KR20010071227A - 무세포 키메라플라스티 및 이형이중나선 돌연변이성벡터를 진핵세포에 이용 - Google Patents

무세포 키메라플라스티 및 이형이중나선 돌연변이성벡터를 진핵세포에 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포질 세포 추출물 및 플라스미드상에 테스트 이중나선 DNA를 포함하는 무세포 시스템에서 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기 반응에 기초한 것이다. 반응은 특이적으로 돌연변이체kan r유전자를 전환시켜, 형질변환된MutS, RecA결손 박테리아에서 저항성 유전자형을 회복시키고, 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기의 신속하고 정량적인 비교를 허용한다. 이와 같은 시스템을 이용하면, 이형이중나선 돌연변이성 벡터로 불리는 이중나선 돌연변이성 벡터는 테스트한 돌연변이성 벡터보다 활성이 더 큰 것으로 나타났다. 또한, 테트라-2'-O-메틸-우리딘과 같은 뉴클레아제 저항성 올리고뉴클레오티드로 테트라티미딘 링커를 대체하여, 재조합에 의해 생성된 올리고핵산염기의 두 가닥에 연결시키고, 간섭 단편을 포함하는 DNA를 제거하면 활성이 개선되었다. 본 청구항은 이와 같은 개선점을 포함하는 이중나선 돌연변이성 벡터에 관계한다. 또 다른 구체예에서, 청구항은 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기, 무세포 효소 혼합물, 표적 서열을 포함하는 이중나선 DNA를 포함하는 반응 혼합물에 관계한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 이와 같은 혼합물을 이용하여 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기에서 개선점을 테스트하고 뿐만아니라 무세포 효소 혼합물의 활성에 화합물의 효과를 테스트하고 또한 표적 DNA 서열에 특정 변화를 만드는 것에 관계한다.

Description

무세포 키메라플라스티 및 이형이중나선 돌연변이성 벡터를 진핵세포에 이용{CELL-FREE CHIMERAPLASTY AND EUKARYOTIC USE OF HETERODUPLEX MUTATIONAL VECTORS}
2.키메라플라스티
여기에서 이용하는 진핵세포에서의 키메라플라스티는 1996년 10월 15일자로 궁고된 미국 특허 5,565,350와 1998년 3월 24일자 공고된 5,731,181 E.B.Kmiec (collectively "Kmiec")에서 설명한다. Kmiec에 의해 설명된 재조합에 의해 생성되는 올리고뉴클레오티드에는 리보형 즉, 2'-O-메틸-리보뉴클레오티드 및 데옥시리보-형 뉴클레오티드를 포함하는데, 이들은 서로 하이브리드되어, 키메라 돌연변이성 벡터(Chimeric Mutational Vectors(CMV))라고 칭한다. Yoon, K., et al.,March 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93,2071에서는 간/뼈/신장 형 알칼라인 포스포타제를 인코드하는 유전자에서 돌연변이를 복구하도록 고안된CMV에 대해 보고한바 있다. 플라스미드에 의해 알칼라인 포스포타제 유전자를 CHO 세포에 일시적으로 도입시킨다. 6시간 후에, CMV가 도입된다. CMV 유도후 24시간에 플라스미드를 회수하여 분석하였다. 그 결과를 보면, 알칼라인 포스포타제의 약 30 내지38%가 CMV에 의해 수복되었다는 것을 알 수 있다.
겸상적혈구 빈혈증 질환의 원인이 되는 사람의 β글로빈에 있는 돌연변이를 교정하도록 고안된 CMV 및 이를 성공적으로 이용한 것에 대해 Cole-Strauss, A., et al.,1996,Science 273:1386에서 설명하고 있다. 쥐의 간세포에 있는 쥐 혈액 응고 인자 Ⅸ 유전자에 돌연변이를 만들도록 고안된 CMV에 대해서는 Kren et al., 1998, Nature Medicine 4,285,290에서 설명하고 있다. 제 1 가닥의 한 개 염기가 제 2 가닥에 비-상보적인 염기와 쌍을 이루는 것으로 구성된 CMV를 Keen et al., June 1997, Hepatology 25, 1462에서 예를 들고 있다.
1996년 5월 1일자로 출원된 미국 특허 출원 08/640,517(E.B.Kmiec, A. Cole-Strauss and K. Yoon, 1997년 11월 6일자로 WO97/41141로 공고됨) 및 1997년 8월 5일자로 출원된 미국 특허 출원 08/906,265에서는 겸상 작혈구 빈혈증, 지중해 빈혈증 및 가우치 질환과 같은 조혈 세포의 유전적 질환 치료 방법 및 CMV가 유용하다는 것을 설명하고 있다.
제 2 가닥의 비-상보적인 염기와 쌍을 이루는 제 1 가닥의 염기를 가지는 CMV의 용도는 Kren et al, June 1997, Hepatology 25, 1462에서 설명하고 있다.Kren에서, 가닥에는 원하는 상이한 서열을 가지고, 이는 2'-Oapxlf 리보뉴클레오티드를 가지는 가닥으로 이는 3'단부 및 5'단부를 가지는 가닥과 쌍을 이룬다. 미국 특허 5,565,350에서는 5' 말단 뉴클레오티드를 가지는 사슬에 위치한 2'-O-메틸화된 RNA 단일 단편을 가지는 CMV에 대해 설명하고 있다.
출원인은 재조합 올리고뉴클레오티드의 이용 및 운반 시스템에 대해 가르치고 있는 다음의 예비 출원은 알고 있다; 1997년 4월 30일자로 출원된 Steer et al., Serial No. 60/045,288; 1997년 8월 5일자로 출원된 60/054,837; 1997년 11월 10일자로 출원된 60/064,996; Steer & Roy-Chowdhury et al.,의 1998년 2월 12일자로 출원된 60/074,497 "Methods of Prophylaxis and Treatment by Alteration of APO B and APO E Genes."
2.2. 무세포 재조합
무세포 추출물을 이용한 상동성 재조합에 대한 다양한 문헌이 보고된 바 있다.
Hotta, Y., et al., 1985, Chromosoma 93, 140-151는 이스트, 생쥐 정모세포,Lilium를 이용하여, 두가지 돌연변이된 pBR322 플라스미드사이에 상동성 재조합에 영향을 준 것에 대해 보고하고 있다. 플라스미드중 한 개는 슈퍼코일된 것이고, 두 번째 플라스미드는 선형화된 또는 슈퍼코일된 것이다. 최대 재조합 비율은 1% 미만이다. 돌연변이 결혼 pSV2neo 및 EJ 세포 추출물을 이용한 유사한 실험에 대해 Kucherlapati, R.S. et al., 1985, Molecular and Cellular Biology 5, 714-720에서 보고한 바 있다. 최대 재조합 비율은 약 0.2%가 된다. Kucherlapati는돌연변이체 플라스미드중 하나는 반드시 선형화되어야 한다고 보고하고 있다. 대조적으로 Hotta는 원형과 선형 플라스미드사이에 재조합 비율이 다소 높지만, 두 개 원형 플라스미드간에도 재조합이 일어난다고 보고하였다.
Jessberger, R., & Berg, P., 1991, Mol. & Cell. Biol. 11,445는 플라스미드간에 핵 추출물에 의해 촉매를 받은 재조합에 대해 보고하고 있다. 보고된 재조합 비율은 약 20%로 0.5%미만인 것과는 대조적이다. 또한, Jessberger는 원형화된 플라스미드와 선형 플라스미드간의 재조합과 같이 원형 플라스미드간에도 동일한 재조합 비율이 관찰되었다고 보고하였다.
사람의 핵 추출물을 이용한 관련 실험이 Lopez, B.S., et al., 1992, Nuclei Acids Research 20, 501-506에서 보고된 바 있다. Lopez는 선형화된 플라스미드와 연속적인 선별 조건에서는 생존할 수 없는 무관한 슈퍼코일된 플라스미드사이에 무세포 시스템에서 재조합에 대해 보고한 바 있다. 선형화된 플라스미드와 슈퍼코일 플라스미드에는 각각lacZ유전자를 포함하고 있는데 이는 선형화된 플라스미드에 있는 돌연변이체이다. 선형화된 플라스미드에는 돌연변이로부터 다양한 거리에서lacZ유전자가 들어있다. 따라서, 돌연변이 부위와 절단 부분사이에 상동성 재조합으로 플라스미드의 원형화가 이루어지고, 이는 생존할 수 있고,lacZ 기능을 얻는다. Lopez는 절단 부분과 돌연변이 부분이 15개 염기쌍으로 떨어져 있는 경우에 상동성 재조합이 감지되지 않는다고 보고하였다. 거리가 27개 염기쌍에 해당되는 경우에는 매우 낮은 수준의 상동성 재조합이 관찰되었다. 거리가 165개 염기쌍이상이 되는 경우에는 상동성 재조합의 비율이 증가되지 않는 것으로관찰되었다(Lopez et al., 1987, Nucleic Acids Research).
2.3. 재조합에서의 RAD51 및 RAD52 의 활성
두 개 염색체의 유전자가 교환되는 과정이 상동성 재조합이다. 두 개 유전 위치사이에 상동성 재조합 비율은 이들의 유전저인 연결에 대해 역비례하기 때문에 단단하게 연결된 유전자에서는 재조합이 드물다. 이의 같은 유전적인 기능에 추가하여, 상동성 재조합으로 체세포는 이중 가닥 브레이크에 의해 손상된 DNA를 수복시킨다.
상동성 재조합의 제 1 단계는 시냅스(synapse) 형성으로 보인다. 시냅스는 한 쇄가 두 개의 다른 쇄에 하이브리드되는 DNA 분자를 말한다. 시냅스 형성에는 ATP 가수분해로부터 에너지 입력 및 효소적인 활성을 요구한다. 시냅스 형성을 위해 요구되는 것으로 보이는 효소 활성에 대해 무세포 시스템에서의 인공적인 검사에서는 "가닥 전달"이다. 일반적인 가닥 전달 검사에서, 원형의 단일 가닥 DNA는 선형 이중나선과 복합하여, "nicked" 또는 이완된 원형 이중나선 및 선형 단일 가닥을 만든다. 이스트, 생쥐 및 사람의Rad51유전자를 클론하여, 가닥 전달을 촉매하였다.Rad51는 시냅스 형성에 참여하는 것으로 보인다(Baumann, P., et al., 1996, Cell 87, 757-766; Gupta, R.C., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 463-468). 또한, Rad52 단백질 및 복제 단백질 A 존재하에서 가닥 전달 활성이 추가로 가오하되었다(Baumann, P., & Wesr, S.C., 1997, EMBO J. 16, 5198-5206; New, J.H., et al., 1998, Nature 391, 407-410l Benson, F.E., et al., 198, Nature 391, 401-404). RecA와는 달리 RAD5 단백질은 RAD52 존재하에서 이중 나선 DNA에결합하여(Bauman & West op cit.; Benson, F.E., et al., EMBO J., 13,5764-5771), 이의 결합이 단일 가닥의 DNA로 향하게 된다.
이스트에서,Rad51또는Rad52결손 개체는 이중 가닥 브레이크를 수복하는 능력이 없기 때문에 방사능 감응성이다. 생쥐에서,Rad51녹아웃으로 배아가 치사된다(Tsuzuki, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci 93,6236-6240; Lin, S.D., & Hasty, P.A., Mol. Cell. Biol., 16, 7133).
2.4. 무세포 미스메취 수복
DNA 복제의 고유(역역학적) 충실성으로 "에러 정정" 기작없이 용인하기 어려운 높은 비율의 돌연변이가 유도된다. 미스메취 수복이 이와 같은 기작중의 하나이다. 미스메취 수복에서, 비-상보적인 염기에 쌍을 이룬 염기를 가지는 이중나선 DNA가 프로세스되어, 가닥중 한 개가 교정된다. 공정은 가닥중 한 개를 잘라내고, 이를 재합성하는 것이다. 무세포 진핵 시스템에서 미스메취 수복에 대해서는 Muster-Nassal & Kolodner, 1986. Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 7618-7622 (yeast); Glazer, P.M., et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7,218-224(HeLa cell); Thomas D.C.,et al., J. Biol. Chem., 266, 3744-3751 (HeLa cell); Holmes et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 5837-5841(HeLa cell and Drosophila)에서 볼 수 있다. HeLa 및 초파리(Drosophila) 무세포 시스템에는 미스메취된 이중 나선중 한 가닥이 완전한 활성을 위해 니크되어야 한다. 대조적으로 아프리카발톱개구리(Xenopus)난에서의 수복에서는 미스메취된 이중나선의 니크를 요구하지는 않는다(Varlet, I., et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7883-7887). 그러나, 종에서는 무작위 방식으로 미스메취가 수독되는데, 가령, 가닥이 동일한 빈도로 주형으로 작용한다.
이스트 및 사람에서 미스메취 수복에 요구되는 유전자의 대부분을 대장균(E.coli) 미스메취 수복 유전자와 상동성을 기초하여 클론하였다(Kolodner, R., 1996, Genes & Development 10, 1433-1442). 결손 미스메취 수복 유전자를 가지는 세포는 유전적으로 불안정성을 보이는데, 이를 복제 에러(RER)라고 하는데, 특히 미소 위성 DNA 및 악성 형질변환에서 볼 수 있다. RER세포의 추출물에는 미스메취 수복 활성을 가지지 않는다(Umar, A., et al., J. Biol. Chem. 269, 14367-14370).
1. 발명의 분야
키메라플라스티는 이중나선 올리고뉴클레오티드를 도입하여 표적 세포의 특정 DNA 부위에 직접적인 돌연변이를 유도하는 것에 관계하는데, 이는 세포의 상동성 재호합 및 에러 수복 시스템에 의해 이루어지고, 표적 DNA의 서열이 상이한 올리고뉴클레오티드의 것으로 전환된다. 본 발명은 무세포 시스템에서 실행되는 키메라플라스티에 관계한다.
도 1은 이중 헤어핀형 재조합 올리고머의 모양을 예로 든 것이다. 특징은 다음과 같다; a는 제 1 가닥; b는 제 2 가닥; c는 제 2 가닥의 제 1 사슬; 1은 5' 단부핵산염기; 2는 3'말단 핵산염기; 3은 5'말단 핵산염기; 4는 3' 단부핵산염기; 5는 제 1 단부 염기; 6은 제 2 단부 염기.
도 2는 돌출부를 가지는 단일 헤어핀형 재조합 핵산염기 모양을 예로 든 것이다. 특징은 위에서 정의한 것에 추가하여, d는 돌출부를 나타낸다. 동일한 핵산염기는 제 2 가닥의 5' 단부핵산염기와 5'말단 핵산염기라는 것이다.
4. 발명의 요약
키메라플라스티는 사람의 질병을 치료하고, 유전공학적으로 조작된 유용한사람 및 동물 균주를 개발시키는데 그 중요성이 증가된 공정이다. 개선된 재조합에 의해 생성되는 올리고뉴클레오티드 개발은 박테리아성 테스트 시스템을 이용하여 상당히 실현되었는데, 이는 R.Kumar et al.,의 "비-키메라성 돌연변이성 벡터"의 제목의 미국 특허 출원 및 "Heteroduplex Mutational Vectors and Use Thereofin Bacteria" by Kumar et al.,(hereafter collectively "Kumar")에서 설명하고 있다. Kumar의 기술에서는 박테리아 시스템에서 적절한 재조합에 의해 생성되는 올리고뉴클레오티드가 진핵세포에서도 적절한지를 설명하지는 않았다. 기존의in vivo및 세포 배양 키메라플라스티는 신속한 정량적인 분석을 위한 것은 아니고, 박테리아 시스템에서 이용된 DNA 표적 및 동일한 재조합에 의해 생성되는 올리고핵산염기를 이용할 수 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 박테리아 시스템에서 이용할 수 있도록 고안된 DNA 표적 및 재조합에 의해 생성된 올리고핵산염기를 이용하여 재조합에 의해 형성된 다른 형태의 올리고핵산염기와 재조합 및 상이한 phyla 수복 효소간의 적합성을 신속하게 평가할 수 있는 검사에 관한 것으로 예를 들면, 상이한 기질 선호성을 가지는 박테리아, 곤충 및 포유류의 재조합 및 미스메취 수복 효소에 관한 것이다.
본 발명의 추가 목적은 조직 또는 세포가 키메라플라스티에 표적이 될 수 있는지, 즉 필수 효소를 포함하는지를 신속하게 결정하는 검사이다. 또 다른 구체예에서, 세포 주 또는 조직에서 키메라플라스티 활성 수준을 변형시킬 수 있는 물질 또는 처리를 결정하는 검사에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 화합물이 재조합 및 수복 경로에 직용 또는 길항물질인지를 결정하는 검사에 관한 것이다.본 발명의 추가 목적은 무세포 시스템에서 DNA 서열에 특정한 유전적인 변화를 실제 만드는 것에 관한 것으로 이는 폴리메라제 사슬 연쇄 반응 PCR계 방법의 대체 방법이 된다.
본 발명은 키메라플라스티가 무세포 시스템에서 실행할 수 있다는 기대이상의 발현에 의한 것이다. 무세포 시스템의 성분은 가닥 전달 활성, 선택적으로 미스메취 수복 활성을 포함하는 효소 혼합물, 표적 DNA 서열, 재조합에의해 생성된 오릴고핵산염기이다. 효소 혼합물은 세포 추출물 또는 재조합에 의해 생성된 정제 효소 혼합물을 수득하여 만들 수 있다. 표적 DNA 서열은 절절하게는 박테리아와 같은 발현 숙주를 형질변환시키는데 이용되는 플라스미드가 된다. 적절한 구체예에서, 플라스미드는 슈퍼코일된 것이다. 재조합에 의해 생성된 올리고핵산염기는 세포에 부위 특이적인, 미리 결정된 유전적인 변화를 도입시키는데 이용되는 임의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유도체가 된다. 여기에서 언급한 것과 같이, 200개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유도체가 없는 것으로 구성된 DNA 이중나선은 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기가 아니다. 일반적으로, 재조합에 의해 형성되는 올리고핵산염기는 이중나선 뉴클레오티드로, 뉴클레오티드 유도체 또는 비-뉴클레오티드 가닥간의 링커를 포함하고, 20 내지 120개 핵산염기 또는 10 내지 60개 Watson-Crick 핵산염기 쌍을 가지는 것을 특징으로 한다. 적절한 구체예에서, 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기는 실제 이중나선으로 한 개의 3'단부 및 5'단부를 가지고, 따라서, 이중나선의 가닥은 올리고핵산염기 또는 비-올리고핵산염기 링커에 의해 공유적으로 연결된다. 본 발명의 또 다른 구체예는 Kumar에 따르면, 비-키메라성 돌연변이성 벡터(NCMV)가 진핵세포 특히, 포유류 세포의 가닥 전달 및 수복 효소에 효과적인 기질이라는 예상치 못한 발견에 기초한 것이다. 본 발명의 또 다른 구체예는 Kumar에 따르면, 두 가지 형태의 재조합에 의해 형성되는 올리고핵산염기, 이형이중나선 돌연변이성 벡터(HDMV), 3'단부 핵산염기 및 5'단부 핵산염기를 포함하는 가닥에 마주하는 가닥에 리보형 핵산염기 단일 단편을 가지는 벡터를 진핵세포 특히, 포유류에 이용하였을 경우에 가닥 전달 및 수복 효소에 우수한 결과를 가진다는 예상치 못한 발견에 기초한 것이다. 여기에서 이용된 이중나선 돌연변이성 벡터(DMV)는 집합적으로 CMV, HDMV NCMV를 말하는 것이다. HDMV는 키메라성 또는 비-키메라성이 될 수 있으나, CMV에는 HDMV를 포함하지 않는다.
5. 발명의 상세한 설명
본 발명에 따르면, 반응은 가닥 전달 및 미스메취 수복 활성으로 구성된 효소 혼합물, DNA 표적, 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기를 포함하는 반응 혼합물에서 실행된다. 한 구체예에서, DNA 표적은 돌연변이된 항생제 저항성 유전자 예를 들면, 플라스미드의tet또는neo(kan)가 되고, 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기는 Kmice에 따른 2'-O-메틸을 포함하는 CMV가 1:200 몰비로 포함된 것이다. 돌연변이체tet또는kan의 기능은 단일 염기의 특정 변형으로 회복된다. 반응은 페닐/클로로포름 추출에 의해 종료되고, 추출된 플라스미드는RacA또는MutS결손 박테리아로 전기천공된다. 표적 DNA의 변형 정도는 부계형(ampr)에 대한재조합 콜로니(kanr또는 tetr)의 비율로 결정할 수 있다. 플라스미드 및 키메라를 별로도 반응시키고, 클로로포름/페놀 추출후에 재조합시키면배경이상의 재조합 콜로니가 관찰되지 않는다. 미스메취 수복 결손 세포(LoVo) 추출물을 이용할 경우에 재조합 콜로니는 약 90% 감소된다. 이와 같은 기준에서는 미스메취를 잘라내는 시점까지 반응 혼합물에서 변형이 완료된다는 것을 나타내는 것이다. Kren et al. Nature Medicine, 1998, 4,285-290 Cole-Strauss et al., 1996, Sciece 273, 1386(a "Cole-Straus CMV")에서 설명하는 CMV 타입을 이용하면, 재조합 콜로니의 빈도는 105부계형 콜로니당 5정도가 된다.
여기에서 이용된 바와 같이, 무세포 효소 혼합물을 이용하여 상기 설명하는 결과를 얻을 때, 혼합물은 가닥 전달 및 미스메취 수복 활성을 가지는 것으로 간주한다.
하기 표 1에서는 박테리아 및 무세포 진핵 시스템에서의 Cole-Strauss CMV의 다중 변형 효과를 나타낸다. 각 시스템에서 측정된 임의 변형 활성간에 매우 양호한 상관관계가 있다. 특히, 가닥간 링커에서 티미딘대신에 2'-O-메틸 우라실로 치환하고(변이체 IV 및 V), 5'가닥에만 돌연변이체가 위치하고(변이체 VIb), 3'가닥에서 DNA가 결손되면, 이들 시스템에서 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기의 실행능력이 상당히 개선되었다.
이들 시스템에서, 3'가닥에 돌연변이체가 존재하면(변이체 VIa), 105재조합 콜로니에서 1개 이하로 기능 손실이 있게된다. 변이체 VIa에서 볼 수 있는 빈도는배경보다 훨씬 높다. 따라서, 여기에서 이용된 것과 같이, 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기는 동일한 돌연변이체 서열을 가지는 변이체 VIa에 따라 만들어진 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기 만큼 높은 재조합 비율을 무세포 시스템에 제공할 수 있는 올리고핵산염기 타입이다.
한 개 염기 돌연변이 서열을 가지는 변이체 VII는 재조합에 4.4/105빈도로 영향을 주는 것으로 관찰된다. 이와 같은 빈도는 배양된 세포 뿐만 아니라 박테리아세포에서 관찰된 것 이상으로 상당히 크다. 이론에 국한되지 않고, 이와 같은 차이는 무세포 시스템으로부터 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제가 상대적으로 없기 때문인 것으로 보인다.
5.1. 무세포 효소 혼합물
본 발명을 실행하기 위한 무세포 효소 혼합물에는 가닥 전달 및 미스메취 수복 활성을 포함한다. 여기에서 이용된 바와 같이, "무세포 효소 혼합물"이란 혼합물에서 살아있는 세포 바람직하게는 세포 기관 가령, 핵이나 미토콘드리아등을 배제한 것을 말한다. 무세포 효소 혼합물에서 요구되는 미스메취 수복 정도는 표적이되는 DNA 서열의 변형을 감지하는 방법 및 이의 용도에 따라 달라진다.
생화학적 수단, 예를 들면 제한효소 엔도뉴클레아제을 이용하여 변형을 감지할 경우에, 미스메취 수북 활성에는 미스메취 감지, 가닥 절단, 잘라내기, 절단부위를 채우기위한 가닥 재합성 및 결찰등이 포함된다. 재조합 결손 박테리아 가령, 대장균(E.coli) 균주 DH10에서 변형을 감지할 경우에, 가닥 재합성 및 결찰 활성은무세포 효소 혼합물에서 생략해도 된다. 여기에서 이용된 바와 같이, "미스메취 수복 활성"에는 재합성 및 결찰 활성이 포함되지 않는데, 이는 대부분의 응용분야에서는 요구되지 않으나, 무세포 효소 혼합물에서는 존재한다.
특정 응용분야에서, 가령, 식물 또는 포유류 효소로 이의 효과상에 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기 변형 효과를 검사할 경우에, 무세포 효소 혼합물에 의해 제공되는 미스메취 수복 활성이 적절하다. 생화학적 수단에 의해MutS박테리아와 같은 숙주 가령, 미스메취 수복 활성이 결여된 NR9162와 같은 숙주가 바람직하다.
특정 응용분야에서, 복합안된 표적 DNA로부터 표적 DNA와 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기 복합물을 분리시키는 것이 바람직하다. 분리는 친화성 리간드 가령, 바이오틴을 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기상에 도입하여 실시한다. 이 경우에, 두 개의 무세포 효소 혼합물을 분리전에 한 개 그리고 분리후에 한 개 이용할 수 있다. 제 1 혼합물에는 가닥 전달 활성만을 포함하고, 제 2 혼합물에는 미스메취 수복 활성만을 포함하도록 한다.
세포 추출물로써 무세포 효소 혼합물을 얻을 수 있다. Li & Kelly의 과정을 이용할 수 있다(Li.,J.J., et alia., 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 1238-1246). Li & Kelly의 과정은 세포질 추출물("cytoplasmic extract")이 된다. 세포는 저장성 완충액에서 기계적으로 파괴하고, 10분간 2000Xg, 15분간 12,000Xg에서 2회의 원심분리하여 상청액을 얻는다. 이론에 구애되지 않고, 가닥 전달 및 미스메취 수복 효소의 생리학적 세포 위치는 핵이 되나, 준비하는 동안에 핵으로부터 이와 같은 효소를 상당한 손실하게 되는 것으로 보인다. Dignam et al., 1983, Nucleic Acid Research 11,1475의 방법에 따른 천연 핵 추출물은 바람직하지 않다.
미스메취 수복 활성이 결여된 무세포 효소 혼합물은 복제 에러 표현형을 가지는 돌연변이 세포 추출물에서 수득할 수 있다(Umar et al., 1994, J. Biol. Chem 269,14367). 세포주 LoVo는 사람의MutS homolog(MSH2) 대립형질 모두가 결손된 것으로, 미스메취 수복 활성없이 가닥 전달 소스로 적합하다.
또 다른 구체예에서, 무세포 효소 혼합물은 재조합에 의해 생성된 효소로 구성된 조성물이 될 수 있다. 정의된 효소의 재조합 생산으로 가닥 전달 및 미스메취 수족에 관련된 모든 다른 효소가 없이 정의된 효소의 공지 양을 추가할 수 있다. 정의된 효소를 효소가 결여된 세포의 추출물에 첨가하면, 그 효소에 대해 정의된 효소 혼합물이 된다. 재조합체 Rad51는 Gupta, R.C., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci.94, 463-468의 방법을 이용하여 생산할 수 있다.
5.2. 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기
무세포 시스템에 이용할 수 있는 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기는 미국 특허 5,565,35; 5,731,181의 방법에 따라 작제할 수 있다. 또한, 재조합에 의해 형성되는 올리고핵산염기는 다음에 따라 만들 수도 있다.
정의
본 발명은 다음의 정의를 이용하면 더 잘 이해할 수 있다.
올리고핵산염기(oligonucleobase)는 해산염기 고분자로써, 고분자는 Watson-Crick 쌍에 의해 상보적인 서열을 가지는 DNA에 하이브리드할 수 있다.
핵산염기(Nucleobases)는 퓨린, 피리미딘 또는 이의 유도체 또는 유사체인 염기로 구성된다. 핵산염기에는 펩티드 핵산염기(peptide nucleobases), 펩티드 핵산염기의 소단위, 모르필린 핵산염기 및 펜토즈퓨라노실 부분을 포함하는 핵산염기 예를 들면 선택적으로 치환된 리보시드 또는 2'-데옥시리보시드등을 포함하는 핵산염기가 포함된다. 뉴클레오티드(Nucleotides)는 포스포디에스테르에 의해 연결된 핵산염기를 포함하는 펜토스퓨라노실이다. 핵산염기를 포함하는 다른 펜토즈퓨라노실도 포스포로티오에이트 또는 삼중에스테르화된 인산염등과 같은 치환된 포스포로디에스테르에 의해 연결될 수 있다.
올리고핵산염기(oligonucleobase) 화합물은 고분자의 최종 핵산 염기가 되는 한 개의 5' 및 3' 말단 핵산염기를 가진다. 리보형 핵산염기(Ribo-type nucleobases)는 2' 찬소가 하이드록실, 치환된 산소 또는 할로겐으로 치환된 메틸렌인 핵산염기를 가지고 있는 펜토스퓨라노실이다. 데옥시리보형 핵산염기(Deoxyribo type nucleobases)는 펩티드 핵산과 같은 펜토스퓨라노실 부분을 포함하지 않는 모든 핵산염기를 포함하는 리보형 핵산염기 이외의 핵산염기이다.
올리고핵산염기 가닥(oligonucleobase strand)은 동일한 길이의 상보적인 가닥의 모든 핵산염기에 실질적으로 하이브리드할 수 있는 올리고핵산염기 화합물의 부분 또는 단편을 포함한다. 올리고핵산염기 가닥에는 3' 단부 핵산염기 및 5'단부 핵산염기를 가진다. 가닥의 3' 단부 핵산염기는 상보적인 가닥의 5'단부 핵산염기에 하이브리드한다. 가닥의 두 개 핵산염기는 이들이 직접적으로 공유 연결또는 직접적으로 공유결합된 상보가닥의 핵산염기에 하이브리드하는 경우에 인접한 핵산염기가 된다. 올리고핵산염기 가닥은 연결된 핵산염기로 구성될 수 있는데, 이때 가닥의 각 핵산염기는 이에 인접한 핵산염기에 공유 결합된다. 또는, 가닥이 두 개의 인접한 핵산염기가 연결이 안된 경우에는 두 개의 사슬로 나뉘어진다. 가닥의 5'(또는 3') 단부 핵산염기는 이의 5'-O(또는 3'-O)에서 링커에 연결될 수 있고, 링커는 제 1 가닥에 상보적인 제 2 올리고핵산염기 가닥의 3'(또는 5') 단부에 연결되어, 두 개 가닥은 한 개의 올리고핵산염기 화합물을 만든다. 링커는 올리고뉴클레오티드, 올리고핵산염기 또는 다른 화합물이 될 수 있다. 올리고핵산염기의 5'말단 및 3'말단 핵산염기의 5'-O 및 3'-O는 올리고핵산염기 가닥을 보호하는 차단기로 치환될 수 있다. 그러나, 닫힌 고리 올리고뉴클레오티드에는 3' 또는 5' 말단 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 올리고핵산염기 화합물에 분할된 가닥이 포함되는 경우에는 3' 및 5' 말단 핵산염기가 가닥의 단부 핵산염기는 아니다.
모양
이중나선 돌연변이성 벡터(DMV)는 핵산염기 고분자로 구성되는데, 고준자는 퓨린 및 피리미딘의 Watson-Crick 염기쌍을 형성하여, 적절한 서열을 가지는 DNA에 하이브리드한다. 각 DMV는 적어도 12개 핵삼염기를 가지나 75개 이상을 초과하지 않는 제 1 과 제2 가닥으로 나뉜다. 적절한 구체예에서, 가닥의 길이는 20 내지 50개 핵산염기로 된다. 가닥에는 서로 상보적인 부분이 포함된다. 적절한 구체예에서, 두 가닥은 표적 서열과 원하는 서열이 다른 핵산염기를 제외하고는 모든 핵산염기에서 서로 상보적이다. 적어도 5개 핵산염기중 적어도 2개의 겹쳐지지 않는부분이 있는 것이 바람직하다.
핵산염기에는 퓨린 또는 피리미딘 또는 이의 유사체 또는 유도체인 염기가 포함된다. 이들은 두 가지 형태의 핵산염기가 있다. 리보형 핵산염기는 2'하이드록실, 치환된 2'-하이드록실 또는 2'-할로-치환된 리보즈를 가지는 리보뉴클레오시드이다. 리보형 핵산염기이외의 모든 핵산염기는 데옥시리보형 핵산염기이다. 따라서, 데옥시형 핵산염기에는 펩티드 핵산염기가 포함된다.
모든 핵산염기에서 서로 상보적인 가닥을 가지는 구체예에서, 제 1 가닥과 제 2 가닥의 서열은 표적 서열에 상동성인 부분과 표적 서열과는 다르고, 표적 유전자에 유전적인 변화를 도입시키는 한 가지 이상의 부분("돌연변이생성 부분")의 적어도 두 가지 부1분으로 구성된다. 돌연변이생성 부분은 3' 및 5' 방형 모두에서 상동성 부분에 바로 인접한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 두 개의 상동성 부분은 길이가 적어도 3개의 핵산염기 또는 적어도 6개의 핵산염기 또는 적어도 12개의 핵산염기가 된다. 모든 상동성 부분의 총 길이는 적어도 12개의 핵산염기, 적절하게는 16개, 가장 적절하게는 20개 내지 약 60개의 핵산염기가 된다. 상동성 부분 및 돌연변이생성 부분의 총 길이는 25개 내지 45개 핵산염기, 적절하게는 30개 내지 45개 핵산염기 또는 35개 내지 40개 핵산염기가 된다. 각 상동성부분은 8 내지 30개 핵산염기, 좀더 적절하게는 8 내지 15개 핵산염기, 가장 적절하게는 12개의 핵산염기 정도가 된다.
DMV의 한 가닥 또는 양 가닥에는 선택적으로 리보형 핵산염기를 포함한다. 적절한 구체예에서, DMV의 제 1 가닥에는 리보형 핵산염기만을 포함하고, 제 2 가닥에는 데옥시리보형 핵산염기만을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제 1 가닥은 두 개의 리보형 핵산염기사이에 끼워진 한 개의 데옥시리보형 핵산염기로 구성된다. 또 다른 구체예에서, 끼워진 단편에는 돌연변이생성 부분이 포함되고, 또는 HDMV의 경우에는 끼워진 부분은 또 다른 가닥의 돌연변이생성 부분과 쌍을 이룬다.
적절하게는 돌연변이생성 부분은 20 또는 그 이하의 염기로 구성되고, 적절하게는 6개 또는 그 이하, 가장 적절하게는 3개 또는 그 이하의 염기로 구성된다. 돌연변이생성 부분은 DMV의 상동성 부분과 표적 유전자 상동성 부분을 분리하는 서열 길이와는 다른 길이를 가지고 있어, 표적 유전자의 삽입 또는 결손이 된다. DMV를 이용하여 표적 유전자에 결손을 도입하는 경우에, 돌연변이생성 부분내에 확인가능한 염기는 없다. 다만, 돌연변이는 표적 유전자에서 분리된 두 개의 상동성 부분의 나란한 병치에 의해 영향을 받는다. 본 발명의 목적으로, 표적 유전자에 결손을 도입하는 DMV의 돌연변이생성 부분의 길이는 결손 길이로 간주된다. 한 구체예에서, 돌연변이생성 부분은 6개 내지 1개의 염기 적절하게는 3개 내지 1개의 염기가 결손된 것이다. 한 개의 DMV로 다중 분리된 돌연변이생성이 도입될 수 있는데, 이때 동일한 DMV에 다중 돌연변이생성 부분이 있다. 또는, 다중 DMV를 이용하여 동시에 한 개 유전자에 다중 유전적 변화를 도입하거나 동일한 세포에 다중 유전자에 유전적인 변화를 도입시킨다. 여기에서 돌연변이생성 부분을 이형성 부분이라고 한다. 원하는 다른 서열이 삽입 또는 결손될 경우에 두 가닥의 서열은 원하는 다른 서열을 가진다.
DMV는 24 내지 150개의 핵산염기로된 올리고핵산염기 화합물(고분자)이다.따라서, DMV에는 한 개의 3' 말단 및 한 개의 5'말단을 포함한다. 제 1 과 제2 가닥은 핵산염기 또는 비-올리고핵산염기 링커에 의해 공유적으로 연결될 수 있다. 적절한 구체예에서, 각 가닥의 3'단부 핵산염기는 3' 엑소뉴클레아제 공격으로부터 보호된다. 당분야에 공지의 기술 또는 개발된 몇 가지 기술에 의해 이와 같이 보호할 수 있다.
한 구체예에서, 한 가닥의 3' 단부 핵산염기에 또 다른 가닥의 5' 단부 핵산염기를 뉴클레아제 저항성 링커(가령, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-1,3-프로판디올 또는 폴리-1,4-부탄디올)로 연결하여, 3'엑소뉴클레아제 공격으로부터 보호할 수 있다. 두 개의 하이브리드된 핵산 가닥을 연결하는데 적합한 다양한 링커의 길이는 당업자가 인지할 수 있을 것이다. 6내 내지 3개의 에틸렌 단위를 가지고, 단부 포스포릴 부분을 가지는 폴리에틸렌 글리콜이 적절하다(Durand, M. et al., 1990, Nucleic Acid Research 18,6353; Ma, M. Y-X., et al., 1993, Nucleic Acids Res. 21,2585-2589). 적절한 또 다른 링커는 비스-포스포릴프로필-트랜스-4,4'-스틸베내디카르복시아미드이다(Letsinger, R.L., et alia, 1994, J. Am. Chem. Soc. 116,811-812; Letsinger, R.L. et alia, 1995, J.Am. Chem. Soc. 117,7323-7328). 통상적인 고형상 합성을 이용하여, DMV내로 이와 같은 링커를 삽입시킬 수 있다. 또는, DMV 가닥을 별도로 합성하여, 그 다음 하이브리드시켜, 1997년 2월 13일자로 공고된 WO 97/05284, Letsinger R.L. et alia에서 설명하는 것과 같이 티오포릴-을 포함하는 스틸베네디카르복사미드를 이용하여, 가닥간에 연결을 만들 수 있다.
또 다른 구체예에서, 링커는 2'-O-메틸, 2'-O-알릴 또는 2-F-리보뉴클레오티드와 같은 뉴클레아제 저항성이 있는 핵산염기로 구성된 1가닥 올리고핵산이 될 수도 있다. 4가 뉴클레오티드 서열, TTTT, UUUU, UUCG 및 3가 뉴클레오티드 서열, TTT, UUU, UCG이 특히 바람직한 뉴클레오티드 링커이다.
또 다른 구체예에서, 3'단부 핵산염기를 변형시켜, 3'-엑소뉴클레아제로부터 보호를 할 수 있다. 가닥의 3'단부 핵산염기가 3'말단인 경우에, 3'-OH, 2-OH에 또는 2' 또는 3' 포스페이트에 에스테르화반응을 시켜, 공간적으로 보호기를 부착시킬 수 있다. 적합한 보호기로는 1,2-(ω-아미노)-알킬디옥 또는 1,2-하이드록시메틸-(ω-아미노)-알킬이 된다. 만들 수 있는 변형에는 알켄 또는 분지쇄 알켄을 이용하는 것이 포함되고, ω-아미노산의 치환 또는 ω-아미노산을 ω-하이드록실로 치환하는 것이 포함된다. 다른 적절한 보호기에는 3'말단 메틸포스페이트(Tidd, D.M., et alia, 1989, Br.J.Crncer, 60,343-350); 3'-아미노헥실(Gamper H.G., et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21, 145-150)이 포함된다. 또는, 3' 또는 5' 말단 하이드록실을 치환된 인산 가령, 메틸포스포네이트 또는 포스포로티오에이트와 결합시켜, 유도할 수 있다.
또 다른 적절한 구체예에서, 3'단부핵산염기를 가닥의 뉴클레아제 저항성 핵산염기로 만들어 3'단부 핵산염기를 보호할 수 있다. 뉴클레아제 저항성 핵산염기에는 펩티드 핵산 핵산염기 및 2'치환된 리보뉴클레오티드등이 포함된다. 적절한 치환체에는 미국 특허 5,731,181; 미국 특허 5,334,711; 미국 특허 5,658,731 Sproat(Sproat)에서 설명하는 치환체, 특허 공고 EP 626 387; EP 679 657(Martin 출원)에서 설명하는 치환체가 포함되고, 이들은 참고문헌에 첨부한다. 여기에서이용된 것과 같이, Martin 출원 또는 Sproat에서 설명하는 치환된 2'-O를 가지는 리보뉴클레오티드 또는 2'플로오르, 클로로 또는 브롬 유도체를 "2-치환된 리보뉴클레오티드"라고 칭한다. 특히 적절한 2'-치환된 리보뉴클레오티드로는 2'-플로오르, 2'-메톡시, 2'-프로필옥시, 2'-알릴옥시, 2'-하이드록시에틸옥시, 2'-메틸에틸옥시, 2'-플로오르프로필옥시 및 2'-트리플로오르프로필옥시 치환된 리보뉴클레오티드등이 된다. 좀더 적절한 2'-치환된 리보뉴클레오티드 구체예로는 2'-플로오르, 2'-메톡시, 2'-메톡시에틸옥시, 2'-알릴옥시 치환된 뉴클레오티드가 된다.
"뉴클레아제 저항성 리보뉴클레오시드"에는 2'-치환된 리보뉴클레오티드 및 비-인산염에 의해 연결된 리보뉴클레오티드 또는 치환된 포스포디에스테르에 의해 연결된 리보뉴클레오티드와 같은 리보뉴클레오티드이외의 모든 2'-하이드록실 리보뉴클레오티드등이 포함된다. 핵산염기 저항성 데옥시리보뉴클레오시드도 비슷하게 정의할 수 있다. 적절한 구체예에서, DMV는 바람직하게는 적어도 3개 바람직하게는 6개의 뉴클레아제 저항성 리보뉴클레오시드가 포함된다. 한 가지 적절한 구체예에서, CMV에는 뉴클레아제 저항성 리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오티드만이 포함된다. 또 다른 적절한 구체예에서, 모든 다른 리보뉴클레오티드가 뉴클레아제 저항성이다.
각 DMV는 한 개의 3' 단부 및 한 개의 5' 단부를 가진다. 한 가지 구체예에서, 단부는 가닥의 말단 핵산염기이다. 또 다흔 구체예에서, 가닥은 서로 직접적으로 공유결합된 것이 아니라 또 다른 가닥을 통하여 공유결합된 두 개의 쇄로 나뉜다. 가닥이 두 개의 쇄로 나뉘는 구체예에서, 3' 및 5' 단부는 또 다른 가닥의인접한 핵산염기에 Watson-Crick 염기쌍을 이룬다. 이와 같은 가닥에서, 3' 및 5' 단부는 말단 핵산염기가 아니다. 가닥의 말단 핵산염기가 아닌 3' 또는 5' 단부는 선택적으로 상기에서 설명한 것과 같은 뉴클레아제 활성으로부터 공간적인 보호기로 치환될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 가닥의 말단 핵산염기에는 마주하는 가닥의 상응하는 핵산염기와 쌍을 이루지 않고, 가닥간의 링커 일부가 아닌 핵산염기에 부착된다. 이와 같은 구체예는 3' 또는 5' 돌출을 가지는 한 개의 "헤어핀" 모양을 가진다. 쌍을 이루지 않은 핵산염기 및 돌출부의 다른 성분은 가닥의 일부로 간주하지 않는다. 돌출부에는 자체 하이브리드된 핵산염기 또는 핵산염기가 아닌 부분 가령, 친화성 리간드 또는 라벨이 포함된다. 3' 돌출부를 가지는 DMV의 특히 적절한 구체예에서, 5'핵산염기를 포함하는 가닥은 데옥시형-핵산염기만으로 구성되어, 마주하는 가닥의 리보형 핵산염기와 쌍을 이룬다. 3' 돌출부를 가지는 DMV의 또 다른 적절한 구체예에서, 5'단부 핵산염기를 포함하는 가닥의 서열은 원하는 다른 서열이 되고, 돌출부를 가지는 가닥의 서열은 표적 DNA의 서열이 된다.
본 발명의 특히 적절한 구체예는 두 개 가닥이 완전히 상보적이지 않는 DMV가 된다. 한 가닥의 서열은 변형될 표적 DNA의 서열이 되고, 또 다른 가닥의 서열은 사용자가 표적 서열에 대신하여 도입시키고자 하는 원하는 다른 서열로 구성된다. 표적 및 원하는 서열이 상이한 핵산염기에서 한 가닥의 염기는 다른 가닥에 있는 비-상보적인 염기와 쌍을 이룬다. 이와 같은 DMV는 이형이중나선 돌연변이성 벡터(Heteroduplex Mutational Vectors(HDMV))라고 한다. 한 가지 적절한 구체예에서, 원하는 서열은 나뉜 가닥 쇄의 서열이다. 둘째로 적절한 구체예에서, 원하는 서열은 리보형 핵산염기가 포함안된 쇄 또는 가닥에서 볼 수 있다. 좀더 적절한 구체예에서, 원하는 서열은 리보형 핵산염기가 포함안된 나뉜 가닥 쇄의 서열이 된다.
핵산염기간의 결합
DMV 가닥의 핵산염기간에 결합은 표적 서열에 DMV가 하이브리드되는 것과 필적할 수 있는 임의 연결이 될 수 있다. 이와 같은 서열에는 자연계 핵산에서 볼 수 있는 통상적인 포스포디에스테르 연결이 포함된다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드의 유기적인 고형상 합성은 미국 특허 34,069.에서 설명하고 있다.
또는, 핵산염기간 연결은 포스포로티오에이트, 치환된 포스포로트리에스테르와 같은 치환된 포스포로디에스테르가 될 수 있다. 또는 비-인산염, 인산을 포함하는 연결이 이용될 수 있다. 미국 특허 5,476,925(Letsinger)에서는 포스포로아미데이트 연결에 대해 설명한다. 3'-포스포로아미데이트 연결 (3'-NP(O-)(O)O-5')이 DMV에 이용하는데 적합한데, 그 이유는 5'-포스포아미데이트와 비교하였을 때 하이브리드 반응을 안정시키기 때문이다. 핵산염기간에 비-인산염 연결을 이용할 수 있다. 미국 특허 5,489,677에서는 인접 N 및 O를 가지는 핵산염기간 연결 및 이들의 합성 방법에 대해 설명한다. 3'-ON(CH3)CH2-5'(메틸렌메틸이미노) 연결이 적절하다. DMV에 이용할 수 있는 다른 적절한 연결에 대해서 미국 특허 5,731,181 (Kmiec)에서 설명하고 있다. 펜토세퓨라노실 부분이 부족하고, 펩티드 결합에 의해 연결된 핵산염기도 본 발명에 이용할 수 있다. 소위 펩티드 핵산(PNA)을 포함하는 올리고핵산염기에 대해서 미국 특허 5,539,082(Nielsen)에서 설명하고 있다. PNA/뉴클레오티드 키메라를 만드는 방법에 대해서는 WO 95/14706에서 설명하고 있다.
5.3. 특정 용도
본 발명의 이종이중나선 돌연변이 벡터 및 본 발명의 비-키메라성 돌연변이성 벡터를 선행기술에서의 키메라성 돌연변이성 벡터에 대신하여 진핵세포에 이용할 수 있다. Kmiec의 특허 공고 WO97/41141에서는 미국 특허 5,565,350 및 미국 특허 5,731,181에서 설명하는 것과 같이 키메라성 돌연변이성 벡터를ex vivo에서 이용하는 것에 대해 설명하고 있다.in vivo에서 키메라성 돌연변이성 벡터를 이용하는 것에 대해서는 Kren et al., 1998, Nature Medicine 4, 285에서 설명하고 있다.
제조합에 의해 형성된 올리고핵산염기를 당업자가 인지할 수 있을 정도의 몇 가지 목적에 맞게 무세포 시스템에 이용할 수 있다. 다음은 그 예를 설명하나 이에 국한시키지는 않는다.
재조합에 의해 형성된 올리고뉴클레오티드에서의 순도, 화학, 크기 및 모양에서의 변형 효과는 무세포 시스템에서 신속하고 정량적으로 테스트할 수 있다. 무세포 시스템은 재조합 효과를 운반 효과와는 무관하게 측정할 수 있는 추가 장점을 가진다. 효소 혼합물을 대체할 수 있는 화합물을 테스트하는 또 다른 구체예의 경우에, 무세포 시스템을 이용하여 키메라플라스티에 필요한 효소의 활성을 저해하는 또는 강화시키는 것으로 보이는 화합물을 테스트할 수 있다. 저해 화합물은 관련된 효소에 직접적으로 작용하는 경쟁적인 또는 비-경쟁적인 저해물질이 될 수 있다. 또는, 저해물질은 효소의 합성을 차단하거나 분해를 가속시키기 위해 추출물을 얻은 세포상에서 작용할 수 있다. 이와 같은 화합물은 관련 효소의 합성을 유도하거나 억제하면 작용할 수 있고 또는 관련 효소를 활성화시키거나 불활성화시키는 합성후 변형과정을 유도하여 작용할 수 있다.
무세포 시스템을 이용하여 키메라플라스티의 기작에 대해 특정 또는 관련 단백질을 테스트할 수 있다. 예를 들면 이와 같은 테스트는 문제의 단백질이 키메라플라스티에 관련이 있는 지를 결정하기 위해 단백질-특이적인 단클론 항체를 이용하여 실시할 수 있으나 이에 국한시키지는 않는다.
무세포 시스템의 또 다른 용도는 플라스미드의 특정 변형 또는 다른 분리된 DNA 분자를 특정하게 변형시키는 것이다. 이와 같은 목적에 이용되는 한 구체예에서, 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기에는 복합안된 표적 DNA로부터 표적 DNA복합물을 분리할 수 있도록 바이오틴과 같은 친화성 리간드를 포함한다. 이와 같은 구체예에서, 가닥 전달 단계 및 미스메취 수북 단계를 별도로 이용하여 키메라플라스티 반응을 실행하였다. 이와 같은 구체예를 이용하면, 변형된 DNA 표적의 비율을 증가시켜, 스크리닝에서 과도한 재료 및 노력없이도 비-선택적인 변형을 할 수 있다. 한 구체예에서, 친화성 리간드에 대한 수용체를 고형상 입자에 결합시켜, 입자에 올리고핵산염기/표적 DNA 복합체를 부착시킬 수 있다. 반응의 제 2 단계에서, 미스메취 수복 활성으로 표적 DNA를 변형시키고 방출하게 되는데, 과정의 제 2 단계의 상청액에는 변형된 플라스미드가 풍부하게 된다.
6. 실시예
하기 표 1에서는 kan 저항성 유전자에서 정지 코돈을 교정하여 CG 변환을 일으키기 위해 Kany-y 변이체를 이용한 관련된 카나마이신 및 암피실린 저항성 콜로니의 수를 보여준다.
다음은 이와 같은 데이터를 얻는데 이용된 재료 및 방법에 대한 설명이다.
무세포 추출물; HuH-7(Nakabayashi, H., et al., 1982, Cancer Res. 42, 3858)세포는 DMEM(10% 태아 송아지 혈청이 보충된)에서 중간 log 상까지 생장시킨다(105cells/㎖). 조직 배양 플라스크로부터 기계적으로 세포를 떼어내고, 500xg에서 펠렛화시킨다. 펠렛은 얼음으로 차게한 저장성 완충액(20mM HEPES, pH7.5 5mM KCl, 1.5mM MgCl2, 1mM DTT, 250mM 슈크로즈)로 세척하고, 을음으로 차게한 저장성 완충액(슈크로즈 제외)로 세척한 후에 저장성 완충액에 6.5X107세포/㎖ 수준이 되도록 재현탁시키고, 15분간 얼음위에 둔다. 그 다음 세포는 Dounce 균질화기를 이용하여, 3-5회 타격하여, 용혈시키고, 추가 45분간 얼음위에 둔다. 용혈물질은 10,000xg에서 10분간 원심분리하여 맑게한 다음, 상청액을 모아 사용할 때 까지 -80℃에 저장한다.
반응 조건; 무세포 효소 혼합물, 플라스미드, DMV는 최종 용적이 50㎕에서 반응시킨다. 반응 완충액은 20mM Tris, pH7.4, 15mM MgCl2, 0.4mM DTT, 1.0mM ATP가 된다. 플라스미드, DMV 및 추출 단백질의 최종 농도는 20㎍/㎖, 20㎍/㎖, 600㎍/㎖이 된다. 반응은 500㎕ "Eppendorf"튜브에서 실행하였다. 튜브는 미리 얼음상에서 차게한 후에 시약을 첨가하고, 추출물을 제외하고 혼합시킨다. 그 다음 추출물을 첨가하고, 반응은 37℃상에서 45분간 실시한다. 클로로포름/페놀 추출에 의해 반응을 종료시킨다. 핵산은 10%(v/v) 3M 아세테이트 나트륨, pH4.8, 2배 용적의 순수 EtOH을 이용하여 -20℃에서 침전시킨다.
박테리아 형질변환; 침전된 DMV-처리된 플라스미드를 용해시키고, 박테리아는 표준 기술을 이용하여 전기천공에 의해 형질변환시킨다. 전기천공후에, 박테리아는 1시간동안 항생제(카나마이신)없이 배양시키고, 그 다음 4시간동안 선택된 수준의 항생제 존재하에 배양시킨다.
분석; DMV의 효과는 카나마이신 저항성 콜로니와 암피실린 저항성 콜로니의 비율로 확인할 수 있는데, 이는 플라스미드 회수 및 전기 천공 효과로 측정된다. 하이에 제공되는 비율은 카나마이신의 선택된 수준 이하에서 4시간 동안 배양한 후에 얻은 데이터를 기초로한 것이다. 이와 같은 선택성 배양으로 kanr콜로니가 약 100배 증가되었다. 선-플레이팅 선별에 대해 교정된 절대 빈도에 대해 보고하고 있다.
DMV; 카나마이신 저항성을 도입시키기 위한 이중나선 돌연변이성 벡터의 일반적인 구조는 다음과 같다. 사이에 끼이는 단편, 3'상동성 부분 및 5'상동성 부분을 각각각 다음과 같이 표시하였다;"I", "H-3", "H-5". 가닥간의 링커는 "L"로나타내었다. 선택적인 chi 부위(5-GCTGGTGG-3') 및 이의 보체는 각각 X와 X'로 나타내었다. 3' 및 5' 돌연변이 부분은 M3' M5'로 각각 단일 뉴클레오티드로 나타내었다. 변이체 I는 Cole-Strauss, 1996, Science 273, 1386, and Kren, 1998, Nature Medicine 4, 285-290에서 설명하는 것과 같은 키메라 돌연변이성 벡터와 유사하다. 변이체 I는 이 명세서에서 Kany.y로 칭한다. "--"는 변이체의 특징을 나타내는 것으로, 변이체의 특징이 변이체 I의 특징과 동일하다는 것을 말한다.
상기 DMV는 TAG 정지 코돈이 TAC try 코돈으로 변환된 CG 전환을 일으킨다. I의 제 1 가닥에는 엑소뉴클레아제 보호된 3'단부가 결여되고, I의 제 2 가닥은 나누어진 가닥으로 이의 제 1 쇄는 원하는 상이한 서열이 된다. 변이체 Ⅳ와 V는 각각 뉴클레아제 저항성 링커(2'OMe-U4)에 의해 보호된 3'단부 엑소뉴클레아제를 가지는 각각 키메라 돌연변이성 벡터 및 비-키메라성 돌연변이성 벡터를 말한다. 변이체 VIa 및 VIb 는 키메라 이형이중나선 돌연변이성 벡터이다. 변이체 VIb는 원하는 상이한 서열이 제 1 쇄에서 볼 수 있는 변이체로 이때 쇄는 DNA 형 뉴클레오티드만으로 구성된다.
하기의 표에서는 박테리아 시스템에서 변이체 I에 대해 변이체의 활성 및 무세포 추출물에 대해 kanr/105플라스미드로의 전환 비율을 제공한다. 배경 비율은 무세포 시스템 및 박테리아 시스템에서 변이체 VIa와 박테리아에서 변이체 VII를 제외하고는 실험치와 비교하였을 때 무시할 수 있을 정도이다. 이와 같은 변이체에 대해 보고된 데이터는 배경에 대해 보정된 것이다. 변이체 VIa 및 VII에서는활성이 낮거나 없는 것을 볼 수 있다. 각 변이체 III-V는 두 시스템에서 변이체 I보다는 우위의 것으로, 이는 Yoon, Cole-Strauss and Kren의 공고에서 설명한 형태이다. 변이체 Ⅷ는 이와 같은 데이터로 추정한 것에 기초하여 최적의 키메라가 된다.
결과에서 볼 수 있는 것과 같이 무세포 추출물에서의 활성과 박테리아 시스템에서의 활성간에는 상당한 상관관계가 있다. 특히, 두 시스템에서 변이체 IV 및 IVb는 Kany.y보다 우수하고, 두 시스템에서 비-키메라성 돌연변이성 벡터는 활성을 가진다. 유일하게 상이한 것은 오로지 데옥시뉴클레오티드만을 포함하는 변이체 VII이다. 변이체 VII는 무세포 추출물에서는 활성이 있으나, 박테리아 시스템에서는 활성이 없다. 데옥시올리고뉴클레오티드도 진핵 세포에서 비활성인 것으로 나타났다. 이론에 구애되지 않고, 출원인은 무세포 시스템에서의 변이체 VII의 활성은 세포를 포함하는 시스템과 비교하였을 경우에 시스템에 존재하는 뉴클레아제의 양이 감소되었기 때문인 것으로 본다. 특히, 출원인은 5'단부 라벨된 46nt 단일 가닥 DNA가 37℃에서 10분간 무세포 추출물로 배양하였을 경우에 분해되지 않았다(1%미만)는 것을 발견하였다. 이와 유사한 결과를 46bp 5'단부 라벨된 이중나선 DNA 기질을 이용한 경우에도 얻을 수 있다. 반응 완충액은 2mM ATP, 1mM DTT, 25mM Tris-Acetate, pH 7.15, 5mM Mg이다.
테트라사이클린 저항성을 도입하기 위한 DMV의 서열은 하기와 같다;

Claims (59)

  1. DNA 서열을 변형시키기 위한 무세포 조성물에 있어서,
    a. 표적 서열을 포함하는 이중나선 DNA;
    b. 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기; 이는 DNA 서열을 표적으로 하고, 이의 변형을 인코드하고;
    c. 가닥 전달 활성을 가지는 무세포 효소 혼합물로 구성된 것을 특징으로 하는 무세포 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 올리고핵산염기는 적어도 20개이상 200개 미만의 핵산염기로 구성된 것을 특징으로 하는 무세포 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 올리고핵산염기는 적어도 10개이상 60개 미만의 Watson-Crick 핵산염기쌍으로 구성된 것을 특징으로 하는 무세포 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 올리고핵산염기는 1개의 3'단부 및 1개의 5'단부로 구성된 것을 특징으로 하는 무세포 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 이중나선 DNA는 두 개의 닫힌 원형 DNA 고분자로 구성된 것을 특징으로 하는 무세포 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 이중나선 DNA 서열은 프로모터에 연결될 원하는 유전자의 일부분으로 원하는 유전자가 숙주 유기체에서 발현되도록 하는 것을 특징으로 하는 무세포 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 무세포 효소 혼합물에는 미스메취 수복 활성이 부족한 것을 특징으로 하는 무세포 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 가닥 전달 활성은 진핵에서 유도된 효소에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 무세포 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 무세포 효소 혼합물은 Rad51 포유류 homolog 또는 Rad52 포유류 homolog에 대해 정의된 효소 혼합물인 것을 특징으로 하는 무세포 조성물.
  10. 제 8 항에 있어서, 무세포 효소 혼합물은 진핵 세포 추출물인 것을 특징으로 하는 무세포 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 무세포 효소 혼합물은 포유류 세포 추출물인 것을 특징으로 하는 무세포 조성물.
  12. 제 1 항에 있어서, 무세포 효소 혼합물에는 미스메취 수복 활성이 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 무세포 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 미스메취 수복 활성은 진핵에서 유도된 효소에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 무세포 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 무세포 효소 혼합물은 진핵 세포 추출물인 것을 특징으로 하는 무세포 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 무세포 효소 혼합물은 포유류 세포 추출물인 것을 특징으로 하는 무세포 조성물.
  16. 제 12 항에 있어서, 가닥 전달 활성은 진핵에서 유도된 효소에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 무세포 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 무세포 효소 혼합물은 진핵 세포 추출물인 것을 특징으로 하는 무세포 조성물.
  18. 제 1 항에 있어서, 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기는 이중나선 돌연변이성 벡터로 구성되는데, 이때 벡터는
    a. 적어도 12개이상 75개 미만의 연결된 핵산염기로 구성된 제 1 올리고핵산염기; 이 가닥은 제 1과 제 2 말단 핵산염기를 가지고;
    b. 제 1 가닥과 동일한 수의 핵산염기를 가지는 제 2 올리고핵산염기 가닥, 이때 가닥은 선택적으로 제 1 쇄 및 제 2 쇄로 나뉘어지고; 그리고
    c. 3' 단부 핵산염기 및 5'단부 핵산염기로 구성되는데, 이때
    i) 제 2 가닥의 3'단부및 5'단부핵산염기는 각각 제 1 말단 및 제 2 말단의 핵산염기에 Watson-Crick 쌍을 이루고; 그리고
    ii) 제 2 가닥에는 제 1 가닥의 핵산염기와 Watson-Crick 쌍을 이루는 적어도 5개의 연속적인 핵산염기로된 적어도 2개의 비-돌출부분을 포함하고;
    적어도 한 개의 가닥의 서열은 원하는 상이한 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 무세포 조성물.
  19. 원하는 유전자 부위를 변형시키는 방법에 있어서,
    a. i. 원하는 유전자를 변형시키는 것을 인코드하는 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기;
    ii. 원하는 유전자를 숙주 유기체에서 발현시키기 위해 프로모터에 연결된 원하는 유전자를 포함하는 이중나선 DNA 분자;
    iii. 가닥 전달 활성 및 미스메취 수북 활성을 가지는 무세포 효소 혼합물을 반응시키고; 이때 원하는 유전자는 표적 부위에서 변형되고;
    b. 유기체로 변형된 원하는 유전자를 도입시키고;
    c. 변형된 원하는 유전자가 발현되었는 지를 감지하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 올리고핵산염기는 적어도 20개이상 200개 미만의 핵산염기로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 올리고핵산염기는 적어도 10개이상 60개 미만의 Watson-Crick 핵산염기쌍으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 19 항에 있어서, 올리고핵산염기는 1개의 3'단부 및 1개의 5'단부로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 19 항에 있어서, 이중나선 DNA는 두 개의 닫힌 원형 DNA 고분자로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 19 항에 있어서, 변형된 원하는 유전자가 발현됨으로써 유기체에 선별가능한 성질을 부여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 19 항에 있어서, 변형된 원하는 유전자가 발현됨으로써 유기체에 관찰한 성질을 부여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. DNA 서열을 변형시키는 방법에 있어서,
    a. i. DNA 변형시키는 것을 인코드하는 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기;
    ii. 서열을 포함하는 이중나선 DNA 분자;
    iii. 가닥 전달 활성 및 미스메취 수북 활성을 가지는 무세포 효소 혼합물을 반응시키고; 이때 서열이 변형되고;
    b. 변형된 서열을 감지하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 변형된 서열을 감지하기 전에 변형안된 이중나선 DNA에 대해 변형된 이중나선 DNA가 풍부하도록 무세포 조성물을 분취하는 단계가 추가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 26 항에 있어서, 올리고핵산염기는 적어도 20개이상 200개 미만의 핵산염기로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 26 항에 있어서, 올리고핵산염기는 적어도 10개이상 60개 미만의 Watson-Crick 핵산염기쌍으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 26 항에 있어서, 올리고핵산염기는 1개의 3'단부 및 1개의 5'단부로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 26 항에 있어서, 재조합에 의해 형성된 올리고핵산염기는 이중나선 돌연변이성 벡터로 구성되는데, 이때 벡터는
    a. 적어도 12개이상 75개 미만의 연결된 핵산염기로 구성된 제 1 올리고핵산염기; 이 가닥은 제 1과 제 2 말단 핵산염기를 가지고;
    b. 제 1 가닥과 동일한 수의 핵산염기를 가지는 제 2 올리고핵산염기 가닥, 이때 가닥은 선택적으로 제 1 쇄 및 제 2 쇄로 나뉘어지고; 그리고
    c. 3' 단부 핵산염기 및 5'단부 핵산염기로 구성되는데, 이때
    i) 제 2 가닥의 3'단부및 5'단부핵산염기는 각각 제 1 말단 및 제 2 말단의 핵산염기에 Watson-Crick 쌍을 이루고; 그리고
    ii) 제 2 가닥에는 제 1 가닥의 핵산염기와 Watson-Crick 쌍을 이루는 적어도 5개의 연속적인 핵산염기로된 적어도 2개의 비-돌출부분을 포함하고;
    적어도 한 개의 가닥의 서열은 원하는 상이한 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 진핵세포에서 원하는 다른 서열에 표적 DNA 서열을 형질도입시키는 방법에 있어서,
    (A) 세포로 이중나선 돌연변이성 벡터를 투여하는데, 이때 벡터는
    a. 적어도 12개이상 75개 미만의 연결된 핵산염기로 구성된 제 1 올리고핵산염기; 이 가닥은 제 1과 제 2 말단 핵산염기를 가지고;
    b. 제 1 가닥과 동일한 수의 핵산염기를 가지는 제 2 올리고핵산염기 가닥, 이때 가닥은 선택적으로 제 1 쇄 및 제 2 쇄로 나뉘어지고; 그리고
    c. 3' 단부 핵산염기 및 5'단부 핵산염기로 구성되는데, 이때
    i) 제 2 가닥의 3'단부및 5'단부핵산염기는 각각 제 1 말단 및 제
    2 말단의 핵산염기에 Watson-Crick 쌍을 이루고; 그리고
    ii)3'단부핵산염기 및 제 2 말단 핵산염기는 3'엑소뉴클레아제 공격
    으로부터 보호되고;
    iii) 제 2 가닥에는 제 1 가닥의 핵산염기와 Watson-Crick 쌍을 이
    루는 적어도 5개의 연속적인 핵산염기로된 적어도 2개의 비-돌출부
    분을 포함하고;
    이때, 리보형 및 데옥시리보형 핵산염기로 구성된 Watson-Crick 염기
    쌍이 두 개 이상 연속하지 않으며;
    (B) 상이한 원하는 서열을 가지는 세포로부터 또는 이의 후손으로부터 DNA를 감지하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 제 1 가닥의 각 핵산염기는 제 2 가닥의 상보적인 핵산염기에 Watson-Crick 쌍을 이루는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 32 항에 있어서, 제 1 가닥의 서열은 상이한 원하는 서열로 구성된 것을특징으로 하는 방법.
  35. 제 32 항에 있어서, 제1 말단 핵산염기 및 3'단부핵산염기는 2'-메틸옥시-우리딘, 2'-알릴옥시-우리딘, 2'-플로오르-우리딘, 2'-메톡시-티미딘, 2'-알일옥시-티미딘, 2;-플로오르-티미딘, 폴리에틸렌 글리콜 및 트란스-4,4'-스틸베네카르복사미드에서 선택된 부분으로 구성된 링커에 의해 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 32 항에 있어서, 제2 말단 핵산염기 및 5'단부핵산염기는 2'-메틸옥시-우리딘, 2'-알릴옥시-우리딘, 2'-플로오르-우리딘, 2'-메톡시-티미딘, 2'-알일옥시-티미딘, 2;-플로오르-티미딘, 폴리에틸렌 글리콜 및 트란스-4,4'-스틸베네카르복사미드에서 선택된 부분으로 구성된 링커에 의해 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 32 항에 있어서, 제 2 가닥은 제 1 쇄 및 제 2 쇄로 구성되고, 제 1 쇄에는 리보형 핵산염기를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 제 1 가닥의 각 핵산염기는 제 2 가닥의 상보적인 핵산염기에 Watson-Crick 쌍을 이루는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 37 항에 있어서, 제 1 쇄의 서열은 상이한 원하는 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 32 항에 있어서, 제 1쇄는 5'단부 핵산염기로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 32 항에 있어서, 제 1쇄는 3'단부 핵산염기로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 진핵세포에서 상이한 원하는 서열에 표적 DNA 서열을 형질도입시키는 방법에 있어서,
    (A) 세포로 이중나선 돌연변이성 벡터를 투여하는데, 이때 벡터는
    a. 적어도 12개이상 75개 미만의 연결된 핵산염기로 구성된 제 1 올리고핵산염기; 이 가닥은 제 1과 제 2 말단 핵산염기를 가지고;
    b. 제 1 가닥과 동일한 수의 핵산염기를 가지는 제 2 올리고핵산염기 가닥, 이때 가닥은 선택적으로 제 1 쇄 및 제 2 쇄로 나뉘어지고; 그리고
    c. 3' 단부 핵산염기 및 5'단부 핵산염기로 구성되는데, 이때
    i) 제 2 가닥의 3'단부및 5'단부핵산염기는 각각 제 1 말단 및 제
    2 말단의 핵산염기에 Watson-Crick 쌍을 이루고; 그리고
    ii) 제 2 가닥에는 제 1 가닥의 핵산염기와 Watson-Crick 쌍을 이
    루는 적어도 5개의 연속적인 핵산염기로된 적어도 2개의 비-돌출부
    분을 포함하고;
    이때, 제 1 가닥의 서열은 표적 DNA 서열로 구성되고, 제 2 가닥의 서열은 원하는 상이한 서열로 구성되고,
    (B) 상이한 원하는 서열을 가지는 세포로부터 또는 이의 후손으로부터 DNA를 감지하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 제 1 가닥은 적어도 12개 리보형 핵산염기로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 42 항에 있어서, 제 2 가닥은 제 1 쇄와 제 2 쇄로 나뉘어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 44 항에 있어서, 제 1 쇄의 서열은 원하는 상이한 서열이고, 제 1 쇄에는 리보형 핵산염기가 포함되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 제 1 쇄는 5'단부 핵산염기로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 45 항에 있어서, 제 1 쇄는 3'단부 핵산염기로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 진핵세포에서 상이한 원하는 서열에 표적 DNA 서열을 형질도입시키는 방법에 있어서,
    (A) 세포로 이중나선 돌연변이성 벡터를 투여하는데, 이때 벡터는
    a. 적어도 12개이상 75개 미만의 연결된 핵산염기로 구성된 제 1 올리고핵산염기; 이 가닥은 제 1과 제 2 말단 핵산염기를 가지고;
    b. 제 1 가닥과 동일한 수의 핵산염기를 가지는 제 2 올리고핵산염기 가닥, 이때 가닥은 선택적으로 제 1 쇄 및 제 2 쇄로 나뉘어지고; 그리고
    c. 3' 단부 핵산염기 및 5'단부 핵산염기로 구성되는데, 이때
    i) 제 2 가닥의 3'단부및 5'단부핵산염기는 각각 제 1 말단 및 제
    2 말단의 핵산염기에 Watson-Crick 쌍을 이루고; 그리고
    ii) 제 2 가닥에는 제 1 가닥의 핵산염기와 Watson-Crick 쌍을 이
    루는 적어도 5개의 연속적인 핵산염기로된 적어도 2개의 비-돌출부
    분을 포함하고;
    이때, 제 1 가닥의 서열은 표적 DNA 서열로 구성되고, 제 2 가닥의 서열은 원하는 상이한 서열로 구성되고,
    (B) 상이한 원하는 서열을 가지는 세포로부터 또는 이의 후손으로부터 DNA를 감지하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 48 항에 있어서, 제 1 가닥의 서열은 표적 DNA 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 48 항에 있어서, 제 1 가닥은 상이한 원하는 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 48 항에 있어서, 제 2 가닥은 제 1쇄 및 제 2 쇄로 구성되고, 제 1 쇄에는 리보형 핵산염기가 포함되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, 표적 DNA 서열은 제 1 쇄의 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 51 항에 있어서, 상이한 원하는 서열은 제 1 쇄 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 진핵세포에서 상이한 원하는 서열에 표적 DNA 서열을 형질도입시키는 방법에 있어서,
    (A) 세포로 이중나선 돌연변이성 벡터를 투여하는데, 이때 벡터는
    a. 적어도 12개이상 75개 미만의 연결된 핵산염기로 구성된 제 1 올리고핵산염기; 이 가닥은 제 1과 제 2 말단 핵산염기를 가지고;
    b. 제 1 가닥과 동일한 수의 핵산염기를 가지는 제 2 올리고핵산염기 가닥, 이때 가닥은 선택적으로 제 1 쇄 및 제 2 쇄로 나뉘어지고; 그리고
    c. 3' 단부 핵산염기 및 5'단부 핵산염기로 구성되는데, 이때
    i) 제 2 가닥의 3'단부및 5'단부핵산염기는 각각 제 1 말단 및 제
    2 말단의 핵산염기에 Watson-Crick 쌍을 이루고; 그리고
    ii) 제 1 쇄의 핵산염기는 데옥시형 핵산염기이고, 이와 쌍을 이루는
    제 1 가닥의 핵산염기는 뉴클레아제 저항성 리보형 핵산염기이고;
    ii) 제 2 가닥에는 제 1 가닥의 핵산염기와 Watson-Crick 쌍을 이
    루는 적어도 5개의 연속적인 핵산염기로된 적어도 2개의 비-돌출부
    분을 포함하고;
    이때, 제 1 가닥의 서열은 표적 DNA 서열로 구성되고, 제 2 가닥의 서열은 원하는 상이한 서열로 구성되고, 원하는 상이한 서열을 가지는 올리고핵산염기는 적어도 12개의 연속하는 데옥시비로형 핵산염기로 구성되고; 그리고
    (B) 상이한 원하는 서열을 가지는 세포로부터 또는 이의 후손으로부터 DNA를 감지하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 54 항에 있어서, 제 1 쇄는 5'단부 핵산염기로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 55 항에 있어서, 제 1 쇄의 1개정도의 핵산염기가 제 1 가닥의 비-상보적인 핵산염기와 쌍을 이루는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 진핵세포에서 상이한 원하는 서열에 표적 DNA 서열을 형질도입시키는 방법에 있어서,
    (A) 세포로 이중나선 돌연변이성 벡터를 투여하는데, 이때 벡터는
    a. 적어도 12개이상 75개 미만의 연결된 핵산염기로 구성된 제 1 올리고핵산염기; 이 가닥은 제 1과 제 2 말단 핵산염기를 가지고;
    b. 제 1 가닥과 동일한 수의 핵산염기를 가지는 제 2 올리고핵산염기 가닥, 이때 가닥은 선택적으로 제 1 쇄 및 제 2 쇄로 나뉘어지고; 그리고
    c. 3' 단부 핵산염기 및 5'단부 핵산염기로 구성되는데, 이때
    i) 제 2 가닥의 3'단부및 5'단부핵산염기는 각각 제 1 말단 및 제
    2 말단의 핵산염기에 Watson-Crick 쌍을 이루고; 그리고
    ii) 제 1 쇄의 핵산염기는 데옥시형 핵산염기이고, 이와 쌍을 이루는
    제 1 가닥의 핵산염기는 뉴클레아제 저항성 리보형 핵산염기이고;
    ii) 제 2 가닥에는 제 1 가닥의 핵산염기와 Watson-Crick 쌍을 이
    루는 적어도 5개의 연속적인 핵산염기로된 적어도 2개의 비-돌출부
    분을 포함하고;
    이때, 쇄의 사슬은 상이한 원하는 서열로 구성되고;
    (B) 상이한 원하는 서열을 가지는 세포로부터 또는 이의 후손으로부터 DNA를 감지하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 57 항에 있어서, 가닥의 서열은 표적 DNA 서열로 구성된 것을 특징으로하는 방법.
  59. 제 58 항에 있어서, 제 1 쇄의 1개 정도의 핵산염기가 제 1 가닥의 비-상보적인 핵산염기와 쌍을 이루는 것을 특징으로 하는 방법.
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