TW202317764A - 用於基因編輯之包含內部連接子之經修飾引導rna - Google Patents
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Abstract
本發明係關於用於活體外及活體內基因編輯方法之包含內部連接子之經修飾引導RNA。
Description
本發明係關於使用CRISPR/Cas系統(識別且切割外源基因元件之原核免疫系統的一部分)進行基因編輯的領域。
原核CRISPR/Cas系統依賴於具有RNA及DNA結合活性之核酸酶，或此類複合物之DNA結合次單元，其中DNA結合活性為序列特異性的且取決於RNA之序列。通常被稱為RNA引導之DNA結合劑的此類複合物包括多種RNA引導之DNA結合劑，包括Cas裂解酶/切口酶。Cas裂解酶及Cas切口酶包括第III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物、其Cas10、Csm1或Cmr2次單元、第I型CRISPR系統之級聯(Cascade)複合物、其Cas3次單元及第2類Cas核酸酶。例示性單體核酸酶，諸如Cas9 (被稱為CRISPR相關蛋白9 (Cas9))，誘導DNA中之位點特異性斷裂。引導RNA通常藉由活體外寡核苷酸合成來製備。考慮到寡核苷酸合成之環狀性質及不完全產率，用非核酸內部連接子取代gRNA之部分同時保留或甚至提高其活性將為合乎需要的，例如使得gRNA可以更高產率獲得(例如，歸因於核苷酸添加之較少循環)，或使得包含gRNA之組合物具有較高同質性或較少不完全或不正確產物。另外，尤其對於治療應用，需要用於防止此類降解、改良gRNA之穩定性且提高基因編輯效率之經改良方法及組合物。
在一些實施例中，提供基因體編輯工具，其包含含有如本文所描述之內部連接子的引導RNA (gRNA)。本申請案源自非核酸連接子可置換引導RNA中與Cas核酸酶具有非必需接觸的某些內部部分的發現。本文所描述之取代可有助於以更高產率或均質性合成gRNA；或可改良gRNA及其對應核酸酶(例如gRNA/Cas複合物)之穩定性且提高Cas9 (例如SauCas9、SpyCas9、CdiCas9、St1Cas9、SthCas9、AceCas9、CjeCas9、RpaCas9、RruCas9、AnaCas9、NmeCas9)、Cas12 (例如AsCas12a、LbCpf1)或Cas13 (例如EsCas13d)之活性以修飾目標DNA。
在一些實施例中，提供具有一或多個取代以包括一或多個如本文所描述之內部連接子的單引導RNA (sgRNA)。
在一些實施例中，提供具有一或多個取代以包括一或多個如本文所描述之內部連接子的crisprRNA (crRNA)或tracrRNA (trRNA)。在一些實施例中，經修飾crRNA或經修飾trRNA包含雙引導RNA (dgRNA)。在一些實施例中，經修飾crRNA或經修飾trRNA包含單引導RNA (sgRNA)。用一或多個如本文所描述之內部連接子進行取代可有助於以更高產率或均質性合成gRNA；或可改良gRNA及其對應核酸酶(例如gRNA/Cas複合物，例如gRNA/Cas9複合物)之穩定性且提高核酸酶(例如Cas9核酸酶(例如SauCas9、SpyCas9))之活性例如以使目標DNA裂解或切口。與包含所有核苷酸之引導物，例如100聚體Spy Cas 9 sgRNA或其他短引導Spy Cas9 RNA相比，本發明所揭示之引導RNA之合成可增加引導RNA之粗產率。類似地，以全長產物之比例量測之gRNA樣品純度(例如粗純度)可增加。gRNA可以較高產率獲得，或包含gRNA之組合物可具有較高同質性或較少不完全或不正確產物。引導RNA純度可使用離子對逆相高效液相層析法(IP-RP-HPLC)及離子交換HPLC方法評定，例如與Kanavarioti等人，Sci Rep
9, 1019 (2019) (數位物件識別碼(doi):10.1038/s41598-018-37642-z)中相同。使用260 nm波長下之UV光譜分析，可藉由層析圖中主峰之吸收度與所有峰之累積吸光度的比率來測定粗純度及最終純度。合成產率係以最終樣品在260 nm下之吸光度與輸入材料之理論吸光度的比率測定。
涵蓋以下實施例。
在一些實施例中，提供一種包含內部連接子之引導RNA (gRNA)。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約3至30個、視情況12至21個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少2個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約6至18個原子、視情況約6至12個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少2個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代2至12個核苷酸。
在一些實施例中，內部連接子位於gRNA之重複反重複區中。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之重複反重複區的至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之重複反重複區的多至28個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之重複反重複區的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。
在一些實施例中，內部連接子位於gRNA之髮夾區中。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的至少2個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的至多22個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的1、2、3、4、5、6、7、8或9個鹼基對。
在一些實施例中，內部連接子位於gRNA之連接區(nexus region)中。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之連接區的1或2個核苷酸。
在一些實施例中，內部連接子位於gRNA之第一部分與gRNA之第二部分之間的髮夾中，其中該第一部分及該第二部分一起形成雙螺旋部分。在一些實施例中，內部連接子橋接雙螺旋體之第一部分與雙螺旋體之第二部分，其中該雙螺旋體包含2至10個鹼基對。
在一些實施例中，gRNA包含兩個內部連接子。在一些實施例中，gRNA包含三個內部連接子。
在一些實施例中，提供一種單引導RNA (sgRNA)，該sgRNA包含引導區及該引導區之3'的保守部分，其中該保守部分包含重複反重複區、連接區、髮夾1區及髮夾2區，且包含以下中之至少一者：
1) 第一內部連接子，其取代該重複反重複區之上莖區的至少2個核苷酸；
2) 第二內部連接子，其取代該連接區之1或2個核苷酸；及
3) 第三內部連接子，其取代該髮夾1之至少2個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種單引導RNA (sgRNA)，該sgRNA包含引導區及該引導區之3'的保守部分，其中保守部分包含重複反重複區、髮夾1區及髮夾2區，且進一步包含以下中之至少一者：
1) 第一內部連接子，其取代該sgRNA之該重複反重複區之上莖區的至少2個核苷酸；
2) 第二內部連接子，其取代該sgRNA之該髮夾1的1或2個核苷酸；或
3) 第三內部連接子，其取代該sgRNA之該髮夾2的至少2個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種引導RNA (gRNA)，該gRNA包含引導區及該引導區之3'的保守部分，其中該保守部分包含重複反重複區、髮夾1區及髮夾2區，且包含取代該重複反重複區之至少2個核苷酸的第一內部連接子及取代該髮夾2之至少2個核苷酸的第二內部連接子。
在一些實施例中，提供一種引導RNA (gRNA)，該gRNA包含引導區及該引導區之3'的保守部分，其中該保守部分包含重複反重複區及髮夾區，且包含取代該重複反重複區之至少2個核苷酸的內部連接子。
在一些實施例中，提供一種引導RNA (gRNA)，該gRNA包含重複反重複區及取代該重複反重複區之至少2個核苷酸的內部連接子。
在一些實施例中，內部連接子包含至少兩個彼此共價連接的乙二醇次單元。
以下為本文所提供之實施例之非詳盡清單。
實施例1為一種引導RNA (gRNA)，其包含內部連接子。
實施例2為如實施例1之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28個核苷酸。
實施例3為如實施例1或2之gRNA，其中該內部連接子具有約3至30個原子、視情況12至21個原子之橋接長度，且該連接子取代該gRNA之至少2個核苷酸。
實施例4為如實施例1至3中任一者之gRNA，其中該內部連接子具有約6至18個原子、視情況約6至12個原子之橋接長度，且該連接子取代該gRNA之至少2個核苷酸。
實施例5為如實施例1至4中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代2至12個核苷酸。
實施例6為如實施例1至5中任一者之gRNA，其中該內部連接子位於該gRNA之重複反重複區中。
實施例7為如實施例1至6中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該重複反重複區的至少4個核苷酸。
實施例8為如實施例1至7中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該重複反重複區的多至28個核苷酸。
實施例9為如實施例1至8中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該重複反重複區的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。
實施例10為如實施例1至9中任一者之gRNA，其中該內部連接子位於該gRNA之髮夾區中。
實施例11為如實施例1至10中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該髮夾區的至少2個核苷酸。
實施例12為如實施例1至11中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該髮夾區的至多22個核苷酸。
實施例13為如實施例1至12中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該髮夾區的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個核苷酸。
實施例14為如實施例1至13中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該髮夾區的1、2、3、4、5、6、7、8或9個鹼基對。
實施例15為如實施例1至14中任一者之gRNA，其中該內部連接子位於該gRNA之連接區中。
實施例16為如實施例1至15中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該連接區的1或2個核苷酸。
實施例17為如實施例1至16中任一者之gRNA，其中該內部連接子位於該gRNA之第一部分與該gRNA之第二部分之間的髮夾中，其中該第一部分及該第二部分一起形成雙螺旋部分。
實施例18為如實施例1至17中任一者之gRNA，其中該內部連接子橋接雙螺旋體之第一部分與雙螺旋體之第二部分，其中該雙螺旋體包含2至10個鹼基對。
實施例19為如實施例1至18中任一者之gRNA，其中該gRNA包含兩個內部連接子。
實施例20為如實施例1至18中任一者之gRNA，其中該gRNA包含三個內部連接子。
實施例21為如實施例1至20中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子位於該重複反重複區之第一部分與第二部分之間的髮夾中，其中該第一部分及該第二部分一起形成雙螺旋部分。
實施例22為如實施例21之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28個核苷酸。
實施例23為如實施例21至22中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之至少4個核苷酸。
實施例24為如實施例21至23中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之至多28個核苷酸。
實施例25為如實施例21至24中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之4至20個核苷酸。
實施例26為如實施例21至25中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之4至14個核苷酸。
實施例27為如實施例21至26中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之4至6個核苷酸。
實施例28為如實施例21至27中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之環或其部分。
實施例29為如實施例21至28中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之該環及莖或其部分。
實施例30為如實施例21至27中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之該環的2、3或4個核苷酸。
實施例31為如實施例21至27中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的至少1個核苷酸。
實施例32為如實施例21至31中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個核苷酸。
實施例33為如實施例21至32中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的至少2個核苷酸。
實施例34為如實施例21至32中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的1、2、3、4、5、6、7或8個核苷酸。
實施例35為如實施例21至32中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個鹼基對。
實施例36為如實施例21至32中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代構成該髮夾之該環的所有核苷酸。
實施例37為如實施例21至32中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代構成該髮夾之該環及莖的所有核苷酸。
實施例38為如實施例1至37中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該連接區的1或2個核苷酸。
實施例39為如實施例1至38中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之髮夾。
實施例40為如實施例39之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個核苷酸。
實施例41為如實施例39至40中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之2至22個核苷酸。
實施例42為如實施例39至41中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之2至12個核苷酸。
實施例43為如實施例39至42中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之2至6個核苷酸。
實施例44為如實施例39至43中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之2至4個核苷酸。
實施例45為如實施例39至44中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之環或其部分。
實施例46為如實施例39至45中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之該環及莖或其部分。
實施例47為如實施例39至46中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之該環的2、3、4或5個核苷酸。
實施例48為如實施例39至47中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的至少1個核苷酸。
實施例49為如實施例39至48中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸。
實施例50為如實施例39至49中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的至少2個核苷酸。
實施例51為如實施例39至50中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的至多18個核苷酸。
實施例52為如實施例39至51中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的1、2、3、4、5、6、7、8或9個鹼基對。
實施例53為如實施例39至52中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代構成該髮夾之該環的所有核苷酸。
實施例54為如實施例39至53中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代構成該髮夾之該環及莖的所有核苷酸。
實施例55為如實施例39至54中任一者之gRNA，其中該髮夾為髮夾1。
實施例56為如實施例39至54中任一者之gRNA，其中該髮夾為髮夾2。
實施例57為如實施例39至54中任一者之gRNA，其中該髮夾為髮夾1，且該內部連接子取代該髮夾1。
實施例58為如實施例57之gRNA，其中該gRNA進一步包含該髮夾1之3'的髮夾2。
實施例59為如實施例58之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾2之環的至少2個核苷酸。
實施例60為如實施例58或59之gRNA，其中該內部連接子不取代該髮夾2。
實施例61為如實施例1至60中任一者之gRNA，其進一步包含引導區。
實施例62為如實施例61之gRNA，其中該引導區之長度為17、18、19或20個核苷酸。
實施例63為如實施例1至62中任一者之gRNA，其中該gRNA為單引導RNA (sgRNA)。
實施例64為如實施例1至62中任一者之gRNA，其中該gRNA包含tracrRNA (trRNA)。
實施例65為一種引導RNA (gRNA)，其中該gRNA為單引導RNA (sgRNA)，其包含引導區及該引導區之3'的保守部分，其中該保守部分包含重複反重複區、連接區、髮夾1區及髮夾2區，且包含以下中之至少一者：
1) 第一內部連接子，其取代該重複反重複區之上莖區的至少2個核苷酸；
2) 第二內部連接子，其取代該連接區之1或2個核苷酸；及
3) 第三內部連接子，其取代該髮夾1之至少2個核苷酸。
實施例66為如實施例65之gRNA，其中該sgRNA包含該第一內部連接子及該第二內部連接子。
實施例67為如實施例65之gRNA，其中該sgRNA包含該第一內部連接子及該第三內部連接子。
實施例68為如實施例65之gRNA，其中該sgRNA包含該第二內部連接子及該第三內部連接子。
實施例69為如實施例65之gRNA，其中該sgRNA包含該第一內部連接子、該第二內部連接子及該第三內部連接子。
實施例70為如實施例65至69中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子具有約9至30個原子、視情況約15至21個原子之橋接長度。
實施例71為如實施例65至70中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。
實施例72為如實施例65至71中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之環或其部分。
實施例73為如實施例65至72中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之該環及莖或其部分。
實施例74為如實施例65至73中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之該環的2、3或4個核苷酸。
實施例75為如實施例65至74中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之該環及該上莖區之莖的至少2、3、4、5、6、7或8個核苷酸。
實施例76為如實施例65至75中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之該環及該上莖區之莖的1、2、3或4個鹼基對。
實施例77為如實施例65至76中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代構成該上莖區之該環的所有核苷酸。
實施例78為如實施例65至77中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代構成該上莖區之該環及莖的所有核苷酸。
實施例79為如實施例65至78中任一者之gRNA，其中該第二內部連接子具有約6至18個原子、視情況約6至12個原子之橋接長度。
實施例80為如實施例65至79中任一者之gRNA，其中該第二內部連接子取代該sgRNA之該連接區的2個核苷酸。
實施例81為如實施例65至80中任一者之gRNA，其中該第二內部連接子取代該sgRNA之該連接區之環的2個核苷酸。
實施例82為如實施例65至81中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子具有約9至30個、視情況約12至21個原子之橋接長度。
實施例83為如實施例65至82中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子取代該gRNA之該髮夾1的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。
實施例84為如實施例65至83中任一者之gRNA，其中該第三連接子取代該gRNA之該髮夾1的1、2、3、4或5個鹼基對。
實施例85為如實施例65至84中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾1之環或其部分。
實施例86為如實施例65至85中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾1之該環及莖或其部分。
實施例87為如實施例65至86中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾1之該環的2、3或4個核苷酸。
實施例88為如實施例65至87中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾1之莖的至少1個核苷酸。
實施例89為如實施例65至88中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾1之莖的2、4或6個核苷酸。
實施例90為如實施例65至89中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該第三內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾1之莖的1、2或3個鹼基對。
實施例91為如實施例65至90中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子取代構成該髮夾1之該環的所有核苷酸。
實施例92為如實施例65至91中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子取代構成該髮夾1之該環及莖的所有核苷酸。
實施例93為如實施例65至92中任一者之gRNA，其中該sgRNA之該髮夾2區不含有任何內部連接子。
實施例94為如實施例65至93中任一者之gRNA，其中該sgRNA為化膿鏈球菌(S. pyogenes) Cas9 sgRNA。
實施例95為如實施例65至94中任一者之gRNA，其中該sgRNA包含含有SEQ ID NO: 400之序列的保守部分。
實施例96為如實施例95之gRNA，其中核苷酸13至16 (該上莖區之US5至US8)中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 400經該第一內部連接子取代。
實施例97為如實施例95至96中任一者之gRNA，其中核苷酸12至17 (該上莖區之US4至US9)相對於SEQ ID NO: 400經該第一內部連接子取代。
實施例98為如實施例95至97中任一者之gRNA，其中核苷酸11至18 (該上莖區之US3至US10)相對於SEQ ID NO: 400經該第一內部連接子取代。
實施例99為如實施例95至98中任一者之gRNA，其中核苷酸10至19 (該上莖區之US2至US11)相對於SEQ ID NO: 400經該第一內部連接子取代。
實施例100為如實施例95至99中任一者之gRNA，其中核苷酸9至20 (該上莖區之US1至US12)相對於SEQ ID NO: 400經該第一內部連接子取代。
實施例101為如實施例95至100中任一者之gRNA，其中核苷酸36至37 (該連接區之N6至N7)相對於SEQ ID NO: 400經該第二內部連接子取代。
實施例102為如實施例95至101中任一者之gRNA，其中核苷酸53至56 (該髮夾1之H1-5至H1-8)中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 400經該第三內部連接子取代。
實施例103為如實施例95至102中任一者之gRNA，其中核苷酸52至57 (該髮夾1之H1-4至H1-9)相對於SEQ ID NO: 400經該第三內部連接子取代。
實施例104為如實施例95至103中任一者之gRNA，其中核苷酸51至58 (該髮夾1之H1-3至H1-10)相對於SEQ ID NO: 400經該第三內部連接子取代。
實施例105為如實施例95至104中任一者之gRNA，其中核苷酸50至59 (該髮夾1之H1-1至H1-12)相對於SEQ ID NO: 400經該第三內部連接子取代。
實施例106為如實施例95至105中任一者之gRNA，其中核苷酸77至80相對於SEQ ID NO: 400缺失。
實施例107為如實施例65至94中任一者之gRNA，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 201之序列。
實施例108為如實施例107之gRNA，其中核苷酸33至36中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 201經該第一內部連接子取代。
實施例109為如實施例107至108中任一者之gRNA，其中核苷酸32至37相對於SEQ ID NO: 201經該第一內部連接子取代。
實施例110為如實施例107至109中任一者之gRNA，其中核苷酸31至38相對於SEQ ID NO: 201經該第一內部連接子取代。
實施例111為如實施例107至110中任一者之gRNA，其中核苷酸30至39相對於SEQ ID NO: 201經該第一內部連接子取代。
實施例112為如實施例107至111中任一者之gRNA，其中核苷酸29至40相對於SEQ ID NO: 201經該第一內部連接子取代。
實施例113為如實施例107至112中任一者之gRNA，其中核苷酸55至56相對於SEQ ID NO: 201經該第二內部連接子取代。
實施例114為如實施例107至113中任一者之gRNA，其中相對於核苷酸50至53中之2、3或4者SEQ ID NO: 201經該第三內部連接子取代。
實施例115為如實施例107至114中任一者之gRNA，其中核苷酸49至54相對於SEQ ID NO: 201經該第三內部連接子取代。
實施例116為如實施例107至115中任一者之gRNA，其中核苷酸77至80相對於SEQ ID NO: 201缺失。
實施例117為一種引導RNA (gRNA)，其中該gRNA為單引導RNA (sgRNA)，其包含引導區及該引導區之3'的保守部分，其中保守部分包含重複反重複區、髮夾1區及髮夾2區，且進一步包含以下中之至少一者：
1) 第一內部連接子，其取代該sgRNA之該重複反重複區之上莖區的至少2個核苷酸；
2) 第二內部連接子，其取代該sgRNA之該髮夾1的1或2個核苷酸；或
3) 第三內部連接子，其取代該sgRNA之該髮夾2的至少2個核苷酸。
實施例118為如實施例117之gRNA，其中該sgRNA包含該第一內部連接子及該第二內部連接子。
實施例119為如實施例117之gRNA，其中該sgRNA包含該第一內部連接子及該第三內部連接子。
實施例120為如實施例117之gRNA，其中該sgRNA包含該第二內部連接子及該第三內部連接子。
實施例121為如實施例117之gRNA，其中該sgRNA包含該第一內部連接子、該第二內部連接子及該第三內部連接子。
實施例122為如實施例117至121中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子具有約9至30個原子、視情況約15至21個原子之橋接長度。
實施例123為如實施例117至122中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子位於該sgRNA之第一部分與該sgRNA之第二部分之間的髮夾中，其中該第一部分及該第二部分一起形成雙螺旋部分。
實施例124為如實施例117至123中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。
實施例125為如實施例117至124中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之環或其部分。
實施例126為如實施例117至125中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之該環及莖或其部分。
實施例127為如實施例117至126中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之該環的2、3或4個核苷酸。
實施例128為如實施例117至127中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之該環及該上莖區之莖的至少2、4、6或8個核苷酸。
實施例129為如實施例117至128中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之該環及該上莖區之莖的1、2、3或4個鹼基對。
實施例130為如實施例117至129中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代構成該上莖區之該環的所有核苷酸。
實施例131為如實施例117至130中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代構成該上莖區之該環及莖的所有核苷酸。
實施例132為如實施例117至131中任一者之gRNA，其中該第二內部連接子具有約6至18個原子、視情況約6至12個原子之橋接長度。
實施例133為如實施例117至132中任一者之gRNA，其中該第二內部連接子取代該sgRNA之該髮夾1的2個核苷酸。
實施例134為如實施例117至133中任一者之gRNA，其中該第二內部連接子取代該sgRNA之該連接區之莖區的2個核苷酸。
實施例135為如實施例117至134中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子具有約9至30個、視情況約12至21個原子之橋接長度。
實施例136為如實施例117至135中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子取代該gRNA之該髮夾2的4、6、8、10或12個核苷酸。
實施例137為如實施例117至136中任一者之gRNA，其中該第三連接子取代該gRNA之該髮夾2的1、2、3、4或5個鹼基對。
實施例138為如實施例117至137中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾2之環或其部分。
實施例139為如實施例117至138中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾2之該環及莖或其部分。
實施例140為如實施例117至139中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾2之該環的2、3或4個核苷酸。
實施例141為如實施例117至140中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾2之莖的至少1個核苷酸。
實施例142為如實施例117至141中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾2之莖的2、4或6個核苷酸。
實施例143為如實施例117至142中任一者之gRNA，其中該重複反重複區中之該第三內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾2之莖的1、2或3個鹼基對。
實施例144為如實施例117至143中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子取代構成該髮夾2之該環的所有核苷酸。
實施例145為如實施例117至144中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子位於該sgRNA之第一部分與該sgRNA之第二部分之間的髮夾中，其中該第一部分及該第二部分一起形成雙螺旋部分。
實施例146為如實施例117至145中任一者之gRNA，其中該gRNA為金黃色葡萄球菌(S. aureus) Cas9 (SauCas9)引導RNA，且不包括該第三內部連接子。
實施例147為如實施例117至146中任一者之gRNA，其中該gRNA為白喉棒狀桿菌(C. diphtheriae) Cas9 (CdiCas9)引導RNA、嗜熱鏈球菌(S. thermophilus) Cas9 (St1Cas9)引導RNA或解纖維熱酸菌(Acidothermus cellulolyticus) Cas9 (AceCas9)引導RNA。
實施例148為如實施例117至147中任一者之gRNA，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 202之序列。
實施例149為如實施例148之gRNA，其中核苷酸35至38中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 202經該第一內部連接子取代。
實施例150為如實施例148至149中任一者之gRNA，其中核苷酸34至39相對於SEQ ID NO: 202經該第一內部連接子取代。
實施例151為如實施例148至150中任一者之gRNA，其中核苷酸33至40相對於SEQ ID NO: 202經該第一內部連接子取代。
實施例152為如實施例148至151中任一者之gRNA，其中核苷酸32至41相對於SEQ ID NO: 202經該第一內部連接子取代。
實施例153為如實施例148至152中任一者之gRNA，其中核苷酸31至42相對於SEQ ID NO: 202經該第一內部連接子取代。
實施例154為如實施例148至153中任一者之gRNA，其中核苷酸61至62相對於SEQ ID NO: 202經該第二內部連接子取代。
實施例155為如實施例148至154中任一者之gRNA，其中核苷酸84至87中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 202經該第三內部連接子取代。
實施例156為如實施例148至155中任一者之gRNA，其中核苷酸83至88相對於SEQ ID NO: 202經該第三內部連接子取代。
實施例157為如實施例148至156中任一者之gRNA，其中核苷酸82至89相對於SEQ ID NO: 202經該第三內部連接子取代。
實施例158為如實施例148至157中任一者之gRNA，其中核苷酸81至90相對於SEQ ID NO: 202經該第三內部連接子取代。
實施例159為如實施例148至158中任一者之gRNA，其中核苷酸97至100相對於SEQ ID NO: 202缺失。
實施例160為一種引導RNA (gRNA)，其包含引導區及該引導區之3'的保守部分，其中該保守部分包含重複反重複區、髮夾1區及髮夾2區，且包含取代該重複反重複區之至少2個核苷酸的第一內部連接子及取代該髮夾2之至少2個核苷酸的第二內部連接子。
實施例161為如實施例160之gRNA，其中該第一內部連接子具有約9至30個原子、視情況約15至21個原子之橋接長度。
實施例162為如實施例160至161中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代該gRNA之該重複反重複區的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸。
實施例163為如實施例160至162中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子位於sgRNA之第一部分與該重複反重複區之第二部分之間的髮夾中，其中該第一部分及該第二部分一起形成雙螺旋部分。
實施例164為如實施例160至163中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代該重複反重複區之該髮夾之環或其部分。
實施例165為如實施例160至164中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代該重複反重複區之該髮夾之該環及莖或其部分。
實施例166為如實施例160至165中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代該重複反重複區之該髮夾之該環的1、2、3或4個核苷酸。
實施例167為如實施例160至166中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代該髮夾之該環及該重複反重複區之該髮夾之上莖的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個核苷酸。
實施例168為如實施例160至167中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代該髮夾之該環及該重複反重複區之該髮夾之上莖的1、2、3、4、5、6或7個鹼基對。
實施例169為如實施例160至168中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代構成該重複反重複區之該髮夾之該環的所有核苷酸。
實施例170為如實施例160至169中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代構成該重複反重複區之該髮夾之該環及上莖的所有核苷酸。
實施例171為如實施例160至169中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代構成該重複反重複區之該環的所有核苷酸；且該重複反重複區之該髮夾之上莖包含至少一個鹼基對，或不超過一個、兩個或三個鹼基對。
實施例172為如實施例160至171中任一者之gRNA，其中該第二內部連接子具有約9至30個、視情況約12至21個原子之橋接長度。
實施例173為如實施例160至172中任一者之gRNA，其中該第二內部連接子取代該gRNA之該髮夾2的2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。
實施例174為如實施例160至173中任一者之gRNA，其中該第二內部連接子取代該髮夾2之環區。
實施例175為如實施例160至174中任一者之gRNA，其中該第二內部連接子取代該髮夾2之環區及莖區之部分。
實施例176為如實施例160至175中任一者之gRNA，其中該第二內部連接子取代該髮夾2之環或其部分。
實施例177為如實施例160至176中任一者之gRNA，其中該第二內部連接子取代該髮夾2之該環及莖或其部分。
實施例178為如實施例160至177中任一者之gRNA，其中該第二內部連接子取代該髮夾2之該環的2、3或4個核苷酸。
實施例179為如實施例160至178中任一者之gRNA，其中該第二內部連接子取代構成該髮夾2之該環的所有核苷酸。
實施例180為如實施例160至179中任一者之gRNA，其中該第二內部連接子取代該髮夾2之該環及該髮夾2之莖的至少1、2、3、4、5或6個核苷酸。
實施例181為如實施例160至180中任一者之gRNA，其中該第二內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾2之莖的1、2或3個鹼基對。
實施例182為如實施例160至181中任一者之gRNA，其中該gRNA為St1Cas9引導RNA。
實施例183為如實施例160至182中任一者之gRNA，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 204之序列。
實施例184為如實施例183之gRNA，其中核苷酸41至44相對於SEQ ID NO: 204經該第一內部連接子取代。
實施例185為如實施例183至184中任一者之gRNA，其中核苷酸101至103相對於SEQ ID NO: 204經該第二內部連接子取代。
實施例186為如實施例183至185中任一者之gRNA，其中核苷酸100至104相對於SEQ ID NO: 204經該第二內部連接子取代。
實施例187為如實施例183至186中任一者之gRNA，其中核苷酸99至105相對於SEQ ID NO: 204經該第二內部連接子取代。
實施例188為如實施例183至187中任一者之gRNA，其中核苷酸98至106相對於SEQ ID NO: 204經該第二內部連接子取代。
實施例189為如實施例183至188中任一者之gRNA，其中核苷酸94至111內之2至18個核苷酸相對於SEQ ID NO: 204經取代。
實施例190為一種引導RNA (gRNA)，其包含引導區及該引導區之3'的保守部分，其中該保守部分包含重複反重複區及髮夾區，且包含取代該重複反重複區之至少2個核苷酸的內部連接子。
實施例191為如實施例190之gRNA，其中第一內部連接子具有約9至30個原子、視情況約12至21個原子之橋接長度。
實施例192為如實施例190或191中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代該gRNA之該重複反重複區的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。
實施例193為如實施例190至192中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子位於sgRNA之第一部分與該重複反重複區之第二部分之間的髮夾中，其中該第一部分及該第二部分一起形成雙螺旋部分。
實施例194為如實施例190至193中任一者之gRNA，其中該gRNA為空腸彎曲桿菌(C. jejuni) Cas9 (CjeCas9)引導RNA。
實施例195為如實施例190至194中任一者之gRNA，其中該gRNA為CjeCas9引導RNA，且該內部連接子僅存在於該gRNA之該重複反重複區中。
實施例196為如實施例190至195中任一者之gRNA，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 207之序列。
實施例197為如實施例196之gRNA，其中核苷酸33至36相對於SEQ ID NO: 207經該內部連接子取代。
實施例198為如實施例196至197中任一者之gRNA，其中核苷酸27至32及37至42中之1、2、3、4、5或6個鹼基對相對於SEQ ID NO: 207經該內部連接子取代。
實施例199為如實施例190至193中任一者之gRNA，其中該gRNA為新兇手弗朗西斯氏菌(Francisella novicida) Cas9 (FnoCas9)引導RNA。
實施例200為如實施例199之gRNA，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 208之序列。
實施例201為如實施例200之gRNA，其中核苷酸40至43中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 208經該內部連接子取代。
實施例202為如實施例200至201中任一者之gRNA，其中核苷酸39至44相對於SEQ ID NO: 208經該內部連接子取代。
實施例203為一種引導RNA (gRNA)，其包含重複反重複區及取代該重複反重複區之至少2個核苷酸的內部連接子。
實施例204為如實施例203之gRNA，其中該內部連接子具有約9至30個原子、視情況約15至21個原子之橋接長度。
實施例205為如實施例203至204中任一者之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該重複反重複區的2、3、4、5或6個核苷酸。
實施例206為如實施例203至205中任一者之組合物，其中該gRNA為Cpf1引導RNA。
實施例207為如實施例206之組合物，其中該Cpf1引導RNA為毛螺旋菌(
Lachnospiraceae bacterium) Cpf1 (LbCpf1)引導RNA或胺基酸球菌屬(
Acidaminococcus sp.) Cpf1 (AsCpf1)引導RNA。
實施例208為如實施例203至207中任一者之gRNA，其中sgRNA包含SEQ ID NO: 209之序列，且核苷酸11至14、或12至15、或視情況12至14相對於SEQ ID NO: 209經該內部連接子取代。
實施例209為如實施例203至205中任一者之組合物，其中該引導RNA為惰性真桿菌(Eubacterium siraeum) (EsCas13d)引導RNA。
實施例210為如實施例203至205及209中任一者之gRNA，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 210之序列，且核苷酸9至16、或視情況10至15、或其至少2個核苷酸相對於SEQ ID NO: 210經該內部連接子取代。
實施例211為如實施例1之gRNA，其中該內部連接子為第一內部連接子、第二內部連接子或第三內部連接子；且該gRNA包含引導區及保守區，該保守區包含以下中之一或多者：
(a)經縮短之重複/反重複區，其中該經縮短之重複/反重複區缺乏2至24個核苷酸，其中
(i)核苷酸37至64中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸36藉由第一內部連接子連接至核苷酸65，該第一內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸；或
(b)經縮短之髮夾1區，其中該經縮短之髮夾1缺乏2至10個、視情況2至8個核苷酸，其中
(i)核苷酸82至95中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸81藉由第二內部連接子連接至核苷酸96，該第二內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸；或
(c)經縮短之髮夾2區，其中該經縮短之髮夾2缺乏2至18個、視情況2至16個核苷酸，其中
(i)核苷酸113至134中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸112藉由第三內部連接子連接至核苷酸135，該第三內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸；
其中核苷酸144至145中之一者或兩者相比於SEQ ID NO: 500視情況缺失。
實施例212為一種引導RNA (gRNA)，其包含引導區及保守區，該保守區包含以下中之一或多者：
(a)經縮短之重複/反重複區，其中該經縮短之重複/反重複區缺乏2至24個核苷酸，其中
(i)核苷酸37至64中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸36藉由第一內部連接子連接至核苷酸65，該第一內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸；或
(b)經縮短之髮夾1區，其中該經縮短之髮夾1缺乏2至10個、視情況2至8個核苷酸，其中
(i)核苷酸82至95中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸81藉由第二內部連接子連接至核苷酸96，該第二內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸；或
(c)經縮短之髮夾2區，其中該經縮短之髮夾2缺乏2至18個、視情況2至16個核苷酸，其中
(i)核苷酸113至134中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸112藉由第三內部連接子連接至核苷酸135，該第三內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸；
其中核苷酸144至145中之一者或兩者相比於SEQ ID NO: 500視情況缺失；
其中該gRNA包含該第一內部連接子、該第二內部連接子及該第三內部連接子中之至少一者。
實施例213為如實施例211或212之gRNA，其中該gRNA包含該第一內部連接子、該第二內部連接子及該第三內部連接子中之至少兩者。
實施例214為如實施例211至213中任一者之gRNA，其中該gRNA包含該第一內部連接子、該第二內部連接子及該第三內部連接子。
實施例215為如實施例211至214中任一者之gRNA，其中至少10個核苷酸為經修飾核苷酸。
實施例216為如實施例211至215中任一者之gRNA，其中該引導區具有：(i)相對於SEQ ID NO: 500，位置1至24內一個核苷酸之插入或1至4個核苷酸之缺失；或(ii) 24個核苷酸之長度。
實施例217為如實施例211至216中任一者之gRNA，其中該引導區具有25、24、23、22、21或20個核苷酸之長度，視情況其中該引導區具有SEQ ID NO: 500之位置1至24處之25、24、23或22個核苷酸之長度。
實施例218為如實施例217之gRNA，其中該引導區具有SEQ ID NO: 500之位置1至24處之23或24個核苷酸之長度。
實施例219為如實施例211至218中任一者之gRNA，其中該gRNA進一步包含3'尾。
實施例220為如實施例219之gRNA，其中該3'尾包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。
實施例221為如實施例220之gRNA，其中該3'尾包含1、2、3、4或5個核苷酸。
實施例222為如實施例219至221中任一者之gRNA，其中該3'尾以包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸終止。
實施例223為如實施例219至222中任一者之gRNA，其中該3'尾之長度為1個核苷酸。
實施例224為如實施例219至223中任一者之gRNA，其中該3'尾由包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸組成。
實施例225為如實施例219至224中任一者之gRNA，其中該3'尾包含存在於該3'尾中之核苷酸中之任一者或多者的修飾。
實施例226為如實施例219至225中任一者之gRNA，其中該3'尾之該修飾為2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸及核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯中之一或多者。
實施例227為如前述實施例219至226中任一者之gRNA，其中該3'尾經完全修飾。
實施例228為如實施例211至227中任一者之gRNA，其中該gRNA之3'核苷酸為包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸。
實施例229為如實施例211至228中任一者之gRNA，其中核苷酸144及145中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失。
實施例230為如實施例211至229中任一者之gRNA，其中核苷酸144及145相對於SEQ ID NO: 500均缺失。
實施例231為如實施例211至218中任一者之gRNA，其中該gRNA不包含3'尾。
實施例232為如實施例211至231中任一者之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區缺乏2至28個核苷酸。
實施例233為如實施例211至232中任一者之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區具有24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸之長度。
實施例234為如實施例211至233中任一者之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區缺乏12至28個、視情況18至24個核苷酸。
實施例235為如實施例211至234中任一者之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區具有24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸之長度。
實施例236為如實施例211至235中任一者之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區具有24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34個核苷酸之長度。
實施例237為如實施例211至236中任一者之gRNA，其中SEQ ID NO: 500之核苷酸37至64形成上莖，且該經縮短之重複/反重複區之上莖的一或多個鹼基對缺失。
實施例238為如實施例211至237中任一者之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區之上莖包含不超過一個、兩個、三個或四個鹼基對。
實施例239為如實施例211至238中任一者之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區之上莖的位置39至48中之所有者及位置53至62中之所有者缺失，且視情況核苷酸38或63經取代。
實施例240為如實施例211至239中任一者之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區之上莖的位置38至63中之所有者缺失，且視情況核苷酸37或64經取代。
實施例241為如實施例211至240中任一者之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區之上莖的核苷酸37至64中之所有者缺失，且視情況核苷酸36或65經取代。
實施例242為如實施例211至241中任一者之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區具有長度為11個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
實施例243為如實施例211至242中任一者之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區具有單一雙螺旋部分。
實施例244為如實施例211至243中任一者之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區之上莖相對於SEQ ID NO: 500包括一或多個取代。
實施例245為如實施例211至244中任一者之gRNA，其中該第一內部連接子取代核苷酸49至52中之至少一部分或所有者。
實施例246為如實施例211至245中任一者之gRNA，其中核苷酸37至64中之所有者缺失，且該第一連接子將核苷酸36直接連接至核苷酸65。
實施例247為如實施例211至245中任一者之gRNA，其中核苷酸38至63中之所有者缺失，且該第一連接子將核苷酸37直接連接至核苷酸64。
實施例248為如實施例211至245中任一者之gRNA，其中核苷酸39至62中之所有者缺失，且該第一連接子將核苷酸38直接連接至核苷酸63。
實施例249為如實施例211至248中任一者之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區具有8至22個經修飾核苷酸。
實施例250為如實施例211至249中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區缺乏2至10個、視情況2至8個、或2至4個核苷酸。
實施例251為如實施例211至250中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區具有9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個核苷酸之長度。
實施例252為如實施例211至251中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區具有長度為4至8個、視情況7至8個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
實施例253為如實施例211至252中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區具有單一雙螺旋部分。
實施例254為如實施例211至253中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區之一個或兩個鹼基對缺失。
實施例255為如實施例211至254中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區之莖的長度為七個或八個鹼基配對核苷酸。
實施例256為如實施例211至255中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區的位置85至86中之一或多者及核苷酸91至92中之一或多者缺失。
實施例257為如實施例211至256中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區之核苷酸86及91缺失。
實施例258為如實施例211至257中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區的核苷酸82至95中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500經取代。
實施例259為如實施例211至258中任一者之gRNA，其中該第二內部連接子取代核苷酸87至90中之至少一部分或所有者。
實施例260為如實施例211至259中任一者之gRNA，其中該第二內部連接子取代核苷酸81至95中之至少一部分或所有者。
實施例261為如實施例211至260中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區具有2至15個經修飾核苷酸。
實施例262為如實施例211至261中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區缺乏2至18個、視情況2至16個核苷酸。
實施例263為如實施例211至262中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸之長度。
實施例264為如實施例211至263中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區具有24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34個核苷酸之長度。
實施例265為如實施例211至264中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區的位置113至121中之一或多者及核苷酸126至134中之一或多者缺失。
實施例266為如實施例211至265中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區包含不成對區。
實施例267為如實施例211至266中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區具有兩個雙螺旋部分。
實施例268為如實施例267之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區具有長度為4個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
實施例269為如實施例267至268之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區具有長度為4至8個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
實施例270為如實施例267至269之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區具有長度為4至6個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
實施例271為如實施例211至270中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區之上莖包含一個、兩個、三個或四個鹼基對。
實施例272為如實施例211至271中任一者之gRNA，其中核苷酸113與134、核苷酸114與133、核苷酸115與132、核苷酸116與131、核苷酸117與130、核苷酸118與129、核苷酸119與128、核苷酸120與127及核苷酸121與126中之至少一對缺失。
實施例273為如實施例211至272中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區的位置113至121及126至134中之所有者缺失。
實施例274為如實施例211至273中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區之核苷酸113至134中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500經取代。
實施例275為如實施例211至274中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子取代核苷酸122至125中之至少一部分或所有者。
實施例276為如實施例211至275中任一者之gRNA，其中該第三內部連接子取代核苷酸112至135中之至少一部分或所有者。
實施例277為如實施例211至276中任一者之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區具有2至15個經修飾核苷酸。
實施例278為如實施例1至277中任一者之gRNA，其中該gRNA之該引導區包含至少兩個經修飾核苷酸，視情況至少四個經修飾核苷酸。
實施例279為如實施例1至277中任一者之gRNA，其中該gRNA之該引導區包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個經修飾核苷酸，視情況1、2或3個經修飾核苷酸。
實施例280為如實施例1至279中任一者之gRNA，其中該gRNA之該引導區包含4、5、6、7、8、9、10、11或12個經修飾核苷酸。
實施例281為如實施例1至280中任一者之gRNA，其中該gRNA之該引導區包含6、7、8、9、10、11或12個經修飾核苷酸。
實施例282為如實施例1至281中任一者之gRNA，其中該gRNA包含5'端修飾。
實施例283為如實施例1至282中任一者之gRNA，其中該gRNA包含5'端修飾及3'端修飾。
實施例284為如實施例1至283中任一者之gRNA，其中該引導區在該引導區之前三個核苷酸之3'不包含經修飾核苷酸。
實施例285為如實施例211至277中任一者之gRNA，其中該引導區不包含經修飾核苷酸。
實施例286為如實施例1至285中任一者之gRNA，其中該gRNA包含3'端修飾。
實施例287為如實施例1至286中任一者之gRNA，其包含該重複/反重複區之該上莖區中之修飾。
實施例288為如實施例1至287中任一者之gRNA，其包含該髮夾1區中之修飾。
實施例289為如實施例1至288中任一者之gRNA，其包含該髮夾2區中之修飾。
實施例290為如實施例1至289中任一者之gRNA，其包含3'端修飾，且包含該重複/反重複區之該上莖區中之修飾。
實施例291為如實施例1至290中任一者之gRNA，其包含3'端修飾及該髮夾1區中之修飾。
實施例292為如實施例1至291中任一者之gRNA，其包含3'端修飾及該髮夾2區中之修飾。
實施例293為如實施例1至292中任一者之gRNA，其包含5'端修飾，且包含該重複/反重複區之該上莖區中之修飾。
實施例294為如實施例1至293中任一者之gRNA，其包含5'端修飾及該髮夾1區中之修飾。
實施例295為如實施例1至294中任一者之gRNA，其包含5'端修飾及該髮夾2區中之修飾。
實施例296為如實施例1至295中任一者之gRNA，其包含5'端修飾、該重複/反重複區之該上莖區中之修飾及3'端修飾。
實施例297為如實施例1至296中任一者之gRNA，其包含5'端修飾、該髮夾1區中之修飾及3'端修飾。
實施例298為如實施例1至297中任一者之gRNA，其包含5'端修飾、該髮夾1區中之修飾、該髮夾2區中之修飾及3'端修飾。
實施例299為如實施例1至298中任一者之gRNA，其包含5'端修飾、該重複/反重複區中之修飾、該髮夾1區中之修飾、該髮夾2區中之修飾及3'端修飾。
實施例300為如實施例282至299中任一者之gRNA，其中該5'端修飾包含選自以下之經修飾核苷酸：2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、反向無鹼基修飾之核苷酸或其組合。
實施例301為如實施例283至300中任一者之gRNA，其中該3'端修飾包含選自以下之經修飾核苷酸：2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、反向無鹼基修飾之核苷酸或其組合。
實施例302為如實施例282至301中任一者之gRNA，其中該5'端修飾包含以下中之任一者：
i. 前1、2、3或4個核苷酸中之任一者或多者之修飾；
ii. 一個經修飾核苷酸；
iii. 兩個經修飾核苷酸；
iv. 三個經修飾核苷酸；及
v. 四個經修飾核苷酸。
實施例303為如實施例282至302中任一者之gRNA，其中該5'端修飾包含以下中之一或多者：
i. 核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯；
ii. 2'-OMe修飾之核苷酸；
iii. 2'-O-moe修飾之核苷酸；
iv. 2'-F修飾之核苷酸；及
v. 反向無鹼基修飾之核苷酸。
實施例304為如實施例283至303中任一者之gRNA，其中該3'端修飾包含以下中之任一者：
i. 最後4、3、2或1個核苷酸中之任一者或多者之修飾；
ii. 一個經修飾核苷酸；
iii. 兩個經修飾核苷酸；
iv. 三個經修飾核苷酸；及
v. 四個經修飾核苷酸。
實施例305為如實施例283至304中任一者之gRNA，其中該3'端修飾包含以下中之一或多者：
i. 核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯；
ii. 2'-OMe修飾之核苷酸；
iii. 2'-O-moe修飾之核苷酸；
iv. 2'-F修飾之核苷酸；及
v. 反向無鹼基修飾之核苷酸。
實施例306為如實施例282至305中任一者之gRNA，其中該5'端修飾包含至少一個PS鍵聯，且其中存在以下中之一或多者：
i. 存在一個PS鍵聯，且該鍵聯介於第一個核苷酸與第二個核苷酸之間；
ii. 前三個核苷酸之間存在兩個PS鍵聯；
iii. 前四個核苷酸中之任一者或多者之間存在PS鍵聯；及
iv. 前五個核苷酸中之任一者或多者之間存在PS鍵聯。
實施例307為如實施例306之gRNA，其中該5'端修飾進一步包含至少一個2'-OMe、2'-O-moe、反向無鹼基或2'-F修飾之核苷酸。
實施例308為如實施例282至307中任一者之gRNA，其中該5'端修飾包含：
i. 前1至4個核苷酸中之一或多者的修飾，其中該修飾為PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合；
ii. 2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合對第一個核苷酸的修飾，及視情況存在的連至該3'尾之下一核苷酸或第一個核苷酸的一個或兩個PS鍵聯；
iii. 2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合對第一個或第二個核苷酸的修飾，及視情況存在的一或多個PS鍵聯；
iv. 2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合對第一個、第二個或第三個核苷酸的修飾，及視情況存在的一或多個PS鍵聯；或
v. 2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合對第一個、第二個、第三個或第四個核苷酸的修飾，及視情況存在的一或多個PS鍵聯。
實施例309為如實施例283至307中任一者之gRNA，其中該3'端修飾包含至少一個PS鍵聯，且其中存在以下中之一或多者：
i. 存在一個PS鍵聯，且該鍵聯介於最後一個核苷酸與倒數第二個核苷酸之間；
ii. 最後三個核苷酸之間存在兩個PS鍵聯；及
iii. 最後四個核苷酸中之任一者或多者之間存在PS鍵聯。
實施例310為如實施例309之gRNA，其中該3'端修飾進一步包含至少一個2'-OMe、2'-O-moe、反向無鹼基或2'-F修飾之核苷酸。
實施例311為如實施例283至310中任一者之gRNA，其中該3'端修飾包含：
最後1至4個核苷酸中之一或多者的修飾，其中該修飾為PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合；
2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個核苷酸的修飾，及視情況存在的連至該3'尾之下一核苷酸或第一個核苷酸的一個或兩個PS鍵聯；
2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個或倒數第二個核苷酸的修飾，及視情況存在的一或多個PS鍵聯；
2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個、倒數第二個或倒數第三個核苷酸的修飾，及視情況存在的一或多個PS鍵聯；或
2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個、倒數第二個、倒數第三個或倒數第四個核苷酸的修飾，及視情況存在的一或多個PS鍵聯。
實施例312為如實施例287至311中任一者之gRNA，其中該重複/反重複區、該髮夾1區或該髮夾2區中之修飾包含選自以下之經修飾核苷酸：2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯或其組合。
實施例313為如實施例287至312中任一者之gRNA，其中該重複/反重複區、該髮夾1區或該髮夾2區中之修飾包含選自以下之經修飾核苷酸：2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯或其組合。
實施例314為如實施例287至313中任一者之gRNA，其中該重複/反重複區、該髮夾1區或該髮夾2區中之修飾包含選自以下之經修飾核苷酸：2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸及核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯或其組合。
實施例315為如實施例1至314中任一者之gRNA，其中該引導區之核苷酸1至3經修飾，且該引導區中除核苷酸1至3以外的核苷酸未經修飾。
實施例316為如實施例1至315中任一者之gRNA，其中核苷酸144之3'尾存在於該gRNA中，且包含核苷酸141至144處之2'-O-Me修飾之核苷酸及分別在核苷酸141至142及142至143之間的兩個PS鍵聯。
實施例317為一種單引導RNA (sgRNA)，其包含如表4A中所示之SEQ ID NO: 1001-1012或任何其他序列中之任一者。
實施例318為如實施例1至317中任一者之gRNA，其包含與如表4A中所示之SEQ ID No: 1001-1012或任何其他序列中之任一者之核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%或70%一致性的核苷酸序列。
實施例319為如實施例1至317中任一者之gRNA，其包含與如表4A至4B中所示之SEQ ID No: 1001-1002及710-759中之任一者之核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%或70%一致性的核苷酸序列，其中與表4A中之參考序列標識符之核苷酸對應的該gRNA之各核苷酸處的修飾與表4B中之參考序列標識符中所示的修飾一致或等效。
實施例320為如實施例1至319中任一者之gRNA，其包含與如表4A至4B中所示之SEQ ID No: 1001-1002及710-759中之任一者之核苷酸序列的X至3'端之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的核苷酸序列，其中X為保守區之第一個核苷酸。
實施例321為如實施例1至230及232至320中任一者之gRNA，其進一步包含含有2'-O-Me修飾之核苷酸的3'尾。
實施例322為如實施例1至321中任一者之gRNA，其中該gRNA將核酸酶引導至目標序列以進行結合。
實施例323為如實施例1至322中任一者之gRNA，其中該gRNA將核酸酶引導至目標序列以在該目標序列內誘導雙股斷裂。
實施例324為如實施例1至323中任一者之gRNA，其中該gRNA將核酸酶引導至目標序列以在該目標序列內誘導單股斷裂。
實施例325為如實施例322至324中任一者之gRNA，其中該核酸酶為NmeCas9。
實施例326為如實施例325之組合物，其中該Nme Cas9為Nme1 Cas9、Nme2 Cas9或Nme3 Cas9。
實施例327為如前述實施例中任一者之gRNA，其中該gRNA包含保守取代，例如以保持鹼基配對。
實施例328為如實施例1至327中任一者之gRNA，其中該內部連接子具有約6埃(Angstrom)至37埃之橋接長度。
實施例329為如實施例1至328中任一者之gRNA，其中該內部連接子包含1至10個彼此共價連接的乙二醇次單元。
實施例330為如實施例1至329中任一者之gRNA，其中該內部連接子包含至少兩個彼此共價連接的乙二醇次單元。
實施例331為如實施例1至330中任一者之gRNA，其中該內部連接子包含3至10個彼此共價連接的乙二醇次單元。
實施例332為如實施例1至331中任一者之gRNA，其中該內部連接子包含3至6個彼此共價連接的乙二醇次單元。
實施例333為如實施例1至332中任一者之gRNA，其中該內部連接子包含3個彼此共價連接的乙二醇次單元。
實施例334為如實施例1至333中任一者之gRNA，其中該內部連接子包含6個彼此共價連接的乙二醇次單元。
實施例335為如實施例1至334中任一者之gRNA，其中該內部連接子包含式(I)之結構：
~-L0-L1-L2-#
(I)
其中：
~指示連至前一核苷酸之3'取代基的鍵；
#指示連至後一核苷酸之5'取代基的鍵；
L0為空值或C1-3脂族基；
L1為-[E1-(R1)]m-，其中
各R1獨立地為視情況經1或2個E2取代之C1-5脂族基團，
各E1及E2獨立地為氫鍵受體，或各自獨立地選自環烴及雜環烴，且
各m為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；且
L2為空值、C1-3脂族基，或為氫鍵受體。
實施例336為如實施例335之gRNA，其中m為6、7、8、9或10。
實施例337為如實施例335至336中任一者之gRNA，其中m為1、2、3、4或5。
實施例338為如實施例335至337中任一者之gRNA，其中m為1、2或3。
實施例339為如實施例335至338中任一者之gRNA，其中L0為空值。
實施例340為如實施例335至338中任一者之gRNA，其中L0為-CH
2-或-CH
2CH
2-。
實施例341為如實施例335至340中任一者之gRNA，其中L2為空值。
實施例342為如實施例335至340中任一者之gRNA，其中L2為-O-、-S-、-CH
2-或-CH
2CH
2-。
實施例343為如實施例335至342中任一者之gRNA，其中該式(I)結構中自~至#之路徑上的最短原子鏈中之原子數目為30或更小、27或更小、24或更小、21或更小，或為18或更小，或為15或更小，或為12或更小，或為10或更小。
實施例344為如實施例335至343中任一者之gRNA，其中該式(I)結構中自~至#之路徑上的最短原子鏈中之原子數目為6至30、視情況9至30、視情況9至21。
實施例345為如實施例335至344中任一者之gRNA，其中該式(I)結構中自~至#之路徑上的最短原子鏈中之原子數目為9。
實施例346為如實施例335至344中任一者之gRNA，其中該式(I)結構中自~至#之路徑上的最短原子鏈中之原子數目為18。
實施例347為如實施例335至346中任一者之gRNA，其中各C1-3脂族基團及C1-5脂族基團為飽和的。
實施例348為如實施例335至346中任一者之gRNA，其中至少一個C1-5脂族基團為C1-4伸烷基，或其中至少兩個C1-5脂族基團為C1-4伸烷基，或其中至少三個C1-5脂族基團為C1-4伸烷基。
實施例349為如實施例335至348中任一者之gRNA，其中至少一個R1係選自-CH
2-、-CH
2CH
2-、-CH
2CH
2CH
2-或-CH
2CH
2CH
2CH
2-。
實施例350為如實施例335至348中任一者之gRNA，其中各R1獨立地選自-CH
2-、-CH
2CH
2-、-CH
2CH
2CH
2-或-CH
2CH
2CH
2CH
2-。
實施例351為如實施例335至350中任一者之gRNA，其中各R1為-CH
2CH
2-。
實施例352為如實施例335至351中任一者之gRNA，其中至少一個C1-5脂族基團為C1-4伸烯基，或其中至少兩個C1-5脂族基團為C1-4伸烯基，或其中至少三個C1-5脂族基團為C1-4伸烯基。
實施例353為如實施例335至352中任一者之gRNA，其中至少一個R1係選自-CHCH-、-CHCHCH
2-或-CH
2CHCHCH
2-。
實施例354為如實施例335至353中任一者之gRNA，其中各E1獨立地選自-O-、-S-、-NH-、-NR-、-C(O)-O-、-OC(O)O-、-C(O)-NR-、-OC(O)-NR-、-NC(O)-NR-、-P(O)
2O-、-OP(O)
2O-、-OP(R)(O)O-、-OP(O)(S)O-、-S(O)
2-、環烴及雜環烴。
實施例355為如實施例335至354中任一者之gRNA，其中各E1獨立地選自-O-、-S-、-NH-、-NR-、-C(O)-O-、-OC(O)O-、-P(O)
2O-、-OP(O)
2O-及-OP(R)(O)O。
實施例356為如實施例335至355中任一者之gRNA，其中各E1為-O-。
實施例357為如實施例335至355中任一者之gRNA，其中各E1為-S-。
實施例358為如實施例335至357中任一者之gRNA，其中R1中之至少一個C1-5脂族基團視情況經一個E2取代。
實施例359為如實施例335至358中任一者之gRNA，其中各E2獨立地選自-OH、-OR、-ROR、-SH、-SR、-C(O)-R、-C(O)-OR、-OC(O)-OR、-C(O)-H、-C(O)-OH、-OPO
3、-PO
3、-RPO
3、-S(O)
2-R、-S(O)
2-OR、-RS(O)
2-R、-RS(O)
2-OR、-SO
3、環烴及雜環烴。
實施例360為如實施例335至359中任一者之gRNA，其中各E2獨立地選自-OH、-OR、-SH、-SR、-C(O)-R、-C(O)-OR、-OC(O)-OR、-OPO
3、-PO
3、-RPO
3及-SO
3。
實施例361為如實施例335至360中任一者之gRNA，其中各E2為-OH或-OR。
實施例362為如實施例335至360中任一者之gRNA，其中各E2為-SH或-SR。
實施例363為如實施例335至362中任一者之gRNA，其中該內部連接子包含PEG-連接子。
實施例364為如實施例335至363中任一者之gRNA，其中該內部連接子包含具有1至10個乙二醇單元之PEG-連接子。
實施例365為如實施例335至364中任一者之gRNA，其中該內部連接子包含具有3至6個乙二醇單元之PEG-連接子。
實施例366為如實施例335至365中任一者之gRNA，其中該內部連接子包含具有3個乙二醇單元之PEG-連接子。
實施例367為如實施例335至365中任一者之gRNA，其中該內部連接子包含具有6個乙二醇單元之PEG-連接子。
實施例368為如實施例1至367中任一者之gRNA，其中該gRNA為包含經縮短之保守部分的短引導RNA，且該內部連接子取代至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。
實施例369為如實施例1至210或278至368中任一者之gRNA，其中該gRNA為包含sgRNA之保守部分的短單引導RNA (短sgRNA)，該保守部分包含髮夾區，其中該髮夾區缺乏至少5至10個核苷酸。
實施例370為如實施例369之gRNA，其中該至少5至10個所缺乏核苷酸為連續的。
實施例371為如實施例369至370中任一者之gRNA，其中該至少5至10個所缺乏核苷酸
i. 位於髮夾1內；
ii. 位於髮夾1內及相對於SEQ ID NO: 400之髮夾1與髮夾2之間的「N」；
iii. 位於髮夾1內及緊鄰髮夾1之3'的兩個核苷酸；
iv. 包括髮夾1之至少一部分；
v. 位於髮夾2內；
vi. 包括髮夾2之至少一部分；
vii. 位於髮夾1及髮夾2內；
viii. 包括髮夾1之至少一部分且包括相對於SEQ ID NO: 400之髮夾1與髮夾2之間的「N」；
ix. 包括髮夾2之至少一部分且包括相對於SEQ ID NO: 400之髮夾1與髮夾2之間的「N」；
x. 包括髮夾1之至少一部分，包括相對於SEQ ID NO: 400之髮夾1與髮夾2之間的「N」，且包括髮夾2之至少一部分；
xi. 位於髮夾1或髮夾2內，視情況包括相對於SEQ ID NO: 400之髮夾1與髮夾2之間的「N」；
xii. 為連續的；
xiii. 為連續的且包括相對於SEQ ID NO: 400之髮夾1與髮夾2之間的「N」；
xiv. 為連續的且跨越髮夾1之至少一部分及髮夾2之一部分；
xv. 為連續的且跨越髮夾1之至少一部分及相對於SEQ ID NO: 400之髮夾1與髮夾2之間的「N」；或
xvi. 為連續的且跨越髮夾1之至少一部分及緊鄰髮夾1之3'的兩個核苷酸。
實施例372為如實施例1至210或278至371中任一者之gRNA，其中該gRNA為包含sgRNA之保守部分的短單引導RNA (短sgRNA)，該保守部分包含髮夾區，其中該髮夾區缺乏至少5至10個核苷酸，且其中該短sgRNA包含5'端修飾或3'端修飾。
實施例373為如實施例1至210或278至372中任一者之gRNA，其中該至少5至10個核苷酸包含SEQ ID NO:400之核苷酸54至61、SEQ ID NO:400之核苷酸53至60；或SEQ ID NO:400之核苷酸54至58，視情況其中該短sgRNA包含至少H1-1至H1-5及H2-1至H2-12之修飾。
實施例374為如實施例1至210或278至373中任一者之gRNA，其包含經縮短之髮夾1區或經取代且視情況經縮短之髮夾1區，其中
(i)以下核苷酸對中之至少一者在該經取代且視情況經縮短之髮夾1中經華特生-克里克(Watson-Crick)配對核苷酸取代：H1-1與H1-12、H1-2與H1-11、H1-3與H1-10或H1-4與H1-9，且該髮夾1區視情況缺乏
(aa) H1-5至H1-8中之任一者或兩者，
(bb)以下核苷酸對中之一者、兩者或三者：H1-1與H1-12、H1-2與H1-11、H1-3與H1-10或H1-4與H1-9，或
(cc)該髮夾1區之1至8個核苷酸；或
(ii)該經縮短之髮夾1區缺乏6至8個核苷酸，較佳6個核苷酸；且
(aa)位置H1-1、H1-2或H1-3中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400缺失或經取代，或
(bb)位置H1-6至H1-10中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400經取代；或
(iii)相對於SEQ ID NO: 400，該經縮短之髮夾1區缺乏5至10個核苷酸，較佳5至6個核苷酸，且位置N18、H1-12或n中之一或多者經取代。
實施例375為如實施例1至210或278至374中任一者之gRNA，其包含經縮短之上莖區，其中相對於SEQ ID NO: 400，該經縮短之上莖區缺乏1至6個核苷酸，且其中該經縮短之上莖區的6、7、8、9、10或11個核苷酸包括少於或等於4個取代。
實施例376為如實施例1至210或278至375中任一者之gRNA，其在LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2及H2-14中之任一者或多者處包含相對於SEQ ID NO: 400之取代，其中該經取代核苷酸既不為後接腺嘌呤之嘧啶，亦不為前接嘧啶之腺嘌呤。
實施例377為如實施例374之gRNA，其中該縮短且經取代之髮夾1缺乏1至4個核苷酸，且核苷酸H1-4至H1-9經內部連接子取代。
實施例378為如實施例374之gRNA，其中該縮短且經取代之髮夾1缺乏以下核苷酸對中之一者或兩者：H1-1及H1-12、H1-2及H1-11或H1-3及H1-10；且核苷酸H1-4至H1-9經內部連接子取代。
實施例379為如實施例1至210或278至378中任一者之gRNA，其包含上莖區，其中上莖修飾包含該上莖區中之US1至US12中之任一者或多者的修飾。
實施例380為如實施例1至210或278至379中任一者之gRNA，其包含經縮短之上莖區，其中該經縮短之上莖區缺乏1至6個核苷酸。
實施例381為如實施例1至210或278至379中任一者之gRNA，其包含經縮短之上莖區，其中該經縮短之上莖區缺乏7至10個核苷酸，且2個核苷酸經內部連接子取代。
實施例382為如實施例381之gRNA，其中莖不包含上莖雙螺旋部分。
實施例383為如實施例381或382之gRNA，其中該內部連接子具有約3至30個原子、視情況12至21個原子、6至18個原子或6至12個原子之橋接長度。
實施例384為如前述實施例中任一者之gRNA，其中該gRNA包含修飾。
實施例385為如實施例384之引導RNA，其中該修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸、2'-H修飾之核苷酸(DNA)、2'-O,4'-C-伸乙基修飾之核苷酸(ENA)、鎖定核苷酸(LNA)或非鎖定核苷酸(UNA)。
實施例386為如實施例384或385之引導RNA，其中該修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。
實施例387為如實施例384至386中任一者之引導RNA，其中該引導RNA為sgRNA，且該修飾包含該引導RNA之5'端處的五個核苷酸中之一或多者處的修飾。
實施例388為如實施例384至387中任一者之引導RNA，其中該引導RNA為sgRNA，且該修飾包含該引導RNA之3'端處的五個核苷酸中之一或多者處的修飾。
實施例389為如實施例384至388中任一者之引導RNA，其中該引導RNA為sgRNA，且該修飾包含該引導RNA之5'端處的四個核苷酸中之各者之間的PS鍵。
實施例390為如實施例384至389中任一者之引導RNA，其中該引導RNA為sgRNA，且該修飾包含該引導RNA之3'端處的四個核苷酸中之各者之間的PS鍵。
實施例391為如實施例384至389中任一者之引導RNA，其中該引導RNA為sgRNA，且該修飾包含該引導RNA之5'端處的前三個核苷酸中之各者處的2'-O-Me修飾之核苷酸。
實施例392為如實施例384至390中任一者之引導RNA，其中該引導RNA為sgRNA，且該修飾包含該引導RNA之3'端處的最後三個核苷酸中之各者處的2'-O-Me修飾之核苷酸。
實施例393為如前述實施例中任一者之gRNA，其中該gRNA之3'核苷酸為具有尿嘧啶鹼基之核苷酸。
實施例394為如前述實施例中任一者之gRNA，其中該gRNA包含3'尾。
實施例395為如實施例394之gRNA，其中該3'尾包含至少1至10個核苷酸。
實施例396為如實施例394至395中任一者之gRNA，其中該3'尾以具有尿嘧啶鹼基之核苷酸終止。
實施例397為如實施例394至396中任一者之gRNA，其中該3'尾之長度為1個核苷酸且為具有尿嘧啶鹼基之核苷酸。
實施例398為如實施例394至397中任一者之gRNA，其中該3'尾包含存在於該3'尾中之核苷酸中之任一者或多者的修飾。
實施例399為如實施例393至398之gRNA，其中該3'尾經完全修飾。
實施例400為如實施例1至393中任一者之gRNA，其中該gRNA不包含3'尾。
實施例401為如前述實施例中任一者之gRNA，其中該gRNA包含3'端修飾或5'端修飾。
實施例402為如前述實施例中任一者之gRNA，其中該gRNA包含5'端修飾及3'端修飾。
實施例403為如實施例401至402中任一者之gRNA，其中該3'或5'端修飾包含保護性端修飾，視情況為選自以下之經修飾核苷酸：2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、反向無鹼基修飾之核苷酸或其組合。
實施例404為如實施例401至403中任一者之gRNA，其中該3'或5'端修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸。
實施例405為如實施例401至404中任一者之gRNA，其中該3'或5'端修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。
實施例406為如實施例401至405中任一者之gRNA，其中該3'或5'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
實施例407為如實施例401至406中任一者之gRNA，其中該3'或5'端修飾包含或進一步包含反向無鹼基修飾之核苷酸。
實施例408為如前述實施例中任一者之gRNA，其包含髮夾區或該髮夾區中之修飾。
實施例409為如實施例408之gRNA，其包含該髮夾區中之修飾，其中該髮夾區中之該修飾包含選自以下之經修飾核苷酸：2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯或其組合。
實施例410為如實施例408或409之gRNA，其進一步包含3'端修飾。
實施例411為如實施例408或409之gRNA，其進一步包含3'端修飾及5'端修飾。
實施例412為如實施例408或409之gRNA，其進一步包含5'端修飾。
實施例413為如實施例408至412中任一者之gRNA，其中該髮夾區中之該修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸。
實施例414為如實施例408至413中任一者之gRNA，其中該髮夾區中之該修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。
實施例415為如前述實施例中任一者之gRNA，其包含上莖區或該上莖區中之修飾。
實施例416為如實施例415之gRNA，其中上莖修飾包含以下中之任一者或多者：
i. 該上莖區中之US1至US12 (對應於SEQ ID NO: 400之核苷酸9至20)中之任一者或多者的修飾；及
ii. 該上莖區中之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或所有12個核苷酸的修飾。
實施例417為如實施例415或416之gRNA，其中該上莖修飾包含以下中之一或多者：
i. 2'-OMe修飾之核苷酸；
ii. 2'-O-moe修飾之核苷酸；
iii. 2'-F修飾之核苷酸；
iv. 2'-H修飾之核苷酸(DNA)；
v. 2'-O,4'-C-伸乙基修飾之核苷酸(ENA)；
vi. 鎖定核苷酸(LNA)；
vii. 非鎖定核苷酸(UNA)；及
viii. (i.)至(vii.)中之一或多者的組合。
實施例418為如前述實施例中任一者之gRNA，其中該修飾包含YA修飾。
實施例419為如前述實施例中任一者之gRNA，其包含一或多個引導區YA位點之YA修飾。
實施例420為如實施例418至419中任一者之gRNA，其中該YA修飾包含YA位點之嘧啶經非嘧啶之取代。
實施例421為如實施例418至419中任一者之gRNA，其中該YA修飾包含YA位點之腺嘌呤經非腺嘌呤之取代。
實施例422為如實施例418至421中任一者之gRNA，其包含YA修飾，其中該修飾包含2'-氟、2'-H、2'-OMe、ENA、UNA、肌苷或PS修飾。
實施例423為如前述實施例中任一者之gRNA，其包含一或多個保守區YA位點之YA修飾。
實施例424為如前述實施例中任一者之gRNA，其中該YA修飾包含
(i) 2'-OMe修飾，視情況屬於該YA位點之嘧啶；
(ii) 2'-氟修飾，視情況屬於該YA位點之嘧啶；或
(iii) PS修飾，視情況屬於該YA位點之嘧啶。
實施例425為如實施例61至210或278至424中任一者之gRNA，其包含與SEQ ID NO: 1-8、20-75、77-84、101-108、120-175及177-184中之任一者之核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%或70%一致性的核苷酸序列。
實施例426為如實施例61至210或278至425中任一者之gRNA，其包含與SEQ ID No: 1-8、20-75、77-92、101-108及120-175及177-184中之任一者之核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%或70%一致性的核苷酸序列，其中與表2A中之參考序列標識符之核苷酸對應的該gRNA之各核苷酸處的修飾與表2B中之參考序列標識符中所示的修飾一致或等效。
實施例427為一種引導RNA (gRNA)，其包含SEQ ID NO: 1-8及20-75及77-84中之任一者。
實施例428為如前述實施例中任一者之gRNA，其包括針對表2A或表2B中之引導RNA所闡述的修飾。
實施例429為一種引導RNA (gRNA)，其包含SEQ ID NO: 101-108及120-175及177-184中之任一者，包括表2A或表2B之修飾。
實施例430為一種單引導RNA (sgRNA)，其包含如表2A至2C中所示之SEQ ID NO: 211-230或任何其他序列中之任一者。
實施例431為如前述實施例中任一者之gRNA，其包含與如表2A至2C中所示之SEQ ID No: 211-230或任何其他序列中之任一者之核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%或70%一致性的核苷酸序列。
實施例432為如前述實施例中任一者之gRNA，其包含與如表2A至2C中所示之SEQ ID NO: 101-108、120-175、177-184、211-230中之任一者之核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%或70%一致性的核苷酸序列，其中與表2C中之參考序列標識符之核苷酸對應的該gRNA之各核苷酸處的修飾與表2A或2B中之參考序列標識符中所示的修飾一致或等效。
實施例433為如前述實施例中任一者之gRNA，其包含與如表2A至2C中所示之SEQ ID NO: 101-108、120-175、177-184及211-230中之任一者之核苷酸序列的X至3'端之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的核苷酸序列，其中X為保守區之第一個核苷酸。
實施例434為如前述實施例中任一者之gRNA，其中該gRNA與脂質奈米顆粒(LNP)締合。
實施例435為一種組合物，其包含如前述實施例中任一者之gRNA。
實施例436為一種組合物，其包含與脂質奈米顆粒(LNP)締合的如實施例1至434中任一者之gRNA。
實施例437為一種組合物，其包含如實施例1至434中任一者之gRNA，或如實施例435至436中任一者之組合物，其進一步包含核酸酶或編碼該核酸酶之mRNA。
實施例438為一種LNP組合物，其包含如實施例1至434中任一者之gRNA。
實施例439為一種LNP組合物，其包含如實施例63至116及278至433中任一者之gRNA及編碼SpyCas9之mRNA。
實施例440為一種LNP組合物，其包含如實施例117至159及278至433中任一者之gRNA及編碼SauCas9之mRNA。
實施例441為一種LNP組合物，其包含如實施例160至189及278至433中任一者之gRNA及編碼St1Cas9之mRNA。
實施例442為一種LNP組合物，其包含如實施例190至202及278至433中任一者之gRNA及編碼CjeCas9或FnoCas9之mRNA。
實施例443為一種LNP組合物，其包含如實施例203至210及278至433中任一者之gRNA及編碼AsCpf1、LbCpf1或EsCas13d之mRNA。
實施例444為如實施例438至443中任一者之LNP組合物，其中該LNP包含十八碳-9,12-二烯酸(9z,12z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯或8-((7,7-雙(辛氧基)庚基)(2-羥乙基)胺基)辛酸壬酯。
實施例445為如實施例438至444中任一者之組合物，其中該LNP包含約4.5至6.5之陽離子脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)之莫耳比，視情況約6.0之N:P。
實施例446為如實施例438至445之組合物，其中該核酸酶包含蛋白質或編碼該核酸酶之核酸。
實施例447為如實施例446之組合物，其中該核酸酶為Cas核酸酶。
實施例448為如實施例447之組合物，其中該Cas核酸酶為Cas9。
實施例449為如實施例448之組合物，其中該Cas9為化膿鏈球菌Cas9 (SpyCas9)。
實施例450為如實施例448之組合物，其中該Cas9為金黃色葡萄球菌Cas9 (SauCas9)。
實施例451為如實施例448之組合物，其中該Cas9為白喉棒狀桿菌Cas9 (CdiCas9)。
實施例452為如實施例448之組合物，其中該Cas9為嗜熱鏈球菌Cas9 (St1Cas9)。
實施例453為如實施例448之組合物，其中該Cas9為解纖維熱酸菌Cas9 (AceCas9)。
實施例454為如實施例448之組合物，其中該Cas9為空腸彎曲桿菌Cas9 (CjeCas9)。
實施例455為如實施例448之組合物，其中該Cas9為沼澤紅假單胞菌(
R. palustris) Cas9 (RpaCas9)。
實施例456為如實施例448之組合物，其中該Cas9為深紅紅螺菌(
R. rubrum) Cas9 (RruCas9)。
實施例457為如實施例448之組合物，其中該Cas9為納士放線菌(
A. naeslundii) Cas9 (AnaCas9)。
實施例458為如實施例448之組合物，其中該Cas9為新兇手弗朗西斯氏菌Cas9 (FnoCas9)。
實施例459為如實施例448之組合物，其中該Cas核酸酶為Cpf1。
實施例460為如實施例459之組合物，其中該Cpf1為毛螺旋菌Cpf1 (LbCpf1)，或該Cpf1為胺基酸球菌屬Cpf1 (AsCpf1)。
實施例461為如實施例448之組合物，其中Cas蛋白為惰性真桿菌Cas13d (EsCas13d)。
實施例462為如實施例448之組合物，其中該Cas9為Nme Cas9。
實施例463為如實施例462之組合物，其中該Cas9為Nme1 Cas9、Nme2 Cas9或Nme3 Cas9。
實施例464為如實施例439至463中任一者之組合物，其中該核酸酶為裂解酶、切口酶或無催化活性之核酸酶，或為包含去胺酶之融合蛋白。
實施例465為如實施例439至464中任一者之組合物，其中該核酸酶經修飾。
實施例466為如前一實施例之組合物，其中該經修飾核酸酶包含核定位信號(NLS)。
實施例467為如實施例439至466之組合物，其中編碼該核酸酶之該核酸係選自：
a. DNA編碼序列；
b. 具有開放閱讀框架(ORF)之mRNA；
c. 表現載體中之編碼序列；
d. 病毒載體中之編碼序列。
實施例468為如前一實施例之組合物，其中該mRNA包含SEQ ID NO: 321-323、361、363-372及374-382中之任一者之序列。
實施例469為一種醫藥調配物，其包含如實施例1至434中任一者之gRNA或如實施例435至468中任一者之組合物及醫藥學上可接受之載劑。
實施例470為一種修飾目標DNA之方法，其包含將以下中之任一者或多者遞送至細胞：i.如實施例1至434中任一者之gRNA；ii.如實施例435至468中任一者之組合物；及iii.如實施例469之醫藥調配物。
實施例471為如實施例470之方法，其中該gRNA包含不超過120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45或40個核苷酸。
實施例472為如實施例470或471之方法，其中該方法引起基因之插入或缺失。
實施例473為如實施例472之方法，其中該方法引起鹼基編輯之插入或缺失。
實施例474為如實施例470至473中任一者之方法，其進一步包含將模板遞送至該細胞，其中該模板之至少一部分在Cas蛋白所誘導之雙股斷裂位點處或附近併入至目標DNA中。
實施例475為如實施例1至434中任一者之gRNA，如實施例435至468之組合物，或如實施例469之醫藥調配物，其用於製備供治療疾病或病症所用的藥劑。
實施例476為如實施例1至427中任一者之gRNA、如實施例435至468之組合物或如實施例469之醫藥調配物的用途，其用於製造治療疾病或病症的藥劑。
實施例477為一種化學合成的gRNA，其包含內部連接子。
實施例478為一種組合物，其包含如實施例1至434中任一者之gRNA，其中該組合物不包含該gRNA之非連接部分。
實施例479為一種固體載體，其共價連接至如實施例1至434中任一者之gRNA之連接子。
實施例480為一種合成包含內部連接子之gRNA的方法，其中該方法為單合成製程。
實施例481為一種合成gRNA之方法，其中內部連接子在合成期間沿線併入。
實施例482為一種合成gRNA之方法，其使用一系列連續偶合反應，其中該等反應包含：
a)用於第一核苷酸與第二核苷酸之共價連接的偶合反應；
b)用於內部連接子與該第二核苷酸之共價連接的偶合反應；及
c)用於第三核苷酸與該內部連接子之共價連接的偶合反應，
其中用於該等共價連接之偶合反應全部相同。
實施例483為如實施例482之方法，其中使用胺基亞磷酸酯化學方法進行共價連接。
實施例484為如前述實施例中任一者之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該gRNA係化學合成的。
實施例485為如前述實施例中任一者之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該內部連接子在該gRNA之化學合成期間經由偶合反應併入該gRNA中。
實施例486為如前述實施例中任一者之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其係藉由包含添加該內部連接子之製程，藉由使包含胺基亞磷酸酯部分之連接子與核苷殘基反應來製備。
實施例487為如前一實施例之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該製程進一步包含使包含胺基亞磷酸酯部分之核苷酸與該連接子反應。
實施例488為如前述實施例中任一者之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該內部連接子藉由磷酸二酯或硫代磷酸酯鍵共價接合至相鄰核苷酸。
實施例489為如前述實施例中任一者之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該內部連接子中不存在尿素。
實施例490為如前述實施例中任一者之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該內部連接子不位於該gRNA之該重複反重複區中。
實施例491為如前述實施例中任一者之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該gRNA包含不位於該引導物之重複反重複中的內部連接子。
實施例492為如前述實施例中任一者之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該gRNA為sgRNA。
實施例493為如前述實施例中任一者之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該內部連接子橋接雙螺旋區且取代2至12個核苷酸。
實施例494為如前述實施例中任一者之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該gRNA在單合成中製得。
本申請案主張2021年6月10日申請之美國臨時申請案第63/209,273號及2021年11月3日申請之美國臨時申請案第63/275,427號的優先權益，該等申請案中之各者之內容以全文引用的方式併入。
本文提供用於基因編輯方法中之包含內部連接子之引導RNA (gRNA)。經工程改造且經測試之gRNA之序列的實例展示於表2A至2B中。
本文所提供的某些gRNA為用於基因編輯方法中之包含內部連接子之雙引導RNA (dgRNA)。
本文所提供的某些gRNA為用於基因編輯方法中之包含內部連接子之單引導RNA (sgRNA)。
本發明進一步提供此等gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)用於活體外(例如在活體外培養的細胞，其用於離體療法，或基因編輯細胞之其他用途)或在個體(諸如人類)之細胞中(例如用於活體內療法)改變目標核酸之基因體的用途。
sgRNA名稱有時用緊接著G之後的一或多個前置零提供。此不影響名稱之含義。因此，舉例而言，G000282、G0282、G00282及G282係指相同sgRNA。類似地，crRNA及或trRNA名稱有時分別用緊接著CR或TR之後的一或多個前置零提供，其不影響名稱之含義。因此，舉例而言，CR000100、CR00100、CR0100及CR100係指相同crRNA，且TR000200、TR00200、TR0200及TR200係指相同trRNA。
I. 定義
冠詞「一(a/an)」在本文中用以指代冠詞之一個或多過一個(亦即，至少一個)文法對象。舉例而言，「一要素」意謂一個要素或多於一個要素，例如複數個要素。
術語「包括」在本文中用於意謂片語「包括(但不限於)」且可與其互換使用。
除非上下文另外明確指示，否則術語「或」在本文中用於意謂術語「及/或」且可與其互換使用。舉例而言，「有義股或反義股」應理解為「有義股或反義股或有義股及反義股」。
術語「約」在本文中用於意謂在此項技術中的許可差的典型範圍內。舉例而言，「約」可理解為與平均值差約2個標準差。在某些實施例中，約意謂±10%。在某些實施例中，約意謂+5%、+2%或+1%。當約存在於一系列數或範圍之前時，應理解，「約」可修飾該系列或範圍中之數中之各者。至少，且不試圖將均等論之應用限於申請專利範圍之範疇，各數值參數至少應根據所報導之有效數位之個數且藉由應用普通捨入技術來解釋。
一個數或一系列數前的術語「至少」應理解為包括與術語「至少」相鄰的數及可邏輯地包括在內的所有後續數或整數，如上下文所明示。舉例而言，核酸分子中之核苷酸數目必須為整數。舉例而言，「20個核苷酸之核酸分子之至少17個核苷酸」意謂17、18、19或20個核苷酸具有指定特性。當至少存在於一系列數或範圍之前時，應理解，「至少」可修飾該系列或範圍中之數中之各者。
如本文所用，「不超過」或「小於」應理解為與片語相鄰的值，及上下文邏輯所示的合理較低值或整數至零。舉例而言，「不超過2個核苷酸鹼基對」之雙螺旋區具有2、1或0個核苷酸鹼基對。當「不超過」或「小於」存在於一系列數或範圍之前時，應理解，該系列或範圍中之數中之各者經修飾。
如本文所用，範圍包括上限及下限兩者。
如本文所用，應理解，當值之最大量由100% (例如100%抑制)表示時，該值受偵測方法限制。舉例而言，100%抑制應理解為抑制至低於分析之偵測水準的水準。
如本文所用之「編輯效率」或「編輯百分比(editing percentage/percent editing)」為藉由Cas RNP裂解或切口之後，所關注之目標區中具有核苷酸之插入、缺失或鹼基變化的序列讀段總數目相對於序列讀段總數目的比率。
如本文所用之「區」描述核酸之部分。區亦可稱為「模組」或「域」。sgRNA之區可執行特定功能，例如引導RNP之核酸內切酶活性，例如如Briner AE等人,
Molecular Cell56:333-339 (2014)中所描述；或具有預測結構。sgRNA之例示性區描述於表3中。
如本文所用之「髮夾」或「髮夾結構」描述當核酸股摺疊且與同一股之另一段形成鹼基對時所產生的核酸雙螺旋體。髮夾可形成包含環或U形之結構。在一些實施例中，髮夾可包含RNA環。髮夾可經由單一核酸分子中之兩個互補序列結合在一起、在分子摺疊或褶皺的情況下形成。在一些實施例中，髮夾包含莖或莖環結構。在一些實施例中，髮夾包含環及莖。如本文所用，當兩個髮夾存在於gRNA中時，「髮夾區」可指sgRNA之保守部分的髮夾1及髮夾2以及髮夾1與髮夾2之間的插入序列(例如「n」)。
如本文所用，「形成雙螺旋部分」應理解為能夠形成不間斷的雙螺旋部分或預測形成不間斷的雙螺旋部分，例如藉由鹼基配對。雙螺旋部分可包含兩個互補序列，例如第一髮夾莖區及與該第一髮夾莖區互補的第二髮夾莖區。如本文所用，雙螺旋部分具有至少2個鹼基對之長度。雙螺旋部分視情況包含2至10個鹼基對，且形成該雙螺旋部分的兩個股可例如藉由核苷酸環接合。雙螺旋體中之鹼基配對可包括華特生-克里克鹼基配對，視情況與鹼基層疊組合。如本文所用，雙螺旋部分可包括一股上之單核苷酸不連續部分，其中一股上之各鄰接核苷酸與互補股上之核苷酸鹼基配對，該互補股可具有一個非鹼基配對之核苷酸之不連續部分，例如如髮夾1中之SEQ ID NO: 500之核苷酸96中，其中該不連續部分直接側接具有華特生-克里克鹼基對之5'及3'。此不同於重複反重複區中之不成對核苷酸36及65，及髮夾2中之不成對核苷酸106至108及139，該等不成對核苷酸構成產生如本文所定義之兩個雙螺旋部分的不連續部分。RNA結構為此項技術中熟知的，且工具可用於RNA之結構預測(參見例如Sato等人, Nature Comm. 12:941 (2021)；rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html處之RNAstructure及rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi處之RNAfold WebServer)。准許摺疊且形成環以允許核鹼基充分接近而成為鹼基對所需的橋接長度及結構可撓性為此項技術中熟知的。
如本文所用，「RNA引導之DNA結合劑(RNA-guided DNA binding agent)」意謂具有RNA及DNA結合活性之多肽或多肽複合物，或此類複合物之DNA結合次單元，其中DNA結合活性具有序列特異性且依賴於RNA之序列。例示性RNA引導之DNA結合劑包括Cas裂解酶(其具有雙股裂解活性)、Cas切口酶(其具有單股裂解活性)及其不活化形式(「dCas DNA結合劑」)。如本文所用，「Cas核酸酶」涵蓋Cas裂解酶、Cas切口酶及dCas DNA結合劑。dCas DNA結合劑可為包含非功能性核酸酶域(RuvC或HNH域)之死核酸酶。在一些實施例中，Cas裂解酶或Cas切口酶涵蓋經修飾以准許例如經由與FokI域融合而進行DNA裂解之dCas DNA結合劑。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑具有核酸酶活性，例如裂解酶或切口酶活性。
如本文所用，「核糖核蛋白」(RNP)或「RNP複合物」描述例如結合核酸酶(諸如Cas蛋白)之sgRNA。在一些實施例中，RNP包含Cas9及gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)。在一些實施例中，引導RNA將核酸酶(諸如Cas9)引導至目標序列，且引導RNA與目標序列雜合且該結合劑結合至目標序列；在核酸酶或Cas蛋白為裂解酶或切口酶之情況下，結合之後可進行裂解或切口。
如本文所用之「莖環」描述核苷酸之二級結構，其形成鹼基配對的「莖」，該「莖」終止於不成對核酸之環。當同一核酸股之兩個區在以相反方向讀取時在序列上至少部分地互補時，可形成莖。如本文所用之「環」描述鹼基不成對(亦即，不互補)、可以將莖封端的核苷酸區。「四環」描述4個核苷酸之環。如本文所用，sgRNA之上莖可包含四環。
如本文中關於多核苷酸所使用之「經取代」或「取代」係指核鹼基之改變(例如核苷酸取代)，其改變其用於華特生-克里克配對之較佳鹼基。當引導RNA之某一區如本文所用「未經取代」時(例如，如表1A中所示之SEQ ID NO: 200-210及500-501)，該區之序列可與例如spyCas9 sgRNA (SEQ ID NO: 400)或任何其他gRNA (例如SEQ ID NO: 200-210及500-501之部分)的對應保守部分之序列比對，僅具有空位及匹配(亦即無錯配)，其中鹼基在具有用於華特生-克里克配對之相同較佳標準搭配鹼基(A、C、G或T/U)或可藉由鹼基層疊形成雙螺旋體時被視為匹配。
如本文所用，關於多核苷酸之「保守取代」係指核鹼基改變，其意謂交換鹼基配對之核苷酸的位置，使得可維持鹼基配對。舉例而言，G-C對變成C-G對，A-U對變成U-A對，或其他天然或經修飾鹼基配對。
如本文所用，關於不成對核苷酸，例如重複/反重複區、髮夾1區或髮夾2區之環(亦即分別為SEQ ID NO: 500中之核苷酸49至52、87至90及122至125)或其他不成對核苷酸之「經取代」及其類似者係用另一核苷酸置換核苷酸序列之一或多個核苷酸(例如1、2、3或4個核苷酸)，該另一核苷酸不會由於該等不成對核苷酸(例如隆突、環)而干擾結構之形成以准許例如在重複/反重複區、髮夾1區或髮夾2區中形成一或多個雙螺旋部分。
如本文所用，關於內部連接子之「經取代」及其類似者係用內部連接子置換至少1個、較佳至少2個核苷酸。在某些實施例中，內部連接子具有與連接子所置換之核苷酸數目大致相同的預測橋接長度。在某些實施例中，內部連接子比連接子所置換之核苷酸數目之預測橋接長度更短。在某些實施例中，內部連接子比連接子所置換之核苷酸數目之預測橋接長度更長。在某些實施例中，內部連接子進一步取代gRNA之重複/反重複部分之雙螺旋部分的一部分。在某些實施例中，內部連接子取代gRNA中之莖環之環部分的一部分。在某些實施例中，內部連接子取代gRNA中之莖環之雙螺旋部分的一部分。
如本文所用，關於包含內部連接子之gRNA的「gRNA之非連接部分」為僅在連接子之一側或另一側上包含核苷酸且視情況包含連接子本身或其一部分的分子。其亦可在核苷酸序列、連接子或其部分末端包含反應性部分或該反應性部分之淬滅形式。
「引導RNA」、「gRNA」及「引導物」在本文中互換使用以指crRNA (亦稱為CRISPR RNA)，或crRNA與trRNA (亦稱為tracrRNA)之組合。crRNA及trRNA可以單一RNA分子(單引導RNA，sgRNA)或以兩個獨立RNA分子(雙引導RNA，dgRNA)形式締合。「引導RNA」或「gRNA」係指各類型。trRNA可為天然存在之序列或與天然存在之序列相比具有修飾或變異之trRNA序列。引導RNA可包括如本文所描述之經修飾RNA。除非自上下文另外顯而易見，否則如本文所用之引導RNA包括至少一個內部連接子。
如本文所用之「內部連接子」描述接合引導RNA內之兩個核苷酸的非核苷酸區段。若gRNA含有間隔區，則內部連接子位於間隔區外部(例如，gRNA之骨架或保守區中)。對於V型引導物，應理解，最後一個髮夾為結構中之唯一髮夾，亦即重複反重複區。如本文所用，連接子為非核苷酸連接子。
如本文所用，術語「脂族基」係指飽和或不飽和的非芳族烴化合物，其中組成性碳原子可為直鏈、環狀或分支鏈的。在某些實施例中，脂族基亦包括雜環烴。環烴及雜環烴係指其中組成性碳原子以及雜環基團中之任何雜原子形成環的環結構。環烴及雜環烴亦可含有單鍵、雙鍵或參鍵。C
1-x脂族基係指具有1至x個組成性碳原子之脂族基團。脂族基團可經由其組成性碳原子中之任一者與其他部分形成一或多個化學鍵。脂族基團可為單價或二價的，根據使用該術語之上下文判定。
如本文所用，術語「伸烷基」係指飽和二價脂族鏈，其可為直鏈或分支鏈的。典型伸烷基包括(但不限於)：亞甲基(CH
2)、1,2-乙基(CH
2CH
2)、1,3-丙基(CH
2CH
2CH
2)、1,4-丁基(CH
2CH
2CH
2CH
2)及其類似基團。
如本文所用，術語「伸烯基」係指至少部分不飽和(例如含有至少一個雙鍵)的二價脂族鏈，其可為直鏈或分支鏈的。典型伸烯基包括(但不限於)：1,2-伸乙基(CH=CH)。
如本文所用，術語「氫鍵受體」係指包含能夠形成氫鍵之雜原子的取代基。H鍵受體可為單價或二價的，根據使用該術語之上下文判定。H鍵受體包括：包含氧、硫或磷之取代基；或包含羥基、烷氧基、硫醇基、醚基、硫醚基、羰基、醯胺基、碳酸根、胺基甲酸根、磷酸根、硫代磷酸根、膦酸根、硫酸根或磺酸根之取代基；或例如-O-、-OH、-OR、-ROR、-S-、-SH、-SR、-NH-、-NR-、-C(O)-R、-C(O)-O-、-OC(O)O-、-C(O)-OR、-OC(O)-OR、-C(O)-H、-C(O)-OH、-C(O)-NR-、-OC(O)-NR-、-NC(O)-NR-、-OPO
3、-PO
3、-RPO
3、-P(O)
2O-、-OP(O)
2O-、-OP(R)(O)O-、-OP(O)(S)O-、-S(O)
2-R、-S(O)
2-OR、-RS(O)
2-R、-RS(O)
2-OR、-S(O)
2-、-SO
3。
如本文所用，內部連接子之「橋接長度」係指自連接子之第一個原子(其與前一核苷酸之3'取代基(諸如氧或磷酸根)結合)至連接子之最後一個原子(其與後一核苷酸之5'取代基(諸如氧或磷酸根)結合) (例如下文所描述之式(I)結構中自~至#)之路徑上的最短原子鏈中之距離或原子數目。各種連接子之大致預測橋接長度提供於下表中。
在一些實施例中，gRNA (例如sgRNA)包含「引導區」，其有時稱為「間隔子」或「間隔區」，例如Briner AE等人,
Molecular Cell56:333-339 (2014)中關於sgRNA所提及(但在本文中適用於所有引導RNA)。引導區或間隔區有時亦稱作「可變區」、「引導域」或「靶向域」。在一些實施例中，「引導區」在其5'端處緊接在「sgRNA之保守部分」之前，且在一些實施例中，sgRNA經縮短。例示性「sgRNA之保守部分」展示於表3A至3B中。在一些實施例中，「引導區」包含位於crRNA之5'端處的一系列核苷酸。
如本文所用，「重複反重複區」應理解為對應於由引導RNA中之crRNA及trRNA序列形成的一或多個雙螺旋體的引導物部分。在單引導RNA中，trRNA及crRNA序列視情況在共價鍵聯前經截短。截短之準確位置可變化。共價鍵聯通常為短RNA序列以允許形成髮夾，通常為莖環結構。
除非指定另一參考點，否則引導RNA中之數字位置或範圍係指由5'端測定之位置；舉例而言，引導RNA中之「核苷酸5」為自5'端起第5個核苷酸；或「核苷酸5至8」係指以自5'端起第5個核苷酸開始且以朝向3'端之第8個核苷酸結束的4個核苷酸。
在一些實施例中，gRNA包含與本文所描述之gRNA之對應或指定核苷酸處之「修飾模式匹配」的核苷酸。此意謂與修飾模式匹配的核苷酸具有與本文所描述之gRNA之對應位置處的核苷酸相同的修飾(例如硫代磷酸酯、2'-氟、2'-OMe等)，不論彼等位置處之核鹼基是否匹配。舉例而言，若在第一gRNA中，核苷酸5及6分別具有2'-OMe及硫代磷酸酯修飾，則此gRNA在核苷酸5及6處具有與第二gRNA相同的修飾模式，該第二gRNA亦在核苷酸5及6處分別具有2'-OMe及硫代磷酸酯修飾，不論第一及第二gRNA中之位置5及6處之核鹼基相同或不同。然而，核苷酸6而非核苷酸7處之2'-OMe修飾在核苷酸6及7處的修飾模式與核苷酸7而非核苷酸6處之2'-OMe修飾不相同。類似地，與本文所描述之gRNA之修飾模式至少75%匹配的修飾模式意謂至少75%核苷酸與本文所描述之gRNA之對應位置具有相同修飾。對應位置可藉由逐對或結構比對來測定。
化膿鏈球菌Cas9 (「spyCas9」(亦稱為「spCas9」)) sgRNA之「保守區」展示於表3A至3B中。第一列展示核苷酸之編號；第二列展示序列(例如SEQ ID NO: 400)；且第三列展示該等區。
如本文所用，gRNA中之「經縮短」區為gRNA之保守部分中與未經修飾gRNA之保守部分(參見例如圖11 (SEQ ID NO: 400)或表3A至3B)中的對應區相比缺乏至少1個核苷酸的區。「經縮短」在任何情況下均不暗示對產生gRNA之過程或方式的任何特定限制。在一些實施例中，gRNA包含經縮短之髮夾1區，其中(i)經縮短之髮夾1區缺乏6至8個核苷酸；及(A)位置H1-1、H1-2或H1-3中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400缺失或經取代，或(B)位置H1-6至H1-10中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400經取代；或(ii)經縮短之髮夾1區缺乏9至10個核苷酸，包括H1-1或H1-12；或(iii)相對於SEQ ID NO: 400 (參見表3A)，經縮短之髮夾1區缺乏5至10個核苷酸且位置N18、H1-12或N中之一或多者經取代。在一些實施例中，非spyCas9 gRNA包含經縮短之髮夾1區，其缺乏6至8個核苷酸，且其中例如藉由逐對或結構比對測定之與SEQ ID NO: 400中之H1-1、H1-2或H1-3對應的一或多個位置缺失或經取代，例如藉由逐對或結構比對測定之與SEQ ID NO: 400中之H1-6至H1-10對應的一或多個位置經取代。在一些實施例中，非spyCas9 gRNA包含經縮短之髮夾1區，其缺乏9至10個核苷酸，包括例如藉由逐對或結構比對測定之與SEQ ID NO: 400中之H1-1或H1-12對應的核苷酸。在一些實施例中，非spyCas9 gRNA包含經縮短之髮夾1區，其缺乏5至10個核苷酸，且例如藉由逐對或結構比對測定之與SEQ ID NO: 400中之N18、H1-12或N對應的一或多個位置經取代。在一些實施例中，gRNA包含經縮短之上莖區，其中該經縮短之上莖區缺乏1至6個核苷酸。
如本文所用，「YA位點」係指5'-嘧啶-腺嘌呤-3'二核苷酸。為了清楚起見，藉由修飾鹼基而改變之原始序列中的「YA位點」仍視為所得序列中之(經修飾之) YA位點，不論字面上缺乏YA二核苷酸。「保守區YA位點」存在於sgRNA之保守區中。「引導區YA位點」存在於sgRNA之引導區中。sgRNA中之未經修飾YA位點可易被RNase-A樣核酸內切酶(例如RNase A)裂解。在某些實施例中，YA位點經修飾，以藉由2'糖修飾(例如2'OMe、2'F)或主鏈修飾(例如硫代磷酸酯鍵聯)降低對RNase A之敏感性。在某些實施例中，YA位點藉由修飾鹼基使得YA序列不再存在而經修飾。
如本文所論述，與關於spyCas9 gRNA所描述之核苷酸對應的核苷酸在另一gRNA中的位置可藉由逐對或結構比對以序列或結構相似性鑑別。結構比對在分子共用類似結構(儘管存在相當大的序列變化)時為有用的。舉例而言，spyCas9與金黃色葡萄球菌Cas9 (「SauCas9」)具有相異的序列，但具有顯著的結構比對。參見例如Nishimasu等人,
Cell162(5): 1113-1126 (2015)之圖2(F)。結構比對可用於鑑別SauCas9或其他sgRNA中對應於特定位置之核苷酸，該等位置諸如spyCas9 sgRNA之保守部分(例如SEQ ID NO: 400) (參見表3A)的位置H1-1、H1-2或H1-3、位置H1-6至H1-10、位置H1-12或位置N18或N)。
結構比對涉及藉由以下鑑別兩個(或更多個)序列上之對應殘基：(i)使用第二序列之已知結構，對第一序列之結構模型化或(ii)比較均已知之第一序列及第二序列的結構，且鑑別第一序列中與第二序列中之所關注殘基最相似地定位的殘基。在一些演算法中，基於重疊結構中之給定位置(例如，多核苷酸之戊糖環的核鹼基位置1或1'碳，或多肽之α碳)的距離最小化，鑑別出對應殘基(例如，哪一組成對位置為比對提供最小化均方根偏差)。當鑑別非spyCas9 gRNA中與關於spyCas9 gRNA所描述之位置對應的位置時，spyCas9 gRNA可為「第二」序列。在所關注之非spyCas9 gRNA不具有可獲得之已知結構、但與具有已知結構之另一種非spyCas9 gRNA更密切相關的情況下，最有效的可以為使用緊密相關之非spyCas9 gRNA之已知結構將所關注之非spyCas9 gRNA模型化，且接著比較該模型與spyCas9 gRNA結構以鑑別出所關注之非spyCas9 gRNA中的所需對應殘基。關於蛋白質之結構模型化及比對，存在大量的文獻；代表性揭示案包括US 6859736；US 8738343；及Aslam等人, Electronic Journal of Biotechnology 20 (2016) 9-13中所引用的彼等文獻。關於基於一或多種已知相關結構將結構模型化的論述，參見例如Bordoli等人,
Nature Protocols4 (2009) 1-13，及其中所引用之參考文獻。關於核酸比對，亦參見Nishimasu等人,
Cell162(5): 1113-1126 (2015)之圖2(F)。此外，已對Cas核酸酶與其引導RNA之複合物進行大量結構研究，參見例如Jiang等人, Science. 2015年6月26日;348(6242):1477-81；Anders等人, Nature. 2014年9月25日;513(7519):569-73；Zhu等人, Nat Struct Mol Biol. 2019年8月;26(8):679-685；Nishimasu等人, Cell. 2014年2月27日;156(5):935-49；Nishimasu等人, Cell. 2015年8月27日;162(5):1113-26；Hirano等人, Nat Commun. 2019年4月29日;10(1):1968；Fuchsbauer等人, Mol Cell. 2019年12月19日;76(6):922-937；Zhang等人, Nat Catal 3, 813-823 (2020)；Yamada等人, Mol Cell. 2017年3月16日;65(6):1109-1121；Hirano等人, Cell. 2016年2月25日;164(5):950-61；Gao等人, Cell Res. 2016年8月;26(8):901-13；及Stella等人, Nature. 2017年6月22日;546(7659):559-563。勘誤表於：Nature. 2017年7月27日;547(7664):476；Qiao等人, Biotechnol Bioeng. 2021年5月8日(數位物件識別碼：10.1002/bit.27813刊載之前的電子版)中。提供此等協同結構，可容易地確定核酸酶與其引導物之間的雙螺旋區、髮夾及接觸點的位置。
如本文所用之「目標序列」係指引導區向其引導核酸酶以進行裂解之核酸序列。在一些實施例中，spyCas9蛋白可藉由引導區、藉由存在於引導區中的核苷酸引導至目標序列。
如本文所用，「5'端」係指gRNA (包括dgRNA (通常為dgRNA之crRNA的5'端)、sgRNA)之第一個核苷酸，其中5'位置不連接至另一核苷酸。
如本文所用，「5'端修飾」係指包含在其5'端處具有一(1)至約七(7)個核苷酸中之一或多者之修飾的引導區的gRNA，視情況其中gRNA之第一個核苷酸(自5'端起)經修飾。
如本文所用，「3'端」係指gRNA之端或末端核苷酸，其中3'位置不連接至另一核苷酸。在一些實施例中，3'端處於3'尾中。在一些實施例中，3'端處於gRNA之保守部分中。
如本文所用，「3'端修飾」係指在其3'端處具有一(1)至約七(7)個核苷酸中之一或多者之修飾的gRNA，視情況其中gRNA之最後一個核苷酸(亦即，最為3'之核苷酸)經修飾。若存在3'尾，則3'尾內可存在1至約7個核苷酸。若不存在3'尾，則sgRNA之保守部分內可存在1至約7個核苷酸。
「最後一個」、「倒數第二個」、「倒數第三個」核苷酸等分別指指定序列中的最為3'、第二個最為3'、第三個最為3'的核苷酸等。舉例而言，在序列5'-AAACTG-3'中，最後一個、倒數第二個及倒數第三個核苷酸分別為G、T及C。片語「最後3個核苷酸」係指最後一個、倒數第二個及倒數第三個核苷酸；更一般而言，「最後N個核苷酸」係指最後一個至倒數第N個核苷酸(包括端點)。「自3'末端之3'端起第三個核苷酸」等效於「倒數第三個核苷酸」。類似地，「自5'末端之5'端起第三個核苷酸」等效於「5'末端之第三個核苷酸」。
如本文所用，「保護性端修飾」(諸如保護性5'端修飾或保護性3'端修飾)係指sgRNA之末端之七個核苷酸內的一或多個核苷酸之修飾，其減少sgRNA降解，諸如核酸外切降解。在一些實施例中，保護性端修飾包含sgRNA之末端之七個核苷酸內的至少兩個或至少三個核苷酸之修飾。在一些實施例中，修飾包含硫代磷酸酯鍵聯、2'修飾(諸如2'-OMe或2'-氟)、2'-H (DNA)、ENA、UNA或其組合。在一些實施例中，修飾包含硫代磷酸酯鍵聯及2'-OMe修飾。在一些實施例中，至少三個末端核苷酸經修飾，例如經以下修飾：硫代磷酸酯鍵聯，或硫代磷酸酯鍵聯與2'-OMe修飾之組合。涵蓋熟習此項技術者已知之減少核酸外切降解的修飾。
在一些實施例中，包含1至20個核苷酸、視情況1至7個核苷酸、或1個核苷酸之「3'尾」在其3'端處跟隨sgRNA之保守部分。在某些實施例中，末端鹼基為尿嘧啶。在某些實施例中，尾為一個核苷酸，且末端鹼基為尿嘧啶。
如本文所用，「Cas核酸酶」(亦稱作「Cas蛋白」)涵蓋Cas裂解酶、Cas切口酶及dCas DNA結合劑。Cas裂解酶/切口酶及dCas DNA結合劑包括：III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物、其Cas10、Csm1或Cmr2次單元，I型CRISPR系統之級聯複合物、其Cas3次單元，及2類Cas核酸酶；V型CRISPR系統，包括Cas12或其次單元，諸如Cas12a (Cpf1)或Cas12e (CasX)；及VI型CRISPR系統，包括Cas13d。如本文所用，「2類Cas核酸酶」為具有RNA引導之DNA結合活性的單鏈多肽，諸如Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶。2類Cas核酸酶包括2類Cas裂解酶及2類Cas切口酶(例如H840A、D10A或N863A變體)，其進一步具有RNA引導之DNA裂解酶或切口酶活性，及2類dCas DNA結合劑，其中裂解酶/切口酶活性未活化。2類Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9 (例如N497A、R661A、Q695A、Q926A變體)、HypaCas9 (例如N692A、M694A、Q695A、H698A變體)、eSPCas9(1.0) (例如K810A、K1003A、R1060A變體)及eSPCas9(1.1) (例如K848A、K1003A、R1060A變體)蛋白質及其變異體(modification)。Cpf1蛋白(Zetsche等人,
Cell, 163: 1-13 (2015))與Cas9同源且含有RuvC樣核酸酶域。Zetsche之Cpf1序列以全文引用之方式併入。參見例如Zetsche，表S1及S3。「Cas9」涵蓋Spy Cas9、本文所列的Cas9之變體及其等效物。參見例如Makarova等人,
Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人,
Molecular Cell, 60:385-397 (2015)。
2類CRISPR系統之特徵為具有單體核酸內切酶，而非多聚體核酸酶。2類CRISPR系統包括II型及V型系統。
II型系統包括相對較大的Cas9核酸內切酶，其具有RNA識別域、兩個核酸酶域、藉由富含精胺酸之螺旋橋連接至RuvC域之HNH域以及原間隔序列相鄰模體(PAM)相互作用域。引導RNA往往相對較長，亦即，單引導RNA通常為約100個核苷酸長或更長，且已由多個功能性研究證實在間隔子(靶向域區)之3'包括多個雙螺旋區及髮夾，包括重複反重複區及第二髮夾區，其通常含有一種或兩種預測髮夾結構。
II型Cas9核酸內切酶包括：II-A型Cas9核酸內切酶，例如化膿鏈球菌(Spy Cas9)；及II-C型Cas9核酸內切酶，例如空腸彎曲桿菌(Cje)、沼澤紅假單胞菌(Rpa)、深紅紅螺菌(Rru)、納士放線菌(Ana)及白喉棒狀桿菌(Cdi)。
V型系統之特徵為相對較小的核酸酶及引導物。核酸酶具有單一DNA識別瓣葉(REC)及單一核酸酶(NUC)瓣葉。引導物以約40至45個核苷酸長之單一RNA形式天然存在，且包括約20個核苷酸長之單一髮夾重複反重複區，接著為23至25個核苷酸之間隔區。V型系統包括新兇手弗朗西斯氏菌Cpf1 (FnCpf1)、毛螺旋菌Cpf1 (LbCpf1)及胺基酸球菌屬Cpf1 (AsCpf1/Cas 12a)。
如本文所用，若第一序列與第二序列之比對顯示整個第二序列之X%或更多位置與第一序列匹配，則第一序列被視為「包含與第二序列具有至少X%一致性的序列」。舉例而言，序列AAGA包含與序列AAG具有100%一致性之序列，此係因為第二序列之全部三個位置均存在匹配，因此比對將得到100%一致性。RNA與DNA之間的差異(一般而言，尿苷交換為胸苷或反之亦然)及核苷類似物(諸如經修飾尿苷)的存在不會造成多核苷酸之間一致性或互補性的差異，只要相關核苷酸(諸如胸苷、尿苷或經修飾尿苷)具有相同補體(例如對於胸苷、尿苷或經修飾尿苷全體而言，為腺苷；另一實例為胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶，兩者具有鳥苷或經修飾鳥苷作為補體)。因此，舉例而言，序列5'-AXG (其中X為任何經修飾尿苷，諸如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)被視為與AUG 100%一致，因為兩者與同一序列(5'-CAU)完全互補。例示性比對演算法為此項技術中熟知的史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)及尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)演算法。熟習此項技術者應理解對於待比對之給定序列對，選擇何種演算法及參數設置為適合的；對於具有一般類似長度及針對胺基酸之＞50%預期一致性或針對核苷酸之＞75%預期一致性的序列而言，由EBI於www.ebi.ac.uk網站伺服器提供的尼德曼-翁施演算法介面之具有默認設置的尼德曼-翁施演算法通常為適合的。
「mRNA」在本文中用於指一種多核苷酸，其為RNA或經修飾RNA且包含可轉譯成多肽之開放閱讀框架(亦即，可充當受質供核糖體及胺基醯基化tRNA轉譯)。mRNA可包含磷酸酯-糖主鏈，其包括核糖殘基或其類似物，例如2'-甲氧基核糖殘基。在一些實施例中，核酸磷酸酯-糖主鏈中之糖類基本上由核糖殘基、2'-甲氧基核糖殘基或其組合組成。一般而言，mRNA不含大量胸苷殘基(例如0個殘基或少於30、20、10、5、4、3或2個胸苷殘基；或少於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%或0.1%的胸苷含量)。mRNA可在其一些或全部尿苷位置處含有經修飾尿苷。在一些實施例中，經修飾mRNA包含至少一個其中磷酸酯、糖或核鹼基中之一或多者與標準腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷核苷酸不同的核苷酸。
如本文所用，「個體」係指動物界之任何成員。在一些實施例中，「個體」係指人類。在一些實施例中，「個體」係指非人類動物。在一些實施例中，「個體」係指靈長類動物。在一些實施例中，「個體」係指非人類靈長類動物。在一些實施例中，個體包括(但不限於)哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物、魚類、昆蟲或蠕蟲。在某些實施例中，非人類個體為哺乳動物(例如嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、貓、綿羊、牛、靈長類動物或豬)。在一些實施例中，個體可為轉殖基因動物、經基因工程改造之動物或純系。在本發明之某些實施例中，個體為成人、青少年或嬰兒。在一些實施例中，使用術語「個體(individual)」或「患者」，且其意欲與「個體(subject)」互換，其中個體為人類個體。
如本文所用，「遞送」及「投與」可互換地使用，且包括離體及活體內應用。
如本文所用，共同投與意謂複數種物質在時間上足夠接近地一起投與，以使得藥劑一起起作用。共同投與涵蓋在單個調配物中一起投與物質及在單獨調配物中在時間上足夠接近地投與物質以使得藥劑一起起作用。
如本文所用，片語「醫藥學上可接受」意謂適用於製備醫藥組合物，該醫藥組合物通常無毒且在生物學上並非不合需要且在其他方面對於醫藥用途並非不可接受的。醫藥學上可接受之物質通常係指非熱解物質。醫藥學上可接受可指無菌物質，尤其對於注射或輸注用之醫藥物質。
II.
包含內部連接子之引導
RNA
本文提供用於基因編輯方法中之包含內部連接子之引導RNA (gRNA)。
A. 內部連接子之位置 / 數目
在一些實施例中，內部連接子取代至少1個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代至少2個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代至少3個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代至少5個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代至少6個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代至少7個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代至少8個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代至少9個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代至少10個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代至少11個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代至少12個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之至少28個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之至少22個核苷酸。在一些實施例中，連接子取代至少2至6個核苷酸。在一些實施例中，連接子取代至少2至4個核苷酸。
在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之至多28個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之至多22個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之至多12個核苷酸。
在一些實施例中，內部連接子取代2個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代3個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代5個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代6個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代7個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代8個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代9個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代10個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代11個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代12個核苷酸。在一些實施例中，連接子取代2至28個核苷酸。在一些實施例中，連接子取代2至22個核苷酸。在一些實施例中，連接子取代2至12個核苷酸。在一些實施例中，連接子取代2至6個核苷酸。在一些實施例中，連接子取代2至4個核苷酸。
在一些實施例中，內部連接子具有約3至30個原子之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子具有約6至30個原子之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子具有約9至30個原子之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子具有約12至30個原子之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子具有約15至30個原子之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子具有約18至30個原子之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子具有約21至30個原子之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子具有約12至21個原子之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子具有約9至21個原子之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子具有約6至12個原子之橋接長度。
在一些實施例中，內部連接子具有約3至30個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約12至30個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約12至24個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約12至21個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約16至20個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約15至18個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。
在一些實施例中，內部連接子具有約15個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約16個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約17個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約18個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約19個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約20個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約21個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約22個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約23個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約24個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約25個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約26個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約27個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約28個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約29個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約30個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。
在一些實施例中，內部連接子具有約21個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約21個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之6個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約21個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之8個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約21個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約21個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之10個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約21個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之12個核苷酸。
在一些實施例中，內部連接子具有約18個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約18個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之6個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約18個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之8個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約18個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約18個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之10個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約18個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之12個核苷酸。
在一些實施例中，內部連接子具有約6至18個原子、視情況約6至12個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少2個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約9至12個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少2個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約8至10個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少2個核苷酸。
在一些實施例中，內部連接子具有約6個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少2個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約7個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少2個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約8個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少2個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約9個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少2個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約10個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少2個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約11個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少2個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約12個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少2個核苷酸。
在一些實施例中，內部連接子具有約9個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之2個核苷酸。
在一些實施例中，內部連接子位於gRNA之重複反重複區中。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之重複反重複區的至少3個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之重複反重複區的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之重複反重複區的3個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之重複反重複區的4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之重複反重複區的5個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之重複反重複區的6個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之重複反重複區的7個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之重複反重複區的8個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之重複反重複區的9個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之重複反重複區的10個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之重複反重複區的11個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之重複反重複區的12個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代重複反重複區中之至多28個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代重複反重複區中之至多20個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子側接形成至少2個鹼基對長之雙螺旋區的核苷酸。在某些實施例中，內部連接子不存在於重複反重複區中之隆突中。
在一些實施例中，內部連接子位於gRNA之髮夾區中。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的至少2個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的至多22個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的至多12個核苷酸。
在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的至少2個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的6個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的8個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾的10個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的12個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的14個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的16個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的18個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的20個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾的22個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的至多22個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的2至6個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的2至4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子側接形成至少2個鹼基對長之雙螺旋區的核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾區中之整個髮夾結構，亦即，雙螺旋體不由側接內部連接子之核苷酸形成。
在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的1、2、3、4、5或6個鹼基對。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的1個鹼基對，亦即取代預測形成髮夾結構中之鹼基對的核苷酸，使得1個鹼基對缺失引起兩個核苷酸之缺失以及髮夾結構中之鹼基對數目減一。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的2個鹼基對。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的3個鹼基對。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的4個鹼基對。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾的5個鹼基對。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的6個鹼基對。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的1至12個鹼基對。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的1至6個鹼基對。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的1至4個鹼基對。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區的至多12個鹼基對。
在一些實施例中，內部連接子位於gRNA之連接區中。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之連接區的至少2個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之連接區的1或2個核苷酸。
在一些實施例中，內部連接子位於gRNA之第一部分與gRNA之第二部分之間的髮夾結構中，其中第一部分及第二部分一起形成雙螺旋部分。
在一些實施例中，gRNA包含三個內部連接子。在一些實施例中，gRNA包含兩個內部連接子。在一些實施例中，gRNA包含一個內部連接子。
重複反重複區之上莖
在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子位於重複反重複區之第一部分與第二部分之間的髮夾結構中，其中第一部分及第二部分一起形成雙螺旋部分。
在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代重複反重複區中之至多28個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代重複反重複區中之至多20個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代重複反重複區中之至多12個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代重複反重複區中之至少4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代重複反重複區中之4至20個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代重複反重複區中之4至14個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代重複反重複區中之4至6個核苷酸。
在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環或其部分。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及莖或其部分。在一些實施例中，內部連接子不取代重複反重複區之隆突部分。
在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環的2、3或4個核苷酸。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環的2個核苷酸。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環的3個核苷酸。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環的4個核苷酸。
在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾之莖的至少1個核苷酸。在一些實施例中，其中重複反重複區中之內部連接子取代髮夾之環及髮夾之莖的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個核苷酸。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾之環及髮夾之莖的至少2個核苷酸。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾之環及髮夾之莖的2至24個核苷酸。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾之環及髮夾之莖的2至18個核苷酸。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾之環及髮夾之莖的2至8個核苷酸。
在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24個核苷酸。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的2、4、6、8、10、12或14個核苷酸。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的2、4、6或8個核苷酸。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的2個核苷酸。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的4個核苷酸。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的6個核苷酸。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的8個核苷酸。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的10個核苷酸。
在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個鹼基對。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的1、2、3、4、5、6、7或8個鹼基對。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的1、2、3或4個鹼基對。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的1個鹼基對。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的2個鹼基對。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的3個鹼基對。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的4個鹼基對。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的5個鹼基對。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的6個鹼基對。在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的7個鹼基對。
在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代構成髮夾結構之環的所有核苷酸。
在一些實施例中，重複反重複區中之內部連接子取代構成髮夾結構之環及上莖的所有核苷酸。
連接區
在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之連接區之環的1或2個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子具有約6至18個原子之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子具有約6至12個原子之橋接長度。
髮夾區
在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區中的髮夾結構。
在一些實施例中，髮夾區等效於可藉由用內部連接子取代gRNA (例如表1A中所示之gRNA中之任一者，或SEQ ID NO: 200-210及500-501中之任一者)之髮夾結構的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個核苷酸獲得的髮夾區。
在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之2至22個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之2至12個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之2至6個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之2至4個核苷酸。在髮夾區中包含內部連接子之gRNA可在髮夾區中形成雙螺旋部分。髮夾區中之內部連接子可取代環，且gRNA可在髮夾區中形成雙螺旋部分。髮夾區中之內部連接子可取代環及莖區中之一或多個鹼基對，且gRNA可在髮夾區中形成雙螺旋部分。
在一些實施例中，內部連接子取代髮夾區中之髮夾結構的環或其部分。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾區中之髮夾結構的環及莖或其部分。
在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環的2、3、4或5個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環的2個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環的3個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環的4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環的5個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環的2至5個核苷酸。
在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的至少1個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的1、2、3、4、5、6、7或8個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的至少2個核苷酸。
在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的2、4、6、8、10、12或14個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的2、4、6或8個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾之環及髮夾結構之莖的2個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的4個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的6個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的8個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的至多24個核苷酸。
在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個鹼基對。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的1、2、3、4、5或6個鹼基對。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的1、2、3或4個鹼基對。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的1個鹼基對。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的2個鹼基對。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的3個鹼基對。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾結構之環及髮夾結構之莖的4個鹼基對。
在一些實施例中，內部連接子取代構成髮夾結構之環的所有核苷酸。
在一些實施例中，內部連接子取代構成髮夾結構之環及莖的所有核苷酸。
在一些實施例中，髮夾為髮夾1，且內部連接子取代髮夾1。在一些實施例中，gRNA為
SpyCas9gRNA，且內部連接子取代髮夾1。
在其他實施例中，gRNA進一步包含髮夾1之3'處的髮夾2。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾2之環的至少2個核苷酸。
在一些實施例中，髮夾2不包括任何內部連接子取代。在一些實施例中，gRNA為Spy Cas9 gRNA，且髮夾2不包括任何內部連接子取代。
在一些實施例中，gRNA進一步包含引導區。在其他實施例中，引導區之長度為17、18、19、20或21個核苷酸。在一些實施例中，gRNA不包含引導區。
在一些實施例中，gRNA為單引導RNA (sgRNA)。
在一些實施例中，gRNA包含tracrRNA (trRNA)。
B. 內部連接子結構 - 物理性質、化學性質
本文所揭示之gRNA包含內部連接子。一般而言，可使用與gRNA之功能相容的任何內部連接子。可能需要連接子具有一定程度之可撓性。在一些實施例中，內部連接子包含至少兩個、三個、四個、五個、六個或更多個路徑上單鍵。若鍵為5'及3'位置連接至連接子之兩個核苷酸之間的最短鍵路徑的一部分，則其為路徑上鍵。
在一些實施例中，內部連接子具有約6至40埃之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子具有約8至25埃之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子具有約8至15埃之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子具有約10至40埃之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子具有約10至35埃之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子具有約10至30埃之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子具有約10至25埃之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子具有約15至40埃之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子具有約15至35埃之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子具有約15至25埃之橋接長度。在一些實施例中，連接子之長度可至少部分地基於連接子相對於不含內部連接子之對應gRNA取代的核苷酸數目來選擇。舉例而言，若連接子代替兩個核苷酸，則可使用長度約8至15埃之連接子，諸如涵蓋在約8至15埃之範圍內的本文其他處所描述之實施例中之任一者。若連接子代替多於兩個核苷酸，則可使用長度約10至25埃之連接子，諸如涵蓋在約10至25埃之範圍內的本文其他處所描述之實施例中之任一者。
根據原子數目、乙二醇單元數目、以埃為單位之大致連接子長度(假設乙二醇單體為約3.7埃)及取代髮夾結構之至少整個環部分的適合位置的例示性預測連接子長度提供於下表中。取代兩個核苷酸需要至少約11埃之連接子長度。取代至少3個核苷酸需要至少約16埃之連接子長度。
表 1
| 原子數目 | 乙二醇單元數目 | 以埃為單位之大致長度 | 用於完全環取代之適合位置 |
| 3 | 1 | 3.7 | 重複反重複區(當不存在莖時，取代環及莖兩者) |
| 6 | 2 | 7.4 | 重複反重複區(當不存在莖時，取代環及莖兩者) |
| 9 | 3 | 11.1 | 重複反重複區(當不存在莖時，取代環及莖兩者)、連接區 |
| 12 | 4 | 14.8 | 連接區 |
| 15 | 5 | 18.5 | 重複反重複區、髮夾1區、髮夾2區 |
| 18 | 6 | 22.2 | 重複反重複區、髮夾1區、髮夾2區 |
| 21 | 7 | 25.9 | 重複反重複區、髮夾1區、髮夾2區 |
| 24 | 8 | 29.6 | 重複反重複區、髮夾1區、髮夾2區 |
| 27 | 9 | 33.3 | 重複反重複區、髮夾1區、髮夾2區 |
| 30 | 10 | 37 | 重複反重複區、髮夾1區、髮夾2區 |
在一些實施例中，內部連接子包含式(I)之結構：
~-L0-L1-L2-#
(I)
其中：
~指示連至前一核苷酸之3'取代基的鍵；
#指示連至後一核苷酸之5'取代基的鍵；
L0為空值或C
1-3脂族基；
L1為-[E
1-(R
1)]
m-，其中
各R
1獨立地為視情況經1或2個E
2取代之C
1-5脂族基團，
各E
1及E
2獨立地為氫鍵受體，或各自獨立地選自環烴及雜環烴，且
各m為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；且
L2為空值、C
1-3脂族基，或為氫鍵受體。
在一些實施例中，L1包含一或多個-CH
2CH
2O-、-CH
2OCH
2-或-OCH
2CH
2-單元(「乙二醇次單元」)。在一些實施例中，-CH
2CH
2O-、-CH
2OCH
2-或-OCH
2CH
2-單元之數目介於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10之範圍內。
在一些實施例中，m為1、2、3、4或5。在一些實施例中，m為1、2或3。在一些實施例中，m為6、7、8、9或10。
在一些實施例中，L0為空值。在一些實施例中，L0為-CH
2-或-CH
2CH
2-。
在一些實施例中，L2為空值。在一些實施例中，L2為-O-、-S-或C
1-3脂族基。在一些實施例中，L2為-O-。在一些實施例中，L2為-S-。在一些實施例中，L2為-CH
2-或-CH
2CH
2-。
式I中之部分及變數的身分及值可經選擇以提供具有本文所描述之橋接長度中之任一者的內部連接子。在一些實施例中，式(I)結構中自~至#之路徑上的最短原子鏈中之原子數目為30或更小、或27或更小、或24或更小、或21或更小，或為18或更小，或為15或更小，或為12或更小，或為10或更小。
在一些實施例中，式(I)結構中自~至#之路徑上的最短原子鏈中之原子數目為6至30，或為9至30，或為9至21。在一些實施例中，式(I)結構中自~至#之路徑上的最短原子鏈中之原子數目為9。在一些實施例中，式(I)結構中自~至#之路徑上的最短原子鏈中之原子數目為18。
在一些實施例中，各C
1-3脂族基團及C
1-5脂族基團為飽和的。在一些實施例中，至少一個C
1-5脂族基團為C
1-4伸烷基，或其中至少兩個C
1-5脂族基團為C
1-4伸烷基，或其中至少三個C
1-5脂族基團為C
1-4伸烷基。在一些實施例中，至少一個R
1係選自-CH
2-、-CH
2CH
2-、-CH
2CH
2CH
2-或-CH
2CH
2CH
2CH
2-。在一些實施例中，各R
1獨立地選自-CH
2-、-CH
2CH
2-、-CH
2CH
2CH
2-或-CH
2CH
2CH
2CH
2-。在一些實施例中，各R
1為-CH
2CH
2-。
在一些實施例中，至少一個C
1-5脂族基團為C
1-4伸烯基，或其中至少兩個C
1-5脂族基團為C
1-4伸烯基，或其中至少三個C
1-5脂族基團為C
1-4伸烯基。在一些實施例中，至少一個R
1係選自-CHCH-、-CHCHCH
2-或-CH
2CHCHCH
2-。
在一些實施例中，各E
1獨立地選自-O-、-S-、-NH-、-NR-、-C(O)-O-、-OC(O)O-、-C(O)-NR-、-OC(O)-NR-、-NC(O)-NR-、-P(O)
2O-、-OP(O)
2O-、-OP(R)(O)O-、-OP(O)(S)O-、-S(O)
2-及環烴以及雜環烴。在一些實施例中，各E
1獨立地選自-O-、-S-、-NH-、-NR-、-C(O)-O-、-OC(O)O-、-P(O)
2O-、-OP(O)
2O-及-OP(R)(O)O。
在一些實施例中，各E
1為-O-。
在一些實施例中，各E
1為-S-。
在一些實施例中，R
1中之至少一個C
1-5脂族基團視情況經一個E
2取代。
在一些實施例中，各E
2獨立地選自-OH、-OR、-ROR、-SH、-SR、-C(O)-R、-C(O)-OR、-OC(O)-OR、-C(O)-H、-C(O)-OH、-OPO
3、-PO
3、-RPO
3、-S(O)
2-R、-S(O)
2-OR、-RS(O)
2-R、-RS(O)
2-OR、-SO
3及環烴以及雜環烴。在一些實施例中，各E
2獨立地選自-OH、-OR、-SH、-SR、-C(O)-R、-C(O)-OR、-OC(O)-OR、-OPO
3、-PO
3、-RPO
3及-SO
3。
在一些實施例中，各E
2為-OH或-OR。
在一些實施例中，各E
2為-SH或-SR。
在一些實施例中，內部連接子包含至少兩個、三個、四個、五個或六個彼此共價連接的乙二醇次單元。在一些實施例中，內部連接子包含具有1至10個乙二醇單元之連接子。在一些實施例中，內部連接子包含具有2至7個乙二醇單元之連接子。在一些實施例中，內部連接子包含具有3至6個乙二醇單元之連接子。在一些實施例中，內部連接子包含具有3個乙二醇單元之連接子。在一些實施例中，內部連接子包含具有6個乙二醇單元之連接子。
在一些實施例中，內部連接子包含PEG-連接子。在一些實施例中，內部連接子包含具有1至9個乙二醇單元之PEG-連接子。在一些實施例中，內部連接子包含具有3至6個乙二醇單元之PEG-連接子。在一些實施例中，內部連接子包含具有3個乙二醇單元之PEG-連接子。在一些實施例中，內部連接子包含具有6個乙二醇單元之PEG-連接子。
在一些實施例中，內部連接子具有約9至30個原子、視情況約15至21個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少4個核苷酸。為簡潔起見，具有約15至21個原子之橋接長度的內部連接子在本文其他處被稱為「連接子1」。具有約9至30個原子、視情況約15至21個原子之橋接長度的內部連接子可選自本文所描述之任何此類實施例。具有約9至30個原子、視情況約15至21個原子之橋接長度的內部連接子可具有本文針對內部連接子所描述之任何相容特徵。
在一些實施例中，連接子包含複數個聚乙二醇次單元，諸如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個聚乙二醇次單元。在一些實施例中，連接子包含至少5、6或7個聚乙二醇次單元。在一些實施例中，連接子由至少5、6或7個聚乙二醇次單元組成。
在一些實施例中，內部連接子具有約6至18個原子、視情況約6至12個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少2個核苷酸。為簡潔起見，具有約6至18個原子、視情況約6至12個原子之橋接長度的內部連接子在本文其他處被稱為「連接子2」。具有約6至18個原子、視情況約6至12個原子之橋接長度的內部連接子可選自本文所描述之任何此類實施例。具有約6至12個原子之橋接長度的內部連接子可具有本文針對內部連接子所描述之任何相容特徵。在一些實施例中，連接子2包含複數個聚乙二醇(PEG)次單元，諸如至少2、3或4個聚乙二醇次單元。在一些實施例中，連接子1包含至少2、3或4個聚乙二醇次單元。在一些實施例中，連接子1由至少2、3或4個聚乙二醇次單元組成。
含有連接子之例示性PEG包括以下：
用於本文所提供之組合物及方法中的連接子為此項技術中已知的，且可購自各種來源，包括但不限於Biosearch Technologies (例如Spacer-CE胺基亞磷酸酯C2，2-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)乙基-1-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-胺基亞磷酸酯；及C6 Spacer亞胺酸酯(DMT-1,6-己二醇))；Glen Research (Spacer胺基亞磷酸酯C3，3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基-1-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-胺基亞磷酸酯；Spacer胺基亞磷酸酯9，9-O-二甲氧基三苯甲基-三乙二醇,1-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-胺基亞磷酸酯；Spacer C12 CE胺基亞磷酸酯，12-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)十二烷基-1-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-胺基亞磷酸酯；及Spacer胺基亞磷酸酯18，18-O-二甲氧基三苯甲基六乙二醇,1-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-胺基亞磷酸酯)。
C. 製備方法
提供合成包含本文所揭示之內部連接子之gRNA的方法。適合之前驅體(例如連接子)可藉由在單合成製程中在sgRNA製備方法中使用對應的胺基亞磷酸酯建構嵌段而引入sgRNA寡核苷酸中。此類建構嵌段為市售的或可藉由已知方法製備。
合成方法包括一系列依序偶合反應，包括將第一核苷酸共價連接至第二核苷酸；將內部連接子共價連接至第二核苷酸；及將第三核苷酸共價連接至內部連接子。在某些實施例中，此等連接係使用胺基亞磷酸酯化學方法進行。在某些實施例中，該方法包括在共價連接第三核苷酸之前將第二連接子共價連接至第一連接子。
在一些實施例中，提供共價連接至本文所揭示之gRNA之連接子的固體載體。
本文所提供之具有內部連接子之gRNA在單合成製程中製得，使得藉由合成方法產生全長gRNA股(sgRNA、crRNA或trRNA)。在dgRNA的情況下，crRNA及trRNA單獨合成且經黏接。亦即，當gRNA以dgRNA之形式製備時，單獨合成的部分不需要共價連接以形成穩定gRNA。在某些實施例中，含有如本文所提供之內部連接子的dgRNA之crRNA及trRNA不包括crRNA與trRNA之間的共價連接。
在較佳實施例中，gRNA不使用點擊化學法製備。
D. 引導 RNA 之類型
在一些實施例中，引導RNA為單引導RNA。
在一些實施例中，引導RNA包含tracrRNA (trRNA)。
例示性gRNA之序列展示於下表1A中。在一些實施例中，引導RNA包含SEQ ID NO: 200-210及500-501中之任一者之核酸序列，其中內部連接子取代一或多個核苷酸。在一些實施例中，表1A中以粗體展示之至少一個核苷酸經內部連接子置換。在一些實施例中，表1中以粗體展示之至少兩個連續核苷酸經內部連接子置換。在一些實施例中，表1A中以粗體展示之至少三個連續核苷酸經內部連接子置換。在一些實施例中，表1A中以粗體展示之至少四個連續核苷酸經內部連接子置換。在一些實施例中，表1A中以粗體展示之至少兩個非連續核苷酸經內部連接子置換。在一些實施例中，表1A中以粗體展示之至少第一兩個或更多個連續核苷酸及至少第二兩個或更多個連續核苷酸經內部連接子置換，其中第一兩個或更多個連續核苷酸與第二兩個或更多個連續核苷酸不連續。在一些實施例中，表1A中以粗體展示之至少第一三個或更多個連續核苷酸及至少第二三個或更多個連續核苷酸經內部連接子置換，其中第一三個或更多個連續核苷酸與第二三個或更多個連續核苷酸不連續。在一些實施例中，表1A中以粗體展示之至少第一四個或更多個連續核苷酸及至少第二兩個或更多個連續核苷酸經內部連接子置換，其中第一四個或更多個連續核苷酸與第二兩個或更多個連續核苷酸不連續。在一些實施例中，表1A中以粗體展示之至少第一四個或更多個連續核苷酸及至少第二四個或更多個連續核苷酸經內部連接子置換，其中第一四個或更多個連續核苷酸與第二四個或更多個連續核苷酸不連續。
表 1A. 例示性引導 RNA 之表(如本文所用，「連接子1」係指具有約15至21個原子之橋接長度的內部連接子。如本文所用，「連接子2」係指具有約6至12個原子之橋接長度的內部連接子。)
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| Cas 類型 | 長度(nt) | SEQ ID NO: | gRNA 序列 ( 例示性核苷酸經受粗體的內部連接子之置換。在一些實施例中，粗斜體指示連接子1 置換且粗體羅馬字體( 非斜體) 指示連接子2 置換。) | 連接子數目 |
| SpyCas9 1-4 | 100 | 200 | NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUA GAAA UAGCAAGUUAAAAUAAGGC UAGUCCGUUAUCAACUU GAAA AAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | 3 |
| SpyCas9 1-4 | 90 | 201 | NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUA GAAA UAGCAAGUUAAAAUAAGGC UAGUCCGUUAUCAC GAAA GGGCACCGAGUCGGUGC | 3 |
| SauCas9 5 | 100 | 202 | NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGUACUCUG GAAA CAGAAUCUACUAAAACAAGGCA AAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAA CUUG UUGGCGAGAUUUU | 3 |
| CdiCas9 6 | 113 | 203 | NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACUGGGGUUCAG GAAA CUGAACCUCAGUAAGCAUUGGC UCGUUUCCAAUGUUGAUUGCUCCGCCGGUGCUCCUUA UUUU UAAGGGCGCCGGCA | 3 |
| St1Cas9 7 | 117 | 204 | NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUUGUACUCUCAAGAUU CAAU AAUCUUGCAGAAGCUACAAAGAUAAGGCUUCAUGCCGAAAUCAACACCCUGUCAU UUU AUGGCAGGGUGUUUU | 2 |
| SthCas9 8 | 97 | 205 | NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUUGUACUC GAAA GAAGCUACAAAGAUAAGGCU UCAUGCCGAAAUCAACACCCUGUCAU UUU AUGGCAGGGUGU | 3 |
| AceCas9 | 94 | 206 | NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCUGGGGAGCCU GAAA AGGCUACCUAGCAAGACCCC UUCG UGGGGUCGCAUUCUUCACCCCC AGCA GGGGGUUC | 3 |
| CjeCas9 9 | 93 | 207 | NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGUCCCU GAAA AGGGACUAAAAUAAAGAGUUUGCGGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGC | 1 |
| FnoCas9 10 | 94 | 208 | NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUCAGUUGCGCC GAAA GGCGCUCUGUAAUCAUUAAAAAGUAUUUUGAACGGACCUCUGUUUGACACGUCUG | 1 |
| AsCpf1/Cas12a 11 | 45 | 209 | UAAUUUCUACU CUU GUAGAUNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN | 1 |
| EsCas13d 12 | 52 | 210 | CUGGUGCAA AUUUG CACUAGCUUAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN | 1 |
| NmeCas9 13 | 101-145 | 500 | NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUGUAGCUCC CUUUCUCAUUUCG GAAA CGAAAUGAGAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUC U GAAA AGAUGUGCCGCAACGCUCUGCC CCUUAAAGC UUCU GCUUUAAGGGGCAUCGUU UA(帶底線指示可缺失之核苷酸) | 3 |
| 經縮短之NmeCas9 | 101 | 501 | NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUGUAGCUCCCUUC GAAA GACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUC GAAA GAUGUGCCGCAACGCUCUGCC UUCU GGCAUCGUU | 3 |
在一些實施例中，引導RNA包含包括本文其他處所揭示之修飾的SEQ ID NO: 200-210及500中之任一者之核酸序列。例示性sgRNA展示於圖10A至圖10E中，其中展示引導區(目標結合區)及可經內部連接子取代之核苷酸。表1B展示具有可能的內部連接子數目及位置的gRNA結構及物種之各種實施例。
表 1B.
a. SpyCas9引導RNA
| gRNA 結構 | 類型 | 內部連接子數目 | 內部連接子位置 |
| 重複/反重複區；連接區；Hp1；Hp2 | Spy | 3 | 重複/反重複區；連接區(位於髮夾內或置換髮夾)、髮夾1 (Hp1) |
| 重複/反重複區；連接區；Hp1；Hp2 | Spy | 2 | 重複/反重複區、連接區(位於髮夾內或置換髮夾)、Hp1中之任何兩者 |
| 重複/反重複區；連接區；Hp1；Hp2 | Spy | 1 | 重複/反重複區、連接區(位於髮夾內或置換髮夾)、Hp1中之任一者 |
| 重複/反重複區；Hp1；Hp2 | Cdi、Sau、Sth及Ace | 3 | 重複/反重複區、Hp1、Hp2中之所有者 |
| 重複/反重複區；Hp1；Hp2 | Cdi、Sau、Sth及Ace | 2 | 對於Sau，較佳不為Hp2 |
| 重複/反重複區；Hp1；Hp2 | Cdi、Sau、Sth及Ace | 1 | 對於Sau，較佳不為Hp2 |
| 重複/反重複區；Hp1；Hp2 | St1 | 2 | 重複/反重複區；Hp2 |
| 重複/反重複區；Hp1；Hp2 | Cje | 1 | 重複/反重複區 |
| 重複/反重複區 | Cpf1 - 各種 | 1 | 重複/反重複區 |
| 重複/反重複區；Hp1；Hp2 | Nme | 3 | 重複/反重複區、Hp1、Hp2中之所有者 |
| 重複/反重複區；Hp1；Hp2 | Nme | 2 | 重複/反重複區、Hp1、Hp2中之任何兩者 |
| 重複/反重複區；Hp1；Hp2 | Nme | 1 | 重複/反重複區、Hp1、Hp2中之任一者 |
在一些實施例中，引導RNA為化膿鏈球菌Cas9 (「SpyCas9」)引導RNA。如本文所用，SpyCas9引導RNA意謂其對SpyCas9具有功能性。上述情況亦適用於本文所揭示之不同Cas9物種之其他gRNA。
在一些實施例中，引導RNA包含SEQ ID NO: 200或201之核酸序列。在一些實施例中，引導RNA為經修飾之SpyCas9引導RNA。在一些實施例中，引導RNA包含包括本文其他處所揭示之修飾的SEQ ID NO: 200或201之核酸序列。
在一些實施例中，sgRNA包含引導區及引導區之3'的保守部分，其中保守部分包含重複反重複區、連接區、髮夾1區及髮夾2區，且包含以下中之至少一者：
第一內部連接子，其取代重複反重複區之上莖區的至少2個核苷酸、視情況至少4個核苷酸；
第二內部連接子，其取代連接區之1或2個核苷酸；及
第三內部連接子，其取代髮夾1之至少2個核苷酸。
例示性SpyCas9 sgRNA展示於圖10A中，其中展示引導區(目標結合區)，以及可經重複反重複區中之第一連接子、連接區中之第二連接子及髮夾1區中之第三連接子取代的核苷酸。
在一些實施例中，sgRNA包含第一內部連接子及第二內部連接子。在一些實施例中，sgRNA包含第一內部連接子及第三內部連接子。在一些實施例中，sgRNA包含第二內部連接子及第三內部連接子。在一些實施例中，sgRNA包含第一內部連接子、第二內部連接子及第三內部連接子。
在一些實施例中，第一內部連接子具有約9至30個原子、視情況約15至21個原子之橋接長度。
在一些實施例中，第一內部連接子取代上莖區之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。在一些實施例中，第一內部連接子取代上莖區之環或其部分。在一些實施例中，第一內部連接子取代上莖區之環及莖或其部分。
在一些實施例中，第一內部連接子取代上莖區之環的2、3或4個核苷酸。在一些實施例中，第一內部連接子取代上莖區之環的4個核苷酸。
在一些實施例中，第一內部連接子取代上莖區之環及上莖區之莖的至少2、4、6或8個核苷酸。在一些實施例中，第一內部連接子取代上莖區之環及上莖區之莖的1、2、3或4個鹼基對。在一些實施例中，第一內部連接子取代上莖區之環及上莖區之莖的1個鹼基對。在一些實施例中，第一內部連接子取代上莖區之環及上莖區之莖的2個鹼基對。在一些實施例中，第一內部連接子取代上莖區之環及上莖區之莖的3個鹼基對。在一些實施例中，第一內部連接子取代上莖區之環及上莖區之莖的4個鹼基對。
在一些實施例中，第一內部連接子取代構成上莖區(亦即，隆突上方的莖之部分)之環的所有核苷酸。在一些實施例中，第一內部連接子取代構成上莖區之環及莖的所有核苷酸。
在一些實施例中，重複反重複區中之隆突不含有連接子。在一些實施例中，重複反重複區中之下莖部分不含有連接子。
在一些實施例中，第二內部連接子具有約6至18個原子、視情況9至18個原子之橋接長度。在一些實施例中，第二內部連接子取代sgRNA之連接區的2個核苷酸。
在一些實施例中，第三內部連接子具有約9至30個原子、視情況15至21個原子之橋接長度。
在一些實施例中，第三內部連接子取代gRNA之髮夾1的2、4、6、8或10個核苷酸。在一些實施例中，第三連接子取代gRNA之髮夾1的1、2、3、4或5個鹼基對。在一些實施例中，第三連接子取代gRNA之髮夾1的1個鹼基對。在一些實施例中，第三連接子取代gRNA之髮夾1的2個鹼基對。在一些實施例中，第三連接子取代gRNA之髮夾1的3個鹼基對。在一些實施例中，第三連接子取代gRNA之髮夾1的4個鹼基對。在一些實施例中，第三連接子取代gRNA之髮夾1的5個鹼基對。
在一些實施例中，第三內部連接子取代髮夾1之環或其部分。在一些實施例中，第三內部連接子取代髮夾1之環及莖或其部分。
在一些實施例中，第三內部連接子取代髮夾1之環的2、3或4個核苷酸。在一些實施例中，第一內部連接子取代髮夾1之環的2個核苷酸。在一些實施例中，第一內部連接子取代髮夾1之環的3個核苷酸。在一些實施例中，第一內部連接子取代髮夾1之環的4個核苷酸。
在一些實施例中，第三內部連接子取代髮夾之環及髮夾之莖的至少1個核苷酸。在一些實施例中，第三內部連接子取代髮夾之環及髮夾之莖的2、4或6個核苷酸。在一些實施例中，重複反重複區中之第三內部連接子取代髮夾之環及髮夾之莖的1、2或3個鹼基對。
在一些實施例中，第三內部連接子取代構成髮夾之環的所有核苷酸。在一些實施例中，第三內部連接子取代構成髮夾之環及莖的所有核苷酸。
在一些實施例中，sgRNA之髮夾2區不含有任何內部連接子。
在一些實施例中，第二內部連接子取代sgRNA之連接區之環的2個核苷酸。
在一些實施例中，sgRNA包含含有SEQ ID NO: 200之序列的保守部分。在一些實施例中，核苷酸33至36中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 200經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸32至37相對於SEQ ID NO: 200經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸31至38相對於SEQ ID NO: 200經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸30至39相對於SEQ ID NO: 200經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸29至40相對於SEQ ID NO: 200經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸55至56相對於SEQ ID NO: 200經第二內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸73至76中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 200經第三內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸72至77相對於SEQ ID NO: 200經第三內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸71至78相對於SEQ ID NO: 200經第三內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸70至79相對於SEQ ID NO: 200經第三內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸97至100相對於SEQ ID NO: 200缺失。
在一些實施例中，sgRNA包含SEQ ID NO: 201之序列。在一些實施例中，核苷酸33至36中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 201經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸32至37相對於SEQ ID NO: 201經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸31至38相對於SEQ ID NO: 201經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸30至39相對於SEQ ID NO: 201經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸29至40相對於SEQ ID NO: 201經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸55至56相對於SEQ ID NO: 201經第二內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸50至53中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 201經第三內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸49至54相對於SEQ ID NO: 201經第三內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸77至80相對於SEQ ID NO: 201缺失。
b. 額外引導RNA
在一些實施例中，sgRNA不來自化膿鏈球菌Cas9 (「非spyCas9」)。
在一些實施例中，引導RNA為金黃色葡萄球菌
Cas9(「SauCas9」)引導RNA。例示性SauCas9 sgRNA展示於圖10B中。在一些實施例中，引導RNA為經修飾之SauCas引導RNA。
在一些實施例中，sgRNA包含引導區及引導區之3'的保守部分，其中保守部分包含重複反重複區、髮夾1區及髮夾2區，且進一步包含以下中之至少一者：
1) 第一內部連接子，其取代sgRNA之重複反重複區之上莖區的至少2個核苷酸、視情況至少4個核苷酸；
2) 第二內部連接子，其取代sgRNA之髮夾1的1或2個核苷酸；或
3) 第三內部連接子，其取代sgRNA之髮夾2的至少2個核苷酸、視情況至少4個核苷酸。
在一些實施例中，sgRNA包含第一內部連接子及第二內部連接子。在一些實施例中，sgRNA包含第一內部連接子及第三內部連接子。在一些實施例中，sgRNA包含第二內部連接子及第三內部連接子。在一些實施例中，sgRNA包含第一內部連接子、第二內部連接子及第三內部連接子。
在一些實施例中，第一內部連接子具有約9至30個原子、視情況約15至21個原子之橋接長度。在一些實施例中，第一內部連接子位於sgRNA之第一部分與sgRNA之第二部分之間的髮夾中，其中第一部分及第二部分一起形成雙螺旋部分。在一些實施例中，第一內部連接子取代上莖區之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。在一些實施例中，第一內部連接子取代上莖區之環或其部分。在一些實施例中，第一內部連接子取代上莖區之環及莖或其部分。在一些實施例中，第一內部連接子取代上莖區之環的2、3或4個核苷酸。
在一些實施例中，第一內部連接子取代上莖區之環及上莖區之莖的至少2、4、6或8個核苷酸。在一些實施例中，第一內部連接子取代上莖區之環及上莖區之莖的1、2、3或4個鹼基對。在一些實施例中，第一內部連接子取代構成上莖區之環的所有核苷酸。
在一些實施例中，第二內部連接子具有約9至18個原子之橋接長度。在一些實施例中，第二內部連接子取代sgRNA之髮夾1的2個核苷酸。在一些實施例中，第二內部連接子取代sgRNA之連接區之莖區的2個核苷酸。
在一些實施例中，第三內部連接子具有約9至30個原子、視情況約15至21個原子之橋接長度。在一些實施例中，第三內部連接子取代gRNA之髮夾2的4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。在一些實施例中，第三連接子取代gRNA之髮夾2的1、2、3、4或5個鹼基對。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾2之2至6個核苷酸。在一些實施例中，內部連接子取代髮夾2之2至4個核苷酸。
在一些實施例中，第三內部連接子取代髮夾2之環或其部分。在一些實施例中，第三內部連接子取代髮夾2之環及莖或其部分。
在一些實施例中，第三內部連接子取代髮夾2之環的2、3或4個核苷酸。在一些實施例中，第三內部連接子取代髮夾之環及髮夾2之莖的至少1個核苷酸。在一些實施例中，第三內部連接子取代髮夾之環及髮夾2之莖的2、3、4、5或6個核苷酸。在一些實施例中，重複反重複區中之第三內部連接子取代髮夾之環及髮夾2之莖的1、2或3個鹼基對。在一些實施例中，第三內部連接子取代構成髮夾2之環的所有核苷酸。在一些實施例中，第三內部連接子位於sgRNA之第一部分與sgRNA之第二部分之間的髮夾中，其中第一部分及第二部分一起形成雙螺旋部分。
在一些實施例中，引導RNA包含SEQ ID NO: 202之核酸序列。在一些實施例中，引導RNA包含包括本文其他處所揭示之修飾的SEQ ID NO: 202之核酸序列。
在一些實施例中，核苷酸35至38中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 202經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸34至39相對於SEQ ID NO: 202經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸33至40相對於SEQ ID NO: 202經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸32至41相對於SEQ ID NO: 202經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸31至42相對於SEQ ID NO: 202經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸61至62相對於SEQ ID NO: 202經第二內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸84至87中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 202經第三內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸83至88相對於SEQ ID NO: 202經第三內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸82至89相對於SEQ ID NO: 202經第三內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸81至90相對於SEQ ID NO: 202經第三內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸97至100相對於SEQ ID NO: 202缺失。
在一些實施例中，其中gRNA為SauCas9引導RNA，且不包括第三內部連接子。
在一些實施例中，引導RNA為白喉棒狀桿菌Cas9 (「CdiCas9」)引導RNA。在一些實施例中，引導RNA為經修飾之CdiCas9引導RNA。在一些實施例中，引導RNA包含SEQ ID NO: 203之核酸序列。在一些實施例中，引導RNA包含包括本文其他處所揭示之修飾的SEQ ID NO: 203之核酸序列。
在一些實施例中，gRNA為白喉棒狀桿菌Cas9 (CdiCas9)引導RNA、嗜熱鏈球菌Cas9 (SthCas9)引導RNA或解纖維熱酸菌Cas9 (AceCas9)引導RNA。
在一些實施例中，引導RNA為嗜熱鏈球菌Cas9 (「St1Cas9」或「SthCas9」)引導RNA。在一些實施例中，引導RNA為經修飾之St1Cas9引導RNA。在一些實施例中，引導RNA包含SEQ ID NO: 204或205之核酸序列。在一些實施例中，引導RNA包含包括本文其他處所揭示之修飾的SEQ ID NO: 204或205之核酸序列。
在一些實施例中，sgRNA包含引導區及引導區之3'的保守部分，其中保守部分包含重複反重複區、髮夾1區及髮夾2區，且包含取代重複反重複區之至少4個核苷酸的第一內部連接子及取代髮夾2之至少3個核苷酸的第二內部連接子。
在一些實施例中，第一內部連接子具有約15至21個原子之橋接長度。在一些實施例中，第一內部連接子取代gRNA之重複反重複區的4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。在一些實施例中，第一內部連接子位於sgRNA之第一部分與重複反重複區之第二部分之間的髮夾中，其中第一部分及第二部分一起形成雙螺旋部分。
在一些實施例中，第一內部連接子取代重複反重複區之髮夾的環或其部分。在一些實施例中，第一內部連接子取代重複反重複區之髮夾的環及莖或其部分。
在一些實施例中，第一內部連接子取代重複反重複區之髮夾結構之環的2、3或4個核苷酸。在一些實施例中，第一內部連接子取代髮夾結構之環及重複反重複區之髮夾結構之莖的至少2、4、6、8、10或12個核苷酸。在一些實施例中，第一內部連接子取代髮夾結構之環及重複反重複區之髮夾結構之莖的1、2、3、4、5或6個鹼基對。在一些實施例中，第一內部連接子取代構成重複反重複區之髮夾結構之環的所有核苷酸。在一些實施例中，第一內部連接子取代構成重複反重複區之上莖區(亦即，隆突上方的重複反重複區之部分)之髮夾結構的環及莖的所有核苷酸。在一些實施例中，第二內部連接子具有約9至30個、視情況約15至21個原子之橋接長度。在一些實施例中，第二內部連接子取代gRNA之髮夾2的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸。在一些實施例中，第二內部連接子取代髮夾2之環區。在一些實施例中，第二內部連接子取代髮夾2之環區及莖區之部分。在一些實施例中，第二內部連接子取代髮夾2之環或其部分。在一些實施例中，第二內部連接子取代髮夾2之環及莖或其部分。在一些實施例中，第二內部連接子取代髮夾2之環的2、3或4個核苷酸。在一些實施例中，第二內部連接子取代構成髮夾2之環的所有核苷酸。在一些實施例中，第二內部連接子取代髮夾2之環及髮夾2之莖的至少1、2、3、4、5或6個核苷酸。在一些實施例中，第二內部連接子取代髮夾之環及髮夾2之莖的1、2或3個鹼基對。
在一些實施例中，sgRNA包含SEQ ID NO: 204之序列。在一些實施例中，核苷酸41至44相對於SEQ ID NO: 204經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸101至103相對於SEQ ID NO: 204經第二內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸94至111內之2至18個核苷酸相對於SEQ ID NO: 204經取代。
在一些實施例中，引導RNA為解纖維熱酸菌Cas9 (「AceCas9」)引導RNA。在一些實施例中，引導RNA為經修飾之AceCas9引導RNA。在一些實施例中，引導RNA包含SEQ ID NO: 206之核酸序列。在一些實施例中，引導RNA包含包括本文其他處所揭示之修飾的SEQ ID NO: 206之核酸序列。
在一些實施例中，引導RNA為空腸彎曲桿菌Cas9 (「CjeCas9」)引導RNA。在一些實施例中，引導RNA為經修飾之CjeCas9引導RNA。
在一些實施例中，gRNA包含引導區及引導區之3'的保守部分，其中保守部分包含重複反重複區及髮夾區，且包含取代重複反重複區之至少4個核苷酸的內部連接子。在一些實施例中，第一內部連接子具有約9至30個原子、視情況約15至21個原子之橋接長度。在一些實施例中，第一內部連接子取代gRNA之重複反重複區的4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。在一些實施例中，第一內部連接子位於sgRNA之第一部分與重複反重複區之第二部分之間的髮夾結構中，其中第一部分及第二部分一起形成雙螺旋部分。
在一些實施例中，引導RNA包含SEQ ID NO: 207之核酸序列。在一些實施例中，引導RNA包含包括本文其他處所揭示之修飾的SEQ ID NO: 207之核酸序列。在一些實施例中，其中相對於SEQ ID NO: 207，核苷酸33至36經內部連接子取代。在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 207，核苷酸27至32及37至42之1、2、3、4、5或6個鹼基對經內部連接子取代。
在一些實施例中，Cpf1引導RNA為新兇手弗朗西斯氏菌Cas9 (「FnoCas9」)引導RNA。在一些實施例中，引導RNA為經修飾之FnoCas9引導RNA。
在一些實施例中，gRNA包含重複反重複區及取代重複反重複區之至少4個核苷酸的內部連接子。在一些實施例中，內部連接子具有約9至30個原子、視情況約15至21個原子之橋接長度。在一些實施例中，內部連接子取代gRNA之重複反重複區的3、4、5或6個核苷酸。
在一些實施例中，引導RNA包含SEQ ID NO: 208之核酸序列。在一些實施例中，引導RNA包含包括本文其他處所揭示之修飾的SEQ ID NO: 208之核酸序列。在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 208，核苷酸40至43中之2、3或4者經內部連接子取代。在一些實施例中，其中相對於SEQ ID NO: 208，核苷酸39至44經內部連接子取代。
VI 型 Cpf1 引導 RNA
在一些實施例中，gRNA為Cpf1引導RNA。在一些實施例中，引導RNA為AsCpf1/Cas12a引導RNA。例示性AsCpf1/Cas12a sgRNA示於圖10C中。在一些實施例中，引導RNA為經修飾之AsCpf1/Cas12a引導RNA。在一些實施例中，引導RNA包含SEQ ID NO: 209之核酸序列。在一些實施例中，引導RNA包含包括本文其他處所揭示之修飾的SEQ ID NO: 209之核酸序列。在一些實施例中，gRNA包含SEQ ID NO: 209之序列，且相對於SEQ ID NO: 209，核苷酸11至14、12至15或視情況12至14經內部連接子取代。
在一些實施例中，引導RNA為惰性真桿菌(Es) Cas13d (EsCas13d)引導RNA。例示性EsCas13d sgRNA示於圖10D中。在一些實施例中，引導RNA包含SEQ ID NO: 210之核酸序列。在一些實施例中，引導RNA包含包括本文其他處所揭示之修飾的SEQ ID NO: 210之核酸序列。在一些實施例中，gRNA包含SEQ ID NO: 210之序列，且相對於SEQ ID NO: 210，核苷酸9至16或視情況10至15或其至少2個核苷酸經內部連接子取代。
例示性Nme sgRNA展示於圖10E中，且下文提供各種實施例。
包含至少一個內部連接子之各種例示性sgRNA提供於表2A至2B中。核苷酸修飾在表2A至2B中如下指示：m：2'-OMe；*：PS鍵聯。因此，舉例而言，mA表示2'-O-甲基腺苷。
當提供未經修飾之核苷酸序列時，A、C、G及U獨立地為未經修飾或經修飾之RNA核苷酸。在某些實施例中，當提供經修飾之核苷酸序列時，A、C、G及U為未經修飾之RNA核苷酸。在某些實施例中，當提供經修飾之核苷酸序列時，A、C、G及U獨立地為未經修飾或經修飾之RNA核苷酸。
在本文中之表中，L1及L2視情況分別為如下C9及C18：
sgRNA名稱有時用緊接著G之後的一或多個前置零提供。此不影響名稱之含義。因此，舉例而言，G000282、G0282、G00282及G282係指相同sgRNA。類似地，crRNA及或trRNA名稱有時分別用緊接著CR或TR之後的一或多個前置零提供，其不影響名稱之含義。因此，舉例而言，CR000100、CR00100、CR0100及CR100係指相同crRNA，且TR000200、TR00200、TR0200及TR200係指相同trRNA。
包含內部連接子之例示性SpyCas9引導RNA提供於表2A至2C中。如本文所用，「連接子1」或「L1」係指具有約15至21個原子之橋接長度的內部連接子。如本文所用，「連接子2」或「L2」係指具有約6至12個原子(例如約9個原子)之橋接長度的內部連接子；「連接子3」或「L3」係指具有約6個原子之橋接長度的內部連接子；「連接子4」或「L4」係指具有約3個原子之橋接長度的內部連接子；「dS」係指無鹼基核苷
表 2A. 例示性 gRNA 序列之表
表 2B. 額外例示性 gRNA 序列
表 2C. 包含連接子之例示性 SpyCas9 引導 RNA
| 引導物ID | SEQ ID NO. | sgRNA 未經修飾序列 | SEQ ID NO. | sgRNA 經修飾序列 |
| G022497 | 1 | ACGCAAAUAUCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUA( L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGC( L2)GUCCGUUAUCAC( L1)GGGCACCGAGUCGGUGC | 101 | mA*mC*mG*CAAAUAUCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmA( L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC( L2)GUCCGUUAUCAC( L1)GGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G022498 | 2 | ACGCAAAUAUCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUA( L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGC( L2)GUCCGUUAUCA( L1)GGCACCGAGUCGGUGC | 102 | mA*mC*mG*CAAAUAUCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmA( L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC( L2)GUCCGUUAUCA( L1)GGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G022499 | 3 | ACGCAAAUAUCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCU( L1)AGCAAGUUAAAAUAAGGC( L2)GUCCGUUAUCAC( L1)GGGCACCGAGUCGGUGC | 103 | mA*mC*mG*CAAAUAUCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmU( L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC( L2)GUCCGUUAUCAC( L1)GGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G022500 | 4 | ACGCAAAUAUCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCU( L1)AGCAAGUUAAAAUAAGGC( L2)GUCCGUUAUCA( L1)GGCACCGAGUCGGUGC | 104 | mA*mC*mG*CAAAUAUCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmU( L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC( L2)GUCCGUUAUCA( L1)GGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G022501 | 5 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUA( L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGC( L2)GUCCGUUAUCAC( L1)GGGCACCGAGUCGGUGC | 105 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmA( L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC( L2)GUCCGUUAUCAC( L1)GGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G022502 | 6 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUA( L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGC( L2)GUCCGUUAUCA( L1)GGCACCGAGUCGGUGC | 106 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmA( L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC( L2)GUCCGUUAUCA( L1)GGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G022503 | 7 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCU( L1)AGCAAGUUAAAAUAAGGC( L2)GUCCGUUAUCAC( L1)GGGCACCGAGUCGGUGC | 107 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmU( L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC( L2)GUCCGUUAUCAC( L1)GGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G022504 | 8 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCU( L1)AGCAAGUUAAAAUAAGGC( L2)GUCCGUUAUCA( L1)GGCACCGAGUCGGUGC | 108 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmU( L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC( L2)GUCCGUUAUCA( L1)GGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G018631 (對照) | 9 | ACGCAAAUAUCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC | 109 | mA*mC*mG*CAAAUAUCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G017276 (對照) | 10 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC | 110 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G000502 (對照) | 11 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | 111 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| G000534 (對照) | 12 | ACGCAAAUAUCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | 112 | mA*mC*mG*CAAAUAUCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| G012401 | 13 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC | 113 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G017278 | 14 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACAAGGGCACCGAGUCGGUGC | 114 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| 引導物ID | SEQ ID NO. | sgRNA 未經修飾序列 | SEQ ID NO. | sgRNA 經修飾序列 |
| G018666 | 20 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAG(L2)UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU | 120 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmG(L2)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018667 | 21 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUA(L2)UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU | 121 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmA(L2)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018668 | 22 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUG(L2)AGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU | 122 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmG(L2)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018669 | 23 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCU(L2)AGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU | 123 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmU(L2)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018670 | 24 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGC(L2)GCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU | 124 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmC(L2)mGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018671 | 25 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCG(L2)GCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU | 125 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmG(L2)mGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018672 | 26 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAG(L2)CAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU | 126 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmG(L2)mCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018673 | 27 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAG(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU | 127 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmG(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018674 | 28 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUA(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU | 128 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018675 | 29 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUG(L1)AGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU | 129 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmG(L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018676 | 30 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCU(L1)AGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU | 130 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmU(L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018677 | 31 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCG(L1)GCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU | 131 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmG(L1)mGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018678 | 32 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGC(L1)GCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU | 132 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmC(L1)mGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018679 | 33 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAG(L1)CAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU | 133 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmG(L1)mCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018680 | 34 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGC(L4)GUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU | 134 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L4)GUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018681 | 35 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU | 135 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018682 | 36 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGC(L1)GUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU | 136 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L1)GUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018683 | 37 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAC(L2)UGGCACCGAGUCGGUGCU | 137 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAC(L2)UGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018684 | 38 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAC(L2)GGCACCGAGUCGGUGCU | 138 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAC(L2)GGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018685 | 39 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA(L2)UGGCACCGAGUCGGUGCU | 139 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA(L2)UGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018686 | 40 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA(L2)GGCACCGAGUCGGUGCU | 140 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA(L2)GGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018687 | 41 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAC(L1)UGGCACCGAGUCGGUGCU | 141 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAC(L1)UGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018688 | 42 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAC(L1)GGCACCGAGUCGGUGCU | 142 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAC(L1)GGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018689 | 43 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGGUGCU | 143 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018690 | 44 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA(L1)GGCACCGAGUCGGUGCU | 144 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA(L1)GGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018691 | 45 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUA(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU | 145 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018692 | 46 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUA(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGC(L1)GUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU | 146 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L1)GUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018693 | 47 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUA(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA(L2)UGGCACCGAGUCGGUGCU | 147 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA(L2)UGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018694 | 48 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUA(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGGUGCU | 148 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018695 | 49 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUA(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAA(L2)UGGCACCGAGUCGGUGCU | 149 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAA(L2)UGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018696 | 50 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUA(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGC(L1)GUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGGUGCU | 150 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L1)GUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018697 | 51 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAG(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAA(L2)UGGCACCGAGUCGGUGCU | 151 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmG(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAA(L2)UGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018698 | 52 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAG(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGC(L1)GUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGGUGCU | 152 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmG(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L1)GUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018699 | 53 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCU(L1)AGCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAA(L2)UGGCACCGAGUCGGUGCU | 153 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmU(L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAA(L2)UGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018700 | 54 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCU(L1)AGCAAGUUAAAAUAAGGC(L1)GUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGGUGCU | 154 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmU(L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L1)GUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018701 | 55 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUG(L1)AGCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAA(L2)UGGCACCGAGUCGGUGCU | 155 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmG(L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAA(L2)UGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018702 | 56 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUG(L1)AGCAAGUUAAAAUAAGGC(L1)GUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGGUGCU | 156 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmG(L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L1)GUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018703 | 57 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGC(L1)GCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAA(L2)UGGCACCGAGUCGGUGCU | 157 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmC(L1)mGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAA(L2)UGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018704 | 58 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGC(L1)GCAAGUUAAAAUAAGGC(L1)GUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGGUGCU | 158 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmC(L1)mGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L1)GUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018705 | 59 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L2)GGGCACCGAGUCGGUGCU | 159 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L2)GGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018706 | 60 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGUGCU | 160 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018707 | 61 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCA(L1)GGCACCGAGUCGGUGCU | 161 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCA(L1)GGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018708 | 62 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCA(L2)GGCACCGAGUCGGUGCU | 162 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCA(L2)GGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G018804 | 63 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC | 163 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmCmGmAmAmAmGmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC |
| G018805 | 64 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC | 164 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACmGmAmAmAmGmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC |
| G018806 | 65 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUA(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC | 165 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G018807 | 66 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGUGC | 166 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G018808 | 67 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUA(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGC(L1)GUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGUGC | 167 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L1)GUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G018809 | 68 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUA(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGUGC | 168 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G018810 | 69 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUA(L2)UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC | 169 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmA(L2)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G018811 | 70 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC | 170 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmAmAmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC |
| G018812 | 71 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC | 171 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAmAmAmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC |
| G018813 | 72 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUA(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC | 172 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G018814 | 73 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGGUGC | 173 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G018815 | 74 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUA(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGGUGC | 174 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G018816 | 75 | ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGC(L1)GCAAGUUAAAAUAAGGC(L1)GUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGGUGC | 175 | mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmC(L1)mGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L1)GUCCGUUAUCAA(L1)UGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| G030924 (目標基因：HEK3) | 77 | GGCCCAGACUGAGCACGUGAGUUUUAGA(dS)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGUGCU | 177 | mG*mG*mC*CCAGACUGAGCACGUGAGUUUUAGA(dS)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G030925 (目標基因：HEK3) | 78 | GGCCCAGACUGAGCACGUGAGUUUUAGA(L4)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGUGCU | 178 | mG*mG*mC*CCAGACUGAGCACGUGAGUUUUAGA(S3)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G030926 (目標基因：HEK3) | 79 | GGCCCAGACUGAGCACGUGAGUUUUAGA(L3)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGUGCU | 179 | mG*mG*mC*CCAGACUGAGCACGUGAGUUUUAGA(L3)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G030927 (目標基因：HEK3) | 80 | GGCCCAGACUGAGCACGUGAGUUUUAGA(L2)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGUGCU | 180 | mG*mG*mC*CCAGACUGAGCACGUGAGUUUUAGA(L2)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G030928 (目標基因：HEK3) | 81 | GGCCCAGACUGAGCACGUGAGUUUUAGA(L1)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGUGCU | 181 | mG*mG*mC*CCAGACUGAGCACGUGAGUUUUAGA(L1)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G030929 (目標基因：HEK3) | 82 | GGCCCAGACUGAGCACGUGAGUUUUAGAGC(L1)GCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGUGCU | 182 | mG*mG*mC*CCAGACUGAGCACGUGAGUUUUAGAmGmC(L1)mGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G025989 (目標基因：HEK3) | 83 | GGCCCAGACUGAGCACGUGAGUUUUAGAGCUA(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGUGCU | 183 | mG*mG*mC*CCAGACUGAGCACGUGAGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| G030930 (目標基因：HEK3) | 84 | GGCCCAGACUGAGCACGUGAGUUUUAGAGCUA(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGUGCU | 184 | mG*mG*mC*CCAGACUGAGCACGUGAGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUmCmGmGmU*mG*mC*mU |
| SEQ ID NO: | gRNA 序列 |
| 211 | NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUA(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAACUU(L1)AAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| 212 | NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUA(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGUGC |
| 213 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| 214 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCA(L1)GGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| 215 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmU(L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| 216 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmU(L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCA(L1)GGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| 217 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmU(L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCA(L1)GGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| 218 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmU(L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCA(L1)GGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| 219 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| 220 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCA(L1)GGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| 221 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmU(L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| 222 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmU(L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCA(L1)GGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC |
| 223 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGA(dS)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| 224 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGA(L4)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| 225 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGA(L3)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| 226 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGA(L2)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| 227 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGA(L1)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| 228 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmC(L1)mGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| 229 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU |
| 230 | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUmCmGmGmU*mG*mC*mU |
核苷酸修飾在表2A至2C中如下指示：m：2'-OMe；及*：PS鍵聯。如本文所用，「N」可為任何天然或非天然核苷酸。舉例而言，本文涵蓋表2C中之SEQ ID NO: 230，其中N'經本文所揭示之引導序列中之任一者置換。儘管引導物之核苷酸用N'取代，但該等修飾保持如SEQ ID NO: 230中所示。亦即，儘管引導物之核苷酸置換「N'」，但前三個核苷酸仍為經2'-O-Me修飾的，且在第一核苷酸與第二核苷酸、第二核苷酸與第三核苷酸及第三核苷酸與第四核苷酸之間存在硫代磷酸酯鍵聯。
E. 本文所描述之化學修飾類型
本文揭示在不同位置包含修飾的引導RNA (例如sgRNA、dgRNA及crRNA)。在一些實施例中，包含修飾之gRNA的位置經修飾而具有以下修飾類型中之任一者或多者。
2'-O-甲基修飾
咸信經修飾之糖類控制核苷酸糖環之褶皺，一種影響寡核苷酸對於互補股之結合親和力、雙螺旋體形成及與核酸酶之相互作用的物理性質。糖環上之取代因此可改變此等糖類之構形及褶皺。舉例而言，2'-O-甲基(2'-OMe)修飾可增加寡核苷酸之結合親和力及核酸酶穩定性，但如實例中所示，寡核苷酸中之指定位置處之任何修飾的影響需要憑經驗確定。
術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」可用於表示已經2'-OMe修飾之核苷酸。
核糖核苷酸及經修飾之2'-O-甲基核糖核苷酸可如下描繪：
2'-O-(2-甲氧基乙基)修飾
在一些實施例中，修飾可為2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)。經修飾之2'-O-moe核糖核苷酸可如下描繪：
術語「moeA」、「moeC」、「moeU」或「moeG」可用於表示已經2'-O-moe修飾之核苷酸。
2'-氟修飾
已展示可影響核苷酸糖環之另一化學修飾為鹵素取代。舉例而言，核苷酸糖環上之2'-氟(2'-F)取代可增加寡核苷酸結合親和力及核酸酶穩定性。
在本申請案中，術語「fA」、「fC」、「fU」或「fG」可用於表示已經2'-F取代之核苷酸。
不具有及具有2'-F取代之核糖核苷酸可如下描繪：
硫代磷酸酯修飾
硫代磷酸酯(PS)鍵聯或鍵係指一鍵，其中硫取代磷酸二酯鍵聯(例如核苷酸之間的磷酸二酯鍵聯)中之一個非橋接磷酸酯氧。當硫代磷酸酯用於產生寡核苷酸時，經修飾之寡核苷酸亦可被稱作S-寡核苷酸。
「*」可用於描繪PS修飾。在本申請案中，術語A*、C*、U*或G*可用於表示經PS鍵連接至下一(例如3')核苷酸之核苷酸。在通篇本申請案中，PS修飾係根據其3'碳鍵結至硫代磷酸酯的核苷酸分組；因此，指示PS修飾位於位置1處意謂硫代磷酸酯鍵結至核苷酸1之3'碳及核苷酸2之5'碳。因此，在YA位點指示為「經PS修飾」或其類似者的情況下，PS鍵聯介於Y與A之間或介於A與下一核苷酸之間。
在本申請案中，術語「mA*」、「mC*」、「mU*」或「mG*」可用於表示已經2'-OMe取代且經由PS鍵聯(其有時可稱為「PS鍵」)連接至下一(例如3')核苷酸的核苷酸。類似地，術語「fA*」、「fC*」、「fU*」或「fG*」可用於表示已經2'-F取代且經由PS鍵聯連接至下一(例如3')核苷酸的核苷酸。本文所描述之實施例涵蓋PS鍵聯或鍵之等效物。
下圖展示用S-取代非橋接磷酸酯氧，從而產生PS鍵聯替代磷酸二酯鍵聯：
反向無鹼基修飾
無鹼基核苷酸係指缺乏含氮鹼基之彼等核苷酸。由於無鹼基核苷酸無法形成鹼基對，因此其不會由於不成對的核苷酸(例如隆突、環)而破壞結構之形成。下圖描繪一種寡核苷酸，其具有缺乏鹼基的無鹼基位點(在此情況下，展示為無嘌呤核酸；無鹼基位點亦可為無嘧啶核酸位點，其中無鹼基位點之描述通常參考華特生-克里克鹼基配對，例如無嘌呤核酸位點係指缺乏含氮鹼基且通常將與嘧啶核酸位點存在鹼基配對的位點)，其中鹼基可在呋喃環之1'位置經另一部分取代(例如羥基，如下文所示，以形成核糖或去氧核糖位點，如下文所示，或氫)：
反向鹼基係指鍵聯相對於正常5'至3'鍵聯呈反向(亦即，5'至5'鍵聯或3'至3'鍵聯)之彼等鹼基。舉例而言：
無鹼基核苷酸可經由反向鍵聯連接。舉例而言，無鹼基核苷酸可經由5'至5'鍵聯連接至末端5'核苷酸，或無鹼基核苷酸可經由3'至3'鍵聯連接至末端3'核苷酸。末端5'抑或3'核苷酸處之反向無鹼基核苷酸亦可稱為反向無鹼基端帽。在本申請案中，術語「invd」指示反向無鹼基核苷酸鍵聯。
去氧核糖核苷酸
在gRNA之情形下，去氧核糖核苷酸(其中糖包含2'-去氧位置)視為一種修飾，原因在於相對於標準RNA，核苷酸因質子取代2'位置之羥基而經修飾。除非另外指明，否則未修飾之RNA中之存在於位置U處的去氧核糖核苷酸修飾亦可包含T置換U核鹼基。
雙環核糖類似物
例示性雙環核糖類似物包括鎖定核酸(LNA)、ENA、橋接之核酸(BNA)，或其他LNA樣修飾。在一些情況下，雙環核糖類似物的2'及4'位置經由連接子連接。連接子可具有式-X-(CH
2)
n-，其中n為1或2；X為O、NR或S；且R為H或C
1-3烷基，例如甲基。雙環核糖類似物之實例包括LNA，其包含2'-O-CH
2-4'雙環結構(氧基-LNA) (參見WO 98/39352及WO 99/14226)；2'-NH-CH
2-4'或2'-N(CH
3)-CH
2-4' (胺基-LNA) (Singh等人,
J. Org. Chem.63:10035-10039 (1998)；Singh等人,
J. Org. Chem.63:6078-6079 (1998))；及2'-S-CH
2-4' (硫基-LNA) (Singh等人,
J. Org. Chem.63:6078-6079 (1998)；Kumar等人,
Biorg. Med. Chem. Lett.8:2219-2222 (1998))。
ENA
ENA修飾係指包含2'-
O,4'-
C-伸乙基修飾的核苷酸。ENA核苷酸之例示性結構展示如下，其中波浪線指示與相鄰核苷酸之連接(或視情況可為末端位置，應理解若3'末端核苷酸為ENA核苷酸，則3'位置可包含羥基而非磷酸酯)。關於ENA核苷酸之進一步論述，參見例如Koizumi等人,
Nucleic Acids Res. 31: 3267-3273 (2003)。
UNA
UNA或非鎖定核酸修飾係指一種包含2',3'-seco-RNA修飾的核苷酸，其中2'碳與3'碳彼此不直接鍵結。UNA核苷酸之例示性結構展示如下，其中波浪線指示與相鄰磷酸酯的連接或置換磷酸酯的修飾(或視情況可為末端位置)。關於UNA核苷酸之進一步論述，參見例如Snead等人,
Molecular Therapy2: e103, 數位物件識別碼:10.1038/mtna.2013.36 (2013)。
鹼基修改
鹼基修飾為改變核鹼基結構或其連至主鏈之鍵的任何修飾，包括異構化(如假尿苷)。在一些實施例中，鹼基修飾包括肌苷。在一些實施例中，修飾包含降低RNA核酸內切酶活性的鹼基修飾，其例如藉由干擾RNase對裂解位點的識別或藉由使RNA結構(例如二級結構)穩定，從而減少RNase對裂解位點的可及性。可使RNA結構穩定的例示性鹼基修飾為假尿苷及5-甲基胞嘧啶。參見Peacock等人,
J Org Chem. 76: 7295-7300 (2011)。在一些實施例中，鹼基修飾可如下提高或降低核酸的解鏈溫度(Tm)，例如藉由增強華特生-克里克鹼基對的氫鍵結、形成非典型鹼基對，或形成錯配的鹼基對。
以上修飾及其等效物包括在本文所描述之實施例之範疇內。
YA修飾
YA位點處之修飾(亦稱為YA修飾)可為核苷間鍵聯之修飾、鹼基(嘧啶或腺嘌呤)之修飾(例如藉由化學修飾、取代或以其他方式達成)，或糖之修飾(例如在2'位置，諸如2'-O-烷基、2'-F、2'-moe、2'-F阿拉伯糖、2'-H (去氧核糖)及其類似者)。在一些實施例中，「YA修飾」為改變二核苷酸模體結構以降低RNA核酸內切酶活性的任何修飾，其例如藉由干擾RNase對YA位點的識別或裂解或藉由使RNA結構(例如二級結構)穩定，從而減少RNase對裂解位點的可及性。參見Peacock等人,
J Org Chem. 76: 7295-7300 (2011)；Behlke,
Oligonucleotides18:305-320 (2008)；Ku等人,
Adv. Drug Delivery Reviews104: 16-28 (2016)；Ghidini等人,
Chem. Commun.,2013, 49, 9036。Peacock等人、Belhke, Ku及Ghidini提供適用作YA修飾的例示性修飾。涵蓋熟習此項技術者已知之減少核酸內切降解的修飾。影響涉及RNase裂解之2'羥基的例示性2'核糖修飾為2'-H及2'-O-烷基，包括2'-O-Me。YA位點處之殘基的修飾(諸如雙環核糖類似物、UNA及經修飾之核苷間鍵聯)可為YA修飾。可使RNA結構穩定的例示性鹼基修飾為假尿苷及5-甲基胞嘧啶。在一些實施例中，YA位點之至少一個核苷酸經修飾。在一些實施例中，YA位點之嘧啶(亦稱為「嘧啶位置」)包含修飾(包括改變緊接嘧啶之糖之3'的核苷間鍵聯的修飾、嘧啶鹼基之修飾，及核糖之修飾，例如在其2'位置)。在一些實施例中，YA位點之腺嘌呤(亦稱為「腺嘌呤位置」)包含修飾(包括改變緊接嘧啶之糖之3'的核苷間鍵聯的修飾、嘧啶鹼基之修飾，及核糖之修飾，例如在其2'位置)。在一些實施例中，YA位點之嘧啶及腺嘌呤包含修飾。在一些實施例中，YA修飾降低RNA核酸內切酶活性。
以上修飾及其等效物包括在本文所描述之實施例之範疇內。
引導區或YA位點之修飾
在一些實施例中，gRNA包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多個YA位點處之修飾。在一些實施例中，YA位點之嘧啶包含修飾(包括改變緊接嘧啶之糖之3'的核苷間鍵聯之修飾)。在一些實施例中，YA位點之腺嘌呤包含修飾(包括改變緊接腺嘌呤之糖之3'的核苷間鍵聯之修飾)。在一些實施例中，YA位點之嘧啶及腺嘌呤包含修飾，諸如糖、鹼基或核苷間鍵聯修飾。YA修飾可為本文所闡述之任何類型的修飾。在一些實施例中，YA修飾包含硫代磷酸酯、2'-OMe或2'-氟中之一或多者。在一些實施例中，YA修飾包含嘧啶修飾，包含硫代磷酸酯、2'-OMe、2'-H、肌苷或2'-氟中之一或多者。在一些實施例中，YA修飾在含有一或多個YA位點的RNA雙螺旋區內包含雙環核糖類似物(例如，LNA、BNA或ENA)。在一些實施例中，YA修飾在含有YA位點的RNA雙螺旋區內包含雙環核糖類似物(例如，LNA、BNA或ENA)，其中YA修飾位於YA位點遠端。
gRNA之引導區可根據任何實施例修飾，其包含本文所闡述之經修飾引導區。在一些實施例中，引導區包含1、2、3、4、5或更多個可包含YA修飾的YA位點(「引導區YA位點」)。在一些實施例中，經修飾之引導區YA位點包含如上文針對YA位點所描述之修飾。引導區修飾(包括引導區YA位點修飾)之額外實施例闡述於本文其他處。在可行的情況下，本發明在其他處闡述之任何實施例可與前述實施例中之任一者組合。
對末端核苷酸之修飾
在一些實施例中，gRNA之5'或3'末端區經修飾。
3'末端區修飾
在一些實施例中，3'末端區中之末端(亦即，最後) 1、2、3、4、5、6或7個核苷酸經修飾。在全篇中，此修飾可被稱為「3'端修飾」。在一些實施例中，3'末端區中之末端(亦即，最後) 1、2、3、4、5、6或7個核苷酸包含超過一個修飾。在一些實施例中，3'末端區中之末端(亦即，最後) 1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中之至少一者經修飾。在一些實施例中，3'末端區中之末端(亦即最後) 1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中之至少兩者經修飾。在一些實施例中，3'末端區中之末端(亦即最後) 1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中之至少三者經修飾。在一些實施例中，修飾包含PS鍵聯。在一些實施例中，對3'末端區的修飾為3'保護性端修飾。在一些實施例中，3'端修飾包含3'保護性端修飾。
在一些實施例中，3'端修飾包含選自以下之經修飾核苷酸：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、反向無鹼基修飾之核苷酸或其組合。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含反向無鹼基修飾之核苷酸。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後7、6、5、4、3、2或1個核苷酸中之任一者或多者之修飾。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含一個經修飾核苷酸。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含兩個經修飾核苷酸。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含三個經修飾核苷酸。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含四個經修飾核苷酸。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含五個經修飾核苷酸。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含六個經修飾核苷酸。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含七個經修飾核苷酸。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含1至7個或1至5個核苷酸之修飾。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含gRNA之3'端處之1、2、3、4、5、6或7個核苷酸的修飾。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含gRNA之3'端處之約1至3、1至5、1至6或1至7個核苷酸的修飾。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含以下中之任一者或多者：核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、2'-O-Me修飾之核苷酸、2'-O-moe修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸、反向無鹼基修飾之核苷酸及其組合。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的1、2、3、4、5、6或7個PS鍵聯。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含至少一個2'-O-Me、2'-O-moe、反向無鹼基或2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含一個PS鍵聯，其中該鍵聯介於最後一個核苷酸與倒數第二個核苷酸之間。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後三個核苷酸之間的兩個PS鍵聯。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後四個核苷酸之間的四個PS鍵聯。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後四個核苷酸中之任一者或多者之間的PS鍵聯。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後五個核苷酸中之任一者或多者之間的PS鍵聯。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後2、3、4、5、6或7個核苷酸中之任一者或多者之間的PS鍵聯。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後1至7個核苷酸中之一或多者的修飾，其中該修飾為PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個核苷酸的修飾，及視情況存在的連至3'尾之下一核苷酸或第一個核苷酸的一個或兩個PS鍵聯。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個或倒數第二個核苷酸的修飾，及視情況存在的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個、倒數第二個或倒數第三個核苷酸的修飾，及視情況存在的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個、倒數第二個、倒數第三個或倒數第四個核苷酸的修飾，及視情況存在的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個、倒數第二個、倒數第三個、倒數第四個或倒數第五個核苷酸的修飾，及視情況存在的一或多個PS鍵聯。
在某些實施例中，3'端修飾包含2'-O-Me修飾及PS修飾。在一些實施例中，3'端修飾包含相同數目之2'-O-Me修飾及PS修飾。在一些實施例中，3'端修飾所包含之2'-O-Me修飾比PS修飾多一個。在一些實施例中，3'端修飾所包含之2'-O-Me修飾比PS修飾少一個。在某些實施例中，3'端修飾包含4個2'-O-Me修飾。在某些實施例中，3'端修飾包含3個2'-O-Me修飾。
在一些實施例中，包含3'端修飾之gRNA包含或進一步包含3'尾，其中該3'尾包含存在於3'尾中之核苷酸中之任一者或多者的修飾。在一些實施例中，3'尾經完全修飾。在一些實施例中，3'尾包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1至2個、1至3個、1至4個、1至5個、1至6個、1至7個、1至8個、1至9個或1至10個核苷酸，視情況其中此等核苷酸中之任一者或多者經修飾。
3'尾
在一些實施例中，gRNA包含3'末端，其包含3'尾，該3'尾在後面且為gRNA之保守部分之3'。在一些實施例中，3'尾包含1至約20個核苷酸、1至約15個核苷酸、1至約10個核苷酸、1至約5個核苷酸、1至約4個核苷酸、1至約3個核苷酸，及1至約2個核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含1個核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含2個核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含3個核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含4個核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含約1至2個、1至3個、1至4個、1至5個、1至7個、1至10個、至少1至5個、至少1至3個、至少1至4個、至少1至5個、至少1至5個、至少1至7個或至少1至10個核苷酸。在一些實施例中，尾以包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸終止。在一些實施例中，3'尾之長度為1個核苷酸且為包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸。在一些實施例中，gRNA之3'核苷酸為包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸。
在一些實施例中，3'尾包含1至20個核苷酸且位於gRNA之保守部分之3'端之後。
在一些實施例中，3'尾包含或進一步包含以下中之一或多者：保護性端修飾、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、2'-OMe修飾之核苷酸、2'-O-moe修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸、反向無鹼基修飾之核苷酸及其組合。
在一些實施例中，3'尾包含或進一步包含核苷酸之間的一或多個硫代磷酸酯(PS)鍵聯。在一些實施例中，3'尾包含或進一步包含一或多個2'-OMe修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含或進一步包含一或多個2'-O-moe修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含或進一步包含一或多個2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含或進一步包含一或多個反向無鹼基修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含或進一步包含一或多個保護性端修飾。在一些實施例中，3'尾包含或進一步包含以下中之一或多者之組合：核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、2'-OMe修飾之核苷酸、2'-O-moe修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸及反向無鹼基修飾之核苷酸。
在一些實施例中，gRNA不包含3'尾。
5'末端區修飾
在一些實施例中，5'末端區經修飾，例如gRNA之前1、2、3、4、5、6或7個核苷酸經修飾。在全篇中，此修飾可稱為「5'端修飾」。在一些實施例中，5'末端區之前1、2、3、4、5、6或7個核苷酸包含超過一個修飾。在一些實施例中，5'端之末端(亦即，前) 1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中之至少一者經修飾。在一些實施例中，5'末端區處之末端1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中之至少兩者經修飾。在一些實施例中，5'末端區處之末端1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中之至少三者經修飾。在一些實施例中，5'端修飾為5'保護性端修飾。
在一些實施例中，gRNA之5'及3'末端區(例如，端)兩者均經修飾。在一些實施例中，僅gRNA之5'末端區經修飾。在一些實施例中，僅gRNA之保守部分之3'末端區(加或減3'尾)經修飾。
在一些實施例中，gRNA包含gRNA之5'末端區處之前7個核苷酸中之1、2、3、4、5、6或7者處的修飾。在一些實施例中，gRNA包含3'末端區處之7個末端核苷酸中之1、2、3、4、5、6或7者處的修飾。在一些實施例中，5'末端區處之前4個核苷酸中之2、3或4者，或3'末端區處之末端4個核苷酸中之2、3或4者經修飾。在一些實施例中，5'末端區處之前4個核苷酸中之2、3或4者經由硫代磷酸酯(PS)鍵連接。
在一些實施例中，對5'末端或3'末端之修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)或2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾。在一些實施例中，修飾包含對核苷酸之2'-氟(2'-F)修飾。在一些實施例中，修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。在一些實施例中，修飾包含反向無鹼基核苷酸。在一些實施例中，修飾包含保護性端修飾。在一些實施例中，修飾包含超過一個選自以下之修飾：保護性端修飾、2'-O-Me、2'-O-moe、2'-氟(2'-F)、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯及反向無鹼基核苷酸。在一些實施例中，涵蓋等效修飾。
在一些實施例中，gRNA包含5'末端處之前一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個核苷酸之間的一或多個硫代磷酸酯(PS)鍵聯。在一些實施例中，gRNA包含3'末端處之最後一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個核苷酸之間的一或多個PS鍵聯。在一些實施例中，gRNA包含3'末端處之最後一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個核苷酸與5'末端之5'端的前一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個核苷酸之間的一或多個PS鍵聯。在一些實施例中，除PS鍵聯之外，5'及3'末端核苷酸亦可包含2'-O-Me、2'-O-moe或2'-F修飾之核苷酸。
在一些實施例中，gRNA包含5'端修飾，例如其中引導區之第一個核苷酸經修飾。在一些實施例中，gRNA包含5'端修飾，其中引導區之第一個核苷酸包含5'保護性端修飾。
在一些實施例中，5'端修飾包含選自以下之經修飾核苷酸：2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、反向無鹼基修飾之核苷酸或其組合。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含反向無鹼基修飾之核苷酸。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含gRNA之引導區之核苷酸1至7中之任一者或多者的修飾。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含一個經修飾核苷酸。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含兩個經修飾核苷酸。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含三個經修飾核苷酸。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含四個經修飾核苷酸。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含五個經修飾核苷酸。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含六個經修飾核苷酸。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含七個經修飾核苷酸。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含1至7個、1至5個、1至4個、1至3個或1至2個核苷酸的修飾。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含自5'端起1、2、3、4、5、6或7個核苷酸之修飾。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含自5'端起約1至3個、1至4個、1至5個、1至6個或1至7個核苷酸之修飾。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含gRNA之5'端處之第一個核苷酸處的修飾。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含自gRNA之5'端起第一個及第二個核苷酸處的修飾。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含自gRNA之5'端起第一個、第二個及第三個核苷酸處的修飾。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含自gRNA之5'端起第一個、第二個、第三個及第四個核苷酸處的修飾。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含自gRNA之5'端起第一個、第二個、第三個、第四個及第五個核苷酸處的修飾。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含自gRNA之5'端起第一個、第二個、第三個、第四個、第五個及第六個核苷酸處的修飾。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含自gRNA之5'端起第一個、第二個、第三個、第四個、第五個、第六個及第七個核苷酸處的修飾。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、或2'-O-Me修飾之核苷酸、或2'-O-moe修飾之核苷酸、或2'-F修飾之核苷酸、或反向無鹼基修飾之核苷酸、或其組合。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的1、2、3、4、5、6或7個PS鍵聯。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的約1至2個、1至3個、1至4個、1至5個、1至6個或1至7個PS鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含至少一個PS鍵聯，其中若存在一個PS鍵聯，則該鍵聯介於引導區之核苷酸1與2之間。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含至少兩個PS鍵聯，且該等鍵聯介於引導區之核苷酸1與2及2與3之間。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含引導區之核苷酸1與2、2與3及3與4中之任一者或多者之間的PS鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含引導區之核苷酸1與2、2與3、3與4及4與5中之任一者或多者之間的PS鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含引導區之核苷酸1與2、2與3、3與4、4與5及5與6中之任一者或多者之間的PS鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含引導區之核苷酸1與2、2與3、3與4、4與5、5與6及7與8中之任一者或多者之間的PS鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含引導區之核苷酸1至7中之一或多者的修飾，其中該修飾為PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合對引導區之第一個核苷酸的修飾，及視情況存在的連至下一核苷酸之PS鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合對引導區之第一個或第二個核苷酸的修飾，及視情況存在的第一個與第二個核苷酸之間或第二個與第三個核苷酸之間的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合對可變區之第一個、第二個或第三個核苷酸的修飾，及視情況存在的第一個與第二核苷酸之間、第二個與第三個核苷酸之間或第三個與第四個核苷酸之間的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合對可變區之第一個、第二個、第三個或第四個核苷酸的修飾，及視情況存在的第一個與第二個核苷酸之間、第二個與第三個核苷酸之間、第三個與第四個核苷酸之間或第四個與第五個核苷酸之間的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合對可變區之第一個、第二個、第三個、第四個或第五個核苷酸的修飾，及視情況存在的第一個與第二個核苷酸之間、第二個與第三個核苷酸之間、第三個與第四個核苷酸之間、第四個與第五個核苷酸之間或第五個與第六個核苷酸之間的一或多個PS鍵聯。
重複反重複區修飾
在一些實施例中，提供包含重複反重複區修飾之gRNA，其中該重複反重複區修飾包含重複反重複區中之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或所有12個核苷酸的修飾。
在一些實施例中，提供包含重複反重複區修飾之gRNA，其中該重複反重複區修飾包含重複反重複區中之約1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10或1至12個核苷酸的修飾。
在一些實施例中，提供包含重複反重複區修飾之gRNA，其中上莖修飾包含2'-OMe修飾之核苷酸。在一些實施例中，提供包含重複反重複區修飾之gRNA，其中上莖修飾包含2'-O-moe修飾之核苷酸。在一些實施例中，提供包含重複反重複區修飾之gRNA，其中上莖修飾包含2'-F修飾之核苷酸。
在一些實施例中，提供包含重複反重複區修飾之gRNA，其中該重複反重複區修飾包含2'-OMe修飾之核苷酸、2'-O-moe修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸或其組合。
在一些實施例中，gRNA包含5'端修飾及重複反重複區修飾。在一些實施例中，gRNA包含3'端修飾及重複反重複區修飾。在一些實施例中，gRNA包含5'端修飾、3'端修飾及上莖修飾。
髮夾修飾
在一些實施例中，gRNA包含髮夾區中之修飾。在一些實施例中，髮夾區修飾包含至少一個選自以下之經修飾核苷酸：2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸或其組合。
在一些實施例中，髮夾區修飾位於髮夾1區中。在一些實施例中，髮夾區修飾位於髮夾2區中。在一些實施例中，修飾位於髮夾1區及髮夾2區內，視情況其中髮夾1與2之間的「n」亦經修飾。
在一些實施例中，髮夾修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸。
在一些實施例中，髮夾修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。
在一些實施例中，髮夾區修飾包含至少一個選自以下之經修飾核苷酸：2'H修飾之核苷酸(DNA)、PS修飾之核苷酸、YA修飾、2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸或其組合。
在一些實施例中，gRNA包含3'端修飾及髮夾區中之修飾。
在一些實施例中，gRNA包含5'端修飾及髮夾區中之修飾。
在一些實施例中，gRNA包含上莖修飾及髮夾區中之修飾。
在一些實施例中，gRNA包含3'端修飾、髮夾區中之修飾、上莖修飾及5'端修飾。
F. 例示性經修飾引導RNA
涵蓋經修飾gRNA，其包含如上文所描述之5'端修飾、3'端修飾、上莖修飾、髮夾修飾及3'末端修飾之組合。下文描述例示性經修飾gRNA。
sgRNA；其域/區
在一些實施例中，本文提供之gRNA為sgRNA。
Briner AE等人,
Molecular Cell56:333-339 (2014)描述sgRNA之功能域，在本文中稱為「域」，包括負責靶向之「間隔」域、「下莖」、「隆突」、「上莖」(其可包括四環)、「連接」以及「髮夾1」及「髮夾2」域。參見Briner等人，第334頁，圖1A。如本文中其他處詳細描述，一或多個域(例如髮夾1或上莖)在本文所描述之sgRNA中可經縮短。
在一些實施例中，sgRNA包含引導區及引導區之3'的保守部分，其中保守部分包含重複反重複區、連接區、髮夾1區及髮夾2區。重複反重複區包含上莖區及下莖區。表3B提供如本文所用之sgRNA之域的示意圖。在表3B中，區之間的「n」表示核苷酸之可變數目，例如0至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大。在一些實施例中，n等於0。在一些實施例中，n等於1。
在一些實施例中，sgRNA包含以下中之至少一者：第一內部連接子，其取代上莖區之至少4個核苷酸；第二內部連接子，其取代連接區之2個核苷酸；及第三內部連接子，其取代髮夾1之至少2個核苷酸。
在一些實施例中，sgRNA包含第一內部連接子及第二內部連接子。在一些實施例中，sgRNA包含第一內部連接子及第三內部連接子。在一些實施例中，sgRNA包含第二內部連接子及第三內部連接子。在一些實施例中，sgRNA包含第一內部連接子、第二內部連接子及第三內部連接子。
在一些實施例中，第一內部連接子具有約9至30個原子、視情況約15至21個原子之橋接長度。在一些實施例中，第一內部連接子取代gRNA之重複反重複區的4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。
在一些實施例中，第二內部連接子具有約9至15個原子之橋接長度。在一些實施例中，第二內部連接子取代sgRNA之連接區之髮夾區。在一些實施例中，第二內部連接子取代sgRNA之連接區之莖區的2個核苷酸。
在一些實施例中，第三內部連接子具有約9至30個原子、視情況約15至21個原子之橋接長度。在一些實施例中，第三內部連接子取代gRNA之髮夾1的4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。
在一些實施例中，第一內部連接子位於第一部分與第二部分之間的髮夾中，且第一部分及第二部分一起形成雙螺旋部分。
在一些實施例中，第三內部連接子位於sgRNA之第一部分與sgRNA之第二部分之間的髮夾中，且第一部分及第二部分一起形成雙螺旋部分。
在一些實施例中，sgRNA之髮夾2區不含有任何內部連接子。在一些實施例中，髮夾2區位於SpyCas9 gRNA中。
5'末端區
在一些實施例中，sgRNA包含如表3A至3B中所示的位於5'端處之核苷酸。在一些實施例中，sgRNA之5'末端包含間隔子或引導區，其功能為將Cas蛋白(例如Cas9蛋白)引導至目標核苷酸序列。在一些實施例中，5'末端不包含引導區。在一些實施例中，5'末端包含間隔子及功能不為將Cas蛋白引導至目標核苷酸區之其他核苷酸。
下莖
在一些實施例中，sgRNA包含當線性地查看時，由隆突區及上莖區分離之下莖(LS)區。參見表3A至3B。
在一些實施例中，下莖區包含1至12個核苷酸，例如在一個實施例中，下莖區包含LS1至LS12。在一些實施例中，下莖區包含比表3中所示更少的核苷酸。在一些實施例中，下莖區包含比表3A至3B中所示更多的核苷酸。當下莖區包含比表3之示意圖中所示更少或更多的核苷酸時，應維持如熟習此項技術者將顯而易見之修飾模式。
在一些實施例中，下莖區具有當以相反方向讀取時在核酸序列上互補之核苷酸。在一些實施例中，下莖之核酸序列中之互補性產生sgRNA中之莖的二級結構(例如該等區可彼此鹼基配對)。在一些實施例中，當以相反方向讀取時，下莖區彼此可以不完全互補。
隆突
在一些實施例中，sgRNA包含隆突區，其包含六個核苷酸B1至B6。當線性地查看時，隆突區分為兩個區。參見表3。在一些實施例中，隆突區包含六個核苷酸，其中前兩個核苷酸之後為上莖區，接著為隆突之後四個核苷酸。在一些實施例中，隆突區包含比表3A至3B中所示更少的核苷酸。在一些實施例中，隆突區包含比表3A至3B中所示更多的核苷酸。當隆突區包含比表3A至3B之示意圖中所示更少或更多的核苷酸時，應維持如熟習此項技術者將顯而易見之修飾模式。
在一些實施例中，隆突之存在導致sgRNA中之上莖模組與下莖模組之間的定向扭結。
上莖
在一些實施例中，上莖區為經縮短之上莖區，諸如本文其他處描述的經縮短之上莖區中之任一者。
在其他實施例中，sgRNA包含含有12個核苷酸之上莖區。在一些實施例中，上莖區包含環序列。在一些情況下，環為四環(由四個核苷酸組成之環)。在一些實施例中，上莖區包含比表3B中所示更多的核苷酸。
當上莖區包含比表3A至3B之示意圖中所示更少或更多的核苷酸時，應維持如熟習此項技術者將顯而易見之修飾模式。
在一些實施例中，上莖區具有當以相反方向讀取時在核酸序列上互補之核苷酸。在一些實施例中，上莖區之核酸序列中之互補性產生sgRNA中之莖的二級結構(例如該等區可彼此鹼基配對)。在一些實施例中，當以相反方向讀取時，上莖區彼此可以不完全互補。
在一些實施例中，上莖區包含比圖10A中所示更少的核苷酸，且有時不存在。在某些實施例中，隆突核苷酸B2及B3 (對應於SEQ ID: 400之核苷酸8及21；參見表3A)藉由內部連接子直接接合(亦即，使得不存在插入核苷酸)。在某些實施例中，B2及B3藉由一或多個，例如1、2、3或4個無鹼基核苷直接接合。在某些實施例中，B2及B3藉由內部連接子或一或多個，例如1、2、3或4個無鹼基核苷接合，其中所存在的額外核苷酸不在隆突上方形成雙螺旋部分。在某些實施例中，B2及B3藉由內部連接子或一或多個，例如1、2、3或4個無鹼基核苷接合，其中所存在的額外核苷酸不在隆突上方形成比3個核苷酸更長的雙螺旋部分。
連接區
在一些實施例中，sgRNA包含位於下莖區與髮夾1區之間的連接區。在一些實施例中，連接區包含18個核苷酸。在一些實施例中，連接區包含如表3A至3B中所示之核苷酸N1至N18。在一些實施例中，連接區包含取代(例如在位置N18處)或缺乏核苷酸，諸如本文其他處詳細描述的具有取代或缺乏核苷酸之連接區中之任一者。
在一些實施例中，連接區包含比表3A至3B中所示更少的核苷酸。在一些實施例中，連接區包含比表3A至3B中所示更多的核苷酸。當連接區包含比表3A至3B之示意圖中所示更少或更多的核苷酸時，應維持如熟習此項技術者將顯而易見之修飾模式。
在一些實施例中，連接區具有當以相反方向讀取時在核酸序列上互補之核苷酸。在一些實施例中，核酸序列中之互補性產生sgRNA中之莖或莖環之二級結構(例如連接區中之某些核苷酸可彼此鹼基配對)。在一些實施例中，當以相反方向讀取時，連接區彼此可以不完全互補。
髮夾
在一些實施例中，sgRNA包含髮夾區內之一或多個髮夾結構。髮夾區位於重複反重複區下游(例如其3')。在一些實施例中，髮夾區位於連接區(若存在)下游。在一些實施例中，緊接連接區下游之核苷酸區被稱為「髮夾1」或「H1」。在一些實施例中，髮夾1之3'的核苷酸區被稱為「髮夾2」或「H2」。在一些實施例中，髮夾區包含髮夾1及髮夾2兩者。在一些實施例中，sgRNA包含髮夾1或髮夾2。
在一些實施例中，髮夾1區為經縮短之髮夾1區，諸如本文其他處描述的經縮短之髮夾1區中之任一者。
在其他實施例中，髮夾1區包含12個緊鄰連接區下游之核苷酸。在一些實施例中，髮夾1區包含如表3B中所示之核苷酸H1-1至H1-12。
在一些實施例中，髮夾2區包含15個在髮夾1區下游之核苷酸。在一些實施例中，髮夾2區包含如表3B中所示之核苷酸H2-1至H2-15。
在一些實施例中，一或多個核苷酸存在於髮夾1區與髮夾2區之間。髮夾1區與髮夾2區之間的一或多個核苷酸可經修飾或未經修飾。在一些實施例中，髮夾1與髮夾2藉由一個核苷酸隔開。在一些實施例中，髮夾區包含比表3B中所示更少的核苷酸。在一些實施例中，髮夾區包含比表3B中所示更多的核苷酸。當髮夾區包含比表3B之示意圖中所示更少或更多的核苷酸時，應維持如熟習此項技術者將顯而易見之修飾模式。
在一些實施例中，髮夾區具有當以相反方向讀取時在核酸序列上互補之核苷酸。在一些實施例中，當以相反方向讀取時，髮夾區彼此可不完全互補(例如髮夾之頂部或環包含不成對核苷酸)。
3' 末端
sgRNA具有3'端，其為sgRNA之最後一個核苷酸。3'末端區包括3'端之最後1至7個核苷酸。在一些實施例中，3'端為髮夾2之末端。在一些實施例中，sgRNA包含髮夾區之後的核苷酸。在一些實施例中，sgRNA包括3'尾區，在此情況下，3'尾之最後一個核苷酸為3'末端。在一些實施例中，3'尾包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20或更多個例如與髮夾之二級結構不相關的核苷酸。在一些實施例中，3'尾區包含1、2、3或4個與髮夾之二級結構不相關的核苷酸。在一些實施例中，3'尾區包含4個與髮夾之二級結構不相關的核苷酸。在一些實施例中，3'尾區包含1、2或3個與髮夾之二級結構不相關的核苷酸。
在一些實施例中，gRNA之間隔子或靶向區存在於gRNA之3'端處。
表 3A (spyCas9 sgRNA 之 保守部分 ； SEQ ID NO:400)
表 3B (spyCas9 sgRNA 之區 ( 線性視圖 ， 5' 至 3'))
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 |
| G | U | U | U | U | A | G | A | G | C | U | A | G | A | A | A | U | A | G | C | A | A | G | U | U | A | A | A | A | U |
| LS1至LS6 | B1至B2 | US1至US12 | B3至B6 | LS7至LS12 |
| 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 |
| A | A | G | G | C | U | A | G | U | C | C | G | U | U | A | U | C | A | A | C | U | U | G | A | A | A | A | A | G | U |
| 連接區 | H1-1至H1-12 |
| 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | 67 | 68 | 69 | 70 | 71 | 72 | 73 | 74 | 75 | 76 |
| G | G | C | A | C | C | G | A | G | U | C | G | G | U | G | C |
| N | H2-1至H2-15 |
| LS1 至LS6 | B1 至B2 | US1 至US12 | B3 至B6 | |||||
| 5' 末端(n) | 下莖 | n | 隆突 | n | 上莖 | n | 隆突 | n |
| LS7 至LS12 | N1 至N18 | H1-1 至H1-12 | H2-1 至H2-15 | ||||
| 下莖 | n | 連接區 | n | 髮夾1 | n | 髮夾2 | 3' 末端 |
在一些實施例中，sgRNA包含含有SEQ ID NO: 400之序列的保守部分。
在一些實施例中，核苷酸13至16 (上莖區之US5至US8)中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 400經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸12至17 (上莖區之US4至US9)相對於SEQ ID NO: 400經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸11至18 (上莖區之US3至US10)相對於SEQ ID NO: 400經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸10至19 (上莖區之US2至US11)相對於SEQ ID NO: 400經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸9至20 (上莖區之US1至US10)相對於SEQ ID NO: 400經第一內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸36至37 (連接區之N6至N7)相對於SEQ ID NO: 400經第二內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸53至56 (髮夾1之H1-5至H1-8)中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 400經第三內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸52至57 (髮夾1之H1-4至H1-9)相對於SEQ ID NO: 400經第三內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸51至58 (髮夾1之H1-3至H1-10)相對於SEQ ID NO: 400經第三內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸50至59 (髮夾1之H1-1至H1-12)相對於SEQ ID NO: 400經第三內部連接子取代。在一些實施例中，核苷酸77至80相對於SEQ ID NO: 400缺失。在一些實施例中，上莖之所有核苷酸(US1至US12)相對於SEQ ID NO: 400經第一內部連接子取代。在一些實施例中，上莖之所有核苷酸(US1至US12)相對於sgRNA中之SEQ ID NO: 400經無鹼基核苷取代，其中sgRNA之另一部分中之核苷酸經內部連接子取代，該另一部分例如如上文所提供之連接區或較佳髮夾1區。
G. 包含內部連接子之具有一或多個經縮短之區的NmeCas9引導RNA
本文提供包含一或多個經縮短之區及一或多個內部連接子的引導RNA (gRNA)。
在一些實施例中，本文所提供之gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)包含保守區，其包含重複/反重複區、髮夾1區及髮夾2區，其中重複/反重複區、髮夾1區及髮夾2區中之一或多者經縮短。在一些實施例中，gRNA為腦膜炎雙球菌(
N. meningitidis)
Cas9(NmeCas9) gRNA。
在一些實施例中，gRNA之保守區包含：
經縮短之重複/反重複區，其中該經縮短之重複/反重複區缺乏2至24個核苷酸，其中
(i)核苷酸37至64中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸36藉由第一內部連接子連接至核苷酸65，該第一內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸。
在一些實施例中，gRNA之保守區包含：
經縮短之髮夾1區，其中該經縮短之髮夾1缺乏2至10個、視情況2至8個核苷酸，其中
(i)核苷酸82至95中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸81藉由第二內部連接子連接至核苷酸96，該第二內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸。
在一些實施例中，gRNA之保守區包含：
經縮短之髮夾2區，其中該經縮短之髮夾2缺乏2至18個、視情況2至16個核苷酸，其中
(i)核苷酸113至134中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸112藉由第三內部連接子連接至核苷酸135，該第三內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸。
在一些實施例中，gRNA之保守區包含：
(a)經縮短之重複/反重複區，其中該經縮短之重複/反重複區缺乏2至24個核苷酸，其中
(i)核苷酸37至64中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸36藉由第一內部連接子連接至核苷酸65，該第一內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸；及
(b)經縮短之髮夾1區，其中該經縮短之髮夾1缺乏2至10個、視情況2至8個核苷酸，其中
(i)核苷酸82至95中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸81藉由第二內部連接子連接至核苷酸96，該第二內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸。
在一些實施例中，gRNA之保守區包含：
(a)經縮短之重複/反重複區，其中該經縮短之重複/反重複區缺乏2至24個核苷酸，其中
(i)核苷酸37至64中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸36藉由第一內部連接子連接至核苷酸65，該第一內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸；及
(b)經縮短之髮夾2區，其中該經縮短之髮夾2缺乏2至18個、視情況2至16個核苷酸，其中
(i)核苷酸113至134中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸112藉由第三內部連接子連接至核苷酸135，該第三內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸。
在一些實施例中，gRNA之保守區包含：
(a)經縮短之髮夾1區，其中該經縮短之髮夾1缺乏2至10個、視情況2至8個核苷酸，其中
(i)核苷酸82至95中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸81藉由第二內部連接子連接至核苷酸96，該第二內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸；及
(b)經縮短之髮夾2區，其中該經縮短之髮夾2缺乏2至18個、視情況2至16個核苷酸，其中
(i)核苷酸113至134中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸112藉由第三內部連接子連接至核苷酸135，該第三內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸。
在一些實施例中，gRNA之保守區包含：
(a)經縮短之重複/反重複區，其中該經縮短之重複/反重複區缺乏2至24個核苷酸，其中
(i)核苷酸37至64中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸36藉由第一內部連接子連接至核苷酸65，該第一內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸；
(b)經縮短之髮夾1區，其中該經縮短之髮夾1缺乏2至10個、視情況2至8個核苷酸，其中
(i)核苷酸82至95中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸81藉由第二內部連接子連接至核苷酸96，該第二內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸；及
(c)經縮短之髮夾2區，其中該經縮短之髮夾2缺乏2至18個、視情況2至16個核苷酸，其中
(i)核苷酸113至134中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸112藉由第三內部連接子連接至核苷酸135，該第三內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸。
此章節(包括下文子章節A至E)中之核苷酸位置係根據提供例示性Nme sgRNA之圖10E進行編號。
在一些實施例中，核苷酸144至145中之一者或兩者相比於SEQ ID NO: 500視情況缺失。
在一些實施例中，gRNA包含第一內部連接子、第二內部連接子及第三內部連接子中之至少一者。
在一些實施例中，gRNA包含第一內部連接子、第二內部連接子及第三內部連接子中之至少兩者。
在一些實施例中，gRNA包含第一內部連接子、第二內部連接子及第三內部連接子。
在一些實施例中，引導區具有：(i)相對於SEQ ID NO: 500，位置1至24內一個核苷酸之插入或1至4個核苷酸之缺失；或(ii) 24個核苷酸之長度。
在一些實施例中，引導區具有25、24、23、22、21或20個核苷酸之長度，視情況其中引導區具有SEQ ID NO: 500之位置1至24處之25、24、23或22個核苷酸之長度。
在一些實施例中，引導區具有SEQ ID NO: 500之位置1至24處之23或24個核苷酸之長度。
在一些實施例中，保守部分之至少10個核苷酸為經修飾核苷酸。
在一些實施例中，雙螺旋部分中之取代為保守取代。
在重複/反重複區、髮夾1區及髮夾2區中之各者內，雙螺旋部分中之各者之股藉由內部連接子接合，該內部連接子單獨或與核苷酸組合取代4個核苷酸或至少4個核苷酸。本文提供具有各種橋接長度以准許熟習此項技術者將雙螺旋部分之股與內部連接子或核苷酸或其組合接合的內部連接子。
在一些實施例中，gRNA之重複/反重複區為缺乏2至24個核苷酸的經縮短之重複/反重複區，例如上文編號實施例或表1至2中所指示或本文其他處所描述之重複/反重複區中之任一者，其可與本文所描述的經縮短之髮夾1區或髮夾2區中之任一者組合，包括(但不限於)上文編號實施例中所指示且在表1至2之序列中呈現或本文其他處所描述之組合。
在一些實施例中，第一連接子取代位置49至52，且第二內部連接子取代位置87至90。
在一些實施例中，第二內部連接子取代位置87至90，且第三內部連接子取代位置122至125。
在一些實施例中，第一連接子取代位置49至52，且第三內部連接子取代位置122至125。
在一些實施例中，第一連接子取代49至52，第二內部連接子取代位置87至90，且第三內部連接子取代位置122至125。
經縮短之重複/反重複區
在一些實施例中，本文所描述之gRNA的保守部分包含經縮短之重複/反重複區。在一些實施例中，重複反重複區包含重複反重複區之第一部分與第二部分之間的髮夾結構，其中第一部分及第二部分一起形成雙螺旋部分。
在一些實施例中，本文所描述之gRNA的保守部分包含重複/反重複區之經縮短之上莖區。在一些實施例中，重複/反重複區包含環(例如四環)。
在一些實施例中，經縮短之重複/反重複區缺乏2至28個核苷酸。在一些實施例中，(i)核苷酸37至64中之一或多者相對於SEQ ID NO: 1缺失且視情況經取代；及(ii)核苷酸36藉由第一內部連接子連接至核苷酸65。
在一些實施例中，經縮短之重複/反重複區缺乏2至28個核苷酸。
在一些實施例中，經縮短之重複/反重複區具有24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸之長度。
在一些實施例中，經縮短之重複/反重複區缺乏12至28個核苷酸、視情況18至24個核苷酸。在一些實施例中，經縮短之重複/反重複區具有24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸之長度。在一些實施例中，經縮短之重複/反重複區具有24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34個核苷酸之長度。在一些實施例中，經縮短之重複/反重複區具有34個核苷酸之長度。在一些實施例中，經縮短之重複/反重複區具有35個核苷酸之長度。在一些實施例中，經縮短之重複/反重複區具有36個核苷酸之長度。在一些實施例中，經縮短之重複/反重複區具有37個核苷酸之長度。在一些實施例中，經縮短之重複/反重複區具有38個核苷酸之長度。
在一些實施例中，經縮短之重複/反重複區之上莖的一或多個鹼基對缺失。在一些實施例中，經縮短之重複/反重複區之上莖包含不超過一個、兩個、三個或四個鹼基對。如本文所用，「鹼基對」或「鹼基配對之核苷酸」或「華特生-克里克配對核苷酸」包括能夠形成華特生-克里克鹼基對之任何對，包括A-T、A-U、T-A、U-A、C-G及G-C對，及具有相同鹼基配對偏好的包括前述核苷酸中之任一者之經修飾形式的對。在一些實施例中，鹼基對或鹼基配對之核苷酸亦包括藉由鹼基層疊產生之鹼基對，例如重複/反重複區中之核苷酸25與76、33與68、34與67及37與64；及髮夾1區中之核苷酸78與100及83與94。
在一些實施例中，第一內部連接子取代經縮短之重複/反重複區之上莖的核苷酸38至63，且將核苷酸37連接至核苷酸64。在一些實施例中，第一內部連接子取代經縮短之重複/反重複區之上莖的核苷酸37至64，且將核苷酸36連接至核苷酸65。
在一些實施例中，經縮短之重複/反重複區具有長度為11個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。在一些實施例中，經縮短之重複/反重複區具有單一雙螺旋部分。在一些實施例中，位置25與76、位置33與68、位置34與67及位置48與53具有鹼基層疊相互作用，且不構成雙螺旋部分中之不連續部分。
在一些實施例中，重複/反重複區中之鹼基配對核苷酸中之一或多者缺失。在一些實施例中，鹼基配對核苷酸中之一或多者係選自位置37與53、位置38與54、位置39與55、位置40與56、位置41與57、位置43與58、位置43與59、位置44與60、位置45與61、位置46與62、位置47與63及位置48與64。
在一些實施例中，重複/反重複區之上莖區包含1至5個鹼基對。
在一些實施例中，經縮短之重複/反重複區之上莖相對於SEQ ID NO: 500包括一或多個取代。
在一些實施例中，一或多個取代藉由交換鹼基配對核苷酸之位置使得可維持鹼基配對而被視為保守取代。舉例而言，G-C對變成C-G對，A-U對變成U-A對，或其他天然或經修飾鹼基配對。
在一些實施例中，第一內部連接子取代核苷酸49至52，相對於SEQ ID NO: 500。
在一些實施例中，經縮短之重複/反重複區具有8至22個經修飾核苷酸。
經縮短之髮夾1區
在一些實施例中，本文所描述之gRNA的保守部分包含經縮短之髮夾1區。在一些實施例中，髮夾1區包含髮夾1區之第一部分與第二部分之間的髮夾結構，其中第一部分及第二部分一起形成雙螺旋部分。
在一些實施例中，本文所描述之gRNA的保守部分包含髮夾1區之經縮短之上莖區。在一些實施例中，髮夾1包含環(例如四環)。
在一些實施例中，經縮短之髮夾1缺乏2至10個核苷酸。在一些實施例中，(i)核苷酸82至95中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；及(ii)核苷酸81藉由第二內部連接子連接至核苷酸96。
在一些實施例中，其中經縮短之髮夾1區缺乏2至10個核苷酸。在一些實施例中，其中經縮短之髮夾1區具有13、14、15、16、17、18、19、20或21個核苷酸之長度。在一些實施例中，其中經縮短之髮夾1區具有長度為4至8個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。在一些實施例中，其中經縮短之髮夾1區具有長度為7至8個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
在一些實施例中，其中經縮短之髮夾1區具有單一雙螺旋部分。在一些實施例中，在經縮短之髮夾1區中，位置78與100及位置83與94具有鹼基層疊相互作用，且不構成雙螺旋部分中之不連續部分。
在一些實施例中，經縮短之髮夾1區之一個或兩個鹼基對缺失。在一些實施例中，經縮短之髮夾1區之莖包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個鹼基對。在一些實施例中，經縮短之髮夾1區之莖的長度為七個或八個鹼基配對核苷酸。
在一些實施例中，經縮短之髮夾1區的位置85至86中之一或多者及核苷酸91至92中之一或多者缺失。在一些實施例中，經縮短之髮夾1區之核苷酸86及91缺失。在一些實施例中，經縮短之髮夾1區的核苷酸82至95中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500經取代。
在一些實施例中，第二內部連接子相對於SEQ ID NO: 500取代核苷酸87至91。
在一些實施例中，其中經縮短之髮夾1區具有2至15個經修飾核苷酸。
經縮短之髮夾2區
在一些實施例中，本文所描述之gRNA的保守部分包含經縮短之髮夾2區。在一些實施例中，經縮短之髮夾2區包含髮夾2區之第一部分與第二部分之間的髮夾結構，其中第一部分及第二部分一起形成雙螺旋部分。
在一些實施例中，經縮短之髮夾2區缺乏2至18個核苷酸。在一些實施例中，經縮短之髮夾2區缺乏2至16個核苷酸。在一些實施例中，(i)核苷酸113至121及126至134中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；及(ii)核苷酸112藉由第三內部連接子連接至核苷酸135。
在一些實施例中，本文所描述之gRNA的保守部分包含髮夾2區之經縮短之上莖區。在一些實施例中，髮夾1包含環(例如四環)。在一些實施例中，經縮短之髮夾2區缺乏2至16個核苷酸。在一些實施例中，經縮短之髮夾2區具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸之長度。在一些實施例中，經縮短之髮夾2區具有24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34個核苷酸之長度。在一些實施例中，經縮短之髮夾2區的核苷酸113至121中之一或多者及核苷酸126至134中之一或多者缺失。
在一些實施例中，經縮短之髮夾2區包含不成對區。
在一些實施例中，經縮短之髮夾2區具有兩個雙螺旋部分。在一些實施例中，經縮短之髮夾2區具有長度為4個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。在一些實施例中，經縮短之髮夾2區具有長度為4至8個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。在一些實施例中，經縮短之髮夾2區具有長度為4至6個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。在一些實施例中，經縮短之髮夾2區之上莖包含一個、兩個、三個或四個鹼基對。在一些實施例中，核苷酸113與134、核苷酸114與133、核苷酸115與132、核苷酸116與131、核苷酸117與130、核苷酸118與129、核苷酸119與128、核苷酸120與127及核苷酸121與126中之至少一對缺失。在一些實施例中，經縮短之髮夾2區的位置113至121及126至134中之所有者缺失。
在一些實施例中，其中經縮短之髮夾2區的核苷酸113至134中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500經取代。在一些實施例中，第三內部連接子相對於SEQ ID NO: 500取代核苷酸122至125。
在一些實施例中，經縮短之髮夾2區具有2至15個經修飾核苷酸。
3'尾
在一些實施例中，gRNA包含3'尾。在一些實施例中，3'尾之長度為1至20個核苷酸，且藉由磷酸二酯或硫代磷酸酯鍵聯連接至gRNA之保守區的3'端。在一些實施例中，3'尾包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含1、2、3、4或5個核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含1或2個核苷酸。
在一些實施例中，3'尾具有1至10個核苷酸、1至5個核苷酸、1至4個核苷酸、1至3個核苷酸及1至2個核苷酸之長度。在一些實施例中，3'尾包含約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。在一些實施例中，3'尾具有1個核苷酸之長度。在一些實施例中，3'尾具有2個核苷酸之長度。在一些實施例中，3'尾具有3個核苷酸之長度。在一些實施例中，3'尾具有4個核苷酸之長度。在一些實施例中，3'尾具有1至2個核苷酸之長度。
在一些實施例中，3'尾以包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸終止。在一些實施例中，3'尾之長度為1個核苷酸。在一些實施例中，3'尾由包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸組成。在一些實施例中，其中3'尾包含存在於3'尾中之核苷酸中之任一者或多者的修飾。在其他實施例中，其中3'尾之修飾為2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸及核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯中之一或多者。
在一些實施例中，其中3'尾經完全修飾。
在一些實施例中，其中gRNA之3'核苷酸為包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸。
在一些實施例中，核苷酸144及145中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失。在一些實施例中，核苷酸144及145兩者相對於SEQ ID NO: 500缺失。
在一些實施例中，gRNA不包含3'尾。
在一些實施例中，不包含3'尾的引導物之3'端以包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸終止。在一些實施例中，3'尾由包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸組成。在一些實施例中，3'末端核苷酸為經修飾核苷酸。在一些實施例中，3'端之修飾為2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸及核苷酸末端核苷酸與倒數第二核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯中之一或多者。
在一些實施例中，3'端(亦即，不進一步具有尾部之髮夾2之端部或3'尾之端部)包含或進一步包含一或多個修飾，例如核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、2'-OMe修飾之核苷酸、2'-O-moe修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸或反向無鹼基修飾之核苷酸，視情況其中3'端包含至少兩個獨立地選自以下之修飾：核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、2'-OMe修飾之核苷酸、2'-O-moe修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸及反向無鹼基修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'端包含或進一步包含一或多個修飾，例如核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、2'-OMe修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸，視情況其中3'端包含至少兩個獨立地選自以下之修飾：核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、2'-OMe修飾之核苷酸及2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'端包含核苷酸141與142及142與143之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯；位置142及143中之各者處的2'-OMe修飾之核苷酸。
在一些實施例中，3'端(亦即，不進一步具有尾部之髮夾2之端部或3'尾之端部)包含或進一步包含核苷酸之間的一或多個硫代磷酸酯(PS)鍵聯。在一些實施例中，3'端包含或進一步包含一或多個2'-OMe修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'端包含或進一步包含一或多個2'-O-moe修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'端包含或進一步包含一或多個2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'端包含或進一步包含一或多個反向無鹼基修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'端包含或進一步包含一或多個保護性端修飾。在一些實施例中，3'端包含或進一步包含以下中之一或多者的組合：核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、2'-OMe修飾之核苷酸、2'-O-moe修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸及反向無鹼基修飾之核苷酸。
引導區
在一些實施例中，gRNA進一步包含引導序列。在一些實施例中，引導序列包含重複/反重複區之最5'核苷酸之5'的20、21、22、23、24或25個核苷酸，視情況22、23、24或25個核苷酸。在一些實施例中，引導序列包含22、23、24、25或更多個核苷酸。在一些實施例中，引導序列具有24個核苷酸之長度。在一些實施例中，引導序列具有23個核苷酸之長度。在一些實施例中，引導序列具有22個核苷酸之長度。在一些實施例中，引導序列具有21個核苷酸之長度。在一些實施例中，引導序列具有20個核苷酸之長度。
在一些實施例中，引導區具有：(i)相對於SEQ ID NO: 500，位置1至24內一個核苷酸之插入或1至4個核苷酸之缺失；或(ii) 24個核苷酸之長度。
在一些實施例中，引導序列之選擇係基於用於編輯之所關注基因內之目標序列而確定。舉例而言，在一些實施例中，gRNA包含與所關注基因之目標序列互補的引導序列。
在一些實施例中，所關注基因中之目標序列可與gRNA之引導序列互補。在一些實施例中，gRNA之引導序列與所關注基因中之其對應目標序列之間的互補性或一致性程度可為約90%、95%或100%。在一些實施例中，gRNA之引導區與所關注基因之目標區可100%互補或一致。在其他實施例中，gRNA之引導序列及所關注基因之目標序列可含有至少一個錯配。舉例而言，gRNA之引導序列及所關注基因之目標序列可包含1個、視情況2個或3個錯配，其中目標序列之總長度為至少約22、23、24或更多個核苷酸。在一些實施例中，gRNA之引導序列及所關注基因之目標區可包含1個、視情況2個或3個錯配，其中引導序列包含約24個核苷酸。在某些實施例中，引導序列不含有錯配，亦即與目標序列完全互補。5'末端可包含不視為引導區(亦即，功能不為將cas9蛋白質引導至目標核酸)之核苷酸。
在一些實施例中，經縮短之引導RNA之引導區包含至少一個經修飾核苷酸。
在一些實施例中，gRNA之引導區包含至少兩個經修飾核苷酸、視情況至少四個經修飾核苷酸，其中各修飾獨立地視情況包含選自以下之經修飾核苷酸：2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、反向無鹼基修飾之核苷酸或其組合。
包含內部連接子的例示性經縮短之引導RNA提供於表4A至4B中。如本文所用，「連接子1」或「L1」係指具有約15至21個原子之橋接長度的內部連接子。如本文所用，「連接子2」或「L2」係指具有約6至12個原子之橋接長度的內部連接子。
核苷酸修飾在表4A至4B中如下指示：m：2'-OMe；*：PS鍵聯；f：2'-氟；(invd)：反向無鹼基；moe：2'-moe；e：ENA；d：去氧核糖核苷酸(亦請注意，T始終為去氧核糖核苷酸)；x：UNA。在某些實施例中，在sgRNA經修飾序列中，各A、C、G、U及N獨立地為核糖(2'-OH)。在某些實施例中，各A、C、G、U及N為核糖(2'-OH)。因此，舉例而言，mA表示2'-O-甲基腺苷；xA表示具有腺嘌呤核鹼基的UNA核苷酸；eA表示具有腺嘌呤核鹼基的ENA核苷酸；且dA表示腺苷去氧核糖核苷酸。
如本文所用，「N」可為任何天然或非天然核苷酸。舉例而言，本文涵蓋表4A中之SEQ ID NO: 1001，其中N'經本文所揭示之引導序列中之任一者置換。儘管引導物之核苷酸用N'取代，但該等修飾保持如SEQ ID NO: 1001中所示。亦即，儘管引導物之核苷酸置換「N'」，但前三個核苷酸仍為經2'-O-Me修飾的，且在第一核苷酸與第二核苷酸、第二核苷酸與第三核苷酸及第三核苷酸與第四核苷酸之間存在硫代磷酸酯鍵聯。
sgRNA名稱有時用緊接著G之後的一或多個前置零提供。此不影響名稱之含義。因此，舉例而言，G000282、G0282、G00282及G282係指相同sgRNA。
表 4A. 包含連接子之例示性 NmeCas9 引導 RNA
表 4B. 例示性 NmeCas9 gRNA 序列
III. 組合物及套組
| SEQ ID NO: | gRNA 序列 |
| 1000 | (N) 20-25GUUGUAGCUCCCUUC (L1)GACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUC (L1)GAUGUGCCGCAACGCUCUGCC (L1)GGCAUCGUU |
| 1001 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmC( L1)mGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC( L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC( L1)GGCAUCG*mU*mU |
| 1002 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| 1003 | NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| 1004 | (N) 20-25GUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| 1005 | (N) 20-25GUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmG(L1)mCmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU |
| 1006 | (N) 20-25GUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmG(L1)mCmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU |
| 1007 | (N) 20-25GUUGmUmAmGmCUCCCmUmG(L1)mCmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU |
| 1008 | (N) 20-25GUUGmUmAmGmCUCCCmG(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU |
| 1009 | (N) 20-25GUUGmUmAmGmCUCCmG(L1)mCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU |
| 1010 | (N) 20-25GUUGmUmAmGmCUCC(L1)GUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU |
| 1011 | (N) 20-25GUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmG(L1)mCmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmU(L1)mAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU |
| 1012 | (N) 20-25GUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmG(L1)mCmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmU(L1)mAGGCAUCGmU*mU |
| 引導物ID | SEQ ID NO. | sgRNA 未經修飾序列 | SEQ ID NO. | sgRNA 經修飾序列 |
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| G021844 | 611 | CCAAGUGUCUUCCAGUACGAUUUGGUUGUAGCUCCCUUCGACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 711 | mC*mC*mA*mAmGUGmUmCUmUCmCAGUAmCGAUmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmC(L1)mGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| G021844 | 612 | CCAAGUGUCUUCCAGUACGAUUUGGUUGUAGCUCCCUUCGACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 712 | mC*mC*mA*mAmGUGmUmCUmUCmCAGUAmCGAUmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmC(L1)mGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| G021845 | 613 | CUUCACCAGGAGAAGCCGUCACACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | 713 | mC*mU*mU*mCmACCmAmGGmAGmAAGCCmGUCAmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU |
| G021846 | 614 | CUUCACCAGGAGAAGCCGUCACACGUUGUAGCUCCCUUCGACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 714 | mC*mU*mU*mCmACCmAmGGmAGmAAGCCmGUCAmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmC(L1)mGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| G023066 | 615 | CCAAGUGUCUUCCAGUACGAUUUGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 715 | mC*mC*mA*mAmGUGmUmCUmUCmCAGUAmCGAUmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| G023067 | 616 | CUUCACCAGGAGAAGCCGUCACACGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 716 | mC*mU*mU*mCmACCmAmGGmAGmAAGCCmGUCAmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| G023069 | 617 | CUUCACCAGGAGAAGCCGUCACACGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 717 | CUUCACCAGGAGAAGCCGUCACACmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| G023070 | 618 | CUUCACCAGGAGAAGCCGUCACACGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 718 | mC*mU*mU*CACCAGGAGAAGCCGUCACACmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| G023071 | 619 | CUUCACCAGGAGAAGCCGUCACACGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 719 | mC*mU*mU*mCACCAGGAGAAGCCGUCACACmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| G023072 | 620 | CUUCACCAGGAGAAGCCGUCACACGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 720 | mC*mU*mU*CmACCAGGAGAAGCCGUCACACmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
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| G023075 | 623 | CUUCACCAGGAGAAGCCGUCACACGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 723 | mC*mU*mU*CACCAGGAGmAAGCCGUCACACmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| G023076 | 624 | CUUCACCAGGAGAAGCCGUCACACGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 724 | mC*mU*mU*CACCAGGAGAAGCCmGUCACACmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| G023077 | 625 | CUUCACCAGGAGAAGCCGUCACACGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 725 | mC*mU*mU*CACCAGGAGAAGCCGUCAmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| G023078 | 626 | CUUCACCAGGAGAAGCCGUCACACGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 726 | mC*mU*mU*CmACCmAmGGmAGmAAGCCmGUCAmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| G023079 | 627 | CUUCACCAGGAGAAGCCGUCACACGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 727 | mC*mU*mU*mCACCmAmGGmAGmAAGCCmGUCAmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| G023080 | 628 | CUUCACCAGGAGAAGCCGUCACACGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 728 | mC*mU*mU*mCmACCAmGGmAGmAAGCCmGUCAmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| G023081 | 629 | CUUCACCAGGAGAAGCCGUCACACGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 729 | mC*mU*mU*mCmACCmAGGmAGmAAGCCmGUCAmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
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| G023083 | 631 | CUUCACCAGGAGAAGCCGUCACACGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 731 | mC*mU*mU*mCmACCmAmGGmAGAAGCCmGUCAmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| G023084 | 632 | CUUCACCAGGAGAAGCCGUCACACGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 732 | mC*mU*mU*mCmACCmAmGGmAGmAAGCCGUCAmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| G023085 | 633 | CUUCACCAGGAGAAGCCGUCACACGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 733 | mC*mU*mU*mCmACCmAmGGmAGmAAGCCmGUCACACmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
| G023103 | 634 | CCAAGUGUCUUCCAGUACGAUUUGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 734 | CCAAGUGUCUUCCAGUACGAUUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
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| G023105 | 636 | CCAAGUGUCUUCCAGUACGAUUUGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 736 | mC*mC*mA*mAGUGUCUUCCAGUACGAUUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCG*mU*mU |
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| G023418 | 658 | CCAAGUGUCUUCCAGUACGAUUUGGUUGUAGCUCCCUUGCACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCUAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | 758 | mC*mC*mA*mAmGUGmUmCUmUCmCAGUAmCGAUmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmG(L1)mCmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmU(L1)mAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU |
| G023419 | 659 | CCAAGUGUCUUCCAGUACGAUUUGGUUGUAGCUCCCUUGCACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUAGGCAUCGUU | 759 | mC*mC*mA*mAmGUGmUmCUmUCmCAGUAmCGAUmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmG(L1)mCmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmU(L1)mAGGCAUCGmU*mU |
涵蓋包含本文所描述之gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)中之任一者及載劑、賦形劑、稀釋劑或其類似者的組合物。在一些情況下，賦形劑或稀釋劑為惰性的。在一些情況下，賦形劑或稀釋劑並非惰性的。在一些實施例中，提供一種醫藥調配物，其包含本文所描述之gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)中之任一者及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑或其類似者。在一些實施例中，醫藥調配物進一步包含LNP。在一些實施例中，醫藥調配物進一步包含Cas9蛋白或編碼Cas9蛋白之mRNA。在一些實施例中，醫藥調配物包含gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)、LNP及Cas蛋白或編碼Cas蛋白之mRNA中之任一者或多者。在一些實施例中，Cas蛋白為單體Cas蛋白，例如Cas9蛋白。在一些實施例中，Cas蛋白包括多個次單元。
亦提供包含本文所描述之一或多種gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)、組合物或醫藥調配物的套組。在一些實施例中，套組進一步包含溶劑、溶液、緩衝液(各自與組合物或醫藥調配物分開)、說明書或乾燥劑中之一或多者。
包含RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸的組合物
在一些實施例中，提供組合物或醫藥調配物，其包含本文所描述之至少一種gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)及RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸(例如mRNA)。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑為Cas蛋白。在一些實施例中，gRNA連同Cas蛋白或編碼Cas蛋白之核酸(例如mRNA)被稱為Cas RNP。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑為與gRNA一起起作用以將RNA引導之DNA結合劑引導至目標核酸序列的結合劑。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑為來自II型CRISPR/Cas系統的Cas蛋白。在一些實施例中，Cas蛋白為Cas9。在一些實施例中，Cas9蛋白為野生型Cas9。在一些實施例中，Cas9蛋白來源於化膿鏈球菌Cas9蛋白，例如化膿鏈球菌Cas9 (SpyCas9)。在一些實施例中，提供包含至少一種gRNA及核酸酶或編碼spyCas9之mRNA的組合物。在一些實施例中，Cas9蛋白不來源於化膿鏈球菌，但以與化膿鏈球菌Cas9相同的方式發揮功能，使得對化膿鏈球菌Cas9具有特異性的gRNA將非化膿鏈球菌Cas9引導至其目標位點。在一些實施例中，Cas9蛋白來源於金黃色葡萄球菌Cas9蛋白，例如SauCas9。在一些實施例中，提供包含至少一種gRNA及核酸酶或編碼SauCas9之mRNA的組合物。在一些實施例中，Cas9蛋白來源於腦膜炎雙球菌Cas9 (NmeCas9)。在一些實施例中，提供包含至少一種gRNA及核酸酶或編碼NmeCas9之mRNA的組合物。在一些實施例中，Cas9蛋白不來源於腦膜炎雙球菌。在一些實施例中，提供包含至少一種gRNA及核酸酶或編碼NmeCas9之mRNA的組合物。在一些實施例中，Cas誘導目標DNA中之雙股斷裂。本文所描述之實施例涵蓋本文所揭示之SpyCas9、SauCas9、NmeCas9及其他Cas蛋白的等效物。
RNA引導之DNA結合劑(包括Cas9)涵蓋經修飾者及其變體。具有一個非活性催化域(RuvC或HNH)之經修飾形式被稱為「切口酶」。切口酶僅切割目標DNA上之一個股，從而產生單股斷裂。單股斷裂亦可稱為「切口」。在一些實施例中，組合物及方法包含切口酶。在一些實施例中，組合物及方法包含切口酶RNA引導之DNA結合劑，諸如切口酶Cas，例如切口酶Cas9，其誘導目標DNA出現切口，而非雙股斷裂。
在一些實施例中，核酸酶(例如RNA引導之DNA結合劑)可經修飾以僅含有一個功能性核酸酶域。舉例而言，RNA引導之DNA結合劑可經修飾使得核酸酶域中之一者發生突變或完全或部分缺失以降低其核酸裂解活性。在一些實施例中，使用具有活性降低之RuvC域之切口酶Cas。在一些實施例中，使用具有非活性RuvC域之切口酶Cas。在一些實施例中，使用具有活性降低之HNH域之切口酶Cas。在一些實施例中，使用具有非活性HNH域之切口酶Cas。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑核酸酶域內之保守胺基酸經取代以降低或改變核酸酶活性。在一些實施例中，Cas蛋白可包含RuvC或RuvC樣核酸酶域中之胺基酸取代。RuvC或RuvC樣核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括D10A (基於化膿鏈球菌Cas9蛋白)或H588A (基於腦膜炎雙球菌Cas9蛋白)。在一些實施例中，Cas蛋白可包含HNH或HNH樣核酸酶域中之胺基酸取代。HNH或HNH樣核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A (基於SpyCas9蛋白)或D16A (基於NmeCas9蛋白)。
在一些實施例中，本文所描述之RNP複合物包含切口酶或編碼切口酶之mRNA及與目標序列之有義股及反義股分別互補的一對gRNA (其中之一者或兩者可為sgRNA)。在此實施例中，gRNA (例如sgRNA)將切口酶引導至目標序列且藉由在目標序列之對置股上產生切口(亦即，雙重切口)來引入雙股斷裂(DSB)。在一些實施例中，使用雙重切口可改良特異性且減少脫靶效應。在一些實施例中，切口酶RNA引導之DNA結合劑連同經選擇以緊密接近之兩個個別gRNA (例如sgRNA)一起使用，以在目標DNA中產生雙重切口。
在一些實施例中，使用嵌合Cas蛋白，其中蛋白質之一個域或區經另一蛋白質之一部分置換。在一些實施例中，Cas核酸酶域可經來自諸如Fok1之另一核酸酶的域置換。在一些實施例中，Cas蛋白可為經修飾之核酸酶。
在一些實施例中，核酸酶(例如RNA引導之DNA結合劑)可經修飾以誘導點突變或鹼基變化，例如去胺作用。
在一些實施例中，Cas蛋白包含融合蛋白，其包含連接至異源功能域之Cas核酸酶(例如Cas9)，該Cas核酸酶為切口酶或為無催化活性的。在一些實施例中，Cas蛋白包含融合蛋白，其包含連接至異源功能域之無催化活性Cas核酸酶(例如Cas9) (參見例如WO2014152432)。在一些實施例中，無催化活性Cas9來自化膿鏈球菌。在一些實施例中，無催化活性Cas9來自腦膜炎雙球菌。在一些實施例中，無催化活性Cas包含使Cas不活化的突變。在一些實施例中，異源功能域為調節基因表現、組蛋白或DNA的域。在一些實施例中，異源功能域為轉錄活化域或轉錄抑制域。在一些實施例中，核酸酶為無催化活性Cas核酸酶，諸如dCas9。
在一些實施例中，異源功能域為去胺酶，諸如胞苷去胺酶或腺嘌呤去胺酶。在某些實施例中，異源功能域為C至T鹼基轉換器(胞苷去胺酶)，諸如脂蛋白元B mRNA編輯酶(APOBEC)去胺酶。諸如去胺酶之異源功能域可為含有具有切口酶活性之Cas核酸酶或無催化活性之Cas核酸酶的融合蛋白的一部分。
在一些實施例中，目標序列可鄰近於PAM。在一些實施例中，PAM可鄰近於或在目標序列之3'端之1、2、3或4個核苷酸內。PAM之長度及序列可視所用Cas蛋白而定。舉例而言，PAM可選自特定Cas9蛋白或Cas9直系同源物之共有或特定PAM序列，包括Ran等人, Nature 520:186-191 (2015)之圖1中所揭示的彼等者。在一些實施例中，PAM可包含2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸長度。非限制性例示性PAM序列包括NCC、NGG、NAG、NGA、NGAG、NGCG、NNGRRT、TTN、NGGNG、NG、NAAAAN、NNAAAAW、NNNNACA、GNNNCNNA及NNNNGATT (其中N定義為任何核苷酸，且W定義為A或T，且R定義為A或G)。在一些實施例中，PAM序列可為NGG。在一些實施例中，PAM序列可為NGGNG。在一些實施例中，PAM序列可為NNAAAAW。
舉例而言，PAM可選自特定Nme Cas9蛋白或Nme Cas9直系同源物之共有或特定PAM序列(Edraki等人, Mol. Cell 73:714-726, 2019)。在一些實施例中，PAM可包含2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸長度。非限制性例示性PAM序列包括NCC、N4GAYW、N4GYTT、N4GTCT、NNNNCC(a)、NNNNCAAA (其中N定義為任何核苷酸，W定義為A或T，且R定義為A或G；且第二個C之後的(a)較佳(但非必需)為A)。在一些實施例中，PAM序列可為NCC。
在一些實施例中，異源功能域可促進將RNA引導之DNA結合劑輸送至細胞核中。舉例而言，異源功能域可為核定位信號(NLS)。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與1至10個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與1至5個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與一個NLS融合。在使用一個NLS之情況下，NLS可在RNA引導之DNA結合劑序列之N末端或C末端處融合。其亦可插入RNA引導之DNA結合劑序列內。在其他實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與多於一個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與2、3、4或5個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合。在一些實施例中，NLS可與RNA引導之DNA結合劑序列之N末端融合。在一些實施例中，NLS可僅與RNA引導之DNA結合劑序列之N末端融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可不具有插入RNA引導之DNA結合劑序列內之NLS。在某些實施例中，RNA引導之DNA結合劑序列之C末端可不具有NLS。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合。在某些情況下，兩個NLS可相同(例如，兩個SV40 NLS)或不同。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑與羧基末端處之兩個NLS序列(例如SV40)融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合，一個NLS在N末端處且一個在C末端處。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與3個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可不與NLS融合。在一些實施例中，NLS可為單聯(monopartite)序列，諸如SV40 NLS、PKKKRKV (SEQ ID NO: 16)或PKKKRRV (SEQ ID NO: 17)。在一些實施例中，NLS可為雙聯序列，諸如核質蛋白之NLS、KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 18)。在特定實施例中，單一PKKKRKV (SEQ ID NO: 19) NLS可在RNA引導之DNA結合劑之C末端處融合。一或多個連接子視情況包括在融合位點處。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑包含與SEQ ID NO: 301-313 (如表5中所示)中之任一者具有至少90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑包含與SEQ ID NO: 301-313、350及352-360中之任一者具有至少90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的序列。在一些實施例中，前述一致性水準中之任一者為至少95%、至少98%、至少99%或100%。
在一些實施例中，編碼RNA引導之DNA結合劑之mRNA包含與如表5中所示之SEQ ID NO: 321-323、361、363-372及374-382中之任一者具有至少90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的序列。
IV. 使用方法
在一些實施例中，本文所描述之gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)、組合物或醫藥調配物中之任一者或多者係用於製備供治療或預防個體之疾病或病症的藥劑。
在一些實施例中，本發明包含一種治療或預防個體之疾病或病症的方法，其包含投與本文所描述之gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)、組合物或醫藥調配物中之任一者或多者。
在一些實施例中，本發明包含一種修飾目標DNA的方法或用途，其包含投與或遞送本文所描述之gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)、組合物或醫藥調配物中之任一者或多者。
在一些實施例中，本發明包含一種調節目標基因的方法或用途，其包含投與或遞送本文所描述之gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)、組合物或醫藥調配物中之任一者或多者。在一些實施例中，調節為編輯目標基因。在一些實施例中，調節為改變目標基因所編碼之蛋白質的表現。如本文所用，「基因編輯」或「基因修飾」為例如藉由gRNA/Cas複合物誘導之DNA層級之改變。基因編輯或基因修飾可包含通常在已確定序列或基因體基因座內之插入、缺失或取代(鹼基取代，例如C至T，或點突變)。基因修飾改變DNA之核酸序列。基因修飾可處於單一核苷酸位置處。基因修飾可處於多個核苷酸，例如2、3、4、5或更多個核苷酸處，該等核苷酸通常彼此非常接近，例如連續核苷酸。
在一些實施例中，該方法或用途引起基因編輯。在一些實施例中，該方法或用途引起目標基因內之雙股斷裂。在一些實施例中，該方法或用途引起在DSB之非同源端接合期間形成插入缺失突變。在一些實施例中，該方法或用途引起目標基因中之核苷酸插入或缺失。在一些實施例中，目標基因中之核苷酸插入或缺失引起讀框轉移突變或提前終止密碼子，其產生非功能蛋白質。在一些實施例中，目標基因中之核苷酸插入或缺失引起目標基因表現之阻斷或消除。在一些實施例中，該方法或用途包含DSB之同源定向修復。在一些實施例中，該方法或用途進一步包含將模板遞送至細胞，其中模板之至少一部分在核酸酶所誘導之雙股斷裂位點處或附近併入至目標DNA中。在一些實施例中，該方法或用途引起目標基因內之單股斷裂。在一些實施例中，該方法或用途引起目標基因內之鹼基變化，例如藉由去胺作用。基因編輯通常發生在目標基因中與間隔序列形成雙螺旋體的部分內或附近。
在一些實施例中，該方法或用途引起基因調節。在一些實施例中，基因調節為基因表現之增加或減少、DNA之甲基化狀態變化，或組蛋白次單元之修飾。在一些實施例中，該方法或用途引起目標基因所編碼之蛋白質之表現增加或減少。
可在活體外及活體內測試gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)之功效。在一些實施例中，本發明包含本文所描述之gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)、組合物或醫藥調配物中之一或多者，其中gRNA在與Cas核酸酶(例如Cas9)或編碼Cas9之mRNA一起提供至細胞時會引起基因調節。在一些實施例中，可在活體外或活體內量測gRNA之功效。
在一些實施例中，對包含gRNA之Cas RNP的活性與包含未經修飾之sgRNA或參考sgRNA之Cas RNP的活性進行比較，該參考sgRNA缺乏存在於sgRNA中之修飾，諸如一或多個內部連接子、經縮短之區或YA位點取代。
在一些實施例中，gRNA增加或減少目標蛋白表現之效率係藉由量測目標蛋白之量測定。
在一些實施例中，遞送Cas核酸酶及gRNA之後，藉由存在於基因體中之目標位置處之編輯來測定利用特定gRNA進行編輯之效率。在一些實施例中，藉由下一代定序來量測利用特定gRNA進行編輯之效率。在一些實施例中，測定所關注之目標區之編輯百分比。在一些實施例中，在遞送gRNA及Cas核酸酶之後，量測具有序列改變(例如所關注之目標區中具有核苷酸之插入或缺失(插入缺失)或不具有插入或缺失之鹼基變化)之序列讀段總數目相對於序列讀段總數目的比率。
在一些實施例中，藉由成功基因編輯引入的序列改變(例如核苷酸之插入或缺失，或鹼基取代，或點突變)之存在來量測利用特定gRNA進行編輯之效率。在一些實施例中，在生物化學分析中測試Cas核酸酶及gRNA之活性。在一些實施例中，在無細胞裂解分析中測試Cas核酸酶及gRNA之活性。在一些實施例中，在Neuro2A細胞中測試Cas核酸酶及gRNA之活性。在一些實施例中，在原代細胞(例如原代肝細胞)中測試Cas核酸酶及gRNA之活性。
在一些實施例中，活體內給與包含經修飾之gRNA及Cas蛋白或編碼Cas蛋白之mRNA的LNP之後，量測經修飾之gRNA之活性。
在一些實施例中，本文提供之gRNA或組合物之活體內功效係藉由在投與gRNA及Cas核酸酶之後在自組織(例如肝臟組織)提取之DNA中量測之編輯功效來測定。
在一些實施例中，個體免疫反應之活化係藉由在活體內給與sgRNA以及Cas核酸酶mRNA或蛋白質(例如調配於LNP中)之後細胞介素之血清濃度來量測。在一些實施例中，細胞介素為干擾素-α (IFN-α)、介白素6 (IL-6)、單核球趨化蛋白1 (MCP-1)或腫瘤壞死因子α (TNF-α)。
在一些實施例中，相較於投與未經修飾之sgRNA，一起投與Cas RNP或Cas核酸酶mRNA與經修飾之gRNA (例如sgRNA或dgRNA)會引起免疫細胞介素之血清濃度降低。在一些實施例中，本發明包含包括向個體投與本文所揭示之gRNA中之任一者的方法，其中該gRNA與未經類似修飾之對照gRNA相比引發個體血清中免疫細胞介素之濃度降低。
V. 引導RNA之遞送
在一些實施例中，單獨或編碼於一或多種載體上的本文所揭示之gRNA組合物、組合物或醫藥調配物調配於脂質奈米顆粒中或經由脂質奈米顆粒投與；參見例如WO2017/173054，其內容特此以全文引用之方式併入。
脂質；調配物；遞送
本文揭示使用包含本文中所描述之核酸或組合物之脂質核酸組裝組合物的各種實施例。在一些實施例中，脂質核酸組裝組合物包含本文所描述之核酸(例如，包含內部連接子之gRNA)。
如本文所用，「脂質核酸組裝組合物」係指基於脂質之遞送組合物，包括脂質奈米顆粒(LNP)及脂質複合體。LNP係指＜100 nM之脂質奈米顆粒。LNP係藉由將脂質組分(例如於乙醇中)與水性核酸組分精確混合而形成，且LNP之大小均一。脂質複合體為藉由使脂質與核酸組分大量混合而形成之顆粒且大小在約100 nm與1微米之間。在某些實施例中，脂質核酸組裝體為LNP。如本文所用，「脂質核酸組裝體」包含複數個(亦即超過一個)藉由分子間力以物理方式彼此締合之脂質分子。脂質核酸組裝體可包含pKa值為＜7.5或＜7之生物可用脂質。脂質核酸組裝體係藉由混合含核酸水溶液與基於有機溶劑之脂質溶液(例如100%乙醇)形成。適合溶液或溶劑包括或可含有：水、PBS、Tris緩衝液、NaCl、檸檬酸鹽緩衝液、乙醇、氯仿、二乙醚、環己烷、四氫呋喃、甲醇、異丙醇。醫藥學上可接受之緩衝液可視情況包含於包含脂質核酸組裝體之醫藥調配物中，例如用於離體療法。在一些實施例中，水溶液包含本文所描述之gRNA。在一些實施例中，水溶液進一步包含編碼RNA引導之DNA結合劑(諸如Cas9)的mRNA。
如本文所用，脂質奈米顆粒(LNP)係指包含複數個(亦即，超過一個)藉由分子間力以物理方式彼此締合之脂質分子的顆粒。LNP可例如為微球體(包括單層及多層囊泡，例如「脂質體」，在一些實施例中為大體上球形之層狀相脂質雙層，且在更特定實施例中可包含水性核心，例如包含大部分RNA分子)、乳液中之分散相、微胞或懸浮液中之內相。乳液、微胞及懸浮液可為用於局部及/或表面遞送之適合組合物。亦參見例如WO2017173054A1，其內容特此以全文引用之方式併入。熟習此項技術者已知能夠將核苷酸遞送至個體之任何LNP可與本文所描述之引導RNA一起使用。
在一些實施例中，水溶液包含本文所描述之gRNA。包含脂質核酸組裝組合物之醫藥調配物可視情況包含醫藥學上可接受之緩衝液。
在一些實施例中，脂質核酸組裝組合物包括「胺脂質」(在本文中或其他處有時描述為「可離子化脂質」或「可生物降解脂質」)，以及視情況存在之「輔助脂質」、「中性脂質」及隱形脂質，諸如PEG脂質。在一些實施例中，取決於pH，胺脂質或可離子化脂質為陽離子型的。
胺脂質
在一些實施例中，脂質核酸組裝組合物包含「胺脂質」，其為例如可離子化脂質，諸如脂質A或其等效物，包括脂質A之縮醛類似物。
在一些實施例中，胺脂質為脂質A，其為十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，亦稱作(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。脂質A可描繪為：
。
可根據WO2015/095340 (例如第84至86頁)合成脂質A。在一些實施例中，胺脂質為脂質A之等效物。
在一些實施例中，胺脂質為脂質A之類似物。在一些實施例中，脂質A類似物為脂質A之縮醛類似物。在特定脂質核酸組裝組合物中，縮醛類似物為C4-C12縮醛類似物。在一些實施例中，縮醛類似物為C5-C12縮醛類似物。在額外實施例中，縮醛類似物為C5-C10縮醛類似物。在其他實施例中，縮醛類似物係選自C4、C5、C6、C7、C9、C10、C11及C12縮醛類似物。
適用於本文所描述之脂質核酸組裝體的胺脂質及其他「可生物降解脂質」為活體內或離體可生物降解的。胺脂質具有低毒性(例如，以大於或等於10 mg/kg之量在動物模型中得到耐受而不具有不良作用)。在一些實施例中，包含胺脂質之脂質核酸組裝體包括其中在8、10、12、24或48小時或3、4、5、6、7或10天內自血漿或工程化細胞清除至少75%之胺脂質的脂質核酸組裝體。在一些實施例中，包含胺脂質之脂質核酸組裝體包括其中在8、10、12、24或48小時或3、4、5、6、7或10天內自血漿清除至少50%之核酸(例如mRNA或gRNA)的脂質核酸組裝體。在一些實施例中，包含胺脂質之脂質核酸組裝體包括其中在8、10、12、24或48小時或3、4、5、6、7或10天內自血漿清除至少50%之脂質核酸組裝體的脂質核酸組裝體，例如藉由量測脂質(例如，胺脂質)、核酸(例如，RNA/mRNA)或其他組分。在一些實施例中，量測脂質核酸組裝體之經脂質囊封相對於游離脂質、RNA或核酸組分。
可生物降解脂質包括例如WO/2020/219876、WO/2020/118041、WO/2020/072605、WO/2019/067992、WO/2017/173054、WO2015/095340及WO2014/136086之可生物降解脂質，且LNP包括其中所描述之LNP組合物，其脂質及組合物特此以引用之方式併入。
脂質清除率可如文獻中所描述來量測。參見Maier, M.A.等人 Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics.
Mol. Ther.2013, 21(8), 1570-78 (「
Maier」)。舉例而言，在
Maier中，以0.3 mg/kg藉由靜脈內彈丸注射經由外側尾部靜脈向六至八週齡雄性C57Bl/6小鼠投與含有靶向螢光素酶之siRNA的LNP-siRNA系統。在給藥後0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、96及168小時收集血液、肝臟及脾臟樣品。在收集組織之前向小鼠灌注生理鹽水且處理血液樣品以獲得血漿。處理且藉由LC-MS分析所有樣品。此外，
Maier描述了一種用於評定投與LNP-siRNA調配物之後的毒性之程序。舉例而言，以0、1、3、5及10 mg/kg (5隻動物/組)經由單一靜脈內彈丸注射以5 mL/kg之劑量體積向雄性史泊格多利大鼠(Sprague-Dawley rat)投與靶向螢光素酶之siRNA。24小時之後，自清醒的動物之頸靜脈獲得約1 mL血液且分離血清。在給藥後72小時，將所有動物安樂死以用於屍體剖檢。進行臨床症狀、體重、血清化學、器官重量及組織病理學之評定。儘管
Maier描述了用於評定siRNA-LNP調配物之方法，但此等方法可適用於評定本發明之脂質核酸組裝組合物之投藥的清除率、藥物動力學及毒性。
此項技術中已知用於核酸之LNP遞送的可離子化及生物可用脂質為適合的。脂質可取決於其所存在之介質的pH而離子化。舉例而言，在弱酸性介質中，脂質，諸如胺脂質可經質子化且因此帶有正電荷。相反地，在弱鹼性介質，諸如其中pH為大約7.35之血液中，脂質，諸如胺脂質可不經質子化且因此不帶電荷。
脂質攜帶電荷之能力與其固有pKa有關。在一些實施例中，本發明之胺脂質可各自獨立地具有在約5.1至約7.4範圍內之pKa。在一些實施例中，本發明之生物可用脂質可各自獨立地具有在約5.1至約7.4，諸如約5.5至約6.6、約5.6至約6.4、約5.8至約6.2或約5.8至約6.5範圍內之pKa。舉例而言，本發明之胺脂質可各自獨立地具有在約5.8至約6.5範圍內之pKa。pKa在約5.1至約7.4範圍內之脂質有效用於將負荷活體內遞送至例如肝臟。另外，已發現，pKa在約5.3至約6.4範圍內之脂質有效用於活體內遞送至例如腫瘤。參見例如WO2014/136086。
額外脂質
適用於本發明之脂質核酸組裝組合物中的「中性脂質」包括例如多種中性、不帶電荷或兩性離子型脂質。適用於本發明之中性磷脂之實例包括但不限於：5-十七基苯-1,3-二醇(間苯二酚)、二軟脂醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、磷酸膽鹼(DOPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、磷脂醯膽鹼(PLPC)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DAPC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、卵磷脂醯膽鹼(EPC)、二月桂醯基磷脂醯膽鹼(DLPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、1-肉豆蔻醯基-2-軟脂醯基磷脂醯膽鹼(MPPC)、1-軟脂醯基-2-肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(PMPC)、1-軟脂醯基-2-硬脂醯基磷脂醯膽鹼(PSPC)、1,2-二花生醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DBPC)、1-硬脂醯基-2-軟脂醯基磷脂醯膽鹼(SPPC)、1,2-二十碳烯醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DEPC)、軟脂醯油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、溶血磷脂醯基膽鹼、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二亞油醯基磷脂醯膽鹼二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二軟脂醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、軟脂醯油醯基磷脂醯乙醇胺(POPE)、溶血磷脂醯乙醇胺及其組合。在一個實施例中，中性磷脂可選自由以下組成之群：二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)及二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)。在另一實施例中，中性磷脂可為二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)。
「輔助脂質」包括類固醇、固醇及烷基間苯二酚。適用於本發明中之輔助脂質包括但不限於膽固醇、5-十七烷基間苯二酚及膽固醇半丁二酸酯。在一個實施例中，輔助脂質可為膽固醇。在一個實施例中，輔助脂質可為膽固醇半丁二酸酯。
「隱形脂質」為改變奈米顆粒可在活體內(例如血液中)存在之時長的脂質。隱形脂質可藉由例如減少顆粒聚集且控制粒度來輔助調配過程。本文使所用之隱形脂質可調節脂質核酸組裝體之藥物動力學特性或有助於奈米顆粒離體穩定性。適用於本發明之脂質核酸組裝組合物之隱形脂質包括但不限於具有連接至脂質部分之親水性頭基的隱形脂質。適用於本發明之脂質核酸組裝組合物之隱形脂質及關於此類脂質之生物化學的資訊可見於Romberg等人, Pharmaceutical Research, 第25卷, 第1期, 2008, 第55至71頁及Hoekstra等人, Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52中。額外適合PEG脂質揭示於例如WO 2006/007712中。
在一個實施例中，隱形脂質之親水性頭基包含選自基於PEG之聚合物的聚合物部分。隱形脂質可包含脂質部分。在一些實施例中，隱形脂質為PEG脂質。
在一個實施例中，隱形脂質包含選自基於以下之聚合物的聚合物部分：PEG (有時稱作聚(環氧乙烷))、聚(㗁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)、聚胺基酸及聚[N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺]。
在一個實施例中，PEG脂質包含基於PEG (有時稱作聚(環氧乙烷))之聚合物部分。
PEG脂質進一步包含脂質部分。在一些實施例中，脂質部分可源自二醯基甘油或二醯基甘油醯胺、包括包含具有獨立地包含約C4至約C40飽和或不飽和碳原子之烷基鏈長度的二烷基甘油或二烷基甘油醯胺基之彼等者，其中該鏈可包含一或多個官能基，諸如醯胺或酯。在一些實施例中，烷基鏈長度包含約C10至C20。二烷基甘油或二烷基甘油醯胺基可進一步包含一或多個經取代之烷基。鏈長可為對稱或不對稱的。
除非另外指示，否則如本文所用，術語「PEG」意謂任何聚乙二醇或其他聚伸烷醚聚合物。在一個實施例中，PEG為乙二醇或環氧乙烷的視情況經取代之直鏈或分支鏈聚合物。在一個實施例中，PEG為未經取代的。在一個實施例中，PEG經例如一或多個烷基、烷氧基、醯基、羥基或芳基取代。在一個實施例中，該術語包括PEG共聚物，諸如PEG-聚胺基甲酸酯或PEG-聚丙烯(參見例如J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992))；在另一實施例中，該術語不包括PEG共聚物。在一個實施例中，PEG之分子量為約130至約50,000，在子實施例中，約150至約30,000，在子實施例中，約150至約20,000，在子實施例中，約150至約15,000，在子實施例中，約150至約10,000，在子實施例中，約150至約6,000，在子實施例中，約150至約5,000，在子實施例中，約150至約4,000，在子實施例中，約150至約3,000，在子實施例中，約300至約3,000，在子實施例中，約1,000至約3,000，及在子實施例中，約1,500至約2,500。
在一些實施例中，PEG (例如，與脂質部分或脂質，諸如隱形脂質結合)為「PEG-2K」，亦稱為「PEG2k」或「PEG 2000」，其平均分子量為約2,000道爾頓。PEG-2K在本文中由下式(I)表示，其中n為45，意謂經數目平均化之聚合度包含約45個次單元
。然而，亦可使用此項技術中已知的其他PEG實施例，包括例如其中經數目平均化之聚合度包含約23個次單元(n=23)及/或68個次單元(n=68)的彼等者。在一些實施例中，n可在約30至約60範圍內。在一些實施例中，n可在約35至約55範圍內。在一些實施例中，n可在約40至約50範圍內。在一些實施例中，n可在約42至約48範圍內。在一些實施例中，n可為45。在一些實施例中，R可選自H、經取代之烷基及未經取代之烷基。在一些實施例中，R可為未經取代之烷基。在一些實施例中，R可為甲基。
在本文所描述之實施例中之任一者中，PEG脂質可係選自PEG-二月桂醯基甘油、PEG-二肉豆蔻醯基甘油(PEG-DMG) (例如1,2-二肉豆蔻醯基-rac-甘油-3-甲基聚氧乙二醇2000 (PEG2k-DMG)或PEG-DMG (目錄號GM-020，來自NOF, Tokyo, Japan))、PEG-二棕櫚醯基甘油、PEG-二硬脂醯基甘油(PEG-DSPE) (目錄號DSPE-020CN，NOF, Tokyo, Japan)、PEG-二月桂基甘油醯胺、PEG-二肉豆蔻基甘油醯胺、PEG-二棕櫚醯基甘油醯胺及PEG-二硬脂醯基甘油醯胺、PEG-膽固醇(1-[8'-(膽甾-5-烯-3[β]-氧基)甲醯胺基-3',6'-二氧雜辛基]胺甲醯基-[Ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB (3,4-二-十四氧基苯甲基-[Ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG2k-DMG) (目錄號880150P，來自Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG2k-DSPE) (目錄號880120C，來自Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(PEG2k-DSG；GS-020，NOF Tokyo, Japan)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(PEG2k-DMA)及1,2-二硬脂醯氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG2k-DSA)。在一個實施例中，PEG脂質可為1,2-二肉豆蔻醯基-rac-甘油-3-甲基聚氧乙二醇2000 (PEG2k-DMG)。在一個實施例中，PEG脂質可為PEG2k-DMG。在一些實施例中，PEG脂質可為PEG2k-DSG。在一個實施例中，PEG脂質可為PEG2k-DSPE。在一個實施例中，PEG脂質可為PEG2k-DMA。在一個實施例中，PEG脂質可為PEG2k-C-DMA。在一個實施例中，PEG脂質可為化合物S027，其揭示於WO2016/010840 (第[00240]至[00244]段)中。在一個實施例中，PEG脂質可為PEG2k-DSA。在一個實施例中，PEG脂質可為PEG2k-C11。在一些實施例中，PEG脂質可為PEG2k-C14。在一些實施例中，PEG脂質可為PEG2k-C16。在一些實施例中，PEG脂質可為PEG2k-C18。
LNP遞送gRNA
脂質奈米顆粒(LNP)為遞送核苷酸及蛋白質負荷之熟知方式，且可用於遞送本文所揭示之gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)、組合物或醫藥調配物。在一些實施例中，LNP遞送核酸、蛋白質、或核酸連同蛋白質一起。如本文所用，脂質奈米顆粒(LNP)係指包含複數個(亦即，超過一個)藉由分子間力以物理方式彼此締合之脂質分子的顆粒。LNP可例如為微球體(包括單層及多層囊泡，例如「脂質體」，在一些實施例中為大體上球形之層狀相脂質雙層，且在更特定實施例中可包含水性核心，例如包含大部分RNA分子)、乳液中之分散相、微胞或懸浮液中之內相(參見例如WO2017173054，其內容特此以全文引用之方式併入)。可利用熟習此項技術者已知能夠向個體遞送核苷酸之任何LNP。
在一些實施例中，本發明包含一種向個體遞送本文所揭示之gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)中之任一者的方法，其中gRNA與LNP締合。在一些實施例中，gRNA/LNP亦與Cas核酸酶或編碼Cas核酸酶之多核苷酸(例如mRNA或DNA)締合。
在一些實施例中，本發明包含一種組合物，其包含所揭示gRNA中之任一者及LNP。在一些實施例中，組合物進一步包含Cas9或編碼Cas9之多核苷酸(例如mRNA或DNA)。
在一些實施例中，本文提供一種將本文所描述之引導RNA中之任一者遞送至個體之細胞或細胞群，包括活體內遞送至個體內之細胞或細胞群的方法，其中該等組分中之任一者或多者與LNP締合。在一些實施例中，該方法進一步包含RNA引導之DNA結合劑(例如，Cas9或編碼Cas9之多核苷酸(例如mRNA或DNA))。
在一些實施例中，本發明提供一種組合物，其包含單獨或與LNP組合的本文所描述之引導RNA中之任一者或本文所揭示之供體構築體。在一些實施例中，該組合物進一步包含RNA引導之DNA結合劑(例如，Cas9或編碼Cas9之多核苷酸(例如mRNA或DNA))。
在一些實施例中，LNP包含陽離子脂質。在一些實施例中，LNP包含十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，亦稱作(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯)。在一些實施例中，LNP包含約4.5之陽離子脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)之莫耳比。在一些實施例中，LNP包含8-((7,7-雙(辛氧基)庚基)(2-羥乙基)胺基)辛酸壬酯。在一些實施例中，LNP包含約4.5至6.5之陽離子脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)之莫耳比。在一些實施例中，LNP包含約4.5之陽離子脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)之莫耳比。在一些實施例中，LNP包含約6.0之陽離子脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)之莫耳比。
在一些實施例中，與本文所揭示之gRNA締合之LNP用於製備供治療疾病或病症所用的藥劑。
電穿孔為遞送負荷之熟知方式，且任何電穿孔方法可用於遞送本文所揭示之gRNA中之任一者。在一些實施例中，電穿孔可用於遞送本文所揭示之gRNA中之任一者及Cas9或編碼Cas9之多核苷酸(例如mRNA或DNA)。
在一些實施例中，本發明包含一種向離體細胞遞送本文所揭示之gRNA中之任一者的方法，其中gRNA與LNP締合或不與LNP締合。在一些實施例中，gRNA/LNP或gRNA亦與Cas9或編碼Cas9之多核苷酸(例如mRNA或DNA)締合。參見例如WO2021222287，其以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，載體包含一或多個編碼mRNA之核苷酸序列，該mRNA編碼RNA引導之DNA核酸酶，其可為Cas核酸酶，諸如Cas9或Cpf1。在一些實施例中，載體包含一或多個編碼crRNA、trRNA及mRNA之核苷酸序列，該mRNA編碼RNA引導之DNA核酸酶，其可為Cas蛋白，諸如Cas9。在一個實施例中，Cas9來自Spy Cas9或NmeCas9。在一些實施例中，編碼crRNA、trRNA或crRNA及trRNA (其可為sgRNA)之核苷酸序列包含或由以下組成：側接有來自天然存在之CRISPR/Cas系統的重複序列之全部或一部分的引導序列。包含或由crRNA、trRNA或crRNA及trRNA組成之核酸可進一步包含載體序列，其中該載體序列包含或由以下組成：不會與crRNA、trRNA或crRNA及trRNA一起經天然發現的核酸。
在一些實施例中，組分可以裸核酸形式、以與諸如脂質體或泊洛沙姆(poloxamer)之藥劑複合之核酸形式引入，或可藉由病毒載體(例如腺病毒、AAV、疱疹病毒、反轉錄病毒、慢病毒)來遞送。用於非病毒遞送核酸之方法及組合物包括電穿孔、脂質體轉染、顯微注射、基因槍、病毒顆粒、脂質體、免疫脂質體、LNP、聚陽離子或脂質：核酸結合物、裸核酸(例如裸DNA/RNA)、人工病毒粒子及經藥劑增強之DNA攝取。使用例如Sonitron 2000系統(Rich-Mar)進行之聲致穿孔亦可用於遞送核酸。
***
本說明書及例示性實施例不應視為限制性的。出於本說明書及所附申請專利範圍之目的，除非另外指示，否則表示數量、百分比或比例的所有數字，及說明書及申請專利範圍中所用之其他數值均應理解為在所有情況下藉由術語「約」修飾至其尚未如此修飾的程度。
表5. 序列表
VI. 實例
| 描述 | SEQ ID NO: | 序列 |
| SpyCas9胺基酸序列 | 301 | MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV |
| SauCas9胺基酸序列 | 302 | MALEAPKKKRKVGSDYKDDDDKKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG |
| CdiCas9胺基酸序列 | 303 | MKYHVGIDVGTFSVGLAAIEVDDAGMPIKTLSLVSHIHDSGLDPDKIKSAVTRLASSGIARRTRRLYRRKRRRLQQLDKFIQRQGWPVIELEDYSDPLYPWKVRAELAASYIADEKERGEKLSVALRHIARHRGWRNPYAKVSSLYLPDEPSDAFKAIREEIKRASGQPVPETATVGQMVTLCELGTLKLRGEGGVLSARLQQSDHAREIQEICRMQEIGQELYRKIIDVVFAAESPKGSASSRVGKDPLQPGKNRALKASDAFQRYRIAALIGNLRVRVDGEKRILSVEEKNLVFDHLVNLAPKKEPEWVTIAEILGIDRGQLIGTATMTDDGERAGARPPTHDTNRSIVNSRIAPLVDWWKTASALEQHAMVKALSNAEVDDFDSPEGAKVQAFFADLDDDVHAKLDSLHLPVGRAAYSEDTLVRLTRRMLADGVDLYTARLQEFGIEPSWTPPAPRIGEPVGNPAVDRVLKTVSRWLESATKTWGAPERVIIEHVREGFVTEKRAREMDGDMRRRAARNAKLFQEMQEKLNVQGKPSRADLWRYQSVQRQNCQCAYCGSPITFSNSEMDHIVPRAGQGSTNTRENLVAVCHRCNQSKGNTPFAIWAKNTSIEGVSVKEAVERTRHWVTDTGMRSTDFKKFTKAVVERFQRATMDEEIDARSMESVAWMANELRSRVAQHFASHGTTVRVYRGSLTAEARRASGISGKLEFLDGVGKSRLDRRHHAIDAAVIAFTSDYVAETLAVRSNLKQSQAHRQEAPQWREFTGKDAEHRAAWRVWCQKMEKLSALLTEDLRDDRVVVMSNVRLRLGNGSAHEETIGKLSKVKLGSQLSVSDIDKASSEALWCALTREPDFDPKDGLPANPERHIRVNGTHVYAGDNIGLFPVSAGSIALRGGYA ELGSSFHHARVYKITSGKKPAFAMLRVYTIDLLPYRNQDLFSVELKPQTMSMRQAEKKLRDALATGNAEYLGWLVVDDELVVDTSKIATDQVKAVEAELGTIRRWRVDGFFGDTRLRLRPLQMSKEGIKKESAPELSKIIDRPGWLPAVNKLFSEGNVTVVRRDSLGRVRLESTAHLPVTWKVQPKKKRKV |
| St1Cas9胺基酸序列 | 304 | MSDLVLGLDIGIGSVGVGILNKVTGEIIHKNSRIFPAAQAENNLVRRTNRQGRRLTRRKK HRIVRLNRLFEESGLITDFTKISINLNPYQLRVKGLTDELSNEELFIALKNMVKHRGISY LDDASDDGNSSVGDYAQIVKENSKQLETKTPGQIQLERYQTYGQLRGDFTVEKDGKKHRL INVFPTSAYRSEALRILQTQQEFNPQITDEFINRYLEILTGKRKYYHGPGNEKSRTDYGR YRTSGETLDNIFGILIGKCTFYPDEFRAAKASYTAQEFNLLNDLNNLTVPTETKKLSKEQ KNQIINYVKNEKAMGPAKLFKYIAKLLSCDVADIKEYRIDKSGKAEIHTFEAYRKMKTLE TLDIEQMDRETLDKLAYVLTLNTEREGIQEALEHEFADGSFSQKQVDELVQFRKANSSIF GKGWHNFSVKLMMELIPELYETSEEQMTILTRLGKQKTTSSSNKTKYIDEKLLTEEIYNP VVAKSVRQAIKIVNAAIKEYGDFDNIVIEMARETNEDDEKKAIQKIQKANKDEKDAAMLK AANQYNGKAELPHSVFHGHKQLATKIRLWHQQGERCLYTGKTISIHDLINNSNQFEVDHI LPLSITFDDSLANKVLVYATANQEKGQRTPYQALDSMDDAWSFRELKAFVRESKTLSNKK KEYLLTEEDISKFDVRKKFIERNLVDTRYASRVVLNALQEHFRAHKIDTKVSVVRGQFTS QLRRHWGIEKTRDTYHHHAVDALIIAASIQLNLWKKQKNTLVSYSEDQLLDIETGELISD DEYKESVFKAPYQHFVDTLKSKEFEDSILFSYQVDSKFNRKISDATIYATRQAKVGKDKA DETYVLGKIKDIYTQDGYDAFMKIYKKDKSKFLMYRHDPQTFEKVIEPILENYPNKQINE KGKEVPVNPFLKYKEEHGYIRKYSKKGNGPEIKSLKYYDSKLGNHIDITPKDSNNKVVLQ SVSPWRADVYFNKTTGKYEILGLKYADLQFEKGTGTYKISQEKYNDIKKKEGVDSDSEFK FTLYKNDLLLVKDTETKEQQLFRFLSRTMPKQKHYVELKPYDKQKFEGGEALIKVLGNVA NSGQCKKGLGKSNISIYKVRTDVLGNQHIIKNEGDKPKLDF |
| 305 | 未使用 | |
| AceCas9胺基酸序列 | 306 | MSLQLIIKGVEYGRGADPTMGGSEVGTVPVTWRLGVDVGERSIGLAAVSYEEDKPKEILA AVSWIHDGGVGDERSGASRLALRGMARRARRLRRFRRARLRDLDMLLSELGWTPLPDKNV SPVDAWLARKRLAEEYVVDETERRRLLGYAVSHMARHRGWRNPWTTIKDLKNLPQPSDSW ERTRESLEARYSVSLEPGTVGQWAGYLLQRAPGIRLNPTQQSAGRRAELSNATAFETRLR QEDVLWELRCIADVQGLPEDVVSNVIDAVFCQKRPSVPAERIGRDPLDPSQLRASRACLE FQEYRIVAAVANLRIRDGSGSRPLSLEERNAVIEALLAQTERSLTWSDIALEILKLPNES DLTSVPEEDGPSSLAYSQFAPFDETSARIAEFIAKNRRKIPTFAQWWQEQDRTSRSDLVA ADNSIAGEEEQELLVHLPDAELEALEGLALPSGRVAYSRLTLSGLTRVMRDDGVDVHNAR KTCFGVDDNWRPPLPALHEATGHPVVDRNLAILRKFLSSATMRWGPPQSIVVELARGASE SRERQAEEEAARRAHRKANDRIRAELRASGLSDPSPADLVRARLLELYDCHCMYCGAPIS WENSELDHIVPRTDGGSNRHENLAITCGACNKEKGRRPFASWAETSNRVQLRDVIDRVQK LKYSGNMYWTRDEFSRYKKSVVARLKRRTSDPEVIQSIESTGYAAVALRDRLLSYGEKNG VAQVAVFRGGVTAEARRWLDISIERLFSRVAIFAQSTSTKRLDRRHHAVDAVVLTTLTPG VAKTLADARSRRVSAEFWRRPSDVNRHSTEEPQSPAYRQWKESCSGLGDLLISTAARDSI AVAAPLRLRPTGALHEETLRAFSEHTVGAAWKGAELRRIVEPEVYAAFLALTDPGGRFLK VSPSEDVLPADENRHIVLSDRVLGPRDRVKLFPDDRGSIRVRGGAAYIASFHHARVFRWG SSHSPSFALLRVSLADLAVAGLLRDGVDVFTAELPPWTPAWRYASIALVKAVESGDAKQV GWLVPGDELDFGPEGVTTAAGDLSMFLKYFPERHWVVTGFEDDKRINLKPAFLSAEQAEV LRTERSDRPDTLTEAGEILAQFFPRCWRATVAKVLCHPGLTVIRRTALGQPRWRRGHLPY SWRPWSADPWSGGTP |
| CjeCas9胺基酸序列 | 307 | MARILAFDIGISSIGWAFSENDELKDCGVRIFTKAENPKTGESLALPRRLARSARKRLAR RKARLNHLKHLIANEFKLNYEDYQSFDESLAKAYKGSLISPYELRFRALNELLSKQDFAR VILHIAKRRGYDDIKNSDDKEKGAILKAIKQNEEKLANYQSVGEYLYKEYFQKFKENSKE FTNVRNKKESYERCIAQSFLKDELKLIFKKQREFGFSFSKKFEEEVLSVAFYKRALKDFS HLVGNCSFFTDEKRAPKNSPLAFMFVALTRIINLLNNLKNTEGILYTKDDLNALLNEVLK NGTLTYKQTKKLLGLSDDYEFKGEKGTYFIEFKKYKEFIKALGDHSLSQDDLNEIAKDIT LIKDEIKLKKALAKYDLNQNQIDSLSKLEFKDHLNISFKALKLITPLMLEGKKYDEACNE LNLKVAINEDKKDFLPAFNETYYKDEVTNPVVLRAIKEYRKVLNALLKKYGKVHKINIEL AREVGKNYSQRAKIEKEQNENYKAKKDAELECEKLGLKINSKNILKLRLFKEQKEFCAYS GEKIKISDLQDEKMLEIDHIYPYSRSFDDSYMNKVLVFTKQNQEKLNQTPFEAFGNDSAK WQKIEVLAKNLPTKKQKRILDKNYKDKEQKDFKDRNLNDTRYIARLVLNYTKDYLDFLPL SDDENTKLNDTQKGSKVHVEAKSGMLTSALRHTWGFSAKDRNNHLHHAIDAVIIAYANNS IVKAFSDFKKEQESNSAELYAKKISELDYKNKRKFFEPFSGFRQKVLDKIDEIFVSKPER KKPSGALHEETFRKEEEFYQSYGGKEGVLKALELGKIRKVNGKIVKNGDMFRVDIFKHKK TNKFYAVPIYTMDFALKVLPNKAVARSKKGEIKDWILMDENYEFCFSLYKDSLILIQTKD MQEPEFVYYNAFTSSTVSLIVSKHDNKFETLSKNQKILFKNANEKEVIAKSIGIQNLKVF EKYIVSALGEVTKAEFRQREDFKK |
| FnoCas9胺基酸序列 | 308 | MNFKILPIAIDLGVKNTGVFSAFYQKGTSLERLDNKNGKVYELSKDSYTLLMNNRTARRH QRRGIDRKQLVKRLFKLIWTEQLNLEWDKDTQQAISFLFNRRGFSFITDGYSPEYLNIVP EQVKAILMDIFDDYNGEDDLDSYLKLATEQESKISEIYNKLMQKILEFKLMKLCTDIKDD KVSTKTLKEITSYEFELLADYLANYSESLKTQKFSYTDKQGNLKELSYYHHDKYNIQEFL KRHATINDRILDTLLTDDLDIWNFNFEKFDFDKNEEKLQNQEDKDHIQAHLHHFVFAVNK IKSEMASGGRHRSQYFQEITNVLDENNHQEGYLKNFCENLHNKKYSNLSVKNLVNLIGNL SNLELKPLRKYFNDKIHAKADHWDEQKFTETYCHWILGEWRVGVKDQDKKDGAKYSYKDL CNELKQKVTKAGLVDFLLELDPCRTIPPYLDNNNRKPPKCQSLILNPKFLDNQYPNWQQY LQELKKLQSIQNYLDSFETDLKVLKSSKDQPYFVEYKSSNQQIASGQRDYKDLDARILQF IFDRVKASDELLLNEIYFQAKKLKQKASSELEKLESSKKLDEVIANSQLSQILKSQHTNG IFEQGTFLHLVCKYYKQRQRARDSRLYIMPEYRYDKKLHKYNNTGRFDDDNQLLTYCNHK PRQKRYQLLNDLAGVLQVSPNFLKDKIGSDDDLFISKWLVEHIRGFKKACEDSLKIQKDN RGLLNHKINIARNTKGKCEKEIFNLICKIEGSEDKKGNYKHGLAYELGVLLFGEPNEASK PEFDRKIKKFNSIYSFAQIQQIAFAERKGNANTCAVCSADNAHRMQQIKITEPVEDNKDK IILSAKAQRLPAIPTRIVDGAVKKMATILAKNIVDDNWQNIKQVLSAKHQLHIPIITESN AFEFEPALADVKGKSLKDRRKKALERISPENIFKDKNNRIKEFAKGISAYSGANLTDGDF DGAKEELDHIIPRSHKKYGTLNDEANLICVTRGDNKNKGNRIFCLRDLADNYKLKQFETT DDLEIEKKIADTIWDANKKDFKFGNYRSFINLTPQEQKAFRHALFLADENPIKQAVIRAI NNRNRTFVNGTQRYFAEVLANNIYLRAKKENLNTDKISFDYFGIPTIGNGRGIAEIRQLY EKVDSDIQAYAKGDKPQASYSHLIDAMLAFCIAADEHRNDGSIGLEIDKNYSLYPLDKNT GEVFTKDIFSQIKITDNEFSDKKLVRKKAIEGFNTHRQMTRDGIYAENYLPILIHKELNE VRKGYTWKNSEEIKIFKGKKYDIQQLNNLVYCLKFVDKPISIDIQISTLEELRNILTTNN IAATAEYYYINLKTQKLHEYYIENYNTALGYKKYSKEMEFLRSLAYRSERVKIKSIDDVK QVLDKDSNFIIGKITLPFKKEWQRLYREWQNTTIKDDYEFLKSFFNVKSITKLHKKVRKD FSLPISTNEGKFLVKRKTWDNNFIYQILNDSDSRVDGTKPFIPAFDISKNEIVEAIIDSF TSKNIFWLPKNIELQKVDNKNIFAIDTSKWFEVETPSDLRDIGVATIQYKIDNNSRPKVR VKLDYVIDDDSKINYFTNHSLLKSRYPDKVLEILKQSTTIEFESSGFNKTIKEMLGMTLA GIYNETSNN |
| AsCpf1胺基酸序列 | 309 | MTQFEGFTNLYQVSKTLRFELIPQGKTLKHIQEQGFIEEDKARNDHYKELKPIIDRIYKT YADQCLQLVQLDWENLSAAIDSYRKEKTEETRNALIEEQATYRNAIHDYFIGRTDNLTDA INKRHAEIYKGLFKAELFNGKVLKQLGTVTTTEHENALLRSFDKFTTYFSGFYENRKNVF SAEDISTAIPHRIVQDNFPKFKENCHIFTRLITAVPSLREHFENVKKAIGIFVSTSIEEV FSFPFYNQLLTQTQIDLYNQLLGGISREAGTEKIKGLNEVLNLAIQKNDETAHIIASLPH RFIPLFKQILSDRNTLSFILEEFKSDEEVIQSFCKYKTLLRNENVLETAEALFNELNSID LTHIFISHKKLETISSALCDHWDTLRNALYERRISELTGKITKSAKEKVQRSLKHEDINL QEIISAAGKELSEAFKQKTSEILSHAHAALDQPLPTTLKKQEEKEILKSQLDSLLGLYHL LDWFAVDESNEVDPEFSARLTGIKLEMEPSLSFYNKARNYATKKPYSVEKFKLNFQMPTL ASGWDVNKEKNNGAILFVKNGLYYLGIMPKQKGRYKALSFEPTEKTSEGFDKMYYDYFPD AAKMIPKCSTQLKAVTAHFQTHTTPILLSNNFIEPLEITKEIYDLNNPEKEPKKFQTAYA KKTGDQKGYREALCKWIDFTRDFLSKYTKTTSIDLSSLRPSSQYKDLGEYYAELNPLLYH ISFQRIAEKEIMDAVETGKLYLFQIYNKDFAKGHHGKPNLHTLYWTGLFSPENLAKTSIK LNGQAELFYRPKSRMKRMAHRLGEKMLNKKLKDQKTPIPDTLYQELYDYVNHRLSHDLSD EARALLPNVITKEVSHEIIKDRRFTSDKFFFHVPITLNYQAANSPSKFNQRVNAYLKEHP ETPIIGIDRGERNLIYITVIDSTGKILEQRSLNTIQQFDYQKKLDNREKERVAARQAWSV VGTIKDLKQGYLSQVIHEIVDLMIHYQAVVVLENLNFGFKSKRTGIAEKAVYQQFEKMLI DKLNCLVLKDYPAEKVGGVLNPYQLTDQFTSFAKMGTQSGFLFYVPAPYTSKIDPLTGFV DPFVWKTIKNHESRKHFLEGFDFLHYDVKTGDFILHFKMNRNLSFQRGLPGFMPAWDIVF EKNETQFDAKGTPFIAGKRIVPVIENHRFTGRYRDLYPANELIALLEEKGIVFRDGSNIL PKLLENDDSHAIDTMVALIRSVLQMRNSNAATGEDYINSPVRDLNGVCFDSRFQNPEWPM DADANGAYHIALKGQLLLNHLKESKDLKLQNGISNQDWLAYIQELRN |
| EsCas13d胺基酸序列 | 310 | MAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAM ARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDR KLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAEL ALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLM TQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDT ERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRAL EKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKF VQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRA LSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREY FPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSF NNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDED GFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAEND RHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFA QEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSG AHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYG GNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKV DKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVE FAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPP VR |
| RruCas9胺基酸序列 | 311 | MRPIEPWILGLDIGTDSLGWAVFSCEEKGPPTAKELLGGGVRLFDSGRDAKDHTSRQAER GAFRRARRQTRTWPWRRDRLIALFQAAGLTPPAAETRQIALALRREAVSRPLAPDALWAA LLHLAHHRGFRSNRIDKRERAAAKALAKAKPAKATAKATAPAKEADDEAGFWEGAEAALR QRMAASGAPTVGALLADDLDRGQPVRMRYNQSDRDGVVAPTRALIAEELAEIVARQSSAY PGLDWPAVTRLVLDQRPLRSKGAGPCAFLPGEDRALRALPTVQDFIIRQTLANLRLPSTS ADEPRPLTDEEHAKALALLSTARFVEWPALRRALGLKRGVKFTAETERNGAKQAARGTAG NLTEAILAPLIPGWSGWDLDRKDRVFSDLWAARQDRSALLALIGDPRGPTRVTEDETAEA VADAIQIVLPTGRASLSAKAARAIAQAMAPGIGYDEAVTLALGLHHSHRPRQERLARLPY YAAALPDVGLDGDPVGPPPAEDDGAAAEAYYGRIGNISVHIALNETRKIVNALLHRHGPI LRLVMVETTRELKAGADERKRMIAEQAERERENAEIDVELRKSDRWMANARERRQRVRLA RRQNNLCPYTSTPIGHADLLGDAYDIDHVIPLARGGRDSLDNMVLCQSDANKTKGDKTPW EAFHDKPGWIAQRDDFLARLDPQTAKALAWRFADDAGERVARKSAEDEDQGFLPRQLTDT GYIARVALRYLSLVTNEPNAVVATNGRLTGLLRLAWDITPGPAPRDLLPTPRDALRDDTA ARRFLDGLTPPPLAKAVEGAVQARLAALGRSRVADAGLADALGLTLASLGGGGKNRADHR HHFIDAAMIAVTTRGLINQINQASGAGRILDLRKWPRTNFEPPYPTFRAEVMKQWDHIHP SIRPAHRDGGSLHAATVFGVRNRPDARVLVQRKPVEKLFLDANAKPLPADKIAEIIDGFA SPRMAKRFKALLARYQAAHPEVPPALAALAVARDPAFGPRGMTANTVIAGRSDGDGEDAG LITPFRANPKAAVRTMGNAVYEVWEIQVKGRPRWTHRVLTRFDRTQPAPPPPPENARLVM RLRRGDLVYWPLESGDRLFLVKKMAVDGRLALWPARLATGKATALYAQLSCPNINLNGDQ GYCVQSAEGIRKEKIRTTSCTALGRLRLSKKAT |
| RpaCas9胺基酸序列 | 312 | MLERHPQRYRLGLDLGSNSLGWFVTNLQQRGDRFEPVGLGPGGVRIFPDGRDPQSKASNA VDRRMARGARKRRDRFVQRRSQLMDALVRHGLMPEEAAARKALAGLDPYQLRARALVDRL PAHHVGRALFHLNQRRGFLSNRKTDNKKNSEDGAIKQAASRLRDSMASQGAETLGEFFAG RRHSDTYAERQTAIRAELQRIGKDHLTGNARKKAWAKVRKRLFGDDVLDPAMAPEGVRAR AIITGTKASYDFYPTRDLLLQEFHAIWRAQAPHHSTMTESACREIERIIFYQRPLKDPIV GKCSLDPATRPFKEDPEGYRAPWAHPLAQRFRILSEARNLEIRETGRGSRKLTKAQSDVV ALALLGSKEVKFDKLRTLLKLPAESKFNLESDRRAALDGDATAARLSDKNGFGKAWRGFP LERQVAIVERLMTVEVEAELVDWLEQECGLGPEAAARVANTSLPEGHCRLGLRAIKKIVP VMQNEVGDDGVSGAGYYEAAKRIGYDHAKLPTGGDLDYLPYYGKWLADAVVGSGDARDGK ERQFGQFPNPTVHIGLGQLRRLVNELIRAYGPPTEISIEFTRALRLSEDQKAQVQREQRK NQDRNRARAAELEQLGFPANPRNLLKMRLWEELNLRDPLDRKCVYTGEQISIERLLSEEV DIDHILPVAMTLDDSAANKIVCMRYANRHKRKQTPFEAFGSSPLVQGRRYAWDDIATRAA ALPRNKRWRFDADAREQFDKRGGFLARQLNETGWLARLAKEYLGAVTDPNRIWVVPGRLT GLLRGKWGLNALLPDHNYAGVQDKAEAFLASTDDMEFSGVKNRADHRHHAIDGLVAALTD RSLLWKMANAYDDEREKFVVELPWPTMRDDLKAALDKMVVSHKPDHGVQGKLHEDSAYGL LDRPEPVEDDDREPANLVYRKAVETLSENEIGRIRDRRLRDLVRDHVDAAKRNGVALADA LRQLTEPSDNPHFRHGLRHVRLLKKEKTDYLVPVVDRATGRPYKAYSAGENFCVEVFETA DGKWSGEAVRRFDANRSNCGPKTPHVPRWRTESAGARLVMRIHKGDLIRLEHEGRTRIMV VHRLDAAAGRFKLAAHNETGNLDKRHATDNDIDPFRWLMASYGTLKKMAAVPVRVDELGR VWRIDPR |
| AnaCas9胺基酸序列 | 313 | MWYASLMSAHHLRVGIDVGTHSVGLATLRVDDHGTPIELLSALSHIHDSGVGKEGKKDHD TRKKLSGIARRARRLLHHRRTQLQQLDEVLRDLGFPIPTPGEFLDLNEQTDPYRVWRVRA RLVEEKLPEELRGPAISMAVRHIARHRGWRNPYSKVESLLSPAEESPFMKALRERILATT GEVLDDGITPGQAMAQVALTHNISMRGPEGILGKLHQSDNANEIRKICARQGVSPDVCKQ LLRAVFKADSPRGSAVSRVAPDPLPGQGSFRRAPKCDPEFQRFRIISIVANLRISETKGE NRPLTADERRHVVTFLTEDSQADLTWVDVAEKLGVHRRDLRGTAVHTDDGERSAARPPID ATDRIMRQTKISSLKTWWEEADSEQRGAMIRYLYEDPTDSECAEIIAELPEEDQAKLDSL HLPAGRAAYSRESLTALSDHMLATTDDLHEARKRLFGVDDSWAPPAEAINAPVGNPSVDR TLKIVGRYLSAVESMWGTPEVIHVEHVRDGFTSERMADERDKANRRRYNDNQEAMKKIQR DYGKEGYISRGDIVRLDALELQGCACLYCGTTIGYHTCQLDHIVPQAGPGSNNRRGNLVA VCERCNRSKSNTPFAVWAQKCGIPHVGVKEAIGRVRGWRKQTPNTSSEDLTRLKKEVIAR LRRTQEDPEIDERSMESVAWMANELHHRIAAAYPETTVMVYRGSITAAARKAAGIDSRIN LIGEKGRKDRIDRRHHAVDASVVALMEASVAKTLAERSSLRGEQRLTGKEQTWKQYTGST VGAREHFEMWRGHMLHLTELFNERLAEDKVYVTQNIRLRLSDGNAHTVNPSKLVSHRLGD GLTVQQIDRACTPALWCALTREKDFDEKNGLPAREDRAIRVHGHEIKSSDYIQVFSKRKK TDSDRDETPFGAIAVRGGFVEIGPSIHHARIYRVEGKKPVYAMLRVFTHDLLSQRHGDLF SAVIPPQSISMRCAEPKLRKAITTGNATYLGWVVVGDELEINVDSFTKYAIGRFLEDFPN TTRWRICGYDTNSKLTLKPIVLAAEGLENPSSAVNEIVELKGWRVAINVLTKVHPTVVRR DALGRPRYSSRSNLPTSWTIE |
| 316-320 | 未使用 | |
| 具有ORF之SpyCas9 mRNA序列 | 321 | AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCUAG |
| 具有ORF之SpyCas9 mRNA序列 | 322 | AUGGACAAGAAGUACUCCAUCGGCCUGGACAUCGGCACCAACUCCGUGGGCUGGGCCGUGAUCACCGACGAGUACAAGGUGCCCUCCAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGCAACACCGACCGGCACUCCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGCGCCCUGCUGUUCGACUCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCUGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGUACACCCGGCGGAAGAACCGGAUCUGCUACCUGCAGGAGAUCUUCUCCAACGAGAUGGCCAAGGUGGACGACUCCUUCUUCCACCGGCUGGAGGAGUCCUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAGGUGGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUGCGGAAGAAGCUGGUGGACUCCACCGACAAGGCCGACCUGCGGCUGAUCUACCUGGCCCUGGCCCACAUGAUCAAGUUCCGGGGCCACUUCCUGAUCGAGGGCGACCUGAACCCCGACAACUCCGACGUGGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUGCAGACCUACAACCAGCUGUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCUCCGGCGUGGACGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCCAAGUCCCGGCGGCUGGAGAACCUGAUCGCCCAGCUGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUGUUCGGCAACCUGAUCGCCCUGUCCCUGGGCCUGACCCCCAACUUCAAGUCCAACUUCGACCUGGCCGAGGACGCCAAGCUGCAGCUGUCCAAGGACACCUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUGGCCGCCAAGAACCUGUCCGACGCCAUCCUGCUGUCCGACAUCCUGCGGGUGAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUGUCCGCCUCCAUGAUCAAGCGGUACGACGAGCACCACCAGGACCUGACCCUGCUGAAGGCCCUGGUGCGGCAGCAGCUGCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCUCCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUGCUGGUGAAGCUGAACCGGGAGGACCUGCUGCGGAAGCAGCGGACCUUCGACAACGGCUCCAUCCCCCACCAGAUCCACCUGGGCGAGCUGCACGCCAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUGAAGGACAACCGGGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUGACCUUCCGGAUCCCCUACUACGUGGGCCCCCUGGCCCGGGGCAACUCCCGGUUCGCCUGGAUGACCCGGAAGUCCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUGGUGGACAAGGGCGCCUCCGCCCAGUCCUUCAUCGAGCGGAUGACCAACUUCGACAAGAACCUGCCCAACGAGAAGGUGCUGCCCAAGCACUCCCUGCUGUACGAGUACUUCACCGUGUACAACGAGCUGACCAAGGUGAAGUACGUGACCGAGGGCAUGCGGAAGCCCGCCUUCCUGUCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUGGACCUGCUGUUCAAGACCAACCGGAAGGUGACCGUGAAGCAGCUGAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACUCCGUGGAGAUCUCCGGCGUGGAGGACCGGUUCAACGCCUCCCUGGGCACCUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAGGACAUCGUGCUGACCCUGACCCUGUUCGAGGACCGGGAGAUGAUCGAGGAGCGGCUGAAGACCUACGCCCACCUGUUCGACGACAAGGUGAUGAAGCAGCUGAAGCGGCGGCGGUACACCGGCUGGGGCCGGCUGUCCCGGAAGCUGAUCAACGGCAUCCGGGACAAGCAGUCCGGCAAGACCAUCCUGGACUUCCUGAAGUCCGACGGCUUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACUCCCUGACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUGUCCGGCCAGGGCGACUCCCUGCACGAGCACAUCGCCAACCUGGCCGGCUCCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUGCAGACCGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACUCCCGGGAGCGGAUGAAGCGGAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUGGGCUCCCAGAUCCUGAAGGAGCACCCCGUGGAGAACACCCAGCUGCAGAACGAGAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGCCGGGACAUGUACGUGGACCAGGAGCUGGACAUCAACCGGCUGUCCGACUACGACGUGGACCACAUCGUGCCCCAGUCCUUCCUGAAGGACGACUCCAUCGACAACAAGGUGCUGACCCGGUCCGACAAGAACCGGGGCAAGUCCGACAACGUGCCCUCCGAGGAGGUGGUGAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGGCAGCUGCUGAACGCCAAGCUGAUCACCCAGCGGAAGUUCGACAACCUGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCUGUCCGAGCUGGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGGCAGCUGGUGGAGACCCGGCAGAUCACCAAGCACGUGGCCCAGAUCCUGGACUCCCGGAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUGAUCCGGGAGGUGAAGGUGAUCACCCUGAAGUCCAAGCUGGUGUCCGACUUCCGGAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUGCGGGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUGAACGCCGUGGUGGGCACCGCCCUGAUCAAGAAGUACCCCAAGCUGGAGUCCGAGUUCGUGUACGGCGACUACAAGGUGUACGACGUGCGGAAGAUGAUCGCCAAGUCCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACUCCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUGGCCAACGGCGAGAUCCGGAAGCGGCCCCUGAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUGUGGGACAAGGGCCGGGACUUCGCCACCGUGCGGAAGGUGCUGUCCAUGCCCCAGGUGAACAUCGUGAAGAAGACCGAGGUGCAGACCGGCGGCUUCUCCAAGGAGUCCAUCCUGCCCAAGCGGAACUCCGACAAGCUGAUCGCCCGGAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACUCCCCCACCGUGGCCUACUCCGUGCUGGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGCAAGUCCAAGAAGCUGAAGUCCGUGAAGGAGCUGCUGGGCAUCACCAUCAUGGAGCGGUCCUCCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUGGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUGAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCCAAGUACUCCCUGUUCGAGCUGGAGAACGGCCGGAAGCGGAUGCUGGCCUCCGCCGGCGAGCUGCAGAAGGGCAACGAGCUGGCCCUGCCCUCCAAGUACGUGAACUUCCUGUACCUGGCCUCCCACUACGAGAAGCUGAAGGGCUCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCUCCGAGUUCUCCAAGCGGGUGAUCCUGGCCGACGCCAACCUGGACAAGGUGCUGUCCGCCUACAACAAGCACCGGGACAAGCCCAUCCGGGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUGUUCACCCUGACCAACCUGGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGGAAGCGGUACACCUCCACCAAGGAGGUGCUGGACGCCACCCUGAUCCACCAGUCCAUCACCGGCCUGUACGAGACCCGGAUCGACCUGUCCCAGCUGGGCGGCGACGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGUGA |
| 具有Hibit標籤的具有ORF之SpyCas9 mRNA序列 | 323 | AUGGACAAGAAGUACUCCAUCGGCCUGGACAUCGGCACCAACUCCGUGGGCUGGGCCGUGAUCACCGACGAGUACAAGGUGCCCUCCAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGCAACACCGACCGGCACUCCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGCGCCCUGCUGUUCGACUCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCUGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGUACACCCGGCGGAAGAACCGGAUCUGCUACCUGCAGGAGAUCUUCUCCAACGAGAUGGCCAAGGUGGACGACUCCUUCUUCCACCGGCUGGAGGAGUCCUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAGGUGGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUGCGGAAGAAGCUGGUGGACUCCACCGACAAGGCCGACCUGCGGCUGAUCUACCUGGCCCUGGCCCACAUGAUCAAGUUCCGGGGCCACUUCCUGAUCGAGGGCGACCUGAACCCCGACAACUCCGACGUGGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUGCAGACCUACAACCAGCUGUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCUCCGGCGUGGACGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCCAAGUCCCGGCGGCUGGAGAACCUGAUCGCCCAGCUGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUGUUCGGCAACCUGAUCGCCCUGUCCCUGGGCCUGACCCCCAACUUCAAGUCCAACUUCGACCUGGCCGAGGACGCCAAGCUGCAGCUGUCCAAGGACACCUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUGGCCGCCAAGAACCUGUCCGACGCCAUCCUGCUGUCCGACAUCCUGCGGGUGAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUGUCCGCCUCCAUGAUCAAGCGGUACGACGAGCACCACCAGGACCUGACCCUGCUGAAGGCCCUGGUGCGGCAGCAGCUGCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCUCCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUGCUGGUGAAGCUGAACCGGGAGGACCUGCUGCGGAAGCAGCGGACCUUCGACAACGGCUCCAUCCCCCACCAGAUCCACCUGGGCGAGCUGCACGCCAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUGAAGGACAACCGGGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUGACCUUCCGGAUCCCCUACUACGUGGGCCCCCUGGCCCGGGGCAACUCCCGGUUCGCCUGGAUGACCCGGAAGUCCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUGGUGGACAAGGGCGCCUCCGCCCAGUCCUUCAUCGAGCGGAUGACCAACUUCGACAAGAACCUGCCCAACGAGAAGGUGCUGCCCAAGCACUCCCUGCUGUACGAGUACUUCACCGUGUACAACGAGCUGACCAAGGUGAAGUACGUGACCGAGGGCAUGCGGAAGCCCGCCUUCCUGUCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUGGACCUGCUGUUCAAGACCAACCGGAAGGUGACCGUGAAGCAGCUGAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACUCCGUGGAGAUCUCCGGCGUGGAGGACCGGUUCAACGCCUCCCUGGGCACCUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAGGACAUCGUGCUGACCCUGACCCUGUUCGAGGACCGGGAGAUGAUCGAGGAGCGGCUGAAGACCUACGCCCACCUGUUCGACGACAAGGUGAUGAAGCAGCUGAAGCGGCGGCGGUACACCGGCUGGGGCCGGCUGUCCCGGAAGCUGAUCAACGGCAUCCGGGACAAGCAGUCCGGCAAGACCAUCCUGGACUUCCUGAAGUCCGACGGCUUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACUCCCUGACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUGUCCGGCCAGGGCGACUCCCUGCACGAGCACAUCGCCAACCUGGCCGGCUCCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUGCAGACCGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACUCCCGGGAGCGGAUGAAGCGGAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUGGGCUCCCAGAUCCUGAAGGAGCACCCCGUGGAGAACACCCAGCUGCAGAACGAGAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGCCGGGACAUGUACGUGGACCAGGAGCUGGACAUCAACCGGCUGUCCGACUACGACGUGGACCACAUCGUGCCCCAGUCCUUCCUGAAGGACGACUCCAUCGACAACAAGGUGCUGACCCGGUCCGACAAGAACCGGGGCAAGUCCGACAACGUGCCCUCCGAGGAGGUGGUGAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGGCAGCUGCUGAACGCCAAGCUGAUCACCCAGCGGAAGUUCGACAACCUGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCUGUCCGAGCUGGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGGCAGCUGGUGGAGACCCGGCAGAUCACCAAGCACGUGGCCCAGAUCCUGGACUCCCGGAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUGAUCCGGGAGGUGAAGGUGAUCACCCUGAAGUCCAAGCUGGUGUCCGACUUCCGGAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUGCGGGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUGAACGCCGUGGUGGGCACCGCCCUGAUCAAGAAGUACCCCAAGCUGGAGUCCGAGUUCGUGUACGGCGACUACAAGGUGUACGACGUGCGGAAGAUGAUCGCCAAGUCCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACUCCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUGGCCAACGGCGAGAUCCGGAAGCGGCCCCUGAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUGUGGGACAAGGGCCGGGACUUCGCCACCGUGCGGAAGGUGCUGUCCAUGCCCCAGGUGAACAUCGUGAAGAAGACCGAGGUGCAGACCGGCGGCUUCUCCAAGGAGUCCAUCCUGCCCAAGCGGAACUCCGACAAGCUGAUCGCCCGGAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACUCCCCCACCGUGGCCUACUCCGUGCUGGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGCAAGUCCAAGAAGCUGAAGUCCGUGAAGGAGCUGCUGGGCAUCACCAUCAUGGAGCGGUCCUCCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUGGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUGAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCCAAGUACUCCCUGUUCGAGCUGGAGAACGGCCGGAAGCGGAUGCUGGCCUCCGCCGGCGAGCUGCAGAAGGGCAACGAGCUGGCCCUGCCCUCCAAGUACGUGAACUUCCUGUACCUGGCCUCCCACUACGAGAAGCUGAAGGGCUCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCUCCGAGUUCUCCAAGCGGGUGAUCCUGGCCGACGCCAACCUGGACAAGGUGCUGUCCGCCUACAACAAGCACCGGGACAAGCCCAUCCGGGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUGUUCACCCUGACCAACCUGGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGGAAGCGGUACACCUCCACCAAGGAGGUGCUGGACGCCACCCUGAUCCACCAGUCCAUCACCGGCCUGUACGAGACCCGGAUCGACCUGUCCCAGCUGGGCGGCGACGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGUGUCCGGCUGGCGGCUGUUCAAGAAGAUCUCCUGA |
| 由mRNA C編碼之Nme2Cas9之胺基酸序列 | 350 | MTGAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVRSGKRTADGSEFESPKKKRKVE* |
| 由mRNA G編碼之UGI之胺基酸序列 | 351 | MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSKRTADGSEFESPKKKRKVE** |
| 由mRNA I編碼之Nme2Cas9之胺基酸序列 | 352 | MVPKKKRKVAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVRYPYDVPDYAAAPAAKKKKLD* |
| 由mRNA J編碼之Nme2Cas9之胺基酸序列 | 353 | MAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVR |
| 由mRNA M編碼之Nme2Cas9之胺基酸序列 | 354 | MDGSGGGSPKKKRKVGGSGGGAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVRSESATPESVSGWRLFKKIS* |
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| 由mRNA P編碼之Nme2Cas9之胺基酸序列 | 357 | MDGSGGGSPKKKRKVEDKRPAATKKAGQAKKKKGGSGGGAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVRSESATPESVSGWRLFKKIS |
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| 由mRNA S編碼之Nme2Cas9鹼基編輯器之胺基酸序列 | 359 | MDGSGGGSPKKKRKVEDKRPAATKKAGQAKKKKGGSGGGEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGNSGSETPGTSESATPESAAFKPNPINYILGLAIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVR* |
| 由mRNA E編碼之BC22n SpyCas9鹼基編輯器之胺基酸序列 | 360 | MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGNSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV* |
| 編碼Nme2Cas9之mRNA C | 361 | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGACCGGUGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGCUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUCCGGAAAGCGGACCGCCGACGGCUCCGAGUUCGAGUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAA |
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| 編碼Nme2Cas9之mRNA N | 366 | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUCCGGAAAGCGGACCGCCGACGGCUCCGGAGGAGGAAGCCCCGCCGCCAAGAAGAAGAAGCUGGACUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG |
| 編碼Nme2Cas9之mRNA O | 367 | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG |
| 編碼Nme2Cas9之mRNA P | 368 | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGUGUCCGGCUGGCGGCUGUUCAAGAAGAUCUCCUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG |
| 編碼Nme2Cas9之mRNA Q | 369 | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG |
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| 編碼BC22n SpyCas9鹼基編輯器之mRNA E | 371 | 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提供以下實例以說明某些所揭示之實施例且不應視為以任何方式限制本發明之範疇。
實例1. 材料及方法 核酸酶mRNA之活體外轉錄(「IVT」)
使用常規方法藉由活體外轉錄來產生含有N1-甲基假-U之經封端且多腺苷酸化之mRNA。通常，根據製造商之方案用XbaI使含有T7啟動子、用於轉譯之序列及多腺苷酸化區之質體DNA線性化。藉由加熱使XbaI不活化。由酶及緩衝鹽純化該線性化質體。用於產生經修飾mRNA之IVT反應係藉由在37℃：50 ng/µL線性化質體；2至5 mM各GTP、ATP、CTP及N1-甲基假-UTP (Trilink)；10至25 mM ARCA (Trilink)；5 U/µL T7 RNA聚合酶；1 U/µL鼠類RNA酶抑制劑(NEB)；0.004 U/µL無機大腸桿菌焦磷酸酶(NEB)；及1×反應緩衝液培育來進行。添加TURBO DNase (ThermoFisher)至0.01 U/µL之最終濃度，且在37℃培育反應物以移除DNA模板。
根據製造商之方案，使用MegaClear Transcription Clean-up套組(ThermoFisher)或RNeasy Maxi套組(Qiagen)來純化mRNA。替代地，經由沈澱方案來純化mRNA，在一些情況下，隨後進行基於HPLC之純化。簡言之，在DNA酶消化之後，使用LiCl沈澱、乙酸銨沈澱及乙酸鈉沈澱來純化mRNA。對於經HPLC純化之mRNA，在LiCl沈澱及復原之後，藉由RP-IP HPLC純化mRNA (參見例如Kariko等人, Nucleic Acids Research, 2011, 第39卷, 第21期el42)。合併所選彙集之溶離份且藉由如上文所描述之乙酸鈉/乙醇沈澱來去鹽。在另一替代方法中，mRNA用LiCl沈澱方法純化，隨後藉由切向流過濾進一步純化。藉由量測在260 nm之吸光度(Nanodrop)測定RNA濃度，且藉由毛細管電泳法用Bioanalyzer (Agilent)來分析轉錄物。
自編碼根據SEQ ID No: 321-323 (參見表5中之序列)之開放閱讀框架之質體DNA產生化膿鏈球菌(「Spy」) Cas9 mRNA。當此段中引用的序列在下文中針對RNA提及時，應理解T應替換為U (其可為如上文所描述之經修飾核苷)。用於實例中之信使RNA包括5'帽及3'多腺苷酸化序列，例如多達100個核苷酸。由商業供應商或使用標準活體外合成技術用經修飾之核苷酸化學合成引導RNA。
細胞製備
設計靶向小鼠、大鼠、人類及石蟹獼猴(獼猴)甲狀腺素轉運蛋白TTR基因之短sgRNA，且將其用於如下文所描述之脂質體轉染，分別轉染至原代小鼠肝細胞(PMH)、原代大鼠肝細胞(PRH)、原代人類肝細胞(PHH)及原代石蟹獼猴肝細胞(PCH)中。將PMH、PRH、PHH或PCH解凍，且再懸浮於含有接種補充劑之肝細胞解凍培養基(William's E培養基(Gibco, 目錄號A12176-01, 批號2039733))、含有地塞米松(dexamethasone)+混合補充劑之肝細胞解凍培養基(Gibco, 目錄號A15563, 批號2019842)及含有接種補充劑+FBS內含物之肝細胞解凍培養基(Gibco, 目錄號A13450, 批號1970698)中，接著離心。丟棄上清液且將集結之細胞再懸浮於肝細胞接種培養基加補充劑包(Invitrogen, 目錄號A1217601及Gibco, 目錄號CM3000)中。對細胞進行計數，且將其接種於經Bio-coat膠原蛋白I塗佈之96孔盤(ThermoFisher, 目錄號877272)中。允許所接種之細胞在組織培養培育箱中、在37℃及5% CO
2氛圍下沈降且黏附4至6小時。在培育之後，檢查細胞之單層形成，且用肝細胞維持培養基(Invitrogen, 目錄號A1217601及Gibco, 目錄號CM4000)洗滌一次。
製備含有sgRNA及Cas9 mRNA之LNP調配物
一般而言，以各種莫耳比將脂質奈米顆粒組分溶解於100%乙醇中。將RNA負荷(例如Cas9 mRNA及sgRNA)溶解於25 mM檸檬酸鹽、100 mM NaCl (pH 5.0)中，產生大致0.45 mg/mL之RNA負荷濃度。所使用之LNP含有之可離子化脂質(十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，亦稱為(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯) (本文中亦稱為脂質A)、膽固醇、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)及1,2-二肉豆蔻醯基-rac-甘油-3-甲基聚氧乙二醇2000 (PEG2k-DMG)呈50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比。以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)之莫耳比及按重量計1:2之gRNA與mRNA之比率調配LNP。所使用之LNP包含單一RNA物種，諸如Cas9 mRNA或sgRNA。LNP以類似方式由Cas9 mRNA及引導RNA之混合物製備。
使用交叉流技術，利用含脂質之乙醇與兩個體積之RNA溶液及一個體積之水的衝擊射流混合來製備LNP。經由混合十字管使於乙醇中之脂質與兩個體積之RNA溶液混合。經由線內T形件將第四水流與十字管之輸出流混合(參見WO2016010840圖2)。將LNP在室溫下保持1小時且進一步用水稀釋(大約1:1 v/v)。使用切向流過濾在平板濾筒(Sartorius，100kD MWCO)上濃縮經稀釋之LNP，且隨後使用PD-10去鹽管柱(GE)將其緩衝液交換至50 mM Tris、45 mM NaCl、5% (w/v)蔗糖，pH 7.5 (TSS)中。接著使用0.2 μm無菌過濾器過濾所得混合物。最終LNP經表徵以確定囊封效率、多分散性指數及平均粒度。將最終LNP儲存於4℃或-80℃下直至進一步使用。
sgRNA及Cas9 mRNA脂質體轉染
使用預混合脂質調配物進行Cas9 mRNA及gRNA之脂質體轉染。脂質體轉染試劑所含有之可離子化脂質(十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，亦稱為(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯)、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG呈50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比。將此混合物在100%乙醇中復原，接著以約6.0之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)之莫耳比與RNA負荷(例如Cas9 mRNA及gRNA)混合。由商業供應商或使用標準活體外合成技術用經修飾之核苷酸化學合成引導RNA。包含表5之Cas9 ORF的mRNA係藉由如WO2019/067910中所描述之活體外轉錄(IVT)產生，參見例如¶ 354，使用2小時IVT反應時間及藉由LiCl沈澱，隨後切向流過濾來純化mRNA。
脂質體轉染係以按重量計1:1之gRNA與mRNA之比率進行。簡言之，將細胞在37℃、5% CO
2下培育24小時，之後用LNP處理。將LNP在37℃下在含有6%石蟹獼猴或6%胎牛血清(FBS)之培養基中培育10分鐘。培育後，依以300 ng Cas9 mRNA起始的8點或12點3倍劑量反應曲線，將LNP添加至小鼠或石蟹獼猴肝細胞中。處理後72小時溶解細胞以進行NGS分析，如實例1中所描述。
基因體DNA分離
在72小時轉染後收集細胞。使用50微升/孔之QuickExtract DNA提取溶液(Epicentre, 目錄號QE09050)或Quick Extract (Lucigen, 目錄號SS000035-D2)根據製造商方案自96孔盤之各孔提取gDNA。
次世代定序(「NGS」)及編輯效率分析
為了定量地測定基因體中之目標位置處之編輯效率，使用定序來鑑別藉由基因編輯引入之插入及缺失的存在。圍繞所關注基因(例如TTR)內之目標位點設計PCR引子，且擴增所關注基因體區域。按本領域中之標準進行引子序列設計。
根據製造商之方案(Illumina)執行額外PCR以添加化學物質以進行定序。擴增子在Illumina MiSeq儀器上定序。在消除具有低品質評分之讀段之後，將讀段與參考基因體(例如，hg38)比對。將含有該等讀段之所得檔案映射至參考基因體(BAM檔案)，其中選擇重疊所關注之目標區之讀段，且計算野生型讀段之數目相對於含有插入或缺失(「插入缺失」)之讀段之數目。
編輯百分比(例如「編輯效率」或「編輯%」)定義為具有插入或缺失(「插入缺失」)之序列讀段之總數目除以包括野生型之序列讀段之總數目。
實例2. 原代肝細胞中之活體外編輯
如表2A至2B中所示設計具有各種骨架序列的共用與小鼠、石蟹獼猴及人類TTR基因交叉反應之相同靶向序列的sgRNA，且將其脂質體轉染至原代小鼠肝細胞(PMH)、石蟹獼猴肝細胞(PCH)及人類肝細胞(PHH)中。除非另外指出，否則如上文所描述製備來自In Vitro ADMET Laboratories, Inc.及Gibco
TM之細胞，藉由脂質體轉染處理，且進行分析。特定言之，使用PMH (批號#839)、PCH (批號#10136011)及PHH (批號#8296)細胞，且分別以15,000、30,000及33,000個細胞/孔之密度接種。如實例1中所描述，使用50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比來製備脂質體轉染試劑。使用約6之N:P莫耳比及按重量計1:1之gRNA:mRNA比率來製備脂質體轉染樣品。分析中包括重複樣品。具有標準差(SD)之平均編輯結果展示於表6及圖1A (PMH)、圖1B (PCH)及圖1C (PHH)中。NA指示引導物之重複物中之一者不滿足定序品質度量值，使得無法計算SD。
表 6. PMH 、 PCH 、 PHH 中之 活體外編輯
實例3. 具有稀釋曲線的原代肝細胞中之活體外編輯
| 引導物ID | PMH | PCH | PHH | |||
| 平均編輯 % | SD | 平均編輯 % | SD | 平均編輯 % | SD | |
| G018707 | 93.1 | 0.8 | 93.3 | 1.8 | 52.2 | 0.6 |
| G018675 | 91.5 | 3.5 | 82.0 | NA | 49.8 | 8.8 |
| G018681 | 90.7 | 3.1 | 91.1 | 1.3 | 52.4 | 12.0 |
| G018706 | 90.7 | 3.3 | 90.3 | NA | 61.5 | 0.1 |
| G018668 | 89.8 | 1.3 | 73.4 | 3.4 | 37.9 | 4.3 |
| G018684 | 89.7 | 4.4 | 85.2 | 5.1 | 65.6 | NA |
| G018695 | 89.6 | 2.8 | 84.1 | 3.7 | 28.1 | 1.6 |
| G018683 | 89.4 | 2.0 | 79.3 | 11.7 | 56.6 | 1.1 |
| G018674 | 88.9 | 7.1 | 85.2 | 10.2 | 42.1 | 5.5 |
| G018687 | 88.7 | 2.5 | 93.5 | 2.1 | 51.6 | 5.9 |
| G018667 | 88.3 | 3.2 | 79.1 | 1.3 | 40.1 | 8.8 |
| G018689 | 88.2 | 1.2 | 85.1 | 4.4 | 60.3 | 13.2 |
| G018685 | 88.0 | 4.1 | 78.0 | 5.7 | 46.8 | 3.7 |
| G018698 | 88.0 | 2.3 | 90.0 | 1.6 | 50.1 | 0.4 |
| G018694 | 87.8 | 7.5 | 91.3 | NA | 42.5 | 9.7 |
| G018705 | 87.8 | 1.4 | 88.1 | 4.0 | 57.7 | 1.8 |
| G018677 | 87.6 | 3.6 | 76.5 | 7.8 | 45.0 | 2.2 |
| G018690 | 87.4 | 3.0 | 91.9 | 0.5 | 60.3 | 7.6 |
| G000502 | 87.1 | 7.2 | 90.2 | 6.4 | 52.5 | 4.2 |
| G018702 | 86.4 | 1.1 | 85.0 | 1.1 | 32.9 | 0.8 |
| G018682 | 86.0 | 9.3 | 77.2 | NA | 37.8 | 16.6 |
| G018686 | 86.0 | 5.0 | 87.3 | 5.1 | 46.1 | 6.7 |
| G018700 | 85.8 | 12.2 | 84.3 | NA | 41.7 | 0.3 |
| G018676 | 84.8 | 0.1 | 87.0 | 2.8 | 42.4 | 8.1 |
| G018669 | 82.0 | 3.6 | 79.2 | 2.4 | 35.5 | 0.6 |
| G018693 | 81.7 | 8.8 | 82.5 | 5.4 | 42.0 | 6.6 |
| G018692 | 81.6 | 7.6 | 86.4 | 3.9 | 49.2 | 8.9 |
| G018688 | 81.3 | 4.8 | 87.9 | 2.1 | 57.0 | 4.4 |
| G018666 | 80.8 | 6.4 | 85.4 | 3.9 | 25.0 | 1.1 |
| G018701 | 80.1 | 2.7 | 77.5 | 12.3 | 26.1 | 2.8 |
| G018673 | 80.0 | 8.9 | 89.2 | 3.3 | 36.1 | 0.2 |
| G018678 | 78.8 | 2.5 | 81.0 | 2.2 | 28.8 | 7.4 |
| G018696 | 76.7 | 7.4 | 87.3 | 3.5 | 36.4 | 3.9 |
| G018699 | 76.1 | 0.4 | 82.1 | 8.6 | 34.3 | 6.4 |
| G018704 | 76.1 | 0.1 | 78.7 | 12.5 | 24.9 | 4.2 |
| G018691 | 75.8 | 3.3 | 90.6 | 5.2 | 43.0 | 5.0 |
| G018697 | 72.9 | 2.6 | 82.8 | 1.3 | 27.2 | 11.2 |
| G018703 | 69.5 | 0.0 | 70.6 | 4.1 | 13.8 | 4.2 |
| G018671 | 67.5 | 0.6 | 68.2 | 11.0 | 15.1 | 1.7 |
| G018670 | 62.3 | 4.1 | 47.7 | 9.3 | 9.6 | 0.2 |
| G018679 | 58.0 | 13.8 | 42.3 | 2.5 | 10.6 | 3.7 |
| G018672 | 55.0 | 5.7 | 56.2 | 2.5 | 7.8 | 0.6 |
| G018708 | 50.7 | 11.6 | 71.5 | 8.1 | 14.2 | 1.3 |
| G018680 | 12.6 | 0.6 | 12.3 | NA | 1.2 | 0.4 |
| G017278 | 92.7 | 5.8 | 87.9 | 5.3 | 60.3 | 6.6 |
| G012401 | 89.7 | 4.1 | 90.6 | 1.4 | 54.1 | 4.7 |
全部具有與小鼠、人類、石蟹獼猴TTR基因交叉反應之相同靶向序列的sgRNA經設計成具有如表2A至2B中所示的將PEG連接子併入sgRNA恆定區之不同區中的各種骨架序列。如上文所描述將引導物及Cas9 mRNA脂質體轉染至原代小鼠肝細胞(PMH)中。使用PMH (批號#839)細胞且以15,000個細胞/孔之密度接種。除非另外指出，否則如上文所描述製備來自Gibco
TM之細胞，藉由脂質體轉染處理，且進行分析。依以46.5 nM引導物濃度起始的8點3倍稀釋曲線分析引導物，如表7中所示。用對照引導物G000502及G012401測試兩組引導物。樣品一式三份地進行。EC
50值及平均編輯結果展示於表7中。劑量反應曲線繪製於圖2A及圖2B中。
表7. PMH中之編輯百分比
| 引導物ID | 組1 | 組2 | |||||||
| 引導物濃度(nM) | 平均編輯% | SD | EC50 | 引導物ID | 引導物濃度(nM) | 平均編輯% | SD | EC50 | |
| G000502 | 46.56 | 93.3 | 2.3 | 2.32 | G000502 | 46.56 | 92.9 | 1.7 | 3.25 |
| 15.52 | 95.4 | 1.3 | 15.52 | 88.1 | 6.1 | ||||
| 5.17 | 81.0 | 2.5 | 5.17 | 65.2 | 0.1 | ||||
| 1.72 | 32.9 | 2.1 | 1.72 | 23.1 | 0.4 | ||||
| 0.57 | 6.0 | 0.1 | 0.57 | 4.0 | 0.7 | ||||
| 0.19 | 1.1 | 0.1 | 0.19 | 0.8 | 0.8 | ||||
| 0.06 | 0.2 | 0.1 | 0.06 | 0.2 | 0.0 | ||||
| 0.02 | 0.1 | 0.0 | 0.02 | 0.1 | 0.1 | ||||
| G012401 | 46.56 | 97.2 | 0.1 | 2.42 | G012401 | 46.56 | 94.2 | 5.2 | 2.36 |
| 15.52 | 95.0 | 1.4 | 15.52 | 92.1 | 1.6 | ||||
| 5.17 | 82.3 | 2.8 | 5.17 | 77.8 | 4.7 | ||||
| 1.72 | 31.8 | 0.6 | 1.72 | 33.6 | 1.1 | ||||
| 0.57 | 8.2 | 0.8 | 0.57 | 9.0 | 1.5 | ||||
| 0.19 | 1.8 | 0.5 | 0.19 | 1.7 | 0.2 | ||||
| 0.06 | 0.1 | 0.1 | 0.06 | 0.9 | 0.1 | ||||
| 0.02 | 0.2 | 0.1 | 0.02 | 0.2 | 0.1 | ||||
| G018804 | 46.56 | 93.2 | 5.9 | 2.87 | G018811 | 46.56 | 90.8 | 3.3 | 2.91 |
| 15.52 | 92.2 | 5.4 | 15.52 | 92.5 | 4.5 | ||||
| 5.17 | 75.2 | 2.3 | 5.17 | 69.8 | 7.4 | ||||
| 1.72 | 22.0 | 1.6 | 1.72 | 24.8 | 3.4 | ||||
| 0.57 | 4.3 | 0.9 | 0.57 | 3.9 | 0.4 | ||||
| 0.19 | 0.7 | 0.4 | 0.19 | 0.6 | 0.2 | ||||
| 0.06 | 0.2 | 0.0 | 0.06 | 0.2 | 0.1 | ||||
| 0.02 | 0.2 | 0.1 | 0.02 | 0.2 | 0.1 | ||||
| G018805 | 46.56 | 93.9 | 2.7 | 3.00 | G018812 | 46.56 | 93.4 | 3.2 | 2.81 |
| 15.52 | 96.6 | 0.8 | 15.52 | 87.5 | 0.4 | ||||
| 5.17 | 74.8 | 7.6 | 5.17 | 72.4 | 3.9 | ||||
| 1.72 | 21.4 | 1.2 | 1.72 | 24.7 | 2.5 | ||||
| 0.57 | 4.0 | 1.2 | 0.57 | 3.8 | 0.7 | ||||
| 0.19 | 0.5 | 0.1 | 0.19 | 0.8 | 0.4 | ||||
| 0.06 | 0.2 | 0.0 | 0.06 | 0.4 | 0.4 | ||||
| 0.02 | 0.2 | 0.0 | 0.02 | 0.3 | 0.1 | ||||
| G018806 | 46.56 | 93.0 | 0.4 | 1.60 | G018813 | 46.56 | 94.6 | 1.5 | 1.73 |
| 15.52 | 93.2 | 4.6 | 15.52 | 91.1 | 4.3 | ||||
| 5.17 | 87.1 | 4.6 | 5.17 | 84.2 | 1.5 | ||||
| 1.72 | 49.1 | 2.7 | 1.72 | 45.6 | 1.4 | ||||
| 0.57 | 15.8 | 1.6 | 0.57 | 16.3 | 0.8 | ||||
| 0.19 | 3.6 | 0.3 | 0.19 | 3.5 | 0.6 | ||||
| 0.06 | 0.7 | 0.2 | 0.06 | 0.7 | 0.3 | ||||
| 0.02 | 0.2 | 0.1 | 0.02 | 0.3 | 0.0 | ||||
| G018807 | 46.56 | 94.3 | 4.8 | 2.21 | G018814 | 46.56 | 95.3 | 1.0 | 1.72 |
| 15.52 | 92.3 | 3.5 | 15.52 | 92.7 | 0.3 | ||||
| 5.17 | 83.6 | 2.8 | 5.17 | 85.0 | 2.5 | ||||
| 1.72 | 34.4 | 4.4 | 1.72 | 47.2 | 2.3 | ||||
| 0.57 | 8.1 | 0.4 | 0.57 | 12.8 | 4.5 | ||||
| 0.19 | 2.4 | 0.1 | 0.19 | 1.9 | 0.2 | ||||
| 0.06 | 0.3 | 0.1 | 0.06 | 0.4 | 0.2 | ||||
| 0.02 | 0.8 | 0.5 | 0.02 | 0.2 | 0.0 | ||||
| G018808 | 46.56 | 96.2 | 0.5 | 4.21 | G018815 | 46.56 | 92.8 | 3.3 | 2.57 |
| 15.52 | 90.9 | 4.8 | 15.52 | 91.8 | 4.7 | ||||
| 5.17 | 58.9 | 1.1 | 5.17 | 74.0 | 3.7 | ||||
| 1.72 | 13.0 | 4.9 | 1.72 | 30.6 | 0.8 | ||||
| 0.57 | 2.7 | 0.6 | 0.57 | 7.4 | 1.6 | ||||
| 0.19 | 0.3 | 0.0 | 0.19 | 1.7 | 0.5 | ||||
| 0.06 | 0.3 | 0.1 | 0.06 | 0.6 | 0.1 | ||||
| 0.02 | 0.2 | 0.1 | 0.02 | 0.2 | 0.1 | ||||
| G018809 | 46.56 | 90.0 | 2.6 | 2.84 | G018816 | 46.56 | 87.6 | 2.1 | 4.03 |
| 15.52 | 90.8 | 2.7 | 15.52 | 89.7 | 1.0 | ||||
| 5.17 | 70.6 | 2.1 | 5.17 | 57.6 | 6.3 | ||||
| 1.72 | 25.0 | 1.4 | 1.72 | 11.8 | 0.5 | ||||
| 0.57 | 5.2 | 0.5 | 0.57 | 1.6 | 0.4 | ||||
| 0.19 | 1.3 | 0.3 | 0.19 | 0.4 | 0.3 | ||||
| 0.06 | 0.2 | 0.0 | 0.06 | 0.2 | 0.1 | ||||
| 0.02 | 0.3 | 0.1 | 0.02 | 0.2 | 0.1 | ||||
| G018810 | 46.56 | 94.1 | 0.1 | 2.36 | |||||
| 15.52 | 91.4 | 3.7 | |||||||
| 5.17 | 81.8 | 8.1 | |||||||
| 1.72 | 30.8 | 7.4 | |||||||
| 0.57 | 8.9 | 1.4 | |||||||
| 0.19 | 1.4 | 0.7 | |||||||
| 0.06 | 0.5 | 0.3 | |||||||
| 0.02 | 0.2 | 0.1 |
使用上文所描述之製備、藉由LNP處理及分析細胞之相同方法，在原代小鼠肝細胞(PMH)及原代石蟹獼猴肝細胞(PCH)中進一步評估來自表7之所選sgRNA。使用來自Gibco
TM之PMH (批號#839)及PCH (批號#CY6011)細胞，且分別以15,000及30,000個細胞/孔之密度接種。如實例1中所描述，以50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比，使用約6之N:P莫耳比及按重量計1:2之gRNA:mRNA比率來製備LNP調配物。依以46.5 nM引導物濃度起始的8點3倍稀釋劑量反應曲線分析引導物，如表8中所示。樣品一式兩份地進行。PMH及PCH之EC
50值及平均編輯結果展示於表8中。劑量反應曲線分別繪製於圖3A及圖3B中。作為不確定值列舉的EC
50值用「ND」表示。
表8. PMH及PCH中之編輯
| 引導物ID | PMH | PCH | ||||||
| 引導物濃度(nM) | 平均編輯% | SD | EC50 | 引導物濃度(nM) | 平均編輯% | SD | EC50 | |
| G012401 | 46.56 | 94.0 | 0.5 | 0.18 | 46.56 | 84.2 | 1.3 | 0.07 |
| 15.52 | 94.4 | 4.7 | 15.52 | 86.6 | 5.4 | |||
| 5.17 | 97.9 | 0.1 | 5.17 | 74.7 | 0.7 | |||
| 1.72 | 92.8 | 0.1 | 1.72 | 71.7 | 3.7 | |||
| 0.57 | 79.8 | 1.8 | 0.57 | 74.9 | 6.9 | |||
| 0.19 | 50.4 | 2.0 | 0.19 | 53.4 | 3.9 | |||
| 0.06 | 16.1 | 0.4 | 0.06 | 32.9 | 0.5 | |||
| 0.02 | 4.7 | 0.9 | 0.02 | 15.8 | 3.7 | |||
| G017276 | 46.56 | 95.3 | 0.5 | 0.17 | 46.56 | 82.4 | 0.5 | 0.03 |
| 15.52 | 93.0 | 0.4 | 15.52 | 83.8 | 2.4 | |||
| 5.17 | 96.7 | 1.4 | 5.17 | 84.0 | 0.6 | |||
| 1.72 | 91.2 | 9.1 | 1.72 | 74.2 | 2.5 | |||
| 0.57 | 82.2 | 3.3 | 0.57 | 73.5 | 6.4 | |||
| 0.19 | 52.7 | 0.1 | 0.19 | 59.6 | 0.6 | |||
| 0.06 | 23.8 | 4.9 | 0.06 | 45.4 | 2.6 | |||
| 0.02 | 8.4 | 1.1 | 0.02 | 26.7 | 4.8 | |||
| G018804 | 46.56 | 97.5 | 0.7 | 0.39 | 46.56 | 87.7 | 0.2 | 0.09 |
| 15.52 | 95.9 | 3.3 | 15.52 | 85.1 | 3.2 | |||
| 5.17 | 96.5 | 2.9 | 5.17 | 81.3 | 6.4 | |||
| 1.72 | 92.0 | 2.3 | 1.72 | 81.3 | 6.3 | |||
| 0.57 | 63.9 | 1.0 | 0.57 | 71.4 | 7.4 | |||
| 0.19 | 24.1 | 0.1 | 0.19 | 56.4 | 6.2 | |||
| 0.06 | 4.7 | 0.3 | 0.06 | 31.2 | 3.9 | |||
| 0.02 | 2.0 | 0.3 | 0.02 | 13.6 | 2.3 | |||
| G018805 | 46.56 | 94.9 | 1.5 | 0.48 | 46.56 | 89.7 | 0.7 | 0.13 |
| 15.52 | 93.5 | 0.7 | 15.52 | 83.9 | 0.1 | |||
| 5.17 | 92.7 | 0.1 | 5.17 | 81.3 | 1.6 | |||
| 1.72 | 91.2 | 2.2 | 1.72 | 75.3 | 0.8 | |||
| 0.57 | 55.9 | 0.2 | 0.57 | 72.7 | 7.0 | |||
| 0.19 | 14.3 | 0.7 | 0.19 | 54.0 | 10.9 | |||
| 0.06 | 4.1 | 0.1 | 0.06 | 21.9 | 4.9 | |||
| 0.02 | 0.9 | 0.2 | 0.02 | 10.9 | 0.3 | |||
| G018806 | 46.56 | 96.3 | 1.8 | 0.23 | 46.56 | 92.2 | 1.3 | 0.02 |
| 15.52 | 93.6 | 2.7 | 15.52 | 92.8 | 1.3 | |||
| 5.17 | 94.1 | 1.2 | 5.17 | 85.3 | 1.4 | |||
| 1.72 | 91.2 | 6.0 | 1.72 | 80.5 | 6.5 | |||
| 0.57 | 74.7 | 8.3 | 0.57 | 73.5 | 3.7 | |||
| 0.19 | 42.1 | 0.8 | 0.19 | 64.6 | 6.0 | |||
| 0.06 | 11.4 | 0.7 | 0.06 | 37.1 | 4.6 | |||
| 0.02 | 3.4 | 1.8 | 0.02 | 17.6 | 2.2 | |||
| G018807 | 46.56 | 97.1 | 0.6 | 0.23 | 46.56 | 94.7 | 1.8 | ND |
| 15.52 | 93.2 | 1.3 | 15.52 | 88.8 | 2.3 | |||
| 5.17 | 93.1 | 1.3 | 5.17 | 79.0 | 0.9 | |||
| 1.72 | 91.9 | 1.7 | 1.72 | 80.4 | 4.3 | |||
| 0.57 | 81.3 | 4.2 | 0.57 | 71.1 | 4.7 | |||
| 0.19 | 41.1 | 1.8 | 0.19 | 67.2 | 6.8 | |||
| 0.06 | 17.1 | 3.2 | 0.06 | 38.5 | 3.5 | |||
| 0.02 | 5.2 | 0.1 | 0.02 | 19.0 | 2.9 | |||
| G018808 | 46.56 | 98.0 | 0.5 | 0.47 | 46.56 | 93.0 | 0.8 | 0.1 |
| 15.52 | 98.1 | 0.1 | 15.52 | 85.9 | 0.6 | |||
| 5.17 | 94.1 | 3.5 | 5.17 | 86.3 | 9.9 | |||
| 1.72 | 85.2 | 1.8 | 1.72 | 81.5 | 0.5 | |||
| 0.57 | 58.0 | 7.0 | 0.57 | 74.5 | 8.6 | |||
| 0.19 | 18.4 | 1.2 | 0.19 | 48.8 | 4.7 | |||
| 0.06 | 4.7 | 1.6 | 0.06 | 16.7 | 1.3 | |||
| 0.02 | 1.1 | 0.1 | 0.02 | 6.4 | 0.3 | |||
| G018809 | 46.56 | 96.2 | 1.8 | 0.3 | 46.56 | 89.6 | 1.1 | 0.12 |
| 15.52 | 96.3 | 1.3 | 15.52 | 87.9 | 0.9 | |||
| 5.17 | 97.2 | 2.1 | 5.17 | 83.3 | 7.6 | |||
| 1.72 | 95.6 | 1.6 | 1.72 | 86.9 | 6.4 | |||
| 0.57 | 69.4 | 4.2 | 0.57 | 81.0 | 6.0 | |||
| 0.19 | 36.0 | 4.7 | 0.19 | 57.5 | 3.8 | |||
| 0.06 | 9.7 | 0.6 | 0.06 | 30.8 | 1.8 | |||
| 0.02 | 3.0 | 0.1 | 0.02 | 13.7 | 0.1 | |||
| G018810 | 46.56 | 95.7 | 0.4 | 0.14 | 46.56 | 92.1 | 2.3 | 0.06 |
| 15.52 | 98.1 | 0.2 | 15.52 | 89.4 | 2.2 | |||
| 5.17 | 92.4 | 1.4 | 5.17 | 89.3 | 1.5 | |||
| 1.72 | 93.8 | 1.2 | 1.72 | 82.8 | 2.1 | |||
| 0.57 | 90.1 | 3.5 | 0.57 | 84.5 | 6.1 | |||
| 0.19 | 61.7 | 2.3 | 0.19 | 76.3 | 7.6 | |||
| 0.06 | 21.9 | 0.1 | 0.06 | 48.4 | 5.6 | |||
| 0.02 | 6.2 | 0.0 | 0.02 | 23.9 | 1.3 |
除非另外指出，否則使用上文所描述之製備、藉由LNP處理及分析細胞之相同方法，在原代小鼠肝細胞(PMH)、原代大鼠肝細胞(PRH)及原代石蟹獼猴肝細胞(PCH)中評估額外sgRNA。使用PMH (批號#839)細胞且以15,000個細胞/孔之密度接種。使用PMH (批號#839或批號# mc114)、PCH (批號#10136011)及PRH (批號# 977A)細胞，且分別以15,000、33,000及30,000個細胞/孔之密度接種。如實例1中所描述，以50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比，使用約6之N:P莫耳比及按重量計1:2之gRNA:mRNA比率來製備LNP調配物。依以46.5 nM引導物濃度起始的12點3倍劑量反應曲線分析引導物，如表8及9中所示。對於PMH及PCH，對照物G017276及G000502分別一式6份及一式4份地運行，且其餘樣品分別一式4份及一式2份地運行。對於PMH及PCH，對照物G017276及G000502分別一式6份及一式3份地運行，且測試樣品分別一式4份及一式2份地運行。對於PRH，對照物G018631及G022500一式4份地運行，且其餘樣品一式2份地運行。PMH及PCH之EC
50值及平均編輯結果展示於表9中，且PRH之EC
50值及平均編輯結果展示於表10中。PMH、PCH及PRH之劑量反應曲線分別繪製於圖4A、圖4B及圖4C中。
表9. PMH及PCH中之編輯
| 引導物ID | PMH | PCH | ||||||
| 引導物濃度(nM) | 平均編輯% | SD | EC50 | 引導物濃度(nM) | 平均編輯% | SD | EC50 | |
| G017276 | 46.5 | 97.4 | 0.3 | 0.11 | 46.5 | 90.6 | 4.0 | 0.05 |
| 15.5 | 98.0 | 0.4 | 15.5 | 94.1 | 1.8 | |||
| 5.1 | 98.1 | 0.4 | 5.1 | 92.4 | 2.1 | |||
| 1.7 | 97.1 | 1.1 | 1.7 | 92.8 | 2.3 | |||
| 0.5 | 91.5 | 1.9 | 0.5 | 85.3 | 8.4 | |||
| 0.19 | 67.7 | 6.9 | 0.19 | 78.0 | 2.3 | |||
| 0.06 | 30.8 | 4.3 | 0.06 | 52.8 | 5.7 | |||
| 0.02 | 8.7 | 1.6 | 0.02 | 20.6 | 2.7 | |||
| 0.007 | 1.6 | 0.5 | 0.007 | 5.1 | 1.3 | |||
| 0.002 | 0.3 | 0.2 | 0.002 | 1.1 | 0.5 | |||
| 0.0007 | 0.1 | 0.1 | 0.0007 | 0.5 | 0.2 | |||
| 0.0002 | 0.1 | 0.0 | 0.0002 | 0.1 | 0.1 | |||
| G022502 | 46.5 | 96.2 | 1.3 | 0.22 | 46.5 | 92.1 | 1.6 | 0.1 |
| 15.5 | 97.4 | 0.6 | 15.5 | 95.2 | 1.4 | |||
| 5.1 | 97.6 | 1.1 | 5.1 | 88.5 | 2.0 | |||
| 1.7 | 95.1 | 1.4 | 1.7 | 90.4 | 0.0 | |||
| 0.5 | 82.1 | 3.4 | 0.5 | 85.2 | 0.1 | |||
| 0.19 | 41.0 | 5.9 | 0.19 | 66.1 | 5.3 | |||
| 0.06 | 10.9 | 1.5 | 0.06 | 30.6 | 3.3 | |||
| 0.02 | 2.2 | 0.4 | 0.02 | 9.1 | 1.6 | |||
| 0.007 | 0.4 | 0.1 | 0.007 | 1.5 | 0.4 | |||
| 0.002 | 0.1 | 0.1 | 0.002 | 0.3 | 0.3 | |||
| 0.0007 | 0.1 | 0.1 | 0.0007 | 0.1 | 0.0 | |||
| 0.0002 | 0.1 | 0.0 | 0.0002 | 0.1 | 0.1 | |||
| G022503 | 46.5 | 95.8 | 1.5 | 0.26 | 46.5 | 85.7 | 10.5 | 0.11 |
| 15.5 | 97.9 | 0.8 | 15.5 | 95.0 | 0.8 | |||
| 5.1 | 97.5 | 0.1 | 5.1 | 94.4 | 0.5 | |||
| 1.7 | 94.5 | 1.9 | 1.7 | 92.0 | 2.9 | |||
| 0.5 | 75.6 | 6.8 | 0.5 | 85.6 | 5.4 | |||
| 0.19 | 33.6 | 4.9 | 0.19 | 59.5 | 6.0 | |||
| 0.06 | 10.4 | 1.6 | 0.06 | 32.3 | 8.6 | |||
| 0.02 | 1.8 | 0.1 | 0.02 | 6.5 | 2.4 | |||
| 0.007 | 0.3 | 0.1 | 0.007 | 1.1 | 0.4 | |||
| 0.002 | 0.1 | 0.1 | 0.002 | 0.4 | 0.4 | |||
| 0.0007 | 0.1 | 0.1 | 0.0007 | 0.0 | 0.0 | |||
| 0.0002 | 0.1 | 0.1 | 0.0002 | 0.1 | 0.0 | |||
| G022501 | 46.5 | 95.5 | 1.8 | 0.21 | 46.5 | 90.2 | 2.5 | 0.9 |
| 15.5 | 97.8 | 0.5 | 15.5 | 88.8 | 4.4 | |||
| 5.1 | 97.2 | 1.0 | 5.1 | 93.6 | 3.0 | |||
| 1.7 | 95.9 | 1.3 | 1.7 | 92.0 | 1.4 | |||
| 0.5 | 82.0 | 5.4 | 0.5 | 86.2 | 1.9 | |||
| 0.19 | 43.9 | 7.6 | 0.19 | 67.8 | 2.9 | |||
| 0.06 | 10.9 | 0.8 | 0.06 | 32.4 | 3.6 | |||
| 0.02 | 2.0 | 0.8 | 0.02 | 7.1 | 2.1 | |||
| 0.007 | 0.5 | 0.1 | 0.007 | 1.9 | 0.6 | |||
| 0.002 | 0.1 | 0.0 | 0.002 | 0.2 | 0.3 | |||
| 0.0007 | 0.1 | 0.1 | 0.0007 | 0.1 | 0.1 | |||
| 0.0002 | 0.1 | 0.0 | 0.0002 | 0.1 | 0.0 | |||
| G022504 | 46.5 | 96.3 | 1.7 | 0.32 | 46.5 | 91.3 | 1.1 | 0.14 |
| 15.5 | 97.7 | 0.3 | 15.5 | 90.0 | 2.5 | |||
| 5.1 | 97.0 | 0.7 | 5.1 | 87.2 | 8.8 | |||
| 1.7 | 92.8 | 3.3 | 1.7 | 90.6 | 1.0 | |||
| 0.5 | 68.7 | 7.8 | 0.5 | 83.3 | 6.4 | |||
| 0.19 | 25.9 | 2.3 | 0.19 | 53.8 | 3.9 | |||
| 0.06 | 5.4 | 0.1 | 0.06 | 19.9 | 4.4 | |||
| 0.02 | 0.7 | 0.1 | 0.02 | 3.3 | 0.6 | |||
| 0.007 | 0.2 | 0.1 | 0.007 | 0.7 | 0.1 | |||
| 0.002 | 0.1 | 0.0 | 0.002 | 0.2 | 0.0 | |||
| 0.0007 | 0.1 | 0.0 | 0.0007 | 0.2 | 0.1 | |||
| 0.0002 | 0.1 | 0.0 | 0.0002 | 0.1 | 0.0 | |||
| G000502 | 46.5 | 95.4 | 1.0 | 0.34 | 46.5 | 88.5 | 6.3 | 0.2 |
| 15.5 | 97.3 | 0.4 | 15.5 | 93.3 | 1.9 | |||
| 5.1 | 96.5 | 1.8 | 5.1 | 93.0 | 1.5 | |||
| 1.7 | 90.5 | 4.8 | 1.7 | 88.2 | 3.3 | |||
| 0.5 | 64.1 | 8.3 | 0.5 | 75.4 | 1.6 | |||
| 0.19 | 24.8 | 3.6 | 0.19 | 42.0 | 4.0 | |||
| 0.06 | 5.4 | 0.4 | 0.06 | 14.1 | 2.4 | |||
| 0.02 | 1.2 | 0.3 | 0.02 | 3.0 | 0.3 | |||
| 0.007 | 0.3 | 0.1 | 0.007 | 0.6 | 0.1 | |||
| 0.002 | 0.1 | 0.1 | 0.002 | 0.2 | 0.1 | |||
| 0.0007 | 0.1 | 0.0 | 0.0007 | 0.0 | 0.1 | |||
| 0.0002 | 0.1 | 0.0 | 0.0002 | 0.1 | 0.1 |
表10. PRH中之編輯
實例4. 使用脂質奈米顆粒(LNP)在小鼠肝臟中之活體內編輯
| 引導物ID | 引導物濃度(nM) | 平均編輯% | SD | EC50 |
| G018631 | 46.5 | 99.0 | 0.2 | 0.02 |
| 15.5 | 99.6 | 0.1 | ||
| 5.1 | 99.5 | 0.2 | ||
| 1.7 | 99.0 | 0.2 | ||
| 0.5 | 97.2 | 0.7 | ||
| 0.19 | 92.3 | 1.3 | ||
| 0.06 | 78.6 | 4.0 | ||
| 0.02 | 49.9 | 8.5 | ||
| 0.007 | 15.5 | 3.6 | ||
| 0.002 | 4.0 | 1.4 | ||
| 0.0007 | 0.9 | 0.4 | ||
| 0.0002 | 0.4 | 0.1 | ||
| G022499 | 46.5 | 98.3 | 0.4 | 0.06 |
| 15.5 | 99.2 | 0.7 | ||
| 5.1 | 99.3 | 0.3 | ||
| 1.7 | 97.7 | 0.0 | ||
| 0.5 | 94.4 | 0.8 | ||
| 0.19 | 81.7 | 2.9 | ||
| 0.06 | 49.6 | 5.0 | ||
| 0.02 | 16.5 | 4.2 | ||
| 0.007 | 3.3 | 1.9 | ||
| 0.002 | 0.9 | 0.4 | ||
| 0.0007 | 0.2 | 0.0 | ||
| 0.0002 | 0.2 | 0.1 | ||
| G022497 | 46.5 | 98.3 | 0.4 | 0.07 |
| 15.5 | 98.9 | 0.4 | ||
| 5.1 | 99.4 | 0.1 | ||
| 1.7 | 97.9 | 1.1 | ||
| 0.5 | 94.0 | 2.9 | ||
| 0.19 | 82.4 | 5.9 | ||
| 0.06 | 41.6 | |||
| 0.02 | 16.7 | 7.1 | ||
| 0.007 | 3.1 | 1.8 | ||
| 0.002 | 0.4 | 0.1 | ||
| 0.0007 | 0.4 | 0.0 | ||
| 0.0002 | 0.1 | 0.0 | ||
| G022498 | 46.5 | 97.9 | 0.0 | 0.04 |
| 15.5 | 99.1 | 0.4 | ||
| 5.1 | 99.2 | 0.0 | ||
| 1.7 | 98.7 | 0.1 | ||
| 0.5 | 96.0 | 1.5 | ||
| 0.19 | 89.6 | 2.3 | ||
| 0.06 | 65.9 | 10.2 | ||
| 0.02 | 31.9 | 10.0 | ||
| 0.007 | 7.4 | 2.3 | ||
| 0.002 | 1.5 | 0.7 | ||
| 0.0007 | 0.4 | 0.1 | ||
| 0.0002 | 0.1 | 0.0 | ||
| G00534 | 46.5 | 98.4 | 0.4 | 0.08 |
| 15.5 | 99.0 | 0.4 | ||
| 5.1 | 99.0 | 0.5 | ||
| 1.7 | 97.9 | 0.8 | ||
| 0.5 | 92.1 | |||
| 0.19 | 77.5 | 7.1 | ||
| 0.06 | 40.3 | 7.0 | ||
| 0.02 | 11.8 | 4.2 | ||
| 0.007 | 2.2 | 0.8 | ||
| 0.002 | 0.3 | 0.0 | ||
| 0.0007 | 0.2 | 0.1 | ||
| 0.0002 | 0.2 | 0.1 | ||
| G022500 | 46.5 | 98.4 | 0.4 | 0.07 |
| 15.5 | 99.1 | 0.2 | ||
| 5.1 | 99.3 | 0.3 | ||
| 1.7 | 97.7 | 0.7 | ||
| 0.5 | 93.3 | 1.8 | ||
| 0.19 | 78.1 | 4.8 | ||
| 0.06 | 44.3 | 6.1 | ||
| 0.02 | 12.9 | 3.1 | ||
| 0.007 | 2.4 | 0.8 | ||
| 0.002 | 0.4 | 0.2 | ||
| 0.0007 | 0.2 | 0.1 | ||
| 0.0002 | 0.1 | 0.1 |
如實例1中所描述調配用於所有活體內研究中之LNP。與方案之偏差在各別實例中提及。用於LNP製備之運輸及儲存溶液(TSS)在實驗中作為僅媒劑陰性對照給藥。LNP中含有的sgRNA之核苷酸序列皆靶向TTR基因中之相同序列，如表2A至2B中所指示。
實例4.1 小鼠模型中之活體內編輯
測試來自表2A至2B之所選引導物設計之活體內編輯效率。涉及小鼠的各研究中使用6至10週齡範圍內的CD-1雌性小鼠。給藥前對動物進行稱重。以每隻動物0.2 mL之體積(每公斤體重約10 mL)，經由外側尾部靜脈給與LNP。給藥後約6小時，觀測動物之不良反應。在投與後二十四小時量測體重，且在給藥後8天，藉由在異氟醚麻醉下放血將動物安樂死。經由心臟穿刺將血液收集至血清分離管中或含有緩衝檸檬酸鈉之管中以得到血漿，如本文所描述。對於涉及活體內編輯之研究，自各動物之左內葉收集肝臟組織以用於DNA提取及分析。
對於活體內研究，使用基於珠粒之提取套組，例如Zymo Quick- DNA 96套組(Zymo Research，目錄號D3010)，根據製造商之方案自10 mg組織中提取基因體DNA，該方案包括使組織在溶解緩衝液中均質化(約400 μL/10 mg組織)。所有DNA樣品相對於100 ng/μL濃度正規化以用於PCR及後續NGS分析，如實例1中所描述。
實例4.2 用於動物研究中的甲狀腺素轉運蛋白(TTR) ELISA分析
收集血液且如上文所描述分離血清。使用小鼠前白蛋白(甲狀腺素轉運蛋白) ELISA套組(Aviva Systems Biology，目錄號OKIA00111)測定總TTR血清含量；使用大鼠特異性ELISA套組(Aviva Systems Biology，目錄號OKIA00159)量測大鼠TTR血清含量。根據製造商方案製備套組試劑及標準品。用1×分析稀釋劑將小鼠或大鼠血清稀釋至10,000倍之最終稀釋度。此如下進行：進行兩次連續50倍稀釋，產生2500倍稀釋度。進行最終4倍稀釋步驟，得到10,000倍之總樣品稀釋度。將標準曲線稀釋液(各100 μL)與稀釋之血清樣品均添加至預塗有捕捉抗體之ELISA盤之各孔中。培養盤在室溫下培育30分鐘，隨後洗滌。添加酶-抗體結合物(每孔100 μL)，培育20分鐘。移除未結合之抗體結合物且再次洗滌培養盤，隨後添加顯色受質溶液。將培養盤培育10分鐘，隨後添加100 μL終止溶液，例如硫酸(約0.3 M)。培養盤在SpectraMax M5或Clariostar盤讀取器上、在450 nm之吸光度下讀取。使用脫離標準曲線之四參數邏輯曲線擬合，藉由SoftMax Pro軟體版本6.4.2或Mars軟體版本3.31計算血清TTR含量。根據分析稀釋度調整最終血清值。相對於對照組，測定蛋白質阻斷百分比(KD%)值，除非另外指示，否則對照組通常為經媒劑(TSS)假處理的動物。在個體或動物組中觀測到負KD%值，其中TTR含量高於對照組平均值，得到負阻斷值。
實例4.3 活體內編輯及血清TTR阻斷
LNP一般如實例1中所描述製備。如實例1中所描述分析LNP調配物之平均粒度、多分散性(pdi)、總RNA含量及RNA囊封效率，且結果展示於表11中。
表11. LNP調配物分析
| LNP ID | 引導物ID | 囊封(%) | Z 均大小(nm) | PDI | 數均大小(nm) |
| LNP1 | TSS | 98 | 88 | 0.04 | 71 |
| LNP2 | G017276 | 99 | 89 | 0.02 | 71 |
| LNP3 | G018804 | 98 | 90 | 0.04 | 71 |
| LNP4 | G018805 | 98 | 92 | 0.02 | 75 |
| LNP5 | G018806 | 98 | 91 | 0 | 75 |
| LNP6 | G018807 | 98 | 90 | 0.02 | 73 |
| LNP7 | G018808 | 98 | 89 | 0.01 | 72 |
| LNP8 | G018809 | 98 | 87 | 0.04 | 68 |
| LNP9 | G018810 | 99 | 88 | 0.06 | 67 |
含有表12中所指示之sgRNA的LNP以0.1 mg/kg總RNA之劑量向雌性CD-1小鼠(n=5)投與，如上文所描述。引導物G017276充當對照。含有所指示sgRNA之LNP的編輯效率、TTR蛋白質含量及TTR阻斷百分比(KD%)展示於表12中，且編輯效率及TTR蛋白質含量繪示於圖5A及圖5B中。
表 12. 肝臟 編輯、血清 TTR 蛋白質及 TTR 蛋白質阻斷
| 引導物ID | 平均插入缺失% | SD | 平均血清TTR (μg/ml) | SD | 平均KD% | SD |
| TSS | 0.06 | 0.05 | 614.6 | 137.4 | 0 | 22.35 |
| G017276 | 64.12 | 5.97 | 107.2 | 38.65 | 82.57 | 6.29 |
| G018804 | 66.08 | 4.98 | 84.5 | 54.1 | 86.25 | 8.8 |
| G018805 | 59.88 | 4.28 | 118.8 | 59.23 | 80.67 | 9.64 |
| G018806 | 63.72 | 2.03 | 104.4 | 19.71 | 83.01 | 3.21 |
| G018807 | 65.34 | 6.11 | 86.4 | 43.46 | 85.94 | 7.07 |
| G018808 | 46.76 | 11.65 | 227.0 | 138.4 | 63.06 | 22.51 |
| G018809 | 64.74 | 2.8 | 78.2 | 20.79 | 87.28 | 3.38 |
| G018810 | 63.44 | 5.91 | 103.1 | 70.12 | 83.22 | 11.41 |
來自表12之所選引導物以0.1 mg/kg及0.03 mg/kg總RNA向雌性CD-1小鼠(n=5)投與，如上文所描述。引導物G012401及G01727充當對照。表13分別展示含有所指示sgRNA之LNP的編輯效率、TTR蛋白質含量及TTR阻斷百分比，且編輯效率展示於圖6中。
表13. 肝臟編輯、血清TTR蛋白質及血清TTR蛋白質KD%
| 引導物 | 劑量(mg/kg) | 平均插入缺失% | SD | 平均血清TTR (μg/ml) | SD | 平均KD% | SD |
| TSS | 0 | 0.2 | 0 | 658.9 | 56.6 | 0 | 8.6 |
| G12401 | 0.1 | 36 | 7.9 | 324.0 | 115.0 | 50.8 | 17.5 |
| 0.03 | 8.3 | 2.1 | 550.3 | 51.3 | 30.7 | 31.7 | |
| G17276 | 0.1 | 60.3 | 7.3 | 115.1 | 54.2 | 68.4 | 31 |
| 0.03 | 27.2 | 5.4 | 412.7 | 65.6 | 37.4 | 10 | |
| G18806 | 0.1 | 63.1 | 6.1 | 89.4 | 76.2 | 86.4 | 11.6 |
| 0.03 | 34.6 | 5.4 | 369.9 | 64.8 | 43.9 | 9.8 | |
| G18807 | 0.1 | 67.8 | 2.3 | 75.5 | 14.8 | 88.6 | 2.3 |
| 0.03 | 40.2 | 9 | 316.5 | 95.8 | 52 | 14.5 | |
| G18808 | 0.1 | 47.3 | 5.4 | 202.2 | 35.8 | 69.3 | 5.4 |
| 0.03 | 17.3 | 6.6 | 444.1 | 101.2 | 32.6 | 15.4 | |
| G18809 | 0.1 | 61 | 4.8 | 114.0 | 44.7 | 82.7 | 6.8 |
| 0.03 | 27 | 3.1 | 494.7 | 93.8 | 24.9 | 14.2 | |
| G18810 | 0.1 | 54.4 | 6.7 | 156.2 | 81.0 | 76.3 | 12.3 |
| 0.03 | 20.9 | 5.1 | 592.4 | 67.0 | 10.1 | 10.2 |
具有額外連接子修飾的具有相同靶向序列之其他引導物以0.1 mg/kg及0.03 mg/kg總RNA向雌性CD-1小鼠(n=5)投與，如上文所描述。引導物G017276及G000502充當對照。表14分別展示含有所指示sgRNA之LNP的編輯效率、TTR蛋白質含量及TTR阻斷百分比，且編輯效率展示於圖7中。
表 14 . 肝臟 編輯、血清 TTR 蛋白質及血清 TTR 蛋白質 KD%
實例5. 使用脂質奈米顆粒(LNP)在大鼠肝臟中之活體內編輯 實例5.1 大鼠中之LNP遞送
| 引導物 | 劑量(mg/kg) | 平均插入缺失% | SD | 平均TTR μg/ml | SD | 平均KD% | SD |
| TSS | x | 0.14 | 0.09 | 588.8 | 62.3 | -6E-10 | 10.6 |
| G017276 | 0.1 | 53.92 | 6.78 | 154.5 | 77.0 | 73.8 | 13.1 |
| 0.03 | 25.6 | 6.59 | 373.3 | 109.3 | 36.6 | 18.6 | |
| G000502 | 0.1 | 43.04 | 9.20 | 240.5 | 52.1 | 59.2 | 8.8 |
| 0.03 | 21.42 | 10.67 | 439.7 | 99.2 | 25.3 | 16.9 | |
| G022501 | 0.1 | 60.74 | 0.59 | 116.0 | 26.6 | 80.3 | 4.5 |
| 0.03 | 17.16 | 5.11 | 611.7 | 183.6 | -3.9 | 31.2 | |
| G022502 | 0.1 | 33.82 | 10.61 | 472.2 | 205.4 | 19.8 | 34.9 |
| 0.03 | 5.52 | 1.35 | 573.5 | 46.9 | 2.6 | 8.0 | |
| G022503 | 0.1 | 58.1 | 9.36 | 154.2 | 78.5 | 73.8 | 13.3 |
| 0.03 | 18.94 | 7.19 | 508.7 | 104.1 | 13.6 | 17.7 | |
| G022504 | 0.1 | 25.88 | 4.45 | 527.5 | 122.2 | 10.4 | 20.8 |
| 0.03 | 624.9 | 88.5 | -6.1 | 15.0 |
在大鼠中進一步測試所選引導物設計。在涉及大鼠之各研究中使用來自Charles River之6至8週齡範圍內的史泊格多利雌性大鼠。LNP經由外側尾部靜脈注射給藥。如實例1中所描述，以50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比，使用約6之N:P莫耳比及按重量計1:2之gRNA:mRNA比率來製備LNP調配物。在給藥後觀測動物之不良反應。在投與後二十四小時量測體重，且在給藥後經由在CO
2窒息下放血將動物安樂死。經由心臟穿刺將血液收集至血清分離管(Geriner Bio One，目錄號450472)中。對於涉及活體內編輯之研究，自各動物收集肝臟組織。如實例5中所描述分離及處理基因體DNA。製備所有DNA樣品以用於PCR及後續NGS分析，如實例5中所描述。
評估各大鼠樣品之肝臟中之編輯效率及TTR血清蛋白質含量，如實例5中所描述。以下研究表中之各者中所示之結果表示各LNP內所含有之sgRNA (關於sgRNA核苷酸序列，參見表2A至2B)，其皆靶向TTR基因中之相同序列。LNP如實例5中所描述製備。與方案之偏差在以下各別實例中提及。
實例5.2 大鼠模型中之活體內編輯及TTR阻斷
含有表15中所指示之sgRNA的LNP以0.1 mg/kg及0.03 mg/kg總RNA之劑量向雌性史泊格多利大鼠(n=5)投與，如上文所描述。引導物G000534及G018631充當對照。表15分別展示編輯效率、血清TTR蛋白質及TSS百分比。編輯效率及血清TTR蛋白質含量繪示於圖8A及圖8B中。
表 15 . 肝臟編輯及血清 TTR
實例6. 使用LNP之相對於sgRNA或pgRNA之sgRNA:mRNA比率
| 引導物 | LNP 劑量(mg/kg) | 平均插入缺失% | SD | 平均血清TTR (μg/ml) | SD | TSS% |
| TSS | n/a | 0.1 | 0.0 | 1385.4 | 215.8 | 100.0 |
| G000534 | 0.03 | 4.8 | 2.4 | 1200.3 | 343.4 | 86.6 |
| 0.1 | 40.4 | 5.7 | 596.3 | 91.7 | 43.0 | |
| G018631 | 0.03 | 25.8 | 4.7 | 770.1 | 181.4 | 55.6 |
| 0.1 | 62.4 | 2.7 | 200.0 | 88.9 | 14.4 | |
| G022497 | 0.03 | 16.0 | 3.4 | 839.6 | 45.5 | 60.6 |
| 0.1 | 46.3 | 8.1 | 521.8 | 137.4 | 37.7 | |
| G022498 | 0.03 | 4.2 | 1.6 | 1052.6 | 207.4 | 76.0 |
| 0.1 | 20.9 | 8.7 | 781.1 | 143.6 | 56.4 | |
| G022499 | 0.03 | 8.6 | 6.2 | 978.5 | 111.8 | 70.6 |
| 0.1 | 42.8 | 9.7 | 489.3 | 185.1 | 35.3 | |
| G022500 | 0.03 | 2.6 | 1.1 | 905.0 | 146.7 | 65.3 |
| 0.1 | 16.1 | 6.1 | 828.3 | 59.8 | 59.8 |
進行研究以評估含有PEG連接子之sgRNA設計(pgRNA)之編輯效率。該研究比較兩種具有相同引導序列的靶向TTR之gRNA，其中一種在引導物之恆定區中包括三個PEG連接子(pgRNA，G021846)，且一種不包括(G021845)，如表4B中所示。引導物及mRNA調配於單獨的LNP中且混合至所要比率，以經由脂質奈米顆粒(LNP)遞送至原代小鼠肝細胞(PMH)。
除非另外指出，否則如實例1中所描述製備、處理及分析PMH細胞。來自In Vitro ADMET Laboratories之PMH細胞(批號#MCM114)以15,000個細胞/孔之密度接種。如下文所描述用LNP處理細胞。LNP一般如實例1中所描述製備。以50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比之脂質組成來製備LNP。以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。LNP囊封單一RNA物種，gRNA G021845、gRNA G021846或mRNA (mRNA M)，如實例1中所描述。
用不同量的按RNA負荷之重量計1:4、1:2、1:1、2:1、4:1或8:1之gRNA與mRNA比率的LNP來處理PMH細胞。各分析中包括重複樣品。依以1 ng/μL總RNA濃度起始的8點3倍劑量反應曲線分析引導物，如表16中所示。平均編輯百分比結果展示於表16中。圖12A展示sgRNA G021845之平均編輯百分比，且圖12B展示sgRNA G021846之平均編輯百分比。表中之「ND」表示由於實驗失敗而無法偵測到的值。
表 16. PMH 中之 平均編輯百分比
實例7. 使用LNP在PMH中經修飾之聚乙二醇化引導物(pgRNA)之活體外編輯
| 負荷比率(gRNA:mRNA) | LNP 劑量(ng/μL) | sgRNA (G021845) | pgRNA (G021846) | ||
| 平均編輯% | SD | 平均編輯% | SD | ||
| 1:4 | 1 | 88.1 | 1.7 | ND | ND |
| 0.3 | 68.7 | 5.7 | 78 | 0.3 | |
| 0.1 | 28.1 | 4.1 | 39.8 | 8.2 | |
| 0.03 | 8.7 | 2 | 5.1 | 0 | |
| 0.01 | 1.5 | 0.4 | 4 | 1.2 | |
| 0.004 | 0.6 | 0.5 | 0.2 | 0 | |
| 0.001 | 0.3 | 0.2 | 0.6 | 0.3 | |
| 1:2 | 1 | 90.6 | 0 | 91.2 | 2.9 |
| 0.3 | 78 | 2.4 | 85.6 | 1.4 | |
| 0.1 | 41.5 | 5.8 | 56.6 | 4.4 | |
| 0.03 | 23 | 5.4 | 17.5 | 0 | |
| 0.01 | 6.1 | 4.3 | 18.6 | 0.5 | |
| 0.004 | 0.1 | 0.1 | 3.4 | 1.7 | |
| 0.001 | 0.1 | 0 | 2.4 | 0.7 | |
| 1:1 | 1 | 90.9 | 1.4 | 94.7 | 0.6 |
| 0.3 | 71.8 | 4.2 | 84.7 | 0.9 | |
| 0.1 | 45.7 | 3.2 | 64.3 | 5.3 | |
| 0.03 | 27.4 | 1 | 44.8 | 11.5 | |
| 0.01 | 4.7 | 2.5 | 10.2 | 4.3 | |
| 0.004 | 0.2 | 0 | 1.7 | 0.7 | |
| 0.001 | 0.1 | 0 | 0.7 | 0.5 | |
| 2:1 | 1 | 92.4 | 1.6 | 94.5 | 0.8 |
| 0.3 | 80 | 1.3 | 85.7 | 0.2 | |
| 0.1 | 45.4 | 0 | 68 | 7.9 | |
| 0.03 | 47.2 | 3 | 49.3 | 0 | |
| 0.01 | 18.1 | 1.8 | 28.8 | 4.1 | |
| 0.004 | 0.8 | 0.7 | 3.8 | 2.4 | |
| 0.001 | 0.2 | 0.1 | 0.8 | 0.3 | |
| 4:1 | 1 | 87.9 | 1.9 | 90.1 | 0 |
| 0.3 | 80.2 | 2.2 | 84 | 0.1 | |
| 0.1 | 43.4 | 0 | 60.4 | 0.1 | |
| 0.03 | 46.2 | 0.5 | 46.1 | 0 | |
| 0.01 | 11.3 | 2.3 | 26.7 | 4.9 | |
| 0.004 | 0.4 | 0.2 | 1.5 | 0.4 | |
| 0.001 | 0.4 | 0.1 | 0.5 | 0.3 | |
| 8:1 | 1 | 89.2 | 0 | 87.5 | 0 |
| 0.3 | 76.7 | 3.9 | 78.6 | 3.1 | |
| 0.1 | 59.5 | 9.4 | 59.4 | 1.1 | |
| 0.03 | 36.4 | 7 | 45.3 | 0.5 | |
| 0.01 | 8.2 | 1.2 | 18.7 | 2.9 | |
| 0.004 | 0.6 | 0.6 | 2.6 | 0.3 | |
| 0.001 | 0.1 | 0 | 0.6 | 0.2 |
分析具有小鼠TTR基因中之相同靶向位點的經修飾pgRNA以評估PMH細胞中之編輯效率。
除非另外指出，否則如實例1中所描述製備、處理及分析PMH細胞。使用來自In Vitro ADMET Laboratories之PMH細胞(批號#MC148)且以15,000個細胞/孔之密度接種。LNP調配物如實例1中所描述製備。以50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比之脂質組成來製備LNP。以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比且用如表17中所指示之gRNA或用mRNA來調配LNP。
用按重量計30 ng總mRNA (mRNA P)之LNP及表17中所指示之量的gRNA之LNP來處理於100 μl培養基中之PMH。樣品一式兩份地進行。PMH之平均編輯結果展示於表17及圖13中。
表 17 . PMH 中之 平均編輯百分比
實例8. 在PMH中評估引導序列化學修飾
| 引導物ID | LNP sgRNA (ng/μL) | 平均編輯% | SD | 引導物ID | LNP sgRNA (ng/μL) | 平均編輯% | SD |
| G021844 | 0.7 | 96.6 | 0.5 | G023416 | 0.7 | 91.5 | 1.8 |
| 0.23 | 95.0 | 0.5 | 0.23 | 84.8 | 0.1 | ||
| 0.08 | 80.0 | 5.9 | 0.08 | 56.4 | 2.7 | ||
| 0.03 | 51.9 | 1.9 | 0.03 | 28.2 | 3.6 | ||
| 0.009 | 13.9 | 0.4 | 0.009 | 10.0 | 1.7 | ||
| 0.003 | 4.6 | 0.9 | 0.003 | 3.2 | 0.0 | ||
| 0.001 | 0.8 | 0.1 | 0.001 | 0.8 | 0.3 | ||
| 0.0003 | 0.2 | 0.1 | 0.0003 | 0.2 | 0.0 | ||
| 0.0001 | 0.1 | 0.0 | 0.0001 | 0.1 | 0.0 | ||
| 0.00004 | 0.2 | 0.1 | 0.00004 | 0.1 | 0.0 | ||
| 0.00001 | 0.1 | 0.0 | 0.00001 | 0.1 | 0.0 | ||
| 0 | 0.1 | 0.0 | 0 | 0.1 | 0.0 | ||
| G023413 | 0.7 | 96.4 | 0.4 | G023417 | 0.7 | 90.5 | 1.8 |
| 0.23 | 92.5 | 0.7 | 0.23 | 71.6 | 0.2 | ||
| 0.08 | 73.9 | 0.9 | 0.08 | 30.9 | 6.7 | ||
| 0.03 | 36.4 | 2.6 | 0.03 | 12.8 | 1.3 | ||
| 0.009 | 10.3 | 1.5 | 0.009 | 4.8 | 1.5 | ||
| 0.003 | 2.4 | 0.7 | 0.003 | 0.4 | 0.4 | ||
| 0.001 | 0.6 | 0.1 | 0.001 | 0.2 | 0.1 | ||
| 0.0003 | 0.3 | 0.0 | 0.0003 | 0.1 | 0.0 | ||
| 0.0001 | 0.1 | 0.0 | 0.0001 | 0.1 | 0.1 | ||
| 0.00004 | 0.1 | 0.0 | 0.00004 | 0.1 | 0.0 | ||
| 0.00001 | 0.1 | 0.0 | 0.00001 | 0.1 | 0.0 | ||
| 0 | 0.1 | 0.0 | 0 | 0.1 | 0.0 | ||
| G023414 | 0.7 | 96.5 | 0.2 | G023418 | 0.7 | 96.8 | 0.3 |
| 0.23 | 92.7 | 0.4 | 0.23 | 90.8 | 1.7 | ||
| 0.08 | 74.1 | 2.7 | 0.08 | 63.3 | 1.8 | ||
| 0.03 | 45.7 | 1.5 | 0.03 | 27.7 | 2.4 | ||
| 0.009 | 13.7 | 0.7 | 0.009 | 8.8 | 0.5 | ||
| 0.003 | 4.3 | 1.3 | 0.003 | 1.9 | 0.6 | ||
| 0.001 | 0.7 | 0.1 | 0.001 | 0.7 | 0.2 | ||
| 0.0003 | 0.2 | 0.0 | 0.0003 | 0.2 | 0.1 | ||
| 0.0001 | 0.2 | 0.1 | 0.0001 | 0.1 | 0.0 | ||
| 0.00004 | 0.2 | 0.1 | 0.00004 | 0.1 | 0.0 | ||
| 0.00001 | 0.1 | 0.0 | 0.00001 | 0.1 | 0.0 | ||
| 0 | 0.1 | 0.0 | 0 | 0.2 | 0.1 | ||
| G023415 | 0.7 | 96.5 | 0.5 | G023419 | 0.7 | 96.6 | 0.6 |
| 0.23 | 92.6 | 0.7 | 0.23 | 93.4 | 1.3 | ||
| 0.08 | 73.1 | 0.2 | 0.08 | 71.1 | 3.3 | ||
| 0.03 | 34.4 | 0.8 | 0.03 | 29.0 | 4.6 | ||
| 0.009 | 14.2 | 0.2 | 0.009 | 9.7 | 4.1 | ||
| 0.003 | 3.9 | 0.4 | 0.003 | 2.3 | 0.5 | ||
| 0.001 | 0.5 | 0.2 | 0.001 | 0.4 | 0.0 | ||
| 0.0003 | 0.2 | 0.0 | 0.0003 | 0.1 | 0.0 | ||
| 0.0001 | 0.2 | 0.0 | 0.0001 | 0.2 | 0.0 | ||
| 0.00004 | 0.1 | 0.0 | 0.00004 | 0.2 | 0.0 | ||
| 0.00001 | 0.1 | 0.0 | 0.00001 | 0.1 | 0.0 | ||
| 0 | 0.1 | 0.0 | 0 | 0.1 | 0.0 |
測試在引導序列中具有化學修飾的聚乙二醇化引導RNA (pgRNA)在PMH中之兩個不同小鼠TTR區(外顯子1及外顯子3)處的編輯效率。如實例1中所描述以20,000個細胞/孔之接種密度製備PMH (In Vitro ADMET Laboratories)。Nme2 Cas9 mRNA (mRNA O；SEQ ID NO: 367)及靶向如表18中所指示之小鼠TTR中之兩個不同基因座之gRNA的脂質體轉染使用如實例1中所描述之預混合脂質組合物。使用具有100 ng/100 μl之Nme2 mRNA且具有表18中所指示濃度之gRNA的脂質複合體來處理細胞。將細胞在維持培養基 + 10% FBS (Corning #35-010-CF)中在37℃下培育72小時。培育後，分離基因體DNA且進行NGS分析，如實例1中所描述。
測定三種gRNA濃度(3 nM、8 nM或25 nM)下各種引導物修飾模式之編輯效率。分析中包括重複樣品。具有N79 pgRNA設計之測試引導物(G023066或G023067)之平均編輯結果展示於表18及圖14A至圖14B中，該設計在gRNA之目標結合區中之指定核苷酸位置處缺乏2'-OMe。表19及圖14C至圖14D展示具有末端修飾pgRNA設計之測試引導物(G023070或G023104)之平均編輯百分比，該等設計在gRNA之目標結合區中之指定核苷酸位置處具有額外2'-OMe修飾。表中之「ND」表示由於實驗失敗而無法偵測到的值。
表 18. 引導序列中之指定位置處缺乏 2'-OMe 修飾的 N79 pgRNA 之 平均編輯百分比。 ND = 由於 技術失敗未報告資料。
表 19. pgRNA 之目標結合區中之指定位置處具有額外 2'-OMe 修飾的末端修飾 pgRNA 之 平均編輯百分比。 ND = 由於 技術失敗未報告資料。
實例9. 在PMH中使用LNP之Nme2 NLS變體之劑量反應
| 基因座 | 引導物序列修飾 | 引導物 | gRNA 濃度 | |||||
| 3 nM | 8 nM | 25 nM | ||||||
| 平均編輯% | SD | 平均編輯% | SD | 平均編輯% | SD | |||
| 外顯子-1 | 高度修飾pgRNA | G023067 | ND | ND | 61.8 | 0.3 | 76.3 | 4.6 |
| 無修飾 | G023069 | 5.1 | 0.4 | 13.0 | 0.2 | 33.8 | 0.3 | |
| 末端修飾 | G023070 | 23.7 | 3.9 | 48.1 | 0.3 | 61.2 | 2.0 | |
| 位置4 | G023078 | 36.5 | 4.1 | 50.7 | 3.5 | 69.5 | 0.1 | |
| 位置5 | G023079 | 57.7 | 0.5 | 63.2 | 3.5 | 71.2 | 3.0 | |
| 位置8 | G023080 | 47.3 | 4.2 | 46.1 | 2.9 | 78.4 | 0.2 | |
| 位置9 | G023081 | 50.4 | 2.2 | 46.8 | 5.6 | 57.4 | 4.1 | |
| 位置11 | G023082 | 31.2 | 2.3 | 39.3 | 1.9 | 50.7 | 3.6 | |
| 位置13 | G023083 | 46.5 | 3.7 | 49.2 | 3.8 | 46.6 | 9.2 | |
| 位置18 | G023084 | 46.8 | 1.8 | 47.7 | 7 | 60.7 | 4.1 | |
| 位置22 | G023085 | 9.5 | 2.6 | 35.2 | 5.8 | 49.6 | 3.9 | |
| 外顯子-3 | 高度修飾pgRNA | G023066 | 38.8 | 4.0 | 79.2 | 4.2 | 88.0 | 1.0 |
| 無修飾 | G023103 | 1.3 | 0.5 | 20 | 0.2 | 37.3 | 1.6 | |
| 末端修飾 | G023104 | 20.3 | 4.7 | 50.1 | 4.9 | 62.1 | 5.1 | |
| 位置4 | G023112 | 56.7 | 3.8 | 64.3 | 3.2 | 77.2 | 2.0 | |
| 位置5 | G023113 | 41.0 | 8.9 | 68.4 | 1.3 | 81.8 | 1.8 | |
| 位置8 | G023114 | 56.3 | 2.2 | 76.8 | 14 | 87.5 | 0.5 | |
| 位置9 | G023115 | 59.5 | 9.0 | 63.6 | 1.9 | 80.8 | 0.9 | |
| 位置11 | G023116 | 49.4 | 10.3 | 49.5 | 7.1 | 67.8 | 0.2 | |
| 位置13 | G023117 | 49.0 | 9.4 | 55.1 | 5.7 | 70.3 | 1.2 | |
| 位置18 | G023118 | 52.9 | 7.3 | 56.6 | 6.0 | 74.4 | 3.4 | |
| 位置22 | G023119 | 21.7 | 4.1 | 30.5 | 3.3 | 40.8 | 1.2 |
| 基因座 | 引導物序列修飾 | 引導物 | gRNA 濃度 | |||||
| 3 nM | 8 nM | 25 nM | ||||||
| 平均編輯% | SD | 平均編輯% | SD | 平均編輯% | SD | |||
| 外顯子-1 | 高度修飾pgRNA | G023067 | ND | ND | 61.8 | 0.3 | 76.3 | 4.6 |
| 無修飾 | G023069 | 5.1 | 0.4 | 13.0 | 0.2 | 33.8 | 0.3 | |
| 末端修飾 | G023070 | 23.7 | 3.9 | 48.1 | 0.3 | 61.2 | 2.0 | |
| 位置4 | G023071 | 22.4 | 4.0 | 51.0 | 5.3 | 54.2 | 0.6 | |
| 位置5 | G023072 | 18.8 | 2.1 | 45.8 | 5.3 | 60.5 | 1.2 | |
| 位置8 | G023120 | 65.3 | 26 | 41.3 | 5.0 | 38.6 | 7.2 | |
| 位置9 | G023073 | 31.1 | 3.1 | 47.7 | 1.0 | 62.4 | 6.3 | |
| 位置11 | G023074 | 24.0 | 5.6 | 52.0 | 1.7 | 66.5 | 1.4 | |
| 位置13 | G023075 | ND | ND | 48.2 | 3.6 | 62.5 | 0.8 | |
| 位置18 | G023076 | 17.2 | 1.6 | 43.1 | 0.2 | 48.1 | 2.8 | |
| 位置22 | G023077 | 30.6 | 2.5 | 59.1 | 7.2 | ND | ND | |
| 外顯子-3 | 高度修飾pgRNA | G023066 | 38.8 | 4.0 | 79.2 | 4.2 | 88.0 | 1.0 |
| 無修飾 | G023103 | 1.3 | 0.5 | 20.0 | 0.2 | 37.3 | 1.6 | |
| 末端修飾 | G023104 | 20.3 | 4.7 | 50.1 | 4.9 | 62.1 | 5.1 | |
| 位置4 | G023105 | 7.0 | 1.4 | 52.6 | 6.8 | 51.6 | 2.2 | |
| 位置5 | G023106 | 22.8 | 4.2 | ND | ND | 63.8 | 3.4 | |
| 位置8 | G023122 | 34.6 | 5.4 | 53.2 | 6.5 | 66.9 | 1.9 | |
| 位置9 | G023107 | 19.3 | 5.1 | ND | ND | ND | ND | |
| 位置11 | G023108 | 27.1 | 7.5 | 49.6 | 6.8 | 50.5 | 0.7 | |
| 位置13 | G023109 | 13.6 | 2.8 | 41.6 | 3.4 | ND | ND | |
| 位置18 | G023110 | 25.1 | 8.8 | 46.2 | 3.9 | 54.1 | 1.1 | |
| 位置22 | G023111 | 22.3 | 6.6 | 56.8 | 1.1 | 61.2 | 3.9 |
分析具有不同NLS置放的編碼Nme2Cas9 ORF之信使mRNA在原代小鼠肝細胞(PMH)中之編輯效率。該分析測試靶向小鼠TTR基因座之引導物，且包括sgRNA及pgRNA兩種設計。
如實例1中以20,000個細胞/孔之接種密度製備PMH。LNP一般如實例1中所描述用單一RNA物種作為負荷製備，如表20中所指示。以50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比之脂質組成來製備LNP。以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。
用按RNA重量計60 ng/100 μl含有gRNA之LNP及含有如表20中所指示之mRNA之LNP來處理細胞。將細胞在含有維持補充劑及10%胎牛血清之Williams' E培養基(Gibco, A1217601)中在37℃下培育72小時。在37℃下培育72小時後，收集細胞且藉由NGS評定編輯，如實例1中所描述。平均編輯百分比資料展示於表20及圖15中。
表 20. 原代小鼠肝細胞中之小鼠 TTR 基因座處的平均編輯百分比。
實例10. 在PMH中使用LNP之Nme2 NLS變體之劑量反應
| 樣品 | mRNA LNP (ng RNA) | 平均編輯% | SD | N |
| mRNA P (2×NLS) G021536 | 40.000 | 92.30 | 0.85 | 3 |
| 13.330 | 82.67 | 1.61 | 3 | |
| 4.440 | 62.27 | 2.96 | 3 | |
| 1.480 | 32.80 | 4.54 | 3 | |
| 0.490 | 11.23 | 1.37 | 3 | |
| 0.160 | 3.40 | 0.71 | 3 | |
| 0.050 | 0.80 | 0.22 | 3 | |
| 0.018 | 0.30 | 0.08 | 3 | |
| 0.006 | 0.20 | 0.08 | 3 | |
| 0.002 | 0.13 | 0.05 | 3 | |
| 0.001 | 0.13 | 0.05 | 3 | |
| 0.000 | 0.10 | 0.00 | 3 | |
| mRNA P (2×NLS) G021844 (pgRNA) | 40.000 | 96.17 | 0.12 | 3 |
| 13.330 | 91.83 | 0.34 | 3 | |
| 4.440 | 75.37 | 6.80 | 3 | |
| 1.480 | 44.53 | 13.11 | 3 | |
| 0.490 | 18.30 | 5.77 | 3 | |
| 0.160 | 5.50 | 1.43 | 3 | |
| 0.050 | 1.63 | 0.71 | 3 | |
| 0.018 | 0.33 | 0.05 | 3 | |
| 0.006 | 0.17 | 0.05 | 3 | |
| 0.002 | 0.07 | 0.05 | 3 | |
| 0.001 | 0.10 | 0.00 | 3 | |
| 0.000 | 0.07 | 0.05 | 3 | |
| mRNA M (1×NLS) G021536 | 40.000 | 84.27 | 1.23 | 3 |
| 13.330 | 66.23 | 5.39 | 3 | |
| 4.440 | 33.80 | 5.14 | 3 | |
| 1.480 | 10.17 | 5.51 | 3 | |
| 0.490 | 4.20 | 0.92 | 3 | |
| 0.160 | 1.10 | 0.45 | 3 | |
| 0.050 | 0.33 | 0.17 | 3 | |
| 0.018 | 0.23 | 0.09 | 3 | |
| 0.006 | 0.10 | 0.00 | 3 | |
| 0.002 | 0.10 | 0.00 | 3 | |
| 0.001 | 0.10 | 0.00 | 3 | |
| 0.000 | 0.07 | 0.05 | 3 | |
| mRNA M (1×NLS) G021844 (pgRNA) | 40.000 | 88.83 | 0.37 | 3 |
| 13.330 | 74.37 | 4.63 | 3 | |
| 4.440 | 39.00 | 3.72 | 3 | |
| 1.480 | 16.40 | 2.52 | 3 | |
| 0.490 | 4.03 | 0.77 | 3 | |
| 0.160 | 1.27 | 0.05 | 3 | |
| 0.050 | 0.23 | 0.05 | 3 | |
| 0.018 | 0.20 | 0.08 | 3 | |
| 0.006 | 0.10 | 0.00 | 3 | |
| 0.002 | 0.10 | 0.00 | 3 | |
| 0.001 | 0.10 | 0.00 | 3 | |
| 0.000 | 0.10 | 0.00 | 3 |
分析具有不同NLS置放的編碼Nme2Cas9 ORF之信使mRNA在原代小鼠肝細胞(PMH)中之編輯效率。
PMH (Gibco, MC148)如實例1中所描述以20,000個細胞/孔之接種密度製備。LNP一般如實例1中所描述用單一RNA物種作為負荷製備。以50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比之脂質組成來製備LNP。以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。
用按RNA重量計30 ng/100 μl含有gRNA G021844之LNP及含有如表21中所指示之mRNA之LNP來處理細胞。將細胞在含有維持補充劑及10%胎牛血清之Williams' E培養基(Gibco, A1217601)中在37℃下培育24小時。在37℃下培育72小時後，收集細胞且藉由NGS評定編輯，如實例1中所描述。平均編輯百分比資料展示於表21及圖16中。
表 21. 用 LNP 處理之 PMH 中的 平均編輯百分比。
實例11. 使用pgRNA及mRNA LNP之活體內編輯
| mRNA | mRNA LNP (ng/μL) | 平均值 | SD | N | EC 50(ng/μL) |
| mRNA C | 0.30 | 86.30 | 4.46 | 3 | 0.0082 |
| 0.10 | 84.17 | 5.52 | |||
| 0.03 | 75.80 | 1.91 | |||
| 0.01 | 43.90 | 14.36 | |||
| 0.004 | 34.03 | 8.64 | |||
| 0.001 | 15.63 | 4.35 | |||
| 0.0004 | 6.17 | 2.41 | |||
| 0.0001 | 3.47 | 0.62 | |||
| 0.00005 | 2.37 | 0.34 | |||
| 0.00002 | 3.00 | 0.64 | |||
| 0.00001 | 2.60 | 0.57 | |||
| 0.00 | 2.70 | 0.16 | |||
| mRN J | 0.30 | 91.30 | 2.92 | 3 | 0.0053 |
| 0.10 | 89.60 | 4.23 | |||
| 0.03 | 80.93 | 8.17 | |||
| 0.01 | 62.85 | 14.35 | |||
| 0.004 | 39.95 | 5.15 | |||
| 0.001 | 16.70 | 3.79 | |||
| 0.0004 | 7.73 | 2.98 | |||
| 0.0001 | 4.23 | 0.95 | |||
| 0.00005 | 2.80 | 0.70 | |||
| 0.00002 | 3.23 | 0.54 | |||
| 0.00001 | 2.67 | 0.48 | |||
| 0.00 | 3.60 | 0.57 | |||
| mRNA Q | 0.30 | 90.67 | 4.40 | 3 | 0.0065 |
| 0.10 | 86.77 | 5.43 | |||
| 0.03 | 80.27 | 6.65 | |||
| 0.01 | 56.90 | 5.48 | |||
| 0.004 | 35.45 | 1.35 | |||
| 0.001 | 12.63 | 3.16 | |||
| 0.0004 | 5.17 | 0.56 | |||
| 0.0001 | 2.73 | 0.17 | |||
| 0.00005 | 2.97 | 0.41 | |||
| 0.00002 | 2.73 | 0.21 | |||
| 0.00001 | 2.87 | 0.56 | |||
| 0.00 | 2.43 | 0.82 | |||
| mRNA N | 0.30 | 93.93 | 2.20 | 3 | 00045 |
| 0.10 | 90.97 | 1.77 | |||
| 0.03 | 82.80 | 8.24 | |||
| 0.01 | 68.67 | 10.18 | |||
| 0.004 | 42.07 | 2.25 | |||
| 0.001 | 24.13 | 4.21 | |||
| 0.0004 | 10.60 | 0.94 | |||
| 0.0001 | 4.67 | 0.66 | |||
| 0.00005 | 3.30 | 1.84 | |||
| 0.00002 | 3.37 | 0.69 | |||
| 0.00001 | 2.53 | 0.90 | |||
| 0.00 | 2.33 | 1.48 | |||
| mRNA P | 0.30 | 94.47 | 1.04 | 3 | 0.0036 |
| 0.10 | 95.03 | 0.96 | |||
| 0.03 | 91.27 | 2.36 | |||
| 0.01 | 74.77 | 6.91 | |||
| 0.004 | 50.57 | 4.89 | |||
| 0.001 | 22.67 | 0.25 | |||
| 0.0004 | 8.27 | 0.74 | |||
| 0.0001 | 4.93 | 0.70 | |||
| 0.00005 | 3.37 | 0.74 | |||
| 0.00002 | 2.93 | 0.68 | |||
| 0.00001 | 2.87 | 0.05 | |||
| 0.00 | 2.87 | 0.45 | |||
| mRNA M | 0.30 | 92.00 | 0.80 | 3 | 0.0093 |
| 0.10 | 91.40 | 1.90 | |||
| 0.03 | 79.70 | 0.70 | |||
| 0.01 | 53.10 | 6.80 | |||
| 0.004 | 22.47 | 14.28 | |||
| 0.001 | 8.20 | 4.20 | |||
| 0.0004 | 4.57 | 1.57 | |||
| 0.0001 | 2.73 | 0.31 | |||
| 0.00005 | 3.07 | 0.21 | |||
| 0.00002 | 2.93 | 0.09 | |||
| 0.00001 | 2.77 | 0.66 | |||
| 0.00 | 3.47 | 1.09 | |||
| mRNA O | 0.30 | 89.40 | 7.00 | 3 | 0.0042 |
| 0.10 | 86.83 | 12.52 | |||
| 0.03 | 78.17 | 15.41 | |||
| 0.01 | 64.83 | 12.48 | |||
| 0.004 | 47.33 | 9.03 | |||
| 0.001 | 20.67 | 7.12 | |||
| 0.0004 | 8.60 | 2.95 | |||
| 0.0001 | 2.47 | 1.33 | |||
| 0.00005 | 4.13 | 0.37 | |||
| 0.00002 | 2.80 | 0.62 | |||
| 0.00001 | 11.13 | 231. | |||
| 0.00 | 6.13 | 2.16 |
活體內評估經修飾pgRNA之編輯效率。重複/反重複區、髮夾1及髮夾2之環中之各者中的四個核苷酸經Spacer-18 PEG連接子取代。
LNP一般如實例1中所描述用單一RNA物種作為負荷製備。LNP含有50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比。以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。
含有表22中所指示之靶向TTR基因之gRNA的LNP如上文所描述以0.1 mg/kg或0.3 mg/kg總RNA之劑量向雌性CD-1小鼠(n=5)投與。含有mRNA (mRNA M；SEQ ID NO: 365)之LNP及含有pgRNA (G021846或G021844)之LNP分別以按RNA重量計1:2之比率同時遞送。給藥後7天將小鼠安樂死。
含有所指示pgRNA之LNP的編輯效率、血清TTR阻斷及TSS百分比展示於表22中且分別繪示於圖17A至圖17C中。
表 22. 肝臟 編輯、血清 TTR 蛋白質及 TTR 蛋白質阻斷
| 引導物 | 劑量(mg/kg) | 平均編輯% | SD | 平均血清TTR (μg/ml) | SD | 平均TSS% | SD |
| TSS | NA | 0.1 | 0 | 733.1 | 131.2 | 100 | 17.9 |
| G021846 | 0.1 | 21.9 | 2.8 | 369.5 | 56.2 | 50.4 | 7.7 |
| 0.3 | 33.8 | 2.9 | 269.8 | 21.3 | 36.8 | 2.6 | |
| G021844 | 0.1 | 59.6 | 3.9 | 84.1 | 26.6 | 11.5 | 3.6 |
| 0.3 | 71.6 | 1.8 | 24.4 | 9.2 | 3.3 | 1.2 |
在不同劑量水準之替代mRNA的情況下，在小鼠中評估來自上文所描述之研究的pgRNA (G021844)。LNP一般如實例1中所描述用單一RNA物種作為負荷製備。如實例1中所描述調配含有pgRNA (G21844)或mRNA (mRNA P或mRNA M)之LNP。以50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比製備所使用LNP。以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。G000502及G021844均靶向小鼠TTR基因之外顯子3。含有pgRNA之LNP及含有mRNA之LNP基於組合RNA重量，分別以按RNA重量計2:1之引導物:mRNA比率同時給藥。額外LNP分別與按重量計1:2比率(較佳SpyCas9引導物:mRNA比率)之G000502及SpyCas9 mRNA共同調配。
具有如表23中所指示之RNA負荷的LNP以0.1 mg/kg或0.03 mg/kg總RNA之劑量向雌性CD-1小鼠(n=4)投與。含有所指示gRNA之LNP之編輯效率展示於表23中且繪示於圖17D至圖17E中。
表 23. 肝臟 編輯及血清 TTR 蛋白質阻斷
實例12. NmeCas9及sgRNA或pgRNA之活體內編輯
| 引導物 | mRNA | 劑量(mg/kg) | 平均編輯% | SD | 平均血清TTR (μg/ml) | SD |
| TSS | TSS | NA | 0.12 | 0.04 | 937.4 | 100.5 |
| G000502 | SpyCas9 | 0.1 | 44.50 | 6.9 | 370.7 | 80.1 |
| G021844 | mRNA P (SEQ ID NO: 368) | 0.03 | 37.70 | 2.9 | 398.7 | 41.9 |
| 0.1 | 65.40 | 2.2 | 92.8 | 27.5 | ||
| mRNA M (SEQ ID NO: 365) | 0.03 | 32.02 | 2.1 | 527.4 | 93.6 | |
| 0.1 | 62.50 | 17.4 | 268.6 | 236.8 |
在小鼠模型中測試用Nme2Cas9測試的經修飾pgRNA之編輯效率。所測試之所有Nme sgRNA皆包含靶向mTTR之相同24核苷酸引導序列。
LNP一般如實例1中所描述用單一RNA物種作為負荷製備。以50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比製備所使用LNP。以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。LNP以按gRNA與mRNA負荷之重量計2:1之比率混合。劑量係基於gRNA及mRNA之組合RNA重量計算。用於LNP製備之運輸及儲存溶液(TSS)在實驗中作為僅媒劑陰性對照給藥。
將6至10週齡範圍內之CD-1雌性小鼠用於涉及小鼠之各研究中(除了TSS對照n = 4之外，n = 5/組)。根據表24中所列出之劑量，經由尾部靜脈注射靜脈內投與調配物。在給藥後至少24小時，定期觀測動物之不良反應。處理之後六天，在異氟醚麻醉下藉由心臟穿刺將動物安樂死；收集肝臟組織用於下游分析。收集重量在5與15 mg之間的肝臟穿孔以分離基因體DNA及總RNA。用NGS定序分析基因體DNA樣品，如實例1中所描述。含有所指示mRNA及gRNA之LNP之編輯效率展示於表24中且繪示於圖18中。
表 24 . 小鼠肝臟中之平均編輯百分比
實例13. gRNA之活體內鹼基編輯
| mRNA | gRNA | 劑量(mg/kg) | 平均編輯% | SD | N |
| TSS | TSS | - | 0.08 | 0.05 | 4 |
| mRNA P (2× N term NLS, HiBit) | G021536 (101-nt Nme sgRNA) | 0.03 | 21.68 | 6.87 | 5 |
| 0.1 | 63.22 | 3.28 | 5 | ||
| mRNA P (2× N term NLS, HiBit) | G021844 (93-nt Nme pgRNA) | 0.03 | 36.28 | 9.45 | 5 |
| 0.1 | 66.44 | 3.55 | 5 | ||
| mRNA O (2 × N-term NLS) | G021844 (93-nt Nme pgRNA) | 0.03 | 40.88 | 14.16 | 5 |
| 0.1 | 66.02 | 5.01 | 5 |
在小鼠模型中用Nme鹼基編輯器構築體測試具有不同mRNA之經修飾gRNA的編輯效率。LNP一般如實例1中所描述用單一RNA物種作為負荷製備。以50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之莫耳比製備所使用LNP。以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。LNP如實例1中所描述調配，不同之處在於各組分、引導RNA或mRNA個別地調配於LNP中，且LNP在投與之前混合，如表25中所描述。對於Nme2Cas9及Nme2Cas9鹼基編輯器樣品，LNP以按gRNA與編輯器mRNA負荷之重量計2:1之比率混合。對於SpyCas9鹼基編輯器樣品，LNP以按gRNA與編輯器mRNA負荷之重量計1:2之比率混合。如表31及圖14中所指示之劑量係基於gRNA與編輯器mRNA之組合RNA重量計算。用額外0.03 mg/kg UGI mRNA處理鹼基編輯器樣品。用於LNP製備之運輸及儲存溶液(TSS)在實驗中作為僅媒劑陰性對照給藥。
將6至10週齡範圍內之CD-1雌性小鼠用於涉及小鼠之各研究中(除了TSS對照n = 4之外，n = 5/組)。根據表25中所列出之劑量，經由尾部靜脈注射靜脈內投與調配物。在給藥後至少24小時，定期觀測動物之不良反應。處理之後六天，在異氟醚麻醉下藉由心臟穿刺將動物安樂死；收集肝臟組織用於下游分析。收集重量在5與15 mg之間的肝臟穿孔以分離基因體DNA及總RNA。使用DNA分離套組(ZymoResearch, D3010)提取基因體DNA且用NGS定序分析樣品，如實例1中所描述。含有所指示gRNA之LNP之編輯效率展示於表25中且繪示於圖19中。
表 25. 小鼠肝臟中之平均編輯百分比
實例14. 使用經修飾之pgRNA在人類肝細胞瘤細胞中之活體外編輯
| 樣品 | 劑量(mg/kg) | C 變T % | C 變A/G % | 插入缺失% | ||||||
| 平均值 | SD | n | 平均值 | SD | n | 平均值 | SD | n | ||
| TSS | 0 | 0.00 | 0.00 | 4 | 0.10 | 0.00 | 4 | 0.08 | 0.05 | 4 |
| mRNA O + G021844 (Nme2Cas9 + pgRNA) | 0.03 | 0.00 | 0.00 | 5 | 0.08 | 0.04 | 5 | 40.88 | 14.16 | 5 |
| 0.1 | 0.00 | 0.00 | 5 | 0.02 | 0.04 | 5 | 66.02 | 5.01 | 5 | |
| mRNA S + mRNA G + G021844 (Nme2鹼基編輯器 + UGI + pgRNA) | 0.03 | 25.60 | 5.28 | 5 | 3.50 | 0.76 | 5 | 11.14 | 2.18 | 5 |
| 0.1 | 46.34 | 1.53 | 5 | 5.74 | 0.33 | 5 | 13.52 | 0.90 | 5 | |
| mRNA E + mRNA G + G000502 (SpyBC22n + UGI + sgRNA) | 0.03 | 9.28 | 2.82 | 5 | 0.94 | 0.54 | 5 | 7.34 | 1.61 | 5 |
| 0.1 | 30.72 | 8.51 | 5 | 2.86 | 0.23 | 5 | 15.60 | 2.58 | 5 |
具有各種骨架序列的靶向HEK3基因體基因座中之相同目標序列的引導RNA經設計成具有如表2B中所示之上莖之截短。gRNA經脂質體轉染至人類肝細胞瘤(Huh7)細胞中以如下測定編輯效率。以15,000個細胞/孔之密度接種細胞。使用Lipofectamine™ MessengerMAX™試劑(Thermofisher)，且根據製造商之方案用50 ng SpyCas9 mRNA (SEQ ID NO: 323)/反應物及初始50 nM引導物濃度來製備樣品。各引導RNA經5倍連續稀釋以用於6點劑量反應。分析中包括重複樣品。具有標準差(SD)之平均編輯結果展示於表26及圖20中。
表 26. Huh7 細胞中之活體外編輯
實例15. 額外實施例
| 引導物ID | gRNA (nM) | ||||||
| 0.016 | 0.08 | 0.4 | 2 | 10 | 50 | ||
| G030924 | 插入缺失% | 79.40 | 80.45 | 84.95 | 78.00 | 89.35 | 76.65 |
| SD | 0.71 | 3.18 | 0.21 | 11.88 | 1.91 | 1.77 | |
| G030925 | 插入缺失% | 81.00 | 83.75 | 86.95 | 90.00 | 90.20 | 76.50 |
| SD | 2.83 | 1.48 | 0.49 | 0.42 | 1.70 | 3.54 | |
| G030926 | 插入缺失% | 85.30 | 87.90 | 89.70 | 91.85 | 92.80 | 77.80 |
| SD | 1.98 | 1.27 | 0.28 | 0.21 | 0.14 | 2.12 | |
| G030927 | 插入缺失% | 82.05 | 85.80 | 87.40 | 88.90 | 90.90 | 79.00 |
| SD | 4.45 | 1.56 | 1.70 | 0.57 | 0.57 | -0.99% | |
| G030928 | 插入缺失% | 66.70 | 78.15 | 81.25 | 85.35 | 88.15 | 80.45 |
| SD | 3.25 | 0.64 | 3.18 | 2.05 | 0.35 | 2.19 | |
| G030929 | 插入缺失% | 74.60 | 88.00 | 80.85 | 82.55 | 84.25 | 79.65 |
| SD | 2.83 | 16.97 | 4.31 | 1.48 | 1.06 | 1.63 | |
| G025989 | 插入缺失% | 80.60 | 81.90 | 84.90 | 87.35 | 88.90 | 74.40 |
| SD | 1.27 | 2.26 | 0.85 | 1.06 | 0.14 | 0.71 | |
| G030930 | 插入缺失% | 75.25 | 79.60 | 80.90 | 83.05 | 86.15 | 72.45 |
| SD | 0.21 | 2.26 | 3.11 | 0.64 | 0.21 | 2.33 |
以下編號條項提供對本文實施例之額外支持及描述。
條項1為一種引導RNA (gRNA)，其包含內部連接子。
條項2為如條項1之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28個核苷酸。
條項3為如條項1或2之gRNA，其中該內部連接子具有約3至30個原子、視情況12至21個原子之橋接長度，且該連接子取代該gRNA之至少2個核苷酸。
條項4為如條項1至3中任一項之gRNA，其中該內部連接子具有約6至18個原子、視情況約6至12個原子之橋接長度，且該連接子取代該gRNA之至少2個核苷酸。
條項5為如條項1至4中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代2至12個核苷酸。
條項6為如條項1至5中任一項之gRNA，其中該內部連接子位於該gRNA之重複反重複區中。
條項7為如條項1至6中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該重複反重複區的至少4個核苷酸。
條項8為如條項1至7中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該重複反重複區的多至28個核苷酸。
條項9為如條項1至8中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該重複反重複區的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。
條項10為如條項1至9中任一項之gRNA，其中該內部連接子位於該gRNA之髮夾區中。
條項11為如條項1至10中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該髮夾區的至少2個核苷酸。
條項12為如條項1至11中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該髮夾區的至多22個核苷酸。
條項13為如條項1至12中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該髮夾區的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個核苷酸。
條項14為如條項1至13中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該髮夾區的1、2、3、4、5、6、7、8或9個鹼基對。
條項15為如條項1至14中任一項之gRNA，其中該內部連接子位於該gRNA之連接區中。
條項16為如條項1至15中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該連接區的1或2個核苷酸。
條項17為如條項1至16中任一項之gRNA，其中該內部連接子位於該gRNA之第一部分與該gRNA之第二部分之間的髮夾中，其中該第一部分及該第二部分一起形成雙螺旋部分。
條項18為如條項1至17中任一項之gRNA，其中該內部連接子橋接雙螺旋體之第一部分與雙螺旋體之第二部分，其中該雙螺旋體包含2至10個鹼基對。
條項19為如條項1至18中任一項之gRNA，其中該gRNA包含兩個內部連接子。
條項20為如條項1至18中任一項之gRNA，其中該gRNA包含三個內部連接子。
條項21為如條項1至20中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子位於該重複反重複區之第一部分與第二部分之間的髮夾中，其中該第一部分及該第二部分一起形成雙螺旋部分。
條項22為如條項21之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28個核苷酸。
條項23為如條項21至22中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之至少4個核苷酸。
條項24為如條項21至23中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之至多28個核苷酸。
條項25為如條項21至24中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之4至20個核苷酸。
條項26為如條項21至25中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之4至14個核苷酸。
條項27為如條項21至26中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之4至6個核苷酸。
條項28為如條項21至27中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之環或其部分。
條項29為如條項21至28中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之該環及莖或其部分。
條項30為如條項21至27中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之該環的2、3或4個核苷酸。
條項31為如條項21至27中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的至少1個核苷酸。
條項32為如條項21至31中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個核苷酸。
條項33為如條項21至32中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的至少2個核苷酸。
條項34為如條項21至32中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的1、2、3、4、5、6、7或8個核苷酸。
條項35為如條項21至32中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個鹼基對。
條項36為如條項21至32中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代構成該髮夾之該環的所有核苷酸。
條項37為如條項21至32中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代構成該髮夾之該環及莖的所有核苷酸。
條項38為如條項1至37中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該連接區的1或2個核苷酸。
條項39為如條項1至38中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之髮夾。
條項40為如條項39之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個核苷酸。
條項41為如條項39至40中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之2至22個核苷酸。
條項42為如條項39至41中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之2至12個核苷酸。
條項43為如條項39至42中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之2至6個核苷酸。
條項44為如條項39至43中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之2至4個核苷酸。
條項45為如條項39至44中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之環或其部分。
條項46為如條項39至45中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之該環及莖或其部分。
條項47為如條項39至46中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之該環的2、3、4或5個核苷酸。
條項48為如條項39至47中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的至少1個核苷酸。
條項49為如條項39至48中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸。
條項50為如條項39至49中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的至少2個核苷酸。
條項51為如條項39至50中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的至多18個核苷酸。
條項52為如條項39至51中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾之莖的1、2、3、4、5、6、7、8或9個鹼基對。
條項53為如條項39至52中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代構成該髮夾之該環的所有核苷酸。
條項54為如條項39至53中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代構成該髮夾之該環及莖的所有核苷酸。
條項55為如條項39至54中任一項之gRNA，其中該髮夾為髮夾1。
條項56為如條項39至54中任一項之gRNA，其中該髮夾為髮夾2。
條項57為如條項39至54中任一項之gRNA，其中該髮夾為髮夾1，且該內部連接子取代該髮夾1。
條項58為如條項57之gRNA，其中該gRNA進一步包含該髮夾1之3'的髮夾2。
條項59為如條項58之gRNA，其中該內部連接子取代該髮夾2之環的至少2個核苷酸。
條項60為如條項58或59之gRNA，其中該內部連接子不取代該髮夾2。
條項61為如條項1至60中任一項之gRNA，其進一步包含引導區。
條項62為如條項61之gRNA，其中該引導區之長度為17、18、19或20個核苷酸。
條項63為如條項1至62中任一項之gRNA，其中該gRNA為單引導RNA (sgRNA)。
條項64為如條項1至62中任一項之gRNA，其中該gRNA包含tracrRNA (trRNA)。
條項65為一種引導RNA (gRNA)，其中該gRNA為單引導RNA (sgRNA)，其包含引導區及該引導區之3'的保守部分，其中該保守部分包含重複反重複區、連接區、髮夾1區及髮夾2區，且包含以下中之至少一者：
1) 第一內部連接子，其取代該重複反重複區之上莖區的至少2個核苷酸；
2) 第二內部連接子，其取代該連接區之1或2個核苷酸；及
3) 第三內部連接子，其取代該髮夾1之至少2個核苷酸。
條項66為如條項65之gRNA，其中該sgRNA包含該第一內部連接子及該第二內部連接子。
條項67為如條項65之gRNA，其中該sgRNA包含該第一內部連接子及該第三內部連接子。
條項68為如條項65之gRNA，其中該sgRNA包含該第二內部連接子及該第三內部連接子。
條項69為如條項65之gRNA，其中該sgRNA包含該第一內部連接子、該第二內部連接子及該第三內部連接子。
條項70為如條項65至69中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子具有約9至30個原子、視情況約15至21個原子之橋接長度。
條項71為如條項65至70中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。
條項72為如條項65至71中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之環或其部分。
條項73為如條項65至72中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之該環及莖或其部分。
條項74為如條項65至73中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之該環的2、3或4個核苷酸。
條項75為如條項65至74中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之該環及該上莖區之莖的至少2、3、4、5、6、7或8個核苷酸。
條項76為如條項65至75中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之該環及該上莖區之莖的1、2、3或4個鹼基對。
條項77為如條項65至76中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代構成該上莖區之該環的所有核苷酸。
條項78為如條項65至77中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代構成該上莖區之該環及莖的所有核苷酸。
條項79為如條項65至78中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子具有約6至18個原子、視情況約6至12個原子之橋接長度。
條項80為如條項65至79中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子取代該sgRNA之該連接區的2個核苷酸。
條項81為如條項65至80中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子取代該sgRNA之該連接區之環的2個核苷酸。
條項82為如條項65至81中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子具有約9至30個、視情況約12至21個原子之橋接長度。
條項83為如條項65至82中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代該gRNA之該髮夾1的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。
條項84為如條項65至83中任一項之gRNA，其中該第三連接子取代該gRNA之該髮夾1的1、2、3、4或5個鹼基對。
條項85為如條項65至84中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾1之環或其部分。
條項86為如條項65至85中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾1之該環及莖或其部分。
條項87為如條項65至86中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾1之該環的2、3或4個核苷酸。
條項88為如條項65至87中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾1之莖的至少1個核苷酸。
條項89為如條項65至88中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾1之莖的2、4或6個核苷酸。
條項90為如條項65至89中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該第三內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾1之莖的1、2或3個鹼基對。
條項91為如條項65至90中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代構成該髮夾1之該環的所有核苷酸。
條項92為如條項65至91中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代構成該髮夾1之該環及莖的所有核苷酸。
條項93為如條項65至92中任一項之gRNA，其中該sgRNA之該髮夾2區不含有任何內部連接子。
條項94為如條項65至93中任一項之gRNA，其中該sgRNA為化膿鏈球菌Cas9 sgRNA。
條項95為如條項65至94中任一項之gRNA，其中該sgRNA包含含有SEQ ID NO: 400之序列的保守部分。
條項96為如條項95之gRNA，其中核苷酸13至16 (該上莖區之US5至US8)中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 400經該第一內部連接子取代。
條項97為如條項95至96中任一項之gRNA，其中核苷酸12至17 (該上莖區之US4至US9)相對於SEQ ID NO: 400經該第一內部連接子取代。
條項98為如條項95至97中任一項之gRNA，其中核苷酸11至18 (該上莖區之US3至US10)相對於SEQ ID NO: 400經該第一內部連接子取代。
條項99為如條項95至98中任一項之gRNA，其中核苷酸10至19 (該上莖區之US2至US11)相對於SEQ ID NO: 400經該第一內部連接子取代。
條項100為如條項95至99中任一項之gRNA，其中核苷酸9至20 (該上莖區之US1至US10)相對於SEQ ID NO: 400經該第一內部連接子取代。
條項101為如條項95至100中任一項之gRNA，其中核苷酸36至37 (該連接區之N6至N7)相對於SEQ ID NO: 400經該第二內部連接子取代。
條項102為如條項95至101中任一項之gRNA，其中核苷酸53至56 (該髮夾1之H1-5至H1-8)中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 400經該第三內部連接子取代。
條項103為如條項95至102中任一項之gRNA，其中核苷酸52至57 (該髮夾1之H1-4至H1-9)相對於SEQ ID NO: 400經該第三內部連接子取代。
條項104為如條項95至103中任一項之gRNA，其中核苷酸51至58 (該髮夾1之H1-3至H1-10)相對於SEQ ID NO: 400經該第三內部連接子取代。
條項105為如條項95至104中任一項之gRNA，其中核苷酸50至59 (該髮夾1之H1-1至H1-12)相對於SEQ ID NO: 400經該第三內部連接子取代。
條項106為如條項95至105中任一項之gRNA，其中核苷酸77至80相對於SEQ ID NO: 400缺失。
條項107為如條項65至94中任一項之gRNA，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 201之序列。
條項108為如條項107之gRNA，其中核苷酸33至36中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 201經該第一內部連接子取代。
條項109為如條項107至108中任一項之gRNA，其中核苷酸32至37相對於SEQ ID NO: 201經該第一內部連接子取代。
條項110為如條項107至109中任一項之gRNA，其中核苷酸31至38相對於SEQ ID NO: 201經該第一內部連接子取代。
條項111為如條項107至110中任一項之gRNA，其中核苷酸30至39相對於SEQ ID NO: 201經該第一內部連接子取代。
條項112為如條項107至111中任一項之gRNA，其中核苷酸29至40相對於SEQ ID NO: 201經該第一內部連接子取代。
條項113為如條項107至112中任一項之gRNA，其中核苷酸55至56相對於SEQ ID NO: 201經該第二內部連接子取代。
條項114為如條項107至113中任一項之gRNA，其中核苷酸50至53中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 201經該第三內部連接子取代。
條項115為如條項107至114中任一項之gRNA，其中核苷酸49至54相對於SEQ ID NO: 201經該第三內部連接子取代。
條項116為如條項107至115中任一項之gRNA，其中核苷酸77至80相對於SEQ ID NO: 201缺失。
條項117為一種引導RNA (gRNA)，其中該gRNA為單引導RNA (sgRNA)，其包含引導區及該引導區之3'的保守部分，其中保守部分包含重複反重複區、髮夾1區及髮夾2區，且進一步包含以下中之至少一者：
1) 第一內部連接子，其取代該sgRNA之該重複反重複區之上莖區的至少2個核苷酸；
2) 第二內部連接子，其取代該sgRNA之該髮夾1的1或2個核苷酸；或
3) 第三內部連接子，其取代該sgRNA之該髮夾2的至少2個核苷酸。
條項118為如條項117之gRNA，其中該sgRNA包含該第一內部連接子及該第二內部連接子。
條項119為如條項117之gRNA，其中該sgRNA包含該第一內部連接子及該第三內部連接子。
條項120為如條項117之gRNA，其中該sgRNA包含該第二內部連接子及該第三內部連接子。
條項121為如條項117之gRNA，其中該sgRNA包含該第一內部連接子、該第二內部連接子及該第三內部連接子。
條項122為如條項117至121中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子具有約9至30個原子、視情況約15至21個原子之橋接長度。
條項123為如條項117至122中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子位於該sgRNA之第一部分與該sgRNA之第二部分之間的髮夾中，其中該第一部分及該第二部分一起形成雙螺旋部分。
條項124為如條項117至123中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。
條項125為如條項117至124中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之環或其部分。
條項126為如條項117至125中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之該環及莖或其部分。
條項127為如條項117至126中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之該環的2、3或4個核苷酸。
條項128為如條項117至127中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之該環及該上莖區之莖的至少2、4、6或8個核苷酸。
條項129為如條項117至128中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之該環及該上莖區之莖的1、2、3或4個鹼基對。
條項130為如條項117至129中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代構成該上莖區之該環的所有核苷酸。
條項131為如條項117至130中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代構成該上莖區之該環及莖的所有核苷酸。
條項132為如條項117至131中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子具有約6至18個原子、視情況約6至12個原子之橋接長度。
條項133為如條項117至132中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子取代該sgRNA之該髮夾1的2個核苷酸。
條項134為如條項117至133中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子取代該sgRNA之該連接區之莖區的2個核苷酸。
條項135為如條項117至134中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子具有約9至30個、視情況約12至21個原子之橋接長度。
條項136為如條項117至135中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代該gRNA之該髮夾2的4、6、8、10或12個核苷酸。
條項137為如條項117至136中任一項之gRNA，其中該第三連接子取代該gRNA之該髮夾2的1、2、3、4或5個鹼基對。
條項138為如條項117至137中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾2之環或其部分。
條項139為如條項117至138中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾2之該環及莖或其部分。
條項140為如條項117至139中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾2之該環的2、3或4個核苷酸。
條項141為如條項117至140中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾2之莖的至少1個核苷酸。
條項142為如條項117至141中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾2之莖的2、4或6個核苷酸。
條項143為如條項117至142中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之該第三內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾2之莖的1、2或3個鹼基對。
條項144為如條項117至143中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代構成該髮夾2之該環的所有核苷酸。
條項145為如條項117至144中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子位於該sgRNA之第一部分與該sgRNA之第二部分之間的髮夾中，其中該第一部分及該第二部分一起形成雙螺旋部分。
條項146為如條項117至145中任一項之gRNA，其中該gRNA為金黃色葡萄球菌Cas9 (SauCas9)引導RNA，且不包括該第三內部連接子。
條項147為如條項117至146中任一項之gRNA，其中該gRNA為白喉棒狀桿菌Cas9 (CdiCas9)引導RNA、嗜熱鏈球菌Cas9 (St1Cas9)引導RNA或解纖維熱酸菌Cas9 (AceCas9)引導RNA。
條項148為如條項117至147中任一項之gRNA，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 202之序列。
條項149為如條項148之gRNA，其中核苷酸35至38中之22、3或4者相對於SEQ ID NO: 202經該第一內部連接子取代。
條項150為如條項148至149中任一項之gRNA，其中核苷酸34至39相對於SEQ ID NO: 202經該第一內部連接子取代。
條項151為如條項148至150中任一項之gRNA，其中核苷酸33至40相對於SEQ ID NO: 202經該第一內部連接子取代。
條項152為如條項148至151中任一項之gRNA，其中核苷酸32至41相對於SEQ ID NO: 202經該第一內部連接子取代。
條項153為如條項148至152中任一項之gRNA，其中核苷酸31至42相對於SEQ ID NO: 202經該第一內部連接子取代。
條項154為如條項148至153中任一項之gRNA，其中核苷酸61至62相對於SEQ ID NO: 202經該第二內部連接子取代。
條項155為如條項148至154中任一項之gRNA，其中核苷酸84至87中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 202經該第三內部連接子取代。
條項156為如條項148至155中任一項之gRNA，其中核苷酸83至88相對於SEQ ID NO: 202經該第三內部連接子取代。
條項157為如條項148至156中任一項之gRNA，其中核苷酸82至89相對於SEQ ID NO: 202經該第三內部連接子取代。
條項158為如條項148至157中任一項之gRNA，其中核苷酸81至90相對於SEQ ID NO: 202經該第三內部連接子取代。
條項159為如條項148至158中任一項之gRNA，其中核苷酸97至100相對於SEQ ID NO: 202缺失。
條項160為一種引導RNA (gRNA)，其包含引導區及該引導區之3'的保守部分，其中該保守部分包含重複反重複區、髮夾1區及髮夾2區，且包含取代該重複反重複區之至少2個核苷酸的第一內部連接子及取代該髮夾2之至少2個核苷酸的第二內部連接子。
條項161為如條項160之gRNA，其中該第一內部連接子具有約9至30個原子、視情況約15至21個原子之橋接長度。
條項162為如條項160至161中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該gRNA之該重複反重複區的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸。
條項163為如條項160至162中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子位於該sgRNA之第一部分與該重複反重複區之第二部分之間的髮夾中，其中該第一部分及該第二部分一起形成雙螺旋部分。
條項164為如條項160至163中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該重複反重複區之該髮夾的環或其部分。
條項165為如條項160至164中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該重複反重複區之該髮夾的該環及莖或其部分。
條項166為如條項160至165中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該重複反重複區之該髮夾之該環的1、2、3或4個核苷酸。
條項167為如條項160至166中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該髮夾之該環及該重複反重複區之該髮夾之上莖的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個核苷酸。
條項168為如條項160至167中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該髮夾之該環及該重複反重複區之該髮夾之上莖的1、2、3、4、5、6或7個鹼基對。
條項169為如條項160至168中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代構成該重複反重複區之該髮夾之該環的所有核苷酸。
條項170為如條項160至169中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代構成該重複反重複區之該髮夾之該環及上莖的所有核苷酸。
條項171為如條項160至169中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代構成該重複反重複區之該環的所有核苷酸；且該重複反重複區之該髮夾之上莖包含至少一個鹼基對，或不超過一個、兩個或三個鹼基對。
條項172為如條項160至171中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子具有約9至30個、視情況約12至21個原子之橋接長度。
條項173為如條項160至172中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子取代該gRNA之該髮夾2的2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。
條項174為如條項160至173中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子取代該髮夾2之環區。
條項175為如條項160至174中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子取代該髮夾2之環區及莖區之部分。
條項176為如條項160至175中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子取代該髮夾2之環或其部分。
條項177為如條項160至176中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子取代該髮夾2之該環及莖或其部分。
條項178為如條項160至177中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子取代該髮夾2之該環的2、3或4個核苷酸。
條項179為如條項160至178中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子取代構成該髮夾2之該環的所有核苷酸。
條項180為如條項160至179中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子取代該髮夾2之該環及該髮夾2之莖的至少1、2、3、4、5或6個核苷酸。
條項181為如條項160至180中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子取代該髮夾之該環及該髮夾2之莖的1、2或3個鹼基對。
條項182為如條項160至181中任一項之gRNA，其中該gRNA為St1Cas9引導RNA。
條項183為如條項160至182中任一項之gRNA，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 204之序列。
條項184為如條項183之gRNA，其中核苷酸41至44相對於SEQ ID NO: 204經該第一內部連接子取代。
條項185為如條項183至184中任一項之gRNA，其中核苷酸101至103相對於SEQ ID NO: 204經該第二內部連接子取代。
條項186為如條項183至185中任一項之gRNA，其中核苷酸100至104相對於SEQ ID NO: 204經該第二內部連接子取代。
條項187為如條項183至186中任一項之gRNA，其中核苷酸99至105相對於SEQ ID NO: 204經該第二內部連接子取代。
條項188為如條項183至187中任一項之gRNA，其中核苷酸98至106相對於SEQ ID NO: 204經該第二內部連接子取代。
條項189為如條項183至188中任一項之gRNA，其中核苷酸94至111內之2至18個核苷酸相對於SEQ ID NO: 204經取代。
條項190為一種引導RNA (gRNA)，其包含引導區及該引導區之3'的保守部分，其中該保守部分包含重複反重複區及髮夾區，且包含取代該重複反重複區之至少2個核苷酸的內部連接子。
條項191為如條項190之gRNA，其中該第一內部連接子具有約9至30個原子、視情況約12至21個原子之橋接長度。
條項192為如條項190或191中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該gRNA之該重複反重複區的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。
條項193為如條項190至192中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子位於該sgRNA之第一部分與該重複反重複區之第二部分之間的髮夾中，其中該第一部分及該第二部分一起形成雙螺旋部分。
條項194為如條項190至193中任一項之gRNA，其中該gRNA為空腸彎曲桿菌Cas9 (CjeCas9)引導RNA。
條項195為如條項190至194中任一項之gRNA，其中該gRNA為CjeCas9引導RNA，且該內部連接子僅存在於該gRNA之該重複反重複區中。
條項196為如條項190至195中任一項之gRNA，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 207之序列。
條項197為如條項196之gRNA，其中核苷酸33至36相對於SEQ ID NO: 207經該內部連接子取代。
條項198為如條項196至197中任一項之gRNA，其中核苷酸27至32及37至42中之1、2、3、4、5或6個鹼基對相對於SEQ ID NO: 207經該內部連接子取代。
條項199為如條項190至193中任一項之gRNA，其中該gRNA為新兇手弗朗西斯氏菌Cas9 (FnoCas9)引導RNA。
條項200為如條項199之gRNA，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 208之序列。
條項201為如條項200之gRNA，其中核苷酸40至43中之2、3或4者相對於SEQ ID NO: 208經該內部連接子取代。
條項202為如條項200至201中任一項之gRNA，其中核苷酸39至44相對於SEQ ID NO: 208經該內部連接子取代。
條項203為一種引導RNA (gRNA)，其包含重複反重複區及取代該重複反重複區之至少2個核苷酸的內部連接子。
條項204為如條項203之gRNA，其中該內部連接子具有約9至30個原子、視情況約15至21個原子之橋接長度。
條項205為如條項203至204中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之該重複反重複區的2、3、4、5或6個核苷酸。
條項206為如條項203至205中任一項之組合物，其中該gRNA為Cpf1引導RNA。
條項207為如條項206之組合物，其中該Cpf1引導RNA為毛螺旋菌Cpf1 (LbCpf1)引導RNA或胺基酸球菌屬Cpf1 (AsCpf1)引導RNA。
條項208為如條項203至207中任一項之gRNA，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 209之序列，且核苷酸11至14、或12至15、或視情況12至14相對於SEQ ID NO: 209經該內部連接子取代。
條項209為如條項203至205中任一項之組合物，其中該引導RNA為惰性真桿菌(EsCas13d)引導RNA。
條項210為如條項203至205及209中任一項之gRNA，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 210之序列，且核苷酸9至16、或視情況10至15、或其至少2個核苷酸相對於SEQ ID NO: 210經該內部連接子取代。
條項N211為如條項1之gRNA，其中該內部連接子為第一內部連接子、第二內部連接子或第三內部連接子；且該gRNA包含引導區及保守區，該保守區包含以下中之一或多者：
(a)經縮短之重複/反重複區，其中該經縮短之重複/反重複區缺乏2至24個核苷酸，其中
(i)核苷酸37至64中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸36藉由第一內部連接子連接至核苷酸65，該第一內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸；或
(b)經縮短之髮夾1區，其中該經縮短之髮夾1缺乏2至10個、視情況2至8個核苷酸，其中
(i)核苷酸82至95中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸81藉由第二內部連接子連接至核苷酸96，該第二內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸；或
(c)經縮短之髮夾2區，其中該經縮短之髮夾2缺乏2至18個、視情況2至16個核苷酸，其中
(i)核苷酸113至134中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸112藉由第三內部連接子連接至核苷酸135，該第三內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸；
其中核苷酸144至145中之一者或兩者相比於SEQ ID NO: 500視情況缺失。
條項N212為一種引導RNA (gRNA)，其包含引導區及保守區，該保守區包含以下中之一或多者：
(a)經縮短之重複/反重複區，其中該經縮短之重複/反重複區缺乏2至24個核苷酸，其中
(i)核苷酸37至64中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸36藉由第一內部連接子連接至核苷酸65，該第一內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸；或
(b)經縮短之髮夾1區，其中該經縮短之髮夾1缺乏2至10個、視情況2至8個核苷酸，其中
(i)核苷酸82至95中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸81藉由第二內部連接子連接至核苷酸96，該第二內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸；或
(c)經縮短之髮夾2區，其中該經縮短之髮夾2缺乏2至18個、視情況2至16個核苷酸，其中
(i)核苷酸113至134中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失且視情況經取代；且
(ii)核苷酸112藉由第三內部連接子連接至核苷酸135，該第三內部連接子單獨或與核苷酸組合取代(i) 4個核苷酸或(ii)至少4個核苷酸；
其中核苷酸144至145中之一者或兩者相比於SEQ ID NO: 500視情況缺失；
其中該gRNA包含該第一內部連接子、該第二內部連接子及該第三內部連接子中之至少一者。
條項N213為如條項N211或N212之gRNA，其中該gRNA包含該第一內部連接子、該第二內部連接子及該第三內部連接子中之至少兩者。
條項N214為如條項N211至N213中任一項之gRNA，其中該gRNA包含該第一內部連接子、該第二內部連接子及該第三內部連接子。
條項N215為如條項N211至N214中任一項之gRNA，其中至少10個核苷酸為經修飾核苷酸。
條項N216為如條項N211至N215中任一項之gRNA，其中該引導區具有(i)相對於SEQ ID NO: 500，位置1至24內一個核苷酸之插入或1至4個核苷酸之缺失；或(ii) 24個核苷酸之長度。
條項N217為如條項N211至N216中任一項之gRNA，其中該引導區具有25、24、23、22、21或20個核苷酸之長度，視情況其中該引導區具有SEQ ID NO: 500之位置1至24處之25、24、23或22個核苷酸之長度。
條項N218為如條項N217之gRNA，其中該引導區具有SEQ ID NO: 500之位置1至24處之23或24個核苷酸之長度。
條項N219為如條項N211至N218中任一項之gRNA，其中該gRNA進一步包含3'尾。
條項N220為如條項N219之gRNA，其中該3'尾包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。
條項N221為如條項N220之gRNA，其中該3'尾包含1、2、3、4或5個核苷酸。
條項N222為如條項N219至N221中任一項之gRNA，其中該3'尾以包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸終止。
條項N223為如條項N219至N222中任一項之gRNA，其中該3'尾之長度為1個核苷酸。
條項N224為如條項N219至N223中任一項之gRNA，其中該3'尾由包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸組成。
條項N225為如條項N219至N224中任一項之gRNA，其中該3'尾包含存在於該3'尾中之核苷酸中之任一者或多者的修飾。
條項N226為如條項N219至N225中任一項之gRNA，其中該3'尾之該修飾為2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸及核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯中之一或多者。
條項N227為如前述條項N219至N226中任一項之gRNA，其中該3'尾經完全修飾。
條項N228為如條項N211至N227中任一項之gRNA，其中該gRNA之3'核苷酸為包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸。
條項N229為如條項N211至N228中任一項之gRNA，其中核苷酸144及145中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500缺失。
條項N230為如條項N211至N229中任一項之gRNA，其中核苷酸144及145相對於SEQ ID NO: 500均缺失。
條項N231為如條項N211至N218中任一項之gRNA，其中該gRNA不包含3'尾。
條項N232為如條項N211至N231中任一項之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區缺乏2至28個核苷酸。
條項N233為如條項N211至N232中任一項之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區具有24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸之長度。
條項N234為如條項N211至N233中任一項之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區缺乏12至28個、視情況18至24個核苷酸。
條項N235為如條項N211至N234中任一項之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區具有24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸之長度。
條項N236為如條項N211至N235中任一項之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區具有24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34個核苷酸之長度。
條項N237為如條項N211至N236中任一項之gRNA，其中SEQ ID NO: 500之核苷酸37至64形成上莖，且該經縮短之重複/反重複區之上莖的一或多個鹼基對缺失。
條項N238為如條項N211至N237中任一項之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區之上莖包含不超過一個、兩個、三個或四個鹼基對。
條項N239為如條項N211至N238中任一項之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區之上莖的位置39至48中之所有者及位置53至62中之所有者缺失，且視情況核苷酸38或63經取代。
條項N240為如條項N211至N239中任一項之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區之上莖的位置38至63中之所有者缺失，且視情況核苷酸37或64經取代。
條項N241為如條項N211至N240中任一項之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區之上莖的核苷酸37至64中之所有者缺失，且視情況核苷酸36或65經取代。
條項N242為如條項N211至N241中任一項之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區具有長度為11個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
條項N243為如條項N211至N242中任一項之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區具有單一雙螺旋部分。
條項N244為如條項N211至N243中任一項之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區之上莖相對於SEQ ID NO: 500包括一或多個取代。
條項N245為如條項N211至N244中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代核苷酸49至52中之至少一部分或所有者。
條項N246為如條項N211至N245中任一項之gRNA，其中核苷酸37至64中之所有者缺失，且該第一連接子將核苷酸36直接連接至核苷酸65。
條項N247為如條項N211至N245中任一項之gRNA，其中核苷酸38至63中之所有者缺失，且該第一連接子將核苷酸37直接連接至核苷酸64。
條項N248為如條項N211至N245中任一項之gRNA，其中核苷酸39至62中之所有者缺失，且該第一連接子將核苷酸38直接連接至核苷酸63。
條項N249為如條項N211至N248中任一項之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區具有8至22個經修飾核苷酸。
條項N250為如條項N211至N249中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區缺乏2至10個、視情況2至8個、或2至4個核苷酸。
條項N251為如條項N211至N250中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區具有9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個核苷酸之長度。
條項N252為如條項N211至N251中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區具有長度為4至8個、視情況7至8個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
條項N253為如條項N211至N252中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區具有單一雙螺旋部分。
條項N254為如條項N211至N253中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區之一個或兩個鹼基對缺失。
條項N255為如條項N211至N254中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區之莖的長度為七個或八個鹼基配對核苷酸。
條項N256為如條項N211至N255中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區的位置85至86中之一或多者及核苷酸91至92中之一或多者缺失。
條項N257為如條項N211至N256中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區之核苷酸86及91缺失。
條項N258為如條項N211至N257中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區的核苷酸82至95中之一或多者相對於SEQ ID NO: 500經取代。
條項N259為如條項N211至N258中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子取代核苷酸87至90中之至少一部分或全部。
條項N260為如條項N211至N259中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子取代核苷酸81至95中之至少一部分或。
條項N261為如條項N211至N260中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區具有2至15個經修飾核苷酸。
條項N262為如條項N211至N261中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區缺乏2至18個、視情況2至16個核苷酸。
條項N263為如條項N211至N262中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸之長度。
條項N264為如條項N211至N263中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區具有24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34個核苷酸之長度。
條項N265為如條項N211至N264中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區的位置113至121中之一或多者及核苷酸126至134中之一或多者缺失。
條項N266為如條項N211至N265中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區包含不成對區。
條項N267為如條項N211至N266中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區具有兩個雙螺旋部分。
條項N268為如條項N267之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區具有長度為4個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
條項N269為如條項N267至N268之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區具有長度為4至8個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
條項N270為如條項N267至N269之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區具有長度為4至6個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
條項N271為如條項N211至N270中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區之上莖包含一個、兩個、三個或四個鹼基對。
條項N272為如條項N211至N271中任一項之gRNA，其中核苷酸113與134、核苷酸114與133、核苷酸115與132、核苷酸116與131、核苷酸117與130、核苷酸118與129、核苷酸119與128、核苷酸120與127及核苷酸121與126中之至少一對缺失。
條項N273為如條項N211至N272中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區的位置113至121及126至134中之所有者缺失。
條項N274為如條項N211至N273中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區的核苷酸113至134中之一或多者相對於SEQ ID NO: 1經取代。
條項N275為如條項N211至N274中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代核苷酸122至125中之至少一部分或所有者。
條項N276為如條項N211至N275中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代核苷酸112至135中之至少一部分或所有者。
條項211為如條項1至210及N1至N276中任一項之gRNA，其中該內部連接子具有約6埃至37埃之橋接長度。
條項212為如條項1至211中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含至少兩個彼此共價連接的乙二醇次單元。
條項213為如條項1至212中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含1至10個彼此共價連接的乙二醇次單元。
條項214為如條項1至213中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含3至10個彼此共價連接的乙二醇次單元。
條項215為如條項1至214中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含3至6個彼此共價連接的乙二醇次單元。
條項216為如條項1至215中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含3個彼此共價連接的乙二醇次單元。
條項217為如條項1至216中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含6個彼此共價連接的乙二醇次單元。
條項218為如條項1至217中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含式(I)之結構：
~-L0-L1-L2-#
(I)
其中：
~指示連至前一核苷酸之3'取代基的鍵；
#指示連至後一核苷酸之5'取代基的鍵；
L0為空值或C
1-3脂族基；
L1為-[E
1-(R
1)]
m-，其中
各R
1獨立地為視情況經1或2個E
2取代之C
1-5脂族基團，
各E
1及E
2獨立地為氫鍵受體，或各自獨立地選自環烴及雜環烴，且
各m為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；且
L2為空值、C
1-3脂族基，或為氫鍵受體。
條項219為如條項218之gRNA，其中m為6、7、8、9或10。
條項220為如條項218至219中任一項之gRNA，其中m為1、2、3、4或5。
條項221為如條項218至220中任一項之gRNA，其中m為1、2或3。
條項222為如條項218至221中任一項之gRNA，其中L0為空值。
條項223為如條項218至221中任一項之gRNA，其中L0為-CH
2-或-CH
2CH
2-。
條項224為如條項218至223中任一項之gRNA，其中L2為空值。
條項225為如條項218至223中任一項之gRNA，其中L2為-O-、-S-、-CH
2-或-CH
2CH
2-。
條項226為如條項218至225中任一項之gRNA，其中該式(I)結構中自~至#之路徑上的最短原子鏈中之原子數目為30或更小、27或更小、24或更小、21或更小，或為18或更小，或為15或更小，或為12或更小，或為10或更小。
條項227為如條項218至226中任一項之gRNA，其中該式(I)結構中自~至#之路徑上的最短原子鏈中之原子數目為6至30、視情況9至30、視情況9至21。
條項228為如條項218至227中任一項之gRNA，其中該式(I)結構中自~至#之路徑上的最短原子鏈中之原子數目為9。
條項229為如條項218至227中任一項之gRNA，其中該式(I)結構中自~至#之路徑上的最短原子鏈中之原子數目為18。
條項230為如條項218至229中任一項之gRNA，其中各C
1-3脂族基團及C
1-5脂族基團為飽和的。
條項231為如條項218至229中任一項之gRNA，其中至少一個C
1-5脂族基團為C
1-4伸烷基，或其中至少兩個C
1-5脂族基團為C
1-4伸烷基，或其中至少三個C
1-5脂族基團為C
1-4伸烷基。
條項232為如條項218至231中任一項之gRNA，其中至少一個R
1係選自-CH
2-、-CH
2CH
2-、-CH
2CH
2CH
2-或-CH
2CH
2CH
2CH
2-。
條項233為如條項218至231中任一項之gRNA，其中各R
1獨立地選自-CH
2-、-CH
2CH
2-、-CH
2CH
2CH
2-或-CH
2CH
2CH
2CH
2-。
條項234為如條項218至233中任一項之gRNA，其中各R
1為-CH
2CH
2-。
條項235為如條項218至234中任一項之gRNA，其中至少一個C
1-5脂族基團為C
1-4伸烯基，或其中至少兩個C
1-5脂族基團為C
1-4伸烯基，或其中至少三個C
1-5脂族基團為C
1-4伸烯基。
條項236為如條項218至235中任一項之gRNA，其中至少一個R
1係選自-CHCH-、-CHCHCH
2-或-CH
2CHCHCH
2-。
條項237為如條項218至236中任一項之gRNA，其中各E
1獨立地選自-O-、-S-、-NH-、-NR-、-C(O)-O-、-OC(O)O-、-C(O)-NR-、-OC(O)-NR-、-NC(O)-NR-、-P(O)
2O-、-OP(O)
2O-、-OP(R)(O)O-、-OP(O)(S)O-、-S(O)
2-、環烴及雜環烴。
條項238為如條項218至237中任一項之gRNA，其中各E
1獨立地選自-O-、-S-、-NH-、-NR-、-C(O)-O-、-OC(O)O-、-P(O)
2O-、-OP(O)
2O-及-OP(R)(O)O。
條項239為如條項218至238中任一項之gRNA，其中各E
1為-O-。
條項240為如條項218至238中任一項之gRNA，其中各E
1為-S-。
條項241為如條項218至240中任一項之gRNA，其中R
1中之至少一個C
1-5脂族基團視情況經一個E
2取代。
條項242為如條項218至241中任一項之gRNA，其中各E
2獨立地選自-OH、-OR、-ROR、-SH、-SR、-C(O)-R、-C(O)-OR、-OC(O)-OR、-C(O)-H、-C(O)-OH、-OPO
3、-PO
3、-RPO
3、-S(O)
2-R、-S(O)
2-OR、-RS(O)
2-R、-RS(O)
2-OR、-SO
3、環烴及雜環烴。
條項243為如條項218至242中任一項之gRNA，其中各E
2獨立地選自-OH、-OR、-SH、-SR、-C(O)-R、-C(O)-OR、-OC(O)-OR、-OPO
3、-PO
3、-RPO
3及-SO
3。
條項244為如條項218至243中任一項之gRNA，其中各E
2為-OH或OR。
條項245為如條項218至243中任一項之gRNA，其中各E
2為-SH或SR。
條項246為如條項218至245中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含PEG-連接子。
條項247為如條項218至246中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含具有1至10個乙二醇單元之PEG-連接子。
條項248為如條項218至247中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含具有3至6個乙二醇單元之PEG-連接子。
條項249為如條項218至248中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含具有3個乙二醇單元之PEG-連接子。
條項250為如條項218至248中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含具有6個乙二醇單元之PEG-連接子。
條項251為如條項1至250中任一項之gRNA，其中該gRNA為包含經縮短之保守部分的短引導RNA，且該內部連接子取代至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。
條項252為如前述條項中任一項之gRNA，其中該gRNA為包含sgRNA之保守部分的短單引導RNA (短sgRNA)，該保守部分包含髮夾區，其中該髮夾區缺乏至少5至10個核苷酸。
條項253為如前述條項中任一項之gRNA，其中該至少5至10個所缺乏核苷酸為連續的。
條項254為如前述條項中任一項之gRNA，其中該至少5至10個所缺乏核苷酸
i. 位於髮夾1內；
ii. 位於髮夾1內及髮夾1與髮夾2之間的「N」；
iii. 位於髮夾1內及緊鄰髮夾1之3'的兩個核苷酸；
iv. 包括髮夾1之至少一部分；
v. 位於髮夾2內；
vi. 包括髮夾2之至少一部分；
vii. 位於髮夾1及髮夾2內；
viii. 包括髮夾1之至少一部分且包括髮夾1與髮夾2之間的「N」；
ix. 包括髮夾2之至少一部分且包括髮夾1與髮夾2之間的「N」；
x. 包括髮夾1之至少一部分，包括髮夾1與髮夾2之間的「N」，且包括髮夾2之至少一部分；
xi. 位於髮夾1或髮夾2內，視情況包括髮夾1與髮夾2之間的「N」；
xii. 為連續的；
xiii. 為連續的且包括髮夾1與髮夾2之間的「N」；
xiv. 為連續的且跨越髮夾1之至少一部分及髮夾2之一部分；
xv. 為連續的且跨越髮夾1之至少一部分及髮夾1與髮夾2之間的「N」；或
xvi. 為連續的且跨越髮夾1之至少一部分及緊鄰髮夾1之3'的兩個核苷酸。
條項255為如前述條項中任一項之gRNA，其中該gRNA為包含sgRNA之保守部分的短單引導RNA (短sgRNA)，該保守部分包含髮夾區，其中該髮夾區缺乏至少5至10個核苷酸，且其中該短sgRNA包含5'端修飾或3'端修飾。
條項256為如前述條項中任一項之gRNA，其中該至少5至10個核苷酸包含SEQ ID NO:400之核苷酸54至61、SEQ ID NO:400之核苷酸53至60；或SEQ ID NO:400之核苷酸54至58，視情況其中該短sgRNA包含至少H1-1至H1-5及H2-1至H2-12之修飾。
條項257為如前述條項中任一項之gRNA，其包含經縮短之髮夾1區或經取代且視情況經縮短之髮夾1區，其中
(i)以下核苷酸對中之至少一者在該經取代且視情況經縮短之髮夾1中經華特生-克里克配對核苷酸取代：H1-1與H1-12、H1-2與H1-11、H1-3與H1-10或H1-4與H1-9，且該髮夾1區視情況缺乏
(aa) H1-5至H1-8中之任一者或兩者，
(bb)以下核苷酸對中之一者、兩者或三者：H1-1與H1-12、H1-2與H1-11、H1-3與H1-10或H1-4與H1-9，或
(cc)該髮夾1區之1至8個核苷酸；或
(ii)該經縮短之髮夾1區缺乏6至8個核苷酸，較佳6個核苷酸；且
(A)位置H1-1、H1-2或H1-3中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400缺失或經取代，或
(B)位置H1-6至H1-10中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400經取代；或
(iii)相對於SEQ ID NO: 400，該經縮短之髮夾1區缺乏5至10個核苷酸，較佳5至6個核苷酸，且位置N18、H1-12或n中之一或多者經取代。
條項258為如前述條項中任一項之gRNA，其包含經縮短之上莖區，其中相對於SEQ ID NO: 400，該經縮短之上莖區缺乏1至6個核苷酸，且其中該經縮短之上莖區的6、7、8、9、10或11個核苷酸包括少於或等於4個取代。
條項259為如前述條項中任一項之gRNA，其在LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2及H2-14中之任一者或多者處包含相對於SEQ ID NO: 400之取代，其中該經取代核苷酸既不為後接腺嘌呤之嘧啶，亦不為前接嘧啶之腺嘌呤。
條項260為如前述條項中任一項之gRNA，其包含上莖區，其中上莖修飾包含該上莖區中之US1至US12中之任一者或多者的修飾。
條項261為如前述條項中任一項之gRNA，其包含經縮短之上莖區，其中該經縮短之上莖區缺乏1至6個核苷酸。
條項262為如前述條項中任一項之gRNA，其中該gRNA包含修飾。
條項263為如條項262之引導RNA，其中該修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸、2'-H修飾之核苷酸(DNA)、2'-O,4'-C-伸乙基修飾之核苷酸(ENA)、鎖定核苷酸(LNA)或非鎖定核苷酸(UNA)。
條項264為如條項262或263之引導RNA，其中該修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。
條項265為如條項262至264中任一項之引導RNA，其中該引導RNA為sgRNA，且該修飾包含該引導RNA之5'端處的五個核苷酸中之一或多者處的修飾。
條項266為如條項262至265中任一項之引導RNA，其中該引導RNA為sgRNA，且該修飾包含該引導RNA之3'端處的五個核苷酸中之一或多者處的修飾。
條項267為如條項262至266中任一項之引導RNA，其中該引導RNA為sgRNA，且該修飾包含該引導RNA之5'端處的四個核苷酸中之各者之間的PS鍵。
條項268為如條項262至267中任一項之引導RNA，其中該引導RNA為sgRNA，且該修飾包含該引導RNA之3'端處的四個核苷酸中之各者之間的PS鍵。
條項269為如條項262至268中任一項之引導RNA，其中該引導RNA為sgRNA，且該修飾包含該引導RNA之5'端處的前三個核苷酸中之各者處的2'-O-Me修飾之核苷酸。
條項270為如條項262至269中任一項之引導RNA，其中該引導RNA為sgRNA，且該修飾包含該引導RNA之3'端處的最後三個核苷酸中之各者處的2'-O-Me修飾之核苷酸。
條項271為如前述條項中任一項之gRNA，其中該gRNA包含3'尾。
條項272為如條項271之gRNA，其中該3'尾包含至少1至10個核苷酸。
條項273為如條項271至272中任一項之gRNA，其中該3'尾以具有尿嘧啶鹼基之核苷酸終止。
條項274為如條項271至273中任一項之gRNA，其中該3'尾之長度為1個核苷酸且為具有尿嘧啶鹼基之核苷酸。
條項275為如前述條項中任一項之gRNA，其中該gRNA之3'核苷酸為具有尿嘧啶鹼基之核苷酸。
條項276為如條項271至274中任一項之gRNA，其中該3'尾包含存在於該3'尾中之核苷酸中之任一者或多者的修飾。
條項277為如條項276之gRNA，其中該3'尾經完全修飾。
條項278為如條項1至270中任一項之gRNA，其中該gRNA不包含3'尾。
條項279為如前述條項中任一項之gRNA，其中該gRNA包含3'端修飾。
條項280為如前述條項中任一項之gRNA，其中該gRNA包含5'端修飾及3'端修飾。
條項281為如條項279至280中任一項之gRNA，其中該3'或5'端修飾包含保護性端修飾，視情況為選自以下之經修飾核苷酸：2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、反向無鹼基修飾之核苷酸或其組合。
條項282為如條項279至281中任一項之gRNA，其中該3'或5'端修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸。
條項283為如條項279至282中任一項之gRNA，其中該3'或5'端修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。
條項284為如條項279至283中任一項之gRNA，其中該3'或5'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
條項285為如條項279至284中任一項之gRNA，其中該3'或5'端修飾包含或進一步包含反向無鹼基修飾之核苷酸。
條項286為如前述條項中任一項之gRNA，其包含髮夾區或該髮夾區中之修飾。
條項287為如條項286之gRNA，其包含該髮夾區中之修飾，其中該髮夾區中之該修飾包含選自以下之經修飾核苷酸：2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯或其組合。
條項288為如條項286或287之gRNA，其進一步包含3'端修飾。
條項289為如條項286或287之gRNA，其進一步包含3'端修飾及5'端修飾。
條項290為如條項286或287之gRNA，其進一步包含5'端修飾。
條項291為如條項286至290中任一項之gRNA，其中該髮夾區中之該修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸。
條項292為如條項286至291中任一項之gRNA，其中該髮夾區中之該修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。
條項293為如前述條項中任一項之gRNA，其包含上莖區或該上莖區中之修飾。
條項294為如條項293之gRNA，其中上莖修飾包含以下中之任一者或多者：
i. 該上莖區中之US1至US12中之任一者或多者的修飾；及
ii. 該上莖區中之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或所有12個核苷酸的修飾。
條項295為如條項293之gRNA，其中該上莖修飾包含以下中之一或多者：
i. 2'-OMe修飾之核苷酸；
ii. 2'-O-moe修飾之核苷酸；
iii. 2'-F修飾之核苷酸；
iv. 2'-H修飾之核苷酸(DNA)；
v. 2'-O,4'-C-伸乙基修飾之核苷酸(ENA)；
vi. 鎖定核苷酸(LNA)；
vii. 非鎖定核苷酸(UNA)；及
viii. (i.)至(iii.)中之一或多者的組合。
條項296為如前述條項中任一項之gRNA，其中該修飾包含YA修飾。
條項297為如前述條項中任一項之gRNA，其包含一或多個引導區YA位點之YA修飾。
條項298為如條項296至297中任一項之gRNA，其中該YA修飾包含YA位點之嘧啶經非嘧啶之取代。
條項299為如條項296至297中任一項之gRNA，其中該YA修飾包含YA位點之腺嘌呤經非腺嘌呤之取代。
條項300為如條項296至298中任一項之gRNA，其包含YA修飾，其中該修飾包含2'-氟、2'-H、2'-OMe、ENA、UNA、肌苷或PS修飾。
條項301為如前述條項中任一項之gRNA，其包含一或多個保守區YA位點之YA修飾。
條項302為如前述條項中任一項之gRNA，其中該YA修飾包含
(i) 2'-OMe修飾，視情況屬於該YA位點之嘧啶；
(ii) 2'-氟修飾，視情況屬於該YA位點之嘧啶；或
(iii) PS修飾，視情況屬於該YA位點之嘧啶。
條項303為如條項61至302中任一項之gRNA，其包含與SEQ ID NO: 1-8、20-75、101-108及120-175中之任一者之核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%或70%一致性的核苷酸序列。
條項304為如條項61至303中任一項之gRNA，其包含與SEQ ID No: 1-8、20-75、101-108及120-175中之任一者之核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%或70%一致性的核苷酸序列，其中與表2A中之參考序列標識符之核苷酸對應的該gRNA之各核苷酸處的修飾與表2B中之參考序列標識符中所示的修飾一致或等效。
條項305為一種引導RNA (gRNA)，其包含SEQ ID NO: 1-8及20-75中之任一者。
條項306為如前述條項中任一項之gRNA，其包括針對表2A或表2B中之引導RNA所闡述的修飾。
條項307為一種引導RNA (gRNA)，其包含SEQ ID NO: 101-108及120-175中之任一者，包括表2A或表2B之修飾。
條項308為如前述條項中任一項之gRNA，其中該gRNA與脂質奈米顆粒(LNP)締合。
條項309為一種組合物，其包含如前述條項中任一項之gRNA。
條項310為一種LNP組合物，其包含如條項1至308中任一項之gRNA。
條項311為一種LNP組合物，其包含如條項63至116及211至308中任一項之gRNA及編碼SpyCas9之mRNA。
條項312為一種LNP組合物，其包含如條項117至159及211至308中任一項之gRNA及編碼SauCas9之mRNA。
條項313為一種LNP組合物，其包含如條項160至189及211至308中任一項之gRNA及編碼St1Cas9之mRNA。
條項314為一種LNP組合物，其包含如條項190至202及211至308中任一項之gRNA及編碼CjeCas9或FnoCas9之mRNA。
條項315為一種LNP組合物，其包含如條項203至308中任一項之gRNA及編碼AsCpf1、LbCpf1或EsCas13d之mRNA。
條項316為如條項310至315中任一項之LNP組合物，其中該LNP包含十八碳-9,12-二烯酸(9z,12z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯或8-((7,7-雙(辛氧基)庚基)(2-羥乙基)胺基)辛酸壬酯。
條項317為如條項310至316中任一項之組合物，其中該LNP包含約4.5至6.5之陽離子脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)之莫耳比，視情況約6.0之N:P。
條項318為如條項309至317之組合物，其中該核酸酶包含蛋白質或編碼該核酸酶之核酸。
條項319為如條項318之組合物，其中該核酸酶為Cas核酸酶。
條項320為如條項319之組合物，其中該Cas核酸酶為Cas9。
條項321為如條項320之組合物，其中該Cas9為化膿鏈球菌Cas9 (SpyCas9)。
條項322為如條項320之組合物，其中該Cas9為金黃色葡萄球菌Cas9 (SauCas9)。
條項323為如條項320之組合物，其中該Cas9為白喉棒狀桿菌Cas9 (CdiCas9)。
條項324為如條項320之組合物，其中該Cas9為嗜熱鏈球菌Cas9 (St1Cas9)。
條項325為如條項320之組合物，其中該Cas9為解纖維熱酸菌Cas9 (AceCas9)。
條項326為如條項320之組合物，其中該Cas9為空腸彎曲桿菌Cas9 (CjeCas9)。
條項327為如條項320之組合物，其中該Cas9為沼澤紅假單胞菌Cas9 (RpaCas9)。
條項328為如條項320之組合物，其中該Cas9為深紅紅螺菌Cas9 (RruCas9)。
條項329為如條項320之組合物，其中該Cas9為納士放線菌Cas9 (AnaCas9)。
條項330為如條項320之組合物，其中該Cas9為新兇手弗朗西斯氏菌Cas9 (FnoCas9)。
條項330.1為如條項320之組合物，其中該Cas蛋白為腦膜炎雙球菌Cas9 (NmeCas9)。
條項331為如條項319之組合物，其中該Cas核酸酶為Cpf1。
條項332為如條項331之組合物，其中該Cpf1為毛螺旋菌Cpf1 (LbCpf1)，或該Cpf1為胺基酸球菌屬Cpf1 (AsCpf1)。
條項333為如條項319之組合物，其中該Cas蛋白為惰性真桿菌Cas13d (EsCas13d)。
條項334為如條項311至329中任一項之組合物，其中該核酸酶為裂解酶、切口酶或無催化活性之核酸酶，或為包含去胺酶之融合蛋白。
條項335為如條項311至334中任一項之組合物，其中該核酸酶經修飾。
條項336為如前一條項之組合物，其中該經修飾核酸酶包含核定位信號(NLS)。
條項337為如條項311至336之組合物，其中編碼該核酸酶之該核酸係選自：
a. DNA編碼序列；
b. 具有開放閱讀框架(ORF)之mRNA；
c. 表現載體中之編碼序列；
d. 病毒載體中之編碼序列。
條項338為如前一條項之組合物，其中該mRNA包含SEQ ID NO: 321-323中之任一者之序列。
條項339為一種醫藥調配物，其包含如條項1至308中任一項之gRNA或如條項309至338中任一項之組合物及醫藥學上可接受之載劑。
條項340為一種修飾目標DNA之方法，其包含將以下中之任一者或多者遞送至細胞：
i. 如條項1至308中任一項之gRNA；
ii. 如條項309至338中任一項之組合物；及
iii. 如條項339之醫藥調配物。
條項341為如條項340之方法，其中該gRNA包含不超過110、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45或40個核苷酸。
條項342為如條項1至308中任一項之gRNA，如條項309至338之組合物，或如條項340之醫藥調配物，其用於製備供治療疾病或病症所用的藥劑。
條項343為如條項1至308中任一項之gRNA、如條項309至338之組合物或如條項340之醫藥調配物的用途，其用於製造供治療疾病或病症所用的藥劑。
條項344為一種化學合成的gRNA，其包含內部連接子。
條項345為一種組合物，其包含如條項1至308中任一項之gRNA，其中該組合物不包含該gRNA之非連接部分。
條項346為一種固體載體，其共價連接至如條項1至308中任一項之gRNA之連接子。
條項347為一種合成包含內部連接子之gRNA的方法，其中該方法為單合成製程。
條項348為一種合成gRNA之方法，其中內部連接子在合成期間沿線併入。
條項349為一種合成gRNA之方法，其使用一系列連續偶合反應，其中該等反應包含：
a)用於第一核苷酸與第二核苷酸之共價連接的偶合反應；
b)用於內部連接子與該第二核苷酸之共價連接的偶合反應；及
c)用於第三核苷酸與該內部連接子之共價連接的偶合反應，
其中用於該等共價連接之偶合反應全部相同。
條項350為如條項349之方法，其中使用胺基亞磷酸酯化學方法進行共價連接。
條項351為如前述條項中任一項之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該gRNA係化學合成的。
條項352為如前述條項中任一項之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該內部連接子在該gRNA之化學合成期間經由偶合反應併入該gRNA中。
條項353為如前述條項中任一項之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其係藉由包含添加該內部連接子之製程，藉由使包含胺基亞磷酸酯部分之連接子與核苷殘基反應來製備。
條項354為如前一條項之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該製程進一步包含使包含胺基亞磷酸酯部分之核苷酸與該連接子反應。
條項355為如前述條項中任一項之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該內部連接子藉由磷酸二酯或硫代磷酸酯鍵共價接合至相鄰核苷酸。
條項356為如前述條項中任一項之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該內部連接子中不存在尿素。
條項357為如前述條項中任一項之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該內部連接子不位於該gRNA之該重複反重複區中。
條項358為如前述條項中任一項之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該gRNA包含不位於該引導物之重複反重複中的內部連接子。
條項359為如前述條項中任一項之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該gRNA為sgRNA。
條項360為如前述條項中任一項之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該內部連接子橋接雙螺旋區且取代2至12個核苷酸。
條項361為如前述條項中任一項之gRNA、組合物、調配物、方法或用途，其中該gRNA在單合成中製得。
圖1A至圖1C展示在(A)原代小鼠肝細胞(PMH)、(B)原代石蟹獼猴肝細胞(PCH)及(C)原代人類肝細胞(PHH)中，具有使用脂質體轉染活體外遞送之內部連接子的指定引導物之編輯%。
圖2A及圖2B展示實驗之(A)組1及(B)組2之編輯%結果的劑量反應曲線，其中使用脂質體轉染將具有內部連接子之引導物活體外遞送至PCH。
圖3A及圖3B展示實驗之編輯%結果的劑量反應曲線，其中使用脂質體轉染將具有內部連接子之引導物活體外遞送至(A) PMH及(B) PCH。
圖4A及圖4C展示實驗之編輯%結果的劑量反應曲線，其中使用脂質體轉染將具有內部連接子之引導物活體外遞送至(A) PMH、(B) PCH及(C) PRH。
圖5A及圖5B展示活體內小鼠研究之結果，其提供以0.1 mg/kg之總RNA之劑量投與的具有內部連接子之指定引導物的(A)編輯%及(B)血清TTR濃度(μg/ml)。
圖6展示活體內小鼠研究之結果，其提供以0.1 mg/kg或0.03 mg/kg之總RNA之劑量投與的具有內部連接子之指定引導物的編輯%。
圖7展示活體內小鼠研究之結果，其提供以0.1 mg/kg或0.03 mg/kg之總RNA之劑量投與的具有內部連接子之指定引導物的編輯%。
圖8A及圖8B展示活體內大鼠研究之結果，其提供以0.1 mg/kg或0.03 mg/kg之總RNA之劑量投與的具有內部連接子之指定引導物的(A)編輯%及(B)血清TTR濃度(μg/ml)。
圖9展示與先前圖式中所呈現之研究結果匹配的具有內部連接子之各種Spy Cas9引導物之圖示。
圖10A至圖10E展示(A) Spy Cas9、(B) Sau Cas9、(C) AsCas12A (AsCpf1)、(D) EsCas 13D及(E) NmeCas9之例示性引導物結構(連接子未示出)，其指示靶向區(具有虛線輪廓之灰色填充，不適合內部連接子取代)、不適合內部連接子取代之鹼基(具有實線輪廓之灰色填充)、適合單一或成對缺失之鹼基(空心圓)、適合經長連接子取代之鹼基(具有實線輪廓之格子圖案填充)及適合經短連接子取代之鹼基(具有實線輪廓之交叉影線填充)。
圖11展示例示性sgRNA (SEQ ID NO: 300，甲基化未示出)的可能二級結構，其中標記標識sgRNA之保守區的個別核苷酸，包括下莖、隆突、上莖、連接區(其核苷酸依5'至3'方向分別可稱作N1至N18)及髮夾區，該髮夾區包括髮夾1區及髮夾2區。髮夾1與髮夾2之間的核苷酸標記為n。引導區可存在於sgRNA上且在此圖中指示為sgRNA之保守區之前的「(N)
x」。
圖12A展示使用不同比率之sgRNA及Nme2Cas9 mRNA時PMH中之TTR基因座處的平均編輯百分比。
圖12B展示使用不同比率之pgRNA及Nme2Cas9 mRNA時PMH中之TTR基因座處的平均編輯百分比。
圖13展示針對pgRNA與Nme2Cas9 mRNA，PMH中之TTR基因座處的平均編輯百分比。
圖14A展示針對在引導序列中具有2'-OMe修飾之pgRNA與Nme2Cas9 mRNA，PMH中之TTR外顯子1處的平均編輯百分比。
圖14B展示針對在引導序列中具有2'-OMe修飾之pgRNA與Nme2Cas9 mRNA，PMH中之TTR外顯子3處的平均編輯百分比。
圖14C展示針對在引導序列中具有輕鏈2'-OMe修飾之pgRNA與Nme2Cas9 mRNA，PMH中之TTR外顯子1處的平均編輯百分比。
圖14D展示針對在引導序列中具有輕鏈2'-OMe修飾之pgRNA與Nme2Cas9 mRNA，PMH中之TTR外顯子3處的平均編輯百分比。
圖15展示用設計成具有1或2個核定位序列之NmeCas9構築體處理的PMH細胞中之小鼠TTR基因座處的平均編輯百分比。
圖16展示用pgRNA及各種Nme2Cas9 mRNA處理的PMH細胞中之小鼠TTR基因座處的平均編輯百分比。
圖17A展示用pgRNA及Nme2Cas9處理後小鼠肝臟中之TTR基因座處的平均編輯百分比。
圖17B展示用pgRNA及Nme2Cas9處理後之平均血清TTR蛋白質。
圖17C展示用pgRNA及Nme2Cas9處理後之平均TTR阻斷百分比。
圖17D展示用pgRNA及各種Nme2Cas9處理後小鼠肝臟中之TTR基因座處的平均編輯百分比。
圖17E展示用pgRNA及各種Nme2Cas9處理後之血清TTR蛋白質阻斷。
圖18展示用pgRNA及各種Nme2Cas9處理後小鼠肝臟中之平均編輯百分比。
圖19展示用各種鹼基編輯器處理後小鼠肝臟中之平均編輯百分比。
圖20展示用各種經修飾pgRNA及SpyCas9 mRNA處理後人類肝細胞瘤(Huh7)中之HEK3基因座處的平均編輯百分比。
<![CDATA[<110> 美商英特利亞醫療公司(INTELLIA THERAPEUTICS, INC.)]]>
<![CDATA[<120> 用於基因編輯之包含內部連接子之經修飾引導RNA]]>
<![CDATA[<130> 01155-0047-00PCT]]>
<![CDATA[<140> TW 111121520]]>
<![CDATA[<141> 2022-06-09]]>
<![CDATA[<150> US 63/275,427]]>
<![CDATA[<151> 2021-11-03]]>
<![CDATA[<150> US 63/209,273]]>
<![CDATA[<151> 2021-06-10]]>
<![CDATA[<160> 1012 ]]>
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之詳細描述，參見所申請之說明書
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<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1及L2、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
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<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1及L2、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
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<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1及L2、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
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之詳細描述，參見所申請之說明書
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參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 109]]>
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<![CDATA[<211> 90]]>
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<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有2'-O-Me及PS修飾；關於取代及較佳實施例之詳細描述，]]>
參見所申請之說明書
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<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有2'-O-Me及PS修飾；關於取代及較佳實施例之詳細描述，]]>
參見所申請之說明書
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參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 112]]>
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<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有2'-O-Me及PS修飾；關於取代及較佳實施例之詳細描述，]]>
參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 113]]>
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參見所申請之說明書
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詳細描述，參見所申請之說明書
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詳細描述，參見所申請之說明書
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詳細描述，參見所申請之說明書
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<![CDATA[<223> 含有內部連接子L2、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例之]]>
詳細描述，參見所申請之說明書
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詳細描述，參見所申請之說明書
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詳細描述，參見所申請之說明書
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之詳細描述，參見所申請之說明書
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之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 169]]>
acacaaauac caguccagcg guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucacgaaag ggcaccgagu cggugc 86
<![CDATA[<210> 170]]>
<![CDATA[<211> 88]]>
<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 合成]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有2'-O-Me及PS修飾；關於取代及較佳實施例之詳細描述，]]>
參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 170]]>
acacaaauac caguccagcg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaaa auggcaccga gucggugc 88
<![CDATA[<210> 171]]>
<![CDATA[<211> 88]]>
<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
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<![CDATA[<223> 合成]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有2'-O-Me及PS修飾；關於取代及較佳實施例之詳細描述，]]>
參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 171]]>
acacaaauac caguccagcg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaaa auggcaccga gucggugc 88
<![CDATA[<210> 172]]>
<![CDATA[<211> 84]]>
<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 合成]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 172]]>
acacaaauac caguccagcg guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaaaaugg caccgagucg gugc 84
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<![CDATA[<211> 86]]>
<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 合成]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 173]]>
acacaaauac caguccagcg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaau ggcaccgagu cggugc 86
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<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 合成]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 174]]>
acacaaauac caguccagcg guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaauggca ccgagucggu gc 82
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<![CDATA[<211> 76]]>
<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 合成]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1、2'-O-Me及PS鍵聯修]]>飾；關於取代及較佳實施例
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 175]]>
acacaaauac caguccagcg guuuuagagc gcaaguuaaa auaaggcguc cguuaucaau 60
ggcaccgagu cggugc 76
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000
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<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1、dS位點、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及]]>
較佳實施例之詳細描述，參見所申請之說明書
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ggcccagacu gagcacguga guuuuagaaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucacggg 60
caccgagucg gugcu 75
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<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L4及L1、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 178]]>
ggcccagacu gagcacguga guuuuagaaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucacggg 60
caccgagucg gugcu 75
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<![CDATA[<211> 75]]>
<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
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<![CDATA[<223> 合成]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L3及L1、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 179]]>
ggcccagacu gagcacguga guuuuagaaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucacggg 60
caccgagucg gugcu 75
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<![CDATA[<211> 75]]>
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<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L2及L1、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 180]]>
ggcccagacu gagcacguga guuuuagaaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucacggg 60
caccgagucg gugcu 75
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<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 181]]>
ggcccagacu gagcacguga guuuuagaaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucacggg 60
caccgagucg gugcu 75
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<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 182]]>
ggcccagacu gagcacguga guuuuagagc gcaaguuaaa auaaggcuag uccguuauca 60
cgggcaccga gucggugcu 79
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<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 183]]>
ggcccagacu gagcacguga guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucacgggca ccgagucggu gcu 83
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<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 184]]>
ggcccagacu gagcacguga guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucacg aaagggcacc gagucggugc 90
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<![CDATA[<220>]]>
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<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<222> (1)..(20)]]>
<![CDATA[<223> n為a、c、g或u]]>
<![CDATA[<400> 202]]>
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuaguac ucuggaaaca gaaucuacua aaacaaggca 60
aaaugccgug uuuaucucgu caacuuguug gcgagauuuu 100
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<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 合成]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<222> (1)..(20)]]>
<![CDATA[<223> n為a、c、g或u]]>
<![CDATA[<400> 203]]>
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn acugggguuc aggaaacuga accucaguaa gcauuggcuc 60
guuuccaaug uugauugcuc cgccggugcu ccuuauuuuu aagggcgccg gca 113
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuuguac ucucaagauu caauaaucuu gcagaagcua 60
caaagauaag gcuucaugcc gaaaucaaca cccugucauu uuauggcagg guguuuu 117
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuuguac ucgaaagaag cuacaaagau aaggcuucau 60
gccgaaauca acacccuguc auuuuauggc agggugu 97
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gcuggggagc cugaaaaggc uaccuagcaa gaccccuucg 60
uggggucgca uucuucaccc ccagcagggg guuc 94
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagucc cugaaaaggg acuaaaauaa agaguuugcg 60
ggacucugcg ggguuacaau ccccuaaaac cgc 93
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參見所申請之說明書
<![CDATA[<220>]]>
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<![CDATA[<222> (1)..(20)]]>
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cguccguuau 60
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<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1及L2；關於取代及較佳實施例之詳細描述，]]>
參見所申請之說明書
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<222> (1)..(20)]]>
<![CDATA[<223> ]]> n為a、c、g或u
<![CDATA[<400> 212]]>
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cguccguuau 60
cacgggcacc gagucggugc 80
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<![CDATA[<211> 80]]>
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<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 合成]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1及L2、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<222> (1)..(20)]]>
<![CDATA[<223> n為a、c、g或u]]>
<![CDATA[<400> 213]]>
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cguccguuau 60
cacgggcacc gagucggugc 80
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<![CDATA[<213> 人工序列]]>
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<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1及L2、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施]]>例
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<222> (1)..(20)]]>
<![CDATA[<223> n為a、c、g或u]]>
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cguccguuau 60
caggcaccga gucggugc 78
<![CDATA[<210> 215]]>
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<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 合成]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1及L2、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<222> (1)..(20)]]>
<![CDATA[<223> n為a、c、g或u]]>
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagcaaguua aaauaaggcg uccguuauca 60
cgggcaccga gucggugc 78
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<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1及L2、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<222> (1)..(20)]]>
<![CDATA[<223> n為a、c、g或u]]>
<![CDATA[<400> 216]]>
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagcaaguua aaauaaggcg uccguuauca 60
ggcaccgagu cggugc 76
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<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1及L2、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagcaaguua aaauaaggcg uccguuauca 60
ggcaccgagu cggugc 76
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<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1及L2、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
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<![CDATA[<222> (1)..(20)]]>
<![CDATA[<223> n為a、c、g或u]]>
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagcaaguua aaauaaggcg uccguuauca 60
ggcaccgagu cggugc 76
<![CDATA[<210> ]]> 219
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之詳細描述，參見所申請之說明書
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<![CDATA[<222> (1)..(20)]]>
<![CDATA[<223> n為a、c、g或u]]>
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cguccguuau 60
cacgggcacc gagucggugc 80
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之詳細描述，參見所申請之說明書
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cguccguuau 60
caggcaccga gucggugc 78
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之詳細描述，參見所申請之說明書
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagcaaguua aaauaaggcg uccguuauca 60
cgggcaccga gucggugc 78
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<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 合成]]>
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<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1及L2、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<220>]]>
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<![CDATA[<222> (1)..(20)]]>
<![CDATA[<223> n為a、c、g或u]]>
<![CDATA[<400> 222]]>
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagcaaguua aaauaaggcg uccguuauca 60
ggcaccgagu cggugc 76
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<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1、dS位點、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實]]>
施例之詳細描述，參見所申請之說明書
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<![CDATA[<222> (1)]]>..(20)
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagaaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucacggg 60
caccgagucg gugcu 75
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<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 合成]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1及L4、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<222> (1)..(20)]]>
<![CDATA[<223> n為a、c、g或u]]>
<![CDATA[<400> 224]]>
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagaaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucacggg 60
caccgagucg gugcu 75
<![CDATA[<210> 225]]>
<![CDATA[<211> 75]]>
<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 合成]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<22]]>3> 含有內部連接子L1及L3、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
<br/><![CDATA[ 之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<222> (1)..(20)]]>
<![CDATA[<223> n為a、c、g或u]]>
<![CDATA[<400> 225]]>
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagaaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucacggg 60
caccgagucg gugcu 75
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<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 合成]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1及L2、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<222> (1)..(20)]]>
<![CDATA[<223> n為a、c、g或u]]>
<![CDATA[<400> 226]]>
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagaaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucacggg 60
caccgagucg gugcu 75
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<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<220>]]>
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<![CDATA[<222> (1)..(20)]]>
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagaaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucacggg 60
caccgagucg gugcu 75
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<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc gcaaguuaaa auaaggcuag uccguuauca 60
cgggcaccga gucggugcu 79
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之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<222> (1)..(20)]]>
<![CDATA[<223> n為a、c、g或u]]>
<![CDATA[<400> 229]]>
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucacgggca ccgagucggu gcu 83
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<![CDATA[<211> 83]]>
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<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 合成]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<222> (1)..(20)]]>
<![CDATA[<223> n為a、c、g或u]]>
<![CDATA[<400> 230]]>
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucacgggca ccgagucggu gcu 83
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<![CDATA[<223> 合成]]>
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Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
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Gly Pro Glu Ile Lys Ser Leu Lys Tyr Tyr Asp Ser Lys Leu Gly Asn
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His Ile Asp Ile Thr Pro Lys Asp Ser Asn Asn Lys Val Val Leu Gln
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Asp Lys Asp Ser Asn Phe Ile Ile Gly Lys Ile Thr Leu Pro Phe
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Lys Lys Glu Trp Gln Arg Leu Tyr Arg Glu Trp Gln Asn Thr Thr
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Ile Lys Asp Asp Tyr Glu Phe Leu Lys Ser Phe Phe Asn Val Lys
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Ser Ile Thr Lys Leu His Lys Lys Val Arg Lys Asp Phe Ser Leu
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Pro Ile Ser Thr Asn Glu Gly Lys Phe Leu Val Lys Arg Lys Thr
1445 1450 1455
Trp Asp Asn Asn Phe Ile Tyr Gln Ile Leu Asn Asp Ser Asp Ser
1460 1465 1470
Arg Val Asp Gly Thr Lys Pro Phe Ile Pro Ala Phe Asp Ile Ser
1475 1480 1485
Lys Asn Glu Ile Val Glu Ala Ile Ile Asp Ser Phe Thr Ser Lys
1490 1495 1500
Asn Ile Phe Trp Leu Pro Lys Asn Ile Glu Leu Gln Lys Val Asp
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Asn Lys Asn Ile Phe Ala Ile Asp Thr Ser Lys Trp Phe Glu Val
1520 1525 1530
Glu Thr Pro Ser Asp Leu Arg Asp Ile Gly Val Ala Thr Ile Gln
1535 1540 1545
Tyr Lys Ile Asp Asn Asn Ser Arg Pro Lys Val Arg Val Lys Leu
1550 1555 1560
Asp Tyr Val Ile Asp Asp Asp Ser Lys Ile Asn Tyr Phe Thr Asn
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His Ser Leu Leu Lys Ser Arg Tyr Pro Asp Lys Val Leu Glu Ile
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Leu Lys Gln Ser Thr Thr Ile Glu Phe Glu Ser Ser Gly Phe Asn
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Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn
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325 330 335
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Leu Ser Cys Pro Asn Ile Asn Leu Asn Gly Asp Gln Gly Tyr Cys
1130 1135 1140
Val Gln Ser Ala Glu Gly Ile Arg Lys Glu Lys Ile Arg Thr Thr
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Ser Cys Thr Ala Leu Gly Arg Leu Arg Leu Ser Lys Lys Ala Thr
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Arg Phe Glu Pro Val Gly Leu Gly Pro Gly Gly Val Arg Ile Phe Pro
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Asp Gly Arg Asp Pro Gln Ser Lys Ala Ser Asn Ala Val Asp Arg Arg
50 55 60
Met Ala Arg Gly Ala Arg Lys Arg Arg Asp Arg Phe Val Gln Arg Arg
65 70 75 80
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Ala Ala Ala Arg Lys Ala Leu Ala Gly Leu Asp Pro Tyr Gln Leu Arg
100 105 110
Ala Arg Ala Leu Val Asp Arg Leu Pro Ala His His Val Gly Arg Ala
115 120 125
Leu Phe His Leu Asn Gln Arg Arg Gly Phe Leu Ser Asn Arg Lys Thr
130 135 140
Asp Asn Lys Lys Asn Ser Glu Asp Gly Ala Ile Lys Gln Ala Ala Ser
145 150 155 160
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325 330 335
Ala Arg Asn Leu Glu Ile Arg Glu Thr Gly Arg Gly Ser Arg Lys Leu
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435 440 445
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450 455 460
Glu Gly His Cys Arg Leu Gly Leu Arg Ala Ile Lys Lys Ile Val Pro
465 470 475 480
Val Met Gln Asn Glu Val Gly Asp Asp Gly Val Ser Gly Ala Gly Tyr
485 490 495
Tyr Glu Ala Ala Lys Arg Ile Gly Tyr Asp His Ala Lys Leu Pro Thr
500 505 510
Gly Gly Asp Leu Asp Tyr Leu Pro Tyr Tyr Gly Lys Trp Leu Ala Asp
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565 570 575
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Asp Val Gly Thr His Ser Val Gly Leu Ala Thr Leu Arg Val Asp Asp
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Ser Gly Val Gly Lys Glu Gly Lys Lys Asp His Asp Thr Arg Lys Lys
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Ser Pro Ala Glu Glu Ser Pro Phe Met Lys Ala Leu Arg Glu Arg Ile
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Leu Ala Thr Thr Gly Glu Val Leu Asp Asp Gly Ile Thr Pro Gly Gln
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Val Ala Asn Leu Arg Ile Ser Glu Thr Lys Gly Glu Asn Arg Pro Leu
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auggacaaga aguacagcau cggacuggac aucggaacaa acagcgucgg augggcaguc 60
aucacagacg aauacaaggu cccgagcaag aaguucaagg uccugggaaa cacagacaga 120
cacagcauca agaagaaccu gaucggagca cugcuguucg acagcggaga aacagcagaa 180
gcaacaagac ugaagagaac agcaagaaga agauacacaa gaagaaagaa cagaaucugc 240
uaccugcagg aaaucuucag caacgaaaug gcaaaggucg acgacagcuu cuuccacaga 300
cuggaagaaa gcuuccuggu cgaagaagac aagaagcacg aaagacaccc gaucuucgga 360
aacaucgucg acgaagucgc auaccacgaa aaguacccga caaucuacca ccugagaaag 420
aagcuggucg acagcacaga caaggcagac cugagacuga ucuaccuggc acuggcacac 480
augaucaagu ucagaggaca cuuccugauc gaaggagacc ugaacccgga caacagcgac 540
gucgacaagc uguucaucca gcugguccag acauacaacc agcuguucga agaaaacccg 600
aucaacgcaa gcggagucga cgcaaaggca auccugagcg caagacugag caagagcaga 660
agacuggaaa accugaucgc acagcugccg ggagaaaaga agaacggacu guucggaaac 720
cugaucgcac ugagccuggg acugacaccg aacuucaaga gcaacuucga ccuggcagaa 780
gacgcaaagc ugcagcugag caaggacaca uacgacgacg accuggacaa ccugcuggca 840
cagaucggag accaguacgc agaccuguuc cuggcagcaa agaaccugag cgacgcaauc 900
cugcugagcg acauccugag agucaacaca gaaaucacaa aggcaccgcu gagcgcaagc 960
augaucaaga gauacgacga acaccaccag gaccugacac ugcugaaggc acuggucaga 1020
cagcagcugc cggaaaagua caaggaaauc uucuucgacc agagcaagaa cggauacgca 1080
ggauacaucg acggaggagc aagccaggaa gaauucuaca aguucaucaa gccgauccug 1140
gaaaagaugg acggaacaga agaacugcug gucaagcuga acagagaaga ccugcugaga 1200
aagcagagaa cauucgacaa cggaagcauc ccgcaccaga uccaccuggg agaacugcac 1260
gcaauccuga gaagacagga agacuucuac ccguuccuga aggacaacag agaaaagauc 1320
gaaaagaucc ugacauucag aaucccguac uacgucggac cgcuggcaag aggaaacagc 1380
agauucgcau ggaugacaag aaagagcgaa gaaacaauca caccguggaa cuucgaagaa 1440
gucgucgaca agggagcaag cgcacagagc uucaucgaaa gaaugacaaa cuucgacaag 1500
aaccugccga acgaaaaggu ccugccgaag cacagccugc uguacgaaua cuucacaguc 1560
uacaacgaac ugacaaaggu caaguacguc acagaaggaa ugagaaagcc ggcauuccug 1620
agcggagaac agaagaaggc aaucgucgac cugcuguuca agacaaacag aaaggucaca 1680
gucaagcagc ugaaggaaga cuacuucaag aagaucgaau gcuucgacag cgucgaaauc 1740
agcggagucg aagacagauu caacgcaagc cugggaacau accacgaccu gcugaagauc 1800
aucaaggaca aggacuuccu ggacaacgaa gaaaacgaag acauccugga agacaucguc 1860
cugacacuga cacuguucga agacagagaa augaucgaag aaagacugaa gacauacgca 1920
caccuguucg acgacaaggu caugaagcag cugaagagaa gaagauacac aggaugggga 1980
agacugagca gaaagcugau caacggaauc agagacaagc agagcggaaa gacaauccug 2040
gacuuccuga agagcgacgg auucgcaaac agaaacuuca ugcagcugau ccacgacgac 2100
agccugacau ucaaggaaga cauccagaag gcacagguca gcggacaggg agacagccug 2160
cacgaacaca ucgcaaaccu ggcaggaagc ccggcaauca agaagggaau ccugcagaca 2220
gucaaggucg ucgacgaacu ggucaagguc augggaagac acaagccgga aaacaucguc 2280
aucgaaaugg caagagaaaa ccagacaaca cagaagggac agaagaacag cagagaaaga 2340
augaagagaa ucgaagaagg aaucaaggaa cugggaagcc agauccugaa ggaacacccg 2400
gucgaaaaca cacagcugca gaacgaaaag cuguaccugu acuaccugca gaacggaaga 2460
gacauguacg ucgaccagga acuggacauc aacagacuga gcgacuacga cgucgaccac 2520
aucgucccgc agagcuuccu gaaggacgac agcaucgaca acaagguccu gacaagaagc 2580
gacaagaaca gaggaaagag cgacaacguc ccgagcgaag aagucgucaa gaagaugaag 2640
aacuacugga gacagcugcu gaacgcaaag cugaucacac agagaaaguu cgacaaccug 2700
acaaaggcag agagaggagg acugagcgaa cuggacaagg caggauucau caagagacag 2760
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cagacaggag gauucagcaa ggaaagcauc cugccgaaga gaaacagcga caagcugauc 3360
gcaagaaaga aggacuggga cccgaagaag uacggaggau ucgacagccc gacagucgca 3420
uacagcgucc uggucgucgc aaaggucgaa aagggaaaga gcaagaagcu gaagagcguc 3480
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uuccuggaag caaagggaua caaggaaguc aagaaggacc ugaucaucaa gcugccgaag 3600
uacagccugu ucgaacugga aaacggaaga aagagaaugc uggcaagcgc aggagaacug 3660
cagaagggaa acgaacuggc acugccgagc aaguacguca acuuccugua ccuggcaagc 3720
cacuacgaaa agcugaaggg aagcccggaa gacaacgaac agaagcagcu guucgucgaa 3780
cagcacaagc acuaccugga cgaaaucauc gaacagauca gcgaauucag caagagaguc 3840
auccuggcag acgcaaaccu ggacaagguc cugagcgcau acaacaagca cagagacaag 3900
ccgaucagag aacaggcaga aaacaucauc caccuguuca cacugacaaa ccugggagca 3960
ccggcagcau ucaaguacuu cgacacaaca aucgacagaa agagauacac aagcacaaag 4020
gaaguccugg acgcaacacu gauccaccag agcaucacag gacuguacga aacaagaauc 4080
gaccugagcc agcugggagg agacggagga ggaagcccga agaagaagag aaaggucuag 4140
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auggacaaga aguacuccau cggccuggac aucggcacca acuccguggg cugggccgug 60
aucaccgacg aguacaaggu gcccuccaag aaguucaagg ugcugggcaa caccgaccgg 120
cacuccauca agaagaaccu gaucggcgcc cugcuguucg acuccggcga gaccgccgag 180
gccacccggc ugaagcggac cgcccggcgg cgguacaccc ggcggaagaa ccggaucugc 240
uaccugcagg agaucuucuc caacgagaug gccaaggugg acgacuccuu cuuccaccgg 300
cuggaggagu ccuuccuggu ggaggaggac aagaagcacg agcggcaccc caucuucggc 360
aacaucgugg acgagguggc cuaccacgag aaguacccca ccaucuacca ccugcggaag 420
aagcuggugg acuccaccga caaggccgac cugcggcuga ucuaccuggc ccuggcccac 480
augaucaagu uccggggcca cuuccugauc gagggcgacc ugaaccccga caacuccgac 540
guggacaagc uguucaucca gcuggugcag accuacaacc agcuguucga ggagaacccc 600
aucaacgccu ccggcgugga cgccaaggcc auccuguccg cccggcuguc caagucccgg 660
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cugaucgccc ugucccuggg ccugaccccc aacuucaagu ccaacuucga ccuggccgag 780
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cggcuggaga accugaucgc ccagcugccc ggcgagaaga agaacggccu guucggcaac 720
cugaucgccc ugucccuggg ccugaccccc aacuucaagu ccaacuucga ccuggccgag 780
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cagaucggcg accaguacgc cgaccuguuc cuggccgcca agaaccuguc cgacgccauc 900
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Met Thr Gly Ala Ala Phe Lys Pro Asn Pro Ile Asn Tyr Ile Leu Gly
1 5 10 15
Leu Asp Ile Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Ala Met Val Glu Ile Asp
20 25 30
Glu Glu Glu Asn Pro Ile Arg Leu Ile Asp Leu Gly Val Arg Val Phe
35 40 45
Glu Arg Ala Glu Val Pro Lys Thr Gly Asp Ser Leu Ala Met Ala Arg
50 55 60
Arg Leu Ala Arg Ser Val Arg Arg Leu Thr Arg Arg Arg Ala His Arg
65 70 75 80
Leu Leu Arg Ala Arg Arg Leu Leu Lys Arg Glu Gly Val Leu Gln Ala
85 90 95
Ala Asp Phe Asp Glu Asn Gly Leu Ile Lys Ser Leu Pro Asn Thr Pro
100 105 110
Trp Gln Leu Arg Ala Ala Ala Leu Asp Arg Lys Leu Thr Pro Leu Glu
115 120 125
Trp Ser Ala Val Leu Leu His Leu Ile Lys His Arg Gly Tyr Leu Ser
130 135 140
Gln Arg Lys Asn Glu Gly Glu Thr Ala Asp Lys Glu Leu Gly Ala Leu
145 150 155 160
Leu Lys Gly Val Ala Asn Asn Ala His Ala Leu Gln Thr Gly Asp Phe
165 170 175
Arg Thr Pro Ala Glu Leu Ala Leu Asn Lys Phe Glu Lys Glu Ser Gly
180 185 190
His Ile Arg Asn Gln Arg Gly Asp Tyr Ser His Thr Phe Ser Arg Lys
195 200 205
Asp Leu Gln Ala Glu Leu Ile Leu Leu Phe Glu Lys Gln Lys Glu Phe
210 215 220
Gly Asn Pro His Val Ser Gly Gly Leu Lys Glu Gly Ile Glu Thr Leu
225 230 235 240
Leu Met Thr Gln Arg Pro Ala Leu Ser Gly Asp Ala Val Gln Lys Met
245 250 255
Leu Gly His Cys Thr Phe Glu Pro Ala Glu Pro Lys Ala Ala Lys Asn
260 265 270
Thr Tyr Thr Ala Glu Arg Phe Ile Trp Leu Thr Lys Leu Asn Asn Leu
275 280 285
Arg Ile Leu Glu Gln Gly Ser Glu Arg Pro Leu Thr Asp Thr Glu Arg
290 295 300
Ala Thr Leu Met Asp Glu Pro Tyr Arg Lys Ser Lys Leu Thr Tyr Ala
305 310 315 320
Gln Ala Arg Lys Leu Leu Gly Leu Glu Asp Thr Ala Phe Phe Lys Gly
325 330 335
Leu Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Ala Glu Ala Ser Thr Leu Met Glu Met
340 345 350
Lys Ala Tyr His Ala Ile Ser Arg Ala Leu Glu Lys Glu Gly Leu Lys
355 360 365
Asp Lys Lys Ser Pro Leu Asn Leu Ser Ser Glu Leu Gln Asp Glu Ile
370 375 380
Gly Thr Ala Phe Ser Leu Phe Lys Thr Asp Glu Asp Ile Thr Gly Arg
385 390 395 400
Leu Lys Asp Arg Val Gln Pro Glu Ile Leu Glu Ala Leu Leu Lys His
405 410 415
Ile Ser Phe Asp Lys Phe Val Gln Ile Ser Leu Lys Ala Leu Arg Arg
420 425 430
Ile Val Pro Leu Met Glu Gln Gly Lys Arg Tyr Asp Glu Ala Cys Ala
435 440 445
Glu Ile Tyr Gly Asp His Tyr Gly Lys Lys Asn Thr Glu Glu Lys Ile
450 455 460
Tyr Leu Pro Pro Ile Pro Ala Asp Glu Ile Arg Asn Pro Val Val Leu
465 470 475 480
Arg Ala Leu Ser Gln Ala Arg Lys Val Ile Asn Gly Val Val Arg Arg
485 490 495
Tyr Gly Ser Pro Ala Arg Ile His Ile Glu Thr Ala Arg Glu Val Gly
500 505 510
Lys Ser Phe Lys Asp Arg Lys Glu Ile Glu Lys Arg Gln Glu Glu Asn
515 520 525
Arg Lys Asp Arg Glu Lys Ala Ala Ala Lys Phe Arg Glu Tyr Phe Pro
530 535 540
Asn Phe Val Gly Glu Pro Lys Ser Lys Asp Ile Leu Lys Leu Arg Leu
545 550 555 560
Tyr Glu Gln Gln His Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Gly Lys Glu Ile Asn
565 570 575
Leu Val Arg Leu Asn Glu Lys Gly Tyr Val Glu Ile Asp His Ala Leu
580 585 590
Pro Phe Ser Arg Thr Trp Asp Asp Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val
595 600 605
Leu Gly Ser Glu Asn Gln Asn Lys Gly Asn Gln Thr Pro Tyr Glu Tyr
610 615 620
Phe Asn Gly Lys Asp Asn Ser Arg Glu Trp Gln Glu Phe Lys Ala Arg
625 630 635 640
Val Glu Thr Ser Arg Phe Pro Arg Ser Lys Lys Gln Arg Ile Leu Leu
645 650 655
Gln Lys Phe Asp Glu Asp Gly Phe Lys Glu Cys Asn Leu Asn Asp Thr
660 665 670
Arg Tyr Val Asn Arg Phe Leu Cys Gln Phe Val Ala Asp His Ile Leu
675 680 685
Leu Thr Gly Lys Gly Lys Arg Arg Val Phe Ala Ser Asn Gly Gln Ile
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Thr Asn Leu Leu Arg Gly Phe Trp Gly Leu Arg Lys Val Arg Ala Glu
705 710 715 720
Asn Asp Arg His His Ala Leu Asp Ala Val Val Val Ala Cys Ser Thr
725 730 735
Val Ala Met Gln Gln Lys Ile Thr Arg Phe Val Arg Tyr Lys Glu Met
740 745 750
Asn Ala Phe Asp Gly Lys Thr Ile Asp Lys Glu Thr Gly Lys Val Leu
755 760 765
His Gln Lys Thr His Phe Pro Gln Pro Trp Glu Phe Phe Ala Gln Glu
770 775 780
Val Met Ile Arg Val Phe Gly Lys Pro Asp Gly Lys Pro Glu Phe Glu
785 790 795 800
Glu Ala Asp Thr Pro Glu Lys Leu Arg Thr Leu Leu Ala Glu Lys Leu
805 810 815
Ser Ser Arg Pro Glu Ala Val His Glu Tyr Val Thr Pro Leu Phe Val
820 825 830
Ser Arg Ala Pro Asn Arg Lys Met Ser Gly Ala His Lys Asp Thr Leu
835 840 845
Arg Ser Ala Lys Arg Phe Val Lys His Asn Glu Lys Ile Ser Val Lys
850 855 860
Arg Val Trp Leu Thr Glu Ile Lys Leu Ala Asp Leu Glu Asn Met Val
865 870 875 880
Asn Tyr Lys Asn Gly Arg Glu Ile Glu Leu Tyr Glu Ala Leu Lys Ala
885 890 895
Arg Leu Glu Ala Tyr Gly Gly Asn Ala Lys Gln Ala Phe Asp Pro Lys
900 905 910
Asp Asn Pro Phe Tyr Lys Lys Gly Gly Gln Leu Val Lys Ala Val Arg
915 920 925
Val Glu Lys Thr Gln Glu Ser Gly Val Leu Leu Asn Lys Lys Asn Ala
930 935 940
Tyr Thr Ile Ala Asp Asn Gly Asp Met Val Arg Val Asp Val Phe Cys
945 950 955 960
Lys Val Asp Lys Lys Gly Lys Asn Gln Tyr Phe Ile Val Pro Ile Tyr
965 970 975
Ala Trp Gln Val Ala Glu Asn Ile Leu Pro Asp Ile Asp Cys Lys Gly
980 985 990
Tyr Arg Ile Asp Asp Ser Tyr Thr Phe Cys Phe Ser Leu His Lys Tyr
995 1000 1005
Asp Leu Ile Ala Phe Gln Lys Asp Glu Lys Ser Lys Val Glu Phe
1010 1015 1020
Ala Tyr Tyr Ile Asn Cys Asp Ser Ser Asn Gly Arg Phe Tyr Leu
1025 1030 1035
Ala Trp His Asp Lys Gly Ser Lys Glu Gln Gln Phe Arg Ile Ser
1040 1045 1050
Thr Gln Asn Leu Val Leu Ile Gln Lys Tyr Gln Val Asn Glu Leu
1055 1060 1065
Gly Lys Glu Ile Arg Pro Cys Arg Leu Lys Lys Arg Pro Pro Val
1070 1075 1080
Arg Ser Gly Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro
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Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu
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Met Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln Leu
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Val Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val Glu Glu Val
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Ile Gly Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr Ala Tyr Asp
35 40 45
Glu Ser Thr Asp Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu
50 55 60
Tyr Lys Pro Trp Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys
65 70 75 80
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Leu Gly Val Arg Val Phe Glu Arg Ala Glu Val Pro Lys Thr Gly Asp
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Ser Leu Ala Met Ala Arg Arg Leu Ala Arg Ser Val Arg Arg Leu Thr
65 70 75 80
Arg Arg Arg Ala His Arg Leu Leu Arg Ala Arg Arg Leu Leu Lys Arg
85 90 95
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865 870 875 880
Lys Arg Phe Val Lys His Asn Glu Lys Ile Ser Val Lys Arg Val Trp
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Leu Thr Glu Ile Lys Leu Ala Asp Leu Glu Asn Met Val Asn Tyr Lys
900 905 910
Asn Gly Arg Glu Ile Glu Leu Tyr Glu Ala Leu Lys Ala Arg Leu Glu
915 920 925
Ala Tyr Gly Gly Asn Ala Lys Gln Ala Phe Asp Pro Lys Asp Asn Pro
930 935 940
Phe Tyr Lys Lys Gly Gly Gln Leu Val Lys Ala Val Arg Val Glu Lys
945 950 955 960
Thr Gln Glu Ser Gly Val Leu Leu Asn Lys Lys Asn Ala Tyr Thr Ile
965 970 975
Ala Asp Asn Gly Asp Met Val Arg Val Asp Val Phe Cys Lys Val Asp
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Lys Lys Gly Lys Asn Gln Tyr Phe Ile Val Pro Ile Tyr Ala Trp Gln
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Val Ala Glu Asn Ile Leu Pro Asp Ile Asp Cys Lys Gly Tyr Arg
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Ile Asp Asp Ser Tyr Thr Phe Cys Phe Ser Leu His Lys Tyr Asp
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Leu Ile Ala Phe Gln Lys Asp Glu Lys Ser Lys Val Glu Phe Ala
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Tyr Tyr Ile Asn Cys Asp Ser Ser Asn Gly Arg Phe Tyr Leu Ala
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Ala Lys Asn Leu Leu Cys Gly Phe Tyr Gly Arg His Ala Glu Leu Arg
100 105 110
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115 120 125
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Arg Ile Phe Ala Ala Arg Ile Tyr Asp Tyr Asp Pro Leu Tyr Lys Glu
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Gly Gly Leu Lys Glu Gly Ile Glu Thr Leu Leu Met Thr Gln Arg Pro
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Lys Gly Tyr Val Glu Ile Asp His Ala Leu Pro Phe Ser Arg Thr Trp
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Asp Asp Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Leu Gly Ser Glu Asn Gln
850 855 860
Asn Lys Gly Asn Gln Thr Pro Tyr Glu Tyr Phe Asn Gly Lys Asp Asn
865 870 875 880
Ser Arg Glu Trp Gln Glu Phe Lys Ala Arg Val Glu Thr Ser Arg Phe
885 890 895
Pro Arg Ser Lys Lys Gln Arg Ile Leu Leu Gln Lys Phe Asp Glu Asp
900 905 910
Gly Phe Lys Glu Cys Asn Leu Asn Asp Thr Arg Tyr Val Asn Arg Phe
915 920 925
Leu Cys Gln Phe Val Ala Asp His Ile Leu Leu Thr Gly Lys Gly Lys
930 935 940
Arg Arg Val Phe Ala Ser Asn Gly Gln Ile Thr Asn Leu Leu Arg Gly
945 950 955 960
Phe Trp Gly Leu Arg Lys Val Arg Ala Glu Asn Asp Arg His His Ala
965 970 975
Leu Asp Ala Val Val Val Ala Cys Ser Thr Val Ala Met Gln Gln Lys
980 985 990
Ile Thr Arg Phe Val Arg Tyr Lys Glu Met Asn Ala Phe Asp Gly Lys
995 1000 1005
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Ile Tyr Asp Tyr Asp Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Leu Gln Met Leu Arg
130 135 140
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Cys Trp Asp Thr Phe Val Asp His Gln Gly Cys Pro Phe Gln Pro Trp
165 170 175
Asp Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Gly Arg Leu Arg Ala
180 185 190
Ile Leu Gln Asn Gln Gly Asn Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
195 200 205
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210 215 220
Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys
225 230 235 240
Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser
245 250 255
Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr
260 265 270
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275 280 285
Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met
290 295 300
Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu
305 310 315 320
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325 330 335
Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu
340 345 350
Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile
355 360 365
Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile
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435 440 445
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450 455 460
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Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys
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725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
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805 810 815
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820 825 830
Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu
835 840 845
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850 855 860
Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu
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Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe
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Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His
900 905 910
Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser
915 920 925
Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser
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Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu
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His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
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Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys
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Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu
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Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu
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Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu
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Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu
1265 1270 1275
Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp
1280 1285 1290
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1295 1300 1305
Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser
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Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val
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Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met
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Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His
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gggaagcuca gaauaaacgc ucaacuuugg ccggaucugc caccaugacc ggugccgccu 60
ucaagcccaa ccccaucaac uacauccugg gccuggacau cggcaucgcc uccgugggcu 120
gggccauggu ggagaucgac gaggaggaga accccauccg gcugaucgac cugggcgugc 180
ggguguucga gcgggccgag gugcccaaga ccggcgacuc ccuggccaug gcccggcggc 240
uggcccgguc cgugcggcgg cugacccggc ggcgggccca ccggcugcug cgggcccggc 300
ggcugcugaa gcgggagggc gugcugcagg ccgccgacuu cgacgagaac ggccugauca 360
agucccugcc caacaccccc uggcagcugc gggccgccgc ccuggaccgg aagcugaccc 420
cccuggagug guccgccgug cugcugcacc ugaucaagca ccggggcuac cugucccagc 480
ggaagaacga gggcgagacc gccgacaagg agcugggcgc ccugcugaag ggcguggcca 540
acaacgccca cgcccugcag accggcgacu uccggacccc cgccgagcug gcccugaaca 600
aguucgagaa ggaguccggc cacauccgga accagcgggg cgacuacucc cacaccuucu 660
cccggaagga ccugcaggcc gagcugaucc ugcuguucga gaagcagaag gaguucggca 720
acccccacgu guccggcggc cugaaggagg gcaucgagac ccugcugaug acccagcggc 780
ccgcccuguc cggcgacgcc gugcagaaga ugcugggcca cugcaccuuc gagcccgccg 840
agcccaaggc cgccaagaac accuacaccg ccgagcgguu caucuggcug accaagcuga 900
acaaccugcg gauccuggag cagggcuccg agcggccccu gaccgacacc gagcgggcca 960
cccugaugga cgagcccuac cggaagucca agcugaccua cgcccaggcc cggaagcugc 1020
ugggccugga ggacaccgcc uucuucaagg gccugcggua cggcaaggac aacgccgagg 1080
ccuccacccu gauggagaug aaggccuacc acgccaucuc ccgggcccug gagaaggagg 1140
gccugaagga caagaagucc ccccugaacc uguccuccga gcugcaggac gagaucggca 1200
ccgccuucuc ccuguucaag accgacgagg acaucaccgg ccggcugaag gaccgggugc 1260
agcccgagau ccuggaggcc cugcugaagc acaucuccuu cgacaaguuc gugcagaucu 1320
cccugaaggc ccugcggcgg aucgugcccc ugauggagca gggcaagcgg uacgacgagg 1380
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ugccccccau ccccgccgac gagauccgga accccguggu gcugcgggcc cugucccagg 1500
cccggaaggu gaucaacggc guggugcggc gguacggcuc ccccgcccgg auccacaucg 1560
agaccgcccg ggaggugggc aaguccuuca aggaccggaa ggagaucgag aagcggcagg 1620
aggagaaccg gaaggaccgg gagaaggccg ccgccaaguu ccgggaguac uuccccaacu 1680
ucgugggcga gcccaagucc aaggacaucc ugaagcugcg gcuguacgag cagcagcacg 1740
gcaagugccu guacuccggc aaggagauca accuggugcg gcugaacgag aagggcuacg 1800
uggagaucga ccacgcccug cccuucuccc ggaccuggga cgacuccuuc aacaacaagg 1860
ugcuggugcu gggcuccgag aaccagaaca agggcaacca gacccccuac gaguacuuca 1920
acggcaagga caacucccgg gaguggcagg aguucaaggc ccggguggag accucccggu 1980
ucccccgguc caagaagcag cggauccugc ugcagaaguu cgacgaggac ggcuucaagg 2040
agugcaaccu gaacgacacc cgguacguga accgcuuccu gugccaguuc guggccgacc 2100
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accugcugcg gggcuucugg ggccugcgga aggugcgggc cgagaacgac cggcaccacg 2220
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gggaagctca gaataaacgc tcaactttgg ccggatctgc caccatggtg cccaagaaga 60
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gggaagcuca gaauaaacgc ucaacuuugg ccggaucugc caccauggac ggcuccggcg 60
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cuucugcuuu aaggggcauc guuua 145
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augugccgca acgcucugcc ggcaucguu 89
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augugccgca acgcucugcc ggcaucguu 89
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<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有2'-O-Me及PS修飾；關於取代及較佳實施例之詳細描述，]]>
參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 710]]>
ccaagugucu uccaguacga uuugguugua gcucccugaa accguugcua caauaaggcc 60
gucgaaagau gugccgcaac gcucugccuu cuggcaucgu u 101
<![CDATA[<210> 711]]>
<![CDATA[<211> 93]]>
<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 合成]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 711]]>
ccaagugucu uccaguacga uuugguugua gcucccuucg accguugcua caauaaggcc 60
gucgaugugc cgcaacgcuc ugccggcauc guu 93
<![CDATA[<210> 712]]>
<![CDATA[<211> 93]]>
<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 合成]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<400> 712]]>
ccaagugucu uccaguacga uuugguugua gcucccuucg accguugcua caauaaggcc 60
gucgaugugc cgcaacgcuc ugccggcauc guu 93
<![CDATA[<210> 713]]>
<![CDATA[<211> 101]]>
<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 合成]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<223> 含有2'-O-Me及PS修飾；關於取代及較佳實施例之詳細描述，]]>
參見所申請之說明書
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cuucaccagg agaagccguc acacguugua gcucccugaa accguugcua caauaaggcc 60
gucgaaagau gugccgcaac gcucugccuu cuggcaucgu u 101
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<![CDATA[<212> RNA]]>
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之詳細描述，參見所申請之說明書
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cuucaccagg agaagccguc acacguugua gcucccuucg accguugcua caauaaggcc 60
gucgaugugc cgcaacgcuc ugccggcauc guu 93
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之詳細描述，參見所申請之說明書
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ccaagugucu uccaguacga uuugguugua gcucccuccg uugcuacaau aaggccgucg 60
augugccgca acgcucugcc ggcaucguu 89
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<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
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augugccgca acgcucugcc ggcaucguu 89
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之詳細描述，參見所申請之說明書
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augugccgca acgcucugcc ggcaucguu 89
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<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
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之詳細描述，參見所申請之說明書
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之詳細描述，參見所申請之說明書
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<![CDATA[<223> 含有內部連接子L1、2'-O-Me及PS鍵聯修飾；關於取代及較佳實施例]]>
之詳細描述，參見所申請之說明書
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<222> (1)..(25)]]>
<![CDATA[<223> n為a、c、g或u]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> misc_feature]]>
<![CDATA[<222> (21)..(25)]]>
<![CDATA[<223> n可存在或可不存在]]>
<![CDATA[<400> 1012]]>
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnguugu agcucccuug caccguugcu acaauaaggc 60
cgucgaugug ccgcaacgcu cugccuaggc aucguu 96
Claims (168)
- 一種引導RNA (gRNA)，其包含內部連接子。
- 如請求項1之gRNA，其中該內部連接子具有約3至30個原子、視情況12至21個原子之橋接長度，且該連接子取代該gRNA之至少2個核苷酸。
- 如請求項1或2之gRNA，其中該內部連接子具有約6至18個原子、視情況約6至12個原子之橋接長度，且該連接子取代該gRNA之至少2個核苷酸。
- 如請求項1至3中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代2至12個核苷酸。
- 如請求項1至4中任一項之gRNA，其中該內部連接子位於該gRNA之重複反重複區(repeat-anti-repeat region)中。
- 如請求項1至5中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之重複反重複區的至少4個核苷酸。
- 如請求項1至6中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之重複反重複區的多至28個核苷酸。
- 如請求項1至7中任一項之gRNA，其中該內部連接子位於該gRNA之髮夾區中。
- 如請求項1至8中任一項之gRNA，其中該內部連接子位於該gRNA之連接區(nexus region)中。
- 如請求項1至9中任一項之gRNA，其中該內部連接子位於該gRNA之第一部分與該gRNA之第二部分之間的髮夾中，其中該第一部分及該第二部分一起形成雙螺旋部分。
- 如請求項1至10中任一項之gRNA，其中該重複反重複區中之內部連接子位於該重複反重複區之第一部分與第二部分之間的髮夾中，其中該第一部分及該第二部分一起形成雙螺旋部分。
- 如請求項1至11中任一項之gRNA，其中該內部連接子取代該gRNA之髮夾。
- 如請求項1至12中任一項之gRNA，其中該gRNA為單引導RNA (sgRNA)。
- 一種引導RNA (gRNA)，其中該gRNA為單引導RNA (sgRNA)，其包含引導區及該引導區之3'的保守部分，其中該保守部分包含重複反重複區、連接區、髮夾1區及髮夾2區，且包含以下中之至少一者： 4)第一內部連接子，其取代該重複反重複區之上莖區的至少2個核苷酸； 5)第二內部連接子，其取代該連接區之1或2個核苷酸；及 6)第三內部連接子，其取代該髮夾1之至少2個核苷酸。
- 如請求項14之gRNA，其中該第一內部連接子具有約9至30個原子、視情況約15至21個原子之橋接長度。
- 如請求項14或請求項15之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之環(loop)或其部分。
- 如請求項14至16中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代該上莖區之該環及莖，或其部分。
- 如請求項14至17中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代構成該上莖區之該環的所有核苷酸。
- 如請求項14至18中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代構成該上莖區之該環及莖的所有核苷酸。
- 如請求項14至19中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子具有約6至18個原子、視情況約6至12個原子之橋接長度。
- 如請求項14至20中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子具有約9至30個、視情況約12至21個原子之橋接長度。
- 如請求項14至21中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾1之環或其部分。
- 如請求項14至21中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代該髮夾1之該環及莖或其部分。
- 如請求項14至23中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代構成該髮夾1之該環的所有核苷酸。
- 如請求項14至23中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代構成該髮夾1之該環及莖的所有核苷酸。
- 如請求項14至25中任一項之gRNA，其中該sgRNA之該髮夾2區不含有任何內部連接子。
- 如請求項14至26中任一項之gRNA，其中該sgRNA為化膿鏈球菌( S. pyogenes) Cas9 sgRNA。
- 如請求項14至27中任一項之gRNA，其中該sgRNA包含含有SEQ ID NO: 400之序列的保守部分。
- 如請求項28之gRNA，其中 1) 相對於SEQ ID NO: 400，核苷酸13至16 (該上莖區之US5至US8)中之2、3或4者經該第一內部連接子取代； 2) 相對於SEQ ID NO: 400，核苷酸12至17 (該上莖區之US4至US9)經該第一內部連接子取代； 3) 相對於SEQ ID NO: 400，核苷酸11至18 (該上莖區之US3至US10)經該第一內部連接子取代； 4) 相對於SEQ ID NO: 400，核苷酸10至19 (該上莖區之US2至US11)經該第一內部連接子取代；或 5) 相對於SEQ ID NO: 400，核苷酸9至20 (該上莖區之US1至US12)經該第一內部連接子取代。
- 如請求項28或29之gRNA， 1) 其中相對於SEQ ID NO: 400，核苷酸36至37 (該連接區之N6至N7)經該第二內部連接子取代； 2) 其中相對於SEQ ID NO: 400，核苷酸53至56 (該髮夾1之H1-5至H1-8)中之2、3或4者經該第三內部連接子取代； 3) 其中相對於SEQ ID NO: 400，核苷酸52至57 (該髮夾1之H1-4至H1-9)經該第三內部連接子取代； 4) 其中相對於SEQ ID NO: 400，核苷酸51至58 (該髮夾1之H1-3至H1-10)經該第三內部連接子取代；或 5) 其中相對於SEQ ID NO: 400，核苷酸50至59 (該髮夾1之H1-1至H1-12)經該第三內部連接子取代。
- 如請求項28至30中任一項之gRNA，其中相對於SEQ ID NO: 400，核苷酸77至80缺失。
- 如請求項14至27中任一項之gRNA，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 201之序列。
- 如請求項32之gRNA，其中 1) 相對於SEQ ID NO: 201，核苷酸33至36中之2、3或4者經該第一內部連接子取代； 2) 相對於SEQ ID NO: 201，核苷酸32至37經該第一內部連接子取代； 3) 相對於SEQ ID NO: 201，核苷酸31至38經該第一內部連接子取代； 4) 相對於SEQ ID NO: 201，核苷酸30至39經該第一內部連接子取代；或 5) 相對於SEQ ID NO: 201，核苷酸29至40經該第一內部連接子取代。
- 如請求項32或33之gRNA，其中 1) 相對於SEQ ID NO: 201，核苷酸55至56經該第二內部連接子取代； 2) 相對於SEQ ID NO: 201，核苷酸50至53中之2、3或4者經該第三內部連接子取代； 3) 相對於SEQ ID NO: 201，核苷酸49至54經該第三內部連接子取代。
- 如請求項32至34中任一項之gRNA，其中相對於SEQ ID NO: 201，核苷酸77至80缺失。
- 如請求項1之gRNA，其中該內部連接子為第一內部連接子、第二內部連接子或第三內部連接子；且該gRNA包含引導區及保守區，該保守區包含以下中之一或多者： (a)經縮短之重複/反重複區，其中該經縮短之重複/反重複區缺乏2至24個核苷酸，其中 (i)相對於SEQ ID NO: 500，核苷酸37至64中之一或多者缺失且視情況經取代；且 (ii)核苷酸36連接至核苷酸65藉由(i)第一內部連接子單獨或與核苷酸組合取代4個核苷酸，或(ii)至少4個核苷酸；或 (b)經縮短之髮夾1區，其中該經縮短之髮夾1缺乏2至10個、視情況2至8個核苷酸，其中 (i)相對於SEQ ID NO: 500，核苷酸82至95中之一或多者缺失且視情況經取代；且 (ii)核苷酸81連接至核苷酸96藉由(i)第二內部連接子單獨或與核苷酸組合取代 4個核苷酸，或(ii)至少4個核苷酸；或 (c)經縮短之髮夾2區，其中該經縮短之髮夾2缺乏2至18個、視情況2至16個核苷酸，其中 (i)相對於SEQ ID NO: 500，核苷酸113至134中之一或多者缺失且視情況經取代；且 (ii)核苷酸112連接至核苷酸135藉由(i)第三內部連接子單獨或與核苷酸組合取代4個核苷酸，或(ii)至少4個核苷酸； 其中相比於SEQ ID NO: 500，核苷酸144至145中之一者或兩者視情況缺失。
- 一種引導RNA (gRNA)，其包含引導區及保守區，該保守區包含以下中之一或多者： (a)經縮短之重複/反重複區，其中該經縮短之重複/反重複區缺乏2至24個核苷酸，其中 (i)相對於SEQ ID NO: 500，核苷酸37至64中之一或多者缺失且視情況經取代；且 (ii)核苷酸36連接至核苷酸65藉由(i)第一內部連接子單獨或與核苷酸組合取代4個核苷酸，或(ii)至少4個核苷酸；或 (b)經縮短之髮夾1區，其中該經縮短之髮夾1缺乏2至10個、視情況2至8個核苷酸，其中 (i)相對於SEQ ID NO: 500，核苷酸82至95中之一或多者缺失且視情況經取代；且 (ii)核苷酸81連接至核苷酸96藉由(i)第二內部連接子單獨或與核苷酸組合取代4個核苷酸，或(ii)至少4個核苷酸；或 (c)經縮短之髮夾2區，其中該經縮短之髮夾2缺乏2至18個、視情況2至16個核苷酸，其中 (i)相對於SEQ ID NO: 500，核苷酸113至134中之一或多者缺失且視情況經取代；且 (ii)核苷酸112連接至核苷酸135藉由(i)第三內部連接子單獨或與核苷酸組合取代4個核苷酸，或(ii)至少4個核苷酸； 其中相比於SEQ ID NO: 500，核苷酸144至145中之一者或兩者視情況缺失； 其中該gRNA包含該第一內部連接子、該第二內部連接子及該第三內部連接子中之至少一者。
- 如請求項36或請求項37之gRNA，其中至少10個核苷酸為經修飾核苷酸。
- 如請求項36至38中任一項之gRNA，其中該引導區具有(i)相對於SEQ ID NO: 500，位置1至24內一個核苷酸之插入或1至4個核苷酸之缺失；或(ii) 24個核苷酸之長度。
- 如請求項36至39中任一項之gRNA，其中該引導區具有23或24個核苷酸之長度在SEQ ID NO: 500之位置1至24。
- 如請求項36至40中任一項之gRNA，其中相對於SEQ ID NO: 500，核苷酸144及145中之一或多者缺失。
- 如請求項36至41中任一項之gRNA，其中相對於SEQ ID NO: 500，核苷酸144及145均缺失。
- 如請求項36至42中任一項之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區缺乏2至28個核苷酸。
- 如請求項36至43中任一項之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區缺乏12至28個、視情況18至24個核苷酸。
- 如請求項36至44中任一項之gRNA，其中SEQ ID NO: 500之核苷酸37至64形成上莖，且該經縮短之重複/反重複區之上莖的一或多個鹼基對缺失。
- 如請求項36至45中任一項之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區之上莖包含不超過一個、兩個、三個或四個鹼基對。
- 如請求項36至46中任一項之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區具有長度11個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
- 如請求項36至47中任一項之gRNA，其中該經縮短之重複/反重複區具有單一雙螺旋部分。
- 如請求項36至48中任一項之gRNA，其中相對於SEQ ID NO: 500，該經縮短之重複/反重複區之上莖包括一或多個取代。
- 如請求項36至49中任一項之gRNA，其中該第一內部連接子取代核苷酸49至52中之至少一部分或全部。
- 如請求項36至50中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區具有長度4至8個、視情況7至8個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
- 如請求項36至51中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區具有單一雙螺旋部分。
- 如請求項36至52中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區之一個或兩個鹼基對缺失。
- 如請求項36至53中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區之莖的長度為七個或八個鹼基配對核苷酸。
- 如請求項36至54中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區的位置85至86中之一或多者及核苷酸91至92中之一或多者缺失。
- 如請求項36至55中任一項之gRNA，其中相對於SEQ ID NO: 500，該經縮短之髮夾1區的核苷酸82至95中之一或多者經取代。
- 如請求項36至56中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子取代核苷酸87至90中之至少一部分或全部。
- 如請求項36至56中任一項之gRNA，其中該第二內部連接子取代核苷酸81至95中之至少一部分或全部。
- 如請求項36至58中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾1區具有2至15個經修飾核苷酸。
- 如請求項36至59中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區缺乏2至18個、視情況2至16個核苷酸。
- 如請求項36至60中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區的位置113至121中之一或多者及核苷酸126至134中之一或多者缺失。
- 如請求項36至61中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區包含不成對區。
- 如請求項36至62中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區具有兩個雙螺旋部分。
- 如請求項63之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區具有長度4個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
- 如請求項63或64之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區具有長度4至8個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
- 如請求項63至65中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區具有長度4至6個鹼基配對核苷酸之雙螺旋部分。
- 如請求項36至66中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區之上莖包含一個、兩個、三個或四個鹼基對。
- 如請求項36至67中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區的位置113至121及126至134全部缺失。
- 如請求項36至68中任一項之gRNA，其中相對於SEQ ID NO: 500，該經縮短之髮夾2區的核苷酸113至134中之一或多者經取代。
- 如請求項36至69中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代核苷酸122至125中之至少一部分或全部。
- 如請求項36至70中任一項之gRNA，其中該第三內部連接子取代核苷酸112至135中之至少一部分或全部。
- 如請求項36至71中任一項之gRNA，其中該經縮短之髮夾2區具有2至15個經修飾核苷酸。
- 如請求項1至72中任一項之gRNA，其中該gRNA之引導區包含至少兩個經修飾核苷酸、視情況至少四個經修飾核苷酸。
- 如請求項1至73中任一項之gRNA， 1) 其包含3'端修飾，且包含該重複/反重複區之上莖區中之修飾； 2) 其包含3'端修飾，及該髮夾1區中之修飾；或 3) 其包含3'端修飾，及該髮夾2區中之修飾。
- 如請求項1至74中任一項之gRNA， 1) 其包含5'端修飾，及包含該重複/反重複區之上莖區中之修飾； 2) 其包含5'端修飾，及該髮夾1區中之修飾； 3) 其包含5'端修飾，及該髮夾2區中之修飾； 4) 其包含5'端修飾、該重複/反重複區之上莖區中之修飾，及3'端修飾； 5) 其包含5'端修飾、該髮夾1區中之修飾，及3'端修飾； 6) 其包含5'端修飾、該髮夾1區中之修飾、該髮夾2區中之修飾，及3'端修飾；或 7) 其包含5'端修飾、該重複/反重複區中之修飾、該髮夾1區中之修飾、該髮夾2區中之修飾，及3'端修飾。
- 如請求項74至75中任一項之gRNA，其中該重複/反重複區、該髮夾1區或該髮夾2區中之修飾包含選自以下之經修飾核苷酸：2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸，及核苷酸間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯，或其組合。
- 如請求項1至76中任一項之gRNA，其中該引導區之核苷酸1至3經修飾，且該引導區中核苷酸1至3以外的核苷酸未經修飾。
- 一種單引導RNA (sgRNA)，其包含如表4A中所示之SEQ ID NO: 1001-1012或任何其他序列中之任一者。
- 如請求項1至78中任一項之gRNA，其包含與如表4A中所示之SEQ ID No: 1001-1012或任何其他序列中之任一者之核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%或70%一致性的核苷酸序列。
- 如請求項1至79中任一項之gRNA，其包含與如表4A至4B中所示之SEQ ID No: 1001-1002及710-759中之任一者之核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%或70%一致性的核苷酸序列，其中與表4A中之參考序列標識符(identifier)之核苷酸對應的該gRNA之各核苷酸的修飾與表4B中之參考序列標識符中所示的修飾一致或等效。
- 如請求項1至80中任一項之gRNA，其包含與如表4A至4B中所示之SEQ ID No: 1001-1002及710-759中之任一者之核苷酸序列的X至3'端之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的核苷酸序列，其中X為保守區之第一個核苷酸。
- 如請求項1至42及44至81中任一項之gRNA，其進一步包含含有2'-O-Me修飾之核苷酸的3'尾。
- 如請求項1至82中任一項之gRNA，其中該gRNA將核酸酶引導至目標序列以進行結合。
- 如請求項1至83中任一項之gRNA，其中該gRNA將核酸酶引導至目標序列以誘導該目標序列內雙股斷裂。
- 如請求項1至84中任一項之gRNA，其中該gRNA將核酸酶引導至目標序列以誘導該目標序列內單股斷裂。
- 如請求項82至84中任一項之gRNA，其中該核酸酶為NmeCas9。
- 如請求項86之gRNA，其中該Nme Cas9為Nme1 Cas9、Nme2 Cas9或Nme3 Cas9。
- 如請求項1至87中任一項之gRNA，其中該gRNA包含保守取代，例如以保持鹼基配對。
- 如請求項1至88中任一項之gRNA，其中該內部連接子具有約6埃(Angstrom)至37埃之橋接長度。
- 如請求項1至89中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含1至10個彼此共價連接的乙二醇次單元。
- 如請求項1至90中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含至少兩個彼此共價連接的乙二醇次單元。
- 如請求項1至91中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含3個彼此共價連接的乙二醇次單元。
- 如請求項1至92中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含6個彼此共價連接的乙二醇次單元。
- 如請求項1至93中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含式(I)之結構： ~-L0-L1-L2-# (I) 其中： ~指示連至前一核苷酸之3'取代基的鍵； #指示連至後一核苷酸之5'取代基的鍵； L0為空或C 1-3脂族基； L1為-[E 1-(R 1)] m-，其中 各R 1獨立地為視情況經1或2個E 2取代之C 1-5脂族基團， 各E 1及E 2獨立地為氫鍵接受體，或各自獨立地選自環烴及雜環烴，且 各m為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；且 L2為空、C 1-3脂族基，或為氫鍵接受體。
- 如請求項94之gRNA，其中該內部連接子包含PEG-連接子。
- 如請求項94或請求項95之gRNA，其中該內部連接子包含具有1至10個乙二醇單元之PEG-連接子。
- 如請求項94至96中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含具有3至6個乙二醇單元之PEG-連接子。
- 如請求項94至97中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含具有3個乙二醇單元之PEG-連接子。
- 如請求項94至97中任一項之gRNA，其中該內部連接子包含具有6個乙二醇單元之PEG-連接子。
- 如請求項1至99中任一項之gRNA，其中該gRNA為包含經縮短之保守部分的短引導RNA，且該內部連接子取代至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。
- 如請求項1至35或78至100中任一項之gRNA，其中該gRNA為包含sgRNA之保守部分的短單引導RNA (短sgRNA)，該保守部分包含髮夾區，其中該髮夾區缺乏至少5至10個核苷酸。
- 如請求項101之gRNA，其中該至少5至10個缺乏核苷酸為連續的。
- 如請求項101或102之gRNA，其中該至少5至10個缺乏核苷酸 i. 位於髮夾1內； ii. 位於髮夾1內，及相對於SEQ ID NO: 400之髮夾1與髮夾2之間的「N」； iii. 位於髮夾1內及緊鄰髮夾1之3'的兩個核苷酸； iv. 包括髮夾1之至少一部分； v. 位於髮夾2內； vi. 包括髮夾2之至少一部分； vii. 位於髮夾1及髮夾2內； viii. 包括髮夾1之至少一部分且包括相對於SEQ ID NO: 400之髮夾1與髮夾2之間的「N」； ix. 包括髮夾2之至少一部分且包括相對於SEQ ID NO: 400之髮夾1與髮夾2之間的「N」； x. 包括髮夾1之至少一部分，包括相對於SEQ ID NO: 400之髮夾1與髮夾2之間的「N」，且包括髮夾2之至少一部分； xi. 位於髮夾1或髮夾2內，視情況包括相對於SEQ ID NO: 400之髮夾1與髮夾2之間的「N」； xii. 為連續的； xiii. 為連續的且包括相對於SEQ ID NO: 400之髮夾1與髮夾2之間的「N」； xiv. 為連續的且跨越髮夾1之至少一部分及髮夾2之一部分； xv. 為連續的且跨越髮夾1之至少一部分及相對於SEQ ID NO: 400之髮夾1與髮夾2之間的「N」；或 xvi. 為連續的且跨越髮夾1之至少一部分及緊鄰髮夾1之3'的兩個核苷酸。
- 如請求項1至35或78至103中任一項之gRNA，其中該gRNA為包含sgRNA之保守部分的短單引導RNA (短sgRNA)，該保守部分包含髮夾區，其中該髮夾區缺乏至少5至10個核苷酸，且其中該短sgRNA包含5'端修飾或3'端修飾。
- 如請求項1至35或78至104中任一項之gRNA，其中該至少5至10個核苷酸包含SEQ ID NO:400之核苷酸54至61、SEQ ID NO:400之核苷酸53至60；或SEQ ID NO:400之核苷酸54至58，視情況其中該短sgRNA包含至少H1-1至H1-5及H2-1至H2-12之修飾。
- 如請求項1至35或78至105中任一項之gRNA，其包含經縮短之髮夾1區，或經取代且視情況經縮短之髮夾1區，其中 (i) 在該經取代且視情況經縮短之髮夾1中以下核苷酸對中之至少一者經華特生-克里克(Watson-Crick)配對核苷酸取代：H1-1與H1-12、H1-2與H1-11、H1-3與H1-10，或H1-4與H1-9，且該髮夾1區視情況缺乏 (aa) H1-5至H1-8中之任一者或兩者， (bb) 以下核苷酸對中之一者、兩者或三者：H1-1與H1-12、H1-2與H1-11、H1-3與H1-10，或H1-4與H1-9，或 (cc) 該髮夾1區之1至8個核苷酸；或 (ii) 該經縮短之髮夾1區缺乏6至8個核苷酸，較佳6個核苷酸；且 (aa) 相對於SEQ ID NO: 400，位置H1-1、H1-2或H1-3中之一或多者缺失或經取代，或 (bb) 相對於SEQ ID NO: 400，位置H1-6至H1-10中之一或多者經取代；或 (iii) 相對於SEQ ID NO: 400，該經縮短之髮夾1區缺乏5至10個核苷酸，較佳5至6個核苷酸，且位置N18、H1-12或n中之一或多者經取代。
- 如請求項1至35或78至106中任一項之gRNA，其包含經縮短之上莖區，其中相對於SEQ ID NO: 400，該經縮短之上莖區缺乏1至6個核苷酸，且其中該經縮短之上莖區的6、7、8、9、10或11個核苷酸包括少於或等於4個取代。
- 如請求項1至35或78至107中任一項之gRNA，其相對於SEQ ID NO: 400包含在LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2及H2-14中之任一者或多者之取代，其中該取代核苷酸既不為後接腺嘌呤之嘧啶，亦不為前接嘧啶之腺嘌呤。
- 如請求項106之gRNA，其中該經縮短且經取代之髮夾1缺乏1至4個核苷酸，且核苷酸H1-4至H1-9經內部連接子取代。
- 如請求項106之gRNA，其中該經縮短且經取代之髮夾1缺乏以下核苷酸對中之一者或兩者：H1-1與H1-12、H1-2與H1-11，或H1-3與H1-10；且核苷酸H1-4至H1-9經內部連接子取代。
- 如請求項1至35或78至110中任一項之gRNA，其包含上莖區，其中該上莖修飾包含該上莖區中之US1至US12中之任一者或多者的修飾。
- 如請求項1至35或78至111中任一項之gRNA，其包含經縮短之上莖區，其中該經縮短之上莖區缺乏1至6個核苷酸。
- 如請求項1至35或78至111中任一項之gRNA，其包含經縮短之上莖區，其中該經縮短之上莖區缺乏7至10個核苷酸，且2個核苷酸經內部連接子取代。
- 如請求項112或113之gRNA，其中該內部連接子具有約3至30個原子、視情況12至21個原子、6至18個原子、或6至12個原子之橋接長度。
- 如請求項1至114中任一項之gRNA，其中該gRNA包含修飾。
- 如請求項115之引導RNA，其中該修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸、2'-H修飾之核苷酸(DNA)、2'-O,4'-C-伸乙基修飾之核苷酸(ENA)、鎖定(locked)核苷酸(LNA)，或非鎖定(unlocked)核苷酸(UNA)。
- 如請求項115或116之引導RNA，其中該修飾包含核苷酸間的硫代磷酸酯(PS)鍵。
- 如請求項117之引導RNA，其中 (i) 該引導RNA為sgRNA，且該修飾包含該引導RNA之5'端的五個核苷酸中之一或多者的修飾； (ii) 該引導RNA為sgRNA，且該修飾包含該引導RNA之3'端的五個核苷酸中之一或多者的修飾； (iii) 該引導RNA為sgRNA，且該修飾包含該引導RNA之5'端的四個核苷酸中之各者之間的PS鍵； (iv) 該引導RNA為sgRNA，且該修飾包含該引導RNA之3'端的四個核苷酸中之各者之間的PS鍵； (v) 該引導RNA為sgRNA，且該修飾包含該引導RNA之5'端的前三個核苷酸中之各者的2'-O-Me修飾之核苷酸；或 (vi) 該引導RNA為sgRNA，且該修飾包含該引導RNA之3'端的最後三個核苷酸中之各者的2'-O-Me修飾之核苷酸。
- 如請求項1至118中任一項之gRNA，其中該gRNA之3'核苷酸為包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸。
- 如請求項1至119中任一項之gRNA，其中該gRNA包含3'尾。
- 如請求項120之gRNA，其中該3'尾包含至少1至10個核苷酸，視情況1、2、3、4或5個核苷酸。
- 如請求項120或121之gRNA，其中該3'尾以包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸終止。
- 如請求項120至122中任一項之gRNA，其中該3'尾之長度為1個核苷酸。
- 如請求項120至123中任一項之gRNA，其中該3'尾由包含尿嘧啶或經修飾尿嘧啶之核苷酸組成。
- 如請求項120至124中任一項之gRNA，其中該3'尾包含存在於該3'尾中之核苷酸中之任一者或多者的修飾。
- 如請求項120至125中任一項之gRNA，其中該3'尾之修飾為2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸及核苷酸間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯中之一或多者。
- 如請求項125或126之gRNA，其中該3'尾經完全修飾。
- 如請求項1至119中任一項之gRNA，其中該gRNA不包含3'尾。
- 如請求項1至128中任一項之gRNA，其中該gRNA包含3'端修飾或5'端修飾。
- 如請求項129之gRNA，其中該3'或5'端修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸。
- 如請求項129或請求項130之gRNA，其中該3'或5'端修飾包含或進一步包含核苷酸間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
- 如請求項1至131中任一項之gRNA，其包含在髮夾區或該髮夾區中之修飾。
- 如請求項132之gRNA，其包含該髮夾區中之修飾，其中該髮夾區中之修飾包含選自以下之經修飾核苷酸：2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯，或其組合。
- 如請求項132或133之gRNA，其中該髮夾區中之修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸。
- 如請求項132至134中任一項之gRNA，其中該髮夾區中之修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。
- 如請求項1至135中任一項之gRNA，其包含在上莖區或該上莖區中之修飾。
- 如請求項136之gRNA，其中該上莖修飾包含以下中之任一者或多者： i. 該上莖區中之US1至US12 (對應於SEQ ID NO: 400之核苷酸9至20)中之任一者或多者的修飾；及 ii. 該上莖區中之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或所有12個核苷酸的修飾。
- 如請求項136或137之gRNA，其中該上莖修飾包含以下中之一或多者： i. 2'-OMe修飾之核苷酸； ii. 2'-O-moe修飾之核苷酸； iii. 2'-F修飾之核苷酸； iv. 2'-H修飾之核苷酸(DNA)； v. 2'-O,4'-C-伸乙基修飾之核苷酸(ENA)； vi. 鎖定核苷酸(LNA)； vii. 非鎖定核苷酸(UNA)；及 viii. (i.)至(iii.)中之一或多者的組合。
- 一種單引導RNA (sgRNA)，其包含如表2A至2C中所示之SEQ ID NO: 211-230或任何其他序列中之任一者。
- 如請求項1至139中任一項之gRNA，其包含與如表2A至2C中所示之SEQ ID No: 211-230或任何其他序列中之任一者之核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%或70%一致性的核苷酸序列。
- 如請求項1至140中任一項之gRNA，其包含與如表2A至2C中所示之SEQ ID NO: 101-108、120-175、177-184、211-230中之任一者之核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%或70%一致性的核苷酸序列，其中與表2C中之參考序列標識符之核苷酸對應的該gRNA之各核苷酸的修飾與表2A或2B中之參考序列標識符中所示的修飾一致或等效。
- 如請求項1至141中任一項之gRNA，其包含與如表2A至2C中所示之SEQ ID NO: 101-108、120-175、177-184及211-230中之任一者之核苷酸序列的X至3'端之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的核苷酸序列，其中X為保守區之第一個核苷酸。
- 一種組合物，其包含如請求項1至142中任一項之gRNA與脂質奈米顆粒(LNP)締合。
- 一種組合物，其包含如請求項1至142中任一項之gRNA或如請求項143之組合物，其進一步包含核酸酶或編碼該核酸酶之mRNA。
- 一種LNP組合物，其包含如請求項1至142中任一項之gRNA。
- 一種LNP組合物，其包含如請求項14至35及73至142中任一項之gRNA及編碼SpyCas9之mRNA。
- 如請求項145或請求項146之LNP組合物，其中該LNP包含十八碳-9,12-二烯酸(9z,12z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯或8-((7,7-雙(辛氧基)庚基)(2-羥乙基)胺基)辛酸壬酯。
- 如請求項145至147中任一項之組合物，其中該LNP包含陽離子脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)之莫耳比約4.5至6.5，視情況約6.0之N:P。
- 如請求項144至148中任一項之組合物，其中該核酸酶包含蛋白質或編碼該核酸酶之核酸。
- 如請求項149之組合物，其中該核酸酶為Cas核酸酶。
- 如請求項150之組合物，其中該Cas核酸酶為Cas9。
- 如請求項151之組合物，其中該Cas9為化膿鏈球菌Cas9 (SpyCas9)。
- 如請求項151之組合物，其中該Cas9為NmeCas9，視情況其中該NmeCas9為Nme1Cas9、Nme2Cas9或Nme3Cas9。
- 如請求項144至153中任一項之組合物，其中該核酸酶為裂解酶、切口酶，或無催化活性之核酸酶，或為包含去胺酶之融合蛋白。
- 如請求項144至154中任一項之組合物，其中編碼該核酸酶之核酸係選自： a. DNA編碼序列； b. 具有開放閱讀框架(ORF)之mRNA； c. 表現載體中之編碼序列； d. 病毒載體中之編碼序列。
- 如請求項155之組合物，其中該mRNA包含SEQ ID NO: 321-323、361、363-372及374-382中之任一者之序列。
- 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至142中任一項之gRNA或如請求項143至156中任一項之組合物及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種修飾目標DNA之方法，其包含將以下中之任一者或多者遞送至細胞： i. 如請求項1至142中任一項之gRNA； ii. 如請求項143至156中任一項之組合物；及 iii. 如請求項157之醫藥調配物。
- 如請求項158之方法，其中該方法造成基因之插入或缺失。
- 如請求項158或159之方法，其進一步包含將模板遞送至該細胞，其中該模板之至少一部分併入目標DNA中在或接近Cas蛋白所誘導之雙股斷裂位點。
- 如請求項1至142中任一項之gRNA、如請求項143至156中任一項之組合物或如請求項157之醫藥調配物，其用於製備治療疾病或病症的藥劑。
- 一種如請求項1至142中任一項之gRNA、如請求項143至156中任一項之組合物或如請求項157之醫藥調配物的用途，其用於製造治療疾病或病症的藥劑。
- 一種組合物，其包含如請求項1至142中任一項之gRNA，其中該組合物不包含該gRNA之非連接部分。
- 一種固體載體，其共價連接至如請求項1至142中任一項之gRNA之連接子。
- 一種合成包含內部連接子之gRNA的方法，其中該方法為單合成製程。
- 一種合成gRNA之方法，其中內部連接子在合成期間沿線(in line)併入。
- 一種合成gRNA之方法，其使用一系列連續偶合反應，其中該等反應包含： a) 用於第一核苷酸與第二核苷酸之共價連接的偶合反應； b) 用於內部連接子與該第二核苷酸之共價連接的偶合反應；及 c) 用於第三核苷酸與該內部連接子之共價連接的偶合反應， 其中用於該等共價連接之偶合反應全部相同。
- 如請求項167之方法，其中使用胺基亞磷酸酯(phosphoramidite)化學方法進行共價連接。
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