um sólido branco. 5'-0-dimetoxitritil-2'-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)-etil)]-5-metiluridina A 0,5 g (1,3 mmol) de 2 '-O-[2(2-N,N-dimetilamino- etoxi)etil)]-5-metil uridina em piridina anidra (8 mL), trietilamina (0,36 mL) e cloreto de dimetoxitritilo (DMT-C1, 0,87 g, 2 eq.) são adicionados e agitados, durante 1 hora. A mistura reaccional é vertida em água (200 mL) e extraída com CH2CI2 (2x200 mL). As camadas de CH2CI2 combinadas são lavadas com solução saturada de NaHCCb, seguida de solução saturada de NaCl e secas sobre sulfato de sódio anidro. A evaporação do solvente, seguida de cromatografia de sílica gel, utilizando

MeOH: CH2CI2:Et3N (20:1, v/v, com trietilamina a 1%), proporciona o composto de título. 5'-O-Dimetoxitritil-2'-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)-etil)]-5-metiluridina-3'-O-(cianoetil-N,N-diisopropil)fosforamidito

Diisopropilaminotetrazolida (0,6 g) e 2-cianoetoxi-N,N-diisopropil fosforamidito (1,1 mL, 2 eq.) são adicionados a uma solução de 5'-O-dimetoxitritil-2'-O-[2(2-N,N- dimetilaminoetoxi)etil)]-5-metiluridina (2,17 g, 3 mmol) dissolvida em CH2C12 (20 mL) , sob uma atmosfera de árgon. A mistura reaccional é agitada, de um dia para o outro e o 110 solvente evaporado. 0 resíduo resultante é purificado por cromatografia de coluna flash de sílica gel, com acetato de etilo como o eluente, para proporcionar o composto de título.

Exemplo 2 Síntese de Oligonucleótido

Os oligonucleótidos de fosfodiéster (P=0), não substituídos e substituídos, são sintetizados num sintetizador de ADN automatizado (Applied Biosystems, modelo 380B), utilizando química padrão de fosforamidito, com oxidação por iodo.

Os fosforotioatos (P=S) são sintetizados como para os oligonucleótidos de fosfodiéster, excepto que o frasco de oxidação padrão foi substituído por solução a 0,2 M de 3H-1,2-benzoditiol-3-ona 1,1-dióxido em acetonitrilo, para a tiação por passos das ligações de fosfito. O passo de espera de tiação foi aumentado para 68 s e foi seguido do passo de capeamento. Após clivagem a partir da coluna de CPG e desbloqueio em hidróxido de amónio concentrado, a 55 °C (18 h) , os oligonucleótidos foram purificados pela precipitação, duas vezes, com 2,5 volumes de etanol, desde uma solução de NaCl a 0,5 M. Os oligonucleótidos de fosfinato são preparados como descrito na Patente U.S. 5508270.

Os oligonucleótidos de fosfonato de alquilo são preparados como descrito na Patente U.S. 4469863. 111

Os oligonucleótidos de fosfonato de 3'-desoxi-3'-metileno são preparados como descrito nas Patentes U.S. 5610289 ou 5625050.

Os oligonucleótidos de fosforamidito são preparados como descrito na Patente U.S. 5256775 ou Patente U.S. 5366878.

Os oligonucleótidos de alquilfosfonotioato são preparados como descrito nos pedidos PCT publicados PCT/US94/00902 e PCT/US93/06976 (publicados como WO 94/17093 e WO 94/02499, respectivamente).

Os oligonucleótidos de fosforamidato de 3'-desoxi-3'-amino são preparados como descrito na Patente U.S. 5476925.

Os oligonucleótidos de fosfotriéster são preparados como descrito na Patente U.S. 5023243.

Os oligonucleótidos de fosfato de borano são preparados como descrito nas Patentes U.S. 5130302 e 5177198.

Exemplo 3 Síntese de Oligonucleótido

Os oligonucleósidos ligados a metilenometilimino, também identificados como oligonucleósidos ligados a MMI, oligonucleósidos ligados a metilenodimetil-hidrazo, também identificados como oligonucleósidos ligados a MDH e oligonucleósidos ligados a metilenocarbonilamino, também identificados como oligonucleósidos ligados a amida-3 e 112 oligonucleósidos ligados a metilenoaminocarbonilo, também identificados como oligonucleósidos ligados a amida-4, assim como compostos de esqueleto mistos tendo, por exemplo, ligações alternadas de MMI e P=0 ou P=S, são preparados como descrito nas Patentes U.S. 5378825, 5386023, 5489677, 5602240 e 5610289.

Os oligonucleósidos ligados a formacetal e tioformacetal são preparados como descrito nas Patentes U.S. 5264562 e 5264564.

Os oligonucleósidos ligados a óxido de etileno são preparados como descrito na Patente U.S. 5223618.

Exemplo 4 Síntese de PNA

Os ácidos nucleicos peptídicos (PNA) são preparados de acordo com qualquer dos diversos processos referidos em Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential

Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23.

Também podem ser preparados de acordo com as Patentes U.S. 5539082, 5700922 e 5719262.

Exemplo 5 Síntese de Oligonucleótidos Quiméricos

Os oligonucleótidos, oligonucleósidos ou oligonucleótidos/oligonucleósidos mistos quiméricos da invenção 113 podem ser de vários tipos diferentes. Estes incluem um primeiro tipo, em que o segmento de "lacuna" de nucleósidos ligados está posicionado entre os segmentos de "asa" 5' e 3' de nucleósidos ligados e um segundo tipo de "extremidade aberta", em que o segmento de "lacuna" está localizado na terminação 3' ou na 5' do composto oligomérico. Os oligonucleótidos do primeiro tipo também são conhecidos na técnica como "gapmeros" ou oligonucleótidos com lacuna. Os oligonucleótidos do segundo tipo também são conhecidos na técnica como "hemimeros" ou "wingmeros".

Oligonucleótidos Quiméricos de Fosforotioato [2'-O-Me]—[2'—desoxi]—[2'-O-Me]

Os oligonucleótidos quiméricos tendo segmentos de oligonucleótido de 2'-O-alquilfosforotioato e 2'-desoxifosforotioato são sintetizados utilizando um sintetizador de ADN automatizado, Modelo 380B, da Applied Biosystems, como acima. Os oligonucleótidos são sintetizados utilizando o sintetizador automatizado e 2'-desoxi-5'-dimetoxitritil-3'-0-fosforamidito para a porção de ADN e 5'-dimetoxitritil-2'-O-metil-3'-0-fosforamidito para as asas 5' e 3'. 0 ciclo de síntese padrão é modificado pelo aumento do passo de espera, após a distribuição de tetrazole e base para 600 s, repetida quatro vezes para ARN e duas vezes para 2'-O-metilo. O oligonucleótido totalmente protegido é clivado do suporte e o grupo fosfato é desprotegido em amónia/etanol, 3:1, à temperatura ambiente, de um dia para o outro, depois, liofilizado até à secura. O tratamento em amónio metanólico, durante 24 h, à temperatura ambiente, é, depois, realizado para desproteger todas as bases e a amostra foi 114 novamente liofilizada até à secura. 0 sedimento é ressuspenso em TBAF a 1 M, em THF, durante 24 h, à temperatura ambiente, para desproteger as posições 2' . A reacção é, depois, neutralizada com TEAA a 1 M e a amostra é, depois, reduzida para 1/2 volume por rotovac, antes de ser dessalinizada numa coluna de exclusão de tamanho G25. 0 oligo recuperado é, depois, analisado espectrofotometricamente para rendimento e para pureza por electroforese capilar e por espectrometria de massa.

Oligonucleótidos Quiméricos de Fosforotioato [2'-O-(2-Metoxietil)]—[2'-desoxi]—(2'-O-(Metoxietilo)]

Os oligonucleótidos quiméricos de fosforotioato [2'-0-(2-metoxietil)]—[2'-desoxi]—[-2'-0-(metoxietilo)] foram preparados conforme o processo acima para o oligonucleótido quimérico 2'-0-metilo, com a substituição de amiditos de 20—(metoxietilo) para os amiditos de 2'-0-metilo.

Oligonucleótidos Quiméricos de [2'-0-(2-Metoxietil)Fosfodiéster]—[2'-desoxi Fosforotioato]— [2'-0-(2-Metoxietil) Fosfodiéster]

Os oligonucleótidos quiméricos de [2'-0-(2-metoxietil fosfodiéster]—[2'-desoxi fosforotioato]—[2'-0-(metoxietilo) fosfodiéster] são preparados conforme o processo acima para o oligonucleótido quimérico de 2'-0-metilo, com a substituição de amiditos de 2'-0-(metoxietilo) para os amiditos de 2'-0-metilo, oxidação com iodo para produzir as ligações internucleótido de fosfodiéster nas porções de asa das estruturas quiméricas e sulfurização utilizando de 3,H-l,2-benzoditiol-3-ona 1,1 dióxido 115 (Reagente de Beaucage) para produzir as ligações internucleótido de fosforotioato para a lacuna central.

Outros oligonucleótidos quiméricos, oligonucleósidos quiméricos e oligonucleótidos/oligonucleósidos quiméricos mistos são sintetizados de acordo com a patente dos Estados Unidos 5623065.

Exemplo 6

Isolamento de Oligonucleótido

Após clivagem da coluna de vidro de poro controlado (Applied Biosystems) e desbloqueio em hidróxido de amónio concentrado a 55 °C, durante 18 horas, os oligonucleótidos ou oligonucleósidos são purificados por precipitação, duas vezes, em NaCl a 0,5 M, com 2,5 volumes de etanol. Os oligonucleótidos sintetizados foram analisados por electroforese em gel de poliacrilamida em géis desnaturantes e avaliados como tendo, pelo menos, 85% de material de comprimento completo. As quantidades relativas de ligações fosforotioato e fosfodiéster obtidas na síntese foram periodicamente verificadas por espectroscopia de ressonância magnética nuclear XP e, para alguns estudos, os oligonucleótidos foram purificados por HPLC, como descrito por Chiang et al., J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171. Os resultados obtidos com material purificado por HPLC foram semelhantes aos obtidos com material não purificado por HPLC. 116

Exemplo 7 Síntese de oligonucleótido - Formato de Placa de 96 Poços

Os oligonucleótidos foram sintetizados por meio de química de fosforamidito de fase sólida P(III) num sintetizador automatizado, capaz de agrupar 96 sequências simultaneamente num formato de 96 poços padrão. As ligações fosfodiéster de internucleótido foram proporcionadas por oxidação com iodo aquoso. As ligações fosforotioato de internucleótido foram geradas por sulfurização, utilizando 3,H-l,2-benzoditiol-3-ona 1,1 dióxido (Reagente de Beaucage) em acetonitrilo anidro. Os fosforamiditos padrão de beta-cianoetildiisopropilo com base protegida foram adquiridos a vendedores comerciais (e. g. , PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, ou Pharmacia, Piscataway, NJ). Os nucleósidos não padrão são sintetizado conforme literatura conhecida ou métodos patenteados. São utilizados como fosforamiditos de beta-cianoetildiisopropilo com base protegida.

Os oligonucleótidos foram clivados do suporte e desprotegidos com NH4OH concentrado a temperatura elevada (55-60 °C), durante 12-16 horas e o produto libertado, depois, seco em vácuo. O produto seco foi, depois, ressuspenso em água estéril para proporcionar uma placa principal, a partir da qual todas as amostras de placa analíticas e de teste são, depois, diluídas, utilizando pipetadores robóticos. 117

Exemplo δ

Análise de oligonucleótido - Formato de Placa de 96 Poços A concentração do oligonucleótido em cada poço foi avaliada por diluição de amostras e espectroscopia de absorção de UV. A integridade de comprimento completo dos produtos individuais foi avaliada por electroforese capilar (CE), no formato de 96 poços (Beckman P/ACE™ NDQ) ou, para amostras preparadas individualmente, num aparelho de CE comercial (e. g. , Beckman P/ACE™ 5000, ABI 270) . A composição de base e esqueleto foi confirmada por análise de massa dos compostos, utilizando espectroscopia de massa de electrosspray. Todas as placas de teste do ensaio foram diluídas a partir da placa principal, utilizando pipetadores robóticos simples e de multicanal. As placas foram avaliadas como sendo aceitáveis se, pelo menos, 85% dos compostos na placa tivessem, pelo menos, 85% de comprimento completo.

Exemplo 9

Cultura celular e tratamento de oligonucleótido O efeito de compostos anti-sentido na expressão de ácido nucleico direccionado pode ser testado em qualquer de uma variedade de tipos de células, desde que o ácido nucleico alvo esteja presente a níveis mensuráveis. Isto pode ser rotineiramente determinado utilizando, por exemplo, análise de PCR ou de transferência de Northern. Os seguintes 7 tipos de células são proporcionados para efeitos ilustrativos, mas outros tipos de células podem ser rotineiramente utilizados, desde que 118 o alvo seja expresso no tipo de célula escolhido. Isto pode ser facilmente determinado por métodos de rotina na técnica, por exemplo análise de transferência de Northern, ensaios de protecção de Ribonuclease ou RT-PCR. Células T-24: A linha celular T-24 de carcinoma da bexiga de célula transicional humana foi obtida da American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) . As células T-24 foram rotineiramente cultivadas em meios basais 5A de McCoy completos (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) , suplementados com soro de vitelo fetal a 10% (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) , 100 unidades de penicilina por mL e 100 microgramas de estreptomicina por mL (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). As células foram rotineiramente passadas por tripsinização e diluição quando atingiram 90% de confluência. As células foram semeadas em placas de 96 poços (Falcon-Primaria N° 3872), a uma densidade de 7000 células/poço, para utilização em análise de RT-PCR.

Para análise de transferência de Northern ou outra, as células podem ser semeadas em placas de cultura tecidos de 100 mm ou outras placas padrão e tratadas do modo semelhante, utilizando volumes apropriados de meio e oligonucleótido. Células A549: A linha celular A549 de carcinoma de pulmão humano foi obtida da American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, 119 VA). As células A549 foram rotineiramente cultivadas em meios basais DMEM (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), suplementados com soro de vitelo fetal a 10% (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), 100 unidades de penicilina por mL e 100 microgramas de estreptomicina por mL (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). As células foram rotineiramente passadas por tripsinização e diluição quando atingiram 90% de confluência. Células de NHDF:

Os fibroblastos dérmicos neonatais humanos (NHDF) foram obtidos da Clonetics Corporation (Walkersville MD). As NHDF foram rotineiramente mantidas em Meio de Crescimento de Fibroblastos (Clonetics Corporation, Walkersville MD), suplementado como recomendado pelo fornecedor. As células foram mantidas durante até 10 passagens, como recomendado pelo fornecedor. Células de HEK:

Os queratinócitos embrionários humanos (HEK) foram obtidos da Clonetics Corporation (Walkersville MD) . As HEK foram rotineiramente mantidas em Meio de Crescimento de Queratinócitos (Clonetics Corporation, Walkersville MD), formulado como recomendado pelo fornecedor. As células foram rotineiramente mantidas durante até 10 passagens, como recomendado pelo fornecedor. 120 Células de HepG2: A linha celular HepG2 de hepatoblastoma humano foi obtida da American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) . As células de HepG2 foram rotineiramente cultivadas em MEM de Eagle, suplementado com soro de vitelo fetal a 10%, aminoácidos não essenciais e piruvato de sódio a 1 mM (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) . As células foram rotineiramente passadas por tripsinização e diluição quando atingiram 90% de confluência. As células foram semeadas em placas de 96 poços (Falcon-Primaria N° 3872), a uma densidade de 7000 células/poço, para utilização em análise de RT-PCR.

Para análises de transferência de Northern ou outras, as células podem ser semeadas em placas de cultura tecidos de 100 mm ou outras placas padrão e tratadas do modo semelhante, utilizando volumes apropriados de meio e oligonucleótido. Células de AML12: A linha celular AML12 (fígado de murganho alfa 12) foi estabelecida a partir de hepatócitos de um murganho (estirpe CD1, linha MT42) transgénico para TGF alfa humano. As células são cultivadas numa mistura 1:1 de meio de Eagle modificado por Dulbecco e meio F12 de Ham, com insulina a 0,005 mg/mL, transferrina a 0,005 mg/mL, selénio a 5 ng/mL e dexametasona a 40 ng/mL e 90%; soro bovino fetal a 10%. Para subcultivo, o meio gasto é removido e são adicionados meios frescos de tripsina a 0,25%, solução de EDTA a 0,03%. A solução de tripsina fresca (1 a 2 mL) é adicionada e a cultura é deixada repousar, à temperatura ambiente, até que as células se desprendam. 121

As células foram rotineiramente passadas por tripsinização e diluição quando atingiram 90% de confluência. As células foram semeadas em placas de 96 poços (Falcon-Primaria N° 3872), a uma densidade de 7000 células/poço, para utilização em análise de RT-PCR.

Para análises de transferência de Northern ou outras, as células podem ser semeadas em placas de cultura tecidos de 100 mm ou outras placas padrão e tratadas do modo semelhante, utilizando volumes apropriados de meio e oligonucleótido.

Hepatócitos primários de murganho:

Os hepatócitos primários de murganho foram preparados a partir de murganhos CD-I adquiridos a Charles River Labs (Wilmington, MA) e foram rotineiramente cultivados em Meios de Conjugação de Hepatócitos (Gibco), suplementados com soro bovino fetal a 10% (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) , dexametasona a 250 nM (Sigma) e insulina de bovino a 10 nM (Sigma). As células foram semeadas em placas de 96 poços (Falcon-Primaria N° 3872), a uma densidade de 10000 células/poço, para utilização em análise de RT-PCR.

Para análises de transferência de Northern ou outras, as células são plaqueadas em placas de cultura tecidos de 100 mm ou outras placas padrão, revestidas com colagénio de cauda de rato (200 pg/mL) e tratadas do modo semelhante, utilizando volumes apropriados de meio e oligonucleótido. 122 Células de Hep3B: A linha celular Hep3B de carcinoma hepatocelular humano foi obtida da American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) . As células de Hep3B foram rotineiramente cultivadas em MEM de Dulbecco com elevado teor de glucose, suplementado com soro de vitelo fetal a 10%, L-glutamina e cloridrato de piridoxina (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) . As células foram rotineiramente passadas por tripsinização e diluição quando atingiram 90% de confluência. As células foram semeadas em placas de 24 poços (Falcon-Primaria N° 3846), a uma densidade de 50000 células/poço, para utilização em análise de RT-PCR.

Para análises de transferência de Northern ou outras, as células podem ser semeadas em placas de cultura tecidos de 100 mm ou outras placas padrão e tratadas do modo semelhante, utilizando volumes apropriados de meio e oligonucleótido.

Hepatócitos primários de coelho:

Os hepatócitos primários de coelho foram adquiridos a Invitro Technologies (Gaithersburg, MD) e mantidos em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco). Quando adquiridas, as células tinham sido semeadas em placas de 96 poços para utilização em análise de RT-PCR e eram confluentes.

Para análises de transferência de Northern ou outras, as células podem ser semeadas em placas de cultura tecidos de 100 mm ou outras placas padrão e tratadas do modo semelhante, utilizando volumes apropriados de meio e oligonucleótido. 123 Células HeLa: A linha celular HeLa de carcinoma epitelóide humano foi obtida da American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). As células HeLa foram rotineiramente cultivadas em DMEM, elevado teor de glucose (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), suplementado com soro bovino fetal 10% (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) . As células foram semeadas em placas de 24 poços (Falcon-Primaria N° 3846), a uma densidade de 50000 células/poço, para utilização em análise de RT-PCR. As células foram rotineiramente passadas por tripsinização e diluição quando atingiram 90% de confluência. As células foram semeadas em placas de 96 poços (Falcon-Primaria N° 3872), a uma densidade de 5000 células/poço, para utilização em análise de RT-PCR. Para análises de transferência de Northern ou outras, as células podem ser semeadas em placas de cultura tecidos de 100 mm ou outras placas padrão e tratadas do modo semelhante, utilizando volumes apropriados de meio e oligonucleótido. Células epiteliais mamárias humanas:

As células epiteliais mamárias humanas normais (HMEC) foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas VA) . As HMEC foram rotineiramente cultivadas em DMEM de baixo teor de glucose (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), suplementado com soro de vitelo fetal a 10% (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). As células foram rotineiramente passadas por tripsinização e diluição quando atingiram 90% de confluência. As células foram semeadas em placas de 96 poços (Falcon-Primaria N° 353872, BD Biosciences, Bedford, MA), a uma densidade de 7000 células/poço, para utilização em análise de 124 RT-PCR. Para análises de transferência de Northern ou outras, as células podem ser semeadas em placas de cultura tecidos de 100 mm ou outras placas padrão e tratadas do modo semelhante, utilizando volumes apropriados de meio e oligonucleótido.

Tratamento com compostos anti-sentido:

Quando as células atingiram 80% de confluência, foram tratadas com oligonucleótido. Para células cultivadas em placas de 96 poços, os poços foram lavados uma vez com 200 pL de meio de soro reduzido 0PTI-MEM™-1 (Gibco BRL) e, depois, tratados com 130 pL de 0PTI-MEM™-1 contendo LIPOFECTIN™ a 3,75 pg/mL (Gibco BRL) e a concentração desejada de oligonucleótido. Após 4-7 horas de tratamento, o meio foi substituído com meio fresco. As células foram recolhidas 16-24 horas após o tratamento de oligonucleótido. A concentração de oligonucleótido utilizado varia de linha celular para linha celular. Para determinar a concentração óptima de oligonucleótido para uma linha celular particular, as células são tratadas com um oligonucleótido de controlo positivo, a uma gama de concentrações. Para células humanas, o oligonucleótido de controlo positivo é ISIS 13920, TCCGTCATCGCTCCTCAGGG, SEQ ID N°: 1, um gapmero de 2'-O-metoxietilo (2'-O-metoxietilos mostrados em negrito) com um esqueleto de fosforotioato que é direccionado para H-ras humano. Para células de murganho ou rato, o oligonucleótido de controlo positivo é ISIS 15770, ATGCATTCTGCCCCCAAGGA, SEQ ID N° : 2, um gapmero de 2'-O-metoxietilo (2'-O-metoxietilos mostrados em negrito) com um esqueleto de fosforotioato que é direccionado para c-raf de murganho e rato. A concentração de oligonucleótido 125 de controlo positivo que resulta em 80% de inibição de ARNm de c-Ha-ras (para ISIS 13920) ou c-raf (para ISIS 15770) é, depois, utilizada como a concentração de rastreio para novos oligonucleótidos em experiências subsequentes para essa linha celular. Se não for alcançada 80% de inibição, a concentração mais baixa de oligonucleótido de controlo positivo que resulta em 60% de inibição de ARNm de H-ras ou c-raf é, depois, utilizada como a concentração de rastreio de oligonucleótido em experiências subsequentes para essa linha celular. Se não for alcançada 60% de inibição, essa linha celular particular é considerada desadequada para experiências de transfecção de oligonucleótido. As concentrações de oligonucleótidos anti-sentido aqui utilizados são desde 5 nM a 300 nM.

Exemplo 10

Análise da inibição de oligonucleótido da expressão de apolipoproteina B A modulação anti-sentido da expressão de apolipoproteina B pode ser ensaiada numa variedade de modos conhecidos na técnica. Por exemplo, os níveis de ARNm de apolipoproteina B podem ser quantificados, e. g. , por análise de transferência de Northern, reacção em cadeia da polimerase (PCR) competitiva ou PCR em tempo real (RT-PCR). 0 PCR quantitativo em tempo real é, presentemente, preferido. A análise de ARN pode ser realizada em ARN total celular ou ARNm poli(A)+. Os métodos de isolamento de ARN são ensinados em, por exemplo, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Blology, Volume 1, p. 4.1.1-4.2.9 e 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993. A análise de transferência de Northern é rotina na técnica e é ensinada em, 126 et al. , F .Μ. por exemplo, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, p. 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996. 0 (PCR) quantitativo em tempo real pode ser convenientemente alcançado utilizando o ABI PRISM™ 7700 Sequence Detection System comercialmente disponível, disponível a partir da PE-Applied Biosystems, Foster City, CA e utilizado de acordo com as instruções do fabricante.

Os níveis de proteína de apolipoproteína B podem ser quantificados numa variedade de modos bem conhecidos na técnica, tais como imunoprecipitação, análise de transferência de Western (imunotransferência) , ELISA ou triagem celular de activação por fluorescência (FACS). Os anticorpos dirigidos para apolipoproteína B podem ser identificados e obtidos de uma variedade de fontes, tal como o catálogo MSRS de anticorpos (Aerie Corporation, Birmingham, MI), ou podem ser preparados por meio de métodos de produção de anticorpo convencionais. Os métodos para a preparação de anti-soros policlonais são ensinados em, por exemplo, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, p. 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997. A preparação de anticorpos monoclonais é ensinada em, por exemplo, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, p. 11.4.1-11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997.

Os métodos de imunoprecipitação são padrão na técnica e podem consultar-se em, por exemplo, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, p. 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998. A análise de transferência de Western (imunotransferência) é padrão na técnica e pode consultar-se, por exemplo, em Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, 127 ρ. 10.8.1-10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1997. Os ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) são padrão na técnica e podem consultar-se em, por exemplo, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, p. 11.2.1-11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991.

Exemplo 11

Isolamento de ARNm poli(A)+ O ARNm poli (A) + foi isolado de acordo com Miura et al., Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764. Outros método para o isolamento de ARNm poli(A)+ são ensinados em, por exemplo, Ausubel, F.M. et ai., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, p. 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993. Resumidamente, para células cultivadas em placas de 96 poços, o meio de crescimento foi removido das células e cada poço foi lavado com 200 pL de PBS frio. Foram adicionados 60 pL de tampão de lise (Tris-HCl a 10 mM, pH 7,6, EDTA a 1 mM, NaCl a 0,5 M, NP-40 a 0,5%, complexo vanadil-ribonucleósido a 20 mM) a cada poço, a placa foi suavemente agitada e, depois, incubada, à temperatura ambiente, durante cinco minutos. Foram transferidos 55 pL de lisado para placas de 96 poços revestidas com Oligo d(T) (AGCT Inc., Irvine CA). As placas foram incubadas, durante 60 minutos, à temperatura ambiente, lavadas 3 vezes com 200 pL de tampão de lavagem (Tris-HCl a 10 mM pH 7,6, EDTA a 1 mM, NaCl a 0,3 M). Após a lavagem final, a placa foi transferida em toalhetes de papel para remover tampão de lavagem em excesso e, depois, secas ao ar durante 5 minutos. A cada poço foram adicionados 60 pL de tampão de eluição (Tris-HCl a 5 mM, pH 7,6), pré-aquecido a 70 °C, a placa foi incubada numa placa 128 de aquecimento a 90 °C, durante 5 minutos e o eluato foi, depois, transferido para uma placa de 96 poços fresca.

As células cultivadas em placas de 100 mm ou outras placas padrão podem ser tratadas de modo semelhante, utilizando volumes apropriados de todas as soluções.

Exemplo 12

Isolamento de ARN Total O ARN total foi isolado utilizando um kit RNEASY 96™ e tampões adquiridos da Qiagen Inc. (Valência CA), seguindo os processos recomendados pelo fabricante. Resumidamente, para células cultivadas em placas de 96 poços, o meio de crescimento foi removido das células e cada poço foi lavado com 200 pL de PBS frio. Foram adicionados 100 pL de Tampão RLT a cada poço e a placa vigorosamente agitada, durante 20 segundos. Foram, depois, adicionados 100 pL de etanol a 70% a cada poço e o conteúdo misturado por pipetagem, três vezes, para cima e para baixo. As amostras foram, depois, transferidas para a placa de 96 poços RNEASY 96™, ligada a um colector QIAVAC™ equipado com um tabuleiro de recolha de resíduos e ligado a uma fonte de vácuo. O vácuo foi aplicado durante 15 segundos. Foi adicionado 1 mL de Tampão RW1 a cada poço da placa RNEASY 96™ e o vácuo novamente aplicado durante 15 segundos. Foi, depois, adicionado 1 mL de Tampão RPE a cada poço da placa RNEASY 96™ e o vácuo aplicado durante um período de 15 segundos. A lavagem com Tampão RPE foi, depois, repetida e o vácuo foi aplicado durante 10 minutos adicionais. A placa foi, depois, removida do colector QIAVAC™ e transferida a seco em toalhetes de papel. A placa foi, depois, 129 novamente ligada ao colector QIAVAC™ equipado com um suporte de tubo de recolha contendo tubos de recolha de 1,2 mL. 0 ARN foi, depois, eluido pela pipetagem de 60 pL de água para cada poço, incubação de 1 minuto e, depois, aplicação do vácuo durante 30 segundos. O passo de eluição foi repetida com 60 pL de água adicionais.

Os passos de pipetagem e eluição repetitiva podem ser automatizadas utilizando um QIAGEN Bio-Robot 9604 (Qiagen, Inc., Valência CA) . Essencialmente, após a lise das células na placa de cultura, a placa é transferida para a plataforma do robô, onde os passos de pipetagem, tratamento de DNase e eluição são efectuadas.

Exemplo 13

Análise de PCR Quantitativo Em Tempo Real de Níveis de ARNm de Apolipoproteína B A quantificação dos níveis de ARNm de apolipoproteína B foi determinada por PCR quantitativo em tempo real, utilizando o Sistema de Detecção de Sequência ABI PRISM™ 7700 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) , de acordo com as instruções do fabricante. Trata-se de um sistema de detecção de fluorescência de tubo fechado, não baseado em gel, que permite quantificação de alta capacidade de produtos de reacção em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. Em oposição ao PCR padrão, no qual os produtos de amplificação são quantificados após a conclusão do PCR, os produtos de PCR quantitativo em tempo real são quantificados à medida que se acumulam. Isto é alcançado pela inclusão na reacção de PCR de uma sonda de oligonucleótido 130 que se emparelha de modo específico entre os iniciadores directo e inverso de PCR e contém dois corantes fluorescentes. Um corante repórter (e. g., JOE, FAM ou VIC, obtidos da Operon Technologies Inc., Alameda, CA ou PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) é conjugado à extremidade 5' da sonda e um corante neutralizador (e. g., TAMRA, obtido da Operon Technologies Inc., Alameda, CA ou PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) é conjugado à extremidade 3' da sonda. Quando a sonda e corantes estão intactos, a emissão de corante repórter é neutralizada pela proximidade do corante 3' neutralizador. Durante a amplificação, o emparelhamento da sonda à sequência alvo cria um substrato que pode ser clivado pela actividade 5'-exonuclease da Taq polimerase. Durante a fase de extensão do ciclo da amplificação por PCR, a clivagem da sonda pela Taq polimerase liberta o corante repórter do resto da sonda (e, por este motivo, da fracção neutralizadora) e um sinal fluorescente específico de sequência é produzido. Com cada ciclo, moléculas de corante repórter adicionais são clivadas das suas respectivas sondas e a intensidade de fluorescência é monitorizada, a intervalos regulares, por óptica a laser, incorporada no Sistema de Detecção de Sequência ABI PRISM™ 7700. Em cada ensaio, uma série de reacções paralelas contendo diluições em série de ARNm de amostras de controlo não tratadas produz uma curva-padrão que é utilizada para quantificar a percentagem de inibição, após tratamento de oligonucleótido anti-sentido das amostras de teste.

Antes da análise de PCR quantitativo, conjuntos de iniciador-sonda específicos para o gene alvo sendo medido são avaliados para a sua capacidade de serem "multiplexados" com uma reacção de amplificação de GAPDH. Na multiplexação, o gene alvo e o gene GAPDH de padrão interno são amplificados 131 concorrentemente numa única amostra. Nesta análise, o ARNm isolado de células não tratadas é diluído em série. Cada diluição é amplificada na presença de conjuntos de iniciador-sonda específicos para apenas GAPDH, apenas gene alvo ("plexação simples") ou ambos (multiplexação). Após amplificação por PCR, são produzidas curvas-padrão de sinal de GAPDH e ARNm alvo em função da diluição a partir das amostras de plexação simples e multiplexadas. Se o declive e coeficiente de correlação dos sinais de GAPDH e alvo, gerados a partir de amostras multiplexadas, se situarem dentro de 10% dos seus correspondentes valores produzidos a partir de amostras de plexação simples, o conjunto de iniciador-sonda específico para esse alvo é considerado multiplexável. Outros métodos de PCR também são conhecidos na técnica.

Os reagentes de PCR foram obtidos da PE-Applied Biosystems, Foster City, CA. As reacções de RT-PCR foram efectuadas pela adição de 25 pL de cocktail de PCR (tampão A lx TAQMAN™, MgCl2 a 5,5 mM, 300 pm cada de dATP, dCTP e dGTP, 600 pm de dUTP, 100 nM cada de iniciador directo, iniciador inverso e sonda, 20 unidades de inibidor de RNAse, 1,25 Unidades de AMPLITAQ GOLD™ e 12,5 Unidades de transcritase reversa MuLV) a placas de 96 poços contendo 25 pL de solução de ARN total. A reacção de RT foi efectuada pela incubação, durante 30 minutos, a 48 °C. Após uma incubação de 10 minutos a 95 °C, para activar o AMPLITAQ GOLD™, foram efectuados 40 ciclos de um protocolo de PCR de dois passos: 95 °C, durante 15 segundos (desnaturação), seguido de 60 °C, durante 1,5 minutos (emparelhamento/extensão).

As quantidades de gene alvo obtidas por RT-PCR em tempo real são normalizadas utilizando o nível de expressão de GAPDH, um gene cuja expressão é constante ou pela quantificação de ARN 132 total utilizando RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). A expressão de GAPDH é quantificada por RT-PCR em tempo real, sendo corrido simultaneamente com o alvo, em multiplexação ou separadamente. 0 ARN total é quantificado utilizando reagente de quantificação de ARN RiboGreen™ da Molecular Probes. Os métodos de quantificação de ARN por RiboGreen™ são ensinados em Jones, L.J., et al., Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374.

Neste ensaio, 175 pL de reagente de trabalho RiboGreen™ (reagente RiboGreen™ diluído 1:2865 em Tris-HCl a 10 mM, EDTA a 1 mM, pH 7,5) são pipetados para numa placa de 96 poços contendo 25 pL de ARN celular purificado. A placa é lida num CytoFluor 4000 (PE Applied Biosystems), com excitação a 480 nm e emissão a 520 nm.

As sondas e iniciadores para apolipoproteína B humana foram concebidos para se hibridarem a uma sequência de apolipoproteína B humana, utilizando informação de sequência publicada (acesso GenBank número NM_000384.1, aqui incorporado como SEQ ID N°: 3) . Para apolipoproteína B humana, os iniciadores de PCR foram: iniciador directo: TGCTAAAGGCACATATGGCCT (SEQ ID N°: 4) iniciador inverso: CTCAGGTTGGACTCTCCATTGAG (SEQ ID N°: 5) e a sonda de PCR foi: FAM-CTTGTCAGAGGGATCCTAACACTGGCCG-TAMRA (SEQ ID N° : 6), onde FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) é o corante repórter fluorescente) e TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) é o corante neutralizador. Para GAPDH humana, os iniciadores de PCR foram: iniciador directo: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC (SEQ ID N°: 7) iniciador inverso: GAAGATGGTGATGGGATTTC (SEQ ID N° : 8) e a sonda de PCR foi: 5' JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA 3' (SEQ ID N° : 9), onde JOE (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) é o corante 133 repórter fluorescente) e TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) é o corante neutralizador.

As sondas e iniciadores para apolipoproteina B de murganho foram concebidos para se hibridarem a uma sequência de apolipoproteina B de murganho, utilizando informação de sequência publicada (acesso GenBank número M35186, aqui incorporado como SEQ ID N°: 10). Para apolipoproteina B de murganho, os iniciadores de PCR foram: iniciador directo: CGTGGGCTCCAGCATTCTA (SEQ ID N° : 11) iniciador inverso:

AGTCATTTCTGCCTTTGCGTC (SEQ ID N°: 12) e a sonda de PCR foi: FAM-CCAATGGTCGGGCACTGCTCAA-TAMRA SEQ ID N° : 13), onde FAM

(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) é o corante repórter fluorescente) e TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) é o corante neutralizador. Para GAPDH de murganho, os iniciadores de PCR foram: iniciador directo: GGCAAATTCAACGGCACAGT

(SEQ ID N° : 14) iniciador inverso: GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT (SEQ ID N° : 15) e a sonda de PCR foi: 5' JOE-AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC-TAMRA 3' (SEQ ID N°: 16), onde JOE (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) é o corante repórter fluorescente) e TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) é o corante neutralizador.

Exemplo 14

Análise de transferência de Northern de níveis de ARNm de apolipoproteina B

Dezoito horas após tratamento anti-sentido, as monocamadas celulares foram lavadas duas vezes com PBS frio e lisadas em 1 mL de RNAZOL™ (TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX) . O ARN 134 total foi preparado seguindo os protocolos recomendados pelo fabricante. Vinte microgramas de ARN total foram fraccionados por electroforese através de géis de agarose a 1,2% contendo formaldeido a 1,1%, utilizando um sistema de tampão de MOPS (AMRESCO, Inc. Solon, OH) . 0 ARN foi transferido do gel para membranas de nylon HYBOND™-N+ (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) por transferência capilar, de um dia para o outro, utilizando um sistema de tampão de Transferência de Northern/Southern (TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX) . A transferência de ARN foi confirmada por visualização UV. As membranas foram fixadas por reticulação UV, utilizando um STRATALINKER™ UV Crosslinker 2400 (Stratagene, Inc, La Jolla, CA) e, depois, revestidas utilizando solução de hibridação QUICKHYB™ (Stratagene, La Jolla, CA) , utilizando as recomendações do fabricante para condições estringentes.

Para detectar apolipoproteina B humana, uma sonda especifica de apolipoproteina B humana foi preparada por PCR utilizando o iniciador directo TGCTAAAGGCACATATGGCCT (SEQ ID N°: 4) e o iniciador inverso CTCAGGTTGGACTCTCCATTGAG (SEQ ID N° : 5) . Para normalizar para variações na eficiência de carregamento e transferência, as membranas foram lavadas e sondadas para ARN de gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase humana (GAPDH) (Clontech, Paio Alto, CA).

Para detectar apolipoproteina B de murganho, uma sonda especifica de apolipoproteina B humana foi preparada por PCR utilizando o iniciador directo CGTGGGCTCCAGCATTCTA (SEQ ID N° : 11) e o iniciador inverso AGTCATTTCTGCCTTTGCGTC (SEQ ID N°: 12) . Para normalizar para variações na eficiência de carregamento e transferência, as membranas foram lavadas e 135 sondadas para ARN de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de murganho (GAPDH) (Clontech, Paio Alto, CA).

As membranas hibridadas foram visualizadas e quantificadas utilizando um PHOSPHORIMAGER™ e software IMAGEQUANT™ V3.3 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Os dados foram normalizados para niveis de GAPDH em controlos não tratados.

Exemplo 15

Inibição anti-sentido da expressão de apolipoproteina B humana por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-MOE e uma lacuna desoxi

Foi concebida uma série de oligonucleótidos para visar diferentes regiões do ARN de apolipoproteina B humana, utilizando sequências publicadas (acesso GenBank número NM_000384.1, aqui incorporado como SEQ ID N° : 3). Os oligonucleótidos são mostrados na Tabela 1. "Sítio alvo" indica o primeiro número de nucleótido (mais em 5') na sequência alvo particular a que o oligonucleótido se liga. Todos os compostos na Tabela 1 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros") , de 20 nucleótidos em comprimento, compostos por uma região de "lacuna" central consistindo de dez 2'-desoxinucleótidos, a qual está flanqueada em ambos os lados (direcções 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por nucleótidos de 2'-metoxietilo (2'-MOE). As ligações internucleósido (esqueleto) são fosforotioato (P=S) em todo o oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas. Os compostos foram analisados para o seu efeito nos níveis de ARNm de apolipoproteina B humana em células HepG2 por PCR quantitativo 136 em tempo real, como aqui descrito noutros exemplos. Os dados são médias de duas experiências, nas quais as células HepG2 foram tratadas com 150 nM dos compostos na Tabela 1. Se presente, "N.D." indica "não determinado".

Tabela 1

Inibição dos oligonucleótidos níveis de ARNm de apolipoproteína B humana por de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-MOE e uma lacuna desoxi N2 ISIS REGIÃO SEQ ID N2 ALVO SÍTIO ALVO SEQUÊNCIA % DE INIB. SEQ ID N2 147780 5'UTR 3 1 CCGCAGGTCCCGGTGGGAAT 40 17 147781 5'UTR 3 21 ACCGAGAAGGGCACTCAGCC 35 18 147782 5'UTR 3 71 GCCTCGGCCTCGCGGCCCTG 67 19 147783 Codão de Partida 3 114 TCCATCGCCAGCTGCGGTGG N.D. 20 147784 Codificante 3 151 CAGCGCCAGCAGCGCCAGCA 70 21 147785 Codificante 3 181 GCCCGCCAGCAGCAGCAGCA 29 22 147786 Codificante 3 321 CTTGAATCAGCAGTCCCAGG 34 23 147787 Codificante 3 451 CTTCAGCAAGGCTTTGCCCT N.D. 24 147788 Codificante 3 716 TTTCTGTTGCCACATTGCCC 95 25 147789 Codificante 3 911 GGAAGAGGTGTTGCTCCTTG 24 26 147790 Codificante 3 951 TGTGCTACCATCCCATACTT 33 27 147791 Codificante 3 1041 TCAAATGCGAGGCCCATCTT N.D. 28 147792 Codificante 3 1231 GGACACCTCAATCAGCTGTG 26 29 147793 Codificante 3 1361 TCAGGGCCACCAGGTAGGTG N.D. 30 147794 Codificante 3 1561 GTAATCTTCATCCCCAGTGC 47 31 147795 Codificante 3 1611 TGCTCCATGGTTTGGCCCAT N.D. 32 147796 Codificante 3 1791 GCAGCCAGTCGCTTATCTCC 8 33 147797 Codificante 3 2331 GTATAGCCAAAGTGGTCCAC N.D. 34 147798 Codificante 3 2496 CCCAGGAGCTGGAGGTCATG N.D. 35 147799 Codificante 3 2573 TTGAGCCCTTCCTGATGACC N.D. 36 137 (continuação) , Λ N2 ISIS REGIÃO SEQ ID N2 SITIO SEQUENCIA % DE SEQ ID N2 ALVO ALVO INIB. 147800 Codificante 3 2811 ATCTGGACCCCACTCCTAGC N.D. 37 147801 Codificante 3 2842 CAGACCCGACTCGTGGAAGA 38 38 147802 Codificante 3 3367 GCCCT CAGTAGATT CAT CAT N.D. 39 147803 Codificante 3 3611 GCCATGCCACCCTGTTGGAA N.D. 40 147804 Codificante 3 3791 AACCCACGTGCCGGAAAGTC N.D. 41 147805 Codificante 3 3841 ACTCCCAGATGCCTTCTGAA N.D. 42 147806 Codificante 3 4281 ATGTGGTAACGAGCCCGAAG 100 43 147807 Codificante 3 4391 GGCGTAGAGACCGATCACAT 25 44 147808 Codificante 3 4641 GTGTTAGGATCCCTCTGACA N.D. 45 147809 Codificante 3 5241 CCCAGTGATAGCTCTGTGAG 60 46 147810 Codificante 3 5355 ATTTCAGCATATGAGCCCAT 0 47 147811 Codificante 3 5691 CCCTGAACCTTAGCAACAGT N.D. 48 147812 Codificante 3 5742 GCTGAAGCCAGCCCAGCGAT N.D. 49 147813 Codificante 3 5891 ACAGCTGCCCAGTATGTTCT N.D. 50 147814 Codificante 3 7087 CCCAATAAGATTTATAACAA 34 51 147815 Codificante 3 7731 TGGCCTACCAGAGACAGGTA 45 52 147816 Codificante 3 7841 TCATACGTTTAGCCCAATCT 100 53 147817 Codificante 3 7901 GCATGGTCCCAAGGATGGTC 0 54 147818 Codificante 3 8491 AGTGATGGAAGCTGCGATAC 30 55 147819 Codificante 3 9181 ATGAGCATCATGCCTCCCAG N.D. 56 147820 Codificante 3 9931 GAACACATAGCCGAATGCCG 100 57 147821 Codificante 3 10263 GTGGTGCCCTCTAATTTGTA N.D. 58 147822 Codificante 3 10631 CCCGAGAAAGAACCGAACCC N.D. 59 147823 Codificante 3 10712 TGCCCTGCAGCTTGACTGAA 19 60 147824 Codificante 3 11170 GAAATCCCATAAGCTCTTGT N.D. 61 147825 Codificante 3 12301 AGAAGCTGCCTCTTCTTCCC 72 62 147826 Codificante 3 12401 TCAGGGTGAGCCCTGTGTGT 80 63 147827 Codificante 3 12471 CTAATGGCCCCTTGATAAAC 13 64 147828 Codificante 3 12621 ACGTTATCCTTGAGTCCCTG 12 65 147829 Codificante 3 12741 TATATCCCAGGTTTCCCCGG 64 66 147830 Codificante 3 12801 ACCTGGGACAGTACCGTCCC N.D. 67 138 (continuação) N2 ISIS REGIÃO SEQ ID N2 SÍTIO SEQUÊNCIA % DE SEQ ID N2 ALVO ALVO INIB. 147831 3'UTR 3 13921 CTGCCTACTGCAAGGCTGGC 0 68 147832 3'UTR 3 13991 AGAGACCTTCCGAGCCCTGG N.D. 69 147833 3'UTR 3 14101 ATGATACACAATAAAGACTC 25 70

Como mostrado na Tabela 1, as SEQ ID N°: 1—1 OO \—1 19, 21, 23, 25, 27, 31, 38, 43, 46, 51, 52 , 53, 55, 57, 62, 63 e 66 demonstraram, pelo menos, 30 i% de inibição da expressão de apolipoproteína B humana neste ensaio e são, por conseguinte, preferidas. Os sítios alvo a que estas sequências preferidas são complementares são aqui referidos como "sítios activos" e são, por conseguinte, sítios preferidos para direccionamento por compostos da presente divulgação. Dado que a apolipoproteína B existe em duas formas em mamíferos (ApoB-48 e ApoB-100) que são colineares na terminação amino, os oligonucleótidos anti-sentido visando os nucleótidos 1-6530 hibridam-se a ambas as formas, enquanto aqueles visando os nucleótidos 6531-14121 são específicos para a forma longa de apolipoproteína B.

Exemplo 16

Inibição anti-sentido da expressão de apolipoproteína B humana por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-MOE e uma lacuna desoxi - Estudo de Resposta de Dose

Um subconjunto dos oligonucleótidos anti-sentido no Exemplo 15 foi ainda investigado em estudos de dose-resposta. As doses de tratamento foram 50, 150 e 250 nM. Os compostos foram 139 seu efeito nos analisados para o seu efeito nos níveis de ARNm de apolipoproteína B humana em células HepG2 por PCR quantitativo em tempo real, como aqui descrito noutros exemplos. Os dados são médias de duas experiências e são mostrados na Tabela 2.

Tabela 2

Inibição dos níveis de ARNm de apolipoproteína B humana por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-MOE e uma lacuna desoxi

Percentagem de Inibição N2 ISIS 50 nM 150 nM 250 nM 147788 54 63 72 147806 23 45 28 147816 25 81 65 147820 10 0 73

Exemplo 17

Inibição anti-sentido da expressão de apolipoproteína B de murganho por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-MOE e uma lacuna desoxi

Foi concebida uma série de oligonucleótidos para visar diferentes regiões do ARN de apolipoproteína B de murganho, utilizando sequência publicada (acesso GenBank número M35186, aqui incorporado como SEQ ID N° : 10) . Os oligonucleótidos são mostrados na Tabela 3. "Sítio alvo" indica o primeiro número de nucleótido (mais em 5') na sequência alvo particular a que o oligonucleótido se liga. Todos os compostos na Tabela 3 são 140 de 20 nucleótidos em oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros"), comprimento, compostos por uma região de "lacuna" central consistindo de dez 2'-desoxinucleótidos, a qual está flanqueada em ambos os lados (direcções 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por nucleótidos de 2'-metoxietilo (2'-MOE). As ligações internucleósido (esqueleto) são fosforotioato (P=S) em todo o oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas. Os compostos foram analisados para o seu efeito nos níveis de ARNm de apolipoproteína B de murganho em hepatócitos primários de murganho por PCR quantitativo em tempo real, como aqui descrito noutros exemplos. Os hepatócitos primários de murganho foram tratados com 150 nM dos compostos na Tabela 3. Os dados são médias de duas experiências. Se presente, "N.D." indica "não determinado".

Tabela 3

Inibição dos níveis oligonucleótidos de ARNm de apolipoproteína B de murganho por de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-MOE e uma lacuna desoxi N2 ISIS REGIÃO SEQ ID N2 ALVO SÍTIO ALVO SEQUÊNCIA % DE INIB. SEQ ID N2 147475 Codificante 10 13 ATTGTATGTGAGAGGTGAGG 79 71 147476 Codificante 10 66 GAGGAGATTGGATCTTAAGG 13 72 147477 Codificante 10 171 CTTCAAATTGGGACTCTCCT N.D 73 147478 Codificante 10 211 TCCAGGAATTGAGCTTGTGC 78 74 147479 Codificante 10 238 TTCAGGACTGGAGGATGAGG N.D 75 147480 Codificante 10 291 TCTCACCCTCATGCTCCATT 54 76 147481 Codificante 10 421 TGACTGTCAAGGGTGAGCTG 24 77 147482 Codificante 10 461 GTCCAGCCTAGGAACACTCA 59 78 147483 Codificante 10 531 ATGTCAATGCCACATGTCCA N.D 79 141 (continuação) N2 ISIS REGIÃO SEQ ID N2 ALVO SÍTIO ALVO SEQUÊNCIA % DE INIB. SEQ ID N2 147484 Codificante 10 581 TTCATCCGAGAAGTTGGGAC 49 80 147485 Codificante 10 601 ATTTGGGACGAATGTATGCC 64 81 147486 Codificante 10 711 AGTT GAGGAAGCCAGATT CA N.D 82 147487 Codificante 10 964 TTCCCAGTCAGCTTTAGTGG 73 83 147488 Codificante 10 1023 AGCTTGCTTGTTGGGCACGG 72 84 147489 Codificante 10 1111 CCTATACTGGCTTCTATGTT 5 85 147490 Codificante 10 1191 TGAACTCCGTGTAAGGCAAG N.D 86 147491 Codificante 10 1216 GAGAAATCCTTCAGTAAGGG 71 87 147492 Codificante 10 1323 CAATGGAATGCTTGTCACTG 68 88 147493 Codificante 10 1441 GCTTCATTATAGGAGGTGGT 41 89 147494 Codificante 10 1531 ACAACTGGGATAGTGTAGCC 84 90 147495 Codificante 10 1631 GTTAGGACCAGGGATTGTGA 0 91 147496 Codificante 10 1691 ACCATGGAAAACTGGCAACT 19 92 147497 Codificante 10 1721 TGGGAGGAAAAACTTGAATA N.D 93 147498 Codificante 10 1861 TGGGCAACGATATCTGATTG 0 94 147499 Codificante 10 1901 CT GCAGGGCGT CAGT GACAA 29 95 147500 Codificante 10 1932 GCATCAGACGTGATGTTCCC N.D 96 147501 Codificante 10 2021 CTTGGTTAAACTAATGGTGC 18 97 147502 Codificante 10 2071 ATGGGAGCATGGAGGTTGGC 16 98 147503 Codificante 10 2141 AATGGATGATGAAACAGTGG 26 99 147504 Codificante 10 2201 ATCAATGCCTCCTGTTGCAG N.D 100 147505 Codificante 10 2231 GGAAGTGAGACTTTCTAAGC 76 101 147506 Codificante 10 2281 AGGAAGGAACTCTTGATATT 58 102 147507 Codificante 10 2321 ATTGGCTTCATTGGCAACAC 81 103 147759 Codificante 10 1 AGGTGAGGAAGTTGGAATTC 19 104 147760 Codificante 10 121 TTGTTCCCTGAAGTTGTTAC N.D 105 147761 Codificante 10 251 GTTCATGGATTCCTTCAGGA 45 106 147762 Codificante 10 281 ATGCTCCATTCTCACATGCT 46 107 147763 Codificante 10 338 TGCGACTGTGTCTGATTTCC 34 108 147764 Codificante 10 541 GTCCCTGAAGATGTCAATGC 97 109 147765 Codificante 10 561 AGGCCCAGTTCCATGACCCT 59 110 142 (continuação)

Na ISIS REGIÃO SEQ ID Na ALVO SÍTIO ALVO SEQUÊNCIA % DE INIB. SEQ ID Na 147766 Codificante 10 761 GGAGCCCACGTGCTGAGATT 59 111 147767 Codificante 10 801 CGTCCTTGAGCAGTGCCCGA 5 112 147768 Codificante 10 1224 CCCATATGGAGAAATCCTTC 24 113 147769 Codificante 10 1581 CATGCCTGGAAGCCAGTGTC 89 114 147770 Codificante 10 1741 GTGTTGAATCCCTTGAAATC 67 115 147771 Codificante 10 1781 GGTAAAGTTGCCCATGGCTG 68 116 147772 Codificante 10 1841 GTTATAAAGTCCAGCATTGG 78 117 147773 Codificante 10 1931 CATCAGACGTGATGTTCCCT 85 118 147774 Codificante 10 1956 TGGCTAGTTTCAATCCCCTT 84 119 147775 Codificante 10 2002 CTGTCATGACTGCCCTTTAC 52 120 147776 Codificante 10 2091 GCTTGAAGTTCATTGAGAAT 92 121 147777 Codificante 10 2291 TTCCTGAGAAAGGAAGGAAC N.D 122 147778 Codificante 10 2331 TCAGATATACATTGGCTTCA 14 123

Como mostrado na Tabela 3, as SEQ ID N° 71, 74, 76, 78, 81, 83, 84, 87, 88, 90, 101, 102, 103, 109, 111, 111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 e 121 demonstraram, pelo menos, 50% de inibição de expressão de apolipoproteína B de murganho neste ensaio e são, por conseguinte, preferidas. Os sítios alvo a que estas sequências preferidas são complementares são aqui referidos como "sítios activos" e são, por conseguinte, sítios preferidos para direccionamento por compostos da presente divulgação. 143

Exemplo 18

Inibição anti-sentido da expressão de apolipoproteina B de murganho por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-M0E e uma lacuna desoxi - Estudo Dose Resposta

Um subconjunto dos oligonucleótidos anti-sentido no Exemplo 17 foi ainda investigado em estudos de dose-resposta. As doses de tratamento foram 50, 150 e 300 nM. Os compostos foram analisados para o seu efeito nos níveis de ARNm de apolipoproteina B de murganho em células de hepatócitos primários por PCR quantitativo em tempo real, como aqui descrito noutros exemplos. Os dados são médias de duas experiências e são mostrados na Tabela 4.

Tabela 4

Inibição dos níveis de ARNm de apolipoproteina B de murganho por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-M0E e uma lacuna desoxi

Percentagem de Inibição Na ISIS 50 nM 150 nM 300 nM 147483 56 88 89 147764 48 84 90 147769 3 14 28 147776 0 17 44 144

Exemplo 19

Análise de transferência de Western dos niveis de proteína de apolipoproteína B A análise de transferência de Western (análise de imunotransferência) foi efectuada utilizando métodos padrão. As células foram recolhidas 16-20 h após tratamento de oligonucleótido, lavadas uma vez com PBS, suspensas em tampão de Laemmli (100 pL/poço), fervidas durante 5 minutos e carregadas num gel de SDS-PAGE a 16%. Os géis foram corridos durante 1,5 horas a 150 V e transferidos para membrana para transferência de Western. Foi utilizado anticorpo primário apropriado dirigido para apolipoproteína B, com um anticorpo secundário marcado radioactivamente ou marcado fluorescentemente, dirigido contra a espécie de anticorpo primário. As bandas foram visualizadas utilizando um PHOSPHORIMAGER™ (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA) ou o sistema de detecção quimioluminescente ECL+ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

Exemplo 20

Efeitos da inibição anti-sentido de apolipoproteína B (ISIS 147764) em murganhos C57BL/6: Animais magros vs. animais Alimentados com Elevado Teor de Gordura.

Os murganhos C57BL/6, uma estirpe referida como sendo susceptível à formação de placa aterosclerótica induzida por hiperlipidemia, foram utilizados nos seguintes estudos para avaliar oligonucleótidos anti-sentido como potenciais compostos 145 de diminuição de lípido em murganhos magros versus murganhos alimentados com elevado teor de gordura.

Os murganhos C57BL/6 macho foram divididos em dois grupos correspondentes; (1) animais de controlo de tipo selvagem (animais magros) e (2) animais recebendo uma dieta de elevado teor de gordura (60% de kcal de gordura). Os animais de controlo receberam tratamento de solução salina e foram mantidos numa dieta de roedor normal. Após jejum de um dia para o outro, os murganhos de cada grupo foram doseados intraperitonealmente de três em três dias com solução salina ou 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID N°: 109), durante seis semanas. No terminal do estudo e quarenta e oito horas após as injecções finais, os animais foram sacrificados e avaliados para níveis de ARNm alvo no fígado, níveis de colesterol e triglicéridos, níveis de enzimas hepáticas e níveis séricos de glucose.

Os resultados dos estudos comparativos são mostrados na Tabela 5. 146

Tabela 5

Efeitos de tratamento de ISIS 147764 nos níveis de ARNm de apolipoproteína B, colesterol, lípido, triglicérido, enzima hepática e glucose em murganhos magros e de elevado teor de gordura.

Grupo de Percentagem de Alteração Tratamento Lipoproteínas Enzimas Hepáticas ARNm COL VLDL LDL HDL TRIG AST ALT GLOC Controlo de magros -73 -63 Sem alteração -64 -44 -3 4 Ligeira diminuição Sem alteração Sem alteração Grupo de Elevado Teor de Gordura -87 -6 7 Sem alteração -87 -65 Sem alteração Ligeira diminuição Ligeiro aumento -28 A partir destes dados, é evidente que o tratamento com ISIS 147764 diminuiu o colesterol, assim como as lipoproteínas LDL e HDL e glucose sérica em murganhos magros e de elevado teor de gordura e que os efeitos demonstrados são, de facto, devidos à inibição da expressão de apolipoproteína B, como suportado pela diminuição nos níveis de ARNm. Não foram observadas alterações significativas nos níveis de enzimas hepáticas, indicando que o oligonucleótido anti-sentido não foi tóxico para qualquer grupo de tratamento. 147

Exemplo 21

Efeitos da inibição anti-sentido de apolipoproteina B (ISIS 147764) em murganhos alimentados com elevado teor de gordura; Estudo de Decurso Temporal de 6 Semanas

Foi realizado um estudo de decurso temporal de 6 semanas para investigar posteriormente os efeitos de ISIS 147764 no metabolismo de lípido e glucose em murganhos alimentados com elevado teor de gordura.

Murganhos C57BL/6 macho (n=8) recebendo uma dieta de elevado teor de gordura (60% de kcal de gordura) foram avaliados ao longo do curso de 6 semanas para os efeitos de tratamento com o oligonucleótido anti-sentido, ISIS 147764. Os animais de controlo receberam tratamento de solução salina (50 mg/kg). Um subconjunto de animais recebeu uma dose oral diária (20 mg/kg) de atorvastatina cálcica (Lipitor®, Pfizer Inc.). Todos os murganhos, excepto animais tratados com atorvastatina, foram doseados intraperitonealmente, de três em três dias (duas vezes por semana), após jejum de um dia para o outro, com 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID N°: 109) ou solução salina (50 mg/kg), durante seis semanas. O colesterol e lipoproteínas séricos foram analisados nos intervalos de tempo intermédios de 0, 2 e 6 semanas. No final do estudo, os animais foram sacrificados 48 horas após as injecções finais e avaliados para níveis de ARNm alvo no fígado, colesterol, lipoproteína, triglicérido, enzima hepática (AST e ALT) e níveis de glucose séricos, assim como pesos de corpo, fígado, baço e corpo adiposo. 148

Exemplo 22

Efeitos da inibição anti-sentido de apolipoproteina B (ISIS 147764) em murganhos alimentados com elevado teor de gordura - expressão de ARNm no figado

Murganhos C57BL/6 macho (n=8) recebendo uma dieta de elevado teor de gordura (60% de kcal de gordura) foram avaliados ao longo do curso de 6 semanas para os efeitos de ISIS 147764 na expressão de ARNm. Os animais de controlo receberam tratamento de solução salina (50 mg/kg). Os murganhos foram doseados intraperitonealmente, de três em três dias (duas vezes por semana) , após jejum de um dia para o outro, com 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID N° : 109) ou solução salina (50 mg/kg), durante seis semanas. No final do estudo, os animais foram sacrificados 48 horas após as injecções finais e avaliados para níveis de ARNm alvo no fígado. O ISIS 147764 mostrou um efeito de dose-resposta, reduzindo os níveis de ARNm em 15, 75 e 88%, a doses de 5, 25 e 50 mg/kg, respectivamente.

As amostras de proteína hepática recolhidas no fim do período de tratamento foram submetidas a análise de imunotransferência, utilizando um anticorpo dirigido para proteína de apolipoproteina B de murganho (Gladstone Institute, São Francisco, CA). Estes dados demonstram que o tratamento com ISIS 147764 diminui a expressão de proteína de apolipoproteina B no fígado, num modo dependente de dose, além da redução dos níveis de ARNm. 149

Exemplo 23

Efeitos da inibição anti-sentido de apolipoproteina B (ISIS 147764) nos níveis séricos de colesterol e triglicéridos

Murganhos C57BL/6 macho (n=8) recebendo uma dieta de elevado teor de gordura (60% de kcal de gordura) foram avaliados ao longo do curso de 6 semanas para os efeitos de ISIS 147764 nos níveis séricos de colesterol e triglicéridos. Os animais de controlo receberam tratamento de solução salina (50 mg/kg). Os murganhos foram doseados intraperitonealmente, de três em três dias (duas vezes por semana), após jejum de um dia para o outro, com 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID N° : 109) ou solução salina (50 mg/kg), durante seis semanas.

Os níveis séricos de colesterol foram medidos às 0, 2 e 6 semanas e estes dados são mostrados na Tabela 6. Os valores na tabela são expressos como percentagem de inibição e estão normalizados para o controlo de solução salina.

Além do colesterol sérico, no final do estudo, os animais foram sacrificados 48 horas após as injecções finais e avaliados para níveis de triglicéridos.

Os murganhos tratados com ISIS 147764 mostraram uma redução no colesterol sérico (240 mg/dL para animais de controlo e 225, 125 e 110 mg/dL para doses de 5, 25 e 50 mg/kg, respectivamente) e triglicéridos (115 mg/dL para animais de controlo e 125, 150 e 85 mg/dL para doses de 5, 25, e 50 mg/kg, respectivamente) para níveis normais no final do estudo. Estes dados também foram comparados aos efeitos de atorvastatina cálcica numa dose oral 150 de 20 mg/kg que mostrou apenas uma diminuição mínima no colesterol sérico de 20 por cento no final do estudo.

Tabela 6

Percentagem de Inibição dos níveis de colesterol de apolipoproteína B de murganho por ISIS 147764

Percentagem de Inibição tempo Solução Salina 5 mg/kg 25 mg/kg 50 mg/kg 0 semanas 0 0 0 0 2 semanas 0 5 12 20 6 semanas 0 10 45 55

Exemplo 24

Efeitos da inibição anti-sentido de apolipoproteína B (ISIS 147764) nos níveis de lipoproteína

Murganhos C57BL/6 macho (n=8) recebendo uma dieta de elevado teor de gordura (60% de kcal de gordura) foram avaliados ao longo do curso de 6 semanas para os efeitos de ISIS 147764 nos níveis de lipoproteína (VLDL, LDL e HDL) . Os animais de controlo receberam tratamento de solução salina (50 mg/kg). Os murganhos foram doseados intraperitonealmente, de três em três dias (duas vezes por semana), após jejum de um dia para o outro, com 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID N°: 109) ou solução salina (50 mg/kg), durante seis semanas. 151

Os níveis de lipoproteína foram medidos às 0, 2 e 6 semanas e estes dados são mostrados na Tabela 7. Os valores na tabela são expressos como percentagem de inibição e estão normalizados para o controlo de solução salina. Os valores negativos indicam um aumento observado nos níveis de lipoproteína.

Estes dados também foram comparados aos efeitos de atorvastatina cálcica, a uma dose oral diária de 20 mg/kg, às 0, 2 e 6 semanas.

Estes dados demonstram que a uma dose de 50 mg/kg, o ISIS 147764 é capaz de diminuir todas as categorias de lipoproteínas séricas investigadas com maior extensão do que a atorvastatina.

Tabela 7

Percentagem de Inibição dos níveis de lipoproteína de apolipoproteína B de murganho por ISIS 147764, em comparação com atorvastatina

Percentagem de Inibição Dose Lipoproteína Tempo (semanas) Solução Salina 5 mg/kg 25 mg/kg 50 mg/kg atorvastatina (20 mg/kg) VLDL 0 0 0 0 0 0 2 0 25 30 40 15 6 0 10 -30 15 -5 LDL 0 0 0 0 0 0 2 0 -30 10 40 10 6 0 -10 55 90 -10 HDL 0 0 0 0 0 0 2 0 5 10 10 15 6 0 10 45 50 20 152

Exemplo 25

Efeitos da inibição anti-sentido de apolipoproteina B (ISIS 147764) nos niveis séricos de AST e ALT

Murganhos C57BL/6 macho (n=8) recebendo uma dieta de elevado teor de gordura (60% de kcal de gordura) foram avaliados ao longo do curso de 6 semanas para os efeitos de ISIS 147764 nos niveis de enzimas hepáticas (AST e ALT) . Niveis aumentados das enzimas hepáticas ALT e AST indicam toxicidade e lesão hepática. Os animais de controlo receberam tratamento de solução salina (50 mg/kg). Os murganhos foram doseados intraperitonealmente, de três em três dias (duas vezes por semana) , após jejum de um dia para o outro, com 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID N°: 109) ou solução salina (50 mg/kg), durante seis semanas. Os niveis de AST e ALT foram medidos em 6 semanas.

Os murganhos tratados com ISIS 147764 não mostraram alteração significativa nos níveis de AST ao longo da duração do estudo, em comparação com controlos de solução salina (105, 70 e 80 IU/L, para doses de 5, 25 e 50 mg/kg, respectivamente, em comparação com 65 IU/L para controlo de solução salina) . Os murganhos tratados com atorvastatina, a uma dose oral diária de 20 mg/kg, tinham niveis de AST de 85 IU/L.

Os niveis de ALT foram aumentados por todos os tratamentos com ISIS 147764 ao longo da duração do estudo, em comparação com controlos de solução salina (50, 70 e 100 IU/L, para doses de 5, 25 e 50 mg/kg, respectivamente, em comparação com 25 IU/L para controlo de solução salina) . Os murganhos tratados com 153 atorvastatina, a uma dose oral diária de 20 mg/kg, tinham niveis de AST de 40 IU/L.

Exemplo 26

Efeitos da inibição anti-sentido de apolipoproteina B (ISIS 147764) nos niveis séricos de glucose

Murganhos C57BL/6 macho (n=8) recebendo uma dieta de elevado teor de gordura (gordura de 60% de kcal) foram avaliados ao longo do curso de 6 semanas para os efeitos de ISIS 147764 nos niveis séricos de glucose. Os animais de controlo receberam tratamento de solução salina (50 mg/kg). Os murganhos foram doseados intraperitonealmente, de três em três dias (duas vezes por semana) , após jejum de um dia para o outro, com 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID N°: 109) ou solução salina (50 mg/kg), durante seis semanas.

No final do estudo, os animais foram sacrificados 48 horas após as injecções finais e avaliados para níveis séricos de glucose. O ISIS 147764 mostrou um efeito de dose-resposta, reduzindo níveis séricos de glucose para 225, 190 e 180 mg/dL, a doses de 5, 25 e 50 mg/kg, respectivamente, em comparação com o controlo de solução salina de 300 mg/dL. Os murganhos tratados com atorvastatina, a uma dose oral diária de 20 mg/kg, tinham níveis séricos de glucose de 215 mg/dL. Estes dados demonstram que o ISIS 147764 é capaz de reduzir os níveis séricos de glucose em murganhos alimentados com elevado teor de gordura. 154

Exemplo 27

Efeitos da inibição anti-sentido de apolipoproteina B (ISIS 147764) no peso de corpo, baço, fígado e corpo adiposo

Murganhos C57BL/6 macho (n=8) recebendo uma dieta de elevado teor de gordura (60% de kcal de gordura) foram avaliados ao longo do curso de 6 semanas para os efeitos de ISIS 147764 no peso de corpo, baço, fígado e corpo adiposo. Os animais de controlo receberam tratamento de solução salina (50 mg/kg). Os murganhos foram doseados intraperitonealmente, de três em três dias (duas vezes por semana), após jejum de um dia para o outro, com 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID N° : 109) ou solução salina (50 mg/kg), durante seis semanas.

No final do estudo, os animais foram sacrificados 48 horas após as injecções finais e os pesos de corpo, baço, fígado e corpo adiposo foram medidos. Estes dados são mostrados na Tabela 8. Os valores são expressos como percentagem de alteração no peso corporal ou peso de órgão, em comparação com animais de controlo tratados com solução salina. Os dados de murganhos tratados com atorvastatina, a uma dose diária de 20 mg/kg, também são mostrados na tabela. Os valores negativos indicavam uma diminuição no peso. 155

Tabela 8

Efeitos da inibição anti-sentido de apolipoproteína B de murganho no peso de corpo e órgão

Percentagem de Alteração Dose Atorvastatina Tecido 5 mg/kg 25 mg/kg 50 mg/kg 20 mg/kg Peso Corporal Total 5 5 -4 1 Baço 10 10 46 10 Fígado 18 70 80 15 Gordura 10 6 -47 7

Estes dados mostram uma diminuição na gordura ao longo da gama de dosagens de ISIS 147764, contrabalançada por um aumento no peso de baço e figado com dose aumentada, para proporcionar uma diminuição global no peso corporal total.

Exemplo 28

Efeitos da inibição anti-sentido de apolipoproteína B (ISIS 147764) em murganhos B6.129P-ApoetmlUnc nocaute: Animais magros vs. animais Alimentados com Elevado Teor de Gordura.

Murganhos B6.12 9P-ApoEtmlUnc nocaute (aqui referidos como murganhos nocaute ApoE), obtidos do The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) , são homozigóticos para a mutação ApoetmlUnc e mostram um marcado aumento nos níveis totais plasmáticos de colesterol que não são afectados pela idade ou sexo. Estes animais 156 apresentam-se com faixas adiposas na aorta proximal aos 3 meses de idade. Estas lesões aumentam com a idade e progridem para lesões com menos lipido, mas células mais elongadas, típicas de um estádio mais avançado de lesão pré-aterosclerótica.

Nestes murganhos, a mutação reside no gene da apolipoproteína E (ApoE). 0 papel principal da proteína de ApoE é transportar colesterol e triglicéridos através do corpo. Esta estabiliza a estrutura da lipoproteína, liga-se ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDLR) e proteínas relacionadas e está presente numa subclasse de HDL, proporcionando-lhe a capacidade de se ligar a LDLR. A ApoE é expressa mais abundantemente no fígado e cérebro. Murganhos nocaute B6.129P-ApoetmlUnc fêmea (murganhos nocaute ApoE) foram utilizados nos seguintes estudos para avaliar oligonucleótidos anti-sentido como potenciais compostos de diminuição de lipido.

Os murganhos nocaute ApoE fêmea variavam em idade 5 a 7 semanas e foram colocados numa dieta normal, durante 2 semanas, antes da iniciação do estudo. Os murganhos nocaute ApoE foram, depois, alimentados ad libitum com uma dieta de 60% de gordura, com colesterol adicionado a 0,15% para induzir dislipidemia e obesidade. Os animais de controlo foram mantidos numa dieta de elevado teor de gordura, sem colesterol adicionado. Após jejum de um dia para o outro, os murganhos de cada grupo foram doseados intraperitonealmente, de três em três dias, com solução salina, 50 mg/kg de um oligonucleótido anti-sentido de controlo (ISIS 29837; TCGATCTCCTTTTATGCCCG; SEQ ID N° 124) ou 5, 25 ou 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID N°: 109), durante seis semanas. 157 0 oligonucleótido de controlo é um oligonucleótido quimérico ("gapmeros") , de 20 nucleótidos em comprimento, composto por uma região de "lacuna" central consistindo de dez 2'-desoxinucleótidos, a qual está flanqueada em ambos os lados (direcções 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por nucleótidos de 2'-metoxietilo (2'-MOE). As ligações internucleósido (esqueleto) são fosforotioato (P=S) em todo o oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas.

No final do estudo e quarenta e oito horas após as injecções finais, os animais foram sacrificados e avaliados para níveis de ARNm alvo no fígado por métodos de RT-PCR, verificados por análise de transferência de Northern, níveis de glucose, níveis de colesterol e lipídicos por métodos de separação de HPLC e níveis de triglicéridos e enzimas hepáticas (realizados pela LabCorp Preclinical Services; San Diego, CA) . Os dados de murganhos nocaute ApoE tratados com atorvastatina, a uma dose diária de 20 mg/kg, também são mostrados na tabela para comparação.

Os resultados dos estudos comparativos são mostrados na Tabela 9. Os dados estão normalizados para controlos de solução salina. 158

Tabela 9

Efeitos de tratamento de ISIS 147764 nos níveis de ARNm de apolipoproteína B, colesterol, glucose, lípido, triglicérido e enzima hepática em murganhos nocaute ApoE.

Percentagem de Inibição Dose Controlo 5 mg/kg 25 mg/kg 50 mg/kg atorvastatina (20 mg/kg) ARNm 0 2 42 70 10 Glucose Níveis de Glucose (mg/dL) 225 195 209 191 162 Níveis de Colesterol (mg/dL) Colesterol 1750 1630 1750 1490 938 Níveis de Lipoproteína (mg/dL) Lipoproteína HDL 51 49 62 61 42 LDL 525 475 500 325 250 VLDL 1190 1111 1194 1113 653 Níveis de Enzima Hepática (IU/L) Enzimas Hepáticas AST 55 50 60 85 75 ALT 56 48 59 87 76 A partir destes dados é evidente que o tratamento com ISIS 147764 diminuiu a glucose e colesterol, assim como todas as lipoproteínas investigadas (HDL, LDL e VLDL) em murganhos nocaute ApoE. Além disso, estas diminuições correlacionavam-se com uma diminuição nos níveis de proteína e ARN de apolipoproteína B, demonstrando uma mecanismo de acção anti-sentido. Não foram observadas alterações significativas nos níveis de enzimas hepáticas, indicando que o oligonucleótido anti-sentido não foi tóxico para qualquer grupo de tratamento. 159

Exemplo 29

Inibição anti-sentido da expressão de apolipoproteina B humana por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-M0E e uma lacuna desoxi: Oligonucleótidos Adicionais

Foi concebida outra série de oligonucleótidos para visar diferentes regiões do ARN de apolipoproteina B humana, utilizando sequência publicada (acesso GenBank número NM_000384.1, aqui incorporado como SEQ ID N°: 3). Os oligonucleótidos são mostrados na Tabela 10. "Sitio alvo" indica o primeiro número de nucleótido (mais em 5') na sequência alvo particular a que o oligonucleótido se liga. Todos os compostos na Tabela 10 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros"), de 20 nucleótidos em comprimento, compostos por uma região de "lacuna" central consistindo de dez 2'-desoxinucleótidos, a qual está flanqueada em ambos os lados (direcções 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por nucleótidos de 2'-metoxietilo (2'-MOE). As ligações internucleósido (esqueleto) são fosforotioato (P=S) em todo o oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas. Os compostos foram analisados para o seu efeito nos níveis de ARNm de apolipoproteina B humana em células HepG2 por PCR quantitativo em tempo real, como aqui descrito noutros exemplos. Os dados são médias de duas experiências, nas quais as células HepG2 foram tratadas com 150 nM dos compostos na Tabela 10. Se presente, "N.D." indica "não determinado". 160

Tabela 10

Inibição dos níveis de ARNm de apolipoproteína B humana por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-MOE e uma lacuna desoxi N2 ISIS REGIÃO SEQ ID N2 ALVO SÍTIO ALVO SEQUÊNCIA % DE INIB. SEQ ID N2 270985 5'UTR 3 199 TTCCTCTTCGGCCCTGGCGC 75 124 270986 codif icante 3 299 CTCCACTGGAACTCTCAGCC 0 125 270987 junção exão:exão 3 359 CCTCCAGCTCAACCTTGCAG 0 126 270988 codif icante 3 429 GGGTTGAAGCCATACACCTC 6 127 270989 junção exão:exão 3 509 CCAGCTTGAGCTCATACCTG 64 128 270990 codif icante 3 584 CCCTCTTGATGTTCAGGATG 42 129 270991 codif icante 3 669 GAGCAGTTTCCATACACGGT 21 130 270992 codif icante 3 699 CCCTTCCTCGTCTTGACGGT 8 131 270993 codif icante 3 756 TTGAAGCGATCACACTGCCC 69 132 270994 codif icante 3 799 GCCTTTGATGAGAGCAAGTG 51 133 270995 codif icante 3 869 TCCTCTTAGCGTCCAGTGTG 40 134 270996 codif icante 3 1179 CCTCTCAGCTCAGTAACCAG 0 135 270997 codif icante 3 1279 GCACTGAGGCTGTCCACACT 24 136 270998 codif icante 3 1419 CGCTGATCCCTCGCCATGTT 1 137 270999 codif icante 3 1459 GTTGACCGCGTGGCTCAGCG 76 138 271000 codif icante 3 1499 GCAGCTCCTGGGTCCCTGTA 22 139 271001 codif icante 3 1859 CCCATGGTAGAATTTGGACA 53 140 271002 junção exão:exão 3 2179 AATCTCGATGAGGTCAGCTG 48 141 271003 codif icante 3 2299 GACACCATCAGGAACTTGAC 46 142 271004 codif icante 3 2459 GCTCCTCTCCCAAGATGCGG 10 143 271005 codif icante 3 2518 GGCACCCATCAGAAGCAGCT 32 144 271006 codif icante 3 2789 AGTCCGGAATGATGATGCCC 42 145 271007 codif icante 3 2919 CTGAGCAGCTTGACTGGTCT 26 146 271008 codif icante 3 3100 CCCGGTCAGCGGATAGTAGG 37 147 271010 junção 3 3449 TGTCACAACTTAGGTGGCCC 57 148 161 (continuação) , Λ N2 ISIS REGIÃO SEQ ID N2 SITIO SEQUENCIA % DE SEQ ID N2 ALVO ALVO INIB. exão:exão 271011 codif icante 3 3919 GTCTGGCAATCCCATGTTCT 51 149 271012 codif icante 3 4089 CCCACAGACTTGAAGTGGAG 55 150 271013 codif icante 3 4579 GAACTGCCCATCAATCTTGA 19 151 271014 codif icante 3 5146 CCCAGAGAGGCCAAGCTCTG 54 152 271015 codif icante 3 5189 TGTGTTCCCTGAAGCGGCCA 43 153 271016 codif icante 3 5269 ACCCAGAATCATGGCCTGAT 19 154 271017 codif icante 3 6049 GGTGCCTGTCTGCTCAGCTG 30 155 271018 codif icante 3 6520 ATGTGAAACTTGTCTCTCCC 44 156 271019 codif icante 3 6639 TATGTCTGCAGTTGAGATAG 15 157 271020 codif icante 3 6859 TTGAATCCAGGATGCAGTAC 35 158 271021 codif icante 3 7459 GAGTCTCTGAGTCACCTCAC 38 159 271022 codif icante 3 7819 GATAGAATATTGCTCTGCAA 100 160 271023 codif icante 3 7861 CCCTTGCTCTACCAATGCTT 44 161 271025 codif icante 3 8449 TCCATTCCCTATGTCAGCAT 16 162 271026 codif icante 3 8589 GACTCCTTCAGAGCCAGCGG 39 163 271027 codif icante 3 8629 CCCATGCTCCGTTCTCAGGT 26 164 271028 codif icante 3 8829 CGCAGGTCAGCCTGACTAGA 98 165 271030 codif icante 3 9119 CAGTTAGAACACTGTGGCCC 52 166 271031 codif icante 3 10159 CAGTGTGATGACACTTGATT 49 167 271032 codif icante 3 10301 CTGTGGCTAACTTCAATCCC 22 168 271033 codif icante 3 10349 CAGTACTGTTATGACTACCC 34 169 271034 codif icante 3 10699 CACTGAAGACCGTGTGCTCT 35 170 271035 codif icante 3 10811 TCGTACTGTGCTCCCAGAGG 23 171 271036 codif icante 3 10839 AAGAGGCCCTCTAGCTGTAA 95 172 271037 codif icante 3 11039 AAGACCCAGAATGAATCCGG 23 173 271038 codif icante 3 11779 GTCTACCTCAAAGCGTGCAG 29 174 271039 codif icante 3 11939 TAGAGGCTAACGTACCATCT 4 175 271041 codif icante 3 12149 CCATATCCATGCCCACGGTG 37 176 271042 codif icante 3 12265 AGTTTCCTCATCAGATTCCC 57 177 271043 codif icante 3 12380 CCCAGTGGTACTTGTTGACA 68 178 162 (continuação) N2 ISIS REGIÃO SEQ ID N2 ALVO SÍTIO ALVO SEQUÊNCIA % DE INIB. SEQ ID N2 271044 codif icante 3 12526 CCCAGTGGTGCCACTGGCTG 22 179 271045 codif icante 3 12579 GTCAACAGTTCCTGGTACAG 19 180 271046 codif icante 3 12749 CCCTAGTGTATATCCCAGGT 61 181 271048 codif icante 3 13009 CTGAAGATTACGTAGCACCT 7 182 271049 codif icante 3 13299 GTCCAGCCAACTATACTTGG 54 183 271050 codif icante 3 13779 CCTGGAGCAAGCTTCATGTA 42 184 281586 junção exão:exão 3 229 TGGACAGACCAGGCTGACAT 80 185 281587 codif icante 3 269 ATGTGTACTTCCGGAGGTGC 77 186 281588 codif icante 3 389 TCTTCAGGATGAAGCTGCAG 80 187 281589 codif icante 3 449 TCAGCAAGGCTTTGCCCTCA 90 188 281590 codif icante 3 529 CTGCTTCCCTTCTGGAATGG 84 189 281591 codif icante 3 709 TGCCACATTGCCCTTCCTCG 90 190 281592 codif icante 3 829 GC T GAT CAGAGT T GACAAGG 56 191 281593 codif icante 3 849 TACTGACAGGACTGGCTGCT 93 192 281594 codif icante 3 889 GATGGCTTCTGCCACATGCT 74 193 281595 codif icante 3 1059 GATGTGGATTTGGTGCTCTC 76 194 281596 codif icante 3 1199 TGACTGCTTCATCACTGAGG 77 195 281597 codif icante 3 1349 GGTAGGTGACCACATCTATC 36 196 281598 codif icante 3 1390 TCGCAGCTGCTGTGCTGAGG 70 197 281599 junção exão:exão 3 1589 TTCCAATGACCCGCAGAATC 74 198 281600 codif icante 3 1678 GATCATCAGTGATGGCTTTG 52 199 281601 codif icante 3 1699 AGCCTGGATGGCAGCTTTCT 83 200 281602 codif icante 3 1749 GTCTGAAGAAGAACCTCCTG 84 201 281603 codif icante 3 1829 TATCTGCCTGTGAAGGACTC 82 202 281604 codif icante 3 1919 CTGAGTTCAAGATATTGGCA 78 203 281605 junção exão:exão 3 2189 CTTCCAAGCCAATCTCGATG 82 204 281606 codif icante 3 2649 TGCAACTGTAATCCAGCTCC 86 205 281607 junção exão:exão 3 2729 CCAGTTCAGCCTGCATGTTG 84 206 163 (continuação) N2 ISIS REGIÃO SEQ ID N2 ALVO SÍTIO ALVO SEQUÊNCIA % DE INIB. SEQ ID N2 281608 codif icante 3 2949 GTAGAGACCAAATGTAATGT 62 207 281609 codif icante 3 3059 CGTTGGAGTAAGCGCCTGAG 70 208 281610 junção exão:exão 3 3118 CAGCTCTAATCTGGTGTCCC 69 209 281611 codif icante 3 3189 CTGTCCTCTCTCTGGAGCTC 93 210 281612 codif icante 3 3289 CAAGGT CATACTCTGCCGAT 83 211 281613 codif icante 3 3488 GTATGGAAATAACACCCTTG 70 212 281614 codif icante 3 3579 TAAGCTGTAGCAGATGAGTC 63 213 281615 codif icante 3 4039 TAGATCTCTGGAGGATTTGC 81 214 281616 codif icante 3 4180 GTCTAGAACACCCAGGAGAG 6 6 215 281617 codif icante 3 4299 ACCACAGAGTCAGCCTTCAT 89 216 281618 codif icante 3 4511 AAGCAGACATCTGTGGTCCC 90 217 281619 codif icante 3 4660 CTCTCCATTGAGCCGGCCAG 96 218 281620 codif icante 3 4919 CCTGATATTCAGAACGCAGC 89 219 281621 codif icante 3 5009 CAGTGCCTAAGATGTCAGCA 53 220 281622 codif icante 3 5109 AGCACCAGGAGACTACACTT 88 221 281623 codif icante 3 5212 CCCATCCAGACTGAATTTTG 59 222 281624 codif icante 3 5562 GGTTCTAGCCGTAGTTTCCC 75 223 281625 codif icante 3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 94 224 281626 codif icante 3 5839 AT GT GCATCGAT GGTCAT GG 88 225 281627 codif icante 3 5869 CCAGAGAGCGAGTTTCCCAT 82 226 281628 codif icante 3 5979 CTAGACACGAGATGATGACT 81 227 281629 codif icante 3 6099 TCCAAGTCCTGGCTGTATTC 83 228 281630 codif icante 3 6144 CGTCCAGTAAGCTCCACGCC 82 229 281631 codif icante 3 6249 TCAACGGCATCTCTCATCTC 88 230 281632 codif icante 3 6759 TGATAGTGCTCATCAAGACT 75 231 281633 codif icante 3 6889 GATTCTGATTTGGTACTTAG 73 232 281634 codif icante 3 7149 CTCTCGATTAACTCATGGAC 81 233 281635 codif icante 3 7549 ATACACTGCAACTGTGGCCT 89 234 281636 codif icante 3 7779 GCAAGAGTCCACCAATCAGA 68 235 281637 codif icante 3 7929 AGAGCCTGAAGACTGACTTC 74 236 281638 codif icante 3 8929 TCCCTCATCTGAGAATCTGG 66 237 164 (continuação) N2 ISIS REGIÃO SEQ ID N2 ALVO SÍTIO ALVO SEQUÊNCIA % DE INIB. SEQ ID N2 281640 codif icante 3 10240 CAGT GCAT CAATGACAGATG 87 238 281641 codif icante 3 10619 CCGAACCCTTGACATCTCCT 72 239 281642 codif icante 3 10659 GCCTCACTAGCAATAGTTCC 59 240 281643 codif icante 3 10899 GACATTTGCCATGGAGAGAG 61 241 281644 codif icante 3 11209 CTGTCTCCTACCAATGCTGG 26 242 281645 junção exão:exão 3 11979 TCTGCACTGAAGTCACGGTG 78 243 281646 codif icante 3 12249 TCCCGGACCCTCAACTCAGT 76 244 281648 3 'UTR 3 13958 GCAGGTCCAGTTCATATGTG 81 245 281649 3 'UTR 3 14008 GCCATCCTTCTGAGTTCAGA 76 246 301012 junção exão:exão 3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 87 247 301013 5'UTR 3 3 CCCCGCAGGTCCCGGTGGGA 82 248 301014 5'UTR 3 6 CAGCCCCGCAGGTCCCGGTG 88 249 301015 5'UTR 3 23 CAACCGAGAAGGGCACTCAG 53 250 301016 5'UTR 3 35 CCTCAGCGGCAGCAACCGAG 62 251 301017 5'UTR 3 36 TCCTCAGCGGCAGCAACCGA 47 252 301018 5'UTR 3 37 CTCCTCAGCGGCAGCAACCG 45 253 301019 5'UTR 3 39 GGCTCCTCAGCGGCAGCAAC 70 254 301020 5'UTR 3 43 GGCGGGCTCCTCAGCGGCAG 85 255 301021 5'UTR 3 116 GGTCCATCGCCAGCTGCGGT 89 256 301022 Codão de Partida 3 120 GGCGGGTCCATCGCCAGCTG 69 257 301023 Codão de Paragem 3 13800 TAGAGGATGATAGTAAGTTC 69 258 301024 3 'UTR 3 13824 AAATGAAGATTTCTTTTAAA 5 259 301025 3 'UTR 3 13854 TATGTGAAAGTTCAATTGGA 76 260 301026 3 'UTR 3 13882 ATATAGGCAGTTTGAATTTT 57 261 301027 3 'UTR 3 13903 GCTCACTGTATGGTTTTATC 89 262 301028 3 'UTR 3 13904 GGCTCACTGTATGGTTTTAT 93 263 301029 3 'UTR 3 13908 GGCTGGCTCACTGTATGGTT 90 264 301030 3 'UTR 3 13909 AGGCTGGCTCACTGTATGGT 90 265 165 (continuação) REGIÃO Λ Na ISIS SEQ ID N° SITIO SEQUENCIA % DE SEQ ID N° ALVO ALVO INIB. 301031 3 'UTR 3 13910 AAGGCT GGCT CACT GTAT GG 90 266 301032 3 'UTR 3 13917 CTACTGCAAGGCTGGCTCAC 63 267 301033 3 'UTR 3 13922 ACTGCCTACTGCAAGGCTGG 77 268 301034 3 'UTR 3 13934 TGCTTATAGTCTACTGCCTA 88 269 301035 3 'UTR 3 13937 TTCTGCTTATAGTCTACTGC 82 270 301036 3 'UTR 3 13964 TTTGGTGCAGGTCCAGTTCA 88 271 301037 3 'UTR 3 13968 CAGCTTTGGTGCAGGTCCAG 90 272 301038 3 'UTR 3 13970 GCCAGCTTTGGTGCAGGTCC 86 273 301039 3'UTR 3 13974 TGGTGCCAGCTTTGGTGCAG 73 274 301040 3 'UTR 3 13978 GCCCTGGTGCCAGCTTTGGT 74 275 301041 3 'UTR 3 13997 GAGTTCAGAGACCTTCCGAG 85 276 301042 3'UTR 3 14012 AAATGCCATCCTTCTGAGTT 81 277 301043 3 'UTR 3 14014 AAAAATGCCATCCTTCTGAG 81 278 301044 3 'UTR 3 14049 AAAATAACTCAGATCCTGAT 76 279 301045 3 'UTR 3 14052 AGCAAAATAACTCAGATCCT 90 280 301046 3 'UTR 3 14057 AGTTTAGCAAAATAACTCAG 80 281 301047 3 'UTR 3 14064 TCCCCCAAGTTTAGCAAAAT 56 282 301048 3 'UTR 3 14071 TTCCTCCTCCCCCAAGTTTA 67 283 301217 3 'UTR 3 14087 AGACTCCATTTATTTGTTCC 81 284

Exemplo 30

Inibição anti-sentido de apolipoproteina B - Deslocação do gene

Foi conduzida uma "deslocação do gene", na qual outra série de oligonucleótidos foi concebida para visar as regiões do ARN de apolipoproteina B humana (acesso GenBank número NM_000384.1, aqui incorporado como SEQ ID N°: 3) que estão próximo do sitio alvo da SEQ ID N° 224 ou 247. Os 166 oligonucleótidos são mostrados na Tabela 11. "Sítio alvo" indica o primeiro número de nucleótido (mais em 5') na sequência alvo particular a que o oligonucleótido se liga. Todos os compostos na Tabela 11 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros"), de 20 nucleótidos em comprimento, compostos por uma região de "lacuna" central consistindo de dez 2'-desoxinucleótidos, a qual está flanqueada em ambos os lados (direcções 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por nucleótidos de 2'-metoxietilo (2'-MOE). As ligações internucleósido (esqueleto) são fosforotioato (P=S) em todo o oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas. Os compostos foram analisados para o seu efeito nos níveis de ARNm de apolipoproteína B humana em células HepG2 por PCR quantitativo em tempo real, como aqui descrito noutros exemplos. As doses de tratamento foram 50 nM e 150 nM e estão indicadas na Tabela 11. Os dados são médias de duas experiências. Se presente, "N.D." indica "não determinado".

Tabela 11

Inibição dos níveis de ARNm de apolipoproteína B humana por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-MOE e uma lacuna desoxi - Deslocação do gene N= REGIÃO SEQ ID Na SÍTIO SEQUÊNCIA % DE % DE SEQ ID Na ISIS ALVO ALVO INIB. INIB. 150 nM 50 nM 308589 junção 3 3230 CTTCTGCTTGAGTTACAAAC 94 20 285 exão:exão 308590 junção 3 3232 ACCTTCTGCTTGAGTTACAA 98 26 286 exão:exão 308591 junção 3 3234 GCACCTTCTGCTTGAGTTAC 92 76 287 exão:exão 167 (continuação) , Λ N2 REGIÃO SEQ ID N2 SITIO SEQUENCIA % DE % DE SEQ ID N2 ISIS ALVO ALVO INIB. INIB. 150 nM 50 nM 308592 junção 3 3236 TCGCACCTTCTGCTTGAGTT 96 49 288 exão:exão 308593 junção 3 3238 CTTCGCACCTTCTGCTTGAG 80 41 289 exão:exão 308594 junção 3 3240 TGCTTCGCACCTTCTGCTTG 88 57 290 exão:exão 308595 junção 3 3242 TCTGCTTCGCACCTTCTGCT 82 60 291 exão:exão 308596 junção 3 3244 AGTCTGCTTCGCACCTTCTG 94 81 292 exão:exão 308597 junção 3 3246 TCAGTCTGCTTCGCACCTTC 91 66 293 exão:exão 308598 junção 3 3248 CCTCAGTCTGCTTCGCACCT 85 59 294 exão:exão 308599 junção 3 3250 AGCCTCAGTCTGCTTCGCAC 94 79 295 exão:exão 308600 codificante 3 3252 GTAGCCTCAGTCTGCTTCGC 89 72 296 308601 codificante 3 3254 TGGTAGCCTCAGTCTGCTTC 91 63 297 308602 codificante 3 3256 ICATGGTAGCCTCAGTCTGCT 92 83 298 308603 codificante 3 3258 GTCATGGTAGCCTCAGTCTG 97 56 299 308604 codificante 3 3260 ATGTCATGGTAGCCTCAGTC 90 73 300 308605 codificante 3 3262 GAATGTCATGGTAGCCTCAG 81 50 301 308606 codificante 3 3264 TTGAATGTCATGGTAGCCTC 97 54 302 308607 codificante 3 3266 ATTTGAATGTCATGGTAGCC 77 9 303 308608 codificante 3 3268 ATATTTGAATGTCATGGTAG 85 70 304 308609 codificante 3 5582 CAGCCACATGCAGCTTCAGG 96 78 305 308610 codificante 3 5584 ACCAGCCACATGCAGCTTCA 90 40 306 308611 codificante 3 5586 TTACCAGCCACATGCAGCTT 95 59 307 308612 codificante 3 5588 GGTTACCAGCCACATGCAGC 90 75 308 308613 codificante 3 5590 TAGGTTACCAGCCACATGCA 87 43 309 308614 codificante 3 5592 TTTAGGTTACCAGCCACATG 92 74 310 308615 codificante 3 5594 CTTTTAGGTTACCAGCCACA 85 45 311 168 (continuação) N2 ISIS REGIÃO SEQ ID N2 ALVO SÍTIO ALVO SEQUÊNCIA % DE INIB. 150 nM % DE INIB. 50 nM SEQ ID NE 308616 codificante 3 5596 TCCTTTTAGGTTACCAGCCA 81 39 312 308617 codificante 3 5598 GCTCCTTTTAGGTTACCAGC 87 77 313 308618 codificante 3 5600 AGGCTCCTTTTAGGTTACCA 77 61 314 308619 codificante 3 5602 GTAGGCTCCTTTTAGGTTAC 74 69 315 308620 codificante 3 5604 TGGTAGGCTCCTTTTAGGTT 88 69 316 308621 codif icante 3 5606 TTTGGTAGGCTCCTTTTAGG 91 56 317

Como mosti ado nas ' rabelas 10 e 11 , as SEQ ID N° 124, 128 129, 132, 133, 134, 138, 140, 141, 142, 144, 145, 147, 148, 149 150, 152, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 163, 165, 166, 167 169, 170, 172, 176, 177, 178, 181, 183, 184, 185, 186, 187, 188 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240 241, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254 255, 256, 257, 258, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, e 31 .7 demonstr aram pelo meno s, 30 % de ini] bição da expres são de apolipoprote ina : humana neste ensaio e são, por conseguinte, preferidas. São mais preferidas as SEQ ID N° 224, 247 e 262. As regiões alvo a que estas sequências preferidas são complementares sao aqui referidas como "segmentos alvo preferidos" e são, por conseguinte, preferidas para direccionamento por compostos da presente divulgação. Estes segmentos alvo preferidos são 169 mostrados na Tabela 18. As sequências representam o complemento inverso dos compostos anti-sentido preferidos mostrados nas Tabelas 10 e 11. "Sítio alvo" indica o primeiro número de nucleótido (mais em 5') no ácido nucleico alvo particular a que o oligonucleótido se liga. Também é mostrada na Tabela 18 a espécie na qual cada dos segmentos alvo preferidos foi encontrado.

Exemplo 31

Inibição anti-sentido da expressão de apolipoproteina B humana por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-MOE e uma lacuna desoxi: Direccionamento para Acesso GenBank número Ml4162.1

Foi concebida outra série de oligonucleótidos para visar diferentes regiões do ARN de apolipoproteina B humana, utilizando sequência publicada (acesso GenBank número M14162.1, aqui incorporado como SEQ ID N° : 318). Os oligonucleótidos são mostrados na Tabela 12. "Sítio alvo" indica o primeiro número de nucleótido (mais em 5') na sequência alvo particular a que o oligonucleótido se liga. Todos os compostos na Tabela 12 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros"), de 20 nucleótidos em comprimento, compostos por uma região de "lacuna" central consistindo de dez 2'-desoxinucleótidos, a qual está flanqueada em ambos os lados (direcções 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por nucleótidos de 2'-metoxietilo (2'-M0E). As ligações internucleósido (esqueleto) são fosforotioato (P=S) em todo o oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas. Os compostos foram analisados para o seu efeito nos níveis de ARNm de 170 apolipoproteína B humana em células HepG2 por PCR quantitativo em tempo real, como aqui descrito noutros exemplos. Os dados são médias de duas experiências, nas quais as células HepG2 foram tratadas com 150 nM dos compostos na Tabela 12. Se presente, "N.D." indica "não determinado".

Tabela 12

Inibição dos níveis de ARNm de apolipoproteína B humana por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-MOE e uma lacuna desoxi

Na REGIÃO SEQ ID Nfi SÍTIO SEQUÊNCIA % DE SEQ ID Na ISIS ALVO INIB. 271009 codificante 318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 75 319 271024 codificante 318 8031 GCTCACTGTTCAGCATCTGG 27 320 271029 codificante 318 8792 TGAGAATCTGGGCGAGGCCC N.D. 321 271040 codificante 318 11880 GTCCTTCATATTTGCCATCT 0 322 271047 codificante 318 12651 CCTCCCTCATGAACATAGTG 32 323 281639 codificante 318 9851 GAC G T CAGAAC CTATGATGG 38 324 281647 codificante 318 12561 TGAGTGAGTCAATCAGCTTC 73 325

Exemplo 32

Inibição anti-sentido de apolipoproteína B humana -direccionamento de Deslocação do gene para Acesso GenBank número M14162.1

Foi conduzido uma "deslocação do gene", no qual outra série de oligonucleótidos foi concebida para visar as regiões do ARN de apolipoproteína B humana (acesso GenBank número M14162.1, aqui incorporado como SEQ ID N°: 318) que estão próximo do sítio 171 alvo da SEQ ID N° 319. Os oligonucleótidos são mostrados na Tabela 13. "Sítio alvo" indica o primeiro número de nucleótido (mais em 5') na sequência alvo particular a que o oligonucleótido se liga. Todos os compostos na Tabela 13 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros"), de 20 nucleótidos em comprimento, compostos por uma região de "lacuna" central consistindo de dez 2'-desoxinucleótidos, a qual está flanqueada em ambos os lados (direcções 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por nucleótidos de 2’-metoxietilo (2'-M0E). As ligações internucleósido (esqueleto) são fosforotioato (P=S) em todo o oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas. Os compostos foram analisados para o seu efeito nos níveis de ARNm de apolipoproteína B humana em células HepG2 por PCR quantitativo em tempo real, como aqui descrito noutros exemplos. As doses de tratamento foram 50 nM e 150 nM e estão indicadas na Tabela 13. Os dados são médias de duas experiências. Se presente, "N.D." indica "não determinado". 172

Tabela 13

Inibição dos níveis de ARNm de apolipoproteína B humana por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-M0E e uma lacuna desoxi

Na ISIS REGIÃO SEQ ID N= ALVO SÍTIO ALVO SEQUÊNCIA % DE INIB. 150 nM % DE INIB. 50 nM SEQ ID Na 308622 codificante 318 3104 GCCTTCTGCTTGAGTTACAA 87 25 326 308623 codificante 318 3106 GCGCCTTCTGCTTGAGTTAC 71 62 327 308624 codificante 318 3108 TCGCGCCTTCTGCTTGAGTT 89 69 328 308625 codificante 318 3110 CTTCGCGCCTTCTGCTTGAG 83 64 329 308626 codificante 318 3116 AGTCTGCTTCGCGCCTTCTG 94 38 330 308627 codificante 318 3118 TCAGTCTGCTTCGCGCCTTC 89 67 331 308628 codificante 318 3120 CCTCAGTCTGCTTCGCGCCT 92 61 332 308629 codificante 318 3122 AGCCTCAGTCTGCTTCGCGC 95 77 333

Como mostrado nas Tabelas 12 e 13, as SEQ ID N°: 319, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332 e 333 demonstraram, pelo menos, 30% de inibição da expressão de apolipoproteína B humana neste ensaio e são, por conseguinte, preferidas. É mais preferida e SEQ ID N° : 319. As regiões alvo a que estas sequências preferidas são complementares são aqui referidas como "segmentos alvo preferidos" e são, por conseguinte, preferidas para direccionamento por compostos da presente divulgação. Estes segmentos alvo preferidos são mostrados na Tabela 18. As sequências representam o complemento inverso dos compostos anti-sentido preferidos mostrados nas Tabelas 12 e 13. "Sítio alvo" indica o primeiro número de nucleótido (mais em 5') no ácido nucleico alvo particular a que o oligonucleótido se liga. Também é mostrada na Tabela 18 a espécie na qual cada dos segmentos alvo preferidos foi encontrado. 173

Exemplo 33

Inibição anti-sentido da expressão de apolipoproteina B humana por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-M0E e uma lacuna desoxi - Direccionamento para a sequência Genómica

Foi concebida outra série de oligonucleótidos para visar diferentes regiões do ARN de apolipoproteina B humana, utilizando sequência publicada (o complemento dos nucleótidos 39835 a 83279 da sequência com o acesso GenBank número NT_022227.9, representando uma sequência genómica, aqui incorporada como SEQ ID N°: 334). Os oligonucleótidos são mostrados na Tabela 14. "Sitio alvo" indica o primeiro número de nucleótido (mais em 5') na sequência alvo particular a que o oligonucleótido se liga. Todos os compostos na Tabela 14 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros"), de 20 nucleótidos em comprimento, compostos por uma região de "lacuna" central consistindo de dez 2'-desoxinucleótidos, a qual está flanqueada em ambos os lados (direcções 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por nucleótidos de 2'-metoxietilo (2'-M0E). As ligações internucleósido (esqueleto) são fosforotioato (P=S) em todo o oligonucleótido. Todos os residuos de citidina são 5-metilcitidinas. Os compostos foram analisados para o seu efeito nos níveis de ARNm de apolipoproteina B humana em células HepG2 por PCR quantitativo em tempo real, como aqui descrito noutros exemplos. Os dados são médias de duas experiências, nas quais as células HepG2 foram tratadas com 150 nM dos oligonucleótidos na Tabela 14. Se presente, "N.D." indica "não determinado". 174

Tabela 14

Inibição dos níveis de ARNm de apolipoproteína B humana por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-M0E e uma lacuna desoxi , Λ N2 ISIS REGIÃO SEQ ID N2 SITIO SEQUENCIA % DE SEQ ID N2 ALVO ALVO INIB. 301049 junção intrão:exão 334 904 TCTGTAAGACAGGAGAAAGA 41 335 301050 junção intrão:exão 334 913 ATTTCCTCTTCTGTAAGACA 22 336 301051 junção exão:intrão 334 952 GATGCCTTACTTGGACAGAC 27 337 301052 intrão 334 1945 AGAAATAGCTCTCCCAAGGA 13 338 301053 junção intrão:exão 334 1988 GTCGCATCTTCTAACGTGGG 45 339 301054 junção exão:intrão 334 2104 TCCTCCATACCTTGCAGTTG 0 340 301055 intrão 334 2722 TGGCTCATGTCTACCATATT 49 341 301056 intrão 334 2791 CAGTTGAAATGCAGCTAATG 35 342 301057 intrão 334 3045 TGCAGACTAGGAGTGAAAGT 30 343 301058 intrão 334 3117 AGGAGGATGTCCTTTTATTG 27 344 301059 intrão 334 3290 AT CAGAGCACCAAAGGGAAT 12 345 301060 junção intrão:exão 334 3381 CCAGCTCAACCTGAGAATTC 17 346 301061 junção exão:intrão 334 3527 CATGACTTACCTGGACATGG 52 347 301062 intrão 334 3566 CCTCAGCGGACACACACACA 21 348 301063 intrão 334 3603 GTCACATCCGTGCCTGGTGC 41 349 301064 intrão 334 3864 CAGTGCCTCTGGGACCCCAC 60 350 301065 intrão 334 3990 AGCTGCAGTGGCCGATCAGC 50 351 301066 intrão 334 4251 GACCTCCCCAGCCACGTGGA 61 352 301067 intrão 334 4853 TCTGATCACCATACATTACA 45 353 301068 intrão 334 5023 ATTTCCCACTGGGTACTCTC 44 354 301069 intrão 334 5055 GGCTGAAGCCCATGCTGACT 44 355 301070 intrão 334 5091 GTTGGACAGTCATTCTTTTG 38 356 301071 intrão 334 5096 CACTTGTTGGACAGTCATTC 48 357 301072 intrão 334 5301 ATTTTAAATTACAGTAGATA 43 358 301073 intrão 334 5780 CTGTTCTCCACCCATATCAG 37 359 301074 junção intrão:exão 334 6353 GAGCTCATACCTGTCCCAGA 75 360 301075 intrão 334 6534 TT CAAGGGCCACT GCTAT CA 52 361 175 (continuação) , Λ N2 ISIS REGIÃO SEQ ID N2 SITIO SEQUENCIA % DE SEQ ID N2 ALVO ALVO INIB. 301076 intrão 334 6641 CCAGTATTTCACGCCAATCC 36 362 301077 intrão 334 6661 GGCAGGAGGAACCTCGGGCA 55 363 301078 intrão 334 6721 TTTTAAAATTAGACCCAACC 22 364 301079 intrão 334 6727 TGACTGTTTTAAAATTAGAC 20 365 301080 intrão 334 6788 CCCAGCAAACACAGGTGAAG 25 366 301081 intrão 334 7059 GAGTGTGGTCTTGCTAGTGC 46 367 301082 intrão 334 7066 CTATGCAGAGTGTGGTCTTG 41 368 301083 intrão 334 7189 AGAAGATGCAACCACATGTA 29 369 301084 junção intrão:exão 334 7209 ACACGGTATCCTATGGAGGA 49 370 301085 junção exão:intrão 334 7365 TGGGACTTACCATGCCTTTG 11 371 301086 intrão 334 7702 GGTTTTGCTGCCCTACATCC 30 372 301087 intrão 334 7736 ACAAGGAGTCCTTGTGCAGA 40 373 301088 intrão 334 8006 ATGTTCACTGAGACAGGCTG 41 374 301089 intrão 334 8215 GAAGGTCCATGGTTCATCTG 0 375 301090 intrão 334 8239 ATTAGACTGGAAGCATCCTG 39 376 301091 intrão 334 8738 GAGATTGGAGACGAGCATTT 35 377 301092 junção exão:intrão 334 8881 CATGACCTACTTGTAGGAGA 22 378 301093 intrão 334 9208 TGGATTTGGATACACAAGTT 42 379 301094 intrão 334 9244 ACTCAATATATATTCATTGA 22 380 301095 intrão 334 9545 CAAGGAAGCACACCATGTCA 38 381 301096 junção intrão:exão 334 9563 ATACTTATTCCTGGTAACCA 24 382 301097 intrão 334 9770 GGTAGCCAGAACACCAGTGT 50 383 301098 intrão 334 9776 ACTAGAGGTAGCCAGAACAC 34 384 301099 intrão 334 10149 ACCACCTGACATCACAGGTT 24 385 301100 intrão 334 10341 TACTGTGACCTATGCCAGGA 55 386 301101 intrão 334 10467 GGAGGTGCTACTGTTGACAT 42 387 301102 intrão 334 10522 TCCAGACTTGTCTGAGTCTA 47 388 301103 intrão 334 10547 TCTAAGAGGTAGAGCTAAAG 7 389 301104 intrão 334 10587 CCAGAGATGAGCAACTTAGG 38 390 301105 intrão 334 10675 GGCCATGTAAATTGCTCATC 7 391 301106 intrão 334 10831 AAAGAAACTATCCTGTATTC 12 392 176 (continuação) , Λ N2 ISIS REGIÃO SEQ ID N2 SITIO SEQUENCIA % DE SEQ ID N2 ALVO ALVO INIB. 301107 junção intrão:exão 334 10946 TTCTTAGTACCTGGAAGATG 23 393 301108 junção exão:intrão 334 11166 CATTAGATACCTGGACACCT 29 394 301109 intrão 334 11337 GTTTCATGGAACTCAGCGCA 44 395 301110 intrão 334 11457 CTGGAGAGCACCTGCAATAG 35 396 301111 intrão 334 11521 TGAAGGGTAGAGAAATCATA 9 397 301112 junção exão:intrão 334 12111 GGAAACTCACTTGTTGACCG 25 398 301113 intrão 334 12155 AGGTGCAAGATGTTCCTCTG 46 399 301114 intrão 334 12162 TGCACAGAGGT GC AAGAT GT 16 400 301115 intrão 334 12221 CACAAGAGTAAGGAGCAGAG 39 401 301116 intrão 334 12987 GATGGATGGTGAGAAATTAC 33 402 301117 intrão 334 13025 TAGACAATTGAGACTCAGAA 39 403 301118 intrão 334 13057 AT GT GCACACAAGGACATAG 33 404 301119 intrão 334 13634 ACATACAAATGGCAATAGGC 33 405 301120 intrão 334 13673 TAGGCAAAGGACATGAATAG 30 406 301121 codificante 334 14448 TTATGATAGCTACAGAATAA 29 407 301122 junção exão:intrão 334 14567 CTGAGATTACCCGCAGAATC 32 408 301123 intrão 334 14587 GATGTATGTCATATAAAAGA 26 409 301124 junção intrão:exão 334 14680 TTTCCAATGACCTGCATTGA 48 410 301125 intrão 334 15444 AGGGATGGTCAATCTGGTAG 57 411 301126 intrão 334 15562 GGCTAATAAATAGGGTAGTT 22 412 301127 intrão 334 15757 TCCTAGAGCACTATCAAGTA 41 413 301128 junção intrão:exão 334 15926 CCTCCTGGTCCTGCAGTCAA 56 414 301129 intrão 334 16245 CATTTGCACAAGTGTTTGTT 35 415 301130 intrão 334 16363 CTGACACACCATGTTATTAT 10 416 301131 junção intrão:exão 334 16399 CTTTTTCAGACTAGATAAGA 0 417 301132 junção exão:intrão 334 16637 TCACACTTACCTCGATGAGG 29 418 301133 intrão 334 17471 AAGAAAATGGCATCAGGTTT 13 419 301134 junção intrão:exão 334 17500 CCAAGCCAATCTGAGAAAGA 25 420 301135 junção exão:intrão 334 17677 AAATACACACCTGCTCATGT 20 421 301136 junção exão:intrão 334 17683 CTTCACAAATACACACCTGC 20 422 301137 intrão 334 18519 AGTGGAAGTTTGGTCTCATT 41 423 177 (continuação) , Λ N2 ISIS REGIÃO SEQ ID N2 SITIO SEQUENCIA % DE SEQ ID N2 ALVO ALVO INIB. 301138 intrão 334 18532 TTGCTAGCTTCAAAGTGGAA 44 424 301139 intrão 334 18586 TCAAGAATAAGCTCCAGATC 41 425 301140 intrão 334 18697 GCATACAAGTCACATGAGGT 34 426 301141 intrão 334 18969 TACAAGGTGTTTCTTAAGAA 38 42 7 301142 intrão 334 19250 AT GCAGCCAGGAT GGGCCTA 54 428 301143 junção intrão:exão 334 19340 TTACCATATCCTGAGAGTTT 55 429 301144 intrão 334 19802 GCAAAGGTAGAGGAAGGTAT 32 430 301145 intrão 334 19813 AAGGACCTTCAGCAAAGGTA 36 431 301146 intrão 334 20253 CATAGGAGTACATTTATATA 23 432 301147 intrão 334 20398 ATTATGATAAAATCAATTTT 19 433 301148 intrão 334 20567 AGAAATTTCACTAGATAGAT 31 434 301149 intrão 334 20647 AGCATATTTTGATGAGCTGA 44 435 301150 intrão 334 20660 GAAAGGAAGGACTAGCATAT 39 436 301151 junção intrão:exão 334 20772 CCTCTCCAATCTGTAGACCC 28 43 7 301152 intrão 334 21316 CTGGATAACTCAGACCTTTG 40 438 301153 intrão 334 21407 AGTCAGAAAACAACCTATTC 11 439 301154 junção intrão:exão 334 21422 CAGCCTGCATCTATAAGTCA 31 440 301155 junção exão:intrão 334 21634 AAAGAATTACCCTCCACTGA 33 441 301156 intrão 334 21664 TCTTTCAAACTGGCTAGGCA 39 442 301157 intrão 334 21700 GCCT GGCAAAATT CT GCAGG 37 443 301158 intrão 334 22032 CTACCTCAAATCAATATGTT 28 444 301159 intrão 334 22048 TGCTTTACCTACCTAGCTAC 36 445 301160 intrão 334 22551 ACCTTGTGTGTCTCACTCAA 49 446 301161 intrão 334 22694 ATGCATTCCCTGACTAGCAC 34 447 301162 intrão 334 22866 CATCTCTGAGCCCCTTACCA 24 448 301163 intrão 334 22903 GCTGGGCATGCTCTCTCCCC 51 449 301164 intrão 334 22912 GCTTTCGCAGCTGGGCATGC 55 450 301165 intrão 334 23137 ACTCCTTTCTATACCTGGCT 47 451 301166 intrão 334 23170 ATTCTGCCTCTTAGAAAGTT 38 452 301167 intrão 334 23402 CCAAGCCTCTTTACTGGGCT 29 453 301168 intrão 334 23882 CACTCATGACCAGACTAAGA 35 454 178 (continuação) , Λ N2 ISIS REGIÃO SEQ ID N2 SITIO SEQUENCIA % DE SEQ ID N2 ALVO ALVO INIB. 301169 intrão 334 23911 ACCTCCCAGAAGCCTTCCAT 22 455 301170 intrão 334 24184 TTCATATGAAATCTCCTACT 40 456 301171 intrão 334 24425 TATTTAATTTACTGAGAAAC 7 457 301172 junção intrão:exão 334 24559 TAATGTGTTGCTGGTGAAGA 35 458 301173 junção exão:intrão 334 24742 CATCTCTAACCTGGTGTCCC 21 459 301174 intrão 334 24800 GTGCCATGCTAGGTGGCCAT 37 460 301175 intrão 334 24957 AGCAAATT GGGAT CT GTGCT 29 461 301176 intrão 334 24991 TCTGGAGGCTCAGAAACATG 57 462 301177 intrão 334 25067 TCAAGACAGGAGCCACCTA 40 463 301178 intrão 334 25152 AGGATTCCCAAGACTTTGGA 38 464 301179 junção intrão:exão 334 25351 CAGCTCTAATCTAAAGACAT 22 465 301180 junção exão:intrão 334 25473 GAATACTCACCTTCTGCTTG 6 466 301181 intrão 334 26047 ATCTCTCTGTCCTCATCTTC 28 46 7 301182 intrão 334 26749 CCAACTCCCCCTTTCTTTGT 37 468 301183 intrão 334 26841 TCTGGGCCAGGAAGACACGA 68 469 301184 intrão 334 27210 TATT GT GT GCT GGGCACT GC 52 470 301185 junção intrão:exão 334 27815 TGCTTCGCACCTGGACGAGT 51 471 301186 junção exão:intrão 334 28026 CCTTCTTTACCTTAGGTGGC 37 472 301187 intrão 334 28145 GCTCTCTCTGCCACTCTGAT 47 473 301188 intrão 334 28769 AACTTCTAAAGCCAACATTC 27 474 301189 junção intrão:exão 334 28919 TGTGTCACAACTATGGTAAA 63 475 301190 junção exão:intrão 334 29095 AGACACATACCATAATGCCA 22 476 301191 junção intrão:exão 334 29204 TTCTCTTCATCTGAAAATAC 21 477 301192 intrão 334 29440 TGAGGATGTAATTAGCACTT 27 478 301193 junção intrão:exão 334 29871 AGCTCATTGCCTACAAAATG 31 479 301194 intrão 334 30181 GTTCTCATGTTTACTAATGC 40 480 301195 intrão 334 30465 GAATTGAGACAACTTGATTT 26 481 301196 junção intrão:exão 334 30931 CCGGCCATCGCTGAAATGAA 54 482 301197 junção exão:intrão 334 31305 CATAGCTCACCTTGCACATT 28 483 301198 intrão 334 31325 CGGTGCACCCTTTACCTGAG 28 484 301199 junção intrão:exão 334 31813 TCTCCAGATCCTAACATAAA 19 485 179 (continuação) , Λ N2 ISIS REGIÃO SEQ ID N2 SITIO SEQUENCIA % DE SEQ ID N2 ALVO ALVO INIB. 301200 intrão 334 39562 TTGAATGACACTAGATTTTC 37 486 301201 intrão 334 39591 AAAATCCATTTTCTTTAAAG 12 487 301202 intrão 334 39654 CAGCTCACACTTATTTTAAA 7 488 301203 junção intrão:exão 334 39789 GTTCCCAAAACTGTATAGGA 36 489 301204 junção exão:intrão 334 39904 AGCTCCATACTGAAGTCCTT 37 490 301205 intrão 334 39916 CAATTCAATAAAAGCTCCAT 31 491 301206 intrão 334 39938 GTTTTCAAAAGGTATAAGGT 28 492 301207 junção intrão:exão 334 40012 TTCCCATTCCCTGAAAGCAG 13 493 301208 junção exão:intrão 334 40196 TGGTATTTACCTGAGGGCTG 21 494 301209 intrão 334 40412 ATAAATAATAGTGCTGATGG 39 495 301210 intrão 334 40483 CTATGGCTGAGCTTGCCTAT 33 496 301211 intrão 334 40505 CTCTCTGAAAAATATACCCT 17 497 301212 intrão 334 40576 TTGATGTATCTCATCTAGCA 41 498 301213 intrão 334 40658 TAGAACCATGTTTGGTCTTC 35 499 301214 intrão 334 40935 TTTCTCTTTATCACATGCCC 29 500 301215 intrão 334 41066 TATAGTACATAAAACTTCA 1 501 301216 junção intrão:exão 334 41130 CTGGAGAGGACTAAACAGAG 49 502

Como mostrado na Tabela 14, as SEQ IE ) N° 335, 339, 341, 342, 343, 347, 349, 350 , 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363 , 367, 368, 370, 372, 373, 374, 376, 377, 379, 381, 383, 384, 386 , 387, 388, 390, 395, 396, 399, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 408 , 410, 411, 413, 414, 415, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430 , 431, 434, 435, 436, 438, 440, 441, 442, 443, 445, 446, 447, 449 , 450, 451, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 463, 464, 468, 469, 470 , 471, 472, 473, 475, 479, 480, 482, 486, 489, 490, 491 , 495 , 496, 498, 499 e 502 demonstraram, pelo menos , 30 % de inibição da expressão de apolipoproteina B humana neste ensaio e sao, por conseguinte , preferidas. As regiões alvo a que estas sequências preferidas sao complementares sao aqui 180 referidas como "segmentos alvo preferidos" e são, por conseguinte, preferidas para direccionamento por compostos da presente divulgação. Estes segmentos alvo preferidos são mostrados na Tabela 18. As sequências representam o complemento inverso dos compostos anti-sentido preferidos mostrados na Tabela 14. "Sitio alvo" indica o primeiro número de nucleótido (mais em 5') no ácido nucleico alvo particular a que o oligonucleótido se liga. Também é mostrada na Tabela 18 a espécie na qual cada dos segmentos alvo preferidos foi encontrado.

Exemplo 34

Inibição anti-sentido da expressão de apolipoproteina B humana por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-MOE e uma lacuna desoxi - Direccionamento para acesso GenBank número AI249040.1

Foi concebida outra série de oligonucleótidos para visar diferentes regiões do ARN de apolipoproteina B humana, utilizando sequência publicada (o complemento da sequência com o acesso GenBank número AI249040.1, aqui incorporada como SEQ ID N°: 503). Os oligonucleótidos são mostrados na Tabela 15. "Sitio alvo" indica o primeiro número de nucleótido (mais em 5') na sequência alvo particular a que o oligonucleótido se liga. Todos os compostos na Tabela 15 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros"), de 20 nucleótidos em comprimento, compostos por uma região de "lacuna" central consistindo de dez 2'-desoxinucleótidos, a qual está flanqueada em ambos os lados (direcções 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por nucleótidos de 2'-metoxietilo (2'-MOE). As 181 ligações internucleósido (esqueleto) são fosforotioato (P=S) em todo o oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas. Os compostos foram analisados para o seu efeito nos níveis de ARNm de apolipoproteína B humana em células HepG2 por PCR quantitativo em tempo real, como aqui descrito noutros exemplos. Os dados são médias de duas experiências, nas quais as células HepG2 foram tratadas com 150 nM dos oligonucleótidos na Tabela 15. Se presente, "N.D." indica "não determinado".

Tabela 15

Inibição dos níveis de ARNm de apolipoproteína B humana por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-M0E e uma lacuna desoxi

Na ISIS REGIÃO SEQ ID Na ALVO SÍTIO ALVO SEQUÊNCIA % DE INIB. SEQ ID N° 301218 3'UTR 503 484 ACATTTTATCAATGCCCTCG 23 504 301219 3'UTR 503 490 GCCAGAACATTTTATCAATG 35 505 301220 3'UTR 503 504 AGAGGTTTTGCTGTGCCAGA 51 506 301221 3'UTR 503 506 CTAGAGGTTTTGCTGTGCCA 61 507 301222 3'UTR 503 507 TCTAGAGGTTTTGCTGTGCC 14 508 301223 3'UTR 503 522 AATCACACTATGTGTTCTAG 26 509 301224 3'UTR 503 523 AAATCACACTATGTGTTCTA 33 510 301225 3'UTR 503 524 TAAATCACACTATGTGTTCT 3 511 301226 3'UTR 503 526 CTTAAATCACACTATGTGTT 39 512 301227 3'UTR 503 536 TATTCTGTTACTTAAATCAC 23 513

Como mostrado na Tabela 15, as SEQ ID N°: 505, 506, 507, 510 e 512 demonstraram, pelo menos, 30% de inibição da expressão de apolipoproteína B humana neste ensaio e são, por conseguinte, preferidas. As regiões alvo a que estas sequências preferidas 182 são complementares são aqui referidas como "segmentos alvo preferidos" e são, por conseguinte, preferidas para direccionamento por compostos da presente divulgação. Estes segmentos alvo preferidos são mostrados na Tabela 18. As sequências representam o complemento inverso dos compostos anti-sentido preferidos mostrados na Tabela 15. "Sítio alvo" indica o primeiro número de nucleótido (mais para 5') no ácido nucleico alvo particular a que o oligonucleótido se liga. Também é mostrada na Tabela 18 a espécie na qual cada dos segmentos alvo preferidos foi encontrado.

Exemplo 35

Inibição anti-sentido da expressão de apolipoproteina B humana por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-MOE e uma lacuna desoxi - Variação na posição da lacuna

Foi concebida uma série de compostos anti-sentido para visar diferentes regiões do ARN de apolipoproteina B humana, utilizando sequências publicadas (acesso GenBank número NM_0 0 03 8 4.1, aqui incorporado como SEQ ID N°: 3) . Os compostos são mostrados na Tabela 16. "Sítio alvo" indica o primeiro número de nucleótido (mais em 5') na sequência alvo particular a que o composto se liga. Todos os compostos na Tabela 16 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros"), de 20 nucleótidos em comprimento. A região de "lacuna" consiste de 2 '-desoxinucleótidos, a qual está flanqueada em um ou ambos os lados (direcções 5' e 3') por "asas" compostas por nucleótidos de 2'-metoxietilo (2'-MOE). O número de nucleótidos de 2'-MOE em cada lado da lacuna varia, de modo que o número total de 183 nucleótidos de 2,-M0E seja sempre igual a 10 e o comprimento total do oligonucleótido quimérico seja 20 nucleótidos. A estrutura exacta de cada oligonucleótido é designada na Tabela 16 como a "estrutura de lacuna" e os 2'-desoxinucleótidos estão a negrito. Uma designação de 8-10-2, por exemplo, indica que os primeiros (mais em 5') 8 nucleótidos e os últimos (mais em 3') 2 nucleótidos são nucleótidos de 2'-MOE e os 10 nucleótidos na lacuna são 2'-desoxinucleótidos. As ligações internucleósido (esqueleto) são fosforotioato (P=S) em todo o oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas. Os compostos foram analisados para o seu efeito nos níveis de ARNm de apolipoproteína B humana por PCR quantitativo em tempo real, como aqui descrito noutros exemplos. Os dados, mostrados na Tabela 16, são médias de três experiências, nas quais as células HepG2 foram tratadas com os oligonucleótidos anti-sentido da presente divulgação, a doses de 50 nM e 150 nM. Se presente, "N.D." indica "não determinado".

Tabela 16

Inibição dos níveis de ARNm de apolipoproteína B humana por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'—MOE e uma lacuna desoxi variável ISIB # SEQ ID N2 SÍTIO SEQUÊNCIA % DE % DE estrutura SEQ ID Ν'* ALVO ALVO INIB. INIB. de lacuna 150 nM 50 nM 308631 3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 94 74 0-10-10 224 184 (continuação) ISIB # SEQ ID N2 ALVO SÍTIO ALVO SEQUÊNCIA % DE INIB. 150 nM % DE INIB. 50 nM estrutura de lacuna SEQ ID N2 308632 3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 97 41 0-10-10 247 308634 3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 67 45 0 1 O t—1 l o t—1 224 308635 3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 93 69 0 1 0 t—1 1 o t—1 247 308637 3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 95 79 1-10-9 224 308638 3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 94 91 1-10-9 247 308640 3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 96 76 2-10-8 224 308641 3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 89 77 2-10-8 247 308643 3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 96 56 3-10-7 224 308644 3 3249 GCCTCAGTCTCCTTCGCACC 93 71 3-10-7 247 308646 3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 76 50 4-10-6 224 308647 3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 86 53 4-10-6 247 185 (continuação) ISIB # SEQ ID N2 ALVO SÍTIO ALVO SEQUÊNCIA % DE INIB. 150 nM % DE INIB. 50 nM estrutura de lacuna SEQ ID N2 308649 3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 91 68 6-10-4 224 308650 3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 94 74 6-10-4 247 308652 3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 95 73 7-10-3 224 308653 3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 89 73 7-10-3 247 308655 3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 83 84 8-10-2 224 308656 3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 97 37 8-10-2 247 308658 3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 78 86 9-10-1 224 308659 3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 93 70 9-10-1 247 308660 3 3254 TGGTAGCCTCAGTCTGCTTC 92 72 2-10-8 514 308662 3 3254 TGGTAGCCTCAGTCTGCTTC 83 76 8-10-2 514 186

Como mostrado na Tabela 16, as SEQ ID N°: 224, 247 e 514 demonstraram, pelo menos, 30% de inibição da expressão de apolipoproteina B humana neste ensaio, a ambas as doses. Estes dados sugerem que os oligonucleótidos são eficazes com um número de variações na colocação da lacuna. As regiões alvo a que estas sequências preferidas são complementares são aqui referidas como "segmentos alvo preferidos" e são, por conseguinte, preferidas para direccionamento por compostos da presente divulgação. Estes segmentos alvo preferidos são mostrados na Tabela 18. As sequências representam o complemento inverso dos compostos anti-sentido preferidos mostrados na Tabela 16. "Sitio alvo" indica o primeiro número de nucleótido (mais em 5') no ácido nucleico alvo particular a que se liga o oligonucleótido. Também é mostrada na Tabela 18 a espécie na qual cada dos segmentos alvo preferidos foi encontrado.

Exemplo 36

Inibição anti-sentido da expressão de apolipoproteina B humana por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-MOE e uma lacuna desoxi - Variação na posição da lacuna das SEQ ID N*: 319 e 515

Foi concebida uma série de compostos anti-sentido com base nas SEQ ID N° 319 e 515, com variações na estrutura da lacuna. Os compostos são mostrados na Tabela 17. "Sitio alvo" indica o primeiro número de nucleótido (mais em 5') na sequência alvo particular a que o composto se liga. Todos os compostos na Tabela 17 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros"), de 20 nucleótidos em comprimento. A região de "lacuna" consiste em 2'-desoxinucleótidos, a qual está flanqueada em um ou ambos os 187 lados (direcções 5' e 3') por "asas" compostas por nucleótidos de 2'-metoxietilo (2'-M0E). O número de nucleótidos de 2'-M0E em

cada lado da lacuna varia , de modo que o número total de nucleótidos de 2,-MOE seja sempre igual a 10 e o comprimento total do oligonucleótido quimérico seja 20 nucleótidos. A estrutura exacta de cada oligonucleótido é designada na Tabela 17 como a "estrutura de lacuna" e os 2'-desoxinucleótidos estão a negrito. Uma designação de 8-10-2, por exemplo, indica que os primeiros (mais em 5') 8 nucleótidos e os últimos (mais em 3') 2 nucleótidos são nucleótidos de 2'-MOE e os 10 nucleótidos na lacuna são 2'-desoxinucleótidos. As ligações internucleósido (esqueleto) são fosforotioato (P=S) em todo o oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas. Os compostos foram analisados para o seu efeito nos níveis de ARNm de apolipoproteína B humana por PCR quantitativo em tempo real, como aqui descrito noutros exemplos. Os dados, mostrados na Tabela 17, são médias de três experiências, nas quais as células HepG2 foram tratadas com os oligonucleótidos anti-sentido da presente divulgação, a doses de 50 nM e 150 nM. Se presente, "N.D." indica "não determinado".

Tabela 17

Inibição dos níveis de ARNm de apolipoproteína B humana por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-MOE e uma lacuna desoxi variável

Na ISIS SEQ ID N2 ALVO SÍTIO ALVO SEQUÊNCIA % DE INIB. 150 nM % DE INIB. 50 nM estrutura de lacuna SEQ ID N2 308630 318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 89 69 0-10-10 319 188 30863 318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 83 66 10-10-0 319 308636 318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 91 81 1-10-9 319 308639 318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 94 86 2-10-8 319 308642 318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 95 85 3-10-7 319 308645 318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 98 57 4-20-6 319 308648 318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 89 78 6-10-4 319 308651 318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 88 87 7-10-3 319 308654 318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 90 81 8-10-2 319 308657 318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 78 61 9-10-1 319 308661 318 3116 AGTCTGCTTCGCGCCTTCTG 91 70 2-10-8 515 308663 318 3116 AGTCTGCTTCGCGCCTTCTG 84 44 8-10-2 515

Como mostrado na Tabela 17, as SEQ ID N°: 319 e 515 demonstraram, pelo menos, 44% de inibição da expressão de apolipoproteina B humana neste ensaio para qualquer das doses. Estes dados sugerem que os compostos são eficazes com um número de variações na colocação da lacuna. As regiões alvo a que estas sequências preferidas são complementares são aqui referidas como "segmentos alvo preferidos" e são, por conseguinte, preferidas para direccionamento por compostos da presente divulgação. Estes segmentos alvo preferidos são mostrados na Tabela 18. As sequências representam o complemento inverso dos compostos anti-sentido preferidos mostrados na Tabela 17. "Sitio alvo" 189 indica o primeiro número de nucleótido (mais em 5') no ácido nucleico alvo particular a que se liga o oligonucleótido. Também é mostrada na Tabela 18 a espécie na qual cada dos segmentos alvo preferidos foi encontrado.

Tabela 18

Sequência e posição de segmentos alvo preferidos identificados em apolipoproteina B. ID DE SEQ ID N2 SÍTIO SEQUÊNCIA COMP REV DE ACTIVO EM SEQ ID N2 SÍTIO ALVO ALVO SEQ ID N2 187342 3 199 GCGCCAGGGCCGAAGAGGAA 124 H. sapiens 516 187346 3 509 CAGGTATGAGCTCAAGCTGG 128 H. sapiens 517 187347 3 584 CATCCTGAACATCAAGAGGG 129 H. sapiens 518 187350 3 756 GGGCAGT GTGAT CGCTT CAA 132 H. sapiens 519 187351 3 799 CACTTGCTCTCATCAAAGGC 133 H. sapiens 520 187352 3 869 CACACTGGACGCTAAGAGGA 134 H. sapiens 521 187356 3 1459 CGCTGAGCCACGCGGTCAAC 138 H. sapiens 522 187358 3 1859 TGTCCAAATTCTACCATGGG 140 H. sapiens 523 187359 3 2179 CAGCTGACCTCATCGAGATT 141 H. sapiens 524 187360 3 2299 GTCAAGTTCCTGATGGTGTC 142 H. sapiens 525 187362 3 2518 AGCTGCTTCTGATGGGTGCC 144 H. sapiens 526 187363 3 2789 GGGCATCATCATTCCGGACT 145 H. sapiens 527 187365 3 3100 CCTACTATCCGCTGACCGGG 147 H. sapiens 528 187367 3 3449 GGGCCACCTAAGTTGTGACA 148 H. sapiens 529 187368 3 3919 AGAACATGGGATTGCCAGAC 149 H. sapiens 530 187369 3 4089 CTCCACTTCAAGTCTGTGGG 150 H. sapiens 531 187371 3 5146 CAGAGCTTGGCCTCTCTGGG 152 H. sapiens 532 187372 3 5189 TGGCCGCTTCAGGGAACACA 153 H. sapiens 533 187374 3 6049 CAGCTGAGCAGACAGGCACC 155 H. sapiens 534 187375 3 6520 GGGAGAGACAAGTTTCACAT 156 H. sapiens 535 187377 3 6859 GTACTGCATCCTGGATTCAA 158 H. sapiens 536 187378 3 7459 GTGAGGTGACTCAGAGACTC 159 H. sapiens 537 190 (continuação) ID DE SEQ ID N2 SÍTIO SEQUÊNCIA CCMP REV DE ACTIVO EM SEQ ID N2 SÍTIO ALVO ALVO SEQ ID N2 187379 3 7819 TTGCAGAGCAATATTCTATC 160 H. sapiens 538 187380 3 7861 AAGCATTGGTAGAGCAAGGG 161 H. sapiens 539 187383 3 8589 CCGCTGGCTCTGAAGGAGTC 163 H. sapiens 540 187385 3 8829 TCTAGTCAGGCTGACCTGCG 165 H. sapiens 541 187387 3 9119 GGGCCACAGTGTTCTAACTG 166 H. sapiens 542 187388 3 10159 AATCAAGTGTCATCACACTG 167 H. sapiens 543 187390 3 10349 GGGTAGT CATAACAGTACT G 169 H. sapiens 544 187391 3 10699 AGAGCACACGGTCTTCAGTG 170 H. sapiens 545 187393 3 10839 TTACAGCTAGAGGGCCTCTT 172 H. sapiens 546 187398 3 12149 CACCGTGGGCATGGATATGG 176 H. sapiens 547 187399 3 12265 GGGAATCTGATGAGGAAACT 177 H. sapiens 548 187400 3 12380 T GT CAACAAGTACCACT GGG 178 H. sapiens 549 187403 3 12749 ACCTGGGATATACACTAGGG 181 H. sapiens 550 187406 3 13299 CCAAGTATAGTTGGCTGGAC 183 H. sapiens 551 187407 3 13779 TACATGAAGCTTGCTCCAGG 184 H. sapiens 552 197724 3 229 ATGTCAGCCTGGTCTGTCCA 185 H. sapiens 553 197725 3 269 GCACCTCCGGAAGTACACAT 186 H. sapiens 554 197726 3 389 CTGCAGCTTCATCCTGAAGA 187 H. sapiens 555 197727 3 449 TGAGGGCAAAGCCTTGCTGA 188 H. sapiens 556 197728 3 529 CCATTCCAGAAGGGAAGCAG 189 H. sapiens 557 197729 3 709 CGAGGAAGGGCAATGTGGCA 190 H. sapiens 558 197730 3 829 CCTTGTCAACTCTGATCAGC 191 H. sapiens 559 197731 3 849 AGCAGCCAGTCCTGTCAGTA 192 H. sapiens 560 197732 3 889 AGCAT GT GGCAGAAGCCAT C 193 H. sapiens 561 197733 3 1059 GAGAGCACCAAATCCACATC 194 H. sapiens 562 197734 3 1199 CCTCAGTGATGAAGCAGTCA 195 H. sapiens 563 197735 3 1349 GATAGATGTGGTCACCTACC 196 H. sapiens 564 197736 3 1390 CCTCAGCACAGCAGCTGCGA 197 H. sapiens 565 197737 3 1589 GATTCTGCGGGTCATTGGAA 198 H. sapiens 566 197738 3 1678 CAAAGCCATCACTGATGATC 199 H. sapiens 567 197739 3 1699 AGAAAGCTGCCATCCAGGCT 200 H. sapiens 568 191 (continuação) ID DE SEQ ID N2 SÍTIO SEQUÊNCIA CCMP REV DE ACTIVO EM SEQ ID N2 SÍTIO ALVO ALVO SEQ ID N2 197740 3 1749 CAGGAGGTTCTTCTTCAGAC 201 H. sapiens 569 197741 3 1829 GAGTCCTTCACAGGCAGATA 202 H. sapiens 570 197742 3 1919 TGCCAATATCTTGAACTCAG 203 H. sapiens 571 197743 3 2189 CATCGAGATTGGCTTGGAAG 204 H. sapiens 572 197744 3 2649 GGAGCTGGATTACAGTTGCA 205 H. sapiens 573 197745 3 2729 CAACATGCAGGCTGAACTGG 206 H. sapiens 574 197746 3 2949 ACATTACATTTGGTCTCTAC 207 H. sapiens 575 197747 3 3059 CTCAGGCGCTTACTCCAACG 208 H. sapiens 576 197748 3 3118 GGGACACCAGATTAGAGCTG 209 H. sapiens 577 197749 3 3189 GAGCT CCAGAGAGAGGACAG 210 H. sapiens 578 197750 3 3289 ATCGGCAGAGTATGACCTTG 211 H. sapiens 579 197751 3 3488 CAAGGGTGTTATTTCCATAC 212 H. sapiens 580 197752 3 3579 GACTCATCTGCTACAGCTTA 213 H. sapiens 581 197753 3 4039 GCAAATCCTCCAGAGATCTA 214 H. sapiens 582 197754 3 4180 CTCTCCTGGGTGTTCTAGAC 215 H. sapiens 583 197755 3 4299 ATGAAGGCTGACTCTGTGGT 216 H. sapiens 584 197756 3 4511 GGGACCACAGATGTCTGCTT 217 H. sapiens 585 197757 3 4660 CTGGCCGGCTCAATGGAGAG 218 H. sapiens 586 197758 3 4919 GCTGCGTTCTGAATATCAGG 219 H. sapiens 587 197759 3 5009 TGCTGACATCTTAGGCACTG 220 H. sapiens 588 197760 3 5109 AAGTGTAGTCTCCTGGTGCT 221 H. sapiens 589 197761 3 5212 CAAAATTCAGTCTGGATGGG 222 H. sapiens 590 197762 3 5562 GGGAAACTACGGCTAGAACC 223 H. sapiens 591 197763 3 5589 CTGCATGTGGCTGGTAACCT 224 H. sapiens 592 197764 3 5839 CCATGACCATCGATGCACAT 225 H. sapiens 593 197765 3 5869 ATGGGAAACTCGCTCTCTGG 226 H. sapiens 594 197766 3 5979 AGTCATCATCTCGTGTCTAG 227 H. sapiens 595 197767 3 6099 GAATACAGCCAGGACTT GGA 228 H. sapiens 596 197768 3 6144 GGCGTGGAGCTTACTGGACG 229 H. sapiens 597 197769 3 6249 GAGATGAGAGATGCCGTTGA 230 H. sapiens 598 197770 3 6759 AGTCTTGATGAGCACTATCA 231 H. sapiens 599 192 (continuação) ID DE SEQ ID N2 SÍTIO SEQUÊNCIA CCMP REV DE ACTIVO EM SEQ ID N2 SÍTIO ALVO ALVO SEQ ID N2 197771 3 6889 CTAAGTACCAAATCAGAATC 232 H. sapiens 600 197772 3 7149 GTCCATGAGTTAATCGAGAG 233 H. sapiens 601 197773 3 7549 AGGCCACAGTTGCAGTGTAT 234 H. sapiens 602 197774 3 7779 TCTGATTGGTGGACTCTTGC 235 H. sapiens 603 197775 3 7929 GAAGTCAGTCTTCAGGCTCT 236 H. sapiens 604 197776 3 8929 CCAGATTCTCAGATGAGGGA 237 H. sapiens 605 197778 3 10240 CATCTGTCATTGATGCACTG 238 H. sapiens 606 197779 3 10619 AGGAGAT GTCAAGGGTT CGG 239 H. sapiens 607 197780 3 10659 GGAACTATTGCTAGTGAGGC 240 H. sapiens 608 197781 3 10899 CTCTCTCCATGGCAAATGTC 241 H. sapiens 609 197783 3 11979 CACCGTGACTTCAGTGCAGA 243 H. sapiens 610 197784 3 12249 ACTGAGTTGAGGGTCCGGGA 244 H. sapiens 611 197786 3 13958 CACATATGAACTGGACCTGC 245 H. sapiens 612 197787 3 14008 TCTGAACTCAGAAGGATGGC 246 H. sapiens 613 216825 3 3249 GGTGCGAAGCAGACTGAGGC 247 H. sapiens 614 216826 3 3 TCCCACCGGGACCTGCGGGG 248 H. sapiens 615 216827 3 6 CACCGGGACCTGCGGGGCTG 249 H. sapiens 616 216828 3 23 CTGAGTGCCCTTCTCGGTTG 250 H. sapiens 617 216829 3 35 CTCGGTTGCTGCCGCTGAGG 251 H. sapiens 618 216830 3 36 TCGGTTGCTGCCGCTGAGGA 252 H. sapiens 619 216831 3 37 CGGTTGCTGCCGCTGAGGAG 253 H. sapiens 620 216832 3 39 GTTGCTGCCGCTGAGGAGCC 254 H. sapiens 621 216833 3 43 CTGCCGCTGAGGAGCCCGCC 255 H. sapiens 622 216834 3 116 ACCGCAGCTGGCGATGGACC 256 H. sapiens 623 216835 3 120 CAGCTGGCGATGGACCCGCC 257 H. sapiens 624 216836 3 13800 GAACTTACTATCATCCTCTA 258 H. sapiens 625 216838 3 13854 TCCAATTGAACTTTCACATA 260 H. sapiens 626 216839 3 13882 AAAATTCAAACTGCCTATAT 261 H. sapiens 627 216840 3 13903 GATAAAACCATACAGTGAGC 262 H. sapiens 628 216841 3 13904 ATAAAACCATACAGTGAGCC 263 H. sapiens 629 216842 3 13908 AACCATACAGTGAGCCAGCC 264 H. sapiens 630 193 (continuação) ID DE SEQ ID N2 SÍTIO SEQUÊNCIA CCMP REV DE ACTIVO EM SEQ ID N2 SÍTIO ALVO ALVO SEQ ID N2 216843 3 13909 ACCATACAGTGAGCCAGCCT 265 H. sapiens 631 216844 3 13910 CCATACAGTGAGCCAGCCTT 266 H. sapiens 632 216845 3 13917 GTGAGCCAGCCTTGCAGTAG 267 H. sapiens 633 216846 3 13922 CCAGCCTTGCAGTAGGCAGT 268 H. sapiens 634 216847 3 13934 TAGGCAGTAGACTATAAGCA 269 H. sapiens 635 216848 3 13937 GCAGTAGACTATAAGCAGAA 270 H. sapiens 636 216849 3 13964 TGAACTGGACCTGCACCAAA 271 H. sapiens 637 216850 3 13968 CTGGACCTGCACCAAAGCTG 272 H. sapiens 638 216851 3 13970 GGACCTGCACCAAAGCTGGC 273 H. sapiens 639 216852 3 13974 CTGCACCAAAGCTGGCACCA 274 H. sapiens 640 216853 3 13978 ACCAAAGCTGGCACCAGGGC 275 H. sapiens 641 216854 3 13997 CTCGGAAGGTCTCTGAACTC 276 H. sapiens 642 216855 3 14012 AACTCAGAAGGATGGCATTT 277 H. sapiens 643 216856 3 14014 CTCAGAAGGATGGCATTTTT 278 H. sapiens 644 216857 3 14049 ATCAGGATCTGAGTTATTTT 279 H. sapiens 645 216858 3 14052 AGGATCTGAGTTATTTTGCT 280 H. sapiens 646 216859 3 14057 CTGAGTTATTTTGCTAAACT 281 H. sapiens 647 216860 3 14064 ATTTTGCTAAACTTGGGGGA 282 H. sapiens 648 216861 3 14071 TAAACTTGGGGGAGGAGGAA 283 H. sapiens 649 217030 3 14087 GGAACAAATAAATGGAGTCT 284 H. sapiens 650 224316 3 3230 GTTTGTAACTCAAGCAGAAG 285 H. sapiens 651 224317 3 3232 TTGTAACTCAAGCAGAAGGT 286 H. sapiens 652 224318 3 3234 GTAACTCAAGCAGAAGGTGC 287 H. sapiens 653 224319 3 3236 AACTCAAGCAGAAGGTGCGA 288 H. sapiens 654 224320 3 3238 CTCAAGCAGAAGGTGCGAAG 289 H. sapiens 655 224321 3 3240 CAAGCAGAAGGTGCGAAGCA 290 H. sapiens 656 224322 3 3242 AGCAGAAGGTGCGAAGCAGA 291 H. sapiens 657 224323 3 3244 CAGAAGGTGCGAAGCAGACT 292 H. sapiens 658 224324 3 3246 GAAGGTGCGAAGCAGACTGA 293 H. sapiens 659 224325 3 3248 AGGTGCGAAGCAGACTGAGG 294 H. sapiens 660 224326 3 3250 GTGCGAAGCAGACTGAGGCT 295 H. sapiens 661 194 (continuação) ID DE SEQ ID N2 SÍTIO SEQUÊNCIA CCMP REV DE ACTIVO EM SEQ ID N2 SÍTIO ALVO ALVO SEQ ID N2 224327 3 3252 GCGAAGCAGACTGAGGCTAC 296 H. sapiens 662 224328 3 3254 GAAGCAGACT GAGGCTACCA 297 H. sapiens 663 224329 3 3256 AGCAGACTGAGGCTACCATG 298 H. sapiens 664 224330 3 3258 CAGACTGAGGCTACCATGAC 299 H. sapiens 665 224331 3 3260 GACTGAGGCTACCATGACAT 300 H. sapiens 666 224332 3 3262 CTGAGGCTACCATGACATTC 301 H. sapiens 667 224333 3 3264 GAGGCTACCATGACATTCAA 302 H. sapiens 668 224334 3 3266 GGCTACCATGACATTCAAAT 303 H. sapiens 669 224335 3 3268 CTACCATGACATTCAAATAT 304 H. sapiens 670 224336 3 5582 CCTGAAGCTGCATGTGGCTG 305 H. sapiens 671 224337 3 5584 TGAAGCTGCATGTGGCTGGT 306 H. sapiens 6 72 224338 3 5586 AAGCTGCATGTGGCTGGTAA 307 H. sapiens 673 224339 3 5588 GCTGCATGTGGCTGGTAACC 308 H. sapiens 674 224340 3 5590 TGCATGTGGCTGGTAACCTA 309 H. sapiens 675 224341 3 5592 CATGTGGCTGGTAACCTAAA 310 H. sapiens 676 224342 3 5594 TGTGGCTGGTAACCTAAAAG 311 H. sapiens 677 224343 3 5596 T GGCT GGTAACCTAAAAGGA 312 H. sapiens 678 224344 3 5598 GCTGGTAACCTAAAAGGAGC 313 H. sapiens 679 224345 3 5600 TGGTAACCTAAAAGGAGCCT 314 H. sapiens 680 224346 3 5602 GTAACCTAAAAGGAGCCTAC 315 H. sapiens 681 224347 3 5604 AACCTAAAAGGAGCCTACCA 316 H. sapiens 682 224348 3 5606 CCTAAAAGGAGCCTACCAAA 317 H. sapiens 683 187366 318 3121 GGCGCGAAGCAGACTGAGGC 319 H. sapiens 684 187404 318 12651 CACTATGTTCATGAGGGAGG 323 H. sapiens 685 197777 318 9851 CCATCATAGGTTCTGACGTC 324 H. sapiens 686 197785 318 12561 GAAGCTGATTGACTCACTCA 325 H. sapiens 687 224349 318 3104 TTGTAACTCAAGCAGAAGGC 326 H. sapiens 688 224350 318 3106 GTAACTCAAGCAGAAGGCGC 327 H. sapiens 689 224351 318 3108 AACTCAAGCAGAAGGCGCGA 328 H. sapiens 690 224352 318 3110 CTCAAGCAGAAGGCGCGAAG 329 H. sapiens 691 224353 318 3116 CAGAAGGCGC GAAGCAGACT 330 H. sapiens 692 195 (continuação) ID DE SEQ ID N2 SÍTIO SEQUÊNCIA CCMP REV DE ACTIVO EM SEQ ID N2 SÍTIO ALVO ALVO SEQ ID N2 224354 318 3118 GAAGGCGCGAAGCAGACTGA 331 H. sapiens 693 224355 318 3120 AGGCGCGAAGCAGACTGAGG 332 H. sapiens 694 224356 318 3122 GCGCGAAGCAGACTGAGGCT 333 H. sapiens 695 224328 3 3254 GAAGCAGACT GAGGCTACCA 514 H. sapiens 696 224353 318 3116 CAGAAGGCGCGAAGCAGACT 515 H. sapiens 697 216862 334 904 TCTTTCTCCTGTCTTACAGA 335 H. sapiens 698 216866 334 1988 CCCACGTTAGAAGATGCGAC 339 H. sapiens 699 216868 334 2722 AATAT GGTAGACAT GAGCCA 341 H. sapiens 700 216869 334 2791 CATTAGCTGCATTTCAACTG 342 H. sapiens 701 216870 334 3045 ACTTTCACTCCTAGTCTGCA 343 H. sapiens 702 216874 334 3527 CCATGTCCAGGTAAGTCATG 347 H. sapiens 703 216876 334 3603 GCACCAGGCACGGATGTGAC 349 H. sapiens 704 216877 334 3864 GTGGGGT CCCAGAGGCACT G 350 H. sapiens 705 216878 334 3990 GCTGATCGGCCACTGCAGCT 351 H. sapiens 706 216879 334 4251 TCCACGTGGCTGGGGAGGTC 352 H. sapiens 707 216880 334 4853 TGTAATGTATGGTGATCAGA 353 H. sapiens 708 216881 334 5023 GAGAGTACCCAGTGGGAAAT 354 H. sapiens 709 216882 334 5055 AGTCAGCATGGGCTTCAGCC 355 H. sapiens 710 216883 334 5091 CAAAAGAATGACTGTCCAAC 356 H. sapiens 711 216884 334 5096 GAATGACTGTCCAACAAGTG 357 H. sapiens 712 216885 334 5301 TATCTACTGTAATTTAAAAT 358 H. sapiens 713 216886 334 5780 CTGATATGGGTGGAGAACAG 359 H. sapiens 714 216887 334 6353 TCT GGGACAGGTAT GAGCT C 360 H. sapiens 715 216888 334 6534 T GATAGCAGT GGCCCTT GAA 361 H. sapiens 716 216889 334 6641 GGATTGGCGTGAAATACTGG 362 H. sapiens 717 216890 334 6661 TGCCCGAGGTTCCTCCTGCC 363 H. sapiens 718 216894 334 7059 GCACTAGCAAGACCACACTC 367 H. sapiens 719 216895 334 7066 CAAGACCACACT CT GCATAG 368 H. sapiens 720 ,216897 334 7209 TCCTCCATAGGATACCGTGT 370 H. sapiens 721 216899 334 7702 GGATGTAGGGCAGCAAAACC 372 H. sapiens 722 216900 334 7736 TCTGCACAAGGACTCCTTGT 373 H. sapiens 723 196 (continuação) ID DE SEQ ID N2 SÍTIO SEQUÊNCIA CCMP REV DE ACTIVO EM SEQ ID N2 SÍTIO ALVO ALVO SEQ ID N2 216901 334 8006 CAGCCTGTCTCAGTGAACAT 374 H. sapiens 724 216903 334 8239 CAGGATGCTTCCAGTCTAAT 376 H. sapiens 725 216904 334 8738 AAATGCT CGT CT CCAAT CTC 377 H. sapiens 726 216906 334 9208 AACTTGTGTATCCAAATCCA 379 H. sapiens 727 216908 334 9545 TGACATGGTGTGCTTCCTTG 381 H. sapiens 728 216910 334 9770 ACACTGGTGTTCTGGCTACC 383 H. sapiens 729 216911 334 9776 GTGTTCTGGCTACCTCTAGT 384 H. sapiens 730 216913 334 10341 TCCTGGCATAGGTCACAGTA 386 H. sapiens 731 216914 334 10467 ATGTCAACAGTAGCACCTCC 387 H. sapiens 732 216915 334 10522 TAGACTCAGACAAGTCTGGA 388 H. sapiens 733 216917 334 10587 CCTAAGTTGCTCATCTCTGG 390 H. sapiens 734 216922 334 11337 TGCGCTGAGTTCCATGAAAC 395 H. sapiens 735 216923 334 11457 CTATTGCAGGTGCTCTCCAG 396 H. sapiens 736 216926 334 12155 CAGAGGAACATCTTGCACCT 399 H. sapiens 737 216928 334 12221 CTCTGCTCCTTACTCTTGTG 401 H. sapiens 738 216929 334 12987 GTAATTTCTCACCATCCATC 402 H. sapiens 739 216930 334 13025 TTCTGAGTCTCAATTGTCTA 403 H. sapiens 740 216931 334 13057 CTATGTCCTTGTGTGCACAT 404 H. sapiens 741 216932 334 13634 GCCTATTGCCATTTGTATGT 405 H. sapiens 742 216933 334 13673 CTATTCATGTCCTTTGCCTA 406 H. sapiens 743 216935 334 14567 GATTCTGCGGGTAATCTCAG 408 H. sapiens 744 216937 334 14680 TCAATGCAGGTCATTGGAAA 410 H. sapiens 745 216938 334 15444 CTACCAGATTGACCATCCCT 411 H. sapiens 746 216940 334 15757 TACTTGATAGTGCTCTAGGA 413 H. sapiens 747 216941 334 15926 TTGACTGCAGGACCAGGAGG 414 H. sapiens 748 216942 334 16245 AACAAACACTTGTGCAAATG 415 H. sapiens 749 216950 334 18519 AATGAGACCAAACTTCCACT 423 H. sapiens 750 216951 334 18532 TTCCACTTTGAAGCTAGCAA 424 H. sapiens 751 216952 334 18586 GATCTGGAGCTTATTCTTGA 425 H. sapiens 752 216953 334 18697 ACCTCATGTGACTTGTATGC 426 H. sapiens 753 216954 334 18969 TTCTTAAGAAACACCTTGTA 42 7 H. sapiens 754 197 (continuação) ID DE SEQ ID N2 SÍTIO SEQUÊNCIA CCMP REV DE ACTIVO EM SEQ ID N2 SÍTIO ALVO ALVO SEQ ID N2 216955 334 19250 TAGGCCCATCCTGGCTGCAT 428 H. sapiens 755 216956 334 19340 AAACT CT CAGGATATGGTAA 429 H. sapiens 756 216957 334 19802 ATACCTTCCTCTACCTTTGC 430 H. sapiens 757 216958 334 19813 TACCTTTGCTGAAGGTCCTT 431 H. sapiens 758 216961 334 20567 ATCTATCTAGTGAAATTTCT 434 H. sapiens 759 216962 334 20647 TCAGCTCATCAAAATATGCT 435 H. sapiens 760 216963 334 20660 ATATGCTAGTCCTTCCTTTC 436 H. sapiens 761 216965 334 21316 CAAAGGTCTGAGTTATCCAG 438 H. sapiens 762 216967 334 21422 T GACTTATAGAT GCAGGCT G 440 H. sapiens 763 216968 334 21634 TCAGTGGAGGGTAATTCTTT 441 H. sapiens 764 216969 334 21664 TGCCTAGCCAGTTTGAAAGA 442 H. sapiens 765 216970 334 21700 CCTGCAGAATTTTGCCAGGC 443 H. sapiens 766 216972 334 22048 GTAGCTAGGTAGGTAAAGCA 445 H. sapiens 767 216973 334 22551 TTGAGTGAGACACACAAGGT 446 H. sapiens 768 216974 334 22694 GTGCTAGTCAGGGAATGCAT 447 H. sapiens 769 216976 334 22903 GGGGAGAGAGCATGCCCAGC 449 H. sapiens 770 216977 334 22912 GCATGCCCAGCTGCGAAAGC 450 H. sapiens 771 216978 334 23137 AGCCAGGTATAGAAAGGAGT 451 H. sapiens 772 216979 334 23170 AACTTTCTAAGAGGCAGAAT 452 H. sapiens 773 216981 334 23882 TCTTAGTCTGGTCATGAGTG 454 H. sapiens 774 216983 334 24184 AGTAGGAGATTTCATATGAA 456 H. sapiens 775 216985 334 24559 TCTTCACCAGCAACACATTA 458 H. sapiens 776 216987 334 24800 ATGGCCACCTAGCATGGCAC 460 H. sapiens 777 216989 334 24991 CATGTTTCTGAGCCTCCAGA 462 H. sapiens 778 216990 334 25067 TAGGTGGCTCCCTGTCTTCA 463 H. sapiens 779 216991 334 25152 TCCAAAGTCTTGGGAATCCT 464 H. sapiens 780 216995 334 26749 ACAAAGAAAGGGGGAGTTGG 468 H. sapiens 781 216996 334 26841 TCGTGTCTTCCTGGCCCAGA 469 H. sapiens 782 216997 334 27210 GCAGTGCCCAGCACACAATA 470 H. sapiens 783 216998 334 27815 ACTCGTCCAGGTGCGAAGCA 471 H. sapiens 784 216999 334 28026 GCCACCTAAGGTAAAGAAGG 472 H. sapiens 785 198 (continuação) ID DE SEQ ID Na SÍTIO SEQUÊNCIA CCMP REV DE ACTIVO EM SEQ ID N= SÍTIO ALVO ALVO SEQ ID Na 217000 334 28145 ATCAGAGTGGCAGAGAGAGC 473 H. sapiens 786 217002 334 28919 TTTACCATAGTT GT GACACA 475 H. sapiens 787 217006 334 29871 CATTTTGTAGGCAATG4GCT 479 H. sapiens 788 217007 334 30181 GCATTAGTAAACATGAGAAC 480 H. sapiens 789 217009 334 30931 TTCATTTCAGCGATGGCCGG 482 H. sapiens 790 217013 334 39562 GAAAATCTAGTGTCATTCAA 486 H. sapiens 791 217016 334 39789 TCCTATACAGTTTTGGGAAC 489 H. sapiens 792 217017 334 39904 AAGGACTTCAGTATGGAGCT 490 H. sapiens 793 217018 334 39916 ATGGAGCTTTTATTGAATTG 491 H. sapiens 794 217022 334 40412 CCATCAGCACTATTATTTAT 495 H. sapiens 795 217023 334 40483 ATAGGCAAGCTCAGCCATAG 496 H. sapiens 796 217025 334 40576 TGCTAGATGAGATACATCAA 498 H. sapiens 797 217026 334 40658 GAAGACCAAACATGGTTCTA 499 H. sapiens 798 217029 334 41130 CTCTGTTTAGTCCTCTCCAG 502 H. sapiens 799 217032 503 490 CATTGATAAAATGTTCTGGC 505 H. sapiens 800 217033 503 504 TCTGGCACAGCAAAACCTCT 506 H. sapiens 801 217034 503 506 TGGCACAGCAAAACCTCTAG 507 H. sapiens 802 217037 503 523 TAGAACACATAGTGTGATTT 510 H. sapiens 803 217039 503 526 AACACATAGTGTGATTTAAG 512 H. sapiens 804

Dado que se verificou por experimentação que estes "segmentos alvo preferidos" estão abertos e acessíveis para hibridação com os compostos anti-sentido da presente divulgação, um especialista na técnica reconhecerá ou será capaz de verificar, utilizando não mais que experimentação de rotina, aspectos adicionais da divulgação que abrangem outros compostos que se hibridam especificamente a estes segmentos alvo preferidos e, consequentemente, inibem a expressão de apolipoproteína B. 199

De acordo com a presente divulgação, os compostos anti-sentido incluem compostos oligoméricos anti-sentido, oligonucleótidos anti-sentido, ribozimas, oligonucleótidos de sequência guia externa (EGS), excisores alternativos, iniciadores, sondas e outros compostos oligoméricos curtos que se hibridam a, pelo menos, uma porção do ácido nucleico alvo.

Exemplo 37

Inibição anti-sentido da expressão de apolipoproteina B humana - dose-resposta de oligonucleótidos 12 Oligonucleótidos descritos nos Exemplos 29 e 31 foram posteriormente investigados num estudo de dose-resposta. Os oligonucleótidos de controlo utilizados neste estudo foram ISIS 18076 (SEQ ID N°: 805) e ISIS 13650 (SEQ ID N°: 806). 200

Todos os compostos neste estudo, incluindo controlos, eram oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros"), de 20 nucleótidos em comprimento, compostos por uma região de "lacuna" central consistindo de dez 2'-desoxinucleótidos, a qual está flanqueada em ambos os lados (direcções 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por nucleótidos de 2'-metoxietilo (2'-MOE). As ligações internucleósido (esqueleto) são fosforotioato (P=S) em todos os oligonucleótidos. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas.

Na experiência de dose-resposta, com níveis de ARNm como o ponto final, as células HepG2 foram tratadas com os oligonucleótidos anti-sentido ou os oligonucleótidos de controlo, a doses de 37, 75, 150, e 300 nM de oligonucleótido. Os dados foram obtidos por PCR quantitativo em tempo real, como aqui descrito noutros exemplos e a média é calculada a partir de duas experiências, com os níveis de ARNm nos grupos de tratamento sendo normalizado para um grupo de controlo não tratado. Os dados são mostrados na Tabela 19. 201

Tabela 19

Inibição dos níveis de ARNm de apolipoproteína B por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-M0E e uma lacuna desoxi - Resposta de Dose 37 nM Dose 75 nM 150 nM 300 nM Na ISIS % de inibição SEQ ID Na 271009 82 91 94 96 319 281625 62 76 84 94 224 301014 75 90 96 98 249 301027 80 90 95 96 262 301028 70 79 85 92 263 301029 54 67 79 85 264 301030 64 75 87 92 265 301031 61 82 92 96 266 301034 73 87 93 97 269 301036 67 83 92 95 271 301037 73 85 89 96 272 301045 77 86 94 98 280

Exemplo 38

Inibição anti-sentido da expressão de apolipoproteína B humana - resposta de dose - Gama de dose mais baixa

Sete oligonucleótidos descritos nos Exemplos 29, 31, 35 e 36 foram posteriormente investigados num estudo de resposta de dose. Os oligonucleótidos de controlo utilizados neste estudo 202 foram ISIS 18076 (SEQ ID N° : 805) e ISIS 13650 (SEQ ID N° : 806) e ISIS 129695 (SEQ ID N°: 807).

Todos os compostos neste estudo, incluindo controlos, eram oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros"), de 20 nucleótidos em comprimento, compostos por uma região de "lacuna" central consistindo de dez 2'-desoxinucleótidos, a qual está flanqueada em ambos os lados (direcções 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por nucleótidos de 2'-metoxietilo (2'-MOE). As ligações internucleósido (esqueleto) são fosforotioato (P=S) em todos os oligonucleótidos. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas.

Na experiência de dose-resposta, com níveis de ARNm como o ponto final, as células HepG2 foram tratadas com os oligonucleótidos anti-sentido ou os oligonucleótidos de controlo, a doses de 12,5, 37, 75, 150 e 300 nM de oligonucleótido. Os dados foram obtidos por PCR quantitativo em tempo real, como aqui descrito noutros exemplos e a média é calculada a partir de duas experiências, com os níveis de ARNm nos grupos de tratamento sendo normalizado para um grupo de controlo não tratado. Os dados são mostrados na Tabela 20. 203

Tabela 20

Inibição dos níveis de ARNm de apolipoproteína B por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-MOE e uma lacuna desoxi - Resposta de Dose 12,5 nM 37 nM Dose 75 nM 150 nM 300 nM N2 ISIS % de inibição SEQ ID N2 271009 67 86 92 94 95 319 281625 44 66 83 85 94 224 301012 63 79 90 92 95 247 308638 42 73 91 96 97 247 308642 59 84 91 97 98 319 308651 57 76 84 90 88 319 308658 29 61 73 78 90 224

Exemplo 39 Síntese de ARN

Em geral, a química de síntese de ARN é baseada na incorporação selectiva de diversos grupos protectores em reacções intermediárias estratégicas. Embora alguém com conhecimentos gerais na técnica compreenda a utilização de grupos protectores na síntese orgânica, uma classe útil de grupos protectores inclui éter silílico. Em particular, sãos utilizados éteres silílicos volumosos para proteger o 5'-hidroxilo em combinação com um grupo protector de ortoéster ácido-lábil no 2'-hidroxilo. Este conjunto de grupos protectores é, depois, utilizado com tecnologia de síntese de fase sólida padrão. É importante remover em último lugar o grupo protector 204 de ortoéster ácido-lábil após todas as outros passos sintéticas. Além disso, a utilização precoce dos grupos protectores de sililo durante a síntese garante a remoção fácil, quando desejado, sem desprotecção não desejada de hidroxilo em 2'.

Depois deste processo para a protecção sequencial do 5'-hidroxilo, em combinação com protecção do 2'-hidroxilo por grupos protectores que são diferencialmente removidos e são, diferencialmente, quimicamente lábeis, foram sintetizados oligonucleótidos de ARN.

Os oligonucleót idos de ARN são sintetizados num modo em passos. Cada nucleótido é adicionado sequencialmente (direcção 3' para 5') a um oligonucleótido ligado a suporte sólido. 0 primeiro nucleósido na extremidade 3' da cadeia está covalentemente conjugado a um suporte sólido. 0 precursor nucleotídico, um fosforamidito de ribonucleósido e activador são adicionados ligando a segunda base à extremidade 5' do primeiro nucleósido. 0 suporte é lavado e quaisquer grupos de 5'-hidroxilo não reagidos são capeados com anidrido acético para produzir fracções de 5'-acetilo. A ligação é, depois, oxidada na ligação de P(V) mais estável e, em última análise, desejada. No fim do ciclo de adição de nucleótido, o grupo 5'-sililo é clivado com fluoreto. 0 ciclo é repetido para cada nucleótido subsequente.

Após a síntese, os grupos protectores metilo nos fosfatos são clivados em 30 minutos, utilizando tri-hidrato de 2-carbamoil-2-cianoetileno-l, 1-ditiolato dissódico (S2Na2) a 1 M em DMF. A solução de desprotecção é lavada do oligonucleótido ligado ao suporte sólido utilizando água. O suporte é, depois, tratado com metilamina a 40% em água, durante 10 minutos, a 205 55 °C. Isto liberta os oligonucleótidos de ARN em solução, desprotege as aminas exocíclicas e modifica os grupos 2' . Nesta fase, os oligonucleótidos podem ser analisados por HPLC de permuta aniónica.

Os grupos de 2'-ortoéster são os últimos grupos protectores a ser removidos. 0 grupo protector de ortoéster de monoacetato de etilenoglicol, desenvolvido pela Dharmacon Research, Inc. (Lafayette, CO) , é um exemplo de um grupo protector de ortoéster útil que tem as seguintes propriedades importantes. É estável às condições da sintese de fosforamidito de nucleósido e sintese de oligonucleótido. Contudo, após a sintese oligonucleotidica, o oligonucleótido é tratado com metilamina que cliva, não apenas o oligonucleótido do suporte sólido, mas também remove os grupos acetilo dos ortoésteres. Os substituintes de 2-etil-hidroxilo resultantes no ortoéster são menos aptos a removerem electrões do que o precursor acetilado. Como resultado, o ortoéster modificado torna-se mais lábil à hidrólise catalisada por ácido. Especificamente, a taxa de clivagem é, aproximadamente, 10 vezes mais rápida depois de os grupos de acetilo serem removidos. Por conseguinte, este ortoéster possui estabilidade suficiente de modo a ser compatível com a síntese oligonucleotidica e, contudo, quando subsequentemente modificado, permite que a desprotecção seja efectuada sob condições aquosas relativamente moderadas, compatíveis com o produto de oligonucleótido de ARN final.

Além disso, os método de síntese de ARN são bem conhecidos na técnica (Scaringe, S. A., Tese de Doutoramento, Universidade de Colorado, 1996 ; Scaringe, S. A., et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 11820-11821; Matteucci, M. D. e Caruthers, Μ. H. J.

Am. Chem. Soc., 1981, 103, 3185-3191; Beaucage, S. L. e 206

Caruthers, Μ. H. Tetrahedron Let£., 1981, 22, 1859-1862; Dahl, B. J., et al., Acta Chem. Scand, . 1990, 44, 639-641; Reddy, M. P., et al., Tetrahedrom Lett., 1994, 25, 4311-4314; Wincott, F. et al., Nucleic Acids Res., 1995, 23, 2677-2684; Griffin, B. E., et al., Tetrahedron, 1967, 23, 2301-2313; Griffin, B. E., et al., Tetrahedron, 1967, 23, 2315-2331).

Os compostos anti-sentido de ARN (oligonucleótidos de ARN) da presente invenção podem ser sintetizados pelos presentes métodos ou adquiridos à Dharmacon Research, Inc (Lafayette, CO). Uma vez sintetizados, os compostos anti-sentido de ARN complementares podem ser, depois, emparelhados de um modo estável por métodos conhecidos na técnica, para formar compostos anti-sentido de cadeia dupla (duplexados). Por exemplo, os dúplices podem ser formados pela combinação de 30 pL de cada das cadeias complementares de oligonucleótidos de ARN (solução de oligonucleótido de ARN a 50 μΜ) e 15 pL de tampão de emparelhamento 5X (acetato de potássio a 100 mM, HEPES-KOH a 30 mM, pH 7,4, acetato de magnésio a 2 mM) , seguido de aquecimento, durante 1 minuto, a 90 °C, depois, 1 hora a 37 °C. Os compostos anti-sentido duplexados resultantes podem ser utilizados em kits, ensaios, rastreios ou outros métodos para investigar o papel de um ácido nucleico alvo.

Exemplo 40

Concepção e rastreio de compostos anti-sentido duplexados visando apolipoproteina B

Uma série de dúplices de ácido nucleico, compreendendo os compostos anti-sentido da presente invenção e os seus 207 complementos, é concebida para visar apolipoproteína B. A sequência de nucleobase da cadeia anti-sentido do dúplice compreende, pelo menos, uma porção de um oligonucleótido aqui descrito. As extremidades das cadeias podem ser modificadas pela adição de uma ou mais nucleobases, naturais ou modificadas, para formar uma protuberância. A cadeia sentido do ARNcd é, depois, concebida e sintetizada como o complemento da cadeia anti-sentido e também pode conter modificações ou adições a qualquer terminação. Por exemplo, numa forma de realização, ambas as cadeias do dúplice de ARNcd seriam complementares ao longo das nucleobases centrais, cada tendo protuberâncias em uma ou ambas as terminações. As cadeias anti-sentido e sentido do dúplice compreendem desde cerca de 17 a 25 nucleótidos ou desde cerca de 19 a 23 nucleótidos. Alternativamente, as cadeias anti-sentido e sentido compreendem 20, 21 ou 22 nucleótidos.

Por exemplo, um dúplice compreendendo uma cadeia anti-sentido tendo a sequência CGAGAGGCGGACGGGACCG e tendo uma protuberância de duas nucleobases de desoxitimidina(dT) teriam a seguinte estrutura: cgagaggcggacgggaccgTT Cadeia Anti-sentido TTgctctccgcctgccctggc Complemento

Noutra forma de realização, um dúplice compreendendo uma cadeia anti-sentido tendo a mesma sequência CGAGAGGCGGACGGGACCG pode ser preparado com extremidades rombas (sem protuberância de cadeia simples), como mostrado: cgagaggcggacgggaccg Cadeia Anti-sentido gctctccgcctgccctggc Complemento 208

As cadeias de ARN do dúplice podem ser sintetizadas por métodos aqui divulgados ou adquiridas à Dharmacon Research Inc., (Lafayette, CO). Uma vez sintetizadas, as cadeias complementares estão emparelhadas de um modo estável. As cadeias simples são aliquotadas e diluídas para uma concentração de 50 μΜ. Uma vez diluídos, 30 pL de cada cadeia são combinados com 15 pL de uma solução 5X de tampão de emparelhamento. A concentração final do referido tampão é acetato de potássio a 100 mM, HEPES-KOH a 30 mM, pH 7,4 e acetato de magnésio a 2 mM. O volume final é 75 pL. Esta solução é incubada durante 1 minuto, a 90 °C e, depois, centrifugada durante 15 segundos. O tubo é deixado repousar, durante 1 hora, a 37 °C, momento em que os dúplices de ARNcd são utilizados em experimentação. A concentração final do dúplice de ARNcd é 20 pM. Esta solução pode ser armazenada congelada (-20 °C) e congelada-descongelada até 5 vezes.

Uma vez preparados, os compostos anti-sentido duplexados são avaliados para a sua capacidade de modularem a expressão de apolipoproteína B.

Quando as células atingiam 80% de confluência, são tratadas com compostos anti-sentido duplexados da invenção. Para células cultivadas em placas de 96 poços, os poços são lavados, uma vez, com 200 pL de meio de soro reduzido OPTI-MEM-1 (Gibco BRL) e, depois, tratados com 130 pL de OPTI-MEM-1 contendo LIPOFECTIN a 12 pg/mL (Gibco BRL) e o composto anti-sentido de dúplice desejado a uma concentração final de 200 nM. Após 5 horas de tratamento, o meio é substituído com meio fresco. As células são recolhidas 16 horas após tratamento, momento em que o ARN é isolado e a redução de alvo medida por RT-PCR. 209

Exemplo 41

Concepção de ensaios fenotipicos e estudos In vivo para a utilização de inibidores de apolipoproteina B

Ensaios fenotipicos

Depois dos inibidores de apolipoproteina B terem sido identificados pelos métodos aqui divulgados, os compostos são posteriormente investigados em um ou mais ensaios fenotipicos, cada tendo pontos finais mensuráveis preditivos de eficácia no tratamento de um estado de doença ou estado particular. Os ensaios fenotipicos, kits e reagentes para a sua utilização são bem conhecidos dos especialistas na técnica e são aqui utilizados para investigar o papel e/ou associação de apolipoproteina B na saúde e doença. Os ensaios fenotipicos representativos, os quais podem ser adquiridos a qualquer um de vários vendedores comerciais, incluem aqueles para determinar a viabilidade, citotoxicidade, proliferação celulares ou sobrevivência celular (Molecular Probes, Eugene, OR;

PerkinElmer, Boston, MA) , ensaios baseados em proteína, incluindo ensaios enzimáticos (Panvera, LLC, Madison, WI; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ; Oncogene Research Products, San Diego, CA) , regulação celular, transdução de sinal, inflamação, processos oxidativos e apoptose (Assay Designs Inc., Ann Arbor, MI), acumulação de triglicéridos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ensaios de angiogénese, ensaios de formação de tubo, ensaios de citocina e hormona e ensaios metabólicos (Chemicon International Inc., Temecula, CA; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). 210

Num exemplo não limitativo, as células determinadas como sendo apropriadas para um ensaio fenotípico particular (i. e., células MCF-7 seleccionadas para estudos de cancro da mama; adipócitos para estudos de obesidade) são tratadas com inibidores de apolipoproteína B, identificados a partir dos estudos in vitro, assim como compostos de controlo a concentrações óptimas que são determinadas pelos métodos descritos acima. No fim do período de tratamento, as células tratadas e não tratadas são analisadas por um ou mais métodos específicos para o ensaio, para determinar resultados fenotípico e pontos finais.

Os pontos finais fenotípicos incluem alterações na morfologia celular ao longo do tempo ou dose de tratamento, assim como alterações nos níveis de componentes celulares, tais como proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, hormonas, sacáridos ou metais. As medições do estatuto celular que incluem pH, estádio do ciclo celular, ingestão ou excreção de indicadores biológicos pela célula, também são pontos finais de interesse. A análise do genótipo da célula (medição da expressão de um ou mais dos genes da célula) , após tratamento, também é utilizada como um indicador da eficácia ou potência dos inibidores de apolipoproteína B. Os genes distintivos, ou os genes suspeitos de estarem associados a um estado de doença, estado ou fenótipo específicos, são medidos em células tratadas e não tratadas. 211

Estudos in vivo

Os sujeitos individuais dos estudos in vivo aqui descritos são animais vertebrados de sangue quente, que incluem humanos. 0 ensaio clinico é submetido a rigorosos controlos, para garantir que os indivíduos não são desnecessariamente colocados em risco e que são totalmente informados acerca do seu papel no estudo.

Para ter em conta os efeitos psicológicos de receber os tratamentos, aos voluntários é aleatoriamente administrado placebo ou inibidor de apolipoproteína B. Além disso, para impedir os médicos de serem tendenciosos nos tratamentos, não são informados sobre se a medicação que estão a administrar é um inibidor de apolipoproteína B ou um placebo. Utilizando esta abordagem de aleatorização, cada voluntário tem a mesma probabilidade de ser administrado com o novo tratamento ou com o placebo.

Os voluntários recebem o inibidor de apolipoproteína B ou placebo, durante um período de oito semanas, com os parâmetros biológicos associados ao estado de doença ou estado indicados sendo medidos no início (medições de linha de base antes de qualquer tratamento), fim (após o tratamento final) e a intervalos regulares durante o período de estudo. Essas medições incluem os níveis de moléculas de ácido nucleico codificando apolipoproteína B ou níveis de proteína de apolipoproteína B em fluidos corporais, tecidos ou órgãos, em comparação com níveis pré-tratamento. Outras medições incluem mas não estão limitadas a índices do estado de doença ou estado sendo tratado, peso corporal, pressão sanguínea, títulos séricos de indicadores 212 farmacológicos de doença ou toxicidade, assim como medições de ADME (absorção, distribuição, metabolismo e excreção). A informação registada para cada doente inclui idade (anos), género, altura (cm), história familiar do estado de doença ou estado (sim/não), avaliação de motivação (alguma/moderada/grande) e número e tipo de regimes de tratamento anteriores para a doença ou estado indicados.

Os voluntários tomando parte neste estudo são adultos saudáveis (idade de 18 a 65 anos) e aproximadamente um número igual de homens e mulheres participa no estudo. Os voluntários com determinadas características são igualmente distribuídos para placebo e tratamento de inibidor de apolipoproteína B. Em geral, os voluntários tratados com placebo têm pouca ou nenhuma resposta ao tratamento, ao passo que os voluntários tratados com o inibidor de apolipoproteína B mostram tendência positiva no seu índice de estado de doença ou estado na conclusão do estudo.

Exemplo 42

Inibição anti-sentido da expressão de apolipoproteína B de coelho por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-M0E e uma lacuna desoxi

Foi concebida uma série de oligonucleótidos para visar diferentes regiões de apolipoproteína B de coelho, utilizando sequências publicadas (acesso GenBank número X07480.1, aqui incorporada como SEQ ID N° : 808, acesso GenBank número M17780.1, aqui incorporada como SEQ ID N° : 809 e foi derivada uma sequência utilizando iniciadores descritos anteriormente 213 (Tanaka, Journ. Biol. Chem., 1993, 268, 12713-12718) representando um ARNm da apolipoproteína B de coelho, aqui incorporada como SEQ ID N°: 810). Os oligonucleótidos são mostrados na Tabela 21. "Sitio alvo" indica o primeiro número de nucleótido (mais em 5') na sequência alvo particular a que se liga o oligonucleótido. Todos os compostos na Tabela 21 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros"), de 20 nucleótidos em comprimento, compostos por uma região de "lacuna" central consistindo de dez 2'-desoxinucleótidos, a qual está flanqueada em ambos os lados (direcções 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por nucleótidos de 2'-metoxietilo (2'-MOE). As ligações internucleósido (esqueleto) são fosforotioato (P=S) em todo o oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas. Os compostos foram analisados para o seu efeito nos níveis de ARNm de apolipoproteína B de coelho em hepatócitos primários de coelho por PCR quantitativo em tempo real, como aqui descrito noutros exemplos. Os hepatócitos primários de coelho foram tratados com 150 nM dos compostos na Tabela 21. Para apolipoproteína B de coelho, os iniciadores de PCR foram: iniciador directo: AAGCACCCCCAATGTCACC (SEQ ID N° : 811) iniciador inverso: GGGATGGCAGAGCCAATGTA (SEQ ID N°: 812) e a sonda de PCR foi: FAM- TCCTGGATTCAAGCTTCTATGTGCCTTCA - TAMRA (SEQ ID N°: 813), onde FAM (PE-Applied Biosystems,

Foster City, CA) é o corante repórter fluorescente) e TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) é o corante neutralizador. Os dados são médias de duas experiências. Se presente, "N.D." indica "não determinado". 214

Tabela 21

Inibição dos níveis de ARNm de apolipoproteína B de coelho por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-M0E e uma lacuna desoxi N2 ISIS SEQ ID N2 ALVO SÍTIO ALVO SEQUÊNCIA % DE INIB. SEQ ID N2 233149 808 1 TGCTTGGAGAAGGTAAGATC 0 814 233150 810 1 GCGTTGTCTCCGATGTTCTG 20 815 233151 809 13 TAATCATTAACTTGCTGTGG 20 816 233152 808 22 TCAGCACGTAGCAATGCATT 0 817 233153 808 31 GCCTGATACTCAGCACGTAG 0 818 233154 809 31 CAATTGAATGTACTCAGATA 18 819 233155 808 51 ACCTCAGTGACTTGTAATCA 47 820 233156 809 51 CACTGGAAACTTGTCTCTCC 23 821 233157 809 71 AGTAGTTAGTTTCTCCTTGG 0 822 233159 808 121 TCAGTGCCCAAGATGTCAGC 0 823 233160 810 121 ATTGGAATAATGTATCCAGG 81 824 233161 809 130 TTGGCATTATCCAATGCAGT 28 825 233162 808 151 GTTGCCTTGTGAGCAGCAGT 0 826 233163 810 151 ATTGTGAGTGGAGATACTTC 80 827 233164 809 171 CATATGTCTGAAGTTGAGAC 8 828 233165 808 181 GTAGATACTCCATTTTGGCC 0 829 233166 810 181 GGATCACATGACTGAATGCT 82 830 233167 808 201 TCAAGCTGGTTGTTGCACTG 28 831 233168 808 211 GGACTGTACCTCAAGCTGGT 0 832 233169 808 231 GCTCATTCTCCAGCATCAGG 14 833 233170 809 251 TTGATCTATAATACTAGCTA 23 834 233172 810 282 ATGGAAGACTGGCAGCTCTA 86 835 233173 808 301 TTGTGTTCCTTGAAGCGGCC 3 836 233174 809 301 TGTGCACGGATATGATAACG 21 837 233175 810 306 GACCTT GAGTAGATT CCTGG 90 838 233176 810 321 GAAATCTGGAAGAGAGACCT 62 839 233177 808 331 GTAGCTTTCCCATCTAGGCT 0 840 233178 808 346 GATAACTCTGTGAGGGTAGC 0 841 215 (continuação)

Na ISIS SEQ ID N2 ALVO SÍTIO ALVO SEQUÊNCIA % DE INIB. SEQ ID N2 233179 810 371 ATGTTGCCCATGGCTGGAAT 65 842 233180 809 381 AAGATGCAGTACTACTTCCA 13 843 233181 808 382 GCACCCAGAATCATGGCCTG 0 844 233182 809 411 CTTGATACTTGGTATCCACA 59 845 233183 810 411 CAGTGTAATGATCGTTGATT 88 846 233184 810 431 TAAAGTCCAGCATTGGTATT 69 847 233185 810 451 CAACAATGTCTGATTGGTTA 73 848 233186 810 473 GAAGAGGAAGAAAGGATATG 60 849 233187 810 481 TGACAGATGAAGAGGAAGAA 66 850 233188 810 500 TTGTACTGTAGTGCATCAAT 74 851 233189 809 511 GCCTCAATCTGTTGTTTCAG 46 852 233190 810 520 ACTTGAGCGTGCCCTCTAAT 69 853 233191 809 561 GAAATGGAATTGTAGTTCTC 31 854

Exemplo 43

Inibição anti-sentido da expressão de apolipoproteina B de coelho por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-MOE e uma lacuna desoxi - Estudo de Resposta de Dose

Um subconjunto dos oligonucleótidos anti-sentido no Exemplo 42 foi ainda investigado em estudos de dose-resposta. As doses de tratamento foram 10, 50, 150 e 300 nM. ISIS 233160 (SEQ ID N°: 824), ISIS 233166 (SEQ ID N°: 830), ISIS 233172 (SEQ ID N°: 835), ISIS 233175 (SEQ ID N°: 838) e ISIS 233183 (SEQ ID N° : 846) foram analisados para o seu efeito nos niveis de ARNm de apolipoproteina B de coelho em hepatócitos primários de coelho por PCR quantitativo em tempo real, como aqui descrito noutros exemplos. Os dados são médias de duas experiências e são mostrados na Tabela 22. 216

Tabela 22

Inibição dos níveis de ARNm de apolipoproteína B de coelho por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos tendo asas de 2'-M0E e uma lacuna desoxi

Percentagem de Inibição N2 ISIS 300 nM 150 nM 50 nM 10 nM 233160 80 74 67 33 233166 73 79 81 66 233172 84 81 76 60 233175 93 90 85 67 233183 80 81 71 30

Exemplo 44

Efeitos da inibição anti-sentido de apolipoproteína B em murganhos LDLr_/_ — Resposta de Dose

Os murganhos deficientes em receptor de LDL (murganhos LDLr (-/-) ) , uma estirpe que não pode editar o ARNm de apolipoproteína B e, por conseguinte, sintetizar exclusivamente apolipoproteína B-100, têm níveis de colesterol LDL e apolipoproteína B-100 marcadamente elevados e desenvolvem extensa aterosclerose.

Os murganhos LDLr(-/-), adquiridos à Taconic (Germantown, N.I.) foram utilizados para avaliar oligonucleótidos anti-sentido para o seu potencial para diminuírem níveis de ARNm ou proteína de apolipoproteína B, assim como pontos finais fenotípicos associados a apolipoproteína B. Os murganhos 217 LDLr(-/-) foram separados em grupos de machos e fêmeas. Os murganhos LDLr(-/-) foram doseados intraperitonealmente, duas vezes por semana, durante seis semanas, com 10, 25 ou 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID N° : 109) ou ISIS 270906 (SEQ ID N° : 856) que tem um erro-de-emparelhamento de 4 bases de ISIS 147764, ou com solução salina ou 20 mg/kg de Atorvastatina. No final do estudo, os animais foram sacrificados e avaliados para vários marcadores fenotipicos. O ISIS 147764 foi capaz de diminuir os níveis de colesterol, triglicéridos e ARNm, num modo dependente da dose, em murganhos macho e fêmea, enquanto o ISIS 270906 com erro-de-emparelhamento de 4 bases não foi capaz de o fazer. Os resultados do estudo são resumidos na Tabela 23.

Tabela 23

Efeitos do tratamento de ISIS 147764 em murganhos LDLr-/- macho e fêmea nos níveis de ARNm de apolipoproteína B, enzimas hepáticas, colesterol e triglicéridos.

Dose Enzimas Hepáticas IU/L Lipoproteinas mg/dL % De controlo de ARNm ISIS N° mg/kg AST ALT COL HDL LDL TRIG Machos Solução Salina 68,4 26,6 279,2 125, 4 134, 7 170,6 100,0 10 57,6 29,8 314, 2 150, 0 134, 7 198,6 61, 7 147764 25 112,6 78,8 185, 0 110,6 66,2 104,2 30,7 50 163,6 156, 8 165,6 107, 8 51,2 113, 4 16,6 270906 50 167, 4 348,0 941, 0 244,2 541,9 844, 8 N.D. Atorvastatina 20 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 110, 9 218 (continuação)

Dose Enzimas Hepáticas IU/L AST ALT Lipoproteínas mg/dL COL HDL LDL TRIG % De controlo de ARNm ISIS N° mg/kg Fêmeas Solução Salina 65, 0 23, 4 265, 8 105, 8 154,9 121, 4 100,0 10 82,0 27,2 269,6 121, 0 127, 8 140, 8 64,2 14776410 25 61, 4 32,2 175, 8 99,5 68,9 100, 4 41,3 50 134,6 120, 4 138,2 92,2 45,9 98, 0 18,5 270906 50 96, 0 88,6 564,6 200, 0 310,0 240, 4 N.D. Atorvastatina 20 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 109, 0

Exemplo 45

Efeitos da inibição anti-sentido de apolipoproteina B em macacos Cinomolgos

Os macacos Cinomolgos, alimentados com uma dieta aterogénica, desenvolvem aterosclerose, com muitas semelhanças com a aterosclerose de humanos. Os macacos Cinomolgos fêmea partilham várias semelhanças em lipoproteínas e no sistema cardiovascular com humanos. Além destas caracteristicas, há semelhanças na biologia reprodutiva. 0 Cinomolgos fêmea tem um ciclo menstrual de 28 dias como o das mulheres. As concentrações hormonais plasmáticas foram medidas durante todo o ciclo menstrual de Cinomolgos e a duração das fases folicular e lútea, assim como concentrações plasmáticas de estradiol e progesterona em todo o ciclo, também são notavelmente semelhantes às das mulheres. 219

Os macacos Cinomolgos (macho ou fêmea) podem ser utilizados para avaliar oligonucleótidos anti-sentido para o seu potencial para diminuírem os níveis de ARNm ou proteína de apolipoproteína B, assim como pontos finais fenotípicos associados a apolipoproteína B, incluindo mas não limitados a indicadores cardiovasculares, aterosclerose, doenças lipídicas, obesidade e formação de placa. Um estudo poderia incluir macacos normais e hipercolesterolémicos induzidos, alimentados com dietas que são normais ou elevadas em lípido e colesterol. Os macacos Cinomolgos podem ser doseados numa variedade de regimes, sendo um deles, subcutaneamente, com 10-20 mg/kg do composto oligomérico, durante 1-2 meses. Os parâmetros que podem ser observados durante o período de teste poderiam incluir: colesterol total plasmático, colesterol LDL, colesterol HDL, triglicérido, conteúdo de colesterol de parede arterial e espessamento da íntima coronária.

Exemplo 4 6

Sequenciação de segmento alvo preferido de apolipoproteína B de macaco Cinomolgos (Macaca fascicularis)

Uma porção do ARNm de apolipoproteína B de macaco cinomolgos, não disponível na técnica, foi amplificada. As posições 2920 a 3420 da sequência de ARNm de apolipoproteína B humana (acesso GenBank número NM_000384.1, aqui incorporada como SEQ ID N° : 3) contêm o segmento alvo preferido a que o ISIS 301012 se hibrida e o segmento correspondente de ARNm de apolipoproteína B de macaco cinomolgos foi amplificado e sequenciado. O sítio a que o ISIS 301012 se hibrida na apolipoproteína B humana foi amplificado pela colocação de 220 iniciadores na posição 2920 em 5' e posição 3420 em 3'. Os hepatócitos de macaco cinomolgos foram adquiridos à In Vitro Technologies (Gaithersburg, MD) . Os fragmentos de 500 pb foram produzidos utilizando ADNc de Io de hepatócito humano e de macaco cinomolgos e foram produzidos por transcrição reversa de ARN total purificado, seguida de 40 ciclos de amplificação por PCR. Após purificação em gel dos produtos de amplificação humanos e de cinomolgos, as reacções de sequenciação directa e inversa de cada produto foram realizadas por Retrogen (o kit da Invitrogen foi utilizado para criar o ADNc de cadeia simples e proporcionou reagentes para a recção de PCR Amplitaq). A sequência de macaco cinomolgo é aqui incorporada como SEQ ID N° : 855 e é 96% idêntica às posições 2920 a 3420 do ARNm de apolipoproteína B humana.

Exemplo 47

Efeitos da inibição anti-sentido do gene de apolipoproteina B humana (ISIS 2S1625 e 301012) em murganhos transgénicos C57BL/6NTac-TgN(APOBlOO)

Os murganhos transgénicos C57BL/6NTac-TgN(APOBlOO) têm o gene de apolipoproteína B humana "knocked-in". Estes murganhos expressam níveis elevados de apolipoproteína B100 humana, resultando em murganhos com níveis séricos elevados de colesterol LDL. Estes murganhos são úteis na identificação e avaliação de compostos para reduzir níveis elevados de colesterol LDL e o risco da aterosclerose. Quando alimentados com uma dieta de colesterol com elevado teor de gordura, estes murganhos desenvolvem acumulação significativa de células espumosas subjacente ao endotélio e na média e têm lesões 221 ateroscleróticas significativamente mais complexas do que os animais de controlo.

Os murganhos C57BL/6NTac-TgN(AP0B100) foram divididos em dois grupos - um grupo recebendo tratamento de oligonucleótido e os animais de controlo recebendo tratamento de solução salina. Após jejum de um dia para o outro, os murganhos foram doseados intraperitonealmente, duas vezes por semana, com solução salina ou ISIS 281625 a 25 mg/kg (SEQ ID N° : 224) ou ISIS 301012 (SEQ ID N°: 247), durante oito semanas. No final do estudo e quarenta e oito horas após as injecções finais, os animais foram sacrificados e avaliados para níveis de ARNm alvo no fígado, níveis de colesterol e triglicéridos e níveis de enzimas hepáticas. Além disso, os níveis endógenos de apolipoproteína B de murganho no fígado foram medidos para avaliar quaisquer efeitos destes oligonucleótidos anti-sentido direccionados para a apolipoproteína B humana.

Após tratamento com ISIS 281625 ou ISIS 301012, os níveis de AST e ALT estavam aumentados não excedendo, contudo, níveis normais (-300 IU/L). Os níveis de colesterol estavam ligeiramente aumentados em relação ao tratamento de solução salina, enquanto os níveis de triglicéridos estavam ligeiramente diminuídos. O tratamento com qualquer destes oligonucleótidos direccionados para a apolipoproteína B humana que é expressa nestes murganhos diminuiu marcadamente os níveis de ARNm da apolipoproteína humana, enquanto os níveis da apolipoproteína B endógena de murganho não foram afectados, indicando que estes oligonucleótidos exibem especificidade para a apolipoproteína B humana. Os resultados dos estudos comparativos são mostrados na Tabela 24. 222

Tabela 24

Efeitos do tratamento de ISIS 281625 e 301012 em murganhos nos níveis de ARNm de apolipoproteína B, enzimas hepáticas, colesterol e triglicéridos. ISIS N2 SOLUÇÃO SALINA 2S1625 301012 Enzimas Hepáticas IU/L AST 70,3 265, 8 208, 4 ALT 32,8 363,8 137, 4 Lipoproteínas mg/dL COL 109,5 152,0 145, 1 HDL 67, 3 84, 6 98,6 LDL 30,2 49, 8 36,6 TRIG 194, 5 171, 1 157, 8 % De controlo de ARNm ARNm humano 100, 0 45, 2 23, 7 ARNm de murganho 100, 0 111,0 94, 6

Após 2 e 4 semanas de tratamento de ISIS 301012, os níveis de colesterol LDL foram significativamente reduzidos para 22 mg/dL e 17 mg/dL, respectivamente.

Os níveis de proteína de apolipoproteína B no fígado também foram avaliados no fim do período de tratamento de 8 semanas. A proteína hepática foi isolada e submetida a análise de imunotransferência, utilizando anticorpos específicos para proteína de apolipoproteína B humana ou de murganho (US Biologicals, Swampscott, MA e Santa Cruz Biotechnology, Inc., 223

Santa Cruz, CA, respectivamente). A análise de imunotransferência de amostras de proteína hepática revela uma redução na expressão de ambas as formas de apolipoproteína B humana, apolipoproteína B-100 e apolipoproteína B-48. Os níveis de apolipoproteína B de murganho no fígado não foram significativamente alterados, como avaliado por análise de imunotransferência.

As amostras séricas também foram recolhidas às 2, 4, 6 e 8

semanas e foram avaliadas para expressão de apolipoproteína B humana, pela utilização de um kit de ELISA específico de apolipoproteína B humana (ALerCHEK Inc. , Portland, ME) . A quantificação de proteína de apolipoproteína B humana sérica por ELISA revelou que o tratamento com ISIS 281625 reduziu a proteína de apolipoproteína B humana sérica em 31, 26, 11 e 26%, às 2, 4, 6 e 8 semanas, respectivamente, em relação a animais tratados com solução salina. 0 tratamento com ISIS 301012 reduziu a proteína de apolipoproteína B humana sérica em 70, 87, 81 e 41%, às 2, 4, 6 e 8 semanas, respectivamente, em relação a animais de controlo tratados com solução salina. O soro de murganhos transgénicos também foi submetido a análise de imunotransferência, utilizando anticorpos específicos de apolipoproteína B humana e de murganho (US Biologicals, Swampscott, MA e Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, respectivamente) . A análise de imunotransferência de amostras séricas retiradas de animais mostra um padrão semelhante de expressão de apolipoproteína B humana, com uma redução significativa na proteína de apolipoproteína B sérica, após 2, 4 e 6 semanas de tratamento e uma ligeira redução às 8 semanas. A apolipoproteína B de murganho no soro não foi significativamente alterada, como avaliado por análise de imunotransferência. 224

Exemplo 48

Efeitos da inibição anti-sentido de apolipoproteina B (ISIS 233172, 233175, 281625, 301012 e 301027) em murganhos C57BL/6

Os murganhos C57BL/6, uma estirpe referida como sendo susceptivel a formação de placa aterosclerótica induzida por hiperlipidemia, foram utilizados nos seguintes estudos para avaliar a toxicidade em murganhos de vários oligonucleótidos anti-sentido direccionados para apolipoproteina B humana ou de coelho.

Os murganhos C57BL/6 foram divididos em dois grupos - um grupo recebendo tratamento de oligonucleótido e os animais de controlo recebendo tratamento de solução salina. Após jejum de um dia para o outro, os murganhos foram doseados intraperitonealmente, duas vezes por semana, com solução salina ou 25 mg/kg de um de vários oligonucleótidos, durante duas semanas. Os oligonucleótidos anti-sentido utilizados no presente estudo foram ISIS 233172 (SEQ ID N°: 835) e ISIS 233175 (SEQ ID N°: 838), ambos direccionados para apolipoproteina B de coelho e ISIS 281625 (SEQ ID N°: 224), ISIS 301012 (SEQ ID N°: 247) e ISIS 301027 (SEQ ID N°: 262), direccionados para apolipoproteina B humana. No final do estudo e quarenta e oito horas após as injecções finais, os animais foram sacrificados e avaliados para níveis de enzimas hepáticas, peso corporal, peso de fígado e peso de baço.

Os níveis de enzimas hepáticas em murganhos estavam diminuídos em relação a tratamento de solução salina, para três dos oligonucleótidos anti-sentido. Contudo, o oligonucleótido 225 ISIS 233175 de coelho e o oligonucleótido ISIS 301027 humano, deduziram ambos níveis drasticamente aumentados destas enzimas hepáticas, indicando toxicidade. Para a totalidade dos oligonucleótidos testados, a alteração no peso corporal, fígado e baço foi menor. Os resultados dos estudos comparativos são mostrados na Tabela 25.

Tabela 25

Efeitos de oligonucleótidos anti-sentido direccionados para apolipoproteína B humana ou de coelho nos níveis de ARNm de apolipoproteína B de murganho, enzimas hepáticas, colesterol e triglicéridos. ISIS N2 SOLUÇÃO SALINA 233172 233175 2S1625 301012 301027 Enzimas Hepáticas AST IU/L 104, 5 94, 3 346,7 89,5 50,6 455, 3 ALT IU/L 39,5 43,3 230,2 36,2 21,2 221,3 Peso CORPO 21,2 21,3 21,5 20,9 21,3 21,2 FÍGADO 1,1 1,3 1,4 1,2 1,1 1,3 BAÇO 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Exemplo 49

Avaliação do curso temporal de oligonucleótido a duas doses diferentes

Os murganhos C57BL/6, uma estirpe referida como sendo susceptível a formação de placa aterosclerótica induzida por 226 hiperlipidemia, foram utilizados nos seguintes estudos para avaliar a toxicidade em murganhos de vários oligonucleótidos anti-sentido direccionados para apolipoproteína B humana.

Os murganhos C57BL/6 fêmea foram divididos em dois grupos -um grupo recebendo tratamento de oligonucleótido e os animais de controlo recebendo tratamento de solução salina. Após jejum de um dia para o outro, os murganhos foram doseados intraperitonealmente, duas vezes por semana, com solução salina ou 25 mg/kg ou 50 mg/kg de ISIS 281625 (SEQ ID N° : 224), ISIS 301012 (SEQ ID N°: 247) ou ISIS 301027 (SEQ ID N°: 262). Após 2 semanas, uma amostra sanguínea foi retirada da cauda dos murganhos e avaliada para enzima hepática. Após 4 semanas e terminação do estudo, os animais foram sacrificados e avaliados para níveis de enzimas hepáticas.

Para ISIS 281625 e ISIS 301012, os níveis de AST e ALT permaneceram próximo dos da solução salina, a qualquer dosem após 2 semanas. Após 4 semanas, os níveis de AST e ALT mostraram um aumento moderado em relação a animais tratados com solução salina para a dose mais baixa, mas um grande aumento à dose mais elevada . 0 ISIS 301027, administrado a qualquer dose, mostrou um pequeno aumento nos níveis de AST e ALT após 2 semanas e um enorme aumento nos níveis de AST e ALT após 4 semanas. Os resultados dos estudos são sumariados na Tabela 26. 227

Tabela 26 Níveis de AST e ALT em murganhos tratados com ISIS 281625, 301012 ou 301027 após 2 e 4 semanas AST (IU/L) ALT (IU/L) 2 semanas 4 semanas 2 semanas 4 semanas SOLUÇÃO SALINA 49,6 63,2 22, 4 25, 2 ISIS Nfi Dose (mg/kg) 281625 25 40,8 75 21,2 31, 8 50 44, 4 152,4 30, 8 210, 4 301012 25 37, 2 89, 8 22, 4 24, 8 50 38,4 107, 4 23,2 29,2 301027 25 55, 4 537, 6 27, 2 311,2 50 64 1884 34, 8 1194

Exemplo 50

Efeitos da inibição anti-sentido de apolipoproteina B (ISIS 147483 e 147764) em murganhos ob/ob A leptina é uma hormona produzida pela gordura que regula o apetite. As deficiências nesta hormona em humanos e animais não humanos conduzem a obesidade. Os murganhos ob/ob têm uma mutação no gene de leptina que resulta em obesidade e hiperglicemia. Como tal, estes murganhos são um modelo útil para a investigação da obesidade e diabetes e os tratamentos concebidos para tratar estes estados.

Os murganhos ob/ob recebendo uma dieta de elevado teor de gordura, elevado colesterol (60% de kcal de gordura suplementado com colesterol a 0,15%) foram tratados com um de vários oligonucleótidos, para avaliar o seu efeito em pontos finais 228 fenotípicos relacionados com apolipoproteína B em murganhos ob/ob. Após jejum de um dia para o outro, os murganhos de cada grupo foram doseados intraperitonealmente, duas vezes por semana, com 50 mg/kg de ISIS 147483 (SEQ ID N°: 79) ou 147764 (SEQ ID N° : 109), ou os controlos ISIS 116847 (SEQ ID N° : 857) ou 141923 (SEQ ID N°: 858), ou solução salina, durante seis semanas. No final do estudo e quarenta e oito horas após as injecções finais, os animais foram sacrificados e avaliados para níveis de ARNm alvo no fígado, níveis de colesterol e triglicéridos, níveis de enzimas hepáticas, níveis séricos de glucose e níveis de PTEN. ISIS 147483 e 147764 foram ambos capazes de diminuírem os níveis de ARNm de apolipoproteína B, assim como os níveis de glucose, colesterol e triglicéridos. Os resultados dos estudos comparativos são mostrados na Tabela 27.

Tabela 27

Efeitos do tratamento de ISIS 147483 e 147764 em murganhos ob/ob nos níveis de ARNm de apolipoproteína B, colesterol, lípido, triglicérido, enzima hepática, glucose e PTEN. ISIS N2 SOLUÇÃO SALINA 116847 141923 147483 147764 Glucose mg/dL 269,6 135,5 328,5 213,2 209,2 Enzimas Hepáticas IU/L AST 422,3 343,2 329,3 790,2 406,5 ALT 884, 3 607, 5 701,7 941, 7 835, 0 Lipoproteínas mg/ dL COL 431,9 287,5 6 46,3 250,0 286,3 229 (continuação) ISIS N2 SOLUÇÃO SALINA 116847 141923 147483 147764 TRIG 128,6 196,5 196,5 99,8 101,2 ARNm % de controlo ApoB 100,0 77, 0 100,0 25, 2 43, 1 PTEN 100,0 20, 0 113,6 143,2 115,3

Exemplo 51

Inibição anti-sentido de apolipoproteina B em murganhos alimentados com elevado teor de gordura: efeitos dependentes do tempo

Numa forma de realização adicional da invenção, a inibição de ARNm de apolipoproteina B em murganhos foi comparada com concentração hepática de oligonucleótido, colesterol total, colesterol LDL e colesterol HDL. Os murganhos C57B1/6 macho recebendo uma dieta de elevado teor de gordura (60% de gordura) foram avaliados ao longo do curso de 6 semanas para os efeitos de tratamento com injecções intraperitoneais, duas vezes por semana, de ISIS 147764 a 50 mg/kg (SEQ ID N° : 109) ou 50 mg/kg do oligonucleótido de controlo ISIS 141923 (SEQ ID N° : 858). Os animais de controlo receberam tratamento de solução salina. Os animais foram sacrificados após 2 dias, 1, 2, 4 e 6 semanas de tratamento. Cada grupo de tratamento em cada intervalo de tempo consistia de 8 murganhos. 230 A expressão de alvo no fígado foi medida por PCR em tempo real, como aqui descrito por outros exemplos e é expressa como percentagem de inibição em relação a murganhos tratados com solução salina. Os níveis de colesterol total, LDL e HDL foram medidos por análise clínica de rotina, utilizando um Analisador Clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, N.I.) e são apresentados em mg/dL. Os resultados de animais tratados com solução salina são mostrados para comparação. 0 oligonucleótido intacto em tecido de fígado foi medido por electroforese em gel capilar e é apresentado como microgramas de oligonucleótido por grama de tecido. Todos os resultados são a média de 8 animais e são mostrados na Tabela 28.

Tabela 28

Correlação entre concentração hepática de fármaco, expressão de ARNm de apolipoproteína B e lípidos séricos durante tratamento de ISIS 147764

Período de tratamento Nfi ISIS 2 dias 1 semana 2 semanas 4 semanas 6 semanas % de inibição de ARNm de apolipoproteína B 141923 9 4 7 0 0 147764 50 57 73 82 88 Oligonucleótido intacto pg/g 141923 58 61 152 261 631 147764 85 121 194 340 586 Colesterol total mg/dL solução salina 105 152 144 180 191 141923 99 146 152 169 225 147764 101 128 121 75 73 231 (continuação)

Período de tratamento Nffi ISIS 2 dias 1 2 4 6 semana semanas semanas semanas solução 8 32 28 50 46 Colesterol LDL mg/dL salina 141923 8 27 27 38 56 147764 7 19 14 7 7 solução 74 117 114 127 141 Colesterol HDL mg/dL salina 141923 70 116 122 128 166 147764 76 107 105 6 6 64

Estes resultados ilustram que a inibição de ARNm de apolipoproteina B por ISIS 147764 ocorreu no espaço de 2 dias de tratamento, aumentou com tratamentos sucessivos e persistiu durante 6 semanas de tratamento. A quantificação dos níveis hepáticos de oligonucleótido revela uma forte correlação entre a extensão da inibição do alvo e a concentração hepática de fármaco. Além disso, às 1, 2, 3 e 4 semanas de tratamento, é observada uma correlação inversa entre a inibição de ARNm alvo e níveis de colesterol (total, HDL e LDL), com os níveis de colesterol diminuindo à medida que a percentagem de inibição de ARNm de apolipoproteina B se torna maior. As amostras séricas foram submetidas a análise imunotransferência, utilizando um anticorpo para detectar proteína de apolipoproteina B de murganho (Gladstone Institute, São Francisco, CA) . A expressão de proteína segue o mesmo padrão que o do ARNm, com a proteína de apolipoproteina B no soro marcadamente reduzida no espaço de 48 horas e diminuída em todo o período de tratamento de 6 semanas. 232

Os tratamentos de oligonucleótido descritos neste exemplo foram duplicados, para investigar em que medida os efeitos de ISIS 147764 persistem após cessação de tratamento. Os murganhos foram tratados como descrito e sacrificados 1, 2, 4, 6 e 8 semanas após a cessação do tratamento de oligonucleótido. Os mesmos parâmetros foram analisados e os resultados são mostrados na Tabela 29 .

Tabela 29

Correlação entre concentração hepática de fármaco, expressão de ARNm de apolipoproteina B e lípidos séricos após cessação de dosagem

Período de tratamento Na ISIS 1 semana 2 semanas 4 semanas 6 semanas 8 semanas % De inibição de ARNm de apolipoproteina B 141923 15 2 7 11 7 147764 82 78 49 37 19 Oligonucleótido intacto pg/g 141923 297 250 207 212 128 147764 215 168 124 70 43 Colesterol total mg/dL solução salina 114 144 195 221 160 141923 158 139 185 186 151 147764 69 67 111 138 135 Colesterol LDL mg/dL solução salina 21 24 34 37 22 141923 24 24 32 32 24 147764 14 14 18 24 21 Colesterol HDL mg/dL solução salina 86 109 134 158 117 141923 121 105 135 136 108 147764 51 49 79 100 94 233

Estes dados demonstram que, após a terminação do tratamento de oligonucleótido, os efeitos de ISIS 147764, incluindo inibição de ARNm de apolipoproteina B e diminuição de colesterol, persistem durante até 8 semanas. A análise de imunotransferência demonstra que os níveis de proteína de apolipoproteina B seguem um padrão semelhante ao observado para níveis de expressão de ARNm.

Exemplo 52

Efeitos da inibição anti-sentido do gene de apolipoproteina B humana por 301012 em murganhos transgénicos C57BL/6NTac-TgN(APOBlOO): estudo de dosagem

Os murganhos transgénicos C57BL/6NTac-TgN(APOBlOO) têm o gene de apolipoproteina B humana "knocked-in". Estes murganhos expressam níveis elevados de apolipoproteina B humana, resultando em murganhos com níveis séricos elevados de colesterol LDL. Estes murganhos são úteis na identificação e avaliação de compostos para reduzir níveis elevados de colesterol LDL e o risco da aterosclerose. Quando alimentados com uma dieta de gordura e colesterol elevado, estes murganhos desenvolvem acumulação significativa de células espumosas subjacente ao endotélio e na média e têm lesões de placa aterosclerótica significativamente mais complexas do que os animais de controlo.

Um estudo de longo prazo de inibição de apolipoproteina B humana por ISIS 301012 em murganhos C57BL/6NTac-TgN(APOBlOO) (Taconic, Germantown, N.I.) foi conduzido durante um período de 3 meses. Os murganhos foram doseados intraperitonealmente, duas 234 vezes por semana, com ISIS 301012 (SEQ ID N°: 247) a 10 ou 25 mg/kg, durante 12 semanas. Os animais injectados com solução salina serviram como controlos. Cada grupo de tratamento compreendia 4 animais.

Após 2, 4, 6, 8 e 12 semanas de tratamento, foram recolhidas amostras séricas para efeitos de medição de proteína de apolipoproteína B humana. A proteína sérica foi quantificada utilizando um kit de ELISA específico para apolipoproteína B humana (ALerCHEK Inc., Portland, ME). Os dados são mostrados na Tabela 30 e cada resultado representa a média de 4 animais. Os dados estão normalizados para animais de controlo tratados com solução salina.

Tabela 30

Redução de proteína de apolipoproteína B humana no soro de murganhos transgénicos após tratamento de ISIS 301012 % De redução de proteína de apolipoproteína B humana no soro Dose de 2 4 6 8 12 oligonucleótido mg/kg semanas semanas semanas semanas semanas 10 76 78 73 42 85 25 80 87 86 47 79

Estes dados ilustram que após 2, 4, 6 ou 12 semanas de tratamento com ISIS 301012, o nível de proteína de apolipoproteína B humana no soro de murganhos transgénicos está diminuído em, aproximadamente, 80%, demonstrando que além da inibição da expressão de ARNm, o ISIS 301012 inibe eficazmente a expressão de proteína de apolipoproteína B humana em murganhos 235 transportando o transgene de apolipoproteína B humana. A proteína de apolipoproteína B no soro também foi avaliada por análise de imunotransferência, utilizando um anticorpo dirigido para proteína de apolipoproteína B humana (US Biologicals, Swampscott, MA) . Esta análise mostra que os níveis de proteína de apolipoproteína B humana, ambas as formas de apolipoproteína B-100 e apolipoproteína B-48, estão diminuídos às 2, 4, 6 e 12 semanas de tratamento. A análise de imunotransferência utilizando um anticorpo específico de apolipoproteína B de murganho (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) não revela alteração significativa na expressão da proteína de murganho no soro.

No começo do tratamento (início) e após 2, 4, 6 e 8 semanas de tratamento, as amostras séricas foram recolhidas e os níveis de colesterol total, LDL e HDL foram medidos por análise clínica de rotina, utilizando um Analisador Clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, N.I.) e estes dados são apresentados na Tabela 31. Os resultados são apresentados como mg/dL no soro e representam a média de 4 animais. Os resultados dos animais de controlo de solução salina também são mostrados.

Tabela 31

Efeitos de ISIS 301012 em lípidos séricos em murganhos transgénicos de apolipoproteína B humana

Período de tratamento Tratamento Início 2 semanas 4 semanas 6 semanas 8 semanas Colesterol total mg/dL Solução Salina 120 110 129 121 126 10 115 97 111 120 122 236 (continuação)

Período de tratamento Tratamento Início 2 semanas 4 semanas 6 semanas 8 semanas 25 107 101 107 124 147 Colesterol HDL mg/dL Solução Salina 67 61 69 62 64 10 70 69 78 72 79 25 64 73 76 80 91 Colesterol LDL mg/dL Solução Salina 39 41 50 45 47 10 35 20 23 37 33 25 33 19 19 37 44

Estes dados demonstram que o colesterol LDL é diminuído por tratamento com 10 ou 25 mg/kg de ISIS 147764 durante as primeiras 4 semanas de tratamento. O estudo foi terminado quarenta oito horas após as injecções finais na oitava semana de tratamento, quando os animais foram sacrificados e avaliados para níveis de ARNm alvo no fígado, níveis de proteína de apolipoproteína B no fígado e níveis séricos de colesterol e enzimas hepáticas. Além disso, a expressão de níveis de apolipoproteína B de murganho endógena no fígado foi medida para avaliar quaisquer efeitos de ISIS 301012 na expressão de ARNm de apolipoproteína B de murganho.

Os níveis de ARNm de apolipoproteína B humana e de murganho no fígado de animais tratados durante 12 semanas foram medidos por PCR em tempo real, como aqui descrito. Cada resultado representa a média de dados de 4 animais. Os dados foram 237 normalizados para controlos de solução salina e sao mostrados na Tabela 32.

Tabela 32

Efeitos de ISIS 301012 nos níveis de ARNm de apolipoproteína B humana e de murganho em murganhos transgénicos % de inibição Dose de ISIS 301012 espécie de ARNm medida 10 mg/kg 25 mg/kg apolipoproteína B humana 65 75 apolipoproteína B de murganho 6 6

Estes dados demonstram que após 12 semanas de tratamento com ISIS 301012, o ARNm de apolipoproteína B humana é reduzido em até 75% nos fígados de murganhos transgénicos, ao passo que o ARNm de apolipoproteína B de fígado de murganho não foi afectado. Além disso, a análise de ELISA de proteína de apolipoproteína B nos fígados de murganhos transgénicos revela uma redução de 80% e 82% na proteína humana, após 10 e 20 mg/kg de ISIS 301012, respectivamente. A análise de imunotransferência utilizando um anticorpo dirigido para apolipoproteína B humana também demonstra uma redução na expressão de apolipoproteína B humana, ambas as formas de apolipoproteína B-100 e apolipoproteína B-48, nos fígados de murganhos transgénicos. A análise de imunotransferência utilizando um anticorpo dirigido para proteína de apolipoproteína B de murganho (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) revela que a expressão da proteína de murganho no fígado não se altera significativamente. 238

Os níveis de ALT e AST no soro também foram medidos utilizando o Analisador Clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, N.I.) e mostraram que após tratamento com ISIS 301012, os níveis de AST e ALT estavam aumentados, contudo não excederam os níveis normais (-300 IU/L), indicando uma ausência de toxicidade devido a tratamento de ISIS 301012.

Exemplo 53

Avaliação de efeitos imunoestimuladores in vitro de ISIS 301012 A actividade imunoestimuladora é definida pela produção de citocinas após exposição a um agente proinflamatório. Numa forma de realização adicional da invenção, o ISIS 301012 foi testado para actividade imunoestimuladora ou proinflamatória. Estes estudos foram realizados pela MDS Pharma Services (Saint Germain sur 1'Arbresle, França). Sangue total foi recolhido de murganhos B6C3F1 inactivos, que não foram mostrados intencionalmente a tratamento virai, químico ou de radiação. As células sanguíneas cultivadas foram mostradas a 0,5, 5 ou 50 ym de ISIS 301012, durante um período de 14 a 16 horas. Os oligonucleótidos anti-sentido conhecidos por possuírem actividade proinflamatória serviram como controlos positivos. Cada tratamento foi realizado em triplicado. No fim do período de tratamento, os sobrenadantes foram recolhidos e a análise de citocina foi realizada utilizando um método de citometria de fluxo com o kit de Inflamação de murganho CBA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . Os resultados revelaram que o ISIS 301012 não estimula a libertação de qualquer das citocinas testadas, que eram a interleucina 12p70 (IL-12p70), factor alfa de necrose tumoral 239 (TNF-alfa), interferão gama (IFN-gama), interleucina 6 (IL-6), proteína 1 quimioatractora de macrófagos (MCP-1) e interleucina 10 (IL-10). Deste modo, o ISIS 301012 não possui actividade imunoestimuladora, como determinado pelo ensaio imunoestimulador in vitro.

Exemplo 54

Análise Genómica Comparativa de apolipoproteina B

Uma análise genómica comparativa de sequências de apolipoproteina B humana, de murganho e macaco foi realizada e ilustrou que as sequências de apolipoproteina B são conservadas entre as espécies. A organização dos genes de apolipoproteina B humana e de murganho também é altamente conservada. Os genes humanos e de murganho são constituídos por 29 e 26 exões, respectivamente. O ARNm de murganho é, aproximadamente, 81% homólogo à sequência humana. A sequência completa e estrutura génica do gene de apolipoproteina B em primatas não humanos não foram identificadas. Contudo, como ilustrado no Exemplo 46, um fragmento de 500 pares de bases que contém a sequência alvo de ISIS 301012 exibe, aproximadamente, 96% identidade com a sequência humana. O sítio de ligação para ISIS 301012 situa-se na região codificante, no exão 22 do ARNm de apolipoproteina B humana. Quando os sítios de ligação de ISIS 301012 de humano, murganho e macaco foram comparados, foi observada significativa diversidade de sequência. Embora a conservação de sequência global entre humano e macaco ao longo de uma região de 500 nucleótidos fosse, aproximadamente, 96%, o sítio de ligação de ISIS 301012 da 240 sequência de macaco contém 2 erros de emparelhamento em relação à sequência humana. Do mesmo modo, embora a sequência de ARNm de apolipoproteína B de murganho seja, aproximadamente, 81% homóloga à humana, no sitio de ligação de ISIS 301012, 5 nucleótidos são divergentes. As comparações de sequência para o sitio de ligação de ISIS 301012 para sequências de apolipoproteína B humana, de murganho e macaco são mostradas na Tabela 33. Os nucleótidos com erros de emparelhamento em relação à sequência alvo de ISIS 301012 estão sublinhados.

Tabela 33

Comparação do sítio de ligação de ISIS 301012 entre sequências de apolipoproteína B humana, de macaco e murganho

Espécie Nfi de erros de emparelhamento Sequência alvo de ISIS 301012 Humana 0 aggtgcgaagcagactgagg Macaco 2 aggtgtaaagcagactgagg Murganho 5 aggagtgcagcagtctgaag A sequência alvo a que o oligonucleótido anti-sentido de murganho ISIS 147764 se híbrida situa-se no exão 24 do gene de apolipoproteína B de murganho. As comparações de sequência para o sítio de ligação de ISIS 147764 nas sequências de apolipoproteína B de murganho e humana são mostradas na Tabela 34. Os nucleótidos com erros de emparelhamento em relação à sequência alvo de ISIS 147764 estão sublinhados. 241

Tabela 34

Comparaçao do sítio de ligação de ISIS 147764 entre sequências de apolipoproteína B de murganho e humana

Espécie Na de erros de emparelhamento Sitio de ligação de ISIS 147764 Humana 5 gcattgacatdttcagggac Murganho 0 gcatggacttcttctggaaa

Exemplo 55

Análise de BLAST de ISIS 301012

Foi determinado o número de regiões no genoma humano a que o ISIS 301012 se irá hibridar com complementaridade perfeita. A percentagem de complementaridade de um composto anti-sentido com uma região de um ácido nucleico alvo foi determinada utilizando programas BLAST (ferramentas básicas de pesquisa de alinhamento local) e programas PowerBLAST conhecidos na técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang e Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656). Esta análise avaliou a complementaridade de sequência em regiões genómicas ou pré-ARNm e em sequências codificantes.

Nas regiões genómicas, o ISIS 301012 mostra perfeita complementaridade de sequência apenas com o gene de apolipoproteína B. Não se verificaram sequências alvo com um erro-de-emparelhamento em relação a ISIS 301012. Verificam-se dois erros de emparelhamento entre a sequência alvo de ISIS 301012 e o gene de heparanase e verificam-se 3 erros de 242 emparelhamento entre a sequência alvo de ISIS 301012 e 28 sítios genómicos únicos.

Nas sequências de ARN, verifica-se perfeita complementaridade de sequência entre ISIS 301012 e o ARNm de apolipoproteína B e três marcadores de sequência expressa que contêm semelhança moderada com um precursor de apolipoproteína B humana. Verifica-se um único erro-de-emparelhamento entre ISIS 301012 e um marcador de sequência expressa semelhante à forma de músculo liso da cadeia leve de miosina.

Exemplo 56

Inibição anti-sentido de apolipoproteína B em hepatócitos primários humanos: estudos dose resposta

Os oligonucleótidos anti-sentido direccionados para apolipoproteína B humana foram testados em estudos de resposta de dose em hepatócitos primários humanos. Os hepatócitos primários humanos pré-plaqueados foram adquiridos à InVitro Technologies (Baltimore, MD) . As células foram cultivadas em DMEM de elevado teor de glucose (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) , suplementado com soro bovino fetal 10% (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), 100 unidades/mL e estreptomicina a 100 pg/mL (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) .

Os hepatócitos primários humanos foram tratados com ISIS 301012 (SEQ ID N°: 247), a 10, 50, 150 ou 300 nM. As células não tratadas e células tratadas com o oligonucleótido de controlo de competição ISIS 113529 (CTCTTACTGTGCTGTGGACA, 243 SEQ ID N°: 859) serviram como dois grupos de células de controlo. 0 ISIS 113529 é um oligonucleótido quimérico ("gapmeros"), de 20 nucleótidos em comprimento, composto por uma região de "lacuna" central consistindo de dez 2' -desoxinucleótidos, a qual é flanqueada em ambos os lados (direcções 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por nucleótidos de 2'-metoxietilo (2'-MOE). As ligações internucleósido (esqueleto) são fosforotioato (P=S) em todo o oligonucleótido. Todas as citidinas são 5-metilcitidinas.

Os oligonucleótidos foram introduzidos em células através de transfecção mediada por LIPOFECTIN, como aqui descrito por outros exemplos. As células foram recolhidas 24 e 48 horas após tratamento com oligonucleótido e o ARN e a proteína foram isolados. Além disso, os meios de cultura de células tratadas foram recolhidos para análise de ELISA de secreção de proteína de apolipoproteína B. A expressão de ARNm de apolipoproteína B foi determinada por PCR em tempo real de amostras de ARN, como aqui descrito por outros exemplos. Cada resultado representa 6 experiências. Os dados estão normalizados para células de controlo não tratadas e são mostrados na Tabela 35. 244

Tabela 35

Inibição do ARNm de apolipoproteína B por oligonucleótidos anti-sentido em hepatócitos primários humanos % de inibição de ARNm de apolipoproteína B N2 ISIS Dose de Tratamento 301012 113529 oligonucleótido (horas) 10 nM 24 65 N.D. 48 33 N.D. 50 nM 24 75 N.D. 48 48 N.D. 150 nM 24 90 16 48 78 5 300 nM 24 89 10 48 72 18

Estes dados demonstram que o ISIS 301012 inibe a expressão de apolipoproteína B, num modo dependente da dose, em hepatócitos primários humanos. A proteína de apolipoproteína B segregada para os meios celulares cultivados foi medida nas amostras tratadas com 50 e 150 nM de oligonucleótido, utilizando um kit de ELISA específico de proteína alvo (ALerCHEK Inc., Portland, ME). Cada resultado representa 3 experiências. Os dados estão normalizados para células de controlo não tratadas e são mostrados na Tabela 36. 245

Tabela 36

Inibição da secreção de proteína de apolipoproteína B de hepatócitos primários humanos por ISIS 301012 % de alteração na secreção de proteína de apolipoproteína B Ns ISIS Dose Tratamento (horas) 301012 113529 150 nM 24 -57 + 6 48 -75 + 4 300 nM 24 -41 -2 48 -48 -5

As amostras de doses de proteína de 50, 150 e 300 nM após 24 horas e doses de 150 e 300 nM após 48 horas foram submetidas a análise de imunotransferência, como aqui descrito por outros exemplos, utilizando um anticorpo específico de proteína de apolipoproteína B humana, adquirido à US Biological (Swampscott, MA). A análise de imunotransferência demonstra, ainda, que a proteína de apolipoproteína B em hepatócitos humanos é reduzida, num modo dependente da dose, após tratamento de oligonucleótido anti-sentido com ISIS 301012.

Foi realizada uma experiência adicional para testar os efeitos de ISIS 271009 (SEQ ID N°: 319), ISIS 281625 (SEQ ID N°: 224) e ISIS 301027 (SEQ ID N°: 262) no ARNm de apolipoproteína B humana em hepatócitos primários humanos. As células foram cultivadas como aqui descrito e tratadas com 5, 10, 50 ou 150 nM de ISIS 271009, ISIS 281625 ou ISIS 301027, durante um período de 24 horas. Os oligonucleótidos de controlo 246 ISIS 13650 (SEQ ID N°: 806) e ISIS 113529 (SEQ ID N°: 859) foram utilizados a 50 ou 150 nM. A expressão de ARNm de apolipoproteina B humana foi avaliada por PCR em tempo real, como aqui descrito por outros exemplos. A proteina de apolipoproteina B segregada para os meios celulares cultivados foi medida nas amostras tratadas com 50 e 150 nM de oligonucleótido, utilizando um kit de ELISA especifico de proteina alvo (ALerCHEK Inc., Portland, ME).

Os dados, mostrados na Tabela 37, representam a média de 2 experiências e estão normalizados para células de controlo não tratadas. Onde presente, um " + " indica que a expressão génica foi aumentada.

Tabela 37

Inibição anti-sentido de ARNm de apolipoproteina B humana por ISIS 271009, ISIS 281625 e ISIS 301027

Dose de oligonucleótido ISIS 271009 ISIS 281625 ISIS 301027 ISIS 13650 ISIS 113529 % De inibição da expressão de ARNm de apolipoproteina B 5 nM + 4 8 11 N.D. N.D. 10 nM 5 22 37 N.D. N.D. 50 nM 52 49 50 38 0 150 nM 81 52 70 26 14 % De inibição da secreção de proteina de apolipoproteina B 50 nM 17 18 21 N.D. N.D. 150 nM 32 18 32 + 18 + 1 247

Estes dados demonstram que ISIS 271009, ISIS 281625 e ISIS 301027 inibem a expressão de ARNm de apolipoproteína B, num modo dependente da dose, em hepatócitos primários humanos. ISIS 271009 e ISIS 301027 inibiram a secreção de proteína de apolipoproteína B de células, num modo dependente da dose.

Exemplo 57

Efeitos de oligonucleótidos anti-sentido de apolipoproteína B-100 na expressão de apolipoproteína(a) A lipoproteína(s) [Lp(a)] contém duas proteínas distintas ligadas por dissulfureto, apolipoproteína(a) e apolipoproteína B (Rainwater e Kammerer, J. Exp. Zool., 1998, 282, 54-61). Os oligonucleótidos anti-sentido direccionados para apolipoproteína B foram testados para efeitos na expressão do componente de apolipoproteína(a) da partícula de lipoproteína(a) em hepatócitos primários humanos.

Os hepatócitos primários humanos (Invitro Technologies, Baltimore, MD) , cultivados e transfectados como aqui descrito, foram tratados com 5, 10, 50 ou 150 nM de ISIS 271009 (SEQ ID N°: 319), 281625 (SEQ ID N°: 224), 301012 (SEQ ID N° : 247) ou 301027 (SEQ ID N° : 262). As células também foram tratadas com 50 ou 150 nM dos oligonucleótidos de controlo ISIS 113529 (SEQ ID N° : 859) ou ISIS 13650 (SEQ ID N° : 806). As células não tratadas serviram como um controlo. Após 24 horas de tratamento de oligonucleótido, a expressão de ARNm de apolipoproteína(a) foi medida por PCR quantitativo em tempo real, como aqui descrito noutros exemplos. 248

As sondas e iniciadores para apolipoproteina(a) humana foram concebidos para se hibridarem a uma sequência de apolipoproteina(a) humana, utilizando informação de sequência publicada (acesso GenBank número NM_005577.1, aqui incorporada como SEQ ID N°: 860). Para apolipoproteina(a) humana, os iniciadores de PCR foram: iniciador directo: CAGCTCCTTATTGTTATACGAGGGA (SEQ ID N°: 861) iniciador inverso: TGCGTCTGAGCATTGCGT (SEQ ID N°: 862) e a sonda de PCR foi: FAM-CCCGGTGTCAGGTGGGAGTACTGC-TAMRA (SEQ ID N°: 863), onde FAM é o corante fluorescente e TAMRA é o corante neutralizador.

Os dados são a média de três experiências e são expressos como percentagem de inibição em relação a controlos não tratados. Os resultados são mostrados na Tabela 38. Um " + " ou precedendo o número indica que a expressão de apolipoproteina(a) foi aumentada ou diminuída, respectivamente, após tratamento com oligonucleótidos anti-sentido. 249

Tabela 38

Efeitos de oligonucleótidos anti-sentido de apolipoproteína B na expressão de apolipoproteína(a) % de alteração na expressão de ARNm de apolipoproteína(a) após inibição anti-sentido de apolipoproteína B Dose de Na ISIS Oligonucleótido 271009 281625 301012 301027 13650 113529 5 nM + 70 -9 + 34 -16 N. D. N. D. 10 nM + 31 -23 + 86 -45 N. D. N.D. 50 nM + 25 -34 + 30 -39 -68 + 14 150 nM -47 + 32 + 38 -43 -37 -9

Estes resultados ilustram que o ISIS 301012 não inibiu a expressão de apolipoproteína(a) em hepatócitos primários humanos. 0 ISIS 271009 inibiu a expressão de apolipoproteína(a) à dose mais elevada. ISIS 281625 e ISIS 301027 diminuíram os níveis de ARNm de apolipoproteína(a).

Exemplo 58

Inibição da secreção de partícula de lipoproteína(a) com oligonucleótidos anti-sentido direccionados para apolipoproteína B-100 A secreção de partículas de lipoproteína(a) , que são constituídas por uma molécula de apolipoproteína(a) ligada covalentemente a uma molécula de apolipoproteína B, foi avaliada em hepatócitos primários humanos, tratados com oligonucleótidos 250 anti-sentido, direccionados para o componente de apolipoproteína B de lipoproteína(a).

Os hepatócitos primários humanos (InVitro Technologies, Baltimore, MD) , cultivados e transfectados como aqui descrito, foram tratados, durante 24 horas, com 50 ou 150 nM de ISIS 271009 (SEQ ID N°: 319), 281625 (SEQ ID N°: 224), 301012 (SEQ ID N° : 247) ou 301027 (SEQ ID N° : 262) . As células também foram tratadas com 150 nM dos oligonucleótidos de controlo ISIS 113529 (SEQ ID N°: 859) ou ISIS 13650 (SEQ ID N°: 806). As células não tratadas serviram como um controlo. Após 24 horas de tratamento de oligonucleótido, a quantidade de lipoproteína(a) no meio de cultura recolhido das células tratadas foi medida utilizando um kit de ELISA comercialmente disponível (ALerCHEK Inc., Portland, ME). Os dados são a média de três experiências e são expressos como percentagem de alteração na secreção de lipoproteína(a) em relação a controlos não tratados. Os dados são mostrados na Tabela 39. Um " + " ou precedendo o número indica que a secreção de partícula de lipoproteína(a) foi aumentada ou diminuída, respectivamente, após tratamento com oligonucleótidos anti-sentido direccionados para apolipoproteína B. 251

Tabela 39

Inibição da secreção de partícula de lipoproteína(a) com oligonucleótidos anti-sentido direccionados para

apolipoproteína B % de alteração na secreção de lipoproteína(a) Dose de N2 ISIS Oligonucleótido 271009 2S1625 301012 301027 13650 113529 50 nM -25 -26 -27 -33 N.D. N.D. 150 nM -42 -24 -37 -44 + 14 + 14

Estes dados demonstram que a inibição anti-sentido de apolipoproteína B, um componente da partícula de lipoproteína(a), pode reduzir a hepatócitos primários humanos, secreção de lipoproteína(a) não com uma diminuição na expressão como mostrado no Exemplo 57. secreção de lipoproteína(a) de Além disso, esta redução na é necessariamente concomitante de ARNm de apolipoproteína(a),

Exemplo 59

Derivados com erros de emparelhamento e truncados de ISIS 301012

Como aqui demonstrado, o ISIS 301012 (SEQ ID N°: 247) reduz os níveis de ARNm de apolipoproteína B em linhas celulares humanas cultivadas, assim como em hepatócitos primários humanos. Numa forma de realização adicional da invenção, foi realizado um estudo utilizando derivados de sequência nucleotídica de 252 ISIS 301012. Foi concebida uma série de oligonucleótidos contendo desde 1 a 7 erros de emparelhamento de bases, começando no centro da sequência de ISIS 301012. Esta série foi concebida para introduzir a perda consecutiva de emparelhamento de bases de Watson-Crick entre ISIS 301012 e a sua sequência de ARNm alvo. Estes compostos são mostrados na Tabela 40. Os compostos anti-sentido com nucleótidos com erros de emparelhamento em relação a ISIS 301012 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros"), de 20 nucleótidos em comprimento, compostos por uma região de "lacuna" central consistindo de dez 2 ’-desoxinucleótidos, a qual é flanqueada em ambos os lados (direcções 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por nucleótidos de 2'-metoxietilo (2'-MOE). As ligações internucleósido (esqueleto) são fosforotioato (P=S) em todo o oligonucleótido.

Foi concebido um derivado adicional de ISIS 301012, compreendendo a sequência de ISIS 301012 com nucleótidos de 2'MOE em todo o oligonucleótido (2'-MOE uniforme). Este composto tem 20 nucleótidos em comprimento, com ligações fosforotioato em todo o oligonucleótido. Este composto também é mostrado na Tabela 40.

As células HepG2 foram tratadas com 50 ou 150 nM dos compostos na Tabela 40, durante um período de 24 horas, após o qual o ARN foi isolado e a expressão de alvo foi medida por PCR em tempo real, como aqui descrito. As células não tratadas serviram como controlos. Os resultados são mostrados na Tabela 40 e estão normalizados para amostras de controlo não tratadas. 253

Tabela 40

Efeitos de oligonucleótidos com erros de emparelhamento de ISIS 301012 e um oligonucleótido de 2'MOE uniforme na expressão de apolipoproteína B em células HepG2 % de alteração na expressão de ARNm de apolipoproteína B N2 de erros de Dose de oligonucleótido N2 ISIS SEQUÊNCIA emparelhamento 50 150 SEQ ID N2 301012 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 0 -44 -75 247 Série de erros de emparelhamento, oligonucleótidos quiméricos 332770 GCCTCAGTCTTCTTCGCACC 1 +7 -22 864 332771 GCCTCAGTCTTATTCGCACC 2 +37 +37 865 332772 GCCTCAGTATTATTCGCACC 3 +99 +84 866 332773 GCCTCATTATTATTCGCACC 4 +75 +80 867 332774 GCCTCATTATTATTAGCACC 5 +62 +66 868 332775 GCCTCATTATTATTATCACC 6 -1 +10 869 332776 GCCTAATTATTATTATCACC 7 +10 +20 870 Oligonucleótido de 2'-MOE uniforme 332769 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 0 -11 -14 247

Os resultados do tratamento de células HepG2 com os compostos na Tabela 40 revelam que nenhum dos compostos exibe a inibição dose-dependente observada após tratamento com a sequência de ISIS 301012 parental. O ISIS 332770, que tem apenas uma única substituição de timidina em citosina no centro do oligonucleótido, foi 3 vezes menos potente do que o ISIS 301012. Substituições nucleotídicas adicionais abrrogaram a inibição anti-sentido da expressão de apolipoproteína B. 254

Os oligonucleótidos quiméricos de fosforotioato são metabolizados in vivo predominantemente por clivagem endonucleolítica. Foi concebida uma série de oligonucleótidos pelo truncamento da sequência de ISIS 301012 em incrementos de 1 ou 2 bases da extremidade 5' e/ou 3'. Os oligonucleót idos truncados representam os possíveis produtos que resultam de clivagem endonucleolítica. Estes compostos são mostrados na Tabela 41. Os compostos na Tabela 41 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros"), de comprimentos variáveis, compostos por uma região de "lacuna" central consistindo de 2’-desoxinucleótidos, a qual é flanqueada em ambas as extremidades por nucleótidos de 2'-metoxietilo (2'-MOE). A estrutura exacta de cada oligonucleótido quimérico é designada na Tabela 41 como a "estrutura de quimera". Por exemplo, uma designação de 4-10-4 indica que os primeiros 4 (mais em 5') e últimos 4 (mais em 3') nucleótidos são nucleótidos de 2'-MOE e os 10 nucleótidos na lacuna são 2'-desoxinucleótidos. Os 2'-desoxinucleótidos estão indicados a negrito. Estas ligações internucleósido (esqueleto) são fosfodiéster (P=0) entre nucleótidos sublinhados; todas as outras ligações internucleósido são fosforotioato (P=S).

Estes compostos foram testados para a sua capacidade de redução da expressão de ARNm de apolipoproteína B. As células HepG2 foram tratadas com 10, 50 ou 150 nM de cada composto anti-sentido na Tabela 41, durante um período de 24 horas, após o qual o ARN foi isolado e a expressão de alvo foi medida por PCR em tempo real, como aqui descrito. As células não tratadas serviram como controlos. Os resultados são mostrados nas Tabela 41 e estão normalizados para amostras de controlo não tratadas. 255

Tabela 41

Efeito de mutantes de truncamento de ISIS 301012 na expressão de apolipoproteína B em células HepG2 % de alteração na expressão de AKNn de apolipoproteína B N2 ISIS Seq ID N2 ALVO Sitio alvo SEQUÊNCIA Estrutura quimérica Dose de oligonucleotido SEQ ID N2 10 50 150 301012 3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 5-10-5 -51 -72 -92 247 331022 3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCAC 5-10-4 -33 -49 -87 871 332777 3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCQCA 5-10-3 -2 7 -53 -80 872 332778 3 3249 GCCTCAGTCTGCTTC 5-10-0 -11 -20 -58 873 332780 3 3248 CCTCAGTCTGCTTCGCAC 4-10-4 -3 -43 -74 874 332781 3 3247 CTCAGTCTGCTTCGCA 3-10-3 -9 -35 -60 875 332782 3 3246 TCAGTCTGCTTCGC 2-10-2 -16 -16 -69 876 332784 3 3249 GCCTCAGTCT 5-5-0 +12 -1 +7 877 332785 3 3238 GCTTCQCACG 0-5-5 +5 -2 - 4 878

Os resultados na Tabela 41 ilustram que a inibição de apolipoproteína B está dependente do comprimento de sequência, assim como da complementaridade e dose de sequência, como demonstrado na Tabela 41, mas as versões truncadas de ISIS 301012 são, em certa medida, capazes da inibição da expressão de ARNm de apolipoproteína B. 256

Exemplo 60

Concepção e rastreio de ARNcd visando apolipoproteina B humana

Uma série de dúplices de ácido nucleico, compreendendo os compostos anti-sentido da presente divulgação e seus complementos, foi concebida para visar apolipoproteina B e mostrada na Tabela 42. Todos os compostos na Tabela 42 são oligorribonucleótidos de 20 nucleótidos em comprimento, com ligações internucleósido de fosfodiéster (esqueletos) em todo o composto. Os compostos foram preparados com extremidades rombas. A Tabela 41 mostra a cadeia anti-sentido do ARNcd e a cadeia sentido é sintetizada como o complemento da cadeia anti-sentido. Mostra-se que estas sequências contêm uracilo (U), mas um especialista na técnica entenderá que, nas sequências de ADN, o uracilo (U) está, em geral, substituído por timina (T) . "Sítio alvo" indica o primeiro número de nucleótido (mais em 5') na sequência alvo particular a que o composto se liga. São um subconjunto dos compostos na Tabela 42 os equivalentes de ARN dos oligonucleótidos anti-sentido de ADN aqui descritos e, onde aplicável, estes são notados pelo N° ISIS do oligonucleótido de ADN na coluna "equivalente de ARN de N° ISIS".

Tabela 42 ARNcd direccionados para apolipoproteina B humana ISIS Região SEQ ID N° Sitio Sequência SEQ ID Equivalente de ARN alvo alvo N2 de Ns ISIS 342855 codificante 3 3249 GCCUCAGUCUGCUUCGCACC 247 301012 342856 3' UTR 3 13903 GCUCACUGUAUGGUUUUAUC 262 301027 257 (continuação) N° ISIS Região SEQ ID N° alvo Sitio alvo Sequência SEQ ID N° Equivalente de ARN de Ns ISIS 342857 codificante 3 5589 AGGUUACCAGCCACAUGCAG 224 308361 342858 codificante 3 669 GAGCAGUUUCCAUACACGGU 130 270991 342859 codificante 3 1179 CCUCUCAGCUCAGUAACCAG 135 270996 342860 codificante 3 2331 GUAUAGCCAAAGUGGUCCAC 34 147797 342861 codificante 3 3579 UAAGCUGUAGCAGAUGAGUC 213 281614 342862 5' UTR 3 6 CAGCCCCGCAGGUCCCGGUG 249 301014 342863 5' UTR 3 116 GGUCCAUCGCCAGCUGCGGU 256 301021 342864 3' UTR 3 13910 AAGGCUGGCUCACUGUAUGG 266 301031 342865 3' UTR 3 13970 GCCAGCUUUGGUGCAGGUCC 273 301038 342866 codificante 3 426 UUGAAGCCAUACACCUCUUU 879 nenhum 342867 codificante 3 3001 UGACCAGGACUGCCUGUUCU 880 nenhum 342868 codificante 3 5484 GAAUAGGGCUGUAGCUGUAA 881 nenhum 342869 codificante 3 6662 UAUACUGAUCAAAUUGUAUC 882 nenhum 342870 codificante 3 8334 UGGAAUUCUGGUAUGUGAAG 883 nenhum 342871 codificante 3 9621 AAAUCAAAUGAUUGCUUUGU 883 nenhum 342872 codificante 3 10155 GUGAUGACACUUGAUUUAAA 885 nenhum 342873 codificante 3 12300 GAAGCUGCCUCUUCUUCCCA 886 nenhum 342874 codificante 3 13629 GAGAGUUGGUCUGAAAAAUC 887 nenhum

Os compostos de ARNcd na Tabela 42 foram testados para os seus efeitos em ARNm de apolipoproteína humana em células HepG2. As células HepG2 foram tratadas com 100 nM de compostos de ARNcd misturados com LIPOFECTIN a 5 pg/mL (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), durante um período de 16 horas. Na mesma experiência, as células HepG2 também foram tratadas com 150 nM de subconjunto dos oligonucleótidos anti-sentido aqui descritos, misturado com LIPOFECTIN a 3,75 pg/mL; estes compostos são listados na Tabela 43. Os oligonucleótidos de controlo incluíram ISIS 18078 (GTGCGCGCGAGCCCGAAATC, SEQ ID N° : 888). O ISIS 18078 é um oligonucleótido quimérico ("gapmeros") , de 20 nucleótidos 258 em comprimento, composto por uma região de "lacuna" central consistindo de 9 2'-desoxinucleótidos, a qual é flanqueada nas extremidades 5' e 3' por uma "asa" de cinco nucleótidos e uma "asa" de seis nucleótidos, respectivamente. As asas são compostas por nucleótidos de 2'-metoxietilo (2'-M0E). As ligações internucleósido (esqueleto) são fosforotioato (P=S) em todo o oligonucleótido. Todas as citidinas são 5-metilcitidinas. 0 dúplice de ISIS 263188 (CUUCUGGCAUCCGGUUUAGTT, SEQ ID N°: 889) e o seu complemento também foi utilizado como um controlo. 0 ISIS 263188 é um oligorribonucleótido de 21 nucleótidos em comprimento, com os 2 nucleótidos na extremidade 3' sendo oligodesoxirribonucleótidos (TT) e com as ligações internucleósido de fosfodiéster (esqueleto) em todo o composto.

As células foram tratadas durante 4 horas, após o que a expressão de ARNm de apolipoproteína B humana foi medida, como descrito pelos presentes exemplos. Os resultados foram normalizados para células de controlo não tratadas, que não foram tratadas com LIPOFECTIN ou oligonucleótido. Os dados são a média de 4 experiências e são apresentados na Tabela 43.

Tabela 43

Inibição de ARNm de apolipoproteína B por ARNcd em células HepG2 N2 ISIS Dose % de Inibição SEQ ID # 342855 100 nM 53 247 342856 100 nM 34 262 342857 100 nM 55 224 342858 100 nM 44 130 259 (continuação) N2 ISIS Dose % de Inibição SEQ ID # 342859 100 nM 23 135 342860 100 nM 34 34 342861 100 nM 42 213 342862 100 nM 16 249 342863 100 nM 34 256 342864 100 nM 53 266 342865 100 nM 50 273 342866 100 nM 12 879 342867 100 nM 26 880 342868 100 nM 36 881 342869 100 nM 78 882 342870 100 nM 71 883 342871 100 nM 9 883 342872 100 nM 2 885 342873 100 nM 53 886 342874 100 nM 73 887 281625 150 nM 79 224 301012 150 nM 77 247 301014 150 nM 88 249 301021 150 nM 67 256 301027 150 nM 79 262 301028 150 nM 85 263 301029 150 nM 77 264 301030 150 nM 70 265 301031 150 nM 73 266 260 (continuação) N2 ISIS Dose % de Inibição SEQ ID # 301037 150 nM 80 272 301038 150 nM 84 273 301045 150 nM 77 280 263188 150 nM 26 888 18078 150 nM 13 889

Exemplo 61

Inibição anti-sentido de apolipoproteina B em hepatócitos primários de macaco Cinomolgos

Como demonstrado no Exemplo 46, a região contendo o sitio alvo ao qual o ISIS 301012 se hibrida partilha 96% de identidade com a correspondente região da sequência de ARNm de apolipoproteina B de macaco Cinomolgos. O ISIS 301012 contém dois nucleótidos desemparelhados em relação à sequência de ARNm de apolipoproteina B de macaco Cinomolgos a que se hibrida. Num aspecto adicional da divulgação, foram concebidos oligonucleótidos para visar regiões do ARNm de apolipoproteina B de macaco, utilizando a sequência parcial de apolipoproteina B de macaco Cinomologos aqui descrita (SEQ ID N°: 855) e uma porção adicional da sequência de ARN de apolipoproteina B de macaco Cinomologos, aqui incorporada como SEQ ID N°: 890. O sitio alvo indica o primeiro número de nucleótidos (mais em 5') na sequência alvo particular a que o oligonucleótido se liga. Para o ISIS 326358 (GCCTCAGTCTGCTTTACACC, SEQ ID N°: 891), o sitio alvo é o nucleótido 168 da SEQ ID N° : 855 e para ISIS 315089 (AGATTACCAGCCATATGCAG, SEQ ID N°: 892), o sitio alvo 261 é o nucleótido 19 da SEQ ID N°: 890. ISIS 326358 e ISIS 315089 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros"), de 20 nucleótidos em comprimento, compostos por uma região de "lacuna" central consistindo de dez 2'-desoxinucleótidos, a qual é flanqueada em ambos os lados (direcções 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por nucleótidos de 2'-metoxietilo (2'-MOE). As ligações internucleósido (esqueleto) são fosforotioato (P=S) em todo o oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas. ISIS 326358 e ISIS 315089 são os equivalentes de macaco Cinomolgos dos oligonucleótidos anti-sentido de apolipoproteína B humana ISIS 301012 (SEQ ID N°: 247) e ISIS 281625 (SEQ ID N°: 224), respectivamente. A inibição anti-sentido por ISIS 301012 foi comparada à de ISIS 326358, a qual é uma correspondência perfeita com a sequência de apolipoproteína B de macaco Cinomolgos a que o ISIS 301012 se hibrida. Os compostos foram analisados para o seu efeito nos níveis de ARNm de apolipoproteína B de macaco Cinomolgos em hepatócitos primários de macaco Cinomolgos adquiridos à In Vitro Technologies (Gaithersburg, MD). Os hepatócitos primários de macaco Cinomolgos pré-plaqueados foram adquiridos à InVitro Technologies (Baltimore, MD) . As células foram cultivadas em DMEM de elevado teor de glucose (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) , suplementado com soro bovino fetal 10% (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), 100 unidades/mL e estreptomicina a 100 pg/mL (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) .

Os hepatócitos primários de macaco Cinomolgos foram tratados com 10, 50, 150 ou 300 nM de oligonucleót idos anti-sentido, durante 48 horas. O ISIS 113529 (SEQ ID N° : 859) 262 foi utilizado como um oligonucleótido de controlo. As células não tratadas também serviram como um controlo. Os niveis de ARNm de apolipoproteína B de macaco Cinomolgos foram quantificados por PCR em tempo real utilizando os iniciadores e sondas de apolipoproteína B humana e GAPDH, aqui descritos por outros exemplos. Os resultados, mostrados na Tabela 44, são a média de 6 experiências e são expressos como percentagem de inibição de ARNm de apolipoproteína B, normalizados para células de controlo não tratadas.

Tabela 44

Inibição de ARNm de apolipoproteína B de macaco Cinomolgos por ISIS 301012 e ISIS 326358 % de inibição de ARN de apolipoproteína B Ne ISIS Dose de oligonucleótido Tempo de tratamento 326358 301012 113529 (horas) 10 nM 24 35 24 N.D. 48 85 76 N.D. 50 nM 24 66 60 N.D. 48 88 77 N.D. 15 0 nM 24 61 56 5 48 82 88 42 30 0 nM 24 64 61 19 48 87 86 13 263

Estes ciados demonstram que ambos os ISIS 326359 e ISIS 301012 (não obstante dois erros de emparelhamento com a sequência de apolipoproteína B de macaco Cinomolgos) podem inibir a expressão de ARNm de apolipoproteína B em hepatócitos primários de macaco Cinomolgos, num modo dose- e tempo-dependente. A proteína de apolipoproteína B segregada de hepatócitos primários de Cinomolgos tratados com 150 e 300 nM de oligonucleótido foi medida por ELISA, utilizando um kit específico de proteína de apolipoproteína B (ALerCHEK Inc., Portland, ME). Cada resultado representa a média de 3 experiências. Os dados estão normalizados para células de controlo não tratadas e são mostrados na Tabela 45.

Tabela 45

Redução na proteína de apolipoproteína B segregada de hepatócitos de macaco Cinomolgos após tratamento de oligonucleótido anti-sentido % de redução em proteina de apolipoproteína B segregada N° ISIS Dose de oligonucleótido Tempo de tratamento (horas) 326358 301012 113529 150 nM 24 21 31 11 48 29 25 18 300 nM 24 17 10 12 48 35 17 8 264

Estes resultados demonstram que a inibição anti-sentido por ISIS 301012 e ISIS 326358 conduz a uma diminuição na secreção de proteína de apolipoproteína B de hepatócitos primários de Cinomolgos cultivados.

Além disso, a proteína foi isolada de hepatócitos primários de macaco Cinomolgos tratados com oligonucleótido e submetida a análise de imunotransferência, para avaliar posteriormente a expressão de proteína de apolipoproteína B. A imunotransferência foi realizada como aqui descrito, utilizando um anticorpo para proteína de apolipoproteína B humana (US Biologicals, Swampscott, MA). A análise de imunotransferência da expressão de apolipoproteína B, após tratamento de oligonucleótido anti-sentido com ISIS 326358 e ISIS 301012, revela uma redução substancial na expressão de apolipoproteína B.

Num aspecto adicional da divulgação, a inibição anti-sentido por ISIS 281625 foi comparada à de ISIS 315089, que é uma correspondência perfeita com a sequência de apolipoproteína B de macaco Cinomolgos a que o ISIS 281625 se híbrida. Hepatócitos primários de macaco Cinomolgos, cultivados como aqui descrito, foram tratados com 10, 50, 150 ou 300 nM de ISIS 315089 ou ISIS 281625, durante 24 horas. As células foram tratadas com o oligonucleótido de controlo ISIS 13650 (SEQ ID N°: 806), a 150 e 300 nM, ou ISIS 113529 (SEQ ID N°: 859), a 300 nM. As células não tratadas também serviram como um controlo. Os níveis de ARNm de apolipoproteína B de macaco Cinomolgos em hepatócitos primários de macaco Cinomolgos foram quantificados utilizando PCR em tempo real com iniciadores e sonda humanos, como aqui descrito por outros exemplos. Os resultados, mostrados na Tabela 46, são a média de 3 experiências e são expressos como percentagem de 265 inibição de ARNm de apolipoproteína B, normalizados para células de controlo não tratadas. Onde presente, um "+" precedendo o valor indica que a expressão de ARNm foi aumentada.

Tabela 46

Inibição anti-sentido da expressão de ARNm de apolipoproteína B em hepatócitos de macaco Cinomolgos % de inibição de ARNm de apolipoproteína B N2 ISIS Dose de oligonucleótido 315089 281625 13650 113529 10 nM 70 + 5 N.D. N.D. 50 nM 83 41 N.D. N.D. 150 nM 81 35 + 50 N.D. 300 nM 82 69 33 28

Estes dados demonstram que ambos os ISIS 315089 e ISIS 281625 podem inibir a expressão de ARNm de apolipoproteína B em hepatócitos primários de macaco Cinomolgos, num modo dependente da dose. A proteína de apolipoproteína B segregada de hepatócitos primários de Cinomolgos tratados com 50 e 150 nM de ISIS 315089 e ISIS 281625 foi medida por ELISA, utilizando um kit específico de proteína de apolipoproteína B (ALerCHEK Inc., Portland, ME) . Cada resultado representa a média de 3 experiências. Os dados estão normalizados para células de controlo não tratadas e são mostrados na Tabela 47.

Tabela 47

Redução na proteína de apolipoproteína B segregada de hepatócitos de macaco Cinomolgos após tratamento de oligonucleótido anti-sentido % de redução de secreção de proteína de apolipoproteína B Ns ISIS Dose de oligonucleótido 315089 281625 13650 113529 50 nM 11 6 1 6 N.D. 150 nM 25 13 13 12

Estes resultados demonstram que a inibição anti-sentido por 150 nM de ISIS 315089 conduz a uma diminuição na secreção de proteína de apolipoproteína B de hepatócitos primários de Cinomolgos cultivados. O ISIS 271009 (SEQ ID N°: 319) e ISIS 301027 (SEQ ID N° : 262) também foram testados para os seus efeitos na expressão de ARNm e proteína de apolipoproteína B em hepatócitos primários de Cinomolgos. As células, cultivadas como aqui descrito, foram tratadas com 10, 50 e 150 nM de ISIS 271009 ou ISIS 301027, durante 24 horas. As células foram tratadas com o oligonucleótido de controlo ISIS 113529 (SEQ ID N°: 859) a 150 nM. As células não tratadas também serviram como um controlo. Os níveis de ARNm de apolipoproteína B de macaco Cinomolgos em hepatócitos primários de macaco Cinomolgos foram quantificados utilizando PCR em tempo real com iniciadores e sonda humanos, como aqui descrito por outros exemplos. Os resultados, mostrados na Tabela 48, são a média de 2 experiências e são expressos como percentagem de inibição de 267 ARNm de apolipoproteína B, normalizados para células de controlo não tratadas.

Tabela 48

Inibição anti-sentido da expressão de ARNm de apolipoproteína B em hepatócitos de macaco Cinomolgos % de inibição de ARNm de apolipoproteína B Ne ISIS Dose de oligonucleótido 271009 301027 113529 10 nM 42 40 N.D. 50 nM 6 6 54 N.D. 150 nM 69 67 11

Estes dados demonstram que ambos os ISIS 271009 e ISIS 301027 podem inibir a expressão de ARNm de apolipoproteína B em hepatócitos primários de macaco Cinomolgos, num modo dependente da dose. A proteína de apolipoproteína B segregada de hepatócitos primários de Cinomolgos tratados com 50 e 150 nM de ISIS 271009 e ISIS 301027 foi medida por ELISA, utilizando um kit específico de proteína de apolipoproteína B (ALerCHEK Inc., Portland, ME). Cada resultado representa a média de 3 experiências. Os dados são mostrados como percentagem de redução em proteína segregada, normalizados para células de controlo de não tratadas e são mostrados na Tabela 49. Onde presente, um " + " indica que a secreção de proteína foi aumentada. 268

Tabela 49

Redução na proteína de apolipoproteína B segregada de hepatócitos de macaco Cinomolgos após tratamento de oligonucleótido anti-sentido % de redução de secreção de proteína de apolipoproteína B Ne ISIS Dose de oligonucleótido 271009 301027 13650 113529 50 nM +30 25 N.D. N.D. 150 nM 26 31 + 1 15

Estes resultados demonstram que a inibição anti-sentido por ISIS 315089 e ISIS 281625 conduz a uma diminuição na secreção de proteína de apolipoproteína B de hepatócitos primários de Cinomolgos cultivados.

Exemplo 62 Métodos para avaliação de esteatose hepática A esteatose hepática refere-se à acumulação de lípidos no fígado, ou "fígado gordo", que é frequentemente causada por consumo de álcool, diabetes e hiperlipidemia. Os fígados de animais tratados com oligonucleótidos anti-sentido direccionados para apolipoproteína B foram avaliados para a presença de esteatose. A esteatose é avaliada por análise histológica de tecido de fígado e medição dos níveis hepáticos de triglicéridos. 269 0 tecido resseccionado de fígado é imediatamente imerso em composto de impregnação Tissue Tek OCT (Ted Pella, Inc., Redding, CA) e congelado numa pasta de gelo seco de 2-metil-butano. As secções de tecido são cortadas a uma espessura de 4-5 pm e, depois, fixas em formalina tamponada neutra a 5%. As secções de tecido são coradas com hematoxilina e eosina seguindo processos histológicos padrão para visualizar os núcleos e citoplasma, respectivamente, e óleo vermelho 0, de acordo com as instruções do fabricante (Newcomers Supply, Middleton, WI) para visualizar os lípidos.

Alternativamente, os tecidos são fixados em formalina tamponada neutra a 10%, embebidos em parafina, seccionados a uma espessura de 4-5 pm, desparafinados e corados com hematoxilina e eosina, tudo de acordo com processos histológicos padrão. A quantificação do teor de triglicéridos hepáticos também é utilizada para avaliar a esteatose. Os níveis triglicéridos tecidulares são medidos utilizando um Ensaio GPO de Triglicéridos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

Exemplo 63

Efeitos da inibição anti-sentido por ISIS 301012 em murganhos magros: estudo de longo prazo A toxicidade de ISIS 301012 (SEQ ID N° : 247) é investigada num estudo de longo prazo, de 3 meses, em murganhos. Os murganhos CD-I de dois meses de idade, macho e fêmea, (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) são doseados com 2, 5, 12,5, 25 ou 50 mg/kg de ISIS 301012, duas vezes por semana durante a 270 primeira semana e de 4 em 4 dias a seguir. Os murganhos são mantidos numa dieta padrão de roedor. Os animais de solução salina e oligonucleótido de controlo servem como controlos e são injectados com o mesmo programa. Cada grupo de tratamento contém 6 a 10 murganhos de cada sexo e cada grupo de tratamento é duplicado, um grupo para uma terminação de estudo de 1 mês, o outro para uma terminação de estudo de 3 meses. Após os períodos de tratamento de 1 ou 3 meses, os murganhos são sacrificados e avaliados para expressão alvo no fígado, níveis lipídicos no soro e indicadores de toxicidade. As amostras de fígado são obtidas, o ARN é isolado e a expressão de ARNm de apolipoproteína B é medida por PCR em tempo real, como aqui descrito noutros exemplos. Os lípidos séricos, incluindo colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL e triglicéridos, são avaliados por análise clínica de rotina, utilizando um Analisador Clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, N.I.). As razões de colesterol LDL para colesterol HDL e colesterol total para colesterol HDL também são calculadas. As análises de ALT e AST séricas e infiltrados inflamatórios em tecido e grânulos basofílicos em tecido proporcionam uma

avaliação de toxicidades relacionadas com o tratamento. A esteatose hepática, ou acumulação de lípidos no fígado, foi avaliada por análise histológica de rotina com o corante óleo vermelho O e medição de triglicéridos de tecido de fígado, utilizando um Ensaio GPO de Triglicéridos (Sigma-Aldrich, St.

Louis, MO). O estudo de toxicidade também inclui grupos de animais deixados recuperar após cessação do tratamento de oligonucleótido. Os murganhos CD-I, macho e fêmea, (Charles

River Laboratories, Wilmington, MA) são tratados com 5, 10, 50 mg/kg de ISIS 301012, duas vezes por semana durante a 271 primeira semana e de 4 em 4 dias a seguir. Os animais injectados com solução salina e oligonucleótido de controlo servem como controlos. Cada grupo de tratamento inclui 6 animais por sexo. Após 3 meses de tratamento, os animais permanecem não tratados durante 3 meses adicionais, após os quais são sacrificados. Os mesmos parâmetros são avaliados como nos murganhos sacrificados imediatamente após 3 meses de tratamento.

Após um mês de tratamento, a quantificação de PCR em tempo real revela que os níveis de ARNm de apolipoproteína B de murganho no fígado são reduzidos em 53%. Além disso, foram observadas toxicidades esperadas de dose-resposta. Os níveis de ALT e AST, medidos por processos clínicos de rotina num Analisador Clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, N.I.), estão aumentados em murganhos tratados com 25 ou 50 mg/kg de ISIS 301012. Os tecidos foram preparados para análise por processos histológicos de rotina. Os grânulos basofílicos em tecido de fígado e rim foram observados às doses de ISIS 301012 acima de 12,5 mg/kg. Infiltrados linfo-histiocíticos moderados foram observados em diversos tecidos, a doses superiores a 12,5 mg/kg de ISIS 301012. A coloração de secções de tecido com óleo vermelho O não revela esteatose presente após os tratamentos de oligonucleótido.

Exemplo 64

Efeitos da inibição anti-sentido por ISIS 301012 em macacos Cinomolgos magros: estudo de longo prazo

Como discutido no Exemplo 45, macacos Cinomolgos (macho ou fêmea) são utilizados para avaliar oligonucleótidos anti-sentido 272 para o seu potencial para diminuírem níveis de ARNm ou proteína de apolipoproteína B, assim como pontos finais fenotípicos associados a apolipoproteína B, incluindo mas não limitados a indicadores cardiovasculares, aterosclerose, doenças lipídicas, obesidade e formação de placa. Consequentemente, numa forma de realização adicional da invenção, o ISIS 301012 (SEQ ID N°: 247) é investigado num estudo de longo prazo para os seus efeitos na expressão de apolipoproteína B e lípidos séricos em macacos Cinomolgos. Esse estudo de longo prazo também é utilizado para avaliar a toxicidade de compostos anti-sentido.

Os macacos Cinomolgos macho e fêmea são tratados com 2, 4 ou 12 mg/kg de ISIS 301012 intravenosamente ou 2 ou 20 mg/kg subcutaneamente, a uma frequência de dois em dois dias, durante a primeira semana, e de 4 em 4 dias a seguir, durante períodos de tratamento de 1 e 3 meses. Os animais tratados com solução salina servem como controlos. Cada grupo de tratamento inclui 2 a 3 animais de cada sexo. A um intervalo de um mês e no final do estudo de 3 meses, os animais são sacrificados e avaliados para expressão alvo no fígado, níveis lipídicos no soro e indicadores de toxicidade. As amostras de fígado são obtidas, o ARN é isolado e a expressão de ARNm de apolipoproteína B é medida por PCR em tempo real, como aqui descrito noutros exemplos. Os lípidos séricos, incluindo colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL e triglicéridos, são avaliados por análise clínica de rotina, utilizando um Analisador Clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, N.I.). As razões de colesterol LDL para colesterol HDL e colesterol total para colesterol HDL também são calculadas. As análises de ALT e AST séricas e infiltrados inflamatórios em tecido e grânulos basofílicos em tecido proporcionam uma 273 avaliação de toxicidades relacionadas com o tratamento. A esteatose hepática, ou acumulação de lipidos no fígado, foi avaliada por análise histológica de rotina com o corante óleo vermelho 0 e medição de triglicéridos de tecido de fígado, utilizando um Ensaio GPO de Triglicéridos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

Grupos de tratamento adicionais, consistindo de 2 animais por sexo, são tratados com solução salina (0 mg/kg), ISIS 301012 a 12 ou 20 mg/kg, a uma frequência de dois em dois dias, durante a primeira semana e de 4 em 4 dias a seguir, durante um período de 3 meses. Após o período de tratamento, os animais não recebem tratamento durante três meses adicionais. Estes grupos de tratamento são para efeitos de estudo dos efeitos da inibição de apolipoproteína B, 3 meses após a cessação do tratamento. No fim do período de recuperação de 3 meses, os animais são sacrificados e avaliados para os mesmos parâmetros que os animais sacrificados imediatamente após 1 e 3 meses de tratamento.

Os resultados do intervalo de um mês do tratamento de longo prazo são mostrados na Tabela 50 e estão normalizados para animais tratados com solução salina para ARNm e para valores de linha de base não tratados para níveis lipídicos. Os níveis de colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL, concentração de partícula de LDL e triglicérido no soro foram medidos por espectroscopia de ressonância magnética nuclear por Liposcience (Raleigh, NC) . Além disso, a concentração de oligonucleótido intacto no fígado foi medida por electroforese em gel capilar e é apresentada como microgramas de oligonucleótido por grama de tecido de fígado. Cada resultado representa a média de dados de 4 animais (2 machos e 2 fêmeas). 274

Tabela 50

Efeitos da inibição anti-sentido por ISIS 301012 em macacos

Cinomolgos magros

Distribuição intravenosa Injecção subcutânea 2 mg/kg 4 mg/kg 12 mg/kg 3,5 mg/kg 20 mg/kg % de alteração de expressão de apolipoproteina B normalizada para solução salina -45 -76 -96 N.D. -94 concentração de oligonucleótido anti-sentido ug/g 92 179 550 N.D. 855 Parâmetros lipídicos, % de alteração normalizada para valor de linha de base não tratado Solução Salina 2 mg/kg 4 mg/kg 12 mg/kg 3,5 mg/kg 20 mg/kg Colesterol total +1 -6 -2 -2 +5 -5 Colesterol LDL + 17 +15 +9 +3 -4 -16 Colesterol HDL -11 -23 -15 -8 +13 +5 IDL/HDL +62 +94 +38 +44 -15 -19 Colesterol total/HDL +30 +44 +22 +21 -7 -10 Triglicérido +37 +26 +32 +15 +1 -3 Concentração de partícula de LDL +15 +8 +8 -11 -14 -21

Estes dados mostram que o ISIS 301012 inibe a expressão de apolipoproteina B num modo dependente da dose dose numa espécie de primata e, concomitantemente, diminui os níveis lipídicos a doses superiores de ISIS 301012. Além disso, estes resultados 275 demonstram que oligonucleótido anti-sentido se acumula no fígado, num modo dependente da dose. A esteatose hepática, ou acumulação de lípidos no fígado, não foi observada após 4 semanas de tratamento com as doses indicadas. As toxicidades relacionadas com dose esperadas foram observadas às doses mais elevadas de 12 e 20 mg/kg, incluindo um factor de aumento de 1,2-1,3 transiente no tempo de tromboplastina parcial activada (APTT) durante as primeiras 4 horas e grânulos basofílicos no fígado e rim (como avaliado por examinação histológica de rotina de amostras tecidulares). Não foram observadas alterações funcionais no rim.

Numa experiência semelhante, macacos Cinomolgos macho e fêmea receberam uma dose intravenosa de ISIS 301012, a 4 mg/kg, de dois em dois dias, durante a primeira semana e de 4 em 4 dias a seguir. Os grupos de animais foram sacrificados após a primeira dose e a quarta dose, assim como 11, 15 e 23 dias após a quarta e final dose. O ARN de figado foi isolado e os níveis de ARNm de apolipoproteína B foram avaliados por PCR em tempo real, como aqui descrito. Os resultados desta experiência demonstram uma redução de 40% na expressão de ARNm de apolipoproteína B, após uma única dose intravenosa de 4 mg/kg de ISIS 301012. Além disso, após 4 doses de ISIS 301012, a 4 mg/kg, o ARNm alvo foi reduzido em, aproximadamente, 85% e uma redução de 50% no ARNm alvo foi mantida durante até 16 dias após a cessação de tratamento de oligonucleótido anti-sentido. 276

Exemplo 65

Análise de micromatriz: padrões de expressão génica em murganhos magros versus alimentados com elevado teor de gordura

Os murganhos C57B1/6 macho foram divididos nos seguintes grupos, consistindo de 5 animais cada: (1) murganhos numa dieta magra, injectados com solução salina (controlo de magro); (2) murganhos numa dieta de elevado teor de gordura; (3) murganhos numa dieta de elevado teor de gordura injectados com 50 mg/kg do oligonucleótido de controlo 141923 (SEQ ID N°: 858); (4) murganhos numa dieta de elevado teor de gordura administrados com atorvastatina cálcica a 20 mg/kg (Lipitor®, Pfizer Inc.); (5) murganhos numa dieta de elevado teor de gordura injectados com ISIS 147764 a 10, 25 ou 50 mg/kg (SEQ ID N°: 109). Os tratamentos de solução salina e oligonucleótido foram administrados intraperitonealmente, duas vezes por semana, durante 6 semanas. A atorvastatina foi administrada diariamente, durante 6 semanas. No final do estudo, as amostras de fígado foram isoladas de cada animal e o ARN foi isolado por avaliação qualitativa de transferência de Northern, micromatriz de ADN e PCR quantitativo em tempo real. A avaliação de transferência de Northern e PCR quantitativo em tempo real foram realizados como aqui descrito por outros exemplos.

Para análise de micromatriz de ADN, as amostras de hibridação foram preparadas a partir de 10 pg de ARN total, isolado de cada fígado de murganho, de acordo com o Affymetrix Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA) . As amostras foram hibridadas a um chip génico de murganho contendo, aproximadamente, 22000 genes, que foi subsequentemente lavado e duplamente corado utilizando o 277

Fluidics Station 400 (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA), como definido pelo protocolo do fabricante. Os chips génicos de murganho corados foram rastreados para intensidade celular de sonda com o scanner GeneArray (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA) . Os valores de sinal para cada conjunto de sondas foram calculados utilizando o software Affymetrix Microarray Suite v5.0 (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA). Fez-se o perfil de cada condição a partir de 5 amostras biológicas por grupo, um chip por amostra. O factor de alteração em expressão foi computado utilizando a média geométrica dos valores de sinal, como produzidos pelo Microarray Suite v5.0. A análise estatística utilizou ANOVA de um factor, seguida de 9 comparações aos pares. Todos os grupos foram comparados com o grupo de elevado teor de gordura para determinar alterações de expressão génica resultantes do tratamento de ISIS 147764. Os dados de micromatriz foram interpretados utilizando agrupamento hierárquico para visualizar padrões de expressão génica global.

Os resultados da análise de micromatriz revelam que o tratamento com ISIS 147764 dirige o perfil de expressão génica em murganhos alimentados com elevado teor de gordura para o perfil observado em murganhos magros. A análise de PCR em tempo real confirmou a redução na expressão de ARNm para os seguintes genes envolvidos no metabolismo lipídico: lipase hepática, cassete de ligação de ATP de ácido gordo sintase, membro 2 da subfamília D (ALD), proteína 2 de ligação de ácido gordo intestinal, estearol CoA desaturase 1 e HMG CoA redutase.

Os níveis séricos de colesterol e ARNm de apolipoproteína B de murganho, medidos como aqui descrito, foram avaliados para confirmar a inibição anti-sentido por ISIS 147764 e ISIS 147483. Os níveis de ARNm e colesterol foram diminuídos, num modo 278 dependente da dose, após tratamento com ISIS 147764 ou ISIS 147483, como aqui demonstrado noutros exemplos. A dose de 50 mg/kg de ISIS 147483 aumentou os níveis de ALT e AST. As doses de 10, 25 e 50 mg/kg de ISIS 147764 e as doses de 10 e 25 mg/kg de ISIS 147483 não elevaram significativamente os níveis de ALT ou AST.

Exemplo 66

Avaliação de esteatose hepática em animais tratados com oligonucleótidos anti-sentido de apolipoproteina B

Os fígados de animais tratados com oligonucleótidos anti-sentido direccionados para apolipoproteina B foram avaliados para a presença de esteatose. A esteatose é avaliada por análise histológica de tecido de fígado e medição dos níveis hepáticos de triglicéridos.

Avaliação de esteatose em animais alimentados com elevado teor de gordura, tratados com ISIS 147764, durante 6 semanas O tecido de fígado de animais tratados com ISIS 147764 (SEQ ID N°: 109) e controlo descritos no Exemplo 21 foi avaliado para esteatose no final do estudo, após 6 semanas de tratamento. As secções de tecido foram coradas com óleo vermelho O e hematoxilina para visualizar lípidos e núcleos, respectivamente. As secções de tecido também foram coradas com hematoxilina e eosina para visualizar núcleos e citoplasma, respectivamente. A análise histológica de secções de tecido coradas por qualquer método não revela diferença em esteatose entre animais tratados 279 com solução salina e tratados com ISIS 147764, demonstrando que um tratamento de 6 semanas com ISIS 147764 não conduz a acumulação de lípidos no fígado.

Avaliação de esteatose após tratamento de longo prazo com inibidor de apolipoproteina B em animais alimentados com elevado teor de gordura

Os murganhos C57B1/6 macho foram tratados com duas injecções intraperitoneais semanalmente de 25 mg/kg ISIS 147764 (SEQ ID N°: 109) ou 25 mg/kg ISIS 141923 (SEQ ID N°: 858), durante 6, 12 e 20 semanas. Os animais tratados com solução salina serviram como controlos. Cada grupo de tratamento continha 4 animais. Os animais foram sacrificados às 6, 12 e 20 semanas e o tecido de fígado foi obtido para análise histológica e medição de teor de triglicéridos tecidulares. Os resultados não revelam diferenças significativas no teor de triglicéridos em tecido de fígado, quando animais tratados com ISIS 147764 são comparados com animais tratados com solução salina. Além disso, a análise histológica de secção de tecido de fígado demonstra que a esteatose é reduzida às 12 e 20 semanas, após tratamento de murganhos alimentados com elevado teor de gordura com ISIS 147764, em comparação com animais de controlo de solução salina que receberam uma dieta de elevado teor de gordura.

Avaliação de esteatose em murganhos magros A acumulaçao de lípidos em tecido de fígado também foi avaliada em murganhos magros. Murganhos C67B1/6 macho (Charles 280

Ri ver Laboratories (Wilmington, MA) , de 6 a 7 semanas de idade, foram mantidos numa dieta padrão de roedor e foram tratados duas vezes semanalmente com injecções intraperitoneais de 147764 a 25 ou 50 mg/kg (SEQ ID N° : 109) ou 147483 (SEQ ID N° : 79), durante 6 semanas. Os animais tratados com solução salina serviram como controlos. Cada grupo de tratamento era composto por 4 animais. Os animais foram sacrificados após o período de tratamento de 6 semanas, momento em que o tecido de fígado e soro foram recolhidos.

Os níveis de ARNm de apolipoproteína B foram avaliados por PCR em tempo real, como aqui descrito por outros exemplos. Os dados, mostrados na Tabela 51, representam a média de 4 animais e são apresentados como inibição em relação a controlos tratados com solução salina. Os resultados demonstram que ambos os ISIS 147483 e ISIS 147764 inibem a expressão de ARNm de apolipoproteína B em murganhos magros, de um modo dependente da dose.

Tabela 51

Inibição anti-sentido de ARNm de apolipoproteína B em murganhos magros

Tratamento e dose ISIS ISIS 147483 147764 25 mg/kg 50 mg/kg 25 mg/kg 50 mg/kg % de inibição de ARNm de apolipoproteína B 79 91 48 77 281

Colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL e triglicéridos no soro foram medidos por análise clínica de rotina, utilizando um Analisador Clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, N.I.). As enzimas hepáticas, ALT e ALT, no soro também foram medidas utilizando o Analisador Clínico Olympus. Estes resultados demonstram que o ISIS 147764 diminui os lípidos séricos em relação a animais de controlo tratados com solução salina. Os níveis de ALT e AST não excedem a gama normal para murganhos (300 IU/L), indicando uma ausência de toxicidade associada a tratamento. Os resultados são a média de dados de 4 animais e são mostrados na Tabela 52.

Tabela 52 Níveis de lípidos séricos e enzimas hepáticas em murganhos magros tratados com ISIS 147764 e ISIS 147483

Tratamento e dose Solução Salina ISIS 147483 ISIS 147764 25 50 25 50 mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg Lípidos séricos Colesterol total mg/dL 164 153 183 114 57 Colesterol LDL mg/dL 25 26 39 29 18 Colesterol HDL mg/dL 127 117 131 79 38 Triglicéridos mg/dL 121 138 127 80 30 Enzimas hepáticas ALT IU/L 105 73 57 47 48 AST IU/L 109 78 72 81 101 282 0 tecido de fígado foi preparado por métodos histológicos de rotina para avaliar a esteatose, como aqui descrito. A examinação de amostras de tecido, coradas com óleo vermelho 0 ou hematoxilina e eosina, revela que o tratamento de murganhos magros com oligonucleótidos anti-sentido de apolipoproteína B não resulta em esteatose.

Estudo de seis meses para prosseguir a avaliação de esteatose em murganhos tratados com oligonucleótidos anti-sentido de apolipoproteína B

Um tratamento de longo prazo de murganhos com oligonucleótidos anti-sentido direccionados para apolipoproteína B é utilizado para avaliar os efeitos toxicológicos e farmacológicos de tratamento prolongado com compostos anti-sentido. Os murganhos C57B1/6 macho e fêmea, de 2 meses de idade, são tratados com 2, 5, 25 ou 50 mg/kg de oligonucleótido anti-sentido de apolipoproteína B. Os tratamentos são administrados intraperitonealmente, de 2 em 2 dias, durante a primeira semana e de 4 em 4 dias a seguir. Os murganhos tratados apenas com solução salina ou oligonucleótido de controlo servem como grupos de controlo. Cada grupo de tratamento contém 25 a 30 murganhos. Após 6 meses de tratamento, um subconjunto dos murganhos em cada grupo de tratamento é sacrificado. Aos restantes murganhos é permitido um período de recuperação de 3 meses sem tratamento, após o qual são sacrificados. A expressão de ARNm de apolipoproteína B no fígado é medida por PCR em tempo real, como aqui descrito por outros métodos. O tecido de fígado também é preparado para medição de teor de triglicéridos, utilizando um Ensaio GPO de Triglicéridos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) . O soro é recolhido e avaliado 283 para teor de lípido, incluindo colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL e triglicéridos, utilizando um Analisador Clinico Olympus (Olympus America Inc., Melville, N.I.). As enzimas hepáticas, ALT e AST, também são medidas no soro, utilizando também o analisador clínico. As amostras séricas são submetidas a análise de imunotransferência, utilizando um anticorpo dirigido para apolipoproteína B (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) . 0 fígado, rim e outros tecidos são preparados por processos de rotina para análises histológicas. Os tecidos são avaliados para a presença de grânulos basofílicos e infiltrados inflamatórios. A esteatose é avaliada por coloração de óleo vermelho O de secções de tecido de fígado.

Exemplo 67

Um modelo de murganho para formação de placa aterosclerótlca: murganhos transgénicos de apolipoproteína B humana desprovidos do gene de receptor de LDL 0 receptor de LDL é responsável pela eliminação de partículas de LDL contendo apolipoproteína B. Sem o receptor de LDL, os animais não podem eliminar eficazmente as partículas de LDL contendo apolipoproteína B do plasma. Deste modo, os níveis séricos de apolipoproteína B e colesterol LDL estão marcadamente elevados. Os murganhos expressando o transgene de apolipoproteína B humana (TgN-hApoB +/+) e os murganhos deficientes para o receptor de LDL (LDLr -/-) são ambos utilizados como modelos animais de desenvolvimento de placa aterosclerótica. Quando o genótipo de deficiência de receptor de LDL é combinado com um genótipo transgénico de apolipoproteína B humana (TgN-hApoB +/+; LDLr -/-), as placas ateroscleróticas 284 desenvolvem-se rapidamente. Os murganhos de fundo genético são utilizados para investigar a capacidade dos compostos prevenirem a aterosclerose e formação de placa.

Os murganhos TgN-hApoB +/+;LDLr -/- macho são tratados duas vezes semanalmente com 10 ou 20 mg/kg de oligonucleótidos anti-sentido de apolipoproteína B humana, durante 12 semanas. Os grupos de controlo são tratados com solução salina ou oligonucleótido de controlo. O colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL e triglicéridos séricos são medidos às 2, 4, 6, 8 e 12 semanas por análise clínica de rotina, utilizando um Analisador Clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, N.I.). A proteína de apolipoproteína B humana sérica é medida às 2, 4, 6, 8 e 12 semanas, utilizando um kit de ELISA (ALerCHEK Inc., Portland, ME). O ARNm de apolipoproteína humana e de murganho no fígado é medido às 12 semanas. Os resultados do estudo de 12 semanas servem para avaliar o comportamento farmacológico de ISIS 301012 num modelo duplamente transgénico.

Além disso, é realizado um estudo de quatro meses em murganhos TgN-hApoB +/+;LDLr -/-, com condições de tratamento utilizadas no estudo de 12 semanas. Os murganhos são tratados durante 4 meses com oligonucleótidos anti-sentido direccionados para apolipoproteína B humana, para avaliar a capacidade de esses compostos prevenirem a formação de placa aterosclerótica. No fim do período de tratamento de 4 meses, os murganhos são anestesiados e perfundidos com formalina a 10%. A árvore arterial perfundida é isolada e examinada para a presença de placas ateroscleróticas. As secções da árvore arterial são embebidas em parafina e preparadas para análise histológica utilizando métodos de rotina. O colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL e triglicéridos séricos são medidos às 2, 4, 285 6, 8, 12 e 16 semanas por análise clínica de rotina, utilizando um Analisador Clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, N.I.). A proteína de apolipoproteína B humana sérica é medida às 2, 4, 6, 8, 12 e 16 semanas, utilizando um kit de ELISA (ALerCHEK Inc., Portland, ME). 0 ARNm de apolipoproteína humana e de murganho no fígado às 16 semanas é medido por PCR em tempo real.

Exemplo 68

Modelos de coelho para estudo de formação de placa aterosclerótica A estirpe hiperlipidémica hereditária Watanabe (WHHL) de coelho é utilizada como um modelo para formação de placa aterosclerótica. Coelhos brancos da Nova Zelândia, numa dieta de elevado teor de gordura, também são utilizados como um modelo de formação de placa aterosclerótica. 0 tratamento de coelhos de WHHL ou brancos da Nova Zelândia alimentados com elevado teor de gordura com compostos anti-sentido de apolipoproteína B é utilizado para testar o seu potencial como tratamento terapêutico ou profiláctico para doença de placa aterosclerótica. Os coelhos são injectados com 5, 10, 25 ou 50 mg/kg de oligonucleótidos anti-sentido direccionados para apolipoproteína B. Os animais tratados apenas com solução salina ou um oligonucleótido de controlo servem como controlos. Em todo o tratamento, as amostras séricas são recolhidas e avaliadas para níveis de proteína de apolipoproteína B por ELISA (kit da ALerCHEK Inc., Portland, ME) e lípidos séricos (colesterol, colesterol LDL, colesterol VLDL, colesterol HDL, triglicéridos) por análise clínica de rotina. O teor de triglicéridos de tecido 286 de fígado é medido utilizando um Ensaio GPO de Triglicéridos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Fígado, rim, coração, aorta e outros tecidos são obtidos e processados para análise histológica, utilizando processos de rotina. Os tecidos de fígado e rim são examinados para evidência de grânulos basofílicos e infiltrados inflamatórios. 0 tecido de fígado é avaliado para esteatose utilizando coloração de óleo vermelho 0. Além disso, as secções aórticas coradas com coloração de óleo vermelho 0 e hematoxilina são examinadas para avaliar a formação de lesões ateroscleróticas.

Exemplo 69

Distribuição oral de inibidores de Apolipoproteina B

Os oligonucleótidos pode ser formulados para distribuição in vivo numa forma de dosagem aceitável, e. g., como formulações parentéricas ou não parentéricas. As formulações parentéricas ou não parentéricas incluem formulações intravenosas (IV), subcutâneas (SC), intraperitoneais (IP), intravitreais e intramusculares (IM), assim como formulações para distribuição por meio de inalação pulmonar, administração intranasal, administração tópica, etc. As formulações não parentéricas incluem formulações para distribuição por meio do canal alimentar, e. g., administração oral, administração rectal, instilação intrajejunal, etc. A administração rectal inclui administração como um enema ou um supositório. A administração oral inclui administração como uma cápsula, uma cápsula de gel, um comprimido, um elixir, etc. 287

Em algumas formas de realização, um oligonucleótido pode ser administrado a um indivíduo por meio de uma via de administração oral. 0 indivíduo pode ser um animal ou um humano (homem). Um indivíduo animal pode ser um mamífero, tais como um murganho, rato, murganho, um rato, um cão, um cobaio, um macaco, um primata não humano, um gato ou um porco. Os primatas não humanos incluem macacos e chimpanzés. Um indivíduo animal adequado pode ser um animal experimental, tais como um murganho, rato, murganho, um rato, um cão, um macaco, um primata não humano, um gato ou um porco.

Em algumas formas de realização, o indivíduo pode ser um humano. Em determinadas formas de realização, o indivíduo pode ser um doente humano a necessitar de tratamento terapêutico, como aqui discutido em maior detalhe. Em determinadas formas de realização, o indivíduo pode estar a necessitar da modulação da expressão de um ou mais genes, como aqui discutido em maior detalhe. Em formas de realização particulares, o indivíduo pode estar a necessitar da inibição da expressão de um ou mais genes, como aqui discutido em maior detalhe. Em formas de realização particulares, o indivíduo pode estar a necessitar da modulação, i. e., inibição ou estimulação, de apolipoproteína B, de modo a obter-se as indicações terapêuticas aqui discutidas em maior detalhe.

Em algumas formas de realização, as formulações de oligonucleótido não parentéricas (e. g. , oral) de acordo com a presente invenção resultam em biodisponibilidade melhorada do oligonucleótido. Neste contexto, o termo "biodisponibilidade" refere-se a uma medição da porção de um fármaco administrado que atinge o sistema circulatório (e. g. , sangue, especialmente plasma sanguíneo), quando é utilizado um modo de administração 288 particular para distribuir o fármaco. A biodisponibilidade melhorada refere-se a um modo particular da capacidade de a administração distribuir oligonucleótido ao plasma de sangue periférico de um indivíduo em relação a outro modo de administração. Por exemplo, quando um modo de administração não parentérico (e. g., um modo oral) é utilizado para introduzir o fármaco num indivíduo, a biodisponibilidade para esse modo de administração pode ser comparada com um modo de administração diferente, e. g. , um modo de administração IV. Em algumas formas de realização, a área sob a curva de concentração de plasma sanguíneo de um composto (AUCo) após administração não parentérica (e. g. , oral, rectal, intrajejunal) pode ser dividida pela área sob a curva de concentração plasmática do fármaco após administração intravenosa (i.v.) (AUCiv) , para proporcionar um quociente adimensional (biodisponibilidade relativa, RB) que representa a fracção do composto absorvido por meio da via não parentérica, comparativamente com a via IV. Diz-se que a biodisponibilidade de uma composição é melhorada, em comparação com a biodisponibilidade de outra composição, quando a biodisponibilidade relativa da primeira composição (RB^ é superior à biodisponibilidade relativa da segunda composição (RB2) .

Em geral, a biodisponibilidade correlaciona-se com a eficácia terapêutica, quando a eficácia terapêutica de um composto se relaciona com a concentração sanguínea alcançada, mesmo se o derradeiro local de acção do fármaco for intracelular (van Berge-Henegouwen et al. , Gastroenterol., 1977, 73, 300). Os estudos de biodisponibilidade foram utilizados para determinar o grau de absorção intestinal de um fármaco, pela medição da alteração nos níveis de sangue periférico do fármaco após uma dose oral (DiSanto, Capítulo 76 In: Remington=s Pharmaceutical 289

Sciences, 18a Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, páginas 1451-1458).

Em geral, diz-se que a biodisponibilidade de uma composição oral é "melhorada", quando a sua biodisponibilidade relativa é superior à biodisponibilidade de uma composição consistindo, substancialmente, de oligonucleótido puro, i. e., oligonucleótido na ausência de um intensificador de penetração. A biodisponibilidade de órgão refere-se à concentração de composto num órgão. A biodisponibilidade de órgão pode ser medida em indivíduos de teste por um número de meios, tal como por radiografia de corpo inteiro. A biodisponibilidade de órgão pode ser modificada, e. g., melhorada, por uma ou mais modificações a um oligonucleótido, por utilização de um ou mais compostos veículos ou excipientes, etc., como aqui discutido em maior detalhe. Em geral, um aumento na biodisponibilidade resultará num aumento na biodisponibilidade de órgão.

As composições de oligonucleótido orais de acordo com a presente invenção podem compreender um ou mais "intensificadores de penetração mucosais", também conhecidos como "intensificadores de absorção" ou, simplesmente, como "intensificadores de penetração". Consequentemente, algumas formas de realização da invenção compreendem, pelo menos, um oligonucleótido, em combinação com, pelo menos, um intensificador de penetração. Em geral, um intensificador de penetração é uma substância que facilita o transporte de um fármaco através de membrana(s) mucosa(s) associado ao modo de administração desejado, e. g., membranas epiteliais intestinais. Consequentemente, é desejável seleccionar um ou mais intensificadores de penetração que facilitem a absorção de um 290 oligonucleótido, sem interferir com a actividade do oligonucleótido e de um tal modo que o oligonucleótido possa ser introduzido no corpo de um animal sem efeitos secundários inaceitáveis, tais como toxicidade, irritação ou resposta alérgica.

As formas de realização da presente invenção proporcionam composições compreendendo um ou mais intensificadores de penetração farmaceuticamente aceitáveis e métodos de utilização dessas composições que resultem na biodisponibilidade melhorada dos oligonucleótidos administrados por meio de modos de administração não parentéricos. Até agora, foram utilizados determinados intensificadores de penetração para melhorar a biodisponibilidade de determinados fármacos. Ver Muranishi, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1 e Lee et ai., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91. Verificou-se que a absorção e distribuição de oligonucleótidos, moléculas relativamente complexas que são conhecidas por serem dificeis de administrar a animais e ao homem, podem ser grandemente melhoradas, mesmo quando administrados por meios não parentéricos, pela utilização de um número de diferentes classes de intensificadores de penetração.

Em algumas formas de realização, as composições para administração não parentérica incluem uma ou mais modificações de oligonucleótidos de ocorrência natural (i. e., oligonucleótidos de desoxirribosilo de fosfodiéster completo ou de ribosilo de fosfodiéster completo). Essas modificações podem aumentar a afinidade de ligação, estabilidade de nuclease, permeabilidade celular ou tecidular, distribuição tecidular ou outra propriedade biológica ou farmacocinética. As modificações podem ser realizadas na base, no ligante ou no açúcar, em geral, 291 como aqui discutido em maior detalhe com respeito à química de oligonucleótido. Em algumas formas de realização da invenção, as composições para administração a um indivíduo e, em particular, composições orais para administração a um animal ou indivíduo humano, compreenderão oligonucleótidos modificados tendo uma ou mais modificações para melhoramento da afinidade, estabilidade, distribuição tecidular ou outra propriedade biológica.

Os ligantes modificados adequados incluem ligantes fosforotioato. Em algumas formas de realização de acordo com a invenção, o oligonucleótido tem, pelo menos, um ligante fosforotioato. Os ligantes fosforotioato proporcionam estabilidade de nuclease, assim como características de ligação de proteína plasmática ao oligonucleótido. A estabilidade de nuclease é útil para o aumento do tempo de vida in vivo dos oligonucleótidos, enquanto a ligação de proteína plasmática diminui a taxa de eliminação de primeira passagem do oligonucleótido por meio de excreção renal. Em algumas formas de realização de acordo com a presente invenção, o oligonucleótido tem, pelo menos, dois ligantes fosforotioato. Em algumas formas de realização, em que o oligonucleótido tem, exactamente, n nucleósidos, o oligonucleótido tem desde uma a n-1 ligações fosforotioato. Em algumas formas de realização, em que o oligonucleótido tem, exactamente, n nucleósidos, o oligonucleótido tem n-1 ligações fosforotioato. Noutras formas de realização, em que o oligonucleótido tem, exactamente, n nucleósidos e n é par, o oligonucleótido tem desde 1 a n/2 ligações fosforotioato ou, quando n é impar, desde 1 a (n-1)/2 ligações fosforotioato. Em algumas formas de realização, o oligonucleótido tem ligações fosfodiéster (PO) e fosforotioato (PS) alternadas. Noutras formas de realização, o oligonucleótido tem, pelo menos, um segmento de duas ou mais ligações PO 292 consecutivas e, pelo menos, um segmento de duas ou mais ligações PS. Noutras formas de realização, o oligonucleótido tem, pelo menos, dois segmentos de ligações PO interrompidas por, pelo menos, uma ligação PS.

Em algumas formas de realização, pelo menos um dos nucleósidos está modificado na unidade de açúcar de ribosilo por uma modificação que confere estabilidade de nuclease, afinidade de ligação ou qualquer outra propriedade biológica benéfica ao açúcar. Em alguns casos, a modificação de açúcar inclui uma modificação em 2', e. g., o 2'-OH do açúcar de ribosilo está substituído. As substituições adequadas para 2'-OH incluem 2'-F e 2'-arabino-F. As substituições adequadas para OH incluem 2'-O-alquilo, e. g. , 2-O-metilo e 2'-O-substituído alquilo, e. g., 2'-O-metoxietilo, 2'-O-aminopropilo, etc. Em algumas formas de realização, o oligonucleótido contém, pelo menos, uma modificação em 2' . Em algumas formas de realização, o oligonucleótido contém, pelo menos, 2 modificações em 2' . Em algumas formas de realização, o oligonucleótido tem, pelo menos, uma modificação em 2' em cada teteminal (i. e., os nucleósidos 3'- e 5'-terminais têm, cada, as mesmas ou diferentes modificações em 2'). Em algumas formas de realização, o oligonucleótido tem, pelo menos, duas modificações em 2' sequenciais em cada extremidade do oligonucleótido. Em algumas formas de realização, os oligonucleótidos compreendem, ainda, pelo menos, um desoxinucleósido. Em formas de realização particulares, os oligonucleótidos compreendem um segmento de desoxinucleósidos, de modo que o segmento seja capaz de activação da clivagem de RNase (e. g., RNase H) de um ARN a que o oligonucleótido seja capaz de se hibridar. Em algumas formas de realização, um segmento of desoxinucleósidos capaz de activação da clivagem de ARN mediada por RNase compreende cerca 293 de 6 a cerca de 16, e. g., cerca de 8 a cerca de 16 desoxinucleósidos consecutivos.

As composições orais para administração de composições de oligonucleótido não parentéricas da presente invenção podem ser formuladas em diversas formas de dosagem, tais como, mas não limitadas a comprimidos, cápsulas, xaropes líquidos, géis macios, supositórios e enemas. A expressão "distribuição alimentar" abrange, e. g., administração oral, rectal, endoscópica e sublingual/bucal. Um requisito comum para estes modos de administração é a absorção ao longo de alguma porção ou da totalidade do aparelho alimentar e a necessidade para penetração mucosal eficiente do(s) ácido(s) nucleico(s) assim administrado(s) . A distribuição de um fármaco por meio da mucosa oral, como no caso da administração bucal e sublingual, tem várias características desejáveis incluindo, em muitos casos, uma subida mais rápida em concentração plasmática do fármaco do que por meio de distribuição oral (Harvey, Capítulo 35: In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, página 711). A endoscopia pode ser utilizada para a distribuição de fármaco directamente num porção interior do aparelho alimentar. Por exemplo, a cistopancreatografia retrógrada endoscópica (ERCP) tira partido da gastroscopia prolongada e permite o acesso selectivo ao tracto biliar e ao dueto pancreático (Hirahata et ai., Gan To Kagaku Ryoho, 1992, 19(10 Supl.), 1591). As composições farmacêuticas, incluindo formulações lipossomais, podem ser distribuídas directamente nas porções do canal alimentar, tais como, e. g., o duodeno (Somogyi et ai., 294

Pharm. Res., 1995, 12, 149) ou a submucosa gástrica (Akamo et ai., Japanese J. Câncer Res., 1994, 85, 652) via meios endoscópicos. Os dispositivos de lavagem gástrica (Inoue et al., Artif. organs, 1997, 21, 28) e dispositivos de alimentação endoscópica percutânea (Pennington et al., Ailment Pharmacol. Ther., 1995, 9, 471) também podem ser utilizados para distribuição alimentar directa das composições farmacêuticas.

Em algumas formas de realização, as formulações de oligonucleótido podem ser administradas através do ânus no recto ou intestino inferior. Os supositórios rectais, enemas de retenção ou cateteres rectais podem ser utilizados para este efeito e podem ser preferidos, quando a aceitação pelo doente possa, de outro modo, ser difícil de alcançar (e. g., em aplicações pediátricas e geriátricas ou quando o doente está com vómitos ou inconsciente). A administração rectal pode resultar em níveis sanguíneos mais imediatos e superiores que a via oral. (Harvey, Capítulo 35 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, página 711) . Devido a cerca de 50% do fármaco que é absorvido a partir do recto contornar o fígado, a administração por esta via reduz significativamente o potencial para metabolismo de primeira passagem (Benet et al., Capítulo 1 In: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a Ed., Hardman et al., eds., McGraw-Hill, Nova Iorque, N.I., 1996).

Um método vantajoso de administração não parentérica de composições de oligonucleótido é a distribuição oral. Algumas formas de realização empregam diversos intensificadores de penetração, de modo a efectuar-se o transporte dos oligonucleótidos e outros ácidos nucleicos através de membranas mucosais e epiteliais. Os intensificadores de penetração podem 295 ser classificados como pertencendo a uma de cinco categorias amplas - surfactantes, ácidos gordos, sais biliares, agentes quelantes e não surfactantes não quelantes (Lee et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Consequentemente, algumas formas de realização compreendem composições de oligonucleótido orais compreendendo, pelo menos, um membro do grupo consistindo de surfactantes, ácido gordos, sais biliares, agentes quelantes e surfactantes não quelantes. Formas de realização adicionais compreendem oligonucleótido oral compreendendo, pelo menos, um ácido gordo, e. g., ácido cáprico ou láurico, ou suas combinações ou sais. Outras formas de realização compreendem métodos de melhoramento da biodisponibilidade oral de um oligonucleótido, o método compreendendo a co-administração do oligonucleótido e, pelo menos, um intensificador de penetração.

Outros excipientes que podem ser adicionados a composições de oligonucleótido incluem surfactantes (ou "agentes tensioactivos"), os quais são entidades químicas que, quando dissolvidas numa solução aquosa, reduzem a tensão de superfície da solução ou a tensão interfacial entre a solução aquosa e outro líquido, com o resultado de que a absorção de oligonucleótidos através da mucosa alimentar e outras membranas epiteliais é melhorada. Além de sais biliares e ácidos gordos, os surfactantes incluem, por exemplo, laurilssulfato de sódio, éter polioxietileno-9-laurílico e éter polioxietileno-20-cetílico (Lee et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); e emulsões perfluoro-hémicas, tal como FC-43 (Takahashi et al., J. Pharm. Phamacol., 1988, 40, 252) . 296

Os ácidos gordos e seus derivados que actuam como intensificadores de penetração e podem ser utilizados em composições da presente invenção incluem, por exemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanóico), ácido miristico, ácido palmitico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleina (1-monooleoil-rac-glicerol) , dilaurina, ácido caprilico, ácido araquidónico, gliceril 1-monocaprato, 1-dodecilazaciclo-heptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas e os seus mono- e di-glicéridos e/ou os seus sais fisiologicamente aceitáveis (i. e., oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1; El-Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651).

Em algumas formas de realização, as composições de oligonucleótido para distribuição oral compreendem, pelo menos, duas fases discretas, cujas fases podem compreender partículas, cápsulas, cápsulas de gel, microsferas, etc. Cada fase pode conter um ou mais oligonucleótidos, intensificadores de penetração, surfactantes, bioadesivos, agentes efervescentes ou outro adjuvante, excipiente ou diluente. Em algumas formas de realização, uma fase compreende, pelo menos, um oligonucleótido e, pelo menos, um intensificador de penetração. Em algumas formas de realização, uma primeira fase compreende, pelo menos, um oligonucleótido e, pelo menos, um intensificador de penetração, enquanto uma segunda fase compreende, pelo menos, um intensificador de penetração. Em algumas formas de realização, uma primeira fase compreende, pelo menos, um oligonucleótido e, pelo menos, um intensificador de penetração, enquanto uma segunda fase compreende, pelo menos, um intensificador de 297 penetração e substancialmente nenhum oligonucleótido. Em algumas formas de realização, pelo menos um fase é combinada com, pelo menos, um retardante de degradação, tais como um revestimento ou uma matriz, a qual retarda a libertação do conteúdo dessa fase. Em algumas formas de realização, pelo menos uma fase, Em algumas formas de realização, uma primeira fase compreende, pelo menos, um oligonucleótido, pelo menos, um intensificador de penetração, enquanto uma segunda fase compreende, pelo menos, um intensificador de penetração e um retardante de libertação. Em formas de realização particulares, um oligonucleótido oral compreende uma primeira fase compreendendo partículas contendo um oligonucleótido e um intensificador de penetração e uma segunda fase compreendendo partículas revestidas com um agente retardante de libertação e contendo intensificador de penetração.

Uma variedade de sais biliares também funciona como intensificadores de penetração para facilitar a absorção e biodisponibilidade de fármacos. Os papéis fisiológicos da bílis incluem a facilitação da dispersão e absorção de lípidos e vitaminas solúveis em gorduras (Brunton, Capítulo 38 Em; Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a Ed., Hardman et al., eds., McGraw-Hill, Nova Iorque, N.I., 1996, páginas 934-935). Diversos sais biliares naturais e os seus derivados sintéticos, actuam como intensificadores de penetração. Deste modo, a expressão "sal biliar" inclui qualquer dos componentes de ocorrência natural da bílis, assim como qualquer dos seus derivados sintéticos. Os sais biliares da invenção incluem, por exemplo, ácido eólico (ou seu sal de sódio farmaceuticamente aceitável, colato de sódio), ácido desidrocólico (desidrocolato de sódio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sódio), ácido glucólico (glucolato de sódio), 298 ácido glicólico (glicocolato de sódio), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sódio), ácido taurocólico (taurocolato de sódio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sódio), ácido guenodesoxicólico (CDCA, guenodesoxicolato de sódio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-di-hidro-fusidato de sódio (STDHF), glicodi-hidrofusidato de sódio e éter de polioxietileno-9-laurilo (POE) (Lee et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swinyard, Capítulo 39 Em; Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, páginas 782-783; Muranishi, Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp.

Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al. , J. Pharm. Sei., 1990, 79, 579) .

Em algumas formas de realização, os intensificadores de penetração úteis em algumas formas de realização da presente invenção são misturas de compostos de intensificação de penetração. Um desses intensificadores de penetração é uma mistura de UDCA (e/ou CDCA) com ácidos cáprico e/ou láurico ou seus sais e. g., sódio. Essas misturas são úteis para o melhoramento da distribuição de substâncias biologicamente activas em membranas mucosais, em particular mucosa intestinal. Outras misturas de intensificador de penetração compreendem cerca de 5-95% de ácido biliar ou sal (sais) UDCA e/ou CDCA com 5-95% de ácido cáprico e/ou láurico. Intensificadores de penetração particulares são misturas dos sais de sódio de UDCA, ácido cáprico e ácido láurico, numa razão de cerca de 1:2:2, respectivamente. Outro desses intensificadores de penetração é uma mistura de ácido cáprico e láurico (ou seus sais), numa razão 0,01:1 a 1:0,01 (base molar). Em formas de realização particulares o ácido cáprico e ácido láurico estão presentes 299 em razoes molares de, e. g., cerca de 0,1:1 a cerca de 1:0,1, em particular cerca de 0,5:1 a cerca de 1:0,5.

Outros excipientes incluem agentes quelantes, i. e., compostos que removem iões metálicos de solução, pela formação de complexos com esta, com o resultado de que a absorção de oligonucleótidos através da mucosa alimentar e outras mucosas é melhorada. Em relação à sua utilização como intensificadores de penetração na presente invenção, os agentes quelantes têm a vantagem adicionada de servirem também como inibidores de DNase, dado que a maioria das ADN nucleases caracterizadas requer um ião metálico divalente para catálise e são, deste modo, inibidas por agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315). Os agentes quelantes da invenção incluem mas não estão limitados a etilenodiaminotetraacetato dissódico (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (e. g., salicilato de sódio, 5-metoxisalicilato e homovanilato) , derivados iV-acilo de colagénio, laureth-9 e derivados N- amino acilo de beta-dicetonas (enaminas) (Lee et al. , Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1; Buur et al., J. Control Rei., 1990, 14, 43) .

Como aqui utilizado, os intensificadores de penetração não surfactantes não quelantes podem ser definidos como compostos que demonstram actividade insignificante como agentes quelantes ou como surfactantes mas que, não obstante, melhoram a absorção de oligonucleótidos através da mucosa alimentar e outras membranas mucosais (Muranishi, Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1). Esta classe de intensificadores de penetração inclui, mas não está limitada a ureias cíclicas insaturadas, 1-alquil- e derivados de 300 1-alcenilazaciclo-alcanona (Lee et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); e agentes anti-inflamatórios não-esteróides, tais como diclofenac sódico, indometacina e fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621).

Os agentes que melhoram a absorção de oligonucleótidos ao nível celular também podem ser adicionados às composições farmacêuticas e outras da presente invenção. Por exemplo, lípidos catiónicos, tal como lipofectina (Junichi et ai., Patente U.S. N° 5705188), derivados catiónicos de glicerol e moléculas policatiónicas, tal como polilisina (Lollo et al., Pedido PCT WO 97/30731), podem ser utilizados.

Algumas composições de oligonucleótido orais também incorporam compostos veículos na formulação. Como aqui utilizado, "composto veículo" ou "veículo" pode referir-se a um ácido nucleico, ou seu análogo, o qual pode ser inerte (i. e., não possui actividade biológica per se) ou pode ser necessário para transporte, reconhecimento ou activação ou mediação de via, ou é reconhecido como um ácido nucleico por processos in vivo que reduzem a biodisponibilidade de um ácido nucleico tendo actividade biológica, por exemplo, pela degradação do ácido nucleico biologicamente activo ou promoção da sua remoção da circulação. A co-administração de um ácido nucleico e um composto veículo, tipicamente com um excesso da última substância, pode resultar numa redução substancial da quantidade de ácido nucleico recuperado no fígado, rim ou outros reservatórios extracirculatórios, presumivelmente devido a competição entre o composto veículo e o ácido nucleico por um receptor comum. Por exemplo, a recuperação de um oligonucleótido parcialmente fosforotioato em tecido hepático pode ser reduzida 301 quando é co-administrado com ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico ou ácido 4-acetamido-4'isotiociano-estilbeno-2,2'-dissulfónico (Miyao et al., Antisense Res. Dev.r 1995, 5, 115; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177) .

Um "veículo farmacêutico" ou "excipiente" pode ser um solvente farmaceuticamente aceitável, agente de suspensão ou qualquer outro transportador farmacologicamente inerte para distribuição de um ou mais ácidos nucleicos a um animal. 0 excipiente pode ser líquido ou sólido e é seleccionado, com o modo de administração pensado, de modo a proporcionar o volume, consistência, etc., desejados, quando combinado com um ácido nucleico e os outros componentes de uma dada composição farmacêutica. Os veículos farmacêuticos típicos incluem mas não estão limitados a agentes de ligação (e. g., amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropilmetilcelulose, etc.); espessantes (e. g., lactose e outros açúcares, celulose microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de cálcio, etilcelulose, poliacrilatos ou hidrogenofosfato de cálcio, etc.); lubrificantes (e. g., estearato de magnésio, talco, sílica, dióxido de silício coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, óleos vegetais hidrogenados, amido de milho, polietilenoglicóis, benzoato de sódio, acetato de sódio, etc.); desagregantes (e. g., amido, glicolato sódico de amido, EXPLOTAB); e agentes molhantes (e. g., laurilssulfato de sódio, etc.). 302

As composições de oligonucleótido orais podem, ainda, conter outros componentes adjuntos convencionalmente verificados em composições farmacêuticas, nos seus níveis de utilização estabelecidos na técnica. Deste modo, por exemplo, as composições podem conter materiais farmaceuticamente activos compatíveis adicionais, tais como, por exemplo, antipruriginosos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes anti-inflamatórios, ou podem conter materiais adicionais úteis na formulação física de diversas formas de dosagem da composição da presente invenção, tais como corantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes de espessamento e estabilizantes. Contudo, esses materiais, quando adicionados, não devem interferir indevidamente com as actividades biológicas dos componentes das composições da presente invenção. 303 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Genzyme Corporation

EXPRESSÃO

<120> MODULAÇÃO ΑΝΤΙ-SENTIDO DA APOLIPOPROTE íNA B

<130> P055617EP <150> US 60/426234 <151> 2002-11-13 <150> PCT/US03/015493 <151> 2003-05-15 <150> PCT/US03/036411 <151> 2003-11-13 <150> EP 03789763.4 <151> 2003-11-13 <160> 892

<210> 1 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 1 tccgtcatcg ctcctcaggg 20

<210> 2 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 2 atgcattctg cccccaagga 20

<210> 3 <211> 14121 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (129)..(13820) <400> 3 attcccaccg ggacctgcgg ggctgagtgc ccttctcggt tgctgccgct gaggagcccg 60 cccagccagc cagggccgcg aggccgaggc caggccgcag cccaggagcc gccccaccgc 120 agctggcg atg gac ccg ccg agg ccc gcg ctg ctg gcg ctg ctg gcg ctg 170 Met Asp Pro Pro Arg Pro Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 15 10 cct gcg ctg ctg ctg ctg ctg ctg gcg ggc gcc agg gcc gaa gag gaa 218

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Met ser Ser Trp Leu Gin Lys Al a Ser Gly Ser Leu Pro 1235 1240 1245 tat acc cag act ttg caa gac cac ctc aat age ctg aag gag ttc aac 3914 Tyr Thr Gl Π Thr Leu Gin Asp HiS Leu Asn ser Leu Lys Glu phe Asn 1250 1255 1260 ctc cag aac atg gaa ttg cca gac ttc cac ate cca gaa aac ctc ttc 3962 Leu Gl n Asn Met Gly Leu Pro Asp phe His ile Pro Glu Asn Leu Phe 1265 1270 1275 tta aaa age gat ggc cgg gtc aaa tat acc ttg aac aag aac agt ttg 4010 Leu Lys Ser Asp Gly Arg val Lys Tyr Thr Leu Asn Lys Asn Ser Leu 1280 1285 1290 aaa att gag att cct ttg cct ttt ggt ggc aaa tcc tcc aga gat cta 4058 LV5 ile Glu ile Pro Leu Pro phe Gly Gly Lys Ser Ser Arg Asp Leu 1295 1300 1305 1310 aag atg tta gag act gtt agg aca cca gee ctc cac ttc aag tct gtg 4106 Lys Met Leu Glu Thr val Arg Thr Pro Ala Leu Hi s Phe Lys Ser Val 1315 1320 1325 gga ttc cat ctg cca tct cga gag ttc caa gtc cct act ttt acc att 4154 Gly Phe Hi s Leu Pro Ser Arg Glu Phe Gin Val Pro Thr Phe Thr Ile 1330 1335 1340 ccc aag ttg tat caa ctg caa gtg cct 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His val Glu Lys Leu Gly Asn Asn Pro vai Ser Lys Gly Leu Leu lie 1440 1445 1450 ttc gat gca tct agt tcc tgg gaa cca cag atg tct gct tca gtt cat

Phe Asp Ala Ser ser Ser Trp Gly pro Gin Met Ser Ala ser val His 1455 1460 1465 1470 ttg gac tcc aaa aag aaa cag cat ttg ttt gtc aaa gaa gtc aag att

Leu Asp Ser Lys Lys Lys Gin His Leu Phe Val Lys Glu val Lys lie 1475 1480 1485 gat ggg cag ttc aga gtc tct tcg ttc tat gct aaa ggc aca tat ggc

Asp Gly Gin Phe Arg Val Ser Ser Phe Tyr Ala Lys Gly Thr Tyr Gly 1490 1495 1500 ctg tct tgt cag agg gat cct aac act ggc cgg ctc aat gga gag tcc

Leu Ser cys Gin Arg Asp Pro Asn Thr Gly Arg Leu Asn Gly Glu Ser 1505 1510 1515 aac ctg agg ttt aac tcc tcc tac ctc caa ggc acc aac cag ata aca

Asn Leu Arg Phe Asn Ser ser Tyr Leu Gin Gly Thr Asn Gin lie Thr 1520 1525 1530 gga aga tat gaa gat gga acc ctc tcc ctc acc tcc acc tct gat ctg oly Arg Tyr Glu Asp Gly Thr Leu ser Leu Thr ser Thr ser Asp Leu 1535 1540 1545 1550 caa agt ggc ate att aaa aat act gct tcc cta aag tat gag aac tac

Gin Ser Gly lie lie Lys Asn Thr Ala ser Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr 1555 1560 1565 gag ctg act tta aaa tct gac acc aat ggg aag tat aag aac ttt gee

Glu Leu Thr Leu Lys Ser Asp Thr Asn Gly Lys Tyr Lys Asn Phe Ala 1570 1575 1580 act tct aac aag atg gat atg acc ttc tct aag caa aat gca ctg ctg

Thr Ser Asn Lys Met Asp Met Thr Phe Ser Lys Gin Asn Ala Leu Leu 1585 1590 1595 cgt tct gaa tat cag gct gat tac gag tca ttg agg ttc ttc age ctg

Arg ser Glu Tyr Gin Ala Asp Tyr Glu ser Leu Arg Phe Phe ser Leu 1600 1605 1610 ctt tct gga tca cta aat tcc cat ggt ctt gag tta aat gct gac ate

Leu Ser Gly ser Leu Asn Ser His Gly Leu Glu Leu Asn Ala Asp Ile 1615 1620 1625 1630 tta ggc act gac aaa att aat agt ggt gct cac aag gcg aca cta agg

Leu Gly Thr Asp Lys ile Asn ser Gly Ala His Lys Ala Thr Leu Arg 1635 1640 1645 att ggc caa gat gga ata tct acc agt gca acg acc aac ttg aag tgt lie Gly Gin Asp Gly Ile Ser Thr Ser Ala Thr Thr Asn Leu Lys Cys 1650 1655 1660 agt ctc ctg gtg ctg gag aat gag ctg aat gca gag ctt ggc ctc tct ser Leu Leu val Leu Glu Asn Glu Leu Asn Ala Glu Leu Gly Leu ser 1665 1670 1675 ggg gca tct atg aaa tta aca aca aat ggc ege ttc agg gaa cac aat

Glv Ala Ser Met Lys Leu Thr Thr Asn Gly Arg Phe Arg Glu His Asn 1680 1685 1690 gca aaa ttc agt ctg gat ggg aaa gee gee ctc aca gag cta tca ctg

Ala Lys Phe ser Leu Asp Gly Lys Ala Ala Leu Thr Glu Leu ser Leu 1695 1700 1705 1710 4490 4538 4586 4634 4682 4730 4778 4826 4874 4922 4970 5018 5066 5114 5162 5210 5258 311 gqa agt gçt tat cag gee atg att ctg ggt gtc gac age aaa aac att 5306 Gly Ser Ala Tyr Gin Ala Met Ile Leu Gly Val Asp Ser Lys Asn Ile 1715 1720 1725 ttc aac ttc aag gtc agt caa gaa gga ctt aag ctc tea aat gac atg 5354 Phe Asn Phe Lys val Ser Gin Glu Gly Leu Lys Leu Ser Asn Asp Met 1730 1735 174C atg ggc tea tat gct gaa atg aaa ttt gac cac aca aac agt ctg aac 5402 Met Gly ser Tyr 1 Ala Glu Met Lys phe ASp HÍS Thr Asn Ser Leu Asn 1745 1750 1755 att gea ggc tta tea ctg gac ttc tet tea aaa ctt gac aac att tac 5450 ile Ala Gly Leu Ser Leu Asp Phe Ser Ser Lys Leu ASP Asn ile Tyr 1760 1765 1770 age tet gac aag ttt tat aag caa act gtt aat tta cag cta cag ccc 5498 ser Ser Asp Lys Phe Tyr Lys > Gin Thr Val Asn Leu G1 n Leu Gin Pro 1775 178C 1785 1790 tat tet ctg gta act act tta aac agt gac ctg aaa tac aat gct Ctg 5546 Tyr Ser 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Arg Thr Leu gct gac cta act cta cta gac tcc cca att aaa gtg Val cca ctt tta ctc 6218 Ala Asp 2015 Leu Thr Leu Leu Asp 2020 Ser Pro Ile Lys 2025 Pro Leu Leu Leu 2030 agt gag ccc ate aat ate att gat gct tta gag atg aga gat gee gtt 6266 Ser Glu Pro Ile Asn Ile 2035 ile Asp Ala Leu Glu 2040 Met Arg Asp Ala Val 2045 gag aag ccc caa gaa ttt aca att gtt gct ttt gta aag tat gat aaa 6314 Glu Lys Pro Gin Glu 2050 Phe Thr ile Val Ala 2055 phe val Lys Tyr Asp 2060 Lys aac caa gat gtt cac tcc att aac ctc cca ttt ttt gag acc ttg caa 6362 Asn Gin Asp 2065 Val Hi s Ser Ile Asn Leu 2070 Pro Phe Phe Glu Thr 2075 Leu Gin gaa tat ttt gag agg aat cga caa acc att ata gtt gta gtg val gaa aac 6410 Glu Tyr Phe 2080 Glu Arg Asn Arg 2085 Gin Thr ile ile val val 2090 Glu Asn gta cag aga aac ctg aag cac ate aat att gat caa ttt gta aga aaa 6458 val 2095 Gin Arg Asn Leu Lys Hi s 2100 Ile Asn Ile ASp Gin 2105 phe val Arg Lys 2110 tac aga gca gee ctg gga Gly aaa ctc cca cag caa gct aat gat tat ctg 6506 Tyr Arg Ala Ala 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Phe Ser Asp Glu Gly Thr 2940 His gaa tca caa att agt ttc acc ata gaa gga ccc ctc act tcc ttt gga 9002 Glu ser Gin 2945 ile ser Phe Thr ile Glu 2950 Gly Pro Leu Thr Ser 2955 Phe Gly ctg tcc aat aag ate aat age aaa cac cta aga gta aac caa aac ttg 9050 Leu Ser Asn 2960 Lys He Asn Ser Lys 2965 His Leu Arg val Asn 2970 Gin Asn Leu qtt tat gaa tet ggc tcc ctc aac ttt tet aaa ctt gaa att caa tca 9098 vai Tyr 2975 Glu Ser Gly Ser Leu 2980 Asn Phe Ser Lys 2985 Leu Glu Ile Gin Ser 2990 caa gtc gat tcc cag cat gtq ggc cac agt gtt cta act gct aaa ggc 9146 Gin Val Asp Ser Gin His 2995 Val Gly Hi s Ser Val 3000 Leu Thr Ala Lys 3005 Gly atg gea ctg ttt gga gaa ggg aag gea gag ttt act ggg agg cat gat 9194 Met Ala Leu Phe Gly 3010 Glu Gly Lys Ala Glu 3015 Phe Thr Gly Arg Hi5 3020 Asp gct cat tta aat gga aag gtt att gga act ttg aaa aat tet ctt ttc 9242 Ala His Leu 3025 Asn Gly Lys Val Ile Gly 3030 Thr Leu Lys Asn Ser 3035 Leu Phe ttt tca gee cag cca ttt gag ate acg gea tcc aca aac aat gaa ggg Gly 9290 Phe Ser Ala 3040 Gin Pro Phe Glu ile 3045 Thr Ala ser Thr Asn 3050 Asn Glu aat ttg aaa gtt cgt ttt cca tta agg tta aca ggg Gly aag ata gac ttc 9338 Asn Leu 3055 Lys val Arg Phe Pro 3060 Leu Arg Leu Thr 3065 Lys Ile Asp Phe 3070 ctg aat aac tat gea ctg ttt ctg agt ccc agt gçc cag caa gea agt 9386 Leu Asn Asn Tyr Ala Leu 3075 Phe Leu Ser Pro Ser 3080 Ala Gin Gin Ala 3085 Ser 316 tgg caa gta agt gct agg ttc aat cag tat aag tac aac caa aat ttc 9434 Trp Gin Vai Ser Ala 3090 Arg Phe Asn Gin 3095 Tyr Lys Tyr Asn Gin Asn 3100 Phe tct gct qga aac aac gag aac att atg gag gçc cat gta gga ata aat 9482 Ser Ala Gly Asn 3105 Asn Glu Asn ile Met 3110 Glu Ala Hi s val 3115 Gly Ile Asn gga gaa gca aat ctg gat ttc tta aac att cct tta aca att cct gaa 9530 Gly Glu Ala 3120 Asn Leu Asp Phe Leu 3125 Asn Ile Pro Leu Thr 3130 ile Pro Glu ata cat cta cct tac aca ata ate aca act cct cca ctg aaa gat ttc 9578 Met Arg 3135 Leu Pro Tyr Thr Ile 3140 Ile Thr Thr Pro 3145 Pro Leu Lys ASP Phe 3150 tct cta tgg gaa aaa 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aag ctt age ttg gaa age ctc 10586 ser Thr Ala Lys Gly Ala 3475 val ASp HÍS Lys Leu 3480 ser Leu Glu ser 348' Leu acc tct tac ttt tcc att gag tca tct acc aaa gga Gly gat gtc aag ggt 10634 Thr Ser Tyr Phe Ser 3490 ile Glu Ser Ser Thr 3495 Lys Asp Val Lys 3500 Gly tcg gtt ctt tct cgg gaa tat tca gga act att gct agt gag gçc aac 10682 Ser vai Leu Ser 3505 Arg Glu Tyr Ser Gly 3510 Thr Ile Ala ser Glu 3515 Ala Asn act tac ttg aat tcc aag age aca cgg tct tca gtg val 353C aag ctg cag ggc Gly 10730 Thr Tyr Leu 3520 Asn Ser Lys Ser Thr 3525 Arg Ser Ser Lys > Leu Gin act tcc aaa att gat gat ate tgg aac ctt gaa gta aaa gaa aat ttt 10778 Thr ser 3535 Lys ile Asp Asp ile 3540 Trp Asn Leu Glu val 3545 Lys Glu Asn Phe 3550 gct gga Ala Gly gaa gee aca ctc caa ege ata tat tcc ctc tgg gag cac agt 10826 Glu Ala Thr Leu 3555 Gin Arg ile Tyr Ser 3560 Leu Trp Glu His Ser 3565 acg aaa aac cac tta cag cta gag ggc ctc ttt ttc acc aac gga gaa 10874 Thr Lys Asn His Leu 3570 Gin Leu Glu Gly Leu 3575 Phe Phe Thr Asn 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Lys Ser Leu Trp Asp 3685 Phe Leu Lys Leu 3690 Asp 1 Vai Thr Thr age att ggt Gly agg aga cag cat ctt cgt gtt tea act gçc ttt gta val tac 11258 Ser Ile 3695 Arg Arg Gin ms 3700 Leu Arg val Ser Thr 3705 Ala Phe Tyr 3710 acc aaa aac ccc aat ggc tat tea ttc tcc ate cct gta aaa gtt ttg 11306 Thr Lys Asn Pro Asn Gly 3715 Tyr Ser Phe Ser 3720 Ile 1 Pro Val Lys Val 3725 Leu gct gat aaa ttc att act cct ggg ctg aaa cta aat gat cta aat tea 11354 Ala Asp Lys Phe ile 3730 Thr Pro Gly Leu Lys 3735 Leu Asn Asp Leu Asn 3740 Ser gtt ctt gtc atg cct acg ttc cat gtc cca ttt aca gat ctt cag gtt 11402 Val Leu val Met 3745 Pro Thr Phe His Val 3750 Pro phe Thr Asp Leu 3755 Gin Val cca teg tgc aaa ctt gac ttc aga gaa ata caa ate tat aag aag ctg 11450 Pro ser 376C cys 1 Lys Leu Asp Phe Arg 3765 Glu ile Gin Ile Tyr 3770 Lys Lys Leu aga act tea tea ttt gee ctc aac cta cca aca ctc ccc gag gta aaa 11498 $3: Thr Ser Ser Phe Ala teu 3780 Asn Leu Pro Thr Leu 3785 Pro Glu val Lys 3790 ttc cct gaa gtt gat 351 tta aca 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ser 3900 Leu 319 aaa aac aaa gca gat tat gtt gaa aca gtc ctg gat tcc aca tgc age

Lys Asn Lys Ala Asp Tyr Vai Glu Thr Vai Leu Asp Ser Thr Cys Ser 3905 3910 3915 tea acc gta cag ttc cta gaa tat gaa cta aat gtt ttg gga aca cac

Ser Thr Vai Gin Phe Leu Glu Tyr Glu Leu Asn Vai Leu Gly Thr His 3920 3925 3930 aaa ate gaa gat gat acg tta gee tet aag act aaa gga aca ctt gca

Lys ile Glu Asp Gly Thr Leu Ala ser Lys Thr Lys Gly Thr Leu Ala 3935 3940 3945 3950 cac cgt gac ttc agt gca gaa tat gaa gaa gat ggc aaa ttt gaa gga

His Arg Asp Phe Ser Ala Glu Tyr Glu Glu Asp Gly Lys Phe Glu Gly 3955 3960 3965 ctt cag gaa tgg gaa gga aaa gcg cac ctc aat ate aaa age cca gcg

Leu Gin Glu Trp Glu Gly Lys Ala His Leu Asn lie Lys Ser Pro Ala 3970 3975 3980 ttc acc gat ctc cat ctg ege tac cag aaa gac aag aaa ggc ate tcc

Phe Thr Asp Leu His Leu Arg Tyr Gin Lys Asp Lys Lys Gly lie Ser 3985 3990 3995 acc tea gca gee tcc cca gee gta ggc acc gtg ggc atg gat atg gat

Thr Ser Ala Ala Ser Pro Ala vai Gly Thr vai Gly Met Asp Met Asp 4000 4005 4010 gaa gat gac gac ttt tet aaa tgg aac ttc tac tac age cct cag tcc

Glu Asp Asp Asp Phe Ser Lys Trp Asn Phe Tyr Tyr ser pro Gin ser 4015 4020 4025 4030 tet cca gat aaa aaa ctc acc ata ttc aaa act gag ttg agg gtc cgg ser pro Asp Lys Lys Leu Thr ile Phe Lys Thr Glu Leu Arg vai Arg 4035 4040 4045 gaa tet gat gag gaa act cag ate aaa gtt aat tgg gaa gaa gag gca

Glu Ser Asp Glu Glu Thr Gin lie Lys vai Asn Trp Glu Glu Glu Ala 4050 4055 4060 gct tet ggc ttg cta acc tet ctg aaa gac aac gtg ccc aag gee aca

Ala Ser Gly Leu Leu Thr Ser Leu Lys Asp Asn Vai Pro Lys Ala Thr 4065 4070 4075 ggg gtc ctt tat gat tat gtc aac aag tac cac tgg gaa cac aca ggg

Gly Val Leu Tyr Asp Tyr Vai Asn Lys Tyr His Trp Glu His Thr Gly 4080 4085 4090 ctc acc ctg aga gaa gtg tet tea aag ctg aga aga aat ctg cag aac

Leu Thr Leu Arg Glu Val Ser Ser Lys Leu Arg Arg Asn Leu Gin Asn 4095 4100 4105 4110 aat gct gag tgg gtt tat caa ggg gee att agg caa att gat gat ate

Asn Ala Glu Trp val Tyr Gin Gly Ala ile Arg Gin He Asp Asp ile 4115 4120 4125 gac gtg agg ttc cag aaa gca gee agt ggc acc act ggg acc tac caa asp val Arg Phe Gin Lys Ala Ala Ser Gly Thr Thr Gly Thr Tyr Gin 4130 4135 4140 gag tgg aag gac aag gee cag aat ctg tac cag gaa ctg ttg act cag

Glu TrD Lys Asp Lys Ala Gin Asn Leu Tyr Gin Glu Leu Leu Thr Gin 4145 4150 4155 gaa ggc caa gee agt ttc cag gga ctc aag gat aac gtg ttt gat ggc

Glu Gly Gin Ala Ser Phe Gin Gly Leu Lys Asp Asn val Phe Asp Gly 4160 4165 4170 11882 11930 11978 12026 12074 12122 12170 12218 12266 12314 12362 12410 12458 12506 12554 12602 12650 320 ttg gta cga gtt act caa aaa ttc cat atg aaa gtc aag cat ctg att 12698 Leu 4175 vai Arg Val Thr Gin 418C Lys 1 Phe His Met Lys Val 4185 Lys Hi s Leu ile 4190 gac. tca ctc att gat ttt ctg aac ttc ccc aga ttc cag ttt ccg ggg 12746 ASp Ser Leu Ile Asp Phe 4195 Leu Asn Phe Pro Arg 4200 Phe Gin Phe pro Gly 4205 aaa cct ggg Gly ata tac act agg gag gaa ctt tgc act atg ttc ata agg 12794 Lys Pro Ile Tyr 4210 Thr Arg Glu Glu Leu 4215 cys Thr Met Phe Ile 4220 Arg gag gta ggg acg gta ctg tcc cag gta tat teg aaa gtc cat aat ggt 12842 Glu Vai Gly Thr 4225 val Leu ser Gin Val 4230 Tyr Ser Lys val His 4235 Asn Gly tca gaa ata ctg ttt tcc tat ttc caa gac cta 42 5( att aca Ctt cct 12890 Ser Glu Ile 4240 Leu Phe ser Tyr Phe 4245 Gin Asp Leu Ile ) Thr Leu Pro ttc gag tta agg aaa cat aaa cta ata gat gta ate teg atg tat agg 12938 Phe Glu 4255 Leu Arg Lys His Lys 4260 Leu Ile Asp Val Ile 4265 Ser Met Tyr Arg 4270 gaa ctg ttg aaa gat tta tca aaa gaa gcc caa gag gta ttt aaa gcc 12986 Glu Leu Leu Lys Asp Leu 4275 Ser Lys Glu Ala Gin 4280 Glu val Phe Lys Ala 4285 att cag tet ctc aag acc aca gag gtg cta cgt aat ctt cag gac ctt 13034 Ile Gin Ser Leu Lys 4290 Thr Thr Glu Val Leu 4295 Arg Asn Leu Gin Asp 4300 Leu tta caa ttc att ttc caa cta ata gaa gat aac att aaa cag ctg aaa 13082 Leu Gin Phe ile 4305 Phe Gin Leu Ile Glu 4310 Asp ASn ile Lys Gin 4315 Leu Lys gag atg aaa ttt act tat ctt att aat tat ate caa gat gag ate aac 13130 Glu Met Lys 4320 Phe Thr Tyr Leu Ile 4325 Asn Tyr Ile Gin Asp 4330 Glu ile Asn aca ate ttc aat gat tat ate cca tat gtt ttt aaa ttg ttg aaa gaa 13178 Thr 433' Ile Phe Asn Asp Tyr Ile 4340 Pro Tyr Val Phe Lys 4345 Leu Leu Lys Glu 4350 aac cta tgc ctt aat ctt cat aag ttc aat gaa ttt att caa aac gag 13226 Asn Leu cys Leu Asn Leu 4355 His Lys Phe Asn Glu 4360 Phe Ile Gin Asn Glu 4365 ctt cag gaa gct tet caa gag tta cag cag ate cat caa tac att atg 13274 Leu Gin Glu Ala ser 4370 Gin Glu Leu Gin Gin 4375 Ile His Gin Tyr Ile 4380 Met gcc ctt cgt gaa gaa tat ttt gat cca agt ata gtt ggc Gly 439' tgg aca ra 13322 Ala Leu Arg Glu 4385 Glu Tyr Phe Asp Pro 4390 Ser Ile Val Trp Thr aaa tat tat gaa ctt gaa gaa aag ata gtc agt ctg ate aag aac ctg 13370 Lys Tyr Tyr 4400 Glu Leu Glu Glu Lys 4405 Ile val ser Leu Ile 4410 Lys Asn Leu tta gtt gct ctt aag gac ttc cat tet gaa tat att gtc agt gcc tet 13418 Leu 4415 vai Ala Leu Lys Asp 4420 Phe 1 Hi s Ser Glu Tyr 4425 íle val Ser Ala ser 4430 aac ttt act tcc caa ctc tca agt caa gtt gag caa ttt ctg cac aga 13466 Asn Phe Thr Ser Gin Leu 4435 Ser Ser Gin Val Glu 4440 Gin phe Leu His Arg 4445 321 aat att cag gaa tat ctt age ate ctt acc gat cca gat gga aaa ggg 13514 Asn lie Gl n Glu Tyr Leu ser ile Leu Thr Asp Pro Asp Gly Lys Gly 4450 4455 4460 aaa gag aag att gea gag ctt tet gee act gct cag gaa ata att aaa 13562 Lys Glu Lys Ile Ala Glu Leu Ser Ala Thr Ala Gin Glu Ile ile Lys 4465 4470 4475 age cag gee att gcg acg aag aaa ata att tet gat tac cac cag cag 13610 ser Gin Ala Ile Ala Thr Lys Lys Ile Ile Ser Asp Tyr His Gin Gin 4480 4485 4490 ttt aga tat aaa ctg caa gat ttt tea gac caa ctc tet gat tac tat 13658 Phe Arg Tyr Lys Leu Gin ASD phe ser ASP Gin Leu Ser ASp Tyr Tyr 4495 4500 4505 4510 gaa aaa ttt att gct gaa tcc aaa aga ttg att gac ctg tcc att caa 13706 Glu Lys Phe ile Ala Glu Ser Lys Arg Leu Ile Asp Leu Ser Ile Gin 4515 4520 4525 aac tac cac aca ttt ctg ata tac ate acg gag tta ctg aaa aag ctg 13754 Asn Tyr Hl s Thr Phe Leu ile Tyr Ile Thr Glu Leu Leu Lys Lys Leu 4530 4535 4540 caa tea acc aca gtc atg aac ccc tac atg aag ctt gct cca gga gaa 13802 Gl π Ser Thr Thr vai Met Asn Pro Tyr Met Lys Leu Ala Pro Gly Glu 4545 4550 4555 ctt act ate ate etc taa ttttttaaaa gaaatcttca tttattcttc 13850 Leu Thr ile ile Leu * 4560 ttttccaatt gaactttcac atagcacaga aaaaattcaa actgcctata ttgataaaac 13910 catacagtga gccagccttg cagtaggcag tagactataa gcagaagcac atatgaactg 13970 gacctgcacc aaagctggca ccagggctcg gaaggtctct gaactcagaa ggatggcatt 14030 ttttgcaagt taaagaaaat caggatctga gttattttgc taaacttggg ggaggaggaa 14090 caaataaatg gagtctttat tgtgtatcat a 14121

<210> 4 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 4 tgctaaaggc acatatggcc t 21 322 <210> 5 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 5 ctcaggttgg actctccatt gag 23 <210> 6 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sonda de PCR <40 0> 6 cttgtcagag ggatcctaac actggccg 28 <210> 7 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 7 gaaggtgaag gtcggagtc 323 <210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 8 gaagatggtg atgggatttc <210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sonda de PCR <400> 9 caagcttccc gttctcagcc <210> 10 <211> 2354 <212> ADN <213> Mus musculus <40 0> 10 gaattccaac ttcctcacct ctcacataca attgaaatac ctgcttttgg caaactgcat 60 agcatcctta agatccaatc tcctctcttt atattagatg ctaatgccaa catacagaat 120 gtaacaactt cagggaacaa agcagagatt gtggcttctg tcactgctaa aggagagtcc 180 324 caatttgaag ctctcaattt tgattttcaa gcacaagctc aattcctgga gttaaatcct 240 catcctccag tcctgaagga atccatgaac ttctccagta agcatgtgag aatggagcat 300 gagggtgaga tagtatttga tggaaaggcc attgagggga aatcagacac agtcgcaagt 360 ttacacacag agaaaaatga agtagagttt aataatggta tgactgtcaa agtaaacaat 420 cagctcaccc ttgacagtca cacaaagtac ttccacaagt tgagtgttcc taggctggac 480 ttctccagta aggcttctct taataatgaa atcaagacac tattagaagc tggacatgtg 540 gcattgacat cttcagggac agggtcatgg aactgggcct gtcccaactt ctcggatgaa 600 ggcatacatt cgtcccaaat tagctttact gtggatggtc ccattgcttt tgttggacta 660 tccaataaca taaatggcaa acacttacgg gtcatccaaa aactgactta tgaatctggc 720 ttcctcaact attctaagtt tgaagttgag tcaaaagttg aatctcagca cgtgggctcc 780 agcattctaa cagccaatgg tcgggcactg ctcaaggacg caaaggcaga aatgactggt 840 gagcacaatg ccaacttaaa tggaaaagtt attggaactt tgaaaaattc tctcttcttt 900 tcagcacaac catttgagat tactgcatcc acaaataatg aaggaaattt gaaagtgggt 960 tttccactaa agctgactgg gaaaatagac ttcctgaata actatgcatt gtttctgagt 1020 ccccgtgccc aacaagcaag ctggcaagcg agtaccagat tcaatcagta caaatacaat 1080 caaaactttt ctgctataaa caatgaacac aacatagaag ccagtatagg aatgaatgga 1140 gatgccaacc tggatttctt aaacatacct ttaacaattc ctgaaattaa cttgccttac 1200 acggagttca aaactccctt actgaaggat ttctccatat gggaagaaac aggcttgaaa 1260 gaatttttga agacaacaaa gcaatcattt gatttgagtg taaaggctca atataaaaag 1320 aacagtgaca agcattccat tgttgtccct ctgggtatgt tttatgaatt tattctcaac 1380 aatgtcaatt cgtgggacag aaaatttgag aaagtcagaa acaatgcttt acattttctt 1440 accacctcct ataatgaagc aaaaattaag gttgataagt acaaaactga aaattccctt 1500 aatcagccct ctgggacctt tcaaaatcat ggctacacta tcccagttgt caacattgaa 1560 gtatctccat ttgctgtaga gacactggct tccaggcatg tgatccccac agcaataagc 1620 accccaagtg tcacaatccc tggtcctaac atcatggtgc cttcatacaa gttagtgctg 1680 ccacccctgg agttgccagt tttccatggt cctgggaatc tattcaagtt tttcctccca 1740 gatttcaagg gattcaacac tattgacaat atttatattc cagccatggg caactttacc 1800 tatgactttt cttttaaatc aagtgtcatc acactgaata ccaatgctgg actttataac 1860 caatcagata tcgttgccca tttcctttct tcctcttcat ttgtcactga cgccctgcag 1920 tacaaattag agggaacatc acgtctgatg cgaaaaaggg gattgaaact agccacagct 1980 gtctctctaa ctaacaaatt tgtaaagggc agtcatgaca gcaccattag tttaaccaag 2040 aaaaacatgg aagcatcagt gagaacaact gccaacctcc atgctcccat attctcaatg 2100 325 aacttcaagc aggaacttaa tggaaatacc aagtcaaaac ccactgtttc atcatccatt 2160 gaactaaact atgacttcaa ttcctcaaag ctgcactcta ctgcaacagg aggcattgat 2220 cacaagttca gcttagaaag tctcacttcc tacttttcca ttgagtcatt caccaaagga 2280 aatatcaaga gttccttcct ttctcaggaa tattcaggaa gtgttgccaa tgaagccaat 2340 gtatatctga attc 2354 <210> 11 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 11 cgtgggctcc agcattcta <210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 12 agtcatttct gcctttgcgt c <210> 13 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial 326 <220> <223> Sonda de PCR <400> 13 ccaatggtcg ggcactgctc aa 22 <210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR <40 0> 14 ggcaaattca acggcacagt 20 <210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR <40 0> 15 gggtctcgct cctggaagat 20 <210> 16 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial 327 <220>

<223> Sonda de PCR <400> 16 aaggccgaga atgggaagct tgtcatc 27 <210> 17 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Ant i <400> 17 ccgcaggtcc. cggtgggaat <210> 18 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Ant i <40 0> 18 accgagaagg gcactcagcc <210> 19 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 20 328 20 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 19 gcctcggcct cgcggccctg

<210> 20 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 20 tccatcgcca gctgcggtgg <210> 21 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 21 cagcgccagc agcgccagca <210> 22 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 22 gcccgccagc agcagcagca 20 <210> 23 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 23 cttgaatcag cagtcccagg 20 <210> 24 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 24 cttcagcaag gctttgccct 20 <210> 25 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 330 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 25 tttctgttgc cacattgccc 20 <210> 26 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 26 ggaagaggtg ttgctccttg 20 <210> 27 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 27 tgtgctacca tcccatactt 20 <210> 28 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 331 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 28 tcaaatgcga ggcccatctt 20 <210> 29 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 29 ggacacctca atcagctgtg 20 <210> 30 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 30 tcagggccac caggtaggtg 20 <210> 31

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 332 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 31 gtaatcttca tccccagtgc

<210> 32 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 32 20 tgctccatgg tttggcccat

<210> 33 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 33 gcagccagtc gcttatctcc

<210> 34 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 333 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 34 gtatagccaa agtggtccac 20 <210> 35 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 35 cccaggagct ggaggtcatg <210> 36 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 36 ttgagccctt cctgatgacc <210> 37 <211> 20

<212> ADN <213> Sequência Artificial 334 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 37 atctggaccc cactcctagc

<210> 38 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 38 cagacccgac tcgtggaaga <210> 39 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 39 gcccfccagta gattcatcat <210> 40 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 40 gccatgccac cctcttggaa 20 <210> 41 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 41 aacccacgtg ccggaaagtc 20 <210> 42 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 42 actcccagat gccttctgaa 20

<210> 43 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 336 <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 43 atgtggtaac gagcccgaag 20

<210> 44 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 44 ggcgtagaga cccatcacat 20 <210> 45 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 45 gtgttaggat ccctctgaca 20 <210> 46

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 337 20 <220> <223> Oligonucleótido Ant i- <40 0> 46 cccagtgata gctctgtgag <210> 47 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Ant i <40 0> 47 atttcagcat atgagcccat <210> 48 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Ant i < 4 0 0 > 48 ccctgaacct tagcaacagt <210> 49 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 20 338 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 49 gctgaagcca gcccagcgat 20 <210> 50 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Ant i <40 0> 50 acagctgccc agtatgttct <210> 51 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Ant i <400> 51 cccaataaga tttataacaa <210> 52 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 20 339 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 52 tggcctacca gagacaggta 20 <210> 53 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 53 tcatacgttt agcccaatct 20 <210> 54 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 54 gcatggtccc aaggatggtc <210> 55 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 340 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 55 agtgatggaa gctgcgatac <210> 56 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 56 atgagcatca tgcctcccag <210> 57 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 57 gaacacatag ccgaatgccg 20 <210> 58 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 341 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 58 gtggtgccct ctaatttgta 20

<210> 59 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 59 cccgagaaag aaccgaaccc 20 <210> 60 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 60 tgccctgcag cttcactgaa 20 <210> 61 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 342 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 61 gaaatcccat aagctcttgt 20

<210> 62 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 62 agaagctgcc tcttcttccc 20 <210> 63 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 63 tcagggtgag ccctgtgtgt 20 <210> 64 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 343 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 64 ctaatggccc cttgataaac 20 <210> 65 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 65 acgttatcct tgagtccctg 20 <210> 6 6 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 66 tatatcccag gtttccccgg 20

<210> 67 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 344 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 67 acctgggaca gtaccgtccc 20 <210> 68 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 68 ctgcctactg caaggctggc 20 <210> 69 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 69 agagaccttc cgagccctgg 20

<210> 70 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 345 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 70 atgatacaca ataaagactc 20 <210> 71 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 71 attgtatgtg agaggtgagg 20 <210> 72 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 72 gaggagattg gatcttaagg 20 <210> 73

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 346 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 73 cttcaaattg ggactctcct <210> 74 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 74 tccaggaatt gagcttgtgc 20

<210> 75 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 75 ttcaggactg gaggatgagg

<210> 76 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 347 20 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 76 tctcaccctc atgctccatt

<210> 77 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 77 tgactgtcaa gggtgagctg <210> 78 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 78 gtccagccta ggaacactca <210> 79 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 79 atgtcaatgc cacatgtcca 20 <210> 80 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 80 ttcatccgag aagttgggac 20 <210> 81 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 81 atttgggacg aatgtatgcc

<210> 82 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 349 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 82 agttgaggaa gccagattca 2 0

<210> 83 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 83 ttcccagtca actttagtgg 20

<210> 84 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 84 20 agcttgcttg ttgggcacgg

<210> 85 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 350 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 85 cctatactgg cttctatgtt

<210> 86 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 86 20 tgaactccgt gtaaggcaag

<210> 87 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 87 20 gagaaatcct tcagtaaggg

<210> 88 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 351 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 88 caatggaatg cttgtcactg

<210> 89 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 89 gcttcattat aggaggtggt <210> 90 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 90 acaactggga tagtgtagcc

<210> 91 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 91 gttaggacca gggattgtga 20 <210> 92 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 92 accatggaaa actggcaact <210> 93 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 93 tgggaggaaa aacttgaata <210> 94

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 353 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 94 tgggcaacga tatctgattg 20 <210> 95 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 95 ctgcagggcg tcagtgacaa 20 <210> 96 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 96 gcatcagacg tgatgttccc 20 <210> 97 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 354 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 97 cttggttaaa ctaatggtgc 20 <210> 98 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 98 atgggagcat ggaggttggc 20 <210> 99 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 99 aatggatgat gaaacagtgg 20 <210> 100 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 355 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 100 atcaatgcct cctgttgcag 20 <210> 101 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 101 ggaagtgaga ctttctaagc 20 <210> 102 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 102 aggaaggaac tcttgatatt 20 <210> 103 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 356 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 103 attggcttca ttggcaacac

<210> 104 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 104 aggtgaggaa gttggaattc <210> 105 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 105 ttgttccctg aagttgttac <210> 106 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 106 gttcatggat tccttcagga 20 <210> 107 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 107 atgctccatt ctcacatgct 20 <210> 108 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 108 tgcgactgtg tctgatttcc 20 <210> 109

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 358 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 109 gtccctgaag atgtcaatgc <210> 110 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 110 aggcccagtt ccatgaccct <210> 111 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 111 ggagcccacg tgctgagatt <210> 112 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 112 cgtccttgag cagtgcccga

<210> 113 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 113 cccatatgga gaaatccttc <210> 114 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <2 23> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 114 catgcctgga agccagtgtc

<210> 115 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 115 gtgttgaatc ccttgaaatc 2 0 <210> 116 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 116 ggtaaagttg cccatggctg 20 <210> 117 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 117 gttataaagt ccagcattgg 20 <210> 118 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 361 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 118 catcagacgt gatgttccct 20 <210> 119 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 119 tggctagttt caatcccctt 20 <210> 120 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 120 ctgtcatgac tgccctttac 20 <210> 121 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 362 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 121 gcttgaagtt cattgagaat 20 <210> 122 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 122 ttcctgagaa aggaaggaac 20 <210> 123 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 123 tcagatatac attggcttca 20 <210> 124 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 363 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 124 ttcctcttcg gccctggcgc 20 <210> 125 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 125 ctccactgga actctcagcc 20 <210> 126 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 126 cctccagctc aaccttgcag 20 <210> 127 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 364 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 127 gggttgaagc catacacctc 20 <210> 128 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 128 ccagcttgag ctcatacctg 20 <210> 129 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 129 ccctcttgat gttcaggatg 20 <210> 130

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 365 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 130 gagcagtttc catacacggt 20 <210> 131 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 131 cccttcctcg tcttgacggt 20 <210> 132 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 132 ttgaagcgat cacactgccc 20

<210> 133 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 366 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 133 gcctttgatg agagcaagtg 20

<210> 134 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 134 tcctcttagc gtccagtgtg 20 <210> 135 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 135 cctctcagct cagtaaccag 20 <210> 136

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 367 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 136 gcactgaggc tgtccacact 20 <210> 137 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 137 cgctgatccc tcgccatgtt 20 <210> 138 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 138 gttgaccgcg tggctcagcg 20

<210> 139 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 368 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 139 gcagctcctg ggtccctgta 20

<210> 140 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 140 cccatggtag aatttggaca 20 <210> 141 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 141 aatctcgatg aggtcagctg 20

<210> 142 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 369 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 142 gacaccatca ggaacttgac

<210> 143 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 143 gctcctctcc caagatgcgg <210> 144 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 144 ggcacccatc agaagcagct

<210> 145 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 145 agtccggaat gatgatgccc 20

<210> 146 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 146 ctgagcagct tgactggtct 20 <210> 147 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 147 cccggtcagc ggatagtagg 20 <210> 148 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 371 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 148 tgtcacaact taggtggccc 20

<210> 149 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 149 gtctggcaat cccatgttct 20 <210> 150 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 150 cccacagact tgaagtggag 20 <210> 151 <211> 20

<212> ADN <213> Sequência Artificial 372 <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 151 gaactgccca tcaatcttga 20

<210> 152 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 152 cccagagagg ccaagctctg 20 <210> 153 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 153 tgtgttccct gaagcggcca 20 <210> 154

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 373 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 154 acccagaatc atggcctgat 20

<210> 155 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 155 ggtgcctgtc tgctcagctg 20 <210> 156 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 156 atgtgaaact tgtctctccc 20 <210> 157 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 374 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 157 tatgtctgca gttgagatag

<210> 158 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 158 ttgaatccag gatgcagtac <210> 159 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 159 gagtctctga gtcacctcac <210> 160 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 160 gatagaatat tgctctgcaa 20 <210> 161 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 161 cccttgctct accaatgctt 20 <210> 162 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 162 tccattccct atgtcagcat 20

<210> 163 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 376 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 163 gactccttca gagccagcgg 20 <210> 164 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 164 cccatgctcc gttctcaggt 20 <210> 165 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 165 cgcaggtcag cctgactaga 20 <210> 166 <211> 20

<212> ADN <213> Sequência Artificial 377 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 166 cagttagaac actgtggccc 2 0

<210> 167 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 167 cagtgtgatg acacttgatt 20 <210> 168 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 168 ctgtggctaa cttcaatccc 20 <210> 169 <211> 20

<212> ADN <213> Sequência Artificial 378 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 169 cagtactgtt atgactaccc

<210> 170 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 20 <40 0> 170 cactgaagac cgtgtgctct

<210> 171 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 171 tcgtactgtg etcccagagg

<210> 172 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 379 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 172 aagaggccct ctagctgtaa 20 <210> 173 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 173 aagacccaga atgaatccgg 20 <210> 174 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 174 gtctacctca aagcgtgcag 20

<210> 175 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 380 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 175 tagaggctaa cgtaccatct

<210> 176 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 176 ccatatccat gcccacggtg <210> 177 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 177 agtttcctca tcagattccc <210> 178 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 178 cccagtggta cttgttgaca 20 <210> 179 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 179 cccagtggtg ccactggctg 20 <210> 180 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 180 gtcaacagtt cctggtacag 20 <210> 181

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 382 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 181 ccctagtgta tatcccaggt

<210> 182 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 182 ctgaagatta cgtagcacct <210> 183 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 183 gtccagccaa ctatacttgg <210> 184 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 184 cctggagcaa gcttcatgta <210> 185 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 185 tggacagacc aggctgacat 20

<210> 186 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 186 atgtgtactt ccggaggtgc 20

<210> 187 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 384 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 187 tcttcaggat gaagctgcag

<210> 188 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 188 tcagcaaggc tttgccctca <210> 189 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 189 ctgcttccct tctggaatgg

<210> 190 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 190 tgccacattg cccttcctcg

<210> 191 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 191 gctgatcaga gttgacaagg <210> 192 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 192 tactgacagg actggctgct

<210> 193 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 193 gatggcttct gccacatgct 20

<210> 194 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 194 gatgtggatt tggtgctctc 20 <210> 195 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 195 tgactgcttc atcactgagg 20 <210> 196

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 387 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 196 ggtaggtgac cacatctatc

<210> 197 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 197 tcgcagctgc tgtgctgagg <210> 198 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 198 ttccaatgac ccgcagaatc <210> 199 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 199 gatcatcagt gatggctttg 20 <210> 200 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 200 agcctggatg gcagctttct 20 <210> 201 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 201 gtctgaagaa gaacctcctg 20 <210> 202 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 389 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 202 tatctgcctg tgaaggactc

<210> 203 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 203 trtgagttcaa gatattggca <210> 204 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 204 cttccaagcc aatctcgatg

<210> 205 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 205 tgcaactgta atccagctcc 20

<210> 206 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 206 ccagttcagc ctgcatgttg 20 <210> 207 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 207 gtagagacca aatgtaatgt 20

<210> 208 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 391 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 208 cgttggagta agcgcctgag

<210> 209 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 209 cagctctaat ctggtgtccc <210> 210 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 210 ctgtcctctc tctggagctc

<210> 211 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 211 caaggtcata ctctgccgat 20 <210> 212 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 212 gtatggaaat aacacccttg 20 <210> 213 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 213 taagctgtag cagatgagtc

<210> 214 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 393 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 214 tagatctctg gaggatttgc 20 <210> 215 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 215 gtctagaaca cccaggagag 20 <210> 216 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 216 accacagagt cagccttcat 20 <210> 217 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 394 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 217 aagcagacat ctgtggtccc 20

<210> 218 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 218 ctctccattg agccggccag 20

<210> 219 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 219 cctgatattc agaacgcagc 20

<210> 220 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 395 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 220 cagtgcctaa gatgtcagca 20

<210> 221 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 221 agcaccagga gactacactt 20 <210> 222 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 222 cccatccaga ctgaattttg 20 <210> 223 <211> 20

<212> ADN <213> Sequência Artificial 396 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 223 ggttctagcc gtagtttccc

<210> 224 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 20 <400> 224 aggttaccag ccacatgcag

<210> 225 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 225 atgtgcatcg atggtcatgg

<210> 226 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 397 20 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 226 ccagagagcg agtttcccat

<210> 227 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 227 ctagacacga gatgatgact <210> 228 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 228 tccaagtcct ggctgtattc

<210> 229 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 229 cgtccagtaa gctccacgcc

<210> 230 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 20 <400> 230 tcaacggcat ctctcatctc

<210> 231 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 20 <400> 231 tgatagtgct catcaagact

<210> 232 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 399 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 232 gattctgatt tggtacttag

<210> 233 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 20 <400> 233 ctctcgatta actcatggac

<210> 234 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 234 atacactgca actgtggcct

<210> 235 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 400 20 <220> <223> Oligonucleótido Ant i- -sentido <400> 235 gcaagagtcc accaatcaga <210> 236 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Ant i- -sentido <400> 236 agagcctgaa gactgacttc 20

<210> 237 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 237 tccctcatct gagaatctgg 20

<210> 238 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 401 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 238 cagtgcatca atgacagatg

<210> 239 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 20 <400> 239 ccgaaccctt gacatctcct

<210> 240 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 240 gcctcactag caatagttcc

<210> 241 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 402 20 <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 241 gacatttgcc atggagagag 20

<210> 242 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 242 ctgtctccta ccaatgctgg 20

<210> 243 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 243 tctgcactga agtcacggtg 20

<210> 244 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 403 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 244 tcccggaccc tcaactcagt 20 <210> 245 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 245 gcaggtccag ttcatatgtg 20 <210> 246 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 246 gccatccttc tgagttcaga 20

<210> 247 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 404 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 247 gccatccttc tgagttcaga

<210> 248 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 248 ccccgcaggt cccggtggga <210> 249 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 249 cagccccgca ggtcccggtg

<210> 250 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 250 caaccgagaa gggcactcag 20 <210> 251 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 251 cctcagcggc agcaaccgag 20 <210> 252 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 252 tcctcagcgg cagcaaccga 20

<210> 253 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 406 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 253 ctcctcagcg gcagcaaccg

<210> 254 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 254 ggctcctcag cggcagcaac <210> 255 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 255 ggcgggctcc tcagcggcag

<210> 256 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 256 ggtccatcgc cagctgcggt 20

<210> 257 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 257 ggcgggtcca tcgccagctg 20

<210> 258 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 258 tagaggatga tagtaagttc 20

<210> 259 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 408 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 259 aaatgaagat ttcttttaaa 20 <210> 260 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 260 tatgtgaaag ttcaattgga 20 <210> 261 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 261 atataggcag tttgaatttt 20

<210> 262 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 409 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 262 gctcactgta tggttttatc 20 <210> 263 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 263 ggctcactgt atggttttat 20 <210> 264 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 264 99ctggctca ctgtatggtt 20

<210> 265 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 410 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 265 aggctggctc actgtatggt

<210> 266 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 20 <400> 266 aaggctggct cactgtatgg

<210> 267 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 267 ctactgcaag gctggctcac

<210> 268 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 411 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 268 actgcctact gcaaggctgg

<210> 269 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 269 tgcttatagt ctactgccta

<210> 270 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido

<400> 270 ttctgcttat agtctactgc <210> 271 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 271 tttggtgcag gtccagttca

<210> 272 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 272 cagctttggt gcaggtccag <210> 273 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 273 gccagctttg gtgcaggtcc

<210> 274 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 274 tggtgccagc tttggtgcag 20 <210> 275 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 275 gccctggtgc cagctttggt 20 <210> 276 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 276 gagttcagag accttccgag 20

<210> 277 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 414 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 277 aaatgccatc cttctgagtt

<210> 278 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 278 aaaaatgcca tccttctgag <210> 279 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 279 aaaataactc agatcctgat <210> 280 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 280 agcaaaataa ctcagatcct 20

<210> 281 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 281 agtttagcaa aataactcag 20 <210> 282 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 282 tcccccaagt ttagcaaaat 20 <210> 283 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 416 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 283 ttcctcctcc cccaagttta

<210> 284 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 20 <400> 284 agactccatt tatttgttcc

<210> 285 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 20 <400> 285 cttctgcttg agttacaaac

<210> 286 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 417 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 286 accttctgct tgagttacaa 20

<210> 287 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 287 gcaccttctg cttgagttac 20

<210> 288 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 288 tcgcaccttc tgcttgagtt 20 <210> 289

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 418 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 289 cttcgcacct tctgcttgag 20

<210> 290 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 290 tgcttcgcac cttctgcttg 20

<210> 291 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 291 tctgcttcgc accttctgct 20 <210> 292

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 419 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 292 agtctgcttc gcaccttctg 20

<210> 293 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 293 tcagtctgct tcgcaccttc 20 <210> 294 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 294 cctcagtctg cttcgcacct 20 <210> 295 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 420 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 295 agcctcagtc tgcttcgcac 20 <210> 296 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 296 gtagcctcag tctgcttcgc 20 <210> 297 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 297 tggtagcctc agtctgcttc 20 <210> 298

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 421 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 298 catggtagcc tcagtctgct

<210> 299 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 20 <400> 299 gtcatggtag cctcagtctg

<210> 300 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 300 atgtcatggt agcctcagtc

<210> 301 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 422 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 301 gaatgtcatg gtagcctcag 20

<210> 302 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 302 ttgaatgtca tggtagcctc 20 <210> 303 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 303 atttgaatgt catggtagcc 20 <210> 304 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 423 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 304 atatttgaat gtcatggtag 20 <210> 305 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 305 cagccacatg cagcttcagg <210> 306 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 306 accagccaca tgcagcttca 20

<210> 307 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 424 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 307 ttaccagcca catgcagctt 20 <210> 308 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 308 ggttaccagc cacatgcagc 20 <210> 309 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 309 taggttacca gccacatgca 20

<210> 310 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 425 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido

<400> 310 tttaggttac cagccacatg <210> 311 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 311 20 cttttaggtt accagccaca

<210> 312 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 20 <400> 312 tccttttagg ttaccagcca

<210> 313 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 426 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 313 gctcctttta ggttaccagc

<210> 314 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 20 <400> 314 aggctccttt taggttacca

<210> 315 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 315 gtaggctcct tttaggttac <210> 316 <211> 20 427 20

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 316 tggtaggctc cttttaggtt 20 <210> 317 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 317 tttggtaggc tccttttagg 20

<210> 318 <211> 13993 <212> ADN <213> H. sapiens <220> <221> CDS <2 2 2> (1) . . (13692 428 <400> 318 atg Met 1 gac Asp ccg Pro ccg Pro agg Arg 5 ccc Pro gcg Ala ctg Leu ctg Leu gcg Ala 10 ctg Leu ctg Leu gcg Ala ctg Leu cct Pro 15 gcg Ala 48 ctg Leu ctg Leu ctg Leu ctg Leu 20 ctg Leu ctg Leu gcg Ala ggc Gly gcc Ala 25 agg Arg gcc Ala gaa Glu gag Glu gaa Glu 30 atg Met ctg Leu 96 gaa Glu aat Asn gtc vai 35 age Ser ctg Leu gtc val tgt Cys cca Pro 40 aaa Lys gat Asp gcg Ala acc Thr cga Arg 45 ttc Phe aag Lys cac HÍS 144 ctc Leu cgg Arg 50 aag Lys tac Tyr aca Thr tac Tyr aac Asn 55 tat Tyr gag Glu gct Ala gag Glu agt Ser 60 tcc Ser agt Ser gga Gly gtc Val 192 cct Pro 65 ggg Gly act Thr gct Ala gat Asp tea ser 70 aga Arg agt ser gcc Ala acc Thr agg Arg 75 ate ile aac Asn tgc cys aag Lys gtt val 80 240 gag Glu ctg Leu gag Glu gtt val ccc Pro 85 cag Gin ctc Leu tgc cys age Ser ttc Phe 90 ate Ile ctg Leu aag Lys acc Thr age Ser 95 cag Gin 288 tgc Cys acc Thr ctg Leu aaa Lys 100 gag Glu gtg Val tat Tyr ggc Gly ttc Phe 105 aac Asn cct Pro gag Glu ggc Gly aaa Lys 110 gcc Ala ttg Leu 336 ctg Leu aag Lys aaa Lys 115 acc Thr aag Lys aac Asn tct Ser gag Glu 120 gag Glu ttt Phe gct Ala gea Ala gcc Ala 125 atg Met tcc ser agg Arg 384 tat Tyr gag Glu 130 ctc Leu aag Lys ctg Leu gcc Ala att ile 135 cca Pro gaa Glu ggg Gly aag Lys cag Gin 140 gtt val ttc Phe ctt Leu tac Tyr 432 ccg Pro 145 gag Glu aaa Lys gat Asp gaa Glu cct Pro 150 act Thr tac Tyr ate Ile ctg Leu aac Asn 155 ate Ile aag Lys agg Arg ggc Gly ate ile 160 480 att Ile tct Ser gcc Ala ctc Leu ctg Leu 165 gtt Val ccc Pro cca Pro gag Glu aca Thr 170 gaa Glu gaa Glu gcc Ala aag Lys caa Gin 175 gtg Val 528 ttg Leu ttt phe ctg Leu gat ASp 180 acc Thr gtg Val tat Tyr gga Gly aac Asn 185 tgc cys tcc ser act Thr cac HlS ttt Phe 190 acc Thr gtc Val 576 aag Lys acg Thr agg Arg 195 aag Lys ggc Gly aat Asn 83 gea Ala 200 aca Thr gaa Glu ata ile tcc ser act Thr 205 gaa Glu aga Arg gac Asp 624 ctg Leu ggg Gly 210 cag Gl n tgt cys gat Asp ege Arg ttc Phe 215 aag Lys CCC Pro ate ile ege Arg aca Thr 220 ggc Gly ate ile age Ser cca Pro 672 ctt Leu 225 gct Ala ctc Leu ate ile aaa Lys ggc Gly 230 atg Met acc Thr ege Arg ccc Pro ttg Leu 235 tea Ser act Thr ctg Leu ate Ile age Ser 240 720 429 age ser age Ser cag Gin tcc ser tgt cys 245 cag Gin tac Tyr aca Thr ctg Leu gac Asp 250 gct Al a aag Lys agg Arg aag Lys cat His 255 gtg Val 768 gea Ala gaa Glu gee Al a ate Ile 260 tgc cys aag Lys gag Glu caa Gin cac HÍS 265 etc Leu ttc Phe ctg Leu cct Pro ttc Phe 270 tcc Ser tac Tyr 816 aag Lys aat Asn aag Lys 275 tat Tyr ggg Gly atg Met gta Val gea Ala 280 caa Gl n 81? aca Thr cag Gin act Thr 285 ttg Leu aaa Lys ctt Leu 864 gaa Gl u gac Asp 290 aca Thr cca Pro aag Lys ate Ile aac Asn 295 age Ser ege Arg ttc Phe ttt Phe ggt Gly 300 gaa Glu ggt Gly act Thr aag Lys 912 aag Lys 305 atg Met ggc Gly etc Leu gea Ala ttt Phe 310 gag Gl U age ser acc Thr aaa Lys tcc Ser 315 aca Thr tea Ser cct Pro cca Pro aag Lys 320 960 cag Gin gee Ala gaa Glu gct Al a gtt Val 325 ttg Leu aag Lys act Thr etc Leu cag Gin 330 gaa Glu ctg Leu aaa Lys aaa Lys cta Leu 335 acc Thr 1008 ate ile tet ser gag Glu caa Gl n 340 aat Asn ate Ile cag Gin aga Arg gct Ala 345 aat Asn etc Leu ttc Phe aat Asn aag Lys 350 ctg Leu gtt val 1056 act Thr gag Glu ctg Leu 355 aga Arg ggc Gly etc Leu agt ser gat Asp 360 gaa Glu gea Ala gtc val aca Thr tet ser 365 etc Leu ttg Leu cca Pro 1104 cag Gin ctg Leu 370 att Ile gag Glu gtg val tcc Ser age Ser 375 ccc Pro ate ile act Thr tta Leu caa Gin 380 gee Al a ttg Leu gtt val cag Gin 1152 tgt cys 385 gga Gly cag Gin cct Pro cag Gin tgc Cys 390 tcc Ser act Thr cac HÍS ate Ile etc Leu 395 cag Gin tgg Trp ctg Leu aaa Lys cgt Arg 400 1200 gtg Val cat Hl 5 gee Ala aac Asn ccc Pro 405 ctt Leu ctg Leu ata Ile gat Asp gtg val 410 gtc Val acc Thr tac Tyr ctg Leu gtg val 415 gee Ala 1248 ctg Leu ate ile ccc pro gag Glu 420 ccc pro tea ser gea Ala cag Gin cag Gin 425 ctg Leu cga Arg gag Glu ate ile ttc Phe 430 aac Asn atg Met 1296 gcg Ala agg Arg gat Asp 435 cag Gin ege Arg age ser cga Arg gee Ala 440 acc Thr ttg Leu tat Tyr gçg Ala ctg Leu 445 age Ser cac Hi s gcg Ala 1344 gtc Val aac Asn 450 aac Asn tat Tyr cat Hi s aag Lys aca Thr 455 aac Asn cct Pro aca Thr ggg Gly acc Thr 460 cag Gin gag Glu ctg Leu ctg Leu 1392 gac Asp 455 att Ile gct Ala aat Asn tac Tyr ctg Leu 470 atg wet gaa Glu cag Gin att Ile caa Gin 475 gat Asp gac ASP tgc cys act Thr ggg Gly 480 1440 gat Asp gaa Glu gat ASP tac Tyr acc Thr 485 tat Tyr ttg Leu att Ile ctg Leu cgg Arg 490 gtc val att ile gga Gly aat Asn atg Met 495 ggc Gly 1488 caa Gin acc Thr atg Met gag Glu 500 cag Gin tta Leu act Thr cca Pro gaa Glu 505 etc Leu aag Lys tet ser tea ser ate ile 510 ctg Leu aaa Lys 1536 430 tflt cys gtc vai caa Gin 515 agt Ser aca Thr aag Lys cca Pro tca Ser 520 ctg Leu atg Met ate Ile cag Gin aaa Bi gct Ala gcc Ala ate Ile 1584 cag Gin gct Ala 530 ctg Leu cgg Arg aaa Lys atg Met gag Glu 535 cct Pro aaa Lys gac Asp aag Lys gac ASp 540 cag Gl n gag Glu gtt Val ctt Leu 1632 ctt Leu 545 cag Gin act Thr ttc Phe ctt Leu gat ASp 550 gat Asp gct Ala tct Ser ccg Pro gga Gly 555 gat Asp aag Lys cga Arg ctg Leu gct Al a 560 1680 gcc Ala tat Tyr ctt Leu atg Met ttg Leu 565 atg Met agg Arg agt ser cct Pro tca Ser 570 cag Gin gea Ala gat Asp att ile aac Asn 575 aaa Lys 1728 att lie gtc Val caa Gin att lie 580 cta Leu cca Pro tgg Trp gaa Glu cag Gin 585 aat Asn gag Glu caa Gin aag Lys 590 aac Asn ttt Phe 1776 gtg vai gçt Ala tcc Ser 595 cat Hl S att ile gçc Ala aat Asn ate ile 600 ttg Leu aac Asn tca ser gaa Glu gaa Glu 605 ttg Leu gat Asp ate ile 1824 caa Gin gat Asp 610 ctg Leu aaa Lys aag Lys tta Leu gtg Val 615 aaa Lys gaa Glu gct Al a ctg Leu aaa Lys 620 gaa Glu tct Ser caa Gin ctt Leu 1872 cca Pro 625 act Thr gtc Val atg Met gac Asp ttc Phe 630 aga Arg aaa Lys ttc Phe tct Ser cgg Arg 635 aac Asn tat Tyr caa Gin ctc Leu tac Tyr 640 1920 aaa Lys tct Ser gtt val tct ser ctt Leu 645 cca Pro tca Ser ctt Leu gac Asp cca Pro 650 gcc Ala tca Ser gcc Ala aaa Lys ata Ile 655 gaa Glu 1968 ggg Gly aat Asn ctt Leu ata ile 660 ttt Phe gat Asp cca Pro aat Asn aac Asn 665 tac Tyr ctt Leu cct Pro aaa Lys gaa Glu 670 age Ser atg Met 2016 ctg Leu aaa Lys act Thr 675 acc Thr ctc Leu act Thr gcc Ala ttt Phe 680 gga Gly ttt Phe gct Ala tca Ser gct Ala 685 gac Asp ctc Leu ate Ile 2064 gag Glu att ile 690 ggc Gly ttg Leu gaa Glu gga Gly aaa Lys 695 ggc Gly ttt Phe gag Glu cca pro aca Thr 700 ttg Leu gag Glu gct Ala cct Pro 2112 ttt Phe 705 ggg Gly aag Lys caa Gin gga Gly ttt Phe 710 ttc Phe cca Pro gac Asp agt Ser gtc val 715 aac Asn aaa Lys gct Ala ttg Leu tac Tyr 720 2160 tgg Trp gtt val aat Asn ggt Gly caa Gl n 725 gtt Val cct Pro gat Asp ggt Gly gtc Val 730 tct Ser aag Lys gtc Val tta Leu gtg Val 735 gac Asp 2208 cac ttt ggc tat acc aaa gat gat aaa cat gag cag gat atg gta aat 2256 Hi s Phe Gly Tyr Thr Lys Asp Asp Lys His Glu Gin Asp Met val Asn 740 745 750 gga ata atg ctc agt gtt gag aag ctg att aaa gat ttg aaa tcc aaa 2304 Gly ile Met Leu Ser Val Glu Lys Leu ile Lys Asp Leu Lys Ser Lys 755 760 765 gaa gtc ccg gaa gçc aga gcc tac ctc ege ate ttg gga gag gag ctt 2352 Glu Val Pro Glu Ala Arg Ala Tyr Leu Arg ile Leu Gly Glu Glu Leu 770 775 780 431 ggt Gly 785 ttt Phe gee Ala agt Ser etc Leu cat Hi 5 790 gac Asp etc Leu cga Arg etc Leu ctg Leu 795 gga Gly aag Lys ctg Leu ctt Leu ctg Leu 800 2400 atg Met ggt Gly gee Ala ege Arg act Thr 805 ctg Leu cag Gin ggg Gly ate ile ccc Pro 810 cag Gin atg Met att ile gga GTy gag Glu 815 gtc val 2448 ate He agg Arg aag Lys ggc Gly 820 tea Ser aag Lys aat Asn gac Asp ttt phe 825 ttt Phe ctt Leu cac Hl s tac Tyr ate ile 830 ttc Phe atg Met 2496 gag Glu aat Asn gee Al a 835 ttt phe gaa Glu etc Leu ccc Pro act Thr 840 gga Gly gct Ala gga Gly tta Leu cag Gin 845 ttg Leu caa Gin ata Ile 2 544 tet Ser tea Ser 850 tet Ser gga Gly gtc val att ile gct Al a 855 ccc Pro 99a Gly gee Ala aag Lys gct Al a 860 99a GTy gta Val aaa Lys ctg Leu 2 592 gaa Glu 865 gta Val gee Al a aac Asn atg Met cag Gin 870 gct Ala gaa Glu ctg Leu gtg Val gea Ala 875 aaa Lys ccc Pro tcc Ser tet ser 880 2640 gtg VaT gag Glu ttt Phe gtg val aca Thr 885 aat Asn atg Met ggc Gly ate Ile ate ile 890 att Ile ccg Pro gac Asp ttc Phe 895 agg Arg 2688 agt Ser ggg Gly gtc Val cag Gin 900 atg Met aac Asn acc Thr aac Asn ttc Phe 905 ttc Phe cac His gag Glu teg Ser ggt GTy 910 ctg Leu gag Glu 2736 gct Ala cat HÍS gtt Val 915 gee Ala cta Leu aaa Lys gct Ala ggg Gly 920 aag Lys ctg Leu aag Lys ttt Phe ate ile 925 att Ile cct Pro tcc Ser 2784 cca Pro aag Lys 930 aga Arg cca Pro gtc Val aag Lys ctg Leu 935 etc Leu agt Ser gga Gly ggc Gly aac Asn 940 aca Thr tta Leu cat HIS ttg Leu 2832 gtc Val 945 tet Ser acc Thr acc Thr aaa Lys acg Thr 950 gag Glu gtc Val ate ile cca Pro cct Pro 955 etc Leu att Ile gag Glu aac Asn agg Arg 960 2880 cag Gin tcc Ser tgg Trp tea Ser gtt Val 965 tgc Cys aag Lys caa Gin gtc Val ttt Phe 970 cct Pro ggc Gly ctg Leu aat Asn tac Tyr 975 tgc cys 2928 acc Thr tea ser ggc Gly gct Al a 980 tac Tyr tcc ser aac Asn gee Ala age ser 985 tcc Ser aca Thr gac Asp tcc ser gee Ala 990 tcc Ser tac Tyr 2976 tat Tyr ccg Pro ctg acc Leu Thr 995 ggg Gly gac Asp acc Thr aga tta Arg Leu 1000 gag Glu ctg Leu gaa Glu ctg agg Leu Arg 1005 cct Pro aca Thr 3024 gga Gly gag att Glu Ile 1010 gag Glu cag Gin tat Tyr tet gtc ser val 1015 age Ser gea Ala acc Thr tat gag Tyr Glu 1020 etc Leu cag Gin aga Arg 3072 gag gac Glu Asp 1025 aga Arg gee Ala ttg Leu gtg gat val Asp 1030 acc Thr ctg Leu aag Lys ttt gta Phe val 1035 act Thr caa Gin gea Ala gaa Glu 1040 3120 ggc Gly gcg Ala aag Lys cag Gin act gag Thr Glu 1045 gct Ala acc Thr atg Met aca ttc Thr Phe 1050 aaa Lys tat Tyr aat Asn cgg cag Arg Gin 1055 3168 agt Ser atg Met acc Thr ttg Leu tcc Ser agt Ser gaa Glu gtc val caa Gl n att ile ccg gat Pro Asp ttt Phe gat Asp gtt Val gac Asp 3216 1060 1065 1070 432 ctc gga aca ate etc aga gtt aat gat gaa tet act gag ggc aaa acg

Leu Gly Thr ile Leu Arg Vai Asn Asp Glu Ser Thr Glu Gly Lys Thr 1075 1080 1085 tet tac aga ctc acc ctg gac att cag aac aag aaa att act gag gtc ser Tyr Arg Leu Thr Leu Asp ile Gin Asn Lys Lys lie Thr Glu vai 1090 1095 1100 gee ctc atg ggc cac cta agt tgt gac aca aag gaa gaa aga aaa ate

Ala Leu Met Gly His Leu ser Cys Asp Thr Lys Glu Glu Arg Lys Ile 1105 1110 1115 1120 aag ggt gtt att tcc ata ccc cgt ttg caa gea gaa gee aga agt gag

Lys Gly vai Ile Ser Ile Pro Arg Leu Gin Ala Glu Ala Arg ser Glu 1125 1130 1135 ate ctc gee cac tgg teg cct gee aaa ctg ctt ctc caa atg gac tea ile Leu Ala His Trp Ser Pro Ala Lys Leu Leu Leu Gin Met Asp Ser 1140 1145 1150 tet gct aca gct tat ggc tcc aca gtt tcc aag agg gtg gea tgg cat

Ser Ala Thr Ala Tyr Gly Ser Thr vai ser Lys Arg vai Ala Trp His 1155 1160 1165 tat gat gaa gag aag att gaa ttt gaa tgg aac aca ggc acc aat gta

Tyr Asp Glu Glu Lys ile Glu Phe Glu Trp Asn Thr Gly Thr Asn vai 1170 1175 1180 gat acc aaa aaa atg act tcc aat ttc cct gtg gat ctc tcc gat tat

Asp Thr Lys Lys Met Thr Ser Asn Phe Pro Vai Asp Leu Ser Asp Tyr 1185 1190 1195 1200 cct aag age ttg cat atg tat gct aat aga ctc ctg gat cac aga gtc

Pro Lys Ser Leu His Met Tyr Ala Asn Arg Leu Leu Asp His Arg Vai 1205 1210 1215 cct caa aca gac atg act ttc cgg cac gtg ggt tcc aaa tta ata gtt

Pro Gin Thr Asp Met Thr Phe Arg His Vai Gly Ser Lys Leu Ile Vai 1220 1225 1230 gea atg age tea tgg ctt cag aag gea tet ggg agt ctt cct tat acc

Ala Met Ser Ser Trp Leu Gin Lys Ala Ser Gly Ser Leu Pro Tyr Thr 1235 1240 1245 cag act ttg caa gac cac ctc aat age ctg aag gag ttc aac ctc cag

Gin Thr Leu Gin Asp His Leu Asn ser Leu Lys Glu Phe Asn Leu Gin 1250 1255 1260 aac atg gga ttg cca gac tcc cac ate cca gaa aac ctc ttc tta aaa

Asn Met Gly Leu Pro Asp ser His ile Pro Glu Asn Leu Phe Leu Lys 1265 1270 1275 1280 age gat ggc ege gtc aaa tat acc ttg aac aag aac agt ttg aaa att ser Asp Gly Arg Vai Lys Tyr Thr Leu Asn Lys Asn Ser Leu Lys Ile 1285 1290 1295 gag att cct ttg cct ttt ggt ggc aaa tcc tcc aga gat cta aag atg

Glu ile Pro Leu Pro Phe Gly Gly Lys Ser Ser Arg Asp Leu Lys Met 1300 1305 1310 tta gag act gtt agg aca cca gee ctc cac ttc aag tet gtg gga ttc

Leu Glu Thr vai Arg Thr Pro Ala Leu His Phe Lys Ser Vai Gly Phe 1315 1320 1325 cat ctg cca tet cga gag ttc caa gtc cct act ttt acc att ccc aag

His Leu Pro Ser Arg Glu Phe Gin vai Pro Thr Phe Thr ile Pro Lys 1330 1335 1340 3264 3312 3360 3408 3456 3504 3552 3500 3648 3696 3744 3792 3840 3888 3936 3984 4032 433 ttg tat caa ctg caa gtg cct ctc ctg ggt gtt cta gac ctc tcc acg 4080 Leu 1345 Tyr 1 Gin Leu Gl n VaT 135C Pro 1 Leu Leu Gly Vai Leu 1355 Asp Leu Ser Thr 1360 aat gtc tac age aac ttg tac aac tgg tcc gee tcc tac agt ggt ggc 4128 Asr Vai Tyr Ser Asn 1365 Leu Tyr Asn Trp Ser 137C Ala 1 Ser Tyr Ser Gly 1375 Gly aac acc age aca gac cat ttc age ctt cgg gct cgt tac cac atg aag 4176 Asn Thr Ser Thr Asp 1380 HiS Phe Ser Leu Arg 1385 Ala Arg Tyr His Met 1390 Lys gct gac tct gtg vai gtt gac ctg ctt tcc tac aat gtg caa gga tct gga 4224 Ala Asp ser 1395 vai ASp Leu Leu ser 1400 Tyr Asn vai Gin 1405 Gly ser Gly gaa aca aca tat gac cac aag aat acg ttc aca cta tea tgt gat ggg Gly 4272 Glu Thr Thr 1410 Tyr Asp Hi S Lys 1415 Asn Thr Phe Thr Leu Ser 1420 Cys Asp tct cta ege cac aaa ttt cta gat teg aat ate aaa ttc agt cat gta 4320 Ser Leu 1425 Arg Hi s Lys Phe Leu 1430 ASp Ser Asn Ile Lys 1435 Phe Ser His vai 1440 gaa aaa ctt gga Gly aac aac cca gtc tea aaa ggt Gly l tta cta ata ttc gat 4368 Glu Lys Leu Asn 1445 Asn pro vai ser Lys 145C Leu Leu ile Phe Asp 1455 gca tct agt tcc tgg gga Gly cca cag atg tct gçt tea gtt cat ttg gac 4416 Ala Ser Ser Ser Trp 1460 Pro Gl n Met Ser 1465 Ala Ser vai Hi s Leu 1470 Asp tcc aaa aag aaa cag cat ttg ttt gtc aaa gaa gtç aag att gat ggg 4464 Ser Lys Lys Lys 1475 Gin HÍS Leu Phe Vai 1480 Lys Glu Vai Lys ile 1485 ASP Gly cag ttc aga gtc tct teg ttc tat gçt aaa ggc aca tat ggc ctg tct 4512 Gin Phe Arg 1490 vai Ser Ser Phe Tyr 1495 Al a Lys Gly Thr Tyr 1500 Gly Leu Ser tgt cag agg gat cct aac act ggc cgg ctc aat gga gag tcc aac ctg 4560 cys Gin 1505 Arg Asp Pro Asn Thr 1510 Gly Arg Leu Asn Gly 1515 Glu Ser Asn Leu 1520 agg ttt aac tcc tcc tac ctc caa ggc acc aac cag ata aca gga aga 4608 Arg phe Asn Ser Ser 1525 Tyr Leu Gin Gly Thr Asn 1530 Gin Ile Thr Gly Arg 1535 tat gaa gat gga acc ctc tcc ctc acc tcc acc tct gat ctg caa agt 4656 Tyr Glu Asp Gly Thr 1540 Leu Ser Leu Thr ser 1545 Thr ser Asp Leu Gin 1550 ser ggc ate att aaa aat act gct tcc cta aag tat gag aac tac gag ctg 4704 Gly Ile ile Lys 1555 Asn Thr Ala Ser Leu 1560 Lys Tyr Glu Asn Tyr 1565 Glu Leu act tta aaa tct gac acc aat ggg aag tat aag aac ttt gee act tct 4752 Thr Leu Lys 1570 Ser Asp Thr Asn Gly 1575 Lys Tyr Lys Asn Phe 1580 Al a Thr Ser aac aag atg gat atg acc ttc tct aag caa aat gca ctg ctg cgt tct 4800 Asn Lys 1585 Met Asp Met Thr Phe 1590 Ser Lys Gl n Asn Ala 1595 Leu Leu Arg Ser 1600 gaa tat cag gct gat tac gag tea ttg agg ttc ttc age ctg Ctt tct 4848 Glu Tyr Gin Al a Asp 1605 Tyr Glu Ser Leu Arg 1610 Phe Phe ser Leu Leu 1615 Ser 434 gga tca cta aat tcc cat ggt ctt gag tta aat gct gac ate tta ggc 4896 Gly ser Leu Asn Ser Hi S Gly Leu Glu Leu Asn Ala Asp Ile Leu Gly 1620 1625 1630 act gac aaa att aat agt ggt gct cac aag gcg aca cta agg att ggc 4944 Thr ASP Lys Ile Asn Ser Gly Ala His Lys Ala Thr Leu Arg ile Gly 1635 1640 1645 caa gat gqa ata tct acc agt gea acg acc aac ttg aag tgt agt ctc 4992 Gin Asp Gly ile Ser Thr ser Al a Thr Thr Asn Leu Lys cys Ser Leu 1650 1655 1660 ctg gtg ctg gag aat gag ctg aat gea gag ctt ggc ctc tct ggg gea 5040 Leu Vai Leu Glu Asn Glu Leu Asn Ala Glu Leu Gly Leu Ser Gly Ala 1665 1670 1675 1680 tct atg aaa tta aca aca aat ggc ege ttc a99 gaa cac aat gea aaa 5088 Ser Met Lys Leu Thr Thr Asn Gly Arg Phe Arg Glu Hl s Asn Ala Lys 1685 1690 1695 ttc agt ctg gat ggg aaa gcc gcc ctc aca gag cta tca ctg gqa agt 5136 phe ser Leu Asp Gly Lys Ala Ala Leu Thr Glu Leu ser Leu Gly Ser 1700 1705 1710 gct tat cag gcc atg att ctg 99t gtc gac age aaa aac att ttc aac 5184 Ala Tyr Gl n Ala Met ile Leu Gly Vai Asp Ser Lys Asn ile phe Asn 1715 1720 1725 ttc aag gtc agt caa gaa gga ctt aag ctc tca aat gac atg atg ggc 5232 Phe Lys vai ser Gin Glu Gly Leu Lys Leu Ser Asn Asp Met Met Gly 1730 1735 1740 tca tat gçt gaa atg aaa ttt gac cac aca aac agt ctg aac att gea 5280 Ser Tyr Al a Glu Met Lys Phe Asp Hl s Thr Asn Ser Leu Asn ile Ala 1745 1750 1755 1760 ggc tta tca ctg gac ttc tct tca aaa ctt gac aac att tac age tct 5328 Gly Leu ser Leu ASp Phe Ser Ser Lys Leu ASp Asn Ile Tyr Ser Ser 1765 1770 1775 gac aag ttt tat aag caa act gtt aat tta cag cta cag ccc tat tct 5376 Asp Lys Phe Tyr Lys Gin Thr vai Asn Leu Gin Leu Gin Pro Tyr Ser 1780 1785 1790 ctg gta act act tta aac agt gac ctg aaa tac aat gçt ctg gat ctc 5424 Leu Vai Thr Thr Leu Asn Ser Asp Leu Lys Tyr Asn Ala Leu Asp Leu 1795 1800 1805 acc aac aat ggg aaa cta cgg cta gaa ccc ctg aag ctg cat gtg gçt 5472 Thr Asn Asn Gly Lys Leu Arg Leu Glu Pro Leu Lys Leu His Vai Ala 1810 1815 1820 ggt aac cta aaa gga gcc tac caa aat aat gaa ata aaa cac ate tat 5520 Gly Asn Leu Lys Gly Ala Tyr Gin Asn Asn Glu ile Lys Hi S Ile Tyr 1825 1830 1835 1840 gcc ate tct tct gct gcc tta tca gea age tat aaa gea gac act gtt 5568 Ala ile Ser ser Ala Ala Leu Ser Ala Ser Tyr Lys Ala Asp Thr val 1845 1850 1855 gçt aag gtt cag ggt gtg gag ttt age cat ggg ctc aac aca gac ate 5616 Ala Lys vai Gl n Gly Vai Glu Phe Ser ΗΊ s Gly Leu Asn Thr Asp ile 1860 1865 1870 gçt ggg ctg gct tca gcc att gac atg age aca aac tat aat tca gac 5664 Ala Gly Leu Ala Ser Ala Ile Asp Met Ser Thr Asn Tyr Asn ser ASp 1875 1880 1885 435 tca ctg cat ttc age aat gtc ttc cgt tet gta atg gee ccg ttt acc 5712 Ser Leu His 1890 Phe ser Asn val Phe 1895 Arg Ser Val Met Ala 1900 pro Phe Thr ata acc ate gat gca cat aca aat ggc aat ggg aaa ctc gct ctc tgg 5760 Met Thr 1905 lie Asp Ala His Thr 1910 Asn Gly Asn Gly Lys 1915 Leu Ala Leu Trp 1920 gga gaa cat act ggg cag ctg tat age aaa ttc ctg ttg aaa gca gaa 5808 Gly Gl u Hl 5 Thr Gly Gln 1925 Leu Tyr Ser Lys Phe 1930 Leu Leu Lys Ala Qlu 1935 cct ctg gca ttt act ttc tet cat gat tac aaa ggc tcc aca agt cat 5856 Pro Leu Al a Phe Thr 1940 Phe ser Hi 5 Asp Tyr 1945 Lys Gly Ser Thr Ser 1950 Hl S cat ctc gtg val 1955 tet agg aaa age ate agt gca gct ctt gaa cac aaa gtc 5904 HIS Leu Ser Arg Lys Ser ile Ser 1960 Al a Al a Leu Glu His 1965 Lys Val agt acc ctq ctt act cca gct gag cag aca ggc acc tgg aaa ctc aag 5952 Ser Ala Leu 1970 Leu Thr Pro Ala 1975 Glu Gin Thr Gly Thr Trp 1980 Lys Leu Lys acc caa ttt aac aac aat gaa tac age cag gac ttg gat gct tac aac 6000 Thr Gin 1985 Phe Asn Asn Asn Glu 1990 Tyr Ser Gin Asp Leu 1995 Asp Ala Tyr Asn 2000 act aaa gat aaa att ggc gtg gag ctt act gga cga act ctg gct gac 6048 Thr Lys Asp Lys lie Gly 2005 val Glu Leu Thr Gly 2010 Arg Thr Leu Ala Asp 2015 cta act cta cta gac tcc cca att aaa 83 cca ctt tta ctc agt gag 6096 Leu Thr Leu Leu ASp 2020 ser Pro Ile Lys 2025 Pro Leu Leu Leu Ser 2030 Glu ccc ate aat ate aat gat gct tta gag atg aga gat gee gtt gag aag 6144 Pro ile Asn lie 2035 Asn Asp Ala Leu Glu 2040 Met Arg Asp Ala Val 2045 Glu Lys ccc caa qaa ttt aca att gtt gct ttt gta aag tat gat aaa aac caa 6192 Pro Gin Glu 2050 Phe Thr ile Val 2055 Ala Phe Val Lys Tyr Asp 2060 Lys Asn Gin aat att cac tcc att aac ctc cca ttt ttt gag acc ttg caa gaa tat 6240 Asp val 2065 His ser ile Asn Leu 2070 Pro Phe Phe Glu Thr 2075 Leu Gin Glu Tyr 2080 ttt gag agg aat cg a caa acc att ata gtt gta ctg gaa aac gta cag 6288 Phe Glu Arg Asn Arg Gin 2085 Thr ile ile val val 2090 Leu Glu Asn Val Gin 2095 aga aac ctg aag cac ate aat att gat caa ttt gta aga aaa tac aga 6336 Arg Asn Leu Lys His 2100 ile Asn ile Asp Gin 2105 Phe Val Arg Lys Tyr 2110 Arg gca gee ctg gga aaa ctc cca cag caa gct aat gat tat ctg aat tca 6384 Ala Ala Leu 2115 Gly Lys Leu pro Gin Gin 2120 Ala Asn ASP Tyr 2125 Leu Asn Ser ttc aat tgg gag aga caa gtt tca cat gee aag gag aaa ctg act gct 6432 phe Asn 213C Trp 1 Glu Arg Gl n val 2135 Ser 1 His Ala Lys Glu Lys 2140 Leu Thr Ala ctc aca aaa aag tat aga att aca gaa aat gat ata caa att gca tta 6480 Leu 2145 Thr Lys Lys Tyr Arg Ile 2150 Thr Glu Asn ASP 2155 ile Gin ile Ala Leu 2160 436 gat gat gee aaa ate aac ttt aat gaa aaa cta tet caa ctg cag aca 6528 Asp Asp Ala Lys ile 2165 Asn Phe Asn Glu Lys Leu 2170 Ser Gl n Leu Gin 2175 Thr tat atg ata caa ttt gat cag tat att aaa gat agt tat gat tta cat 6576 Tyr Niet lie Gin Phe 2180 Asp Gl n Tyr ile 2185 iLyS Asp ser Tyr Asp 219C Leu 1 His gat ttg aaa ata gct att gct aat att att gat gaa ate att gaa aaa 6524 Asp Leu Lys 2195 Ile Ala ile Al a Asn Ile 2200 ile Asp Glu ile 2205 He Glu Lys tta aaa aqt ctt gat gag cac tat cat acc cgt gta aat tta gta aaa 6672 Leu Lys ser 2210 Leu Asp Glu his Tyr 2215 His Thr Arg Val Asn 2220 Leu Val Lys aca ate cat gat cta cat ttg ttt att gaa aat att gat ttt aac aaa 6720 Thr 2225 ile Hi S Asp Leu His Leu 2230 Phe Ile Glu Asn Ile 2235 Asp Phe Asn Lys 2240 agt gga agt agt act gea tcc tgg att caa aat gtg Val gat act aag tac 6768 Ser Gly Ser Ser Thr 2245 Al a Ser Trp Ile Gin Asn 2250 Asp Thr Lys Tyr 2255 caa ate aga ate cag ata caa gaa aaa ctg cag cag ctt aag aga cac 6816 Gin ile Arg lie Gin 2260 ile Gin Glu Lys Leu 2265 Gl n Gin Leu Lys Arg 2270 Hi s ata cag aat ata gac ate cag cac cta gct gga aag tta aaa caa cac 6864 lie Gin Asn ile 2275 Asp ile Gin His Leu 2280 Ala Gly Lys 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Lys Asp Tyr Phe Glu 2390 Lys Leu Val Gly Phe 2395 Ile Asp Asp Ala 2400 gtç aag aag ctt aat gaa tta tet ttt aaa aca ttc att gaa gat gtt 7248 Val Lys Lys Leu Asn Glu 2405 Leu Ser Phe Lys Thr 2410 Phe Ile Glu Asp Val 2415 aac aaa ttc ctt gac atg ttg ata aag aaa tta aag tea ttt gat tac 7296 Asn Lys Phe Leu Asp 2420 Met Leu Ile Lys Lys 2425 Leu Lys Ser Phe Asp 2430 Tyr cac cag ttt gta gat gaa acc aat gac aaa ate cgt gag gtg act cag 7344 His Gin Phe val Asp Glu Thr Asn Asp Lys ile Arg Glu Val Thr Gin 2435 2440 2445 437 aga ctc aat g< jt gaa att cag gct ctg gaa cta cca caa aaa gct gaa 7392 Arg Leu Asn 2450 G fy Glu ile Gin Ala 2455 Leu Glu Leu Pro Gin 2460 Lys Al a Glu gca tta aaa ctg ttt tta gag gaa acc aag gee aca gtt gca gtg tat 7440 Ala Leu Lys Leu Phe Leu Glu Glu Thr Lys Ala Thr Val Ala val Tyr 2465 2470 2475 2480 ctg gaa age cta cag gac acc aaa ata acc tta ate ate aat tgg tta 7488 Leu Glu Ser Leu Gin ASD Thr Lys Ile Thr Leu Ile Ile Asn Trp Leu 2485 2490 2495 cag gag gct tta agt tea gca 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Gin 2595 2600 2605 aaa gct acc ttc cag aca cct gat ttt ata gtç ccc cta aca gat ttg 7872 Lys Ala Thr Phe Gin Thr pro Asp Phe Ile Val Pro Leu Thr ASP Leu 2610 2615 2620 agg att cca tea gtt cag ata aac ttc aaa gac tta aaa aat ata aaa 7920 Ara Ile Pro Ser Val Gin lie Asn Phe Lys Asp Leu Lys Asn ile Lys 2625 2630 2635 2640 ate cca tcc agg ttt tcc aca cca gaa ttt acc ate ctt aac acc ttc 7968 ile Pro Ser Arg Phe Ser Thr pro Glu phe Thr ile Leu Asn Thr Phe 2645 2650 2655 cac att cct tcc ttt aca att gac ttt gta gaa atg aaa gta aag ate 8016 Hi S Ile Pro Ser Phe Thr Ile Asp Phe val Glu Met Lys val Lys ile 2660 2 665 2670 ate aga acc att gac cag atg ctg aac agt gag ctg cag tgg ccc gtt 8064 Ile Arg Thr Ile Asp Gin Met Leu Asn ser Glu Leu Gin Trp Pro val 2675 2680 2685 cca gat ata tat ctc agg gat ctg aag gtg gag gac att cct cta gçg 8112 Pra ASD ile Tyr Leu Arg ASP Leu Lys Val Glu ASP Ile Pro Leu Ala 2690 2695 2700 aga ate acc ctg cca gac ttc cgt tta cca gaa ate gca att cca gaa 8160 Arg ile Thr Leu pro Asp Phe Arg Leu Pro Glu ile Ala ile Pro Glu 2705 2710 2715 2720 438 ttc ata ate cca act ctc aac ctt aat gat ttt caa gtt cct gac ctt 8208 Phe Ile ile Pro Thr Leu Asn Leu Asn Asp phe Gl n vai Pro Asp Leu 2725 2730 2735 cac ata cca gaa ttc cag ctt ccc cac ate tea cac aca att gaa gta 8256 His Ile pro Glu Phe Gin Leu Pro Hi s ile Ser HiS Thr Ile Glu Vai 2740 2745 2750 cct act ttt ggc Gly aag cta tac agt att ctg aaa ate caa tet cct ctt 8304 ΡΓΟ Thr phe Lys Leu Tyr ser ile Leu Lys ile Gl n ser pro Leu 2755 2760 2765 ttc aca tta gat gea aat gct gac ata ggg aat gga acc acc tea gea 8352 phe Thr Leu Asp Ala Asn Ala Asp ile Gly Asn Gly Thr Thr Ser Ala 2770 2775 2780 aac gaa gea gat Gly ate gea gct tcc ate act gee aaa gga gag tcc aaa 8400 Asn Glu Ala Ile Ala Ala Ser ile Thr Al a Lys Gly Glu Ser Lys 2785 2790 279' 2800 tta gaa gtt ctc aat ttt gat ttt caa gea aat gea caa ctc tea aac 8448 Leu Glu vai Leu Asn Phe Asp phe Gin Ala Asn Ala Gl n Leu Ser Asn 2805 2810 2815 cct aag att aat ceg ctg gct ctg aag gag tea gtg vai aag ttc tcc age 8496 Pro Lys Ile Asn Pro 2820 Leu Ala Leu Lys 282! Glu 5 Ser Lys Phe Ser 2830 Ser aag tac ctg aga acg gag cat ggg agt gaa atg ctg ttt ttt gga aat 8544 Lys Tyr Leu Arg Thr Glu His Gly Ser Glu Met Leu Phe Phe Gly Asn 2835 2840 2845 gct att gag gga Gly aaa tea aac aca gtg vai gea agt tta cac aca gaa aaa 8592 Ala ile Glu Lys Ser Asn Thr Ala Ser Leu His Thr Glu Lys 2850 2855 2860 aat aca ctg gag ctt agt aat gga Gly att gtc aag ata aac aat cag 8640 Asn Thr Leu Glu Leu Ser Asn ile vai Lys Ile Asn Asn Gin 2865 2870 2875 2880 ctt acc ctg gat age aac act aaa tac ttc cac aaa ttg aac ate ccc 8688 Leu Thr Leu Asp Ser Asn Thr Lys Tyr Phe Hi s Lys Leu Asn Ile Pro 2885 2890 2895 aaa ctg gac ttc tet agt cag gct gac ctg ege aac gag ate aag aca 8736 Lys Leu Asp Phe 2900 Ser i Ser Gin Ala Asp Leu 2905 Arg Asn Glu Ile Lys 2910 Thr ctg ttg aaa gct ggc cac ata gea tgg act tet tet gga aaa ggg Gly tea 8784 Leu Leu Lys Ala 2915 Gly His ile Ala Trp 2920 Thr Ser Ser Gly 2925 Lys Ser tgg aaa tgg gee teg ccc aga ttc tea gat gag gga aca cat gaa tea 8832 Trp Lys Trp 2930 Ala Ser Pro Arg Phe 2935 Ser Asp Glu Gly Thr 2940 Hi s Glu Ser caa att agt ttc acc ata gaa gga Gly ccc ctc act tcc ttt gga ctg tcc 8880 Gin 2945 ile Ser Phe Thr Ile Glu 2950 Pro Leu Thr Ser 2955 Phe Gly Leu ser 2960 aat aag ate aat age aaa cac cta aga gta aac caa aac ttg gtt tat 8928 Asn Lys Ile Asn Ser 2965 Lys Hi s Leu Arg Vai Asn 2970 Gin Asn Leu Val Tyr 2975 gaa tet ggc Gly tcc ctc aac ttt tet aaa ctt gaa att caa tea caa gtc 8976 Glu 5er Ser 2980 Leu Asn Phe Ser Lys Leu 2985 Glu ile Gl n ser Gin 2990 val 439 gat tcc cag cat gtg Val ggc cac agt gtt cta act gct aaa ggc atg gca 9024 Asp Ser Gin His 2995 Gly His Ser Val 3000 Leu Thr Ala Lys Gly 3005 Met Ala ctg ttt gga gaa ggg aag gca gag ttt act ggg agg cat gat gct cat 9072 Leu Phe Gly 3010 Glu Gly Lys Al a 3015 Glu Phe Thr Gly Arg His 3020 Asp Ala Hi s tta aat gga Gly aag gtt att gga act ttg aaa aat tet ctt ttc ttt tea 9120 Leu Asn 3025 Lys val Ile Gly 3030 Thr Leu Lys Asn 3035 Ser Leu Phe Phe Ser 3040 gcc cag cca ttt gag ate 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Asn His Leu 3570 Gin Leu Glu Leu Phe Phe Thr Asn Gly 3580 Glu His Thr age aaa gee acc ctg gaa etc tet cca tgg caa atg tea gct ctt gtt 10800 Ser Lys 3585 Ala Thr Leu Glu Leu 3590 Ser Pro Trp Gin Met 3595 Ser Al a Leu val 3600 cag gtc cat gea agt cag ccc agt tcc ttc cat gat ttc cct gac ctt 10848 Gin vai Hl s Ala Ser Gin 3605 Pro Ser ser phe His 3610 Asp phe Pro Asp Leu 3615 ggc cag gaa gtg vai 362C gee ctg aat gct aac act aag aac cag aag ate aga 10896 Gly Gin Glu Al a ) Leu Asn Ala Asn Thr 3625 Lys Α5Π Gin Lys Ile 3630 Arg tgg aaa aat gaa gtc cgg att cat tet ggg tet ttc cag age cag gtc 10944 Trp Lys Asn 363' Glu Vai Arg Ile His ser 3640 Gly ser Phe Gin ser 3645 Gl n val gag ctt tcc aat gac caa gaa aag gea cac ctt gac att gea gga tcc 10992 Glu Leu Ser 3650 Asn Asp Gl n Glu Lys 3655 Ala Hl s Leu Asp Ile 3660 Ala Gly Ser tta gaa gga Gly cac cta agg ttc etc aaa aat ate ate cta cca gtc tat 11040 Leu 366' Glu Hl s Leu Arg Phe 3670 Leu Lys Asn ile 367' Ile Leu Pro Val Tyr 3680 gac aag age tta 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Arg Asn Leu Gin Asn Asn Aia 4105 4110 gag tgg gtt tat caa ggg gcc att agg caa att gat gat ate gac gtg

Glu Trp vai Tyr Gin Gly Ala Ile Arg Gin ile Asp Asp He Asp vai 4115 4120 4125 agg ttc cag aaa gea gcc agt gac acc act ggg acc tac caa gag tgg

Arg Phe Gin Lys Ala Ala Ser Gly Thr Thr Gly Thr Tyr Gin Glu Trp 4130 4135 4140 aag gac aag gcc cag aat ctg tac cag gaa ctg ttg act cag gaa ggc

Lys Asp Lys Ala Gin Asn Leu Tyr Gin Glu Leu Leu Thr Gin Glu Gly 4145 4150 4155 4160 caa gcc agt ttc cag gga ctc aag gat aac gtg ttt gat ggc ttg gta

Gin Ala ser Phe Gin Gly Leu Lys Asp Asn vaT Phe Asp Gly Leu vai 4165 4170 4175 cga gtt act caa aaa ttc cat atg aaa gtc aag aag ctg att gac tca

Arg val Thr Gin Lys Phe His Met Lys vai Lys Lys Leu ile Asp Ser 4180 4185 4190 ctc att gat ttt ctg aac ttc ccc aga ttc cag ttt ccg ggg aaa cct

Leu ile Asp Phe Leu Asn Phe pro Arg Phe Gin Phe Pro Gly Lys Pro 4195 4200 4205 ggg ata tac act agg gag gaa ctt tgc act atg ttc atg agg gag gta

Gly Ile Tyr Thr Arg Glu Glu Leu Cys Thr Met Phe Met Arg Glu Val 4210 4215 4220 ggg acg gta ctg tcc cag gta tat teg aaa gtc cat aat ggt tca gaa

Gly Thr Val Leu Ser Gin val Tyr ser Lys val His Asn Gly Ser Glu 4225 4230 4235 4240 ata ctg ttt tcc tat ttc caa gac cta gtg att aca ctt cct ttc gag ile Leu Phe Ser Tyr Phe Gin Asp Leu Val Ile Thr Leu Pro Phe Glu 4245 4250 4255 tta agg aaa cat aaa cta ata gat gta ate teg atg tat agg gaa ctg

Leu Arg Lys His Lys Leu ile Asp val ile ser Met Tyr Arg Glu Leu 4260 4265 4270 ttg aaa gat tta tca aaa gaa gcc caa gag gta ttt aaa gcc att cag

Leu Lys Asp Leu Ser Lys Glu Ala Gin Glu val Phe Lys Ala ile Gin 4275 4280 4285 tct ctc aag acc aca gag gtg cta cgt aat ctt cag gac ctt tta caa

Ser Leu Lys Thr Thr Glu val Leu Arg Asn Leu Gin Asp Leu Leu Gin 4290 4295 4300 ttc att ttc caa cta ata gaa gat aac att aaa cag ctg aaa gag atg

Phe Ile Phe Gin Leu Ile Glu Asp Asn Ile Lys Gin Leu Lys Glu Met 4305 4310 4315 4320 aaa ttt act tat ctt att aat tat ate caa gat gag ate aac aca ate

Lys Phe Thr Tyr Leu ile Asn Tyr ile Gin Asp Glu ile Asn Thr ile 4325 4330 4335 ttc aat gat tat ate cca tat gtt ttt aaa ttg ttg aaa gaa aac cta

Phe Asn Asp Tyr Ile Pro Tyr Val Phe Lys Leu Leu Lys Glu Asn Leu 4340 4345 4350 tgc ctt aat ctt cat aag ttc aat gaa ttt att caa aac gag ctt cag

Cys Leu Asn Leu His Lys Phe Asn Glu Phe ile Gin Asn Glu Leu Gin 4355 4360 4365 12336 12384 12432 12480 12528 12576 12624 12672 12720 12768 12816 12864 12912 12960 13008 13056 13104 444 gaa gct tet caa gag tta cag cag ate cat caa tac att atg gcc ctt 13152 Gl u Ala ser Gin Glu Leu Gin Gin Ile Hi s Gin Tyr ile Met Ala Leu 4370 4375 4380 cgt gaa gaa tat ttt gat cca agt ata gtt ggc tgg aca gtg aaa tat 13200 Arg Glu Glu Tyr Phe Asp Pro Ser Ile Val Gly Trp Thr Val Lys Tyr 4385 4390 4395 4400 tat gaa ctt gaa gaa aag ata gtc agt ctg ate aag aac ctg tta gtt 13248 Tyr Glu Leu Glu Glu Lys Ile Vai Ser Leu Ile Lys Asn Leu Leu Val 4405 4410 4415 gct ctt aag gac ttc cat tet gaa tat att gtc agt gcc tet aac ttt 13296 Ala Leu Lys Asp Phe Hi S Ser Glu Tyr Ile Val Ser Ala Ser Asn Phe 4420 4425 4430 act tec caa ctc tea agt caa gtt gag caa ttt ctg cac aga aat att 13344 Thr ser Gl n Leu Ser Ser Gin Vai Glu Gin Phe Leu Hi 5 Arg Asn Ile 4435 4440 4445 cag gaa tat ctt age ate ctt acc gat cca gat gga aaa m aaa gag 13392 Gin Glu Tyr Leu Ser Ile Leu Thr Asp Pro Asp Gly Lys Giy Lys Glu 4450 4455 4460 aag att gea gag ctt tet gcc act gct cag gaa ata att aaa age cag 13440 LYS Ile Ala Glu Leu Ser Ala Thr Ala Gin Glu Ile ile Lys Ser Gin 4465 4470 4475 4480 gcc att gcg acg aag aaa ata att tet gat tac cac cag cag ttt aga 13488 Ala Ile Ala Thr LVS Lys ile ile Ser Asp Tyr H1S Gin Gin Phe Arg 4485 4490 4495 tat aaa ctg caa gat ttt tea gac caa ctc tet gat tac tat gaa aaa 13536 Tyr Lys Leu Gin ASP Phe Ser ASp Gin Leu Ser Asp Tyr Tyr Glu Lys 4500 4505 4510 ttt att gct gaa tcc aaa aga ttg att gac ctg tcc att caa aac tac 13584 phe ile Ala Glu ser Lys Arg Leu ile Asp Leu ser ile Gin Asn Tyr 4515 4520 4525 cac aca ttt ctg ata tac ate acg gag tta ctg aaa aag ctg caa tea 13632 Hi s Thr Phe Leu Ile Tyr Ile Thr Glu Leu Leu Lys Lys Leu Gin Ser 4530 4535 4540 acc aca gtc atg aac ccc tac atg aag ctt gct cca gga gaa ctt act 13680 Thr Thr vai Met Asn Pro Tyr Met Lys Leu Ala Pro Gly Glu Leu Thr 4545 4550 4555 4560 ate ate ctc taa tttttttaaa agaaatcttc atttattctt cttttccaat 13732 lie ile Leu * tgaactttca catagcacag aaaaaattca aactgcctat attgataaaa « ccatacagtg 13792 agccagcctt gcagtaggca gtagactata agcagaagca catatgaact ggacctgcac 13852 caaagctggc accagggctc ggaaggtctc tgaactcaga aggatggcat tttttgcaag 13912 ttaaagaaaa tcaggatctg agttattttg ctaaacttgg gggaggagga acaaataaat 13972 13993 ggagtcttta ttgtgtatca t 445 <210> 319

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 319 gcctcagtct gcttcgcgcc 20

<210> 320 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 320 gctcactgtt cagcatctgg 20

<210> 321 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 321 tgagaatctg ggcgaggccc 20 446 <210> 322

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 322 gtccttcata tttgccatct 20

<210> 323 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 323 cctccctcat gaacatagtg 20

<210> 324 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 324 gacgtcagaa cctatgatgg 20 447

<210> 325 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 325 tgagtgagtc aatcagcttc 20 <210> 326 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 326 gccttctgct tgagttacaa 20 <210> 327 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 327 gcgccttctg cttgagttac 20 448 <210> 328

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 328 tcgcgccttc tgcttgagtt 20 <210> 329 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 329 cttcgcgcct tctgcttgag 20 <210> 330 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 330 agtctgcttc gcgccttctg 20 449 <210> 331

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 331 tcagtctgct tcgcgccttc 20 <210> 332 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 332 cctcagtctg cttcgcgcct 20 <210> 333 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 333 agcctcagtc tgcttcgcgc 20 450 <210> 334 <211> 43445 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 334 accaagacag cgctcaggac tggttctcct cgtggctccc aattcagtcc aggagaagca 60 gagattttgt ccccatggtg ggtcatctga agaaggcacc cctggtcagg gcaggcttct 120 cagaccctga ggcgctggcc atggccccac tgagacacag gaagggccgc gccagagcac 180 tgaagacgct tggggaaggg aacccacctg ggacccagcc cctggtggct gcggctgcat 240 cccaggtggg ccccctcccc gaggctcttc aaggctcaaa gagaagccag tgtagaaaag 300 caaacaggtc aggcccggga ggcgcccttt ggaccttttg caatcctggc gctcttgcag 360 cctgggcttc ctataaatgg ggtgcgggcg ccggccgcgc attcccaccg ggacctgcgg 420 ggctgagtgc ccttctcggt tgctgccgct gaggagcccg cccagccagc 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451 tcgaacctcc acccccttcc tatttacctg acccctgggg gttaaaggaa ctggcctcca 1380 agcgcgaccc tgtgtgctgg agccgcgggg cggacttctg atggggcagc accgccatct 1440 agtggccgtc tgtcatcact gcagctggac tcaggaccca gatgttcttt ttcttcaatt 1500 gttcagaaaa ttcctctcaa ctacagtgga aacctccaga aattcttttc taggagtttg 1560 ttaagttagt tacgcttaat gcttaatgaa ctttgcctta agtatttggt agtcttagag 1620 tcacggaatt acggcgtgtt caagctaaaa aagcattaga gatagtacta tttgcgtaat 1680 gttgtcatct cttaatttgc cagagggtct ctcatgcaga ttttctgagc cccattactt 1740 gacacttgtc actcccttcc ctgtgcctca gatgagatat tcaagacatg ccagccaatt 1800 taaacattag cctcagcaaa aacataatgg agaagtcaaa tctataaagg aaaattaagt 1860 ataaagtcaa ttaaaaaata atttgagttg aattaccatt tttaattctc tatgccactg 1920 cccctctctg cccagaattg gctgtccttg ggagagctat ttctgctatg tggctgacgt 1980 atttctcccc acgttagaag atgcgacccg attcaagcac ctccggaagt acacatacaa 2040 ctatgaggct gagagttcca gtggagtccc tgggactgct gattcaagaa gtgccaccag 2100 gatcaactgc aaggtatgga ggatgcaggc aggagggacc tagagcccac agctttcccc 2160 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ttgttgaaag aaaacctatg ccttaatctt 42120 cataagttca atgaatttat tcaaaacgag cttcaggaag cttctcaaga gttacagcag 42180 atccatcaat acattatggc ccttcgtgaa gaatattttg atccaagtat agttggctgg 42240 acagtgaaat attatgaact tgaagaaaag atagtcagtc tgatcaagaa cctgttagtt 42300 gctcttaagg acttccattc tgaatatatt gtcagtgcct ctaactttac ttcccaactc 42360 tcaagtcaag ttgagcaatt tctgcacaga aatattcagg aatatcttag catccttacc 42420 gatccagatg gaaaagggaa agagaagatt gcagagcttt ctgccactgc tcaggaaata 42480 attaaaagcc aggccattgc gacgaagaaa ataatttctg attaccacca gcagtttaga 42540 tataaactgc aagatttttc agaccaactc tctgattact atgaaaaatt tattgctgaa 42600 tccaaaagat tgattgacct gtccattcaa aactaccaca catttctgat atacatcacg 42660 gagttactga aaaagctgca atcaaccaca gtcatgaacc cctacatgaa gcttgctcca 42720 ggagaactta ctatcatcct ctaatttttt aaaagaaatc ttcatttatt cttcttttcc 42780 aattgaactt tcacatagca cagaaaaaat tcaaactgcc tatattgata aaaccataca 42840 gtgagccagc cttgcagtag gcagtagact ataagcagaa gcacatatga actggacctg 42900 caccaaagct ggcaccaggg ctcggaaggt ctctgaactc agaaggatgg cattttttgc 42960 aagttaaaga aaatcaggat ctgagttatt ttgctaaact tgggggagga ggaacaaata 43020 aatggagtct ttattgtgta tcataccact gaatgtggct catttgtatt gaaagacagt 43080 gaaacgaggg cattgataaa atgttctggc acagcaaaac ctctagaaca catagtgtga 43140 tttaagtaac agaataaaaa tggaaacgga gaaattatgg agggaaatat tttgcaaaaa 43200 tatttaaaaa gatgaggtaa ttgtgttttt ataattaaat attttataat taaaatattt 43260 ataattaaaa tatttataat taaatatttt ataattaaaa tatttataat taaatatttt 43320 ataattaaag tatttataat taaatatttt ataattaaaa tatttataat taaatatttt 43380 ataattaaaa tatttataat taaatatttt ataattaaaa tatttataat taaatatttt 43440 ataat 43445

<210> 335 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 471 <4Ο0> 335 20 tctgtaagac aggagaaaga

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<210> 337 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 20 <400> 337 gatgccttac ttggacagac

<210> 338 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 472 20 <4Ο0> 338 agaaatagct ctcccaagga

<210> 339 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 339 gtcgcatctt ctaacgtggg 20

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gacctcccca gccacgtgga <210> 353 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 477 20

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<210> 358 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 20 <400> 358 attttaaatt acagtagata

<210> 359 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 479 20 <4Ο Ο> 359 ctgttctcca cccatatcag <210> 360 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Ant i- <40 0> 360 gagctcatac ctgtcccaga <210> 361 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Ant i <40 0> 361 ttcaagggcc actgctatca < 210 > 362 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti 20 20 480 20

<4Ο0> 362 ccagtatttc acgccaatcc <210> 363 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 363 ggcaggagga acctcgggca 20 <210> 364 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 364 ttttaaaatt agacccaacc 20 <210> 365 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 481 20

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<210> 371 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 483 20

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gagattggag acgagcattt <210> 378 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 378 catgacctac ttgtaggaga

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<210> 395 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 491 20

< 4 Ο Ο > 395 gtttcatgga actcagcgca <210> 396 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 396 ctggagagca cctgcaatag 20 <210> 397 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 397 tgaagggtag agaaatcata 20 <210> 398 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 492 20

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ttatgatagc tacagaataa <210> 408 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 408 ctgagattac ccgcagaatc <210> 409 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 409 gatgtatgtc atataaaaga

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<210> 422 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 500 20 <4Ο0> 422 cttcacaaat acacacctgc

<210> 423 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 423 agtggaagtt tggtctcatt 20 <210> 424 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 424 ttgctagctt caaagtggaa 20 <210> 425 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 501 20

<4Ο0> 425 tcaagaataa gctccagatc <210> 426 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 426 gcatacaagt cacatgaggt 20 <210> 427 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 427 tacaaggtgt ttcttaagaa 20

<210> 428 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 502 20

<4Ο0> 428 atgcagccag gatgggccta <210> 429 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 429 ttaccatatc ctgagagttt 20 <210> 430 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 430 gcaaaggtag aggaaggtat 20 <210> 431 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 503 20

<4Ο0> 431 aaggaccttc agcaaaggta <210> 432 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 20 <400> 432 cataggagta catttatata

<210> 433 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 20 <400> 433 attatgataa aatcaatttt

<210> 434 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 504 20

<4Ο0> 434 agaaatttca ctagatagat <210> 435 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 435 agcatatttt gatgagctga 20 <210> 436 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 436 gaaaggaagg actagcatat 20

<210> 437 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 505 20

<4Ο0> 437 cctctccaat ctgtagaccc <210> 438 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 438 ctggataact cagacctttg 20 <210> 439 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 439 agtcagaaaa caacctattc 20 <210> 440 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 506 20

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<210> 444 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 444 ctacctcaaa tcaatatgtt 20 <210> 445 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 445 tgctttacct acctagctac 20

<210> 446 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 508 <4Ο0> 446 accttgtgtg tctcactcaa 20

<210> 447 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 447 atgcattccc tgactagcac 20 <210> 448 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 448 catctctgag ccccttacca 20 <210> 449 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 509 <4Ο0> 449 gctgggcatg ctctctcccc 20

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<210> 453 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 453 ccaagcctct ttactgggct 20 <210> 454 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 454 cactcatgac cagactaaga 20 <210> 455 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 511 <4 Ο Ο> 455 acctcccaga agccttccat 20

<210> 456 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 456 ttcatatgaa atctcctaat 20 <210> 457 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 457 tatttaattt actgagaaac 20 <210> 458 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 512 <4Ο0> 458 taatgtgttg ctggtgaaga 20

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<210> 492 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 492 gttttcaaaa ggtataaggt 20 <210> 493 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 493 ttcccattcc ctgaaagcag 20

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<210> 504 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 504 acattttatc aatgccctcg 20

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<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 529 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 508 tctagaggtt ttgctgtgcc

<210> 509 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 509 aatcacacta tgtgttctag <210> 510 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 510 aaatcacact atgtgttcta

<210> 511 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 511 taaatcacac tatgtgttct

<210> 512 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 512 cttaaatcac actatgtgtt <210> 513 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 513 tattctgtta cttaaatcac

<210> 514 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Olígonucleótido Anti-sentido <400> 514 tggtagcctc agtctgcttc

<210> 515 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Olígonucleótido Anti-sentido <400> 515 agtctgcttc gcgccttctg <210> 516 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 516 gcgccagggc cgaagaggaa <210> 517 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 517 caggtatgag ctcaagctgg 532 <210> 518 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 518 catcctgaac atcaagaggg <210> 519 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 519 gggcagtgtg atcgcttcaa <210> 520 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 520 cacttgctct catcaaaggc <210> 521 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 521 cacactggac gctaagagga 20 533 <210> 522 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 522 cgctgagcca cgcggtcaac <210> 523 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 523 tgtccaaatt ctaccatggg <210> 524 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 524 cagctgacct catcgagatt <210> 525 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 525 gtcaagttcc tgatggtgtc 20 534 <210> 526 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 526 agetgcttct gatgggtgcc <210> 527 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 527 gggcatcatc attccggact <210> 528 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 528 cctactatcc gctgaccggg <210> 529 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 529 gggccaccta agttgtgaca 535 <210> 530 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 530 agaacatggg attgccagac <210> 531 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 531 ctccacttca agtctgtggg <210> 532 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 532 cagagcttgg cctctctggg <210> 533 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 533 tggccgcttc agggaacaca 53 6 <210> 534 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 534 cagctgagca gacaggcacc <210> 535 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 535 gggagagaca agtttcacat <210> 536 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 536 gtactgcatc ctggattcaa <210> 537 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 537 gtgaggtgac tcagagactc 537 <210> 538 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 538 ttgcagagca atattctatc <210> 539 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 539 aagcattggt agagcaaggg <210> 540 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 540 ccgctggctc tgaaggagtc <210> 541 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 541 tctagtcagg ctgacctgcg 538 20 <210> 542 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 542 gggccacagt gttctaactg <210> 543 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 543 aatcaagtgt catcacactg <210> 544 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 544 gggtagtcat aacagtactg <210> 545 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 545 agagcacacg gtcttcagtg 20 20 20 539 <210> 546 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 546 ttacagctag agggcctctt <210> 547 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 547 caccgtgggc atggatatgg <210> 548 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 548 gggaatctga tgaggaaact <210> 549 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 549 tgtcaacaag taccactggg 540 <210> 550

<211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 550 acctgggata tacactaggg 20

<210> 551 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 551 ccaagtatag ttggctggac 20 <210> 552 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 552 tacatgaagc ttgctccagg 20

<210> 553 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 553 atgtcagcct ggtctgtcca 20 541 20 <210> 554 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 554 gcacctccgg aagtacacat <210> 555 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <40 0> 555 ctgcagcttc atcctgaaga 20 <210> 556 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 556 tgagggcaaa gccttgctga 20 <210> 557 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 557 ccattccaga agggaagcag 542 20 <210> 558 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 558 cgaggaaggg caatgtggca <210> 559 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 559 ccttgtcaac tctgatcagc <210> 560 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 560 agcagccagt cctgtcagta <210> 561 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 561 agcatgtggc agaagccatc 543 <210> 562 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 562 gagagcacca aatccacatc <210> 563 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 563 cctcagtgat gaagcagtca <210> 564 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 564 gatagatgtg gtcacctacc <210> 565 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 565 cctcagcaca gcagctgcga 544 <210> 566 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 566 gattctgcgg gtcattggaa <210> 567 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 567 caaagccatc actgatgatc <210> 568 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 568 agaaagctgc catccaggct <210> 569 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 569 caggaggttc ttcttcagac 545 <210> 570 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 570 gagtccttca caggcagata <210> 571 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 571 tgccaatatc ttgaactcag <210> 572 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 572 catcgagatt ggcttggaag <210> 573 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 573 ggagctggat tacagttgca 546 <210> 574 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 574 caaeatgcag gctgaactgg <210> 575 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 575 acattacatt tggtctctac <210> 576 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 576 ctcaggcgct tactccaacg <210> 577 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 577 gggacaccag attagagctg 547 <210> 578 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 578 gagctccaga gagaggacag <210> 579 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 579 atcggcagag tatgaccttg <210> 580 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 580 caagggtgtt atttccatac <210> 581 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 581 gactcatctg ctacagctta 20 548 <210> 582 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 582 gcaaatcctc eagagatcta <210> 583 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 583 ctctcctggg tgttctagac <210> 584 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 584 atgaaggctg actctgtggt <210> 585 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 585 gggaccacag atgtctgctt 549 <210> 586 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 586 ctggccggct caatggagag 20 <210> 587 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 587 gctgcgttct gaatatcagg 20 <210> 588 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 588 tgctgacatc ttaggcactg 20 <210> 589 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 589 aagtgtagtc tcctggtgct 20 550 <210> 590

<211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 590 caaaattcag tctggatggg 20 <210> 591 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 591 gggaaactac ggctagaacc 20 <210> 592 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 592 ctgcatgtgg ctggtaacct 20 <210> 593 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 593 ccatgaccat cgatgcacat 20 551 <210> 594 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 594 atgggaaact cgctctctgg <210> 595 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 595 agtcatcatc tcgtgtctag <210> 596 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 596 gaatacagcc aggacttgga <210> 597 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 597 ggcgtggagc ttactggacg 552 20 <210> 598 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 598 gagatgagag atgccgttga <210> 599 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 599 agtcttgatg agcactatca <210> 600 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 600 ctaagtacca aatcagaatc 20 20 <210> 601 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 601 gtccatgagt taatcgagag 553 20 <210> 602 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 602 aggccacagt tgcagtgtat <210> 603 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 603 tctgattggt ggactcttgc <210> 604 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 604 gaagtcagtc ttcaggctct <210> 605 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 605 ccagattctc agatgaggga 554 <210> 606 <211> 20

<212> ADN <213> Η. sapiens <400> 606 catctgtcat tgatgcactg <210> 607 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 607 aggagatgtc aagggttcgg <210> 608 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 608 ggaactattg ctagtgaggc <210> 609 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 609 ctctctccat ggcaaatgtc 555 20 <210> 610 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 610 caccgtgact tcagtgcaga <210> 611 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 611 actgagttga gggtccggga <210> 612 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 612 cacatatgaa ctggacctgc <210> 613 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 613 tctgaactca gaaggatggc 20 20 20 556 20 <210> 614 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 614 ggtgcgaagc agactgaggc <210> 615 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 615 tcccaccggg acctgcgggg <210> 616 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 616 caccgggacc tgcggggctg <210> 617 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 617 ctgagtgccc ttctcggttg 20 20 20 557 <210> 618 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 618 ctcggttgct gccgctgagg <210> 619 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 619 tcggttgctg ccgctgagga <210> 620 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 620 cggttgctgc cgctgaggag <210> 621 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 621 gttgctgccg ctgaggagcc 558 <210> 622 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 622 ctgccgctga ggagcccgcc 20 <210> 623 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 623 accgcagctg gcgatggacc 20 <210> 624 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <4 0 0> 624 cagctggcga tggacccgcc 20 <210> 625 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 625 gaacttacta tcatcctcta 20 559

<210> 626 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 626 tccaattgaa ctttcacata 20 <210> 627 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 627 aaaattcaaa ctgcctatat 20 <210> 628 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 628 gataaaacca tacagtgagc 20 <210> 629 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 629 ataaaaccat acagtgagcc 20 560 <210> 630 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 630 aaccatacag tgagccagcc <210> 631 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 631 accatacagt gagccagcct <210> 632 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 632 ccatacagtg agccagcctt <210> 633 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 633 gtgagccagc cttgcagtag 561 <210> 634 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 634 ccagccttgc agtaggcagt <210> 635 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 635 taggcagtag actataagca <210> 636 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 636 gcagtagact ataagcagaa <210> 637 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 637 tgaactggac. ctgcaccaaa 562 <210> 638 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 638 ctggacctgc accaaagctg <210> 639 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 639 ggacctgcac caaagctggc <210> 640 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 640 ctgcaccaaa gctggcacca <210> 641 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 641 accaaagctg gcaccagggc 563 <210> 642 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 642 ctcggaaggt ctctgaactc <210> 643 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 643 aactcagaag gatggcattt <210> 644 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 644 ctcagaagga tggcattttt <210> 645 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 645 atcaggatct gagttatttt 564 <210> 646 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 646 aggatctgag ttattttgct <210> 647 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 647 ctgagttatt ttgctaaact <210> 648 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 648 attttgctaa acttggggga <210> 649 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 649 taaacttggg ggaggaggaa 565 <210> 650 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 650 ggaacaaata aatggagtct <210> 651 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 651 gtrtgtaact caagcagaag <210> 652 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 652 ttgtaactca agcagaaggt <210> 653 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 653 gtaactcaag cagaaggtgc 566 <210> 654 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 654 aactcaagca gaaggtgcga <210> 655 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 655 ctcaagcaga aggtgcgaag <210> 656 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 656 caagcagaag gtgcgaagca <210> 657 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 657 agcagaaggt gcgaagcaga 567 <210> 658 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 658 cagaaggtgc gaagcagact <210> 659 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 659 gaaggtgcga agcagactga <210> 660 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 660 aggtgcgaag cagactgagg <210> 6 61 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 6 61 gtgcgaagca gactgaggct 568 20 <210> 662 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 662 gcgaagcaga ctgaggctac <210> 663 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 663 gaagcagact gaggctacca <210> 6 6 4 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 66 4 agcagactga ggctaccatg <210> 665 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 665 cagactgagg ctaccatgac 20 20 20 569 <210> 666 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 6 6 6 gactgaggct accatgacat <210> 667 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 667 ctgaggctac catgacattc <210> 668 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 668 gaggctacca tgacattcaa <210> 66 9 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 6 6 9 ggctaccatg acattcaaat 20 570 <210> 670 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 670 ctaccatgac attcaaatat 20 <210> 671 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 671 cctgaagctg catgtggctg 20 <210> 672 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 672 tgaagctgca tgtggctggt 20 <210> 673 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 673 aagctgcatg tggctggtaa 20 571 <210> 674 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 674 gctgcatgtg gctggtaacc <210> 675 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 675 tgcatgtggc tggtaaccta <210> 676 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 676 catgtggctg gtaacctaaa <210> 677 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 677 tgtggctggt aacctaaaag 572 <210> 678 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <4 0 0> 678 tggctggtaa cctaaaagga <210> 679 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 679 gctggtaacc taaaaggagc <210> 680 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 680 tggtaaccta aaaggagcct <210> 681 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 681 gtaacctaaa aggagcctac 573 <210> 682 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 682 aacctaaaag gagcctacca <210> 683 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 683 cctaaaagga gcctaccaaa <210> 684 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 684 ggcgcgaagc agactgaggc <210> 685 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 685 cactatgttc atgagggagg 574 <210> 686 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 686 ccatcatagg ttctgacgtc <210> 687 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 687 gaagctgatt gactcactca <210> 688 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 688 ttgtaactca agcagaaggc <210> 689 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 689 gtaactcaag cagaaggcgc 575 <210> 690 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 690 aactcaagca gaaggcgcga <210> 691 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 691 ctcaagcaga aggcgcgaag <210> 692 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 692 cagaaggcgc gaagcagact <210> 693 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 693 gaaggcgcga agcagactga 576 <210> 6 9 4 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 6 9 4 aggcgcgaag cagactgagg <210> 6 9 5 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 6 9 5 gcgcgaagca gactgaggct <210> 6 9 6 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 6 96 gaagcagact gaggctacca <210> 697 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 697 cagaaggcgc gaagcagact 577 20 <210> 698 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 698 tctttctcct gtcttacaga <210> 6 9 9 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <4 0 0> 6 9 9 cccacgttag aagatgcgac 20 <210> 700 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 700 aatatggtag acatgagcca 20 <210> 701 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 701 cattagctgc atttcaactg 578 20 <210> 702 <211> 20

<212> ADN <213> Η. sapiens <400> 702 actttcactc ctagtctgca <210> 703 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 703 ccatgtccag gtaagtcatg <210> 704 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 704 gcaccaggca cggatgtgac <210> 705 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 705 gtggggtccc agaggcactg 579 <210> 706 <211> 20

<212> ADN <213> Η. sapiens <400> 706 gctgatcggc cactgcagct <210> 707 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 707 tccacgtggc tggggaggtc <210> 708 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 708 tgtaatgtat ggtgatcaga <210> 709 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 709 gagagtaccc agtgggaaat 580 20 <210> 710 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 710 agtcagcatg ggcttcagcc <210> 711 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 711 caaaagaatg actgtccaac <210> 712 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 712 gaatgactgt ccaacaagtg <210> 713 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 713 tatctactgt aatttaaaat 20 20 20 581 <210> 714 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 714 ctgatatggg tggagaacag <210> 715 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 715 tctgggacag gtatgagctc <210> 716 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 716 tgatagcagt ggcccttgaa <210> 717 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 717 ggattggcgt gaaatactgg 582 <210> 718 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 718 tgcccgaggt tcctcctgcc <210> 719 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <4 0 0> 719 gcactagcaa gaccacactc <210> 720 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 720 caagaccaca ctctgcatag <210> 721 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 721 tcctccatag gataccgtgt 583 <210> 722 <211> 20

<212> ADN <213> Η. sapiens <400> 722 ggatgtaggg cagcaaaacc 20 <210> 723 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 723 tctgcacaag gactccttgt 20 <210> 724 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens 20 <400> 724 cagcctgtct cagtgaacat <210> 725 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 725 caggatgctt ccagtctaat 584 20 <210> 726 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 726 aaatgctcgt ctccaatctc <210> 727 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 727 aacttgtgta tccaaatcca <210> 728 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 728 tgacatggtg tgcttccttg <210> 729 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 729 acactggtgt tctggctacc 585 <210> 730 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 730 gtgttctgge isacctctagt <210> 731 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 731 tcctggcata ggtcacagta <210> 732 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 732 atgtcaacag tagcacctcc <210> 733 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 733 tagactcaga caagtctgga 586 <210> 734 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 734 cctaagttgc tcatctctgg <210> 735 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 735 tgcgctgagt tccatgaaac <210> 736 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 736 ctattgcagg tgctctccag <210> 737 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 737 cagaggaaca tcttgcacct 587 <210> 738 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 738 ctctgctcct tactcttgtg <210> 739 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <4 0 0> 739 gtaatttctc accatccatc <210> 740 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 740 ttctgagtct caattgtcta < 210 > 741 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 741 ctatgtcctt gtgtgcacat. <210> 742 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 742 gcctattgcc atttgtatgt 20 <210> 743 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 743 ctattcatgt cctttgccta 20 <210> 744 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <4 0 0> 744 gattctgcgg gtaatctcag 20 <210> 745 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 745 tcaatgcagg tcattggaaa 20 589 <210> 746 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 746 ctaccagatt gaccatccct <210> 747 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <40 0> 747 tacttgatag tgctctagga <210> 748 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 748 ttgactgcag gaccaggagg <210> 749 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 749 aacaaacact tgtgcaaatg 20 590 <210> 750 <211> 20

<212> ADN <213> Η. sapiens <400> 750 aatgagacca aacttccact 20 <210> 751 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens 20 20 <400> 751 ttccactttg aagctagcaa <210> 752 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 752 gatctggagc ttattcttga <210> 753 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 753 acctcatgtg acttgtatgc 591 20 <210> 754 <211> 20

<212> ADN <213> Η. sapiens <400> 754 ttcttaagaa acaccttgta 20 <210> 755 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 755 taggcccatc ctggctgcat 20 <210> 756 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens 20 <400> 756 aaactctcag gatatggtaa <210> 757 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 757 ataccttcct ctacctttgc 592 20 20 <210> 758 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 758 tacctttgct gaaggtcctt <210> 759 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens 20 <400> 759 atctatctag tgaaatttct <210> 760 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens 20 <400> 760 tcagctcatc aaaatatgct <210> 761 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 761 atatgctagt ccttcctttc 593 20 <210> 762 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 762 caaaggtctg agttatccag <210> 763 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 763 tgacttatag atgcaggctg <210> 764 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 764 tcagtggagg gtaattcttt <210> 765 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 765 tgcctagcca gtttgaaaga 594 <210> 766 <211> 20

<212> ADN <213> Η. sapiens <400> 766 cctgcagaat tttgccaggc <210> 767 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 767 gtagctaggt aggtaaagca <210> 768 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 768 ttgagtgaga cacacaaggt <210> 769 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 769 gtgctagtca gggaatgcat 595 20 20 <210> 770 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 770 ggggagagag catgcccagc <210> 771 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 771 gcatgcccag ctgcgaaagc <210> 772 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 772 agccaggtat agaaaggagt <210> 773 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 773 aactttctaa gaggcagaat 20 20 20 596 <210> 774 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 774 tcttagtctg gtcatgagtg <210> 775 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 775 agtaggagat ttcatatgaa <210> 776 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 776 tcttcaccag caacacatta <210> 777 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 777 atggccacct agcatggcac 597 <210> 778 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 778 catgtttctg agcctccaga <210> 779 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 779 taggtggctc cctgtcttca <210> 780 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 780 tccaaagtct tgggaatcct <210> 781 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 781 acaaagaaag ggggagttgg 598 20 <210> 782 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 782 tcgtgtcttc ctggcccaga <210> 783 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 783 gcagtgccca gcacacaata <210> 784 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 784 actcgtccag gtgcgaagca <210> 785 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 785 gccacctaag gtaaagaagg 20 20 20 599 <210> 786 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 786 atcagagtgg cagagagagc <210> 787 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 787 tttaccatag ttgtgacaca <210> 788 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 788 cattttgtag gcaatgagct <210> 789 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 789 gcattagtaa acatgagaac 600 <210> 790 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 790 ttcatttcag cgatggccgg <210> 791 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 791 gaaaatctag tgtcattcaa <210> 792 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 792 tcctatacag ttttgggaac <210> 793 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 793 aaggacttca gtatggagct 20 601 <210> 794 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 794 atggagcttt tattgaattg <210> 795 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 795 ccatcagcac tattatttat <210> 796 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 796 ataggcaagc tcagccatag <210> 797 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 797 tgctagatga gatacatcaa 602 <210> 798 <211> 20 <212> ADN <213> Η. sapiens <400> 798 gaagaccaaa catggttcta <210> 799 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 799 ctctgtttag tcctctccag <210> 800 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens < 4 0 0 > 800 cattgataaa atgttctggc <210> 801 <211 > 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 801 tctggcacag caaaacctct 603

<210> 802 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 802 tggcacagca aaacctctag 20

<210> 803 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 803 tagaacacat agtgtgattt 20 <210> 804 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 804 aacacatagt gtgatttaag 20 <210> 805 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 604 20

< 4 Ο Ο > 805 ctttccgttg gacccctggg <210> 806 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 20 <400> 806 tcccgcctgt gacatgcatt

<210> 807 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 807 20 ttctacctcg cgcgatttac

<210> 808 <211> 432 <212> ADN <213> Ο. cuniculus 605 <400> 808 gatcttacct tctccaagca tcactgaggt tctteaccct gctgacatct tgggcactga ggccaaaatg gagtatctac gagaatgagc tgaacgcaga ggccgcttca aggaacacaa ttatccctgg gaagcgctta aacttcaaga tc aaatgcattg gctttctggg caaaatgaat cagtgcaaca gcttgccctt tgcaaaattc ccaggccatg ctacgtgctg ttgttgaata actgctgctc accagcttga tctggggcat agcctagatg attctgggtg agtatcaggc cccatggtct acaaggcaac ggtacagtcc ctatgaaatt ggaaagctac ctgacagcaa tgattacaag 60 tgaattaaat 120 tctaagaatt 180 cctgatgctg 240 agcaacaaat 300 cctcacagag 360 gaacattttc 420 432

<210> 809 <211> 660 <212> ADN <213> O. cuniculus <400> 809 ctgggaaaac tcccacagca gtttccagtg ccaaggagaa gatatacaaa ctgcattgga cagacatatg tgatataatt aaaatagcta tagctagtat cgttatcata tccgtgcaca gctattgatt ttaacaaaat aagtatcaag tcagaatctg aatacaaaca tcccatacct agagtgcttt tagatcaatt gaacatttca aatactttgt agttaatgat tatctgagta actaactact ttcacaaaaa taatgccaaa atcaacttaa tgatcagtat attaaagata tatagatcaa atcatggaaa tttaattaaa tcaatccata tggaagtagt actgcatctt gatacaagaa atattgcaac ggctgaaaaa ctgaaacaac gagaactaca attccatttc tataaatatt attgaaaatt cattcaattg ggagagacaa 60 attataaaat tacagagaat 120 atgaaaaact gtctcaactt 180 attttgatct acatgatttt 240 aattaaaaat tcttgatgaa 300 atttatattt gtttattgaa 360 ggattcaaaa tgtggatacc 420 agtttaagac acagattcag 480 agattgaggc tattgatgtc 540 gtataataaa ggacattatt 600 ttgaagtaat tgacaaaatc 660

<210> 810 <211> 543 <212> ADN <213> O. cuniculus 606 <22 0> <221> característica_misc <222> (45) <223> n = a, c, g ou t <220> <221> característica_misc <222> (118) <223> n = a, c, g ou t <220> <221> característica_misc <222> (148) <223> n = a, c, g ou t <220> <221> característica_misc <222> (173) <223> n = a, c, g ou t <220> <221> característica_misc <222> (180) <223> n = a, c, g ou t <400> 810 cagaacatcg gagacaacgc attggatttt ctcactaaat cttanaatga agcaaaaatt 60 aagtttgata agtacaaagt tgaaaaatcg ctcaacaggc tccccaggac ctttcagnct 120 cctggataca ttattccaat tttcaatntt gaagtatctc cactcacaat agnagacgtn 180 agcattcagt catgtgatcc caaaatcaat aagcaccccc aatgtcacca tcctggattc 240 aagcttctat gtgccttcat atacattggc tctgccatcc ctagagctgc cagtcttcca B00 607 tgtccccagg aatctactca aggtctctct tccagatttc aaggaattga aaaccattaa 360 caatattttt attccagcca tgggcaacat tacctatgaa ttttccttca aatcaacgat 420 cattacactg aataccaatg ctggacttta taaccaatca gacattgttg cccatatcct 480 ttcttcctct tcatctgtca ttgatgcact acagtacaaa ttagagggca cgctcaagtt 540 tga 543 <210> 811 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador <400> 811 aagcaccccc aatgtcacc 19 <210> 812 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador <400> 812 gggatggcag agccaatgta 20 <210> 813 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial 608 <223> Probe <400> 813 tcctggattc aagcttctat gtgccttca

<210> 814 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 814 tgcttggaga aggtaagatc <210> 815 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 815 gcgttgtctc cgatgttctg <210> 816 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 816 taatcattaa cttgctgtgg

<210> 817 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 817 20 tcagcacgta gcaatgcatt

<210> 818 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 818

gcctgatact cagcacgtag <210> 819 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 610 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 819 caattgaatg tactcagata

<210> 820 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 820 acctcagtga cttgtaatca <210> 821 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 821 cactggaaac ttgtctctcc <210> 822

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 822 agtagttagt ttctccttgg

<210> 823 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 823 20 tcagtgccca agatgtcagc

<210> 824 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 824 attggaataa tgtatccagg

<210> 825 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 612 20 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 825 ttggcattat ccaatgcagt

<210> 826 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 826 20 gttgccttgt gagcagcagt

<210> 827 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 827 attgtgagtg gagatacttc

<210> 828 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 613 20 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 828 catatgtctg aagttgagac

<210> 829 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 829 20 gtagatactc cattttggcc

<210> 830 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 830 20 ggatcacatg actgaatgcc

<210> 831 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 614 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 831 tcaagctggt tgttgcactg

<210> 832 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 832 20 ggactgtacc tcaagctggt

<210> 833 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 833 20 gctcattctc cagcatcagg

<210> 834 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 615 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 834 ttgatctata atactagcta 20

<210> 835 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 835 atggaagact ggcagctcta 20 <210> 836 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 836 ttgtgttcct tgaagcggcc 20

<210> 837 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 616 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 837 tgtgcacgga tatgataacg 20

<210> 838 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 838 gaccttgagt agattcctgg 20

<210> 839 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 839 gaaatctgga agagagacct 20

<210> 840 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 617 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 840 gtagctttcc catctaggct

<210> 841 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 841 gataactctg tgagggtagc

<210> 842 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 842 atgttgccca tggctggaat

<210> 843 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 843 aagatgcagt actacttcca <210> 844 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 844 gcacccagaa tcatggcctg 20

<210> 845 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 845 cttgatactt ggtatccaca 20 <210> 846

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 619 <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 846 cagtgtaatg atcgttgatt

<210> 847 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 847 taaagtccag cattggtatt <210> 848 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 848 caacaatgtc tgattggtta

<210> 849 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 20 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 849 gaagaggaag aaaggatatg <210> 850 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 850 tgacagatga agaggaagaa 20

<210> 851 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 851 20 ttgtactgta gtgcatcaat

<210> 852 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 621 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 852 gcctcaatct gttgtttcag 20

<210> 853 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <40 0> 853 acttgagcgt gccctctaat 20 <210> 854 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 854 gaaatggaat tgtagttctc 20 <210> 855 <211> 479 <212> ADN <213> M. fascicularis 622 <220> <221> característica_misc <222> (7) <223> η = A, Τ, C ou G <220> <221> característica_misc <222>(469)..(474)

<223> η = A, Τ, C ou G <22 0> <221> característica_misc <222> (476)..( 479)

<223> n = A, T, C ou G <400> 855 tgaccgggga caccagatta gagctggaac 60 ctgtcagtgc aacctatgag ctccagagag 120 ttgtaactca agcagaaggt gtaaagcaga 180 ggcagagtat gaccttgtcc agtgaagtcc 240 caatcctcag agttaatgat gaatctactg 300 acattcagaa ccagaaaatt actgaggtca 360 aggaagaagg aaaaatcaaa ggtgttattt 420 gtgagatcct cgcccacann nnnnannnn 479 tgcgtcnaga ctccgccccc tactatccgc tgaggcctac aggagaagtt gagcagtatt aggacagagc cttggtggac accctgaagt ctgaggctac catgacattc aaatataatc aaattccgga ttttgaggtt gaccttggaa agggcagaaa gtcttacaga ctcaccctgg ccctcatggg ccacctaagt tgtgacacaa ccgtaccccg tttgcaagca gaagccagaa

<210> 856 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 623 <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 856 gtccctcaac atctgaatgc 20 <210> 857 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 857 ctgctagcct ctggatttga 20 <210> 858 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 858 ccttccctga aggttcctcc 20 624 <210> 859

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 859 ctcttactgt gctgtggaca 20 <210> 860 <211> 13938 <212> ADN <213> H. sapiens <400> 860 ctgggattgg gacacacttt gtggttcttc tacttctttt caggattgct accatggtga ggaaggacct gccaagcttg aactacccaa atgctggctt ccttattgtt atacgaggga tcagacgcag aagggactgc gctccttccg aacaagcacc aatggacaga gttatcgagg tggtcatcta tgacaccaca ttgatcatga actactgcag gatcccggtg tcaggtggga gccgtcgcgc ctccgactgt ccgactgagc aaaggcctgg ggcacatact ccaccactgt cactcgcata gtcggacccc aggaatccag atgctgtggc gagtactgca acctgacgca gttaccccgg ttccaagcct ggggtgcagg agtgctacca gtcacaggaa gaacctgcca ccagaatact acccaaatgc gcagctcctt attgttatac caatgctcag acgcagaagg ctggacactg atttctgaaa tggacagagt gtcatctatg gatcatgaac tcccggtgtc cgtcgcgcct gactgagcaa cacatactcc ctcgcatagt gaatccagat gtactgcaac taccccggtt ggtgcaggag cacaggaaga agaatactac agctccttat atgctcagac agaggctCCt tggtaatgga agcttggtca tggcttgatc gagggatccc gactgccgtc ctggccagtc tcagcagcac tatcgaggca acaccacatc tactgcagga aggtgggagt ccgactgtta aggcctgggg accactgtca cggaccccag gctgtggcag ctgacgcaat ccaagcctag tgctaccatg acctgccaag ccaaatgctg tgttatacga gcagaaggga tccgaacaag cagagttatc tctatgacac atgaactact ggtgtcaggt gcgcctccga ccaaaatgga ctgagcaaag cgtactccac aacataatag atccagatgc actgcaacct ccccggttcc tgcaggagtg caggaagaac aatactaccc ctccttattg gctcagacgc aggctccttc gtaatggaca cttggtcatc gcttgatcat gggatcccgg ctgccgtcgc caccgactga gaggcacata cacactcgca gcaggaatcc gggagtactg ctgttacccc acataaggaa 60 ccatgtggtc 120 cactgtcaca 180 gaccacagaa 240 tgtggcagct 300 gacgcaatgc 360 aagcctagag 420 ctaccatggt 480 ctgccaagct 540 aaatgctggc 600 ttatacgagg 660 agaagggact 720 cgaacaagca 780 gagttatcga 840 tatgacacca 900 gaactactgc 960 tgtcaggtgg 1020 gcctccgact 1080 gcaaaggcct 1140 ctccaccact 1200 tagtcggacc 1260 agatgctgtg 1320 caacctgacg 1380 ggttccaagc 1440 625 ctagaggctc cttccgaaca agcaccgact gagcaaaggc ctggggtgca ggagtgctac 1500 catggtaatg gacagagtta tcgaggcaca tactccacca ctgtcacagg aagaacctgc 1560 caagcttggt catctatgac accacactcg catagtcgga ccccagaata ctacccaaat 1620 gctggcttga tcatgaacta ctgcaggaat ccagatgctg tggcagctcc ttattgttat 1680 acgagggatc ccggtgtcag gtgggagtac tgcaacctga cgcaatgctc agacgcagaa 1740 gggactgccg tcgcgcctcc gactgttacc ccggttccaa gcctagaggc tccttccgaa 1800 caagcaccga ctgagcaaag gcctggggtg caggagtgct accatggtaa tggacagagt 1860 tatcgaggca catactccac cactgtcaca ggaagaacct gccaagcttg gtcatctatg 1920 acaccacact cgcatagtcg gaccccagaa tactacccaa atgctggctt gatcatgaac 1980 tactgcagga atccagatgc tgtggcagct ccttattgtt atacgaggga tcccggtgtc 2040 aggtgggagt actgcaacct gacgcaatgc tcagacgcag aagggactgc cgtcgcgcct 2100 ccgactgtta ccccggttcc aagcctagag gctccttccg aacaagcacc gactgagcaa 2160 aggcctgggg tgcaggagtg ctaccatggt aatggacaga gttatcgagg cacatactcc 2220 accactgtca caggaagaac ctgccaagct tggtcatcta tgacaccaca ctcgcatagt 2280 cggaccccag aatactaccc aaatgctggc ttgatcatga actactgcag gaatccagat 2340 gctgtggcag ctccttattg ttatacgagg gatcccggtg tcaggtggga gtactgcaac 2400 ctgacgcaat gctcagacgc agaagggact gccgtcgcgc ctccgactgt taccccggtt 2460 ccaagcctag aggctccttc cgaacaagca ccgactgagc aaaggcctgg ggtgcaggag 2520 tgctaccatg gtaatggaca gagttatcga ggcacatact ccaccactgt cacaggaaga 2580 acctgccaag cttggtcatc tatgacacca cactcgcata gtcggacccc agaatactac 2640 ccaaatgctg gcttgatcat gaactactgc aggaatccag atgctgtggc agctccttat 2700 tgttatacga gggatcccgg tgtcaggtgg gagtactgca acctgacgca atgctcagac 2760 gcagaaggga ctgccgtcgc gcctccgact gttaccccgg ttccaagcct agaggctcct 2820 tccgaacaag caccgactga gcaaaggcct ggggtgcagg agtgctacca tggtaatgga 2880 cagagttatc gaggcacata ctccaccact gtcacaggaa gaacctgcca agcttggtca 2940 tctatgacac cacactcgca tagtcggacc ccagaatact acccaaatgc tggcttgatc 3000 atgaactact gcaggaatcc agatgctgtg gcagctcctt attgttatac gagggatccc 3060 ggtgtcaggt gggagtactg caacctgacg caatgctcag acgcagaagg gactgccgtc 3120 gcgcctccga ctgttacccc ggttccaagc ctagaggctc cttccgaaca agcaccgact 3180 gagcaaaggc ctggggtgca ggagtgctac catggtaatg gacagagtta tcgaggcaca 3240 tactccacca ctgtcacagg aagaacctgc caagcttggt catctatgac accacactcg 3300 catagtcgga ccccagaata ctacccaaat gctggcttga tcatgaacta ctgcaggaat 3360 ccagatgctg tggcagctcc ttattgttat acgagggatc ccggtgtcag gtgggagtac 3420 tgcaacctga cgcaatgctc agacgcagaa gggactgccg tcgcgcctcc gactgttacc 3480 ccggttccaa gcctagaggc tccttccgaa caagcaccga ctgagcaaag gcctggggtg 3540 caggagtgct accatggtaa tggacagagt tatcgaggca catactccac cactgtcaca 3600 ggaagaacct gccaagcttg gtcatctatg acaccacact cgcatagtcg gaccccagaa 3660 tactacccaa atgctggctt gatcatgaac tactgcagga atccagatgc tgtggcagct 3720 ccttattgtt atacgaggga tcccggtgtc aggtgggagt actgcaacct gacgcaatgc 3780 tcagacgcag aagggactgc cgtcgcgcct ccgactgtta ccccggttcc aagcctagag 3840 gctccttccg aacaagcacc gactgagcaa aggcctgggg tgcaggagtg ctaccatggt 3900 aatggacaga gttatcgagg cacatactcc accactgtca caggaagaac ctgccaagct 3960 tggtcatcta tgacaccaca ctcgcatagt cggaccccag aatactaccc aaatgctggc 4020 ttgatcatga actactgcag gaatccagat gctgtggcag ctccttattg ttatacgagg 4080 gatcccggtg tcaggtggga gtactgcaac ctgacgcaat gctcagacgc agaagggact 4140 gccgtcgcgc ctccgactgt taccccggtt ccaagcctag aggctccttc cgaacaagca 4200 ccgactgagc aaaggcctgg ggtgcaggag tgctaccatg gtaatggaca gagttatcga 4260 ggcacatact ccaccactgt cacaggaaga acctgccaag cttggtcatc tatgacacca 4320 cactcgcata gtcggacccc agaatactac ccaaatgctg gcttgatcat gaactactgc 4380 aggaatccag atgctgtggc agctccttat tgttatacga gggatcccgg tgtcaggtgg 4440 gagtactgca acctgacgca atgctcagac gcagaaggga ctgccgtcgc gcctccgact 4500 gttaccccgg ttccaagcct agaggctcct tccgaacaag caccgactga gcaaaggcct 4560 ggggtgcagg agtgctacca tggtaatgga cagagttatc gaggcacata ctccaccact 4620 gtcacaggaa gaacctgcca agcttggtca tctatgacac cacactcgca tagtcggacc 4680 ccagaatact acccaaatgc tggcttgatc atgaactact gcaggaatcc agatgctgtg 4740 gcagctcctt attgttatac gagggatccc ggtgtcaggt gggagtactg caacctgacg 4800 caatgctcag acgcagaagg gactgccgtc gcgcctccga ctgttacccc ggttccaagc 4860 ctagaggctc cttccgaaca agcaccgact gagcaaaggc ctggggtgca ggagtgctac 4920 catggtaatg gacagagtta tcgaggcaca tactccacca ctgtcacagg aagaacctgc 4980 caagcttggt catctatgac accacactcg catagtcgga ccccagaata ctacccaaat 5040 gctggcttga tcatgaacta ctgcaggaat ccagatgctg tggcagctcc ttattgttat 5100 acgagggatc ccggtgtcag gtgggagtac tgcaacctga cgcaatgctc agacgcagaa 5160 gggactgccg tcgcgcctcc gactgttacc ccggttccaa gcctagaggc tccttccgaa 5220 caagcaccga ctgagcaaag gcctggggtg caggagtgct accatggtaa tggacagagt 5280 tatcgaggca catactccac cactgtcaca ggaagaacct gccaagcttg gtcatctatg 5340 acaccacact cgcatagtcg gaccccagaa tactacccaa atgctggctt gatcatgaac 5400 tactgcagga atccagatgc tgtggcagct ccttattgtt atacgaggga tcccggtgtc 5460 aggtgggagt actgcaacct gacgcaatgc tcagacgcag aagggactgc cgtcgcgcct 5520 ccgactgtta ccccggttcc aagcctagag gctccttccg aacaagcacc gactgagcaa 5580 aggcctgggg tgcaggagtg ctaccatggt aatggacaga gttatcgagg cacatactcc 5640 626 accactgtca caggaagaac ctgccaagct tggtcatcta tgacaccaca ctcgcatagt 5700 cggaccccag aatactaccc aaatgctggc ttgatcatga actactgcag gaatccagat 5760 gctgtggcag ctccttattg ttatacgagg gatcccggtg tcaggtggga gtactgcaac 5820 ctgacgcaat gctcagacgc agaagggact gccgtcgcgc ctccgactgt taccccggtt 5880 ccaagcctag aggctccttc cgaacaagca ccgactgagc aaaggcctgg ggtgcaggag 5940 tgctaccatg gtaatggaca gagttatcga ggcacatact ccaccactgt cacaggaaga 6000 acctgccaag cttggtcatc tatgacacca cactcgcata gtcggacccc agaatactac 6060 ccaaatgctg gcttgatcat gaactactgc aggaatccag atgctgtggc agctccttat 6120 tgttatacga gggatcccgg tgtcaggtgg gagtactgca acctgacgca atgctcagac 6180 gcagaaggga ctgccgtcgc gcctccgact gttaccccgg ttccaagcct agaggctcct 6240 tccgaacaag caccgactga gcaaaggcct ggggtgcagg agtgctacca tggtaatgga 6300 cagagttatc gaggcacata ctccaccact gtcacaggaa gaacctgcca agcttggtca 6360 tctatgacac cacactcgca tagtcggacc ccagaatact acccaaatgc tggcttgatc 6420 atgaactact gcaggaatcc agatgctgtg gcagctcctt attgttatac gagggatccc 6480 ggtgtcaggt gggagtactg caacctgacg caatgctcag acgcagaagg gactgccgtc 6540 gcgcctccga ctgttacccc ggttccaagc ctagaggctc cttccgaaca agcaccgact 6600 gagcaaaggc ctggggtgca ggagtgctac catggtaatg gacagagtta tcgaggcaca 6660 tactccacca ctgtcacagg aagaacctgc caagcttggt catctatgac accacactcg 6720 catagtcgga ccccagaata ctacccaaat gctggcttga tcatgaacta ctgcaggaat 6780 ccagatgctg tggcagctcc ttattgttat acgagggatc ccggtgtcag gtgggagtac 6840 tgcaacctga cgcaatgctc agacgcagaa gggactgccg tcgcgcctcc gactgttacc 6900 ccggttccaa gcctagaggc tccttccgaa caagcaccga ctgagcaaag gcctggggtg 6960 caggagtgct accatggtaa tggacagagt tatcgaggca catactccac cactgtcaca 7020 ggaagaacct gccaagcttg gtcatctatg acaccacact cgcatagtcg gaccccagaa 7080 tactacccaa atgctggctt gatcatgaac tactgcagga atccagatgc tgtggcagct 7140 ccttattgtt atacgaggga tcccggtgtc aggtgggagt actgcaacct gacgcaatgc 7200 tcagacgcag aagggactgc cgtcgcgcct ccgactgtta ccccggttcc aagcctagag 7260 gctccttccg aacaagcacc gactgagcaa aggcctgggg tgcaggagtg ctaccatggt 7320 aatggacaga gttatcgagg cacatactcc accactgtca caggaagaac ctgccaagct 7380 tggtcatcta tgacaccaca ctcgcatagt cggaccccag aatactaccc aaatgctggc 7440 ttgatcatga actactgcag gaatccagat gctgtggcag ctccttattg ttatacgagg 7500 gatcccggtg tcaggtggga gtactgcaac ctgacgcaat gctcagacgc agaagggact 7560 gccgtcgcgc ctccgactgt taccccggtt ccaagcctag aggctccttc cgaacaagca 7620 ccgactgagc aaaggcctgg ggtgcaggag tgctaccatg gtaatggaca gagttatcga 7680 ggcacatact ccaccactgt cacaggaaga acctgccaag cttggtcatc tatgacacca 7740 cactcgcata gtcggacccc agaatactac ccaaatgctg gcttgatcat gaactactgc 7800 aggaatccag atgctgtggc agctccttat tgttatacga gggatcccgg tgtcaggtgg 7860 gagtactgca acctgacgca atgctcagac gcagaaggga ctgccgtcgc gcctccgact 7920 gttaccccgg ttccaagcct agaggctcct tccgaacaag caccgactga gcagaggcct 7980 ggggtgcagg agtgctacca cggtaatgga cagagttatc gaggcacata ctccaccact 8040 gtcactggaa gaacctgcca agcttggtca tctatgacac cacactcgca tagtcggacc 8100 ccagaatact acccaaatgc tggcttgatc atgaactact gcaggaatcc agatgctgtg 8160 gcagctcctt attgttatac gagggatccc ggtgtcaggt gggagtactg caacctgacg 8220 caatgctcag acgcagaagg gactgccgtc gcgcctccga ctgttacccc ggttccaagc 8280 ctagaggctc cttccgaaca agcaccgact gagcaaaggc ctggggtgca ggagtgctac 8340 catggtaatg gacagagtta tcgaggcaca tactccacca ctgtcacagg aagaacctgc 8400 caagcttggt catctatgac accacactcg catagtcgga ccccagaata ctacccaaat 8460 gctggcttga tcatgaacta ctgcaggaat ccagatgctg tggcagctcc ttattgttat 8520 acgagggatc ccggtgtcag gtgggagtac tgcaacctga cgcaatgctc agacgcagaa 8580 gggactgccg tcgcgcctcc gactgttacc ccggttccaa gcctagaggc tccttccgaa 8640 caagcaccga ctgagcaaag gcctggggtg caggagtgct accatggtaa tggacagagt 8700 tatcgaggca catactccac cactgtcaca ggaagaacct gccaagcttg gtcatctatg 8760 acaccacact cgcatagtcg gaccccagaa tactacccaa atgctggctt gatcatgaac 8820 tactgcagga atccagatgc tgtggcagct ccttattgtt atacgaggga tcccggtgtc 8880 aggtgggagt actgcaacct gacgcaatgc tcagacgcag aagggactgc cgtcgcgcct 8940 ccgactgtta ccccggttcc aagcctagag gctccttccg aacaagcacc gactgagcag 9000 aggcctgggg tgcaggagtg ctaccacggt aatggacaga gttatcgagg cacatactcc 9060 accactgtca ctggaagaac ctgccaagct tggtcatcta tgacaccaca ctcgcatagt 9120 cggaccccag aatactaccc aaatgctggc ttgatcatga actactgcag gaatccagat 9180 gctgtggcag ctccttattg ttatacgagg gatcccggtg tcaggtggga gtactgcaac 9240 ctgacgcaat gctcagacgc agaagggact gccgtcgcgc ctccgactgt taccccggtt 9300 ccaagcctag aggctccttc cgaacaagca ccgactgagc agaggcctgg ggtgcaggag 9360 tgctaccacg gtaatggaca gagttatcga ggcacatact ccaccactgt cactggaaga 9420 acctgccaag cttggtcatc tatgacacca cactcgcata gtcggacccc agaatactac 9480 ccaaatgctg gcttgatcat gaactactgc aggaatccag atgctgtggc agctccttat 9540 tgttatacga gggatcccgg tgtcaggtgg gagtactgca acctgacgca atgctcagac 9600 gcagaaggga ctgccgtcgc gcctccgact gttaccccgg ttccaagcct agaggctcct 9660 tccgaacaag caccgactga gcagaggcct ggggtgcagg agtgctacca cggtaatgga 9720 cagagttatc gaggcacata ctccaccact gtcactggaa gaacctgcca agcttggtca 9780 tctatgacac cacactcgca tagtcggacc ccagaatact acccaaatgc tggcttgatc 9840 627 atgaactact gcaggaatcc agatgctgtg gcagctcctt attgttatac gagggatccc 9900 ggtgtcaggt gggagtactg caacctgacg caatgctcag acgcagaagg gactgccgtc 9960 gcgcctccga ctgttacccc ggttccaagc ctagaggctc cttccgaaca agcaccgact 10020 gagcagaggc ctggggtgca ggagtgctac cacggtaatg gacagagtta tcgaggcaca 10080 tactccacca ctgtcactgg aagaacctgc caagcttggt catctatgac accacactcg 10140 catagtcgga ccccagaata ctacccaaat gctggcttga tcatgaacta ctgcaggaat 10200 ccagatcctg tggcagcccc ttattgttat acgagggatc ccagtgtcag gtgggagtac 10260 tgcaacctga cacaatgctc agacgcagaa gggactgccg tcgcgcctcc aactattacc 10320 ccgattccaa gcctagaggc tccttctgaa caagcaccaa ctgagcaaag gcctggggtg 10380 caggagtgct accacggaaa tggacagagt tatcaaggca catacttcat tactgtcaca 10440 ggaagaacct gccaagcttg gtcatctatg acaccacact cgcatagtcg gaccccagca 10500 tactacccaa atgctggctt gatcaagaac tactgccgaa atccagatcc tgtggcagcc 10560 ccttggtgtt atacaacaga tcccagtgtc aggtgggagt actgcaacct gacacgatgc 10620 tcagatgcag aatggactgc cttcgtccct ccgaatgtta ttctggctcc aagcctagag 10680 gctttttttg aacaagcact gactgaggaa acccccgggg tacaggactg ctactaccat 10740 tatggacaga gttaccgagg cacatactcc accactgtca caggaagaac ttgccaagct 10800 tggtcatcta tgacaccaca ccagcatagt cggaccccag aaaactaccc aaatgctggc 10860 ctgaccagga actactgcag gaatccagat gctgagattc gcccttggtg ttacaccatg 10920 gatcccagtg tcaggtggga gtactgcaac ctgacacaat gcctggtgac agaatcaagt 10980 gtccttgcaa ctctcacggt ggtcccagat ccaagcacag aggcttcttc tgaagaagca 11040 ccaacggagc aaagccccgg ggtccaggat tgctaccatg gtgatggaca gagttatcga 11100 ggctcattct ctaccactgt cacaggaagg acatgtcagt cttggtcctc tatgacacca 11160 cactggcatc agaggacaac agaatattat ccaaatggtg gcctgaccag gaactactgc 11220 aggaatccag atgctgagat tagtccttgg tgttatacca tggatcccaa tgtcagatgg 11280 gagtactgca acctgacaca atgtccagtg acagaatcaa gtgtccttgc gacgtccacg 11340 gctgtttctg aacaagcacc aacggagcaa agccccacag tccaggactg ctaccatggt 11400 gatggacaga gttatcgagg ctcattctcc accactgtta caggaaggac atgtcagtct 11460 tggtcctcta tgacaccaca ctggcatcag agaaccacag aatactaccc aaatggtggc 11520 ctgaccagga actactgcag gaatccagat gctgagattc gcccttggtg ttataccatg 11580 gatcccagtg tcagatggga gtactgcaac ctgacgcaat gtccagtgat ggaatcaact 11640 ctcctcacaa ctcccacggt ggtcccagtt ccaagcacag agcttccttc tgaagaagca 11700 ccaactgaaa acagcactgg ggtccaggac tgctaccgag gtgatggaca gagttatcga 11760 ggcacactct ccaccactat cacaggaaga acatgtcagt cttggtcgtc tatgacacca 11820 cattggcatc ggaggatccc attatactat ccaaatgctg gcctgaccag gaactactgc 11880 aggaatccag atgctgagat tcgcccttgg tgttacacca tggatcccag tgtcaggtgg 11940 gagtactgca acctgacacg atgtccagtg acagaatcga gtgtcctcac aactcccaca 12000 gtggccccgg ttccaagcac agaggctcct tctgaacaag caccacctga gaaaagccct 12060 gtggtccagg attgctacca tggtgatgga cggagttatc gaggcatatc ctccaccact 12120 gtcacaggaa ggacctgtca atcttggtca tctatgatac cacactggca tcagaggacc 12180 ccagaaaact acccaaatgc tggcctgacc gagaactact gcaggaatcc agattctggg 12240 aaacaaccct ggtgttacac aaccgatccg tgtgtgaggt gggagtactg caatctgaca 12300 caatgctcag aaacagaatc aggtgtccta gagactccca ctgttgttcc agttccaagc 12360 atggaggctc attctgaagc agcaccaact gagcaaaccc ctgtggtccg gcagtgctac 12420 catggtaatg gccagagtta tcgaggcaca ttctccacca ctgtcacagg aaggacatgt 12480 caatcttggt catccatgac accacaccgg catcagagga ccccagaaaa ctacccaaat 12540 gatggcctga caatgaacta ctgcaggaat ccagatgccg atacaggccc ttggtgtttt 12600 accatggacc ccagcatcag gtgggagtac tgcaacctga cgcgatgctc agacacagaa 12660 gggactgtgg tcgctcctcc gactgtcatc caggttccaa gcctagggcc tccttctgaa 12720 caagactgta tgtttgggaa tgggaaagga taccggggca agaaggcaac cactgttact 12780 gggacgccat gccaggaatg ggctgcccag gagccccata gacacagcac gttcattcca 12840 gggacaaata aatgggcagg tctggaaaaa aattactgcc gtaaccctga tggtgacatc 12900 aatggtccct ggtgctacac aatgaatcca agaaaacttt ttgactactg tgatatccct 12960 ctctgtgcat cctcttcatt tgattgtggg aagcctcaag tggagccgaa gaaatgtcct 13020 ggaagcattg taggggggtg tgtggcccac ccacattcct ggccctggca agtcagtctc 13080 agaacaaggt ttggaaagca cttctgtgga ggcaccttaa tatccccaga gtgggtgctg 13140 actgctgctc actgcttgaa gaagtcctca aggccttcat cctacaaggt catcctgggt 13200 gcacaccaag aagtgaacct cgaatctcat gttcaggaaa tagaagtgtc taggctgttc 13260 ttggagccca cacaagcaga tattgccttg ctaaagctaa gcaggcctgc cgtcatcact 13320 gacaaagtaa tgccagcttg tctgccatcc ccagactaca tggtcaccgc caggactgaa 13380 tgttacatca ctggctgggg agaaacccaa ggtacctttg ggactggcct tctcaaggaa 13440 gcccagctcc ttgttattga gaatgaagtg tgcaatcact ataagtatat ttgtgctgag 13500 catttggcca gaggcactga cagttgccag ggtgacagtg gagggcctct ggtttgcttc 13560 gagaaggaca aatacatttt acaaggagtc acttcttggg gtcttggctg tgcacgcccc 13620 aataagcctg gtgtctatgc tcgtgtttca aggtttgtta cttggattga gggaatgatg 13680 agaaataatt aattggacgg gagacagagt gaagcatcaa cctacttaga agctgaaacg 13740 tgggtaagga tttagcatgc tggaaataat agacagcaat caaacgaaga cactgttccc 13800 agctaccagc tatgccaaac cttggcattt ttggtatttt tgtgtataag cttttaaggt 13860 ctgactgaca aattctgtat taaggtgtca tagctatgac atttgttaaa aataaactct 13920 gcacttattt tgatttga 13938 628 <210> 861

<211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 861 cagctcctta ttgttatacg aggga 25

<210> 862 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador de PCR <400> 862 tgcgtctgag cattgcgt

<210> 863 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Sonda de PCR <400> 863 cccggtgtca ggtgggagta ctgc 629 24

<210> 864 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 20 <400> 864 gcctcagtct tcttcgcacc

<210> 865 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido 20 <400> 865 gcctcagtct tattcgcacc

<210> 866 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 866 gcctcagtat tattcgcacc 630 20 <210> 867

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 867 gcctcattat tattcgcacc 20 <210> 868 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 868 gcctcattat tattagcacc

<210> 869 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 869 gcctcattat tattatcacc 631

<210> 870 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 870 gcctaattat tattatcacc

<210> 871 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 871 gcctcagtct gcttcgcac

<210> 872 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 872 gcctcagtct gcttcgca 632 <210> 873

<211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 873 gcctcagtct gcttc <210> 874 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 874 cctcagtctg cttcgcac <210> 875 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 875 16 ctcagtctgc ttcgca 633 <210> 876

<211> 14 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 876 tcagtctgct tcgc <210> 877 <211> 10 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 877 gcctcagtct <210> 878 <211> 10 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 878 gcttcgcacc 10 634

<210> 879 <211> 20 <212> RNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 879 uugaagccau acaccucuuu

<210> 880 <211> 20 <212> RNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 880 ugaccaggac ugccuguucu

<210> 881 <211> 20 <212> RNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 881 gaauagggcu guagcuguaa 635 <210> 882

<211> 20 <212> RNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 882 uauacugauc aaauuguauc <210> 883 <211> 20 <212> RNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 883 uggaauucug guaugugaag <210> 884 <211> 20 <212> RNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 884 aaaucaaaug auugcuuugu 20 636 <210> 885

<211> 20 <212> RNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 885 gugaugacac uugauuuaaa 20

<210> 886 <211> 20 <212> RNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 886 gaagcugccu cuucuuccca 20

<210> 887 <211> 20 <212> RNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 887 gagaguuggu cugaaaaauc 20 637

<210> 888 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 888 gtgcgcgcga gcccgaaatc 20 <210> 889 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 889 cuucuggcau ccgguuuagt t 21 <210> 890 <211> 46 6 <212> ADN <213> M. fascicularis <22 0> <221> característica_misc <222> 9 <223> n = A, T, C ou G 638 <400> 890 ggatcggcng accctgagct gcatatggct ggtaatctaa aaggagccta ccaaaataat 60 gaaataaaac acatctatac catctcttct gctgccttat cagcaagcta caaagcagac 120 actgttgcta aggttcaggg tgtggagttt agccatcggc tcaacacaga catcgctggg 180 ctggcttcag ccattgacat tagcacaaac tataattcag actcattgca tttcagcaat 240 gtcttccatt ctgtaatggc tccatttacc atgaccattg atacacatac aaatggcaac 300 gggaaacttg ttctctgggg agaacatact gggcagctgt atagcaaatt cctgttgaaa 360 gcagaacctc tggcattcac tttctctcat gattacaaag gctccacgag tcatcatctc 420 atgtctagga aaagcatcag tgcagctctt gaacacaaag tcagta 466 <210> 891 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 891 gcctcagtct gctttacacc 20 <210> 892 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido Anti-sentido <400> 892 agattaccag ccatatgcag 20

Lisboa, 9 de Julho de 2013 639

Claims (21)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Oligonucleótido anti-sentido de 12 a 30 nucleobases de comprimento direccionado para uma molécula de ácido nucleico codificando apolipoproteína B, em que o referido oligonucleótido é 100% complementar ao referido ácido nucleico e inibe a expressão da apolipoproteína B, o referido oligonucleótido compreendendo, pelo menos, 8 nucleobases contíguas da SEQ ID N°: 247.
2. 2. Oligonucleótido anti-sentido da reivindicação 1, em que o oligonucleótido tem uma sequência compreendendo a SEQ ID N°: 247 .
3. 3. Oligonucleótido anti-sentido de 20 a 30 nucleobases de comprimento direccionado para uma molécula de ácido nucleico codificando apolipoproteína B, em que o referido oligonucleótido hibrida especificamente com o referido ácido nucleico e inibe a expressão de apolipoproteína B, em que o oligonucleótido tem uma sequência compreendendo a SEQ ID N°: 247.
4. 4. Oligonucleótido anti-sentido de qualquer das reivindicações 1 a 3, em que o oligonucleótido tem uma sequência consistindo da SEQ ID N°: 247.
5. 5. Oligonucleótido anti-sentido de qualquer das reivindicações 1-4, em que o oligonucleótido é um composto mimético de oligonucleótido. 1
6. 6. Oligonucleótido anti-sentido oligonucleótido compreende, fosforotioato, pelo menos, 2'-O-metoxietilo ou, pelo
7. 7. Oligonucleótido anti-sentido oligonucleótido anti-sentido quimérico.
8. 8. Oligonucleótido anti-sentido oligonucleótido anti-sentido fosfotioato.
9. 9. Oligonucleótido anti-sentido oligonucleótido compreende 2'-metoxietilo e uma lacuna d< a reivindicação 5, em que o pelo menos uma ligação uma fracção de açúcar , uma 5-metilcitosina. da reivindicação 5, em que o é um composto anti-sentido da reivindicação 7, em que o é um composto quimérico de da reivindicação 8, em que o asas de nucleótidos de ; 2'-desoxinucleótido.
10. 10. Oligonucleótido anti-sentido da reivindicação 9, em que o oligonucleótido compreende dez 2'-desoxinucleótidos.
11. 11. Oligonucleótido anti-sentido de qualquer das reivindicações anteriores, em que o oligonucleótido é um sal farmaceuticamente aceitável.
12. 12. Oligonucleótido anti-sentido de qualquer das reivindicações 1 a 11, em que o oligonucleótido inibe a expressão de ARNm codificando apolipoproteína B humana após 16 a 24 horas em, pelo menos, 30% ou, pelo menos, 50% em células HepG2 80% confluentes em cultura, a uma concentração de 150 nM. 2
13. 13. Composição compreendendo o oligonucleótido anti-sentido de qualquer das reivindicações 1 a 12 e um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
14. 14. Método de inibição ex vivo da expressão de apolipoproteína B em células ou tecidos, compreendendo a colocação das referidas células ou tecidos em contacto com um oligonucleótido anti-sentido de qualquer das reivindicações 1 a 12, sob condições de modo que a expressão de apolipoproteína B seja inibida.
15. 15. Oligonucleótido anti-sentido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12 ou uma composição de acordo com a reivindicação 13 para utilização em terapia ou profilaxia de doença.
16. 16. Oligonucleótido anti-sentido de qualquer das reivindicações 1 a 12, ou a composição da reivindicação 13 para utilização no tratamento de: (a) hipercolesterolemia; (b) doença cardivascular; (c) hiperlipidemia; (d) diabetes; ou (e) obesidade, num humano.
17. Utilização de um oligonucleótido anti-sentido de qualquer das reivindicações 1 a 12 para o fabrico de um medicamento para tratamento de: 3 (a) hipercolesterolemia; (b) doença cardivascular; (c) hiperlipidemia; (d) diabetes; ou (e) obesidade, num humano.
18. 18. Oligonucleótido anti-sentido ou composição da reivindicação 16, ou a utilização da reivindicação 17, em que a doença cardiovascular é aterosclerose.
19. 19. Oligonucleótido anti-sentido ou composição da reivindicação 16 para utilização no tratamento de hipercolesterolemia.
20. 20. Utilização da reivindicação 17, em que o medicamento é para tratar hipercolesterolemia.
21. 21. Oligonucleótido anti-sentido ou composição da reivindicação 19, ou a a utilização da reivindicação 20, em que a hipercolesterolemia é uma hipercolesterolemia familiar. Lisboa, 9 de Julho de 2013 4