CN103459596B - 靶向改变dna - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向改变受体DNA，例如双链受体DNA的方法。该方法包括寡核苷酸的应用，该寡核苷酸具有至少一个相对靶（双链）受体DNA的错配。该错配位于所述寡核苷酸中的特定位点。还提供了一种包含用于实施本发明方法的说明书的试剂盒，在一个优选实施方式中，包含适用于该方法的寡核苷酸。

Description

靶向改变DNA
技术领域
本发明涉及靶向改变受体DNA，例如双链受体DNA的方法。所述方法包括寡核苷酸的应用，该寡核苷酸有至少一个相对靶（双链）受体DNA的错配。错配位于所述的寡核苷酸的特定位置上。本发明同时提供了包括实施本发明方法的说明书，且在优选的实施方式中包括本方法适用的寡核苷酸。
背景技术
遗传修饰是在活细胞的遗传物质中特意形成变化的方法。该目的通常是修饰细胞，或细胞形成的部分生物体或细胞可再生成的生物体的遗传编码生物特性。这些改变可采用以下方式：删除部分遗传物质、添加外源性遗传物质或改变遗传物质中存在的核苷酸序列，例如用一个核苷酸取代另一个核苷酸。
已经有20多年知道遗传修饰真核生物的方法，并发现已广泛应用于植物、人和动物细胞以及微生物以改善农业、人类健康、食物品质和环境保护领域。
常见的遗传修饰方法由以下方法组成：向细胞基因组添加外源DNA片段，这可能赋予该细胞或其生物体一种新特性，该特性超过并优于已存在基因所编码的特性（包括从而抑制已存在基因表达的应用）。
虽然这些方法在向靶标提供所需特性上可能有一定功效，但这些方法并不精确。例如，无法控制外源DNA片段插入的基因组位点（进而控制最终表达水平）。另外，所需效果的自身体现必需超过原始和良好平衡基因组所编码的天然性质。相反，遗传修饰方法会导致预定基因组基因座中核苷酸的增加、缺失或转化，从而精确并可控地修饰现有基因。
寡核苷酸导向的靶向核苷酸交换（TNE）是一种基于向真核细胞递送（合成）寡核苷酸（由沃森-克里克碱基配对性质类似于DNA但化学上不同于DNA的核苷酸和/或核苷酸样部分的短链组成的分子；(Alexeev和Yoon,1998);(Rice等,2001);(Kmiec,2003)）的方法。
通过在寡核苷酸的同源序列上特意设计错配核苷酸，该错配核苷酸可能诱导改变可与其核苷酸杂交的基因组DNA序列。该方法允许转化靶标中一个或多个核苷酸，并且可（例如）应用在现有基因中产生终止密码子导致其功能破坏，或产生密码子改变导致基因编码蛋白具有改变的氨基酸组成（蛋白质工程）。
靶向核苷酸交换（TNE）已经在包括植物、动物和酵母细胞的许多生物体中描述，也称为寡核苷酸导向诱变（ODM）。
TNE的第一个示例使用来自动物细胞的嵌合DNA:RNA寡核苷酸（综述见（Igoucheva等，2001））。使用嵌合DNA：RNA寡核苷酸的TNE也在植物细胞中证实（Beetham等，1999;Kochevenko和Willmitzer,2003;Okuzaki和Toriyama,2004;Zhu等，2000;Zhu等,1999）。通常在非选择性染色体基因座上实际应用TNE时，植物和动物研究中报告的频率都太低，。发现使用嵌合寡核苷酸的TNE也难以重复（Ruiter等，2003），从而需要寻找其它寡核苷酸设计以产生更可靠的结果。
多个实验室已聚焦于在TNE中使用单链（ss）寡核苷酸。已发现其在植物和动物细胞中提供了更多可重复的结果(Liu等，2002)(Parekh-Olmedo等，2005)(Dong等，2006)。然而，在细胞，特别是较高等生物体（如植物）的细胞中使用TNE所面临的最大问题还是迄今为止报道的效率相对较低。在玉米中，报道的转化频率为1x10-4(Zhu等，2000)。在烟草(Kochevenko和Willmitzer,2003)和水稻(Okuzaki和Toriyama,2004)中的后续实验中报道的频率分别是1x10-6和1x10-4。
使用各类寡核苷酸的TNE已是各种专利和专利申请的主题，包括US6936467、US7226785、US579597、US6136601、US2003/0163849、US2003/0236208、WO03/013226、US5594121和WO01/92512。
在US6936467中认为，使用未修饰DNA寡核苷酸得到低基因改变频率是由于反应混合物或靶细胞中存在的核酸酶降解了供体寡核苷酸。提出引入修饰的核苷酸，其使所得的寡核苷酸（更）耐核酸酶。公开这些修饰优选位于寡核苷酸末端，其中错配存在于距离各末端至少8个核苷酸。
US7226785也揭示了用具有至少一个修饰的耐核酸末端区域的修饰单链寡核苷酸来靶向染色体基因组改变的方法。使用修饰的单链寡核苷酸的TNE也是WO02/26967的主题。
因为现有TNE方法效率低，需要替代和/或更好的TNE技术。这些技术可单独使用或与上述和本技术领域的现有TNE技术联用以改善效率。因此，本发明人表明了对现有TNE技术的改进。
发明内容
技术问题
本领域确定的技术问题是现有在细胞中诱导特定或需要的遗传变化的可用方法，例如在植物细胞中存在的基因组中导入特定的遗传变化，由于受到低效的阻碍，使该技术费力并且昂贵。需要替代的且更佳的TNE技术。
需要解决的问题之一是提供一种替代的和/或更佳的和/或额外的方法以将遗传变化引入遗传信息，例如（如存在于细胞中的）双链DNA序列。优选该方法与本技术领域描述那些方法相比改善了效率。这些方法能向细胞提供改变的遗传信息，特别是就通过向靶DNA导入该改变从而改变该细胞功能的细胞而言。例如这些功能可涉及DNA序列编码蛋白的特性改变，该DNA序列包含根据本发明方法改变的DNA。
问题的解决方案
发明人发现一种靶向改变双链DNA序列的方法。该方法使用包含能与靶标杂交的结构域的供体寡核苷酸（如本领域技术人员已知，在允许杂交的条件下）。该供体寡核苷酸还包括相比靶双链DNA序列的至少一个错配，该错配导入到靶双链DNA序列中。
而本技术领域和常规知识主张错配应该存在于寡核苷酸中，换言之，寡核苷酸“中间某个位点”（参见例如，如上所述的各种专利申请，特别是US6936467和US7226785），现在出人意料且非预期地发现当错配不位于寡核苷酸中间某位点而在特定位置时TNE效率良好。尤其发现对于有效的TNE而言，错配位于距离寡核苷酸3'端最多2个核苷酸，优选最多1个核苷酸的位置。最优选至少一个错配位于（单链）寡核苷酸的3’末端。
与通常认为错配应该位于寡核苷酸中间部分，以及例如导入寡核苷酸5’末端和3’末端的修饰应该是防止核酸酶过早降解该寡核苷酸（参见例如US6936467）相反，现在发现在寡核苷酸距离3’末端0，1或2个核苷酸处的错配可有利地用于靶核苷酸交换，即靶向改变双链DNA序列的方法。
此外，包含至少一个距离3’末端0，1或最多2个核苷酸的错配的寡核苷酸可通过纳入修饰核苷酸进一步修饰，即该修饰核苷酸具有碱基修饰、主链修饰、糖修饰和/或在所述核苷酸5’末端和/或3’末端进行修饰的核苷酸。这些修饰包括熟知的修饰，以改善寡核苷酸与靶序列的结合/杂交和/或防止或抑制所谓核酸酶分解寡核苷酸。该修饰核苷酸的示例包括锁核酸，或具有硫代磷酸酯键的核苷酸。然而，如实施例3所示，不要求寡核苷酸引入具有硫代磷酸酯键的核苷酸也不要求寡核苷酸引入任何其它类型的修饰核苷酸。
附图简要说明
图1显示含有一个终止密码子的GFP开放阅读框核苷酸序列（SEQ ID NO:1）。
图2显示GFP-终止蛋白的氨基酸序列，其终止密码子位点用星号表示（SEQ ID NO:2）。
图3显示用于本研究的构建体示意性概图。
图4显示通过不同寡核苷酸的附加体GFP修复，其在至少3个独立实验中测试。
图5显示YFP-终止构建体的核苷酸序列。位于186的核苷酸已经改变（C到A），产生了一个框内的终止密码子（SEQ ID NO:3）。
图6显示YFP-终止的蛋白序列。蛋白中的终止密码子的位点用星号表示（SEQ IDNO:4）。
图7显示番茄原生质体中附加体YFP质粒上的TNE。7460表示仅使用野生型YFP基因的转化效率。7461+PB212表示35S YFP-终止构建体与寡核苷酸PB212一起共同导入番茄原生质体的修复效率。
图8显示本发明的寡核苷酸甚至在没有例如PS连接的任何修饰下提高了TNE效率。
定义
以下说明和实施例中使用了许多术语。为提供对说明书和权利要求清楚和一致的理解，包括给定这些术语的范围，提供以下定义。除非另外定义，使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。所有出版物、专利申请、专利和其他文献的公开内容都在本文中完整引入以供参考。
如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代形式，除非文中另有明确说明。例如，分离“一个”DNA分子的方法，如上所用，包括分离多个分子（例如，上十、上百、上千、上万、上十万、上百万或更多的分子）。
用于本发明方法的常规技术的实施方法对本领域技术人员是显而易见的。分子生物学、生物化学、计算化学、细胞培养、重组DNA、生物信息学、基因组学、测序和相关领域中的常规技术的实践对于本领域技术人员而言是熟知的，并描述在（例如）以下参考文献中：Sambrook等，Molecular Cloning（《分子克隆：实验室手册》），第二版，冷泉港出版社，冷泉港，纽约，1989；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology（《新编分子生物学实验指南》），约翰威力和桑斯有限公司（John Wiley&Sons），纽约，1987及定期更新；和Methods in Enzymology（《酶学方法》）系列，学术出版社（Academic Press），圣地亚哥。
本发明的核酸可包括嘧啶和嘌呤碱基，分别优选胞嘧啶、胸腺嘧啶、和尿嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤的任何聚合物或寡聚物(参见Albert L.Lehninger,Principles ofBiochemistry（《生物化学原理》），793-800(Worth Pub.1982)其在此出于所有目的完整引入以供参考）。本发明考虑了任何脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸成分，以及任何其化学变体，例如这些碱基的甲基化、羟甲基化或糖基化形式等。在组合物中聚合物或寡聚物可以是异源或同源的，可分离自天然存在的来源，或者人工或合成产生。另外，核酸可以是DNA或RNA，或其混合物，可永久或瞬间以单链或双链形式，存在，包括同源双链、异源双链、和杂交状态。
（合成）寡核苷酸：可化学合成的具有优选约5-150个碱基的单链DNA分子被称为合成寡核苷酸。一般这些合成DNA分子设计成具有独特或所需的核苷酸序列，虽然可能合成具有相关序列的分子家族，其在核苷酸序列内的特定位点具有不同核苷酸组成。术语合成寡核苷酸用于指具有经设计或所需核苷酸序列的DNA分子。
“靶向核苷酸交换”或“TNE”。靶向核苷酸交换（TNE）是一种方法，通过该方法一条与染色体或附加体基因中的位点至少部分互补的合成寡核苷酸引导逆转特异性位点核苷酸的方法。TNE经描述使用了大量寡核苷酸和靶标。一些报道的寡核苷酸是RNA/DNA嵌合体，包含末端修饰以具有核酸酶耐受性。
具体实施方式
本发明一方面涉及靶向改变双链受体DNA序列的方法。
该方法包括将一个/该双链受体DNA序列与供体寡核苷酸结合。该寡核苷酸包含能与第一DNA序列杂交的结构域（在如本领域技术人员知晓的杂交条件下）。能与第一DNA序列杂交的结构域包含至少一个相对第一DNA序列的错配。所述至少一个错配位于距离所述第一寡核苷酸3’末端最多2个，优选最多1个核苷酸处。最优选所述至少一个错配位于该寡核苷酸的3’末端。
本发明方法能通过寡核苷酸的方式特异性和选择性改变受体DNA序列中特异性位点的一个或多个核苷酸。特别是可以根据本发明（即相比第一DNA序列具有至少一个错配，其中至少一个错配位于距离所述寡核苷酸3’端最多2个优选最多1个核苷酸处）通过向该细胞引入寡核苷酸在含有双链受体DNA序列的靶细胞中实施靶向改变。最优选所述至少一个错配位于寡核苷酸的3’末端。该方法的结果是靶向改变一个或多个核苷酸，因而改变靶DNA序列。本发明可优选体内实施，但也可以离体或体外实施。
在本发明的范围中，双链DNA序列包含第一DNA序列和第二DNA序列。第二DNA序列与第一DNA序列互补并与之配对形成双链。例如，第一DNA序列ATTT（方向从5’到3’）的互补是TAAA（方向从3’到5’）。第二DNA序列与第一DNA序列配对形成双链。例如，在双链DNA序列是一个基因的一部分的情况下，第一DNA序列可在有义链或反义链上。
双链DNA序列的DNA可以是任意类型的DNA，如基因组DNA、衍生自基因组的DNA、线性DNA、人工染色体、核染色体DNA、细胞器DNA、BAC、YAC、质粒DNA、或附加体DNA。DNA序列可以是内含子或外显子的部分，编码或非编码的，调控或不调控表达的。
用于本发明所述方法的寡核苷酸优选单链并包含至少一个能与第一DNA序列杂交的结构域。
相对待改变的双链DNA序列的至少一个错配位于距离该寡核苷酸3’末端0、1或2个核苷酸处，该错配包含在能与第一DNA序列杂交的结构域中或直接毗邻于该结构域。
该至少一个结构域可因此包含至少一个相对待改变的DNA序列的错配或直接紧邻/毗邻于该错配。换言之，该寡核苷酸包含由以下核苷酸组成的结构域，可在实验条件下与双链受体DNA序列的第一DNA序列杂交的相邻核苷酸，任一种含有相对所述第一DNA序列的错配，或该错配直接紧邻于所述结构域（其中错配位于距离寡核苷酸3’末端0、1或2个核苷酸处）。
例如，如果结构域（方向从5’到3’）位于距离3’末端多至3个核苷酸处，错配可直接紧邻于距离寡核苷酸3’末端2个核苷酸的结构域旁。
例如，如果结构域（方向从5’到3’）位于距离3’末端多至1个核苷酸处，错配可位于结构域内，例如位于距离3’末端2个核苷酸处，或者直接相邻于结构域，即位于距离3’末端0个核苷酸处，换言之，位于该寡核苷酸的3’末端。
本领域技术人员可以理解的是，在本发明通篇中指出错配时或该错配包含在能与第一DNA序列杂交的结构域中时，其包括包含在结构域中或直接相邻于该结构域的任意错配，只要该错配位于距离寡核苷酸3’末端2，1或0个核苷酸处。
在某些实施方式中，该寡核苷酸优选包含不超过1个错配。在某些实施方式中，可向靶DNA中同时或连续引入多于一个突变。该寡核苷酸能包含超过一个寡核苷酸上相邻或去除位置的错配。在某些实施方式中，寡核苷酸可包括2、3、4或更多的错配核苷酸，该错配核苷酸可以是相邻的或远距离的（即非相邻的）。该寡核苷酸还可包含容纳它的结构域。该错配可以在相同或不同的结构域中。
本领域技术人员可以理解的是按照本发明的寡核苷酸还可包含非杂交部分，换言之，相邻核苷酸不与第一DNA序列杂交，例如这些部分不与第一DNA序列中的任意序列互补。
在一个优选的实施方式中，该寡核苷酸包含一个能与第一DNA序列杂交的结构域，并含有或直接相邻于相对于待改变双链DNA序列的至少一个错配，优选一个错配。该实施方式中，原理上该寡核苷酸可包含超过一个能与第一DNA序列杂交的结构域，然而只有一个结构域可包含或直接相邻于至少一个错配（或一个错配），如本文所述。在另一个优选的实施方式中，寡核苷酸只包含一个能与双链DNA杂交的结构域。该结构域位于寡核苷酸3’末端或附近，并包括错配或直接相邻于错配。
本文所述方法中用作供体的寡核苷酸长度可变化，但长度通常在10至500个核苷酸之间变化，优选11至100个核苷酸，更优选15至90个核苷酸，更加优选20至70个核苷酸。
结构域可由包含错配的至少5个核苷酸组成，但也可由包含错配的该寡核苷酸所有核苷酸组成。在错配直接相邻于结构域的情况下，结构域可由至少5个核苷酸组成，但也可由除错配以外的寡核苷酸所有核苷酸组成。寡核苷酸中的结构域一般大约至少5、10个核苷酸，优选15、20、25、或30个核苷酸。
按照本发明寡核苷酸包含至少一个位于距离所述寡核苷酸3’末端最多2个核苷酸，优选最多1个核苷酸处的错配。最优选地，所述（至少一个）错配位于寡核苷酸的3’末端。本领域技术人员理解术语3’末端包括的内容。单链非环状的DNA分子有两个末端，3’末端和5’末端（也称为“3端”和“5端”）。
单链核酸的5'末端表示特定核苷酸的C-5碳原子形成了糖-磷酸主链的末端碳原子。C-5碳原子可通过磷酸二酯键与磷酸基团连接或不连接，但该磷酸基团反过来不与其它的核苷酸形成任何连接。
单链核酸的3'末端表示特定核苷酸，其C-3碳原子不通过磷酸二酯键或其它键与任何其它核苷酸连接。
C-5原子是核糖或脱氧核糖分子上的第5号碳原子且不形成呋喃糖环的一部分，从直接与呋喃糖环上的氧和核碱基相邻的碳原子开始数起。C-3原子是核糖或脱氧核糖分子上的第3号碳原子且形成呋喃糖环的一部分，从直接与呋喃糖环上的氧和核碱基相邻的1号碳原子开始数起。
术语“错配位于距离3’末端2个核苷酸”表示错配与寡核苷酸3’末端核苷酸距离2个核苷酸。术语“错配位于距离3’末端1个核苷酸”表示错配与寡核苷酸3’末端核苷酸距离1个核苷酸。术语“错配位于距离3’末端0个核苷酸”表示错配位于寡核苷酸3’末端核苷酸。
在某些实施方式中，用于本发明方法的供体寡核苷酸除至少一个错配之外与第一DNA序列互补，例如除寡核苷酸中1、2、3或4个错配之外。
在某些优选实施方式中，所述寡核苷酸与第一DNA序列在除了位于距离所述寡核苷酸3’末端最多2个核苷酸，优选最多1个核苷酸，最优选所述的错配位于3’末端处的一个错配以外的整条寡核苷酸中互补。在另一个实施方式中，寡核苷酸（方向从5’到3’）直到错配处（位于距离3’末端2、1或0个核苷酸）与第一DNA序列在整条寡核苷酸中互补。
在某些实施方式中，用于本发明方法的供体寡核苷包含具有至少一个修饰核苷酸的至少一部分，该修饰核苷酸具有碱基修饰、3'和/或5'末端碱基修饰、主链修饰或糖修饰。
碱基修饰、3'和/或5'末端碱基修饰、主链修饰和/或糖修饰可引入寡核苷酸中以增加寡核苷酸与靶序列的（结合/杂交）亲和力，独立或额外增加寡核苷酸对细胞核酸酶耐受。然而，如实施例3所示，不要求寡核苷酸引入任何修饰的核苷酸。
可有利地使用寡核苷酸中对核苷酸的任何修饰，其提供了适用于本发明方法的寡核苷酸（并包含至少一个位于距离所述寡核苷酸3’末端最多2个核苷酸，优选最多1个核苷酸的错配，最优选所述的错配位于寡核苷酸3’末端）。本领域技术人员可以理解的是修饰是相对天然存在的A、C、T、G核苷酸中个任何一种。
较佳地，虽然不是必需的，用于本发明方法的寡核苷酸可包含修饰的核苷酸以相对天然存在的A、T、C和G核苷酸提高该寡核苷酸对细胞核酸酶的耐受性。这些修饰可包括碱基修饰、主链修饰、和/或糖修饰。通常这些修饰的核苷酸会增加寡核苷酸对细胞核酸酶的耐受性，从而增加寡核苷酸在细胞环境中的稳定性，可因此改善靶向核苷酸交换。优选地，用于按照本发明方法寡核苷酸包含至少1个，优选至少2个，更优选至少4个，更加优选至少6个，最优选至少8个与天然存在的A、T、C和G核苷酸相比提高寡核苷酸对细胞核酸酶耐受性的修饰核苷酸。或者，或同时，用于本发明方法的寡核苷酸包括至多25个，优选至多20个，更优选至多15个，最优选至多10个与天然存在的A、T、C和G核苷酸相比提高寡核苷酸对细胞核酸酶耐受性的修饰核苷酸。这些修饰的核苷酸可位于寡合苷酸中任何位置，距离相应的寡核苷酸3’末端和/或5’末端优选在20个，优选在15个，更优选在10个，更优选在8个，更优选在6个核苷酸内，最优选位于寡核苷酸3’末端的最后一个核苷酸和/或5’末端的最后一个核苷酸。作为引入到靶DNA序列中的错配，其位于距离寡核苷酸3’末端0、1或最多2个核苷酸处，特别优选该修饰核苷酸保护3’端抵抗细胞核酸酶并因此位于寡核苷酸3’末端，如在距离3’末端的20、15、10、9、8、7、6、或4个核苷酸内。然而，如之前所述并如实施例3所示，寡核苷酸实际上包含修饰核苷酸以提高该寡核苷酸抵抗细胞核酸酶对于本发明并不是必需的。
文中提到的各种该修饰核苷酸，如果与天然存在的A、T、C、和G核苷酸相比提高了寡核苷酸抵抗细胞核酸酶的耐受性，并可引入用于本发明方法的寡核苷酸中。该修饰核苷酸可以是具有硫代磷酸酯键的核苷酸，但也可以是亚磷酰胺、甲基磷酸酯、或含非磷酸核苷酸间键如碳酸盐、氨基甲酸盐、硅氧烷、磺酰胺和聚酰胺核酸的核苷酸。另外，可使用如WO0226967中所述赋予细胞核酸酶耐受性的修饰核苷酸，如LNA（锁核酸），或本领域技术人员已知的改进寡核苷酸细胞核酸酶耐受性的任何其它修饰核苷酸。
替代上述核酸酶耐受性赋予修饰核苷酸的或除此之外，用于本发明方法的寡核苷酸可包含与天然存在的A、T、C、和G核苷酸相比与靶DNA序列结合亲和力更强的修饰核苷酸。这些修饰可包括碱基修饰、主链修饰、和/或糖修饰。通常，这些结合亲和力增强的修饰核苷酸会与靶序列的产生更强的碱基配对，这会使寡核苷酸与靶序列的杂交稳定性提高，认为这从而改善了靶向核苷酸交换。优选地，用于本发明方法的寡核苷酸包含至少1-10，优选1-8，更优选1-6，更优选1-4，如1，2，3，或4，甚至更优选2个修饰核苷酸，其如果与天然存在的A，T，C，和G核苷酸相比与靶DNA序列的结合亲和力更高。上述的这些修饰核苷酸可位于寡核苷酸中的任意位置，优选位于距离错配1个核苷酸处，优选距离错配最多2，3，4，5，6，或7个核苷酸处。优选地，这些修饰核苷酸位于错配5’侧，但如果错配不位于寡核苷酸3’末端最后一个核苷酸，也可选择该核苷酸位于错配3’侧的位点。
本文所述的这些修饰核苷酸的各示例如果与天然存在的A，T，C，和G核苷酸相比与靶DNA序列的结合亲和力更高，可将其引入本发明方法所用的寡核苷酸中，包括2-甲氧基取代，LNA（锁核酸），核糖核苷酸、超级A（superA）、超级T（superT）或如本领域技术人员已知与天然存在的A，T，C，和G核苷酸相比改进寡核苷酸与靶DNA序列结合亲和力的任何其它类型修饰核苷酸。
确定修饰核苷酸与天然存在的A，T，G，C核苷酸相比是否赋予对细胞核酸酶更强的耐受性可以通过，例如，在细胞核酸酶（例如存在于番茄提取物、番茄细胞、或在大肠杆菌中的）存在下，比较具有所述修饰核苷酸的寡核苷酸与不具有所述修饰核苷酸的寡核苷酸的半衰期。如果第一项的半衰期更长，所述修饰核苷酸就赋予与天然存在的A，T，G，C核苷酸相比更强的细胞核酸酶耐受性。确定一个修饰核苷酸与靶DNA序列的结合亲和力是否高于天然存在的A，T，C，或G核苷酸可通过，例如，比较具有所述修饰核苷酸的寡核苷酸和其靶DNA形成双链的熔融温度（Tm）与不含所述修饰核苷酸的寡核苷酸和其靶DNA形成双链的熔融温度。如果前一项的熔融温度较高，所述修饰核苷酸相比天然存在的A，T，G，C核苷酸赋予对靶DNA序列的更高的结合亲和力。
本发明的一部分应理解为长度至少为1个核苷酸的寡核苷酸的任何部分。例如，一部分可包括1-10，优选1-6，更优选1-4，更优选1-2个核苷酸，并且可位于错配的3’侧和/或5’侧。至少一部分可以是如本发明所述结构域的一部分，换言之，一部分可以是可与第一DNA序列杂交的结构域。或者，一部分可与结构域完全或部分重叠。完全重叠的情况中，该部分可与结构域长度相同，但其长度也可超过结构域长度。部分重叠的情况中，该结构域和该部分共有至少一个核苷酸。
根据用于寡核苷酸的修饰类型，可优选修饰核苷酸为与第一DNA序列杂交的结构域的一部分，并且该结构域包含或直接相邻于至少一个错配，该错配位于距离所述寡核苷酸3’末端最多2个，优选最多1个核苷酸处，最优选所述错配位于寡核苷酸的3’末端。特别情况是相比天然存在的A，C，T或G核苷酸，修饰核苷酸与互补核苷酸的结合亲和力更高。
碱基修饰包括但不限于，例如WO0226967中描述的修饰，包括对C-5位点嘧啶的修饰，如2'-脱氧尿苷、5-氟-2'-脱氧尿苷、5-溴-2'-脱氧尿苷和5-甲基-2'-脱氧胞苷。其它碱基修饰包括合成和天然核碱基，如5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫代、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤和3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。
末端（3'和/或5'）修饰可包括2'-O-甲基碱基、3'胺基基团、硫代磷酸酯键、或任何其它核酸酶耐受性修饰。本领域技术人员熟知这些各类型的修饰。认为提供核酸酶耐受性还能改善靶向核苷酸交换。
多种主链修饰会提高细胞核酸酶的耐受性，所述修饰如WO0226967提到的那些，包括硫代磷酸酯、亚磷酰胺和甲基磷酸酯和具有非磷酸核苷酸间键的那些，如碳酸盐、氨基甲酸盐、硅氧烷、磺酰胺和聚酰胺核酸。因此这些主链修饰对用于本发明方法的寡核苷酸很有用。
另外，糖修饰包括但不限于2'-O-甲基、2'-氟或2'-甲氧基乙氧基可提高所形成双链的热稳定性，并同时提供改善的核酸酶耐受性。
其它合适修饰的例子在WO2007073149中描述。供体寡核苷酸的修释（例如）可包括硫代磷酸酯键、2-甲氧基取代、LNA（锁核酸）的使用、核糖核苷酸以及单独或共同通过改善结合靶DNA的亲和力或抑制核酸酶活性，来修饰并优选地增强寡核苷酸和受体链之间杂交稳定性的其它碱基。
本领域技术人员熟知所有这些类型的修饰并且容易从各商业来源获得。
在一个实施方式中提供了一种本发明方法，其中将修饰核苷酸引入到寡核苷酸中，其中该修饰核苷酸与其互补核苷酸的结合亲和力高于天然存在的A，C，T，或G核苷酸，且与互补于第一DNA序列中相对位置核苷酸的天然存在的核苷酸相比，该修饰核苷酸与第一DNA序列中相对位置核苷酸的结合亲和力更高，且/或其中该修饰核苷酸是耐受核酸酶的核苷酸。
优选的修饰是碱基修饰、3’末端和/或5’末端的碱基修饰、主链修饰或糖修饰。如上所述，本发明的供体寡核苷酸可包含修饰以改进杂交特性，以至该供体展现出对靶DNA链提高的亲和力，这可使供体更容易插入和/或提高所形成双链的热稳定性（与不包含该修饰的相同寡核苷酸相比，且在相同的实验环境下）。供体寡核苷酸能独立地或额外地修饰以对核酸酶的耐受性更高，这可稳定该双链结构。
在现有技术中，多种修饰核苷酸与其互补核苷酸的结合亲和力高于天然存在的A，C，T，或G核苷酸，且与互补于第一DNA序列中相对位置核苷酸的天然存在的核苷酸相比，该修饰核苷酸与第一DNA序列中相对位置核苷酸的结合更强，且/或其中该修饰核苷酸是如上所述的耐受核酸酶的核苷酸（参见示例WO2007073154和上述各种修饰）。
在某些实施方式中，修饰位于距离错配1个核苷酸处，优选距离错配2、3、4、5、6或7个核苷酸处。在某些实施方式中，修饰位于错配的下游位置。在某些实施方式中，修饰位于错配的上游位置。
包含或直接相邻于错配的结构域和含有修饰核苷酸的部分可以重叠。因此，在某些实施方式中，含有错配或直接相邻于错配的结构域与考虑修饰的那部分位于寡核苷酸不同位点。在某些实施方式中，该结构域引入一个或多个部分。在某些实施方式中，部分可引入该结构域。在某些实施方式中，该结构域与该部分可位于寡核苷酸上相同位点并且长度相同，即，该部分在长度和位置上重合。在某些实施方式中，结构域中可有多于一个的部分。
对本发明而言，这意味着含有改变DNA双链的错配的寡核苷酸部分与修饰的寡核苷酸部分可位于不同或转移的位置。
在一个优选的实施方式中，修饰核苷酸选自下组：LNA和/或含有硫代磷酸酯键的核苷酸。
在一个优选的实施方式中，修饰的核苷酸是锁核酸。锁核酸（LNA）是反义基因治疗中使用的具有感兴趣特性的DNA类似物，对本领域技术人员而言是已知的。
LNA是双环和三环核苷和核苷酸类似物并可引入寡核苷酸中。LNA和其相关类似物的基本结构和功能特性在多个文献和专利中揭示，包括WO99/14226、WO00/56748、WO00/66604、WO98/39352、US6043060和US6268490，其全部内容通过引用纳入本文。
LNA核苷就所有常用核碱基（T，C，G，A，U；例如来自Exiqon(www.exiqon.com)）而言市售可得，并能根据标准沃森-克里克碱基配对规律形成碱基对。当引入DNA寡核苷酸中时，LNA与互补核苷酸链配对更快并且提高了所得双链的稳定性。换言之，LNA结合了区分正确和错误靶标的能力（高特异性）和极高的生物稳定性（低周转）以及前所未见的亲和力（对靶标的结合强度极高）。事实上，LNA记录的亲和力提高使之前报道的所有类似物的亲和力停留在了低到中等范围。
LNA是RNA类似物，结构上其核糖通过2'-氧原子和4'-碳原子之间的亚甲基桥限制。该桥限制了呋喃核糖环的灵活性并将结构锁定为刚性的双环体。这所谓的N-型（或3'-内）构象使含有LNA的双链的Tm（熔融温度）上升，从而结合亲和力更高且特异性更高。重要的是，LNA的有利特性不以其它重要特性为代价，但这在其它核酸类似物中很常见。
LNA可与组成众多DNA类似物的所有其它化学物自由混合。LNA碱基可以以短的全LNA序列或较长的LNA/DNA嵌合体引入寡核苷酸中。LNA可位于内部，3'或5'的位置。然而，由于刚性双环构象，LNA残基有时会阻碍核酸链的螺旋扭转。因此通常不优选设计具有两个或更多相邻LNA残基的寡核苷酸。优选地，LNA残基由至少一个不会阻碍螺旋扭转的（修饰的）核苷酸隔开，如常规核苷酸（A，C，T，或G）。
最初开发的和优选的LNA单体（[β]-D-氧基-LNA单体）已被修饰为新的LNA单体。新型[α]-L-氧基-LNA已经显示出抗3'外切核酸酶活性的优良稳定性，并且还在设计有效的反义寡核苷酸中比[β]-D-氧基-LNA更加强大和通用。也可使用木糖LNAs、L-核糖LNA和其它LNA，如在WO9914226、WO00/56748、WO00/66604和J.Org.Chem.,2010,75(7)，第2341–2349页中所述。在本发明中，任何上述类型LNA能有效实现本发明目的，即，优选用[β]-D-氧基-LNA类似物改善TNE的效率。
如上所述，优选地，在本发明方法使用的寡核苷酸中LNA距离错配至少1个核苷酸。虽然在TNE的技术领域中，LNA修饰已列为在可能的寡核苷酸修饰中以替代TNE中使用的嵌合分子，但发现本发明方法所用的单链DNA寡核苷酸经修饰含有LNA时，TNE效率显著提高到目前所能发现的程度，当LNA位于距离错配至少一个核苷酸，甚至更优选距离错配一个核苷酸时。寡核苷酸优选含有不超过约75％（归整到最接近的核苷酸整数）LNA。
在另一优选的实施方式中，修饰核苷酸包含具有硫代磷酸酯键的核苷酸。已开发许多市售可得的寡核苷酸修饰以用于基因治疗的反义应用。用于反义应用（“第一代”反义寡核苷酸）中最简单且应用最广的核酸酶化学物是硫代磷酸酯键。在这些分子中，一个硫原子代替了寡核苷酸磷酸主链上的非桥联氧（参见，例如，WO2007073154的图2），产生耐受内切核酸酶和外切核酸酶的活性。
对于基因治疗，硫代磷酸酯/磷酸二酯嵌合体通常与未修饰的DNA的中心核心在5'和3'末端处具有1-4个PS修饰的核苷间键。然而，硫代磷酸酯键可引入到寡核苷酸中任何需要的位置。
优选的修饰核苷酸是LNA，或甚至更优选地是具有硫代磷酸酯键的核苷酸，更优选地是具有至少1个，例如，1个、2个、3个或4个硫代磷酸酯的修饰寡核苷酸。优选地，根据本发明该寡核苷酸位于或在该寡核苷酸的5’末端附近（例如，距离1、2、3、4、5、6、7个核苷酸内）具有至少一个硫代磷酸酯。
在一个实施方式中提供了，本发明方法使用的寡核苷酸含有至少2，3，4或5个修饰核苷酸。优选地，寡核苷酸含有2，3，4或5个修饰核苷酸。优选地，该修饰选自下组：LNA和/或硫代磷酸酯键。
在某些本发明优选的实施方式中，可修饰寡核苷酸中位于错配的核苷酸。错配是否能修饰很大程度上取决于靶向核苷酸交换或细胞DNA修复机制的确切机制，这些机制在供体链和受体链之间使用不同亲和力。在一个优选的实施方式中，位于错配处的核苷酸不是修饰的核苷酸。
在一个实施方式中提供了一种本发明的方法，其中修饰核苷酸位于距离至少一个错配至少一个核苷酸处，该错配位于距离所述寡核苷酸的3’末端最多2个，优选最多1个核苷酸处，最优选所述至少一个错配位于寡核苷酸的3’末端。
如前所述，发现当本发明方法所用的单链DNA寡核苷酸经修饰含有修饰核苷酸（例如LNA）时，TNE效率显著提高到目前已发现的程度，当修饰核苷酸，优选LNA，位于距离错配至少一个核苷酸处，甚至更优选距离错配一个错配处。换言之，在一个优选的实施方式中，修饰的核苷酸，优选LNA，与错配分隔至少一个其它核苷酸，所述至少一个其它核苷酸不是LNA，优选不是修饰的核苷酸。然而，在例如硫代磷酸酯键的情况中，该连接直接相邻于错配核苷酸。
在一个实施方式中提供了一种方法，其中双链受体DNA的改变在细胞中，该细胞优选选自下组：原核细胞、细菌细胞、真核细胞、植物细胞、动物细胞、酵母细胞、真菌细胞、啮齿动物细胞、人细胞和非人细胞、和/或（非人）胚胎细胞。本发明最广义的形式一般可应用于各种生物体如人、动物、植物、鱼类、爬行类、昆虫、真菌、细菌等等。因此本发明可以在选自下组的细胞中实施：原核细胞、细菌细胞、真核细胞、植物细胞、动物细胞、酵母细胞、真菌细胞、啮齿动物细胞、人细胞、非人细胞、和/或胚胎细胞。在一个优选的实施方式中，所述细胞是植物细胞。
还提供了一种本文所述的方法，其中双链受体DNA获自原核生物体、细菌、真核生物体、植物、动物、酵母、真菌、啮齿动物、或人。在一个优选的实施方式中，双链受体DNA从植物（或植物细胞中存在的植物DNA）中获得。
在本发明的一个实施方式中，双链受体DNA序列的改变是删除、替换和/或插入至少一个核苷酸。优选地，双链受体DNA序列的改变是删除、替换和/或插入不超过5个核苷酸，优选不超过4、3、2、1个核苷酸，最优选一个核苷酸。更优选地，双链受体DNA序列的改变是取代不超过5个核苷酸，优选不超过4、3、2、1个核苷酸，最优选一个核苷酸。
在另一个实施方式中提供了一种本发明的方法，其中双链受体DNA来自基因组DNA、线性DNA、人工染色体、哺乳动物人工染色体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体DNA、细胞器DNA、和/或包括质粒的附加体DNA。
实际上本发明可用于任何类型DNA的修饰，例如上述的那些。本发明能在体内、离体或体外实施，例如在能靶向核苷酸交换的蛋白的存在下用供体寡核苷酸修饰DNA，该蛋白例如并且具体地是在细胞错配修复机制中有功能的蛋白。
向细胞递送寡核苷酸能通过电穿孔或其它能向核或胞质递送的常规技术来实现。本发明方法的体外测试可使用描述在WO01/87914、WO03/027265、WO99/58702、WO01/92512中的无细胞系统来实现。该寡核苷酸可包括甲基化核苷酸、非甲基化核苷酸或两者。
本发明的最广义形式可用于许多目的以改变细胞、通过恢复野生型来纠正突变、诱导突变、通过破坏编码区使酶失活、通过改变编码区调节酶的生物活性、通过破坏编码区来修饰蛋白。
本发明也涉及基本如上所述使用寡核苷酸来改变细胞、通过恢复野生型来纠正突变、诱导突变、通过破坏编码区使酶失活、通过改变编码区调节酶的生物活性、通过破坏编码区修饰蛋白、错配修复、（植物）遗传物质的靶向改变（包括基因突变）、靶向基因修复和基因敲除。优选地，本发明方法用于靶向改变双链受体DNA，该DNA获自植物、存在于植物中或递呈给植物。
本发明还涉及试剂盒、包括如本文他处定义的一种或多种寡核苷酸，任选地与TNE的蛋白联用。
具体地，该试剂盒包含靶向改变双链DNA的说明书。该说明书基本包括如本文所述的本发明方法的步骤描述。
具体地，提供了一种包含说明书的试剂盒，该试剂盒用于实施如本文描述的本发明的靶向改变双链受体DNA的方法，其中试剂盒还包括如本文所述方法中使用的寡核苷酸。优选该寡核苷酸是如本文所述的寡核苷酸。
该实施方式中，试剂盒可因此包含寡核苷酸，该寡核苷酸含有至少一个能与第一DNA序列杂交的结构域，该结构域包含或直接相邻于至少一个相对靶DNA序列的错配，其中所述至少一个错配位于距离所述寡核苷酸3’末端至多2个，优选至多1个核苷酸处，最优选所述至少一个错配位于该寡核苷酸3’末端，且另外还包含实施本发明所述方法的说明书，即实施TNE，其中使用具有相对于靶DNA的错配的寡核苷酸，该错配位于距离所述寡核苷酸3’末端至多2个，优选至多1个核苷酸处，最优选所述至少一个错配位于该寡核苷酸3’末端。
本领域技术人员可以理解的是，通过提供说明书，该说明书上至少告知错配位于寡核苷酸的3’末端或距离3’末端1个核苷酸处或距离3’末端2个核苷酸处，以及所述寡核苷酸可用于改变双链DNA序列，包括这些说明书和寡核苷酸的该试剂盒是上述的以及权利要求范围之内的试剂盒。
所述试剂盒，例如，也可采用网页或文件形式提供按照本发明方法实施靶向改变双链受体DNA的说明书或信息，如本文描述和公开，以及（单独）提供或给予适用于本发明方法的寡核苷酸，如本文所述和公开。//esp
在一个优选实施方式中，提供了一种本发明的试剂盒，如上所述，其中寡核苷酸与双链受体DNA序列结合时，该双链受体DNA序列含有第一DNA序列和与第一DNA序列互补的第二DNA序列，该寡核苷酸包含能与第一DNA序列杂交的结构域，该结构域包含或直接相邻于至少一个相对于第一DNA序列的错配，其中至少一个错配位于距离所述寡核苷酸3’末端最多2个，优选最多1个核苷酸处，最优选所述的至少一个错配位于寡核苷酸的3’末端。
实施例
实施例1：在烟草原生质体中GFP附加体进行TNE
TNE涉及向细胞引入寡核苷酸，在该细胞中其通过寡核苷酸的错配核苷酸驱动在基因组靶基因座上诱导突变。
在以下实验中，TNE的准确度和效率通过在携带含有框内终止密码子的非功能性绿色荧光蛋白（GFP）的附加体（质粒）上实施TNE。该质粒与设计用于修复终止密码子的寡核苷酸一起共转染，该转染应该恢复GFP表达和活性，其在下面的实验中，在原生质体转染24小时后对单个细胞水平进行评分。第一个实施例描述了在烟草原生质中实施的实验。
材料和方法
构建体
合成功能性GFP开放阅读框并且优化密码子在茄科植物中的使用。如图1所示，通过位点82的核苷酸改变（G到T）产生GFP变体。这造成了一个框内终止密码子的产生，所得蛋白的氨基酸序列如图2所示。GFP开放阅读框（GFP野生型）和GFP终止密码子变体（GFP-终止）克隆得到基于pUC的含有用于植物细胞中基因表达的CaMV35S启动子的载体的多克隆位点中的XhoI-SacI片段。这得到了pKG7381（GFP-野生型）和pKG7384（GFP-终止）构建体。另外，GFP融合了6x HIS标签和NLS（序列核定位信号）翻译以辅助GFP蛋白在原生质体核中的积累，从而改善我们对GFP阳性细胞的评分能力。这些构建体如图3所示。
寡核苷酸
修复GFP基因中终止密码子的寡核苷酸如表1所示。
表1.用于本研究的寡核苷酸。各寡核苷酸中的错配核苷酸以下划线表示。星号表示硫代磷酸酯（PS）连接。寡核苷酸的方向记作正义（与GFP编码序列相同）或反义（与GFP编码序列互补）。所有寡核苷酸以5’-3’方向显示。PB221含有除错配以外的LNA修饰（L=LNAC）。
烟草原生质体的分离与转染
用于该实施例的原材料是烟草体外芽培养物，在玻璃罐（750ml）中，MS20培养基中，25/20℃（日/夜）温度下，且80μE.m-2.s-1的光子流密度（16/24小时的光周期）下无菌生长。MS20培养基是基础穆拉什格斯固格培养基（Murashige and Skoog's medium）（Murashige，T.和Skoog,F.，Physiologia Plantarum,15:473-497,1962），其中含有2%(w/v)蔗糖，不添加激素和0.8％迪菲克琼脂（Difco agar）。芽每三周更换新鲜培养基培养。
对于分离叶肉原生质体，收获3-6周龄的芽培养物的完全展开的叶片。叶片被切成1mm细条，然后转移到含有45ml MDE基础培养基的大皮氏培养皿（100mm x100mm）中在室温下进行30分钟的预原生质分离处理。900ml总体积的MDE基础培养基含有0.25g KCl、1.0gMgSO4.7H2O、0.136g KH2PO4、2.5g聚乙烯基吡咯烷酮（MW10,000）、6mg萘乙酸和2mg的6-苄氨基嘌呤。该溶液渗透压用山梨糖醇调节至600mOsm.kg-1，pH调节至5.7。
预原生质分离后，向各皮氏培养皿中加入5ml酶储液。每100ml酶储液由100ml中750mg纤维素酶Onozuka R10、500mg崩解酶和250mg离析酶R10（Duchefa公司，荷兰，哈勒姆，例如产品C8001&M8002）组成，用沃特曼纸（Whatman paper）过滤并过滤除菌。密封皮氏培养皿并在25℃下黑暗中过夜孵育，不移动以消化细胞壁。
原生质体悬浮液然后通过500μm和100μm的筛进入250ml的锥形瓶，与等体积的KCl洗涤液混合，并在50ml管中85x g离心10分钟。KCl洗涤培养基由每升2.0g CaCl2.2H2O和足量的KCl组成，以使渗透压达到540mOsm.kg-1。
离心步骤重复两次，第一次将原生质体重悬于MLm洗涤培养基中，该培养基是大量营养物的MS培养基（Murashige，T.和Skoog,F.，Physiologia Plantarum,15:473-497,1962）正常浓度的一半，每升2.2g CaCl2.2H2O和一定量的甘露醇使渗透压达到540mOsm.kg-1，最后将原生质体重悬于MLs培养基，该培养基用蔗糖取代了甘露醇。
从蔗糖培养基中漂浮带中回收原生质体并在等体积的KCl洗涤培养基中重悬。其密度用血球计数器计算。随后，原生质体在10ml的玻璃管中再次以85x g离心5分钟，并将团块以1x105原生质体ml-1密度重悬于的电穿孔培养基中。
原生质体电穿孔
伯乐基因脉冲仪设备用于电穿孔。使用PHBS作为电穿孔培养基（10mM Hepes,pH7.2;0.2M甘露醇,150mM NaCl；5mM CaCl2）电穿孔混合物中原生质体密度为约1x106/ml，电穿孔设置为250V(625V cm-1)电和800μF电容，脉冲和培养间的恢复时间是10分钟。对于每次电穿孔，约2μg寡核苷酸和20μg KG7381或KG7384用于每800微升电穿孔。
电穿孔处理后，该原生质体在冰上放置30分钟恢复，然后以1x105原生质体ml-1的密度重悬于T0培养基，并在21℃下黑暗中孵育过夜。T0培养基含有（每升，pH5.7）含有950mgKNO3、825mg NH4NO3、220mg CaCl2.2H2O、85mg MgSO4.7H2O、85mg KH2PO4、27.85mgFeSO4.7H2O、37.25mg Na2EDTA.2H2O，根据海氏培养基（Heller's medium）（Heller,R.,AnnSci Nat Bot Biol Veg14:1–223,1953）的微营养，根据莫氏和韦氏培养基（Morel andWetmore's medium）（Morel,G.和R.H.Wetmore,Amer.J.Bot.38:138–40,1951）的维生素，2%(w/v)蔗糖、3mg萘乙酸、1mg6-苄氨基嘌呤和一定量的甘露醇使渗透压达到540mOsm.kg-1。电穿孔后20小时在UV显微镜下检验该原生质体以显现细胞核中的GFP信号。
或者，PEG处理能用于向烟草原生质中导入质粒和寡核苷酸DNA。实现这些的方法在文献中熟知。
结果
当构建体KG7381（GFP-野生型）电穿孔至烟草原生质体中，孵育约20小时后可够观察到核中强烈的GFP信号。该信号是由于GFP开放阅读框的强瞬时表达。该信号在48小时内消失，可能是由于细胞中质粒DNA的降解/清除。在典型的实验中，大约30％的原生质体显示GFP信号，这代表了最大的电穿孔效率。当KG7384（GFP-终止）转入烟草原生质体中时没有观察到GFP信号。
一旦该实验设定被验证，通过KG7384与几个不同寡核苷酸联用导入烟草原生质体来进行实验，该寡核苷酸设计含有替代的错配核苷酸位点。
当KG7384与寡核苷酸共同导入时，该寡核苷酸携带错配以修复导入的终止密码子，我们的确观察到恢复的GFP表达。在KG7384与缺少错配的寡核苷酸共同导入时没有观察到GFP表达。结论是TNE细胞机制能使用寡核苷酸来改变GFP-终止序列，因而恢复细胞中的GFP活性。
每个所测的寡核苷酸修复效率示于图4。各独立实验中，KG7381用来测定最大转化效率，然后用其校正各寡核苷酸的修复效率。例如，如果用寡核苷酸的GFP修复事件个数等于KG7384转染后的GFP阳性细胞数，那么GFP修复百分数为100％。
从该数据中可得出修复仅发生在错配核苷酸存在于寡核苷酸中，因为使用GFP8时没有观察到修复。当寡核苷酸含有单个在中间的错配（GFP7）时，观察到约30％转化细胞得到修复。出乎意料的是，我们发现当错配位于寡核苷酸3’末端（PB154）时TNE效率得到了提高。该情况下，该修复效率在目前实验的观察中最高。令人惊奇的是，带有5'末端错配的寡核苷酸（PB153）所产生修复效率很低。GFP3的效率几乎与GFP7、PB218和PB221相同。
之后设计并测试一系列分别在3’末端寡核苷酸位点-1、-2或-3带有错配的寡核苷酸（PB218、PB219、PB220）。当错配位于-3位点时，修复效率落后于GFP7。PB218(-1位点)效率与GFP7一样。PB219(-2位点)得到的修复效率相当于PB154。因此，虽然位于3’末端的错配得到最大修复效率，内部位点-1、-2的错配位点也可得到有效的TNE效率。
之后测试具有-2位点的LNA修饰和3’错配的寡核苷酸（PB221）。LNA核苷酸提高了寡核苷酸对其靶标的亲和力。该结果示于图5中。
实施例2。对番茄原生质体中的YFP附加体进行TNE
实施例1显示具有3’端错配的寡核苷酸能有效进行TNE。为表明本发明方法广泛的使用范围，并排除观察到3’末端寡核苷酸提高TNE效率是由于实施例1中使用了特定寡核苷酸序列，很重要的是要表明具有替代序列的寡核苷酸根据本发明在例如3’端的各位点上带有错配，其在TNE试验中有活性。此外，证实所观察到的作用也发生在其它植物种类中是很有价值的，因此决定在番茄原生质体中进行类似实验。
构建体
产生YFP-野生型和YFP-终止形式，其中YFP-终止具有位于186（C至T）位点的核苷酸改变以产生终止密码子。显示YFP-终止基因（图5）的核苷酸序列和翻译的蛋白序列（图6）。虽然GFP和YFP基因共有显著的序列同源性，该终止密码子设计在编码区的不同位点，导致该寡核苷酸相比用于GFP实验的那些具有完全不同的序列。这些基因随后克隆到植物表达载体中以至YFP开放阅读框可通过病毒35S启动子表达。设计具有3’末端错配的寡核苷酸以将YFP-终止构建体中位于186位点的T转化为C并因此恢复YFP活性。
用于修复YFP（PB212）中终止密码子的寡核苷酸序列如以下所示。星号代表硫代磷酸酯连接。寡核苷酸中的错配用下划线表示。
PB212 G*A*T*G*AACTTGAGAGTAAGCTT*T*C*C*G(SEQ ID NO:14)
番茄原生质体的分离和纯化
番茄叶原生质体的分离和再生成之前已描述（Shahin,1985;Tan等，1987a;Tan等，1987b)，所需溶液可在这些出版物中找到。简而言之，番茄（Solanum lycopersicum）种子用0.1%次氯酸盐灭菌，以16/8小时2000lux的光周期在25℃和50-70%的相对湿度下体外生长于无菌MS20培养基中。1g新鲜收获的叶子与5mlCPW9M置于培养皿中，用手术刀片垂直于主茎按毫米切碎。将其转移到含有25ml酶溶液（含2%纤维素onozuka RS、0.4%离析酶onozukaR10、2.4-D(2mg/ml)、NAA(2mg/ml)、BAP(2mg/ml)pH5.8的CPW9M）的新平板上并在25℃下黑暗中消化过夜。随后通过置于轨道振荡器上1小时（40-50rpm）释放该原生质体。通过经过50μm筛子并用CPW9M对该筛子洗涤两次从而从该细胞碎片分离出原生质体。原生质体在85g离心，弃去上清液，然后收集在一半体积的CPW9M中。原生质体最终收集在3ml CPW9M中，并小心加入3ml CPW18S以避免混合两种溶液。该原生质体在85g旋转10分钟，使用长移液管收集漂浮在中间层的活原生质体。加入CPW9M使该原生质体体积增加到10ml并用血球计数器测定回收的原生质体数。该原生质体悬液在5℃下以85x g离心10分钟。弃去上清液，将该原生质体团块在CPW9M洗涤培养基中重悬至106.mL-1的浓度。在10mL管子中，温和但彻底混合250μL原生质体悬液+/-12.5μg dsRNA和250μl PEG溶液（40%PEG4000(Fluka#81240),0.1M Ca(NO3)2,0.4M甘露醇）。20分钟后，在室温孵育，逐滴加入5mL冷0.275M Ca(NO3)2。该原生质体悬液在4℃下以85x g离心10分钟，弃去上清液。然后将番茄原生质体转移至含有4ml K8p培养基的4cm皮氏培养皿，24小时后用荧光显微镜检测YPF表达。
结果
这些实验的结果如图7所示。我们能确定在3’末端具有错配的不同序列的寡核苷酸的确能在番茄原生质体中恢复YEP表达。
实施例3。PS连接对TNE效率的影响
该实施例显示，不需要本发明寡核苷酸引入具有硫代磷酸酯键的核苷酸，也不需要本发明寡核苷酸引入任何其它类型的修饰。
方法
番茄叶肉原生质体从番茄体外植物的幼叶中分离。报告构建体含有eYFP（终止）基因，其表达是通过CaMV35S启动子驱动，并将寡核苷酸通过PEG介导的方法转入番茄原生质体。在生长室中30℃下黑暗中过夜孵育，感染的原生质体用配备有YFP过滤片的荧光显微镜观察。计算发出黄色荧光的原生质体数，TNE效率通过将黄色原生质体数除以转染的原生质体数得到。
测试的寡核苷酸的序列：
PB72 C*A*T*G*CATGCATGCATGCATGC*A*T*G*C
(SEQ ID NO:15)25聚体，PS，无义（=阴性对照）
PB243 G*A*T*G*AACTTAAGTGTAAGTTT*A*C*C*G
(SEQ ID NO:16)25聚体，硫代磷酸酯，3'MM（=错配）反义
TF8 GATGAACTTAAGTGTAAGTTTACCG
(SEQ ID NO:17)25聚体，3'MM反义
*代表硫代磷酸酯连接
由PB243和TF8引起的TNE反应将靶序列从TAA转化为TAC。因此寡核苷酸PB243和TF8经设计可修复YFP中的终止密码子，其中PB72包括PS连接，而TF8不包含PS连接。如图8所示，PB243能以20.13％的效率修复YFP表达，而TF8能以5.83%的效率修复YFP表达，因而显著高于无义寡核苷酸1.43的背景水平（分别为约15倍和约4倍）。
因此该实施例说明使用寡核苷酸，无论是否修饰，如PS连接，可用于TNE。
参考文献
Alexeev,V.和Yoon,K.(1998).Stable and inheritable changes in genotypeand phenotype of albino melanocytes induced by an RNA-DNA oligonucleotide.（《RNA-DNA寡核苷酸诱导的白化黑素细胞基因型和表型稳定及可遗传变化》）NatBiotechnol16,1343-6.
Beetham,P.R.,Kipp,P.B.,Sawycky,X.L.,Arntzen,C.J.和May,G.D.(1999).Atool for functional plant genomics:chimeric RNA/DNA oligonucleotides cause invivo gene-specific mutations（《用于功能性植物基因组的工具：嵌合RNA/DNA寡核苷酸引起体内基因特异性突变》）.Proc Natl Acad Sci U S A96,8774-8.
Dong,C.,Beetham,P.,Vincent,K.和Sharp,P.(2006).Oligonucleotide-directed gene repair in wheat using a transient plasmid gene repair assaysystem（《使用瞬时质粒基因修复试验系统在小麦中由寡核苷酸引导的基因修复》）.PlantCell Rep25,457-65.
Igoucheva,O.,Alexeev,V.和Yoon,K.(2001).Targeted gene correction bysmall single-stranded oligonucleotides in mammalian cells（《哺乳动物细胞中通过小单链寡核苷酸的靶向基因校正》）.Gene Ther8,391-9.
Kmiec,E.B.(2003).Targeted gene repair--in the arena（《靶向基因修复--在平台中》）J Clin Invest112,632-6.
Kochevenko,A.和Willmitzer,L.(2003).Chimeric RNA/DNA oligonucleotide-based site-specific modification of the tobacco acetolactate syntase gene（《烟草乙酰乳酸合酶基因的基于嵌合RNA/DNA寡核苷酸的位点特异性修饰》）.PlantPhysiol132,174-84.
Liu,L.,Cheng,S.,van Brabant,A.J.和Kmiec,E.B.(2002).Rad51p and Rad54p,but not Rad52p,elevate gene repair in Saccharomyces cerevisiae directed bymodified single-stranded oligonucleotide vectors（《Rad51p和Rad54p，但不是Rad52p通过修饰的单链寡核苷酸载体引导提高酿酒酵母中的基因修复》）.Nucleic Acids Res30,2742-50.
Okuzaki,A.和Toriyama,K.(2004).Chimeric RNA/DNA oligonucleotide-directed gene targeting in rice.（《大米中嵌合RNA-DNA寡核苷酸引导的基因靶向》）Plant Cell Rep22,509-12.
Parekh-Olmedo,H.,Ferrara,L.,Brachman,E.和Kmiec,E.B.(2005).Genetherapy progress and prospects:targeted gene repair（《基因治疗进展和展望：靶向基因修复》）.Gene Ther12,639-46.
Rice,M.C.,Czymmek,K.和Kmiec,E.B.(2001).The potential of nucleic acidrepair in functional genomics（《功能性基因组中核酸修复的潜力》）.NatBiotechnol19,321-6.
Ruiter,R.,van den Brande,I.,Stals,E.,Delaure,S.,Cornelissen,M.和D'Halluin,K.(2003).Spontaneous mutation frequency in plants obscures the effectof chimeraplasty（《植物中自发性突变频率掩盖嵌合体成形术的影响》）.Plant MolBiol53,675-89.
Shahin,E.A.(1985).Totipotency of tomato protoplasts（《番茄原生质体的全能性》）.Theor.Appl.Genet.69,235-240.
Tan,M.-L.M.C.,Colijn-Hooymans,C.M.,Lindhout,W.H.和Kool,A.J.(1987a).Acomparison of shoot regeneration from protoplasts and leaf discs of differentgenotypes of the cultivated tomato（《比较从培养番茄的不同基因分型的原生质体和叶盘中的苗再生》）.Theor.Appl.Genet.75,105-108.
Tan,M.-L.M.C.,Rietveld,E.M.,van Marrewijk,G.A.M.和Kool,A.J.(1987b).Regeneration of leaf mesophyll protoplasts of tomato cultivars(L.esculentum):factors important for efficient protoplast culture andregeneration（《番茄栽培变种(L.esculentum)的叶肉原生质体的再生：对有效原生质体培养和再生的重要因素》）.Plant Cell Reports6,172-175.
Zhu,T.,Mettenburg,K.,Peterson,D.J.,Tagliani,L.和Baszczynski,C.L.(2000).Engineering herbicide-resistant maize using chimeric RNA/DNAoligonucleotides（《使用嵌合RNA/DNA寡核苷酸工程改造抗除草剂玉米》）.NatBiotechnol18,555-8.
Zhu,T.,Peterson,D.J.,Tagliani,L.,St Clair,G.,Baszczynski,C.L.和Bowen,B.(1999).Targeted manipulation of maize genes in vivo using chimeric RNA/DNAoligonucleotides（《使用嵌合RNA/DNA寡核苷酸靶向操作玉米基因》）.Proc Natl AcadSci U S A96,8768-73.

Claims (54)

1.一种靶向改变双链受体DNA序列的方法，所述双链受体DNA序列包含第一DNA序列和与第一DNA序列互补的第二DNA序列，所述方法包括：
用供体寡核苷酸与双链受体DNA序列结合，其中所述寡核苷酸包含至少一个能与所述第一DNA序列杂交的结构域，所述结构域包含或直接相邻于至少一个相对于所述第一DNA序列的错配，其中所述至少一个错配位于距离所述寡核苷酸3’末端至多2个核苷酸处，所述方法在能靶向核苷酸交换的蛋白的存在下进行。
2.如权利要求1所述的方法，所述至少一个错配位于距离所述寡核苷酸3’末端至多1个核苷酸处。
3.如权利要求1所述的方法，所述至少一个错配位于所述寡核苷酸的3’末端。
4.如权利要求1所述的方法，所述供体寡核苷酸除错配以外与第一DNA序列互补。
5.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述的寡核苷酸包含至少一个部分，所述部分包含至少一个修饰的核苷酸，所述修饰选自下组：碱基修饰、主链修饰或糖修饰。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碱基修饰是3’和/或5’末端碱基修饰。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述修饰的核苷酸与其互补核苷酸的结合亲和力高于天然存在的A，C，T，或G核苷酸，与互补于第一DNA序列中相对位置核苷酸的天然存在的核苷酸相比，所述修饰的核苷酸与第一DNA序列中相对位置核苷酸的结合更强，且/或其中所述修饰的核苷酸是耐受核酸酶的核苷酸。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述修饰的核苷酸选自下组：LNA或硫代磷酸酯键的核苷酸。
9.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸包含至少2、3、4或5个修饰核苷酸。
10.如前述的任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述错配不是修饰的核苷酸。
11.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述修饰的核苷酸距离至少一个错配至少1个核苷酸处。
12.如前述的任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸包含2、3或4个错配。
13.如前述的任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA的改变在细胞中进行。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述细胞是原核细胞。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述细胞是细菌细胞。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述细胞是真核细胞。
17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述细胞是植物细胞。
18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述细胞是动物细胞。
19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述细胞是酵母细胞。
20.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述细胞是真菌细胞。
21.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述细胞是啮齿细胞。
22.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述细胞是人细胞。
23.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述细胞是非人细胞。
24.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述细胞是非人胚胎细胞。
25.如前述的任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA获自原核生物体。
26.如前述的任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA获自细菌。
27.如前述的任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA获自真核生物体。
28.如前述的任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA获自植物。
29.如前述的任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA获自动物。
30.如前述的任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA获自酵母。
31.如前述的任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA获自真菌。
32.如前述的任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA获自啮齿动物。
33.如前述的任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA获自人。
34.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述改变是删除、取代和/或插入至少一个核苷酸。
35.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA来自基因组DNA。
36.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA来自线性DNA。
37.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA来自哺乳动物人工染色体。
38.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA来自细菌人工染色体。
39.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA来自酵母人工染色体。
40.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA来自植物人工染色体。
41.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA来自核染色体DNA。
42.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA来自细胞器DNA。
43.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA来自质粒DNA。
44.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA来自附加体DNA。
45.将前述任一项权利要求所述的方法应用于改变细胞。
46.将前述任一项权利要求所述的方法应用于通过恢复野生型校正突变。
47.将前述任一项权利要求所述的方法应用于诱导突变。
48.将前述任一项权利要求所述的方法应用于破坏编码区使酶失活。
49.将前述任一项权利要求所述的方法应用于改变编码区修饰酶的生物活性。
50.将前述任一项权利要求所述的方法应用于破坏编码区修饰蛋白。
51.将前述任一项权利要求中所述的寡核苷酸应用于靶向改变双链受体DNA序列。
52.如权利要求51所述的应用，所述应用是错配修复。
53.如权利要求51所述的应用，所述应用是植物遗传物质的靶向改变。
54.如权利要求53所述的应用，所述植物遗传物质的靶向改变包括基因突变、靶向基因修复和基因敲除。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012074386A1 (en) 2010-12-02 2012-06-07 Keygene N.V. Targeted alteration of dna with oligonucleotides
WO2015035034A1 (en) * 2013-09-04 2015-03-12 Mice With Horns, Llc Materials and methods for correcting recessive mutations in animals
WO2016105185A1 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Keygene N.V. Plant callus populations
WO2018115389A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Keygene N.V. Methods of targeted genetic alteration in plant cells
AU2018336126A1 (en) * 2017-09-19 2020-04-30 Tropic Biosciences UK Limited Modifying the specificity of non-coding RNA molecules for silencing gene expression in eukaryotic cells
JP7396770B2 (ja) 2018-07-12 2023-12-12 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 植物細胞におけるゲノム編集のためのｖ型ｃｒｉｓｐｒ／ヌクレアーゼシステム
EP3874048A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Keygene N.V. Dual guide rna for crispr/cas genome editing in plants cells

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US579597A (en) 1897-03-30 Apparatus for heating blooms or other articles of metal
US5556747A (en) * 1990-07-09 1996-09-17 E. R. Squibb & Sons, Inc. Method for site-directed mutagenesis
US6136601A (en) 1991-08-21 2000-10-24 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Targeted mutagenesis in living cells using modified oligonucleotides
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5731181A (en) 1996-06-17 1998-03-24 Thomas Jefferson University Chimeric mutational vectors having non-natural nucleotides
ES2192672T3 (es) 1996-11-18 2003-10-16 Takeshi Imanishi Nuevos analogos de nucleotidos.
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
NZ503765A (en) 1997-09-12 2002-04-26 Exiqon As Bi-cyclic and tri-cyclic nucleotide analogues
US6010907A (en) 1998-05-12 2000-01-04 Kimeragen, Inc. Eukaryotic use of non-chimeric mutational vectors
CA2368135C (en) 1999-03-18 2010-06-08 Exiqon A/S Xylo-lna analogues
JP2002543214A (ja) 1999-05-04 2002-12-17 エクシコン エ／エス Ｌ−リボ−ｌｎａ類縁体
AP2002002638A0 (en) 2000-03-27 2002-09-30 Univ Delaware Targeted chromosomal genomic alternations with modified single stranded oligonucleotides.
US6936467B2 (en) 2000-03-27 2005-08-30 University Of Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides
AU2001263271A1 (en) 2000-05-17 2001-11-26 University Of Delaware Plant gene targeting using oligonucleotides
WO2002026967A2 (en) 2000-09-25 2002-04-04 Thomas Jefferson University Targeted gene correction by single-stranded oligodeoxynucleotides
WO2003013226A2 (en) 2001-08-09 2003-02-20 Cibus Genetics Non-transgenic herbicide resistant plants
EP1446503A2 (en) 2001-09-27 2004-08-18 University Of Delaware Composition and methods for enhancing oligonucleotide-directed nucleic acid sequence alteration
JP4883447B2 (ja) * 2004-12-13 2012-02-22 浩之 紙谷 核酸構築物及びそれを利用した標的領域への変異導入方法
WO2007073149A1 (en) 2005-12-22 2007-06-28 Keygene N.V. Alternative nucleotides for improved targeted nucleotide exchange
JP5467999B2 (ja) * 2007-06-22 2014-04-09 キージーン・エン・フェー 改善された修飾オリゴヌクレオチドを用いた標的ヌクレオチドの交換
ATE555219T1 (de) * 2008-08-12 2012-05-15 Hoffmann La Roche Korrekturlese-primerverlängerung
WO2012074386A1 (en) 2010-12-02 2012-06-07 Keygene N.V. Targeted alteration of dna with oligonucleotides

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