JP2010193894A - アポリポタンパク質ｂ発現のアンチセンス調節 - Google Patents

Abstract

【課題】アポリポタンパク質Ｂ発現を調節するための組成物および方法を提供すること。
【解決手段】アンチセンス化合物、組成物および方法が、アポリポタンパク質Ｂの発現を調節するために提供される。この組成物は、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物（特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を含む。本発明の化合物を含む、薬学的組成物および他の組成物もまた提供される。この細胞中のアポリポタンパク質Ｂの発現を調節する方法がさらに提供される。
【選択図】なし

Description

本願は、米国仮出願番号：６０／４２６，２３４（２００３年１１月１３日出願）に対
する優先権を主張するＰＣＴ出願ＵＳ０３／１５４９３（２００３年５月１５日出願）の
一部継続出願である。この米国仮出願番号：６０／４２６，２３４は、米国出願番号１０
／１４７，１９６（２００２年５月１５日出願）（代理人整理番号ＩＳＰＨ−０６６４）
の一部継続出願であり、これは、米国出願番号１０／１３５，９８５（２００２年４月３
０日出願）（代理人整理番号ＩＳＰＨ−０６６３）の一部継続出願であり、これは、米国
出願番号０９／９２０，０３３（２００１年８月１日出願）の（代理人整理番号ＩＳＰＨ
−０５９２）の一部継続出願である。

（発明の分野）
本発明は、アポリポタンパク質Ｂの発現を調節するための組成物および方法を提供する
。特に、本発明は、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸と特異的にハイブリダイズし
得る化合物（特に、オリゴヌクレオチド）に関する。このような化合物は、アポリポタン
パク質Ｂの発現を調節することが示されている。

リポタンパク質は、タンパク質、リン脂質およびコレステロールの両親媒性コーティン
グによって取り囲まれた、アシルグリセロールおよびコレステリルエステルの非極性コア
から構成される、球状のミセル様粒子である。リポタンパク質は、それらの機能的特性お
よび物理的特性に基づいて、以下の５つの広範の範疇に分類されている：カイロミクロン
（これは、食物脂質を腸から組織へと輸送する）；超低密度リポタンパク質（ＶＬＤ）；
中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）；低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）（これらは全て、
トリアシルグリセロールおよびグリセロールを肝臓から組織へと輸送する）；および高密
度リポタンパク質（ＨＤＬ）（これは、内在性コレステロールを組織から肝臓へと輸送す
る）。

リポタンパク質粒子は、連続代謝プロセシングを受け、そして非常に多様な特性および
組成を有する。リポタンパク質の密度は、粒子直径を低減することなく増大する。なぜな
ら、これらの外側のコーティングの密度が、内側の密度よりも小さいからである。リポタ
ンパク質のタンパク質成分は、アポリポタンパク質（ａｐｏｌｉｐｒｏｔｅｉｎ）として
公知である。少なくとも９つのアポリポタンパク質が、種々のヒトリポタンパク質におい
て顕著な量で分布している。

アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ、アポリポタンパク質Ｂ−１００；ＡｐｏＢ−１００
、アポリポタンパク質Ｂ−４８；ＡｐｏＢ−４８およびＡｇ（ｘ）抗原としても公知）は
、脂質のアセンブリおよび分泌において、ならびに別個のクラスのリポタンパク質の輸送
およびレセプター媒介取り込みおよび送達において必須の役割を果たす、大きな糖タンパ
ク質である。アポリポタンパク質Ｂの重要性は、食物脂質の吸収およびプロセシングから
循環するリポタンパク質のレベルの調節まで、種々の機能にまたがる（Ｄａｖｉｄｓｏｎ
およびＳｈｅｌｎｅｓｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．，２０００，２０，１６９−１
９３）。この後者の特性は、アテローム性動脈硬化症感受性に関するその関連性の基礎で
あり、アテローム性動脈硬化症感受性は、アポリポタンパク質Ｂ含有リポタンパク質の周
囲濃度と高度に関連している（ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＳｈｅｌｎｅｓｓ，Ａｎｎｕ．Ｒ
ｅｖ．Ｎｕｔｒ．，２０００，２０，１６９−１９３）。

２つの形態のアポリポタンパク質Ｂが、哺乳動物において存在する。ＡｐｏＢ−１００
は、ヒト肝臓においてもっぱら合成される、４５３６アミノ酸残基を含む、全長タンパク
質を表す（ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＳｈｅｌｎｅｓｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．，
２０００，２０，１６９−１９３）。ＡｐｏＢ−４８として公知の短縮形態は、アミノ末
端の２１５２残基と対応する部分が同一線形順序に並んでおり、そして全ての哺乳動物の
小腸において合成される（ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＳｈｅｌｎｅｓｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ
．Ｎｕｔｒ．，２０００，２０，１６９−１９３）。

ＡｐｏＢ−１００は、ＬＤＬの主なタンパク質成分であり、そしてこのリポタンパク質
種とＬＤＬレセプターとの相互作用に必要とされるドメインを含む。さらに、ＡｐｏＢ−
１００は、アポリポタンパク質（ａ）との相互作用を媒介して、Ｌｐ（ａ）と呼ばれる別
の異なるアテローム発生リポタンパク質を生成する、不対のシステイン残基を含む（Ｄａ
ｖｉｄｓｏｎおよびＳｈｅｌｎｅｓｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．，２０００，２０
，１６９−１９３）。

ヒトでは、ＡｐｏＢ−４８は、カイロミクロンと会合して循環し、そしてカイロミクロ
ンのレムナントおよびこれらの粒子は、ＬＤＬレセプター関連タンパク質として公知の別
個のレセプターによって浄化される（ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＳｈｅｌｎｅｓｓ，Ａｎｎ
ｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．，２０００，２０，１６９−１９３）。ＡｐｏＢ−４８は、Ａｐ
ｏＢ−１００が、内在性血漿コレステロールの輸送および送達に関与する一方で、食物脂
質が小腸から肝臓へと送達される重大な順応とみなされ得る（ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＳ
ｈｅｌｎｅｓｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．，２０００，２０，１６９−１９３）。

アポリポタンパク質Ｂについての共通の構造遺伝子が２つの別個のタンパク質アイソフ
ォームを産生する基礎は、ＲＮＡ編集として公知のプロセスである。部位特異的シトシン
−ウラシル編集反応は、ＵＡＡ停止コドン、そしてアポリポタンパク質Ｂの翻訳終結を生
じて、ＡｐｏＢ−４８を産生する（ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＳｈｅｌｎｅｓｓ，Ａｎｎｕ
．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．，２０００，２０，１６９−１９３）。

アポリポタンパク質Ｂは、１９８５年にクローニングされ（Ｌａｗら，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８５，８２，８３４０−８３４４）、そし
て１９８６年に染色体２ｐ２３−２ｐ２４にマッピングされた（Ｄｅｅｂら，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８６，８３，４１９−４２２）。

米国特許第５，７８６，２０６号において開示および特許請求されるのは、アポリポタ
ンパク質Ｂ−１００のエピトープ領域をコードする単離されたＤＮＡ配列を含む、血漿中
での低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のレベルを決定するための方法および組成物である
（Ｓｍｉｔｈら，１９９８）。

ヒトアポリポタンパク質Ｂを発現し、高脂肪食餌を給餌されたトランスジェニックマウ
スは、高血漿コレステロールレベルを発達させることが見出され、そしてアテローム性動
脈硬化症の病巣の、非トランスジェニック同腹仔に対して１１倍の増加を提示した（Ｋｉ
ｍおよびＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，１９９８，３９，７０３−７２３；Ｎ
ｉｓｈｉｎａら，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，１９９０，３１，８５９−８６９）。

さらに、短縮形態のヒトアポリポタンパク質Ｂを発現するトランスジェニックマウスを
用いて、アポリポタンパク質（ａ）と相互作用してＬｐ（ａ）リポタンパク質粒子を生成
するために必要とされる、ＡｐｏＢ−１００のカルボキシル末端の構造的特徴が同定され
ており、ＡｐｏＢ−１００のＬＤＬレセプター結合領域の構造的特徴が調査されている（
ＫｉｍおよびＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，１９９８，３９，７０３−７２３
；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２，２３６１６−
２３６２２）。

高脂肪食餌を給餌した場合に高コレステロール血症を発達させることから保護される、
アポリポタンパク質Ｂノックアウトマウス（ＡｐｏＢ−１００およびＡｐｏＢ−４８の両
方が破壊されている）が作製されている（Ｆａｒｅｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９５，９２，１７７４−１７７８；ＫｉｍおよびＹｏｕ
ｎｇ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，１９９８，３９，７０３−７２３）。ＡｐｏＢ１００
またはＡｐｏＢ−４８を排他的に発現するマウスにおいてアテローム性動脈硬化症の発生
率が調査されており、そしてアテローム性動脈硬化症に対する感受性は、総コレステロー
ルレベルに依存することが見出された。マウスによって合成されたＡｐｏＢ−１００また
はＡｐｏＢ−４８がアテローム性動脈硬化症の程度に影響を与えようが与えまいが、おそ
らく、ＡｐｏＢ−１００とＡｐｏＢ−４８とでは、固有のアテローム発生性に主な相違は
ないことを示す（ＫｉｍおよびＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，１９９８，３９
，７０３−７２３；Ｖｅｎｉａｎｔら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９７，１０
０，１８０−１８８）。

ＡｐｏＢ−１００含有リポタンパク質Ｌｐ（ａ）の血漿レベルの上昇は、アテローム性
動脈硬化症およびその発現の危険性の増大と関連し、これらは、高コレステロール血症（
Ｓｅｅｄら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９０，３２２，１４９４−１４９９）、
心筋梗塞（Ｓａｎｄｋａｍｐら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，３６，２０−２３）
、および血栓症（Ｎｏｗａｋ−Ｇｏｔｔｌら，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１９９７，９９，
Ｅ１１）を包含し得る。

Ｌｐ（ａ）の血漿濃度は、遺伝的因子によって強く影響され、そして大部分の薬物およ
び食物操作に対して治療不応性である（ＫａｔａｎおよびＢｅｙｎｅｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｅｐ
ｉｄｅｍｉｏｌ．，１９８７，１２５，３８７−３９９；Ｖｅｓｓｂｙら，Ａｔｈｅｒｏ
ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１９８２，４４，６１−７１）。上昇したＬｐ（ａ）レベルの薬理
学的治療は、ほんのわずかにしか好首尾ではなく、そしてアフェレーシスが最も有効な治
療様式のままである（ＨａｊｊａｒおよびＮａｃｈｍａｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．
，１９９６，４７，４２３−４４２）。

米国特許第６，１５６，３１５号および対応するＰＣＴ公開ＷＯ ９９／１８９８６に
おいて開示および特許請求されるのは、アポリポタンパク質Ｂのアミノ末端領域に結合し
得、従って、血管マトリクスに対する低密度リポタンパク質の結合を阻害し得る、有効量
の抗体またはそのフラグメントを被験体に投与することを包含する、被験体における血管
マトリクスに対するＬＤＬの結合を阻害するための方法である（Ｇｏｌｄｂｅｒｇおよび
Ｐｉｌｌａｒｉｓｅｔｔｉ，２０００；ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＰｉｌｌａｒｉｓｅｔｔ
ｉ，１９９９）。

米国特許第６，０９６，５１６号において開示および特許請求されるのは、心臓血管疾
患の診断および処置の目的のための、ヒトＡｐｏＢ−１００に結合するマウス組換え抗体
をコードするｃＤＮＡを含むベクターである（Ｋｗａｋら，２０００）。

ＰＣＴ公開ＥＰ ９１１３４４において開示および特許請求されるのは、ＡｐｏＢ−４
８に特異的に結合し、そしてＡｐｏＢ−１００特異的に結合せず、高脂血症および動脈硬
化の診断および治療のために有用である、モノクローナル抗体である（Ｕｃｈｉｄａおよ
びＫｕｒａｎｏ，１９９８）。

ＰＣＴ公開ＷＯ ０１／３０３５４において開示および特許請求されるのは、治療有効
量の化合物を患者に投与する工程を包含する、心臓血管障害を有する患者を処置する方法
であり、ここで、この化合物は、アポリポタンパク質Ｂ分解経路を刺激することによって
、アポリポタンパク質Ｂまたはアポリポタンパク質Ｂを含有するリポタンパク質の血漿濃
度を低下させるように一定期間にわたって作用する（ＦｉｓｈｅｒおよびＷｉｌｌｉａｍ
ｓ，２００１）。

米国特許第５，２２０，００６号において開示および特許請求されるのは、アテローム
発生アポリポタンパク質Ｂの抑制を媒介する、クローニングされたシス作用性ＤＮＡ配列
である（Ｒｏｓｓら，１９９３）。

ＰＣＴ公開ＷＯ ０１／１２７８９において開示および特許請求されるのは、ＡｐｏＢ
−１００ ｍＲＮＡを６６７９位で特異的に切断するリボザイムである（Ｃｈａｎら，２
００１）。

今日までに、アポリポタンパク質Ｂの機能を阻害することを目的としたストラテジーは
、Ｌｐ（ａ）アフェレーシス、抗体、抗体フラグメントおよびリボザイムに制限されてい
る。

アンチセンス技術は、特定の遺伝子産物の発現を低減する有効な手段として出現してお
り、それゆえ、アポリポタンパク質Ｂの発現調節に関連する多数の治療適用、診断適用お
よび研究適用において独特に有用であると証明され得る。

本発明は、アポリポタンパク質Ｂ発現を調節する（アポリポタンパク質Ｂの選択的アイ
ソフォームであるＡｐｏ−４８の阻害を含む）ための組成物および方法を提供する。

（発明の要旨）
本発明は、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸を標的化して、アポリポタンパク質
Ｂの発現を調節する化合物（特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド）に関する。本発明
の化合物を含む、薬学的組成物および他の組成物もまた提供される。細胞または組織と、
１以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物とを接触させる工程を包含する、この
細胞中または組織中のアポリポタンパク質Ｂの発現を調節する方法がさらに提供される。
治療有効量または予防有効量の１以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物を投与
することによる、アポリポタンパク質Ｂの発現に関連する疾患もしくは状態を有する疑い
があるか、またはこのような疾患もしくは状態になる傾向がある疑いがある動物（特に、
ヒト）を処置する方法がさらに提供される。

特に本発明は、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に標的化された、長さが８
〜５０個の核化合物を提供し、ここで、その化合物は、アポリポタンパク質Ｂをコードす
る核酸分子に特異的にハイブリダイズし、かつアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分
子の発現を阻害する。その化合物は、配列番号１２７〜１３４、配列番号１３６、配列番
号１３８〜１７４、配列番号１７６〜３１７、配列番号３１９〜３２１、配列番号３２３
〜３３３、配列番号３３５〜３３９、配列番号３４１〜３７４、配列番号３７６〜４１６
、配列番号４１８〜５００、配列番号５０２〜５１０、配列番号５１２〜８０４、配列番
号８１５、配列番号８１６、配列番号８１９〜８２１、配列番号８２４、配列番号８２５
、配列番号８２７、配列番号８２８、配列番号８３０、配列番号８３１、配列番号８３３
〜８３５、配列番号８３７〜８３９、配列番号８４２、配列番号８４３、および配列番号
８４５〜８５４のいずれか１つのうちの少なくとも８個の連続した核酸塩基を含む。

本発明はさらに、長さが８〜５０個の核酸塩基である化合物を提供し、これは、アポリ
ポタンパク質Ｂをコードする核酸分子における活性部位の少なくとも８個の核酸塩基部分
に特異的にハイブリダイズする。この化合物は、配列番号１２７〜１３４、配列番号１３
６、配列番号１３８〜１７４、配列番号１７６〜３１７、配列番号３１９〜３２１、配列
番号３２３〜３３３、配列番号３３５〜３３９、配列番号３４１〜３７４、配列番号３７
６〜４１６、配列番号４１８〜５００、配列番号５０２〜５１０、配列番号５１２〜８０
４、配列番号８１５、配列番号８１６、配列番号８１９〜８２１、配列番号８２４、配列
番号８２５、配列番号８２７、配列番号８２８、配列番号８３０、配列番号８３１、配列
番号８３３〜８３５、配列番号８３７〜８３９、配列番号８４２、配列番号８４３、およ
び配列番号８４５〜８５４のいずれか１つのうちの少なくとも８個の連続した核酸塩基を
含み、この活性部位は、この核酸中の領域であり、ここで、その部位への化合物の結合は
、コントロールと比較して、アポリポタンパク質Ｂの発現を有意に阻害する。

本発明はまた、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に標的化された、長さが８
〜５０個の核酸塩基である化合物を提供し、ここで、この化合物は、その核酸に対して十
分にハイブリダイズし、そしてアポリポタンパク質Ｂの発現を阻害し、ここで、このアポ
リポタンパク質Ｂは、以下：
（ａ）配列番号３、および
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）のポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズ
する、天然に存在する改変体アポリポタンパク質Ｂをコード化するポリヌクレオチド
からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされる。この化合物は、配列
番号１２７〜１３４、配列番号１３６、配列番号１３８〜１７４、配列番号１７６〜３１
７、配列番号３１９〜３２１、配列番号３２３〜３３３、配列番号３３５〜３３９、配列
番号３４１〜３７４、配列番号３７６〜４１６、配列番号４１８〜５００、配列番号５０
２〜５１０、配列番号５１２〜８０４、配列番号８１５、配列番号８１６、配列番号８１
９〜８２１、配列番号８２４、配列番号８２５、配列番号８２７、配列番号８２８、配列
番号８３０、配列番号８３１、配列番号８３３〜８３５、配列番号８３７〜８３９、配列
番号８４２、配列番号８４３、および配列番号８４５〜８５４のいずれか１つのうちの少
なくとも８個の連続した核酸塩基を含む。

別の局面において、本発明は、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に標的化さ
れた、長さが８〜５０個の核酸塩基である化合物を提供し、ここで、この化合物は、その
核酸に特異的にハイブリダイズし、そしてアポリポタンパク質Ｂの発現を阻害し、ここで
、このアポリポタンパク質Ｂは、配列番号３および配列番号１７からなる群より選択され
るポリヌクレオチドによってコードされる。この化合物は、配列番号１２７〜１３４、配
列番号１３６、配列番号１３８〜１７４、配列番号１７６〜３１７、配列番号３１９〜３
２１、配列番号３２３〜３３３、配列番号３３５〜３３９、配列番号３４１〜３７４、配
列番号３７６〜４１６、配列番号４１８〜５００、配列番号５０２〜５１０、配列番号５
１２〜８０４、配列番号８１５、配列番号８１６、配列番号８１９〜８２１、配列番号８
２４、配列番号８２５、配列番号８２７、配列番号８２８、配列番号８３０、配列番号８
３１、配列番号８３３〜８３５、配列番号８３７〜８３９、配列番号８４２、配列番号８
４３、および配列番号８４５〜８５４のいずれか１つのうちの少なくとも８個の連続した
核酸塩基を含む。

本発明はまた、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸に標的化された、長さが８〜５
０個の核酸塩基である化合物を提供し、ここで、この化合物は、その核酸の活性部位に特
異的にハイブリダイズし、そしてアポリポタンパク質Ｂの発現を阻害する。この化合物は
、配列番号１２７〜１３４、配列番号１３６、配列番号１３８〜１７４、配列番号１７６
〜３１７、配列番号３１９〜３２１、配列番号３２３〜３３３、配列番号３３５〜３３９
、配列番号３４１〜３７４、配列番号３７６〜４１６、配列番号４１８〜５００、配列番
号５０２〜５１０、配列番号５１２〜８０４、配列番号８１５、配列番号８１６、配列番
号８１９〜８２１、配列番号８２４、配列番号８２５、配列番号８２７、配列番号８２８
、配列番号８３０、配列番号８３１、配列番号８３３〜８３５、配列番号８３７〜８３９
、配列番号８４２、配列番号８４３、および配列番号８４５〜８５４のいずれか１つのう
ちの少なくとも８個の連続した核酸塩基を含み、この活性部位は、その核酸中の領域であ
り、ここで、その部位への化合物の結合は、コントロールと比較して、アポリポタンパク
質Ｂの発現を有意に阻害される。

別の局面において、本発明は、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に標的化さ
れた、長さが８〜５０個の核酸塩基である化合物を提供し、ここで、この化合物は、その
核酸と十分にハイブリダイズし、そしてアポリポタンパク質Ｂの発現を阻害する。この化
合物は、配列番号１２７〜１３４、配列番号１３６、配列番号１３８〜１７４、配列番号
１７６〜３１７、配列番号３１９〜３２１、配列番号３２３〜３３３、配列番号３３５〜
３３９、配列番号３４１〜３７４、配列番号３７６〜４１６、配列番号４１８〜５００、
配列番号５０２〜５１０、配列番号５１２〜８０４、配列番号８１５、配列番号８１６、
配列番号８１９〜８２１、配列番号８２４、配列番号８２５、配列番号８２７、配列番号
８２８、配列番号８３０、配列番号８３１、配列番号８３３〜８３５、配列番号８３７〜
８３９、配列番号８４２、配列番号８４３、および配列番号８４５〜８５４のいずれか１
つのうちの少なくとも８個の連続した核酸塩基を含む。

別の局面において、本発明は、長さが８〜５０個の核酸塩基であるアンチセンス化合物
を提供し、ここで、この化合物は、配列番号３に示されるヌクレオチド２９２０〜３４２
０に特異的にハイブリダイズし、そして１５０ｎＭの濃度での培養物中の８０％コンフル
エントなＨｅｐＧ２細胞において、１６〜２４時間後に少なくとも３０％までヒトアポリ
ポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡの発現を阻害する。好ましい実施形態において、長
さが８〜５０個の核酸塩基であるアンチセンス化合物は、配列番号３に示されるヌクレオ
チド３２３０〜３２８８に特異的にハイブリダイズし、そして１５０ｎＭの濃度での培養
物中の８０％コンフルエントなＨｅｐＧ２細胞において、１６〜２４時間後に少なくとも
３０％までヒトアポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡの発現を阻害する。別の局面
において、この化合物は、１５０ｎＭの濃度での培養物中の８０％コンフルエントなＨｅ
ｐＧ２細胞において、１６〜２４時間後に少なくとも５０％までヒトアポリポタンパク質
ＢをコードするｍＲＮＡの発現を阻害する。

１つの局面において、本発明の化合物は、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子
に対して標的化され、ここで、この化合物は、アポリポタンパク質Ｂの長形態（ｌｏｎｇ
ｆｏｒｍ）であるＡｐｏＢ−１００に特異的にハイブリダイズし、そしてＡｐｏＢ−１
００の発現を阻害する。別の局面において、この化合物は、その核酸に特異的にハイブリ
ダイズし、そして最適濃度での培養物中の８０％コンフルエントなＨｅｐＧ２細胞におい
て、少なくとも５％までアポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡの発現を阻害する。
なお別の局面において、この化合物は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくと
も２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％
、または少なくとも５０％まで、アポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡの発現を阻
害する。

１つの局面において、上記化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、１つの
実施形態において、この化合物は、配列番号２２４を含む配列を含み、このアンチセンス
オリゴヌクレオチドは、配列番号２２４、配列番号２２４を含む化合物、本質的に配列番
号２２４からなる化合物、または配列番号２２４からなる化合物に対して相補的な領域に
ハイブリダイズする。

別の局面において、上記化合物は、配列番号２４７を含む配列を有し、このアンチセン
スオリゴヌクレオチドは、配列番号２４７、配列番号２４７を含む化合物、配列番号２４
７からなる化合物、または配列番号２４７からなる化合物に対して相補的な領域にハイブ
リダイズする。

別の局面において、上記化合物は、配列番号３１９を含む配列を有し、このアンチセン
スオリゴヌクレオチドは、配列番号３１９、配列番号３１９を含む化合物、配列番号３１
９からなる化合物、または配列番号３１９からなる化合物に対して相補的な領域にハイブ
リダイズする。

１つの実施形態において、上記化合物は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間
結合を含み、別の実施形態において、この修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチ
オエート結合である。

別の局面において、上記化合物は、少なくとも１つの修飾された糖部分を含み、１つの
局面において、この修飾された糖部分は、２’−Ｏ-メトキシエチル糖部分である。

別の実施形態において、上記化合物は、少なくとも１つの修飾された核酸塩基を含み、
１つの局面において、この修飾された核酸塩基は、５−メチルシトシンである。

さらに別の局面において、上記化合物は、キメラオリゴヌクレオチドである。好ましい
キメラ化合物としては、１以上のホスホロチオエート結合を有し、さらに２’−メトキシ
エトキシヌクレオチドウイングと１０個の核酸塩基２’−デオキシヌクレオチドギャップ
を含むキメラ化合物が挙げられる。

別の局面において、上記化合物は、アポリポタンパク質の代替的スプライス形態をコー
ドする核酸分子に特異的にハイブリダイズし、そしてその発現を阻害する。

本発明はまた、本発明の化合物と、薬学的に許容可能な担体もしくは希釈剤とを含む組
成物を提供する。１つの局面において、この組成物は、コロイド分散系をさらに含み、別
の局面において、この組成物中の化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。特
定の実施形態において、この組成物は、相補鎖にハイブリダイズされた本発明のアンチセ
ンス化合物を含む。アンチセンス鎖のハイブリダイゼーションは、１以上の平滑末端また
は１以上の突出末端を形成し得る。いくつかの実施形態において、この突出末端は、修飾
塩基を含む。

本発明はさらに、細胞または組織におけるアポリポタンパク質Ｂの発現を阻害する方法
を提供し、この方法は、アポリポタンパク質Ｂの発現が阻害されるように、その細胞また
は組織を、本発明の化合物と接触させる工程を包含する。方法はまた、アポリポタンパク
質Ｂに関連する疾患または状態を有する動物を処置するために提供され、これらの方法は
、アポリポタンパク質Ｂの発現が阻害されるように、治療有効量または予防有効量の本発
明の化合物を、その動物に投与する工程を包含する。種々の局面において、状態は脂質代
謝異常に関連し、状態はコレステロール代謝異常に関連し、状態は代謝状態異常に関連し
、この代謝状態異常は高脂血症であり、疾患は糖尿病であり、この糖尿病は２型糖尿病で
あり、状態は肥満であり、および／または疾患は心疾患である。

本発明はまた、動物におけるグルコースレベルを調節する方法を提供し、その方法は、
その動物に本発明の化合物を投与する工程を包含し、１つの局面において、その動物は、
ヒトである。種々の実施形態において、グルコースレベルは、血漿グルコースレベルであ
り、グルコースレベルは、血清グルコースレベルであり、そして／またはその動物は、糖
尿病の動物である。

本発明はまた、動物におけるアポリポタンパク質Ｂに関連する疾患または状態の発生を
予防または遅延させる方法を提供し、その方法は、この動物に、本発明の化合物の治療有
効量または予防有効量を投与する工程を包含する。１つの局面において、その動物は、ヒ
トである。他の局面において、上記状態は、代謝状態異常であり、その代謝状態異常は、
高脂血症であり、上記疾患は、糖尿病であり、その糖尿病は２型糖尿病であり、上記状態
は、肥満であり、上記状態は、アテローム性動脈硬化症であり、上記状態は、脂質代謝異
常を含み、そして／または上記状態は、コレステロール代謝異常を含む。

本発明はまた、動物におけるグルコースレベルの増加を予防または遅延させる方法を提
供し、その方法は、この動物に、本発明の化合物の治療有効量または予防有効量を投与す
る工程を包含する。１つの局面において、上記動物は、ヒトである。他の局面において、
上記グルコースレベルは、血清グルコースレベルであり、そして／または上記グルコース
レベルは、血漿グルコースレベルである。

本発明はまた、動物におけるコレステロールレベルを調節する方法を提供し、その方法
は、この動物に、本発明の化合物の治療有効量または予防有効量を投与する工程を包含す
る。１つの局面において、上記動物は、ヒトである。

本発明はまた、動物におけるリポタンパク質レベルを調節する方法を提供し、その方法
は、この動物に、本発明の化合物の治療有効量または予防有効量を投与する工程を包含す
る。１つの局面において、上記動物は、ヒトである。他の局面において、上記リポタンパ
ク質は、ＶＬＤＬであり、上記タンパク質は、ＨＤＬであり、そして／または上記リポタ
ンパク質は、ＬＤＬである。

本発明はまた、動物におけるトリグリセリドレベルを調節する方法を提供し、その方法
は、この動物に、本発明の化合物の治療有効量または予防有効量を投与する工程を包含す
る。１つの局面において、上記動物は、ヒトである。

本発明はまた、アポリポタンパク質Ｂ発現に関連する疾患または状態の処置のための医
薬、脂質代謝異常に関連する状態の処置のための医薬、コレステロール代謝異常に関連す
る状態の処置のための医薬、アテローム性動脈硬化症の処置のための医薬、高脂血症の処
置のための医薬、糖尿病の処置のための医薬、２型糖尿病の処置のための医薬、肥満の処
置のための医薬、心血管疾患の処置のための医薬、グルコースレベル増加の発生を予防ま
たは遅延させるための医薬、血清グルコースレベル増加の発生を予防または遅延させるた
めの医薬、血漿グルコースレベル増加の発生を予防または遅延させるための医薬、血清コ
レステロールレベルの調節のための医薬、血清リポタンパク質レベルの調節のための医薬
、血清ＶＬＤＬレベルの調節のための医薬、血清ＨＤＬレベルの調節のための医薬、およ
び／または血清ＬＤＬレベルの調節のための医薬、血清トリグリセリドレベルの調節のた
めの医薬の製造ための本発明の化合物の使用を証明する。

別の局面において、本発明は、循環リポタンパク質レベルを減少させる方法を提供し、
その方法は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるのに十分な量の本発明の化
合物を投与する工程を包含する。別の局面において、本発明は、リポタンパク質輸送を減
少させる方法を提供し、その方法は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるの
に十分な量の本発明の化合物を投与する工程を包含する。本発明はまた、リポタンパク質
吸収／吸収を減少させる方法を提供し、その方法は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現
を減少させるのに十分な量の本発明の化合物を投与する工程を包含する。

別の局面において、本発明は、循環トリグリセリドレベルを減少させる方法を意図し、
その方法は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるのに十分な量の本発明の化
合物を投与する工程を包含する。また、トリグリセリド輸送を減少させる方法が提供され
、その方法は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるのに十分な量の本発明の
化合物を投与する工程を包含する。本発明はさらに、トリグリセリド吸収／吸収を減少さ
せる方法を提供し、その方法は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるのに十
分な量の本発明の化合物を投与する工程を包含する。

別の局面において、本発明は、循環コレステロールレベル（コレステリルエステルおよ
び／または非エステル化コレステロールを含む）を減少させる方法を提供し、その方法は
、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるのに十分な量の本発明の化合物を投与
する工程を包含する。また、コレステロール輸送を減少させる方法が意図され、その方法
は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるのに十分な量の本発明の化合物を投
与する工程を包含する。本発明はまた、コレステロール吸収／吸収を減少させる方法提供
し、その方法は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるのに十分な量の本発明
の化合物を投与する工程を包含する。

別の局面において、本発明は、循環脂質レベルを減少させる方法を提供し、その方法は
、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるのに十分な量の本発明の化合物を投与
する工程を包含する。本発明はまた、血漿中の脂質輸送を減少させる方法を提供し、その
方法は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるのに十分な量の本発明の化合物
を投与する工程を包含する。さらに、本発明は、脂質吸収／吸収を減少させる方法提供し
、その方法は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるのに十分な量の本発明の
化合物を投与する工程を包含する。

本発明はさらに、循環する食物脂質を減少させる方法を意図し、その方法は、個体に、
アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるのに十分な量の本発明の化合物を投与する工程を
包含する。また、食物脂質輸送を減少させる方法、ならびに食物脂質吸収／吸収を減少さ
せる方法が提供され、それらの方法は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させる
のに十分な量の本発明の化合物を投与する工程を包含する。

別の局面において、本発明は、循環脂肪酸レベルを減少させる方法を提供し、その方法
は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるのに十分な量の本発明の化合物を投
与する工程を包含する。本発明はまた、脂肪酸輸送を減少させる方法を提供し、その方法
は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるのに十分な量の本発明の化合物を投
与する工程を包含する。また、脂肪酸吸収を減少させるための方法が意図され、その方法
は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるのに十分な量の本発明の化合物を投
与する工程を包含する。

本発明はまた、循環急性期反応物質を減少させる方法を提供し、その方法は、個体に、
アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるのに十分な量の本発明の化合物を投与する工程を
包含する。別の局面において、本発明は、急性期反応物質輸送を減少させる方法、ならび
に急性期反応物質吸収を減少させる方法を提供し、それらの方法は、個体に、アポリポタ
ンパク質Ｂ発現を減少させるのに十分な量の本発明の化合物を投与する工程を包含する。

別の局面において、本発明は、循環カイロミクロンを減少させる方法、カイロミクロン
輸送を減少させる方法、およびカイロミクロン吸収を減少させる方法を提供し、それらの
方法は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるのに十分な量の本発明の化合物
を投与する工程を包含する。

本発明はさらに、循環カイロミクロン残留粒子を減少させる方法、カイロミクロン残留
物輸送を減少させる方法、およびカイロミクロン残留物吸収を減少させる方法を提供し、
それらの方法は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるのに十分な量の本発明
の化合物を投与する工程を包含する。

本発明はさらに、循環ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬおよび／またはＨＤＬを減少させる方
法を意図し、その方法は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるのに十分な量
の本発明の化合物を投与する工程を包含する。同様に、本発明は、ＶＬＤＬ輸送、ＩＤＬ
輸送、ＬＤＬ輸送および／またはＨＤＬ輸送を減少させる方法を提供し、その方法は、個
体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少させるのに十分な量の本発明の化合物を投与する
工程を包含する。さらに、ＶＬＤＬ吸収、ＩＤＬ吸収、ＬＤＬ吸収および／またはＨＤＬ
吸収を減少させる方法を提供し、その方法は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を減少
させるのに十分な量の本発明の化合物を投与する工程を包含する。

なお別の局面において、本発明は、アポリポタンパク質Ｂに関連する状態を処置する方
法を提供し、その方法は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を阻害するのに十分な量の
本発明の化合物を投与する工程を包含する。上記状態は、高リポタンパク血症、家族性３
型高リポタンパク血症（家族性高リポタンパク血症）、および家族性高アルファリポタン
パク血症；高脂質血症、混合型高脂質血症、多発性リポタンパク質型高脂質血症、および
家族性複合高脂質血症；トリグリセリド過剰血症、家族性トリグリセリド過剰血症、およ
び家族性リポタンパク質リパーゼ；高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症
、多遺伝子性高コレステロール血症、および家族性欠損アポリポタンパク質Ｂ；心血管疾
患（アテローム性動脈硬化症および冠動脈疾患が挙げられる）；末梢血管疾患；フォンギ
ールケ病（グリコーゲン蓄積症、Ｉ型）；リポジストロフィー（先天的形態および後天的
形態）；クッシング症候群；性器発育正常性小人症（ｓｅｘｕａｌ ａｔｅｌｏｉｔｉｃ
ｄｗａｒｆｉｓｍ）（成長ホルモン単独欠損症）；真性糖尿病；ウェルナー症候群；急
性間欠性ポルフィリン症；原発性胆汁性肝硬変；肝外胆汁性障害；急性肝炎；肝臓癌；全
身性エリテマトーデス；単クローン性免疫グロブリン血症（骨髄腫、多発性骨髄腫、マク
ログロブリン血症、およびリンパ腫が挙げられる）；内分泌障害；肥満；ネフローゼ症候
群；代謝症候群；炎症；甲状腺機能低下症；尿毒症（高尿酸血症）；インポテンス；閉塞
性肝疾患；特発性高カルシウム血症；異常グロブリン血症（ｄｙｓｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍ
ｉａ）；インスリンレベルの上昇；Ｘ症候群；デュピィトレン拘縮；ならびにアルツハイ
マー病および痴呆から選択される。

本発明はまた、状態の危険性を減少させる方法を提供し、その方法は、個体に、アポリ
ポタンパク質Ｂ発現を阻害するのに十分な量の本発明の化合物を投与する工程を包含し、
上記状態は、妊娠；間欠性跛行；通風；ならびに水銀毒性およびアマルガム病から選択さ
れる。

本発明はさらに、血管内皮へのコレステロール粒子の結合を阻害する方法を提供し、そ
の方法は、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発現を阻害するのに十分な量の本発明の化合物
を投与する工程を包含し、そして結果として、本発明はまた、以下：
（ｉ）コレステロール粒子酸化；
（ｉｉ）血管内皮への単球の結合；
（ｉｉｉ）単球のマクロフェージへの分化；
（ｉｖ）酸化した脂質粒子のマクロファージ摂取およびサイトカイン（ＩＬ−１、ＴＮＦ
−α、ＴＧＦ−βが挙げられるが、これらに限定されない）の放出；
（ｖ）線維の線維脂肪障害および炎症の血小板形成；
（ｖｉ）血栓をもたらす内皮障害；および
（ｖｉｉ）心筋梗塞または脳卒中をもたらす血栓
の危険性を減少させる方法を提供し、その方法はまた、個体に、アポリポタンパク質Ｂ発
現を阻害するのに十分な量の本発明の化合物を投与する工程を包含する。

本発明はまた、アルコール依存症、喫煙、経口避妊の使用、糖質コルチコイドの使用、
βアドレナリン遮断剤の使用、またはイソトレチノイン（１３−シス−レチノール酸）の
使用に関連する高脂質血症を軽減する方法を提供し、その方法は、個体に、アポリポタン
パク質Ｂ発現を阻害するのに十分な量の本発明の化合物を投与する工程を包含する。

特定の局面において、本発明は、配列番号２４７の少なくとも８個の連続したヌクレオ
チドを含み、かつ少なくとも１２もしくは少なくとも１４〜３０核酸塩基の長さを有する
、長さが８〜５０個の核酸塩基であるアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を提供する
。

さらなる局面において、本発明は、配列番号２４７に示されるような核酸塩基の配列を
有し、かつ核酸塩基２、３、５、９、１２、１５、１７、１９、および２０にて５−メチ
ルシチジンを含む、長さが２０核酸塩基であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し
、ここで、各ヌクレオシド間結合は、ホスホチオエート結合であり、核酸塩基１〜５およ
び１６〜２０は、２’−メトキシエトキシ改変体を含み、そして核酸塩基６〜１５は、デ
オキシヌクレオチドである。

別の局面において、本発明は、第２の核酸塩基鎖にハイブリダイズされた第１の核酸塩
基鎖を含む化合物を提供し、この第１の核酸塩基鎖は、長さが８〜５０個の核酸塩基であ
り、配列番号３に示される配列のうちの少なくとも８個の連続した核酸塩基を含み、この
第２の核酸塩基鎖は、長さが８〜５０個の核酸塩基であり、安定なハイブリダイゼーショ
ンが可能になるように上記第１の鎖と十分に相補的な配列を含む。上記化合物は、１００
ｎＭの濃度での培養物中の８０％コンフルエントなＨｅｐＧ２細胞において、１６〜２４
時間後に少なくとも３０％までかまたは少なくとも５０％までヒトアポリポタンパク質Ｂ
をコードするｍＲＮＡの発現を阻害する。

さらに、本発明の化合物または組成物を含む小胞（例えば、リポソーム）が提供される
。

動物に対する本発明の化合物または組成物の投与の好ましい方法は、血管内、皮下、ま
たは経口である、。投与は繰り返され得る。

別の局面において、本発明は、肝細胞によるリポタンパク質（ａ）分泌を減少させる方
法を提供し、その方法は、以下：
（ａ）ヒトアポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズし、か
つ１００ｎＭの濃度での培養物中の８０％コンフルエントなＨｅｐＧ２細胞において、１
６〜２４時間後に少なくとも３０％までかまたは少なくとも５０％までヒトアポリポタン
パク質ＢをコードするｍＲＮＡの発現を阻害する、長さが８〜５０個の核酸塩基である非
触媒化合物を含む組成物のある量と、肝細胞とを接触させる工程；および
（ｂ）上記肝細胞によるリポタンパク質（ａ）の分泌を測定する工程
を包含する。

本発明はさらに、霊長類におけるアポリポタンパク質Ｂに関連する状態を処置する方法
を提供し、その方法は、この霊長類に、ヒトアポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡ
に特異的にハイブリダイズし、かつ１００ｎＭの濃度での培養物中の８０％コンフルエン
トなＨｅｐＧ２細胞において、１６〜２４時間後に少なくとも３０％までかまたは少なく
とも５０％までヒトアポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡの発現を阻害する、長さ
が８〜５０個の核酸塩基である非触媒化合物の治療有効量または予防有効量を投与する工
程を包含する。

本発明は、動物の肝臓においてアポリポタンパク質Ｂの発現を減少させる方法を提供し
、その方法は、この動物に、ヒトアポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡに特異的に
ハイブリダイズし、かつ１００ｎＭの濃度での培養物中の８０％コンフルエントなＨｅｐ
Ｇ２細胞において、１６〜２４時間後に少なくとも３０％までかまたは少なくとも５０％
までヒトアポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡの発現を阻害する、長さが８〜５０
個の核酸塩基である非触媒化合物の２ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間の量を投与する
工程を包含する。

また、インビトロで第２の核酸塩基鎖に特異的にハイブリダイズする第１の核酸塩基鎖
を含む本発明の化合物を作製する方法が提供され、この第１の鎖は、配列番号３に示され
る配列のうち少なくとも８個の連続した核酸塩基を含み、この第２の鎖は、安定なハイブ
リダイゼーションを可能にするために上記第１の鎖と十分に相補的な配列を含む。

本発明はさらに、本明細書中で開示される任意の状態およびすべての状態の処置のため
の医薬の製造における、本発明の化合物の使用を提供する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
長さが８〜５０個の核酸塩基であるアンチセンス化合物であって、該化合物は、配列番号
３に示されるようなヌクレオチド２９２０〜３４２０と特異的にハイブリダイズし、そし
て１５０ｎＭの濃度での培養物中の８０％コンフルエントなＨｅｐＧ２細胞において、１
６〜２４時間後に少なくとも３０％までヒトアポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡ
の発現を阻害する、アンチセンス化合物。
（項目２）
前記化合物は、配列番号３に示されるヌクレオチド３２３０〜３２８８と特異的にハイブ
リダイズし、そして１５０ｎＭの濃度での培地物中の８０％コンフルエントなＨｅｐＧ２
細胞において、１６〜２４時間後に少なくとも３０％までがヒトアポリポタンパク質Ｂを
コードするｍＲＮＡの発現を阻害する、項目１に記載のアンチセンス化合物。
（項目３）
アンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目２に記載のアンチセンス化合物。
（項目４）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド模倣化合物である、項目３
に記載のアンチセンス化合物。
（項目５）
長さが１２〜３０個の核酸塩基である、項目２に記載のアンチセンス化合物。
（項目６）
長さが１４〜２０個の核酸塩基である、項目５に記載のアンチセンス化合物。
（項目７）
前記オリゴヌクレオチド模倣化合物は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む
、項目４に記載のアンチセンス化合物。
（項目８）
前記オリゴヌクレオチド模倣化合物は、少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル糖部
分を含む、項目４に記載のアンチセンス化合物。
（項目９）
前記オリゴヌクレオチド模倣化合物は、少なくとも１つの５−メチルシトシンを含む、項
目４に記載のアンチセンス化合物。
（項目１０）
前記アンチセンス化合物は、キメラアンチセンス化合物である、項目２に記載のアンチセ
ンス化合物。
（項目１１）
前記キメラアンチセンス化合物は、キメラホスホロチオエートアンチセンス化合物である
、項目１０に記載のアンチセンス化合物。
（項目１２）
前記キメラホスホロチオエートアンチセンス化合物は、２’−メトキシエトキシヌクレオ
チドウイングおよび２’−デオキシヌクレオチドギャップを含む、項目１１に記載のアン
チセンス化合物。
（項目１３）
前記キメラホスホロチオエートアンチセンス化合物は、１０個の２’−デオキシヌクレオ
チドを含む、項目１２に記載のアンチセンス化合物。
（項目１４）
前記アンチセンス化合物は、１５０ｎＭの濃度での培養物中の８０％コンフルエントなＨ
ｅｐＧ２細胞において、１６〜２４時間後に少なくとも５０％までヒトアポリポタンパク
質ＢをコードするｍＲＮＡの発現を阻害する、項目１〜１３のいずれか１項に記載のアン
チセンス化合物。
（項目１５）
少なくとも１つの核酸塩基は、結合体に共有結合されている、項目１〜１３のいずれか１
項に記載のアンチセンス化合物。
（項目１６）
項目１〜１３のいずれか１項に記載のアンチセンス化合物と、薬学的に許容可能な担体も
しくは希釈剤とを含む、組成物。
（項目１７）
コロイド分散系をさらに含む、項目１６に記載の組成物。
（項目１８）
相補鎖にハイブリダイズされた項目１〜１３のいずれか１項に記載のアンチセンス化合物
を含む、組成物。
（項目１９）
前記アンチセンス化合物の相補鎖へのハイブリダイゼーションは、少なくとも１つの平滑
末端を形成する、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
前記アンチセンス化合物の相補鎖へのハイブリダイゼーションは、２つの平滑末端を形成
する、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
長さが８〜５０個の核酸塩基であり、配列番号２４７の少なくとも８個の連続したヌクレ
オチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物。
（項目２２）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、配列番号２４７を含む配列を有する、項
目２１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物。
（項目２３）
長さが１２〜３０個の核酸塩基である、項目２２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド化合物。
（項目２４）
長さが１４〜２０個の核酸塩基である、項目２３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド化合物。
（項目２５）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、配列番号２４７からなる配列を有する、
項目２４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物。
（項目２６）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、オリゴヌクレオチド模倣化合物である、
項目２５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物。
（項目２７）
前記オリゴヌクレオチド模倣化合物は、キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド化
合物である、項目２６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物。
（項目２８）
前記キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド化合物は、２’−メトキシエトキシヌ
クレオチドウイングおよび２’−デオキシヌクレオチドギャップを含む、項目２７に記載
のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物。
（項目２９）
前記キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド化合物は、１０個の２’−デオキシヌ
クレオチドを含む、項目２８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物。
（項目３０）
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、結合体に共有結合されている、項目２１〜２９
のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物。
（項目３１）
項目２１〜２９のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物と、薬学
的に許容可能な担体もしくは希釈剤とを含む、組成物。
（項目３２）
コロイド分散系をさらに含む、項目３１に記載の組成物。
（項目３３）
相補鎖にハイブリダイズされた項目２２〜２９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチ
ド化合物を含む、組成物。
（項目３４）
前記オリゴヌクレオチド化合物の相補鎖へのハイブリダイゼーションは、少なくとも１つ
の平滑末端を形成する、項目３３に記載の組成物。
（項目３５）
前記オリゴヌクレオチド化合物の相補鎖へのハイブリダイゼーションは、２つの平滑末端
を形成する、項目３４に記載の組成物。
（項目３６）
細胞または組織中でのアポリポタンパク質Ｂの発現を阻害する方法であって、該細胞また
は組織を、アポリポタンパク質Ｂの発現が阻害されるような条件下で、項目２に記載の化
合物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目３７）
細胞または組織中でのアポリポタンパク質Ｂの発現を阻害する方法であって、該細胞また
は組織を、アポリポタンパク質Ｂの発現が阻害されるような条件下で、項目２１に記載の
化合物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目３８）
前記細胞または組織は、インビボで接触される、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記接触させる工程は、前記化合物を動物に投与する工程を包含する、項目３８に記載の
方法。
（項目４０）
前記動物はヒトである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記ヒトは、アポリポタンパク質Ｂの発現に関連する疾患または状態を有し、治療有効量
または予防有効量の前記化合物が投与される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記ヒトは、脂質代謝異常に関連する状態を有する、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記ヒトは、コレステロール代謝異常に関連する状態を有する、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
前記ヒトは、心疾患を有する、項目４１に記載の方法。
（項目４５）
前記心疾患は、アテローム性動脈硬化症である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記ヒトは、アポリポタンパク質Ｂの発現に関連する代謝異常状態を有する、項目４１に
記載の方法。
（項目４７）
前記代謝異常状態は、高脂血症である、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記ヒトは、糖尿病を有する、項目４１に記載の方法。
（項目４９）
前記ヒトは、肥満である、項目４１に記載の方法。
（項目５０）
有効量の前記化合物は、アポリポタンパク質Ｂの発現に関連する疾患または状態を予防す
るために投与される、項目４０に記載の方法。
（項目５１）
有効量の前記化合物は、アポリポタンパク質Ｂの発現に関連する疾患または状態を遅延さ
せるために投与される、項目４０に記載の方法。
（項目５２）
動物におけるグルコースレベルの上昇開始を予防または遅延させる方法であって、治療有
効量または予防有効量の項目１に記載の化合物を、該動物に投与する工程を包含する、
方法。
（項目５３）
動物におけるグルコースレベルの上昇開始を予防または遅延させる方法であって、治療有
効量または予防有効量の項目２２に記載の化合物を、該動物に投与する工程を包含する、
方法。
（項目５４）
前記動物は、ヒトである、項目５２または項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記グルコースレベルは、血清グルコースレベルまたは血漿グルコースレベルである、項
目５４に記載の方法。
（項目５６）
動物における血清コレステロールレベルを調節する方法であって、治療有効量または予防
有効量の項目１または２１に記載の化合物を、該動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目５７）
前記動物は、ヒトである、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
動物におけるリポタンパク質レベルを調節する方法であって、治療有効量または予防有効
量の項目１に記載の化合物を、該動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目５９）
動物におけるリポタンパク質レベルを調節する方法であって、治療有効量または予防有効
量の項目２２に記載の化合物を、該動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目６０）
前記動物は、ヒトである、項目５８または項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記リポタンパク質は、ＶＬＤＬである、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記リポタンパク質は、ＨＤＬである、項目６０に記載の方法。
（項目６３）
前記リポタンパク質は、ＬＤＬである、項目６０に記載の方法。
（項目６４）
前記化合物は、静脈投与される、項目３９、５２、５３、５６、５８および５９のいずれ
か１項に記載の方法。
（項目６５）
前記化合物は、皮下投与される、項目３９、５２、５３、５６、５８および５９のいずれ
か１項に記載の方法。
（項目６６）
配列番号２４７に示される核酸塩基配列を有し、かつ核酸塩基２、３、５、９、１２、１
５、１７、１９および２０に５−メチルシチジンを含む、長さが２０個の核酸塩基である
アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物であって、ここで、各ヌクレオチド間結合はフォ
スフォチオエート結合であり、核酸塩基１〜５および１６〜２０は、２’−メトキシエト
キシル修飾を含み、そして核酸塩基６〜１５はデオキシヌクレオチドである、アンチセン
スオリゴヌクレオチド化合物。
（項目６７）
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、結合体に共有結合されている、項目６６に記載
のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物。
（項目６８）
項目６６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物と、薬学的に許容可能な担体も
しくは希釈剤とを含む、組成物。
（項目６９）
コロイド分散系をさらに含む、項目６８に記載の組成物。
（項目７０）
相補鎖にハイブリダイズされた項目６６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物
を含む、組成物。
（項目７１）
細胞または組織においてアポリポタンパク質Ｂの発現を阻害する方法であって、該細胞ま
たは組織を、アポリポタンパク質Ｂの発現が阻害されるように、項目６６に記載の化合物
と接触させる工程を包含する、方法。
（項目７２）
前記細胞または組織は、インビボで接触される、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記接触させる工程は、前記化合物を動物に投与する工程を包含する、項目７２に記載の
方法。
（項目７４）
前記動物はヒトである、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記ヒトは、アポリポタンパク質Ｂの発現に関連する疾患または状態を有し、そして治療
有効量または予防有効量の前記化合物が投与される、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記ヒトは、脂質代謝異常に関連する状態を有する、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記ヒトは、コレステロール代謝異常に関連する状態を有する、項目７５に記載の方法。
（項目７８）
前記ヒトは、心疾患を有する、項目７５に記載の方法。
（項目７９）
前記心疾患は、アテローム性動脈硬化症である、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記ヒトは、アポリポタンパク質Ｂの発現に関連する代謝異常状態を有する、項目７５に
記載の方法。
（項目８１）
前記代謝異常状態は、高脂血症である、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記ヒトは、糖尿病を有する、項目７５に記載の方法。
（項目８３）
前記ヒトは、肥満である、項目７５に記載の方法。
（項目８４）
有効量の前記化合物は、アポリポタンパク質Ｂの発現に関連する疾患または状態を予防す
るために投与される、項目７４に記載の方法。
（項目８５）
有効量の前記化合物は、アポリポタンパク質Ｂの発現に関連する疾患または状態を遅延さ
せるために投与される、項目７４に記載の方法。
（項目８６）
動物におけるグルコースレベルの上昇開始を予防または遅延させる方法であって、治療有
効量または予防有効量の項目６６に記載の化合物を、該動物に投与する工程を包含する、
方法。
（項目８７）
グルコースレベルは、血清グルコースレベルである、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
グルコースレベルは、血漿グルコースレベルである、項目８６に記載の方法。
（項目８９）
ヒトにおける血清コレステロールレベルを調節する方法であって、治療有効量または予防
有効量の項目６６に記載の化合物を、該ヒトに投与する工程を包含する、方法。
（項目９０）
ヒトにおけるリポタンパク質レベルを調節する方法であって、治療有効量または予防有効
量の項目６６に記載の化合物を、該ヒトに投与する工程を包含する、方法。
（項目９１）
前記リポタンパク質は、ＶＬＤＬである、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
前記リポタンパク質は、ＨＤＬである、項目９０に記載の方法。
（項目９３）
前記リポタンパク質は、ＬＤＬである、項目９０に記載の方法。
（項目９４）
前記化合物は、静脈投与される、項目７３〜９３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９５）
前記化合物は、皮下投与される、項目７３〜９３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９６）
前記化合物は、経口投与される、項目７３〜９３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９７）
項目１〜１５、項目２１〜３０、および項目６６〜６７のいずれか１項に記載の化合物を
含む、キット。
（項目９８）
第２の核酸塩基鎖にハイブリダイズされた第１の核酸塩基鎖を含む化合物であって、各鎖
は長さが８〜５０個の核酸塩基であり、該第１の核酸塩基鎖は、配列番号３に示される配
列の少なくとも８個の連続した核酸塩基の配列を含み、該第２の核酸塩基鎖は、安定した
ハイブリダイゼーションを可能にするように該第１の鎖に対して十分に相補的な配列を含
み、該化合物は、１００ｎＭの濃度での培養物中の８０％コンフルエントなＨｅｐＧ２細
胞において、１６〜２４時間後に少なくとも３０％までヒトアポリポタンパク質Ｂをコー
ドするｍＲＮＡの発現を阻害する、化合物。
（項目９９）
前記第１の鎖は、配列番号３に示される配列の１２〜３０個の連続した核酸塩基の配列を
含む、項目９８に記載の化合物。
（項目１００）
前記第１の鎖は、配列番号３に示された配列の２０個の連続した核酸塩基の配列を含む、
項目９８に記載の化合物。
（項目１０１）
前記第２の鎖は、配列番号３に示された配列の少なくとも８個の連続した核酸塩基に対し
て完全に相補的な配列を含む、項目９８、９９または１００に記載の化合物。
（項目１０２）
前記第２の鎖は、配列番号３に示される配列の１２〜３０個の連続した核酸塩基に対して
完全に相補的な配列を含む、項目１０１に記載の化合物。
（項目１０３）
前記第２の核酸塩基鎖は、配列番号３に示される配列の２０個の連続した核酸塩基に対し
て完全に相補的な配列を含む、項目１０１に記載の化合物。
（項目１０４）
少なくとも１つの鎖は、ＲＮＡを含む、項目９８〜１０３のいずれかに記載の化合物。
（項目１０５）
少なくとも１つの鎖は、１つまたはそれ以上のデオキシヌクレオシドを含む、項目９８〜
１０４のいずれかに記載の化合物。
（項目１０６）
前記ハイブリダイズした鎖は、少なくとも１つの突出末端を形成する、項目９８〜１０５
のいずれかに記載の化合物。
（項目１０７）
前記突出末端は、少なくとも１つの修飾塩基を含む、項目１０６に記載の化合物。
（項目１０８）
前記化合物は、１５０ｎＭの濃度での培養物中の８０％コンフルエントなＨｅｐＧ２細胞
において、少なくとも１６〜２４時間後に、少なくとも５０％までヒトアポリポタンパク
質ＢをコードするｍＲＮＡの発現を阻害する、項目９８〜１０７のいずれかに記載の化合
物。
（項目１０９）
項目９８〜項目１０８のいずれかに記載の化合物を含む、ベシクル。
（項目１１０）
前記ベシクルは、リポソームである、項目１０９に記載のベシクル。
（項目１１１）
項目９８〜１０８のいずれか１項に記載の化合物と、薬学的に許容可能な担体もしくは希
釈剤とを含む、組成物。
（項目１１２）
コロイド分散系をさらに含む、項目１１１に記載の組成物。
（項目１１３）
細胞または組織におけるアポリポタンパク質Ｂの発現を阻害する方法であって、該細胞ま
たは組織を、アポリポタンパク質Ｂの発現が阻害されるような条件下で、項目９８〜１０
８のいずれか１項に記載の化合物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目１１４）
前記細胞または組織はインビボで接触される、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記接触させる工程は、前記化合物を動物に投与する工程を包含する、項目１１４に記載
の方法。
（項目１１６）
前記動物はヒトである、項目１１５に記載の方法。
（項目１１７）
前記ヒトは、アポリポタンパク質Ｂの発現に関連する疾患または状態をし、そして治療有
効量または予防有効量の前記化合物が投与される、項目１１６に記載の方法。
（項目１１８）
前記状態は、脂質代謝異常に関連する、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
前記状態は、コレステロール代謝異常に関連する、項目１１７に記載の方法。
（項目１２０）
前記状態は、心疾患である、項目１１７に記載の方法。
（項目１２１）
前記心疾患は、アテローム性動脈硬化症である、項目１２０に記載の方法。
（項目１２２）
前記状態は、アポリポタンパク質Ｂの発現に関連する代謝異常状態である、項目１１７に
記載の方法。
（項目１２３）
前記アポリポタンパク質のＢ発現に関連する代謝異常状態は、高脂血症である、項目１２
２に記載の方法。
（項目１２４）
前記状態は、糖尿病である、項目１１７に記載の方法。
（項目１２５）
前記状態は、肥満である、項目１１７に記載の方法。
（項目１２６）
有効量の前記化合物は、アポリポタンパク質Ｂの発現に関連する状態を予防するために投
与される、項目１１６に記載の方法。
（項目１２７）
有効量の前記化合物は、アポリポタンパク質Ｂの発現に関連する状態を遅延させるために
投与される、項目１２６に記載の方法。
（項目１２８）
肝細胞によるリポタンパク質（ａ）分泌を減少させる方法であって、以下：
（ａ）該肝細胞を、ヒトアポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡと特異的なハイブリ
ダイズし、かつ１５０ｎＭの濃度での培養物中の８０％コンフルエントなＨｅｐＧ２細胞
において、１６〜２４時間後に、少なくとも３０％まで該ｍＲＮＡの発現を阻害する、長
さが８〜５０個の核酸塩基である非触媒化合物を含む組成物のある量と接触させる工程で
あって、ここで、該量は、該肝細胞におけるアポリポタンパク質Ｂの発現を阻害するのに
有効である、工程；および
（ｂ）該肝細胞によるリポタンパク質（ａ）分泌を測定する工程
を包含する、方法。
（項目１２９）
前記非触媒化合物は、配列番号３に示されるヌクレオチド３２３０〜３２８８と特異的に
ハイブリダイズする、項目１２８に記載の方法。
（項目１３０）
前記非触媒化合物は、配列番号２４７に示される核酸塩基の配列を含む、項目１２９に記
載の方法。
（項目１３１）
前記非触媒化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド模倣物である、項目１２８〜１３
０のいずれかに記載の方法。
（項目１３２）
霊長類におけるアポリポタンパク質Ｂに関連する状態を処置する方法であって、ヒトアポ
リポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡと特異的なハイブリダイズし、かつ１５０ｎＭの
濃度での培養中の８０％コンフルエントなＨｅｐＧ２細胞において、１６〜２４時間後に
、少なくとも３０％まで該ｍＲＮＡの発現を阻害する、長さが８〜５０個の核酸塩基であ
る非触媒化合物の治療有効量または予防有効量を、該霊長類に投与する工程を包含する、
方法。
（項目１３３）
前記霊長類は、ヒトである、項目１３２に記載の方法。
（項目１３４）
前記状態は、脂質代謝異常、コレステロール代謝異常、心疾患、高脂血症、糖尿病および
肥満からなる群より選択される、項目１３３に記載の方法。
（項目１３５）
動物の肝臓におけるアポリポタンパク質Ｂの発現を減少させる方法であって、１５０ｎＭ
の濃度での培養中の８０％コンフルエントなＨｅｐＧ２細胞において、少なくとも３０％
までアポリポタンパク質ＢをコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズする長さが８
〜５０個の核酸塩基である非触媒化合物を、２ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間の量で
、該動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目１３６）
前記化合物は、皮下投与される、項目１３５に記載の方法。
（項目１３７）
前記化合物は、静脈投与される、項目１３５に記載の方法。
（項目１３８）
前記化合物は、経口投与される、項目１３５に記載の方法。
（項目１３９）
前記動物への投与は、繰り返される、項目１３５〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４０）
前記動物は、ヒトである、項目１３５〜１３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４１）
医薬の製造における、項目１〜１５、項目２１〜３０、項目６６〜６７、および項目９８
〜１０８のいずれか１項に記載の化合物の使用。
（項目１４２）
脂質代謝を変化させるための医薬における、項目１〜１５、項目２１〜３０、項目６６〜
６７、および項目９８〜１０８のいずれか１項に記載の化合物の使用。
（項目１４３）
アポリポタンパク質Ｂの発現に関連する疾患または状態に対する医薬における、項目１〜
１５、項目２１〜３０、項目６６〜６７、および項目９８〜１０８のいずれか１項に記載
の化合物の使用。
（項目１４４）
項目９８〜１０８のいずれか１項に記載の化合物を作製する方法であって、インビトロで
第１の核酸塩基鎖を第２の核酸塩基鎖に特異的にハイブリダイズさせる工程を含み、該第
１の核酸塩基鎖は配列番号３に示される配列の少なくとも８個の連続する核酸塩基の配列
を含み、該第２の核酸塩基鎖は安定したハイブリダイゼーションを可能にするように該第
１の鎖に対して十分に相補的な配列を含む、方法。

（発明の詳細な説明）
本発明は、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子の機能を調節する際に、最終的
には、産生されるアポリポタンパク質Ｂの量を調節するために、オリゴマー化合物（特に
、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を用いる。これは、アポリポタンパク質Ｂをコード
する１以上の核酸に特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することによ
って達成される。本明細書中で使用される場合、用語「標的核酸」および「アポリポタン
パク質Ｂをコードする核酸」は、アポリポタンパク質ＢをコードするＤＮＡ、このような
ＤＮＡから転写されたＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを包含する）、およびこの
ようなＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡもまた包含する。オリゴマー化合物の、その標的核
酸との特異的ハイブリダイゼーションは、その核酸の正常な機能を妨害する。標的核酸に
特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸の機能のこの調節は、一般に、「アン
チセンス」といわれる。妨害されるべきＤＮＡの機能としては、複製および転写が挙げら
れる。妨害されるべきＲＮＡの機能としては、生命維持に必要な全ての機能（例えば、タ
ンパク質翻訳部位へのＲＮＡのトランスロケーション、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、
１以上のｍＲＮＡ種を生じるＲＮＡスプライシング、およびＲＮＡに関与し得るかまたは
ＲＮＡによって促進され得る触媒活性など）が挙げられる。標的核酸機能のこのような妨
害の全体的効果は、アポリポタンパク質Ｂの発現調節である。本発明に関連しては、「調
節」とは、遺伝子発現の増大（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明
に関連しては、阻害は、遺伝子発現の好ましい調節形態であり、そしてｍＲＮＡが好まし
い標的である。

アンチセンスに関して特定の核酸を標的とすることが好ましい。アンチセンス化合物を
特定の核酸に対して「標的化」することは、本発明に関連しては、複数工程のプロセスで
ある。このプロセスは通常、その機能が調節されるべき核酸配列の同定に始まる。これは
、例えば、その発現が特定の障害状態もしくは疾患状態と関連している細胞性遺伝子（ま
たはこの遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）または感染性因子由来の核酸分子であり得る。
本発明では、この標的は、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子である。この標的
化プロセスはまた、所望の効果（例えば、このタンパク質の検出またはこのタンパク質の
発現の調節）をもたらすように、この遺伝子内での、アンチセンス相互作用が生じる部位
の決定を包含する。本発明に関連しては、好ましい遺伝子内部位は、その遺伝子のオープ
ンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンまたは翻訳終結コドンを包含する領
域である。当該分野で公知であるように、翻訳開始コドンは代表的には５’−ＡＵＧ（転
写されたｍＲＮＡ分子において；対応するＤＮＡ分子においては５’−ＡＴＧ）であるの
で、翻訳開始コドンはまた、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」または「ＡＵＧ開始コド
ン」ともいわれる。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧまたは５’
−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、そして５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧおよび５’
−ＣＵＧがインビボで機能することが示されている。従って、用語「翻訳開始コドン」お
よび「開始コドン」は、各例における開始アミノ酸は代表的には、メチオニン（真核生物
において）またはホルミルメチオニン（原核生物において）とはいえ、多くのコドン配列
を包含し得る。真核生物遺伝子および原核生物遺伝子が、２以上の代替的開始コドンを有
し得、これらのうちの任意のものが、特定の細胞型もしくは組織において、または特定の
セットの条件下で、翻訳開始に関して優先的に利用され得ることもまた当該分野で公知で
ある。本発明に関しては、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」とは、このようなコ
ドンの配列にかかわらず、アポリポタンパク質Ｂをコードする遺伝子から転写されたｍＲ
ＮＡ分子の翻訳を開始するためにインビボで用いられるコドンをいう。

遺伝子の翻訳終結コドン（または「停止コドン」）が、３つの配列（すなわち、５’−
ＵＡＡ、５’−ＵＡＧおよび５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ、５’−Ｔ
ＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡである）のうちの１つを有し得ることもまた、当
該分野で公知である。用語「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」とは、この
ようなｍＲＮＡまたは遺伝子のうちの、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、
５’または３’）にある約２５〜約５０連続したヌクレオチドを含む部分をいう。同様に
、用語「停止コドン領域」および「翻訳終結コドン領域」とは、このようなｍＲＮＡまた
は遺伝子のうちの、翻訳終結コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）に
ある約２５〜約５０連続したヌクレオチドを含む部分をいう。

オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コード領域」は、翻訳開始コドンと
翻訳終結コドンとの間の領域をいうことが当該分野で公知であり、効果的に標的化され得
る領域でもある。他の標的領域としては、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）（これは、ｍＲ
ＮＡのうちの翻訳開始コドンから５’方向にある部分をいうことが当該分野で公知であり
、従って、ｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドまたは遺
伝子上の対応するヌクレオチドを包含する）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）（これ
は、ｍＲＮＡのうちの翻訳終結コドンから３’方向にある部分をいうことが当該分野で公
知であり、従って、ｍＲＮＡの翻訳終結コドンと３’末端との間のヌクレオチドまたは遺
伝子上の対応するヌクレオチドを包含する）が挙げられる。ｍＲＮＡの５’キャップは、
５’−５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡの最も５’側の残基に連結されたＮ７−メチル
化グアノシン残基を包含する。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造自体な
らびにキャップに隣接する最初の５０ヌクレオチドを包含すると考えられる。５’キャッ
プ領域はまた、好ましい標的領域であり得る。

いくつかの真核生物ｍＲＮＡ転写産物は、直接的に翻訳されるが、多くのものは、転写
産物から翻訳前に切り出される、「イントロン」として公知の１以上の領域を含む。残り
の（それゆえ翻訳された）領域は、「エキソン」として公知であり、そして一緒にスプラ
イシングされて、連続したｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡスプライス部位、すなわち
、イントロン−エキソン連結部はまた、好ましい標的領域であり得、そして異常なスプラ
イシングが疾患に関与する状況または特定のｍＲＮＡスプライス産物の過剰発現が疾患に
関与する状況で特に有用である。再編成または欠失に起因した異常な融合連結部もまた、
好ましい標的である。イントロンもまた、例えば、ＤＮＡまたはプレ−ｍＲＮＡに対して
標的化されるアンチセンス化合物についての効果的な（それゆえ、好ましい）標的領域で
あり得ることが見出されている。

一旦、１以上の標的部位が同定されたら、その標的に対して充分に相補的である、すな
わち、充分によく、そして充分な特異性を有してハイブリダイズし、所望の効果を与える
オリゴヌクレオチドが選択される。

本発明に関しては、「ハイブリダイゼーション」とは、相補的ヌクレオシド塩基間また
は相補的ヌクレオチド塩基間での水素結合（これは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ水素結合
、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合であり得る）を意味
する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を介して対合する、相補的核酸
塩基である。「相補的」とは、本明細書中で使用される場合、２つのヌクレオチド間で正
確に対合する能力をいう。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドは、
ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の同じ位置でヌクレオチドと水素結合し得る場合、このオリ
ゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡとは、その位置で互いに相補的であると考えられる
。このオリゴヌクレオチドとこのＤＮＡまたはＲＮＡとは、各分子における充分な数の対
応する位置が、互いに水素結合し得るヌクレオチドによって占められている場合、互いに
相補的である。従って、「特異的にハイブリダイズし得る」および「相補的」は、安定か
つ特異的な結合がこのオリゴヌクレオチドとこのＤＮＡ標的またはＲＮＡ標的との間で生
じるような充分な程度の相補性または正確な対合を示すために用いられる用語である。ア
ンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の
配列に対して１００％相補的である必要はないことが当該分野で理解される。アンチセン
ス化合物は、この標的ＤＮＡ分子または標的ＲＮＡ分子に対するこの化合物の結合が、こ
の標的ＤＮＡまたはこのＲＮＡの正常な機能を妨害して有用性の喪失を引き起こし、そし
て特異的結合が所望される条件下で（すなわち、インビボアッセイまたは治療処置の場合
は生理学的条件下で、そしてインビトロアッセイの場合はアッセイが実施される条件下で
）非標的配列に対するこのアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するに充分な程度の
相補性が存在する場合、特異的にハイブリダイズし得る。

標的にハイブリダイズしてその標的の発現を阻害する、本発明のアンチセンスおよび他
の化合物は、実験によって同定され、そしてこれらの化合物の配列は、本明細書中以下で
、本発明の好ましい実施形態として同定される。これらの好ましい配列が相補的である標
的部位は、本明細書中以下で、「活性部位」といわれ、それゆえ、標的化のために好まし
い部位である。それゆえ、本発明の別の実施形態は、これらの活性部位にハイブリダイズ
する化合物を包含する。

アンチセンス化合物は通常、研究試薬および診断剤として用いられる。例えば、アンチ
センスオリゴヌクレオチド（これは、遺伝子発現を鋭敏な特異性で阻害し得る）はしばし
ば、特定の遺伝子の機能を解明するために当業者によって用いられる。アンチセンス化合
物はまた、例えば、生物学的経路の種々のメンバーの機能を識別するために用いられる。
それゆえ、アンチセンス調節は、研究用途のために利用されている。

キットおよび診断における使用に関して、本発明のアンチセンス化合物は、単独で、ま
たは他のアンチセンス化合物もしくは治療剤との組合せのいずれかで、細胞内および組織
内で発現される遺伝子の構成要素の一部または全体の発現パターンを解明するために、示
差的分析および／またはコンビナトリアル分析においてツールとして用いられ得る。

１以上のアンチセンス化合物で処理された細胞内または組織内での発現パターンは、ア
ンチセンス化合物で処理されていない、コントロールの細胞または組織と比較され、そし
て生じたパターンは、例えば、調べられる遺伝子の、疾患との関連、シグナル伝達経路、
細胞局在、発現レベル、サイズ、構造または機能に関連するので、示差的レベルの遺伝子
発現について分析される。これらの分析は、刺激された細胞または刺激されていない細胞
において、そして発現パターンに影響を及ぼす他の化合物の存在下または非存在下で実施
され得る。

当該分野で公知の遺伝子発現分析方法の例としては、以下が挙げられる：ＤＮＡアレイ
またはマイクロアレイ（ＢｒａｚｍａおよびＶｉｌｏ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０００
，４８０，１７−２４；Ｃｅｌｉｓら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２−
１６）、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続分析）（Ｍａｄｄｅｎら，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ
．Ｔｏｄａｙ，２０００，５，４１５−４２５）、ＲＥＡＤＳ（消化したｃＤＮＡの制限
酵素増幅）（ＰｒａｓｈａｒおよびＷｅｉｓｓｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ
．，１９９９，３０３，２５８−７２）、ＴＯＧＡ（総遺伝子発現分析）（Ｓｕｔｃｌｉ
ｆｆｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，１
９７６−８１）、タンパク質アレイおよびプロテオミクス（Ｃｅｌｉｓら，ＦＥＢＳ Ｌ
ｅｔｔ．，２０００，４８０，２−１６；Ｊｕｎｇｂｌｕｔら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ
ｅｓｉｓ，１９９９，２０，２１００−１０）、発現配列タグ（ＥＳＴ）の配列決定（Ｃ
ｅｌｉｓら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２−１６；Ｌａｒｓｓｏｎら，
Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０００，８０，１４３−５７）、差引きＲＮＡフィンガ
ープリント（ＳｕＲＦ）（Ｆｕｃｈｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００，２８
６，９１−９８；Ｌａｒｓｏｎら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２０００，４１，２０３−２０
８）、差引きクローニング、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）（Ｊｕｒｅｃｉｃ
およびＢｅｌｍｏｎｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，３，３
１６−２１）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（Ｃａｒｕｌｌｉら，Ｊ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．，１９９８，３１，２８６−９６）、ＦＩＳＨ（蛍光イン
サイチュハイブリダイゼーション）技術（ＧｏｉｎｇおよびＧｕｓｔｅｒｓｏｎ，Ｅｕｒ
．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，３５，１８９５−９０４）および質量分析法（Ｔｏ，Ｃ
ｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ，２０００，３，２
３５−４１において概説される）。

アンチセンスの特異性および感度はまた、治療的用途に関して、当業者によって利用さ
れる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトの疾患状態の処置において治
療部分として用いられている。アンチセンスオリゴヌクレオチド薬物（リボザイムを含む
）は、ヒトに対して安全かつ有効に投与されており、そして多数の臨床試験が現在行われ
ている。従って、オリゴヌクレオチドが、細胞、組織および動物（特に、ヒト）の処置に
関する処置レジメにおいて有用であるように構成され得る有用な治療様式であり得ること
が確立されている。

本発明に関しては、用語「オリゴヌクレオチド」とは、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデ
オキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらの模倣物のオリゴマーまたはポリマーをいう。こ
の用語は、天然に存在する核酸塩基、糖および共有結合性ヌクレオシド間（骨格）結合か
ら構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに同様に機能する、天然に存在しない部分を有
するオリゴヌクレオチドを包含する。このような改変または置換されたオリゴヌクレオチ
ドはしばしば、ネイティブな形態よりも好ましい。なぜなら、所望の特性（例えば、増強
された細胞取り込み、増強された核酸標的親和性およびヌクレアーゼの存在下での増大し
た安定性など）があるからである。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましい形態のアンチセンス化合物であるが、本
発明は、以下で記載されるようなオリゴヌクレオチド模倣物を包含するがこれらに限定さ
れない、他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明によるアンチセンス化合
物は好ましくは、約８〜約５０個の核酸塩基（すなわち、約８〜約５０個連結されたヌク
レオシド）を含む。特に好ましいアンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチド
であり、さらにより好ましくは、約１２〜約３０個の核酸塩基を含むアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドである。アンチセンス化合物としては、標的核酸にハイブリダイズしてその
発現を調節する、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド（オリゴザ
イム（ｏｌｉｇｏｚｙｍｅ）、および他の短い触媒性ＲＮＡまたは触媒性オリゴヌクレオ
チドが挙げられる。

当該分野で公知のように、ヌクレオシドは、塩基と糖との組合せである。ヌクレオシド
の塩基部分は、通常、複素環式塩基である。２つの最も一般的なクラスのこのような複素
環式塩基は、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に
共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌク
レオシドに関して、リン酸基は、糖の２’ヒドロキシル部分、３’ヒドロキシル部分また
は５’ヒドロキシル部分のいずれかへと連結され得る。オリゴヌクレオチドを形成する際
に、リン酸基は、隣のヌクレオシドを別のヌクレオシドへと共有結合的に連結して、直鎖
状のポリマー化合物を形成する。次いで、この直鎖状ポリマー構造体のそれぞれの末端は
、さらに連結されて、環状構造体を形成し得る。しかし、開いた直鎖状構造体が一般的に
好ましい。このオリゴヌクレオチド構造においては、リン酸基は通常、オリゴヌクレオチ
ドのヌクレオシド間骨格を形成するといわれる。ＲＮＡおよびＤＮＡの正常な結合または
骨格は、３’−５’ホスホジエステル結合である。

本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例としては、改変された骨
格または天然に存在しないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
本明細書中で定義する場合、改変された骨格を有するオリゴヌクレオチドとしては、リン
原子をその骨格中に保持するオリゴヌクレオチドおよびリン原子をその骨格中に有さない
オリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書の目的に関して、そしてときどき当該分野で
参照されるように、リン原子をそれらのヌクレオシド間骨格に有さない、改変されたオリ
ゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであるとみなされ得る。

好ましい改変されたオリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、正常な３’−５’結合
を有する、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホ
スホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートおよび他の
アルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート
およびキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホロアミデート（３’−アミ
ノホスホロアミデートおよび３’−アミノアルキルホスホロアミデートを含む）、チオノ
ホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル
、セレノホスフェートならびにボラノホスフェート；これらの２’−５’連結アナログ；
ならびに１以上のヌクレオチド間結合が、３’−３’結合、５’−５’結合または２’−
２’結合である、逆の極性を有するオリゴヌクレオチド骨格が挙げられる。逆の極性を有
する好ましいオリゴヌクレオチドは、最も３’側のヌクレオチド間結合での単一の３’−
３’結合を含む、すなわち、無塩基性（核酸塩基が失われているかまたはその代わりにヒ
ドロキシル基を有する）であり得る単一の逆ヌクレオシド残基を含む。種々の塩、混合塩
および遊離酸の形態もまた含まれる。

上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、以下が挙げられるが
これらに限定されない：米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；
同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同
第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第
５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５
，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，
４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５
１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５
０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７
，３６１号；同第５，１９４，５９９号；同第５，５６５，５５５号；同第５，５２７，
８９９号；同第５，７２１，２１８号；同第５，６７２，６９７号および同第５，６２５
，０５０号。これらのうちの特定のものは、本願と共有に係っており、そしてこれらのう
ちの各々は、本明細書中に参考として援用される。

リン原子を含まない、好ましい改変されたオリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルヌ
クレオシド間結合もしくは短鎖シクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテロ原子およ
びアルキルヌクレオシド間結合もしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１以
上の短鎖へテロ原子ヌクレオシド間結合もしくは短鎖複素環式ヌクレオシド間結合によっ
て形成される骨格を有する。これらとしては、以下が挙げられる：モルホリノ結合を有す
る骨格（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド
骨格、スルホキシド骨格およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセ
チル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨
格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラ
ジノ骨格；スルホネート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合した
Ｎ構成要素部分、Ｏ構成要素部分、Ｓ構成要素部分およびＣＨ_２構成要素部分を有する他
の骨格。

上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的米国特許としては、以下の米国特許
が挙げられるがこれらに限定されない：第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５
号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５
，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５
，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７
号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５
，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２
，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４
号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５
，６７７，４３７号；第５，７９２，６０８号；第５，６４６，２６９号および第５，６
７７，４３９号。これらのうちの特定のものは、本願と共有に係っており、そしてこれら
の各々は、本明細書中に参考として援用される。

他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣物において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレ
オシド間結合の両方（すなわち、骨格）が、新規の基で置き換えられる。塩基単位は、適
切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのそのような
オリゴマー化合物（優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリ
ゴヌクレオチド模倣物）は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）といわれる。ＰＮＡ化合物では、オ
リゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置き換
えられる。この核酸塩基は、維持され、そして骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的
または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、米
国特許第５，５３９，０８２号；米国特許第５，７１４，３３１号；および米国特許第５
，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されず、これらの各々は、本明細書中
で参考として援用される。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７〜１５００に見出され得る。

本発明の最も好ましい実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチ
ドおよびヘテロ原子骨格（特に上記で参照した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ
_２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−ＣＨ_２−［メチレン（メチルイ
ミノ）またはＭＭＩ骨格として公知］、−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−、−ＣＨ
_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ならびに−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ
_２−［ここでネイティブホスホジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ_２−と表される］
、ならびに上記で参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格）を有するオリ
ゴヌクレオシドである。上記で参照した米国特許第５，０３４，５６０号のモルホリノ骨
格構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい。

改変されたオリゴヌクレオチドはまた、１つ以上の置換された糖部分を含み得る。好ま
しいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうち１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−アルキル、
Ｓ−アルキル、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、もしくはＮ−
アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニルもしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アル
キル−Ｏ−アルキル（ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または
非置換の、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１０アルケニルおよびＣ_２〜Ｃ_１０アル
キニルであり得る）。特に好ましくは、Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ
ＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２およ
びＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）］_２であり、ここでｎおよびｍは、１〜約
１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうちの１つを含む：Ｃ
_１〜Ｃ_１０の低級アルキル、置換された低級アルキル、置換された低級アルケニル、置換
された低級アルキニル、置換された低級アルカリール、置換された低級アラルキル、置換
された低級Ｏ−アルカリールもしくは置換された低級Ｏ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、
ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、
ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアル
キルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、イ
ンターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、または
オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、および同様の性質を有する他の
置換基。好ましい改変としては、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエ
チル）または２’−ＭＯＥとしても公知の２’−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３）（Ｍａｒｔ
ｉｎら，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）（すなわち
、アルコキシアルコキシ基）が挙げられる。さらに好ましい改変としては、２’−ジメチ
ルアミノオキシエトキシ（すなわち、本明細書後述でも記載したような、２’−ＤＭＡＯ
Ｅとしても公知の、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基）、および２’−ジメチルアミノ
エトキシエトキシ（当該分野で、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−
ＤＭＡＥＯＥとしても公知）（すなわち、本明細書後述の実施例にも記載される、２’−
Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_２）_２）が挙げられる。

さらに好ましい改変としては、ロックされた核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ）（ＬＮＡ）が挙げられ、ここで２’−ヒドロキシル基は、糖環の３’または４
’の炭素原子と連結しており、それにより二環式糖部分が形成されている。この結合は、
好ましくは、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメチレン（−ＣＨ_２−）_ｎ基であ
り、ここでｎは、１または２である。ＬＮＡおよびその調製は、ＷＯ９８／３９３５２お
よびＷＯ９９／１４２２６に記載される。

他の好ましい改変としては、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ_３）、２’−アミノプロ
ポキシ（２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）、２’−アリル（２’−ＣＨ_２−ＣＨ＝Ｃ
Ｈ_２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）および２’−フルオロ（
２’−Ｆ）が挙げられる。２’−改変は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位において
であり得る。好ましい２’−アラビノ改変は、２’−Ｆである。同様の改変もまた、オリ
ゴヌクレオチド上の他の位置（特に、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’結合オリ
ゴヌクレオチド中の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位）でなされ得る。オ
リゴヌクレオチドはまた、糖模倣物（例えば、ペントフラノシル糖の代わりのシクロブチ
ル部分）を有し得る。このような改変された糖構造体の調製を教示する代表的な米国特許
としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：米国特許第４，９８１，９５７号
；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；
同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同
第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第
５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５
，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，
６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；同第５，７
９２，７４７号；および同第５，７００，９２０号。これらのうちの特定のものは、本願
と共有に係っており、そしてこれらのうちの各々は、その全文が、本明細書中に参考とし
て援用される。

オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（しばしば、当該分野において単に「塩基」とい
われる）の改変または置換を含み得る。本明細書中で用いられる場合、「非改変」または
「天然」の核酸塩基は、プリン塩基である、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、なら
びにピリミジン塩基である、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を包含
する。改変核酸塩基としては、例えば、以下の他の合成核酸塩基および天然核酸塩基が挙
げられる：５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサ
ンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘
導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他
のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハ
ロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ_３）ウラシルおよ
び５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ_３））シトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアル
キニル誘導体、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシ
ル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−ハログアニン、８
−アミノアデニン、８−アミノグアニン、８−チオールアデニン、８−チオールグアニン
、８−チオアルキルアデニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルアデニン、
８−ヒドロキシルグアニン、ならびに他の８−置換アデニンおよび８−置換グアニン、５
−ハロ（特に、５−ブロモ）ウラシル、５−ハロ（特に、５−ブロモ）シトシン、５−ト
リフルオロメチルウラシル、５−トリフルオロメチルシトシン、ならびに他の５−置換ウ
ラシルおよび５−置換シトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ
−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デ
アザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザア
デニン。さらなる改変核酸塩基としては、三環式ピリミジン（例えば、フェノキサジンシ
チジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）
、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−
２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ（例えば、置換されたフェノキサジンシチジン（例え
ば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジ
ン−２（３Ｈ）−オン））、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］イン
ドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピ
ロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が挙げられる。改変核酸塩基はまた、プリン
塩基またはピリミジン塩基が、他の複素環に置き換えられている核酸塩基（例えば、７−
デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドン）を
包含し得る。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示される
核酸塩基、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８５８−８５９頁，Ｋｒｏｓｃｈ
ｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示される核
酸塩基、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，国際版，１９９１
，３０，６１３により開示される核酸塩基、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，第１５章
，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２８９
−３０２頁，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ
，１９９３により開示される核酸塩基が挙げられる。これらの核酸塩基のうちの特定のも
のは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増強するために特に有用である。これら
としては、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２置換プリン、Ｎ−
６置換プリンおよびＯ−６置換プリンが挙げられ、これには２−アミノプロピルアデニン
、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが含まれる。５−メチルシトシ
ン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃上昇させることが示されており（Ｓａ
ｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編，Ａｎｔｉ
ｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，２７６−２７８頁）、そしてこれらは現在好まし
い塩基置換であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖改変と合わせた場合、なおさら特に好ま
しい。

上記の改変核酸塩基ならびに他の改変核酸塩基の特定のものの調製を教示する代表的な
米国特許としては、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに以下の米国特許が
挙げられるがこれらに限定されない：米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０
，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，
０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２
５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１
１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１
号、同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６４５，９８５号
；同第５，８３０，６５３号；同第５，７６３，５８８号；同第６，００５，０９６号；
および同第５，６８１，９４１号（これらのうちの特定のものは、本願と共有に係ってお
り、そしてこれらのうちの各々は、本明細書中に参考として援用される）、ならびに米国
特許第５，７５０，６９２号（これは、本願と共有に係っており、そしてまた本明細書中
に参考として援用される）。

本発明のオリゴヌクレオチドの別の改変は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布また
は細胞取込みを増強する１つ以上の部分または結合体をオリゴヌクレオチドに対して化学
的に連結することを含む。本発明の化合物は、官能基（例えば、一級ヒドロキシル基また
は二級ヒドロキシル基）と共有結合した結合基を包含し得る。本発明の結合基としては、
インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコー
ル、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動
態学的特性を増強する基が挙げられる。代表的な結合基としては、コレステロール、脂質
、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリ
ジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および染料が挙げられる。本発明に関連
して、薬力学的特性を増強する基としては、オリゴマー取込みを改善する基、分解に対す
るオリゴマーの耐性を増強する基、および／またはＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼ
ーションを強化する基が挙げられる。本発明に関連して、薬物動態学的性質を増強する基
としては、オリゴマーの取込み、分布、代謝または排出を改善する基が挙げられる。代表
的な結合基は、１９９２年１０月２３日に出願され、その開示の全体が参考として本明細
書中に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６において開示される。結
合部分としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：脂質部分（例えば、コレ
ステロール部分）（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｂｉ
ｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエ
ーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ａｎｎ．
Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ
ら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）
、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１
９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオール残基またはウン
デシル残基）（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０
，１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，
３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９
−５４）、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチ
ルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネー
ト）（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，
３６５１−３６５４；Ｓｈｅａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，
３７７７−３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａ
ｎら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９
−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ
ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７
）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロ
ール部分（Ｃｒｏｏｋｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，
２７７，９２３−９３７）。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、活性薬物物質（例えば
、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェ
ンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダ
ンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベ
ンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツレート、セ
ファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗細菌剤または抗生物質）に対して結合体化
され得る。オリゴヌクレオチド−薬物結合体およびそれらの調製は、その全体が参考とし
て本明細書中に援用される、米国特許出願第０９／３３４，１３０号（１９９９年６月１
５日に出願）に記載される。

そのようなオリゴヌクレオチド結合体の調製を教示する、代表的な米国特許としては、
以下が挙げられるがこれらに限定されない：米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，
９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５
４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７
８，７１７号，同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１
，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，
０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４
３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４
４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９
号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号
；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；
同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同
第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第
５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５
，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，
３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号，同第５，３９１，７２３号；同第５，４
１６，２０３号，同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１
２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７
，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，
３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９
２３号；同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号。これらのうちの特
定のものは、本願と共有に係っており、そしてこれらのうちの各々は、本明細書中に参考
として援用される。

所定の化合物内の全ての位置に対して、一様に改変する必要はなく、実際、単一の化合
物において、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにおいてすら、１を超え
る上述の改変が組み込まれ得る。本発明はまた、キメラの化合物であるアンチセンス化合
物を包含する。本発明に関連して、「キメラの」アンチセンス化合物または「キメラ」は
、２以上の化学的に異なる領域を含み、これらの領域の各々が、少なくとも１つのモノマ
ー単位（すならち、オリゴヌクレオチド化合物の場合、ヌクレオチド）で構成される、ア
ンチセンス化合物（特に、オリゴヌクレオチド）である。これらのオリゴヌクレオチドは
、代表的に、ヌクレアーゼ分解に対する増強した耐性、増大した細胞取込み、そして／ま
たは標的核酸に対する増大した結合親和性をオリゴヌクレオチドに対して与えるようにオ
リゴヌクレオチドが改変されている、少なくとも１つの領域を含む。オリゴヌクレオチド
のさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切
断し得る酵素に対する基質として役立ち得る。例として、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮ
Ａ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。それゆえ、ＲＮａｓｅ
Ｈの活性化は、ＲＮＡ標的の切断を生じ、それにより、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド
阻害効率を大いに高める。結果として、キメラオリゴヌクレオチドを用いた場合、同じ標
的領域にハイブリダイズするホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、よ
り短いオリゴヌクレオチドを用いて、匹敵する結果がしばしば得られ得る。ＲＮＡ標的の
切断は、ゲル電気泳動、および必要に応じて、当該分野で公知である関連した核酸ハイブ
リダイゼーション技術により慣用的に検出され得る。

本発明のキメラアンチセンス化合物は、上記のような２つ以上のオリゴヌクレオチド、
改変されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチド
模倣物の複合構造体とし形成され得る。このような化合物はまた、当該分野において、ハ
イブリッドまたはギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）といわれている。このようなハイブリッ
ド構造体の調製を教示する代表的な米国特許としては、以下が挙げられるが、これらに限
定されない：米国特許第５，０１３，８３０号；同第５，１４９，７９７号；同第５，２
２０，００７号；同第５，２５６，７７５号；同第５，３６６，８７８号；同第５，４０
３，７１１号；同第５，４９１，１３３号；同第５，５６５，３５０号；同第５，６２３
，０６５号；同第５，６５２，３５５号；同第５，６５２，３５６号；および同第５，７
００，９２２号。これらのうちの特定のものは、本願と共有に係っており、そしてこれら
のうちの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。

本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、周知の固相合成技術を通して、好都
合にかつ慣用的に作製され得る。そのような合成のための装置は、いくつかの販売者（例
えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）が挙げ
られる）によって販売される。当該分野において公知のそのような合成のための任意の他
の手段が、追加的にまたは代替的に用いられ得る。オリゴヌクレオチド（例えば、ホスホ
ロチオエートおよびアルキル化誘導体）の調製のために同様の技術を使用することは周知
である。

本発明のアンチセンス化合物は、インビトロで合成され、生物学的起源のアンチセンス
組成物もアンチセンス分子のインビボでの合成を指示するように設計した遺伝的ベクター
構築物も含まない。

本発明の化合物はまた、取込み、分布および／または吸収の補助のために、他の分子、
分子構造体、または化合物の混合物と（例えば、リポソーム、レセプター標的化分子、経
口処方物、直腸処方物、局所的処方物または他の処方物として）混合され得るか、カプセ
ル化され得るか、結合体化され得るか、さもなければ、会合され得る。そのような取込み
、分布および／または吸収を補助する処方物の調製を教示する代表的な米国特許としては
、以下が挙げられるがこれらに限定されない：米国特許第５，１０８，９２１号；同第５
，３５４，８４４号；同第５，４１６，０１６号；同第５，４５９，１２７号；同第５，
５２１，２９１号；同第５，５４３，１５８号；同第５，５４７，９３２号；同第５，５
８３，０２０号；同第５，５９１，７２１号；同第４，４２６，３３０号；同第４，５３
４，８９９号；同第５，０１３，５５６号；同第５，１０８，９２１号；同第５，２１３
，８０４号；同第５，２２７，１７０号；同第５，２６４，２２１号；同第５，３５６，
６３３号；同第５，３９５，６１９号；同第５，４１６，０１６号；同第５，４１７，９
７８号；同第５，４６２，８５４号；同第５，４６９，８５４号；同第５，５１２，２９
５号；同第５，５２７，５２８号；同第５，５３４，２５９号；同第５，５４３，１５２
号；同第５，５５６，９４８号；同第５，５８０，５７５号；および同第５，５９５，７
５６号。これらは各々、本明細書中に参考として援用される。

本発明のアンチセンス化合物は、任意の薬学的に受容可能な塩、エステル、もしくはそ
のようなエステルの塩、またはヒトを含む動物へと投与されたら、生物学的に活性な代謝
産物またはその残基を（直接的または間接的に）供給し得る、任意の他の化合物を含む。
従って、例えば、この開示はまた、本発明の化合物のプロドラッグおよび本発明の化合物
の薬学的に受容可能な塩、そのようなプロドラッグの薬学的に受容可能な塩、ならびに他
の生体等価物に関する。

用語「プロドラッグ」は、内在性酵素もしくは他の化学物質および／または状態の作用
によって、体内もしくはその細胞内で活性形態（すなわち、薬物）に転換される、不活性
形態で調製される治療薬剤を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドッグ版は
、Ｇｏｓｓｅｌｉｎらに対するＷＯ ９３／２４５１０（１９９３年１２月９日公開）ま
たはＩｍｂａｃｈらに対するＷＯ ９４／２６７６４および米国特許第５，７７０，７１
３号に開示される方法に従って、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェ
ート］誘導体として調製される。

用語「薬学的に受容可能な塩」とは、本発明の化合物の、生理学的および薬学的に受容
可能な塩（すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、その上さらに所望しない
毒物学的影響を与えない塩）をいう。

薬学的に受容可能な塩基付加塩は、金属またはアミン（例えば、アルカリ金属およびア
ルカリ土類金属または有機アミン）を用いて形成される。カチオンとして用いられる金属
の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。適切なアミンの
例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノー
ルアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、および
プロカインである（例えば、Ｂｅｒｇｅら，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔ
ｓ」、Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１−１９を参照のこと）。
上記酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸形態と十分量の所望の塩基とを接触させて従来の
様式でその塩を生成することにより、調製される。この遊離酸形態は、塩形態と酸とを接
触させ、そして従来の様式で遊離酸を単離することによって、再生され得る。この遊離酸
形態は、極性溶媒中での溶解度のような特定の物理的特性がいくらかそれらの各々の塩形
態とは異なるが、他の点ではこれらの塩は、本発明の目的のためにはそれらの各々の遊離
酸と等価である。本明細書中に使用される場合、「薬学的付加塩」は、本発明の組成物の
成分の一つの酸形態の薬学的に受容可能な塩を包含する。これらとしては、アミンの有機
酸塩または無機酸塩が挙げられる。好ましい酸性塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、
硝酸塩およびリン酸塩である。他の適切な薬学的に受容可能な塩は、当業者に周知であり
、そして以下を包含する：種々の無機酸および有機酸の塩基性塩（例えば、無機酸（例え
ば、塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸）との塩基性塩；有機カルボン酸、スルホン酸
、スルホ酸もしくはホスホ酸、またはＮ−置換スルファミン酸（例えば、酢酸、プロピオ
ン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸
、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン
酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、
２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エムボン酸（ｅｍｂｏｎｉｃ ａｃ
ｉｄ）、ニコチン酸またはイソニコチン酸）との塩基性塩；およびアミノ酸（例えば、天
然におけるタンパク質合成に関与する２０種のαアミノ酸（例えば、グルタミン酸または
アスパラギン酸））との塩基性塩、ならびにまた、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エ
タンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベ
ンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフ
タレン−１，５−ジスルホン酸、２−ホスホグリセレートもしくは３−ホスホグリセレー
ト、グルコース−６−ホスフェート、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメート
の形成を伴う）との塩基性塩、または他の酸性有機化合物（例えば、アスコルビン酸）と
の塩基性塩）。化合物の薬学的に受容可能な塩はまた、薬学的に受容可能なカチオンを用
いて調製され得る。適切な薬学的に受容可能なカチオンは、当業者に周知であり、アルカ
リ金属カチオン、アルカリ土類金属カチオン、アンモニウムカチオンおよび四級アンモニ
ウムカチオンを包含する。炭酸塩または炭酸水素塩もまた可能である。

オリゴヌクレオチドに関して、薬学的に受容可能な塩の好ましい例としては、以下が挙
げられるが、これらに限定されない：（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグ
ネシウム、カルシウム、ポリアミン（例えば、スペルミンおよびスペルミジン）などのよ
うなカチオンで形成される塩；（ｂ）例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸な
どのような無機酸で形成される酸付加塩；（ｃ）例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハ
ク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息
香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン
酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラク
ツロン酸などのような有機酸で形成される塩；ならびに（ｄ）塩素、臭素、およびヨウ素
のような元素のアニオンから形成される塩。

本発明のアンチセンス化合物は、診断、治療、予防のために、ならびに研究試薬および
キットとして利用され得る。治療について、アポリポタンパク質Ｂの発現を調節すること
によって処置され得る疾患または障害を有することが疑われる動物（好ましくは、ヒト）
が、本発明によるアンチセンス化合物を投与することによって処置される。本発明の化合
物は、適切な、薬学的に受容可能な希釈剤またはキャリアに有効量のアンチセンス化合物
を添加することによって、薬学的組成物において利用され得る。本発明のアンチセンス化
合物および方法の使用もまた、例えば、感染、炎症または腫瘍形成を予防または遅延させ
るために、予防的に有用であり得る。

本発明のアンチセンス化合物は、研究および診断に有用である。なぜなら、これらの化
合物は、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸にハイブリダイズし、サンドウィッチア
ッセイおよびその他のアッセイが、この事実を活用するように容易に構築されることを可
能にするからである。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの、アポリポタンパク質
Ｂをコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当該分野で公知の手段によって検出
され得る。このような手段としては、オリゴヌクレオチドへの酵素の結合体化、オリゴヌ
クレオチドの放射性標識化または任意の他の適切な検出手段が挙げられ得る。サンプル中
のアポリポタンパク質Ｂのレベルを検出するための、このような検出手段を使用するキッ
トがまた、調製され得る。

本発明はまた、本発明のアンチセンス化合物を含有する薬学的組成物および薬学的処方
物を含む。本発明の薬学的組成物は、局所処置または全身処置のいずれが望まれているか
、および処置される領域に依存して、多くの経路で投与され得る。投与は、局部（眼への
投与、ならびに膣送達および直腸送達を含む粘膜への投与を含む）、肺（例えば、パウダ
ーまたはエアロゾルの吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）または吸入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉ
ｏｎ）（噴霧器によるものを含む）；気管支内、鼻腔内、上皮および経皮、経口または非
経口であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内へ
の注射または注入；あるいは頭蓋内（例えば、くも膜下腔内投与または脳室内投与）が挙
げられる。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル改変を有するオリゴヌクレオチド
は、経口投与に特に有用であると考えられている。

局所投与のための薬学的組成物および薬学的処方物としては、経皮パッチ、軟膏、ロー
ション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体およびパウダーが挙げられ得
る。従来の薬学的キャリア、水性のベース、パウダーベースまたは油ベース、増粘剤など
もまた必要であるか、または望まれ得る。被覆コンドーム、手袋などもまた、有用であり
得る。好ましい局所処方物としては、本発明のオリゴヌクレオチドが、局所送達剤（例え
ば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活
性剤）とともに混合物中にある局所処方物が挙げられる。好ましい脂質およびリポソーム
としては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミ
リストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、ネ
ガティブ（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオ
ン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロリルＤＯＴＡＰおよびジオレオイル
ホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチ
ドは、リポソーム内にカプセル化され得るか、またはリポソーム（特に、カチオン性リポ
ソーム）に複合体を形成し得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、脂質（特に、カチオ
ン性脂質）に複合体化され得る。好ましい脂肪酸および脂肪酸エステルとしては、以下が
挙げられるが、これらに限定されない：アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウ
リン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノー
ル酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセ
リル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチ
ン、アシルコリン、またはＣ_１−１０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステ
ート ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリドあるいは薬学的に受容可能なそれらの塩
。局所処方物は、米国特許出願０９／３１５，２９８（１９９９年５月２０日に出願され
、全体が本明細書中に参考として援用される）に詳細に記載される。

経口投与のための組成物および処方物としては、パウダーまたは顆粒、マイクロ粒子、
ナノ粒子、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、小袋（
ｓａｃｈｅｔ）、錠剤またはミニ錠剤（ｍｉｎｉｔａｂｌｅｔ）が挙げられる。増粘剤、
香料添加剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤は、望ましくあり得る。好ましい
経口処方物は、本発明のオリゴヌクレオチドが、１つ以上の浸透増強剤、界面活性剤およ
びキレート剤と併用して投与される経口処方物である。好ましい界面活性剤としては、脂
肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩が挙げられる
。好ましい胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキ
シケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸
、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ
ａｃｉｄ）、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タ
ウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム、グリコジヒドロフシジン酸ナトリ
ウムが挙げられる。好ましい脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸
、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、
リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、
グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカ
ルニチン、アシルコリン、モノグリセリド、ジグリセリドあるいは薬学的に受容可能なそ
れらの塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。浸透増強剤の組合せ（例えば、胆汁酸／
塩と組み合わせた脂肪酸／塩）もまた好ましい。特に好ましい組合せは、ラウリン酸、カ
プリン酸およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透増強剤としては、ポリオキ
シエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げ
られる。本発明のオリゴヌクレオチドは、スプレーされる乾燥粒子を含む顆粒形態または
ミクロ粒子またはナノ粒子を形成するように複合体化された顆粒形態で、経口で送達され
得る。オリゴヌクレオチド複合体化剤としては、ポリ−アミノ酸；ポリイミン；ポリアク
リレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン（ｐｏｌｙｏｘｅｔｈａｎｅｓ）
、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アク
リレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアク
リレート；ＤＥＡＥ−誘導体化ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎ）、セルロース
およびデンプンが挙げられる。特に好ましい複合体化剤としては、キトサン、Ｎ−トリメ
チルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、
プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ
）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、
ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブ
チルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタ
クリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−
アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアク
リレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）
、アルギナート、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。オリゴヌクレ
オチドのための経口処方物およびそれらの調製は、米国特許出願０８／８８６，８２９（
１９９７年７月１日出願）、０９／１０８，６７３（１９９８年７月１日出願）、０９／
２５６，５１５（１９９９年２月２３日出願）、０９／０８２，６２４（１９９８年５月
２１日出願）および０９／３１５，２９８（１９９９年５月２０日出願）（各々は、その
全体が本明細書中に参考として援用される）に詳細に記載される。

非経口投与、くも膜下腔内投与または脳室内投与のための組成物および処方物としては
、滅菌水溶液（これはまた、緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加物（例えば、浸透増強
剤、キャリア化合物および他の薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤が挙げられるが
これらに限定されない）を含み得る）が挙げられ得る。

本発明の薬学的組成物としては、溶液、エマルジョン、およびリポソーム含有処方物が
挙げられるが、これらに限定されない。これらの組成物は、種々の成分（前もって成形さ
れた（ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ）液体、自己乳化固体および自己乳化半固体が挙げられるが、
これらに限定されない）から作製され得る。

本発明の薬学的処方物（単位投薬形態で便利に与えられ得る）は、製薬業界で周知の従
来の技術に従って調製され得る。このような技術としては、活性成分を薬学的キャリアま
たは賦形剤と結合させる工程が挙げられる。一般的に、この処方物は、活性成分を液体キ
ャリアまたは細かく分割された固体キャリアまたは両方と均一かつ密接に結合させること
および次いで、必要に応じて、この製品を成形することによって調製される。

本発明の組成物は、多くの可能な投薬形態（例えば、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、
液体シロップ、軟性ゲル、坐薬および浣腸が挙げられるがこれらに限定されない）のいず
れかに処方され得る。本発明の組成物はまた、水性媒体、非水性媒体または混合媒体中の
懸濁液として処方され得る。水性懸濁液は、懸濁液の粘性を増やす物質（例えば、カルボ
キシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む）を
さらに含み得る。この懸濁液はまた、安定剤を含み得る。

本発明の１つの実施形態において、薬学的組成物は、泡として処方され、そして使用さ
れ得る。薬学的泡としては、エマルジョン、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリーお
よびリポソームのような処方物が挙げられるが、これらに限定されない。これらの処方物
は、性質において基本的に類似しているが、最終産物の成分および濃度において異なる。
このような組成物および処方物の調製は、薬学および処方の分野における、当業者に一般
的に公知であり、そして本発明の組成物の処方に適用され得る。

（エマルジョン）
本発明の組成物は、エマルジョンとして調製および処方され得る。エマルジョンは、代
表的には、通常直径０．１μｍを越える液滴の形態で別の液体中に分散される、ある液体
の不均一系である。（Ｉｄｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏ
ｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａ
ｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、１９９頁；Ｒ
ｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒ
ｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅ
ｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、２４５頁；Ｂｌｏｃｋ、Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒお
よびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，２巻、３３５頁；Ｈｉｇｕｃｈｉら、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ
ｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８５，３０１頁）。エマルジョンは、しばしば、互いで
完全に混合および分散された２つの不混和性の液体相で構成される二相系である。一般的
に、エマルジョンは、油中水（ｗ／ｏ）または水中油（ｏ／ｗ）種のいずれかであり得る
。水相が、大量の油相に細かく分割され、そして微細な液滴として分散される場合、生じ
た組成物は、油中水（ｗ／ｏ）エマルジョンと呼ばれる。あるいは、油相が、大量の水相
に細かく分割され、そして微細な液滴として分散される場合、生じた組成物は、水中油（
ｏ／ｗ）エマルジョンと呼ばれる。エマルジョンは、分散された相および活性薬物（これ
は、水相、油相中で、またはそれ自体が別の相としてのいずれかで、溶液として存在し得
る）に加えて、さらなる成分を含み得る。乳化剤、安定剤、色素、および抗酸化剤のよう
な薬学的賦形剤もまた、必要に応じて、エマルジョン中に存在し得る。薬学的エマルジョ
ンはまた、（例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）エマルジョンおよび例えば、水中油中水
（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンの場合のような）２つより多くの相で構成される複合エマル
ジョンであり得る。このような複雑な処方物は、しばしば単純な２成分のエマルジョンが
成さない特定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルジョンの個々の油滴が、小さい水滴を囲む
複合エマルジョンは、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを構成する。同様に、油の連続中に安定化
された水の小球中に囲まれた油滴の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルジョンを提供する。

エマルジョンは、熱力学的安定性がほとんどまたは全くないことによって特徴付けられ
る。しばしば、エマルジョンの分散された相または不連続相は、外側の相または連続相に
うまく分散され、そして乳化剤の手段または処方物の粘性により、この形態で維持される
。エマルジョン型の軟膏基剤およびクリームの場合、エマルジョンの相のいずれかは、半
固体または固体であり得る。エマルジョンを安定化する他の手段は、エマルジョンのいず
れかの相に組み込まれ得る乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、４つのカテゴリーに広
く分類され得る：合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸着基剤、および細かく分散
された固体（Ｉｄｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，
Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、１９９頁）。

合成の界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）（界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ ａｃｔｉ
ｖｅ ａｇｅｎｔ）としても知られる）は、エマルジョンの処方物における広い適用性を
有が見出されており、そして文献中で概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢ
ａｎｋｅｒ（編）、１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、２８５頁；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａ
ｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編）、Ｍａ
ｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，１巻、１
９９頁）。界面活性剤は、代表的には両親媒性であり、親水性の部分および疎水性の部分
を含む。界面活性剤の疎水性の性質に対する親水性の性質の割合は、親水／親油バランス
（ＨＬＢ）と呼ばれ、処方物の調製において、界面活性剤を分類および選択する際の価値
のある道具である。界面活性剤は、親水基の性質：非イオン性、アニオン性、カチオン性
、および両親媒性に基づいて異なるクラスに分類され得る（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａ
ｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ Ｒｉｅｇｅｒおよ
びＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、２８５頁）。

乳化処方物において使用される天然に存在する乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、ホス
ファチド、レシチンおよびアカシアが挙げられる。吸着基剤は、吸着基剤が水を吸い上げ
て、無水ラノリンおよび親水性ワセリンのような、吸着基剤の半固体の粘度をなお維持す
るｗ／ｏエマルジョンを形成し得るように、親水性の性質を有する。細かく分割された固
体はまた、特に界面活性剤との併用において、および粘稠性の調製物における良い乳化剤
として使用されている。これらとしては、極性の無機固体（例えば、重金属水酸化物、非
膨張性の粘土（例えば、ベントナイト、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モン
モリロナイト、コロイド状のケイ酸アルミニウムおよびコロイド状のケイ酸マグネシウム
アルミニウム）、顔料および非極性固体（例えば、カーボンまたはグリセリルトリステア
レート）が挙げられる。

多種の非乳化物質もまた、エマルジョン処方物中に含まれ、エマルジョンの性質に寄与
する。これらとしては、脂肪、油、蝋、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、湿潤
剤、親水性コロイド、保存剤および抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒおよび
Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、３３５頁；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓ
ａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１
９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、
１９９頁）。

親水性コロイドまたはヒドロコロイドとしては、天然に存在するゴムおよび合成ポリマ
ー（例えば、多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラギナン、グアールゴム、
カラヤゴム、およびトラガカント））、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセ
ルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、ならびに合成ポリマー（例えば、カル
ボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）が挙げられる。これら
は、水中で分散または膨潤し、コロイド状溶液を形成し、これは分散相の液滴の周りに強
い界面フィルムを形成することおよび外部の相の粘性を増すことによってエマルジョンを
安定化する。

エマルジョンは、しばしば微生物の増殖を容易に支え得る多くの成分（例えば、炭水化
物、タンパク質、ステロールおよびホスファチド）を含むので、これらの処方物は、しば
しば保存剤を取り入れる。エマルジョン処方物中に含まれる一般的に使用される保存剤と
しては、メチルパラベン、プロピルパラベン、４級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウ
ム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルおよびホウ酸が挙げられる。抗酸化剤がまた、処
方物の変質を抑制するためにエマルジョン処方物に一般的に添加される。使用される抗酸
化剤はフリーラジカルスカベンジャー（例えば、トコフェロール、アルキルギャレット、
ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、または還元剤（例えば、
アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム）、および抗酸化共力剤（例えば、クエン
酸、酒石酸、およびレシチン））であり得る。

皮膚科学的経路、経口経路および非経口経路を介したエマルジョン処方物の適用および
それらの製造方法は、文献に概説されている（Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ
（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ
．，１巻、１９９頁）。経口送達のためのエマルジョン処方物は、処方の容易さ、吸収の
有効性およびバイオアベイラビリティーの見地の理由で、非常に広く使用されている。（
Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅ
ｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋ
ｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻，２４５頁；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ
およびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻，１９９頁）。ｏ／ｗエマルジョンとして一般的に経口で投
与されている物質中には、鉱油ベースの下剤、油溶性ビタミンおよび高脂肪栄養調製物が
ある。

本発明の１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドおよび核酸の組成物は、マイク
ロエマルジョンとして処方される。マイクロエマルジョンは、単一で光学的に等方性であ
り、熱力学的に安定な液体溶液である、水、油および両親媒性物質の系として定義され得
る（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅ
ｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅ
ｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，２４５頁）。代表的には、
マイクロエマルジョンは、界面活性剤水溶液中の油をまず分散し、次いで十分量の第４の
成分（一般的には中間の鎖長のアルコール）を透明な系を形成するように添加することに
よって調製される系である。従って、マイクロエマルジョンは、熱力学的に安定で等方的
に透明な、２つの混合できない液体の分散物としてもまた記載され、これらの液体は、表
面活性分子の界面フィルムによって安定化される（ＬｅｕｎｇおよびＳｈａｈ：Ｃｏｎｔ
ｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇ
ｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．編，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１８５頁−２１５頁）。マイクロエマルジョンは、３〜
５の成分の組み合わせによって一般に調製され、これらの成分としては、油、水、界面活
性剤、補助界面活性剤および電解質が挙げられる。マイクロエマルジョンが油中水（ｗ／
ｏ）型であるかまたは水中油（ｏ／ｗ）型であるかは、使用される油および界面活性剤の
特徴ならびに界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的パッキ
ングに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ
．，１９８５，２７１頁）。

状態図を使用した現象論的アプローチは、広範に研究されており、そして当業者に、ど
のようにマイクロエマルジョンを処方するかという包括的な知見を与えてきた（Ｒｏｓｏ
ｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ
，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉ
ｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，２４５頁；Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒおよび
Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，３３５頁）。従来のエマルジョンと比較すると、マイクロエマ
ルジョンは、自発的に形成される、熱力学的に安定な小滴の処方物中に、水不溶性薬物を
溶解するという利点を提供する。

マイクロエマルジョンの調製物において使用される界面活性剤としては、単独でまたは
補助界面活性剤との組み合わせての、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒ
ｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、脂肪酸ポリグリセロールエステル、モ
ノラウリン酸テトラグリセロール（ＭＬ３１０）、モノオレイン酸テトラグリセロール（
ＭＯ３１０）、モノオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ３１０）、ペンタオレイン酸ヘ
キサグリセロール（ＰＯ５００）、モノカプリン酸デカグリセロール（ＭＣＡ７５０）、
モノオレイン酸デカグリセロール（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセスキオレアート（
ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカオレイン酸デカグリセロール（ＤＡＯ７
５０）が挙げられるがこれらに限定されない。補助界面活性剤（通常、短鎖アルコール（
例えば、エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノール））は、界面活性剤分子
間に生成された間隙空間に起因して、界面活性剤フィルムに浸透し、それ故に無秩序なフ
ィルムを作製することによって界面の流動性を増加するように作用する。しかし、マイク
ロエマルジョンは、補助界面活性剤を使用せずに調製され得、無アルコールの自己乳化マ
イクロエマルジョン系は、当該分野で公知である。水相は、代表的に、水、薬物の水溶液
、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコー
ル、およびエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相は、
Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル
、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）のモノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド、ポリ
オキシエチレン化脂肪酸グリセリルエステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセ
リド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコーンオイルの
ような材料が挙げられ得るが、これらに限定されない。

マイクロエマルジョンは、薬物可溶化および薬物の増大された吸収の観点から特に重要
である。脂質ベースのマイクロエマルジョン（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方）は、ペプチド
を含む、薬物の経口バイオアベイラビリティーを増大するために提案されている（Ｃｏｎ
ｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９
４、１１、１３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ、Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９３、１３、２０５）。マイクロエマルジョンは、改
善された格物可溶性、酵素的加水分解からの薬物の保護、膜流動性および透過性における
界面活性剤で誘導された改変に起因する薬物吸収の可能な増大、調製の容易、固形投与量
形態よりも経口投与が容易、改善された臨床的効目、および低減された毒性（Ｃｏｎｓｔ
ａｎｔｉｎｉｄｅｓら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４、
１１、１３８５；Ｈｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９９６、８５、１３８−１４３
）の利点を与える。しばしば、マイクロエマルジョンは、それらの成分が周囲温度で一緒
にされるとき、自然に形成され得る。これは、熱不安定性の薬物、ペプチドまたはオリゴ
ヌクレオチドを処方するとき特に有利であり得る。マイクロエマルジョンはまた、化粧品
および薬学的適用の両方において活性成分の経皮送達に有効である。本発明のマイクロエ
マルジョン組成物および処方物は、胃腸管からのオリゴヌクレオチドおよび核酸の増大し
た全身吸収を容易にし、および胃腸管、膣、頬側口腔および投与のその他の領域内のオリ
ゴヌクレオチドおよび核酸の局所細胞摂取を改善する。

本発明のマイクロエマルジョンはまた、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３
）、ラブラゾールおよび浸透促進剤のような添加成分および添加剤を含み得、処方物の性
質を改善し、そして本発明のオリゴヌクレオチドおよび核酸の吸収を増大する。本発明の
マイクロエマルジョンで用いられる浸透促進剤は、５つの広範なカテゴリー−界面活性剤
、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔ
ｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ
Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁）の１つに属するとして分類され得る。これら分類
の各々は上述されている。

（リポソーム）
マイクロエマルジョンの他に、薬物の処方物のために研究され、かつ用いられている、
多くの組織化された界面活性剤構造がある。これらは、単層、ミセル、二重層およびビヒ
クルを含む。リポソームのようなビヒクルは、薬物送達の観点からそれらが提供する、そ
れらの特異性および持続期間のため、大きな興味を引き付ける。本発明で用いられるとき
、用語「リポソーム」は、球状二重層または二重層中に配列された両親媒性脂質で構成さ
れるビヒクルを意味する。

リポソームは、親油性材料および水性の内側から形成された膜を有する、単層または多
層のヒビクルである。水性部分は、送達されるべき組成物を含む。カチオン性リポソーム
は、細胞壁に融合し得る利点を所有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁と効率的に
融合することはできないが、インビボでマクロファージにより摂取される。

インタクトな哺乳動物皮膚を横切るために、脂質ビヒクルは、適切な経皮グラディエン
トの影響下で、各々が５０ｎｍより小さい直径をもつ、一連の微細な穴を通過しなければ
ならない。したがって、高度に変形可能であり、このような微細な穴を通過し得るリポソ
ームを用いることが所望され得る。

リポソームのさらなる利点は以下を含む；天然のリン脂質から得られたリポソームは、
生体適合性かつ生分解性である；リポソームは、広範な範囲の水および脂質可溶性薬物を
取り込み得る；リポソームは、それらの内部区画において、代謝および分解からカプセル
化された薬物を保護し得る（Ｒｏｓｏｆｆ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇ
ｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編）、１９８
８、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、第１巻、２
４５頁）。リポソーム処方物の調製における重要な考慮は、脂質表面電荷、ビヒクルサイ
ズおよびリポソームの水の容積である。

リポソームは、作用の部位への活性成分の移入および送達に有用である。リポソーム膜
は、生物学的膜に構造的に類似しているので、リポソームを組織に適用するとき、リポソ
ームは、細胞膜と融合することを開始する。リポソームと細胞の融合が進行するにつれ、
リポソーム内容物は、活性成分が作用し得る細胞中へと、空にされる。

リポソーム処方物は、多くの薬物のための送達のモードとして、広範な調査の焦点であ
る。局所投与には、リポソームがその他の処方物に対しいくつかの利点を提示するという
証拠が増加している。このような利点は、投与された薬物の高全身吸収に関連する低減さ
れた副作用、所望の標的における投与された薬物の増加した蓄積、および、皮膚への疎水
性および親水性両方の広範な薬物を投与するための能力を含む。

いくつかの報告は、高分子量ＤＮＡを含む薬剤を皮膚に送達するためのリポソームの能
力の詳細を記載している。鎮痛剤、抗体、ホルモンおよび高分子量ＤＮＡを含む化合物が
皮膚に投与されている。適用の大部分は、上部表皮の標的化を生じた。

リポソームは、２つの広範なクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に荷電
したＤＮＡ分子と相互作用し、安定な複合体を形成する正に荷電したリポソームである。
正に荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、そしてエン
ドソーム中に内部移行する。エンドソーム内の酸性ｐＨに起因して、リポソームは破裂し
、それらの内容物を細胞の細胞質中に放出する（Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９８７、１４７、９８０−９８５）。

ｐＨ感受性であるか、負に荷電したリポソームは、ＤＮＡとの複合体よりもむしろそれ
を包括する。ＤＮＡおよび脂質の両方は同様に荷電されるので、複合体形成よりもむしろ
反発が起こる。それにもかかわらず、特定のＤＮＡは、これらのリポソームの水のある内
側の中に包括される。ｐＨ感受性リポソームを用いて、培養中の細胞単層にチミジンキナ
ーゼ遺伝子をコードするＤＮＡが送達されている。外来遺伝子の発現は、標的細胞中で検
出された（Ｚｈｏｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ
、１９９２、１９、２６９−２７４）。

リポソーム組成物の１つの主要なタイプは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリ
ン脂質を含む。天然リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン
（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る
。一般に、アニオン性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルグリセロール
から形成され、その一方、アニオン性の紡錘形成性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソームは
、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別
のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）（例えば、大豆ＰＣ、お
よび卵ＰＣなど）から形成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジ
ルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。

いくつかの研究は、リポソーム薬物処方物の皮膚への局所送達を評価した。モルモット
皮膚へのインターフェロンを含むリポソームの適用は、皮膚ヘルペスただれの減少をもた
らした。その一方、その他の手段によるインターフェロンの送達（例えば、溶液として、
またはエマルジョンとして）は、有効でなかった（Ｗｅｉｎｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、１９９２、２、４０５−４１０）。さらに、さらな
る研究は、水系を用いるインターフェロンの投与へのリポソーム処方物の一部として投与
されたインターフェロンの効目を試験し、そしてこのリポソーム組成物は、水投与より優
れていたことを結論付けた（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ、１９９２、１８、２５９−２６５）。

非イオンリポソーム系もまた、非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む特定
の系において、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性を決定するために試験された
。Ｎｏｖａｓｏｍｅ^ＴＭＩ（グリセロールジラウレート／コレステロール／ポリオキシエ
チレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ^ＴＭＩＩ（グリセロールジ
ステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含
む、非イオン性リポソーム処方物を用いて、マウス皮膚の真皮中にシクロスポリンＡが送
達された。結果は、このような非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層中へのシクロ
スポリンＡの沈着を容易にすることで有効であったことを示した（Ｈｕら、Ｓ．Ｔ．Ｐ．
Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．、１９９４、４、６、４６６）。

リポソームはまた、「立体的に安定化された」リポソームを含み、この用語は、本明細
書で用いられるとき、リポソーム中に取り込まれたとき、このような特別な脂質を欠くリ
ポソームに対して増加した循環寿命を生じる、１つ以上の特別な脂質を含むリポソームを
いう。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームのベシクル形成性脂質部分の
一部分が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧ_Ｍ１のような１つ以上のグリコリピドを含
むか、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分のような、１つ以上の親水性
ポリマーで誘導体化されているものである。任意の特定の理論により拘束されることを望
まないが、当該分野では、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰ
ＥＧ−誘導体化脂質を含む、立体的に安定化されたリポソームについては、これら立体的
に安定化されたリポソームの増加した循環半減期は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞中への
低下した取込みに由来すると考えられている（Ａｌｌｅｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ
、１９８７、２２３、４２；Ｗｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９３、５３
、３７６５）。

１つ以上のグリコリピドを含む種々のリポソームが当該分野で公知である。Ｐａｐａｈ
ａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９８７、５０７、６
４）は、モノシアロガングリオシドＧ_Ｍ１、ガラクトセレブロシドサルフェートおよびホ
スファチジルイノシトールがリポソームの血液半減期を改良する能力を報告した。これら
の知見は、Ｇａｂｉｚｏｎらにより（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．、１９８８、８５、６９４９）詳細に説明された。両方ともＡｌｌｅｎらによる、米
国特許第４，８３７，０２８号およびＷＯ ８８／０４９２４は、（１）スフィンゴミエ
リンおよび（２）ガングリオシドＧ_Ｍ１またはガラクトセレブロシドサルフェートエステ
ルを含む、リポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）
は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２−ｓｎ−ジミリストイ
ルホスファチジルコリンを含むリポソームは、ＷＯ９７／１３４９９（Ｌｉｍら）に開示
されている。

１つ以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその
調製の方法は、当該分野で公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．Ｊｐｎ．、１９８０、５３、２７７８）は、非イオン性界面活性剤、２Ｃ_１２１５Ｇ
を含み、ＰＥＧ成分を含むリポソームを記載した。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．
、１９８４、１６７、７９）は、ポリマー性グリコールでのポリスチレン粒子の親水性被
覆が、有意に増加した血液半減期を生じることを記載した。ポリアルキレングリコール（
例えば、ＰＥＧ）のカルボン酸基の付着によって改変された合成リン脂質はＳｅａｒｓ（
米国特許第４，４２６，３３０号および同第４，５３４，８９９号）によって記載されて
いる。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９０、２６８、２３５）は、Ｐ
ＥＧまたはＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ
）を含むリポソームの血液循環半減期が有意に増加することを示す実験を記載した。Ｂｌ
ｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１９９０、
１０２９、９１）は、このような観察を、他のＰＥＧ−誘導体化リン脂質、例えば、ジス
テアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧとの組合せから形成さ
れる、ＤＳＰＥ−ＰＥＧに拡張した。Ｆｉｓｈｅｒによる欧州特許第ＥＰ ０４４５１３
１Ｂ１およびＷＯ９０／０４３８４には、それらの外表面上に共有結合したＰＥＧ成分を
有するリポソームが記載されている。１〜２０モル％のＰＥＧで誘導体化されたＰＥを含
むリポソーム組成物、およびその使用の方法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３
，５５６号および同５，３５６，６３３号）およびＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１
３，８０４号および欧州特許第ＥＰ ０４９６８１３Ｂ１）によって記載されている。多
くのその他の脂質−ポリマー複合体を含むリポソームが、ＷＯ９１／０５５４５および米
国特許第５，２２５，２１２号（両方ともＭａｒｔｉｎらによる）およびＷＯ９４／２０
０７３（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に記載されている。ＰＥＧ−改変セラミドリピドを含むリ
ポソームは、ＷＯ９６／１０３９１（Ｃｈｏｉら）に記載されている。米国特許第５，５
４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および同第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａ
ら）は、それらの表面上で官能成分によりさらに誘導体化され得るＰＥＧ含有リポソーム
を記載している。

核酸を含む限定数のリポソームが当該分野で知られている。ＴｈｉｅｒｒｙらによるＷ
Ｏ９６／４００６２は、リポソーム中に高分子量核酸をカプセル化するための方法を記載
する。Ｔａｇａｗａらによる、米国特許第５，２６４，２２１は、タンパク質が結合した
リポソームを開示し、そしてこのようなリポソームの内容物は、アンチセンスＲＮＡを含
み得ることを主張している。Ｒａｈｍａｎらによる米国特許第５，６６５，７１０号は、
リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドをカプセル化する特定の方法を記載している
。ＬｏｖｅらによるＷＯ９７／０４７８７は、ｒａｆ遺伝子を標的にするアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを含むリポソームを開示している。

トランスフェロソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅ）は、なお別のタイプのリポソー
ムであり、そして薬物送達ビヒクルの魅力的な候補である高度に変形可能な脂質凝集物で
ある。トランスフェロソームは脂質小滴であり、それらがこの小滴より小さな穴を容易に
通過し得るように高度に変形可能である脂質小滴として記載され得る。トランスフェロソ
ームは、それらが用いられる環境に適合可能であり、例えば、それらは、自己適合性（皮
膚中の穴の形状に適合可能）であり、自己修復性であり、フラグメント化なくしてそれら
の標的に頻繁に到達し、そしてしばしば自己充填性である。トランスフェロソームを作製
するために、標準的なリポソーム組成物に、通常界面活性剤である、表面エッジ活性化剤
を添加することが可能である。トランスフェロソームは、皮膚に血清アルブミンを送達す
るために用いられている。血清アルブミンのトランスフェロソーム媒介送達は、血清アル
ブミンを含む溶液の皮下注入と同様に有効であることが示されている。

界面活性剤は、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソームのよう
な処方物において、広範な適用を見出している。天然および合成の両方の多くのタイプの
界面活性剤の性質を分類かつランク分けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バラン
ス（ＨＬＢ）の使用による。親水性基の性質（「頭部」としても知られる）は、処方物で
用いられる異なる界面活性剤をカテゴリーに分類するための最も有用な手段を提供する（
Ｒｉｅｇｅｒ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｍａｒｃｅ
ｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９８８、２８５頁）。

界面活性剤分子がイオン化されていないとき、非イオン性界面活性剤として分類される
。非イオン性界面活性剤は、薬学的製品および化粧品に広範な適用を見出し、そして広範
な範囲のｐＨ値に亘って使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に
依存して、２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤は、エチレングリコールエス
テル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、
ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシ化エステルのような非イオン
性エステルを含む。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、および
エトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーのような、非イオン性アルカノールアミ
ドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非
イオン性界面活性剤クラスの最も一般的なメンバーである。

界面活性剤が水に溶解または分散されるとき、それが負電荷を保持する場合、この界面
活性剤は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤は、石鹸、アシルラクチ
レート、アミノ酸のアシルアミドのようなカルボキシレート、アルキル硫酸およびエトキ
シル化アルキルサルフェートのような硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネート、
アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホサクシネートのようなスルホネー
ト、およびホスフェートを含む。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要なメンバーは、
アルキルサルフェートおよび石鹸である。

界面活性剤が水に溶解または分散されるとき、それが正電荷を保持する場合、この界面
活性剤は、カチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤は、第四級アンモニウム
塩およびエトキシ化アミンを含む。この第四級アンモニウム塩は、このクラスで最も使用
されるメンバーである。

界面活性剤分子が、正または負電荷のいずれかを保持する能力を有する場合、この界面
活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤は、アクリル酸誘導体、置換アルキルア
ミド、Ｎ−アルキルベタインおよびホスファチドを含む。

薬物製品、処方物における、およびエマルジョンにおける界面活性剤の使用が総説され
ている（Ｒｉｅｇｅｒ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｍ
ａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９８８、２８５頁）
。

（透過エンハンサー）
１つの実施形態では、本発明は、種々の透過エンハンサーを採用し、動物の皮膚に、核
酸、特にオリゴヌクレオチドの効率的な送達を行う。大部分の薬物は、イオン化形態およ
び非イオン化形態の両方で存在する。しかし、通常、脂質可溶性または親油性薬物のみが
容易に細胞膜を横切る。横切られるべき膜が透過エンハンサーで処理される場合、非親油
性薬物でさえ、細胞膜を横切り得ることが発見された。細胞膜を横切る非親油性薬物の拡
散を補助することに加え、透過エンハンサーはまた、親油性薬物の透過性を増大する。

透過エンハンサーは、５つの広範なカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁
酸塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤剤（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒ
ｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ、１９９１、９２頁）の１つに属するとして分類され得る。透過エンハンサーの上記
のクラスの各々は、以下により詳細に記載される。

界面活性剤：本発明に関連して、界面活性剤（または「表面活性薬剤」）は、水溶液に
溶解されるとき、この溶液の表面張力、または水溶液と別の液体との間の界面間の張力を
低減する化学的実体であり、粘膜を通るオリゴヌクレオチドの吸収が増大される。胆汁酸
塩および脂肪酸に加え、これらの透過エンハンサーは、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム
、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエステル、およびポリオキシエチレン−２０−セチ
ルエーテル（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁）；およびＦＣ−
４３のような、水素をフッ素で置換した化合物（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ）
のエマルジョン（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９
８８、４０、２５２）を含む。

脂肪酸：透過エンハンサーとして作用する、種々の脂肪酸およびそれらの誘導体は、例
えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチ
ン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオ
レイン（１−モノオレイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキ
ドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン
、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ_１−１０アルキル（例えば、メチル、イ
ソプロピルおよびｔ−ブチル）エステル、およびそれらのモノおよびジグリセリド（例え
ば、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート
、リノリエートなど）を含む（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁
；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３；Ｅｌ Ｈ
ａｒｉｒｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９２、４４、６５１−６５
４）。

胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収
の促進が挙げられる（Ｂｒｕｎｔｏｎ、第３８章：Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’
ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃｓ、第９版、Ｈａｒｄｍａｎら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１
９９６、９３４−９３５頁）。種々の天然の胆汁酸塩およびその合成の誘導体は、浸透増
強剤として作用する。従って、用語「胆汁酸塩」は、胆汁の任意の天然に存在する成分、
およびそれらの任意の合成誘導体を含む。本発明の胆汁酸塩としては、例えば、以下が挙
げられる：コール酸（またはその薬学的に受容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム
）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコ
ール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコ
ール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、
タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキ
シコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、
ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロー２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナト
リウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン
−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉ
ｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、
９２頁；Ｓｗｉｎｙａｒｄ、第３９章：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．、１９９０、７８２−７８３頁；Ｍｕｒａｎｉｓ
ｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ
Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．
Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９２、２６３、２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｊ
．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９９０、７９、５７９−５８３）
キレート剤：本発明に関して使用される場合、キレート剤は、金属イオンと錯体を形成
することによって溶液から金属イオンを除去し、その結果、粘膜を介するオリゴヌクレオ
チドの吸収が促進される化合物として定義され得る。本発明における浸透増強剤としての
それらの使用に関して、キレート剤は、ＤＮａｓｅインヒビターとしても作用するという
さらなる利点を有する。なぜなら、最も特徴付けられたＤＮＡヌクレアーゼは、触媒のた
めに二価の金属イオンを必要とし、従って、キレート剤によって阻害されるからである（
Ｊａｒｒｅｔｔ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、１９９３、６１８、３１５−３３９）。
本発明のキレート剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：エチレンジ
アミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸
ナトリウム、５−メトキシサリチレートおよびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔ
ｅ））、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス（ｌａｕｒｅｔｈ）−９およびβ−ジ
ケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉ
ｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、
１９９１、９２頁；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１
−３３；Ｂｕｕｒら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．、１９９０、１４、４３−５１）。

非キレート性非界面活性剤：本明細書中で使用される場合、非キレート性非界面活性剤
浸透促進化合物は、キレート剤または界面活性剤としてわずかな活性しか実証しないにも
かかわらず、消化粘膜を通るオリゴヌクレオチドの吸収を促進する化合物として規定され
得る（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅ
ｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３）。こ
の種類の浸透増強剤としては、例えば、不飽和環式尿素、１−アルキル−アルカノン誘導
体および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ
Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ、１９９１、９２頁）；ならびに非ステロイド抗炎症剤（例えば、ジクロフェナク
ナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾン（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｐｈ
ａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９８７、３９、６２１−６２６）が挙げられる。

細胞レベルでのオリゴヌクレオチドの取り込みを促進する薬剤はまた、本発明の薬学的
組成物および他の組成物に添加され得る。例えば、カチオン性脂質（例えば、リポフェク
チン（Ｊｕｎｉｃｈｉら、米国特許第５，７０５，１８８号））、カチオン性グリセロー
ル誘導体、およびポリカチオン性分子（例えば、ポリリジン（Ｌｏｌｌｏら、ＰＣＴ出願
ＷＯ ９７／３０７３１））はまた、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを促進すること
が知られている。

他の薬剤が、投与された核酸の浸透を促進するために利用され得る。これらの薬剤とし
ては、グリコール（例えば、エチレングリコールおよびプロピレングリコール）、ピロー
ル（例えば、２−ピロール）、アゾン（ａｚｏｎｅ）およびテルペン（例えば、リモネン
およびメントン）が挙げられる。

（キャリア）
本発明の特定の組成物はまた、処方物中にキャリア化合物を含む。本明細書中で使用さ
れる場合、「キャリア化合物」または「キャリア」とは、核酸またはそれらのアナログを
いい得、これは、不活性（すなわち、それ自体生物活性を有さない）であるが、例えば、
生物学的に活性な核酸を分解すること、または循環から生物学的に活性な核酸を除去する
ことを促進することによって、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティーを
減少させるインビボプロセスにより、核酸として認識される。核酸とキャリア化合物との
同時投与（典型的に、後者の物質過剰である）は、おそらく、共通のレセプターについて
のキャリア化合物と核酸との間の競合に起因して、肝臓、腎臓または他の体外循環レザバ
において回収される核酸の量の実質的な減少を生じ得る。例えば、肝臓組織における部分
的なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの回収は、ポリイノシン酸、硫酸デキストラ
ン、ポリシチジン酸または４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２
’−ジスルホン酸と同時投与される場合に減少され得る（Ｍｉｙａｏら、Ａｎｔｉｓｅｎ
ｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．、１９９５、５、１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａら、Ａｎｔ
ｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．、１９９６、６、１７７−
１８３）。

（賦形剤）
キャリア化合物とは対照的に、「薬物学的キャリア」または「賦形剤」は、薬学的に受
容可能な溶媒、懸濁剤または動物に１つ以上の核酸を送達するための他の任意の薬物学的
に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体でも固体でもよく、核酸と所定の薬学的組成
物の他の成分とが組み合わされる場合、所望のバルク、粘稠度などが提供されるように考
慮して計画された投与様式によって選択され得る。代表的な薬学的キャリアとしては、以
下が挙げられるが、これらに限定されない：結合剤（例えば、予めゼラチン化したトウモ
ロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど
）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチ
ン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウム
など）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸
化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属、水素化植物油、トウモロコシデンプン、ポ
リエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、
デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えば、ラウリル硫
酸ナトリウムなど）。

核酸と有害に反応しない、非腸管外投与に適切な薬学的に受容可能な有機賦形剤または
無機賦形剤もまた、本発明の組成物を処方するために使用され得る。適切な薬学的に受容
可能なキャリアとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水、塩溶液、ア
ルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸
マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビ
ニルピロリドンなど。

核酸の局所投与のための処方物としては、以下が挙げられ得る：滅菌水溶液および非滅
菌水溶液、アルコールのような一般的な溶媒中の非水溶液、または液体油ベースもしくは
固体油ベース中の核酸溶液。これらの溶液はまた、緩衝剤、希釈剤、および他の適切な添
加剤を含み得る。核酸と有害な反応をしない、非腸管外投与に適切な薬学的に受容可能な
有機賦形剤または無機賦形剤が、使用され得る。

適切な薬学的に受容可能な賦形剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロ
ース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチル
セルロース、ポリビニルピロリドンなど。

（拍動性送達）
本発明の化合物はまた、拍動性送達によって投与され得る。「拍動性送達」とは、浸透
増強剤と組み合わせた薬物の第１のパルスと浸透増強剤の第２のパルスを送達して、浸透
増強剤の第１のパルスでの放出の際に吸収されない薬物の吸収を促進する薬学的処方物を
いう。

本発明の１つの実施形態は、腸の薬物吸収を増強するための遅延放出経口処方物であり
、この処方物は、以下：
（ａ）上記薬物と浸透増強剤とを含有するキャリア粒子の第１の集団であって、上記薬
物および上記浸透増強剤は、腸の第１の位置において放出される、第１の集団；ならびに
（ｂ）浸透増強剤と遅延放出コーティングもしくはマトリクスとを含有するキャリア粒
子の第２の集団であって、浸透増強剤が第１の位置よりも下流にある腸の第２の位置にお
いて放出され、それによって、薬物が第２の位置に到達する場合に、薬物の吸収を増強す
る、第２の集団
を含む。

あるいは、（ａ）および（ｂ）における浸透増強剤は別個のものである。

この増強は、少なくとも２つのキャリア粒子の集団をカプセル化することによって得ら
れる。キャリア粒子の第１の集団は、生物学的に活性な物質および浸透増強剤を含み、そ
して、キャリア粒子の第２の（そして必要に応じて追加の）集団は、浸透増強剤および遅
延放出コーティングもしくはマトリクスを含む。

経口投与された薬物に適用する「初回通過効果」は、胃酸および種々の消化酵素の作用
による分解である。初回通過効果を緩和する１つの手段は、薬物の投与用量を増やし、そ
れによって、薬物の集団の初回通過クリアランスに対する損失を補うことである。このこ
とは、例えば、単純に、より多くの薬物を動物に与えることによってｉ．ｖ．投与で容易
に達成され得るが、他の因子が、非経口手段により投与される薬物のバイオアベイラビリ
ティに影響を及ぼす。例えば、薬物は、消化管もしくは血流において酵素的もしくは化学
的に分解され得、そして／または、種々の粘膜に対して不浸透性もしくは半透性であり得
る。

これらの薬学的組成物は、直腸、膣、鼻腔もしくは肺の経路を介して投与される場合に
、生物学的に活性な物質の吸収を増強し得ることがまた意図される。生物学的に活性な物
質の放出は、腸管の任意の部分において達成され得ることがまた意図される。

オリゴヌクレオチドの液体薬学的組成物は、適切なビヒクル（例えば、滅菌の発熱物質
を含まない水または生理食塩水溶液）とオリゴヌクレオチドを合わせることによって調製
され得る。他の治療用化合物が、必要に応じて含められ得る。

本発明はまた、固体粒子状組成物の使用を意図する。このような組成物は、好ましくは
、吸入可能なサイズのオリゴヌクレオチドの粒子を含む。このような粒子は、例えば、従
来の手段により、乳鉢および乳棒を用いて、乾燥オリゴヌクレオチドをすりつぶし、次い
で、得られた粉末組成物を、４００メッシュ篩を通して大きな粒子および塊を分離するこ
とによって調製され得る。活性なオリゴヌクレオチドから構成される固体粒子状組成物は
、必要に応じて、エアロゾルの形成を促進するように機能する分散剤（例えば、ラクトー
ス）を含み得る。

本発明に従って、オリゴヌクレオチド組成物が、エアロゾル化され得る。液体粒子のエ
アロゾル化は、ネブライザーのような任意の適切な手段によって生成され得る。例えば、
米国特許第４，５０１，７２９号を参照のこと。ネブライザーは、溶液もしくは懸濁液を
、狭いベンチュリオリフィスを通る圧縮ガス（代表的には空気もしくは酸素）の加速によ
ってか、または、超音波振動によって、治療用エアロゾルミストに変換する、市販のデバ
イスである。適切なネブライザーとしては、ＰＡＲＩ ＬＣ ＰＬＵＳ，ＰＡＲＩ ＤＵ
ＲＡ−ＮＥＢ ２０００，ＰＡＲＩ−ＢＡＢＹ Ｓｉｚｅ，ＰＡＲＩ ＰＲＯＮＥＢ Ｃ
ｏｍｐｒｅｓｓｏｒ ｗｉｔｈ ＬＣ ＰＬＵＳ，ＰＡＲＩ ＷＡＬＫＨＡＬＥＲ Ｃｏ
ｍｐｒｅｓｓｏｒ／Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ，ＰＡＲＩ ＬＣ ＰＬＵＳ Ｒ
ｅｕｓａｂｌｅ ＮｅｂｕｌｉｚｅｒおよびＰＡＲＩ ＬＣ Ｊｅｔ＋ｅＮｅｂｕｌｉｚ
ｅｒの名でＢｌａｉｒｅより販売されているものが挙げられる。

ネブライザーにおいて使用するための例示的な処方物は、滅菌の発熱物質を含まない水
または生理食塩水溶液のような液体中のオリゴヌクレオチドから構成され、ここで、この
オリゴヌクレオチドは、処方物の約４０％ｗ／ｗまでを構成する。好ましくは、オリゴヌ
クレオチドは、２０％ｗ／ｗ未満を構成する。所望される場合、保存料（例えば、メチル
ヒドロキシ安息香酸エステル）、抗酸化剤および矯味剤のようなさらなる添加物が、この
組成物に添加され得る。

オリゴヌクレオチドを含む固体粒子は、当該分野で公知の任意の固体粒子状医薬のエア
ロゾル生成器を用いてエアロゾル化され得る。このようなエアロゾル生成器は、上記のよ
うに吸入可能な粒子を生成し、そしてさらに、エアロゾルの単位容量あたりの再現性の定
量を生成する。適切な固体粒子状エアロゾル生成器としては、吸入器および定量吸入器が
挙げられる。定量吸入器は、当該分野で用いられ、本発明において有用である。

好ましくは、液体もしくは固体のエアロゾルが、約１０〜１５０リットル／分の速度、
より好ましくは、約３０〜１５０リットル／分の速度、そして最も好ましくは約６０リッ
トル／分の速度で生成される。

生物学的に活性な物質のバイオアベイラビリティの増強はまた、組成物の経口投与およ
び本発明の方法によって達成される。用語「バイオアベイラビリティ」とは、非経口の投
与様式を用いて、動物に薬物を導入する場合に、投与される薬物のどの部分が循環系に到
達するかの指標をいう。

浸透増強剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：界面活性剤、脂肪酸
、胆汁酸、キレート化剤および非キレート化非界面活性分子のような分子分類のメンバー
（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒ
ｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。キャリアは、本発明の
組成物内に含められて、生物利用可能な薬物のレベルの減少を生じるプロセスを妨害し得
る、不活性な分子である。

（他の成分）
本発明の組成物は、薬学的組成物中に慣習的に見出される他のアジュバント成分を、当
該分野で確立された使用レベルでさらに含み得る。したがって、例えば、組成物は、さら
なる適合性の薬学的に活性な物質（例えば、かゆみ止め、収れん薬、局所麻酔剤または抗
炎症剤）を含み得るか、あるいは本発明の組成物の、種々の投薬形態を生理学的に処方す
ることにおいて有用なさらなる物質（例えば、色素、矯味剤、保存剤、酸化防止剤、乳白
剤、増粘剤および安定剤）を含み得る。しかし、このような材料は、添加される場合に、
本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に阻害するべきではない。これらの処方物は
、安定化され得、そして所望される場合、処方物の核酸と有害に相互作用しない補助剤（
例えば、滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝剤、着色
料、矯味物質および／または芳香物質など）と混合され得る。

水性懸濁液は、懸濁液の粘性を増加させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロース
ナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランが挙げられる）を含み得る。懸濁
液はまた、安定剤を含み得る。

本発明の特定の実施形態は、（ａ）１つ以上のアンチセンス化合物、および（ｂ）１つ
以上の他の化学療法剤（これは、非アンチセンス機構によって機能する）を含む薬学的組
成物を提供する。このような化学療法剤の例としては、以下が挙げられるが、これらに限
定されない：ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エ
ピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド（ｍａｆｏ
ｓｆａｍｉｄｅ）、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロ
ソウレア（ｂｉｓ−ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ブスルファン、マ
イトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプレ
ゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサ
メチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブ
シル、メチルシクロへキシルニトロソウレア（ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｎｉｔ
ｒｏｓｕｒｅａ）、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６
−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシウ
レア、デオキシコホルマイシン（ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ）、４−ヒドロキシペ
ルオキシシクロホスホラミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキ
シウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、
ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキサート、イ
リノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ゲムシタビ
ン、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ｄｉｅｔｈｙｌｓｔ
ｉｌｂｅｓｔｒｏｌ（ＤＥＳ））。一般的に、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１５版、１９８７、１２０６−１２
２８頁、Ｂｅｒｋｏｗら編、Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．を参照のこと。本発明の化合物と共
に使用される場合、このような化学療法剤は、別個に（例えば、５−ＦＵおよびオリゴヌ
クレオチド）か、連続して（例えば、一定時間の５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド、引
き続いてＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド）か、あるいは１つ以上の他のこのような化学
療法剤と組み合わせて（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド、または５
−ＦＵ、放射線療法およびオリゴヌクレオチド）使用され得る。抗炎症薬物（非ステロイ
ド抗炎症薬物およびコルチコステロイドが挙げられるが、これらに限定されない）、なら
びに抗ウイルス薬物（リビビリン（ｒｉｂｉｖｉｒｉｎ）、ビダラビン、アシクロビルお
よびガンシクロビルが挙げられるが、これらに限定されない）もまた、本発明の組成物と
組み合わされ得る。一般的に、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏ
ｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１５版、Ｂｅｒｋｏｗら編、１９８７、Ｒａｈｗａ
ｙ，Ｎ．Ｊ．、それぞれ、２４９９−２５０６頁および４６−４９頁を参照のこと。他の
非アンチセンス化学療法剤もまた、本発明の範囲内である。２つ以上組み合わせた化合物
は、一緒にか、または連続して使用され得る。

別の関連する実施形態において、本発明の組成物は、第１核酸に標的化された１つ以上
のアンチセンス化合物（特にオリゴヌクレオチド）、および第２核酸標的に標的化された
１つ以上のさらなるアンチセンス化合物を含み得る。アンチセンス化合物の多数の例は、
当該分野で公知である。２つ以上組み合わせた化合物は、一緒にか、または連続して使用
され得る。

治療組成物の処方およびそれに続く投与は、当業者の技術の範囲内と考えられる。投与
は、処置されるべき疾患状態の重篤度および応答性に依存して、数日から数ヶ月間まで続
く処置過程で、あるいは治癒がもたらされるか、または疾患状態の縮小が達成されるまで
続く。最適な投与スケジュールは、患者の身体における薬物蓄積の測定から計算され得る
。当業者は、最適な投薬量、投与方法および繰り返し率を容易に決定し得る。最適な投薬
は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的な効力に非常に依存し得、そして一般的に、イン
ビトロおよびインビボ動物モデルにおいて有効であることが見出されたＥＣ_５０に基づい
て評価され得る。一般的に、投薬量は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇであり
、そして１日に１回以上、一週間に１回以上、一ヶ月に１回以上、もしくは１年に１回以
上、または２年〜２０年ごとに１回、与えられ得る。当業者は、測定された、身体の流体
または組織における薬物の滞留時間および濃度に基づいて、投与のための繰り返し率を容
易に決定し得る。首尾よい処置の後、患者は、疾患状態の再発を予防するために維持療法
を受けることが所望され得、ここで、このオリゴヌクレオチドは、維持用量（体重１ｋｇ
あたり０．０１μｇ〜１００ｇ、１日に１回以上〜２０年毎に１回の範囲）で投与される
。

（併用療法）
本発明はまた、併用療法の方法も提供し、この方法において、１種以上の本発明の化合
物および１種以上の他の治療／予防用化合物が投与されて、本明細書中に記載されるよう
な状態および／または疾患状態を処置する。種々の局面において、本発明の化合物および
治療／予防用化合物は、混合物として同時に投与されるか、または別々に投与される。１
つの局面において、投与経路は、本発明の化合物および治療／予防用化合物について同じ
であるが、別の局面において、本発明の化合物および治療／予防用化合物は、異なる投与
経路によって投与される。１つの実施形態において、本発明の化合物および治療／予防用
化合物の投薬量は、別々に投与される場合に、各化合物について治療有効もしくは予防有
効な量である。あるいは、併用投与は、別々に投与される場合の治療効果もしくは予防効
果を達成するために必要とされるよりも低い投薬量の使用を可能にし、そして、このよう
な方法は、化合物の用量を減らすことの１種以上の副作用を減らすことにおいて有用であ
る。

１つの局面において、本発明の化合物、およびある状態を処置する際に有効な１種以上
の他の治療／予防用化合物が投与され、ここで、両方の化合物が、同じかまたは異なる機
構により作用する。治療／予防用化合物としては以下が挙げられるがこれらに限定されな
い：胆汁酸金属イオン封鎖樹脂（例えば、コレスチラミン、コレスチポールおよびコレセ
ベラム塩酸塩（ｃｏｌｅｓｅｖｅｌａｍ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ））、ＨＭＧＣｏ
Ａ−レダクターゼインヒビター（例えば、ロバスタチン、セリバスタチン、プレバスタチ
ン、アトルバスタチン（ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）、シンバスタチンおよびフルバスタ
チン）、ニコチン酸、フィブリン酸誘導体（例えば、クロフィブレート、ゲムフィブロジ
ル、フェノフィブレート、ベザフィブレートおよびシプロフィブレート）、プロブコール
、ネオマイシン、デキストロチロキシン、植物−スタノールエステル（ｐｌａｎｔ−ｓｔ
ａｎｏｌ ｅｓｔｅｒ）、コレステロール吸収インヒビター（例えば、エゼチミブ（ｅｚ
ｅｔｉｍｉｂｅ））、インプリタピド（ｉｍｐｌｉｔａｐｉｄｅ）、胆汁酸トランスポー
ターのインヒビター（先端の（ａｐｉｃａｌ）ナトリウム依存性胆汁酸トランスポーター
）、肝臓ＣＹＰ７ａのレギュレーター、エストロゲン置換療法（例えば、タモキシゲン）
、および抗炎症剤（例えば、糖質コルチコイド）。

従って、本発明はさらに、本明細書中に記載される疾患もしくは状態の処置および／ま
たは予防のための医薬の製造における、本発明の化合物および本明細書中に記載される１
種以上の他の治療／予防用化合物の使用を提供する。

（標的化送達）
別の局面において、本発明の化合物を、体内の特定の組織、器官または位置に標的化す
るための方法が提供される。例示的な標的としては、肝臓、肺、腎臓、心臓および血管内
のアテローム性動脈硬化プラークが挙げられる。化合物を標的化する方法は、当該分野で
周知である。

１つの実施形態において、化合物は、直接投与もしくは局所投与によって標的化される
。例えば、血管を標的化する場合、化合物は、例えば、単一バルーンもしくは二重バルー
ンのカテーテルによって、脈管の管腔の内側から管の関連部位に直接投与されるか、また
は、例えば、Ｓｉｍｏｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３５９：６７−７０（１９９２）によって
記載された肺ゲルシステムによって化合物の徐放を補助する物質を含む外膜を通して投与
される。化合物の脈管への局所送達のための他の徐放技術としては、化合物を用いるステ
ントのコーティングが挙げられる。アンチセンス化合物の血管への送達方法は、米国特許
第６，１５９，９４６号に記載され、この特許は、その全体が参考として援用される。

特定の組織または器官を標的化する場合、化合物は、その組織もしくは器官の中または
その周囲に投与され得る。例えば、米国特許第６，５４７，７８７号（その全体が参考と
して本明細書中に援用される）は、治療剤を心臓に標的かするための方法およびデバイス
を開示する。１つの局面において、投与は、組織もしくは器官につながる血管への直接注
射または注射によって生じる。例えば、肝臓を標的化する場合、化合物は、門脈を解する
注射または注入によって投与され得る。

別の局面において、化合物を標的化する方法が提供され、この方法は、１種以上の細胞
型による化合物の取り込みを指向する薬剤とこの化合物を会合させる工程を包含する。例
示的な薬剤としては、例えば、米国特許第６，４９５，５３２号（その開示は、その全体
が参考として本明細書中に援用される）に記載されるような抗体、細胞表面レセプター、
細胞表面レセプターに対するリガンド、ポリッリポサッカリド、薬物、ホルモン、ハプテ
ン、特異的な脂質および核酸のような、器官特異的もしくは組織特異的標的か部分と一般
に組み合せられる、脂質および脂質ベースの構造（例えば、リポソーム）が挙げられる。
米国特許第５，３９９，３３１号（その開示は、その全体が参考として本明細書中に援用
される）は、少なくとも１腫のマレイミド基とアミノ反応性機能を有する架橋化剤の使用
による、タンパク質のリポソームへのカップリングを記載する；米国特許第４，８８５，
１７２号、同第５，０５９，４２１号および同第５，１７１，５７８号（これらの開示は
、その全体が参考として本明細書中に援用される）は、糖タンパク質ストレプトアビジン
の使用によってタンパク質をリポソームに連結すること、そして、標的化リポソームをポ
リサッカリドを用いてコーティングすることを記載する。他の脂質ベースの標的化剤とし
ては、例えば、米国特許第６，２１７，８８６号（その開示は、その全体が参考として本
明細書中に援用される）に記載されるようなミセル生成物および結晶性生成物が挙げられ
る。

別の局面において、標的化剤としては、米国特許第４，８１８，５４２号（その開示は
、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載されるような、加水分解可能な
エステル結合を含むコポリマーおよびホモポリマーのポリエステルに由来する多孔性のポ
リマーミクロスフェアが挙げられる。代表的なポリエステルとしては、ポリグリコール酸
（ＰＧＡ）およびポリ乳酸（ＰＬＡ）、ならびに、グリコリドおよびＬ（−ラクチド）の
コポリマー（ＰＧＬ）が挙げられ、これらは、ヒトに対して低い毒性を示し、生分解性で
ある点で、本発明の方法および組成物に特に適している。ミクロスフェアのポリマーマト
リクスとして利用される特定のポリエステルまたは他のポリマーもしくはコポリマーは、
重要ではなく、種々のポリマーが、所望の多孔度、粘度、形状およびサイズ分布に依存し
て利用され得る。他の生分解性もしくは生物腐食性のポリマーもしくはコポリマーとして
は、例えば、以下が挙げられる：ゼラチン、デンプン、アラビノガラクタン、アルブミン
、コラーゲン、天然および合成の物質もしくはポリマー（例えば、ポリ（ε-カプロラク
トン)、ポリ（ε-カプロラクトン−ＣＯ−乳酸）、ポリ（ε−カプロラクトン−ＣＯ−グ
リコール酸）、ポリ（β−ヒドロキシ酪酸）、ポリエチレンオキシド、ポリエチレン、ポ
リ（アルキル−２−シアノアクリレート）（例えば、メチル、エチル、ブチル）、ヒドロ
ゲル（例えば、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート））、ポリアミド（例えば、ポリ
アクリルアミド）、ポリ（アミノ酸）（すなわち、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパラギン酸、
β−メチル−Ｌ−アスパラギン酸、β−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸塩、グルタミン酸
）、ポリ（２−ヒドロキシエチルＤＬ−アスパラギン酸アミド）、ポリ（エステルウレア
）、ポリ（Ｌ−フェニルアラニン／エチレングリコール／１，６−ジイソシアナトヘキサ
ン）およびポリ（メチルメタクリレート））。標的化送達に適切な例示的な天然および合
成のポリマーは、容易に市販に入手可能であるか、または、適切なモノマーもしくはコモ
ノマーもしくはオリゴマーからの縮合重合反応によって得られ得るかのいずれかである。

なお別の実施形態において、米国特許第６，５６２，８６４号（その開示は、その全体
が参考として本明細書中に援用される）は、カテキン（エピおよび他の炭素カチオン性ア
イソマーおよびその誘導体を含む）を記載し、これは、モノマー、ダイマーおよび高次の
マルチマーとして、求核性かつカチオン性生物活性薬剤と、送達薬剤としての使用のため
の複合体を形成し得る。カテキンマルチマーは、脈管内皮内、および細胞膜／細胞小器官
膜上に存在するものなどの極性タンパク質に対して強い親和性を有し、そして、インビボ
で選択された部位へと生物活性薬剤を標的化送達するために特に有用である。脈管の疾患
および障害（例えば、アテローム性動脈硬化症および冠動脈疾患）の処置において、送達
性薬剤としては、持続性カテキンマルチマー（カテキンと窒素含有部分（例えばアンモニ
ア）との間の反応から形成されるアミド化カテキンマルチマーを含む）が挙げられる。

本発明の他の標的化ストラテジーとしては、米国特許第６，４３３，０１２号（その開
示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載されるようなＡＤＥＰＴ（
抗体指向型酵素プロドラッグ療法）、ＧＤＥＰＴ（遺伝子指向型ＥＰＴ）およびＶＤＥＰ
Ｔ（ウイルス指向型ＥＰＴ）が挙げられる。

本発明はさらに、標的化送達のための医療用デバイスおよびキットを提供し、ここで、
このデバイスは、例えば、シリンジ、ステントまたはカテーテルである。キットは、化合
物を投与するためのデバイス、および本発明の化合物を含む容器を備える。１つの局面に
おいて、化合物は、デバイスに予め充填されている。他の実施形態において、キットは、
化合物の投与方法および投薬量のための指示書を提供する。アンチセンス化合物を送達す
るための医療用デバイスおよびキットを記載する米国特許としては、米国特許第６，３６
８，３５６；６，３４４，０３５号；同第６，３４４，０２８号；同第６，２８７，２８
５号；同第６，２００，３０４号；同第５，８２４，０４９号；同第５，７４９，９１５
号；同第５，６７４，２４２号；同第５，６７０，１６１号；同第５，６０９，６２９号
；同第５，５９３，９７４号；および同第５，４７０，３０７号（これら全ては、その全
体が参考として本明細書中に援用される）が挙げられる。

本発明は、特定の実施形態に従って特異性を伴って記載されてきたが、以下の実施例は
、本発明を例示するためだけに機能し、そして、本発明を制限することを意図しない。

（実施例１）
（オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホルアミダイト）
（デオキシアミダイトおよび２’−アルコキシアミダイト）
２’−デオキシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトおよび２’−メト
キシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトを、業者（例えば、Ｃｈｅｍｇ
ｅｎｅｓ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ、またはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ
ｅｒｌｉｎｇ，Ｖａ．）から購入した。他の２’−Ｏ−アルコキシ置換されたヌクレオシ
ドアミダイトを、米国特許第５，５０６，３５１号（本明細書中に参考として援用される
）に記載されたように調製する。２’−アルコキシアミダイトを使用して合成されたオリ
ゴヌクレオチドについて、テトラゾールおよび塩基のパルス送達後の待ち工程を３６０秒
まで長くしたことを除いて、非改変オリゴヌクレオチドについての標準的なサイクルを利
用した。

５−メチル−２’−デオキシシチジン（５−Ｍｅ−Ｃ）ヌクレオチドを含むオリゴヌク
レオチドを、公開された方法（Ｓａｎｇｈｖｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９３、２１、３１９７−３２０３）に従って、市販のホス
ホルアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ，またはＣｈｅ
ｍＧｅｎｅｓ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ）を使用して、合成した。

（２’−フルオロアミダイト）
（２’−フルオロデオキシアデノシンアミダイト）
２’−フルオロオリゴヌクレオチドを、以前に記載されるように［Ｋａｗａｓａｋｉら
，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６，８３１−８４１および米国特許第５，６７
０，６３３号（本明細書中に参考として援用される）］合成した。簡潔には、保護ヌクレ
オシドＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンを、文献の手順を
改変し、それによりこの２’−α−フルオロ原子を２’−β−トリチル基のＳ_Ｎ２−置換
により導入することによって、出発物質として市販の９−β−Ｄ−アラビノフラノシルア
デニンを利用して合成した。従って、Ｎ６−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシ
ルアデニンを、３’，５’−ジテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）中間体として、中程度の
収量において選択的に保護した。ＴＨＰ基およびＮ６−ベンゾイル基の脱保護を、標準的
な方法論を使用して達成し、そして標準的な方法を使用して、５’−ジメトキシトリチル
（ＤＭＴ）中間体および５’−ＤＭＴ−３’−ホスホルアミダイト中間体を得た。

（２’−フルオロデオキシグアノシン）
２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンの合成を、テトライソプロピルジシロキサ
ニル（ＴＰＤＳ）保護９−β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニンを出発物質として使用し
て、その中間体ジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへの変換により達成した。
ＴＰＤＳ基の脱保護の次に、そのヒドロキシル基をＴＨＰで保護して、ジイソブチリルジ
−ＴＨＰ保護アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的Ｏ−脱アシル化およびトリフレ
ート化（ｔｒｉｆｌａｔｉｏｎ）の次に、フッ素で粗製生成物を処理し、次いで、ＴＨＰ
基の脱保護を行った。

標準的な方法論を使用して、その５’−ＤＭＴ−ホスホルアミダイトおよび５’−ＤＭ
Ｔ−３’−ホスホルアミダイトを得た。

（２’−フルオロウリジン）
２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンの合成を、文献の手順の改変によって達成し
た。この手順において、２，２’−無水−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルを、
７０％ フッ化水素−ピリジンで処理した。標準的な手順を使用して、その５’−ＤＭＴ
ホスホルアミダイトおよび５’−ＤＭＴ−３’ホスホルアミダイトを得た。

（２’−フルオロデオキシシチジン）
２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジ
ンのアミノ化を介して合成し、続いて、選択的に保護して、Ｎ４−ベンゾイル−２’−デ
オキシ−２’−フルオロシチジンを得た。標準的な手順を使用して、その５’−ＤＭＴホ
スホルアミダイトおよび５’−ＤＭＴ−３’ホスホルアミダイトを得た。

（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミダイト）
２’−Ｏ−メトキシエチル置換ヌクレオシドアミダイトを以下のように調製するか、ま
たは代わりに、Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，
１９９５，７８，４８６−５０４の方法に従って調製する。

（２，２’−無水［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン］）
５−メチルウリジン（Ｙａｍａｓａ，Ｃｈｏｓｈｉ，Ｊａｐａｎから市販されるリボシ
ルチミン）（７２．０ｇ、０．２７９Ｍ）、ジフェニルカーボネート（９０．０ｇ、０．
４２０Ｍ）および重炭酸ナトリウム（２．０ｇ、０．０２４Ｍ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）
に添加した。この混合物を、攪拌しながら加熱して還流し、発生した二酸化炭素ガスを制
御された様式にて放出させた。１時間後、わずかに色が濃くなった溶液を、減圧下で濃縮
した。この得られたシロップを、攪拌しながらジエチルエーテル（２．５Ｌ）に注いだ。
この生成物はガム状物質を形成した。エーテルをデカントし、残渣を、最小量のメタノー
ル（約４００ｍＬ）に溶解した。この溶液を、新たなエーテル（２．５Ｌ）に注いで、硬
いガム状物質を得た。このエーテルをデカントし、このガム状物質を、真空オーブンで乾
燥して（６０℃、１ｍｍＨｇにて２４時間）、固体を得、これを、淡い黄褐色粉末（５７
ｇ、８５％粗収率）に粉にした。そのＮＭＲスペクトルは、その構造と一致し、そのナト
リウム塩としてフェノールが混入していた（約５％）。さらなる反応のために、この物質
を使用した（または酢酸エチル中のメタノール勾配（１０〜２５％）を使用するカラムク
ロマトグラフィーによりさらに精製されて、白色固体を獲得し得る（ｍｐ ２２２〜４℃
））。

（２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン）
２，２’−無水−５−メチルウリジン（１９５ｇ、０．８１Ｍ）、トリス（２−メトキ
シエチル）ボレート（２３１ｇ、０．９８Ｍ）および２−メトキシエタノール（１．２Ｌ
）を、２Ｌのステンレス鋼圧力容器に添加し、予め加熱した１６０℃の油浴に入れた。１
５５〜１６０℃にて４８時間加熱した後、この容器を開け、その溶液を乾燥するまでエバ
ポレートし、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で摩砕した。その残渣を、熱アセトン（１Ｌ）中に
再懸濁した。不溶性の塩を濾過し、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄し、濾液をエバポレー
トした。その残渣（２８０ｇ）をＣＨ_３ＣＮ（６００ｍＬ）中に溶解し、エバポレートし
た。シリカゲルカラム（３ｋｇ）を、０．５％ Ｅｔ_３ＮＨを含有するＣＨ_２Ｃｌ_２／ア
セトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）中にパックした。残渣を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２５０ｍＬ
）中に溶解し、このカラムに装填する前に、シリカ（１５０ｇ）に吸着させた。生成物を
、パックした溶媒を用いて溶出して、１６０ｇ（６３％）の生成物を得た。さらなる物質
を、不純物質画分を、再度作業することにより得た。

（２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン）
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ、０．５０６Ｍ）を、ピリ
ジン（２５０ｍＬ）とともに同時にエバポレートし、その乾燥した残渣を、ピリジン（１
．３Ｌ）中に溶解した。ジメトキシトリチルクロリド（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）の第
１のアリコートを添加し、その混合物を、室温にて１時間攪拌した。ジメトキシトリチル
クロリドの第２のアリコート（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）を添加し、その反応系を、さ
らに１時間攪拌した。次いで、メタノール（１７０ｍＬ）を添加して、その反応系を停止
させた。ＨＰＬＣにより、約７０％の生成物の存在が示された。その溶媒をエバポレート
し、ＣＨ_３ＣＮ（２００ｍＬ）で摩砕した。その残渣を、ＣＨＣｌ_３（１．５Ｌ）中に溶
解し、２×５００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ_３および２×５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出し
た。その有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、エバポレートした。２７５ｇの残渣を
得た。この残渣を、充填され、０．５％ Ｅｔ_３ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン／
アセトン（５：５：１）で溶出される３．５ｋｇのシリカゲルカラムで精製した。この純
粋画分をエバポレートして、１６４ｇの生成物を得た。さらに約２０ｇを、不純物質画分
から得て、合計収量１８３ｇ（５７％）を得た。

（３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−
５−メチルウリジン）
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１
０６ｇ、０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ｍＬのＤＭＦと１８８ｍＬのピリジ
ンから調製した、７５０ｍＬの３：１混合物）および、無水酢酸（２４．３８ｍＬ、０．
２５８Ｍ）を合わせ、室温にて２４時間攪拌した。この反応系を、最初にＭｅＯＨの添加
によりＴＬＣサンプルをクエンチすることによって、ＴＬＣによりモニターした。ＴＬＣ
により判断した場合に、反応が完了した際に、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を添加し、この混合
物を、３５℃でエバポレートした。その残渣を、ＣＨＣｌ_３（８００ｍＬ）中に溶解し、
２×２００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウムおよび２×２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した
。その水層を、２００ｍＬのＣＨＣｌ_３で逆抽出（ｂａｃｋ ｅｘｔｒａｃｔ）した。合
わせた有機物質を、硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートして、１２２ｇの残渣（約９
０％生成物）を得た。その残渣を、３．５ｋｇのシリカゲルカラムで精製し、ＥｔＯＡｃ
／ヘキサン（４：１）を使用して溶出した。純粋な生成物画分をエバポレートして、９６
ｇ（８４％）を得た。さらに１．５ｇを残りの画分から回収した。

（３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−
５−メチル−４−トリアゾールウリジン）
第１の溶液を、ＣＨ_３ＣＮ（７００ｍＬ）中に３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキ
シエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ、０．１４４Ｍ
）を溶解することによって調製し、とっておいた。トリエチルアミン（１８９ｍＬ、１．
４４Ｍ）を、ＣＨ_３ＣＮ（１Ｌ）中のトリアゾール（９０ｇ、１．３Ｍ）の溶液に添加し
、−５℃まで冷却し、オーバーヘッドスターラーを用いて０．５時間攪拌した。０〜１０
℃に維持した攪拌溶液に３０分かけてＰＯＣｌ_３を滴下し、得られた混合物を、さらに２
時間攪拌した。第１の溶液を、後者の溶液に４５分かけて滴下した。得られた反応混合物
を低温室に一晩保存した。塩を反応混合物から濾過し、その溶液をエバポレートした。そ
の残渣をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶解し、不溶性固体を、濾過により除去した。その濾液を
、１×３００ｍＬのＮａＨＣＯ_３および２×３００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナ
トリウムで乾燥し、エバポレートした。その残渣を、ＥｔＯＡｃで粉砕して、標題化合物
を得た。

（２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン）
ジオキサン（５００ｍＬ）およびＮＨ_４ＯＨ（３０ｍＬ）中の３’−Ｏ−アセチル−２
’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾー
ルウリジン（１０３ｇ、０．１４１Ｍ）の溶液を、室温にて２時間攪拌した。このジオキ
サン溶液をエバポレートし、その残渣を、ＭｅＯＨ（２×２００ｍＬ）で共沸した。その
残渣をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）中に溶解し、２ｌのステンレス鋼圧力容器に移した。ＮＨ
_３ガスで飽和させたＭｅＯＨ（４００ｍＬ）を添加し、この容器を、１００℃まで２時間
加熱した（ＴＬＣにより、完全な変換が示された）。この容器の内容物を、乾燥するまで
エバポレートし、その残渣を、ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）中に溶解し、飽和ＮａＣｌ（２
００ｍＬ）で１回洗浄した。この有機物質を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒をエバポレー
トして、８５ｇ（９５％）の標題化合物を得た。

（Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５
−メチルシチジン）
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−シチジン（
８５ｇ、０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）中に溶解し、無水安息香酸（３７．２ｇ
、０．１６５Ｍ）を攪拌しながら添加した。３時間攪拌した後、ＴＬＣにより、反応が約
９５％完了したことが示された。溶媒をエバポレートし、その残渣をＭｅＯＨ（２００ｍ
Ｌ）で共沸した。残渣をＣＨＣｌ_３（７００ｍＬ）中に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ_３（２×
３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２×３００ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、エ
バポレートして、残渣（９６ｇ）を得た。その残渣を、溶出溶媒として０．５％ Ｅｔ_３
ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を使用して１．５ｋｇのシリカカラムで
クロマトグラフィーにかけた。純粋な生成物画分をエバポレートして、９０ｇ（９０％）
の標題化合物を得た。

（Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５
−メチルシチジン−３’−アミダイト）
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−
メチルシチジン（７４ｇ、０．１０Ｍ）を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１Ｌ）中に溶解した。テトラ
ゾールジイソプロピルアミン（７．１ｇ）および亜リン酸２−シアノエトキシ−テトラ（
イソプロピル）（４０．５ｍＬ、０．１２３Ｍ）を、窒素雰囲気下で攪拌しながら添加し
た。得られた混合物を、室温にて２０時間攪拌した（ＴＬＣにより、反応が９５％完了し
たことが示された）。反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ_３（１×３００ｍＬ）および飽和Ｎ
ａＣｌ（３×３００ｍＬ）で抽出した。この水性洗浄液を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３００ｍＬ）
で逆抽出し、その抽出物を合わせて、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濃縮した。得られた残渣を、
溶出溶媒としてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を使用して１．５ｋｇのシリカカラムで
クロマトグラフィーにかけた。純粋画分を合わせて、９０．６ｇ（８７％）の標題化合物
を得た。

（２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトおよび２’−Ｏ−（ジメ
チルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト）
（２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト）
２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト（当該分野で２’−
Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても公知）を、以下の
段落に記載されるように調製する。アデノシン、シチジンおよびグアノシンのヌクレオシ
ドアミダイトを、アデノシンおよびシチジンの場合には環外アミンをベンゾイル部分で保
護し、グアノシンの場合にはイソブチリルで保護することを除いて、チミジン（５−メチ
ルウリジン）と同様に調製する。

（５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ^２−２’−無水−５−メチルウリ
ジン）
Ｏ^２−２’−無水−５−メチルウリジン（Ｐｒｏ．Ｂｉｏ．Ｓｉｎｔ．，Ｖａｒｅｓｅ
，Ｉｔａｌｙ，１００．０ｇ、０．４１６ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（０．６
６ｇ、０．０１３当量、０．００５４ｍｍｏｌ）を、機械的に攪拌しながらアルゴン雰囲
気下で周囲温度にて乾燥ピリジン（５００ｍｌ）中に溶解した。ｔｅｒｔ−ブチルジフェ
ニルクロロシラン（１２５．８ｇ、１１９．０ｍＬ、１．１当量、０．４５８ｍｍｏｌ）
を一部添加した。その反応系を、周囲温度にて１６時間攪拌した。ＴＬＣ（Ｒｆ ０．２
２、酢酸エチル）により、完全な反応が示された。この溶液を、減圧下で濃オイルになる
まで濃縮した。これを、ジクロロメタン（１Ｌ）と、飽和重炭酸ナトリウム（２×１Ｌ）
と、ブライン（１Ｌ）との間で分配した。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下
で濃オイルになるまで濃縮した。このオイルを、酢酸エチルとエチルエーテルの１：１混
合物（６００ｍＬ）中に溶解し、この溶液を−１０℃まで冷却した。得られた結晶生成物
を、濾過により回収し、エチルエーテル（３×２００ｍＬ）で洗浄し、１４９ｇ（７４．
８％）の白色固体になるまで乾燥した（４０℃、１ｍｍＨｇ、２４時間）。ＴＬＣおよび
ＮＭＲは、純粋生成物と一致した。

（５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル
）−５−メチルウリジン）
２Ｌのステンレス鋼の攪拌されない圧力反応器中に、テトラヒドロフラン（１．０Ｍ、
２．０当量、６２２ｍＬ）中のボランを添加した。換気フードにおいて、手動で攪拌しな
がら、まず、水素ガスの蒸発が静まるまでエチレングリコール（３５０ｍＬ、過剰）を慎
重に添加した。５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ^２−２’−無水−５−
メチルウリジン（１４９ｇ、０．３１１ｍｏｌ）および重炭酸ナトリウム（０．０７４ｇ
、０．００３当量）を、手動で攪拌しながら添加した。反応器を封鎖し、内部温度が１６
０℃に達するまで油浴中で加熱し、次いで、１６時間維持した（圧力＜１００ｐｓｉｇ）
。この反応容器を周囲温度まで冷却し、開けた。ＴＬＣ（所望の生成物についてＲｆ ０
．６７およびａｒａ−Ｔ副生成物についてＲｆ ０．８２、酢酸エチル）により、生成物
の約７０％の変換が示された。さらなる副生成物形成を避けるために、反応を停止し、よ
り極端な条件を、エチレングリコールを除去するために用いて、温水浴（４０〜１００℃
）中、減圧下（１０〜１ｍｍＨｇ）で濃縮した（あるいは、一旦、低温での溶媒沸騰を行
い、残りの溶液を、酢酸エチルと水との間で分配し得る。その生成物は、有機相中にある
）。その残渣を、カラムクロマトグラフィー（２ｋｇのシリカゲル、１：１〜４：１の酢
酸エチル−ヘキサン勾配）により精製した。適切な画分を合わせ、ストリッピングし（ｓ
ｔｒｉｐ）、白色の砕けやすい泡沫（ｃｒｉｓｐ ｆｏａｍ）（８４ｇ、５０％）、混入
した出発物質（１７．４ｇ）および純粋な再利用可能な出発物質（２０ｇ）として生成物
を乾燥した。出発物資、あまり純粋でない回収された出発物質に基づく収率は、５８％で
あった。ＴＬＣおよびＮＭＲは、９９％の純粋物質と一致した。

（２’−Ｏ−（［２−フタルイミドオキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシ
リル−５−メチルウリジン）
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）
−５−メチルウリジン（２０ｇ、３６．９８ｍｍｏｌ）を、トリフェニルホスフィン（１
１．６３ｇ、４４．３６ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシフタルイミド（７．２４ｇ、４
４．３６ｍｍｏｌ）と混合した。次いで、これを、４０℃にて２日間、高減圧下で、Ｐ_２
Ｏ_５で乾燥した。この反応混合物を、アルゴンでフラッシュし、乾燥ＴＨＦ（３６９．８
ｍＬ、Ａｌｄｒｉｃｈ、しっかりした封鎖瓶）を添加して、透明な溶液を得た。ジエチル
−アゾジカルボキシレート（６．９８ｍＬ、４４．３６ｍｍｏｌ）を、反応混合物に滴下
した。添加速度を、得られた濃赤色の着色が、次の滴下の前にちょうど脱色されるように
維持した。添加を完了した後、この反応系を４時間攪拌した。そのときまでには、ＴＬＣ
により、反応の完了が示される（６０：４０の酢酸エチル：ヘキサン）。溶媒を、真空中
でエバポレートした。得られた残渣を、フラッシュカラムに配置し、酢酸エチル：ヘキサ
ン（６０：４０）で溶出して、２’−Ｏ−（［２−フタルイミドオキシ）エチル］−５’
−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジンを白色泡沫（２１．８１９ｇ、８６
％）として得た。

（５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシ
イミノオキシ（ｆｏｒｍａｄｏｘｉｍｉｎｏｏｘｙ））エチル］−５−メチルウリジン）
２’−Ｏ−（［２−フタルイミドオキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリ
ル−５−メチルウリジン（３．１ｇ、４．５ｍｍｏｌ）を、乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（４．５ｍ
Ｌ）中に溶解し、メチルヒドラジン（３００ｍＬ、４．６４ｍｍｏｌ）を−１０℃〜０℃
にて滴下した。１時間後、この混合物を濾過し、その濾液を、氷冷ＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄し
、合わせた有機相を、水、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥した。この溶液を
濃縮して、２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）チミジンを得た。次いで、これを、ＭｅＯ
Ｈ（６７．５ｍＬ）中に溶解した。これに、ホルムアルデヒド（２０％水溶液、ｗ／ｗ、
１．１当量）を添加し、得られた混合物を、１時間攪拌した。溶媒を、真空下で除去し；
残渣をクロマトグラフィーにかけて、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２
’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジンを白色泡
沫（１．９５ｇ、７８％）として得た。

（５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミ
ノオキシエチル］−５−メチルウリジン）
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイ
ミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン（１．７７ｇ、３．１２ｍｍｏｌ）を、乾燥
ＭｅＯＨ（３０．６ｍＬ）中の１Ｍ ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）
の溶液に溶解した。シアノホウ化水素ナトリウム（０．３９ｇ、６．１３ｍｍｏｌ）を、
１０℃にて不活性雰囲気下でこの溶液に添加した。この反応混合物を、１０℃にて１０分
間攪拌した。その後、反応容器を氷浴から取り出し、室温にて２時間攪拌し、この反応系
を、ＴＬＣ（ＣＨ_２Ｃｌ_２中の５％ ＭｅＯＨ）によりモニターした。ＮａＨＣＯ_３水溶
液（５％、１０ｍＬ）を添加し、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル相
を、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、乾燥するまでエバポレートした。残渣を、ＭｅＯＨ（３
０．６ｍＬ）中の１Ｍ ＰＰＴＳの溶液に溶解した。ホルムアルデヒド（２０％ ｗ／ｗ
、３０ｍＬ、３．３７ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を、室温にて１０分間攪拌し
た。この反応混合物を、氷浴中で１０℃まで冷却し、シアノホウ化水素ナトリウム（０．
３９ｇ、６．１３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を、１０℃にて１０分間攪拌した。１
０分後、この反応混合物を、氷浴から取り出し、室温にて２時間攪拌した。この反応混合
物に、５％ ＮａＨＣＯ_３（２５ｍＬ）溶液を添加し、酢酸エチル（２×２５ｍＬ）で抽
出した。酢酸エチル層を、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、乾燥するまでエバポレートした。
その得られた残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、ＣＨ_２Ｃｌ_２
中の５％ ＭｅＯＨで溶出して、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−
Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジンを白色泡沫（１４．
６ｇ、８０％）として得た。

（２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン）
トリエチルアミントリヒドロフルオリド（３．９１ｍＬ、２４．０ｍｍｏｌ）を、乾燥
ＴＨＦおよびトリエチルアミン（１．６７ｍＬ、１２ｍｍｏｌ、乾燥、ＫＯＨで維持）中
に溶解した。次いで、トリエチルアミン−２ＨＦのこの混合物を、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−
ブチルジフェニルシラン−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メ
チルウリジン（１．４０ｇ、２．４ｍｍｏｌ）に添加し、室温にて２４時間攪拌した。反
応系を、ＴＬＣ（ＣＨ_２Ｃｌ_２中の５％ ＭｅＯＨ）によりモニターした。溶媒を真空下
で除去し、その残渣を、フラッシュカラムに配置し、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の１０％ ＭｅＯＨ
で溶出して、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７６６
ｍｇ、９２．５％）を得た。

（５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジ
ン）
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７５０ｍｇ、２．
１７ｍｍｏｌ）を、Ｐ_２Ｏ_５で、高い減圧下で４０℃にて一晩乾燥した。次いで、これを
、無水ピリジン（２０ｍＬ）とともに同時エバポレートした。得られた残渣を、アルゴン
雰囲気下でピリジン（１１ｍＬ）中に溶解した。４−ジメチルアミノピリジン（２６．５
ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（８８０ｍｇ、２．
６０ｍｍｏｌ）を、この混合物に添加し、この反応混合物を、出発物質のすべてがなくな
るまで、室温にて攪拌した。ピリジンを真空下で除去し、その残渣を、クロマトグラフィ
ーにかけ、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の１０％ ＭｅＯＨ（数滴のピリジンを含有する）で溶出して
、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノ−オキシエチル）−５−メチルウリジ
ン（１．１３ｇ、８０％）を得た。

（５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−
メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミ
ダイト］）
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
（１．０８ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）を、トルエン（２０ｍＬ）と同時エバポレートした。
この残渣に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミンテトラゾニド（０．２９ｇ、１．６７ｍｍｏ
ｌ）を添加し、そして高い減圧下、４０℃で一晩、Ｐ_２Ｏ_５上で乾燥させた。次いで、こ
の反応混合物を、無水アセトニトリル（８．４ｍＬ）に溶解し、そして２−シアノエチル
−Ｎ，Ｎ，Ｎ^１，Ｎ^１−テトライソプロピルホスホルアミダイト（２．１２ｍＬ、６．０
８ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を、周囲温度で、４時間、不活性雰囲気下で撹
拌した。この反応の進行を、ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル １：１）でモニタリングし
た。溶媒をエバポレートし、次いで、残渣を、酢酸エチル（７０ｍＬ）に溶解し、そして
５％ＮａＨＣＯ_３水溶液（４０ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で
乾燥し、そして濃縮した。得られた残渣を、クロマトグラフィー（溶出液として酢酸エチ
ル）にかけて、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチ
ル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホ
スホルアミダイト］を泡状物として得た（１．０４ｇ、７４．９％）。

（２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト）
２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト（２’−Ｏ−（アミノオキシ
エチル）ヌクレオシドアミダイトとしても当該分野で公知）を、以下のパラグラフにおい
て記載するようにして調製する。アデノシンヌクレオシドアミダイト、シチジンヌクレオ
シドアミダイトおよびチミジンヌクレオシドアミダイトを、同じようにして調製する。
（Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセ
チル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シア
ノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］）
２’−Ｏ−アミノオキシエチルグアノシンアナログは、ジアミノプリンリボシドの選択
的２’−Ｏ−アルキル化によって得られ得る。数グラム量のジアミノプリンリボシドを、
Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ（Ｂｅｒｌｉｎ）から購入して、少量の３’−Ｏ−異性体と共に
、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを提供し得る。２’−Ｏ−
（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを溶解し得、そしてアデノシンデアミナ
ーゼを用いる処理によって、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）グアノシンに変換し得る
（ＭｃＧｅｅ，Ｄ．Ｐ．Ｃ．，Ｃｏｏｋ，Ｐ．Ｄ．，Ｇｕｉｎｏｓｓｏ，Ｃ．Ｊ．，ＷＯ
９４／０２５０１ Ａ１ ９４０２０３）。標準的な保護手順により、２’−Ｏ−（２
−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンおよび２
−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチ
ル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを得、これらを還元して
、２−Ｎ−イソブチリル−６−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエ
チル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを提供し得る。上記の
ように、ヒドロキシル基を、Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ反応によってＮ−ヒドロキシフタルイミ
ドで置換し得、そしてこの保護されたヌクレオシドを、従来どおり、亜リン酸化して、２
−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（［２−フタルイミ
ドキシ（ｐｈｔｈａｌｍｉｄｏｘｙ）］エチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシト
リチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホル
アミダイト］を得ることができる。

（２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオシドアミダ
イト）
２’−ジメチルアミノエトキシエトキシヌクレオシドアミダイト（２’−Ｏ−ジメチル
アミノエトキシエチル（すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_２）_２）ま
たは２’−ＤＭＡＥＯＥヌクレオシドアミダイトとしても当該分野で公知）を、以下のよ
うにして調製する。他のヌクレオシドアミダイトも、同じようにして調製する。

（２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリ
ジン）
２［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］エタノール（Ａｌｄｒｉｃｈ，６．６６ｇ，５
０ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬの容器（ｂｏｍｂ）中で撹拌しながら、ボランのテトラヒド
ロフラン溶液（１Ｍ，１０ｍＬ，１０ｍｍｏｌ）にゆっくりと添加する。この固体が溶解
するにつれて、水素ガスが発生する。Ｏ^２−，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（
１．２ｇ，５ｍｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（２．５ｍｇ）を添加し、そしてこの
容器を密閉し、油浴に入れ、そして１５５℃で２６時間加熱する。この容器を、室温まで
冷却し、そして開ける。粗溶液を濃縮し、そして残渣を水（２００ｍＬ）とヘキサン（２
００ｍＬ）との間で分配する。過剰のフェノールをヘキサン層に抽出する。水層を、酢酸
エチル（３×２００ｍＬ）で抽出し、そして合わせた有機層を、水で１回洗浄し、無水硫
酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮する。残渣を、１：２０のメタノール／塩化メチレン
（これは２％のトリエチルアミンを含む）を溶出液として使用するシリカゲルカラムにか
ける。このカラムの画分を濃縮すると、無色の固体が形成され、これを回収して、表題化
合物を白色固体として得る。

（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエト
キシ）−エチル）］−５−メチルウリジン）
無水ピリジン（８ｍＬ）中の０．５ｇ（１．３ｍｍｏｌ）の２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，
Ｎ−ジメチルアミノ−エトキシ）エチル）］−５−メチルウリジンに、トリエチルアミン
（０．３６ｍＬ）およびジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ，０．８７ｇ、２当
量）を添加し、１時間撹拌する。この反応混合物を、水（２００ｍＬ）に注ぎ入れ、そし
てＣＨ_２Ｃｌ_２（２×２００ｍＬ）で抽出する。合わせたＣＨ_２Ｃｌ_２層を、飽和ＮａＨ
ＣＯ_３溶液で洗浄し、続いて、飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、そして無水硫酸ナトリウムで
乾燥する。溶媒をエバポレートし、続いて、ＭｅＯＨ：ＣＨ_２Ｃｌ_２：Ｅｔ_３Ｎ（２０：
１，ｖ／ｖ，１％のトリエチルアミンを含む）を使用するシリカゲルクロマトグラフィー
にかけて、表題化合物を得る。

（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエト
キシ）エチル）］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプ
ロピル）ホスホルアミダイト）
ジイソプロピルアミノテトラゾリド（０．６ｇ）および２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−
ジイソプロピルホスホルアミダイト（１．１ｍＬ、２当量）を、アルゴン雰囲気下で、Ｃ
Ｈ_２Ｃｌ_２（２０ｍＬ）に溶解した５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２
−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）］−５−メチルウリジン（２．１７ｇ，３
ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。この反応混合物を、一晩撹拌し、そして溶媒をエバポレー
トする。得られた残渣を、酢酸エチルを溶出液として使用するシリカゲルフラッシュカラ
ムクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物を得る。

（実施例２）
（オリゴヌクレオチドの合成）
非置換および置換のホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドを、ヨウ素による
酸化を用いる標準的なホスホルアミダイト化学を使用して、自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３８０Ｂ）で合成する。

ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を、ホスファイト結合の段階的チオ化（ｔｈｉａｔｉｏ
ｎ）のために、標準的な酸化ボトルをアセトニトリル中０．２Ｍの３Ｈ−１，２−ベンゾ
ジチオール−３−オン１，１−ジオキシド溶液で置き換えた以外は、ホスホジエステルオ
リゴヌクレオチドと同様に合成する。このチオ化を待つ工程を、６８秒までのばし、続い
てキャッピング工程を行った。ＣＰＧカラムからの切断および濃水酸化アンモニウム中で
の５５℃における脱ブロック化（１８時間）の後、このオリゴヌクレオチドを、２．５容
量のエタノールを用いて２回、０．５ＭのＮａＣｌ溶液から沈殿させることにより精製し
た。ホスフィネートオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，５０８，２７０号（本明細書
中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。

アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドを、米国特許第４，４６９，８６３号（本明
細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。

３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，
６１０，２８９号または同第５，６２５，０５０号（本明細書中で参考として援用される
）に記載されるようにして調製する。

ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，２５６，７７５号または米
国特許第５，３６６，８７８号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるよう
にして調製する。

アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドを、公開ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４
／００９０２およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６（それぞれ、ＷＯ ９４／１７０９３
およびＷＯ ９４／０２４９９として公開されている）（本明細書中で参考として援用さ
れる）に記載されるようにして調製する。

３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデートオリゴヌクレオチドを、米国特許第
５，４７６，９２５号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調
製する。

ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，０２３，２４３号（本明細
書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。

ボラノ（ｂｏｒａｎｏ）ホスフェートオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，１３０，
３０２号および同第５，１７７，１９８号（この両方は本明細書中で参考として援用され
る）に記載されるようにして調製する。

（実施例３）
（オリゴヌクレオシドの合成）
メチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド（ＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドとして
も特定される）、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド（ＭＤＨ結合オリゴ
ヌクレオシドとしても特定される）、およびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレ
オシド（アミド−３結合オリゴヌクレオシドとしても特定される）、およびメチレンアミ
ノカルボニル結合オリゴヌクレオシド（アミド−４結合オリゴヌクレオシドとしても特定
される）、ならびに例えば、ＭＭＩ結合とＰ＝Ｏ結合またはＰ＝Ｓ結合とを交互に有する
混合骨格化合物を、米国特許第５，３７８，８２５号、同第５，３８６，０２３号、同第
５，４８９，６７７号、同第５，６０２，２４０号および同第５，６１０，２８９号（こ
れら全ては本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。

ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）結合オリゴヌクレオシドおよびチオホルム
アセタール結合オリゴヌクレオシドを、米国特許第５，２６４，５６２号および同第５，
２６４，５６４号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製す
る。

エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドを、米国特許第５，２２３，６１８号（本明
細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。

（実施例４）
（ＰＮＡの合成）
ペプチド核酸（ＰＮＡ）を、以下に言及される様々な手順のいずれかに従って調製する
：Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒ
ｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｏ
ｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，４，５−２３
。これらをまた、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７００，９２２号および同
第５，７１９，２６２号（本明細書中で参考として援用される）に従って調製し得る。

（実施例５）
（キメラオリゴヌクレオチドの合成）
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドまたは混合オリゴヌク
レオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なるタイプのものであり得る。これらと
しては、第１のタイプ（結合ヌクレオシドの「ギャップ」セグメントが、結合ヌクレオシ
ドの５’「ウイング」セグメントと３’「ウイング」セグメントとの間に位置する）、お
よび第２の「開放端」タイプ（ここで「ギャップ」セグメントは、オリゴマー化合物の３
’末端または５’末端のいずれかに位置する）が挙げられる。第１のタイプのオリゴヌク
レオチドは、「ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）」またはギャップオリゴヌクレオチドとし
ても当該分野で公知である。第２のタイプのオリゴヌクレオチドは、「ヘミマー（ｈｅｍ
ｉｍｅｒ）」または「ウイングマー（ｗｉｎｇｍｅｒ）」としても当該分野で公知である
。

（［２’−Ｏ−Ｍｅ］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−Ｍｅ］キメラホスホロ
チオエートオリゴヌクレオチド）
２’−Ｏ−アルキルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントおよび２’−デ
オキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを有するキメラオリゴヌクレオ
チドを、上記のように、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの自動ＤＮＡ合成機モデ
ル３８０Ｂを使用して合成する。オリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ部分については２’−デ
オキシ−５’−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトを、５’ウイングお
よび３’ウイングについては５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−
ホスホルアミダイトを使用して、自動合成機を使用して合成する。標準的な合成サイクル
を、テトラゾールおよび塩基の送達の後に待つ工程を６００ｓまでのばし、ＲＮＡについ
ては４回、２’−Ｏ−メチルについては２回繰り返すことによって改変する。完全に保護
されたオリゴヌクレオチドを、支持体から切断し、そしてホスフェート基を、３：１のア
ンモニア／エタノール中、室温で一晩脱保護し、次いで乾固するまで凍結乾燥する。室温
で２４時間、メタノール性アンモニアで処理して、全ての塩基を脱保護し、サンプルを再
び、乾固するまで凍結乾燥する。このペレットを、ＴＨＦ中１ＭのＴＢＡＦに、室温で２
４時間再懸濁して、２’位を脱保護する。次いで、この反応を、１Ｍ ＴＥＡＡでクエン
チし、次いで、このサンプルを、ｒｏｔｏｖａｃによって２分の１の容量になるまで減ら
し、その後Ｇ２５サイズ排除カラムで脱塩する。次いで、回収したオリゴを、収率におい
ては分光光度計によって、そして純度についてはキャピラリー電気泳動および質量分析法
によって分析する。

（［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−（
メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−（メ
トキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、２’−Ｏ−メチルア
ミダイトの代わりに２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトを使用したこと以外は、２
’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドについて上で記載された手順に従って調製した
。

（［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−−［２’−デオキシホス
ホロチオエート］−−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオ
リゴヌクレオチド）
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−−［２’−デオキシホスホ
ロチオエート］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌ
クレオチドを、２’−Ｏ−メチルアミダイトの代わりに２’−Ｏ−（メトキシエチル）ア
ミダイトを使用したこと以外は、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドについて上
で記載された手順に従って調製する。ヨウ素を用いる酸化により、ホスホジエステルヌク
レオチド間結合をキメラ構造のウイング部分内に形成し、そして３，Ｈ−１，２ベンゾジ
チオール−３−オン１，１ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）を利用する硫黄化により
、中心ギャップについてホスホロチオエートヌクレオチド間結合を生成する。

他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドおよび混合キメラオリゴヌ
クレオチド／オリゴヌクレオシドを、米国特許第５，６２３，０６５号（本明細書中で参
考として援用される）に従って合成する。

（実施例６）
（オリゴヌクレオチドの単離）
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを、制御型多孔質ガラスカラム（ｃｏｎ
ｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ ｃｏｌｕｍｎ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ）から切断し、５５℃で１８時間、濃水酸化アンモニウム中で脱ブロック化し
た後、このオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを、２．５容量のエタノールを
用いて２回、０．５ＭのＮａＣｌから沈殿させることにより精製する。合成されたオリゴ
ヌクレオチドを、変性ゲルを用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、全長
の少なくとも８５％の物質であると判断した。合成で得られたホスホロチオエート結合お
よびホスホジエステル結合の相対量を、^３１Ｐ核磁気共鳴分光法によって定期的にチェッ
クし、そしていくつかの研究のために、オリゴヌクレオチドを、Ｃｈｉａｎｇら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，２６６，１８１６２−１８１７１に記載されるようにＨＰ
ＬＣによって精製した。ＨＰＬＣで精製した物質について得られた結果は、ＨＰＬＣで精
製していない物質について得られた結果と類似していた。

（実施例７）
（オリゴヌクレオチドの合成−９６ウェルプレート様式）
オリゴヌクレオチドを、固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホルアミダイト化学によって、標準的な
９６ウェル様式で同時に９６の配列を構築し得る自動合成機で合成した。ホスホジエステ
ルヌクレオチド間結合を、水性ヨウ素を用いて酸化することによって得た。無水アセトニ
トリル中で、３，Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン−１，１ジオキシド（Ｂｅａｕ
ｃａｇｅ試薬）を利用して硫黄化することによって、ホスホロチオエートヌクレオチド間
結合を生成した。標準的な塩基保護されたβ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミ
ダイトを、商業的販売業者（例えば、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆ
ｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、またはＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ
）から購入した。非標準的なヌクレオシドを、公知の文献または特許方法によって合成す
る。これらを、塩基保護されたβ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトとし
て利用する。

オリゴヌクレオチドを、支持体から切断し、そして高温（５５〜６０℃）で１２〜１６
時間、濃ＮＨ_４ＯＨを使用して脱保護し、次いで遊離した生成物を減圧下で乾燥した。次
いで、この乾燥した生成物を滅菌水に再懸濁して、マスタープレートを得、次いで、この
プレートから、全ての分析プレートサンプルおよび試験プレートサンプルを、ロボット式
ピペッターを利用して希釈する。

（実施例８）
（オリゴヌクレオチドの分析−９６ウェルプレート様式）
各ウェル中のオリゴヌクレオチドの濃度を、サンプルの希釈およびＵＶ吸収分光法によ
って評価した。個々の生成物の全長完全性を、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって、
９６ウェル様式（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥ^ＴＭ ＭＤＱ）、または別々の調製された
サンプルについては、市販のＣＥ装置（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥ^ＴＭ ５０
００，ＡＢＩ ２７０）のいずれかで評価した。塩基および骨格の組成を、エレクトロス
プレー質量分光法を利用する化合物の質量分析により確認した。全てのアッセイ試験プレ
ートを、シングルチャネルロボット式ピペッターおよびマルチチャネルロボット式ピペッ
ターを使用して、マスタープレートから希釈した。このプレート上の化合物の少なくとも
８５％が、全長の少なくとも８５％である場合、プレートを許容可能であると判断した。

（実施例９）
（細胞培養およびオリゴヌクレオチド処理）
標的核酸が、測定可能なレベルで存在している限り、標的核酸発現に対するアンチセン
ス化合物の効果を、種々の細胞型の任意のものにおいて試験し得る。これは、例えば、Ｐ
ＣＲまたはノーザンブロット分析を使用して、慣用的に決定され得る。以下の７個の細胞
型を、例示目的のために示すが、選択された細胞型で標的が発現される限り、他の細胞型
が慣用的に使用され得る。これは、当該分野で慣用的な方法（例えば、ノーザンブロット
分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイまたはＲＴ−ＰＣＲ）によって容易に決定され得る
。

（Ｔ−２４細胞）
ヒト移行細胞の膀胱癌細胞株Ｔ−２４を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ｔ−
２４細胞を、ＭｃＣｏｙの５Ａ基本完全培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）（１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、１００単位／ｍ
Ｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を補充）中で慣用的に
培養した。細胞が９０％のコンフルエンスに達したら、トリプシン処理および希釈によっ
て、慣用的に継代した。ＲＴ−ＰＣＲ分析で使用するために、細胞を、９６ウェルプレー
ト（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ ＃３８７２）に、７０００細胞／ウェルの密度で
播種した。

ノーザンブロットまたは他の分析のために、細胞を、１００ｍｍまたは他の標準的組織
培養プレート上に播種し、そして適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して
同様に処理し得る。

（Ａ５４９細胞）
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ａ５４９細胞を、Ｄ
ＭＥＭ基本培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ，ＭＤ）（１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１０
０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を補充）中で、慣用的に培養した。細胞が９０％の
コンフルエンスに達したら、トリプシン処理および希釈によって、慣用的に継代した。

（ＮＨＤＦ細胞）：
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得た。ＮＨＤＦを、供給業者によって推奨
されるように、補充された線維芽細胞増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中で慣用的に維持した。細胞を、供給業者に
よって推奨されるように、１０継代まで維持した。

（ＨＥＫ細胞）：
ヒト胚性ケラチノサイト（ＨＥＫ）を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得た。ＨＥＫを、供給業者によって推奨される
ように処方した、ケラチノサイト増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）において慣用的に維持した。細胞を、供給業者に
よって推奨されるように、１０継代まで慣用的に維持した。

（ＨｅｐＧ２細胞）：
ヒト肝芽細胞腫細胞株ＨｅｐＧ２を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。ＨｅｐＧ２細胞を、１０％
ウシ胎仔血清、非必須アミノ酸、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充したＥａｇｌ
ｅのＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ
ｒｇ、ＭＤ）中で慣用的に培養した。細胞が、９０％コンフルエンスに達したら、トリプ
シン処理および希釈によって、慣用的に継代した。細胞を、ＲＴ−ＰＣＲ分析における使
用のために７０００細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉ
ｍａｒｉａ ＃３８７２）に播種した。

ノーザンブロットまたは他の分析のために、細胞を、１００ｍｍまたは他の標準的組織
培
養プレート上に播種し、そして適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同
様に処理し得る。

（ＡＭＬ１２細胞）
ＡＭＬ１２（αマウス肝臓１２）細胞株を、ＴＧＦαについてトランスジェニックであ
るマウス（ＣＤ１系統、系列ＭＴ４２）由来の肝細胞から樹立した。細胞を、０．００５
ｍｇ／ｍｌインスリン、０．００５ｍｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌセレン、
および４０ｎｇ／ｍｌデキサメタゾンならびに９０％；１０％ウシ胎仔血清を含む、Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地とＨａｍのＦ１２培地との１：１混合物中で培養する。
継代培養するために、使用済培地を除去し、そして０．２５％トリプシン、０．０３％Ｅ
ＤＴＡ溶液の新鮮培地を添加する。新鮮トリプシン溶液（１〜２ｍｌ）を添加し、そして
この培養物を、細胞が剥がれるまで室温で静置する。

細胞が９０％コンフルエンスに達したら、トリプシン処理および希釈によって、慣用的
に継代した。細胞を、ＲＴ−ＰＣＲ分析における使用のために７０００細胞／ウェルの密
度で、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ ＃３８７２）に播種した
。

ノーザンブロットまたは他の分析のために、細胞を、１００ｍｍまたは他の標準的組織
培養プレート上に播種し、そして適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して
同様に処理し得る。

（初代マウス肝細胞）
初代マウス肝細胞を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ
，ＭＡ）から購入したＣＤ−１マウスから調製し、そして１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃ
ｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、２５０
ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、および１０ｎＭウシインスリン（Ｓｉｇｍａ）を補
充したＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｍｅｄｉａ（Ｇｉｂｃｏ）中で慣
用的に培養した。細胞を、ＲＴ−ＰＣＲ分析における使用のために１００００細胞／ウェ
ルの密度で、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ ＃３８７２）に播
種した。

ノーザンブロットまたは他の分析のために、細胞を、ラット尾コラーゲン（２００μｇ
／ｍＬ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でコートした１００ｍｍまたは他の標準
的培養プレート上にプレーティングし、そして適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチ
ドを使用して同様に処理し得る。

（Ｈｅｐ３Ｂ細胞）
ヒト肝細胞癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂを、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、１０
％ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミンおよびピリドキシンヒドロクロリドを補充したＤｕｌｂ
ｅｃｃｏｓ ＭＥＭ高グルコース（Ｇｏｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で慣用的に培養した。９０％コンフルエントに達し
た場合に、細胞を、トリプシン化および希釈によって慣用的に継代させた。細胞を、ＲＴ
−ＰＣＲ分析における使用のために、５０，０００細胞／ウェルの密度で、２４ウェルプ
レート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ ＃３８４６）に播種した。

ノーザンブロット分析または他の分析のために、細胞を、１００ｍｍまたは他の標準的
な組織培養プレート上に播種し得、適切な容積の培地およびオリゴヌクレオチドを使用し
て同様に処理し得る。

（ウサギ初代肝細胞）
初代ウサギ肝細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で
維持した。購入したときに、細胞を、ＲＴ−ＰＣＲにおいて使用するために、９６ウェル
プレートに播種しており、それらはコンフルエントであった。

ノーザンブロット分析または他の分析のために、細胞を、１００ｍｍまたは他の標準的
な組織培養プレート上に播種し得、適切な容積の培地およびオリゴヌクレオチドを使用し
て同様に処理し得る。

（ＨａＬａ細胞）
ヒト上皮細胞癌細胞株ＨａＬａを、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。ＨａＬａ細胞を、１０％
ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ
）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏｓ ＭＥＭ高グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）中で慣用的に培養した。細胞を、ＲＴ−ＰＣ
Ｒ分析における使用のために、５０，０００細胞／ウェルの密度で、２４ウェルプレート
（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ ＃３８４６）に播種した。９０％コンフルエントに
達した場合に、細胞を、トリプシン化および希釈によって慣用的に継代させた。細胞を、
ＲＴ−ＰＣＲ分析における使用のために、５０，０００細胞／ウェルの密度で、９６ウェ
ルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ ＃３８７２）に播種した。ノーザンブロ
ット分析または他の分析のために、細胞を、１００ｍｍまたは他の標準的な組織培養プレ
ート上に播種し得、適切な容積の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理し
得る。

（ヒト乳房上皮細胞）
正常なヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。ＨＭＥＣを、１０
％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ，ＭＤ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏｓ ＭＥＭ低グルコース（Ｇｉｂｃｏ／Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で慣用的に培
養した。９０％コンフルエントに達した場合に、細胞を、トリプシン化および希釈によっ
て慣用的に継代させた。細胞を、ＲＴ−ＰＣＲ分析における使用のために、７０００細胞
／ウェルの密度で、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ ＃３５３８
７２，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に播種した。ノーザンブ
ロット分析または他の分析のために、細胞を、１００ｍｍまたは他の標準的な組織培養プ
レート上に播種し得、適切な容積の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理
し得る。

（アンチセンス化合物での処理）
細胞が８０％コンフルエンスに達したときに、これらを、オリゴヌクレオチドで処理し
た。９６ウェルプレートで増殖された細胞に関して、ウェルを一度２００μＬ ＯＰＴＩ
−ＭＥＭ^ＴＭ−１低血清培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で洗浄し、次いで、３．７５μｇ／
ｍＬ ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ^ＴＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）および所望の濃度のオリゴヌク
レオチドを含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ^ＴＭ−１で処理した。４〜７時間の処理後
、培地を、新鮮な培地と置き換えた。細胞をオリゴヌクレオチド処理の１６〜２４時間後
に収穫した。

使用されるオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株間で異なる。特定の細胞株に対して最
適なオリゴヌクレオチド濃度を決定するために、細胞を、ある範囲の濃度でポジティブコ
ントロールオリゴヌクレオチドを用いて処理する。ヒト細胞について、ポジティブコント
ロールオリゴヌクレオチドは、ヒトＨ−ｒａｓを標的化するホスホロチオエート骨格を有
する、ＩＳＩＳ １３９２０、

配列番号１、２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）（２’−Ｏ−メト
キシエチルが太字で示される））である。マウス細胞またはラット細胞について、ポジテ
ィブコントロールオリゴヌクレオチドは、マウスｃ−ｒａｆおよびラットｃ−ｒａｆの両
方を標的とするホスホロチオエート骨格を有する、ＩＳＩＳ １５７７０、

配列番号２、２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（２’−Ｏ−メトキシエチルが太字
で示される）である。次いで、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ ｍＲＮＡ（ＩＳＩＳ １３９２０に対
して）またはｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ（ＩＳＩＳ １５７７０に対して）の８０％阻害を生
じるポジティブコントロールオリゴヌクレオチドの濃度を、その細胞株についての、後の
実験における新規オリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として利用する。８０％阻害
に達しない場合、Ｈ−ｒａｓ ｍＲＮＡまたはｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡの６０％阻害を生じ
るポジティブコントロールオリゴヌクレオチドの最低濃度を、その細胞株についての、後
の実験におけるオリゴヌクレオチドスクリーニング濃度として利用する。６０％阻害が達
成されない場合、その特定の細胞株を、オリゴヌクレオチドトランスフェクション実験に
適さないとみなす。

（実施例１０）
（アポリポタンパク質Ｂ発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析）
アポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス調節を、当該分野で公知の種々の方法でアッ
セイし得る。例えば、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルを、例えば、ノーザンブロ
ット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−
ＰＣＲ）によって定量し得る。リアルタイム定量的ＰＣＲが、ここでは好ましい。ＲＮＡ
分析を、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡに対して実施し得る。ＲＮＡ単離の方
法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻，４．１．１〜４．２．９頁および４
．５．１〜４．５．３頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９３に
教示される。ノーザンブロット分析は、当該分野において慣用的であり、例えば、Ａｕｓ
ｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻，４．２．１〜４．２．９頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９６に教示される。リアルタイム定量的（ＰＣＲ）は、市販の
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔ
ｅｍ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡか
ら入手可能であり、そして製造業者の指示に従って使用される）を使用して簡便に達成し
得る。

アポリポタンパク質Ｂのタンパク質レベルは、当該分野で周知の種々の方法（例えば、
免疫沈降法、ウェスタンブロット分析（イムノブロッティング）、ＥＬＩＳＡまたは蛍光
細胞分析分離（ＦＡＣＳ））で定量し得る。アポリポタンパク質Ｂに対する抗体を、同定
し、種々の供給源（例えば、ＭＳＲＳ抗体カタログ（Ａｅｒｉｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＭＩ））から入手し得るか、または従来の抗体産生方法によ
って調製し得る。ポリクローナル抗血清の調製のための方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ
，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，第２巻，１１．１２．１〜１１．１２．９頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に教示される。モノクローナル抗体の調製は、例えば、Ａ
ｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，１１．４．１〜１１．１１．５頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に教示される。

免疫沈降方法は、当該分野において標準的であり、そして例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ
．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，第２巻，１０．１６．１〜１０．１６．１１頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓ
ｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９８に見出され得る。ウェスタンブロット（イムノブロット）分
析は、当該分野において標準的であり、そして例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２
巻，１０．８．１〜１０．８．２１頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．
，１９９７に見出され得る。酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）は、当該分
野において標準的であり、そして例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，１１．２
．１〜１１．２．２２頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９１に
見出され得る。

（実施例１１）
（ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離）
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを、Ｍｉｕｒａら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ，，１９９６，４２，１
７５８−１７６４に従って単離した。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離のための他の方法は、例
えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻，４．５．１〜４．５．３頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９３に教示される。簡単に述べると、９６ウェル
プレートで増殖された細胞について、増殖培地を、その細胞から除去し、そして各ウェル
を、２００μＬの冷ＰＢＳで洗浄した。６０μＬの溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０、２
０ｍＭ バナジル−リボヌクレオシド複合体）を各ウェルに添加し、そのプレートを穏や
かに攪拌し、次いで、室温で５分間インキュベートした。５５μＬの溶解物を、Ｏｌｉｇ
ｏ ｄ（Ｔ）コーティング済み９６ウェルプレート（ＡＧＣＴ Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ
ＣＡ）に移した。プレートを６０分間室温でインキュベートし、２００μＬの洗浄緩衝
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３Ｍ ＮａＣｌ
）で３回洗浄した。最後の洗浄の後、プレートをペーパータオル上で吸い取らせて過剰な
洗浄緩衝液を除去し、次いで、５分間風乾した。６０μＬの溶出緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６）（７０℃まで予備加熱した）を、各ウェルに添加し、そのプレ
ートを、９０℃のホットプレート上で５分間インキュベートし、次いで、その溶出物を、
新しい９６ウェルプレートに移した。

１００ｍｍプレート上または他の標準的なプレート上で増殖した細胞を、適切な容量の
全ての溶液を使用して、同様に処理し得る。

（実施例１２）
（全ＲＮＡ単離）
全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から購入したＲＮＥ
ＡＳＹ ９６^ＴＭキットおよび緩衝液を製造業者の推奨する手順に従って使用して、単離
した。簡単に述べると、９６ウェルプレート上で増殖した細胞に対して、増殖培地を、そ
の細胞から除去し、そして各ウェルを２００μＬの冷ＰＢＳで洗浄した。１００μＬの緩
衝液ＲＬＴを各ウェルに添加し、そしてそのプレートを２０秒間激しく攪拌した。次いで
、１００μＬの７０％エタノールを各ウェルに添加し、そして内容物を、３回ピペッティ
ングして出し入れすることによって混合した。次いで、そのサンプルを、廃液収集トレイ
を備え減圧供給源に取り付けられたＱＩＡＶＡＣ^ＴＭマニホルドに取り付けられた、ＲＮ
ＥＡＳＹ９６^ＴＭウェルプレートに移した。減圧を１５秒間適用した。１ｍＬの緩衝液Ｒ
Ｗ１を、ＲＮＥＡＳＹ９６^ＴＭプレートの各ウェルに添加し、そして再び減圧を１５秒間
適用した。次いで、１ｍＬの緩衝液ＲＰＥをＲＮＥＡＳＹ９６^ＴＭプレートの各ウェルに
添加し、そして減圧を１５秒間適用した。次いで、緩衝液ＲＰＥ洗浄を繰り返し、そして
減圧をさらに１０分間適用した。次いで、そのプレートをＱＩＡＶＡＣ^ＴＭマニホルドか
ら取り外し、そしてペーパータオル上にて吸い取らせて乾かした。次いで、そのプレート
を、１．２ｍＬコレクションチューブを備えるコレクションチューブラックを備え付けた
ＱＩＡＶＡＣ^ＴＭマニホルドに、再び取り付けた。次いで、各ウェルに６０μＬの水をピ
ペッティングし、１分間インキュベートし、次いで、３０秒間減圧を適用することによっ
て、ＲＮＡを溶出した。この溶出工程を、さらに６０μＬの水を用いて繰り返した。

反復するこのピペッティング工程および溶出工程を、ＱＩＡＧＥＮ Ｂｉｏ−Ｒｏｂｏ
ｔ ９６０４（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して自動化し
得る。基本的に、培養プレート上で細胞を溶解させた後、そのプレートをロボットデッキ
に移し、このロボットデッキにおいて、ピペッティング工程、ＤＮａｓｅ処理工程および
溶出工程を実施する。

（実施例１３）
（アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量的ＰＣＲ分析）
アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの定量を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ ７７００
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を製造業者の指示に従って使用して
、リアルタイム定量的ＰＣＲによって決定した。これは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）生成物をリアルタイムでハイスループット定量することを可能にする、閉鎖管式で非ゲ
ルベースの蛍光検出システムである。ＰＣＲが完了した後に増幅生成物を定量する標準的
なＰＣＲに対して、リアルタイム定量的ＰＣＲにおける生成物は、それらが蓄積するにつ
れて定量される。これは、順方向ＰＣＲプライマーと逆方向ＰＣＲプライマーとの間で特
異的にアニールしかつ２つの蛍光色素を含むオリゴヌクレオチドプローブを、このＰＣＲ
反応において含むことによって達成される。レポーター色素（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡまたはＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡのいずれかから入手される、Ｊ
ＯＥ、ＦＡＭ、またはＶＩＣ）を、そのプローブの５’末端に結合させ、そしてクエンチ
ャー色素（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄ
ａ，ＣＡまたはＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ
，ＣＡのいずれかから入手される、ＴＡＭＲＡ）を、そのプローブの３’末端に結合させ
る。そのプローブおよび色素がインタクトである場合、レポーター色素発光は、３’クエ
ンチャー色素が近いことにより、クエンチされる。増幅の間、そのプローブが標的配列に
アニールすることによって、Ｔａｑポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性によって
切断され得る基質が、生成される。ＰＣＲ増幅サイクルの伸長期の間、Ｔａｑポリメラー
ゼによりそのプローブが切断されると、そのプローブの残りから（それ故、クエンチャー
部分から）レポーター色素が遊離され、そして配列特異的蛍光シグナルが生成される。各
サイクルに伴い、さらなるレポーター色素分子が、それらの個々のプローブから切断され
る。そしてその蛍光強度を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅ
ｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍに組み込まれたレーザーオプティクスによって、規則的間
隔でモニターする。各アッセイにおいて、未処理のコントロールサンプル由来のｍＲＮＡ
の系列希釈物を含む一連の並行反応を使用して、試験サンプルのアンチセンスオリゴヌク
レオチド処理後の阻害％を定量するために使用する標準曲線を作成する。

定量的ＰＣＲ分析の前に、測定している標的遺伝子に特異的なプライマー−プローブセ
ットを、そのセットがＧＡＰＤＨ増幅反応によって「多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）」さ
れる能力について評価する。多重化において、その標的遺伝子と内部標準遺伝子ＧＡＰＤ
Ｈとの両方が、単一のサンプル中で同時に増幅される。この分析において、未処理細胞か
ら単離したｍＲＮＡを、系列希釈する。各希釈物を、ＧＡＰＤＨのみに特異的なプライマ
ー−プローブセット、標的遺伝子のみに特異的なプライマー−プローブセット（「一重化
（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｌｅｘｉｎｇ）」）、または両方に特異的なプライマー−プローブセ
ット（多重化）の存在下で増幅する。ＰＣＲ増幅に続いて、希釈の関数としてのＧＡＰＤ
Ｈ ｍＲＮＡシグナルおよび標的ｍＲＮＡシグナルの標準曲線を、一重化サンプルおよび
多重化サンプルの両方から作成する。多重化サンプルから作成したＧＡＰＤＨシグナルお
よび標的シグナルの傾きおよび補正係数の両方が、一重化サンプルから作成したそれらの
対応する値の１０％以内に入る場合、その標的に特異的なプライマー−プローブセットは
、多重化可能であるとみなされる。他のＰＣＲ方法もまた、当該分野において公知である
。

ＰＣＲ試薬を、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔ
ｙ，ＣＡから得た。２５μＬ ＰＣＲカクテル（１×ＴＡＱＭＡＮ^ＴＭ緩衝液Ａ、５．５
ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３００μＭのｄＡＴＰ、３００μＭのｄＣＴＰおよび３００μＭのｄ
ＧＴＰ、６００μＭのｄＵＴＰ、１００ｎＭの順方向プライマー、１００ｎＭの逆方向プ
ライマー、および１００ｎＭのプローブ、２０単位のＲＮＡｓｅインヒビター、１．２５
単位のＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤ^ＴＭ、および１２．５単位のＭｕＬＶ逆転写酵素）を
、９６ウェルプレート（２５μＬの全ＲＮＡ溶液を含む）に添加することによって、ＲＴ
−ＰＣＲ反応を行った。このＲＴ反応を、４８℃で３０分間インキュベーションすること
によって、実行した。ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤ^ＴＭを活性化するために９５℃で１０
分間インキュベーションした後、４０サイクルの２工程ＰＣＲプロトコルを実行した。こ
の２工程ＰＣＲプロトコルは、９５℃にて１５秒間（変性）、その後、６０℃にて１．５
分間（アニーリング／伸長）であった。

リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって得られる遺伝子標的量を、ＧＡＰＤＨの発現レベル
（この遺伝子の発現は一定である）を使用すること、またはＲｉｂｏＧｒｅｅｎ^ＴＭ（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して全ＲＮＡを
定量することのいずれかによって、正規化する。ＧＡＰＤＨ発現を、標的と同時に実施す
るか、多重化するか、または別々に実施することによって、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに
よって定量する。全ＲＮＡを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＰｒｏｂｅｓからのＲｉｂｏＧｒｅ
ｅｎ^ＴＭＲＮＡ定量試薬を使用して定量する。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ^ＴＭによるＲＮＡ定量
の方法は、Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｊ．ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，１９９８，２６５，３６８−３７４に教示される。

このアッセイにおいて、１７５μＬのＲｉｂｏＧｒｅｅｎ^ＴＭ作業試薬（１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５中で、１：２８６５に希釈したＲｉｂｏ
Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ試薬）を、２５μＬの精製細胞ＲＮＡを含む９６ウェルプレートにピペッ
ティングする。このプレートを、４８０ｎｍでの励起および５２０ｎｍでの発光を用いて
ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ ４０００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で読み
取る。

ヒトアポリポタンパク質Ｂに対するプローブおよびプライマーを、公開された配列情報
（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ ０００３８４（本明細書中において、配列番号３として
援用される））を使用して、ヒトアポリポタンパク質Ｂ配列にハイブリダイズするように
設計した。ヒトアポリポタンパク質Ｂについて、そのＰＣＲプライマーは、

であり、そしてそのＰＣＲプローブは、

（配列番号６）であった。ここで、ＦＡＭ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、蛍光レポーター色素であり、そしてＴＡＭＲＡ
（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、
クエンチャー色素である。ヒトＧＡＰＤＨについて、そのＰＣＲプライマーは：

であり、そしてそのＰＣＲプローブは：

（配列番号９）であった、ここで、ＪＯＥ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、蛍光レポーター色素であり、そしてＴＡＭＲＡ
（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、
クエンチャー色素である。

マウスアポリポタンパク質Ｂに対するプローブおよびプライマーを、公開された配列情
報（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３５１８６（本明細書中において、配列番号１０として援
用される））を使用して、マウスアポリポタンパク質Ｂ配列にハイブリダイズするように
設計した。マウスアポリポタンパク質Ｂについて、そのＰＣＲプライマーは：

であり、そしてＰＣＲプローブは：

（配列番号１３）であった。ここで、ＦＡＭ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、蛍光レポーター色素であり、そしてＴＡＭＲ
Ａ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は
、クエンチャー色素である。マウスＧＡＰＤＨについて、そのＰＣＲプライマーは：

であり、そしてそのＰＣＲプローブは、

であった。ここで、ＪＯＥ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅ
ｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、蛍光レポーター色素であり、そしてＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、クエンチャー色
素である。

（実施例１４）
（アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析）
アンチセンス処理の１８時間後、細胞単層を、冷ＰＢＳで２回洗浄し、そして１ｍＬ
ＲＮＡＺＯＬ^ＴＭ（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ ”Ｂ” Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，Ｔ
Ｘ）中に溶解させた。全ＲＮＡを、製造業者の推奨するプロトコルに従って、調製した。
２０μｇの全ＲＮＡを、ＭＯＰＳ緩衝液系（ＡＭＲＥＳＣＯ，Ｉｎｃ．Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ
）を使用して、１．１％ホルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲルを通す電気泳動
によって分画した。ＲＮＡを、ノーザン／サザントランスファー緩衝液系（ＴＥＬ−ＴＥ
ＳＴ ”Ｂ” Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を使用する一晩のキャピラリ
ートランスファーによって、そのゲルからＨＹＢＯＮＤ^ＴＭ−Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に移し
た。ＲＮＡトランスファーを、ＵＶ可視化によって確認した。膜を、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮ
ＫＥＲ^ＴＭ ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ ２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ
，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用するＵＶ架橋によって固定し、次いで、ストリンジェ
ントな条件についての製造業者の推奨を使用して、ＱＵＩＣＫＨＹＢ^ＴＭハイブリダイゼ
ーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用してプロービン
グした。

ヒトアポリポタンパク質Ｂを検出するために、ヒトアポリポタンパク質Ｂ特異的プロー
ブを、

を使用するＰＣＲによって、調製した。ローディング効率およびトランスファー効率にお
ける変動を正規化するために、膜をストリッピングし、そしてヒトグリセルアルデヒド−
３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌ
ｔｏ，ＣＡ）についてプロービングした。

マウスアポリポタンパク質Ｂを検出するために、ヒトアポリポタンパク質Ｂ特異的プロ
ーブを、

を使用するＰＣＲによって、調製した。ローディング効率およびトランスファー効率にお
ける変動を正規化するために、膜をストリッピングし、そしてマウスグリセルアルデヒド
−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａ
ｌｔｏ，ＣＡ）についてプロービングした。

ハイブリダイズした膜を、ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ^ＴＭおよびＩＭＡＧＥＱＵＡ
ＮＴ^ＴＭ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ３．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕ
ｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して可視化し、そして定量した。データを、未処理コント
ロールにおけるＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した。

（実施例１５）
（２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを有するキメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドによる、ヒトアポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス阻害）
本発明に従って、公開された配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００３８４（本明
細書中で配列番号３として援用される）を使用して、ヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮ
Ａの異なる領域を標的とするように、一連のオリゴヌクレオチドを設計した。それらのオ
リゴヌクレオチドを表１に示す。「標的部位」とは、そのオリゴヌクレオチドが結合する
特定の標的配列上で最初の（最も５’側の）ヌクレオチド番号を示す。表１におけるすべ
ての化合物が、２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー（ｇａ
ｐｍｅｒ）」）であり、これは、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中心「ギ
ャップ」領域と、それに両方の側（５’方向および３’方向）で隣接する５ヌクレオチド
の「ウィング（ｗｉｎｇ）」から構成されている。このウィングは、２’−メトキシエチ
ル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成されている。ヌクレオシド間（骨格）結合は、
そのオリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。シチ
ジン残基はすべて５’−メチルシチジンである。これらの化合物を、ＨｅｐＧ２細胞にお
けるヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルに対する効果について、本明細書中の他
の実施例に記載されるような定量的リアルタイムＰＣＲによって分析した。データは、２
回の実験からの平均である。「Ｎ．Ｄ．」が存在する場合、それは「データなし」を示す
。

（表１）
（２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを有するキメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの阻害）

表１に示されるように、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、
配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３８、配列番号４
３、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５５、配列番
号５７、配列番号６２、配列番号６３、および配列番号６６は、このアッセイにおいてヒ
トアポリポタンパク質Ｂ発現の少なくとも３０％の阻害を示した。従って、これらの配列
が好ましい。これらの好ましい配列が相補的である標的部位は、本明細書中において「活
性部位」と呼ばれており、従って、本発明の化合物により標的化される好ましい部位であ
る。アポリポタンパク質Ｂは、哺乳動物において２つの形態（ＡｐｏＢ−４８およびＡｐ
ｏＢ−１００）で存在し、これらの形態は、アミノ末端が共直線性であるので、ヌクレオ
チド１〜６５３０を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、両方の形態にハイブ
リダイズし、一方、ヌクレオチド６５３１〜１４１２１を標的とするアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、アポリポタンパク質Ｂの長い方の形態に特異的である。

（実施例１６）
（２’−ＭＯＥウィング（ｗｉｎｇ）とデオキシギャップとを有するキメラホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス阻害−
用量応答研究）
本発明に従って、実施例１５におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの部分集合を、
用量応答研究においてさらに調査した。処理用量は、５０ｎＭ、１５０ｎＭおよび２５０
ｎＭであった。これらの化合物を、ＨｅｐＧ２細胞におけるヒトアポリポタンパク質Ｂ
ｍＲＮＡレベルに対する効果について、本明細書中の他の実施例に記載されるような定量
的リアルタイムＰＣＲによって分析した。データは、２回の実験からの平均であり、その
データを表２に示す。

（表２）
（２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを有するキメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの阻害）

（実施例１７）
（２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを有するキメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドによるマウスアポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス阻害）
本発明に従って、公開された配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３５１８６（本明細書中
で配列番号１０として援用される）を使用して、マウスアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ
の異なる領域を標的とする、一連のオリゴヌクレオチドを設計した。それらのオリゴヌク
レオチドを表３に示す。「標的部位」とは、そのオリゴヌクレオチドが結合する特定の標
的配列上で最初の（最も５’側の）ヌクレオチド番号を示す。表３におけるすべての化合
物が、２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ
）」）であり、これは、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中心「ギャップ」
領域と、それに両方の側（５’方向および３’方向）で隣接する５ヌクレオチドの「ウィ
ング（ｗｉｎｇ）」から構成されている。このウィングは、２’−メトキシエチル（２’
−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成されている。ヌクレオシド間（骨格）結合は、そのオリ
ゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。シチジン残基
はすべて５’−メチルシチジンである。これらの化合物を、初代肝細胞におけるマウスア
ポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルに対する効果について、本明細書中の他の実施例に
記載されるような定量的リアルタイムＰＣＲによって分析した。データは、２回の実験か
らの平均である。「Ｎ．Ｄ．」が存在する場合、それは「データなし」を示す。

（表３）
（２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを有するキメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドによるマウスアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの阻害）

表３に示されるように、配列番号７１、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、
配列番号８１、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８７、配列番号８８、配列番号９
０、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０９、配列番号１１
１、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１
８、配列番号１１９、配列番号１２０および配列番号１２１は、このアッセイにおいてマ
ウスアポリポタンパク質Ｂ発現の少なくとも５０％の阻害を示した。従って、これらの配
列が好ましい。これらの好ましい配列が相補的である標的部位は、本明細書中において「
活性部位」と呼ばれており、従って、本発明の化合物により標的化される好ましい部位で
ある。

（実施例１８）
（２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを有するキメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドによるマウスアポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス阻害−用量応答研
究）
本発明に従って、実施例１７におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの部分集合を、
用量応答研究においてさらに調査した。処理用量は、５０ｎＭ、１５０ｎＭおよび３００
ｎＭであった。これらの化合物を、初代肝細胞におけるヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲ
ＮＡレベルに対する効果について、本明細書中の他の実施例に記載されるような定量的リ
アルタイムＰＣＲによって分析した。データは、２回の実験からの平均であり、そのデー
タを表４に示す。

（表４）
（２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを有するキメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドによるマウスアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの阻害）

（実施例１９）
（アポリポタンパク質Ｂタンパク質レベルのウェスタンブロット分析）
ウェスタンブロット分析（イムノブロット分析）を、標準的方法を使用して行った。細
胞をオリゴヌクレオチド処理の１６〜２０時間後に採集し、ＰＢＳで１回洗浄し、Ｌａｅ
ｍｍｌｉ緩衝液（１００μｌ／ウェル）中に懸濁し、５分間沸騰させ、そして１６％ Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にローディングした。ゲルを１５０Ｖにて１．５時間泳動させ、そ
してウェスタンブロッティング用の膜にトランスファーした。アポリポタンパク質Ｂに対
する適切な一次抗体を、その一次抗体種に対する放射標識二次抗体または蛍光標識二次抗
体とともに使用した。バンドを、ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ^ＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）を使用して可視化した。

（実施例２０）
（Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるアポリポタンパク質Ｂ（ＩＳＩＳ １４７７６４）の
アンチセンス阻害の効果：やせた動物対高脂肪食動物）
高脂血症誘導性アテローム性動脈硬化症性プラーク形成に対して感受性であると報告さ
れている系統であるＣ５７ＢＬ／６マウスを、以下の研究において使用して、やせたマウ
ス対高脂肪食マウスにおける潜在的脂質減少化合物としてのアンチセンスオリゴヌクレオ
チドを評価した。

雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、２つの同等の群（（１）野生型コントロールマウス（や
せた動物）および（２）高脂肪食（６０％ ｋｃａｌ脂肪）を与えられる動物）に分割し
た。コントロール動物には、生理食塩水処理を与え、そして通常の齧歯類用食餌にて維持
した。一晩絶食させた後、各群からのマウスに、生理食塩水または５０ｍｇ／ｋｇ ＩＳ
ＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）を３日間ごとに６週間、腹腔内投与した。研究の
終了時に、最後の注射の４８時間後に、動物を屠殺し、肝臓中の標的ｍＲＮＡレベル、コ
レステロールレベルおよびトリグリセリドレベル、肝臓酵素レベルおよび血清中グルコー
スレベルについて評価した。

この比較研究の結果を、表５に示す。

（表５）
（やせたマウスおよび高脂肪マウスにおける、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベル
、コレステロールレベル、脂質レベル、トリグリセリドレベル、肝臓酵素レベルおよびグ
ルコースレベルに対するＩＳＩＳ １４７７６４処理の効果）

ＩＳＩＳ １４７７６４による処理が、やせたマウスおよび高脂肪マウスの両方におい
て、コレステロールならびにＬＤＬリポタンパク質およびＨＤＬリポタンパク質ならびに
血清中グルコールを低下させたこと、ならびに示された効果が、実際には、ｍＲＮＡレベ
ルの減少により支持されるアポリポタンパク質Ｂ発現の阻害に起因することが、これらの
データから明らかである。肝臓酵素レベルの有意な変化は観察されなかった。このことは
、このアンチセンスオリゴヌクレオチドが、いずれの処理群に対しても毒性ではなかった
ことを示す。

（実施例２１）
（高脂肪食マウスに対するアポリポタンパク質Ｂ（ＩＳＩＳ １４７７６４）のアンチ
センス阻害効果；６週間時間経過研究）
本発明に従って、６週間の時間経過研究を実施して、高脂肪食マウスにおける脂質代謝
およびグルコース代謝に対するＩＳＩＳ １４７７６４の効果をさらに調査した。

高脂肪食（６０％ ｋｃａｌ脂肪）を与えた雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８）を、
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ １４７７６４）による処理の効果について
６週間の時間経過にわたって評価した。コントロール動物には、生理食塩水処理（５０ｍ
ｇ／ｋｇ）を与えた。動物の部分集合に、１日経口用量（２０ｍｇ／ｋｇ）のアトロバス
タチンカルシウム（Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標），Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）を与えた。
すべてのマウス（アトロバスタチン処理動物を除く）に、一晩絶食させた後に、５ｍｇ／
ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、２５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７
７６４（配列番号１０９）、５０ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９
）または生理食塩水（５０ｍｇ／ｋｇ）を、３日間ごと（１週間に２回）に６週間、腹腔
内投与した。血清中コレステロールおよびリポタンパク質を、０週間目、２週間目、およ
び６週間目の暫定時点にて分析した。研究終了時に、最後の注射の４８時間後に動物を屠
殺し、そして肝臓中の標的ｍＲＮＡレベル、コレステロールレベル、リポタンパク質レベ
ル、トリグリセリドレベル、肝臓酵素（ＡＳＴおよびＡＬＴ）レベルおよび血清中グルコ
ースレベル、ならびに体重、肝臓重量、脾臓重量および脂肪パッド重量について評価した
。

（実施例２２）
（高脂肪食マウスにおけるアポリポタンパク質Ｂ（ＩＳＩＳ １４７７６４）のアンチ
センス阻害の効果−肝臓におけるｍＲＮＡ発現）
高脂肪食（６０％ ｋｃａｌ脂肪）を与えた雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８）を、ｍ
ＲＮＡ発現に対するＩＳＩＳ １４７７６４の効果について６週間の時間経過にわたって
評価した。コントロール動物には、生理食塩水処理（５０ｍｇ／ｋｇ）を与えた。マウス
に、一晩絶食させた後に、５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、
２５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、５０ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩ
Ｓ １４７７６４（配列番号１０９）または生理食塩水（５０ｍｇ／ｋｇ）を、３日間ご
と（１週間に２回）に６週間、腹腔内投与した。研究終了時に、最後の注射の４８時間後
に動物を屠殺し、そして肝臓中の標的ｍＲＮＡレベルについて評価した。ＩＳＩＳ １４
７７６４は、５ｍｇ／ｋｇ用量、２５ｍｇ／ｋｇ用量、および５０ｍｇ／ｋｇ用量におい
て、ｍＲＮＡレベルをそれぞれ１５％、７５％、および８８％減少させる、用量応答効果
を示した。

処置期間の終わりに収集した肝臓タンパク質サンプルを、マウスアポリポタンパク質Ｂ
（Ｇｌａｎｄｓｔｏｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）に
指示された抗体を使用する免疫ブロット分析に供した。これらのデータは、ＩＳＩＳ １
４７７６４での処置が、ｍＲＮＡレベルを減少させることに加えて、肝臓中のアポリポタ
ンパク質Ｂの発現を、用量依存性の様式で減少させることを実証する。

（実施例２３）
（血清中コレステロールレベルおよびトリグリセリドレベルに対するアポリポタンパク
質Ｂ（ＩＳＩＳ １４７７６４）のアンチセンス阻害の効果）
高脂肪食（６０％ ｋｃａｌ脂肪）を与えた雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８）を、血
清中コレステロールレベルおよびトリグリセリドレベルに対するＩＳＩＳ １４７７６４
の効果について６週間の時間経過にわたって評価した。コントロール動物には、生理食塩
水処理（５０ｍｇ／ｋｇ）を与えた。マウスに、一晩絶食させた後に、５ｍｇ／ｋｇ Ｉ
ＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、２５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（
配列番号１０９）、５０ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）または
生理食塩水（５０ｍｇ／ｋｇ）を、３日間ごと（１週間に２回）に６週間、腹腔内投与し
た。

血清中コレステロールレベルを、０週間目、２週間目、および６週間目に測定した。こ
のデータを表６に示す。この表の値は、阻害パーセントとして表されており、生理食塩水
コントロールに対して正規化されている。

血清中コレステロールに加えて、研究終了時に、最後の注射の４８時間後に動物を屠殺
し、そしてトリグリセリドレベルについて評価した。

ＩＳＩＳ １４７７６４により処理したマウスは、研究終了までに、正常レベルに対し
て、血清中コレステロール（コントロール動物について２４０ｍｇ／ｄＬ、そして５ｍｇ
／ｋｇ用量、２５ｍｇ／ｋｇ用量、および５０ｍｇ／ｋｇ用量について、それぞれ２２５
ｍｇ／ｄＬ、１２５ｍｇ／ｄＬおよび１１０ｍｇ／ｄＬ）ならびにトリグリセリド（コン
トロール動物について１１５ｍｇ／ｄＬ、そして５ｍｇ／ｋｇ用量、２５ｍｇ／ｋｇ用量
、および５０ｍｇ／ｋｇ用量について、それぞれ１２５ｍｇ／ｄＬ、１５０ｍｇ／ｄＬお
よび８５ｍｇ／ｄＬ）の両方の減少を示した。これらのデータを、２０ｍｇ／ｋｇ経口用
量でのアトロバスタチンカルシウムの効果ともまた比較した。このアトロバスタチンカル
シウムの効果は、研究終了時に、血清中コレステロールの極小の減少（２０％）しか示さ
なかった。

（表６）
（ＩＳＩＳ １４７７６４によるマウスアポリポタンパク質Ｂコレステロールレベルの
阻害パーセント）

（実施例２４）
（リポタンパク質レベルに対するアポリポタンパク質Ｂ（ＩＳＩＳ １４７７６４）の
アンチセンス阻害の効果）
高脂肪食（６０％ ｋｃａｌ脂肪）を与えた雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８）を、リ
ポタンパク質（ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬ）レベルに対するＩＳＩＳ １４７７６
４の効果について６週間の時間経過にわたって評価した。コントロール動物には、生理食
塩水処理（５０ｍｇ／ｋｇ）を与えた。マウスに、一晩絶食させた後に、５ｍｇ／ｋｇ
ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、２５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４
（配列番号１０９）、５０ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）また
は生理食塩水（５０ｍｇ／ｋｇ）を、３日間ごと（１週間に２回）に６週間、腹腔内投与
した。

リポタンパク質レベルを、０週間目、２週間目、および６週間目に測定した。このデー
タを表７に示す。この表の値は、阻害パーセントとして表されており、生理食塩水コント
ロールに対して正規化されている。負の値は、観察されたリポタンパク質レベル増加を示
す。

これらのデータを、０週間目、２週間目、および６週間目での、一日経口用量２０ｍｇ
／ｋｇのアトロバスタチンカルシウムの効果ともまた比較した。

これらのデータは、５０ｍｇ／ｋｇ用量のＩＳＩＳ １４７７６４が、アトロバスタチ
ンよりも大きな程度まで、調査した血清中リポタンパク質部類すべてを減少可能であるこ
とを、示す。

（表７）
（アトロバスタチンと比較した、ＩＳＩＳ １４７７６４によるマウスアポリポタンパ
ク質Ｂリポタンパク質レベルの阻害パーセント）

（実施例２５）
（血清中ＡＳＴレベルおよび血清中ＡＬＴレベルに対するアポリポタンパク質Ｂ（ＩＳ
ＩＳ １４７７６４）のアンチセンス阻害の効果）
高脂肪食（６０％ ｋｃａｌ脂肪）を与えた雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８）を、肝
臓酵素（ＡＳＴおよびＡＬＴ）レベルに対するＩＳＩＳ １４７７６４の効果について６
週間の時間経過にわたって評価した。コントロール動物には、生理食塩水処理（５０ｍｇ
／ｋｇ）を与えた。マウスに、一晩絶食させた後に、５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７
６４（配列番号１０９）、２５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）
、５０ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）または生理食塩水（５０
ｍｇ／ｋｇ）を、３日間ごと（１週間に２回）に６週間、腹腔内投与した。ＡＳＴレベル
およびＡＬＴレベルを、６週間目に測定した。

ＩＳＩＳ １４７７６４により処理したマウスは、生理食塩水コントロールと比較して
、この研究の期間にわたって有意なＡＳＴレベル変化を何ら示さなかった（生理食塩水コ
ントロールについての６５ＩＵ／Ｌと比較して、５ｍｇ／ｋｇ用量、２５ｍｇ／ｋｇ用量
、および５０ｍｇ／ｋｇ用量について、それぞれ１０５ＩＵ／Ｌ、７０ＩＵ／Ｌおよび８
０ＩＵ／Ｌ）。一日経口用量２０ｍｇ／ｋｇのアトロバスタチンにより処理したマウスは
、ＡＳＴレベル８５ＩＵ／Ｌを有した。

ＡＬＴレベルは、生理食塩水コントロールと比較して、この研究の期間にわたってすべ
ての処理によって増加した（生理食塩水コントロールについての２５ＩＵ／Ｌと比較して
、５ｍｇ／ｋｇ用量、２５ｍｇ／ｋｇ用量、および５０ｍｇ／ｋｇ用量について、それぞ
れ５０ＩＵ／Ｌ、７０ＩＵ／Ｌおよび１００ＩＵ／Ｌ）。一日経口用量２０ｍｇ／ｋｇの
アトロバスタチンにより処理したマウスは、ＡＳＴレベル４０ＩＵ／Ｌを有した。

（実施例２６）
（血清中グルコースレベルに対するアポリポタンパク質Ｂ（ＩＳＩＳ １４７７６４）
のアンチセンス阻害の効果）
高脂肪食（６０％ ｋｃａｌ脂肪）を与えた雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８）を、血
清中グルコースレベルに対するＩＳＩＳ １４７７６４の効果について６週間の時間経過
にわたって評価した。コントロール動物には、生理食塩水処理（５０ｍｇ／ｋｇ）を与え
た。マウスに、一晩絶食させた後に、５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号
１０９）、２５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、５０ｍｇ／ｋ
ｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）または生理食塩水（５０ｍｇ／ｋｇ）を
、３日間ごと（１週間に２回）に６週間、腹腔内投与した。

研究終了時に、最後の注射の４８時間後に動物を屠殺し、そして血清中グルコースレベ
ルについて評価した。ＩＳＩＳ １４７７６４は、生理食塩水コントロールについての３
００ｍｇ／ｄＬと比較して、５ｍｇ／ｋｇ用量、２５ｍｇ／ｋｇ用量、および５０ｍｇ／
ｋｇ用量について、それぞれ２２５ｍｇ／ｄＬ、１９０ｍｇ／ｄＬおよび１８０ｍｇ／ｄ
Ｌにまで血清中グルコースレベルを減少させる、用量応答効果を示した。一日経口用量２
０ｍｇ／ｋｇのアトロバスタチンにより処理したマウスは、血清中グルコースレベル２１
５ｍｇ／ｄＬを有した。これらのデータは、ＩＳＩＳ １４７７６４が、高脂肪食マウス
において血清中グルコースレベルを減少可能であることを示す。

（実施例２７）
（体重、脾臓重量、肝臓重量および脂肪パッド重量に対するアポリポタンパク質Ｂ（Ｉ
ＳＩＳ １４７７６４）のアンチセンス阻害の効果）
高脂肪食（６０％ ｋｃａｌ脂肪）を与えた雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８）を、体
重、脾臓重量、肝臓重量および脂肪パッド重量に対するＩＳＩＳ １４７７６４の効果に
ついて６週間の時間経過にわたって評価した。コントロール動物には、生理食塩水処理（
５０ｍｇ／ｋｇ）を与えた。マウスに、一晩絶食させた後に、５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ
１４７７６４（配列番号１０９）、２５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号
１０９）、５０ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）または生理食塩
水（５０ｍｇ／ｋｇ）を、３日間ごと（１週間に２回）に６週間、腹腔内投与した。

研究終了時に、最後の注射の４８時間後に動物を屠殺し、そして体重、脾臓重量、肝臓
重量および脂肪パッド重量を測定した。これらのデータを表８に示す。値は、生理食塩水
処理したコントロール動物と比較した体重または器官重量の変化パーセントとして表して
いる。一日経口用量２０ｍｇ／ｋｇのアトロバスタチンにより処理したマウスからのデー
タもまた、この表に示している。負の値は、重量の減少を示した。

（表８）
（体重または器官重量に対するマウスアポリポタンパク質Ｂのアンチセンス阻害の効果
）

これらのデータは、脾臓重量および肝臓重量の両方の増加により相殺されたＩＳＩＳ
１４７７６４の投与範囲にわたる脂肪減少を示し、用量が増加するにつれて全体重の全体
的減少が生じている。

（実施例２８）
（Ｂ６．１２９Ｐ−Ａｐｏｅ^{ｔｍ１Ｕｎｃ}ノックアウトマウスにおけるアポリポタンパ
ク質Ｂ（ＩＳＩＳ １４７７６４）のアンチセンス阻害の効果：やせた動物対高脂肪食動
物）
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から得たＢ６
．１２９Ｐ−Ａｐｏｅ^{ｔｍ１Ｕｎｃ}ノックアウトマウス（本明細書中でＡｐｏＥノックア
ウトマウスと呼ぶ）は、Ａｐｏｅ^{ｔｍ１Ｕｎｃ}変異についてホモ接合性であり、年齢によ
っても性別によっても影響を受けない全血漿コレステロールレベルの顕著な増加を示す。
これらの動物は、３ヶ月齢にて、近位大動脈中に脂肪線条を示す。これらの病変は、年齢
とともに増加し、そして脂質が少ないがより細長い細胞を含む病変（アテローム性動脈硬
化症性病変のより進行した病期特有である）へと進行する。

これらのマウスにおける変異は、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子中に存在す
る。ＡｐｏＥタンパク質の主要な目的は、コレステロールおよびトリグリセリドを身体全
体へと輸送することである。アポリポタンパク質Ｅは、リポタンパク質構造を安定化させ
、低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬＲ）および関連タンパク質に結合し、そして
ＨＤＬサブクラス中に存在し、ＨＤＬにＬＤＬＲ結合能を提供する。ＡｐｏＥは、肝臓お
よび脳において最も豊富に発現される。雌Ｂ６．１２９Ｐ−Ａｐｏｅ^{ｔｍ１Ｕｎｃ}ノック
アウトマウス（ＡｐｏＥノックアウトマウス）を以下の研究に使用して、潜在的脂質減少
化合物としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドを評価した。

雌ＡｐｏＥノックアウトマウスは、５週齢〜７週齢の範囲であった。これらの雌Ａｐｏ
Ｅノックアウトマウスに、研究開始前の２週間、通常の食餌を与えた。その後、ＡｐｏＥ
ノックアウトマウスに、６０％脂肪食（０．１５％コレステロール添加）を無制限に与え
て、高脂血症および肥満を誘導した。コントロール動物には、コレステロールを添加して
いない高脂肪食を与えて維持した。一晩絶食させた後、各群からのマウスに、生理食塩水
、５０ｍｇ／ｋｇのコントロールアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ２９８３
７ ＴＣＧＡＴＣＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＣＣＣＧ；配列番号１２４）、あるいは５ｍｇ／
ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、２５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７
７６４（配列番号１０９）、５０ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９
）を、３日間ごとに６週間、腹腔内投与した。

このコントロールオリゴヌクレオチドは、２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオ
チド（「ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）」）であり、これは、１０個の２’−デオキシヌ
クレオチドからなる中心「ギャップ」領域と、それに両方の側（５’方向および３’方向
）で隣接する５ヌクレオチドの「ウィング（ｗｉｎｇ）」から構成されている。このウィ
ングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成されている。ヌク
レオシド間（骨格）結合は、そのオリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート
（Ｐ＝Ｓ）結合である。シチジン残基はすべて５’−メチルシチジンである。

研究終了時に、最後の注射の４８時間後に動物を屠殺し、そして肝臓中の標的ｍＲＮＡ
レベルについてＲＴ−ＰＣＲ法により評価しノーザンブロット分析により確認した。そし
てその動物を、グルコースレベル、コレステロールレベルおよび脂質レベルについてＨＰ
ＬＣ分離法により評価し、トリグリセリドレベルおよび肝臓酵素レベルについて評価した
（ＬａｂＣｏｒｐ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，
ＣＡが実施した）。一日経口用量２０ｍｇ／ｋｇのアトロバスタチンにより処理したマウ
スからのデータもまた、比較のための表に示している。

この比較研究の結果を表９に示す。データは、生理食塩水コントロールに対して正規化
している。

（表９）
（ＡｐｏＥノックアウトマウスにおけるアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベル、コレ
ステロールレベル、グルコースレベル、脂質レベル、トリグリセリドレベルおよび肝臓酵
素レベルに対する、ＩＳＩＳ １４７７６４処理の効果）

ＩＳＩＳ １４７７６４による処理が、ＡｐｏＥノックアウトマウスにおいて、グルコ
ースおよびコレステロールならびに調査したすべてのリポタンパク質（ＨＤＬ、ＬＤＬお
よびＶＬＤＬ）を低下させたことが、これらのデータから明らかである。さらに、これら
の減少は、アポリポタンパク質Ｂタンパク質レベルおよびアポリポタンパク質ＲＮＡレベ
ルの両方の減少と相関した。このことは、アンチセンス作用機構を示す。肝臓効果レベル
の有意な変化は観察されなかった。このことは、このアンチセンスオリゴヌクレオチドが
、いずれの処理群に対しても毒性ではなかったことを示す。

（実施例２９）
（２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを持つキメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス阻害：追加オリゴヌ
クレオチド）
本発明によれば、公開されている配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ０００３８４．１
、本明細書では配列番号３として援用する）を用いて、別系列のオリゴヌクレオチドを設
計してヒトアポリポタンパク質Ｂ ＲＮＡの異なる領域を標的にする。オリゴヌクレオチ
ドを表１０に示す。「標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）」は、オリゴヌクレオチドが
結合する特定の標的配列上の第１の（５’最末端の）ヌクレオチド番号を示す。表１０の
すべての化合物が２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（ギャップマー（ｇａ
ｐｍｅｒ））であり、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領
域から構成され、該領域の両側（５’方向および３’方向）に５ヌクレオチドの「ウィン
グ」が隣接している。これらのウィングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌク
レオチドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチドの全体に
わたって、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全てのシチジン残基は、５−メチルシ
チジンである。これらの化合物を、本明細書中の他の実施例で述べられるように、定量的
リアルタイムＰＣＲによってＨｅｐＧ２細胞でのヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレ
ベルに対する該化合物の効果について分析した。データは、ＨｅｐＧ２細胞を表１０に示
す１５０ｎＭの化合物で処理した２回の実験から得られた平均値である。「Ｎ．Ｄ．」が
表示されている場合、これは「データ無し」を示す。

（表１０）
（２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの阻害）

（実施例３０）
（アポリポタンパク質Ｂのアンチセンス阻害−ジーンウオーク（ｇｅｎｅ ｗａｌｋ）
）
本発明にもとづいて、別系列のオリゴヌクレオチドを設計してヒトアポリポタンパク質
Ｂ ＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ０００３８４．１、本明細書では配列番号３と
して援用）の複数の領域（配列番号が２２４または２４７である標的部位の近傍）を標的
にする「ジーンウオーク（ｇｅｎｅ ｗａｌｋ）」を実施した。上記オリゴヌクレオチド
を表１１に示す。「標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）」は、オリゴヌクレオチドが結
合する特定の標的配列上の第１（５’−末端）のヌクレオチド番号を示す。表１１のすべ
ての化合物が２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（ギャップマー（ｇａｐｍ
ｅｒ））であり、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域か
ら構成され、該領域の両側（５’方向および３’方向）に５ヌクレオチドの「ウィング」
が隣接している。これらのウィングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオ
チドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチドの全体にわた
って、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全てのシチジン残基は、５−メチルシチジ
ンである。これらの化合物を、本明細書中の他の実施例で述べられるように、定量的リア
ルタイムＰＣＲによってＨｅｐＧ２細胞でのヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベル
に対する該化合物の効果について分析した。処理用量は、５０ｎＭおよび１５０ｎＭであ
り、表１１に示される。データは、２回の実験から得られた平均値である。「Ｎ．Ｄ．」
が表示されている場合、これは「データ無し」を示す。

（表１１）
（２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの阻害 − ジーン
ウオーク）

図１０および１１に示すように、配列番号１２４、１２８、１２９、１３２、１３３、
１３４、１３８、１４０、１４１、１４２、１４４、１４５、１４７、１４８、１４９、
１５０、１５２、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６３、
１６５、１６６、１６７、１６９、１７０、１７２、１７６、１７７、１７８、１８１、
１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、
１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、
２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、
２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、
２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、
２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、
２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、
２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、
２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、
２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、
２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、
２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、
３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、
３１５、３１６、および３１７は、このアッセイでヒトアポリポタンパク質Ｂ発現を少な
くとも３０％阻害したことから、好ましい。より好ましくは、配列番号２２４、２４７、
および２６２である。これらの好ましい配列に対して相補的である標的領域を、本明細書
では「好ましい標的セグメント」という。したがって、該標的領域は本明細書の化合物に
よる標的化にとって好ましい。これらの好ましい標的セグメントを、表１８に示す。これ
らの配列は、表１０および１１に示す好ましいアンチセンス化合物の逆相補体を表す。「
標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の第１の（５’最末端の
）ヌクレオチド番号を示す。表１８にさらに示されているものが、好ましい標的セグメン
トの各々が見いだされた種類である。

（実施例３１）
（２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを持つキメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス阻害：ＧｅｎＢａｎ
ｋ受託番号Ｍ１４１６２．１の標的化）
本発明によれば、公開されている配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１４１６２．１、本
明細書では配列番号３１８として援用する）を用いて、別系列のオリゴヌクレオチドを設
計してヒトアポリポタンパク質Ｂ ＲＮＡの異なる領域を標的にする。オリゴヌクレオチ
ドを表１２に示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の
第１の（５’最末端の）ヌクレオチド番号を示す。表１２のすべての化合物が２０ヌクレ
オチド長のキメラオリゴヌクレオチド（ギャップマー）であり、１０個の２’−デオキシ
ヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域から構成され、該領域の両側（５’方向およ
び３’方向）に５ヌクレオチドの「ウィング」が隣接している。これらのウィングは、２
’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（主
鎖）結合は、オリゴヌクレオチドの全体にわたって、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）であ
る。全てのシチジン残基は、５−メチルシチジンである。これらの化合物を、本明細書中
の他の実施例で述べられるように、定量的リアルタイムＰＣＲによってＨｅｐＧ２細胞で
のヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルに対する該化合物の効果について分析した
。データは、ＨｅｐＧ２細胞を表１２に示す１５０ｎＭの化合物で処理した２回の実験か
ら得られた平均値である。「Ｎ．Ｄ．」が表示されている場合、これは「データ無し」を
示す。

（表１２）
（２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの阻害）

（実施例３２）
（ヒトアポリポタンパク質Ｂのアンチセンス阻害−ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１４１６
２．１を標的とするジーンウオーク）
本発明にもとづいて、別系列のオリゴヌクレオチドを設計してヒトアポリポタンパク質
Ｂ ＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号１４１６２．１、本明細書では配列番号３１８とし
て援用）の複数の領域（配列番号が３１９である標的部位の近傍）を標的にする「ジーン
ウオーク（ｇｅｎｅ ｗａｌｋ）」を実施した。上記オリゴヌクレオチドを表１３に示す
。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の第１（５’−末端
）のヌクレオチド番号を示す。表１３のすべての化合物が２０ヌクレオチド長のキメラオ
リゴヌクレオチド（ギャップマー）であり、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからな
る中央「ギャップ」領域から構成され、該領域の両側（５’方向および３’方向）に５ヌ
クレオチドの「ウィング」が隣接している。これらのウィングは、２’−メトキシエチル
（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴ
ヌクレオチドの全体にわたって、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全てのシチジン
残基は、５−メチルシチジンである。これらの化合物を、本明細書中の他の実施例で述べ
られるように、定量的リアルタイムＰＣＲによってＨｅｐＧ２細胞でのヒトアポリポタン
パク質Ｂ ｍＲＮＡレベルに対する該化合物の効果について分析した。処理用量は、５０
ｎＭおよび１５０ｎＭであり、表１３に示される。データは、２回の実験から得られた平
均値である。「Ｎ．Ｄ．」が表示されている場合、これは「データ無し」を示す。

（表１３）
（２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの阻害）

図１２および１３に示すように、配列番号３１９、３２３、３２４、３２５、３２６、
３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、および３３３は、このアッセイでヒ
トアポリポタンパク質Ｂ発現を少なくとも３０％阻害したことから、好ましい。より好ま
しくは、配列番号３１９である。これらの好ましい配列に対して相補的である標的領域を
、本明細書では「好ましい標的セグメント」という。したがって、該標的領域は本明細書
の化合物による標的化にとって好ましい。これらの好ましい標的セグメントを、表１８に
示す。これらの配列は、表１２および１３に示す好ましいアンチセンス化合物の逆相補体
を表す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の第１の（５
’最末端の）ヌクレオチド番号を示す。表１８にさらに示されているものが、好ましい標
的セグメントの各々が見いだされた種類である。

（実施例３３）
（２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを持つキメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス阻害：ゲノム配列の
標的化）
本発明によれば、公開されている配列（ゲノム配列を表すＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＭＴ
＿０２２２２７．９のヌクレオチド３９８３５ないし８３２７９の相補体、本明細書では
配列番号３３４として援用する）を用いて、別系列のオリゴヌクレオチドを設計してヒト
アポリポタンパク質Ｂ ＲＮＡの異なる領域を標的にする。オリゴヌクレオチドを表１４
に示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の第１の（５
’最末端の）ヌクレオチド番号を示す。表１４のすべての化合物が２０ヌクレオチド長の
キメラオリゴヌクレオチド（ギャップマー）であり、１０個の２’−デオキシヌクレオチ
ドからなる中央「ギャップ」領域から構成され、該領域の両側（５’方向および３’方向
）に５ヌクレオチドの「ウィング」が隣接している。これらのウィングは、２’−メトキ
シエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は
、オリゴヌクレオチドの全体にわたって、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全ての
シチジン残基は、５−メチルシチジンである。これらの化合物を、本明細書中の他の実施
例で述べられるように、定量的リアルタイムＰＣＲによってＨｅｐＧ２細胞でのヒトアポ
リポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルに対する該化合物の効果について分析した。データは
、ＨｅｐＧ２細胞を表１４に示す１５０ｎＭの化合物で処理した２回の実験から得られた
平均値である。「Ｎ．Ｄ．」が表示されている場合、これは「データ無し」を示す。

（表１４）
（２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの阻害）

表１４に示すように、配列番号３３５、３３９、３４１、３４２、３４３、３４７、３
４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３
５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６７、３６８、３７０、３７２、３７３、３
７４、３７６、３７７、３７９、３８１、３８３、３８４、３８６、３８７、３８８、３
９０、３９５、３９６、３９９、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４
０８、４１０、４１１、４１３、４１４、４１５、４２３、４２４、４２５、４２６、４
２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３４、４３５、４３６、４３８、４４０、４
４１、４４２、４４３、４４５、４４６、４４７、４４９、４５０、４５１、４５２、４
５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６３、４６４、４６８、４６９、４７０、４
７１、４７２、４７３、４７５、４７９、４８０、４８２、４８６、４８９、４９０、４
９１、４９５、４９６、４９８、４９９、および５０２は、このアッセイでヒトアポリポ
タンパク質Ｂ発現を少なくとも３０％阻害したことから、好ましい。これらの好ましい配
列に対して相補的である標的領域を、本明細書では「好ましい標的セグメント」という。
したがって、該標的領域は本明細書の化合物による標的化にとって好ましい。これらの好
ましい標的セグメントを、表１８に示す。これらの配列は、表１４に示す好ましいアンチ
センス化合物の逆相補体を表す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の
標的配列上の第１の（５’最末端の）ヌクレオチド番号を示す。表１８にさらに示されて
いるものが、好ましい標的セグメントの各々が見いだされた種類である。

（実施例３４）
（２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを持つキメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス阻害 − ＧｅｎＢ
ａｎｋ受託番号ＡＩ２４９０４０．１）
本発明によれば、公開されている配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＩ２４９０４０．１
を持つ配列の相補体、本明細書では配列番号５０３として援用する）を用いて、別系列の
オリゴヌクレオチドを設計してヒトアポリポタンパク質Ｂ ＲＮＡの異なる領域を標的に
する。オリゴヌクレオチドを表１５に示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合
する特定の標的配列上の第１の（５’最末端の）ヌクレオチド番号を示す。表１５のすべ
ての化合物が２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（ギャップマー）であり、
１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域から構成され、該領
域の両側（５’方向および３’方向）に５ヌクレオチドの「ウィング」が隣接している。
これらのウィングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成され
る。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチドの全体にわたって、ホスホロチ
オエート（Ｐ＝Ｓ）である。全てのシチジン残基は、５−メチルシチジンである。これら
の化合物を、本明細書中の他の実施例で述べられるように、定量的リアルタイムＰＣＲに
よってＨｅｐＧ２細胞でのヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルに対する該化合物
の効果について分析した。データは、ＨｅｐＧ２細胞を表１５に示す１５０ｎＭの化合物
で処理した２回の実験から得られた平均値である。「Ｎ．Ｄ．」が表示されている場合、
これは「データ無し」を示す。

（表１５）
（２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの阻害）

表１５に示すように、配列番号５０５、５０６、５０７、５１０、および５１２は、こ
のアッセイでヒトアポリポタンパク質Ｂ発現を少なくとも３０％阻害したことから、好ま
しい。これらの好ましい配列に対して相補的である標的領域は、本明細書では「好ましい
標的セグメント」と呼ばれることから、本明細書の化合物による標的化にとって好ましい
。これらの好ましい標的セグメントを、表１８に示す。これらの配列は、表１５に示す好
ましいアンチセンス化合物の逆相補体を表す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結
合する特定の標的配列上の第１の（５’最末端の）ヌクレオチド番号を示す。表１８にさ
らに示されているものが、好ましい標的セグメントの各々が見いだされた種類である。

（実施例３５）
（２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを持つキメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス阻害 − ギャップ
の位置での変異）
本発明によれば、公開されている配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３８４．
１、本明細書では配列番号３として援用する）を用いて、別系列のオリゴヌクレオチドを
設計してヒトアポリポタンパク質Ｂ ＲＮＡの異なる領域を標的にする。化合物を表１６
に示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の第１の（５
’最末端の）ヌクレオチド番号を示す。表１６のすべての化合物が２０ヌクレオチド長の
キメラオリゴヌクレオチド（ギャップマー）である。「ギャップ」領域は、２’−デオキ
シヌクレオチドから構成され、該領域の片側または両側（５’方向および３’方向）に２
’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される「ウィング」が隣接し
ている。２’−ＭＯＥヌクレオチドの全数が常に１０に等しく、かつキメラオリゴヌクレ
オチドの全長が２０ヌクレオチドである。「ギャップ構造」および「２’−デオキシヌク
レオチド」を太字で示すことで、各オリゴヌクレオチドの正確な構造を表１６に示した。
例えば、８〜１０〜２の設計は、第１の（５’最末端の）８ヌクレオチドおよび最後の（
３’最末端の）２ヌクレオチドが２’−ＭＯＥヌクレオチドであり、ギャップにある１０
ヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチドである。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オ
リゴヌクレオチドの全体にわたって、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全てのシチ
ジン残基は、５−メチルシチジンである。これらの化合物を、本明細書中の他の実施例で
述べられるように、定量的リアルタイムＰＣＲによってＨｅｐＧ２細胞でのヒトアポリポ
タンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルに対する該化合物の効果について分析した。データ（表１
６に示す）は、ＨｅｐＧ２細胞を５０ｎＭおよび１５０ｎＭの用量の本発明のアンチセン
スオリゴヌクレオチドで処理した３回の実験から得られた平均値である。「Ｎ．Ｄ．」が
表示されている場合、これは「データ無し」を示す。

（表１６）
（２’−ＭＯＥウィングおよび可変デオキシギャップを有するキメラホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの阻害）

表１６に示すように、このアッセイでは、配列番号２２４、２４７、および５１４が、
両用量でヒトアポリポタンパク質Ｂ発現を少なくとも３０％阻害した。これらのデータが
示すことは、オリゴヌクレオチドがギャップ置換においていくつかの変異によって効果的
であることを示唆している。これらの好ましい配列に対して相補的である標的領域を、本
明細書では「好ましい標的セグメント」という。したがって、該標的領域は本明細書の化
合物による標的化にとって好ましい。これらの好ましい標的セグメントを、表１８に示す
。これらの配列は、表１６に示す好ましいアンチセンス化合物の逆相補体を表す。「標的
部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の第１の（５’最末端の）ヌ
クレオチド番号を示す。表１８にさらに示されているものが、好ましい標的セグメントの
各々が見いだされた種類である。

（実施例３６）
（２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを持つキメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス阻害 −配列番号３
１９および５１５の位置での変異）
本発明に従って、ギャップ構造に変異を持つ一連のアンチセンス化合物を配列番号３１
９および５１５を基づいて設計した。これらの化合物を表１７に示す。「標的部位」は、
化合物が結合する特定の標的配列上の第１の（５’最末端の）ヌクレオチド番号を示す。
表１７のすべての化合物が２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（ギャップマ
ー）である。「ギャップ」領域は、２’−デオキシヌクレオチドからなり、２’−メトキ
エチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される「ウィング」が、片方または両側（
５’および３’方向）に隣接している。ギャップの各々の側にある２’−ＭＯＥヌクレオ
チドの数は、２’−ＭＯＥヌクレオチドの合計が常に１０に等しく、かつキメラオリゴヌ
クレオチドの全長が２０ヌクレオチドとなるように、変動する。「ギャップ構造」および
「２’−デオキシヌクレオチド」を太字で示すことで、各オリゴヌクレオチドの正確な構
造を表１７に示した。例えば、８〜１０〜２の設計は、第１の（５’最末端の）８ヌクレ
オチドおよび最後の（３’最末端の）２ヌクレオチドが２’−ＭＯＥヌクレオチドであり
、ギャップにある１０ヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチドであることを示す。ヌ
クレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチドの全体にわたって、ホスホロチオエー
ト（Ｐ＝Ｓ）である。全てのシチジン残基は、５−メチルシチジンである。これらの化合
物を、本明細書中の他の実施例で述べられるように、定量的リアルタイムＰＣＲによって
ＨｅｐＧ２細胞でのヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルに対する該化合物の効果
について分析した。データ（表１７に示す）は、ＨｅｐＧ２細胞を５０ｎＭおよび１５０
ｎＭの用量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した３回の実験から得られ
た平均値である。「Ｎ．Ｄ．」が表示されている場合、これは「データ無し」を示す。

（表１７）
（２’−ＭＯＥウィングおよび可変デオキシギャップを有するキメラホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの阻害）

表１７に示すように、このアッセイでは、配列番号３１９および５１５が、両用量でヒ
トアポリポタンパク質Ｂ発現を少なくとも４４％阻害した。これらのデータが示すことは
、オリゴヌクレオチドがギャップ置換においていくつかの変異によって効果的であること
を示唆している。これらの好ましい配列に対して相補的である標的領域を、本明細書では
「好ましい標的セグメント」という。したがって、該標的領域は本明細書の化合物による
標的化にとって好ましい。これらの好ましい標的セグメントを、表１８に示す。これらの
配列は、表１７に示す好ましいアンチセンス化合物の逆相補体を表す。「標的部位」は、
オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の第１の（５’最末端の）ヌクレオチド
番号を示す。表１８にさらに示されているものが、好ましい標的セグメントの各々が見い
だされた種類である。

（表１８）
（アポリポタンパク質Ｂで同定された好ましい標的セグメントの配列および位置）

これらの「好ましい標的セグメント」が本発明のアンチセンス化合物とのハイブリダイ
ゼーションについて公開され、かつ利用可能となったことから、これらの好ましい標的セ
グメントに特異的にハイブリダイズすることでアポリポタンパク質Ｂの発現を阻害する本
発明のさらなる実施形態を、ルーチンの実験しか使用しないで、本発明の実施形態を認識
または確認することが可能である。本発明によれば、アンチセンス化合物として、アンチ
センスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部誘導配列
（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、代
わりのスプライサー、プライマー、プローブ、および標的核酸の少なくとも一部にハイブ
リダイズする他の短いオリゴマー化合物が挙げられる。

（実施例３７）
（ヒトアポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス阻害 − オリゴヌクレオチドの用量
応答）
本発明に従って、実施例２９および３１に記載した１２オリゴヌクレオチドを、用量応
答試験でさらに調べた。この試験で用いた対照オリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ １８０
７６（配列番号８０５）およびＩＳＩＳ １３６５０（配列番号８０６）であった。

対照群を含むこの試験のすべての化合物が２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオ
チド（ギャップマー）であり、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャ
ップ」領域から構成され、該領域の両側（５’方向および３’方向）に５ヌクレオチドの
「ウィング」が隣接している。これらのウィングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯ
Ｅ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチド
の全体にわたって、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全てのシチジン残基は、５−
メチルシチジンである。

用量反応実験では、指標としてのｍＲＮＡレベルで、ＨｅｐＧ２細胞を、用量が３７、
７５、１５０、および３００ｎＭオリゴヌクレオチドの用量で、アンチセンスオリゴヌク
レオチドまたは対照オリゴヌクレオチドによって処理した。データは、本明細書の他の実
施例に記載したように定量的リアルタイムＰＣＲによって得られたもので、未処理対照群
に対して正規化されている処理群のｍＲＮＡレベルによる２回の実験から平均したもので
ある。データを用１９に示す。

（表１９）
（２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを持つキメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドによるアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの阻害 − 用量応答）

（実施例３８）
（ヒトアポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス阻害 − 用量応答 − 低用量範囲
）
本発明に従って、実施例２９、３１、３５、および３６に記載した７オリゴヌクレオチ
ドを、用量応答試験でさらに調べた。この試験で用いた対照オリゴヌクレオチドは、ＩＳ
ＩＳ １８０７６（配列番号８０５）、ＩＳＩＳ １３６５０（配列番号８０６）、およ
びＩＳＩＳ １２９６９５（配列番号８０７）であった。

対照群を含むこの試験のすべての化合物が２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオ
チド（ギャップマー）であり、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャ
ップ」領域から構成され、該領域の両側（５’方向および３’方向）に５ヌクレオチドの
「ウィング」が隣接している。これらのウィングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯ
Ｅ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチド
の全体にわたって、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全てのシチジン残基は、５−
メチルシチジンである。

用量反応実験では、指標としてのｍＲＮＡレベルで、ＨｅｐＧ２細胞を、用量が１２．
５、３７、７５、１５０、および３００ｎＭオリゴヌクレオチドの用量で、アンチセンス
オリゴヌクレオチドまたは対照オリゴヌクレオチドによって処理した。本明細書の他の実
施例に記載したように定量的リアルタイムＰＣＲによってデータを得て、該データを未処
理の対照群に対して正規化されている処理群でのｍＲＮＡレベルによる２回の実験から平
均化した。データを表２０に示す。

（表２０）
（２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを持つホスホロチオエートオリゴヌク
レオチドによるアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡのレベルの阻害 − 用量応答）

（実施例３９）
（ＲＮＡ合成）
一般に、ＲＮＡ合成化学は、戦略的中間反応での種々の保護基の選択的取り込みに基づ
いている。有機合成で保護基を使用することは、当業者が理解することではあるが、保護
基の有用な種類としてシリルエーテル類があげられる。特に、大きなシリルエーテル類は
２’−ヒドロキシル上の酸に不安定なオルトエステル保護基との組み合わせで５’−ヒド
ロキシルを保護するのに用いられる。このような組みを成した保護基を次に標準固相合成
技術とともに用いる。他の全ての合成ステップの後、最後に酸性の不安定なオルソエステ
ル保護基を除去することが重要である。さらに、合成過程でシリル保護基を早めに使用す
ることで、望ましくない２’−ヒドロキシルの脱保護を生ずることなく、必要に応じた容
易な除去が確実になる。

このような手順は、差次的に除去され、かつ差次的に化学的に不安定である保護基によ
る２’−ヒドロキシルの保護と組み合わせた５’−ヒドロキシルの逐次保護のためのもの
であって、該手順の後に、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成をおこなった。

ＲＮＡオリゴヌクレオチドを段階的に合成する。各々のヌクレオチドを順次（３’から
５’方向）、固相結合オリゴヌクレオチドに添加する。鎖の３’末端にある第１のヌクレ
オシドが固体担体に共有結合する。ヌクレオチド前駆体であるリボヌクレオシドホスホラ
ミダイトとアクティベーターとを添加し、第２の塩基を第１のヌクレオシドの５’末端に
連結させる。担体を洗い、いっさいの未反応５′ヒドロキシル基に無水酢酸をかぶせて５
’−アセチル部分を生じさせる。つぎに、この結合部分を酸化して、より安定かつ究極的
に所望されるＰ（Ｖ）結合にする。ヌクレオチド添加サイクルの終わりに、５’−シリル
基をフッ化物で切断する。このサイクルを引き続くヌクレオチドの各々に対して繰り返す
。

合成後、リン酸塩上のメチル保護基を、１Ｍの二ナトリウム−２−カルバモイル−２ー
シアノエチレン−１，１−ジチオレート三水酸基化合物（Ｓ_２Ｎａ_２）含有ＤＭＦを用い
て３０分で切断する。水を使って、脱保護溶液を固相担体結合オリゴヌクレオチドから洗
い落とす。つぎに、担体を４０％メチルアミンを含む水で、５５℃、１０分間処理する。
これによって、ＲＮＡオリゴヌクレオチドが溶液中に放出されることで、環外アミンが脱
保護されて、２’の基が修飾される。この段階で、アニオン交換ＨＰＬＣでオリゴヌクレ
オチドの分析をおこなうことができる。

２’−オルトエステル基は、除去すべき最後の保護基である。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）によって開発されたエチレング
リコールモノアセテートオルトエステル保護は、有用なオルトエステル保護基の一例であ
り、以下の重要な特性を有する。すなわち、それがヌクレオシドホスホラミダイト合成お
よびオリゴヌクレオチド合成の条件に対して安定であることである。しかし、オリゴヌク
レオチド合成後、このオリゴヌクレオチドをメチルアミンで処理する。このメチルアミン
は、固体担体からオリゴヌクレオチドを切り離すだけではなく該オルトエステルからアセ
チル基も除去してしまう。オルトエステル上に結果として生ずる２−エチル−ヒドロキシ
置換基はアセチル化前駆体よりも電子求引性が低い。その結果、修飾オルトエステルが酸
接触加水分解に対して、よりいっそう不安定になる。具体的には、アセチル基が除去され
た後、切断速度が約１０倍速くなる。したがって、このオルトエステルは、オリゴヌクレ
オチド合成に十分に対応しており、またその一方で、その後修飾された場合、最終ＲＮＡ
オリゴヌクレオチド産物に対応する相対的に穏やかな水性条件下で脱保護を実施すること
が可能である。

さらに、ＲＮＡ合成の方法は、当技術分野で周知である （Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ
．Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ，１９９６
；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９８，１２０，
１１８２０−１１８２１；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ
．Ｈ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８１，１０３，３１８５−３１９１；Ｂｅａ
ｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌ
ｅｔｔ．，１９８１，２２，１８５９−１８６２；Ｄａｈｌ，Ｂ．Ｊ．ら、Ａｃｔａ Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ，．１９９０，４４，６３９−６４１；Ｒｅｄｄｙ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９４，２５，４３１１−４３１４；Ｗｉｎｃｏ
ｔｔ，Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９５，２３，２６７７−２
６８４；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｂ．Ｅ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９６７，２３，２３
０１−２３１３；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｂ．Ｅ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９６７，２
３，２３１５−２３３１）。

本発明のＲＮＡアンチセンス化合物（ＲＮＡオリゴヌクレオチド）を本明細書の方法に
よって合成またはＤｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ （Ｌａｆａｙｅｔｔ
ｅ，ＣＯ）から購入することができる。ひとたび合成すると、当技術分野で周知の方法に
よって相補的ＲＮＡアンチセンス化合物のアニーリングが安定的におこなわれ、二本鎖（
二重鎖）のアンチセンス化合物が形成される。例えば、二重鎖は、ＲＮＡオリゴヌクレオ
チド（５０μＭＲＮＡオリゴヌクレオチド溶液）の相補鎖の各々３０μｌと５ｘアニーリ
ング緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２
ｍＭ酢酸マグネシウム）１５μｌとを混ぜ合わせ、その後、９０℃で１分間、続いて３７
℃で１時間の加熱をおこなうことによって、形成される。得られた二重鎖アンチセンス化
合物をキット、アッセイ、スクリーニング、または他の方法で用いて、標的核酸の役割を
調べることができる。

（実施例４０）
（アポリポタンパク質Ｂを標的とする二重鎖アンチセンス化合物の設計およびスクリー
ニング）
本発明に従って、本発明のアンチセンス化合物を含む一連の核酸二重鎖とそれらの相補
体とを、アポリポタンパク質Ｂを標的とするために設計する。二重鎖のアンチセンス鎖の
核酸塩基配列は、本明細書に記載したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を含む。１種
類以上の天然または修飾核酸塩基を付加することで、上記鎖の末端を修飾して突出部分を
形成することができる。つぎに、ｄｓＲＮＡのセンス鎖をアンチセンスの相補体として設
計および合成する。このセンス鎖は、いずれかの末端に対する修飾または付加を含むもの
であってもよい。例えば、一実施形態では、ｄｓＲＮＡ二重鎖の両鎖が、中心にある複数
の核酸塩基にわたって相補的であり、各々が一方の終端または両方の終端で突出部分を持
つことになる。二重鎖のアンチセンスおよびセンス鎖は、約１７ないし２５ヌクレオチド
、または約１９ないし２３ヌクレオチドから構成される。あるいは、アンチセンスおよび
センス鎖は、２０、２１、または２２ヌクレオチドから構成される。

例えば、ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧ配列を有し、かつデオキシチミジン
（ｄＴ）の２塩基突出部分を持つアンチセンス鎖を含む二重鎖は、以下の構造を有するだ
ろう。すなわち、
ｃｇａｇａｇｇｃｇｇａｃｇｇｇａｃｃｇＴＴ アンチセンス鎖
｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜
ＴＴｇｃｔｃｔｃｃｇｃｃｔｇｃｃｃｔｇｇｃ 相補体
。

別の実施形態では、同一配列ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧを持つアンチセ
ンス鎖を含む二重鎖を以下のように調製して平滑末端を持たせてもよい（単一鎖になった
突出部分無し）：
ｃｇａｇａｇｇｃｇｇａｃｇｇｇａｃｃｇ アンチセンス鎖
｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜
ｇｃｔｃｔｃｃｇｃｃｔｇｃｃｃｔｇｇｃ 相補体
。

上記二重鎖のＲＮＡ鎖は、本明細書に開示した方法によって合成することができ、ある
いはＤｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．，（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）
より購入することができる。ひとたび合成すると、相補的鎖のアニーリングが安定的にお
こなわれる。単一鎖を等分し、さらに５０μＭの濃度まで希釈する。ひとたび希釈すると
、鎖の各々３０μｌと５ｘアニーリング緩衝液１５μｌとが混ざり合う。上記緩衝液の最
終濃度は、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、およ
び２ｍＭ酢酸マグネシウムである。最終容量は７５μｌである。この溶液を９０℃で１分
間インキュベートし、つぎに１５分間遠心した。試験管を、ｄｓＲＮＡ二重鎖が実験に用
いられる時点で、３７℃で１時間、静置する。ｄｓＲＮＡ二重鎖の最終濃度は、２０μＭ
である。この溶液を凍結保存（−２０℃）し、最大５回まで凍結融解する。

調製するとすぐに、アポリポタンパク質Ｂ発現を修飾する能力について、二重鎖アンチ
センス化合物の評価をおこなった。

細胞が８０％密集度に達した場合、該細胞を本発明の二重鎖アンチセンス化合物で処理
する。９６穴プレートで増殖する細胞のために、ウエルを２００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ
−１還元血清培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で一回洗浄し、続いてＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（
Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を１２μｇ／ｍｌ含有した１３０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１およ
び最終濃度２００ｎＭで所望の二重鎖アンチセンス化合物による処理を施す。５時間処理
した後に、培地を新鮮な培地に置き換える。処理後１６時間で細胞を集め、その時点でＲ
ＮＡを単離し、かつ標的還元をＲＴ−ＰＣＲで測定した。

（実施例４１）
（アポリポタンパク質Ｂ阻害剤を使用するための表現型アッセイの設計および生体内（
ｉｎ ｖｉｖｏ）試験）
（表現型アッセイ）
アポリポタンパク質Ｂ阻害剤が本明細書に開示された方法によって同定され次第、該化
合物を１種類以上の表現型アッセイでさらに調べ、各々が特定の症状または状態の処理に
有効であることを予示する測定可能な指標を持つ。表現型アッセイ、該アッセイの使用の
ためのキットおよび試薬は、当業者に周知であり、本明細書では健康および疾患状態での
アポリポタンパク質Ｂの役割および／または関連を調べるために用いられる。代表的な表
現型アッセイ（いくつかの製造業者のいずれからでも購入することができる）として、細
胞生存率、細胞毒性、増殖、または細胞の生存を測定するもの（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐ
ｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、酵
素アッセイ等のタンパク質をベースとしたアッセイ（Ｐａｎｖｅｒａ，ＬＬＣ，Ｍａｄｉ
ｓｏｎ，ＷＩ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ；
Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
、細胞制御、シグナル伝達、炎症、酸化的プロセス、およびアポトーシス （Ａｓｓａｙ
Ｄｅｓｉｇｎｓ Ｉｎｃ．，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、トリグリセリドアキュミュ
レーション（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、血管形成アッセ
イ、管形成アッセイ、サイトカインおよびホルモンアッセイ、ならびに代謝アッセイ（Ｃ
ｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ；Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる
。

非限定的な一実施例で、特定の表現型アッセイに適当であると判断された細胞（すなわ
ち、乳癌試験のために選択されたＭＣＦ−７細胞、肥満試験のための脂肪細胞）を、上記
した方法によって決定される最適濃度で、対照化合物と同様に、インビトロ試験で同定さ
れたアポリポタンパク質Ｂ阻害剤によって処理する。処理期間の終わりに、処理細胞およ
び未処理細胞を、表現型の結果および指標を決定する上で特異的な１種類以上の方法によ
って分析する。

表現型の指標として、時間経過または処理用量に応じた細胞形態の変化と、細胞構成成
分（例えば、タンパク質、脂質、核酸、ホルモン、糖類、または金属）の濃度の変化とが
挙げられる。細胞状態（例えば、ｐＨ、細胞周期の段階、細胞による生物指標の取り込み
または分泌）の測定もまた、対象とする指標である。

処理後の細胞の遺伝子型を分析（細胞の１種類以上の遺伝子の発現を測定）することも
、アポリポタンパク質Ｂ阻害剤の有効性または効力の指標として用いられる。ホールマー
ク遺伝子または特異的疾患に関連していると考えられる遺伝子も、処理細胞および未処理
細胞の両方で測定する。

（インビボ研究）
本明細書に記載したインビボ試験の個々の被験体は、温血脊椎動物であり、ヒトも含ま
れる。

臨床試験は、個人が不必要に危険にさらされることなく、また試験でのその個人の役割
について完全に伝えられることを確実にするために、厳密な規制を受ける。

処置を受ける心理的効果を説明するために、ボランティアに対してランダムにプラセボ
またはアポリポタンパク質Ｂ阻害剤を投与する。さらに、医師が偏った処置をおこなうこ
とを防ぐために、投与されている薬物がアポリポタンパク質Ｂ阻害剤であるか、またはプ
ラセボであるかについての情報は医師には伝えられてはいない。この無作為化アプローチ
を用いて、各々のボランティアに新規処置またはプラセボが与えられるチャンスは等しい
。

適応症状または状態に関連した生物学的パラメーターで、ボランティアに対して、アポ
リポタンパク質Ｂ阻害剤またはプラセボを８週間にわたって投与する。ここで、生物学的
パラメーターは、開始時（いっさいの処置に先立つ基線測定）、終了時（最終的な処置の
後）、および試験期間中一定の間隔で測定される。そのような測定として、前処理濃度と
比較したアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子の濃度、体液、組織、もしくは器官
に含まれるアポリポタンパク質Ｂタンパク質濃度が挙げられる。他の測定として、限定さ
れるものではないが、他の測定として、限定されるものではないが、処置している疾患症
状または状態の指標、体重、血圧、疾患または毒性の薬理学的指標である血清力価、なら
びにＡＤＭＳ（吸収、分布、代謝、および排泄 ）測定が挙げられる。

各々の患者に関して記録される情報として、年齢（歳）、性別、身長（ｃｍ）、症状ま
たは状態の家族歴（はい／いいえ）、動機付け評価（小／中／大）、ならびに指標疾患ま
たは状態に対する以前の処置療法の数および種類が挙げられる。

本試験に参加しているボランティアは、健康な成人（年齢１８歳から６５歳まで）であ
り、試験に参加している男性および女性の数はほぼ等しい。特定の特徴を持つボランティ
アを、プラセボおよびアポリポタンパク質Ｂ阻害剤による処置に対して等しく分ける。一
般に、プラセボによる処置を受けたボランティアは、処理に対してほとんど反応しない。
一方、アポリポタンパク質Ｂ阻害剤による処置を受けたボランティアは、本試験の判定で
、疾患症状または状態のインデックスで好ましい傾向を示す。

（実施例４２）
（２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを持つキメラホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチドによるウサギアポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス阻害）
本発明に従って、ウサギアポリポタンパク質Ｂの異なる領域を標的とするために、一連
のオリゴヌクレオチドを設計した。この設計にあたっては、公開された配列を用いた（Ｇ
ｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０７４８０．１（本明細書では配列番号８０８として援用）、Ｇ
ｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１７７８０．１（本明細書では配列番号８０９として援用））、
さらに既に記載したウサギアポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡを表現するプライマー（Ｔａ
ｎａｋａ，Ｊｏｕｒｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，２６８，１２７１３−１２７
１８）を用いて一配列を誘導した（本明細書では配列番号８１０として援用））。オリゴ
ヌクレオチドを表２１に示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標
的配列上の第１の（５’最末端の）ヌクレオチド番号を示す。表２１のすべての化合物が
２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（ギャップマー）であり、１０個の２’
−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域から構成され、該領域の両側（５
’方向および３’方向）に５ヌクレオチドの「ウィング」が隣接している。これらのウィ
ングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオ
シド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチドの全体にわたって、ホスホロチオエート（Ｐ
＝Ｓ）である。全てのシチジン残基は、５−メチルシチジンである。これらの化合物を、
本明細書中の他の実施例で述べられるように、定量的リアルタイムＰＣＲによってウサギ
一次肝細胞でのアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルに対する該化合物の効果について
分析した。ウサギ一次肝細胞を表２１に示す１５０ｎＭの化合物で処理した。ウサギアポ
リポタンパク質Ｂに関して、ＰＣＲプライマーを、
順方向プライマー：ＡＡＧＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＧＴＣＡＣＣ（配列番号８１１）および
逆方向プライマー：ＧＧＧＡＴＧＧＣＡＧＡＧＣＣＡＡＴＧＴＡ（配列番号８１２）
とし、さらにＰＣＲプローブをＦＡＭ−ＴＣＣＴＧＧＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＧＴ
ＧＣＣＴＴＣＡ−ＴＡＭＲＡ（配列番号８１３）とした。ここで、ＦＡＭ（ＰＥ−Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は蛍光レポーター色
素であり、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ，ＣＡ）はクエンチャー色素である。データは、２回の実験から得られた平均値
である。「Ｎ．Ｄ．」が表示されている場合、これは「データ無し」を示す。

（表２１）
（２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを持つキメラホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチドによるウサギアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの阻害）

（実施例４３）
（２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを持つキメラホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチドによるウサギアポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス阻害 − 用量応答
試験）
本発明に従って、実施例４２のアンチセンスオリゴヌクレオチドのサブセットを、用量
応答試験でさらに調べた。処理用量を１０、５０、１５０、および３００ｎＭとした。Ｉ
ＳＩＳ ２３３１６０（配列番号３２４）、ＩＳＩＳ ２３３１６６（配列番号８３０）
、ＩＳＩＳ ２３３１７２（配列番号８３５）、ＩＳＩＳ ２３３１７５（配列番号８３
８）、およびＩＳＩＳ ２３３１８３（配列番号８４６）を、本明細書中の他の実施例で
述べられるように、定量的リアルタイムＰＣＲによってウサギ一次肝細胞でのアポリポタ
ンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルに対する該化合物の効果について分析した。データは、２回
の実験から得られた平均値であり、表２２に示す。

（表２２）
（２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを持つキメラホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチドによるウサギアポリポタンパク質Ｂ発現の阻害）

（実施例４４）
（ＬＤＬｒ−／−マウスでのアポリポタンパク質Ｂのアンチセンス阻害の効果 − 用
量応答）
アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡを修飾できないことから全くアポリポタンパク質Ｂ−
１００のみ合成する株であるＬＤＬ受容体欠損マウス（ＬＤＬｒ（−／−）マウス）は、
著しく上昇したＬＤＬコレステロールおよびアポリポタンパク質Ｂ−１００のレベルが著
しく上昇し、広範囲にわたるアテローム性動脈硬化を呈する。

Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）より購入したＬＤＬｒ（−／−）マウ
スを用い、アンチセンスオリゴヌクレオチドの評価を、アポリポタンパク質Ｂメッセンジ
ャーＲＮＡまたはタンパク質レベルを低下させる該アンチセンスオリゴヌクレオチドの潜
在能力と、アポリポタンパク質Ｂに伴う表現型指標とについて、おこなった。ＬＤＬｒ（
−／−）マウスをオスの群とメスの群とに分けた。ＬＤＬｒ（−／−）マウス に対して
、１０、２５、または５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）また
はＩＳＩＳ １４７７６４と４塩基不一致であるＩＳＩＳ ２７０９０６（配列番号８５
６）、あるいは生理食塩水もしくは２０ｍｇ／ｋｇのアトルバスタチン を、６週間にわ
たり週２回、腹腔内投与した。試験終了時に、動物を犠牲にしていくつかの表現型マーカ
ーについて評価した。

ＩＳＩＳ １４７７６４は、オスおよびメスマウスの両方で、用量依存的な方法で、コ
レステロール、トリグリセリド、およびｍＲＮＡのレベルを低下させることができた。一
方、４塩基不一致ＩＳＩＳ ２７０９０６をこのことをおこなうことができなかった。検
討の結果を表２３にまとめた。

（表２３）
（アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ、肝臓酵素、コレステロール、およびトリグリセリ
ドのレベルに対するオスおよびメスのＬＤＬｒ−／−マウスでのＩＳＩＳ １４７７６４
処理の効果）

（実施例４５）
（カニクイザルでのアポリポタンパク質Ｂのアンチセンス阻害の効果）
アテローム誘発食を与えられたカニクイザルは、ヒトのアテローム性動脈硬化と多くの
類似性があるアテローム性動脈硬化を発症する。メスのカニクイザルは、リポタンパク質
および心血管系でヒトといくつかの類似性を共有する。これらの特徴に加え、類似点が生
殖生物学にある。カニクイザルのメスは、女性の場合と同様に月経周期が２８日である。
血漿ホルモン濃度の測定は、カニクイザルの月経周期全体を通じておこない、卵胞期およ
び黄体期の継続期間、該周期中の血漿エストラジオールおよびプロゲステロン濃度もまた
、女性のものと著しく類似している。

カニクイザル（オスまたはメス）を用いて、アンチセンスオリゴヌクレオチドの評価を
、該アンチセンスオリゴヌクレオチドがアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡまたはタンパク
質のレベルを下げる可能性について、またアポリポタンパク質Ｂに関連した表現型指標（
限定されるものではないが、心血管指標、アテローム性動脈硬化、脂質疾患、肥満、およ
びプラーク形成が挙げられる）についてもおこなった。１回の試験で、通常または高脂質
かつ高コレステロールの餌を与えられた正常および誘発性高コレステロール血症のサルを
含むこともあり得る。カニクイザルに対して、種々の処方計画で投薬することができ、１
〜２ヶ月間にわたってオリゴマー化合物１０〜２０ｍｇ／ｋｇが皮下に投与される。試験
期間中に観察可能なパラメータとして、全血漿コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール
、ＨＤＬ−コレステロール、トリグリセリド、動脈壁コレステロール含有量、および冠状
内膜肥厚を挙げることができるだろう。

（実施例４６）
（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）アポリポタンパク質Ｂの
好ましい標的セグメントの配列決定）
本発明に従って、当技術分野で入手不可能なカニクイザルアポリポタンパク質Ｂの一部
分を増幅した。ヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ
＿０００３８４．１、本明細書では配列番号３として援用）の位置２９２０ないし３４２
０は、ＩＳＩＳ ３０１０１２がハイブリダイズする好ましい標的セグメントを含むこと
から、カニクイサルのアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡの対応セグメントを増幅して、そ
の配列を決定した。ヒトアポリポタンパク質ＢにおいてＩＳＩＳ ３０１０１２にハイブ
リダイズする部位の増幅を、５’側位置２９２０と３’側位置３４２０とにプライマーを
置くことよって、おこなった。カニクイザル肝細胞をＩｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ （Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入した。５００ｂｐフラグメン
トをヒトおよびカニクイザル１°肝細胞ｃＤＮＡを用いて生産し、また精製された全ＲＮ
Ａの逆転写とそれに続く４０ラウンドのＰＣＲ増幅によって生産した。ヒトおよびカニク
イザルの単位複製配列のゲル精製に続いて、各生成物の正方向および逆方向の配列決定反
応をＲｅｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのキットを用いて単鎖ｃＤＮＡを生成し、
Ａｍｐｌｉｔａｑ ＰＣＲ反応のための試薬を提供）によっておこなった。本明細書では
、このカニクイザル配列を配列番号８５５として援用するもので、該カニクイザル配列は
ヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡの位置２９２０ないし３４２０と９６％相同である
。

（実施例４７）
（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ−ＴｇＮ（ＡＰＯＢ１００）標的マウスでのヒトアポリポタ
ンパク質Ｂ遺伝子のアンチセンス阻害の効果（ＩＳＩＳ ２８１６２５および３０１０１
２））
Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ−ＴｇＮ（ＡＰＯＢ１００）トランスジェニックマウスは、導
入（「ノックイン」）されたヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子を有する。該マウスは、高
レベルのヒトアポリポタンパク質Ｂ１００を発現し、ＬＤＬコレステロールの血清レベル
が上昇したマウスを生ずる。これらのマウスは、上昇したＬＤＬコレステロールレベルと
アテローム性動脈硬化のリスクとを減少させる化合物の同定および評価に有用である。高
脂肪コレステロール食餌を与えた場合、これらのマウスは、内皮の下に横たわり、かつ中
膜内にある泡末細胞の著しい蓄積を生じ、対照群の動物よりも著しく複雑なアテローム硬
化型の病変を持つ。

Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ−ＴｇＮ（ＡＰＯＢ１００）マウスを２つの群（一群をオリゴ
ヌクレオチド処理とし、対照群動物を生理食塩水処理とする）に分けた。一晩絶食させた
後、マウスに対して生理食塩水または２５ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ２８１６２５（配列番
号２２４）もしくはＩＳＩＳ ３０１０１２（配列番号２４７）を８週間にわたり週に２
回、腹腔内に投薬した。試験終了時および最終注射の４８時間後に、動物を犠牲にして肝
臓内の標的ｍＲＮＡレベル、コレステロールおよびトリグリセリドレベル、ならびに肝臓
酵素レベルを評価した。加えて、内因性の肝臓内マウスアポリポタンパク質Ｂレベルを測
定して、ヒトアポリポタンパク質Ｂを標的化したそれらのアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドのすべての効果を評価した。

ＩＳＩＳ ２８１６２５またはＩＳＩＳ ３０１０１２で処理するやいなや、ＡＳＴお
よびＡＬＴレベルが上昇したが、正常のレベル（〜３００ＩＵ／Ｌ）を超えるものではな
かった。コレステロールレベルは生理食塩水処理と比べてわずかに増加し、その一方でト
リグリセリドレベルがわずかに減少した。それらのマウスで発現されるヒトアポリポタン
パク質Ｂを標的化したそれらのオリゴヌクレオチドのいずれかによる処理は、ヒトアポリ
ポタンパク質のｍＲＮＡレベルを顕著に減少させる一方で、内因性マウスアポリポタンパ
ク質Ｂのレベルには影響を及ぼさなかった。このことは、それらのオリゴヌクレオチドが
ヒトアポリポタンパク質Ｂに対して特異性を示すことを示している。比較試験の結果を表
２４に示す。

（表２４）
（マウスでのＩＳＩＳ ２８１６２５および３０１０１２処理のアポリポタンパク質Ｂ
ｍＲＮＡ、肝臓酵素、コレステロール、およびトリグリセリドレベルに対する効果）

ＩＳＩＳ ３０１０１２による２週間および４週間の処理の後、ＬＤＬ−コレステロー
ルのレベルがそれぞれ２２ｍｇ／ｄＬおよび１７ｍｇ／ｄＬまで減少した。

肝臓に含まれるアポリポタンパク質Ｂのタンパク質レベルも８週間にわたる処理の終わ
りに評価した。肝臓タンパク質を単離して、ヒトまたはマウスアポリポタンパク質Ｂタン
パク質に特異的な抗体（それぞれ、ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔ
ｔ，ＭＡ およびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａ
ｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いて、免疫ブロット法による分析をおこなった。肝臓タン
パク質試料の免疫ブロット分析は、ヒトアポリポタンパク質Ｂの両形態（アポリポタンパ
ク質Ｂ−１００およびアポリポタンパク質Ｂ‐４８）の発現の減少を明らかにする。マウ
スの肝臓内アポリポタンパク質Ｂレベルは、免疫ブロット分析で判断されるように、著し
くは変化しなかった。

血清試料も、２、４、６、および８週目で採取し、ヒトアポリポタンパク質Ｂ特異的Ｅ
ＬＩＳＡキット（ＡＬｅｒＣＨＥＫ Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＭＥ）を用いて、ヒ
トアポリポタンパク質Ｂ発現について評価した。ＥＬＩＳＡによるヒト血清アポリポタン
パク質Ｂタンパク質の定量によって、ＩＳＩＳ ２８１６２５による処理で、２、４、６
、および８週目でそれぞれ３１、２６、１１、および２６％まで減少したことが明らかに
なった。ＩＳＩＳ ３０１０１２による処理では、生理的食塩水で処理された対照群の動
物と比較して、２、４、６、および８週目でそれぞれ７０、８７、８１、および４１％ま
でヒト血清アポリポタンパク質Ｂタンパク質が減少した。トランスジェニックマウスから
得た血清も、ヒトおよびマウス特異的アポリポタンパク質Ｂ抗体（それぞれＵＳ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＡおよびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いた免疫ブロット分
析にかけた。動物から得た血清試料の免疫ブロット分析は、ヒトアポリポタンパク質Ｂ発
現と類似したパターンを示し、血清アポリポタンパク質Ｂタンパク質が処理２、４、およ
び６週目後に著しく減少し、８週目では僅かに減少した。血清中のマウスアポリポタンパ
ク質Ｂは、免疫ブロット分析によって評価されたように、著しくは変化しなかった。

（実施例４８）
（Ｃ５７ＢＬ／６マウスでのアポリポタンパク質Ｂ（ＩＳＩＳ ２３３１７２、２３３
１７５、２８１６２５、３０１０１２、および３０１０２７）のアンチセンス阻害の効果
）
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（高脂血症によって誘発されたアテローム硬化型プラーク形成に
感受性であると報告された株）を、ヒトまたはウサギのアポリポタンパク質Ｂを標的とす
るいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドのマウスでの毒性を評価する以下の試験に
用いた。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２つの群（一群をオリゴヌクレオチド処理とし、対照群動物を
生理食塩水処理とする）に分けた。一晩絶食させた後、マウスに対して生理食塩水または
２５ｍｇ／ｋｇのいくつかのオリゴヌクレオチドを２週間にわたり週に２回、腹腔内に投
薬した。本試験に用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ ２３３１７２（
配列番号８３５）およびＩＳＩＳ ２３３１７５（配列番号８３８）（両方ともウサギア
ポリポタンパク質Ｂを標的化）と、ＩＳＩＳ ２８１６２５（配列番号２２４）、ＩＳＩ
Ｓ ３０１０１２（配列番号２４７）およびＩＳＩＳ ３０１０２７（配列番号２６２）
（ヒトアポリポタンパク質Ｂを標的化）とである。試験終了時および最終注射の４８時間
後に、動物を犠牲にして、肝臓酵素レベル、体重、肝重量、および脾臓重量を評価した。

３種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドに対して、マウスでの肝臓酵素のレベルが生
理食塩水処理と比較して減少した。しかし、ウサギオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ２３３
１７５とヒトオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ３０１０２７の両方ともこれらの肝臓酵素の
レベルを大幅に増加させたことから、毒性があることが示された。試験したオリゴヌクレ
オチドの全てについて、体重、肝重量、および脾臓重量の変化は軽度であった。比較試験
の結果を表２５に示す。

（表２５）
（マウスアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ、肝臓酵素、コレステロール、トリグリセリ
ドレベルに対するヒトまたはウサギアポリポタンパク質Ｂを標的化したアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドの効果）

（実施例４９）
（２つの異なる用量でのオリゴヌクレオチドの経時的評価）
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（高脂血症によって誘発されたアテローム硬化型プラーク形成に
感受性であると報告された株）を、ヒトアポリポタンパク質Ｂを標的とするいくつかのア
ンチセンスオリゴヌクレオチドのマウスでの毒性を評価する以下の試験に用いた。

メスＣ５７ＢＬ／６マウスを２つの群（一群をオリゴヌクレオチド処理とし、対照群動
物を生理食塩水処理とする）に分けた。一晩絶食させた後、マウスに対して生理食塩水ま
たは２５ｍｇ／ｋｇもしくは５０ｍｇ／ｋｇＩＳＩＳ ２８１６２５（配列番号２２４）
、ＩＳＩＳ ３０１０１２（配列番号２４７）、またはＩＳＩＳ ３０１０２７（配列番
号２６２）を２週間にわたり週に２回、腹腔内に投薬した。２週間後、血液試料をマウス
の尾から採取し、肝臓酵素について評価した。４週間後、試験を終了し、動物を犠牲にし
て肝臓酵素レベルについての評価をおこなった。

ＩＳＩＳ ２８１６２５およびＩＳＩＳ ３０１０１２に関して、２週間後、どの用量
でもＡＳＴおよびＡＬＴレベルが生理食塩水のものに近いままであった。４週間後、ＡＳ
ＴおよびＡＬＴレベルは、低用量に関しては生理食塩水処理の動物を上回る適度な増加を
示したが、高用量では大きく増加した。ＩＳＩＳ ３０１０２７（いずれの用量でも投与
される）は、２週間後にＡＳＴおよびＡＬＴレベルがわずかに増加し、４週間後にＡＳＴ
およびＡＬＴレベルがかなり増加したことが示された。試験の結果を表２６にまとめた。

（表２６）
（２および４週間後のＩＳＩＳ ２８１６２５、３０１０１２、または３０１０２７で
処理したマウスでのＡＳＴおよびＡＴＬレベル）

（実施例５０）
（ｏｂ／ｏｂマウスでのアポリポタンパク質Ｂ（ＩＳＩＳ １４７４８３および１４７
７６４）のアンチセンス阻害の効果）
レプチンは、食欲を調整する脂肪によって生産されるホルモンである。このホルモンが
ヒトおよびヒト以外の動物で欠乏すると肥満なる。ｏｂ／ｏｂマウスは、肥満および高血
糖が生ずるレプチン遺伝子の突然変異を有する。それなりに、これらのマウスは、肥満お
よび糖尿病の試験、さらにはそれらの状態を処理するように設計された処理にとって、有
用なモデルである。

高脂肪高コレステロール食餌（０．１５％コレステロールが補充された６０％ｋｃａｌ
脂肪）を、いくつかのオリゴヌクレオチドの１つと反応させ、ｏｂ／ｏｂマウスでのアポ
リポタンパク質Ｂ関連表現型指標に対する効果を評価した。一晩絶食させた後、各群のマ
ウスに対して５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ １４７４８３（配列番号７９）もしくは１４７
７６４（配列番号１０９）、または対照群ＩＳＩＳ １１６８４７（配列番号８５７）も
しくは１４１９２３（配列番号８５８）、あるいは生理食塩水を、６週間にわたって、週
に２回、腹腔内に投薬した。試験終了時および最終注射の４８時間後に、動物を犠牲にし
て肝臓内の標的ｍＲＮＡレベル、コレステロールおよびトリグリセリドレベル、肝臓酵素
レベル、血清グルコースレベル、ならびにＰＴＥＮレベルを評価した。

ＩＳＩＳ １４７４８３および１４７７６４を両方ともアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮ
Ａレベルのみならず、グルコース、コレステロール、およびトリグリセリドのレベルも下
げることが可能である。比較試験の結果を表２７に示す。

（表２７）
（ｏｂ／ｏｂマウスでのＩＳＩＳ １４７４８３および１４７７６４処理のアポリポタ
ンパク質Ｂ ｍＲＮＡ、コレステロール、脂質、トリグリセリド、肝臓酵素、グルコース
、およびＰＴＥＮレベルの効果）

（実施例５１）
（高脂肪摂食マウスでのアポリポタンパク質Ｂのアンチセンス阻害：時間依存効果）
本発明の別の実施形態では、マウスでのアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルを、肝
臓オリゴヌクレオチド濃度、全コレステロール、ＬＤＬコレステロール、およびＨＤＬコ
レステロールと比較した。高脂肪食餌（６０％）を与えられたオスＣ５７Ｂ１／６マウス
を、６週間にわたって、５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）ま
たは５０ｍｇ／ｋｇの対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ １４１９２３（配列番号８５８
）を腹腔内に週に２回注射することによる処理の効果について評価した。対照動物に対し
て、生理食塩水による処理を施した。２日間の処理後ならびに１、２、４、および６週間
の処理後に、動物を犠牲にした。各時点での各処理群のマウスの数を８匹とした。

肝臓での標的発現の測定は、本明細書の他の実施例に記載したように、リアルタイムＰ
ＣＲによっておこない、該標的発現を生理的食塩水処理マウスと比較したパーセント阻害
として表した。Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ｏｌｙｍｐｕ
ｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いた日常的な臨床分析に
よって、総コレステロールレベル、ＬＤＬコレステロールレベル、およびＨＤＬコレステ
ロールレベルを測定してｍｇ／ｄＬで表した。生理食塩水処理動物で得られた結果を比較
のために示す。肝臓組織内のインタクトなオリゴヌクレオチドの測定は、キャピラリーゲ
ル電気泳動によっておこない、組織１グラムあたりのオリゴヌクレオチドのマイクログラ
ムとして表す。全ての結果は８匹の動物の平均値であり、該結果を表２８に示す。

（表２８）
（ＩＳＩＳ １４７７６４処理中の肝臓薬物濃度と、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ
発現と、血清脂質との相関関係）

これらの結果は、ＩＳＩＳ １４７７６４によるアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡの阻
害が処理２日以内に生じ、引き続く処理で阻害が増大し、６週間の処理まで持続していた
ことを示している。肝臓オリゴヌクレオチドレベルの定量によって、標的阻害の程度と肝
臓薬物濃度とのあいだに強い相互関係があることがあきらかになる。さらに、１、２、３
、および４週間の処理で、標的ｍＲＮＡの阻害とコレステロールレベル（総、ＨＤＬ、お
よびＬＤＬ）とのあいだに、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡのパーセント阻害が大きく
なり始めるとコレステロールレベルが低下するという、逆相関が観察される。血清試料を
、マウスアポリポタンパク質Ｂタンパク質に対する抗体（Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ Ｉｎｓｔ
ｉｔｕｔｅ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いた免疫ブロット分析にかけた。
タンパク質の発現は、血清中のアポリポタンパク質Ｂタンパク質が４８時間以内に著しく
減少し、６週間の処理期間を通して低下することで、ｍＲＮＡのものとｍＲＮＡのもと同
じパターンになる。

この例に記載されているオリゴヌクレオチド処理を繰り返しておこない、ＩＳＩＳ １
４７７６４の効果が処理停止の後で持続する程度を調べた。この例に記載されているオリ
ゴヌクレオチド処理を繰り返しておこない、ＩＳＩＳ １４７７６４の効果が処理停止の
後で持続する程度を調べた。記載したようにマウスを処理し、オリゴヌクレオチド処理を
停止した後、１、２、４、６、および８週目で犠牲にした。同じパラメータを分析し、結
果を表２９に示した。

（表２９）
（投薬停止後の肝臓薬物濃度と、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ発現と、血清脂質と
の相関）

これらのデータは、オリゴヌクレオチド処理終了後、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ
阻害およびコレステロール低下を含むＩＳＩＳ １４７７６４の効果が８週間持続するこ
とを示す。免疫ブロット分析によって、アポリポタンパク質Ｂタンパク質／レベルが、ｍ
ＲＮＡ発現レベルで観察されたパターンに類似のパターンをたどることが示される。

（実施例５２）
（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ−ＴｇＮ（ＡＰＯＢ１００）トランスジェニックマウスでの
３０１０１２によるヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子のアンチセンス阻害の効果：投薬試
験）
Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ−ＴｇＮ（ＡＰＯＢ１００）トランスジェニックマウスは、導
入（「ノックイン」）されたヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子を有する。該マウスは、高
レベルのヒトアポリポタンパク質Ｂ１００を発現し、ＬＤＬコレステロールの血清レベル
が上昇したマウスを生ずる。これらのマウスは、上昇したＬＤＬコレステロールレベルと
アテローム性動脈硬化のリスクとを減少させる化合物の同定および評価に有用である。高
脂肪コレステロール食餌を与えた場合、これらのマウスは、内皮の下に横たわり、かつ中
膜内にある泡末細胞の著しい蓄積を生じ、対照群の動物よりも著しく複雑なアテローム斑
の病変を持つ。

Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ−ＴｇＮ（ＡＰＯＢ１００）マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｇｅｒ
ｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）でのＩＳＩＳ３０１０１２によるヒトアポリポタンパク質Ｂの阻
害に関する長期にわたる試験を、３ヶ月間にわたって実施した。マウスに対して、１０ま
たは２５ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ３０１０１２（配列番号２４７）を週に２回、１２週間
にわたって腹腔内投与した。生理食塩水を注射した動物を対照群とした。各処理群を４匹
の動物からなるものとした。

２週間、４週間、６週間、８週間、および１２週間にわたる処理の後、ヒトアポリポタ
ンパク質Ｂタンパク質を測定することを目的として血清試料を採取した。血清タンパク質
の定量を、ヒトアポリポタンパク質Ｂに特異的なＥＬＩＳＡキット（ＡＬｅｒＣＨＥＫ
Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＭＥ）を用いておこなった。データを表３０に示した。各
々の結果は動物４匹の平均値である。データの正規化は、生理食塩水処理した対照動物に
対しておこなう。

（表３０）
（ＩＳＩＳ ３０１０１２処理後のトランスジェニックマウス血清でのヒトアポリポタ
ンパク質Ｂタンパク質の減少）

これらのデータは、ＩＳＩＳ ３０１０１２による２、４、６、または１２週間の処理
後に、トランスジェニック／マウスから得た血清に含まれるヒトアポリポタンパク質Ｂタ
ンパク質のレベルが約８０％まで低下することを示しており、ｍＲＮＡ発現の阻害に加え
て、ＩＳＩＳ ３０１０１２がヒトアポリポタンパク質Ｂトランス遺伝子を持つマウスで
のヒトアポリポタンパク質Ｂタンパク質発現を効果的に阻害することが示される。血清中
のアポリポタンパク質Ｂタンパク質の評価も、ヒトアポリポタンパク質Ｂタンパク質に対
する抗体（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＡ）を用いた免疫
ブロット分析によっておこなわれる。 この分析によって、ヒトアポリポタンパク質Ｂタ
ンパク質（アポリポタンパク質Ｂ１００およびアポリポタンパク質Ｂ−４８の形態）が処
理の２、４、６、および１２週目で低下することが示される。マウスアポリポタンパク質
Ｂ特異的抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ
ｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いた免疫ブロット分析によって、血清中のマウスタンパク質
の発現に著しい変化がないことが明らかである。

処理が開始された時点（開始）および処理２週目、４週目、６週目、および８週目で、
血清試料を採取し、総コレステロールレベル、ＬＤＬコレステロールレベル、およびＨＤ
Ｌコレステロールレベルを、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ （
Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いた日常的
な臨床分析によって測定し、それらのデータを表３１に示す。結果を血清中のｍｇ／ｄＬ
として表し、動物４匹の平均値として表示する。生理食塩水対照動物の結果も示す。

（表３１）
（ヒトアポリポタンパク質Ｂトランス遺伝子マウスの血清脂質に対するＩＳＩＳ ３０
１０１２の効果）

これらのデータは、最初の４週間の処理中、１０または２５ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ １
４７７６４による処理によって、ＬＤＬコレステロールが減少することを示している。

この試験は、処理の第８週目での最終注射から４８時間後、動物を犠牲にして肝臓の標
的ｍＲＮＡレベル、肝臓のアポリポタンパク質Ｂタンパク質レベル、ならびに血清コレス
テロールおよび肝臓酵素レベルを評価した時に終了した。また、マウスアポリポタンパク
質Ｂ ｍＲＮＡ発現に対するＩＳＩＳ ３０１０１２のいっさいの効果を評価するために
、肝臓での内因性マウスアポリポタンパク質Ｂレベルの発現を測定した。

１２週間にわたって処理した動物の肝臓におけるヒトおよびマウスアポリポタンパク質
Ｂ ｍＲＮＡレベルを、本明細書に記載したようにリアルタイムＰＣＲによって測定した
。各々の結果は、動物４匹から得たデータの平均値である。これらのデータを、生理的食
塩水の対照群に対して正規化して表３２に示す。

（表３２）
（トランスジェニックマウスでのヒトおよびマウスアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレ
ベルに対するＩＳＩＳ ３０１０１２の効果）

これらのデータは、ＩＳＩＳ ３０１０１２による処理を１２週間おこなった後、ヒト
アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡがトランスジェニックマウスの肝臓で７５％ほど減少す
る一方で、マウス肝臓アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡは影響を受けなかったことを示し
ている。さらに、トランスジェニックマウスの肝臓におけるアポリポタンパク質Ｂタンパ
ク質のＥＬＩＳＡ分析は、１０および２０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ３０１０１２による処
理後に、それぞれヒトタンパク質が８０％および８２％減少することを明らかにしている
。ヒトアポリポタンパク質Ｂに対する抗体を用いた免疫ブロット分析もまた、トランスジ
ェニックマウスの肝臓におけるヒトアポリポタンパク質Ｂ（アポリポタンパク質Ｂ−１０
０およびアポリポタンパク質Ｂ−４８の形態）の発現の減少を示している。マウスアポリ
ポタンパク質Ｂタンパク質（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎ
ｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）に対する抗体を用いた免疫ブロット分析では、肝臓
でのマウスタンパク質の発現に有意な変化はない。

血清中のＡＬＴおよびＡＳＴレベルもまた、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｎ
ａｌｙｚｅｒ （Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ
）を用いて測定したところ、ＩＳＩＳ ３０１０１２による処理の後、ＡＳＴおよびＡＬ
Ｔレベルが上昇したが正常のレベル（〜３００ＩＵ／Ｌ）を超えるものではないことが示
された。このことは、ＩＳＩＳ ３０１０１２処理による毒性の欠如を示している。

（実施例５３）
（ＩＳＩＳ ３０１０１２のインビトロ免疫活性化効果の評価）
免疫活性化活性は、炎症誘発性因子への暴露に対するサイトカインの生産によって定義
される。本発明のさらに別の実施形態では、ＩＳＩＳ ３０１０１２を免疫活性化（また
は炎症誘発性）活性について試験した。これらの試験は、ＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒ
ｖｉｃｅｓ （Ｓａｉｎｔ Ｇｅｒｍａｉｎ ｓｕｒ ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，Ｆｒａｎ
ｃｅ）によっておこなわれた。ウイルス、化学、または放射線による処理を故意に受けて
いない野生型Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウスから全血を採取した。培養血液細胞を０．５、５、また
は５０μＭのＩＳＩＳ ３０１０１２に対して、１４ないし１６時間にわたって晒した。
炎症誘発活性を持つことが知られているアンチセンスオリゴヌクレオチドを正の対照群と
して用いた。各々の処理を三回繰り返しておこなった。処理期間が終わる時点で、上清を
採取し、マウス炎症ＣＢＡキット（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉ
ｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）によってフローサイトメトリー法を用いて、サイトカイン分析を
おこなった。結果は、ＩＳＩＳ ３０１０１２は、試験したサイトカイン（インターロイ
キン−１２ｐ７０（ＩＬ−１２ｐ７０）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インタ
ーフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、マクロファージ走化因
子タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、およびインターロイキンー１０（ＩＬ−１０））のい
ずれの放出も刺激しないことを明らかにした。したがって、ＩＳＩＳ ３０１０１２は、
インビトロ免疫活性化アッセイで決定されたように、免疫活性化作用を持たない。

（実施例５４）
（アポリポタンパク質Ｂの比較ゲノム分析）
本発明に従って、ヒト、マウス、およびサルに由来するアポリポタンパク質Ｂ配列の比
較ゲノム分析をおこなったところ、アポリポタンパク質Ｂ配列は種を超えて保存される。
ヒトおよびマウスのアポリポタンパク質Ｂ遺伝子の組織化もまた、高度に保存される。ヒ
トおよびマウス遺伝子は、２９および２６個のエキソンからそれぞれ構成されている。マ
ウスｍＲＮＡは、ヒト配列に対して約８１％相同性である。ヒト以外の霊長類におけるア
ポリポタンパク質Ｂの完全配列および遺伝子構造は同定されていなかった。しかし、実施
例４６に説明したように、ＩＳＩＳ ３０１０１２標的配列を含む５００塩基対フラグメ
ントは、ヒト配列に対して約９６％同一性を示す。

ＩＳＩＳ ３０１０１２の結合部位は、コーディング領域内にあり、ヒトアポリポタン
パク質ＢｍＲＮＡのエキソン２２内である。ヒト、マウス、およびサルのＩＳＩＳ ３０
１０１２結合部位を比較したところ、重要な配列多様性が観察された。５００ヌクレオチ
ド領域にわたるヒトとサルとの全体的な配列保存が約９６％であるが、サル配列のＩＳＩ
Ｓ ３０１０１２結合部位には、ヒト配列と比較してミスマッチが２つ含まれる。同様に
、マウスアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ配列がヒトに対して約８１％相同性であり、Ｉ
ＳＩＳ ３０１０１２結合部位内で、５ヌクレオチドが異なる。ヒト、マウス、およびサ
ルのアポリポタンパク質Ｂ配列に対するＩＳＩＳ ３０１０１２結合部位についての配列
比較を表３３に示す。ＩＳＩＳ ３０１０１２標的配列に関連するミスマッチをしたヌク
レオチドに下線が引かれている。

（表３３）
（ヒト、サル、およびマウスのアポリポタンパク質Ｂ配列のあいだでのＩＳＩＳ ３０
１０１２結合部位の比較）

マウスアンチセンスオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ １４７７６４がハイブリダイズする
標的配列は、マウスアポリポタンパク質Ｂ遺伝子のエキソン２４内にある。マウスおよび
ヒトアポリポタンパク質Ｂ配列でのＩＳＩＳ １４７７６４結合部位についての配列比較
を表３４に示す。ＩＳＩＳ １４７７６４標的配列に関連したミスマッチのヌクレオチド
に下線を付した。

（表３４）
マウスアポリポタンパク質Ｂ配列とヒトアポリポタンパク質Ｂ配列とのあいだのＩＳＩＳ
１４７７６４結合部位の比較

（実施例５５）
（ＩＳＩＳ ３０１０１２のＢＬＡＳＴ分析）
本発明に従って、ＩＳＩＳ ３０１０１２が完全な相補性でハイブリダイズするヒトゲ
ノム内の領域の数を測定した。標的核酸の一領域とのアンチセンス化合物のパーセント相
補性の測定は、当業者に公知のＢＬＡＳＴプログラム（ベーシックローカルアラインメン
トサーチツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄ
ｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９−６５６）を用いておこなった。
この分析は、ゲノムまたはプレｍＲＮＡ領域およびコード配列での配列相補性を評価した
。

ゲノム領域では、ＩＳＩＳ ３０１０１２では、アポリポタンパク質Ｂ遺伝子のみに対
して相補的な完全配列を示す。ＩＳＩＳ ３０１０１２に関連した１つのミスマッチを持
つ標的配列は見つけられていない。ＩＳＩＳ ３０１０１２標的配列とヘパラナーゼ遺伝
子とのあいだに２つのミスマッチが見いだされ、ＩＳＩＳ ３０１０１２標的配列と２８
ユニークゲノム部位とのあいだに３つのミスマッチが見いだされる。

ＲＮＡ配列では、完全な配列相補性がＩＳＩＳ ３０１０１２と、アポリポタンパク質
Ｂ ｍＲＮＡおよび３つの発現配列タグ（ヒトアポリポタンパク質Ｂ前駆体に対する適度
な類似性を持つ）とのあいだに見いだされる。単一のミスマッチがＩＳＩＳ ３０１０１
２と、ミオシン軽鎖のかたちの平滑筋に対して類似した発現配列タグとのあいだに見いだ
される。

（実施例５６）
（ヒト一次肝細胞でのアポリポタンパク質Ｂのアンチセンス阻害：用量応答試験）
本発明によれば、ヒト一次肝細胞における用量応答試験で、ヒトアポリポタンパク質Ｂ
を標的化したアンチセンスオリゴヌクレオチドを試験した。プレ培養ヒト一次肝細胞を、
ＩｎＶｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から購入し
た。細胞の培養は、高１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と１００単位／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬのストレプ
トマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ
）とを添加した高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で、おこなった。

ヒト一次肝細胞を、１０、５０、１５０、または３００ｎＭのＩＳＩＳ ３０１０１２
（配列番号２４７）で処理した。未処理細胞およびクランブル対照オリゴヌクレオチドＩ
ＳＩＳ １１３５２９ （ＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＣＡ、配列番号８５９
）で処理した細胞を２つの対照細胞群とした。ＩＳＩＳ １１３５２９は、２０ヌクレオ
チド長のキメラオリゴヌクレオチド（ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ））であり、１０個の
２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域から構成され、該領域の両側
（５’方向および３’方向）に５ヌクレオチドの「ウィング」が隣接している。これらの
ウィングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌク
レオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチドの全体にわたって、ホスホロチオエート
（Ｐ＝Ｓ）である。全てのシチジン残基は、５−メチルシチジンである。

オリゴヌクレオチドを、本明細書の他の実施例に記載したように、ＬＩＰＯＥＦＥＣＴ
ＩＮ媒介トランスフェクションによって、細胞に導入した。細胞を、オリゴヌクレオチド
による処理後２４および４８時間目に収集し、ＲＮＡおよびタンパク質両方とも単離した
。さらに、アポリポタンパク質Ｂタンパク質分泌のＥＬＩＳＡ分析用に、処理細胞の培養
液を回収した。

アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ発現の測定は、本明細書の他の実施例に記載したよう
に、ＲＮＡ試料のリアルタイムＰＣＲによって、おこなった。各々の結果は、６回の実験
を表す。データを未処理対照細胞に対して正規化し、表３５に示す。

（表３５）
（ヒト一次細胞でのアンチセンスオリゴヌクレオチドによるアポリポタンパク質Ｂ ｍ
ＲＮＡの阻害）

これらのデータは、ＩＳＩＳ ３０１０１２がヒト一次肝細胞で用量依存的にアポリポ
タンパク質Ｂ発現を阻害することを示している。

培養細胞の培地に分泌されたアポリポタンパク質Ｂの測定を、標的タンパク質特異的Ｅ
ＬＩＳＡキット（ＡＬｅｒＣＨＥＫ Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＭＥ）を用いて、５
０および１５０ｎＭのオリゴヌクレオチドで処理した試料でおこなった。各々の結果は、
３回の実験を表す。データを未処理対照細胞に対して正規化し、表３６に示す。

（表３６）
（ＩＳＩＳ３０１０１２によるヒト一次肝細胞からのアポリポタンパク質Ｂタンパク質
分泌の阻害）

２４時間後の５０、１５０、および３００ｎＭ用量から得たタンパク質試料と４８時間
後の１５０および３００ｎＭ用量から得たタンパク質試料とを、本明細書の他の実施例に
記載したように、ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ （Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＡ）から購
入したヒトアポリポタンパク質Ｂタンパク質特異的抗体を用いて、イムノブロット分析に
かけた。イムノブロット分析は、さらに、ＩＳＩＳ ３０１０１２によるアンチセンスオ
リゴヌクレオチド処理後、ヒト肝細胞のアポリポタンパク質Ｂタンパク質が用量依存的に
減少することを示している。

ヒト一次肝細胞のヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡに対するＩＳＩＳ ２７１００
９（配列番号３１９）、ＩＳＩＳ ２８１６２５（配列番号２２４）、およびＩＳＩＳ
３０１０２７（配列番号２６２）の効果を調べるために、追加の実験をおこなった。細胞
を、本明細書に記載したように培養し、５、１０、５０、または１５０ｎＭのＩＳＩＳ
２７１００９、ＩＳＩＳ ２８１６２５、またはＩＳＩＳ ３０１０２７によって、２４
時間処理した。対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ １３６５０ （配列番号８０６）およ
びＩＳＩＳ １１３５２９（配列番号８５９）を、５０または１５０ｎＭで用いた。ヒト
アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ発現の評価を、本明細書の他の実施例で説明したように
、リアルタイムＰＣＲによっておこなった。培養細胞の培地に分泌されたアポリポタンパ
ク質Ｂの測定を、標的タンパク質特異的ＥＬＩＳＡキット（ＡＬｅｒＣＨＥＫ Ｉｎｃ．
，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＭＥ）を用いて、５０および１５０ｎＭのオリゴヌクレオチドで処
理した試料でおこなった。

表３７に示すデータは、２回の実験の平均値を表し、未処理対照細胞に対して正規化し
たものである。存在する場合、「＋」は遺伝子発現が増加したことを示す。

（表３７）
（ＩＳＩＳ ２７１００９、ＩＳＩＳ ２８１６２５、およびＩＳＩＳ ３０１０２７
によるヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡのアンチセンス阻害）

これらのデータは、ＩＳＩＳ ２７１００９、ＩＳＩＳ ２８１６２５、およびＩＳＩ
Ｓ ３０１０２７がヒト一次肝細胞で用量依存的にアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡを阻
害することを示している。ＩＳＩＳ ２７１００９およびＩＳＩＳ ３０１０２７は、細
胞からのアポリポタンパク質Ｂタンパク質の分泌を用量依存的に阻害する。

（実施例５７）
（アポリポタンパク質（ａ）発現に対するアポリポタンパク質Ｂ−１００ アンチセン
スオリゴヌクレオチドの効果）
リポタンパク質（ａ）［Ｌｐ（ａ）］は、ジスフィルド結合した２つの異なるタンパク
質であるアポリポタンパク質（ａ）とアポリポタンパク質Ｂとを含む（Ｒａｉｎｗａｔｅ
ｒ ａｎｄ Ｋａｍｍｅｒｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．，１９９８，２８２，５４−６
１）。本発明に従って、アポリポタンパク質Ｂを標的化したアンチセンスオリゴヌクレオ
チドを、ヒト一次肝細胞に含まれるリポタンパク質（ａ）のアポリポタンパク質（ａ）成
分の発現に対する効果について調べた。

ヒト一次肝細胞（ＩｎＶｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，
ＭＤ）（本明細書に記載したように培養およびトランスフェクションした）を５、１０、
５０、または１５０ｎＭのＩＳＩＳ ２７１００９（配列番号３１９）、２８１６２５（
配列番号２２４）、３０１０１２（配列番号２４７）、または３０１０２７（配列番号２
６２）によって処理した。細胞は、５０または１５０ｎＭの対照オリゴヌクレオチドＩＳ
ＩＳ １１３５２９（配列番号８５９）またはＩＳＩＳ １３６５０（配列番号８０６）
によっても処理した。未処理細胞を対照とした。２４時間のオリゴヌクレオチド処理の後
、アポリポタンパク質（ａ）ｍＲＮＡ発現の測定を、本明細書の他の実施例に記載したよ
うに、定量的リアルタイムＰＣＲによっておこなった。

ヒトアポリポタンパク質（ａ）に対するプローブおよびプライマーを、ヒトアポリポタ
ンパク質（ａ）配列にハイブリダイズするように設計した。この際、公開されている配列
情報を用いた（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５５７７．１、本明細書では配列番号
８６０として援用）。ヒトアポリポタンパク質（ａ）に関して、ＰＣＲプライマーを、
順方向プライマー：ＣＡＧＣＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＴＡＣＧＡＧＧＧＡ（配列番号８
６１）および
逆方向プライマー：ＴＧＣＧＴＣＴＧＡＧＣＡＴＴＧＣＧＴ（配列番号８６２）
とし、ＰＣＲプローブをＦＡＭ−ＣＣＣＧＧＴＧＴＣＡＧＧＴＧＧＧＡＧＴＡＣＴＧＣ−
ＴＡＭＲＡ（配列番号８６３）とした。ここで、ＦＡＭは蛍光色素、またＴＡＭＲＡはク
エンチャー色素である。

データは、３回の実験の平均値であり、未処理対照と比較したパーセント阻害として表
されている。結果を表３８に示す。番号の頭に付けられた「＋」または「−」は、アンチ
センスオリゴヌクレオチドによる処理後、アポリポタンパク質（ａ）発現が増加または減
少したことを、それぞれ示している。

（表３８）
（アポリポタンパク質（ａ）発現に対するアポリポタンパク質Ｂアンチセンスオリゴヌ
クレオチドの効果）

これらの結果は、ＩＳＩＳ ３０１０１２がヒト一次肝細胞でアポリポタンパク質（ａ
）の発現を損害しなかったことを示している。ＩＳＩＳ ２７１００９は、最も高い用量
でアポリポタンパク質（ａ）発現を阻害した。ＩＳＩＳ ２８１６２５およびＩＳＩＳ
３０１０２７は、アポリポタンパク質（ａ）ｍＲＮＡのレベルを減少させた。

（実施例５８）
（アポリポタンパク質Ｂ−１００を標的化したアンチセンスオリゴヌクレオチドによる
リポタンパク質（ａ）粒子分泌の阻害）
本発明に従って、１つのアポリポタンパク質Ｂ分子に共有結合した１つのアポリポタン
パク質（ａ）分子から構成されるリポタンパク質（ａ）粒子の評価をリポタンパク質（ａ
）のアポリポタンパク質Ｂ成分に対して標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに
より処理したヒト一次肝細胞でおこなった。

ヒト一次肝細胞（ＩｎＶｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，
ＭＤ）は、本明細書に記載したように培養およびトランスフェクションしたものであり、
２４時間にわたって５０または１５０ｎＭのＩＳＩＳ ２７１００９（配列番号３１９）
、２８１６２５（配列番号２２４）、３０１０１２（配列番号２４７）、または３０１０
２７（配列番号２６２）によって処理した。細胞は、５０または１５０ｎＭの対照オリゴ
ヌクレオチドＩＳＩＳ １１３５２９（配列番号８５９）またはＩＳＩＳ １３６５０（
配列番号８０６）によっても処理した。未処理細胞を対照とした。２４時間のオリゴヌク
レオチド処理の後、処理細胞から回収した培地に含まれるリポタンパク質（ａ）の量を、
市販のＥＬＩＳＡキット（ＡＬｅｒＣＨＥＫ Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＭＥ）を用
いて測定した。これらの結果は、３回の実験の平均値であり、未処理の対照と比較したリ
ポタンパク質（ａ）分泌のパーセント変化として、表されている。データを表３９に示す
。番号の頭に付けられた「＋」または「−」は、アポリポタンパク質Ｂを標的化している
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理後、リポタンパク質（ａ）粒子の発現が増加
または減少したことを、それぞれ示している。

（表３９）
（アポリポタンパク質Ｂを標的化したアンチセンスオリゴヌクレオチドによるリポタン
パク質（ａ）粒子分泌の阻害）

これらのデータは、リポタンパク質（ａ）粒子の一成分であるアポリポタンパク質Ｂの
アンチセンス阻害が、ヒト一次肝細胞からのリポタンパク質（ａ）の分泌を減少しうるこ
とを示している。また、このようなリポタンパク質（ａ）分泌の減少は、実施例５７に示
すように、アポリポタンパク質（ａ）ｍＲＮＡ発現の減少と必ずしも両立するというわけ
ではない。

（実施例５９）
（ＩＳＩＳ ３０１０１２のミスマッチおよび切断誘導体）
本明細書で示すように、ＩＳＩＳ ３０１０１２（配列番号２４７）は、ヒト一次肝細
胞と同様に培養ヒト細胞系統のアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルを減少させる。本
発明のさらに別の実施形態では、ＩＳＩＳ ３０１０１２のヌクレオチド配列誘導体を用
いて、試験をおこなった。ＩＳＩＳ ３０１０１２配列の中心から開始して１ないし７塩
基がミスマッチしている一連のオリゴヌクレオチドを設計した。この系列は、ＩＳＩＳ
３０１０１２とその標的ｍＲＮＡ配列とのあいだでワトソンクリック塩基対形成の連続的
損失が導入されるように設計された。これらの化合物を表４０に示す。ＩＳＩＳ ３０１
２と比較してミスマッチしたヌクレオチドを持つアンチセンス化合物は、２０ヌクレオチ
ド長のキメラオリゴヌクレオチド（ギャップマー）であり、１０個の２’−デオキシヌク
レオチドからなる中央「ギャップ」領域から構成され、該領域の両側（５’方向および３
’方向）に５ヌクレオチドの「ウィング」が隣接している。これらのウィングは、２’−
メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）
結合は、オリゴヌクレオチドの全体にわたって、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。

ＩＳＩＳ ３０１０１２の付加的な誘導体を設計した。この誘導体は、オリゴヌクレオ
チド全体にわたって２’−ＭＯＥヌクレオチドを有するＩＳＩＳ ３０１０１２を含む（
均一２’−ＭＯＥ）。この化合物は、長さが２０ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチ
ド全体にホスホロチオエート結合を有する。この化合物もまた、表４０に示す。

ＨｅｐＧ２細胞を、表４０の化合物５０または１５０ｎＭで２４時間にわたって処理し
、その後、ＲＮＡを単離し、標的発現を本明細書に記載したようにリアルタイムＰＣＲで
測定した。未処理細胞を対照とした。結果を表４０に示し、未処理の対照試料に対して正
規化する。

（表４０）
（ＨｅｐＧ２細胞でのアポリポタンパク質Ｂ発現に対するＩＳＩＳ ３０１０１２ミス
マッチオリゴヌクレオチドと均一２’−ＭＯＥオリゴヌクレオチドとの効果）

表４０の化合物でＨｅｐＧ２細胞を処理した結果から、親ＩＳＩＳ ３０１０１２配列
による処理の後に、どの化合物も用量依存的阻害を示さないことが明らかである。オリゴ
ヌクレオチドの中心に単一のチミジン−シトシン置換のみを持つＩＳＩＳ ３３２７７０
は、ＩＳＩＳ ３０１０１２よりも３倍効果が弱かった。さらにヌクレオチド置換をおこ
なうことで、アポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス阻害が抑制された。

ホスホロチオエートキメラオリゴヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ的切断によって
優先的にインビボで代謝される。本発明に従って、ＩＳＩＳ ３０１０１２配列を５’お
よび／または３’末端から１または２塩基区切りで切断することで、一連のオリゴヌクレ
オチドを設計した。切断オリゴヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ的切断によって生ず
る予想生成物を表す。これらの化合物を表４１に示す。表４１の化合物は、いろいろな長
さのキメラオリゴヌクレオチド（ギャップマー）であり、２’−デオキシヌクレオチドか
らなる中央「ギャップ」領域から構成され、該領域の両側に２’−メトキシエチル（２’
−ＭＯＥ）ヌクレオチドが隣接している。各キメラオリゴヌクレオチドの正確な構造を「
キメラ構造」として表４１に示す。例えば、４〜１０−４の表示は、最初の４（５’最末
端）および最後の４（３’最末端）ヌクレオチドが２’−ＭＯＥヌクレオチドであり、ギ
ャップにある１０ヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチドである。２’−ＭＯＥヌク
レオチドを太字で示す。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、下線を引いたヌクレオチド間の
ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）である。すなわち、他の全てのヌクレオシド間結合はホスホ
ロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。

これらの化合物を、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡの発現を減少させる能力について
、調べた。ＨｅｐＧ２細胞を、２４時間にわたって表４１の各々のアンチセンス化合物１
０、５０、または１５０ｎＭで処理し、その後、ＲＮＡを単離して、本明細書に記載した
ようにリアルタイムＰＣＲによって標的発現の測定をおこなった。未処理細胞を対照とし
た。結果を表４１に示すとともに、未処理対照試料に対して正規化する。

（表４１）
（ＨｅｐＧ２細胞でのアポリポタンパク質Ｂ発現に対するＩＳＩＳ ３０１０１２の効
果）

表４１の結果は、アポリポタンパク質Ｂの阻害が、配列相補性および用量のみならず配
列長に依存している。しかし、表４１に示すように、 ＩＳＩＳ ３０１０１２の切断型
では、有る程度、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ発現を阻害することができる。

（実施例６０）
（ｄｓＲＮＡ標的ヒトアポリポタンパク質Ｂの設計およびスクリーニング）
本発明によれば、本発明のアンチセンス化合物とその相補体とを含む一連の核酸二本鎖
を、標的アポリポタンパク質Ｂを標的とするために設計し、表４２に示す。表４２にある
全ての化合物は、２０ヌクレオチドのオリゴリボヌクレオチドであり、化合物全体にわた
ってホスホジエステルヌクレオシド間結合（主鎖）を有する。該化合物を、平滑末端を持
つものとして調製した。表４１は、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖であり、該センス鎖をア
ンチセンス鎖の相補体として合成した。これらの配列は、ウラシル（Ｕ）を含むものとし
て表されているが、当業者はウラシル（Ｕ）がＤＮＡ配列のチミン（Ｔ）によって概ね置
き換えられることを容易に理解する。「標的部位」は、化合物が結合する特定の標的配列
上の第１の（５’最末端）ヌクレオチド番号を示している。表４２で複数の化合物からな
るサブセットは、本明細書で記載したＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮＡ等
価物であり、必要に応じて、このことは「ＩＳＩＳ番号のＲＮＡ等価物」欄にあるＤＮＡ
オリゴヌクレオチドのＩＳＩＳ番号によって示される。

（表４２）
（ヒトアポリポタンパク質Ｂを標的とするｄｓＲＮＡ）

表４２のｄｓＲＮＡ化合物を、ＨｅｐＧ２細胞でのヒトアポリポタンパク質ｍＲＮＡに
対する効果について調べた。ＨｅｐＧ２細胞を、５μｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と混合した
１００ｎＭのｄｓＲＮＡによって１６時間にわたって処理した。同一の実験で、ＨｅｐＧ
２細胞に対して、３．７５μｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮと混合した本明細書に記載
の複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド（これらの混合物を表４３に列挙）からなるサ
ブセット１５０ｎＭによる処理も、おこなった。対照オリゴヌクレオチドとして、ＩＳＩ
Ｓ １８０７８（ＧＴＧＣＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＧＡＡＡＴＣ，配列番号８８８）も挙げ
られ、ＩＳＩＳ １８０７８は、２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（ギャ
ップマー）であり、９個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域か
ら構成され、該領域の両側、すなわち５’方向および３’方向に、５ヌクレオチドの「ウ
ィング」および６ヌクレオチドの「ウィング」がそれぞれ隣接している。これらのウィン
グは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシ
ド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチドの全体にわたって、ホスホロチオエート（Ｐ＝
Ｓ）である。全てのシチジンは、５−メチルシチジンである。ＩＳＩＳ ２６３１８８（
ＣＵＵＣＵＧＧＣＡＵＣＣＧＧＵＵＵＡＧＴＴ、配列番号８８９）とその相補体とからな
る二重鎖もまた、対照として用いた。ＩＳＩＳ ２６３１８８は、３’末端上の２ヌクレ
オチドがオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＴＴ）であり、かつ化合物全体にわたってホ
スホジエステルヌクレオシド間結合（主鎖）を有する２１ヌクレオチド長のオリゴリボヌ
クレオチドである。

細胞を４時間処理し、その後、本明細書の実施例に説明されるように、ヒトアポリポタ
ンパク質Ｂ ｍＲＮＡ発現を測定した。結果は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮまたはオリゴヌク
レオチドで処理していない未処理対照細胞に対して正規化した。データは、４回の実験の
平均値であり、該結果を表４３に示す。

（表４３）
（ＨｅｐＧ２細胞でのｄｓＲＮＡによるアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡの阻害）

（実施例６１）
（カニクイザル一次肝細胞でのアポリポタンパク質Ｂのアンチセンス阻害）
実施例４６で示したように、ＩＳＩＳ ３０１０１２がハイブリダイズする標的部位を
含む領域は、カニクイザルアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ配列の対応領域と９６％の同
一性を共有する。ＩＳＩＳ ３０１０１２は、それがハイブリダイズするカニクイザルア
ポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡに関連した２つのミスマッチ配列を含む。本発明の別の実
施形態では、オリゴヌクレオチドの設計は、このサルのアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ
の領域を標的とするためにおこなわれ、本明細書に記載した部分的なカニクイザルアポリ
ポタンパク質Ｂ配列（配列番号８５５）とカニクイザルアポリポタンパク質Ｂ ＲＮＡ配
列の別の部分（配列番号８９０として本明細書に援用）とが用いられる。標的部位は、オ
リゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上にある第１の（５’最末端）ヌクレオチド
番号を示す。ＩＳＩＳ ３２６３５８（ＧＣＣＴＣＡＧＴＣＴＧＣＴＴＴＡＣＡＣＣ、配
列番号８９１）に関しては、標的部位は配列番号８５５のヌクレオチド１６８であり、Ｉ
ＳＩＳ ３１５０８９（ＡＧＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＡＴＡＴＧＣＡＧ、配列番号８９２）
に関しては、標的部位は配列番号８９０のヌクレオチド１９である。ＩＳＩＳ ３２６３
５８およびＩＳＩＳ ３１５０８９は、２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド
（ギャップマー）であり、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ
」領域から構成され、該領域の両側（５’方向および３’方向）に、５ヌクレオチドの「
ウィング」が隣接している。これらのウィングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ
）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチドの
全体にわたって、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全てのシチジンは、５−メチル
シチジンである。ＩＳＩＳ ３２６３５８およびＩＳＩＳ ３１５０８９は、それぞれヒ
トアポリポタンパク質ＢアンチセンスオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ３０１０１２（配列
番号２４７）およびＩＳＩＳ ２８１６２５（配列番号２２４）のカニクイザル等価物で
ある。

ＩＳＩＳ ３０１０１２によるアンチセンス阻害を、ＩＳＩＳ ３０１０１２がハイブ
リダイズするカニクイザルアポリポタンパク質Ｂ配列と完全に一致するＩＳＩＳ ３２６
３５８のものと比較した。化合物の分析を、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ （Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入したカニクイザル一次肝細胞のカニク
イザルアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルに対する該化合物の効果について、おこな
った。プレ培養したカニクイザル一次肝細胞を、ＩｎＶｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ （Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＮＤ）から購入した。細胞の培養は、高１０％ウシ胎仔血
清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と１０
０単位／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とを添加した高グルコースＤＭＥＭ（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で、おこな
った。

カニクイザル一次肝細胞を、１０、５０、１５０、または３００ｎＭのアンチセンスオ
リゴヌクレオチドで４８時間処理した。ＩＳＩＳ １１３５２９（配列番号８５９）を対
照オリゴヌクレオチドとして用いた。未処理細胞もまた、対照とした。カニクイザルアポ
リポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの定量を、ヒトアポリポタンパク質Ｂと、本明細書の
他の実施例に記載したＧＡＰＤＨプライマーおよびプローブとを用いたリアルタイムＰＣ
Ｒによっておこなった。表４４に示す結果は、６回の実験の平均値を示し、未処理対照細
胞に対して正規化されたアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡのパーセント阻害として表され
る。

（表４４）
（ＩＳＩＳ ３０１０１２およびＩＳＩＳ ３２６３５８によるカニクイザルアポリポ
タンパク質Ｂ ｍＲＮＡの阻害）

これらのデータは、ＩＳＩＳ ３２６３５９およびＩＳＩＳ ３０１０１２の両方（カ
ニクイザルアポリポタンパク質Ｂ配列によるミスマッチが２つあるにもかかわらず）が、
カニクイザル一次肝細胞でのアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡの発現を用量および時間依
存的に阻害しうることを示している。

１５０および３００ｎＭのオリゴヌクレオチドで処理したカニクイザル一次肝細胞から
分泌されるアポリポタンパク質Ｂタンパク質の測定は、アポリポタンパク質Ｂタンパク質
特異的キット（ＡＬｅｒＣＨＥＫ Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＭＥ）を用いたＥＬＩ
ＳＡによって、おこなった。各々の結果は、３回の実験の平均値を表す。データを未処理
対照細胞に対して正規化し、表４５に示す。

（表４５）
（アンチセンスオリゴヌクレオチド処理後のカニクイザル肝細胞から分泌されたアポリ
ポタンパク質Ｂの減少）

これらの結果は、ＩＳＩＳ ３０１０１２およびＩＳＩＳ ３２６３５８によるアンチ
センス阻害が培養カニクイザル一次肝細胞からのアポリポタンパク質Ｂの分泌の減少をも
たらすことを示している。

また、アポリポタンパク質Ｂタンパク質発現の評価をさらにおこなうために、オリゴヌ
クレオチド処理カニクイザル一次肝細胞からタンパク質を単離してイムノブロット分析に
かけた。イムノブロッティングを、ヒトアポリポタンパク質Ｂタンパク質 （ＵＳ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＡ）を用いて、本明細書の記載どおりに
おこなった。ＩＳＩＳ ３２６３５８およびＩＳＩＳ ３０１０１２によるアンチセンス
オリゴヌクレオチド処理に続くアポリポタンパク質Ｂ発現のイムノブロット分析によって
、アポリポタンパク質Ｂ発現の実質的な減少が明らかになる。

本発明のさらなる実施形態では、ＩＳＩＳ ２８１６２５によるアンチセンス阻害を、
ＩＳＩＳ ２８１６２５とハイブリダイズするカニクイザルアポリポタンパク質Ｂに完全
一致するＩＳＩＳ ３１５０８９によるアンチセンス阻害と比較した。本明細書に記載し
たように培養したカニクイザル一次肝細胞を、１０、５０、１５０、または３００ｎＭの
ＩＳＩＳ ３１５０８９またはＩＳＩＳ ２８１６２５と２４時間にわたって培養した。
細胞を、１５０または３００ｎＭで対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ １３６５０（配列
番号８０６）あるいは３００ｎＭでＩＳＩＳ １１３５２９（配列番号８５９）で処理し
た。未処理細胞もまた、対照とした。カニクイザル一次肝細胞のカニクイザルアポリポタ
ンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの定量を、本明細書の他の実施例に記載したように、ヒトプ
ライマーおよびプローブによるリアルタイムＰＣＲを用いて、おこなった。表４６に示す
結果は、３回の実験の平均値であり、未処理対照細胞に対して正規化されたアポリポタン
パク質Ｂ ｍＲＮＡのパーセント阻害として表される。存在する場合、存在する場合、「
＋」はｍＲＮＡ発現が増加したことを示す。

（表４６）
（カニクイザル一次肝細胞でのアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ発現のアンチセンス阻
害）

これらのデータは、ＩＳＩＳ ３１５０８９およびＩＳＩＳ ２８１６２５が、用量依
存的に、カニクイザル一次肝細胞でのアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡの発現を阻害しう
ることを示している。

５０および１５０ｎＭのＩＳＩＳ ３１５０８９およびＩＳＩＳ ２８１６２５で処理
したカニクイザル一次肝細胞から分泌されたアポリポタンパク質Ｂタンパク質の測定は、
アポリポタンパク質Ｂタンパク質特異的キット（ＡＬｅｒＣＨＥＫ Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔ
ｌａｎｄ，ＭＥ）を用いたＥＬＩＳＡによって、おこなった。各々の結果は、３回の実験
の平均値を示す。データを未処理対照細胞に対して正規化して表４７に示す。

（表４７）
（アンチセンスオリゴヌクレオチド処理に続いてカニクイザル肝細胞から分泌されたア
ポリポタンパク質Ｂタンパク質の減少）

これらの結果は、１５０ｎＭのＩＳＩＳ ３１５０８９によるアンチセンス阻害が培養
カニクイザル一次肝細胞からのアポリポタンパク質Ｂタンパク質分泌の減少をもたらすこ
とを示している。

ＩＳＩＳ ２７１００９（配列番号３１９）およびＩＳＩＳ ３０１０２７（配列番号
２６２）に対しても、カニクイザル一次肝細胞でのアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡおよ
びタンパク質発現に対する効果ついて試験した。本明細書に記載したように培養した細胞
を、１０、５０、および１５０ｎＭのＩＳＩＳ ２７１００９またはＩＳＩＳ ３０１０
２７で２４時間にわたり処理した。細胞を１５０ｎＭの対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ
１１３５２９（配列番号８５９）で処理した。未処理細胞も対照とした。カニクイザル
一次肝細胞のカニクイザルアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの定量を、本明細書の
他の実施例によって説明されたように、ヒトプライマーおよびプローブによるリアルタイ
ムＰＣＲを用いておこなった。表４８に示す結果は、２回の実験の平均値であり、未処理
対照細胞に対して正規化されたアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡのパーセント阻害として
表される。

（表４８）
（カニクイザル肝細胞でのアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ発現のアンチセンス阻害）

これらのデータは、ＩＳＩＳ ２７１００９およびＩＳＩＳ ３０１０２７の両方がカ
ニクイザル一次肝細胞でのアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡの発現を用量依存的に阻害し
うることを示している。

５０および１５０ｎＭのＩＳＩＳ ２７１００９およびＩＳＩＳ ３０１０２７によっ
て処理されたカニクイザル一次肝細胞から分泌されたアポリポタンパク質Ｂタンパク質の
測定は、アポリポタンパク質Ｂタンパク質特異的キット（ＡＬｅｒＣＨＥＫ Ｉｎｃ．，
Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＭＥ）を用いたＥＬＩＳＡ分析によっておこなった。各々の結果は、
３回の実験の平均値を示す。データを、分泌されたタンパク質のパーセント減少として表
すとともに、未処理対照細胞に対して正規化し、表４９に示す。存在する場合、「＋」は
タンパク質分泌が増加したことを示す。

（表４９）
（アンチセンスオリゴヌクレオチド処理に続くカニクイザル肝細胞から分泌されたアポ
リポタンパク質Ｂタンパク質の減少）

これらの結果は、ＩＳＩＳ ３１５０８９およびＩＳＩＳ ２８１６２５によるアンチ
センス阻害が、培養カニクイザル一次肝細胞からのアポリポタンパク質Ｂタンパク質の分
泌の減少をもたらすことを示している。

（実施例６２）
（肝脂肪症を評価する方法）
肝脂肪症は、肝臓への脂肪の蓄積または「脂肪肝」のことをいい、しばしばアルコール
消費、糖尿病、および高脂血症に起因する脂質をいう。アポリポタンパク質Ｂを標的とす
るアンチセンスオリゴヌクレオチドによって処置された動物の肝臓を、脂肪症の存在につ
いて評価した。脂肪症は、肝臓組織の組織学分析と肝臓トリグリセリドレベルの測定とに
よって評価される。

肝臓から切除した組織を直ちにＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ ＯＣＴ埋封材料（Ｔｅｄ Ｐｅ
ｌｌａ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）に浸し、２−メチルーブタンドライアイスで
凍らせる。組織切片を厚さ４〜５μｍに切断し、５％中性緩衝ホルマリンで固定する。組
織切片を、核および細胞質をそれぞれ視覚化するために標準的な組織化学的手順の後にヘ
マトキシリン−エオシン染色し、さらに脂質を視覚化するために、製造元の指示書（Ｎｅ
ｗｃｏｍｅｒｓ Ｓｕｐｐｌｙ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）に従って、オイルレッドＯ
で染色する。

あるいは、組織を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、厚さ４〜
５μｍに切断し、脱パラフィン化をおこない、さらにヘマトキシリン−エオシン染色をお
こなうもので、すべてが標準的な組織化学的手順にもとづいている。

肝臓トリグリセリド含有量の定量は、脂肪症を評価するのにも用いられる。組織トリグ
リセリドレベルの測定は、Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ＧＰＯ Ａｓｓａｙ （Ｓｉｇｍ
ａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いておこなわれる。

（実施例６３）
（痩せたマウスでのＩＳＩＳ ３０１０１２によるアンチセンス阻害の効果：長期試験
）
本発明によれば、ＩＳＩＳ ３０１０１２（配列番号２４７）の毒性をマウスで長期間
（３ヶ月間）にわたって調べる。３ヶ月齢の雄および雌ＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ
Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）に２、５、１
２．５、２５、または５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ３０１０１２を５週間にわたって週２
回、さらにその後４日毎に投与する。マウスを標準的な齧歯目の食餌で飼育する。生理食
塩水および対照オリゴヌクレオチド動物を対照とし、同一のスケジュールで注射をおこな
った。各処理群は、各々の性のマウスを６ないし１０匹含み、また各処理群を複製し、一
方の群では１ヶ月で試験を終了させ、他方の群では３ヶ月で試験を終了させた。１または
３ヶ月の処理期間後、マウスを犠牲にして、肝臓内での標的発現、血清中の脂質レベル、
および毒性の指標について、評価をおこなった。肝臓試料を生産し、ＲＮＡを単離してア
ポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ発現を、本明細書の他の実施例で記載されたように、リア
ル／タイムＰＣＲで測定する。血清脂質（総コレステロール、ＬＤＬコレステロール、Ｈ
ＤＬコレステロール、およびトリグリセリドを含む）は、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｌｉｎｉｃ
ａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌ
ｌｅ，ＮＹ）を用いて、日常的な臨床分析によって、評価される。ＬＤＬコレステロール
とＨＤＬコレステロールとの比、ならびに総コレステロールとＨＤＬコレステロールとの
比も計算する。血清ＡＬＴおよびＡＳＴ、組織の炎症性浸潤および組織中の好塩基顆粒は
、上記処理に関連した毒性の評価をもたらす。肝脂肪症または肝臓への脂質の蓄積は、オ
イルレッドＯ染色による日常的な組織学的分析およびＴｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ＧＰＯ
Ａｓｓａｙ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いる肝臓組
織トリグリセリドの測定によって評価される。

毒性試験は、オリゴヌクレオチド処理の停止後に回復することが可能となる動物の群も
含む。しかし、雄および雌のＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を、第１週目は１週あたり２回、それ以
降は４日毎に、５、１０、５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ３０１０１２で処置する。生理食
塩水および対照オリゴヌクレオチドを注射された動物を対照として用いる。各々の処理群
は、１つの性あたり６匹の動物を含む。３ヶ月の処理をおこなった後、動物はさらに３ヶ
月間のあいだ未処理のままであり、その後に犠牲になる。３ヶ月の処理後に直ちに犠牲に
なったマウスの場合、同一パラメータで評価する。

１ヶ月の処理後、リアル／タイムＰＣＲ定量化によって、肝臓内のマウスアポリポタン
パク質Ｂ ｍＲＮＡレベルが５３％減少する。さらに、予想される用量応答毒性を観察し
た。日常的な臨床手順によってＯｌｙｍｐｕｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ
（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）上で測定され
るＡＬＴおよびＡＳＴレベルは、２５または５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ３０１０１２で
処理したマウスで増加する。日常的な組織学的手順による分析のために、組織を調製した
。肝臓および腎臓組織中の好塩基顆粒は、１２．５ｍｇ／ｋｇを超えるＩＳＩＳ ３０１
０１２の用量で観察された。穏やかなリンパ組織球性浸潤が、ＩＳＩＳ ３０１０２が１
２．５ｍｇ／ｋｇを上回る用量で、種々の組織で観察される。オイルレッドＯによる組織
切片の染色は、オリゴヌクレオチド処理のあとに脂肪症がみられないことを明らかにして
いる。

（実施例６４）
（痩せたカニクイザルでのＩＳＩＳ ３０１０１２によるアンチセンス阻害の効果：長
期試験）
実施例４５で議論したように、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡまたはタンパク質レベ
ルを低下させるそれらの可能性に関連して、カニクイザル（雄または雌）を用いてアンチ
センスオリゴヌクレオチド、同様にアポリポタンパク質Ｂに関連した表現型の指標を評価
するために用いられ、該指標として心血管指標、アテローム性動脈硬化、脂質疾患、肥満
、およびク形成が挙げられる。したがって、本発明の別の実施形態では、ＩＳＩＳ ３０
１０１２（配列番号２４７）に対するその効果について、およびカニクイザルの血清脂質
について、調べられる。そのような長期試験もまた、アンチセンス化合物の毒性評価に用
いられる。

雄および雌のカニクイザルの処置は、第１週目は２日毎、その後４日毎の頻度で、１ヶ
月および３ヶ月の処理期間にわたって、２、４、または１２ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ３０
１０１２を静脈内あるいは２または２０ｍｇ／ｋｇを皮下投与することでおこなわれる。
生理食塩水処理動物を対照とする。各処理群として、各性の動物を２ないし３匹含む。

１ヶ月の間隔で、また３ヶ月の試験終了で、動物を犠牲にして、肝臓における標的発現
、血清中の血清濃度、および毒性の指標として評価する。肝臓試料を獲得し、ＲＮＡを単
離し、アポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡ発現を他の実施例に記載したとおりに、リアルタ
イムＰＣＲによって測定する。血清脂質（総コレステロール、ＬＤＨコレステロール、Ｈ
ＤＬコレステロール、およびトリグリセリドを含む）は、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｌｉｎｉｃ
ａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌ
ｌｅ，ＮＹ）を用いた日常的な臨床分析によって、評価される。ＨＤＬコレステロールに
対するＬＤＨコレステロールの比とＨＤＬコレステロールに対する総コレステロールの比
も算出される。血清ＡＬＴおよびＡＳＴの血清の分析は、組織の炎症性浸潤および組織の
好塩基顆粒が上記処理に関連した毒性の評価を提供してくれる。肝脂肪症または肝臓への
脂肪蓄積は、オイルレッドＯ染色による日常的な組織学分析とＴｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ
ＧＰＯ Ａｓｓａｙ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用い
た肝臓組織トリグリセリドの測定とによって評価される。

１つの性あたり動物２匹からなる追加の処理群に対して、生理食塩水（０ｍｇ／ｋｇ）
、１２または２０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ３０１０１２によって、第１週目は２日毎、そ
の後４日毎の頻度で、３ヶ月の期間にわたって、処理をおこなう。処理期間の後、動物は
さらに３ヶ月間にわたって何ら処理されていないことを確認する。これらの処理群は、処
理終了後３ヶ月、アポリポタンパク質Ｂの効果を試験する目的のためである。３ヶ月の回
復期間の終わりに、１および３ヶ月の処理後直ちに動物を犠牲にしたのと同じパラメータ
で評価される。

１ヶ月間隔の長期処理からの結果は、表５０に示しており、またｍＲＮＡに関して生理
食塩水処理動物に対して、さらに脂質レベルに関して未処理の基線値に対して、正規化さ
れる。総コレステロール、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬ粒子濃
度、および血清中のトリグリセリドレベルを、Ｌｉｐｏｓｃｉｅｎｃｅ （Ｒａｌｅｉｇ
ｈ，ＮＣ））による核磁気共鳴分光法によって、測定した。さらに、肝臓に含まれるイン
タクトなオリゴヌクレオチドの濃度をキャピラリーゲル電気泳動によって測定し、肝臓組
織１グラムあたりのオリゴヌクレオチドのマイクログラムとして表す。各結果は、動物４
匹（雄２匹および雌２匹）からのデータの平均値を表す。

（表５０）
（痩せたカニクイザルでのＩＳＩＳ ３０１０１２によるアンチセンス阻害の効果）

これらのデータは、霊長類の種でＩＳＩＳ ３０１０１２が用量依存的なアポリポタン
パク質Ｂ発現を阻害し、より高い用量のＩＳＩＳ ３０１０１２で同時に脂質レベルを低
下させることを示す。さらに、これらの結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが用量
依存的に肝臓に蓄積していくことを示している。

肝脂肪症または肝臓での脂質の蓄積は、示した用量による処理の４週間後に、観察され
なかった。期待される用量関連毒性は、１２および２０ｍｇ／ｋｇのより高い用量で観察
され、最初の４時間のあいだの活性部分的トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の一時的
な１．２ないし１．３倍の増加、ならびに肝臓および腎臓内の好塩基顆粒の増加を含む（
組織試料の日常的な組織学的検査によって評価される）。腎臓では何ら機能的変化が観察
されなかった。

類似の実験では、雄および雌のカニクイザルに対して、第１週目は２日毎に、その後は
４日毎に、４ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ３０１０１２の静脈内用量が投与される。第１の用
量および第４の用量の後に、同様に第４および最終の用量の後の１１、１５、および２３
日間後に、動物群が犠牲になる。肝臓ＲＮＡを単離し、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ
レベルを、本明細書に記載したようにリアルタイムＰＣＲによって評価した。この実験の
結果は、４ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ３０１０１２の単一静脈内用量後、アポリポタンパク
質Ｂ ｍＲＮＡ発現での４０％減少を示している。さらに、４ｍｇ／ｋｇでＩＳＩＳ ３
０１０１２を４回投与した後に、標的ｍＲＮＡが約８５％に減少し、さらに標的ｍＲＮＡ
の５０％減少は、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理の終了後、１６日間まで持続した
。

（実施例６５）
（マイクロアレイ：高脂肪食餌マウスに対する痩せたマウスにおける遺伝子発現パター
ン）
雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを次の群に分割した。この群は、（１）生理食塩水を注射した
貧弱な食餌を与えられたマウス（痩せ対照）；（２）高脂肪食餌を与えられたマウス；（
３）５０ｍｇ／ｋｇの対照オリゴヌクレオチド１４１９２３（配列番号８５８）を注射し
た高脂肪食餌を与えられたマウス；（４）２０ｍｇ／ｋｇのアトバスタチンカルシウム（
Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）を投与された高脂肪食餌を与え
られたマウス；（５）１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ
１４７７６４（配列番号１０９）を注射された高脂肪食餌を与えられたマウスで構成さ
れ、各マウスは５体から構成されている。生理食塩水およびオリゴヌクレオチド処理では
、６週間、週に２回、腹腔内に投与した。アトバスタチンを、６週間、毎日、投与した。
試験終了時では、肝臓試料を各動物から分離し、ＲＮＡを定性的ノーザンブロット評価法
、デオキシＲＮＡマイクロアレイおよび定量的リアルタイムＰＣＲで分離した。ノーザン
ブロット評価法および定量的リアルタイムＰＣＲを、この明細書に記載された他の実施例
によって記述されているように実行した。

ＤＮＡマイクロアレイ分析では、ハイブリダイゼーション試料を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉ
ｘ Ｅｚｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ
（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）に従って、各マウ
ス肝臓から分離された１０μｇの全ＲＮＡから調製した。試料を、約２２，０００個の遺
伝子を含むマウス遺伝子断片にハイブリダイズし、次に、製造者のプロトコルによって規
定されたように、Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，
Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて、洗浄しかつ二重染色した。染色し
た遺伝子断片を、ＧｅｎｅＡｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎ
ｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｅ，ＣＡ）によりプローブ細胞強度で走査した。各プローブ
の設定についての信号値を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ
ｖ５．０ソフトウエア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，
ＣＡ）を用いて算出した。各条件を、試料ごとに１つの断片を用い、群ごとに５個の生物
学的試料から分布測定した。発現における倍（ｆｏｌｄ）変化を、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ
Ｓｕｉｔｅ ｖ５．０によって生成されるような信号値の幾何学的平均値を用いて計算
した。一方向（ｏｎｅ−ｗａｙ）Ａｎｏｖａを利用した統計的分析の後に、９回のペアワ
イズ比較を行った。全ての群を高脂肪群と比較し、ＩＳＩＳ １４７７６４処理から得ら
れる遺伝子発現変化を確認した。マイクロアレイデータを、階層的クラスタ分析を用いて
解釈し、全遺伝子発現パターンを視覚化した。

マイクロアレイの結果は、ＩＳＩＳ １４７７６４処理が高脂肪食餌マウスにおける遺
伝子発現プロファイルを痩せマウスにおいて観察されたプロファイルに伝達することを示
している。リアルタイムＰＣＲ分析では、脂質代謝に含まれる次の遺伝子：肝性リパーゼ
、脂肪酸合成アデノシン３リン酸結合カセット、サブファミリーＤ（ＡＬＤ）メンバー２
、腸管脂肪酸結合タンパク質２、ステアロールコエンザイムＡデサチュラーゼ１およびヒ
ドロキシメチルグルタリル−コエンザイムＡ還元酵素に関するｍＲＮＡの発現の緩和を確
認した。

この明細書に記述されているように測定されたマウスアポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡ
および血清コレステロールレベルを評価して、ＩＳＩＳ １４７７６４およびＩＳＩＳ
１４７４８３によるアンチセンス阻害を確認した。ｍＲＮＡおよびコレステロールの双方
のレベルを、この明細書の他の実施例に示されているように、用量依存法によるＩＳＩＳ
１４７７６４またはＩＳＩＳ １４７４８３処理で、低下させた。ＩＳＩＳ １４７４
８３の用量５０ｍｇ／ｋｇはＡＬＴおよびＡＳＴのレベルを上昇させた。ＩＳＩＳ １４
７７６４の用量１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇと、ＩＳＩＳ １
４７４８３の用量１０ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇは、ＡＬＴおよびＡＳＴのレベル
を有意に上昇させなかった。

（実施例６６）
（アポリポタンパク質Ｂアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された動物における肝
性脂肪症の評価）
アポリポタンパク質Ｂを標的にしたアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された動物
の肝臓を脂肪症の存在で評価した。脂肪症は、肝組織の組織学的分析および肝臓トリグリ
セリドレベルの測定によって評価される。

（６週間、ＩＳＩＳ １４７７６４で処理された高脂肪食餌マウスにおける脂肪症の評
価）
ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）および実施例２１で記述された対照処理動
物からの肝組織を、その後に６週間処理を行う試験終了時において脂肪症で評価した。組
織切片をオイルレッドＯおよびヘマトキシリンで染色して、脂質および核をそれぞれ視覚
化した。また、組織切片をヘマトキシリン−エオシンで染色して、核および原形質をそれ
ぞれ視覚化した。いずれかの方法で染色した組織切片の組織学的分析は、生理食塩水で処
理された動物とＩＳＩＳ １４７７６４で処理された動物とでは脂肪症において差異がな
いことを示し、ＩＳＩＳ １４７７６４で６週間処理した切片が肝臓中への脂質の蓄積に
至らないことを示している。

（高脂肪食餌動物においてアポリポタンパク質Ｂで長期間、処理された脂肪症の評価）
雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、６週間、１２週間および２０週間、週に２回、２５ｍｇ／
ｋｇのＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）または２５ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ １
４１９２３（配列番号８５８）の腹腔内注射で処理した。生理食塩水で処理した動物を対
照として役立てた。各処理群には４匹の動物を含めた。動物を６週間、１２週間および２
０週間後に殺処理し、組織学的分析および組織トリグリセリド含有量の測定のために調達
した。その結果は、ＩＳＩＳ １４７７６４で処理した動物を生理食塩水で処理した動物
に比較したときに肝組織中のトリグリセリド含有量に有意な差異を示さない。さらに、肝
組織の切片の組織学的分析は、高脂肪食餌を受けた生理食塩水による対照動物に比べて、
ＩＳＩＳ １４７７６４で処理された高脂肪食餌マウスの脂肪症が１２週および２０週で
緩和されている。

（痩せマウスにおける脂肪症の評価）
肝組織中への脂質の蓄積を痩せマウスに対しても評価した。生後６週から７週までの雄
Ｃ６７Ｂｌ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｗ
ｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ））を標準齧歯目用食餌で維持し、６週間、週に２回、２５ｍ
ｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）またはＩＳ
ＩＳ １４７４８３（配列番号７９）の腹腔内注射で処理した。生理食塩水で処理した動
物を対照として役立てた。各処理群を４匹の動物で構成した。動物を６週間後に、肝組織
および血清を採取して殺処理した。

アポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡレベルを、この明細書の他の実施例によって記述され
ているように、リアルタイムＰＣＲによって測定した。表５１に示されたデータは、４匹
の動物の平均を示し、生理食塩水で処理した対照を基準とした阻害として示されている。
結果は、用量依存法で、痩せマウスにおけるＩＳＩＳ １４７４８３およびＩＳＩＳ １
４７７６４が共にアポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡの発現を阻害することを示している。

（表５１）
（痩せマウスにおけるアポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡのアンチセンス阻害）

血清中における総コレステロール、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールおよ
びトリグリセリドを、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ｏｌｙ
ｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いた日常的な臨床
分析によって測定した。また、血清中の肝臓酵素ＡＬＴおよびＡＳＴをも、Ｏｌｙｍｐｕ
ｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定した。これらの結果は、ＩＳＩＳ
１４７７６４が生理食塩水で処理した対照に対して血清脂質を下げることを示している
。ＡＬＴおよびＡＳＴのレベルは、マウスの通常範囲（３００ＩＵ／Ｌ）を超えず、処理
に関連した毒性の欠如を示している。結果は、４匹の動物からのデータの平均値であり、
図５２に示されている。

（表５２）
（ＩＳＩＳ １４７７６４およびＩＳＩＳ １４７４８３で処理した痩せマウスにおけ
る血清脂質および肝臓酵素のレベル）

肝臓組織を組織学的ルーチン法によって調製し、この明細書に記述されているように、
脂肪症を評価した。オイルレッドＯまたはヘマトキシリン−エオシンで染色した組織試料
の実験は、アポリポタンパク質Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる痩せマウスへ
の処理が脂肪症にならないことを示している。

（アポリポタンパク質Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した痩せマウスにお
ける脂肪症をさらに評価するための６月間の研究）
アポリポタンパク質Ｂを標的にしたアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理されたマウ
スの長期間治療は、アンチセンス化合物での延長処理の毒性学的および薬理学的な効果を
評価するのに使用される。月齢２ヶ月の雌雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、２ｍｇ／ｋｇ、５
ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇのアポリポタンパク質Ｂのアンチセン
スオリゴヌクレオチドで処理する。処理は、第１週において２日ごとに、その後において
は４日ごとに腹腔内に投与される。生理食塩水だけ、あるいは対照オリゴヌクレオチドで
処理したマウスを対照群として役立てた。各処理群には２５から３０匹のマウスを含めて
いる。６月間の処理後に、各処理群のマウスの一部を犠牲にする。残りのマウスには、処
理しない３月間の回復期間を与え、その後に犠牲にする。肝臓におけるアポリポタンパク
質ＢのｍＲＮＡの発現を、この明細書の他の方法によって記述されているように、リアル
タイムＰＣＲによって測定する。肝組織は、Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ＧＰＯ Ａｓｓ
ａｙ （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いたトリグリセリ
ド含有量の測定用にも調製される。血清を採取しかつ、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ
，ＮＹ）を用いて、総コレステロール、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールお
よびトリグリセリドを含む脂質の含有量を評価する。また、血清中の肝臓酵素ＡＬＴおよ
びＡＳＴをも、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定する
。血清試料を、アポリポタンパク質Ｂ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）に対する抗体を用いて、免疫ブロット分
析にかける。肝臓、腎臓および他の組織は組織学的分析用のルーチン処置によって調製さ
れる。組織は、好塩基顆粒および炎症性浸潤の存在を評価する。脂肪症は、肝組織切片の
オイルレッドＯ染色剤によって評価される。

（実施例６７）
（アテローム硬化型プラーク形成に対するマウスモデル：ＬＤＬ受容体遺伝子を持たな
いヒトアポリポタンパク質Ｂトランスジェニックマウス）
ＬＤＬ受容体は、アポリポタンパク質Ｂ含有ＬＤＬ粒子の除去を担っている。ＬＤＬ受
容体を持たないと、動物は、アポリポタンパク質Ｂ含有ＬＤＬ粒子をプラズマから効果的
に除去することができない。したがって、アポリポタンパク質ＢおよびＬＤＬコレステロ
ールの血清レベルは著しく上昇する。ヒトアポリポタンパク質Ｂトランスジーンを発現す
るマウス（ＴｇＮ−ｈＡｐｏＢ＋／＋）およびＬＤＬ受容体欠損マウス（ＬＤＬｒ−／−
）両方をアテローム硬化型プラーク発生の動物モデルとして用いる。ＬＤＬ受容体欠損遺
伝子型をヒトアポリポタンパク質Ｂトランスジェニック遺伝子型と組み合わせる（ＴｇＮ
−ｈＡｐｏＢ＋／＋；ＬＤＬｒ−／−）場合、アテローム硬化型プラークは急速に発生す
る。本発明にしたがって、このような遺伝的バックグラウンドであるマウスを用いて、ア
テローム性動脈硬化およびプラーク形成を防ぐ化合物の能力を調べる。

オスＴｇＮ−ｈＡｐｏＢ＋／＋；ＬＤＬｒ−／−マウスに対して、１２週間にわたって
週２回、ヒトアポリポタンパク質Ｂアンチセンスオリゴヌクレオチド１０または２０ｍｇ
／ｋｇによる処理を施す。対照群に対しては、生理食塩水または対照オリゴヌクレオチド
による処理を施す。血清総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロー
ル、およびトリグリセリドを、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（
Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いた日常的
な臨床分析によって２、４、６、８、および１２週目に測定する。血清ヒトアポリポタン
パク質Ｂタンパク質を、ＥＬＩＳＡキット（ＡＬｅｒＣＨＥＫ Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａ
ｎｄ，ＭＥ）を用いて２、４、６、８、および１２週目に測定する。肝臓内のヒトおよび
マウスアポリポタンパク質ｍＲＮＡを１２週目に測定する。１２週間の試験の結果は、二
重トランスジェニックモデルでのＩＳＩＳ３０１０１２の薬理学的挙動を評価するのに役
立つ。

さらに、ＴｇＮ−ｈＡｐｏＢ＋／＋；ＬＤＬｒ−／−マウスに対して、１２週間の試験
で用いた処理条件による４ヶ月間の試験をおこなう。マウスに対して、ヒトアポリポタン
パク質Ｂを標的化したアンチセンスオリゴヌクレオチドによる４ヶ月にわたる処理を施し
て、アテローム硬化型プラーク形成を防ぐそのような化合物の能力を評価する。４ヶ月間
の処理期間の終わりに、マウスに麻酔を施し、１０％ホルマリンで潅流する。潅流された
動脈管を単離して、アテローム硬化型プラークの存在について調べる。動脈管の切片をパ
ラフィンで包理し、日常的な方法を用いて組織学的分析のために調製する。血清総コレス
テロール、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、およびトリグリセリドを、Ｏ
ｌｙｍｐｕｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ
Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いた日常的な臨床分析によって２、４、６、
８、１２、および１６週目に測定する。血清ヒトアポリポタンパク質Ｂタンパク質を、Ｅ
ＬＩＳＡキット（ＡＬｅｒＣＨＥＫ Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＭＥ）を用いて２、
４、６、８、１２、および１６週目に測定する。肝臓内のヒトおよびマウスアポリポタン
パク質ｍＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲによって１６週目に測定する。

（実施例６８）
（アテローム硬化型プラーク形成に対するウサギモデル）
ワタナベ遺伝性高脂血症（ＷＨＨＬ）系統のウサギをアテローム硬化型プラーク形成に
対するモデルとして用いる。高脂肪食を与えたニュージーランド白ウサギもアテローム硬
化型プラーク形成のモデルとして用いる。ＷＨＨＬまたは高脂血症食を与えたニュージー
ランド白ウサギに対するアポリポタンパク質Ｂアンチセンス化合物による処理を用いて、
アテローム硬化型プラーク疾患に対する治療的または予防的処理としてのそれらの潜在能
力について試験する。ウサギに、アポリポタンパク質Ｂを標的化したアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド５、１０、２５、または５０ｍｇ／ｋｇを注射する。生理食塩水のみまたは
対照オリゴヌクレオチドによる処理を施した動物は、対照としての役割を果たす。処理全
体を通して、血清試料を採取し、ＥＬＩＳＡキット（ＡＬｅｒＣＨＥＫ Ｉｎｃ．，Ｐｏ
ｒｔｌａｎｄ，ＭＥ）によってアポリポタンパク質Ｂタンパク質レベルを評価し、日常的
な臨床分析によって血清脂質（コレステロール、ＬＤＬコレステロール、ＶＬＤＬコレス
テロール、ＨＤＬコレステロール、トリグリセリド）を評価する。肝臓組織トリグリセリ
ド含有量を、Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ＧＰＯ Ａｓｓａｙ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉ
ｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて測定する。肝臓、腎臓、心臓、大動脈、および
他の組織を入手し、日常的な手順を用いて組織学的分析のために調製する。好塩基性顆粒
および炎症性湿潤の形跡について、肝臓および腎臓組織を調べる。オイルレッドＯ系統を
用いて、脂肪変性について肝臓組織を評価する。さらに、オイルレッドＯ系統およびヘマ
トキシリンで染色した大動脈切片を試験して、アテローム硬化型の病変の形成について評
価する。

（実施例６９）
（アポリポタンパク質Ｂ阻害剤の経口送達）
インビボでの送達のために、許容される剤形で、例えば非経口または非非経口配合物と
してオリゴヌクレオチドを配合することが可能である。非経口配合物としては、静脈内（
ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、硝子体内、および筋肉内（ＩＭ）配合物と、肺
吸入、鼻腔内投与、局所的投与等を介した送達用の配合物が挙げられる。非非経口配合物
としては、消化管、例えば経口投与、直腸投与、空腸内点滴注入等を介した送達用の配合
物が挙げられる。直腸投与としては、浣腸剤または座剤としての投与が挙げられる。経口
投与としては、カプセル、ゲルカプセル、丸薬、エリキシル剤等としての投与が挙げられ
る。

いくつかの実施形態では、経口投薬経路を介して、オリゴヌクレオチドを被験体に投与
することが可能である。被験体は、動物またはヒト（人類）でもよい。動物被験体は、マ
ウス、ラット、マウス、ラット、イヌ、モルモット、サル、非ヒト霊長目動物、ネコ、ま
たはブタ等の哺乳動物でもよい。非ヒト霊長目動物としては、サルおよびチンパンジーが
挙げられる。適当な動物被験体は、マウス、ラット、マウス、ラット、イヌ、サル、非ヒ
ト霊長目動物、ネコ、またはブタ等の実験動物とすることが可能である。

いくつかの実施形態では、被験体はヒトでもよい。特定の実施形態では、被験体は、本
明細書でより詳細に論じるように、治療的処理を必要とするヒト患者でもよい。特定の実
施形態では、被験体は、本明細書でより詳細に論じるように、１種類以上の遺伝子の発現
の調節を必要とする場合もある。いくつかの特定の実施形態では、被験体は、本明細書で
より詳細に論じるように、１種類以上の遺伝子の発現の阻害を必要とする場合もある。特
定の実施形態では、被験体は、本明細書でより詳細に論じる治療的表示を得るためにアポ
リポタンパク質Ｂの調節、すなわち阻害または増強を必要とする場合もある。

いくつかの実施形態では、本発明にかかる非非経口（例えば、経口）オリゴヌクレオチ
ド配合物は、オリゴヌクレオチドの増強された生物学的利用能を生じる。この文脈におい
て、用語「生物学的利用能（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）」とは、特定の投与形態
を用いて薬剤を送達する際の循環系（例えば、血液、特に血漿）に到達する投与薬剤の部
分の測定値を指す。増強された生物学的利用能とは、別の投与形態と比べた、被験体の末
梢血漿へオリゴヌクレオチドを送達する投与の能力の特定の形態を指す。例えば、非非経
口投与形態（例えば、経口形態）を用いて薬剤を被験体に導入する場合、その投与形態に
対する生物学的利用能を、異なる投与形態（例えば、ＩＶ投与形態）と比較することが可
能である。いくつかの実施形態では、非非経口（例えば、経口、直腸、空腸内）投与後の
化合物の血漿濃度曲線下面積（ＡＵＣ_０）を、静脈内（ｉ．ｖ．）投与後の該薬剤の血漿
濃度曲線下面積（ＡＵＣ_ｉｖ）で除算して、ＩＶ経路と比較した経口経路を介して吸収さ
れた化合物の分数を表す無次元商（相対的生物学的利用能、ＲＢ）を与えることが可能で
ある。第１の組成物の相対的生物学的利用能（ＲＢ_１）が第２の組成物の相対的生物学的
利用能（ＲＢ_２）より大きいとき、組成物の生物学的利用能が別の組成物の生物学的利用
能と比較して増強されたと言える。

一般に、化合物の治療効果が、達成された化合物の血液濃度に関連する場合、薬剤の最
終作用部位が細胞内であるとしても生物学的利用能は、治療効果と相関する（ｖａｎ Ｂ
ｅｒｇｅ−Ｈｅｎｅｇｏｕｗｅｎら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１９７７，７３，
３００）。生物学的利用能研究を用いて、経口用量後の薬剤の末梢血レベルの変化を測定
することによって薬剤の腸管吸収度を決定した（ＤｉＳａｎｔｏ，Ｃｈａｐｔｅｒ ７６
Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ＝ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．
，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０，ｐａｇｅｓ １４５１−１４５８）。

一般に、経口組成物の相対的生物学的利用能が、純粋なオリゴヌクレオチド（すなわち
、浸透エンハンサーの不在下でのオリゴヌクレオチド）から実質的になる組成物の生物学
的利用能より大きいとき、経口組成物の生物学的利用能が「増強された（ｅｎｈａｎｃｅ
ｄ）」と言える。

器官生物学的利用能とは、器官中の化合物の濃度を指す。器官生物学的利用能を、試験
被験体で、全身Ｘ線撮影による手段等の多数の手段によって測定することが可能である。
器官生物学的利用能を、本明細書でより詳細に論じるように、１種類以上の担体化合物ま
たは賦形剤等を用いたオリゴヌクレオチドへの１種類以上の修飾によって修飾、例えば増
強することが可能である。一般に、生物学的利用能の増加は、器官生物学的利用能の増加
を生じる。

本発明にかかる経口オリゴヌクレオチド組成物は、「吸収エンハンサー（ａｂｓｏｒｐ
ｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ）」または単に「浸透エンハンサー（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏ
ｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ）」としても知られる１種類以上の「粘膜浸透エンハンサー（ｍｕ
ｃｏｓａｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ）」を含むことが可能である。
したがって、本発明のいくつかの実施形態は、少なくとも１種類の浸透エンハンサーと組
み合わせた少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドを含む。一般に、浸透エンハンサーは
、所望の投与形態に関連する粘膜（粘膜群）、例えば腸管上皮膜を越えた薬剤の輸送を促
進する物質である。したがって、オリゴヌクレオチドの活性に緩衝することなく、さらに
、許容できない副作用（例えば、毒性、刺激、またはアレルギー応答）なしにオリゴヌク
レオチドが動物の体内に導入されうるように、オリゴヌクレオチドの取り込みを促進する
１種類以上の浸透エンハンサーを選択することが望ましい。

本発明の実施形態は、１種類以上の薬学的に受容可能な浸透エンハンサーを含む組成物
と、そのような組成物を用いる方法とを提供するものであり、経口投与形態を介して投与
されたオリゴヌクレオチドの生物学的利用能を向上させる。従来から、特定の浸透エンハ
ンサーが、特定の薬剤の生物学的利用能を向上するために用いられてきた。Ｍｕｒａｎｉ
ｓｈｉ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１
９９０，７，１およびＬｅｅら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅ
ｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８，９１を参照せよ。動物および人類に投与することが
難しいことが知られている比較的複雑な分子であるオリゴヌクレオチドの取り込みおよび
送達を、浸透エンハンサーの多数の異なるクラスを介した経口手段によって投与される場
合であってさえ、非常に向上することができることが判明した。

いくつかの実施形態では、経口投与用の組成物は、天然に存在するオリゴヌクレオチド
（すなわち、完全なホスホジエステルデオキリボシルまたは完全なホスホジエステルリボ
シルオリゴヌクレオチド）からの１種類以上の修飾を含む。そのような修飾は、結合親和
性、ヌクレアーゼ安定性、細胞または組織浸透性、組織分布、あるいは他の生物学的薬物
動態学的特性を増加することが可能である。修飾を、オリゴヌクレオチド化学に関して本
明細書でより詳細に論じるように、塩基、リンカー、または糖におこなうことが可能であ
る。本発明のいくつかの実施形態では、被験体への投与用の組成物、特に動物またはヒト
被験体への投与用の経口組成物は、親和性、安定性、組織分布、または他の生物学的特性
を増強するための１種類以上の修飾を持つ修飾オリゴヌクレオチドを含むだろう。

適当な修飾リンカーとしては、ホスホロチオエートリンカーが挙げられる。本発明にか
かるいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のホスホロチオエ
ートリンカーを持つ。ホスホロチオエートリンカーは、ヌクレアーゼ安定性と、オリゴヌ
クレオチドに対する血漿タンパク質結合特性とをもたらす。ヌクレアーゼ安定性は、オリ
ゴヌクレオチドのインビボ生存期間を増加するために有用であり、それに対して、血漿タ
ンパク質結合は、腎排泄を介してオリゴヌクレオチドの初回通過除去率を減少させる。本
発明にかかるいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２個のホスホ
ロチオエートリンカーを持つ。オリゴヌクレオチドが厳密にｎ個のヌクレオシドを持つい
くつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、１個ないしｎ−１個のホスホロチオ
エート結合を持つ。オリゴヌクレオチドが厳密にｎ個のヌクレオシドを持ついくつかの実
施形態では、このオリゴヌクレオチドは、ｎ−１個のホスホロチオエート結合を持つ。オ
リゴヌクレオチドが厳密にｎ個のヌクレオシドを持ち、ｎが偶数である他の実施形態では
、このオリゴヌクレオチドは、１ないしｎ／２個のホスホロチオエート結合を持ち、ある
いはｎが奇数である場合は、１ないし（ｎ−１）／２個のホスホロチオエート結合を持つ
。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル（ＰＯ）結合およ
びホスホロチオエート（ＰＳ）結合を交互に持つ。他の実施形態では、オリゴヌクレオチ
ドは、２個以上の連続するＰＯ結合の少なくとも１つの一続きの配列（ストレッチ）と、
２個以上のＰＳ結合の少なくとも１つのストレッチとを持つ。他の実施形態では、オリゴ
ヌクレオチドは、少なくとも１つのＰＳ結合が割り込んだ、ＰＯ結合の２個のストレッチ
を持つ。

いくつかの実施形態では、ヌクレオシドのうちの少なくとも１個を、ヌクレアーゼ安定
性、結合親和性、または他の有用な生物学的特性を糖に付与する修飾によってリボシル糖
単位上で修飾する。いくつかの場合では、糖修飾は、２′修飾、例えば、リボシル糖の２
′−ＯＨが置換される（ｒｅｐｌａｃｅｄまたはｓｕｂｓｔｉｔｕｅｄ）修飾を含む。２
′−ＯＨに対する適した置換としては、２′−Ｆおよび２′−アラビノ−Ｆが挙げられる
。ＯＨに対する適当な置換としては、２′−Ｏ−アルキル（例えば、２′−Ｏ−メチル）
および２′−Ｏ置換アルキル（例えば、２′−Ｏ−メトキシエチル、２′−Ｏ−アミノプ
ロピル）等が挙げられる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも
１種類の２′修飾を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも
２種類の２′修飾を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、各末端に少
なくとも１種類の２′修飾を持つ（すなわち、３′および５′末端ヌクレオシド各々が同
じまたは異なる２′修飾を持つ）。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オ
リゴヌクレオチドの各末端に少なくとも２種類の連続的な２′修飾を持つ。いくつかの実
施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のデオキシヌクレオシドをさらに含
む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、デオキシヌクレオシドのストレッチを
、該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることが可能なＲＮＡのＲＮアーゼ（例えば
、ＲＮアーゼＨ）切断を該ストレッチが活性化可能であるように含む。いくつかの実施形
態では、ＲＮＡのＲＮアーゼ媒介切断を活性化することが可能なデオキシヌクレオシドの
ストレッチは、約６ないし約１６、例えば約８ないし約１６個の連続するデオキシヌクレ
オシドを含む。

本発明の非経口オリゴヌクレオチド組成物の投与のための経口組成物を種々の剤形で配
合することが可能であり、該剤形としては、限定はされないが、例えば、錠剤、カプセル
、液体シロップ、軟性ゲル、座薬、および浣腸剤がある。用語「消化管送達（ａｌｉｍｅ
ｎｔａｒｙ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」とは、例えば、経口、直腸、内視鏡的、および舌下／
頬側投与を包括する。この投与形態に共通する要件は、消化管のある部分または全てにわ
たる吸収であり、そのように投与された核酸（群）の効率的な粘膜浸透を必要とする。

頬側および舌下投与の場合と同様に、口腔粘膜を介した薬剤の送達には、経口送達を介
する送達より薬剤の血漿濃度が多くの場合急速に上昇することを含む複数の望ましい特徴
がある（Ｈａｒｖｅｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３５ Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ＝ｓ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ
．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０，ｐａｇ
ｅ ７１１）。

消化管の内部へ直接薬剤を送達するために、内視鏡検査を用いることが可能である。例
えば、内視鏡的逆行性膵胆管造影法（ＥＲＣＰ）は、拡張された胃鏡検査を利用しており
、胆道および膵管への選択的なアクセスが可能である（Ｈｉｒａｈａｔａら、Ｇａｎ Ｔ
ｏ Ｋａｇａｋｕ Ｒｙｏｈｏ，１９９２，１９（１０ Ｓｕｐｐｌ．），１５９１）。
リポソーム配合物を含む薬学的組成物を、内視鏡的手段を介して、例えば、十二指腸（Ｓ
ｏｍｏｇｙｉら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９９５，１２，１４９）または胃粘膜下（Ａ
ｋａｍｏら、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９４，８５，６５２
）等の消化管の部分中に直接送達することができる。胃洗浄装置（Ｉｎｏｕｅら、Ａｒｔ
ｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ，１９９７，２１，２８）および経皮内視鏡的供給装置（Ｐｅｎｎｉ
ｎｇｔｏｎら、Ａｉｌｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１９９５，９，４７
１）も、薬学的組成物の直接消化管送達のために用いることができる。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配合物を、肛門を介して直腸またはより
下部の腸へと投与することが可能である。直腸座剤、留置浣腸、または直腸カテーテルを
この目的のために用いることができ、特に患者の薬剤服用順守を達成するのが困難である
場合に好ましいであろう（例えば、小児科学および老人病学用途において、あるいは患者
が嘔吐してしまうかまたは意識がない場合）。直腸投与は、経口経路より迅速かつ高度の
血漿レベルを生じうる（Ｈａｒｖｅｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３５ Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏ
ｎ＝ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎ
ｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１
９９０，ｐａｇｅ ７１１）。直腸から吸収される薬剤の約５０％が肝臓を迂回すること
から、この経路による投与は、初回通過代謝に対する潜在能力を有意に低減する（Ｂｅｎ
ｅｔら、Ｃｈａｐｔｅｒ １ Ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ＝ｓ Ｔｈｅ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔ
ｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎら、ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
，ＮＹ，１９９６）。

オリゴヌクレオチド組成物の経口投与に有利な一方法は、経口送達である。いくつかの
実施形態は、粘膜および上皮膜を越えてオリゴヌクレオチドおよび他の核酸を輸送するた
めに種々の浸透エンハンサーを用いる。浸透エンハンサーは、５つの広範なカテゴリー（
界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化剤非界面活性剤）の
うちの１つに属するものとして分類されうる（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅ
ｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１
９９１，ｐ．９２）。したがって、いくつかの実施形態は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸
塩、キレート化剤、および非キレート化剤界面活性剤からなる群の少なくとも１つのメン
バーを含む経口オリゴヌクレオチド組成物を含む。さらに別の実施形態は、少なくとも１
種類の脂肪酸、例えば、カプリン酸、ラウリン酸、またはそれらの組み合わせ、あるいは
それらの塩を含む経口オリゴヌクレオチドを含む。他の実施形態は、オリゴヌクレオチド
の経口生物学的利用能を増強する方法を含み、該方法は、オリゴヌクレオチドおよび少な
くとも１種類の浸透エンハンサーの共投与を含む。

経口オリゴヌクレオチド組成物に添加することが可能である他の賦形剤としては、界面
活性剤（または「表面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ−ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）」）が挙げ
られ、該界面活性剤は、水溶液に溶解された場合、該水溶液の表面張力または該水溶液と
他の液体との間の界面張力を低減させ、その結果、消化管粘膜または他の上皮膜を介した
オリゴヌクレオチドの吸収を増強する化学物質である。胆汁酸塩および脂肪酸以外に、界
面活性剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリ
ルエーテル、およびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉ
ｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ．９２）と、ＦＣ−４３等のパーフルオロケミカル
エマルション（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．，１９８８
，４０，２５２）とが挙げられる。

浸透エンハンサーとして作用し、本発明の組成物に用いることが可能な脂肪酸およびそ
れらの誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）
、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプラート
、トリカプラート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラ
ウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル１−モノカプラート、１−ドデシルアザ
シクロへプタン−２−ｏｎｅ、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのモノグリセリ
ドおよびジグリセリド、ならびに／またはそれらの生理学的に許容される塩（すなわち、
オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステア
リン酸塩、リノール酸塩等）が挙げられる（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ
ｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９
９１，ｐａｇｅ ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７
，１；Ｅｌ−Ｈａｒｉｒｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４
，６５１）。

いくつかの実施形態では、経口送達用のオリゴヌクレオチド組成物は、少なくとも２種
類の異なる相を含み、どちらの相も、粒子、カプセル、ゲルカプセル、ミクロスフェア等
を含むことが可能である。各相は、１種類以上のオリゴヌクレオチド、浸透エンハンサー
、界面活性剤、生体接着剤、発泡剤、あるいは他のアジュバント、賦形剤、または希釈剤
を含有することが可能である。いくつかの実施形態では、一方の相は、少なくとも１種類
のオリゴヌクレオチドおよび少なくとも１種類の浸透エンハンサーを含む。いくつかの実
施形態では、第１の相は、少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドおよび少なくとも１種
類の浸透エンハンサーを含み、一方で、第２の相は、少なくとも１種類の浸透エンハンサ
ーを含む。いくつかの実施形態では、第１の相は、少なくとも１種類のオリゴヌクレオチ
ドおよび少なくとも１種類の浸透エンハンサーを含み、一方で、第２の相は、少なくとも
１種類の浸透エンハンサーを含み、実質的にオリゴヌクレオチドは含まない。いくつかの
実施形態では、少なくとも一方の相は、その相の内容物を徐放するコーティングまたはマ
トリックス等の少なくとも１種類の分解遅延剤と混合する。いくつかの実施形態では、第
１の相は、少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドおよび少なくとも１種類の浸透エンハ
ンサーを含み、一方で、第２の相は、少なくとも１種類の浸透エンハンサーおよび放出遅
延剤を含む。特定の実施形態では、経口オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよ
び浸透エンハンサーを含有する粒子を含む第１の相と、放出遅延剤で被覆し、かつ浸透エ
ンハンサーを含有する粒子を含む第２の相とを含む。

種々の胆汁酸塩も、浸透エンハンサーとして機能して、薬剤の取り込みおよび生物学的
利用能を促進する。胆汁の生理学的役割としては、脂質および脂肪可溶ビタミンの分散お
よび吸収の促進が挙げられる（Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ：Ｇｏｏｄ
ｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ＝ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ
ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎら、ｅｄｓ．，Ｍ
ｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９６，ｐａｇｅｓ ９３４−９３
５）。種々の天然胆汁酸塩およびそれらの合成誘導体は浸透エンハンサーとして作用する
。したがって、用語「胆汁酸塩（ｂｉｌｅ ｓａｌｔ）」とは、胆汁の天然発生の成分の
いずれのものも含み、かつそれらの合成誘導体のいずれのものも含む。本発明の胆汁酸塩
としては、例えば、コール酸（またはその薬学的に受容可能なナトリウム塩、コール酸塩
）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコ
ール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコ
ール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデコキシコール酸ナトリウム）、
タウロコール酸（タウロコール酸塩）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール
酸塩）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ、ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソ
デオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−ヒシジン酸ナトリウム
（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロヒシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン−９
−ラウリルエーテルが挙げられる（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ
ａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ＝
ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａ
ｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９
０，ｐａｇｅｓ ７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅ
ｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１
９９０，７，１；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２
，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９
，
５７９）。

いくつかの実施形態では、本発明のいくつかの実施形態で有用な浸透エンハンサーは、
浸透増強化合物の混合物である。そのような浸透エンハンサーの１つには、ＵＤＣＡ（お
よび／またはＣＤＣＡ）とカプリン酸および／ラウリン酸あるいはそれらの塩（例えば、
ナトリウム）との混合物がある。そのような混合物は、粘膜、特に腸粘膜を越えた生物学
的活性物質の送達を増強するために有用である。他の浸透エンハンサー混合物は、約５な
いし９５％の胆汁酸または胆汁酸塩（類）ＵＤＣＡおよび／またはＣＤＣＡと、５ないし
９５％のカプリン酸および／またはラウリン酸とを含む。特定の浸透エンハンサーは、Ｕ
ＤＣＡ、カプリン酸、およびラウリン酸のそれぞれ１：２：２の比率のナトリウム塩の混
合物である。そのような浸透エンハンサーの別のものは、０．０１：１ないし１：０．０
１の比率（モル基準）のカプリン酸およびラウリン酸（またはそれらの塩）の混合物であ
る。特定の実施形態では、カプリン酸およびラウリン酸は、例えば、約０．１：１ないし
約１：０．１のモル比率で、特に約０．５：１ないし約１：０．５のモル比率で存在する
。

他の賦形剤としては、キレート化剤、すなわち、金属イオンとの複合体を形成すること
によって溶液から金属イオンを除去し、その結果、消化管粘膜および他の粘膜を介したオ
リゴヌクレオチドの吸収を増強する化合物が挙げられる。キレート化剤の本発明における
浸透エンハンサーとしての使用に関しては、最も特徴的なＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作
用に対して二価の金属イオンを必要とすることからキレート化剤によって阻害されるので
、キレート化剤は、ＤＮアーゼ阻害剤としても機能するという付加的な利点を持つ（Ｊａ
ｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５）。本発明のキレ
ート化剤としては、限定はされないが、エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム（ＥＤＴＡ
）、クエン酸、サルチル酸塩（例えば、サルチル酸ナトリウム、５−メトキシサルチル酸
塩、およびホモバニリン酸塩）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、および
ベータ−ジケトン（エナミン）のＮ−アミノアシル誘導体（Ｌｅｅ ら、Ｃｒｉｔｉｃａ
ｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅ
ｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ，１９９０，７，１；Ｂｕｕｒら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，
４３）。

本明細書で用いられるように、非キレート化非界面活性剤浸透エンハンサーは、キレー
ト化剤または界面活性剤としては小さな活性しか示さないが、それにもかかわらず、消化
管粘膜および他の粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収を増強する化合物として定義さ
れうる（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐ
ｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１）。浸透エ
ンハンサーのこのクラスとしては、限定はされないが、不飽和環状尿素、１−アルキル−
アルカノン誘導体、および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅら、Ｃ
ｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒ
ｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）と、ジクロフェナックナトリウム
、インドメタシン、およびフェニルブタゾン等の非ステロイド性抗炎症剤（Ｙａｍａｓｈ
ｉｔａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１）とが挙げ
られる。

オリゴヌクレオチドの取り込みを細胞レベルで増強する物質を、本発明の薬学的組成物
および他の組成物に添加することも可能である。例えば、リポフェクチン（Ｊｕｎｉｃｈ
ｉ ｅｔ ａｌ、米国特許第５，７０５，１８８号）等のカチオン性脂質、カチオン性グ
リセロール誘導体、およびポリリジン（Ｌｏｌｌｏら、ＰＣＴ出願ＷＯ ９７／３０７３
１）等のポリカチオン性分子を用いることができる。

いくつかの経口オリゴヌクレオチド組成物は、その配合物中に担体化合物も組み込む。
本明細書で用いられるように、「担体化合物（ｃａｒｒｉｅｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ま
たは「担体（ｃａｒｒｉｅｒ）」とは、不活性でありうる（すなわち、それ自体では生物
学的活性を持たない）か、または輸送、認識、経路活性、もしくは経路媒介を必要としう
る核酸またはその類似体のことを指すことができる。あるいは、担体化合物または担体は
、例えば、生物学的に活性な核酸を分解することまたは循環からのその除去を促進するこ
とによって生物学的活性を持つ核酸の生物学的利用能を低減させるインビボ過程によって
核酸として認識される。核酸および担体化合物（通常は、過剰の単体化合物）の共投与は
、恐らく共通の受容体に対する担体化合物と核酸との競合が原因で、肝臓、腎臓、または
他の循環外貯蔵所で回収される核酸の量の実質的な低減を生じうる。例えば、部分的ホス
ホロチオエートオリゴヌクレオチドを、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジ
ン酸、または４−アセトアミド−４′−イソチオシアノ−スチルベン−２，２′−ニスル
ホン酸とともに共投与する際、肝臓組織での部分的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチ
ドの回収を低減することができる（Ｍｉｙａｏら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ
．，１９９５，５，１１５；Ｔａｋａｋｕｒａら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｉ．
Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７）。

「薬学的担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃａｒｒｉｅｒ）」または「賦形剤（
ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」は、薬学的に受容可能な溶剤、懸濁剤、または１種類の以上の核
酸を動物に送達するための任意のほかの薬理学的に不活性な媒体でもよい。賦形剤は、液
体または固体でありえ、所定の薬学的組成物の核酸および他の成分と組み合わせる場合、
計画された投与様式を考慮して所望の容量、粘度等を可能にするように選択される。通常
の薬学的担体としては、限定はされないが、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデ
ンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）と、充
填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸
カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリラート、またはリン酸水素カルシウム等）、
潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素
、ステアリン酸、金属ステアラート、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコ
ール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）と、崩壊剤（例えば、デンプン、グリコ
ール酸ナトリウムデンプン、ＥＸＰＬＯＴＡＢ）と、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナト
リウム等）が挙げられる。

経口オリゴヌクレオチド組成物は、薬学的組成物で見出される他の添加物成分を、それ
らの技術で確立されている使用レベルでさらに含むことが可能である。したがって、例え
ば、組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬、または抗炎症剤等の付加的で適合
した薬学的的に活性な物質を含有することが可能であるか、あるいは、本発明の組成物の
種々の剤形を物理的に配合する上で有用な、色素、香料添加剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白
剤、増粘剤、および安定剤等の物質を含有することが可能である。しかし、そのような物
質が添加される場合、本発明の組成物の成分の生物学的活性に必要以上に干渉しないよう
にすべきである。

Claims (1)

1. 本明細書中に記載の発明。