CN101868542A

CN101868542A - 具有改进的经修饰的寡核苷酸的定向核苷酸交换

Info

Publication number: CN101868542A
Application number: CN200880020319A
Authority: CN
Inventors: P·邦道克
Original assignee: Keygene NV
Current assignee: Keygene NV
Priority date: 2007-06-22
Filing date: 2008-06-19
Publication date: 2010-10-20
Also published as: BRPI0811710A2; KR20100051795A; NZ582721A; AU2008269778A1; JP5467999B2; CA2690510A1; RU2010101882A; IL202530A0; WO2009002150A1; EP2167660A1; JP2010530750A; US20100223691A1

Abstract

一种用于双链DNA序列的定向核苷酸交换的方法和寡核苷酸，其中供体寡核苷酸含有至少两个经修饰的核苷酸，至少其中一个是丙炔化嘌呤和/或嘧啶并且至少其中一个是LNA，所述经修饰的核苷酸与天然存在的A、C、T或G相比具有较高的结合亲和力和/或与天然存在的与第一DNA序列中相反位置上的核苷酸互补的核苷酸相比更强地结合至第一DNA序列中相反位置上的核苷酸。

Description

具有改进的经修饰的寡核苷酸的定向核苷酸交换

技术领域

本发明涉及一种通过向细胞中引入寡核苷酸而特异地和选择性地改变靶细胞中特定的DNA位点上的核苷酸序列的方法。结果是定向改变了一个或多个核苷酸，以致在其不同的地方修改了靶DNA的序列。更特别地是，本发明涉及使用经修饰的寡核苷酸的定向核苷酸交换。本发明进一步涉及寡核苷酸和试剂盒。本发明还涉及该方法的应用。

背景技术

遗传修饰是在活细胞的遗传物质中故意产生变化的过程，其目的是修饰该细胞或生物的一个或多个遗传编码的生物学特征，所述细胞形成所述生物的一部分或再生形成所述生物。这些改变可以是下列形式：删除部分遗产物质、加入外源性遗传物质或改变遗传物质的现有核苷酸序列。遗传修饰真核生物的方法被人们知道已经超过20年，已经发现其广泛地在植物、人类和动物细胞和微生物中应用于农业、人类健康、食品质量和环境保护领域中的改善。遗传修饰的常见方法由以下组成：向细胞的基因组中加入外源DNA片段，然后将赋予细胞或其生物除了由已经存在的基因所编码的性质之外的新性质(包括已经存在的基因的表达将因此被抑制的应用)。虽然许多这样的例子在获得所需性质中有效，但是这些方法不十分精确，因为对外源DNA片段插入的基因组位置没有控制(因此无法控制最终的表达水平)，并且因为所需的效果将需要证实其优于原始和均衡的基因组所编码的天然性质。相反，将引起预先确定的基因组位点中的核苷酸的加入、删除或转换的遗传修饰的方法将允许精确地修饰现有基因。

寡核苷酸指引的定向核苷酸交换(TNE)是一种基于向真核细胞核中递送合成性寡核苷酸(由在Watson-Crick碱基配对性质上与DNA相似的短段核苷酸样半体(moiety)组成的分子，但是可以在化学上与DNA不同)的方法(Alexeev和Yoon，Nature Biotechnol.16：1343，1998；Rice，Nature Biotechnol.19：321，2001；Kmiec，J.Clin.Invest.112：632，2003)。通过故意在寡核苷酸的同源序列中设计错配核苷酸，该错配核苷酸可以导致基因组DNA序列中的改变。该方法允许在靶标中转换单个或最多几个核苷酸，但是可以应用于在现有基因中产生终止密码子，导致其功能的破坏，或产生密码子改变，导致编码具有改变的氨基酸组成(蛋白工程)的蛋白的基因。

在植物、动物和酵母细胞中已经有定向核苷酸交换(TNE)的描述。第一次TNE报道应用了被设计插入染色体靶标位点的所谓的DNA:RNA自我互补寡核苷酸。该嵌合体含有在形成模板的DNA链上的错配核苷酸，所述模板用于将突变引入染色体靶标。使用嵌合体DNA:RNA寡核苷酸的第一个例子来自动物细胞(在Igoucheva等人.2001Gene Therapy 8，391-399中有综述)。许多实验室的深入研究已经显示使用这样的寡核苷酸的TNE频率是可变的，并且平均非常低，并且取决于这样的因素如靶标的转录状态、细胞周期的影响和转化的细胞类型。在植物细胞中已经证明使用嵌合体DNA:RNA寡核苷酸的TNE(Beetham等人1999Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778；Zhu等人1999Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，8768-8773；Zhu等人2000Nature Biotech.18，555-558；Kochevenko等人2003PlantPhys.132：174-184；Okuzaki等人2004Plant Cell Rep.22：509-512)。通常，在植物和动物研究中报道的频率对于在非可选择的染色体位点上实际应用TNE是太低了。

还发现使用嵌合体寡核苷酸的TNE难以重复(Ruiter等人(2003)Plant Mol.Biol.53，715-729)，这导致对另外的给出更可靠结果的寡核苷酸设计的寻找。几个实验室已经集中精力于为TNE而使用单链(ss)寡核苷酸。已经发现这些在植物和动物细胞中给出更可重复的结果(Liu等人2002Nuc.Acids Res.30：2742-2750；review，Parekh-Olmedo等人2005Gene Therapy 12：639-646；Dong等人2006PlantCell Rep.25：457-65)。

几个小组已经显示可以在体外使用总细胞蛋白提取物模仿TNE过程。这样的TNE活性分析被称为无细胞分析。

该分析包括通过将载有这样报告体的质粒与来自特定细胞类型的细胞蛋白和寡核苷酸孵育而修复使细菌报告体基因(如LacZ或抗生素抗性基因)失活的突变。孵育后，将质粒电穿孔至用作测定TNE效率的读出系统的大肠杆菌(E.coli)中。无细胞系统已经与嵌合体DNA:RNA(Cole-Strauss等人1999NucleicAcids Res.27：1323-1330；Gamper等人2000Nucleic Acids Res.28，4332-4339；Kmiec等人2001Plant J.27：267-274；Rice等人2001 40：857-868；Thorpe等人2002 J.GeneMedicine 4，195-204)和单链寡核苷酸(Igoucheva等人2001 Gene Therapy 8，391-399；Kren等人2003DNA Repair 2，531-546；Olsen等人2005 J.Gene Medicine7，1534-1544)联合使用。

在这样的实验中，寡核苷酸通常通过将终止密码子(TAG)改变为指定氨基酸的密码子而影响置换。另外，无细胞系统还可以用于研究使用寡核苷酸产生单核苷酸插入的可能性。可以产生具有从细菌报告体基因中删除单个核苷酸而产生移框突变的质粒。在无细胞分析中，通过加入由寡核苷酸介导的核苷酸的删除而修复该删除。相似地，含有原本不存在于靶标的一个或多个额外的核苷酸的寡核苷酸还可以用于向靶序列中引入一个或多个核苷酸。

TNE在高等生物中如植物的细胞中应用所面临的最大问题是迄今已经报道的低效率。在玉米中Zhu等人(2000Nature Biotech.18：555-558)报道1x10^-4的转换频率。随后在烟草(Kochevenko等人2003Plant Phys.132：174-184)和水稻(Okuzaki等人2004Plant Cell Rep.22：509-512)中的研究分别报道1x10^-6和1x10^-4的频率。这些频率对于TNE的实际应用仍然太低。

使用嵌合体DNA：RNA寡核苷酸的TNE已经在Kmiec的各种专利申请中有描述，特别是WO0173002、WO03/027265、WO01/87914、WO99/58702、WO97/48714、WO02/10364。在WO 01/73002考虑到，使用未经修饰的DNA寡核苷酸获得的基因改变的低效率相信大多是由存在于靶细胞的反应混合物中的核酸酶降解供体寡核苷酸的结果。为了校正这一问题，建议的是引入给予获得的寡核苷酸核酸酶抗性的经修饰的核苷酸。通常的例子包括具有磷硫酰连接或2’-O-甲基类似物的核苷酸。这些修饰优选位于寡核苷酸的末端，令中心DNA结构域包围错配的核苷酸。另外，公开物规定转换寡核苷酸和参与转换的蛋白之间包括特异性化学相互作用。不能预测使用除了磷硫酰连接或2’-O-甲基类似物引入寡核苷酸以外的修饰而产生核酸酶抗性末端的这样的化学相互作用的效果，因为还不知道，并且根据WO0173002的发明人，不能预测参与改变过程的蛋白及其与寡核苷酸取代物的化学相互作用。

使用经修饰的单链寡核苷酸的TNE已经在专利申请WO 02/26967中有描述。该申请证明给予寡核苷酸增加的核酸酶抗性的经修饰的核苷酸对于使用无细胞系统的TNE效率的作用。然后该申请继续显示使用无细胞系统鉴定的经修饰的核苷酸(当引入单链寡核苷酸中时)还增强哺乳动物染色体靶标上的TNE。这证实在体外无细胞分析中获得的信息可应用于体内染色体位点。该申请还要要求保护：几个经修饰的核苷酸，例如C5-丙炔嘧啶，而不是被锁定的核酸，还可以用于增加TNE的效率。作者陈述(第16页)：“引入寡核苷酸的修饰将不改变对生物活性负责的细胞功能，在这个情况下是指重组和修复活性”。相反，我们在本申请中证明WO 02/26967所述的显示增加的结合活性的几个经修饰的核苷酸在TNE过程中无生物学活性，因此预测经修饰的核苷酸在TNE过程中的有用性不能只基于增加结合亲和力而做出。

由于现在的TNE方法效率相对低(如前面说明的在10^-6至10^-4之间，尽管报道的寡核苷酸的90％的高递送率)，本领域中有必要得到更有效的TNE的方法。因此，本发明人开始改进现有的TNE技术。

发明内容

现在本发明人已经发现通过向用于TNE的供体寡核苷酸引入经修饰的核苷酸组合(其能够比相应的未经修饰的核苷酸如A、C、T或G更强结合受体DNA，可以显著增加TNE的速率。不限于理论，本发明人相信，通过向供体寡核苷酸引入经修饰的核苷酸，供体寡核苷酸更强地结合受体DNA，因此增加TNE的比率。

另外，本发明人已经发现，经修饰的核苷酸增加TNE的能力依赖两个重要性质：(1)与正常未经修饰的DNA相比其对其靶标增加的结合亲和力，(2)其对于TNE过程的生物学活性。反义技术也应用寡核苷酸在细胞中诱导效应。在这种情况下，将寡核苷酸设计成与互补靶标mRNA结合。这个DNA:RNA杂合体由切割杂合体的RNA链的RNaseH识别，抑制基因表达。增加的结合亲和力和增强的核酸酶抗性，获得有效反义反应所需的寡核苷酸特征也是已经发现对于增加TNE频率重要的特征。已经在文献中报道了许多显示增加的结合亲和力和/或核酸酶抗性的经修饰的核苷酸，但是关键步骤是证明含有这样经修饰的核苷酸的寡核苷酸对于TNE过程仍然保持生物学活性。

本发明人已经使用无细胞系统为了其增强TNE能力而筛选了许多经修饰的核苷酸并且已经发现这不能通过研究经修饰的核苷酸的物理性质而预测。另外，本发明人发现，许多用于增加反义寡核苷酸性质的经修饰的核苷酸实际上抑制无细胞系统中的TNE。因此，本发明人鉴定了对增加TNE本身效率特异的经修饰的核苷酸。另外相信，本寡核苷酸显示出有利的立体化学和空间构型。

本发明人已经发现含有接近但不(直接)毗邻错配，即位于距离错配至少一个核苷酸的位置上的一个或多个LNA的寡核苷酸，与C7-丙炔修饰的嘌呤和/或C5-丙炔修饰的嘧啶一起(一起被称为丙炔化的核苷酸)增加TNE的效率至迄今未预料的程度，特别地增加体内即不在无细胞系统中，但是例如在原生质体系统中的TNE的效率。

为此，已经研究了使用在寡核苷酸中不同位置上引入一个或多个LNA和一个或多个丙炔化核苷酸的寡核苷酸对于无细胞系统中TNE频率的效果。这样的寡核苷酸的TNE活性与由正常DNA构成的或由只用LNA或丙炔化核苷酸修饰的寡核苷酸构成的寡核苷酸的TNE活性比较。发现含有在距离错配至少一个核苷酸的位置上的一个或多个LNA并联合增加量的丙炔化核苷酸的寡核苷酸增加无细胞分析中置换和插入的TNE效率至迄今未观察到的水平。特别地，通过插入核苷酸，即在给定的位置插入一个或多个核苷酸而获得了有利的效果，并且特别是在体内系统，如原生质体系统中，效率显著增加。

进一步发现：当经修饰的寡核苷酸用于西红柿叶子原生质体中的TNE时(其给出寡核苷酸的未有先例的增加)这种增强也可以通过改变LNA的数目和位置而被增加。例如其中将LAN位于至少间隔2个核苷酸，优选至少3个核苷酸，更优选至少4个核苷酸。

另外发现引入西红柿基因组的核苷酸改变。这证明观察到的增加为位点非依赖性的，表明具有在与错配相比特定位置上的经修饰的核苷酸的本发明的寡核苷酸能够以物种不相关的方式，如在植物和动物细胞中，提供增加的TNE频率。

因此本发明基于如下的发明考虑：可以通过使用部分(即最多50％，优选最多40％)LNA修饰的进一步含有丙炔化寡核苷酸的寡核苷酸而实现所需的定向核苷酸交换。寡核苷酸修饰的位置、类型和数量可以在限定内变化，如将在下面本文所讨论的那样。

因此本发明在一个方面提供经LNA修饰的和丙炔化寡核苷酸。因此修饰的单链寡核苷酸可以用于在植物和动物或人类细胞中引入特异的遗传改变。本发明适用于生物医学研究、农业领域并且构建特异突变的植物和动物，包括人类。本发明还适用于医学和基因治疗领域。

除了含有将碱基变化引入靶链的错配碱基的部分之外，本发明的寡核苷酸的序列与靶链同源。错配碱基被引入靶序列。通过操作核苷酸的修饰(与常规的A、C、T或G相比)，更特别地，通过操作引入错配的寡核苷酸修饰的位置和数量，可以增加效率(或DNA双链中所需位置的核苷酸改变的成功程度)。

本发明的另一个方面在于一种通过将亲代DNA双链与寡核苷酸接触而定向改变亲代DNA链(第一链、第二链)的方法，所述寡核苷酸含有与亲代链相比至少一个错配的核苷酸，其中供体寡核苷酸含有特定位置上以LNA修饰的区段从而当能够进行定向核苷酸交换的蛋白存在时，具有比亲代(受体)链更高的结合能力。

因此，本发明的发明要点在于以相对于未经修饰的寡核苷酸来说，具有经修饰的核苷酸的寡核苷酸(有时称作供体)的结合能力的增加，其中LNA修饰位于与错配不相邻的一个或多个位置并且通常在未经LNA修饰的位置和不在错配的位置上将丙炔化核苷酸引入寡核苷酸。

还通过使用根据本发明的具有组合的LNA和丙炔修饰物的寡核苷酸以插入DNA片段中的插入物达到了有利的结果。特别令人惊讶值得注意的是其它经修饰的已知本身增加结合效率的寡核苷酸，在TNE中不如LNA和丙炔修饰的寡核苷酸的本组合有效。

具体实施方式

在一个方面，本发明涉及用于定向改变双链DNA序列的寡核苷酸，该双链DNA序列含有第一DNA序列和与第一DNA序列互补的第二DNA序列，所述寡核苷酸含有能够与第一DNA序列杂交的结构域，该结构域相对于第一DNA序列来说含有至少一个错配，并且其中该寡核苷酸包含至少一个区段，该区段含有至少两个经修饰的核苷酸，所述核苷酸与天然存在的A、C、T或G核苷酸相比具有更高的结合亲和力，其中

-至少一个经修饰的核苷酸是位于与至少一个错配相距至少一个核苷酸的位置上的LNA，其中可选地，寡核苷酸含有最多约50％的LNA修饰的核苷酸；并且

-至少一个经修饰的核苷酸是C7-丙炔嘌呤或C5-丙炔嘧啶。

在一个方面，本发明涉及用于定向改变双链DNA序列的经修饰的寡核苷酸。该双链DNA序列含有第一DNA序列和第二DNA序列。该第二DNA序列与第一DNA序列互补并且与之配对而形成双链。该寡核苷酸包括结构域，该结构域含有相对于需要改变的双链DNA序列的至少一个错配。优选，该结构域是与第一链互补的包括至少一个错配的寡核苷酸的一部分。

优选地，结构域中的错配是相对于第一DNA序列的错配。该寡核苷酸包含以至少一个LNA修饰的区段和以至少一个丙炔化核苷酸修饰的区段，从而具有比第二DNA序列(对应的部分)更高的结合亲和力，同时保留了生物学活性。优选地，至少一个经修饰的LNA核苷酸位于与至少一个错配相距至少一个核苷酸的位置，更优选寡核苷酸含有最多约50％的LNA修饰的核苷酸以及至少一个丙炔化核苷酸。

含有错配的结构域和含有经修饰的核苷酸的区段，无论分别是LNA或是丙炔化的，可以重叠。因此，在某些具体实施方式中，相对于所考虑修饰的区段，含有错配的结构域位于寡核苷酸上的不同位置上。在某些具体实施方式中，结构域整合一个或多个区段。在某些具体实施方式中，区段可以整合结构域。在某些具体实施方式中，结构域和区段可以位于寡核苷酸的相同位置上并且具有相同的长度，即区段在长度和位置上是一致的。在某些具体实施方式中，结构域中可以有一个以上的区段。

对于本发明，这意味含有为了改变DNA双链的错配的寡核苷酸部分可以位于与修饰的寡核苷酸部分不同的或移位的位置上。特别地，在某些具体实施方式中，其中细胞的修复系统(或至少参与该系统的蛋白，或至少参与TNE的蛋白)决定哪条链含有错配以及哪条链将用作改正该错配的模板。

LNA变化

锁定的核酸(LNA)是具有非常有趣性质的用于反义基因治疗的DNA类似物。LNA是二环和三环核苷和核苷酸类似物和含有这样类似物的寡核苷酸。在各种出版物和专利中，包括WO 99/14226、WO 00/56748、WO00/66604、WO 98/39352、美国专利No.6,043,060和美国专利No.6,268,490中公开了LNA的基本结构和功能性特征以及相关的类似物，所有这些全部通过参考全文并入本文。

特别地，其结合了区分正确和非正确靶标(高特异性)的能力，非常高的生物稳定性(低周转)和未有先例的亲和力(非常高的对靶标的结合强度)。事实上，以LNA记录的亲和力的增加使得所有以前报道的类似物的亲和力在低至中等的氛围内。

LNA是RNA类似物，其中核糖在结构上被2′-氧和4′-碳原子之间的亚甲基桥所限制。该桥限制了呋喃核糖环的灵活性并且将结构锁至刚性的二环结构。这个所谓的N-型(或3′-内)构象造成含有双链的LNA的T_m增加，以及随后的更高的结合亲和力和更高的特异性。NMR光谱研究实际上已经证明LNA糖的锁定的N-型构象，但是还揭示LNA单体能够将其非修饰的相邻核苷酸扭至N-型构象。重要的是LNA的有利特征是不以其它重要性质为代价的，而核酸类似物则经常观察到是以其它重要性质为代价。

可以将LNA与所有其它组成DNA类似物总体的化学物自由地混合。可以将LNA碱基引入寡核苷酸作为短的全LNA序列或作为较长的LNA/DNA嵌合体。可以将LNA置于内部3′或5′位置。但是由于其刚性的二环构象，LNA残基有时妨碍核酸链的螺旋扭转。因此较不优选的是设计具有两个或两个以上相邻LNA残基的寡核苷酸。优选，LNA残基由至少一个(经修饰的)不干扰螺旋扭转的核苷酸(如常规的核苷酸A、C、T或G)分开。

最初开发的和优选的LNA单体(β-D-氧-LNA单体)已经被修饰成新的LNA单体。新型α-L-氧-LNA对3’-外切核酸酶活性显示超稳定性，并且还比β-D-氧-LNA在设计有力的反义寡核苷酸方面更有力和更万能。另外可以使用木-LNA(xylo-LNA)和L-核糖LNA，如在WO9914226、WO00/56748、WO00/66604中公开的。本发明中，任何上面类型的LNA可以在实现本发明的目标(即增加TNE效率)中有效，优选是β-D-LNA类似物。

TNE领域中，LNA修饰被列在作为TNE中的嵌合体分子的替代物的可能寡核苷酸修饰的名单中。但是，迄今本领域中没有显示建议：当LNA位于距离错配至少一个核苷酸远时和/或当寡核苷酸不含约50％以上(四舍五入至最接近核苷酸整数)的LNA时，LNA修饰的单链DNA寡核苷酸显著增加TNE效率至现在已经发现的程度。

在某些具体实施方式中，寡核苷酸包括含有至少一个，优选至少2个，更优选2个LNA修饰的核苷酸的区段。在某些具体实施方式中，寡核苷酸上的区段可以含有2、3、4、5、6、7、8、9或10个以上的LNA修饰的核苷酸。

在某些具体实施方式中，至少一个LNA位于距离错配最多10个核苷酸，优选最多8个核苷酸，更优选最多6个核苷酸，甚至更优选最多4、3或2个核苷酸的距离。在更优选的具体实施方式中，至少一个LNA位于距离错配一个核苷酸的距离，即错配和LNA之间有一个核苷酸。在某些涉及含有一个以上的LNA的寡核苷酸的具体实施方式中，至少两个LNA位于距离错配至少一个核苷酸的距离。在优选的具体实施方式中，LNA彼此不相邻并且由至少一个核苷酸，优选由两个或三个核苷酸所分开。在某些具体实施方式中，在两个或两个以上(偶数)LNA修饰寡核苷酸的情况下，修饰位于距离错配(约)相等的距离。换句话说，优选LNA修饰对称地位于错配的周围。例如，在优选的具体实施方式中，两个LNA对称地位于错配周围距离错配1个核苷酸的距离(且彼此间隔3个核苷酸)，即...(LNA)-N-(错配)N-(LNA)...。

在某些具体实施方式中，最多40％，优选最多30％，更优选最多25％，甚至更优选最多20％，和最优选最多10％的寡核苷酸的经修饰的核苷酸是LNA衍生物，即常规的A、C、T或G被其LNA的对应物所替代。

在某些具体实施方式中，可以引入一个以上的错配，或同时或相继引入。寡核苷酸可以在寡核苷酸相邻或远离的位置上容纳一个以上的错配。为此，寡核苷酸可以根据本文所示的原则适应为容纳第二套LNA，只要它们不会由于寡核苷酸中的LNA的特定构象(即优选位于错配周围距离错配一个核苷酸的距离)而干扰彼此的增加的结合能力或保留的生物学活性。在某些具体实施方式中，寡核苷酸可以包含可以是相邻的或远距离的(即非相邻的)两个、三个、四个或更多错配核苷酸。寡核苷酸可以进一步含有结构域和区段以容纳这些，并且特别地可以含有几个区段。在某些具体实施方式中，寡核苷酸可以整合一个潜在的插入物以插入受体链。这样的插入物的长度可以从5个以上至100个核苷酸变化。以相似的方式，在某些具体实施方式中，可以引入相似长度变化(从1至100个核苷酸)的删除。

可以通过电穿孔或其它能够递送至核或细胞质的常规技术而完成寡核苷酸的递送。可以使用如WO01/87914、WO03/027265、WO99/58702、WO01/92512中所述的无细胞系统而实现本发明的方法的体外测试。

丙炔修饰

在某些具体实施方式中，寡核苷酸包括含有至少一个，优选至少两个，更优选至少三个丙炔修饰的核苷酸的区段，所述修饰的核苷酸独立地选自C7嘌呤和/或C5嘧啶。在某些具体实施方式中，寡核苷酸上的区段可以含有4、5、6、7、8、9或10个以上丙炔修饰的核苷酸。在某些具体实施方式中，区段是完全修饰的，即所有寡核苷酸中的嘧啶都载有C5-丙炔取代物和/或所有嘌呤都载有C7-丙炔取代物，然后LNA修饰可以位于区段的旁侧。在某些具体实施方式中，有经LNA修饰的区段和经丙炔修饰的区段。在某些具体实施方式中，区段同时含有LNA修饰的核苷酸和丙炔修饰的核苷酸。在某些具体实施方式中，寡核苷酸包括含有至少一个，优选至少2个，更优选至少3个丙炔修饰的核苷酸的区段。在某些具体实施方式中，寡核苷酸上的区段可以含有4、5、6、7、8、9或10个以上丙炔修饰的核苷酸。在某些具体实施方式中，区段是完全修饰的，即所有寡核苷酸中的嘧啶都载有C5-丙炔取代物和/或所有嘌呤都载有C7-丙炔取代物。在某些具体实施方式中，所有的嘌呤都可以被丙炔化并且嘧啶可以被LNA所置换或反之亦然。在某些具体实施方式中，寡核苷酸中至少10％的核苷酸被其丙炔化对应物所替代。在某些具体实施方式中，至少25，更优选至少50％，更优选至少75％和在某些情况下优选至少90％的核苷酸被其丙炔化对应物所替代。

包含在C5-位置上带有丙炔基团的嘧啶核苷酸的寡核苷酸形成相对于其对应的嘧啶衍生物而言更稳定的双链和三链。在7-位置上带有相同丙炔取代物的嘌呤形成甚至更稳定的双链并且因此是优选的。因此，在某些具体实施方式中，通过使用比C5-丙炔嘧啶核苷酸增强结合亲和力至甚至更大程度的7-丙炔嘌呤核苷酸(8-氮-7-脱氮-2’-脱氧鸟苷和8-氮-7-脱氮-2’-脱氧腺嘌呤的7-丙炔衍生物)进一步增加了效率。这样的核苷酸特别在He和Seela，2002 Nucleic Acids Res.30：5485-5496中被公开。

在某些具体实施方式中，可以引入一个以上的错配，或同时或相继引入。寡核苷酸可以在寡核苷酸相邻或远离的位置上容纳一个以上的错配。在某些具体实施方式中，寡核苷酸可以包含可以是相邻的或远距离的(即非相邻的)两个、三个、四个或更多错配核苷酸。寡核苷酸可以进一步包含结构域和区段以适应这一状况，并且特别可以包含几个区段。在某些具体实施方式中，寡核苷酸可以整合潜在的需要插入受体链的插入物。这样的插入物的长度可以从5个以上至100个核苷酸变化。以相似的方式在某些具体实施方式中，可以引入相似长度变化(从1至100个核苷酸)的删除。

在本发明的某些有利的具体实施方式中，使用本发明的寡核苷酸已经实现核苷酸的插入。在某些具体实施方式中，寡核苷酸可以整合潜在的需要插入受体链的插入物。这样的插入物的长度可以从1、2、3、4、5至100个核苷酸变化。以相似的方式在某些具体实施方式中，可以引入相似长度变化(从1至100个核苷酸)的删除。

在某些具体实施方式中，寡核苷酸中至少10％的核苷酸被其丙炔化对应物所替换。在某些具体实施方式中，至少25，更优选至少50％，更优选至少75％和在某些情况下优选至少90％的核苷酸被其丙炔化对应物所替代。

丙炔基团是具有三键的三碳链。三键与位于嘧啶的C⁵位置和嘌呤核苷酸的7-位上的核苷酸基本结构共价结合(图2)。胞嘧啶和尿嘧啶(替代寡核苷酸上的胸腺嘧啶)都可以装备C5-丙炔基团，分别形成C⁵-丙炔-胞嘧啶和C⁵-丙炔-尿嘧啶。单个C⁵-丙炔-胞嘧啶残基增加T_m 2.8℃，单个C⁵-丙炔-尿嘧啶增加1.7℃(Froehler等人1993 Tetrahedron Letters 34：1003-6；Lacroix等人1999 Biochemistry 38：1893-1901；Ahmadian等人1998 Nucleic Acids Res.26：3127-3135；Colocci等人1994J.Am.Chem.Soc 116：785-786)。这是由于C5-位上的1-丙炔基团的疏水性并且其还允许更好地堆积碱基，因为丙炔基团相对于杂环碱基而言是平面的。

已经研究了含有C5-丙炔取代的嘧啶基团的寡核苷酸的增加的结合性质以改变细胞过程。含有C5-丙炔基团的反义寡核苷酸与其靶标mRNA形成更稳定的双链，引起基因表达抑制的增加(Wagner等人1993 Science 260：1510-1513；Flanagan等人1996 Nature Biotech.14：1139-1145；Meunier等人2001 Antisense&NucleicAcid Drug Dev.11：117-123)。另外，这些实验证明这样的寡核苷酸有生物学活性并且可被细胞耐受。在TNE的领域中，C5-丙炔嘧啶修饰被列在作为TNE中的嵌合体分子的替代物的可能寡核苷酸修饰的名单中。但是，迄今本领域中没有显示建议：与LNA修饰联合的C5和/或C7修饰的单链DNA寡核苷酸显著增加TNE效率至现在已经发现的程度。

寡核苷酸设计

在本发明的进一步方面，可以通过下列方法实现寡核苷酸的设计：

-确定受体链的序列，或需要交换的核苷酸周围序列的至少一个区段。这可以通常是约与错配或所需插入位置相邻的至少10个，优选15、20、25或30个核苷酸，优选在错配的每一侧，(例如GGGGGGXGGGGGG，其中X是错配或插入位置)；

-设计与错配相邻的一个或两个区段互补的并且含有需要交换的核苷酸的供体寡核苷酸(例如CCCCCCYCCCCCC)；

-给供体寡核苷酸提供(例如通过合成)所需位置上的LNA和丙炔修饰。修饰可以根据环境广泛变化。例子是CCC^mCC^mCYCC^mCCC^mC、CCC^mCCCYCCC^mCCC、CCCCCCYCCC^mC^mC^mC^m、C^mC^mC^mC^mC^mCYCCCCCC、CCCCC^mCYCCC^mCCCCC等等，其中C^m代表LNA或丙炔修饰的核苷酸残基。对于不同的受体序列，例如ATGCGTACXGTCCATGAT，可以设计对应的供体寡核苷酸，例如具有如上文概括的可变修饰的TACGCALGYCLGGTACTA(L＝LNA或丙炔)。

-当存在能够靶向核苷酸交换的蛋白(例如，并且特别地是在细胞的错配修复机制中有功能的蛋白)时以供体寡核苷酸修饰DNA。

不被理论所限制，增加的结合亲和力被认为增加寡核苷酸发现并且保持结合其靶标的可能性，因此增加了TNE的效率。对糖骨架或碱基的许多不同化学修饰给予增加的结合亲和力。但是本发明人选择集中于LNA修饰的寡核苷酸并且发现其在TNE中的活性依赖寡核苷酸中的位置。

如本文中使用的，供体寡核苷酸影响TNE的能力取决于引入供体寡核苷酸中经修饰的核苷酸的类型、位置和数目或相对数量。该能力被定量：可以通过例如将常规核苷酸之间的结合亲和力(或结合能量(Gibbs自由能))标准化至1，即对于AT和GC，结合亲和力均标准化至1。对于本发明的寡核苷酸，每个修饰的核苷酸的相对结合亲和力(RBA)为＞1。这在下面的公式中举例说明：

其中RBA是总相对结合亲和力，RBA(经修饰的)是具有n个核苷酸长度的经修饰的寡核苷酸的相对结合亲和力的和，RBA(未修饰的)是具有m个核苷酸长度的未修饰的寡核苷酸的相对结合亲和力的和。例如，对于含有10个修饰的100bp寡核苷酸，每个具有1.1的相当结合亲和力。然后总RBA等于：RBA＝[(10*1.1)+(90*1.0)]-(100*1.0)＝1。

注意RBA的定义原则上不依赖需要比较的核苷酸链的长度。但是，当比较不同链的RBA时，优选的是链具有约相同的长度或采用可比长度的区段。注意RBA不考虑可以在链上集合在一起的修饰。因此以链B相比，某些链A的较高程度修饰意味着RBA(A)＞RBA(B)。对于上游和下游区段，可以确定和使用对应的(局部的)RBA值。为了容纳经修饰的核苷酸的位置效应，可以将重量因素引入RBA值。例如，经修饰的核苷酸对于与错配相邻的供体寡核苷酸的效应可以比位于距离错配5个核苷酸距离的经修饰的核苷酸的效应大。在本发明的上下文中，RBA(供体)＞RBA(受体)。

在某些具体实施方式中，供体的RBA值可以比受体的RBA至少大0.1。在某些具体实施方式中，供体的RBA值可以比受体的RBA值至少大0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5。RBA值可以源自核苷酸的经修饰的结合亲和力的常规分析，例如通过分子模拟法、热力学测定等。或者，可以通过测定修饰链和未修饰链之间的Tm差别而确定它们。或者，可以以未修饰和修饰链之间Tm的差别表示RBA，或者是通过测量，或者是通过使用用于计算一组核苷酸的Tm的常规公式，或者是计算和测量组合。

根据本发明的供体寡核苷酸可以含有进一步修饰以增加杂交特征，以致供体显示对靶标DNA链增加的亲和力，因此促进了供体的插入。也可以进一步修饰供体寡核苷酸以使其对核酸酶更具抗性，以稳定三链或四链结构。对本发明的LNA修饰的供体寡核苷酸的修饰可以包括硫磷酰修饰、2-OMe置换、在寡核苷酸的3和/或5’末端使用其它类型的LNA、PNA(肽核酸)，核糖核苷酸和其它碱基，所述这些调节优选为增加寡核苷酸和受体链之间杂交体的稳定性。

这些修饰中特别有用的是PNA，其是寡核苷酸类似物，其中寡核苷酸的脱氧核糖骨架被肽骨架所替代。一个这样的肽骨架是由通过酰胺键连接的N-(2-氨乙基)甘氨酸重复单位构成。每个单位的肽骨架连接至核苷碱基(也称为“碱基”)，其可以是天然存在的，非天然存在的或经修饰的碱基。PNA寡聚物结合具有比DNA或RNA更高的亲和力的与DNA或RNA特异性互补的序列。因此，获得的PNA/DNA或PNA/RNA双链具有更高的熔解温度(Tm)。此外，PNA/DNA或PNA/RNA双链的Tm比DNA/DNA或DNA/RNA双链对盐浓度较为不敏感。PNA的聚酰胺骨架还对酶的降解更有抗性。PNA合成在例如WO 92/20702和WO92/20703中有描述，其内容通过参考全文并入本文。其它PNA在例如WO93/12129和1996年7月23日出版的美国专利No.5,539,082中有示例，其内容通过参考全文并入本文。另外，许多科学出版物描述了PNA的合成以及其性质和用途。见例如Patel，Nature，1993，365，490、Nielsen等人，Science，1991，254，1497；Egholm，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，1895、Knudson等人，NucleicAcids Research，1996，24，494、Nielsen等人，J.Am.Chem.Soc.，1996，118，2287、Egholm等人，Science，1991，254，1497、Egholm等人，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，1895和Egholm等人，J Am.Chem.Soc.，1992，114，9677。

本发明的寡核苷酸的进一步有用的修饰还有从德国Epoch Biosciences获得的SuperA和Super T。这些经修饰的核苷酸含有插入DNA大沟的另外的取代物，其中被认为增加DNA双链的碱基堆积。

在另外的具体实施方式中，当将根据本发明的经修饰的寡核苷酸以外的进一步的修饰(其可以甚至更增加寡核苷酸对于受体链的亲和力)引入寡核苷酸时，可以获得有利的结果。因此，已经发现，进一步包含C5-丙炔修饰的嘧啶和/或C7-丙炔修饰的嘌呤的根据本发明的LNA修饰的寡核苷酸显著增加TNE的效率。

本发明的供体寡核苷酸还可以制成嵌合体，即含有DNA、RNA、LNA、PNA或其组合物的区段。

因此，在某些具体实施方式中，本发明的寡核苷酸进一步含有其它的可选的非甲基化的经修饰的核苷酸。

在某些具体实施方式中，寡核苷酸对核酸酶有抗性。这对于防止寡核苷酸被核酸酶降解有利，并且增大供体寡核苷酸发现其靶标(受体分子)的机会。

在本发明的某些具体实施方式中，可以修饰在寡核苷酸的错配位置上的核苷酸。错配是否可以被修饰将很大程度上取决于定向核苷酸交换的确切机制或利用供体和受体链间亲和力的差别的细胞DNA修复机制。对于与错配相邻或附近的其它修饰位置确切位置也是这样。但是，基于本文中显示的公开，考虑到对于如本文其它地方所述的合适的测试过程，可以容易地设计和测试这样的寡核苷酸。在某些具体实施方式中，未修饰错配位置上的核苷酸。在某些具体实施方式中，修饰在距离错配1个核苷酸远的位置上，优选距离错配2、3、4、5、6或7个核苷酸远。在某些具体实施方式中，修饰位于错配下游的位置。在某些具体实施方式中，修饰位于错配上游的位置。在某些具体实施方式中，修饰位于距离错配10bp至10kb，优选50至5000bp，更优选距离错配100至500bp。

用作供体的寡核苷酸的长度可变化但是通常在10-500个核苷酸的长度变化，优选为11-100个核苷酸，优选为15-90个核苷酸，更优选为20-70个核苷酸，最优选为30-60个核苷酸。

在一个方面，本发明涉及一种定向改变双链受体DNA序列的方法，其包括将双链受体DNA序列与供体寡核苷酸结合，其中双链受体DNA序列含有第一DNA序列和与第一DNA序列互补的第二DNA序列，并且其中供体寡核苷酸包括含有相对于需要改变的双链受体DNA序列(优选相对于第一DNA序列)而言至少一个错配的结构域，并且其中供体寡核苷酸的区段以至少一个LNA和至少一个丙炔化核苷酸修饰，从而当存在能够靶向核苷酸交换的蛋白时，表达与寡核苷酸中该位置上的未经修饰的核苷酸比，较高程度的对第一DNA序列的亲和力，其中LNA位于距离错配至少一个核苷酸的距离。

本发明以其最广泛的形式，通常适用于所有种类的生物如人类、动物、植物、鱼、爬行动物、昆虫、真菌、细菌等等。本发明适用于任何类型的DNA的修饰，如源于基因组DNA的DNA、线性DNA、人工染色体、核染色体DNA、细胞器染色体DNA、BAC、YAC的修饰。本发明可以在体内以及在体外进行。

本发明以其最广泛的形式，适用于改变细胞、通过恢复至野生型而改正突变、诱导突变、通过破坏编码区而灭活酶、通过改变编码区而修饰酶的生物活性、通过破坏编码区而修饰蛋白的许多目的。

本发明还涉及实质上如以上所述的寡核苷酸的用途，其用于改变细胞、通过恢复至野生型而改正突变、诱导突变、通过破坏编码区而失酶、通过改变编码区而修饰生物活性、通过破坏编码区而修饰蛋白、错配修复、定向改变(植物)遗传物质，包括基因突变、定向基因修复和基因敲除。

本发明进一步涉及一种试剂盒，其含有如本文其它地方所述的一个或多个寡核苷酸，可选地与能够诱导定向突变和特别地能够进行TNE的蛋白联合。

本发明进一步涉及通过本发明的方法获得的修饰的遗传物质，涉及含有修饰的遗传物质的细胞和生物，涉及如此获得的植物或植物部分。

可以通过电穿孔或其他能够递送至核或细胞质的常规技术实现寡核苷酸的递送。可以使用如WO01/87914、WO03/027265、WO99/58702、WO01/92512中所述的无细胞系统实现本发明方法的体外测试。

本发明以其最广泛的形式，适用于改变细胞、通过恢复至野生型而改正突变、诱导突变、通过破坏编码区而灭活酶、通过改变编码区而修饰生物活性、通过破坏编码区而修饰蛋白的许多目的。

本发明还涉及实质上如以上所述的寡核苷酸的用途，其用于改变细胞、通过恢复至野生型而改正突变、诱导突变、通过破坏编码区而灭活酶、通过改变编码区而修饰生物活性、通过破坏编码区而修饰蛋白、错配修复、定向改变(植物)遗传物质，包括基因突变、定向基因修复和基因敲除。

本发明进一步涉及一种试剂盒，其含有如本文其它地方所述的一个或多个寡核苷酸，可选地，与能够诱导定向突变和特别地能够进行TNE的蛋白联合。

本发明特别涉及使用本发明的LNA和丙炔修饰的寡核苷酸的TNE方法用于提供植物中的除草剂抗性的用途。特别地，本发明涉及提供了抗除草剂抗性的植物，特别是磺酰脲除草剂(例如氯磺隆(chlorsulfuron)和草甘膦。

本发明进一步涉及一种增加双链DNA的定向核苷酸交换效率的方法，该方法包括下列步骤：(a)获得含有能够与所述双链的第一DNA序列杂交的结构域的寡核苷酸，其中所述结构域含有：(i)至少一个相对于第一DNA序列的错配；和(ii)至少一个具有增加的结合亲和力的经修饰的核苷酸；和(b)将所述修饰的核苷酸和所述错配间的距离减小至约8个或更少的核苷酸；(c)回收用于定向核苷酸交换的寡核苷酸。该方法基于寡核苷酸的现有技术中给出的限制的观察，即错配和寡核苷酸之间的距离必须是至少8个核苷酸的要求不是本发明的寡核苷酸的要求。如从附属的实施例中可见的，含有一个或多个经修饰的核苷酸比未经修饰的寡核苷酸在TNE中更有效。

本发明进一步涉及用于定向改变双链DNA的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含能够与所述双链的第一DNA序列杂交的结构域并且所述结构域含有：(a)至少一个相对于第一DNA序列的错配；(b)含有至少一个经修饰的具有增加的结合亲和力的核苷酸的至少一个区段，其中所述经修饰的核苷酸是LNA或丙炔修饰的核苷酸，如本文其它地方所述，其中所述经修饰的核苷酸位于距离所述错配至少8个核苷酸。在某些具体实施方式中，区段含有两个或两个以上经修饰的核苷酸，独立选自如本文其它地方所述的LNA或丙炔修饰的核苷酸。在某些具体实施方式中，LNA位于距离错配至少一个但是不超过8个核苷酸。在某些具体实施方式中，经修饰的核苷酸位于距离所述错配至多8个核苷酸。在某些具体实施方式中，经修饰的核苷酸位于距离所述错配至多6个核苷酸。在某些具体实施方式中，经修饰的核苷酸位于距离所述错配至多4个核苷酸。在某些具体实施方式中，经修饰的核苷酸位于距离所述错配至多2个核苷酸。在某些具体实施方式中，寡核苷酸含有能够与双链的第一DNA序列杂交的结构域，其中所述结构域含有2个LNA。另外，用于双链DNA的定向核苷酸交换的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有(a)经修饰的核苷酸；和(b)相对于所述双链DNA链的错配，其中所述经修饰的核苷酸位于距离所述错配约1个核苷酸远。

附图说明

图1：图解说明定向核苷酸交换。将含有需要交换的核苷酸(X)的受体双链DNA链与LNA和C5-丙炔嘧啶修饰的含有需要插入的核苷酸(Y)的供体寡核苷酸(以NNN^mNNN^mYNN^mNN^m图解给出)接触。将受体/供体结构置于或者与能够进行TNE的环境接触或至少与能够进行TNE的蛋白接触，如与已知的无细胞酶混合物或无细胞提取物(见WO99/58702，WO01/73002)接触。

图2：5-丙炔脱氧尿嘧啶、5-丙炔脱氧胞嘧啶、2′-脱氧-7-丙炔-7-脱氮-腺苷和2’脱氧-7-丙炔-7-脱氮鸟苷和锁定的核酸的化学结构。

图3：自除草剂抗性的番茄愈伤组织扩增的ALS P186/184密码子的序列分析。在这个情况下将单独的PCR产物克隆并测序。

实施例

实施例1：无细胞系统中的TNE

含有C5-丙炔嘧啶的寡核苷酸、LNA核苷酸或其组合购自Trilink Biotech、GeneLink或Ribotask。含有其它修饰的核苷酸的寡核苷酸购自Eurogentec。

使用的寡核苷酸的序列在表1中显示。用于实验的质粒是含有提供卡那霉素和羧苄青霉素的抗性基因的pCR2.1(Invitrogen)的衍生物。质粒KmY22stop具有卡那霉素ORF中密码子Y22上的TAT至TAG突变。在质粒KmY22Δ中，将Y22密码子(TAT)的第三个核苷酸去除以产生框架移动。在两个质粒中，将卡那霉素ORF在相同的位置突变。因此，可以通过分别以KmY22stop或KmY22Δ孵育测试单个核苷酸产生核苷酸取代或插入的效率。

Km WT GAG AGG CTA TTC GGC TAT GAC TGG GCA CAA CAG

E R L F G Y D W A Q Q

KmY22stop GAG AGG CTA TTC GGC TAG GAC TGG GCA CAA CAG

E R L F G ＊

KmY22Δ GAG AGG CTA TTC GGC TA_ GAC TGG GCA CAA CAG

E R L F G ＊

显示了卡那霉素ORF的相对序列和编码的氨基酸。如前所述(Sawano等人2000 Nucleic Acids Res.28：e78)引入单个核苷取代和删除从而产生终止密码子(TAG，*)。显示了用于实验的寡核苷酸的序列。在卡那霉素ORF中寡核苷酸结合区以下划线标示。

无细胞分析

无细胞分析如下进行。从拟南芥(Arabidopsis thaliana)(生态型Col-0)收集花蕾并在液氮下研磨。加入200μl蛋白分离缓冲液(20mM HEPES pH7.5，5mM KCl，1.5mM MgCl₂，10mM DTT，10％(v/v)甘油，1％(w/v)PVP)。通过14k RPM离心30分钟将植物碎片沉淀并且将上清液储存于-80℃。使用NanoOrange试剂盒(Molecular Probes，Inc)测定蛋白浓度。通常分离形成约3-4μg/μl的蛋白浓度。无细胞反应物含有下列成分：1μg质粒DNA(KmY22stop或KmY22Δ)，100ng寡核苷酸，30μg总植物蛋白，4μl剪切的鲑精DNA(3μg/μl)，2μl蛋白酶抑制剂混合物(50x浓度：完全的无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物片，Roche Diagnostics)，50μl 2x无细胞反应缓冲液(400mM Tris pH7.5，200mM MgCl₂，2mM DTT，0.4mM亚精胺，50mM ATP，2mM每种CTP，GTP，UTP，0.1mM每种dNTP和10mM NAD)，以水制成总体积100μl。将混合物于37℃孵育1小时。然后将质粒DNA按照如下分离：向每个反应物中加入100μl H₂O以增加体积，然后加入200μl碱缓冲的酚(pH8-10)。将其短时振荡，然后于13k rpm离心3分钟。将上层水相转移至新管然后加入200μl氯仿。将其短时振荡，于13k rpm离心3分钟并将水相转移至新管中。通过加入0.7倍体积的2-异丙醇沉淀DNA，将沉淀重悬于TE。为了去除任何共纯化的寡核苷酸，将DNA通过Qiagen PCR纯化柱并将质粒DNA洗脱于最终体积30μl。将2μl质粒DNA电穿孔至18μl DH10B(Invitrogen)电感受态细胞。电穿孔后，令细胞在SOC培养基中于37℃恢复1小时。这期间后，加入卡那霉素至100μg/ml的浓度并将细胞继续孵育3小时。通过计数获自涂在含有培养基的羧苄青霉素上的10-4至10^-5电穿孔稀释液的克隆数而计算电穿孔的效率。通过用卡那霉素抗性克隆数除以从羧苄青霉素抗性克隆数计算来的总转化细胞数而计算TNE的效率。

结果

使用KmY22stop的无细胞实验

显示在表1中的引入寡核苷酸的经修饰的核苷酸如下：

甲基磷酸酯(MP)是含有核酸酶抗性甲基磷酸酯连接而不是天然存在的带负电的磷酸二脂键的非离子核酸类似物。它们广泛用于哺乳动物细胞中的反义方法。

已知C-5甲基化嘧啶脱氧核苷酸(5Me-dC)比其对应的嘧啶衍生物形成更稳定的双链。例如，已经显示5-甲基-2’-脱氧胞苷(5-Me-dC)的取代增加Tm 1.3℃/取代。合成5-(1-丙炔)-2’-脱氧尿苷(pdU)和5-(1-丙炔)-2’-脱氧胞苷(pdC)已经证明两个取代均增加双链的稳定性。在嘧啶C5的位置用1-丙炔取代甲基使得更好地堆积碱基，因为与杂环碱基相比丙炔基团是平的。同时，丙炔比甲基更疏水，这一性质进一步提供结合的增加。双链结合增加1.7℃/pdU和1.5℃/pdC残基。

吗啉代寡核苷酸是DNA类似物，其中核糖被吗啉半体替代，使用磷酸酰胺(phosphoroamidate)亚基间连接替代磷酸二酯键。其广泛用于斑马鱼中的基因敲除研究(Genesis，Vol 30，2001)。其还用于改正突变β-球蛋白前体mRNA的异常剪接(Lacerra等人2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，9591-9596)。

首先由Wengel和同事描述(Koshkin等人1998，Tetrahedron 54，3607-3630；Singh等人，1998，Chem.Commun.455-456)的和由Imanishi和同事(Okiba等人1998，Tetrahedron Lett.39，5401-5404)描述的锁定的核酸(β-D-LNA)是构象限定的核苷酸衍生物。其含有减少构象灵活性并给核苷酸的糖半体提供RNA样C3’-内构象的亚甲基2’-O，4’-C连接(Petersen等人2002，J.Am.Chem.Soc.124，5974-5982)。与未经修饰的双链比，这极大地增加了对于DNA靶标的亲和力，每个引入的LNA单体增加寡核苷酸的Tm 4-9℃(Wengel，J.2001，In Crooke，S.T.(ed)，Antisense DrugTechnology：Principles，Strategies and Applications.Marcel Dekker，Inc.，New York，Basle，pp.339-357)。还研究了β-D-LNA的立体异构体α-L-LNA的性质。熟知β-D-LNA用互补的DNA锁至A-形式，但是α-L-LNA和DNA间的双链采用B形式(Nielsen等人2002，Chem.Eur.J.8，3001-3009)，其是双链DNA的天然形式。由于其增加的结合亲和力，这些LNA形式都显示增加寡核苷酸的反义性质(Kurreck等人2002，Nuc.Acids.Res.30，1911-1918；Frieden等人2003，Nuc.AcidsRes.31，6365-6372)。

在两个末端任一个或在序列内带有6-氯-2-甲氧吖啶分子的寡核苷酸具有有效插入双螺旋的能力。因此这样的插入通过提供额外的结合能量而增加杂合体稳定性。吖啶标记的寡核苷酸已经用于那些寡核苷酸杂合体稳定性的增加为重要的应用。向寡核苷酸3’末端加入染料还保护寡核苷酸免受外切核酸酶的降解。

由于形成额外的氢键，结合胸腺嘧啶的2-氨基腺嘌呤的稳定性位于A:T和G:C碱基对稳定性的中间。

2’-O-甲基核苷酸，例如2’-O-甲基肌苷对各种核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶有抗性，也与互补序列形成更稳定的杂合体。

所有的寡核苷酸共享相同的序列并且被设计成通过TNE转换卡那霉素ORFY22上的终止密码子(TAG)为TAC(酪氨酸)。错配核苷酸加下划线。小写字母代表未经修饰的DNA而大写字母代表经修饰的核苷酸(碱基，糖或磷酸盐骨架修饰或其组合)和其在寡核苷酸中的位置。说明了每个寡核苷酸中包括的经修饰的核苷酸。每个寡核苷酸的TNE效率表示为与只有DNA的寡核苷酸(寡核苷酸1)的TNE效率相比TNE增加(或减少)的倍数。每个寡核苷酸至少进行了4次重复，每个系列的实验还包括作为参考的寡核苷酸1的多次重复。为了区分不同种类的位于相同寡核苷酸上的经修饰的核苷酸，以粗体显示一种类型的经修饰的寡核苷酸(例如寡核苷酸9、10、21和22)。pdC，5-(1-丙炔)-2’-脱氧胞苷；pdU，5-(1-丙炔)-2’-脱氧尿苷；LNA，锁定的核酸；MP，甲基磷酸酯连接；5Me-dC，5-甲基-脱氧胞苷。对照实验中，当从反应中省略寡核苷酸或蛋白时，未获得卡那霉素抗性克隆。

将寡核苷酸设计为分别在KmY22stop或KmY22Δ质粒中产生单个核苷酸取代或插入，恢复ORF功能。实验证明单链寡核苷酸中的β-D-LNA核苷酸的数量和位置是相关的。其中β-D-LNA核苷酸被置于错配核苷酸旁边的寡核苷酸(寡核苷酸2)与未经修饰的寡核苷酸相比显示出较小的TNE活性。增加β-D-LNA核苷酸的数量(寡核苷酸3和4)产生生物非活性寡核苷酸。但是，当以3或4个包括错配核苷酸的正常DNA核苷酸(寡核苷酸5和6)分开β-D-LNA时，观察到TNE效率的增加。考虑到α-L-LNA核苷酸采用更多DNA构象，可以预期其还将增加TNE至与β-D-LNA比相同的程度或也许甚至更好。但是显示寡核苷酸7和8在我们的分析中几乎无活性，证明β-D-LNA立体异构体优选用于增加TNE。2’-氨基-LNA与其他LNA形式比显示较优的DNA结合，由于向LNA核苷酸加入可以提供额外的DNA相互作用的额外的基团(Singh等人(1998)J.Org.Chem.63，10035)。但是，再次，虽然寡核苷酸9和10的结合亲和性假设是增加了，测试的2’-氨基-LNA衍生物去除了这些寡核苷酸的TNE活性并且因此是较不优选的。与其提供给反义寡核苷酸的强烈增强相反，寡核苷酸11、12、13和16在TNE中无活性。在每一端含有2个2’-O-甲基肌苷的寡核苷酸14与未经修饰的寡核苷酸的活性一样，但是当2’-O-甲基肌苷核苷酸在错配核苷酸的侧面(寡核苷酸15)时，该寡核苷酸变得无活性。插入剂6-氯-2-甲氧吖啶还使得寡核苷酸无活性(寡核苷酸17和18)。我们的数据显示含有C5-丙炔嘧啶的寡核苷酸显示TNE的增强，其至少部分依赖于寡核苷酸中经修饰的嘧啶的数量。当我们考虑含有C5-甲基胞嘧啶的等同寡核苷酸(寡核苷酸13)是无活性时，这个结果令人惊讶。因此，我们观察到的效果完全依赖于连接至嘧啶C5-位置的基团。最后，将具有优化间距的β-D-LNA核苷酸与C5-丙炔嘧啶组合于单个寡核苷酸上显示出比未经修饰的寡核苷酸增加平均13倍的TNE频率。

使用KmY22Δ的无细胞实验

还测试了优化的寡核苷酸设计在质粒KmY22Δ中插入单个核苷酸和恢复卡那霉素ORF功能性的能力(见表2)。使用未经修饰的DNA寡核苷酸，我们发现其通过TNE引入插入的能力比其产生取代的能力低约5倍。当我们测试含有LNA和/或C5-丙炔嘧啶核苷酸的寡核苷酸5、19和20的引入插入的能力时，与我们的取代的数据相反，这些经修饰的寡核苷酸没有将效率增加至以未经修饰的寡核苷酸(寡核苷酸1)获得的效率以上。但是，当使用寡核苷酸21或22时，获得核苷酸插入效率的协同性增加。这证明LNA和C5-丙炔嘧啶优选存在于相同的寡核苷酸上以增加TNE的效率，其中核苷酸被插入靶标。另外，寡核苷酸20和寡核苷酸21间见到的效率的差别指示可以最大化寡核苷酸中C5-丙炔嘧啶核苷酸的数量以获得优化的核苷酸插入效率。

序列分析无细胞TNE事件

将所有本研究中的寡核苷酸设计为将KmY22stop中的终止密码子(TAG)转换为TAC，恢复卡那霉素ORF的功能性。为了确定含有经修饰的核苷酸的寡核苷酸修复的忠实性，从以寡核苷酸1(未修饰的DNA)或寡核苷酸18(其中所有嘧啶核苷酸由C5-丙炔嘧啶所替代)修复后获得的卡那霉素抗性克隆中纯化质粒。当以寡核苷酸1进行TNE反应时，所有40个测序的质粒显示在Y22上预期的TAC修复事件。但是，当使用寡核苷酸20时，28/38显示在Y22上的TAC而其余10个质粒在该位置含有TAT。因此，虽然C5-丙炔嘧啶增加TNE频率，其还影响修复反应的结果，使其更倾向于错误。

证明使用体外TNE分析、无细胞系统，含有C5-丙炔嘧啶核苷酸的寡核苷酸和错配周围的LNA的特异性间隔确实显示与使用正常DNA寡核苷酸获得的TNE效率比显著高水平的TNE。这种增加可以高至14倍。可以通过靶向嘧啶丰富序列以便使C5-丙炔嘧啶核苷酸的百分比最大化而进一步提高这种增加。还可以通过使用增加结合亲和力至比C5-丙炔嘧啶核苷酸甚至更大程度的7-丙炔嘌呤核苷酸而进一步增加效率(He & Seela，2002 Nucleic Acids Res.30：5485-5496)。将丙炔嘌呤和嘧啶组合允许产生其中所有核苷酸载有碱基上的丙炔基团的寡核苷酸。

实施例2：烟草中的TNE

烟草嫩芽培养

这个实施例的材料来源是烟草体外嫩芽培养物，其无菌生长于25/20℃(白天/夜晚)温度和光子流密度为80μE.m^-2.s^-1(光周期为16/24h)的玻璃杯(750ml)中的MS20培养基中。MS20培养基是基础Murashige和Skoog氏培养基(Murashige，T.和Skoog，F.，Physiologia Plantarum，15：473-497，1962)，其含有2％(w/v)蔗糖，没有加入荷尔蒙和0.8％Difco琼脂。将嫩芽每3周亚培养至新鲜的培养基。

原生质体分离

为了分离叶肉原生质体，收集3-6周龄的嫩芽培养物的完全展开的叶子。将叶子切成1mm的薄条，然后将其转移至大(100mmx100mm)的含有45ml MDE基本培养基的培养皿以进行前质壁分离处理30分钟的。MDE基本培养基含有0.25g KCl、1.0g MgSO₄.7H₂O、0.136g KH₂PO₄、2.5g聚乙烯吡咯酮(MW 10,000)、6mg萘乙酸和2mg 6-苄氨基嘌呤，总体积为900ml。将溶液的重量克分子渗透压浓度用山梨醇调整至600mOsm.kg^-1，将pH调整至5.7。

前质壁分离后，向每个培养皿加入5ml的酶储存液。每100ml酶储存液含有750mg纤维素酶Onozuka R10、500mg崩溃酶和250mg浸解酶R10，以Whatman纸过滤并过滤消毒。将培养皿密封并在黑暗中25℃静止孵育过夜以消化细胞壁。

次日早晨，将原生质体悬浮液通过500μm和100μm筛进入250ml的Erlenmeyer瓶中，与等体积的KCl洗涤培养基混合，并于50ml管中于85xg离心10分钟。KCl洗涤100培养基由2.0g的CaCl₂.2H₂O/L和足够量的KCl组成以使重量克分子渗透压浓度至540mOsm.kg^-1。

将离心步骤重复两次，首先以重悬于MLm洗涤培养基(其是一半的正常浓度的MS培养基的宏量营养素(Murashige，T.and Skoog，F.，Physiologia Plantarum，15：473-497，1962)，2.2g的CaCl₂.2H₂O/L和一定量的甘露醇以使重量克分子渗透压浓度至540mOsm.kg^-1)中的原生质体进行，最后以重悬于MLs培养基(其是甘露醇被蔗糖替代的MLm培养基)中的原生质体进行。

将原生质体从蔗糖培养基中的漂浮带回收并重悬于等体积的KCl洗涤培养基。用血细胞计数器计数其密度。随后，将原生质体在10ml玻璃管中于85xg再次离心5分钟，将沉淀以1x10⁵原生质体/ml的密度重悬于电穿孔培养基中。使所有的溶液保持无菌，所有操作在无菌条件下进行。

ALS靶标基因和寡核苷酸的设计

在烟草乙酰乳酸合成酶(ALS)SurA基因(Gene Bank登录号X07644)中，氨基酸转换P194Q和W571L使得ALS蛋白对磺酰脲除草剂氯磺隆不敏感。将两个寡核苷酸设计为引入在编码这些氨基酸的SurA密码子中的碱基对突变。SEQ IDNO 23将产生P194Q突变，SEQ ID NO 24产生W571L突变。两个寡核苷酸中所有的C和T残基都被丙炔化(这样的寡核苷酸中，脱氧胸苷被5-(1-丙炔)-2’-脱氧尿苷替代)，除了寡核苷酸SEQ ID NO 231中的脱氧胸苷错配核苷酸，其对应于所要的点突变的位置。丙炔化胞嘧啶或尿嘧啶核苷酸在SEQ ID NO 23和SEQ ID NO24中标示为Cp或Up。另外，在距离错配核苷酸任一侧两个核苷酸远的位置上引入了LNA残基(在SEQ ID NO 23和SEQ ID NO 24中标示为A^、T^、C^或G^)。对照单链寡核苷酸只由具有相同核苷酸序列的正常DNA残基(无C5-丙炔嘧啶也无LNA残基)组成。

5’UpCpAGUpACpCpUpAUpCpAUpCpCpUpACpG^UpTGC^ACpUpUpGACpCpUpGUpUpAUpAG3’[SEQ ID NO：23]

5’CpCpUpUpAUpAGAACpCpGAUpCpCpUpC^CpAAT^UpGAACpCpACpCpAUpUpCpCpCpAA3’[SEQID NO：24]

CodA靶标基因和寡核苷酸的设计

对于用于碱基对转换的TNE，ALS基因是有用的选择性标记基因，因为在特异位置上的单个碱基变化导致单个氨基酸转换，这转而提供对磺酰脲除草剂的抗性。对于用于产生单个碱基插入或删除(indel)的TNE，ALS不是有用的选择性标记基因，因为单个碱基indel将导致基因的开放阅读框的框架移动，因此产生无功能性蛋白。因此对于磺酰脲除草剂的筛选是不可能的。

CodA是细菌的编码胞嘧啶脱氨基酶的基因，可以用作负筛选标记(Stougaard，Plant Journal 3：755-761，1993)。表达该基因并暴露于5-氟胞嘧啶(5-FC)的植物将死于由5-氟尿嘧啶(5-FU)的胸苷酸合成酶的不可逆抑制途径，所述5-氟尿嘧啶是通过被CodA的基因产物催化的5-FC的脱氨形成的。通过寡核苷酸的作用引入CodA序列的框架移动突变将使基因无功能，并且这样的植物细胞对5-FC有抗性。

在本实施例中，利用CodA负筛选系统来选择由于寡核苷酸的作用进行indel突变的烟草细胞。为此，通过如Stougaard(Plant Jlant Journal 3：755-761，1993)中所述的土壤杆菌-介导的转化已经产生从CaMV 35S启动子表达细菌CodA基因的烟草SR1植物。已经测试转化植物对5-FC的正确反应，并以如上所述的体外嫩芽培养物保持所述植物。本实施例中，使用了CodA基因的优化用于植物密码子的特异版本以便增加其在植物细胞中的翻译效率。密码子优化的CodA基因的序列是：

ATGTCTAACAACGCTCTTCAGACTATCATCAACGCTAGACTTCCTGGAGAAGAGGGAC

TTTGGCAGATTCATCTTCAGGATGGAAAGATCTCTGCTATCGATGCTCAGTCTGGAGTGATGC

CTATCACTGAGAACTCTCTTGATGCTGAGCAGGGACTTGTTATTCCTCCTTTCGTGGAGCCTC

ACATCCATCTTGATACAACTCAGACTGCTGGACAACCTAATTGGAACCAGTCTGGAACTCTTT

TCGAGGGAATCGAAAGATGGGCTGAGAGAAAGGCTCTTCTTACTCACGATGATGTGAAGCAAA

GGGCTTGGCAAACTCTTAAGTGGCAGATCGCTAACGGAATTCAGCATGTGAGGACTCATGTGG

ATGTGTCTGATGCTACTCTTACTGCTCTTAAGGCTATGCTGGAAGTGAAGCAGGAAGTCGCGC

CGTGGATTGATCTTCAGATCGTGGCTTTCCCTCAAGAGGGAATCCTTTCTTACCCTAACGGAG

AGGCTCTTCTTGAAGAGGCTCTTAGGCTTGGAGCTGATGTTGTTGGAGCTATCCCTCACTTCG

AGTTCACTAGGGAATACGGAGTTGAGTCTCTTCACAAGACTTTCGCTCTTGCTCAGAAGTACG

ATAGGCTTATCGATGTTCACTGCGATGAGATCGATGATGAGCAGTCAAGATTCGTTGAGACTG

TGGCTGCTCTTGCTCATCATGAAGGAATGGGAGCTAGAGTTACTGCTTCTCACACTACTGCTA

TGCACTCTTACAACGGAGCTTACACTTCTAGGCTTTTCGGCTTCTTAAGATGTCTGGTATCAA

CTTCGTGGCTAACCCTCTTGTGAACATCCATCTTCAGGGAAGATTCGATACTTACCCTAAGAG

GAGGGGAATTACTAGGGTGAAGGAGATGCTTGAGTCAGGTATCAATGTGTGCTTCGGACACGA

TGATGTTTTCGATCCTTGGTATCCTCTTGGAACTGCTAACATGCTTCAGGTGTTGCATATGGG

ACTTCATGTGTGCCAACTTATGGGATACGGACAGATCAACGATGGACTTAACCTTATCACTCA

CCACTCTGCTAGGACTCTTAACCTTCAGGATTACGGAATTGCTGCTGGAAACTCTGCTAACCT

TATCATCCTTCCTGCTGAGAATGGATTCGATGCTCTTAGGAGGCAAGTTCCTGTTAGGTACTC

TGTTAGGGGAGGAAAGGTGATCGCTTCTACTCAACCTGCTCAGACTACTGTTTACCTTGAGCA

GCCTGA[SEQ ID NO：25]。

设计寡核苷酸用于在CodA基因5′末端的位置上引入单个碱基对插入。丙炔化胞嘧啶或尿嘧啶核苷酸标示为Cp或Up。自对应于要插入(插入核苷酸，下划线的)的核苷酸任一端两个核苷酸远的位置上，引入LNA残基(标示为A^，T^，C^或G^)。对照单链寡核苷酸只由具有相同核苷酸序列的正常DNA残基(无C5-丙炔嘧啶也无LNA残基)组成。

5′GAAGUpCpUpAGCpGUpUpGAUpGA^UpGAG^UpCpUpGAAGAGCpGUpUpGUpUpAGA3′[SEQ ID NO：26]。

原生质体电穿孔

使用PHBS作为电穿孔培养基(10mM Hepes，pH 7.2；0.2M甘露醇，150mMNaCl；5mM CaCl₂)，原生质体在电穿孔化合物中的密度为约1x10⁶/ml，电穿孔设置为250V(625V cm^-1)电荷和800μF电容，脉冲和培养间恢复时间为10分钟。对于每个电穿孔使用约每800微升1-2μF寡核苷酸。电穿孔＝25μg/ml。

原生质体再生和选择

电穿孔处理后，将原生质体置于冰上恢复30分钟，然后重悬于T₀培养基，密度为1x10⁵原生质体/ml。T₀培养基含有(每升，pH5.7)950mg KNO₃、825mgNH₄NO₃、220mg CaCl₂.2H₂O、185mg MgSO₄.7H₂O、85mg KH₂PO₄、27.85mgFeSO₄.7H₂O、37.25mg Na₂EDTA.2H₂O、根据Heller氏培养基的微量营养素(Heller，R.，Ann Sci Nat Bot Biol Veg 14：1-223，1953)，根据Morel和Wetmore氏培养基的维生素(Morel，G.and R.H.Wetmore，Amer.J.Bot.38：138-40，1951)、2％(w/v)蔗糖、3mg萘乙酸、1mg 6-苄氨基嘌呤和一定量的使重量克分子渗透压浓度至540mOsm.kg^-1的甘露醇。

然后将重悬于T_o培养基的原生质体与等体积的T₀培养基中的1.6％SeaPlaque低熔点琼脂糖溶液混合，灭菌后于30℃水浴中保持液态。混合后，将悬浮液以2.5ml等份轻柔移至5cm培养皿中。将皿密封并在黑暗中于25/20℃(16/24h光周期)孵育。

在黑暗中孵育8-10天后，将琼脂糖培养基切成饼状的6等份，将其转移至含有22.5ml液体MAP₁AO培养基的10cm培养皿中。该培养基由下列成分组成(每升，pH5.7)：950mg KNO₃、825mg NH₄NO₃、220mg CaCl₂.2H₂O、185mgMgSO₄.7H₂O、85mg KH₂PO₄、27.85mg FeSO₄.7H₂O、37.25mg Na₂EDTA.2H₂O、根据Murashige和Skoog氏培养基的十分之一原浓度的微量营养素(Murashige，T.和Skoog，F.，Physiologia Plantarum，15：473-497，1962)，根据Morel和Wetmore氏培养基的维生素(Morel，G.and R.H.Wetmore，Amer.J.Bot.38：138-40，1951)、6mg丙酮酸盐、12mg苹果酸、12mg反丁烯二酸和12mg柠檬酸、3％(w/v)蔗糖、6％(w/v)甘露醇、0.03mg萘乙酸和0.1mg 6-苄氨基嘌呤。为了选择有成功TNE事件的克隆，还向培养基中加入41nM氯磺隆或250μg/ml 5-FC。将培养皿于25/20℃光周期为16/24h的弱光中(光子流密度为20μE.m^-2.s^-1)孵育。两周后，将培养皿转移至全光中(80μE.m^-2.s^-1)。在这个选择期间内，大多数原生质体死亡。只有其中通过寡核苷酸的作用，靶基因中发生碱基变化以致产生对除草剂或5-FC的抗性的原生质体，分裂并繁殖成原生质体衍生的微克隆。

分离后六至八周，将原生质体衍生的克隆转移至MAP₁培养基。此时琼脂糖珠子分开至足以用广口无菌移液管转移微克隆，或者将它们单独用镊子转移。MAP₁培养基具有与MAP₁AO培养基相同的组成，但是以3％(w/v)甘露醇代替6％的甘露醇，并具有46.2mg.l^-1组氨酸(pH 5.7)。其用0.8％(w/v)Difco琼脂固化。

在该固体培养基上生长2-3周后，将克隆转移至再生培养基RP，每10cm培养皿有50个克隆。RP培养基由下列成分组成(每升，pH5.7)：273mg KNO₃、416mg Ca(NO₃)₂.4H₂O、392mg Mg(NO₃)₂.6H₂O、57mg MgSO₄.7H₂O、233mg(NH₄)₂SO₄、271mg KH₂PO₄、27.85mg FeSO₄.7H₂O、37.25mg Na₂EDTA.2H₂O、根据Murashige和Skoog氏培养基的五分之一发表浓度的微量营养素(Murashige，T.and Skoog，F.，Physiologia Plantarum，15：473-497，1962)、根据Morel和Wetmore氏培养基的维生素(Morel，G.和R.H.Wetmore，Amer.J.Bot.38：138-40，1951)、0.05％(w/v)蔗糖、1.8％(w/v)甘露醇、0.25mg玉米素和41nM氯磺隆或250μg.ml^-15-FC，并用0.8％(w/v)Difco琼脂固化。

靶基因的PCR扩增

使用DNeasy试剂盒(Qiagen)从氯磺隆或5-FC抗性烟草微克隆分离DNA，并用作PCR反应的模板。使用下列引物检测烟草ALS基因中定向密码子的转换：5’GGTCAAGTGCCACGTAGGAT[SEQ ID NO：27]和5’GGGTGCTTCACTTTCTGCTC[SEQ ID NO：28]，其扩增该基因的776bp片段，包括密码子194。引物5’CCCGTGGCAAGTACTTTGAT[SEQ ID NO：29]和5’GGATTCCCCAGGTATGTGTG[SEQ ID NO：30]同样用于扩增烟草ALS基因的794bp的片段，包括密码子571。为了PCR扩增5-FC抗性烟草愈伤组织中的经修饰的CodA基因，设计下列引物组：5′GTGGAAAAAGAAGACGTTCCAAC3′[SEQID NO：31]和5′AGCATCGATAGCAGAGATCTTTC3′[SEQ ID NO：32]。

测序以证明核苷酸转换

通过测序获自这样愈伤组织中的DNA的PCR产物以证实除草剂抗性烟草愈伤组织中的核苷酸转换。烟草ALS P194密码子(CCA至CAA)的转换导致密码子第二位置上的双峰(C/A)。最后，烟草ALS W571密码子(TGG至TTG)的转换导致第二密码子位置上的双峰(G/T)。

实施例3：小鼠胚胎干细胞中的TNE

为了具有选择性系统以证明小鼠细胞中的TNE，使用了表达提供培养物中G418抗性的选择性标记基因(neo)的小鼠胚胎干(ES)细胞系，但是通过故意的突变使其无功能。该TNE实验的目的是修复该突变并恢复neo基因的功能性，形成G418中这样的细胞的选择。

小鼠ES细胞系通过引入由MC1启动子驱动的缺陷性neo基因而衍生自E14系(Te Riele等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5128-5132，1992)。该缺陷性neo基因含有neo的ATG起始密码子的紧接下游的两个额外的核苷酸GT，引起框架移动(Dekker等人，Nucl.Acids Res.31，No.6e27，2003)。该细胞生长于BRL条件化培养基中。

为了TNE实验，将细胞以7×10⁵/孔的密度分配于6孔培养板24小时。然后向每孔加入1.4ml无血清培养基、10μg寡核苷酸和63μl TransFast^TM lipofection试剂(Promega)。1小时后，加入4ml含有血清的培养基，将细胞孵育过夜。无选择孵育24小时后，令细胞生长于含有100mg.l^-1G418的选择性培养基中。10天后，计数G418抗性克隆。

用于修复框架移动突变的寡核苷酸由对应于ATG起始密码子周围的neo基因区域的编码链的序列的36聚体组成，但是不具有被引入neo中为了产生框架移动突变的GT核苷酸。另外，所有的胞嘧啶或胸腺嘧啶核苷酸被丙炔化，下面通过Cp或Tp标示。自距离框架移动插入任一端两个核苷酸远的位置，引入LNA残基(标示为A^，T^，C^或G^)。对照单链寡核苷酸只由正常DNA残基(无C5丙炔嘧啶也无LNA残基)组成，并含有GT框架移动突变。寡核苷酸序列如下：

5′TpCpTpAGAGCpCpGCpCpACpCpAT^GAT^CpACpCpGATpGCpATpCpGAG3′[SEQ ID NO：33]。

从G418抗性克隆中抽提DNA，并进行PCR以便扩增neo起始密码子周围的区域。随后测序该PCR片段以便证实正确修复框架移动突变。

实施例4

使用C5-丙炔和LNA修饰的寡核苷酸在番茄(Solanum lycopersicum)中的定向核苷酸交换

乙酰乳酸合成酶(ALS，也称为乙酰羟酸合成酶；AHAS)是第一个在生物合成途径中合成支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的共同的酶。该途径存在于植物和微生物，如细菌、真菌和藻类中。ALS是至少4种结构上不同类的除草剂，包括磺脲(SU)、咪唑啉酮(IMI)、三唑并嘧啶磺酰胺(triazolopyrimidinesulfonamides)(TP)和嘧啶水杨酸(PS)的首要作用靶点。在番茄中，ALS是多拷贝基因，因为两个全长EST存在于植物转录数据库(http://planta.tigr.org)中。在我们的研究中，我们将转录物TA3727_44081定义为ALS1，将转录物TA37275_4081定义为ALS2。ALS1编码659AA的蛋白而ALS2编码657AA的蛋白。ALS1和ALS2分别在DNA和蛋白水平上显示93％和96％的同一性。两个蛋白主要的差别在于负责叶绿体定向的蛋白的信号肽区。虽然有这些差别，ALS1和ALS2蛋白都被预测为靶向叶绿体。以前的研究已经显示保守残基上的几个氨基酸变化足以给予植物对除草剂的抗性，如水稻ALS中的P171Q、W548L和S627I突变。生物间的ALS的保守是高度的并且许多生物中相同的突变造成相似的除草剂抗性表型。在本研究中，我们向设计用于改变ALS2中的P184密码子(或ALS1中的P184)的番茄叶子原生质体中引入正常DNA寡核苷酸或C5-丙炔和LNA修饰的寡核苷酸以便产生对磺酰脲类除草剂氯磺隆的抗性。由于经修饰的和未经修饰的寡核苷酸的序列相同，因此当使用无细胞系统时我们观察到的任何TNE效率的差别一定是由于C5-丙炔和LNA修饰造成的。

材料和方法

寡核苷酸

含有P184/186密码子(大写字母)的ALS1和ALS2区的序列显示如下。ALS1和ALS2之间的单核苷酸多态性以粗体显示。

ALS1 gattgttgctattac

ggtcaagtgCC

aggaggatgattggtactgatgcgt P186[SEQ ID NO34]

ALS2 gattgttgctattac

ggtcaagtgCC

aggaggatgattggtactgatgcgt P184[SEQ IDNO 35]

设计表3中的寡核苷酸44和95用于产生ALS2中的P184Q改变。两个都是“反义”寡核苷酸，与ALS基因的非转录链互补。寡核苷酸80由C5-丙炔和LNA修饰的核苷酸的GATC重复组成并作为对照。该设计包括末端4个核苷酸间的磷硫酰连接因为这样的修饰已知部分保护寡核苷酸免受核酸酶的降解。

表3

SEQ ID NO	寡核苷酸	序列	突变
SEQ ID NO	寡核苷酸	序列	突变	SEQ ID NO 36	95	ATCATCCTCCTCTGCACTTGACCG	P184Q
SEQ ID NO 37	44	AzyAzyyzyyvyTGwAyzzGAyyG	P184Q	SEQ ID NO 36	95	ATCATCCTCCTCTGCACTTGACCG	P184Q
SEQ ID NO 37	44	AzyAzyyzyyvyTGwAyzzGAyyG	P184Q	SEQ ID NO 38	80	GzAyGzAyAxzCAxzAyGzAGGAU	无

y＝5-丙炔-2′-脱氧胞苷；z＝5-丙炔-2′-脱氧尿嘧啶；s＝LNA A；v＝LNA T；w＝LNAC；x＝LNA G；U＝脱氧尿嘧啶；*＝磷硫酰连接。所有的寡核苷酸通过Eurogentec合成和HPLC纯化。与靶标形成错配的核苷酸加下划线。

番茄叶子原生质体的分离和转化

以前已经描述了番茄叶子原生质体的分离和再生(Shahin，1985Theor.Appl.Genet.69：235-240；Tan等人1987 Theor.Appl.Genet.75：105-108；Tan等人1987 Plant Cell Rep.6：172-175)，可以在这些发表物中找到所需溶液。简单地说，将番茄(Solanum Lycopersicum)的种子以0.1％的次氯酸盐灭菌，体外在16/8小时光周期于2000lux于25℃和50-70％相对湿度生长于无菌MS20培养基中。将1g新鲜收集的叶子置于含有5ml CPW9M的皿中，使用解剖刀片每毫米垂直于主干切割。将其转移至25ml酶溶液(CPW9M，其含有2％纤维素onozuka RS、0.4％浸解酶onozuka R10、2.4-D(2mg/ml)，NAA(2mg/ml)、BAP(2mg/ml)，pH5.8)的新鲜板中并在黑暗中于25℃进行消化过夜。然后通过将其置于轨道振荡器上(40-50rpm)1小时而释放原生质体。通过将其通过50μm的筛子而将原生质体从细胞碎片中分离，并以CPW9M洗涤筛子2次。以85g离心原生质体，弃去上清液，然后吸收于一半体积的CPW9M。最后将原生质体吸收于3ml CPW9M，然后小心加入3ml CPW18S以避免两种溶液混合。将原生质体以85g离心10分钟，并使用长巴斯德移液管收集漂浮于相间层的活原生质体。通过加入CPW9M增加原生质体的体积至10ml并在血细胞计数器中测定回收的原生质体的数目。

使用Gene Pulser(BioRad)用电穿孔将寡核苷酸引入番茄原生质体。将原生质体以1x10⁶/ml的密度重悬于0.4cm电穿孔杯中的作为电穿孔培养基(10mM HEPES，pH 7.2；0.2M甘露醇，150mM NaCl，5mM CaCl₂)的PHBS中。将5μg寡核苷酸加入到1ml原生质体悬浮液中，电穿孔在250V(625C cm^-1)和800μF电容下进行。然后小心地从杯中移出原生质体并转移至新管，加入8ml 9M培养基。然后将其于85g离心5分钟，去除上清液，加入2ml新鲜的9M培养基。

将原生质体植入藻酸盐溶液以再生。加入2ml藻酸盐溶液(甘露醇90g/l，CaCl₂.2H₂O 140mg/l，藻酸钠20g/l(Sigma A0602))并通过倒置重复混合。将其1ml平均地铺在Ca-琼脂板(72.5g/l甘露醇，7.35g/l CaCl₂.2H₂O，8g/l琼脂)上并令其聚合。然后将藻酸盐盘转移至含有4ml K8p培养基的4cm培养皿中并在黑暗中于30℃孵育7天。然后将盘切成5mm宽的条并铺在含有20nM氯磺隆的TM-DB愈伤组织诱导培养基上。30℃孵育4-5周后，除草剂抗性愈伤组织出现，然后将个体转移至GM-ZG培养基进一步生长。在该培养基上2-3周后，将部分愈伤组织用于DNA分离。

分析番茄愈伤组织

使用植物DNAeasy试剂盒(Qiagen，#69104)从5周龄的愈伤组织中分离基因组DNA。将引物设计为特异性扩增ALS1或ALS2。对于ALS1我们使用引物08Z769(5’GAAAGGGAAGGTGTTACGGATGTA SEQ ID NO 39)和08Z770(5’CTTGATTGCGAACACCCACC SEQ ID NO 40)；对于ALS2使用引物08Z773(5’GAAAGGGAAGGGGTTAAGGATGTG SEQ ID NO 41)和08Z774(5’CTCGACTGTGAACACCCACC SEQ ID NO 42)。使用校正性酶rTth DNA聚合酶XL (Roche)进行PCR扩增，并直接测序获得的PCR片段。为了证实核苷酸改变，使用Taq DNA聚合酶向用校正性酶产生的平端PCR片段加A-尾(100ng产物(5μl)+1μl PCR缓冲液+1μl dNTP’s(20mM)+1U Taq DNA聚合酶+2.8μl H₂O；72℃10分钟)。然后使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR片段，并将10ng克隆至TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)。转化至大肠杆菌(E.coli)后，使用rTth DNA聚合酶XL(Roche)使用退火至载体中的位点和插入点旁侧的M13引物在白色、卡那霉素抗性克隆上进行PCR反应。然后使用M13引物直接测序这些PCR产物。

结果

进行两个独立的实验以测试使用含有C5-丙炔和LNA修饰的寡核苷酸是否增加了番茄中TNE的效率。结果在表4中显示。

表4

寡核苷酸	原生质体转化¹	氯磺隆抗性愈伤组织数目	每10⁶原生质体的愈伤组织数目
寡核苷酸	原生质体转化¹	氯磺隆抗性愈伤组织数目	每10⁶原生质体的愈伤组织数目	95	9x10⁶	1	0.11
44	4.5x10⁶	4	0.88	95	9x10⁶	1	0.11
44	4.5x10⁶	4	0.88	80	2.5x10⁶	0	0
无	9x10⁶	0	0	80	2.5x10⁶	0	0

含有C5-丙基和LNA修饰的核苷酸的寡核苷酸44给出比由未经修饰的DNA组成的寡核苷酸95多约8倍的愈伤组织。这些寡核苷酸的序列是相同的。寡核苷酸80是也含有经修饰的核苷酸的“乱序的”寡核苷酸。该寡核苷酸对于ALS1或ALS2都不特异并作为对照以证明寡核苷酸单独存在于植物细胞中不足以产生除草剂抗性愈伤组织。另外，当将寡核苷酸从原生质体转化混合物中去除时，未观察到除草剂抗性愈伤组织，表明番茄原生质体中的自发除草剂抗性低于可检测水平。

为了证明氯磺隆抗性愈伤组织在期望的位点确实含有突变，将3个愈伤组织(1个来自寡核苷酸95(D)，2个来自寡核苷酸44(E和F))测序。对来自ALS1或ALS2的PCR产物的序列分析显示在所有3个愈伤组织中混合峰存在于靶标密码子。这证明除草剂抗性表型确实是由于由寡核苷酸产生的核苷酸改变并且愈伤组织对于核苷酸改变是半合的。然后我们进行了克隆并对源自ALS1或ALS2的单个PCR产物测序。序列分析的结果在图5中显示。愈伤组织D和E分别显示ALS2和ALS1上的CCA至TCA改变(P186S)，而愈伤组织G显示ALS1上的CCA至TTA的改变(P186L)。烟草中的研究已经显示在烟草ALS直系同源物(SurA或SurB)中保守脯氨酸残基上的任何氨基酸改变给予氯磺隆抗性(Kochevenko等人2003PlantPhys.132：174-184)。因此ALS1或ALS2的P186/184密码子用于检测未预期的核苷酸改变是理想的，因为这样的事件也将引起除草剂抗性表型。

我们的结果证明通常C5-丙炔和LNA修饰不抑制基因组中，特别是番茄的基因组中的核苷酸改变的产生。另外，这种类型的修饰通常显著增加植物细胞中定向核苷酸交换的效率，在番茄的情况下约增加8倍。这种类型的组合修饰(如本文所述的LNA和丙炔)提供在体外的相对于以前描述的那些只使用LNA修饰的寡核苷酸或只使用丙炔修饰的核苷酸的无细胞分析(即体外)的显著增加。这里特别值得注意的是从无细胞分析至体外分析的步骤。

令人惊讶的是我们没有发现预期的核苷酸改变(ALS2上的CCG至CAG，P184Q)。相反在愈伤组织D和E中，我们观察到对靶标核苷酸密码子的核苷酸5’上的改变(C至T)。另外，我们来自愈伤组织G的数据显示与靶序列共享单个错配的寡核苷酸能够诱导2个核苷酸的改变。将完全PCR产物(500bp)的序列与ALS1或ALS2的相比，除了靶标脯氨酸密码子上的改变，未观察到其它核苷酸的变化。因此，寡核苷酸能够诱导植物基因的特异密码子上的突变。使用无细胞系统和DNA寡核苷酸产生的TNE事件的分析确实给出预期的核苷酸改变。在我们对愈伤组织D的分析中，使用未经修饰的DNA寡核苷酸，我们观察到未预期的核苷酸改变。这显示细胞中可能有其它因素，其影响在无细胞系统中不起作用的修复过程，使得从无细胞分析至体外分析的步骤不简单。但是，我们显示含有C5-丙炔修饰的寡核苷酸确实产生无细胞系统中未预期的核苷酸变化，揭示经修饰的核苷酸本身引起更“倾向于错误的”修复。因此值得注意的是使用经修饰的寡核苷酸产生了显示CCA至TTA改变的愈伤组织G。

几个研究提示用寡核苷酸处理后在人类细胞中产生的核苷酸变化是由于在靶位点整合了寡核苷酸(Radecke等人2006 J.Gene Med.8：217-218)。但是寡核苷酸整合不能解释我们在番茄中获得的结果。首先寡核苷酸整合将引起预期的核苷酸改变(P184Q)，这我们未观察到。第二，我们使用靶向ALS2的寡核苷酸还发现ALS1中的核苷酸改变。在ALS1上整合该寡核苷酸还将改变存在于P 186/184密码子的第三个核苷酸的单核苷酸多态性。因为未观察到此，我们得出结论，寡核苷酸整合不能解释我们的结果。这可以反映动物和植物细胞间的TNE机制的差别。我们倾向于下列机制：寡核苷酸结合其基因组靶标并诱导靶密码子上的突变过程，随之寡核苷酸随后被降解。

序列表

<110>凯津公司

<120>具有改进的经修饰的寡核苷酸的定向核苷酸交换

<130>P28851PC01/RLA

<150>PCT/NL2007/000159

<151>2006-06-22

<160>42

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于TNE的未经修饰的序列

<400>1

tgtgcccagt cgtagccgaa tagc 24

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(11)

<223>？-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)..(13)

<223>beta-D-LNA

<400>2

tgtgcccagt cgtagccgaa tagc 24

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(7)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(11)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)..(13)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(15)..(15)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_fature

<222>(17)..(17)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(19)..(19)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(23)

<223>beta-D-LNA

<400>3

tgtgcccagt cgtagccgaa tagc 24

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(14)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(16)..(16)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(18)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(20)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(22)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(24)

<223>beta-D-LNA

<400>4

tgtgccccgt cgtagccgaa tagc 24

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(14)

<223>beta-D-LNA

<400>5

tgtgcccagt cgtagccgaa tagc 24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(15)..(15)

<223>beta-D-LNA

<400>6

tgtgcccagt cgtagccgaa tagc 24

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(11)

<223>alpha-L-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)..(13)

<223>alpha-L-LNA

<400>7

tgtgcccagt cgtagccgaa tagc 24

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(11)

<223>alpha-L-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)..(13)

<223>alpha-L-LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(16)..(17)

<223>alpha-L-LNA

<400>8

tgtgcccagt cgtagccgaa tagc 24

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>misc_feature .

<222>(10)..(10)

<223>beta-D-甘氨酰氨基LNA，

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(14)

<223>beta-D-LNA，

<400>9

tgtgcccagt cgtagccgaa tagc 24

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>beta-D-金刚-氨基LNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(14)

<223>beta-D-LNA

<400>10

tgtgcccagt cgtagccgaa tagc 24

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(4)

<223>甲基磷酸酯连接

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(23)

<223>甲基磷酸酯连接

<400>11

tgtgcccagt cgtagccgaa tagc 24

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(24)

<223>吗啉修饰的核苷酸

<400>12

tgtgcccagt cgtagccgaa tagc 24

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(5)..(7)

<223>m5c

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(11)..(11)

<223>m5c

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(17)..(18)

<223>m5c

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(24)..(24)

<223>m5c

<400>13

tgtgcccagt cgtagccgaa tagc 24

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(1)..(2)

<223>2′O-Me肌苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(23)..(24)

<223>2′O-Me肌苷

<400>14

tgtgcccagt cgtagccgaa tagc 24

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(1)..(2)

<223>2′-O-Me肌苷，

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(11)..(13)

<223>2′-O-Me肌苷，

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(23)..(24)

<223>2′-O-Me肌苷，

<400>15

tgtgcccagt cgtagccgaa tagc 24

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(8)..(8)

<223>2-氨基腺嘌呤

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(14)..(14)

<223>2-氨基腺嘌呤

<400>16

tgtgcccagt cgtagccgaa tagc 24

<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(10)..(10)

<223>6-氯-2-甲氧吖啶取代

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(14)..(14) .

<223>6-氯-2-甲氧吖啶取代

<400>17

tgtgcccagt cgtagccgaa tagc 24

<210>18

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(1)..(1)

<223>6-氯-2-甲氧吖啶取代

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(24)..(24)

<223>6-氯-2-甲氧吖啶取代

<400>18

tgtgcccagt cgtagccgaa tagc 24

<210>19

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(11)..(11)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(13)..(13)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<400>19

tgtgcccagt cguagccgaa tagc 24

<210>20

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(1)..(1)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(3)..(3)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(5)..(7)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(10)..(10)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(11)..(11)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(16)..(17)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(21)..(21)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(24)..(24)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<400>20

ugugcccagu cguagccgaa uagc 24

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(10)..(10)

<223>beta D LNA

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(11)..(11)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(13)..(13)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(14)..(14)

<223>beta D LNA

<400>21

tgtgcccagt cguagccgaa tagc 24

<210>22

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(1)..(1)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(3)..(3)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(5)..(7)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(10)..(10)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(10)..(10)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(11)..(11)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(14)..(14)

<223>beta-D-LNA

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(16)..(17)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(21)..(21)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(24)..(24)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<400>22

ugugcccagt cguagccgaa uagc 24

<210>23

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(1)..(1)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(2)..(2)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(5)..(5)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(7)..(8)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(9)..(9)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(11)..(11)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(12)..(12)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(14)..(14)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(15)..(16)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(17)..(17)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(19)..(19)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>锁定的核酸

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(21)..(21)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(24)..(24)

<223>锁定的核酸

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(26)..(26)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(31)..(31)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(32)..(32)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(33)..(33)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(35)..(36)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(38)..(38)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<400>23

ucaguaccua ucauccuacg utgcacuuga ccuguuauag 40

<210>24

<211>40

<212>DNA

<213>本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(1)..(2)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(3)..(4)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(6)..(6)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(11)..(12)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(15)..(15)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(16)..(17)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(18)..(18)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(19)..(19)

<223>锁定的核酸

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(23)..(23)

<223>锁定的核酸

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(24)..(24)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(28)..(29)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(31)..(32)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(34)..(35)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(36)..(38)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<400>24

ccuuauagaa ccgauccucc aatugaacca ccauucccaa 40

<210>25

<211>1261

<212>DNA

<213>本塞姆氏烟草

<400>25

atgtctaaca acgctcttca gactatcatc aacgctagac ttcctggaga agagggactt 60

tggcagattc atcttcagga tggaaagatc tctgctatcg atgctcagtc tggagtgatg 120

cctatcactg agaactctct tgatgctgag cagggacttg ttattcctcc tttcgtggag 180

cctcacatcc atcttgatac aactcagact gctggacaac ctaattggaa ccagtctgga 240

actcttttcg agggaatcga aagatgggct gagagaaagg ctcttcttac tcacgatgat 300

gtgaagcaaa gggcttggca aactcttaag tggcagatcg ctaacggaat tcagcatgtg 360

aggactcatg tggatgtgtc tgatgctact cttactgctc ttaaggctat gctggaagtg 420

aagcaggaag tcgcgccgtg gattgatctt cagatcgtgg ctttccctca agagggaatc 480

ctttcttacc ctaacggaga ggctcttctt gaagaggctc ttaggcttgg agctgatgtt 540

gttggagcta tccctcactt cgagttcact agggaatacg gagttgagtc tcttcacaag 600

actttcgctc ttgctcagaa gtacgatagg cttatcgatg ttcactgcga tgagatcgat 660

gatgagcagt caagattcgt tgagactgtg gctgctcttg ctcatcatga aggaatggga 720

gctagagtta ctgcttctca cactactgct atgcactctt acaacggagc ttacacttct 780

aggcttttcg gcttcttaag atgtctggta tcaacttcgt ggctaaccct cttgtgaaca 840

tccatcttca gggaagattc gatacttacc ctaagaggag gggaattact agggtgaagg 900

agatgcttga gtcaggtatc aatgtgtgct tcggacacga tgatgttttc gatccttggt 960

atcctcttgg aactgctaac atgcttcagg tgttgcatat gggacttcat gtgtgccaac 1020

ttatgggata cggacagatc aacgatggac ttaaccttat cactcaccac tctgctagga 1080

ctcttaacct tcaggattac ggaattgctg ctggaaactc tgctaacctt atcatccttc 1140

ctgctgagaa tggattcgat gctcttagga ggcaagttcc tgttaggtac tctgttaggg 1200

gaggaaaggt gatcgcttct actcaacctg ctcagactac tgtttacctt gagcagcctg 1260

a 1261

<210>26

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>tne的探针

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(5)..(5)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(6)..(6)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(7)..(7)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(10)..(10)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(12)..(13)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(16)..(16)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(18)..(18)

<223>锁定的核酸

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(19)..(19)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>锁定的核酸

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(23)..(23)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(24)..(24)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(31)..(31)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(36)..(37)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷

<400>26

gaagucuagc guugaugaug agucugaaga gcguuguuag a 41

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>27

ggtcaagtgc cacgtaggat 20

<210>28

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<400>28

gggtgcttca ctttctgctc 20

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

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cccgtggcaa gtactttgat 20

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>30

ggattcccca ggtatgtgtg 20

<210>31

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>31

gtggaaaaag aagacgttcc aac 23

<210>32

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>32

agcatcgata gcagagatct ttc 23

<210>33

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>tne的探针

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(1)..(1)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胸苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(2)..(2)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(3)..(3)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胸苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(8)..(9)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(11)..(12)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(14)..(15)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(17)..(17)

<223>锁定的核酸

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>锁定的核酸

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(21)..(21)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(23)..(24)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(27)..(27)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胸苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(29)..(29)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(31)..(31)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胸苷

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(32)..(32)

<223>5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷

<400>33

tctagagccg ccaccatgat caccgatgca tcgag 35

<210>34

<211>53

<212>DNA

<213>番茄(Lycopersicon esculentum)

<400>34

gattgttgct attacaggtc aagtgccaag gaggatgatt ggtactgatg cgt 53

<210>35

<211>53

<212>DNA

<213>番茄

<400>35

gattgttgct attaccggtc aagtgccgag gaggatgatt ggtactgatg cgt 53

<210>36

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>TNE的探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(5)

<223>磷硫酰连接

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(24)

<223>磷硫酰连接

<400>36

atcatcctcc tctgcacttg accg 24

<210>37

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>tne的探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(4)

<223>磷硫酰连接

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>5-丙炔基-2′-脱氧尿嘧啶

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>5-丙炔基-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>5-丙炔基-2′-脱氧尿嘧啶

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(7)

<223>5-丙炔基-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>5-丙炔基-2′-脱氧尿嘧啶

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(10)

<223>5-丙炔基-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(11)

<223>lna

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>5-丙炔基-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(15)..(15)

<223>lna

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(19)

<223>5-丙炔基-2′-脱氧尿嘧啶

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(18)

<223>5-丙炔基-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(24)

<223>磷硫酰连接

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(23)

<223>5-丙炔基-2′-脱氧胞苷

<400>37

atcatcctcc tctgcacttg accg 24

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<213>人工的

<220>

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<220>

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<222>(1)..(4)

<223>磷硫酰连接

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>5-丙炔基-2′-脱氧尿嘧啶

<220>

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<222>(4)..(4)

<223>5-丙炔基-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>5-丙炔基-2′-脱氧尿嘧啶

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>5-丙炔基-2′-脱氧胞苷

<220>

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<222>(10)..(10)

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<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(14)

<223>LNA

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<222>(15)..(15)

<223>5-丙炔基-2′-脱氧尿嘧啶

<220>

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<222>(17)..(17)

<223>5-丙炔基-2′-脱氧胞苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(19)..(19)

<223>5-丙炔基-2′-脱氧尿嘧啶

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(24)

<223>磷硫酰连接

<400>38

gtacgtacag tcagtacgta ggat 24

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<211>24

<212>DNA

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gaaagggaag gtgttacgga tgta 24

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<212>DNA

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<220>

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<400>40

cttgattgcg aacacccacc 20

<210>41

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<400>41

gaaagggaag gggttaagga tgtg 24

<210>42

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>42

ctcgactgtg aacacccacc 20

Claims

1.一种用于定向改变双链DNA序列的寡核苷酸，该双链DNA序列含有第一DNA序列和与第一DNA序列互补的第二DNA序列，该寡核苷酸含有能够与第一DNA序列杂交的结构域，该结构域含有相对于第一DNA序列的至少一个错配，并且该寡核苷酸包括至少一个区段，该区段含有与天然存在的A、C、T或G核苷酸相比具有较高的结合亲和力的至少两个经修饰的核苷酸，其中

-至少一个经修饰的核苷酸是位于距离至少一个错配至少一个核苷酸距离的LNA，并且其中，可选地，该寡核苷酸含有最多约50％的LNA修饰的核苷酸；并且

-至少一个经修饰的核苷酸是C7-丙炔嘌呤或C5-丙炔嘧啶。

2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中至少2个，优选至少3个，更优选至少4个，甚至更优选至少5个和最优选至少6个核苷酸是LNA。

3.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中LNA在距离错配两端最多10个核苷酸，优选最多8个核苷酸，更优选最多6个核苷酸，甚至更优选最多4、3或2个核苷酸的距离独立地分布。

4.根据权利要求1-3所述的寡核苷酸，其中2个，优选3个，更优选4个，甚至更优选5个和最优选6个核苷酸是LNA。

5.根据前述权利要求任一项所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸的最多40％，优选最多30％，更优选最多25％，甚至更优选最多20％，和最优选最多10％的经修饰的核苷酸是LNA衍生物。

6.根据前述权利要求任一项所述的寡核苷酸，其中经修饰的核苷酸独立位于错配的5’侧和/或3’侧。

7.根据前述权利要求任一项所述的寡核苷酸，其中位于错配5’或3’侧的两个LNA修饰的核苷酸被至少1个，优选至少2个碱基对(核苷酸)彼此分开。

8.根据前述权利要求任一项所述的寡核苷酸，其中嘌呤是腺嘌呤或鸟嘌呤和/或嘧啶是胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶脱氧核苷。

9.根据前述权利要求任一项所述的寡核苷酸，其中，独立地至少10％，优选至少50％，更优选至少75％和最优选至少90％的嘧啶和/或嘌呤被其各自的丙炔化衍生物替代。

10.根据前述权利要求任一项所述的寡核苷酸，其中经修饰的核苷酸是嘧啶。

11.根据前述权利要求任一项所述的寡核苷酸，其中经修饰的核苷酸是嘌呤。

12.根据前述权利要求任一项所述的寡核苷酸，其中至少两个经修饰的核苷酸是丙炔化核苷酸，独立地选自丙炔化嘌呤或丙炔化嘧啶。

13.根据前述权利要求任一项所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含至少2个区段，优选至少3个区段，所述区段独立地含有至少2个，更优选至少3、4、5、6、7、8、9或10个经修饰的核苷酸。

14.根据前述权利要求任一项所述的寡核苷酸，其中区段位于或接近3’末端、5’末端和/或包括错配位置或在错配位置旁侧。

15.根据前述权利要求任一项所述的寡核苷酸，其中位于错配位置的核苷酸不经修饰。

16.根据前述权利要求任一项的寡核苷酸，其中至少一个丙炔修饰的核苷酸位于错配的附近，优选在错配的2、3、4、6、7、8、9或10个核苷酸以内。

17.根据前述权利要求任一项的寡核苷酸，其具有10至500个核苷酸的长度。

18.根据前述权利要求任一项的寡核苷酸，其中(经修饰的)区段是结构域。

19.根据前述权利要求任一项所述的寡核苷酸。

20.一种定向改变双链受体DNA序列的方法，其包括将双链受体DNA序列与供体寡核苷酸结合，其中双链受体DNA序列含有第一DNA序列和与第一DNA序列互补的第二DNA序列，并且其中供体寡核苷酸包括结构域，该结构域含有相对于需要改变的双链受体DNA序列，优选相对于第一DNA序列的至少一个错配，并且其中寡核苷酸包括区段，该区段含有与天然存在的A、C、T或G相比具有较高的结合亲和力的至少一个经修饰的核苷酸，并且其中当存在能够定向核苷酸交换的蛋白时，与天然存在的与第一DNA序列中相反位置上的核苷酸互补的核苷酸相比经修饰的核苷酸与第一DNA序列中相反位置上的核苷酸的结合更强，并且其中经修饰的寡核苷酸如权利要求1-19中所定义。

21.根据权利要求20所述的方法，其中改变是在细胞内，所述细胞优选选自植物细胞、真菌细胞、啮齿动物细胞、灵长类细胞、人类细胞或酵母细胞。

22.根据前述方法权利要求任一项所述的方法，其中蛋白来自细胞提取物。

23.根据前述方法权利要求任一项所述的方法，其中细胞提取物选自植物细胞提取物、真菌细胞提取物、啮齿动物细胞提取物、灵长类细胞提取物、人类细胞提取物或酵母细胞提取物。

24.根据前述方法权利要求任一项所述的方法，其中改变是删除、取代或插入至少一个核苷酸。

24、根据前述方法权利要求任一项所述的方法，其中细胞是真核细胞、植物细胞、非人类哺乳动物细胞或人类细胞。

25.根据前述方法权利要求任一项所述的方法，其中靶DNA来自真菌、细菌、植物、哺乳动物或人类。

26.根据前述方法权利要求任一项所述的方法，其中双链DNA来自基因组DNA、线性DNA、哺乳动物人工染色体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体DNA、细胞器染色体DNA、游离DNA。

27.根据前述方法权利要求任一项的方法，其用于改变细胞、通过恢复至野生型而改正突变、诱导突变、通过破坏编码区而使酶失活，通过改变编码区而修饰酶的生物学活性、通过破坏编码区而修饰蛋白。

28.如权利要求1-19中所定义的寡核苷酸的用途，其用于改变细胞、通过恢复至野生型而改正突变、诱导突变、通过破坏编码区而使酶失活、通过改变编码区而修饰酶的生物学活性、通过破坏编码区而修饰蛋白、错配修复、定向改变(植物)遗传物质包括基因突变、定向基因修复和基因敲除。

29.如权利要求1-19所定义的寡核苷酸的用途，其用于增加双链DNA序列的定向改变，该双链DNA序列含有第一DNA序列和与第一DNA序列互补的第二DNA序列，寡核苷酸含有能够与第一DNA序列杂交的结构域，该结构域含有相对于第一DNA序列的至少一个错配，并且其中寡核苷酸包括区段，该区段含有与天然存在的A、C、T或G核苷酸相比具有较高结合亲和力的至少两个经修饰的核苷酸，其中

-至少一个经修饰的核苷酸是位于距离至少一个错配为至少一个核苷酸的LNA，并且其中，可选地，寡核苷酸含有最多约50％的LNA修饰的核苷酸；并且

-至少一个经修饰的核苷酸是C7-丙炔嘌呤或C5-丙炔嘧啶。

30.如权利要求1-19所定义的寡核苷酸在用于为植物提供除草剂抗性的方法中的用途。

31.含有如权利要求1-19所定义的寡核苷酸的试剂盒。

32.通过权利要求13-27所述的方法产生的经修饰的遗传物质。

33.含有权利要求32所述的经修饰的遗传物质的细胞。

34.一种增加双链DNA定向核苷酸交换效率的方法，其包括

(a)获得含有能够与所述双链的第一DNA序列杂交的结构域的寡核苷酸，其中所述结构域含有：

(i)相对于第一DNA序列的至少一个错配；和

(ii)具有增加的结合亲和力的至少一个经修饰的核苷酸，和

(b)减少所述经修饰的核苷酸和所述错配之间的距离至约8个或更少的核苷酸；和

(c)回收用于定向核苷酸交换的寡核苷酸。

35.一种用于定向改变双链DNA的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有能够与所述双链的第一DNA序列杂交的结构域并且所述结构域含有：

(a)相对于第一DNA序列的至少一个错配；

(b)至少一个区段，该区段含有具有增加的结合亲和力的至少一个经修饰的核苷酸，其中所述经修饰的核苷酸是LNA，其中所述经修饰的核苷酸位于距离所述错配最多8个核苷酸。

36.根据权利要求35所述的寡核苷酸，其中经修饰的核苷酸位于距离所述错配最多8个核苷酸。

37.根据权利要求35所述的寡核苷酸，其中经修饰的核苷酸位于距离所述错配最多6个核苷酸。

38.根据权利要求35所述的寡核苷酸，其中经修饰的核苷酸位于距离所述错配最多4个核苷酸。

39.根据权利要求35所述的寡核苷酸，其中经修饰的核苷酸位于距离所述错配最多2个核苷酸。

40.根据权利要求35所述的寡核苷酸，其中所述结构域含有两个LAN。

41.一种用于双链DNA的定向核苷酸交换的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有

(a)经修饰的核苷酸；和

(b)相对于所述双链DNA链的错配；

其中所述经修饰的核苷酸位于距离所述错配约1个核苷酸远。