CN103958519A - 用于靶向核酸的探针和方法的实施方式 - Google Patents

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Abstract

本公开的实施方式涉及一种探针，其包含一对或多对能够靶向核酸靶的单体。所述单体对可以以促进所述探针复合物的热不稳定性的方式排列，从而产生能够定位和/或检测靶的探针。所述探针还可以包含能够与等序列的（isosequential）核酸靶Watson-Crick碱基配对的一个或多个天然或非天然核苷酸。具体公开的实施方式涉及使用本公开探针靶向核酸的方法。在具体公开的实施方式中，可以将所述探针与靶核酸温育，然后进行检测。

Description

用于靶向核酸的探针和方法的实施方式
与相关申请的交叉引用
本申请要求2011年7月19日提交的美国临时申请号61/509,336和2011年9月30日提交的美国临时申请号61/542,044的较早提交日期的优先权，所述两个在先申请一起全部内容通过参考并入本文。
技术领域
本文公开了能够靶向核酸及其特定序列的探针的实施方式。还公开了使用本公开探针靶向核酸及其序列的方法。
政府支持的确认
本发明在国立普通医学科学研究院（National Institute of GeneralMedical Sciences）授予的R01GM088697、国立卫生研究院（NationalInstitute of Health）授予的P20RR016448和INBRE-Institute ofTranslational Health Sciences授予的资助下，利用政府支持做出。美国政府在本发明中具有一定权利。
背景技术
使用短的外源反义寡核苷酸（ON）或siRNA在RNA水平上沉默基因表达，已变成研究基因的基础功能、检测目标基因和设计针对遗传起源疾病的新药物的极为流行的方法。为了开发具有广泛应用的高影响力的疗法，直接靶向基因的策略为常规疗法提供了强有力的替选方案。
使用结合小沟的聚酰胺或通过使用修饰的寡核苷酸或侵入螺旋的肽核酸（PNA）的基于DNA三螺旋的方法，在双链DNA（dsDNA）的序列选择性靶向中已取得进展。然而，这些方法的应用受到DNA双链体小沟的序列依赖性微观结构（聚酰胺）、靶序列限制（基于三链体的方法）或需要非生理性盐浓度（PNA）的限制。引入了一种有吸引力的替选方法，其使用假互补DNA（pcDNA），即含有不能彼此形成稳定碱基配对的修饰的嘌呤和嘧啶，同时允许与天然的互补DNA杂交的DNA双链体。pcDNA能够链侵入含有末端混合序列靶区域的平端化双链体，并且这种策略已被扩展到假互补PNA（pcPNA）中，其已被用于靶向双链DNA的混合序列内部靶区域。不幸的是，通常用于提高pcPNA溶解性和结合亲和性的带正电荷的赖氨酸残基，在高探针浓度下可能引起链侵入的自我抑制效应。在混合序列dsDNA的pcPNA介导的链侵入期间对低盐浓度的要求，对于生物介质中的所有实验和大量生物技术应用来说是一种限制。因此，开发用于在生理相关盐浓度下序列选择性地识别dsDNA的可替选策略，是非常合乎需要的。
发明概述
具体公开的实施方式涉及一种探针，其包含：一对单体，其包含具有下式的第一单体
其中每个Y独立地选自碳、氧、硫、三唑和NRb，其中Rb选自氢、脂族基团、芳基、杂脂族基团和杂芳基；V选自碳、氧、硫和NRb；n在0至4的范围内；R1和R2选自氢、脂族基团、芳基和含杂原子组成部分；R3是含杂原子官能团；R4选自任何天然或非天然核苷碱基；R5选自适合于嵌入到核酸内的任何芳香族组成部分；“任选的连接物”选自烷基、酰胺、氨酯、碳酸酯、脲及其组合；具有下式的第二单体：
以及选自天然核苷酸、非天然核苷酸及其组合的至少一个核苷酸，其中所述至少一个核苷酸通常在R2和/或R3处通过磷酸酯基团偶联于所述第一和/或第二单体。
在具体公开的实施方式中，所述含杂原子官能团选自醚（RaORb）、羟基（RaOH）、甲硅烷基醚（RaRbRcSiORd）、膦（PRaRbRc）、硫醇（RaSH）、硫醚/硫化物（RaSRb）、二硫化物（RaSSRb）、异硫氰酸酯（RaNCS）、异氰酸酯（RaNCO）、胺（NH2、NHRa、NRaRb）、酰胺（RaNRbC(O)Rc）、酯（RaOC(O)Rb）、卤素（I、Br、Cl、F）、碳酸酯（RaOC(O)ORb）、羧基（RaC(O)OH）、羧酸根（RaCOO-）、酯（RaC(O)ORb）、酮（RaC(O)Rb）、磷酸酯（RaOP(O)OH2）、磷酰基（RaP(O)(OH)2）、亚硫酰基（RaS(O)Rb）、磺酰基（RaSO2Rb）、硫羰基（RaC(S)Rb或RaC(S)H）、亚磺基（RaS(O)OH）、磺基（RaSO3H）、酰胺（RaC(O)NRbRc）、叠氮化物（N3）、腈（RaCN）、异腈（RaN+C-）和硝基（RaNO2）；Ra表示剩余的单体结构，其在所指示的位置处附连于上述官能团；并且Rb、Rc和Rd独立地是氢、脂族基团、芳基、杂脂族基团、杂芳基及其任何组合。在某些实施方式中，R2和R3独立地选自包含磷、硫、氮、氧、硒和/或金属的杂原子官能团，更通常地R2和R3独立地选自天然核苷酸、非天然核苷酸、合成核苷酸的磷酸酯基团或其组合。在具体公开的实施方式中，R4选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶或其任何衍生物，并且所述嵌入剂是芳香族烃或芳香族杂环。在具体公开的实施方式中，所述嵌入剂是选自芘、晕苯、苝、蒽、萘及其官能化衍生物的烃，或者可以是选自卟啉、核苷碱基、金属螯合物、氮杂芘、噻唑橙、吲哚、吡咯及其衍生物的芳香族杂环。
某些公开的实施方式涉及一种探针，其具有至少一个单体，并通常具有两个或更多单体。所述单体一般并入到寡核苷酸链内，并且可以位于所述寡核苷酸链中的任何位置、包括第一位置、最后位置和之间的任何位置，并且优选地以链间拉链排列方式例如+1拉链排列方式排列在最终结构中，如下面更详细讨论的。某些公开的实施方式涉及某些探针，其中所述第一单体或所述第二单体具有下列结构式：
在某些公开的实施方式中，所述第一单体或第二单体具有下列结构式
其中B选自尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、2-硫尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷、3-吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮或其衍生物。
所述探针的具体公开的实施方式包含具有下列任一结构的单体：
其中B选自尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、2-硫尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷、3-吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮或其衍生物，Re是H、DMT或磷酸酯，例如由寡核苷酸中的磷酸二酯键提供的磷酸酯，并且Rf是H、(N(i-Pr)2)P(OCH2CH2CN)或磷酸酯，例如由寡核苷酸中的磷酸二酯键提供的磷酸酯；Nap是指萘基例如2-萘基，Cor是指晕苯基例如晕苯-1-基，Py是指芘基例如芘-1-基、芘-2-基和芘-4-基，Pery是指苝基例如苝-3-基。
在具体公开的实施方式中，所述至少一个天然核苷酸可以选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶及其衍生物，并且所述至少一个非天然核苷碱基可以选自C5-官能化嘧啶、C6-官能化嘧啶、C7-官能化的7-脱氮杂嘌呤、C8-官能化嘌呤、2-硫尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷、3-吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮或其衍生物。在某些公开的实施方式中，所述探针包含至少一个天然核苷酸、非天然核苷酸及其组合，其被选择成与相应核酸序列的至少一个核苷酸基本上匹配。
具体公开的实施方式涉及具有下式的探针：
5’(B1B2…Bm)(XA)(B1B2…Bn)(XA)f(B1B2…Bo)(XA)g(B1B2…Bp)(XA)h(B1B2…Bq)(XA)i(B1B2…Br)(XA)j(B1B2…Bs)
3’(C1C2…Cm)(DP)(C1C2…Cn)(DP)f(C1C2…Co)(DP)g(C1C2…Cp)(DP)h(C1C2…Cq)(DP)i(C1C2…Cr)(DP)j(C1C2…Cs)
其中B1、B2和Bm-s可以是任何天然或非天然核苷酸，其中m-s在0至约28的范围内；f、g、h、i和j在0至10、更可能地0至5、通常0至3的范围内；X是所述第一单体；A是P的互补Watson-Crick碱基配对核苷酸；C是能够与B1、B2和Bm-s中的任一个Watson-Crick碱基配对的任何天然或非天然核苷酸；P是所述第二单体，并且D是X的互补Watson-Crick碱基配对核苷酸。在某些公开的实施方式中，所述探针被选择成识别预定的核酸靶序列，所述核酸靶可以是单链或双链的，更通常是双链的。在某些公开的实施方式中，所述探针可以在任何给定位置处另外包含一个或多个不参与碱基配对的单体，例如下列结构，其中Re是H、DMTr或磷酸酯，例如由寡核苷酸中的磷酸二酯键提供的磷酸酯，并且Rf是H、(N(i-Pr)2)P(OCH2CH2CN)或磷酸酯，例如由寡核苷酸中的磷酸二酯键提供的磷酸酯，并且示例而非限制性地，Rg和Rh独立地选自氢、脂族基团尤其是烷基例如C1-C10烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、酰胺和氨酯。
具体公开的实施方式涉及一种探针，其中所述第一单体和第二单体以显著减弱双链体的热稳定性的方式排列。在具体公开的实施方式中，所述探针可以具有与相应的（即等序列的）通常不包含具有本文所公开的结构式的单体的未修饰核酸双链体相当的（略低、相近或略高的）热解链温度。所述探针可以包含一对单体，其中所述第一单体和第二单体以+n或-n链间拉链取向排列，其中n在0至约10、更通常0至约2的范围内，更通常地，所述第一单体和第二单体以+n取向排列，其中n为1。所述探针还可以包含另外一对或多对单体对；能够被检测的产生信号的组成部分，其选自荧光团、特异性结合对的成员（例如生物素）、纳米粒子、信号淬灭组成部分例如荧光淬灭剂（例如Black Hole淬灭剂）；能够在所述探针与核酸、蛋白质、糖类、脂类或其他生物分子之间形成键的永久或可诱导的交联剂（例如补骨脂素）；核酸荷载（cargo）（例如单链DNA、单链RNA、双链DNA、双链RNA、质粒、基因）；及其组合。在具体公开的实施方式中，所述第二实体促进细胞摄取和/或细胞区室化，并包括肽[NLS、CPP、KDEL]和具有核亲和性的小分子（例如Hoechst型染料、乙锭、吖啶和噻唑橙）。所述探针可以在溶液中、在固相表面（例如多孔板、贵金属表面例如电极）上或与胶体材料和/或纳米材料（例如金纳米粒子、量子点）组合使用。
某些公开的实施方式涉及用于检测靶的方法，所述方法包括：选择探针，所述探针包含具有下式的单体
其中每个Y独立地选自氧、硫和NRb；其中Rb选自氢、脂族基团、芳基、杂脂族基团和杂芳基；V选自碳、氧、硫和NRb；n在0至4的范围内；R1和R2选自氢、脂族基团、芳基和含杂原子组成部分；R3是含杂原子官能团；R4选自任何天然或非天然核苷碱基；R5选自适合于偶联到核酸或与核酸结合的任何官能团，以及至少一个天然核苷酸、非天然核苷酸及其组合；将核酸靶暴露于所述探针；以及检测所述探针。在所述方法的具体公开的实施方式中，所述探针被选择成与靶核酸的区域、尤其是双链核酸靶区域基本上匹配，所述区域可以包含或可以包含一个或多个多嘌呤区段；更通常地所述核酸是核苷酸的混合序列、结构化核酸，尤其是双链核酸序列（dsDNA）、甚至更特别地是双链DNA，例如但不限于混合序列的发夹DNA靶、PCR扩增子、基因组DNA等，其与所述探针等序列。在具体公开的实施方式中，将所述靶暴露于所述探针包括将所述探针与所述核酸靶温育。在某些公开的实施方式中，将所述核酸靶与过量的例如约5倍过量的所述探针直至至少约5,000倍过量的所述探针、更通常地高达约500倍过量的所述探针、甚至更通常地约5倍过量的所述探针至约200倍过量的所述探针温育。在具体公开的实施方式中，所述探针和探针-靶（识别）复合物通过荧光光谱术、电泳、吸收光谱术、荧光显微术、流式细胞术及其组合来检测。
本领域普通技术人员将会认识到，本公开探针实施方式的靶序列可以改变。对于某些公开的实施方式来说，所述方法对哺乳动物中的性别决定特别有用。例如，所述方法可用于有蹄类动物和反刍动物，尤其是牛科动物、马科动物或猪的性别决定。对于其他实施方式来说，所述靶是等序列的（相对于探针）双链DNA靶区域，包括分子信标的茎、嵌入在PCR扩增子中的靶区域、嵌入在环状或线性化质粒中的靶区域、嵌入在基因组DNA中的靶区域和嵌入在微生物中的靶区域。所述靶也可以选自与增殖性病症例如B细胞和T细胞白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌和神经系统癌症相关的核酸序列。在其他实施方式中，所述靶选自病毒或其他微生物，并且所述探针被用于检测和/或鉴定所述微生物。
还公开了包含核酸探针的试剂盒。这样的试剂盒通常包含含有至少一个本公开单体的探针，并且可以包含至少一个凸出部单体。这样的试剂盒还可以包括选自SEQ ID NOs.1-254的序列。某些试剂盒的实施方式对哺乳动物中的性别决定特别有用。
从下面参考附图进行的详细描述，本发明的上述和其他目的、特定和优点将变得显而易见。
附图简述
图1是说明了使用本公开探针检测靶的方法的特定实施方式的示意图。
图2是本公开探针的实施方式的图像。
图3A是示出了使用凸出部单体的概念的示意图。
图3B是示出了探针的示意图，所述探针具有本公开单体（绿色）的两个+1链间排列方式和1至4个未配对的凸出部单体（红色环），例如402-4、402-N和402-9。
图4是本公开探针的示例性实施方式与核酸靶之间的热变性曲线的图像，其示出了（两个）探针链之一与（两个）靶链之一之间的双链体的特征。
图5是本公开探针的示例性实施方式与核酸靶之间的热变性曲线的图像，其示出了（两个）探针链之一与（两个）靶链之一之间的双链体的特征。
图6是本公开探针的示例性实施方式与核酸靶之间的热变性曲线的图像，其示出了（两个）探针链之一与（两个）靶链之一之间的双链体的特征。
图7是从示例性探针实施方式和与核酸靶形成的双链体获得的吸收光谱。
图8是从示例性探针实施方式和与核酸靶形成的双链体获得的吸收光谱。
图9是示例性探针实施方式在存在或不存在核酸靶情况下的荧光发射光谱。
图10是示例性探针实施方式在存在或不存在核酸靶情况下的荧光发射光谱。
图11是示例性探针实施方式在存在或不存在核酸靶情况下的荧光发射光谱。
图12是示例性探针实施方式在存在或不存在核酸靶情况下的荧光发射光谱。
图13是示例性探针实施方式在存在或不存在核酸靶情况下的荧光发射光谱。
图14是示例性探针实施方式在存在或不存在核酸靶情况下的荧光发射光谱。
图15是示例性探针实施方式在存在或不存在核酸靶情况下的荧光发射光谱。
图16是示例性探针实施方式在存在或不存在核酸靶情况下的荧光发射光谱。
图17是示例性探针实施方式在存在或不存在核酸靶情况下的荧光发射光谱。
图18是在使用本公开探针的示例性方法中使用的靶的示意图。
图19是在使用探针的示例性方法中使用的靶和本公开探针的示例性实施方式的示意图。
图20是使用探针的不同示例性实施方式及其结合于特定靶的能力的凝胶电泳分析获得的凝胶的图像。
图21是用于分析本公开探针抑制基因表达的能力的靶的示意图。
图22是本公开探针的示例性实施方式和使用这样的探针在特定靶中抑制基因表达获得的结果的示意图。
图23是从使用本公开探针的示例性实施方式和特定靶的剂量依赖性研究获得的结果的示意图。
图24是使用探针靶向混合序列的结构化核酸靶的示例性实施方式的示意图。
图25是从本公开探针的示例性实施方式的凝胶电泳分析获得的凝胶的图像，说明了所述探针与混合序列的结构化核酸靶复合的能力。
图26是使用本公开探针的各种示例性实施方式以及作为对照使用的实施方式（例如单链探针前体和没有探针的对照）来靶向混合序列的结构化核酸靶并与其形成复合物获得的结果的图像。
图27是使用本公开的包含三唑组成部分的探针的示例性实施方式获得的吸收光谱。
图28是使用本公开的包含三唑组成部分的探针的示例性实施方式获得的稳态荧光发射光谱。
图29是示出了其中发生通用杂交的本公开探针的推断机制的示意图。
图30示出了使用电泳迁移率改变测定法通过探针识别结构化dsDNA靶：（a）识别过程的示意图；（b）具有等序列（SL1）或非等序列（SL2和SL3）的茎区域（箭头表示偏差点）的dsDNA-靶的结构；（c）、（d）和（e）分别使用不断增加的过量126W2:126W5、120Q2:120Q5或D1:D2识别SL1；（f）SL1与100倍过量的单链126W2、126W5、120Q2或120Q5的温育；（g）和（h）SL1-SL3分别与100倍过量的126W2:126W5或120Q2:120Q5的温育。探针-靶温育：20℃下3小时；15%非变性PAGE；DIG：地高辛。
图31是结构化dsDNA SL1被下列探针（从上至下）识别的剂量响应性曲线：126W2:126W5，126X2:126X5，126Y2:126Y5，120Q2:120Q5，120Y2:120Y5（P2:P5），124X6:124X8（K6:K8）和120’W6:120’W8（M6:M8）。实验条件参见图30。将剂量响应曲线拟合于对数方程。
图32示出了对照实验的结果。将SL1与100倍过量的单链120’W6（M6）、120’W8（M8）、120Y2（P2）或120Y5（P5）温育。对于实验条件和SL1的序列来说，参见图30。
图33示出了对照实验的结果。将SL1-SL3与100倍过量的a）126X2:126X5、b）126Y2:126Y5或c）124X6:124X8温育。对于实验条件和SL1-SL3的序列来说，参见图30。
图34示出了通过凝胶迁移率改变测定法（电泳迁移率改变测定法；其概念参见图30）监测的使用单体120Y（200倍摩尔过量）修饰的不同探针对结构化dsDNA HP1进行的靶向。HP1：（5’-GGTATATATAGGC-(T10)-GCCTATATATACC）（34.4nM），在室温下温育。单独的HP1（第1道）；与200倍过量的120Y-P1（第2道）、120Y-P2（第3道）、120Y-P3（第4道）、120Y-P4（第5道）、120Y-P5（第6道）、120Y-P6（第7道）或120Y-P7（第8道）温育的HP12。
图35示出了使用各种浓度的所选探针（120Y-P4）对结构化dsDNAHP1进行的靶向。
图36示出了对照实验的结果，其证实了本公开探针的识别特异性。
图37为提出的识别机制提供了证据，证实了使用本公开探针的本公开的核酸靶向模式。第1道：仅仅DIG标记的HP1；第2道：仅仅DIG标记的“上方”探针链（5’-GG(120Y)A(120Y)A TAT AGG C-DIG）；第3道：仅仅DIG标记的“下方”探针链（3’-DIG-CCA(120Y)A(120Y)ATA TCC G）；第4道：与未标记的结构化靶HP1温育的具有DIG标记的上方链的探针（5’-GG(120Y)A(120Y)ATATAGGC-DIG+3’-CCA(120Y)A(120Y)ATATCCG）；第5道：与未标记的结构化靶HP1温育的具有DIG标记的下方链的探针（5’-GG(120Y)A(120Y)ATATAGGC+3’-DIG-CCA(120Y)A(120Y)ATATCCG）；第6道：与未标记的结构化靶HP1温育的未标记的探针（5’-GG(120Y)A(120Y)ATATAGGC+3’-CCA(120Y)A(120Y)ATATCCG）。
图38提供了双链探针的两条链便于dsDNA靶区域的识别这一信息。第1道：仅仅HP1；第2道：HP1+120Y-P4的上方链（即5’-GG(120Y)A(120Y)ATATAGGC）；第3道：HP1+120Y-P4的下方链（即3’-CCA(120Y)A(120Y)ATATCCG）；第4道：HP1+120Y-P4。探针以相对于结构化靶HP1200倍的摩尔过量使用。在室温下在Hepes缓冲液中温育15小时。
图39是示出了HP1与不断增加浓度的等序列和未修饰的dsDNA探针的温育结果的凝胶。5x-500x是指dsDNA相对于HP1的摩尔过量倍数。
图40是对称凸出部的连接物化学相对于侵入%的图，示出了使用具有一个或多个凸出部的探针对结构化dsDNA（茎-环）靶进行的靶向的结果，其中将Dig标记的结构化dsDNA靶与200倍过量的探针在Hepes缓冲液中温育15小时，然后进行电泳、成像和定量。
图41是上链凸出部的连接物化学相对于侵入%的图，示出了使用具有一个或多个凸出部的探针对结构化dsDNA（茎-环）靶进行的靶向的结果，其中将Dig标记的结构化dsDNA靶与200倍过量的探针在Hepes缓冲液中温育15小时，然后进行电泳、成像和定量。
图42是下链凸出部的连接物化学相对于侵入%的图，示出了使用具有一个或多个凸出部的探针对结构化dsDNA（茎-环）靶进行的靶向的结果，其中将Dig标记的结构化dsDNA靶与200倍过量的探针在Hepes缓冲液中温育15小时，然后进行电泳、成像和定量。
图43是具有+1链间拉链排列方式并另外用荧光团-淬灭剂对修饰的双链探针的使用图示。与核酸靶的结合导致光学信号、更通常为荧光信号的产生。
序列表
在随附的序列表中列出的核酸序列，使用如37C.F.R.1.822中所定义的核苷酸碱基的标准字母缩写来显示。只示出了每个核酸序列的一条链，但应该理解对显示出的链的任何指称包含了互补链。在随附的序列表中：
SEQ ID NOs:1-4、11和240-245是具有等序列或非等序列的茎区域的结构化dsDNA靶的核苷酸序列。
SEQ ID NOs:5-10、12-239、246-251和254是寡核苷酸探针和靶区域的核苷酸序列。
SEQ ID NOs:252和253是含有未配对凸出部的双链探针的核苷酸序列。
详细描述
I.术语
除非另有指明，否则技术术语按照常规用法使用。分子生物学中常用术语的定义可以在下述文献中找到：Benjamin Lewin，《基因VII》（Genes VII），Oxford University Press出版，2000（ISBN019879276X）；Kendrew等主编，《分子生物学百科全书》（The Encyclopedia ofMolecular Biology），Blackwell Publishers出版，1994（ISBN0632021829）；和Robert A.Meyers主编，《分子生物学和生物技术：详尽桌面参考》（Molecular Biology and Biotechnology:a ComprehensiveDesk Reference），Wiley,John&Sons,Inc.出版，1995（ISBN0471186341）；以及其他类似参考文献。
当在本文中使用时，单数术语包括复数指称物，除非上下文明确指明不是如此。同样地，单词“或”打算包括“和”，除非上下文明确指明不是如此。此外，当在本文中使用时，术语“包含”是指“包括”。因此，“包含A或B”意味着包括A、B或A和B。
波浪线（）指示键断开。虚线（）表明在特定位置处可能形成键。
为核酸或多肽或其他化合物提供的所有核苷酸大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值都是近似值，并且出于描述的目的提供。
尽管与本文中所述相似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或试验，但下面描述了适合的方法和材料。
本文中提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献以其全文引为参考。在冲突的情况下，以本说明书、包括术语的解释为准。此外，材料、方法和实例仅仅是说明性的而不打算是限制性的。
为了便于评阅本公开的各个实例，提供了下列特定术语的解释：
脂族化合物：仅含有通过单键（烷烃）、双键（烯烃）或叁键（炔烃）相连的碳和氢原子的任何开放或闭合的链分子，并包括芳香族化合物。这一术语涵盖取代的脂族化合物、饱和的脂族化合物和不饱和的脂族化合物。
类似物、衍生物或模拟物：类似物是在化学结构上与母体化合物不同的分子，例如同系物（区别在于化学结构的增加，例如烷基链长度的差异）、分子片段、相差一个或多个官能团的结构、离子化变化。结构类似物通常利用例如在Remington（《制药学科学与实践》（The Scienceand Practice of Pharmacology），第19版（1995），第28章）中公开的技术，使用定量结构活性关系（QSAR）来发现。衍生物是源自于基本结构的生物活性分子。模拟物是模拟另一个分子例如生物活性分子的活性的分子。生物活性分子可以包括模拟化合物的生物活性的化学结构。
芳香化合物：描述具有不饱和键、孤对电子或空轨道，并且表现出比由单独的共轭稳定作用所预计的更强的稳定作用的共轭环。它可以被当作环离域作用和共振的表象。
芳基：基本上基于烃的芳香族化合物或其作为取代基键合于另一个基团、特别是其他有机基团的原子团（例如C6H5），其具有环结构例如苯、萘、菲、蒽等。该术语还涵盖取代的芳基化合物。
芳烷基：含有脂族基团和芳香族结构两者的化合物，或其作为取代基键合于另一个基团、特别是其他有机基团的原子团（甲苯的C7H7）。
互补：多核苷酸在容许的盐和温度条件下通过碱基配对的天然结合。互补性的存在可以包括仅有一部分核酸结合的情况或在核酸之间存在完全互补性的情况。
缀合、联结、键合或连接：将一个分子联结到另一个分子以制成更大的分子。例如，将两个多肽制成一个连续的多肽分子，或者将半抗原或其他分子共价附连于多肽例如scFv抗体。在特定上下文中，该术语包括指称将配体例如抗体组成部分联结到效应分子。连接可以通过化学或重组手段。“化学手段”是指抗体组成部分与效应分子之间的反应，使得在两个分子之间存在形成的共价键以形成一个分子。
偶联的：术语“偶联的”是指直接或间接地联结在一起。第一个原子或分子可以被直接偶联或间接偶联到第二个原子或分子。第二抗体提供了间接偶联的实例。偶联可以通过共价、非共价和离子键形成来进行。
衍生物：在化学中，衍生物是从类似化合物产生的化合物或者可以被想象为从另一个化合物产生的化合物，例如如果将一个原子用另一个原子或原子团代替。后一种定义在有机化学中常用。在生物化学中，该词被用于至少在理论上可以从前体化合物形成的化合物。
与加和的偏差（Deviation from additivity）（DA）：探针ONX:ONY的DA值被定义为：DAONX:ONY≡ΔTm(ONX:ONY)–[ΔTm(ONX:DNA X)+ΔTm(DNA Y:ONY)]，其中ONX:ONY是具有本公开单体的某些链间拉链排列方式的双链探针，“DNA X”和“DNA Y”分别是ONX和ONY的互补单链核酸靶。术语“热优势（Thermal advantage）”与DA显著相关，即TA=-DA。
置换：用一个原子、原子团或分子（阴离子或中性的）代替化合物中的另一个原子、原子团或分子的反应。
双链核酸：含有具有双链基序的两个或更多核苷酸区域的寡核苷酸。
表位：抗原决定簇。它们是分子上具有抗原性，也就是说引发特异性免疫应答的特定化学基团或毗邻或不毗邻的肽序列。
荧光：吸收波长不同的光或其他电磁辐射的物质的光发射。
荧光团：分子的引起所述分子发射荧光的官能团。通常，所述官能团能够吸收特定波长的能量并重新发射不同（但同样地特定）波长的能量。
人表皮生长因子受体（Her）家族：一族结构相关的蛋白，至少包括Her1、Her2、Her3和Her4（也分别称为EGFR1、EGFR2、EGFR3和EGFR4，或分别称为ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3和ErbB-4）。Her1、Her2和Her4是受体酪氨酸激酶；尽管Her3与Her1、Her2和Her4具有同源性，但Her3是无激酶活性的。Her家族中包括p95，即Her2的缺少Her2细胞外结构域部分的截短的形式（参见例如Arribas等，CancerRes.,71:1515-1519,2011；Molina等，Cancer Res.,61:4744-4749,2001）。
人表皮生长因子受体家族介导细胞生长，并在许多癌症类型中解调控。例如，Her1和Her2在许多人类癌症中被上调，并且它们的过度信号传导在这些肿瘤的发展和恶性化中可能是关键因素。参见例如Herbst,Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.,59:21–6,2004；Zhang等，J.Clin.Invest.117(8):2051–8,2007。受体二聚化对Her途径激活来说是必不可少的，引起受体磷酸化和下游信号传导。与Her1、-3和-4不同，Her2没有已知配体并假设具有开放构象，其二聚化结构域被暴露用于与其他配体激活的Her受体相互作用。
约30%的乳腺癌具有Her2基因的扩增或其蛋白产物的过表达。Her2过表达也发生在其他癌症类型例如卵巢癌、胃癌以及子宫癌的生物攻击性形式例如子宫浆液性内膜癌中。参见例如Santin等，Int.J.Gynaecol.Obstet.,102(2):128–31,2008。含有Her2的同源二聚体和异源二聚体是具有转化能力的蛋白质复合物。曲妥珠单抗，一种防止Her2同源二聚化的人源化抗体，被用于治疗某些过表达Her2的癌症，包括乳腺癌。此外，癌组织中Her2的表达水平可用于预测患者对Her2治疗性抗体（例如曲妥珠单抗）的响应。由于其预后作用及其预测对曲妥珠单抗的响应的能力，因此常规地检查肿瘤（例如与乳腺癌相关的肿瘤）的Her2过表达。
Her途径还参与卵巢癌病理发生。许多卵巢肿瘤样品表达Her家族的所有成员。与在正常卵巢上皮中相比，在卵巢癌中更频繁地观察到Her1和Her2的共表达，并且这两种受体的过表达与不良预后相关联。也已显示，与Her2的优选二聚化（Her1/Her2、Her2/Her3）和随后通过受体磷酸化的途径激活驱动卵巢肿瘤细胞增殖，即使在不存在Her2过表达的情况下。已显示，帕妥珠单抗，一种防止Her2二聚化（与其自身和与Her3）的人源化抗体，对患有表达Her2和/或Her3的卵巢癌的患者提供治疗益处。
Her1氨基酸序列的实例包括NCBI/Genbank登记号NP_005219.2、CAA25240.1、AAT52212.1、AAZ66620.1、BAF83041.1、BAH11869.1、ADZ75461.1、ADL28125.1、BAD92679.1、AAH94761.1。Her2氨基酸序列的实例包括NCBI/Genbank登记号BAJ17684.1、P04626.1、AAI67147.1、NP_001005862.1、NP_004439.2、AAA75493.1、AAO18082.1。Her3氨基酸序列的实例包括NCBI/Genbank登记号NP_001973.3、P21860.1、AAH82992.1、AAH02706.1、AAA35979.1。Her4氨基酸序列的实例包括NCBI/Genbank登记号AAI43750、Q15303.1、NP_005226.1、NP_001036064.1、AAI43748.1。
杂脂族基团：含有碳和氢之外的一个或多个原子例如但不限于氧、硫、氮、磷、氯、氟、溴、碘和硒的脂族基团。
同源性：当在本文中使用时，“同源性”是指互补程度。可以存在部分同源性或完全同源性。部分同源性包括至少部分地抑制一致的序列与靶核酸杂交的核酸序列。
均聚物：该术语是指通过单一类型的分子物质例如单一单体（例如氨基酸）的多个单元键合在一起形成的聚合物。
链间拉链命名法（+1/-1等）：“链间拉链排列方式”命名法被用于描述位于双链体的相反链上的两个单体之间的相对排列方式。数字“n”描述以碱基对数目度量的距离，并且如果单体相对于另一条链上第二参比单体向其自身链的5’侧移动，则具有正值。相反，如果单体相对于另一条链上第二参比单体向其自身链的3’侧移动，则n具有负值。
分离的：“分离的”微生物（例如病毒、细菌、真菌或原生生物）已经与不同类型、株或种的微生物基本上分离开或从其中纯化出来。微生物可以通过各种技术包括连续稀释和培养来分离。
“分离的”生物组分（例如核酸分子、蛋白质或细胞器）已与天然存在所述组分的生物体的细胞中的其他生物组分，例如其他染色体或染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器基本上分离开或从其中纯化出来。已被“分离的”核酸和蛋白质包括通过标准纯化技术纯化的核酸和蛋白质。该术语还包含通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质，以及化学合成的核酸或蛋白质或其片段。
离去基团：在异裂键断裂后带有一对电子离开的分子片段。离去基团可以是阴离子或中性分子。常见的阴离子离去基团可以包括卤化物例如Cl-、Br-和I-和磺酸酯类，例如对甲苯磺酸根（TsO-）、三氟甲磺酸根（TfO-）。常见的中性分子离去基团可以包括H2O、NH3醇类和气体（N2、O2、CO2、CO和SO2）。
路易斯酸：可以从起到电子对供体作用的路易斯碱B接受一对电子，形成加成物AB的化学物质，如下式所述：A+:B→A—B。
连接物：当在本文中使用时，连接物是位于两个组成部分之间的分子或原子团。
低级烷基：含有1-10个碳原子的任何脂族链。
修饰的：当在本文中使用时，“修饰的”是指具有非天然组成的寡核苷酸，因为它包含可以与天然碱基配对的一个或多个合成的核苷碱基。
目标分子或靶分子：其存在、位置和/或浓度待测定的分子。
核酸碱基：当在本文中使用时，“核酸碱基”包括天然存在的核苷碱基以及非天然核苷碱基。本领域普通技术人员将会认识到，“核酸碱基：涵盖嘌呤和嘧啶衍生物及其杂环衍生物和互变异构体。
亲核试剂：通过贡献两个成键电子与其反应配偶体（亲电试剂）形成化学键的试剂。具有自由电子对的分子或离子可以用作亲核试剂。
核苷酸:磷酸化的核苷是“核苷酸”，其是DNA和RNA的分子结构单元。
核苷：杂环碱基的糖苷。术语“核苷”被广义使用以便包括非天然存在的核苷、天然存在的核苷以及其他核苷类似物。核苷的说明性实例是包含核糖组成部分的核糖核苷以及包含脱氧核糖组成部分的脱氧核糖核苷。对于这样的核苷的碱基来说，应该理解它可以是任何天然存在的碱基例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，及其任何修饰的变体或任何可能的非天然碱基。
寡核苷酸：由天然磷酸二酯键相连的多个联结的核苷酸。寡核苷酸是长度在至少2至约300个核苷酸之间的多核苷酸。通常，寡核苷酸是约5至约50个核苷酸之间的多核苷酸。寡核苷酸类似物是指功能类似于寡核苷酸但具有非天然存在的部分的组成部分。例如，寡核苷酸类似物可以含有非天然存在的部分，例如改变的糖组成部分或糖间连接，例如硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸。天然存在的多核苷酸的功能类似物可以结合于RNA或DNA，并包括锁核酸（LNA）和肽核酸（PNA）分子。
可药用盐：可药用盐与用于产生所述盐的相应的游离酸和碱相比在水溶液中溶解性更高；然而，也可能形成与用于产生所述盐的相应的游离酸和碱相比具有更低溶解性的盐。可药用盐如果带有正电荷，通常用无机碱、有机碱或碱性氨基酸来平衡；或者如果它们带有负电荷，则用无机酸、有机酸或酸性氨基酸来平衡。可药用盐也可以采取两性离子形式。盐可以从阳离子例如钠、钾、铝、钙、锂、镁、锌并从碱例如氨、乙二胺、N-甲基-谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N,N'-二苯甲基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苯甲基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羟甲基)氨基甲烷和四甲基氢氧化铵形成。其他能够形成盐的元素对于本领域普通技术人员来说是公知的，例如来自于元素周期表的第I至V主族的所有元素以及来自于第I至VIII副族的元素。在本说明书中叙述的任何化学化合物可以可替选地作为其可药用盐给药。“可药用盐”还包括游离酸、碱。适合的可药用盐的描述可以在《制药用盐、性质、选择和使用手册》（Handbook of Pharmaceutical Salts,Properties,Selection and Use），Wiley VCH(2002)中找到，所述文献通过参考并入本文。
多肽：单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-光学异构体或D-光学异构体。当在本文中使用时，术语“多肽”或“蛋白质”打算涵盖任何氨基酸序列并包括修饰的序列例如糖蛋白。术语“多肽”具体打算涵盖天然存在的蛋白质以及重组或合成生产的蛋白质。
术语“残基”或“氨基酸参见”包括对掺入到蛋白质、多肽或肽中的氨基酸的指称。
保护基团：可以通过官能团的化学修饰导入到分子中的组成部分。保护基团通常被用于包含一个官能团，以便在与不同官能团的化学反应中获得化学选择性。适合的保护基团对于本领域普通技术人员来说是公知的，并且可以包括芳基、脂族基团、杂脂族基团、杂芳基。
蛋白质：由氨基酸构成的分子，特别是多肽。
纯化的：术语“纯化的”不要求绝对纯度；相反，它打算作为相对术语。因此，例如，纯化的化合物是整体或部分地与其他污染物分离开的化合物。一般来说，用于本公开的基本上纯化的肽、蛋白质、缀合物、寡核苷酸或其他活性化合物，包含在将所述肽、蛋白质、缀合物或其他活性化合物与药用载体、赋形剂、缓冲剂、吸收增强剂、稳定剂、防腐剂、佐剂或其他辅助成分混合或配制成完整的用于治疗性给药的药物配方之前，制备物中存在的所有大分子物质的80%以上。更通常地，所述肽、蛋白质、缀合物或其他活性化合物被纯化成占与其他配制成分混合之前纯化的制备物中存在的所有大分子物质的90%以上，通常95%以上。在其他情况下，纯化的制备物可能是基本上均质的，其中其他大分子物质不能通过常规技术检测到。
量子产率：荧光过程的效率的度量。诱导辐射的过程的“量子产率”表示系统每吸收一个光子时发生的确定事件的次数。
反应性基团：整个本申请中的结构式被称为“反应性基团”，其可以是适合于经历本文中所描述的化学转化的各种基团中的任一种。例如，反应性基团可以是胺-反应性基团例如异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、NHS酯、酰基氯例如磺酰氯、醛类和乙二醛、环氧化物和环氧乙烷、碳酸酯、芳基化试剂、亚胺酸酯、碳二亚胺类、酸酐及其组合。适合的硫醇-反应性官能包括卤代乙酰基和烷基卤化物、马来酰亚胺类、氮丙啶类、丙烯酰基衍生物、芳基化试剂、硫醇-二硫化物交换试剂例如吡啶基二硫化物、TNB-硫醇和二硫化物还原剂及其组合。适合的羧酸-反应性官能团包括重氮烷、重氮乙酰基化合物、羰基二咪唑化合物和碳二亚胺类。适合的羟基-反应性官能团包括环氧化物和环氧乙烷、羰基二咪唑、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯或N-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯、高碘酸氧化化合物、酶氧化、烷基卤和异氰酸酯类。醛和酮-反应性官能团包括肼类、西佛氏碱、还原胺化产物、Mannich缩合产物及其组合。活性氢-反应性化合物包括重氮盐衍生物、Mannich缩合产物、碘化反应产物及其组合。光反应性化学官能团包括芳基叠氮化物、卤代芳基叠氮化物、二苯甲酮类、重氮化合物、双吖丙啶衍生物及其组合。
样品：来自于对象的生物样品，例如可以包含基因组DNA、RNA（包括mRNA）、蛋白质或其组合。实例包括但不限于外周血、尿液、唾液、组织活检样品、手术样本、羊膜穿刺术样品和尸检材料。
单核苷酸多态性：当物种的成员之间或个体中成对染色体之间基因组（或其他共有序列）中单个核苷酸不同时出现的核酸序列变异。例如。来自于不同个体的两个测序的核酸片段AAGCCTA与AAGCTTA相比，含有单个核苷酸差异。
基本上互补的：当在本文中使用时，“基本上互补的”是指本公开方法的寡核苷酸与它们被设计用于检测的靶核酸序列至少约50%同源，更优选地至少约60%、更优选地至少约70%、更优选地至少约80%、更优选地至少约90%、更优选地至少约90%、更优选地至少约95%、最优选地至少约99%同源。
热优势：热优势（TA）被定义为TA(ONX:ONY)≡Tm(ONX:DNAX)+Tm(DNA Y:ONY)-Tm(ONX:ONY)–Tm(DNA X:DNA Y)，其中ONX:ONY是具有本公开单体的某些链间拉链排列方式的双链探针，ONX:DNA X和DNA Y:ONY是单个探针链与核酸靶之间的双链体，DNA X:DNA Y是双链核酸靶。大的正TA值表示探针ONX:ONY靶向DNA X:DNA Y的显著潜力。术语“与加和的偏差”通过下述公式与“TA”显著相关：TA=-DA（高的正TA或高的负DA值表明显著的靶向潜力）。
过渡金属：周期表中第3至12族内的任何金属元素，其具有不完整的内电子壳层，并且在元素系列中的最高与最低电负性之间起到过渡连接的作用。
II.简介
本文公开了用于靶向核酸及其特定序列的探针。在具体公开的实施方式中，所述探针包含能够嵌入到一个或多个核酸靶内的一对或多对单体。在具体公开的实施方式中，所述探针包含一对或多对单体，其包含排列在相反核酸链上的第一单体和第二单体。某些公开的实施方式涉及其中一个或多个单体以促进探针的热不稳定性并提高探针检测靶的能力的方式排列的探针。
III.本公开探针的实施方式
A.单体
在具体公开的实施方式中，本公开探针可以包含一个或多个能够与核酸偶联的单体。在具体公开的实施方式中，每个单体可以独立地具有下面示出的式1。
式1
对于式1来说，每个Y可以独立地选自氧、硫、三唑、噁唑、四唑、异噁唑和NRb，其中Rb选自氢、脂族基团、芳基、杂脂族基团和杂芳基，并且V可以选自碳、氧、硫和NRb，其中Rb如前所述。变量“n”可以在0至4的范围内；更通常地，n为1或0。本领域普通技术人员将会认识到，当n为1或更大时，V可以结合或可以不结合于Y，正如由式1中连接这两个变量的虚线所指示的。R1可以选自氢，脂族基团例如烷基、更通常为低级烷基例如甲基、乙基、丙基、丁基等、烯基、炔基，芳基，芳基脂族基团例如芳烷基，以及含杂原子组成部分。含杂原子组成部分可以选自但不限于醚（RaORb）、羟基（RaOH）、甲硅烷基醚（RaRbRcSiORd）、膦（PRaRbRc）、硫醇（RaSH）、硫醚/硫化物（RaSRb）、二硫化物（RaSSRb）、异硫氰酸酯（RaNCS）、异氰酸酯（RaNCO）、胺（NH2、NHRa、NRaRb）、酰胺（RaNRbC(O)Rc）、酯（RaOC(O)Rb）、卤素（I、Br、Cl、F）、碳酸酯（RaOC(O)ORb）、羧基（RaC(O)OH）、羧酸根（RaCOO-）、酯（RaC(O)ORb）、酮（RaC(O)Rb）、磷酸酯（RaOP(O)OH2）、磷酰基（RaP(O)(OH)2）、亚硫酰基（RaS(O)Rb）、磺酰基（RaSO2Rb）、硫羰基（RaC(S)Rb或RaC(S)H）、亚磺基（RaS(O)OH）、磺基（RaSO3H）、酰胺（RaC(O)NRbRc）、叠氮化物（N3）、腈（RaCN）、异腈（RaN+C-）和硝基（RaNO2）。对于本文中公开的所有含杂原子组成部分来说，Ra表示在标为R1的位置处附连于上述官能团的剩余的单体结构；Rb、Rc、和Rd独立地是氢、脂族基团、芳基、杂脂族基团、杂芳基及其任何组合。任选的连接物可以选自烷基、酰胺、氨酯、碳酸酯、脲及其组合。
R2可以选自氢、脂族基团、芳基和本文中描述的任一含杂原子组成部分。在特定实施方式中，R2可以选自本领域普通技术人员已知的保护基团，例如但不限于4,4’-二甲氧基三苯甲基、三苯甲基、9-芳基噻吨基、甲磺酰基（Ms）、甲苯磺酰基（Ts）、苯磺酰基（Bs）、三氟甲烷（CF3）和三氟甲磺酰基。在某些公开的实施方式中，R2可以是一个或多个核苷酸或单体。
R3通常可以是含杂原子官能团。在具体公开的实施方式中，杂原子可以选自磷、硫、氮、氧、硒和/或金属。某些公开的实施方式利用具有下式的R3取代基
其中Y选自氧、硫、NRb，其中Rb选自氢、脂族基团、芳基、杂脂族基团、杂芳基，并且W选自磷、SH或she。某些类型的R3取代基包括但不限于下列：
在其他公开的实施方式中，R3具有下式
其中W是磷，并且每个Z独立地选自醚、硫醚、羟基和NRb 2。在具体公开的实施方式中，R3可以是
R4可以选自任何天然或非天然核苷碱基。在具体公开的实施方式中，R4是选自尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤的天然核苷碱基。本领域普通技术人员将会认识到，R4也可以是任何非天然或合成开发的核苷碱基，包括目前已知的或将来开发的。在具体公开的实施方式中，R4可以选自C-5官能化嘧啶、C6-官能化嘧啶、C7-官能化的7-脱氮杂嘌呤、C8-官能化嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、脱氧次黄嘌呤核苷和3-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖苷基)吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮。
R5可以是能够嵌入到核酸内的嵌入剂。在具体公开的实施方式中，R5可以是能够嵌入到单链核酸、双链核酸和/或三链核酸内的任何组成部分。在具体公开的实施方式中，R5可以是当插入到核酸中时能够维持平坦取向的平面组成部分。R5可以是选自芘、晕苯、苝、蒽、萘及其官能化衍生物的烃；或芳香族杂环，例如卟啉、核苷碱基（例如嘧啶、嘌呤、尺寸扩大的核苷碱基）、金属螯合物（例如菲绕啉、DPPZ）、氮杂芘、噻唑橙、乙锭、重氮苯、吲哚、吡咯、苯并咪唑及其修饰的类似物。R5可以被修饰以包含各种脂族基团、芳基或含杂原子官能团。
具体公开的实施方式涉及包含选自式3-5任一种的一个或多个单体的探针。
式3
式4
式5
在某些公开的实施方式中，探针可以包含具有式6和7任一式的一个或多个单体。对于式6和7来说，B可以选自带有或不带有常见保护基团的尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和2-硫尿嘧啶，R5可以选自萘-2-基、芘-1-基、晕苯-1-基、CH2-芘-1-基、CH2-晕苯-1-基、CO-芘-1-基、COCH2-芘-1-基、CH2-苝-3-基、CH2-1-(7-新戊基芘基)、CH2-1-(6-溴芘基)、CH2-1-(8-溴芘基)、CH2-1-(8-甲基芘基)、CH2-1-(7-叔丁基-3-甲氧基芘基)、CH2-芘-2-基和CH2-芘-4-基。
式6
式7
式8
式9
示例性的工作实施方式包括下列化合物：
具体公开的实施方式涉及使用当形成探针时或当探针与靶反应时不参与碱基配对的一个或多个单体。不参与碱基配对的单体在本文中被称为“凸出部单体”。在具体公开的实施方式中，凸出部单体可以包含一个或多个脂族基团、脱碱基位点、杂烷基、天然/修饰的核苷酸及其组合。探针中可以包含一个或多个凸出部单体。
B.单链探针前体
具体公开的实施方式涉及单链探针前体，其中一个或多个本公开单体包含在单链寡核苷酸中。在某些公开的实施方式中，单链探针前体可以包含顺序地或以其中一个或多个天然或非天然核苷酸被放置在两个或多个单体之间的方式排列的一个或多个单体。
在具体公开的实施方式中，单链探针可以起到包含一个或多个本公开单体的双链体的前体的作用，或者它可用于本文中讨论的本公开的方法中。某些公开的实施方式涉及具有下面示出的通式9的单链探针。本公开的单链探针前体可以包含闭锁单体、未闭锁单体或其组合。
5’(B1B2…Bm)(XA)(B1B2…Bn)(XA)f(B1B2…Bo)(XA)g(B1B2…Bp)(XA)h(B1B2…Bq)(XA)i(B1B2…Br)(XV)j(B1B2…Bs)
式9
对于式9来说，B1B2、Bm-s可以是目前已知的或将来发现的任何天然或非天然核苷酸，其中m-s可以在0至约28的范围内。在具体公开的实施方式中，f、g、h、i和j可以在0至10、更通常地0至5、甚至更通常地0至1的范围内。每个X可以独立地选自任何本公开单体，并且A可以是Watson-Crick碱基配对的核苷酸或其衍生物，其能够与靶中互补的Watson-Crick碱基配对核苷酸或其衍生物偶联。在具体公开的实施方式中，每个X可以独立地是具有1-7任一式的单体，并且A可以选自尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及其衍生物。在具体公开的实施方式中，单链探针前体可以具有式9，其中变量按照下列任一种来定义：m=2，n=5，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X是包含尿嘧啶核苷碱基的任一本公开单体，并且A是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=4，n=3，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X是包含尿嘧啶核苷碱基的任一本公开单体，并且A是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=2，n=9，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X是包含尿嘧啶核苷碱基的任一本公开单体，并且A是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=4，n=7，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X是包含尿嘧啶核苷碱基的任一本公开单体，并且A是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=6，n=5，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X是包含尿嘧啶核苷碱基的任一本公开单体，并且A是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=8，n=3，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X是包含尿嘧啶核苷碱基的任一本公开单体，并且A是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=2，n=0，o=7，p=q=r=s=0，f=1，g=h=i=j=0，X是包含尿嘧啶核苷碱基的任一本公开单体，并且A是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=2，n=2，o=5，p=q=r=s=0，f=1，g=h=i=j=0，X是包含尿嘧啶核苷碱基的任一本公开单体，并且A是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=2，n=4，o=3，p=q=r=s=0，f=1，g=h=i=j=0，X是包含尿嘧啶核苷碱基的任一本公开单体，并且A是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=2，n=o=p=q=r=s=0，f=g=h=1，i=j=0，X是包含尿嘧啶核苷碱基的任一本公开单体，并且A是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=2，n=13，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X是包含尿嘧啶核苷碱基的任一本公开单体，并且A是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=2，n=0，o=11，p=q=r=s=0，f=1，g=h=i=j=0，X是包含尿嘧啶核苷碱基的任一本公开单体，并且A是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=2，n=7，o=4，p=q=r=s=0，f=1，g=h=i=j=0，X是包含尿嘧啶核苷碱基的任一本公开单体，并且A是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=4，n=3，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X是包含腺嘌呤核苷碱基的任一本公开单体，并且A是胸腺嘧啶-1-基DNA核苷酸；m=4，n=3，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X是包含胞嘧啶核苷碱基的任一本公开单体，并且A是鸟嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=4，n=3，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X是包含鸟嘌呤核苷碱基的任一本公开单体，并且A是胞嘧啶-1-基DNA核苷酸；m=4，n=3，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X是包含腺嘌呤核苷碱基的任一本公开单体，并且A是鸟嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=4，n=3，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X是包含胞嘧啶核苷碱基的任一本公开单体，并且A是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸。
一个或多个凸出部单体也可以被插入在单链或双链探针内的任何位置处。探针可以另外地用一个或多个不配对的修饰（不配对的修饰是可以内部并入到寡核苷酸中的任何修饰）来修饰，所述修饰起到降低探针的热稳定性的作用，这便于dsDNA识别反应。下面提供了已被并入本公开探针的实施方式的不配对凸出部的结构实例。
C.探针双链体
具体公开的实施方式涉及可用于鉴定、定位、结合和/或修饰靶的探针。所述探针可以是包含两条寡核苷酸链的双链体，所述寡核苷酸包含一对或多对本公开单体。在具体公开的实施方式中，一对或多对本公开单体以显著降低双链体的热稳定性的方式排列，由此提供了具有结合靶的能力的探针。不受限于单一操作理论，目前相信以本文中公开的特定方式排列单体，提供了具有足够能量以解离（或变性）成两条链，然后与靶偶联的探针（图1）。
探针可以包含超过一对单体；例如，探针可以包含1对至约5对单体。在具体公开的实施方式中，一对单体可以包含具有本文公开的任一式的两个单体，其位于探针的相反链（例如双链体的相反链）上。在具体公开的实施方式中，第一单体可以位于一条探针链上的任何位置处，而所述探针对中的第二单体位于另一条探针链上相对于第一单体的特定位置处。某些公开的实施方式涉及具有以(+/-)n拉链排列方式排列的一对或多对单体的探针，其中n可以在0至约10、更通常地0至约3、甚至更通常地至少1至约2的范围内。具体公开的实施方式涉及具有至少一对以+n拉链排列方式排列的单体的探针。不受特定操作理论的限制，目前相信某些链间单体排列方式引起探针的去稳定化，例如图1-2中所示。在具体公开的实施方式中，单体对可以以–n拉链排列方式排列。本公开探针的示例性实施方式通常包含一对单体，其包含以(+1)链间拉链排列方式排列的第一单体和第二单体。其他示例性实施方式涉及包含两对单体的探针，每对单体的第一单体和第二单体以(+1)链间拉链排列方式排列，并且每对单体相隔至少0至约10个天然或非天然核苷酸或凸出部单体。
探针的具体公开的实施方式可以具有如下所述的式10。本公开探针可以包含闭锁单体、未闭锁单体及其组合。
5’(B1B2…Bm)(XA)(B1B2…Bn)(XA)f(B1B2…Bo)(XA)g(B1B2…Bp)(XA)h(B1B2…Bq)(XA)i(B1B2…Br)(XA)j(B1B2…Bs)
3’(C1C2…Cm)(DP)(C1C2…Cn)(DP)f(C1C2…Co)(DP)g(C1C2…Cp)(DP)h(C1C2…Cq)(DP)i(C1C2…Cr)(DP)j(C1C2…Cs)
式10
对于式10来说，B1、B2……Bm-s可以是目前已知的或将来发现的任何天然或非天然核苷酸，其中m-s可以在0至约28的范围内。在具体公开的实施方式中，f、g、h、i和j可以在0至1,000的范围内，例如0至900，例如0至800，例如0至700，例如0至600，例如0至500，例如0至400，例如0至300，例如0至200，例如0至100，例如0至50，通常地0至10，甚至更通常地0-5。X可以选自任何本公开单体，并且A可以是Watson-Crick碱基配对的核苷酸或其衍生物或另一个本公开单体，其能够与靶中的互补Watson-Crick碱基配对核苷酸或其衍生物偶联。在具体公开的实施方式中，X可以是具有1-7任一式的单体，并且A可以选自具有尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶核苷碱基的核苷酸，或具有假互补核苷碱基（例如2-硫尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷、3-吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮）的核苷酸。C可以是目前已知或将来发现的任何天然或非天然核苷酸，其能够与B1,B2……Bm-s中的任一个Watson-Crick碱基配对。“B”和“C”也可以是不形成强碱基配对的假互补碱基对（或任何碱基对）；P可以选自任何本公开单体，并且D可以是Watson-Crick碱基配对的核苷酸或其衍生物或另一个本公开单体，其能够与靶中的互补Watson-Crick碱基配对核苷酸或其衍生物偶联。在具体公开的实施方式中，P可以是具有1-7任一式的单体，并且D可以选自尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。
具体公开的实施方式涉及具有式10的探针，其中变量按照下面任一种来定义：m=2，n=5，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X=P是具有尿嘧啶核苷碱基的单体，并且V=Y是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=4，n=3，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X=P是具有尿嘧啶核苷碱基的单体，并且V=Y是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=2，n=9，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X=P是具有尿嘧啶核苷碱基的单体，并且V=Y是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=4，n=7，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X=P是具有尿嘧啶核苷碱基的单体，并且V=Y是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=6，n=5，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X=P是具有尿嘧啶核苷碱基的单体，并且V=Y是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=8，n=3，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X=P是具有尿嘧啶核苷碱基的单体，并且V=Y是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=2，n=0，o=7，p=q=r=s=0，f=1，g=h=i=j=0，X=P是具有尿嘧啶核苷碱基的单体，并且V=Y是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=2，n=2，o=5，p=q=r=s=0，f=1，g=h=i=j=0，X=P是具有尿嘧啶核苷碱基的单体，并且V=Y是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=2，n=4，o=3，p=q=r=s=0，f=1，g=h=i=j=0，X=P是具有尿嘧啶核苷碱基的单体，并且V=Y是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=2，n=o=p=q=r=s=0，f=g=h=1，i=j=0，X=P是具有尿嘧啶核苷碱基的单体，并且V=Y是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=2，n=13，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X=P是具有尿嘧啶核苷碱基的单体，并且V=Y是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=2，n=0，o=11，p=q=r=s=0，f=1，g=h=i=j=0，X=P是具有尿嘧啶核苷碱基的单体，并且V=Y是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=2，n=7，o=4，p=q=r=s=0，f=1，g=h=i=j=0，X=P是具有尿嘧啶核苷碱基的单体，并且V=Y是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=4，n=3，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X=P是具有腺嘌呤核苷碱基的单体，并且V=Y是胸腺嘧啶-1-基DNA核苷酸；m=4，n=3，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X=W是具有胞嘧啶核苷碱基的单体，并且V=Y是鸟嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=4，n=3，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X=W是具有鸟嘌呤核苷碱基的单体，并且V=Y是胞嘧啶-1-基DNA核苷酸；m=4，n=3，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X是具有腺嘌呤核苷碱基的单体，W是具有胞嘧啶核苷碱基的单体，Y是胸腺嘧啶-1-基DNA核苷酸并且V是鸟嘌呤-9-基DNA核苷酸；m=4，n=3，o=p=q=r=s=0，f=g=h=i=j=0，X是具有胞嘧啶核苷碱基的单体，W是具有胸腺嘧啶核苷碱基的单体，Y是鸟嘌呤-9-基DNA核苷酸并且V是腺嘌呤-9-基DNA核苷酸。
图3A和B示出了使用凸出部单体的概念。对于图3A和B来说，绿色表示本公开的嵌入剂官能化单体；红色表示非核苷连接物。可以向上面的式所定义的任何实施方式添加一个或多个凸出部单体。
本公开探针的示例性实施方式提供在表1中。本领域普通技术人员将会认识到，探针的任何所公开的实施方式可以从合并（杂交）以形成探针的两个单链前体来制造。表1中公开的实施方式涉及其中X是本文中描述的单体并且R4被定义为尿嘧啶或胸腺嘧啶核苷碱基的探针；然而，本领域普通技术人员将会认识到，可以使用任何本公开单体。
表1
某些本公开探针和相应靶的示例性实施方式
其他示例性实施方式公开在表2中。表2中公开的实施方式涉及一种探针，其中每条链（例如被称为5’和3’的链）中的单体可以具有1-7中的任一式，其中R4组成部分选自腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、尿嘧啶（U）或胸腺嘧啶（T）。
表2
某些本公开探针和相应的靶区域的示例性实施方式
具有0-排列方式的探针的其他工作实施方式提供在下面的表3中。
表3
具有0-排列方式的探针的工作实施方式
表4-6概括了靶向不同DNA区域，即第二胰岛素[INSB]、PPARγ和CEBP启动子的某些示例性探针的工作实施方式。
表4
靶向第二胰岛素启动子[INSB]的探针
表5
用于PPARγ的探针的其他实施例
表6
用于CEBP的探针的其他实例
可用于在动物中，更通常在牛科动物中进行性别决定的探针的其他工作实施方式示出在表7中，其中Cy3是Cy3荧光团；下划线的A/C/G/T是单体；并且下划线的B是凸出的（未配对）单体。
表7
牛科动物序列
IV.靶
具体公开的实施方式涉及使用本公开探针靶向并结合于特定靶。在具体公开的实施方式中，靶可以是核酸例如但不限于单链DNA（及其衍生物）、双链DNA（及其衍生物）及其任何组合。具体公开的实施方式涉及靶向等序列（相对于探针）的双链DNA靶区域，包括：分子信标的茎，嵌入在PCR扩增子中的靶区域，嵌入在环状或线性化质粒中的靶区域，嵌入在基因组DNA（粗品、纯化的、细胞培养物、体外、胚胎等）中的靶区域和嵌入在微生物中的靶区域等。这个靶的名单打算是示例性的并且不打算是限制性的。在具体公开的实施方式中，靶可以通过鉴定RNA靶来选择，例如在反义/siRNA/anti-miRNA临床试验和临床前试验中所寻求的靶（例如在基因表达的调节和/或生物标志物的鉴定中使用的靶），并且可以设计包含相应于该特定RNA靶的DNA的靶。仅仅作为实例，具体的靶包括线性化质粒（例如针对T7启动子，如图18-20所示），环状质粒（例如针对环状质粒中的胰岛素B启动子，如图21-23所示），基因组DNA，结构化dsDNA靶（图24-26和图30-42）。
靶核酸序列在尺寸上可以显著变化。非限制性地，核酸序列可以具有可变的核酸残基数目。例如，靶核酸序列可以具有至少约2个核酸残基，通常至少约10个核酸残基，或至少约20、30、50、100、150、500、1000个残基。
在具体的非限制性实例中，蛋白由与肿瘤（例如癌症）相关的靶核酸序列（例如基因组靶核酸序列）产生。在肿瘤细胞、尤其是癌细胞例如B细胞和T细胞白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、神经系统癌症等中，已鉴定大量染色体畸变（包括易位和其他重排、扩增或缺失）。因此，在某些实例中，至少一部分蛋白由在样品的至少一部分细胞中扩增或缺失的核酸序列（例如基因组靶核酸序列）产生。
已知癌基因造成几种人类恶性肿瘤。例如，在滑膜肉瘤软组织肿瘤中，涉及位于染色体18q11.2的断点区域中的SYT基因的染色体重排是常见的。使用本公开探针可以例如鉴定到t(18q11.2)易位。在其他实例中，选择产生蛋白质的核酸序列（例如基因组靶核酸序列），使得它是在恶性肿瘤细胞中缺失（丢失）的肿瘤抑制基因。在具体公开的实施方式中，也可以使用本公开探针的实施方式来检测、鉴定这种类型的靶的基因表达降低和/或基因修饰。例如，在某些膀胱癌中，位于染色体9p21上的p16区域（包括D9S1749、D9S1747、p16（INK4A）、p14（ARF）、D9S1748、p15（INK4B）和D9S1752）被缺失。涉及1号染色体的短臂的远端区域（其涵盖例如SHGC57243、TP73、EGFL3、ABL2、ANGPTL1和SHGC-1322）和19号染色体的着丝粒周缘区域（例如19p13-19q13）（其涵盖例如MAN2B1、ZNF443、ZNF44、CRX、GLTSCR2和GLTSCR1）的染色体缺失，是某些类型的中枢神经系统实体肿瘤的特征性分子特点。
提供上述实例仅仅是出于说明的目的而不打算是限制性的。对于本领域普通技术人员来说，与肿瘤转化和/或生长相关联的大量其他细胞遗传学畸变是已知的。由已经与肿瘤转化相关联的核酸序列（例如基因组靶核酸序列）生产并且可用于本公开方法的靶蛋白，还包括EGFR基因（7p12；例如GENBANKTM登记号NC_000007，55054219-55242525位核苷酸）、C-MYC基因（8q24.21；例如GENBANKTM登记号NC_000008，128817498-128822856位核苷酸）、D5S271（5p15.2）、脂蛋白脂肪酶（LPL）基因（8p22；例如GENBANKTM登记号NC_000008，19841058-19869049位核苷酸）、RB1（13q14；例如GENBANKTM登记号NC_000013，47775912-47954023位核苷酸）、p53（17p13.1；例如GENBANKTM登记号NC_000017，互补的，7512464-7531642位核苷酸）、N-MYC（2p24；例如GENBANKTM登记号NC_000002，互补的，151835231-151854620位核苷酸）、CHOP（12q13；例如GENBANKTM登记号NC_000012，互补的，56196638-56200567位核苷酸）、FUS（16p11.2；例如GENBANKTM登记号NC_000016，31098954-31110601位核苷酸）、FKHR（13p14；例如GENBANKTM登记号NC_000013，互补的，40027817-40138734位核苷酸），以及例如：ALK（2p23；例如GENBANKTM登记号NC_000002，互补的，29269144-29997936位核苷酸），Ig重链，CCND1（11q13；例如GENBANKTM登记号NC_000011，69165054..69178423位核苷酸），BCL2（18q21.3；例如GENBANKTM登记号NC_000018，互补的，58941559-59137593位核苷酸），BCL6（3q27；例如GENBANKTM登记号NC_000003，互补的，188921859-188946169位核苷酸），MALF1，AP1（1p32-p31；例如GENBANKTM登记号NC_000001，互补的，59019051-59022373位核苷酸），TOP2A（17q21-q22；例如GENBANKTM登记号NC_000017，互补的，35798321-35827695位核苷酸），TMPRSS（21q22.3；例如GENBANKTM登记号NC_000021，互补的，41758351-41801948位核苷酸），ERG（21q22.3；例如GENBANKTM登记号NC_000021，互补的，38675671-38955488位核苷酸）；ETV1（7p21.3；例如GENBANKTM登记号NC_000007，互补的，13897379-13995289位核苷酸），EWS（22q12.2；例如GENBANKTM登记号NC_000022，27994271-28026505位核苷酸）；FLI1（11q24.1-q24.3；例如GENBANKTM登记号NC_000011，128069199-128187521位核苷酸），PAX3（2q35-q37；例如GENBANKTM登记号NC_000002，互补的，222772851-222871944位核苷酸），PAX7（1p36.2-p36.12；例如GENBANKTM登记号NC_000001，18830087-18935219位核苷酸），PTEN（10q23.3；例如GENBANKTM登记号NC_000010，89613175-89716382位核苷酸），AKT2（19q13.1-q13.2；例如GENBANKTM登记号NC_000019，互补的，45431556-45483036位核苷酸），MYCL1（1p34.2；例如GENBANKTM登记号NC_000001，互补的，40133685-40140274位核苷酸），REL（2p13-p12；例如GENBANKTM登记号NC_000002，60962256-61003682位核苷酸）和CSF1R（5q33-q35；例如GENBANKTM登记号NC_000005，互补的，149413051-149473128位核苷酸）。
在其他实例中，靶蛋白选自与疾病或病症相关的病毒或其他微生物。细胞或组织样品中病毒或微生物来源的靶核酸序列（例如基因组靶核酸序列）的检测，指示了所述生物体的存在。本公开探针可用于检测和/或鉴定这些类型的靶。此外，编码对于微生物的存活来说关键的酶的基因可以用本公开探针的实施方式来靶向，这能够引起微生物的死亡。例如，靶蛋白可以选自致癌或病原性病毒、细菌或细胞内寄生虫（例如恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）和其他疟原虫属物种（Plasmodium species）、利什曼原虫属物种（Leishmania(sp.)）、小球隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）、溶组织内阿米巴（Entamoebahistolytica）和兰氏贾第鞭毛虫（Giardia lamblia），以及弓形虫属（Toxoplasma）、艾美虫属（Eimeria）、泰来虫属（Theileria）和巴贝虫属（Babesia）物种）的基因组。
在某些情况下，靶蛋白从来自于病毒基因组的核酸序列（例如基因组靶核酸序列）产生。示例性的病毒和相应的基因组序列可以选自下列（括号中为GENBANKTMRefSeq登记）：人类腺病毒A（NC_001460），人类腺病毒B（NC_004001），人类腺病毒C（NC_001405），人类腺病毒D（NC_002067），人类腺病毒E（NC_003266），人类腺病毒F（NC_001454），人类星状病毒（NC_001943），人类BK多瘤病毒（V01109；GI:60851），人类博卡病毒（NC_007455），人类冠状病毒229E（NC_002645），人类冠状病毒HKU1（NC_006577），人类冠状病毒NL63（NC_005831），人类冠状病毒OC43（NC_005147），人类肠病毒A（NC_001612），人类肠病毒B（NC_001472），人类肠病毒C（NC_001428），人类肠病毒D（NC_001430），人类红细胞病毒V9（NC_004295），人类泡沫病毒（NC_001736），人类疱疹病毒1（单纯性疱疹病毒1型）（NC_001806），人类疱疹病毒2（单纯性疱疹病毒2型）（NC_001798），人类疱疹病毒3（水痘-带状疱疹病毒）（NC_001348），1型人类疱疹病毒4（Epstein-Barr病毒1型）（NC_007605），2型人类疱疹病毒4（Epstein-Barr病毒2型）（NC_009334），人类疱疹病毒5AD169毒株（NC_001347），人类疱疹病毒5Merlin毒株（NC_006273），人类疱疹病毒6A（NC_001664），人类疱疹病毒6B（NC_000898），人类疱疹病毒7（NC_001716），M型人类疱疹病毒8（NC_003409），P型人类疱疹病毒8（NC_009333），人类免疫缺陷病毒1（NC_001802），人类免疫缺陷病毒2（NC_001722），人类偏肺病毒（NC_004148），人类乳头瘤病毒-1（NC_001356），人类乳头瘤病毒-18（NC_001357），人类乳头瘤病毒-2（NC_001352），人类乳头瘤病毒-54（NC_001676），人类乳头瘤病毒-61（NC_001694），人类乳头瘤病毒-cand90（NC_004104），人类乳头瘤病毒RTRX7（NC_004761），人类乳头瘤病毒10型（NC_001576），人类乳头瘤病毒101型（NC_008189），人类乳头瘤病毒103型（NC_008188），人类乳头瘤病毒107型（NC_009239），人类乳头瘤病毒16型（NC_001526），人类乳头瘤病毒24型（NC_001683），人类乳头瘤病毒26型（NC_001583），人类乳头瘤病毒32型（NC_001586），人类乳头瘤病毒34型（NC_001587），人类乳头瘤病毒4型（NC_001457），人类乳头瘤病毒41型（NC_001354），人类乳头瘤病毒48型（NC_001690），人类乳头瘤病毒49型（NC_001591），人类乳头瘤病毒5型（NC_001531），人类乳头瘤病毒50型（NC_001691），人类乳头瘤病毒53型（NC_001593），人类乳头瘤病毒60型（NC_001693），人类乳头瘤病毒63型（NC_001458），人类乳头瘤病毒6b型（NC_001355），人类乳头瘤病毒7型（NC_001595），人类乳头瘤病毒71型（NC_002644），人类乳头瘤病毒9型（NC_001596），人类乳头瘤病毒92型（NC_004500），人类乳头瘤病毒96型（NC_005134），人类副流感病毒1（NC_003461），人类副流感病毒2（NC_003443），人类副流感病毒3（NC_001796），人类副肠孤病毒（NC_001897），人类细小病毒4（NC_007018），人类细小病毒B19（NC_000883），人类呼吸道合胞病毒（NC_001781），人类鼻病毒A（NC_001617），人类鼻病毒B（NC_001490），人类泡沫反转录病毒（NC_001795），人类嗜T淋巴细胞病毒1（NC_001436），人类嗜T淋巴细胞病毒2（NC_001488）。
在某些实例中，靶蛋白从来自于致癌病毒例如Epstein-Barr病毒（EBV）或人类乳头瘤病毒（HPV，例如HPV16、HPV18）的核酸序列（例如基因组靶核酸序列）产生。在其他实施方式中，从核酸序列（例如基因组靶核酸序列）产生的靶蛋白来自于病原性病毒，例如呼吸道合胞病毒、肝炎病毒（例如丙肝病毒）、冠状病毒（例如SARS病毒）、腺病毒、多瘤病毒、细胞肥大病毒（CMV）或单纯性疱疹病毒（HSV）。本公开所设想的其他靶包括Her1、Her2、Her3和Her4（例如分别为EGFR1、EGFR2、EGFR3和EGFR4，或分别为ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3和ErbB-4）。
V.制造单体的方法
具体公开的实施方式涉及制造本公开单体的方法，在某些公开的实施方式中，方法可以涉及合成闭锁单体（例如具有式1、2或3的单体）；并且在其他本公开的实施方式中，方法可以涉及合成未闭锁单体（例如具有式1、2或4的单体）。
在具体公开的实施方式中，单体可以是闭锁单体，其可以使用反应图式1中示出的合成顺序从前体2合成。
反应图式1
根据反应图式1，可以使用大量化学转化将前体核苷2转变成N2’-官能化的锁核酸。可以使用本领域普通技术人员已知的方法将前体核苷2转变成叠氮化物4，例如通过将前体核苷2的YH基团转变成离去基团例如甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯和/或甲苯磺酸酯，并使用亲和叠氮化物例如叠氮化钠置换所述离去基团。然后可以使用串联的Staudinger反应（亚氨基膦形成）/分子内亲和取代顺序将叠氮化物4转变成闭锁核苷6。在多个步骤中进行N2’核苷6的保护和保护基团操作，然后去保护，最终提供闭锁核苷10。
在具体公开的实施方式中，闭锁核苷10可以被转变成适合应用于本公开探针中的单体。反应图式2示出了闭锁核苷10向这样的单体的转变。
反应图式2
参考反应图式2，可以将闭锁核苷10转变成被保护的核苷20。使用各种取代基对被保护的核苷20进行的N2’官能化，可以使用本领域普通技术人员已知的适用于胺与各种官能团偶联的条件来进行。这些条件包括例如使用三乙酰氧基硼氢化物，使用芳香族醛类（ArCHO）的还原胺化，或使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）或2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸甲铵（HATU）作为偶联试剂，使用芳香族羧酸（ArCOOH）的酰化。N2’官能化的核苷22可以包含任选的连接物和选自本文公开的任何R5组成部分的R5组成部分。在使用本领域普通技术人员已知的方法，通过例如碱介导的取代将N2’官能化的核苷22的YH基团官能化后，可以制造单体24。单体24适合于进一步并入到核酸序列中。
制造本公开单体的示例性方法示出在下面的反应图式3和4中。参见N.K.Andersen,J.Wengel和P.J.Hrdlicka，“N2’-官能化的2’-氨基α-L-LNA腺嘌呤衍生物——单链DNA的有效靶向”（N2’-Functionalized2’-Amino-α-L-LNA Adenine Derivatives–Efficient Targeting of SingleStranded DNA），Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids,2007,26,1415-1417，其通过参考并入本文。
反应图式3试剂和条件：a）BSA,TMSOTf,ABz,an.1,2-DCE，回流70h；b）1）硝酸胍,NaOMe,MeOH,DCM,30min,rt.或2）1/2sat.NH3/MeOH,0℃,1.5h；c）(CF3SO2)2O吡啶,an.DCM-78℃,3h；d）NaN3,15-C-5,an.DMF,40℃,16h；e）2Maq.NaOH,PMe3,THF,rt.16h；f）(CF3CO)2O,an.吡啶,an CH2Cl2,0℃,2h；g）BCl3,an.CH2Cl2,-78℃至rt.,17h；h）NaOBz,15-冠-5,an.DMF,90℃,5h,；i）2M aq.NaOH,1,4-二噁烷/水,0℃,2h；j）DMTrCl,an.吡啶,0℃至rt.,23h.缩略语：ABz=6-N-苯甲酰基-腺嘌呤.1,2-DCE=1,2-二氯乙烷
根据反应图式3，二乙酸酯30向所需β-核苷32的转变使用一锅反应，在改良的Vorbrüggen条件下，使用N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺（BSA）和TMSOTf在1,2-二氯乙烷中回流，利用苯甲酰基保护的腺嘌呤核苷碱基的原位全甲硅烷化来进行。然后使用半饱和甲醇氨对核苷32进行化学选择性O2’-脱乙酰化，以得到核苷34。将核苷34与三氟甲磺酸酐反应，以便于O2’-三氟甲磺酸酯36的形成，其随后不需中间体纯化，用叠氮化钠和15-冠-5在无水DMF中处理，以得到叠氮化物38。IR光谱术证实了叠氮化物官能团的存在（2115cm-1处的尖锐带），并且与NMR和HRMS-MALDI一起，为叠氮化物38的建议结构提供了证据。使用一锅串联的Staudinger/分子内亲和取代反应，将叠氮化物38以80%的得率转变成所需的双环核苷40。使用无水二氯甲烷和无水吡啶中的三氟乙酸酐，用三氟乙酰基保护核苷40，促进以70%的得率形成核苷42。随后使用无水二氯甲烷中的BCl3，使核苷42经历苯甲醚切割反应，以65-87%的得率产生脱苯甲基的核苷44。脱苯甲基化后将C-5’处的甲磺酰基保护基团用苯甲酰基保护基团交换。反应在无水条件下，使用DMF中的苯甲酸钠和15-冠-5来进行，以70–83%的分离得率产生核苷46。使核苷46经受水和1,4-二噁烷中的氢氧化钠，切开5’-苯甲酰基和三氟乙酸保护基团两者。氨基二醇的纯化以60-80%的分离得率产生靶核苷48。随后通过4,4’-二甲氧基三苯甲基（DMTr）保护核苷48的5’-位置处的羟基，得到DMTr保护的核苷50。
反应图式4示出了将DMTr保护的核苷50转变成本公开单体的不同示例性实施方式的示例性方法。
反应图式4试剂和条件：a）Fmoc-Cl,an.吡啶,rt.6h,51%；b）2-氰基乙基-N,N’-(二异丙基)-氯代亚磷酰胺,N-甲基咪唑,DIPEA,CH2Cl2,rt,4h,47%；c）1-芘甲醛,NaBH(OAc)3,1,2-DCE,rt.,17h,68%.；d）2-氰基乙基-N,N’-(二异丙基)-氯代亚磷酰胺,20%DIPEA在CH2Cl2中,rt.21h,51%；e）1-芘甲酸,EDC·HCl,CH2Cl2,rt.45h,64%,或1-芘甲酸,HATU,DIPEA,DMF,0℃至rt,5h,74%；f）2-氰基乙基-N,N’-(二异丙基)-氯代亚磷酰胺,20%DIPEA在CH2Cl2中,rt.22h,67%；g）1-芘乙酸,EDC·HCl,CH2Cl2,rt,3.5h,79%；h）2-氰基乙基-N,N’-(二异丙基)-氯代亚磷酰胺,DIPEA,CH2Cl2,rt,71%。
根据反应图式4，单体51W从核苷50使用无水吡啶中的9-芴基甲氧基羰基氯（Fmoc-Cl），在0℃反应6h来合成，并以51%的得率分离。使用无水二氯甲烷中的2-氰基乙基-N,N’-(二异丙基)-氯代亚磷酰胺和二异丙基乙基胺将核苷51W转变成相应的酰胺52W，其在寡核苷酸合成期间使用。
芘基甲基衍生物51X从核苷50通过还原胺化，使用1,2-二氯乙烷中的芘甲醛和三乙酰氧基硼氢化钠在室温下反应24h来合成，并且以60%的得率分离。使用无水二氯甲烷中的2-氰基乙基-N,N’-(二异丙基)-氯代亚磷酰胺和20%二异丙基乙基胺，将官能化的核苷51X转变成相应的酰胺52X，其在寡核苷酸合成期间使用。
通过1-乙基-3-(3-二甲基-氨基-丙基)-碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）介导的偶联，来形成51Y的酰胺键。通过将双环核苷50溶解在无水二氯甲烷中并加入芘甲酸和EDC·HCl来进行反应。将反应混合物在室温下搅拌45h。随后对反应混合物进行标准的水相整理和纯化，以64%的得率分离核苷51Y。使用无水二氯甲烷中的2-氰基乙基-N,N’-(二异丙基)-氯代亚磷酰胺和20%二异丙基乙基胺将核苷51Y转变成相应的亚磷酰胺52Y。
此外，通过添加芘甲酸和EDC·HCl将双环核苷50转变成单体51Z。将反应混合物在室温下搅拌2.5h并进行标准的水相整理和纯化，以79%的得率分离核苷51Z。使用无水二氯甲烷中的2-氰基乙基-N,N’-(二异丙基)-氯代亚磷酰胺和二异丙基乙基胺将核苷51Z转变成相应的亚磷酰胺52Z。
此外公开了其中R4组成部分被选择为胸腺嘧啶的实施方式。用于合成具有R4=胸腺嘧啶的单体的示例性方法示出在下面的反应图式5中。参见T.S.Kumar,A.S.Madsen,M.E.S.P.Sau,J.Wengel和P.J.Hrdlicka*，“官能化2’-氨基-α-L-LNA——用于DNA靶向的嵌入剂的定点定位”（Functionalized2′-Amino-α-L-LNA-DirectedPositioning of Intercalators for DNA Targeting），J.Org.Chem.2009,74,1070-1081，其通过参考并入本文。
反应图式5
参考反应图式5，O5’-三苯甲基化双环核苷54，其可以从可商购的二丙酮-α-D-葡萄糖，在包含8个层析纯化步骤的超过17个步骤内以5%的总体得率获得，并被用作合成N2’-官能化的2’-氨基-α-L-LNA亚磷酰胺58Q-58Z的适合的起始原料。对本公开单体进行选择以探测核酸内的可用结构空间，并且所述单体可以根据N2’-组成部分的性质分成两组（例如具有下的非芳香族单元的单体[单体58Q、58S和58V]或具有芳香族单元的单体[单体58W-58Z]）。仲胺54的用乙醛或1-芘甲醛的三乙酰氧基硼氢化钠介导的还原胺化，分别以48%和67%的得率提供叔胺56S和56W。氨基醇54的化学选择性N-酰基化使用两种不同策略来实现。用略微过量的乙酸酐处理氨基醇54，然后使用稀甲醇氨选择性O3’-脱酰基化，以两个步骤88%的出色得率提供核苷56V。氨基醇54的使用1-芘基甲酸、1-芘基乙酸或4-(1-芘基)丁酸的EDC介导的偶联，分别以62%、86%和63%的得率产生核苷56X、56Y和56Z。使用HATU介导的偶联程序以便将56X的得率提高到90%。添加D2O后可交换的3′-OH质子的1H NMR信号的消失，证实了核苷56S-56Z的N2′-官能化的构造，随后使用2-氰基乙基N,N′-(二异丙基)-氯代亚磷酰胺和二异丙基乙基胺（Hünig’s碱）将所述核苷转变成相应的亚磷酰胺58S-58Z。尽管酰胺58S-58Y以良好至出色的得率获得（60-90%），但58Z以36%的得率获得。使用二氯甲烷中的双(N,N-二异丙基氨基)-2-氰基乙氧基膦并使用二异丙基四唑铵作为激活剂来提高58X的得率。
其他公开的实施方式涉及未闭锁单体以及在这些单体的制造方法。在具体公开的实施方式中，未闭锁单体可以从特定化合物分大约三步来制造。制造未闭锁单体的方法的具体的示例性实施方式示出在反应图式6中。
反应图式6
根据反应图式6，双环核苷60可以通过本领域普通技术人员已知的方法例如例如路易斯酸介导的开环和/或热催化的亲核加成，转变成核苷62。在具体公开的实施方式中，可以使用醇、硫醇或胺进行反应图式6中所示的开环。这些试剂可以与路易斯酸例如硼烷组合，并加热以促进官能化和双环核苷60转变成核苷62。随后，可以将核苷62转变成被保护的核苷64，其然后可以被进一步保护以产生单体66。此外，根据反应图式6，可以将核苷62转变成在C2’位置处具有双官能化Y2’组成部分的化合物，例如化合物68，其可以通过本领域已知的方法，例如通过开环和官能化操作来制造。为了制造单体70，可以将化合物68暴露于本领域普通技术人员已知的偶联条件，例如但不限于活化偶联和碱介导的偶联。在具体公开的实施方式中，活化剂例如N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI）、二环己基碳二亚胺（DCC）、羰基二咪唑（CDI）、1-羟基苯并三唑（HOBt）、1-羟基-7-氮杂-苯并三唑（HOAt）和o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU）可以用于活化偶联中。在某些公开的实施方式中，偶联的核苷也可以通过用碱例如脂族胺碱（例如三乙胺、1,8-二氮杂双环十一-7-烯、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷和二异丙基乙基胺）和亲电试剂例如包含R4组成部分和离去基团的化合物处理核苷68来获得，其中所述离去基团可以选自卤化物、甲磺酸、三氟甲磺酸和甲苯磺酸。单体70通过碱介导的官能化来制造。在某些实施方式中，将任选的连接物插入到Y与R5和/或R6之间。
在反应图式6中所示的通用方法中，可以使用硫类似物。这种方法的实例示出在下面的反应图式6A中，其中使用亲核试剂R5YH和碱（例如NaH）来引入硫亲核试剂。
反应图式6A
在具体公开的实施方式中，单体可以使用在下面的反应图式7中示出的方法来合成。本领域普通技术人员将会认识到，反应图式7的方法仅仅是示例性的而不打算是限制性的。
反应图式7A
根据反应图式7A，将2,2’-脱水尿苷70用纯净酚类例如2-萘酚和1-芘酚处理，分别以25%和44%的得率产生O2’-芳基化的尿苷72W和72X。对这种方法进行改造以便通过用三(芘-1-基甲基)或三(晕苯-1-基甲基)硼烷（在向硼烷添加芘-1-基甲醇或晕苯-1-基甲醇后原位产生的）处理双环核苷70，来获得核苷72Y和72Z。这种修改以可重复的得率得到核苷72Y和72Z。随后的O5’-二甲氧基三苯甲基化以47-78%的得率产生核苷74W-74Z，其在用2-氰基乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺（PCl试剂）和二异丙基乙基胺（Hünig’s碱）处理后以74-78%的得率提供目标亚磷酰胺76W-76Z（反应图式7）。
反应图式7B提供了通过这种方法获得的单体的其他实例。
反应图式7B
制造本公开单体的其他具体公开的实施方式示出在反应图式8和9中。参考反应图式8，并考虑128向130W的示例性转变，某些实施方式使用O2’烷基化，通常地使用卤代烷烃和碱，例如芳基甲基卤化物和氢化钠。
反应图式8
反应图式9
本公开单体的示例性实施方式也可以使用反应图式10中示出的方法来获得。根据反应图式10，甲基胺核苷80（从5’-O-二甲氧基三苯甲基-2,2’-脱水尿苷以三步～73%的得率制成）可以经历直接N2’-烷基化，使用芘-1-基甲基氯，以46%的得率产生所需产物82Q。有趣的是，80的使用1-芘甲醛和三乙酰氧基硼氢化钠或氰基硼氢化钠的还原胺化不能以适合的得率产生82Q，这是由于主要形成相应的环状N2’,O3’-半酰胺醚。尽管通过将80的O3’-位预先保护成TBDMS-醚避免了这种副产物的形成，但增加的空间位阻在随后的还原胺化期间引起低得率。
反应图式10
仍参考反应图式10，核苷80与1-芘甲酸之间的HATU介导的偶联以78%的得率产生N2’-酰基化核苷82S，而核苷80与1-芘乙酸之间的EDC介导的偶联以83%的得率提供82V。随后使用与用于76W-76Z的合成相似的条件进行82Q/82S/82V的O3’-亚磷酰化，仅以中等得率（42-57%）产生亚磷酰胺84Q/84S/84V，推测是由N2’-位置处的空间位阻增加造成的。
参考反应图式11，使用芳香族醛（例如1-芘甲醛、3-苝甲醛或1-晕苯甲醛）还原胺化220以43-95%的得率产生222。随后，经还原胺化的222的N-甲基化以89-99%的得率产生224（注意，224X=82Q并且226X=84Q）。随后的O3’-亚磷酰化（例如使用氰基乙基N,N-二异丙基-氯-亚磷酰胺，即PCl试剂）以62-90%的得率提供226。
反应图式11
其他公开的实施方式涉及包含三唑组成部分的单体，其中所述三唑组成部分允许核苷与各种R5组成部分偶联。反应图式12和13示出了制造包含三唑组成部分的单体的示例性实施方式。反应图式12示出了用于制造在三唑组成部分的生产中使用的必需偶联试剂的示例性方法，反应图式13示出了如何将这些偶联试剂最终使用在三唑合成中。
反应图式12
参考反应图式12，按照本领域中容易知道的方法制备2,2,2-三氟-N-(丙-2-炔基)乙酰胺96、1-乙炔基芘98和N-(丙-2-炔基)芘-1-甲酰胺100。相反，通过显著不同的方法获得1-(芘-1-基)-丙-2-炔-1-酮92和4-(芘-1-基)-丁-1-炔94。根据反应图式12，MgC≡CTMS（从THF中的三甲基甲硅烷基丙炔和MeMgBr原位产生）向芘-1-甲醛的亲核加成，然后使用碳酸钾脱甲硅烷化，以58%的得率提供90。随后的Jones氧化以75%的得率提供92。类似地，HC≡CCH2ZnBr（从THF中的炔丙基溴和活性锌原位产生）向芘-1-甲醛的亲核加成，然后使用三氟化硼乙醚合物和三乙基甲硅烷对得到的高炔丙基醇进行脱氧合，以31%的得率产生94。
反应图式13
参考反应图式13，102与端位炔92-100之间的室温反应以高得率（60-83%）提供相应的三唑104V-104Z，例外的是包含1-乙炔基芘98的反应，其需要加热（75℃）才能以35%的得率产生核苷104W（反应图式2）。随后使用2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基二氨基磷酸酯（PN2试剂）和1H-四唑作为激活剂，将核苷104V-104Z转变成亚磷酰胺106V-106Z（得率为51-67%）。
其他公开的实施方式涉及包含假互补核苷碱基（尤其是包含C2-硫尿嘧啶作为核苷碱基组成部分的核苷碱基）的单体。参考反应图式14，核苷82Q（=224X）上的保护基团操将其以55%的得率转变成核苷260。碱介导的脱水核苷形成及其亲和切割，以52%的得率提供262。其O5’-保护提供264，其在用硫源处理后产生2-硫尿嘧啶衍生物266。随后使用标准条件的O3’-亚磷酸化产生酰胺268，作为寡核苷酸合成的适合的结构单元。
反应图式14
VI.制造本公开探针的实施方式的方法
本公开的实施方式涉及能够识别靶、尤其是双链DNA靶的探针的制造方法。在具体公开的实施方式中，探针是包含至少一对单体的核酸双链体，所述单体能够降低双链体的热稳定性，从而促进双链体的两条链的解离。
在某些公开的实施方式中，探针可能能够鉴定等序列核酸序列。例如，可以通过首先鉴定所需靶例如特定核酸序列，然后通过开发具有能够与所述靶Watson-Crick碱基配对的核苷酸的探针以构建与这样的序列互补的探针，来制造探针。探针可以被修饰成具有至少一对单体，而等序列靶缺少这样的修饰。
在具体公开的实施方式中，通过将本文公开的一个或多个单体转变成寡核苷酸来构建探针，其中将所述单体与一个或多个天然或非天然核苷碱基偶联，以形成修饰的寡核苷酸。探针可以被设计成双链DNA探针（例如通过磷酸酯组成部分结合在一起的单体和天然和/或非天然核苷碱基）、双链硫代磷酸酯-DNA探针（例如通过一个或多个硫代磷酸酯组成部分结合在一起的单体和天然和/或非天然核苷碱基）、三唑连接的DNA或RNA探针、未修饰的RNA探针、修饰的RNA探针和/或现在已知或后面发现或制造的其他非天然DNA/RNA链。
反应图式14示出了用于制造探针的方法的具体的公开实施方式。按照反应图式14，可以使用本领域普通技术人员已知的方法，例如通过使用核酸合成仪，将单体合并到寡核苷酸中。参考反应图式15，可以将单体110转变成寡核苷酸112，其中波浪线表示可以偶联一个或多个天然或非天然核苷酸和/或其他一致或不同单体的位置。反应图式14中示出的转化可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法来获得，例如通过使用活化剂例如咪唑、三唑或四唑化合物和氧化剂例如碘或过氧化物。具体的实施方式利用二氰基咪唑作为活化剂。过氧化物的实例包括但不限于过氧化氢或叔丁基过氧化氢。
反应图式15
具体公开的实施方式可以涉及按照反应图式16中示出的方法制造本公开探针。
反应图式16
按照反应图式16，通过机器辅助的固相DNA合成，使用活化剂例如选自4,5-二氰基咪唑and5-(双-3,5-三氟甲基苯基)-1H-四唑的活化剂，在约1分钟至约40分钟、更通常地约10分钟至约35分钟的时间段中，将嵌入剂官能化的亚磷酰胺120W-120Z、120Q-120V、122W-122Z和124W-124Y（本领域普通技术人员将会认识到这可以适用于所有本公开单体的实施方式）合并到寡核苷酸中。
具体实施方式涉及同时包含一个或多个本公开单体和一个或多个不配对或凸出部单体的探针。按照反应图式17，通过机器辅助的固相DNA合成，按照供应商的推荐和/或以与对本公开的嵌入剂官能化单体所描述的等同的方式，将不配对或凸出部单体402-4、402-9和402-N合并到寡核苷酸中。
反应图式17
为了确定本文公开的探针的效率，可以使用模拟生理离子强度（[Na+]=110mM，表8和9）的中盐缓冲液，通过UV热变性实验来评估探针对互补DNA或RNA靶的热亲和性。在具体公开的实施方式中，变性曲线可以展现出反曲单相变化，例如图4-5中示出的示例性实施方式。除非另外提到，否则修饰的双链体的热变性温度（Tm值）的变化相对于未修饰的参比双链体的Tm值来讨论。
某些实施方式要求单链探针包含本公开的单体。目前相信，某些本公开单体对单链核酸靶、更通常为单链DNA产生明显提高的热亲和性。例如，用闭锁单体126W-Z修饰的9-mer寡核苷酸（ON）相对于未修饰的ON，对互补DNA表现出格外高的热亲和性（ΔTm高达+19.5℃，表8）。
不受一种操作理论的限制，具有短连接物的单体的掺入，与具有长连接物的单体相比显得产生更高的双链体稳定性（126X>126Y>>126Z）；并且不受一种操作理论的限制，具有酰基连接物的单体似乎比具有烷基连接物的单体优选（126X>126W）。对于用N2'-芘-官能化的2'-氨基-α-L-LNA腺嘌呤单体124X和124Y修饰的ON来说，似乎观察到显著相近的趋势（表9）。
用2'-氧-α-L-LNA胸腺嘧啶单体O单独修饰的对照ON（即不含嵌入剂）对DNA互补体仅表现出适度增加的热亲和性（参见表8）。用官能化的2’-氨基-α-L-LNA胸腺嘧啶单体N（即不含嵌入剂）修饰的ON对DNA也显示出低的热亲和性（参见表8）。这表明本公开单体的嵌入剂具有稳定化作用。
不受单一理论的限制，目前相信，在包含单体120Q-120V的探针的DNA双链体热稳定化中观察到的趋势，表明嵌入剂组成部分通过N2’-烷基连接物附连的单体比使用N2’-烷酰基连接物的单体优选（将120S1-120S5的ΔTm/mod=-6.0至+4.0℃与120Q1-120Q5的数据进行比较，表8），并且如在用2’-N-(芘-1-基甲基羰基)-2’-氨基尿苷单体120V修饰的寡核苷酸中那样延长呋喃糖与嵌入剂组成部分之间的N2’-烷酰基连接物，部分地逆转了N2’-酰基化对DNA双链体热稳定性的不利影响（单体120S→单体120V，ΔTm/mod=-0.5至+6.5℃，表8）。此外，不受限于单一操作理论，目前相信刚性的2’-N-烷酰基连接物将嵌入剂置于对增加亲和性的嵌入来说不适合的位置中，和/或连接物溶剂化的提高使单链状态稳定，使杂交变得在能量上不太有利。
不受限于单一操作理论，目前相信，在用未闭锁单体例如单体120Q或120Y修饰的ON的DNA亲和性中观察到的趋势，与使用闭锁单体例如126W-126Z获得的趋势基本上相似（表8）。对于用带有腺嘌呤作为核苷碱基的单体120’W和124X修饰的探针来说，观察到显著相似的趋势（表9）。
表8
包含某些本公开单体的探针与互补DΝΑ之间的双链体的ΔTm值a
aΔTm=相对于未修饰的参比双链体D1:D2（Tm≡29.5℃）的Tm值变化；Tm值被确定为在中盐缓冲液（[Na+]=110mM，[Cl-]=100mM，pH7.0（NaH2PO4/Na2HPO4））中，使用1.0μM的每条链记录的变性曲线（A260相对于T）的一阶导数最大值。Tm值是在1.0℃内的至少两个测量值的平均值；A=腺嘌呤-9-基DNA单体，C=胞嘧啶-1-基DNA单体，G=鸟嘌呤-9-基DNA单体，T=胸腺嘧啶-1-基DNA单体。“-”=未测定。
表9
包含某些本公开单体的探针与互补DΝΑ之间的双链体的ΔTm值a
aΔTm=相对于未修饰的参比双链体D1:D2（Tm≡29.5℃）的Tm值变化；实验条件参见表8。
在具体公开的实施方式中，其他单体的DNA热亲和性的结果可以从ΔTm/mod=-13.0℃变化到+20.0℃（表10）。这些结果还建议了下述理论，即增加嵌入剂表面积导致DNA双链体热稳定性的进一步提高（对包含单体120Y与120Z的探针的数据进行比较，表8和10），并且缩短呋喃糖与嵌入剂组成部分之间的连接物产生明显更低的DNA亲和性（对包含单体120Y与120X的探针的数据进行比较，表8和10）。此外，目前相信，芳香族化合物表面积的同时减小导致DNA双链体热稳定性的进一步降低（对包含单体120X与120W的探针的数据进行比较，表8和10）。
表10
包含某些本公开单体的探针与互补DΝΑ之间的双链体的ΔTm值a
aΔTm=相对于未修饰的参比双链体D1:D2（Tm≡29.5℃）的Tm值变化；实验条件参见表8。
某些实施方式要求双链探针具有本公开单体的链间拉链排列方式，例如表11中示出的排列方式，其导致探针的去稳定。各自用一个或多个本公开单体修饰的两个单链探针对杂交后的双链体热稳定性的影响，相对于相应的单修饰双链体来说，可以是加和、高于加和或低于加和的。这可以通过用于探针ONX:ONY的术语“与加和的偏差”（DA）来容易地评估，所述DA被定义为：
DAONX:ONY≡ΔTm(ONX:ONY)–[ΔTm(ONX:DNA X)+ΔTm(DNA Y:ONY)]
其中ONX:ONY是具有链间单体排列方式的双链体，“DNA X”和“DNA Y”分别是ONX和ONY的互补DNA。规则如下：对于加和影响来说DA～0℃，对于高于加和影响来说DA>>0℃，对于低于加和影响来说DA<<0℃（也参见定义）。术语热优势TA与DA极为相关，即TA=-DA（也参见定义）。双链探针可能表现出大的正TA（或大的负DA）。在一方为探针-靶双链体与另一方为双链核酸靶（更通常为dsDNA）和探针之间的这种能量差，可以为通过图1中所示的方法识别双链靶区域（更通常为dsDNA靶区域）提供驱动力。
具体实施方式要求双链探针具有表11和12中所示的本公开单体的+1链间拉链排列方式（也参见定义），其表现出显著的dsDNA靶向潜力，正如由高的负DA值（DA在-40℃与-12℃之间）所证实的。其他实施方式要求双链探针具有嵌入剂修饰的单体的+2拉链排列方式，其也表现出负的DA值，尽管所述值一般明显小于具有+1拉链单体排列方式的探针。具有链间拉链排列方式（例如+4、-1和-3）的其他探针表现出较不常规和/或显著的dsDNA靶向潜力，正如由中等负值至中等正值范围内的DNA值（DA在-8.5℃至+4℃之间）所指示的。不受限于单一操作理论，具有本公开单体的+1链间排列方式的探针表现出靶向等序列dsDNA区域的显著潜力，并且能够通过图1中概述的方法靶向等序列双链核酸区域，更通常为双链DNA。
具有采取+1排列方式的两个常规的2'-氧-α-L-LNA胸腺嘧啶单体O或2’-氨基-α-L-LNA胸腺嘧啶单体N的对照双链体，表现出～0℃的DA值。这暗示了dsDNA靶向潜力由嵌入剂组成部分的主动参与产生。
表11
具有本公开单体的某些链间拉链排列方式的双链探针的ΔTm和DA值a
aΔTm=相对于未修饰的参比双链体D1:D2（Tm≡29.5℃）的Tm值变化；实验条件参见表8。
表12
具有本公开单体的某些链间拉链排列方式的双链探针的ΔTm和DA值a
aΔTm=相对于未修饰的参比双链体D1:D2（Tm≡29.5℃）的Tm值变化；实验条件参见表8。
某些实施方式要求双链探针具有本公开单体的“混合的”链间排列方式。具有124X和124Y的“混合的”链间排列方式的双链探针是这种实施方式的一个代表性实例（例如一条链用2'-氨基-α-L-LNA单体124X修饰，另一条链用2'-氨基-α-L-LNA单体124Y修饰，表13）。对这些双链探针观察到明显负的DA值。例如，具有“混合的”+1拉链的探针表现出-19.5℃至-23.0℃之间的DA值（表13）。不受限于单一操作理论，具有由不同单体构成的+1拉链的探针表现出显著的dsDNA靶向潜力，并且能够入土1中所述靶向dsDNA区域。
表13
具有单体124X和单体124Y的“混合的”链间排列方式的双链探针的ΔTm和DA值a
aΔTm=相对于未修饰的参比双链体D1:D2（Tm≡29.5℃）的Tm值变化；实验条件参见表8。
某些实施方式要求在双链探针中，一条链用包含胸腺嘧啶核苷碱基的一个或多个单体修饰，另一条链用包含腺嘌呤核苷碱基的一个或多个单体修饰。一条链用胸腺嘧啶单体（126W或126X）并且另一条链用腺嘌呤单体（124X或124Y）修饰的双链探针的具体实施方式提供在表14-17中。具有0或+2链间单体排列方式的探针通常表现出显著负的DA值（DA值在-22℃至-10℃之间），表明通过图1-2中示出的方法靶向双链核酸靶、更通常为dsDNA的显著潜力。具有-2链间排列方式的探针表现出～0℃的DA值。不受限于单一操作理论，具有本公开单体的0、+1或+2链间拉链排列方式的探针可能表现出对靶向双链核酸、更通常为dsDNA的显著潜力，并且可能能够如图1中所示靶向dsDNA。
表14
具有包含单体126W和单体124X的“混合的”链间拉链的所选双链探针的ΔTm和DA值a
aΔTm=相对于未修饰的参比双链体D1:D2（Tm≡29.5℃）的Tm值变化；实验条件参见表8。
表15
具有包含单体126X和单体124Y的“混合的”链间拉链的所选DNA双链体的ΔTm和DA值a
aΔTm=相对于未修饰的参比双链体D1:D2（Tm≡29.5℃）的Tm值变化；实验条件参见表8。
表16
具有包含单体126X和单体124X的“混合的”链间拉链的所选DNA双链体的ΔTm和DA值a
aΔTm=相对于未修饰的参比双链体D1:D2（Tm≡29.5℃）的Tm值变化；实验条件参见表8。
表17
具有包含单体126W和单体124Y的“混合的”链间拉链的所选DNA双链体的ΔTm和DA值a
aΔTm=相对于未修饰的参比双链体D1:D2（Tm≡29.5℃）的Tm值变化；实验条件参见表8。
其他实施方式包括具有单体208W-Z的+1链间拉链排列方式的双链探针（表18）。
表18
某些本公开探针的热变性性质和dsDNA靶向潜力
实验条件参见表8。
参考上面的表18.模型，给出了模型DNA双链体靶（6列中的第2列）、探针（6列中的第3列）、包含上方（6列中的第4列）或下方探针链（6列中的第5列）的探针-靶双链体的热变性温度。因此，具有单体的+1链间拉链排列方式的探针（第3列）与模型DNA双链体靶（第2列；注意第3列中的负ΔTm值）相比表现出相近或更低的热稳定性，而探针-靶双链体（第4和5列）可以被极大稳定化（注意高的正ΔTm值）。不限于单一操作理论，具有单体120Y/208X/208Y/208Z的+1链间排列方式的探针表现出显著的正的热优势（TA）值，并且因此表现出通过图1-2中概述的方法靶向双链核酸靶、更通常为dsDNA的显著潜力。
要求双链探针具有某些本公开单体的+1链间拉链排列方式的其他具体实施方式提供在下面的表19中。不受限于单一操作理论，具有单体228X-Z的+1链间排列方式的探针表现出明显正的热优势（TA）值，并且因此表现出通过图1-2中概述的方法靶向双链核酸靶、更通常为dsDNA的显著潜力。
表19
具有包含某些本公开单体的+1链间拉链排列方式的双链探针的示例性实施方式
实验条件参见表8。
基于单体120Y的探针工作实施方式的其他实例提供在下面的表20中。表20提供了模型DNA双链体靶（7列中的第6列）、探针（7列中的第5列）、包含上方（7列中的第3列）或下方探针链（7列中的第4列）的探针-靶双链体[即来自于dsDNA识别的模型产物]的热变性温度。具有单体的一种+1链间拉链排列方式的探针（前4个记录）与未修饰的dsDNA（表示靶；注意第5列中负的ΔTm值）相比表现出相似或更低的热稳定性，而探针-靶双链体（第3和4列）表现出远远更大的稳定作用（注意高的正ΔTm值）。正如前面指出的，具有其他链间排列方式的探针可以表现出较低的正的（或甚至负的）TA值，并因此可以表现出较低的dsDNA靶向潜力（即这一表中的记录）。具有本公开单体的两种或更多种+1链间排列方式的探针（底部6个记录），可能表现出非常高的TA值，表明通过图1-2中示出的方法靶向双链靶、更通常为dsDNA靶区域的显著潜力。
表20
基于单体120Y（=T）的示例性探针
具体实施方式涉及具有本公开单体、在某些特定情况下单体120Y和120”W的0-排列方式的探针。这样的探针可以表现出-1℃至+27℃范围内的可变TA值，证实了所述探针可以表现出通过图1-2中概述的方法靶向双链核酸靶、更通常为dsDNA靶的显著潜力。
表21
具有0-拉链链间排列方式的某些探针的热变性性质，其中T为120Y并且A为120’W
表22-24概述了包含未闭锁单体并靶向不同DNA区域即第二胰岛素[INSB]、PPARγ和CEBP启动子的其他探针的其他工作实施方式的热变性性质。此外，给出了下列热变性温度：模型DNA双链体靶（6列中的第5列），探针（6列中的第4列），包含上方（6列中的第2列）或下方探针链（6列中的第3列）的探针-靶双链体[来自于dsDNA识别的产物]。具有单体的一种或多种+1链间拉链排列方式的探针相对于未修饰的dsDNA表现出范围从强烈去稳定化到中度稳定化的可变的热稳定性（注意ΔTm值为-18至+8℃，第4列）。探针-靶双链体（第2和3列）被极大稳定化（注意高的正ΔTm值）。所有探针表现出正的热优势（TA）。具有两个或更多+1链间单体排列方式的探针与具有单一+1链间单体排列方式的探针相比，表现出更大的TA值（以及因此更大的dsDNA靶向潜力）。不受限于单一操作理论，具有单体的一种以上+1拉链排列方式的探针便于dsDNA靶向。
表22
靶向第二胰岛素启动子[INSB]的探针，其中Y=120Y并且X=120Q
表23
用于PPARγ的探针的其他实例
其中T=120Y；A=120’W；并且C=140’X
表24
用于CEBP的探针的其他实例
其中T=120Y；A=120’W；C=140’X；并且G=140’Y
下面的表25-27描述了可用于来自于某些动物和人的单个细胞或多细胞集合体，更通常为来自于某些动物和人的体细胞、精细胞或胚胎、甚至更通常为来自于牛科动物的体细胞、精细胞或胚胎的性别决定的探针的热变性性质。
与前面相同，所述探针与相应的未修饰的双链DNA靶相比表现出明显更低至适度更高范围内的热稳定性（注意，ΔTm值为-13℃至+9℃；第4列），而探针-靶双链体（第2和3列）明显更加热稳定（+5至+24℃范围内）。因此，所有探针（具有2至5个+1拉链单体排列方式的探针）表现出明显正的TA值，表明靶向双链核酸靶、更通常为dsDNA的明显潜力。
表25
示例性探针的热变性性质
其中T=120Y；A=120’W；C=140’X并且G=140’Y
特定实施方式的另一个工作实例提供在下面的表26中，其示出了用未闭锁单体120Q修饰的探针的热变性性质和TA值。观察到了与对其他本公开单体所看到的相似的模式，即探针表现出相对低的热稳定性，而探针-靶双链体具有明显更高的热稳定性。因此，含有未闭锁单体120Q的一个或多个+1拉链排列方式的探针表现出明显正的TA值，并因此表现出靶向双链核酸靶、更通常为dsDNA靶的明显潜力。
表26
用未闭锁单体120Q修饰的探针的热变性性质和TA值
特定实施方式要求双链探针具有包含所谓的假互补核苷碱基（例如2-硫尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷和吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮）的单体的某些拉链排列方式，更通常为包含假互补核苷碱基的单体的+1拉链排列方式，甚至更通常为单体例如270的+1拉链排列方式。这些特定实施方式的工作实例提供在下面的表27中。
其他特定实施方式要求双链探针具有包含核苷碱基的单体的某些拉链排列方式（更通常为+1拉链），此外，其中与包含假互补核苷碱基的本公开单体相对的核苷酸，是包含假互补核苷碱基（例如2-硫尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷和吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮）的核苷酸或本公开单体。对于代表性工作实例来说，请参见下面表29的记录2和4，其中D是具有2,6-二氨基嘌呤核苷碱基的DNA单体（即2,6-二氨基嘌呤-2’-脱氧核糖核苷）。参考下面的表27，观察到具有单体270的-1或+1拉链排列方式的双链探针表现出正的TA值，因此表现出通过图1-2中公开的方法靶向双链核酸靶、更通常为dsDNA的明显潜力。进一步参考下面的表27，观察到具有单体270的-1或+1拉链排列方式并且另外其中与单体270相反的核苷酸是D的双链探针表现出正的TA值，并且因此表现出通过图1-2中公开的方法靶向双链核酸靶、更通常为dsDNA的明显潜力。
表27
具有单体270的-1或+1拉链排列方式的双链探针
具体实施方式要求双链探针同时包含本公开单体的一种或多种排列方式和一个或多个不配对单体（图3b）。这样的实施方式的工作实例在下面提供。表28涉及含有不配对凸出部的18-mer探针的热杂交性质和dsDNA靶向潜力，所述探针具有下列通用结构：
5’-GG(120Y)GGT CAA L CTA TC(120Y)GGA
3’-CCA(140’X)CA GGT L GAT AGA(140’X)CT
其中“L”表示不配对单体；在具体工作实例中，L选自单体402-4、402-9和402-N。参考下面的表28，“4”、“9”和“N”分别表示单个402-4、402-9和402-N的掺入。“444”、“999”和“NNN”分别表示三个连续的402-4、402-9和402-N的掺入。仍参考下面的表28，第3列中的“上方”、“下方”和“两条”分别表示凸出单体仅包含在上方探针链中、仅包含在下方探针链中还是包含在两条探针链中。
继续参考下面表28中的数据，将一个或两个不配对凸出部导入到双链探针中，相对于被称为对照探针的不含不配对凸出部的相应双链探针极大地降低探针热稳定性（注，探针的Tm值低于第一行第3列中示出的对照探针[即凸出部=无]所观察到的60.5℃）。尽管相对于对照探针，探针-靶双链体的稳定性也降低（注意，第4和5列中的Tm值接近或低于第3列中的Tm值），但包含一个或两个不配对凸出部的探针显示出正的TA值；在下面示出的工作实例中，几种包含一个或两个不配对凸出部的探针与第1行中示出的对照探针相比，显示出明显相近或更大的TA值，表明通过图1-2中公开的方法靶向双链核酸靶、更通常为dsDNA的显著潜力。
表28
包含含有不配对单体的探针的双链体的热变性性质和TA值
这种实施方式的其他工作实例示出在下面的表29中，其示出了包含单体120Y（=T）和不配对单体402-9（=9）的13-mer双链探针的热杂交性质和dsDNA靶向潜力。在探针末端附近引入一个或两个不配对单体402-9导致探针热稳定性极大降低（注意，所有Tm值低于第1行第2列中示出的对照探针所观察到的45℃）。尽管相对于对照探针，探针-靶双链体的稳定性也降低（注意，第3和4列中的Tm值接近或低于第1行第3列中的Tm值），但除了一个探针之外的所有探针都具有正的TA值。不受限于操作理论，这表明在朝向探针末端具有一个或多个凸出部的探针，表现出通过图1-2中示出的方法靶向双链核酸靶、更通常为dsDNA的显著潜力。
表29
包含单体120Y的13-Mer双链探针的热杂交性质和dsDNA靶向潜力
表30
示例性探针的热变性性质
其中T=120Y；A=120’W；C=140’X并且G=140’Y
上面的表30示出了这一实施方式的其他工作实例。被设计用于牛科动物细胞性别鉴定的包含不配对单体4（402-4）、9（402-9）或N（402-N）凸出部的探针的杂交性质和dsDNA靶向潜力示出在表30中，其中A=120’W，C=140’X，G=140’Y，并且T=120Y。
VII.本公开探针的实施方式的使用方法
在具体公开的实施方式中，本公开探针能够与靶结合。本公开探针包含以+/-n拉链排列方式排列的至少一对单体，所述排列方式允许所述单体影响探针的热稳定性。某些拉链排列方式即-1、0、+1和+2拉链排列方式，但是更通常地+1拉链排列方式，为探针提供足够的热动力学不稳定性，使得在存在显著互补的双链核酸靶、更通常地dsDNA的情况下，探针双链体的两条链解离，从而与靶结合。在具体公开的实施方式中，探针的两条分离的链将参加与靶核酸、更通常地dsDNA的两条链的核苷酸的Watson-Crick碱基配对。在具体公开的实施方式中，探针可用于诊断技术中，例如生物标志物、癌基因、性别特异性基因等的鉴定，和/或活细胞、胚胎、器官和组织中双链DNA的直接检测，和/或诱导基因组DNA的位点特异性突变、重组或修复以及基因表达的位点特异性调节（即上调或下调）。探针不限于使用在这些技术中，因此这个名单仅仅意味着示例性而不是限制性的。在具体公开的实施方式中，可以使用本领域普通技术人员已知的方法将探针预先退火。然后向靶例如双链DNA靶加入预先退火的探针。
具体公开的实施方式涉及使用本公开探针来抑制转录。本公开探针可以被设计成具有至少一对单体。在具体公开的实施方式中，探针被设计成具有两对单体，其中两对单体可以一致或不同，并且相隔0或更多个天然或非天然核苷酸，例如本文公开的单体。在具体公开的实施方式中，单体对包含至少两个非闭锁或闭锁单体，其用嵌入剂官能化并以+1拉链排列方式排列。
探针可以被设计成靶向特定等序列核酸靶——不论是合成的还是生物来源的，例如本文中公开的任何等序列核酸靶。在某些公开的实施方式中，核酸靶可以是PGEM-Teasy质粒上的SP6和T7启动子，其可以与或者可以不与翻译起始位点重叠。参考这一具体公开的实施方式，将含有insb-cDNA的pGEM-T-Easy载体用SpeI或SacII线性化并用于体外转录反应，以合成分别由T7或SP6启动子驱动的cRNA（图18）。将线性化的质粒与下列dsDNA靶向剂温育：靶向SP6启动子的阳性对照（商购的Zorro LNA），或所选的靶向SP6或T7启动子的本公开探针（图19）。在温育以促进阳性对照和探针的结合后，通过与核糖核苷酸三磷酸、缓冲液和T7或SP6聚合酶温育，来启动体外转录。将cRNA产物反转录成cDNA。在终点PCR中使用被设计用于检测240碱基的插入复制子的引物，并将产物通过凝胶电泳进行解析。这一具体公开的实施方式的结果示出在图20中，其中第1和9道示出了DNA梯（增量为100bp）；第2道示出了在SpeI消化的质粒中，在不存在对照或探针的情况下形成的T7驱动的产物；第3到示出了SacII消化的质粒，其不产生T7驱动的产物；第4道示出了在SpeI消化的质粒中，探针的特定实施方式结合于T7启动子并阻止T7驱动的产物的形成；第5道示出了在SacII消化的质粒中，在不存在阳性对照或探针的情况下形成SP6驱动的产物。也参考图20，第6-8道示出了在SacII处理的质粒中，Zorro LNA（第6道）、本公开探针的一种实施方式（第7道）或本公开探针的不同实施方式（第8道）结合于SP6启动子，并阻止SP6驱动的产物的形成。本公开的方法设想了其他靶，例如在活细胞系中靶向染色体孕酮受体、雌激素受体和任何其他生物相关靶的基因抑制。在具体公开的实施方式中，本公开的探针可用于动物性别鉴定，例如有蹄类动物、反刍动物、更具体地牛科动物、马科动物和猪的性别鉴定，这是因为探针可以被设计成选择性靶向性别特异性DNA区。性别特异性DNA区的实例在本领域中是已知的。参见例如WO2009079456以及Brown,Kim H.,Irvin R.Schultz,J.G.Cloud和James J.Nagler(2008)“暴露于环境雌激素17a-炔雌醇的虹鳟鱼中非整倍体精子的形成”（Aneuploid SpermFormation in Rainbow Trout Exposed to the Environmental Estrogen17a-乙炔基estradiol），PNAS(USA),105:19786-19791，二者通过参考并入本文。在具体公开的实施方式中，探针可以被设计成包含一对或多对本公开单体，并具有与靶细胞的对某些遗传性状、例如性别特异性的特定基因等序列的核苷酸序列。在某些公开的实施方式中，探针包含选自本文公开的单体的实施方式、例如反应图式16的实施方式的一对或多对本公开单体，并且可以含有0个或更多不配对单体例如402-4、402-9或402-9。在具体公开的实施方式中，探针可用于确定动物及其细胞（特别是精细胞）、器官、组织和胚胎的性别。具体实施方式能够对来自于食品生产和运动育种中使用的动物的纯种早期胚胎进行性别决定。
在使用本公开探针的另一种公开的实施方式中，进行转染质粒细胞内测定法。将Beta TC-6细胞（ATCC，CRL-11506）用[pGL4.10(luc2/-374insb)]和内部转染对照载体[pGL4.74(hRluc/TK)]共转染（图21）。在质粒共转染后24h，转染靶向insb启动子的包含至少一对闭锁单体的探针。在这种具体公开的实施方式中，每个孔使用2μg探针（6孔板格式）。添加探针后24h（90-100%合生）收获细胞，并使用双重萤光素酶测定系统（Promega）测定萤火虫和海肾萤光素酶活性，以确定探针介导的抗基因活性的效率和特异性。将萤火虫萤光素酶活性归一化至海肾萤光素酶活性以校正转染变差。归一化的萤火虫萤光素酶活性相对于混杂的对照探针来表示。在三个独立场合下重复一式三份进行的实验。对于剂量响应研究来说，将细胞用每个孔0.1、1.0或5.0μg特定探针进行一式三份转染。参考这一转染研究和图22，探针的特定实施方式（即仅包含一对闭锁单体的探针）没有显示出萤光素酶活性的可检测的降低。包含超过一对闭锁单体的两种不同探针显示出效果（萤光素酶活性减低10-30%）。还调查了剂量依赖性研究，其显示出探针的特定实施方式在最高剂量下表现出效果，特定实施方式表现出剂量响应性效果，其他实施方式随着剂量增加表现出逆向效能的迹象。这些结果示出在图23中。
在具体公开的实施方式中，探针可用于靶向等序列双链DNA双链体或其结构类似物。例如，等序列靶双链体的两条链可以通过连接物例如多核苷酸连接，以产生具有发夹构型的双链体（图24）。在示例性实施方式中，连接物包含10个胸苷，其中发夹靶的茎是探针识别的首要区域。在具体公开的实施方式中，核酸靶可以包含或者可以不包含一个或多个多嘌呤单元，在某些公开的实施方式中，发夹结构的靶双链体的分子内本性提高了双链体的Tm值，使其成为与线性dsDNA靶相比更具挑战性的靶。探针识别和侵入（或缔合）复合体的能力可以使用电泳迁移率改变测定法来分析。
在示例性实施方式中，使用包含至少一对单体的(+1)链间拉链探针的能力来靶向发夹靶。按照图25，本公开探针的发夹侵入产生具有较慢迁移速率的探针-靶复合体，例如在图25的A-D道中所示。如图25中所示，向靶添加的探针的浓度影响形成探针-靶复合体的能力。在具体公开的实施方式中，约5倍至约500倍过量的本公开探针可以导致探针-靶复合体形成；甚至更通常地，约5倍至约50倍过量的本公开探针导致显著的探针-靶复合体形成。按照图25，A-E道表示使用不同过量探针的样品，其中道A表示500倍过量的探针，道B表示100倍过量的探针，道C表示50倍过量的探针，道D表示10倍过量的探针，道E表示5倍过量的探针。在具体公开的实施方式中，可以将任何本公开的单体合并到探针中。
在示例性实施方式中，使用单体124X、124Y、126W、126X、126Y、126Z、120Q、120S、120V、120Y和120’W在探针内形成(+1)链间拉链。这些实施方式的工作实例给出在图30中。因此，具有本公开单体的+1排列方式的探针，识别结构化和地高辛标记的dsDNA靶，所述靶包含等序列双链靶区域，其在一侧通过单链T10环（SL1，图30b）连接。这种靶（SL）结构的单分子本性导致双链区的广泛热稳定性[Tm(SL1)=56.0℃相比于Tm(D1:D2)=29.5℃]。126W2:126W5与结构化的dsDNA靶SL1的温育（20℃下3h），导致形成在15%非变性PAGE凝胶上与SL1相比具有更低电泳迁移率的识别复合体（图30c）。观察到明显的剂量响应性区室；当使用5倍过量的126W2:126W5时观察到痕量复合体形成，而100倍过量的126W2:126W5产生～48%的识别（图30c；表31，其中对于除了124X和120’W之外的所有情况来说，探针是：
5’-GTG ABA TGC
3’-CAC TAB ACG
其中B是本公开单体。对于124X和120’W来说，探针是：
5’-GTG BTA TGC
3’-CAC TBT ACG
其中B是本公开单体；图31）。对于探针120Q2:120Q5（图30D，表31，图31）和除了120S2:120S5与120V2:120V5（表31）之外的所有其他评估的探针（表31，图31）来说，观察到类似的结果。这包括具有闭锁胸腺嘧啶单体126X和126Y、未闭锁的基于尿嘧啶的单体120Y和120Q、以及基于腺嘌呤的单体124X和120’W的+1链间排列方式的探针。因此，在示例性实施方式中，单体120S和120V不产生探针-靶复合体，并且发现单体124X侵入发夹双链体的效率较低，而其他单体表现出显著的探针-靶复合体形成。不受限于单一操作理论，目前相信单体120S、120V和124X的反应性能够归因于热稳定性较低的探针-靶双链体的形成。在示例性实施方式中，发夹侵入在25μM探针时达到饱和点，此时约50%至约75%的发夹被靶向。使用5μM探针的发夹侵入的百分率的其他结果概述在下面的表31中。
表31
在100倍过量的探针下，各种侵入双链体的发夹侵入效率a
a3次独立测定的平均值
在具体公开的实施方式中，本公开探针侵入或缔合靶的能力，可以通过将其反应性与对照探针的反应性进行比较来评估。例如，混合序列的发夹靶与未修饰的等序列DNA双链体的温育未显示出任何复合体形成，即使使用高达500倍过量的未修饰的DNA双链体。此外，发夹靶与包含双链探针的任一单链探针前体的温育没有表现出显著的复合体形成（图26D和E）。另外，探针的序列特异性可以通过本领域普通技术人员已知的方法来确定。在示例性实施方式中，对单或双突变但准确碱基配对的发夹进行靶向。在这些特定实施方式中没有观察到探针-靶复合体，即使在100倍（5uM）过量的探针下，从而证实了高的靶特异性（图26A和B）。
进行了对照实验的具体实例以验证方法并评估结合特异性（图30e-h）：a）向结构化DNA靶SL1添加高达500倍过量的未修饰的DNA双链体D1:D2（3小时，20℃）不能产生识别复合体，这强调了本公开单体的+1链间排列方式对dsDNA靶向的关键作用（图30e）；b）向结构化DNA靶SL1添加100倍过量的单链126W2/126W5/120Q2/120Q5/120P2/120P5/120’W6/120’W8（3小时，20℃）不能产生识别复合体，其证实了探针的两条链都能进行dsDNA识别（图30f；图32）；并且c）向以完全碱基配对但非等序列茎结构[相对于探针一个或两个碱基对偏差；Tm(SL2)=57.0℃；Tm(SL3)=64.5℃]为特征的结构化DNA靶SL2或SL3添加100倍过量的探针126W2:126W5、120Q2:120Q5、126X2:126X5、120Y2:120Y5或124X6:124X8（3h，20℃），不能形成识别复合体，证实了方法是非常特异性的（图30g和30h；图33）。
VIII.工作实例
通用实验部分：除非另外注明，否则试剂和溶剂为可商购的分析级，并且不需进一步纯化而使用。使用60-80℃馏程的石油醚。将溶剂在活性分子筛上干燥：乙腈和THFCH2Cl2，1,2-二氯乙烷，N,N’-二异丙基乙基胺和无水DMSO“无水”溶剂的水含量在Karl-Fisher装置上验证。当使用无水溶剂时，反应在氩气下进行。反应通过TLC监测，使用带有荧光指示剂（SiO2-60，F-254）的硅胶涂层板，所述指示剂在a）UV光下和/或b）通过浸泡在含有5%浓H2SO4的无水乙醇（v/v）中然后加热来可视化。使用硅胶60（粒径0.040–0.063mm），使用中等压力（压力球）进行硅胶柱层析。溶剂的蒸发在减压下，在低于45℃的温度下进行。在柱层析后，将适合的级份合并、蒸发并在高真空下干燥至少12h，以通过1D NMR技术确定的高纯度（>95%）给出得到的产物。1H NMR(500MHz)、13C NMR(125.6MHz)和/或31P NMR(121.5MHz)的化学位移相对于氘化溶剂或其他内部标准（对于31P NMR来说，80%磷）来报告。可交换的（ex）质子通过添加D2O后信号的消失来检测。NMR光谱的指派基于2D光谱（HSQC，COSY）和DEPT光谱。季碳没有在13C NMR中指派，而是从HSQC和DEPT光谱（不存在信号）验证。化合物的MALDI-HRMS图谱在Q-TOF质谱仪上，使用2,5-二羟基苯甲酸（DHB）作为基质并使用聚乙二醇（PEG600）作为内部校准标准品来记录。
9-[2-O-乙酰基-3-O-苯甲基-5-O-甲磺酰基-4-C-甲磺酰氧基-甲基]-α-L-苏型-呋喃戊糖基-6-N-苯甲酰基腺嘌呤（32）。将苯甲酰化腺嘌呤（28.6g，120mmol）和偶联糖30α/β（40.6g，80mmol）与1,2-DCE（2×150mL）共蒸发，重新溶解在无水1,2-DCE（270mL）中，并加入BSA（49.2mL,0.20mol）。将异质混合物加热回流直至变得均质。在冷却至室温后，加入TMSOTf（43.1mL，0.24mol）并将反应混合物加热回流70h。在冷却至室温后，将混合物倒入sat.aq.NaHCO3/碎冰（500mL，1:1，v/v）中。为了控制起泡，加入另外的碎冰（400mL），并将混合物搅拌30min，在此期间形成沉淀物。通过过滤除去沉淀物，并将滤液用CH2Cl2（1.5L）洗涤。将合并的有机相用sat.aq.NaHCO3洗涤（2×500mL），并将水性相用CH2Cl2反萃取（2×500mL）。将有机相蒸发以得到粗品黄色泡沫，将其通过硅胶柱层析进行纯化（0-10%i-PrOH在CH2Cl2中，v/v），得到作为白色泡沫的靶核苷32（38.3g，70%）。Rf=0.4（5%MeOH在CH2Cl2中，v/v）。MALDI-HRMS m/z712.1380([M+Na]+,C29H31N5O11S2·Na+计算值712.1354)；1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.97(s,1H),8.81(s,1H),8.37(s,1H),8.03(d,2H,J=8.1Hz),7.50-7.65(m,5),7.29-7.38(m,5H),6.45(d,1H,J=2.6Hz),5.95(t,1H,J=2.4Hz),4.78-4.82(d,J=11.7Hz,1H),4.63-4.67(m,3H),4.38-4.43(m,4H),3.28-3.32(d,1H,J=10.6Hz),3.0(s,3H),2.96(s,3H),2.16(s,3H)；13CNMR(75.5MHz,CDCl3)δ169.5,164.6,152.9(ABz),151.6,149.7,141.2(ABz),135.7,133.4,132.8,128.9,128.8,128.7,128.6,128.5,128.4,128.0,127.8,123.0,87.3(C1’),86.0(C4’),81.3(C3’),79.4(C2’),73.3(CH2-Ph),67.4(C5’),65.5(C5”),37.7(OMs),37.6(OMs),20.7(Ac)。
9-(3-O-苯甲基-5-O-甲磺酰基-4-C-甲磺酰氧基甲基-α-L-苏型-呋喃戊糖基)-6-N-苯甲酰基腺嘌呤（34）
使用硝酸胍的小规模程序
胍/硝酸胍（G/GHNO3）的储用溶液按照已发表的程序，通过将硝酸胍（4.91g，40.2mmol）溶解在MeOH:CH2Cl2混合物（450mL，9:1，v/v）中并添加NaOMe（0.24g，4.5mmol）来制备。将完全保护的核苷32（4.66g，6.7mmol）溶解在制备的G/GHNO3溶液（450mL）的等分试样中，并将混合物在室温下搅拌30min，然后加入sat.aq.NH4Cl（200mL），导致白色沉淀物的形成。过滤掉形成的沉淀物，并用CH2Cl2重复洗涤，直至通过TLC在滤液中不能检测到糖残留物。将滤液在减压下浓缩，将水性相用CH2Cl2洗涤（5×200mL）并将合并的有机相蒸发，得到浅黄色固体。将粗品固体通过硅胶柱层析进行纯化（0-4%MeOH在CH2Cl2中，v/v），得到作为白色泡沫的醇34（3.84g，88%）。Rf：0.5（10%MeOH在CH2Cl2中，v/v）。
使用1/2sat.甲醇氨的大规模方法
将完全保护的核苷32（30.42g，44mmol）溶解在MeOH（706mL）中并将溶液冷却至0℃，随后加入sat.甲醇氨（353mL）。将反应混合物在室温搅拌2.5h，随后将反应混合物蒸发，并将得到的残留物与无水EtOH：甲苯共蒸发（2×500mL，1:1，v/v）。将固体残留物通过硅胶柱层析进行纯化（0-2.5%MeOH在CH2Cl2中，v/v），得到作为白色泡沫的靶醇34（23.81g，84%）。Rf：0.5（10%MeOH在CH2Cl2中，v/v）。MALDI-HRMS m/z670.1234([M+Na]+,C27H29N5O10S2·Na+计算值647.1248)；1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.21(s,1H),8.47(s,1H),8.29(s,1H),7.97(d,2H,J=7.7Hz),7.61-7.32(m,9H),6.11(d,1H,J=6.2Hz),5.28(d,1H,J=9.2Hz),4.96(d,1H,J=11.7Hz),4.75(d,1H,J=11.3Hz),4.61(d,1H,J=10.6Hz),4.45-4.25(m,4H),3.03(s,3H),2.90(s,3H)。13C NMR(75.5MHz,CDCl3)δ165.2,152.4(ABz),151.1,148.6,141.9(ABz),136.8,133.2,133.0,128.9,128.6,128.3,127.8,121.7,87.6(C1’),83.0(C4’),81.9(C3’),78.6(C2’),73.2(CH2-Ph),68.4(C5’),68.2(C5”),37.7(OMs),37.4(OMs)。
1-(2-叠氮-3-O-苯甲基-4-C-甲磺酰氧基甲基-5-O-甲磺酰基-2-脱氧-α-L-赤型-呋喃戊糖基)-6-苯甲酰基-腺嘌呤-9-基（36，38）：将醇34（18.6g，30mmol）与吡啶（50mL）共蒸发，随后溶解在无水CH2Cl2（200mL）中。然后将混合物冷却至-78℃，并加入吡啶（7.3mL，90mmol）和三氟甲磺酸酐（9.90mL，60mmol）。将混合物搅拌3h，在此期间允许将其加热至室温。随后加入碎冰（50mL）。将有机相用sat.aq.NaHCO3洗涤（2×50mL），蒸发至干并与无水EtOH（2×50mL）共蒸发，得到粗品浅黄色/棕色固体，其不需进一步纯化用于下一步骤中。将姑且称为三氟甲磺酸酯衍生物36的粗品固体溶解在DMF（300mL）中，并加入NaN3（19.6g，0.3mol）和15-冠-5（6.0mL，30.2mmol）。将反应混合物在室温搅拌15h，此时分析TLC显示出约50%的转化。随后将混合物加热至50℃8h，随后分析TLC显示出完全转化。在冷却至室温后，将混合物过滤以除去过量NaN3。将滤液用EtOAc重复洗涤，并将合并的有机相在减压下浓缩。将合并的混合物转移到盐水（200mL）和EtOAc（200mL）中。进行相分离，并将水性相用EtOAc萃取（4×100mL）。将合并的有机相在减压下蒸发，得到粗品深棕色固体。然后将粗品固体通过硅胶柱层析进行纯化（0-90%EtOAc在石油醚中，v/v），得到作为白色固体的叠氮化物38（17.9g，两步后89%）。Rf：0.4(EtOAc)。IR:2115.6cm-1(-N3)。MALDI-HRMS m/z695.1295([M+Na]+,C27H28N8O9S2·Na+计算值695.1313)；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.30(s,1H,NH,ex),8.79(s,1H,ABz),8.54(s,1H,ABz),8.05(d,2H,J=7.0Hz,Bz),7.53-7.67(m,3H,Bz),7.35-7.47(m,5H,Bn),6.74(d,1H,J=4.4Hz,H-1’),5.20(t,1H,J=4.8Hz,H-2’),4.89(d,1H,J=5.1Hz,H-3’),4.79-4.83(d,1H,J=11.7Hz,H-5’a),4.74-4.78(d,1H,J=11.7Hz,H-5’b),4.69-4.72(d,1H,J=11.4Hz,CH2-Ph),4.47-4.51(d,1H,J=11.4Hz,CH2-Ph),4.42(s,2H,H-5’’),3.28(s,3H,OMs),3.24(s,3H,OMs)。13C NMR(75.5MHz,DMSO-d6)δ151.9(ABz),150.4,142.7(ABz),136.9,133.2,132.5,128.5,128.0,81.9(C1’),81.7(C3’),80.1(C2’),73.5(CH2-Ph),68.3(C5’),61.9(C5”),36.98(OMs),36.94(OMs)。
(1R,3R,4S,7R)-3-(6-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)-7-苯甲氧基-1-甲磺酰氧基-甲基-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷（40）：将叠氮化物衍生物38（35.18g，51.8mmol）溶解在冷却至0℃的THF（500mL）中，并加入aq.NaOH（2M，38.9mL，77.8mmol）和三甲基膦（1M，在THF中，77.8mL，77.8mmol）。将反应混合物搅拌21h，在此期间允许其加热至室温，随后将反应混合物蒸发至干。将得到的粗品残留物转移到盐水（200mL）和EtOAc（200mL）中，并将水性相用MeOH:CH2Cl2洗涤（3×200mL，2:8，v/v）。将合并的有机相蒸发至干，并将粗品通过硅胶柱层析进行纯化（0-5%MeOH在CH2Cl2中，v/v），得到作为黄色/棕色固体的双环核苷40（24.2g，85%）。Rf：0.3(EtOAc)。MALDI-HRMS m/z573.1517([M+Na]+,C26H26N6O6S·Na计算值573.1527)；13C NMR数据与以前的数据不一致。在这里提供校正的数据。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.20(s,1H,NH,ex),8.77(s,1H,ABz),8.73(s,1H,ABz),8.06(d,2H,J=7.0Hz,Bz),7.53-7.67(m,3H,Bz),7.29-7.47(m,5H,Ph),6.52(d,1H,J=1.8Hz,H-1’),4.72-4.76(d,1H,J=11.7Hz,CH2Ph),4.62-4.67(d,1H,J=11.7Hz,CH2Ph),4.57-4.60(d,1H,J=11.7Hz,H-5a’),4.49-4.53(d,1H,J=11.7Hz,H-5b’),4.44(s,1H,H-3’),3.92(m,1H,H-2’),3.24-3.30(m,1H,H5a”与H2O重叠)3.23(s,3H,OMs),3.10-3.13(d,1H,J=9.89Hz,H-5b’’).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ165.5,152.0,151.4(ABz),150.0,143.1(ABz),137.8,133.3,132.3(Ar),128.4(Ar),128.2(Ar),127.6(Ar),127.5(Ar),125.0,87.1,84.3(C-1’),80.3(C-3’),71.0(CH2-Ph),66.8(C-5’),59.8(C-2’),51.1(C-5”),36.8(Ms)。
(1R,3R,4S,7R)-3-(6-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)-7-苯甲氧基-1-甲磺酰氧基-甲基-5-三氟乙酰基-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷（42）：将胺衍生物40（8.68g，15.8mmol）与吡啶（2×20mL）共蒸发并溶解在无水CH2Cl2（200mL）中。加入无水吡啶（5.09mL，63mmol），将混合物冷却至0℃并加入三氟乙酸酐（4.45mL，31.5mmol）。将反应混合物搅拌2h，然后加入碎冰（50mL）。将有机相用sat.aq.NaHCO3洗涤（2×50mL），并将水相用CH2Cl2（2×100mL）和MeOH:CH2Cl2（100mL，2:8，v/v）反萃取。将合并的有机相蒸发至干，与甲苯（50mL）共蒸发，并与无水EtOH：甲苯（50mL，1:1，v/v）共蒸发一次。将粗品残留物通过硅胶柱层析进行纯化（0-100%EtOAc在石油醚中，v/v）得到作为白色泡沫的完全保护的核苷42（6.27g，62%）。Rf：0.5（10%MeOH:EtOAc，v/v）。旋转异构体的混合物的物理数据：MALDI-HRMS m/z647.1541([M+H]+,C28H25F3N6O7S·H计算值647.1530)；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.21(s,0.5H,NH,ex),11.19(s,0.5H,NH,ex),8.78(s,0.5H,ABz),8.76(s,0.5H,ABz),8.64(s,0.5H,ABz),8.60(s,0.5H,ABz),8.05(d,2H,J=7.0Hz,Bz),7.52-7.67(m,3H,Bz),7.31-7.41(m,5H,Ph),6.83(d,0.5H,J=1.1Hz,H-1’),6.80(d,0.5H,J=1.1Hz,H-1’),5.26(s,0.5H,H-2’),5.17(s,0.5H,H-2’),4.84(s,1H,H-3’),4.82(s,0.5H,H-3’),4.62-4.79(m,4H,CH2Ph,H5”),4.53(d,0.5H,J=10.6Hz,H-5’),4.35(d,0.5H,J=12.1Hz,H-5’),4.07(d,0.5H,J=10.6Hz,H-5’),3.90(d,0.5H,J=12.1Hz,H-5’),3.28(s,3H,OMs)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ165.5,155.2(q,J=36.6Hz,COCF3),154.8(q,J=36.6Hz,COCF3),151.8(ABz),151.6(ABz),151.5,150.3,150.26,141.2(ABz),141.0(ABz),137.1,137.0,133.2,132.4(Ar),128.4(Ar),128.38(Ar),128.36(Ar),128.32(Ar),127.9(Ar),127.8(Ar),127.5(Ar),125.4,125.2,115.5(q,J=288Hz,CF3),115.2(q,J=288Hz,CF3),86.15(C-4’),86.14(C-4’),84.9(C-1’),84.8(C-1’),83.9(C-2’),79.1(C-3’),77.4(C-3’),71.6(CH2Ph),65.3(C-5”),65.0(C-5”),63.0(C-2’),61.4(C-2’),53.2(C-5’),53.07(C-5’)53.05(C-5’),37.0(OMs)。19F NMR(376MHz,DMSO-d6)δ-71.3,-72.1。
(1R,3R,4S,7R)-3-(6-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)-7-羟基-1-甲磺酰氧基-甲基-5-三氟乙酰基-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷（44）：将完全保护的核苷42（19.63g，30.4mmol）与1,2-DCE（3×100mL）共蒸发并溶解在无水CH2Cl2（610mL）中。将溶液冷却至-78℃，然后加入BCl3（在己烷中的1M溶液，370mL，370mmol）。将反应混合物搅拌17h，在此期间允许其加热至室温。然后将反应混合物冷却至0℃并加入碎冰（800mL）。进行相分离，将有机相用sat.aq.NaHCO3洗涤（2×300mL）。将水相用EtOAc反萃取（4×500mL），并将合并的有机相在减压下蒸发。将得到的残留物使用硅胶柱层析进行纯化（0-20%MeOH在CH2Cl2中，v/v），得到作为白色固体的靶醇44（14.65g，87%）。Rf：0.3（50%丙酮在CH2Cl2中，v/v）。旋转异构体的混合物的物理数据：MALDI-HRMS m/z579.0871([M+Na]+,C21H19F3N6O7S·Na计算值579.0880)；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.21(s,1H,NH,ex),8.76(s,0.5H,ABz),8.75(s,0.5H,ABz),8.61(s,0.5H,ABz),8.56(s,0.5H,ABz),8.04(d,2H,J=7.7Hz,Bz),7.51-7.67(m,3H,Bz),6.83(d,0.5,J=1.37Hz,H-1’),6.80(d,0.5H,J=1.37Hz,H-1’),6.73(d,0.5H,J=4.12Hz,3’-OH,ex),6.69(d,0.5H,J=4.12Hz,3’-OH,ex),4.91(br s,0.5H,H-2’),4.81(d,0.5H,J=4.12Hz,H-3’),4.76(d,0.5H,J=4.12Hz,H-3’),4.70(br s,0.5H,H-2’),4.60-4.67(m,2H,H-5”),4.46(d,0.5H,J=10.3Hz,H-5’),4.26(d,0.5H,J=11.7Hz,H-5’),4.03(d,0.5H,J=10.3Hz,H-5’),3.86(d,0.5H,J=11.7Hz,H-5’),3.29(s,3H,OMs)；13C NMR(75.5MHz,DMSO-d6)δ165.5,155.3(q,J=36.6Hz,COCF3),155.1(q,J=36.6Hz,COCF3),151.7(ABz),151.5(ABz),150.3,150.2,141.2(ABz),141.0(ABz),133.3,132.4,128.4,125.4,125.2,115.5(q,J=288Hz,CF3),115.2(q,J=288Hz,CF3),87.0(C-4’),85.7(C-4’),84.7(C-1’),83.8(C-1’),72.5(C-3’),70.6(C-3’),65.7(C-5”),65.4(C-5”),65.3(C-2’),63.6(C-2’),52.7(C-5’),52.6(C-5’),36.97(OMs)。19F NMR(376MHz,DMSO-d6)δ-71.1,-72.1。
(1S,3R,4S,7R)-3-(6-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)-1-苯甲酰基甲基-7-羟基-5-三氟-乙酰基-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷（46）：将醇44（5.8g，10.4mmol）溶解在DMF（100mL）中，然后加入NaOBz（2.99g，20.8mmol）和15-冠-5（2.07mL，10.4mmol）。将混合物加热至90℃并搅拌5h，然后允许其冷却至室温并继续搅拌18h。随后，将混合物在真空中浓缩并转移至EtOAc和盐水中。进行相分离，并将水相用EtOAc反萃取（4×200mL）。将合并的有机相在减压下蒸发，得到深棕色固体材料，将其通过硅胶柱层析进行纯化（0-3.5%i-PrOH在CHCl3中，v/v）得到作为白色泡沫的目标苯甲酰基保护的醇46（5.05g，83%）。Rf=0.4（10%i-PrOH在CHCl3中，v/v）。旋转异构体的混合物的物理数据：MALDI-HRMS m/z605.1337([M+Na]+,C27H21F3N6O6·Na计算值605.1367)；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.18(br s,1.7H,NHa,b,ex),8.77(s,1H,ABz a),8.76(s,0.7H,ABz b),8.67(s,0.7H,ABz b),8.63(s,1H,ABz b),8.09-8.18(m,4H,Bz),8.02-8.09(m,4H,Bz),7.51-7.76(m,13.5H,Bz),6.89(d,1H,J=1.65Hz,H1’a),6.86(d,0.7H,J=1.65Hz,H1’b),6.67(d,1H,J=4.12Hz,3’-OHa,ex),6.63(d,0.7H,J=4.12Hz,3’-OHb,ex),4.89-4.96(m,2.4H,H3’a,b,H2’b),4.74-4.82(dd,2H,J=6.04Hz,J=12.65Hz,H5”a),4.68-4.72(m,1H,H2’a),4.58-4.66(dd,1.4H,J=6.04Hz,J=12.65Hz,H5”b),4.55(d,0.7H,J=10.7Hz,H5’b),4.38(d,1H,J=11.53Hz,H5’a),4.10(d,0.7H,J=10.7Hz,H5’b),3.93(d,1H,J=11.53Hz,H5’a)。13C NMR(75.5MHz,DMSO-d6)δ166.5,165.3,155.1(q,COCF3),151.9(ABz),151.7(ABz),151.1,140.3(ABz),140.1(ABz),134.5,134.4,133.5(Bz),131.9(Bz),129.55(Bz),129.54(Bz),129.18,129.17,128.7(Bz),128.4(Bz),128.2(Bz),125.4,125.2,115.5(q,CF3),87.3(C-4’),86.0(C-4’),84.4(C-1’b),83.6(C-1’a),72.9(C-3’a),71.0(C-3’b),65.3(C-2’b),63.6(C-2’a),60.7(C-5”a),60.2(C-5”b),53.0(C-5’a),52.9(C-5’b)。19FNMR(376MHz,DMSO-d6)δ-71.1,-72.0。
(1S,3R,4S,7R)-3-(6-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)-7-羟基-1-羟甲基-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷（48）：将醇46（3.41g，5.85mmol）溶解在1,4-二噁烷:H2O（225mL，2:1，v/v）中并冷却至0℃，然后加入aq.NaOH（2M，17.5mL，35mmol）。将反应混合物搅拌2h，随后加入sat.aq.NH4Cl（25mL），然后将混合物蒸发至干。将得到的粗品吸附在硅胶上并通过硅胶柱层析进行纯化（0-20%MeOH在CH2Cl2中，v/v），得到作为白色固体的目标氨基二醇48（1.33g，60%）。Rf=0.4（20%MeOH在CH2Cl2中，v/v）。MALDI-HRMS m/z405.1294([M+Na]+,C18H18N6O4·Na+计算值405.1282)；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.17(br s,1H,NH,ex),8.73(s,1H,ABz),8.71(s,1H,ABz),8.05(d,2H,J=8.1Hz,Bz),7.49-7.67(m,3H,Bz),6.44(d,1H,J=1.92Hz,H-1’),5.70(d,1H,J=4.0Hz,3’OH,ex),4.82(t,1H,J=5.5Hz,5’-OH,ex),4.30(d,1H,J=4.0Hz,H-3’),3.69(d,2H,J=5.5Hz,H-5’),3.51(s,1H,H-2’),3.15(d,1H,J=10.6Hz,Ha-5’’),2.96(d,1H,J=10.6Hz,Hb-5’’)；13C NMR(75.5MHz,DMSO-d6)δ165.5(C=O),152.0,151.2(ABz),149.8,143.2(ABz),133.3,132.3(Bz),128.4(Bz),125.2,91.3(C-4’),83.9(C-1’),73.4(C-3’),62.2(C-5”),58.3(C-2’),50.6(C-5’)。
(1R,3R,4R,7R)-3-(6-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)-7-羟基-1-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基-甲基)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷（50）：将二醇48（2.47g，6.5mmol）与无水吡啶共蒸发（2×50mL），重新溶解在无水吡啶（130mL）中并冷却至0℃。加入DMTrCl（3.25g，2.7mmol）并将反应混合物搅拌23h，在此期间允许其加热至室温。随后加入MeOH（20mL），将混合物用EtOAc（200mL）稀释，并用sat.aq.NaHCO3洗涤（2×20mL）。在分离两相后，将水相用EtOAc反萃取（4×50mL），并将合并的有机相蒸发至干。将得到的残留物通过硅胶柱层析进行纯化（0-8%MeOH和1%吡啶在CH2Cl2中，v/v），并将得到的产物与无水EtOH：甲苯（2×50mL，1:1，v/v）共蒸发，得到作为白色固体的核苷50（1.51g，34%）。Rf：0.2（7%MeOH在CH2Cl2中，v/v）。MALDI-HRMS m/z707.2609([M+Na]+,C39H36N6O4·Na+计算值707.2589)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.15(br s,1H,NH,ex),8.78(s,1H,ABz),8.73(s,1H,ABz),8.06(d,2H,J=7Hz,Bz),7.52–7.69(m,3H,Bz),7.18–7.46(m,9H,DMTr),6.86-6.93(m,4H,DMTr),6.54(d,1H,J=1.92Hz,H-1’),5.66(d,1H,J=4.67Hz,3’-OH,ex),4.39(d,1H,J=4.94Hz,H-3’),3.74(s,6H,2×OMe),3.48-3.51(m,1H,H-2’),3.31(d,1H,J=10.7Hz,H-5’a),3.26(d,1H,J=10.7Hz,H-5’b),3.16-3.21(m,2H,H-5”a,b),2.89(br s,1H,2’-NH,ex)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ165.5,158.0,152.2,151.3(ABz),149.9,144.8,143.3(ABz),135.5,135.4,133.4,132.3(Ar),129.7(Ar),129.68(Ar),128.4(Ar),128.39(Ar),127.8(Ar),127.7(Ar),126.5(Ar),125.1,113.1(Ar),89.6(C4’),85.1(C1’),84.0,74.0(C-3’),62.2(C-2’),61.2(C5”),54.9(OMe),51.2(C5’)。
*在13C NMR中鉴定到痕量的吡啶杂质（149.5ppm）。
(1S,3R,4S,7R)-3-(6-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)-7-羟基-1-(4,4’-二甲氧基三苯甲基-氧-甲基)-5-(9’-芴基甲氧基羰基)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷51W：将氨基醇50（200mg，0.29mmol）在无水吡啶中共蒸发（2x2mL），并重新溶解在无水吡啶（1.5mL）中。将其冷却至0℃，随后加入9’-芴基甲基氯甲酸酯（100mg，0.38mmol）并允许其达到室温同时搅拌6h。然后将其用EtOAc（30mL）稀释，并用sat.aq.NaHCO3（30mL）洗涤。将水性相用EtOAc反萃取（25mL），将合并的有机相蒸发至干，并与2:1EtOH：甲苯共蒸发（2x6mL）。将得到的粗品通过硅胶柱层析进行纯化（30-100%EtOAc在石油醚中，v/v），得到所谓白色泡沫的目标核苷51W（136mg，51%）。Rf=0.4(EtOAc)。旋转异构体的混合物的物理数据：MALDI-HRMS m/z929.3241([M+Na]+,C54H46N6O8·Na+计算值929.3269)；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.29(br s,2H,ex),8.74(s,1H,ABz),8.72(s,1H,ABz),8.55(s,1H,ABz),8.49(s,1H,ABz),8.02-8.08(m,4H,Bz),7.77–7.88(m,6H,Bz),7.09–7.69(m,40H,DMT,Fmoc),6.90-6.95(m,8H,DMT),6.80(d,1H,J=1.65Hz,H-1’),6.73(d,1H,J=1.65Hz,H-1’),6.25(d,1H,J=4.39Hz,3’-OH,ex),6.22(d,1H,J=4.39Hz,3’-OH,ex),4.50(br s,1H,H-2’),4.45(br s,1H,H-2’),4.22(d,1H,J=6.86,CH2Fmoc),4.15(d,1H,J=6.86,CH2Fmoc),3.87(d,1H,J=6.86,CH2Fmoc),3.83(d,1H,J=6.86,CH2Fmoc),3.73-3.76(m,14H,OCH3,CH(Fmoc)),3.70(d,1H,J=10.5Hz,H-5’),3.62(d,1H,J=10.5Hz,H-5’),3.34-3.43(m,6H,H-5”,H-5’)。13C NMR(75.5MHz,DMSO-d6)δ165.6,158.1,154.7,154.6,151.8(ABz),151.5(ABz),150.3,150.2,144.7,143.7,143.6,143.5,142.8,141.3(ABz),141.2(ABz),140.6,140.4,140.3,135.3,135.2,133.3,132.4,129.7,128.8,128.4,127.9,127.7,127.6,127.5,127.2,127.1,126.9,126.7,125.4,125.2,125.1,124.9,124.6,121.3,119.98,113.2,88.9(C-4’),88.4(C-4’),85.4(C-(Ph)3,DMT),84.9(C-1’),84.7(C-1’),72.5(C-3’),72.0(C-3’),66.7(CH2-Fmoc),63.9(C-2’),63.4(C-2’),60.6(C-5”),60.56(C-5”),54.96(OCH3),52.7(C-5’),52.6(C-5’),46.4(CH,Fmoc),45.9(CH,Fmoc)。
FMOC保护的核苷亚磷酰胺52W：将核苷51W（225mg，0.25mmol）与无水1,2-DCE共蒸发（2×4mL）并重新溶解在无水CH2Cl2（3.5mL）中。加入无水DIPEA（195μL，1.12mmol）和N-甲基咪唑（16μL，0.20mmol），然后逐滴加入2-氰基乙基-N,N’-(二异丙基)-氯代亚磷酰胺（111μL，0.50mmol）。将反应混合物在室温搅拌4h，然后将粗品蒸发至干，将得到的残留物通过硅胶柱层析进行纯化（0-2%MeOH在CH2Cl2中，v/v，最初建立在0.5%Et3N中），并从CH2Cl2/石油醚沉淀，得到作为白色泡沫的目标酰胺酸酯52W（126mg，46%）。旋转异构体的混合物的物理数据：Rf=0.5（5%MeOH在CH2Cl2中，v/v）；HiResESI m/z1129.4356([M+Na]+,C63H63N8O9P·Na+计算值1129.4348)；31P NMR(121MHz,CDCl3)δ150.32,150.26,150.12,149.48。
(1R,3R,4S,7R)-3-(6-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)-7-羟基-1-(4,4’-二甲氧基三苯甲基-氧-甲基)-5-(芘-1-基)甲基-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷（51X）：将核苷50（300mg，0.44mmol）与无水1,2-DCE共蒸发（2×10mL），悬浮在无水CH2Cl2（4.4mL）中并加入芘甲醛（171mg，0.74mmol）和NaBH(OAc)3（186mg，0.88mmol）。将得到的悬液在室温搅拌17h，然后加入sat.aq.NaHCO3（4mL），随后将混合物用CH2Cl2（20mL）稀释。将两相分离，并将有机相用sat.aq.NaHCO3（20mL）洗涤。将得到的水性相用EtOAc反萃取（2×20mL）。将合并的有机相蒸发至干，并将得到的残留物通过硅胶柱层析进行纯化（0-99%EtOAc和1%吡啶在石油醚中，v/v），得到作为白色泡沫的目标核苷51X（268mg，68%）。Rf=0.4(EtOAc)。MALDI-HRMS m/z921.3326([M+Na]+,C56H46N6O6·Na+计算值921.3371)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.13(s,1H,NH,ex),8.46(s,1H,ABz),8.36(s,1H,ABz),7.89-8.16(m,12H,Ar),7.51-7.76(m,9H,Ar),7.12-7.36(m,14H,Ar),6.82(s,3H,DMT),6.78(s,3H,DMT),6.42(s,1H,H-1’),6.07(s,1H,3’-OH,ex),4.66(d,1H,J=12.5Hz,CH2Py),4.51(s,1H,H-3’),4.45(d,1H,J=12.5Hz,CH2Py),3.64(s,6H,2×OMe),3.57(s,1H,H-2’),3.42(d,1H,J=9.6Hz,H-5’),3.17(d,1H,J=9.6Hz,H-5’)。由于与水的信号重叠，来自于H-5’’A+B的信号不可鉴定；13C NMR(75.5MHz,CDCl3)δ164.1,158.6,151.3(ABz),150.5,149.6,148.3,144.4,141.8(ABz),136.1,135.5,135.4,133.7,132.6,132.3,131.1,130.7,130.5,130.0,129.1,128.7,128.0,127.8,127.6,127.2,127.1,127.0,126.8,125.7,125.0,124.8,124.6,124.4,124.1,123.8,122.9,122.6,113.2(DMT),90.2(C-4’)86.5(C-(Ph)3DMT),86.1(C-1’),65.2(C-3’),61.2(C-2’),59.2(C-5”),57.6(C-5’),55.2(OCH3),29.6(CH2Py)。
(1S,3R,4R,7S)-3-(6-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)-膦氧基]-1-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基甲基)-5-(芘-1-基)甲基-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷（52X）：将核苷51X（220mg，0.24mmol）与1,2-DCE共蒸发（2×10mL），溶解在含20%DIPEA的无水CH2Cl2中（4.4mL，v/v），并加入2-氰基乙基-N,N’-(二异丙基)-氯代亚磷酰胺（0.12mL，0.54mmol）。将反应混合物在室温搅拌21h，随后加入另外的2-氰基乙基-N,N’-(二异丙基)-氯代亚磷酰胺（0.05mL，0.06mmol）。然后将反应混合物搅拌4h，随后加入无水EtOH（2mL）。随后将混合物用CH2Cl2（10mL）稀释，并将有机相用sat.aq.NaHCO3（10mL）和盐水（10mL）连续洗涤。在分离两相后，将有机相蒸发至干，并将得到的残留物通过硅胶柱层析进行纯化（0-60%EtOAc和1%吡啶在石油醚中，v/v）。将得到的产物与无水EtOH：甲苯共蒸发（2×10mL，1:1，v/v），得到白色固体，然后将其从HPLC级EtOAc/正己烷沉淀，得到作为白色固体的醇酰胺酸酯52X（136mg，51%）。Rf：0.7（5%MeOH在CH2Cl2中，v/v）。HiResESI m/z1099.4642([M+Na]+,C65H63N8O7P·Na+Calc.1099.4630)。31P NMR(121MHz,CDCl3)δ151.3,149.0。
(1S,3R,4S,7R)-3-(6-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)-7-羟基-1-(4,4’-二甲氧基三苯甲基-氧-甲基)-5-(芘-1-基)羰基-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷（51Y）：将氨基醇50（407mg，0.59mmol）与无水1,2-DCE共蒸发（2×10mL），溶解在无水CH2Cl2（11.9mL）中，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl，226mg，1.19mmol）和1-芘基甲酸（293mg，1.19mmol）。将反应混合物在室温搅拌45h，然后将其用CH2Cl2（50mL）稀释并用水（20mL）洗涤。将两相分离，并将水性相用CH2Cl2反萃取（3×50mL）。将合并的有机相在减压下蒸发，并将得到的残留物通过硅胶柱层析进行纯化（0-99%EtOAc和1%吡啶在石油醚中，v/v）。将得到的产物与无水EtOH：甲苯共蒸发（2×50mL，1:1，v/v），得到作为黄色固体的目标核苷51Y（343mg，64%）。旋转异构体的混合物的物理数据：Rf：0.5（5%MeOH:CH2Cl2，v/v)；MALDI-HRMS m/z935.3138([M+Na]+,C56H44N6O7·Na+计算值935.3164)。在1H-NMR中在6.22ppm处鉴定到未知杂质。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.21(s,1H,NH,ex),11.20(s,1H,NH,ex),8.55(s,1H,ABz),8.53(s,1H,ABz),8.45(s,1H,ABz),8.40(s,1H,ABz),7.97–8.23(m,10H,Ar),7.56–7.84(m,7H,Ar),7.18–7.44(m,10H,Ar),7.09(s,1H,Ar),7.06(s,1H,Ar),6.82–6.90(m,4H,DMTr),6.50(d,1H,J=2.2Hz,H-1’),6.40(d,1H,J=1.8Hz,H-1’),6.15(d,1H,J=4.0Hz,3’-OH,ex),6.07(d,1H,J=3.7Hz,3’-OH,ex),4.42–4.77(m,4H,H-3’,H-5’),3.73(s,12H,2×OMe),3.66(s,2H,H-2’),3.41–3.44(d,1H,J=13.6Hz,H-5’’a),3.15–3.20(d,2H,J=13.6Hz,H-5’’b)；13C NMR(75.5MHz,DMSO-d6)δ165.5,157.9,157.7,151.7,150.98,149.8,148.2,144.7,142.8,140.1,135.4,135.3,133.5,133.1,132.3,130.5,130.2,129.9,129.6,128.8,128.6,128.4,127.8,127.6,127.5,127.3,127.2,126.9,126.5,126.3,125.9,125.5,124.9,124.8,124.78,124.2,123.8,123.7,123.1,113.1,112.7,92.0,90.3,85.1,84.7,79.8,75.3,74.7,66.4,61.2,59.1,58.6,58.3,58.2,54.6。
(1S,3R,4S,7R)-3-(6-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)-7-羟基-1-(4,4’-二甲氧基三苯甲基-氧-甲基)-5-(芘-1-基)羰基-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷（51Y）：将芘-1-甲酸（127mg，0.50mmol）、2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU，166mg，0.44mmol）和二异丙基乙基胺（DIPEA，0.15mL，0.87mmol）溶解在无水DMF（3mL）中，并允许其在室温搅拌1h，然后冷却至0℃。将氨基醇50（230mg，0.34mmol）与无水1,2-DCE共蒸发（2×3mL），重新溶解在无水DMF（3mL）中，并加入到冷却的反应混合物中。在搅拌5h后，将混合物用EtOAc（30mL）稀释并用水洗涤（3x20mL）。将有机层蒸发至干，并将得到的残留物通过硅胶柱层析进行纯化（0–4%MeOH在CH2Cl2中，v/v），得到作为白色固体的化合物51Y（227mg，74%）。旋转异构体的混合物的物理数据：Rf：0.5(5%MeOH:CH2Cl2,v/v)；MALDI-HRMS m/z935.3138([M+Na]+,C56H44N6O7·Na+计算值935.3164)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.32(br s,1.3H,NH,ex),8.85(s,0.3H,ABz),8.79(s,1.3H,ABz),8.75(s,0.3H,ABz),8.02-8.39(m,13.7H,Ar),7.82(m,0.6H,Ar),7.49-7.75(m,6H,Ar),7.10-7.42(m,9.7H,Ar),6.93-6.98(m,4H,DMTa),6.92(d,0.3H,J=1.92Hz,H-1’b),6.72-6.78(m,1.2H,DMTb),6.54(d,0.3H,J=3.57Hz,3’-OHb,ex),6.48(d,1H,J=4.94Hz,3’-OHa,ex),6.44(s,1H,H-1’a),5.22(s,0.3H,H-2’b),4.87(d,0.3H,J=3.56Hz,H-3’b),4.61(d,1H,J=5.21Hz,H-3’a),4.36(d,1H,J=12.08Hz,H-5’a)4.02(d,1H,J=12.08Hz,H-5’a),3.77(s,7H,2x(OCH3)a,H-2’a),3.69(d,0.3H,J=10.43Hz,H-5’b),3.66(s,1H,(OCH3)b),3.64(s,1H,(OCH3)b),3.47(s,2H,H5”a),3.39(d,0.3H,J=10.43Hz,H-5’b),3.18(s,0.6H,H-5”b)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ169.5,169.1,165.8,165.6,158.0,157.9,152.0,151.6,151.23,151.21,150.3,144.7,144.5,141.5(ABz),141.4(ABz),135.4,135.2,135.15,135.11,133.48,132.5(Ar),132.4(Ar),131.3,130.9,130.6,130.5,130.4,130.1,129.9(Ar),129.8(Ar),129.7(Ar),129.6(Ar),128.8(Ar),128.7,128.6(Ar),128.5(Ar),128.49(Ar),128.47,128.2(Ar),128.1(Ar),127.9(Ar),127.8(Ar),127.7(Ar),127.6(Ar),127.1(Ar),126.9(Ar),126.7(Ar),126.6(Ar),126.5(Ar),125.9(Ar),125.8(Ar),125.6(Ar),125.5(Ar),124.8(Ar),124.2(Ar),124.0,123.9(Ar),123.5,123.3,123.1,113.2(DMT),113.06(DMT),113.04(DMT),88.7(C-4’a),88.5(C-4’b),85.4(C-(Ph)3,DMTa),85.3(C-(Ph)3,DMTb),85.0(C-1’b),84.7(C-1’a),72.5(C-3’a),71.8(C-3’b),65.6(C-2’b),62.8(C-2’a),60.5(C-5”a),60.0(C-5”b),55.0(OCH3),54.8(OCH3),54.0(C-5’b),52.2(C-5’a)。
(1S,3R,4S,7R)-3-(6-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)-膦氧基]-1-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基甲基)-5-(芘-1-基)羰基-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷（52Y）：将核苷51Y（300mg，0.33mmol）与1,2-DCE共蒸发（2×5mL），溶解在无水CH2Cl2（2.7mL）和无水DIPEA（0.66mL）中，并加入2-氰基乙基-N,N’-(二异丙基)-氯代亚磷酰胺（0.11mL，0.5mmol）。将反应混合物在室温搅拌22h，随后加入无水EtOH（2mL）。然后将混合物转移至CH2Cl2（50mL）中，并用sat.aq.NaHCO3（50mL）和盐水（50mL）洗涤。将合并的水性相用CH2Cl2反萃取（2×20mL），并将合并的有机相在减压下蒸发。将得到的残留物通过硅胶柱层析进行纯化（0-99%EtOAc和1%吡啶在石油醚中，v/v），将得到的产物与无水EtOH：甲苯共蒸发（2×50mL，1:1，v/v），并从HPLC级EtOAc/正己烷沉淀，得到作为白色泡沫的目标酰胺酸酯52Y（247mg，67%）。旋转异构体的混合物的物理数据：Rf=0.5(EtOAc)；HiResESI m/z1113.4462([M+Na]+,C65H61N8O8P·Na+计算值1113.4422)；31P NMR(121MHz,CDCl3)δ152.3,151.8,150.2。
(1S,3R,4S,7R)-3-(6-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)-7-羟基-1-(4,4’-二甲氧基三苯甲基-氧-甲基)-5-(芘-1-基)乙酰基-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷51Z：将氨基醇50（250mg，0.37mmol）与无水1,2-DCE共蒸发（2×5mL），溶解在无水CH2Cl2（10mL）中，并加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl，108mg，0.55mmol）和1-芘乙酸（145mg，0.55mmol）。将反应混合物在室温下搅拌2.5h，随后将其用CH2Cl2（20mL）稀释并用水洗涤（2x10mL）。将两相分离，并将水性相用CH2Cl2反萃取（10mL）。将合并的有机相在减压下蒸发，并将得到的残留物通过硅胶柱层析进行纯化（0-4%MeOH在CH2Cl2中v/v），得到作为白色固体的目标核苷51Z（266mg，79%）。旋转异构体的混合物的物理数据：Rf:0.5(10%MeOH:CH2Cl2,v/v)；MALDI-HRMS m/z949.3321([M+Na]+,C57H46N6O7·Na+计算值949.3320)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.29(br s,1.5H,NH,ex),8.96(s,1H,ABz a),8.73(s,0.5H,ABz b),8.71(s,1H,ABz a),8.55(s,0.5H,ABz b),7.92-8.33(m,16H,Py,Bz),7.83(m,1H,Py,Bz),7.60-7.79(m,4.5H,Py,Bz),7.44-7.54(m,3.5H,DMT),7.20-7.40(m,10.5H,DMT),6.88-6.98(m,6H,DMT),6.82(d,0.5H,J=1.65Hz,H-1’b),6.79(d,1H,J=1.37Hz,H-1’a),6.31(d,0.5H,J=4.39Hz,3’-OHb,ex),6.19(d,1H,J=4.39Hz,3’-OHa,ex),5.07(s,0.5H,H-2’b),4.71-4.74(m,1.5H,H-2’a,H-3’b),4.67(d,1H,J=10.43,H-5’1a),4.63(d,1H,J=4.39Hz,H-3’a),4.57(d,1H,J=16.2Hz,CH2Pya),4.38(d,1H,J=10.2Hz,CH2Pya),4.11(d,0.5H,J=16.2Hz,CH2Pyb),3.95-4.04(m,1.5H,H-5’1b,H-5’2a),3.66-3.77(m,9.5H,OCH3,H-5’2b),3.34-3.51(m,3.5H,H-5”a,b,CH2Pyb)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ172.7,169.8,169.6,165.5,165.4,158.1,158.0,151.9,151.7(ABz),151.5,151.4(ABz),150.5,150.2,144.7,144.6,141.7(ABz),141.5(ABz),135.5,135.2,133.5,133.4,132.5,130.8,130.7,130.6,130.3,130.2,130.1,129.9,129.88,129.82,129.78,129.77,129.74,129.68,129.67,129.66,129.62,129.4,129.2,128.9,128.8,128.7,128.6,128.5,128.5,128.2,127.8,127.77,127.72,127.4,127.3,127.27,127.25,127.1,126.9,126.8,126.7,126.6,126.2,126.0,125.9,125.4,125.3,125.2,125.0,124.9,124.8,124.76,124.72,124.6,124.5,124.4,124.3,124.0,123.9,123.8,123.78,123.76,123.72,123.6,123.2,113.2(DMT),89.0(C-4’),88.4(C-4’),85.47(C-(Ph)3),85.40(C-(Ph)3),84.7(C-1’a),84.6(C-1’b),72.9(C-3’b),72.0(C-3’a),64.5(C-2’b),61.8(C-2’a),60.9(C-5”a),60.8(C-5”b),55.0(OCH3),54.8(OCH3),52.8(C-5’a),52.3(C-5’b),38.7,37.8(CH2Pya),37.7(CH2Pyb).*在13CNMR中鉴定到痕量的残留1-芘乙酸杂质（172ppm处的C=O，38.7ppm处的CH2，加上额外的芘峰，并耦合于HNMR中的杂质（4.35ppm是与HSQC中的38.7耦合的额外的CH2Py峰））。
(1S,3R,4S,7R)-3-(6-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)-膦氧基]-1-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基甲基)-5-(芘-1-基)乙酰基-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷（52Z）：将核苷51Z（235mg，0.25mmol）与无水1,2-DCE共蒸发（2×5mL）并重新溶解在无水CH2Cl2（5mL）中。加入无水DIPEA（220μL，1.27mmol），随后逐滴加入2-氰基乙基-N,N’-(二异丙基)-氯代亚磷酰胺（115μL，0.51mmol）。将反应混合物在室温下搅拌22h，随后加入无水EtOH（1mL）。将粗品蒸发至干，将得到的残留物通过硅胶柱层析进行纯化（0-2%MeOH在CH2Cl2中v/v），并从CH2Cl2/石油醚沉淀，得到作为白色泡沫的目标酰胺酸酯52Z（203mg，71%）。旋转异构体的混合物的物理数据：Rf=0.6(5%MeOH在CH2Cl2中v/v)；MALDI-HRMS m/z1149.4358([M+Na]+,C66H63N8O8P·Na+计算值1149.4399)；31P NMR(121MHz,CDCl3)δ150.39,150.31,150.26,148.09。
带有闭锁单体124W-124Y的探针的合成：含有掺入的闭锁酰胺酸酯52W、52X和52Y的探针的合成，在自动DNA合成仪上进行（0.2μmol规模），使用下面的手动偶联条件（活化剂；偶联时间；近似偶联得率）：单体124W（吡啶盐酸盐；30min；～82%），单体124X和124Y（吡啶盐酸盐；15min；～95%）。使用32%aq.NH3在55℃2h将探针去保护。探针的纯化（到至少75%的纯度）通过RP-HPLC（DMT-ON）进行，然后去三苯甲基化（80%aq.AcOH，20min）并沉淀（无水EtOH，-18℃，12h）。寡核苷酸的RP-HPLC纯化使用装备有Xterra MS C18柱（10μm，300mm×7.8mm）的Waters Prep LC4000系统来进行。使用DMT-ON纯化寡核苷酸的代表性RP-HPLC梯度方案，是使用100%A缓冲液的等度保持5min，随后使用75min内至55%B缓冲液的线性梯度，流速为1.0mL/min（A缓冲液：95%0.1M NH4HCO3，5%CH3CN；B缓冲液：25%0.1M NH4HCO3，75%CH3CN）。探针的组成通过MALDI-MS分析来验证（表32），而纯度（除非另有指明，否则>80%）使用装备有Gen-Pak Fax柱（100mm×4.6mm）的LaChrom L-7000系统（VWR International）通过离子交换HPLC来验证。代表性方案包括使用95%A缓冲液的等度保持5min，随后使用41min内至70%B缓冲液的线性梯度，流速为0.75mL/min（A缓冲液：25mM Tris-Cl，1mMEDTA，pH8.0；B缓冲液：1M NaCl）。
表32
用腺嘌呤单体124X(=K)或124Y(=L)修饰的代表性单链探针的MS数据a
用单体124W/X/Y修饰的探针的热亲和性：探针对互补的DNA或RNA靶以及探针双链体的热亲和性，通过UV热变性实验来评估（[Na+]=110mM，表33和34）。除非另有陈述，否则修饰的双链体的热变性温度（Tm值）的变化，相对于未修饰的对照双链体的Tm值进行讨论。用单体124W修饰的单链探针对单链DNA显示出与对单链RNA靶相近的热亲和性。用124X和124Y修饰的单链探针对单链DNA显示出比对单链RNA靶更高的热亲和性（表33和34）。这种DNA选择性使这些单体可用作靶向双链DNA的探针。
表33
B6-B11与互补DNA靶之间的双链体的Tm值a
aΔTm=相对于未修饰的参比双链体的Tm变化；Tm被确定为在中盐缓冲液（[Na+]=110mM，[Cl-]=100mM，pH7.0（NaH2PO4/Na2HPO4））中，使用1.0μM每条链记录的熔解曲线（A260相对于T）的一阶导数的最大值。Tm第1.0℃内的至少两个测定值的平均值；A=腺嘌呤-9-基DNA单体，C=胞嘧啶-1-基DNA单体，G=鸟嘌呤-9-基DNA单体，T=胸腺嘧啶-1-基DNA单体。ND=未测定。
表34
B6-B11与互补RNA靶之间的双链体的Tm值a
a热变性实验的条件参见表33。
用单体124W、124X和124Y（B8系列）修饰的单链探针的Watson-Crick特异性，使用在修饰位点的相反位置处含有错配核苷碱基的DNA（表35）或RNA靶（表36）来评估。所有单体在Tm方面显示出出色的辨别力。
表35
通过用单体124W-Y修饰的探针辨别错配的DNA靶a
a热变性实验的条件参见上面的表33。完全匹配的双链体的Tm值用粗体示出。ΔTm=相对于完全匹配的DNA:DNA双链体的Tm变化。
表36
通过用单体124W-Y修饰的探针辨别错配的RNA靶a
a热变性实验的条件参见上面的表33。完全匹配的双链体的Tm值用粗体示出。ΔTm=相对于完全匹配的RNA:DNA双链体的Tm变化。
还评估了双修饰的单链探针对中央错配的DNA靶的特异性（表37）。与未修饰的参比例D1相比，观察到错配辨别力的降低。
表37
通过用单体124X/Y修饰的探针辨别错配的DNA靶a
a热变性实验的条件参见上面的表33。完全匹配的双链体的Tm值用粗体示出。ΔTm=相对于完全匹配的DNA:DNA双链体的Tm变化。ND=未测定
在存在或不存在互补DNA/RNA靶的情况下，用单体124X和124Y修饰的单链探针在300-400 nm范围内的最大吸光度在下面给出（表38）。
表38
在存在或不存在互补DNA/RNA靶的情况下，用单体124X和124Y修饰的单链探针在300-400nm范围内的最大吸光度a
a测量使用分光光度计和光程长度为1.0cm的石英光学比色杯进行。缓冲条件与热变性实验相同。
用于1与酚类（ArOH）之间的偶联以制备72W/72X的通用流程（用于～1.33 mmol规模的描述）：将适合的酚和2,2’-脱水尿苷70置于密封压力管中（底物和试剂的具体量在下面给出）并加热（对于72W来说165℃；对于72X来说175℃），直至分析HPLC表明完全转化（～2h）。将得到的粗品通过硅胶柱层析进行纯化（2-4%MeOH在CH2Cl2中，v/v），得到核苷72W/72X（得率在下面注明）。
2’-O-(萘-2-基)尿苷（72W）：将2,2’-脱水尿苷70（1.00g，4.42mmol）与2-萘酚（2.40g，22.1mmol）的混合物进行反应并如上所述进行纯化，得到作为浅棕色固体的核苷72W（0.41g，25%）。Rf：0.4（10%MeOH在CH2Cl2中，v/v）；MALDI-HRMS m/z393.1039([M+Na]+,C19H18N2O6·Na+,计算值393.1057)；1H NMR(DMSO-d6)δ11.34(s,1H,ex,NH),8.03(1H,d,J=8.1Hz,H6),7.82-7.85(ap d,2H,Nap),7.73-7.75(1H,d,J=8.3Hz,Nap),7.44-7.48(ap t,1H,Nap),7.41(d,1H,J=2.5Hz,Nap),7.34-7.37(ap t,1H,Nap),7.23-7.25(dd,1H,J=9.1Hz,J=2.5Hz,Nap),6.14(d,1H,J=4.9Hz,H1’),5.68(d,1H,J=8.1Hz,H5),5.46(d,1H,ex,J=6.4Hz,3’-OH),5.25(t,1H,ex,J=5.2Hz,5’-OH),5.02(ap t,1H,H2’),4.43-4.46(m,1H,H3’),4.02-4.05(m,1H,H4’),3.74-3.78(m,1H,H5’),3.65-3.69(m,1H,H5’)；13C NMR(DMSO-d6)δ162.9,155.4,150.5,140.4(C6),133.9,129.2(Nap),128.7,127.4(Nap),126.6(Nap),126.4(Nap),123.8(Nap),118.9(Nap),108.9(Nap),102.0(C5),86.4(C1’),85.2(C4’),79.3(C2’),68.2(C3’),60.4(C5’)。
2’-O-(芘-1-基)尿苷（72X）：将2,2’-脱水尿苷70（0.30g，1.33mmol）与1-芘酚19（0.86g，3.97mmol）的混合物进行反应并如上所述进行纯化，得到作为浅黄色固体的核苷72X（0.26g，44%）。Rf：0.4（10%MeOH在CH2Cl2中，v/v）；MALDI-HRMS m/z467.1217([M+Na]+,C25H20N2O6·Na+,计算值467.1214)；1H NMR(DMSO-d6)δ11.36(s,1H,ex,NH),8.45(d,1H,J=9.3Hz,Py),8.20-8.24(m,3H,Py),8.14(d,1H,J=9.3Hz,Py),7.99-8.09(m,4H,H6,Py),7.86(1H,d,J=8.5Hz,Py),6.35(d,1H,J=4.6Hz,H1’),5.68(d,1H,J=8.2Hz,H5),5.63(br s,1H,ex,3’-OH),5.30(br s,1H,ex,5’-OH),5.22-5.25(ap t,1H,H2’),4.55-4.56(m,1H,H3’),4.19-4.21(m,1H,H4’),3.81-3.84(ap d,1H,H5’),3.72-3.75(ap d,1H,H5’)；13C NMR(DMSO-d6)δ162.9,151.7,150.5,140.3(C6),131.0,130.9,127.1(Py),126.4(Py),125.6(Py),125.2,125.0(Py),124.8(Py),124.5(Py),124.3(Py),123.9,121.1(Py),120.1,111.9(Py),102.0(C5),86.6(C1’),85.4(C4’),80.9(C2’),68.5(C3’),60.4(C5’)。
用于1与芳甲基醇（ArCH2OH）之间的偶联以制备72Y/72Z的通用流程（用于～44.2mmol规模的描述）：将适合的芳香族醇（ArCH2OH）、NaHCO3和THF中的1.0M BH3置于压力管中，悬浮在无水DMSO中，并在氩气气氛和室温下搅拌，直至发泡停止（～10min）。此时加入2,2’-脱水尿苷70（底物和试剂的具体量在下面给出），将压力管用氩气吹扫并密封，并将反应在～160℃加热，直至分析TLC表明完全转化（～3h）。此时，将反应混合物倒入水（200mL）中，搅拌30min并用EtOAc（500mL）稀释。将有机相用水洗涤（4×200mL），蒸发至干，并将得到的粗品通过硅胶柱层析进行纯化（2-4%MeOH在CH2Cl2中，v/v）得到残留物，将其从冷丙酮沉淀，获得核苷72Y/72Z（得率在下面注明）。
2’-O-(芘-1-基-甲基)尿苷（72Y）：将2,2’-脱水尿苷70（10.00g，44.2mmol）、芘-1-基甲醇（20.5g，88.4mmol）、NaHCO3（0.73g，8.80mmol）、THF中的1.0M BH3（24.5mL，22.0mmol）和无水DMSO（40mL）如上所述混合、反应、精整并纯化，得到作为白色固体的核苷72Y（5.04g，25%）。Rf：0.4（10%MeOH在CH2Cl2中，v/v）；MALDI-HRMS m/z458.1480([M]+,C26H22N2O6 +,计算值458.1472)；1HNMR(DMSO-d6):δ11.29(s,1H,ex,NH),8.37-8.39(d,1H,J=9.3Hz,Py),8.29-8.31(m,2H,Py),8.24-8.26(d,1H,J=7.7Hz,Py),8.17-8.19(m,3H,Py),8.06-8.12(m,2H,Py),7.82(d,1H,J=8.4Hz,H6),6.04(d,1H,J=5.1Hz,H1’),5.43-5.50(m,2H,H5,CH2Py),5.37(d,1H,ex,J=5.7Hz,3’-OH),5.28-5.30(d,1H,J=12.0Hz,CH2Py),5.11(t,1H,ex,J=4.9Hz,5’-OH),4.26-4.31(m,1H,H3’),4.18-4.21(m,1H,H2’),3.96-3.97(m,1H,H4’),3.64-3.68(m,1H,H5’),3.59-3.62(m,1H,H5’)；13C NMR(DMSO-d6)δ162.9,150.6,140.1(C6),131.4,130.7,130.2,128.7,127.4(Py),127.3(Py),127.0(Py),126.2(Py),125.3(Py),124.5(Py),124.0(Py),123.8,123.5(Py),101.7(C5),86.2(C1’),85.4(C4’),80.9(C2’),69.8(CH2Py),68.5(C3’),60.6(C5’)。
2’-O-(晕苯-1-基-甲基)尿苷（72Z）：将2,2’-脱水尿苷70（1.40g，6.19mmol）、晕苯-1-基甲醇（4.08g，12.4mmol）、NaHCO3（0.104g，1.24mmol）、THF中的1.0M BH3（3.5mL，3.1mmol）和无水DMSO（40mL）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，并做出少量修改。将反应混合物倒入水中后形成的沉淀物通过过滤进行收集，用水洗涤（3×100mL）并通过柱层析进行纯化，得到作为浅黄色固体的核苷72Z（450mg，13%）。Rf：0.4（10%MeOH在CH2Cl2中，v/v）；MALDI-HRMSm/z579.1537([M+Na]+,C34H24N2O6·Na+,计算值579.1532)；1H NMR(DMSO-d6)δ11.30(br d,ex,1H,J=1.9Hz,NH),9.13-9.15(d,1H,J=8.7Hz,Cor),8.93-9.03(m,10H,Cor),7.82(d,1H,J=8.0Hz,H6),6.18(d,1H,J=4.9Hz,H1’),5.85-5.88(d,1H,J=12.1Hz,CH2Cor),5.67-5.69(d,1H,J=12.1Hz,CH2Cor),5.52(d,1H,ex,J=5.5Hz,3’-OH),5.38(dd,1H,J=8.0Hz,1.9Hz,H5),5.11(ap t,1H,ex,5’-OH),4.37-4.43(m,2H,H2’,H3’),4.03-4.06(m,1H,H4’),3.63-3.71(m,2H,H5’)；13C NMR(DMSO-d6)δ162.9,150.6,140.1(C6),132.1,128.2,128.1,127.9,127.4,126.5,126.23(Cor),126.20(Cor),126.1(Cor),126.0(Cor),122.5(Cor),121.8,121.5,121.4,121.23,121.17,101.7(C5),86.3(C1’),85.5(C4’),81.1(C2’),70.7(CH2Cor),68.6(C3’),60.6(C5’)。
用于制备74W-74Z的通用DMTr保护流程（用于～2.2mmol规模的描述）：将适合的核苷72（具体量在下面给出）与无水吡啶（15mL）共蒸发两次，并重新溶解在无水吡啶中。向其加入4,4’-二甲氧基三苯甲基氯（DMTrCl）和N,N-二甲基-4-氨基吡啶（DMAP），并将反应混合物在室温搅拌，直至TLC表明完全转化（～14h）。将反应混合物用CH2Cl2（70mL）稀释，并将有机相用水（2×70mL）和sat.aq.NaHCO3（2×100mL）连续洗涤。将有机相蒸发至接近干燥，将得到的粗品与无水EtOH和甲苯（2:1，v/v，3×6mL）共蒸发，并通过硅胶柱层析进行纯化（0-5%MeOH在CH2Cl2中，v/v），得到核苷74（得率在下面注明）。
2’-O-(萘-2-基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷（74W）：将核苷72W（150mg，0.40mmol）、DMTrCl（240mg，0.60mmol）和无水吡啶（7mL）中的DMAP（～6mg）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为浅黄色泡沫的核苷74W（120mg，47%）。Rf：0.6（5%MeOH在CH2Cl2中v/v）；MALDI-HRMS m/z695.2379([M+Na]+,C40H36N2O8·Na+,计算值695.2364)；1H NMR(DMSO-d6)δ11.40(d,1H,ex,J=2.1Hz,NH),7.83-7.86(m,3H,H6,Nap),7.68(d,1H,J=8.2Hz,Nap),7.24-7.45(m,13H,DMTr,Nap),6.90-6.92(d,4H,J=7.1Hz,DMTr),6.06(d,1H,J=3.2Hz,H1’),5.51(d,1H,ex,J=7.1Hz,3’-OH),5.38-5.40(m,1H,H5),5.12-5.14(m,1H,H2’),4.51-4.55(m,1H,H3’),4.14-4.17(m,1H,H4’),3.75(s,6H,2×CH3O),3.32-3.41(m,2H,H5’)；13C NMR(DMSO-d6)δ162.9,158.1,155.5,150.3,144.6,140.6(C6),135.4,135.2,133.9,129.8(Ar),129.1(Nap),128.8,127.9(Ar),127.7(Ar),127.5(Nap),126.8(Ar),126.6(Nap),126.4(Ar),123.8(Ar),119.0(Ar),113.2(Ar),109.0(Ar),101.8(C5),87.6(C1’),85.9,82.6(C4’),79.1(C2’),68.5(C3’),62.7(C5’),55.0(CH3O)。
2’-O-(芘-1-基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷（74X）：将核苷72X（230mg，0.52mmol）、DMTrCl（0.30g，0.78mmol）和无水吡啶（8mL）中的DMAP（～9mg）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为浅黄色泡沫的核苷74X（0.30g，78%）。Rf：0.6（5%MeOH在CH2Cl2中，v/v）；MALDI-HRMS m/z769.2504([M+Na]+,C46H38N2O8·Na+,计算值769.2520)；1H NMR(DMSO-d6):δ11.32(s,1H,ex,NH),8.49(d,1H,J=9.2Hz,Py),8.20-8.24(m,3H,Py),8.14(d,1H,J=9.2Hz,Py),8.08-8.10(d,1H,J=9.1Hz,Py),7.99-8.04(m,2H,Py),7.86-7.89(m,2H,H6,Py),7.43-7.45(m,2H,DMTr),7.24-7.36(m,7H,DMTr),6.90-6.92(m,4H,DMTr),6.25(d,1H,J=3.2Hz,H1’),5.69(d,1H,ex,J=6.8Hz,3’-OH),5.38(d,1H,J=8.2Hz,H5),5.35-5.37(m,1H,H2’),4.61-4.65(m,1H,H3’),4.34-4.37(m,1H,H4’),3.74(s,6H,2×CH3O),3.46-3.50(m,1H,H5’),3.38-3.41(m,1H,H5’)；13C NMR(DMSO-d6)δ162.9,158.1,151.7,150.3,144.6,140.5(C6),135.4,135.1,131.1,131.0,129.78(DMTr),129.76(DMTr),127.9(DMTr),127.1(Py),126.8(DMTr),126.4(Py),125.6(Py),125.3,125.1(Py),124.9,124.5(Py),124.3(Py),124.0,121.2(Py),120.1,113.2(DMTr),112.3(Py),101.7(C5),87.8(C1’),85.9,82.7(C4’),80.7(C2’),68.7(C3’),62.7(C5’),55.0(CH3O)。
2’-O-(芘-1-基-甲基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷（74Y）：将核苷72Y（1.02g，2.20mmol）、DMTrCl（1.29g，3.30mmol）和无水吡啶（20mL）中的DMAP（～18mg）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为浅黄色泡沫的74Y（1.20g，72%）。Rf：0.6（5%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z783.2698([M+Na]+,C47H40N2O8·Na+,计算值783.2677)；1H NMR(DMSO-d6)δ11.36(d,1H,ex,J=1.9Hz,NH),8.41-8.43(d,1H,J=9.3Hz,Py),8.30-8.32(m,2H,Py),8.14-8.25(m,5H,Py),8.07-8.10(t,1H,J=7.7Hz,Py),7.63(d,1H,J=8.1Hz,H6),7.17-7.34(m,9H,DMTr),6.82-6.86(m,4H,DMTr),6.02(d,1H,J=3.9Hz,H1’),5.48-5.50(d,1H,J=12.1Hz,CH2Py),5.45(d,1H,ex,J=6.3Hz,3’-OH),5.36-5.38(d,1H,J=12.1Hz,CH2Py),5.13(dd,1H,J=8.1Hz,1.9Hz,H5),4.34-4.38(m,1H,H3’),4.21-4.24(m,1H,H2’),4.05-4.09(m,1H,H4’),3.71(s,3H,CH3O),3.69(s,3H,CH3O),3.20-3.24(m,2H,H5’)；13C NMR(DMSO-d6)δ162.8,158.08,158.06,150.4,144.5,140.0(C6),135.3,135.0,131.3,130.7,130.2,129.71(DMTr),129.66(DMTr),128.7,127.8(DMTr),127.6(DMTr),127.4(Py),127.3(Py),127.0(Py),126.7(DMTr),126.2(Py),125.3(Py),124.5(Py),124.0,123.8,123.4(Py),113.20(DMTr),113.17(DMTr),101.4(C5),87.1(C1’),85.9,83.1(C4’),80.6(C2’),69.9(CH2Py),68.7(C3’),62.8(C5’),55.0(CH3O)。
2’-O-(晕苯-1-基-甲基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷（74Z）：将核苷72Z（250mg，0.45mmol）、DMTrCl（262mg，0.67mmol）和无水吡啶（6mL）中的DMAP（～15mg）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为浅黄色泡沫的核苷74Z（245mg，63%）。Rf：0.6（5%MeOH在CH2Cl2中，v/v）；MALDI-HRMS m/z881.2824([M+Na]+,C55H42N2O8·Na+,计算值881.2839)；1H NMR(DMSO-d6)δ11.40(br d,1H,ex,J=1.9Hz,NH),9.14-9.16(d,1H,J=8.8Hz,Cor),8.96-9.02(m,9H,Cor),8.88-8.90(d,1H,J=8.5Hz,Cor),7.63(d,1H,J=8.1Hz,H6),7.29-7.31(d,2H,J=7.4Hz,DMTr),7.11-7.22(m,7H,DMTr),6.74-6.79(m,4H,DMTr),6.18(d,1H,J=4.1Hz,H1’),5.87-5.90(d,1H,J=12.6Hz,CH2Cor),5.75-5.78(d,1H,J=12.6Hz,CH2Cor),5.59(d,1H,ex,J=6.3Hz,3’-OH),5.06(dd,1H,J=8.1Hz,1.9Hz,H5),4.46-4.50(m,1H,H3’),4.40-4.43(m,1H,H2’),4.15-4.18(m,1H,H4’),3.63(s,3H,CH3O),3.58(s,3H,CH3O),3.32-3.34(m,1H,H5’),3.25-3.27(m,1H,H5’)；13CNMR(DMSO-d6)δ162.8,158.02,157.97,150.4,144.4,140.0(C6),135.3,135.0,132.2,129.7(DMTr),129.6(DMTr),128.3,128.2,128.0,127.7(DMTr),127.59(DMTr),127.56,126.61(DMTr),126.59,126.41(Cor),126.36(Cor),126.3(Cor),126.23(Cor),126.21,126.19,126.1(Cor),122.6(Cor),121.9,121.6,121.5,121.4,121.35,121.28,113.13(DMTr),113.09(DMTr),101.4(C5),87.1(C1’),85.9,83.2(C4’),80.7(C2’),70.7(CH2Cor),68.8(C3’),62.8(C5’),54.9(CH3O),54.8(CH3O)。
用于制备4W-4Z的通用亚磷酸化流程（用于～1mmol规模的描述）：将适合的核苷74（底物和试剂的具体量在下面给出）与无水1,2-二氯乙烷（4mL）共蒸发，并重新溶解在无水CH2Cl2中。向其加入N,N-二异丙基乙基胺（DIPEA）和2-氰基乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺（PCl试剂），并将反应混合物在室温搅拌直至TLC表明完全转化（～3h），随后向溶液顺序加入无水EtOH（2mL）和CH2Cl2（20mL）。将有机相用sat.aq.NaHCO3（10mL）洗涤，蒸发至接近干燥，并将得到的残留物通过硅胶柱层析进行纯化（40-70%EtOAc在石油醚中，v/v），得到相应的亚磷酰胺76（得率在下面注明）。
2’-O-(萘-2-基)-3’-O-(N,N-二异丙基氨基-2-氰基乙氧基亚膦酰基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷（76W）：将核苷74W（100mg，0.15mmol）、DIPEA（106μL，0.59mmol）和无水CH2Cl2（1.5mL）中的PCl试剂（66μL，0.23mmol）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为白色泡沫的亚磷酰胺76W（95mg，74%）。Rf：0.8（5%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z895.3462([M+Na]+,C49H53N4O9P·Na+,计算值895.3448)；31P NMR(CDCl3)δ151.0,150.9。
3’-O-(N,N-二异丙基氨基-2-氰基乙氧基亚膦酰基)-2’-O-(芘-1-基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷（76X）：将核苷74X（0.28g，0.38mmol）、DIPEA（268μL，1.50mmol）和无水CH2Cl2（2.5mL）中的PCl试剂（167μL，0.75mmol）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为白色泡沫的亚磷酰胺76X（0.27g，76%）。Rf：0.8（5%MeOH在CH2Cl2中，v/v）；MALDI-HRMS m/z969.3608([M+Na]+,C55H55N4O9P·Na+,计算值969.3604)；31P NMR(CDCl3)δ149.8,149.4。
3’-O-(N,N-二异丙基氨基-2-氰基乙氧基亚膦酰基)-2’-O-(芘-1-基-甲基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷（76Y）：将核苷74Y（0.58g，0.76mmol）、DIPEA（0.53mL，3.05mmol）和无水CH2Cl2（5mL）中的PCl试剂（340μL，1.53mmol）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为白色泡沫的亚磷酰胺76Y（0.56g，76%）。Rf：0.8（5%MeOH在CH2Cl2中v/v）；MALDI-HRMS m/z983.3767([M+Na]+,C56H57N4O9P·Na+,计算值983.3761)；31P NMR(CDCl3)δ150.3,150.2。
2’-O-(晕苯-1-基-甲基)-3’-O-(N,N-二异丙基氨基-2-氰基乙氧基亚膦酰基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷（76Z）：将核苷74Z（240mg，0.28mmol）、DIPEA（200μL。1.11mmol）和无水CH2Cl2（6mL）中的PCl试剂（125μL，0.56mmol）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为浅黄色泡沫的亚磷酰胺76Z（230mg，78%）。Rf：0.8（5%MeOH在CH2Cl2中，v/v）；MALDI-HRMS m/z1081.3864([M+Na]+,C64H59N4O9P·Na+,计算值1081.3917)；31P NMR(CDCl3)δ150.2。
7-新戊基芘-1-基甲基醇：在0℃下将芘（2.0g，9.9mmol）加入到含有无水AlCl3（1.3g，9.0mmol）和2,2,2-三甲基乙酰氯（0.97mL，7.9mmol）的混合物的无水CH2Cl2中。使用硅胶柱层析对黄色粗产物进行纯化，得到作为亮黄色固体的7-(2,2,2-三甲基乙酰基)芘（1.4g，50%）。然后将该中间体在三氟乙酸（3.6mL，49mmol）和三乙基甲硅烷（4.7mL，29.0mmol）存在下还原成7-新戊基芘（1.4g，98%）。Rf：0.8（10%EtOAc在石油醚中，v/v）。在0℃下，向7-新戊基芘（0.9g，3.3mmol）和二氯甲基甲基醚（0.4mL，4.3mmol）在无水CH2Cl2（20mL）的搅拌的溶液加入四氯化钛溶液（0.7mL，6.3mmol）。将混合物倒入大量冰水中并用CH2Cl2萃取。将粗品用硅胶柱层析进行纯化（40%苯在石油醚中，v/v），得到作为黄色固体的7-新戊基芘-1-甲醛（0.9g，91%）。然后使用四氢呋喃（50mL）中的硼氢化钠（0.1g，2.66mmol）将该中间体还原成7-新戊基芘-1-基甲基醇（0.9g，99%）。
6/8-溴芘-1-基甲基醇：在0℃下向1-溴芘（2.6g，9.25mmol）和二氯甲基甲基醚（1.08mL，12.0mmol）在无水CH2Cl2（60mL）中的溶液加入四氯化钛溶液（1.98mL，17.5mmol）。将混合物倒入大量冰水中并用CH2Cl2萃取。将粗品用硅胶柱层析进行纯化（40%苯在石油醚中，v/v），得到作为黄色固体的6-和8-溴芘-1-甲醛（1.4g，49%）的混合物。然后使用四氢呋喃（80mL）中的硼氢化钠（0.17g，4.53mmol）将该中间体还原成6-和8-溴芘-1-基甲基醇的混合物（1.4g，99%）。
8-甲基芘-1-基甲基醇：在0℃下向1-甲基芘（4.3g，19.8mmol）和二氯甲基甲基醚（2.34mL，25.8mmol）在无水CH2Cl2（150mL）中的搅拌的混合物加入四氯化钛溶液（4.26mL，37.7mmol）。将混合物倒入大量冰水中并用CH2Cl2萃取。将粗品用硅胶柱层析进行纯化（40%苯在石油醚中，v/v），得到作为黄色固体的8-甲基芘-1-甲醛（4.0g，83%）。然后使用四氢呋喃（100mL）中的硼氢化钠（0.74g，19.6mmol）将该中间体还原成8-甲基芘-1-基甲基醇（4.0g，99%）。
7-叔丁基-3-甲氧基芘-1-基甲基醇：使用四氢呋喃（30mL）中的硼氢化钠（0.26g，6.94mmol）将7-叔丁基-3-甲氧基芘-1-甲醛（如Yamoto等，Organic Preparation and Procedure International.1997,29,3中所述来获得）还原成7-叔丁基-3-甲氧基芘-1-基甲基醇（2.1g，99%）。
用于O2,O2’-脱水核苷70与芳基甲基醇（ArCH2OH）之间的偶联以制备200W-Z的通用流程（用于～44.2mmol规模的描述）。将适合的芳香族醇（ArCH2OH）、NaHCO3和THF中的1.0M BH3置于压力管中，悬浮在无水DMSO中并在氩气气氛和室温下搅拌，直至发泡停止（～10min）。此时加入核苷70（底物和试剂的具体量在下面给出），将压力管用氩气吹扫并密封，将反应在～160℃加热，直至TLC指示完全转化（～3h）。此时，将反应混合物倒入水（200mL）中，搅拌30min并用EtOAc（500mL）稀释。将有机相用水洗涤（4×200mL），蒸发至干，并将得到的粗品通过硅胶柱层析进行纯化（2-4%MeOH在CH2Cl2中v/v）以得到残留物，将其从冷丙酮沉淀，获得核苷200（得率在下面注明）。
2’-O-(7-新戊基芘-1-基甲基)尿苷（200W）。将核苷70（0.40g，1.8mmol）、7-新戊基芘-1-基甲醇（1.07g，3.5mmol）、NaHCO3（0.03g，0.35mmol）、THF中的1.0M BH3（0.9mL，0.9mmol）和无水DMSO（3mL）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为白色固体的核苷200W（0.18g，20%）。Rf：0.4（10%MeOH在CH2Cl2中，v/v）。
2’-O-(6/8-溴芘-1-基甲基)尿苷（200X）。将核苷70（0.7g，3.1mmol）、6/8-溴芘-1-基甲醇（1.9g，6.2mmol）、NaHCO3（0.05g，0.62mmol）、THF中的1.0M BH3（1.6mL，1.55mmol）和无水DMSO（10mL）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为白色固体的核苷200X（0.28g，17%）。Rf：0.4（10%MeOH在CH2Cl2中，v/v）。
2’-O-(8-甲基芘-1-基甲基)尿苷（200Y）。将核苷70（2.0g，8.84mmol）、8-甲基芘-1-基甲醇（4.3g，17.7mmol）、NaHCO3（0.15g，1.77mmol）、THF中的1.0M BH3（4.9mL，4.42mmol）和无水DMSO（10mL）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为白色固体的核苷200Y（0.87g，20%）。Rf：0.4（10%MeOH在CH2Cl2中，v/v）。
2’-O-(3-甲氧基-7-叔丁基芘-1-基甲基)尿苷（200Z）。将核苷70（0.36g，1.57mmol）、3-甲氧基-7-叔丁基芘-1-基甲醇（1.0g，3.14mmol）、NaHCO3(26.0mg，0.31mmol）、THF中的1.0M BH3（0.8mL，0.78mmol）和无水DMSO（8mL）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为白色固体的核苷200Z（0.2g，21%）。Rf：0.4（10%MeOH在CH2Cl2中，v/v）。
用于制备202V-Z的通用DMTr保护流程（用于～2.2mmol规模的描述）。将适合的核苷200（底物和试剂的具体量在下面给出）与无水吡啶（15mL）共蒸发两次，并重新溶解在无水吡啶中。向其加入4,4’-二甲氧基三苯甲基氯（DMTrCl）和N,N-二甲基-4-氨基吡啶（DMAP），并将反应混合物在室温下搅拌直至TLC指示完全转化（～14h）。将反应混合物用CH2Cl2（70mL）稀释，并将有机相用水（2×70mL）和sat.aq.NaHCO3（2×100mL）顺序洗涤。将有机相蒸发至接近干燥并与无水EtOH和甲苯（2:1，v/v，3×6mL）共蒸发，将得到的粗品通过硅胶柱层析进行纯化（0-5%MeOH在CH2Cl2中，v/v），得到核苷202（得率在下面注明）。
5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(7-新戊基芘-1-基甲基)尿苷（202W）。将核苷200W（0.13g，0.25mmol）、DMTrCl（0.14g，0.37mmol）和无水吡啶（3mL）中的DMAP（～1mg）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为浅黄色泡沫的202W（0.13g，64%）。Rf：0.6（5%MeOH在CH2Cl2中，v/v）。
5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(6/8-溴芘-1-基甲基)尿苷（202X）。将核苷200X（0.21g，0.39mmol）、DMTrCl（0.23g，0.58mmol）和无水吡啶（7mL）中的DMAP（～2mg）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为浅黄色泡沫的202X（0.28g，85%）。Rf：0.6（5%MeOH在CH2Cl2中，v/v）。
5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(8-甲基芘-1-基甲基)尿苷（202Y）。将核苷200Y（0.7g，1.48mmol）、DMTrCl（0.86g，2.20mmol）和无水吡啶（10mL）中的DMAP（～4mg）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为浅黄色泡沫的202Y（0.9g，78%）。Rf：0.6（5%MeOH在CH2Cl2中，v/v）。
5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(芘-1-基甲基)尿苷（202Z）。将核苷200Z（0.18g，0.33mmol）、DMTrCl（0.19g，0.49mmol）和无水吡啶（7mL）中的DMAP（～2mg）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为浅黄色泡沫的202Z（0.2g，70%）。Rf：0.6（5%MeOH在CH2Cl2中，v/v）。
用于制备204V-Z的通用亚磷酸化流程（用于～1mmol规模的描述）。将适合的核苷202（底物和试剂的具体量在下面给出）与无水1,2-二氯乙烷（4mL）共蒸发并重新溶解在无水CH2Cl2中。向其加入DIPEA和2-氰基乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺（PCl试剂），将反应混合物在室温下搅拌直至TLC指示完全转化（～3h），随后向溶液顺序加入无水EtOH（2mL）和CH2Cl2（20mL）。将有机相用sat.aq.NaHCO3（10mL）洗涤，蒸发至接近干燥，并将得到的残留物通过硅胶柱层析进行纯化（40-70%EtOAc在石油醚中，v/v），得到相应的亚磷酰胺204（得率在下面注明）。
5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(7-新戊基芘-1-基甲基)尿苷-3’-O-(2-氰基乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺（204W）。将核苷202W（0.11g，0.13mmol）、DIPEA（0.1mL，0.53mmol）和无水CH2Cl2（3mL）中的PCl试剂（60μL，0.26mmol）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为白色泡沫的亚磷酰胺204W（0.11g，81%）。Rf：0.8（5%MeOH在CH2Cl2中，v/v）。
5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(6/8-溴芘-1-基甲基)尿苷-3’-O-(2-氰基乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺（204X）。将核苷202X（0.25g，0.29mmol）、DIPEA（0.21mL，1.19mmol）和无水CH2Cl2（5mL）中的PCl试剂（133μL，0.59mmol）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为白色泡沫的亚磷酰胺204X（0.26g，82%）。Rf：0.8（5%MeOH在CH2Cl2中，v/v）。
5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(8-甲基芘-1-基甲基)尿苷-3’-O-(2-氰基乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺（204Y）。将核苷202Y（0.65g，0846mmol）、DIPEA（0.59mL，3.35mmol）和无水CH2Cl2（10mL）中的PCl试剂（374μL，1.77mmol）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为白色泡沫的亚磷酰胺204Y（0.6g，78%）。Rf：0.8（5%MeOH在CH2Cl2中，v/v）。
5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(3-甲氧基-7-叔丁基芘-1-基甲基)尿苷-3’-O-(2-氰基乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺（204Z）。将核苷202Z（0.15g，0.18mmol）、DIPEA（126μL，0.71mmol）和无水CH2Cl2（5mL）中的PCl试剂（79μL，0.35mmol）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为白色泡沫的亚磷酰胺204Z（0.15g，80%）。Rf：0.8（5%MeOH在CH2Cl2中，v/v）。
2’-O-(芘-1-基-甲基)腺苷（130W）：将腺苷官能化的核苷128（1.60g，5.98mmol）、芘-1-基甲基氯（1.0g，3.9mmol）、NaH（0.36g，14.9mmol）和无水DMSO（30mL）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为浅黄色固体的核苷2W（0.48g，17%）。Rf0.29(10%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z504.1649([M+Na]+,C27H23N5O4.Na+,计算值504.1642)；1HNMR(DMSO-d6)δ8.32(s,1H,腺嘌呤),7.95–8.29(m,10H,芘,腺嘌呤),7.27(s,2H,NH2),6.14(d,1H,H1’,J=6.3Hz),5.48(d,1H,ex,J=5.1Hz,3’-OH),5.39-5.45(m,2H,CH2-Py,5’-OH(ex)),5.17-5.20(d,1H,J=11.7Hz,CH2Py),4.81(t,1H,J=5.1Hz,11.1Hz,H2’),4.50-4.54(m,1H,H3’),4.08-4.11(m,1H,H4’),3.68-3.75(m,1H,H5’),3.57-3.65(m,1H,H5’)；13C NMR(DMSO-d6)δ156.1,152.3,148.9,139.6,131.2,130.6,130.6,130.1,128.7,127.2,127.2,127.0,126.1,125.2,125.2,124.3,123.8,123.7,123.3,119.3,86.7,86.1,80.8,69.9,69.1,61.5。
2’-O-(芘-1-基-甲基)胞苷（130X）：将胞苷132（10.0g，41.1mmol）、芘-1-基甲基氯（6.8g，27.1mmol）、NaH（2.47g，102.8mmol）和无水DMSO（150mL）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为浅黄色固体的核苷130X（3.5g，19%）。Rf0.3(10%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z480.1532([M+Na]+,C26H23N3O5.Na+,计算值480.1529)；1HNMR(DMSO-d6)δ8.06-8.49(m,9H,Py),7.90(d,1H,胞嘧啶),7.15(s,2H,NH2),6.08(d,1H,H1’),5.67(d,1H,胞嘧啶),5.41-5.43(d,1H,CH2Py),5.24(d,1H,CH2Py),5.22(d,1H,3’-OH),5.07-5.11(m,1H,5’-OH),4.18-4.22(m,1H,H3’),4.06-4.11(m,1H,H2’),3.93-3.95(m,1H,H4’),3.53-3.74(m,2H,H5’)；13C NMR(DMSO-d6)δ165.6,155.1,141.0,131.6,130.7,130.5,130.2,128.6,127.4,127.3,127.2,126.9,126.1,125.2,124.5,123.9,123.8,123.6,93.8,89.7,87.5,84.2,81.7,77.2,72.9,69.7,68.2,60.1。
2’-O-(芘-1-基-甲基)鸟苷（130Y）：将鸟苷134（3.0g，10.6mmol）、芘-1-基甲基氯（1.86g，7.4mmol）、NaH（0.64g，26.5mmol）和无水DMSO（50mL）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为白色固体的核苷130Y（0.90g，17%）。Rf0.29（10%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z520.1608([M+Na]+,C27H23N5O5.Na+,计算值520.1591)；1HNMR(DMSO-d6)10.6(s,1H,NH),8.0-8.35(m,9H,Py),7.97(s,1H,H7-腺嘌呤),6.37(s,2H,NH2),5.97(d,1H,H1’),5.40-5.43(dd,2H,CH2Py),5.20(d,1H,ex,3’-OH),5.08(t,1H,ex,5’-OH),4.61-4.63(m,1H,H2’),4.44-4.46(m,1H,H3’),4.00-4.02(m,1H,H4’),3.60-3.68(m,2H,H5’)；13C NMR(DMSO-d6)δ156.6,153.6,151.1,135.2,131.2,130.6,130.2,128.7,127.3,127.0,126.2,125.2,125.1,124.4,123.8,123.7,123.5,116.7,86.1,84.5,81.3,69.8,69.0,61.3。
2’-O-(晕苯-1-基-甲基)胞苷（130Z）：将胞苷132（0.70g，2.88mmol）、晕苯-1-基甲基氯（0.66g，1.99mmol）、NaH（0.17g，7.19mmol）和无水DMSO（20mL）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为浅黄色固体的核苷130Z（0.16g，10%）。Rf0.3(10%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z578.1679([M+Na]+,C34H25N3O5.Na+,计算值578.1686)；1H-NMR(DMSO-d6)δ9.01-9.17(m,11H,Cor),7.94(d,1H,胞嘧啶),7.20(s,2H,NH2),6.08(d,1H,H1’),5.85(d,1H,胞嘧啶),5.68-5.78(m,2H,CH2Cor),5.22(d,1H,3’-OH),5.07-5.11(m,1H,5’-OH),4.18-4.22(m,1H,H3’),4.13-4.15(m,1H,H2’),3.90-3.93(m,1H,H4’),3.58-3.88(m,2H,H5’)。
2’-O-(芘-1-基-甲基)-N-苯甲酰基-腺苷（136W）：将核苷130W（0.40g，0.83mmol）通过与吡啶（5mL）共蒸发进行干燥，并重新溶解在无水吡啶（10mL）中，然后加入三甲基氯代甲硅烷（0.42mL，3.32mmol）。在室温下搅拌30min后，加入苯甲酰氯（0.14mL，1.25mmol）并将混合物继续搅拌5h。加入NH3水（28%，10mL）并继续搅拌1h，将反应混合物浓缩至接近干燥。将残留材料重新溶解在CH2Cl2（150mL）中，并用水洗涤（2x75mL）。将有机相蒸发至接近干燥，并将产物通过硅胶柱层析进行纯化（1-3%MeOH在CH2Cl2中，v/v），得到作为浅黄色固体的核苷136W（0.245g，50%）。Rf0.56(10%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z608.1910([M+Na]+,C34H27N5O5.Na+,计算值608.1904)；1H NMR(DMSO-d6)δ11.09(s,1H,酰胺),8.62(s,1H,腺嘌呤),8.57(s,1H,腺嘌呤),7.99–8.28(m,11H,苯甲酰基,Py),7.56-7.70(m,3H,苯甲酰基),6.25(d,1H,H1’,J=6Hz),5.58(d,1H,J=5.1Hz,ex,3’-OH),5.46-5.50(d,1H,J=11.4Hz,CH2Py),5.17–5.24(m,2H,1ex,5’-OH,CH2Py),4.86(m,1H,H2’),4.52-4.57(m,1H,H3’),4.10-11(m,1H,H4’),3.59-3.74(m,2H,H5’)。13C NMR(DMSO-d6)δ165.4,151.8,151.4,150.2,142.77,133.4,132.4,131.1,131.1,130.7,130.6,130.1,128.7,128.4,128.4,128.1,127.4,127.3,127.2,127.1,126.1,125.6,125.2,125.2,124.3,123.8,123.7,123.3,86.6,85.9,80.8,70.1,69.0,61.3。
2’-O-(芘-1-基-甲基)-N-苯甲酰基-胞苷（136X）：向核苷130X（3.1g，6.77mmol）在无水DMF（100mL）中的溶液加入苯甲酸酐（1.68g，7.45mmol）。将反应混合物在60℃下搅拌，直至TLC指示完全转化（～6h）。将反应混合物用CH2Cl2（150mL）稀释，并将有机相用水（2x60mL）和satd aq NaHCO3（2x100mL）顺序洗涤。将有机相在Na2SO4上干燥，蒸发至接近干燥，并将得到的粗品通过硅胶柱层析进行纯化（0-2%MeOH在CH2Cl2中，v/v），得到作为浅黄色固体的核苷136X（2.1g，55%）。Rf0.6(10%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMSm/z584.1785([M+Na]+,C33H27N3O6.Na+,计算值584.1790)；1HNMR(DMSO-d6)δ11.16(s,1H,酰胺),8.15-8.45(m,9H,Py),8.00-8.03(m,3H,苯甲酰基,胞嘧啶),7.62-7.66(m,1H,苯甲酰基),7.52-7.55(m,2H,苯甲酰基),7.44(d,1H,胞嘧啶),6.13(d,1H,H1’),5.43-5.53(dd,2H,CH2Py),5.30(d,1H,ex,3’-OH),5.19(t,1H,5’-OH),4.24-4.27(m,1H,H3’),4.17-4.18(m,1H,H2’),4.02-4.04(m,1H,H4’),3.76-3.80(m,1H,H5’),3.63-3.67(m,1H,H5’)；13C NMR(DMSO-d6)δ167.2,162.9,154.5,144.8,133.1,132.7,132.6,131.8,131.5,130.6,130.3,130.2,129.2,128.7,128.4,127.4,127.3,126.2,125.2,124.5,123.9,123.7,123.6,96.0,88.1,84.7,82.6,81.7,76.3,73.0,69.9,67.8,59.7。
2’-O-(芘-1-基-甲基)-N-异丁酰基-鸟苷（136Y）：向通过与吡啶共蒸发三次进行干燥的核苷130Y（0.26g，0.52mmol）在吡啶（6mL）中的溶液加入三甲基氯代甲硅烷基（0.5mL，3.92mmol）。在室温下搅拌2h后，在0℃下在10min内逐滴加入异丁酰氯（0.15mL，1.57mmol）。在0℃下向反应混合物加入水（2mL）并继续搅拌10min。将溶液在室温继续搅拌5min，并向溶液加入NH3水（28%，5mL）。在室温下继续搅拌15min后，将溶液浓缩至接近干燥。将残留材料重新溶解在CH2Cl2（100mL）中，并用水洗涤（2x60mL）。将有机相在Na2SO4上干燥，蒸发至接近干燥，并将粗品通过硅胶柱层析进行纯化（1-3%MeOH在CH2Cl2中，v/v），得到作为浅黄色固体的核苷136Y（0.220g，74%）。Rf0.56(10%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z590.2008([M+Na]+,C31H29N5O6.Na+,计算值590.2010)；1HNMR(DMSO-d6)11.8(s,1H,酰胺),11.3(s,1H,NH),8.01-8.27(m,9H,Py),7.95(s,1H,H7-鸟嘌呤),5.93(d,1H,H1’),5.43-5.46(m,2H,1ex,3’-OH,CH2Py),5.20(d,1H,ex,3’-OH),5.06-5.16(m,2H,1ex,5’-OH,CH2Py),4.65-4.67(m,1H,H2’),4.45-4.48(m,1H,H3’),4.01-4.03(m,1H,H4’),3.61-3.66(m,2H,H5’),2.56-2.61(m,1H,异丁酰基),1.00-1.04(dd,6H,异丁酰基)；13C NMR(DMSO-d6)δ179.8,154.5,148.5,147.8,137.2,131.1,130.6,130.1,128.7,127.3,127.1,127.0,126.1,125.2,125.1,124.3,123.8,123.6,123.5,86.5,84.6,81.6,70.2,69.2,61.3,34.5,18.7,18.6。
用于制备138W-138Y的通用DMTr保护流程[用于～3.6mmol规模的描述]：将适合的核苷136（具体量在下面给出）用无水吡啶（15mL）共蒸发两次并重新溶解在无水吡啶中。向其加入4,4’-二甲氧基三苯甲基氯（DMTrCl）和N,N-二甲基-4-氨基吡啶（DMAP），并将反应混合物在室温下搅拌，直至TLC指示完全转化（～14h）。将反应混合物用CH2Cl2（100mL）稀释，并将有机相用水（2x50mL）和satd aq NaHCO3（2x100mL）顺序洗涤。将有机相蒸发至接近干燥，将得到的粗品与无水EtOH和甲苯（2:1，v/v，3x10mL）共蒸发，并通过硅胶柱层析进行纯化（0-5%MeOH在CH2Cl2中，v/v），得到核苷138（得率在下面注明）。
5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(芘-1-基-甲基)-N-苯甲酰基-腺苷（138W）。将核苷136W（0.24g，0.41mmol）、DMTrCl（0.27g，0.70mmol）和无水吡啶（6mL）中的DMAP（～12mg）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为浅黄色泡沫的核苷138W（0.3g，71%）。Rf0.78(10%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z910.3225([M+Na]+,C55H45N5O7.Na+,计算值910.3211)；1H NMR(DMSO-d6)δ11.12(s,1H,酰胺),8.50(s,1H,腺嘌呤),8.46(s,1H,腺嘌呤),8.00–8.29(m,11H,苯甲酰基,Py),7.64-7.69(m,1H,苯甲酰基),7.55-7.60(m,2H,苯甲酰基),7.35(d,2H,J=9Hz,DMTr),7.14–7.27(m,7H,DMTr),6.81(d,4H,J=8.4Hz,DMTr),6.27(d,1H,J=5.7Hz,H1’),5.56(d,1H,ex,J=5.7Hz,3’-OH),5.50(d,1H,J=11.7Hz,CH2Py),5.28(d,1H,J=11.7Hz,CH2Py),4.97-5.00(m,1H,H2’),4.61-4.65(m,1H,H3’),4.20-4.24(m,1H,H4’),3.70(s,6H,2×CH3O),3.26-3.28(m,2H,H5’)。13C NMR(DMSO-d6)δ165.5,158.0,151.8,151.3,150.3,144.7,135.5,135.4,133.4,132.4,131.1,131.1,130.7,130.6,130.1,129.6,129.6,128.8,128.7,128.4,128.4,128.1,128.1,127.7,127.6,127.4,127.3,127.2,127.1,126.6,126.1,125.7,125.2,124.3,123.9,123.7,123.3,113.1,86.3,85.5,84.2,79.8,70.1,69.2,63.5,54.9。
5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(芘-1-基-甲基)-N-苯甲酰基-胞苷（138X）。将核苷136X（2.0g，3.56mmol）、DMTrCl（2.07g，5.34mmol）和无水吡啶（50mL）中的DMAP（～20mg）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为浅黄色泡沫的核苷138X（2.0g，65%）。Rf0.78(10%MeOH中的CH2Cl2，v/v)；MALDI-HRMS m/z886.3087([M+Na]+,C54H45N3O8.Na+,计算值886.3098)；1HNMR(DMSO-d6)δ11.22(s,1H,酰胺),847-8.49(d,1H,Py),8.21-8.30(m,6H,H6and Py),8.16(s,2H,Py),8.00-8.05(m,3H,苯甲酰基and Py),7.63-7.65(m,1H,苯甲酰基),7.52-7.55(m,2H,苯甲酰基),7.24-7.39(m,9H,DMTr),7.04(d,1H,H5),6.86-6.90(m,4H,DMTr),6.15(d,1H,H1’),5.56(bs,2H,CH2Py),5.37(d,1H,ex,3’-OH),4.41-4.45(m,1H,H3’),4.16-4.20(m,2H,H2’and H4’),3.73(bs,6H,2x CH3O),3.38-3.41(m,1H,H5’),3.29-3.34(m,1H,H5’)；13C NMR(DMSO-d6)δ167.1,163.1,158.1,154.3,144.3,135.5,135.1,133.1,132.6,131.4,130.6,130.2,129.7,129.6,128.7,128.4,127.8,127.7,127.5,127.2,127.8,126.1,125.2,124.5,123.9,123.8,123.6,113.2,96.0,88.7,85.9,82.3,81.5,69.9,68.0,61.8,54.9。
5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(芘-1-基-甲基)-N-异丁酰基-鸟苷（138Y）。将核苷136Y（0.20g，0.35mmol）、DMTrCl（0.20g，0.53mmol）和无水吡啶（5mL）中的DMAP（～10mg）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为浅黄色泡沫的核苷138Y（0.27g，89%）。Rf0.8(10%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z892.3325([M+Na]+,C52H47N5O8.Na+,计算值892.3317)；1HNMR(DMSO-d6)11.8(s,1H,酰胺),11.3(s,1H,NH),8.25-8.32(m,3H,Py),7.99-8.15(m,7H,H7-鸟嘌呤and Py),7.32-7.34(m,2H,DMTr),7.18-7.25(m,7H,DMTr),6.79-6.82(m,4H,DMTr),5.97(d,1H,H1’),5.46-5.51(m,2H,1ex,3’-OH,CH2Py),5.22-5.25(d,1H,CH2Py),4.71-4.73(m,1H,H2’),4.45-4.48(m,1H,H3’),4.11-4.13(m,1H,H4’),3.70-3.71(bd,6H,2x CH3O),3.18-3.28(m,2H,H5’),2.59-2.65(m,1H,异丁酰基),1.04-1.06(dd,6H,异丁酰基)；13C NMR(DMSO-d6)δ179.8,158.0,154.5,148.5,147.8,144.6,137.1,135.4,135.3,131.12,130.7,130.6,130.1,129.6,128.7,127.7,127.6,127.3,127.2,127.1,127.0,126.6,126.1,125.2,125.1,124.4,123.8,123.7,123.4,120.1,113.1,85.6,85.0,84.2,80.8,70.3,69.3,63.9,54.9,34.6,18.7,18.6。
通用亚磷酸化流程：[用于～2.3mmol规模的描述]
将适合的核苷（底物和试剂的具体量在下面描述）用无水1,2-二氯乙烷（20mL）共蒸发两次，并重新溶解在无水CH2Cl2（25mL）中。向其加入N,N-二异丙基乙基胺（DIPEA）和2-氰基乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺（PCl试剂），并将反应混合物在室温下搅拌直至TLC指示完全转化（～3h），随后向溶液顺序加入abs.EtOH（4mL）和CH2Cl2（50mL）。将有机相用sat.aq.NaHCO3（20mL）洗涤，蒸发至接近干燥，并将得到的残留物通过硅胶柱层析进行纯化（40-70%EtOAc在石油醚中，v/v），得到相应的亚磷酰胺（得率在下面注明）。
3’-O-(N,N-二异丙基氨基-2-氰基乙氧基亚膦酰基)-2’-O-(芘-1-基-甲基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-N-苯甲酰基-腺苷（76’W）。将核苷138W（0.25g，0.28mmol）、DIPEA(74μL，0.43mmol）和无水CH2Cl2（6mL）中的PCl试剂（95μL，0.43mmol）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为白色泡沫的亚磷酰胺76’W（0.26g，82%）。Rf:0.75(5%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z1110.4295([M+Na]+,C64H62N7O8P·Na+,计算值1110.4289)；31P NMR(CDCl3)δ150.7,150.8。
3’-O-(N,N-二异丙基氨基-2-氰基乙氧基亚膦酰基)-2’-O-(芘-1-基-甲基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-N-苯甲酰基-胞苷（140X）。将核苷138X（2.0g，2.31mmol）、DIPEA（1.65mL，9.26mmol）和无水CH2Cl2（25mL）中的PCl试剂（1.03mL，4.63mmol）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为白色泡沫的亚磷酰胺140X（2.3g，93%）。Rf:0.67(5%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z1086.4183([M+Na]+,C63H62N5O9P·Na+,计算值1086.4177)；31P NMR(CDCl3)δ149.7,150.1。
3’-O-(N,N-二异丙基氨基-2-氰基乙氧基亚膦酰基)-2’-O-(芘-1-基-甲基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-N-异丁酰基-鸟苷（140Y）。将核苷138Y（0.26g，0.29mmol）、DIPEA（213μL，1.19mmol）和无水CH2Cl2（7mL）中的PCl试剂（133μL，0.59mmol）如上所述进行混合、反应、精整和纯化，得到作为白色泡沫的亚磷酰胺140Y（0.25g，78%）。Rf:0.7(5%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z1092.4389([M+Na]+,C61H64N7O9P·Na+,计算值1092.4395)；31P NMR(CDCl3)δ150.3,150.4。
反应图式15
环状N2’,O3’-半酰胺醚：环状N2’,O3’-半酰胺醚副产物（反应图式15）的结构得到下列1H NMR观察的支持（500MHz，DMSO-d6，结果未示出）：a）在6.07ppm处出现作为单线的半酰胺醚质子；b）不存在对应于3’-OH基团的可交换信号，c）不存在对应于将O2’-位与芘组成部分相连的CH2基团的信号，并且d）在6.13ppm处出现作为单线的H1’信号，表明形成了受限的North型呋喃糖构型，不同于对6Q所观察到的（H1’信号作为双重线出现在6.43ppm处，J=8.2Hz）。尽管形成了新的立体中心，但我们仅观察到一组信号，表明只形成环状N2’,O3’-半酰胺醚副产物的一种非对映异构体。
2’-氨基-2’-脱氧-2’-N-甲基-2’-N-(芘-1-基-甲基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷（82Q）：将核苷80（200mg，0.36mmol）与无水1,2-二氯乙烷（2×4mL）共蒸发并重新溶解在无水THF（5mL）中。加入芘‐1‐基甲基氯（205mg，0.37mmol）和三乙胺（0.52mL，3.73mmol）并将应混合物加热回流2天，随后蒸发掉溶剂。将粗品残留物转移到CHCl3和sat.aq.NaHCO3的混合物（50mL，3:2，v/v）中并进行层分离。将水性相用CHCl3萃取（2×20mL）并将合并的有机相蒸发至干。将得到的残留物通过硅胶柱层析进行纯化（0‐1.25%MeOH/CH2Cl2，v/v），得到作为黄色泡沫的核苷82Q（129mg，46%）。Rf:0.5(60%EtOAc在石油醚中，v/v)；MALDI-HRMS m/z774.3156([M+H]+C48H43N3O7·H+,计算值774.3174)；1H NMR(DMSO-d6)δ11.41(d,1H,ex,J=1.7Hz,NH),8.50(d,1H,J=9.1Hz,Py),8.01‐8.29(m,8H,Py),7.63(d,1H,J=8.2Hz,H6),7.20‐7.38(m,9H,DMTr),6.85‐6.89(m,4H,DMTr),6.43(d,1H,J=8.2Hz,H1’),5.56(d,1H,ex,J=5.2Hz,3’‐OH),5.43(dd,1H,J=8.3Hz,1.7Hz,H5),4.41-4.50(m,3H,CH2Py,H3’),4.06-4.08(m,1H,H4’),3.71(s,3H,CH3O),3.70(s,3H,CH3O),3.44-3.48(dd,1H,J=8.3Hz,8.1Hz,H2’),3.28‐3.31(m,1H,H5’,与H2O重叠),3.16‐3.20(dd,1H,J=10.6Hz,3.6Hz,H5’),2.33(s,3H,CH3N)；13C NMR(DMSO-d6)δ162.7,158.08,158.07,150.6,144.5,140.2(C6),135.4,135.1,132.7,130.7,130.3,130.2,129.71(DMTr),129.67(DMTr),129.2,128.0(Py),127.8(DMTr),127.6(DMTr),127.3(Py),126.9(Py),126.8(Py),126.7(DMTr),126.1(Py),125.01,124.98(Py),124.4(Py),124.1,124.0(Py),123.9,113.20(DMTr),113.17(DMTr),102.1(C5),85.9,85.1(C4’),83.4(C1’),71.3(C3’),67.8(C2’),64.1(C5’),57.4(CH2Py),55.0(CH3O),38.6(CH3N)。
2’-氨基-2’-脱氧-2’-N-甲基-2’-N-(芘-1-基-羰基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷（82S）：将核苷80（150mg，0.27mmol）与无水1,2-二氯乙烷共蒸发（2×5mL），溶解在无水DMF（4.5mL）中，并加入到1-芘甲酸（100mg，0.40mmol）、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU，125mg，0.32mmol）和DIPEA（0.12mL，0.70mmol）在无水DMF（4.5mL）中的预先搅拌（室温1h）的溶液中。将反应混合物搅拌17h，随后将其用EtOAc（50mL）稀释，并用sat.aq.NaHCO3（20mL）和H2O（2×20mL）顺序洗涤。将有机相蒸发至干，并将得到的残留物通过硅胶柱层析进行纯化（0‐2%MeOH在CH2Cl2中，v/v），得到作为白色泡沫的核苷82S（164mg，78%）。Rf=0.4(5%MeOH在CH2Cl2中v/v)。MALDI-HRMS m/z788.2985([M+H]+,C48H41N3O8·H+,计算值788.2966)；1H NMR(CDCl3)δ8.65(br s,1H,NH,ex),7.97-8.28(m,9H,Py),7.85(d,1H,J=8.3Hz,H6),7.20-7.44(m,9H,DMTr),6.80-6.90(m,4H,DMTr),6.78(d,1H,J=6.0Hz,H1’),5.42-5.48(m,1H,H5),4.80-4.90(m,2H,H2’,H3’),4.28-4.43(m,1H,H4’),3.77(s,6H,CH3O),3.48-3.63(m,2H,H5’),2.98(s,3H,NCH3)，观察到痕量的第二旋转异构体；13C NMR(CDCl3)δ174.4,162.9,159.0,150.5,144.5,140.0(C6),135.6,135.5,132.3,131.4,131.0,130.44(DMTr),130.42(DMTr),129.4(Py),128.7(Py),128.5(DMTr),128.3(DMTr),127.4,126.7(Py),126.1(Py),126.0(Py),125.0(Py),124.8,124.7,124.3(Py),113.6(DMTr),113.3(DMTr),103.2(C5),87.3,86.6(C4’),85.3(C1’),71.8(C3’/C2’),65.8(C2’/C3’),63.0(C5’),55.5(CH3O),38.5(NCH3)。在29.9ppm处观察到痕量油脂杂质。
2’-氨基-2’-脱氧-2’-N-甲基-2’-N-(芘-1-基-甲基羰基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷（82V）：将核苷80（158mg，0.28mmol）与1,2-二氯乙烷共蒸发（2×5mL），随后溶解在无水CH2Cl2（8mL）中。向其加入1‐乙基‐3‐(3‐二甲基氨基‐丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl，73mg，0.38mmol）和芘‐1‐基乙酸（108mg，0.41mmol）。将反应混合物在氩气和室温下搅拌3h，随后将反应混合物用CH2Cl2（30mL）稀释，并用sat.aq.NaHCO3（20mL）和H2O（3×15mL）顺序洗涤。将有机相蒸发至干，并将得到的残留物通过硅胶柱层析进行纯化（0‐3%i‐PrOH/CH2Cl2，v/v），得到作为棕色泡沫的核苷82V（187mg，83%）的旋转异构混合物（2:5，根据1HNMR）。Rf:0.5(5%,i-PrOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z801.3078([M]+,C49H43N3O8,计算值801.3045)；1H NMR(DMSO-d6)δ11.52(d,1H,J=1.7Hz,NH(A)),11.46(d,0.4H,J=1.7Hz,NH(B)),8.05‐8.31(m,11.2H,Py(A)+Py(B)),7.89(d,1H,J=7.8Hz,Py(A)),7.82(d,0.4H,J=7.8Hz,Py(B)),7.67‐7.70(m,1.4H,H6(A)+H6(B)),7.13-7.43(m,12.6H,DMT(A+B)),6.78‐6.87(m,5.6H,DMT(A+B)),6.42(d,1H,J=8.0Hz,H1’(A)),6.31(d,0.4H,J=5.5Hz,H1’(B)),5.92(d,0.4H,ex,J=4.9Hz,3’‐OH(B)),5.76(d,1H,ex,J=4.9Hz,3’‐OH(A)),5.38(dd,1H,J=8.2Hz,1.7Hz,H5(A)),5.33(dd,0.4H,J=8.2Hz,1.7Hz,H5(B)),5.11-5.17(m,1H,H2’(A)),4.80-4.86(m,0.4H,H2’(B)),4.58-4.63(d,1H,J=16.5Hz,CH2Py(A)),4.51-4.56(d,0.4H,J=16.5Hz,CH2Py(B)),4.37-4.49(m,2.4H,1x CH2Py(A),H3’(A),H3’(B)),4.30-4.37(d,0.4H,J=16.5Hz,CH2Py(B)),4.10‐4.16(m,1.4H,H4’(A)+H4’(B)),3.68(s,2.4H,CH3O(B)),3.64(s,3H,CH3O(A)),3.62(s,3H,CH3O(A)),3.35-3.37(m,0.4H,H5’(B)),3.32(s,3H,CH3N(A)),3.29-3.32(m,1H,H5’(A),与H2O重叠),3.23-3.27(dd,0.4H,J=10.6Hz,2.6Hz,H5’(B)),3.15-3.19(dd,1H,J=10.6Hz,2.6Hz,H5’(A)),3.03(s,1.2H,CH3N(B))；13C NMR(DMSO-d6)δ172.2,172.1,162.81,162.78,158.06,158.03,158.02,150.5,150.4,144.6,144.3,140.2(C6(B)),140.1(C6(A)),135.4,135.3,135.2,135.0,130.7,130.62,130.56,130.3,130.2,129.71(DMTr),129.69(DMTr),129.1,128.1(Py-CHA),127.9(Py-CHB),127.8(DMTr),127.73(DMTr),127.70(DMTr),127.3(Py),127.14(Py),127.10(Py),126.73(Py),126.66(DMTr),126.1(Py),125.1(Py),125.0(Py),124.9(Py),124.5(Py),124.1,124.0,123.85(Py),123.76(Py),113.2(DMTr),113.1(DMTr),102.2(C5(A)),102.0(C5(B)),85.9,85.7,85.5(C1’(B)),85.2(C4’(A)),84.8(C4’(B)),83.2(C1’(A)),70.5(C3’(A)),69.3(C3’(B)),63.8(C5’(A)),63.7(C5’(B)),62.1(C2’(B)),59.0(C2’(A)),54.92(CH3O(B)),54.87(CH3O(B)),54.85(CH3O(A)),54.82(CH3O(A)),38.1(CH2Py(A)),37.8(CH2-Py(B)),34.2(CH3N(A)),31.4(CH3N(B))。
2’-氨基-2’-脱氧-2’-N-甲基-2’-N-(芘-1-基-甲基)-3’-O-(N,N-二异丙基氨基-2-氰基乙氧基亚膦酰基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷（84Q）：将核苷82Q（135mg，0.18mmol）与CH3CN（2×4mL）共蒸发并重新溶解在无水CH3CN（2.5mL）中。向其加入DIPEA（153μL，0.87mmol）和PCl试剂（78μL，0.35mmol）。将反应混合物在室温下搅拌4h，随后将其在冰浴上冷却，并加入无水EtOH（3mL）。蒸发掉溶剂，并将得到的残留物通过硅胶柱层析进行纯化（0‐40%EtOAc在石油醚中，v/v；柱子在0.5%Et3N中安装），得到作为白色泡沫的核苷84Q（97mg，57%）。Rf:0.3(40%EtOAc在石油醚中，v/v)；MALDI-HRMSm/z996.4046([M+Na]+,C57H60N5O8P·Na+,计算值996.4077)；31P NMR(CDCl3)δ151.0,149.8。
2’-氨基-2’-脱氧-2’-N-甲基-3’-O-(N,N-二异丙基氨基-2-氰基乙氧基亚膦酰基)-2’-N-(芘-1-基-羰基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷（84S）：将核苷82S（219mg，0.28mmol）与无水1,2-二氯乙烷（2×2mL）共蒸发并重新溶解在无水CH2Cl2（2mL）中。向其加入DIPEA（58μL，0.33mmol），然后逐滴加入PCl试剂（74μL，0.33mmol）。在室温搅拌2h后，加入CH2Cl2（10mL）并将反应混合物继续搅拌10min，随后在减压下蒸发溶剂。将得到的残留物通过硅胶柱层析进行纯化（第一根柱：0‐40%EtOAc在石油醚中，v/v；第二根柱：0‐4%MeOH在CH2Cl2中，v/v），得到作为白色泡沫的亚磷酰胺84S的旋转异构混合物（138mg，49%）。Rf:0.8(5%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z1010.3865([M+Na]+,C57H58N5O9P·Na+,计算值1010.3870)；31P NMR(CDCl3)δ151.8,151.2,150.8。
2’-氨基-2’-脱氧-2’-N-甲基-3’-O-(N,N-二异丙基氨基-2-氰基乙氧基亚膦酰基)-2’-N-(芘-1-基-甲基羰基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷（84V）：将核苷82V（0.30g，0.37mmol）与无水1,2-二氯乙烷共蒸发（2×3mL）并重新溶解在无水CH2Cl2（4mL）中。向其加入DIPEA（0.32mL，1.84mmol），然后逐滴加入PCl试剂（0.16mL，0.74mmol）。在室温下搅拌1.5h后，加入CH2Cl2（10mL）并将反应混合物继续搅拌10min，然后在减压下蒸发溶剂。将得到的残留物通过硅胶柱层析进行纯化（0‐60%EtOAc在石油醚中，v/v），得到作为亮黄色泡沫的亚磷酰胺84V（153mg，42%）。Rf:0.4(60%EtOAc在石油醚中，v/v)；MALDI-HRMSm/z1024.4037([M+Na]+,C58H60N5O9P·Na+,计算值1024.4026)；31P NMR(CDCl3)δ150.6,150.5。
用于222的通用程序：将起始原料（1mmol）在无水1,2-二氯乙烷（2x5mL）中共蒸发并重新溶解在无水1,2-二氯乙烷（5mL）中。向其加入NaBH(OAc)3（1.5-7eq）和RCHO（1.5eq）。允许在室温和氩气气氛下搅拌5-22h，随后将反应混合物用CH2Cl2（50mL）稀释，用sat.aq.NaHCO3（2x30mL）和H2O（30mL）洗涤。用CH2Cl2（2x20mL）反萃取水性相，在Na2SO4上干燥并蒸发至干。然后将粗品通过硅胶柱层析进行纯化，分离产物（43-95%）。
用于合成224的通用程序：将起始原料（1mmol）在无水1,2-二氯乙烷（2x10mL）中共蒸发并重新溶解在无水1,2-二氯乙烷（10mL）中。向其加入NaBH(OAc)3（10eq）和CH2O（1.5eq）并在室温和氩气气氛下搅拌4-7h，随后将反应混合物用CH2Cl2（50mL）稀释，用sat.aq.NaHCO3（2x30mL）洗涤，并用CH2Cl2（2x20mL）反萃取水性相，在Na2SO4上干燥并蒸发至干。然后将粗品通过硅胶柱层析进行纯化，分离产物（89-99%）。
用于合成226的通用程序：将起始原料（1mmol）在无水1,2-二氯乙烷（10mL）中共蒸发并重新溶解在an.CH2Cl2（10mL）中。向其加入DIPEA（4-5eq），然后逐滴缴入“PCl”试剂（2-3eq），并允许在室温和氩气气氛下搅拌2-4h，随后将反应混合物用冷EtOH（1mL）淬灭并蒸发至干。将粗品通过硅胶柱层析进行纯化并在CH2Cl2和石油醚中沉淀，得到所需亚磷酰胺（62-90%）。
240的合成：将萘-2-甲基硫醇（616mg，3.53mmol）和氢化钠（42mg，1.77mmol）溶解在an.DMA（3mL）中并在氩气气氛下搅拌10min，随后加入O2,O2’-脱水尿苷70（200mg，0.88mmol）。在搅拌48h后，将反应混合物用EtOAc（30mL）稀释，用乙酸（1滴）中和并用水H2O（2x15mL）洗涤。将水性相用CH2Cl2反萃取（3x15mL）并将有机层蒸发至干。将粗产品通过硅胶柱层析进行纯化（0-7%MeOH/CH2Cl2，v/v），给出核苷240（311mg，88%）。Rf=0.3(10%MeOH在CH2Cl2中)；1H NMR(DMSO-d6)11.33(br s,1H,NH,ex),7.77-7.89(m,3H,Ar),7.61-7.68(m,2H,Ar),7.39-7.54(m,3H,Ar,H6),6.09(d,1H,J=8.23Hz,H1’),5.65(d,1H,J=5.21Hz,ex,3’-OH),5.34(d,1H,J=7.96Hz,H5),5.05(t,1H,J=5.21,ex,5’-OH),4.15-4.20(m,1H,H3’),3.81-3.94(m,3H,SCH2,H4’),3.50-3.58(m,2H,H5’),3.36(dd,1H,J=8.5Hz,5.5Hz,H2’)。
用单体120W/X/Y/Z、120Q/S/V、120’W、120’X、140’X、140’Y、208W/X/Y/Z、228Y/Z和244修饰的单链探针的合成和纯化：修饰的探针的合成在DNA合成仪上，使用孔径为的0.2μmol规模的琥珀酰基连接的LCAA-CPG（长链烷基胺受控孔眼玻璃）柱来进行。使用用于掺入DNA亚磷酰胺的标准流程。在手动偶联（为保护材料而进行）期间，通常使用无水乙腈中的～50倍过量的修饰的亚磷酰胺（0.05M），例外的是76Z（无水CH2Cl2中的～70倍摩尔过量，0.07M）。此外，通常使用延长的氧化（45s）和偶联时间（0.01M4,5-二氰基咪唑作为活化剂，对于单体84V/76W/76Y来说15min，对于单体76Z来说35min；0.01M5-(双-3,5-三氟甲基苯基)-1H-四唑[活化剂42]，对于单体84Q/84S/84V来说15min）。用单体120’W、120’X、140’X、140’Y、208W/X/Y/Z、228Y/Z和244修饰的探针以等同的方式制造。在用32%氨水处理（55℃，24h）后，通常实现从固相支持物上的切下和保护基团的移除。所有修饰的寡核苷酸的纯化使用两种方法进行至最低80%的纯度：a）总体合成得率>80%：使用80%aq.AcOH切开DMT，然后从丙酮沉淀（-18℃12-16h）并用丙酮洗涤，或者b）总体合成得率<80%：如下所述通过RP-HPLC纯化寡核苷酸，然后去三苯甲基化并沉淀。
粗品寡核苷酸的纯化在装备有XTerra MS C18预柱（10μm，7.8x10mm）和XTerra MS C18柱（10μm，7.8x150mm）的HPLC系统上进行。合成的寡核苷酸的身份通过MALDI-MS/MS分析来建立（表35-36），在装备有MALDI源的四极飞行时间串联质谱仪上，使用邻氨基苯甲酸作为基质（表39-51）以正离子模式记录，而纯度（>80%）通过以分析模式运行的RP-HPLC来验证。
表39
用单体120W/X/Y/Z修饰的代表性单链探针的MALDI-MS
表40
用单体120Q/S/V修饰的代表性单链探针的MALDI-MS
表41
用单体120’W(=M)修饰的代表性单链探针的MS数据a
表42
用单体208W/X/Y/Z修饰的代表性单链探针的MS数据a
表43
用单体228Y/Z修饰的代表性单链探针的MS数据a
探针 计算的[M] 实测的[M+1]
5’–GTG A(228Y)A TGC 3031.6 3032.4
3’–CAC TA(228Y)ACG 2960.6 2961.4
5’–GTG A(228Z)A TGC 3079.6 3079.6
3’–CAC TA(228Z)ACG 3008.6 3010.5
表44
用单体120Y修饰的其他单链探针的MS数据
表45
用单体120’W修饰的其他单链探针的MS数据
表46
用单体120Y修饰的另一些单链探针的MS数据
表47
用单体120Q修饰的另一些其他单链探针的MS数据
探针 计算的[M] 实测的[M+H]
5'–GG(120Q)ATA TAT AGG C 4240.8 4242.5
3'-CCA(120Q)AT ATA TCC G 4120.8 4122.6
5'-GG(120Q)A(120Q)A TAT AGG C 4469.9 4471.5
3'-CCA(120Q)A(120Q)ATA TCC G 4349.9 4351.6
5'-GGT A(120Q)A(120Q)AT AGG C 4469.9 4471.9
3'-CCA TA(120Q)A(120Q)A TCC G 4349.9 4351.4
5'-GG(120Q)A(120Q)A(120Q)A(120Q)AGG C 4928.1 4929.7
3'-CCA(120Q)A(120Q)A(120Q)A(120Q)CC G 4808.1 4810.5
表48
用单体120Q修饰的又一些其他单链探针的MS数据
表49
用单体120Y、120’W和140’X修饰的又一些其他单链探针的MS数据
表50
用单体120Y、120’W、140’X和140’Y修饰的又一些其他单链探针的MS数据
表51
用单体120Y、120’W、140’X和140’Y修饰的又一些其他单链探针的MS数据
涉及用120W/X/Y/Z、120Q/S/V、120’W、120’X、140’X、140’Y、208W/X/Y/Z、228Y/Z和244修饰的探针的热变性研究：对于DNA来说，使用下列消光系数来评估寡核苷酸的浓度（OD/μmol）：G(12.01)，A(15.20)，T(8.40)，C(7.05)；对于RNA来说（OD/μmol）：G(13.70)，A(15.40)，U(10.00)，C(9.00)；对于荧光团来说（OD/μmol）：萘(3.75)，芘(22.4)和晕苯(36.0)。将每条链充分混合并通过加热至70-85℃来变性，然后冷却至实验的起始温度。使用光程长度为1.0cm的石英光学比色皿。热变性温度（双链体（每条链1.0μM的终浓度）的Tm值[℃]）在装备有12比色皿Peltier温度控制器的UV/VIS分光光度计上测量，并确定为在中盐缓冲液（Tm缓冲液：100mM NaCl，0.1mM EDTA，并且用10mM Na2HPO4和5mM Na2HPO4调整至pH7.0）中记录到的热变性曲线（A260相对于T）的一阶导数的最大值。变性实验的温度在比Tm低至少15℃至比Tm高20℃的范围内（尽管不低于1℃）。在所有实验中使用0.5℃/min的温度匀变速率。报告的Tm值是±1.0℃内的两个实验的平均值。
在具体公开的实施方式中，用单体120W/X/Y/Z或120Q/S/V修饰的单链探针在对互补RNA的热亲和性方面表现出不同趋势（ΔTm/mod=-12.0℃至+10.5℃，表52）。对这些探针观察到显著的DNA选择性，其被定义为ΔΔTm(DNA-RNA)=ΔTm(vs DNA)-ΔTm(vs RNA)>0℃（表53）。用未闭锁单体120Y和120Z修饰的探针的DNA选择性特别明显，并且与用闭锁单体126W修饰的探针的DNA选择性相当（表53）。这表明感兴趣的DNA靶向应用是可能的。对于用嵌入组成部分修饰的寡核苷酸来说，通常观察到DNA选择性杂交，因为嵌入有利于DNA:DNA双链体的压缩较少的螺旋几何结构。相反，用单体120X或120W修饰的大多数探针表现出低得多的DNA选择性，表明与用单体120Y和120Z修饰的探针相比，嵌入结合模式显著性较低（表53）。
表52
用单体120W/X/Y/Z/Q/S/V或126W修饰的探针与互补RNA靶之间的双链体的Tm值
表53
用单体120W/X/Y/Z/Q/S/V或126W修饰的探针的DNA选择性
aDNA选择性被定义为ΔΔTm(DNA-RNA)=ΔTm(vs DNA)-ΔTm(vs RNA)。
也可以确定本公开探针的Watson–Crick特异性。在具体公开的实施方式中，可以使用在单体掺入位点相对处具有错配核苷酸的核酸靶来评估修饰的寡核苷酸。某些公开的实施方式涉及使用单链探针以及它们与在掺入位点相对处包含错配核苷酸的DNA（表54）或RNA靶（表55）结合的能力。
B2系列的探针相对于参比链D1一般表现出降低的DNA靶特异性。例如，120Y2和120Z2相对于D1辨别dT错配非常差（比较D1/120Y2/120Z2针对具有dT错配的靶的ΔTm值，表X），而dC和dG错配的辨别与使用D1时几乎同样有效。包含闭锁单体的寡核苷酸的具体公开的实施方式具有相似的特异性情况，但是辨别dT错配甚至更差。有趣的是，120Q2与120Y2、120Z2和126W2相比表现出明显更好的dC和dT错配辨别，使其成为最特异的高亲和性DNA靶向修饰。在具体公开的实施方式中，连接物的化学组成和长度的甚至少量变化也对靶特异性具有显著影响。例如，120S2表现出与120Y2/120Z2/126W2相似的DNA靶特异性，而120V2辨别DNA错配非常差。类似地，120W2表现出非常差的靶特异性，而120X2与120W2或120Y2相比表现出高得多的靶特异性（表54）。
表54
通过B2系列的单链探针辨别错配的DNA靶a
a热变性实验的条件参见上面的表33。完全匹配的双链体的Tm值用粗体示出。ΔTm=相对于完全匹配的DNA:DNA双链体的Tm变化。
表55
通过B2系列的单链探针辨别错配的RNA靶a
a热变性实验的条件参见上面的表33。完全匹配的双链体的Tm值用粗体示出。ΔTm=相对于完全匹配的DNA:RNA双链体的Tm变化。
在其他公开的实施方式中，评估了在最近邻位置处具有两个修饰的寡核苷酸（B6系列）针对具有与中央2’-脱氧腺苷残基相对的单一中央错配核苷酸的核酸（例如DNA）靶的特异性（表56）。有趣的是，这种设计一般导致与对照链D2相比错配辨别力提高；A和G错配被特别有效地辨别。
表56
通过B6系列和参比链辨别错配的DNA靶a
a热变性实验的条件参见上面的表33。完全匹配的双链体的Tm值用粗体示出。ΔTm=相对于完全匹配的DNA:DNA双链体的Tm变化。
在具体公开的实施方式中，可以检查本公开探针的荧光特征，其中观察到的光信号提供了与探针和/或靶相关的信息。在具体公开的实施方式中，记录了在存在或不存在互补或错配核酸靶（例如DNA/RNA）的情况下，包含一个或多个本公开单体例如单体120Q/120S/120V/120X/120Y的探针的吸收和稳态荧光发射光谱，以获得关于嵌入剂（例如芘）组成部分的结合模式和/或匹配或错配靶的存在的其他见解。本领域普通技术人员将会认识到，已知芘组成部分的嵌入引起芘吸收峰的红移。本公开探针的具体实施方式，例如用单体120Q/120S/120Y修饰的探针，在与核酸（例如DNA）靶杂交后表现出明显的红移（分别为平均Δλmax=2.8-5.0nm对2.5nm，表58和图8）。与互补RNA的杂交产生较小的红移（平均Δλmax=2.0-4.5nm，表58）。探针120X1-120X5与其他芘官能化的寡核苷酸相比表现出明显更小的杂交诱导的红移（平均Δλmax～0.6nm，表57和图7），其证实了从热变性研究得到的趋势，表明芘组成部分的嵌入对于单体120X来说是不太重要的结合模式。
表57
在存在或不存在互补DNA/RNA靶的情况下用单体120X-120Z或126W修饰的探针在320-360nm范围内的最大吸光度a
a测量在室温（单体126W）、10℃（单体120Z）和7℃（单体120X和120Y）下使用分光光度计和光程长度为1.0cm的石英光学比色皿进行。缓冲条件与热变性实验相同。斜体值表示具有低热稳定性的双链体（在实验温度下可能发生部分双链体解离）。
表58
在存在或不存在互补DNA/RNA靶的情况下用单体120Q/120S/120V修饰的探针在320-360nm范围内的最大吸光度a
a测量在5℃进行。
稳态荧光发射光谱：使用λex=350nm的激发波长、5.0nm激发狭缝、2.5nm发射狭缝和600nm/min扫描速率，在非脱氧热变性缓冲液中记录并作为5次扫描的平均值获得用芘官能化的单体120Q/120S/120V/120X/120Y修饰的寡核苷酸与具有互补DNA/RNA靶的相应双链体的稳态荧光发射光谱（每条链1.0μM）（图9-17）。实验在5℃下测定，以确保探针与DNA/RNA靶的最大杂交。将溶液加热至80℃，然后在10min内冷却至5℃。
稳态荧光发射光谱（λex=350nm；λem=360-600nm；T=5℃）分别在λem=382±3nm和402±3nm处显示出两个预期的振动带I和III，以及～420nm处的小肩（图9-17）。用单体120Q/120S/120V/120X/120Y修饰的寡核苷酸与互补靶、尤其是DNA的杂交，导致荧光发射强度降低（图9-17）。该趋势表明芘的嵌入，因为已知核苷碱基组成部分通过光诱导电子转移（PET）淬灭芘的荧光，其中鸟嘌呤和胞嘧啶组成部分是最强的淬灭剂。与此相一致，包含120Y/120Q/120V系列（嵌入，重要的结合模式）的双链体与包含120X系列（嵌入，不太重要的结合模式）的双链体相比表现出远远更低的发射强度。
总之，来自于热变性和光学光谱术研究（DNA选择性；错配辨别；UV-vis；荧光）的结果表明对于所有研究的单体来说，附连的烃的嵌入是可能的结合模式。嵌入对于单体120W和120X来说是最不重要的，而对于单体120Y、120Z和120Q来说是占优势的结合模式。
包含用单体228Y/Z修饰的探针的实施方式的其他工作实例
特定实施方式包含用单体228Y和228Z修饰的探针。参考下面的表59，观察到用单体228Y和228Z修饰的单链探针对核酸靶、更通常地单链DNA表现出明显增加的热亲和性。这种性质促进通过图1中示出的方法靶向双链核酸靶、更通常地dsDNA。
表59
用单体228Y或228Z修饰的DNA双链体的热变性温度的其他实例
特定实施方式包括具有单体228Y和/或228Z的某些链间拉链排列方式的双链探针。参考下面的表60，观察到双链探针+1和+2链间拉链排列方式表现出相对低的热稳定性，其与每条探针链所表现出的高DNA亲和性（表59）相结合，产生通过图1中概述的方法靶向双链核酸靶、更通常地dsDNA的显著潜力。
表60
具有单体228Y或228Z的各种链间拉链排列方式的双链探针的其他实例
用于制备104V-104Z的通用click反应流程（用于～6mmol规模的描述）：向THF/t-BuOH/H2O（3:1:1，v/v/v）的混合物加入5’-O-二甲氧基三苯甲基-2'-叠氮-2’-脱氧尿苷102和适合的炔92-100以及抗坏血酸钠和CuSO4·5H2O（试剂量和溶剂体积在下面注明）。将反应混合物在氮气气氛下搅拌，直至分析TLC指示完全转化（反应时间和温度在下面注明），随后将其用EtOAc（10mL）稀释。将有机相用sat.aq.NaHCO3（20mL）和盐水（20mL）连续洗涤，在无水Na2SO4上干燥并蒸发至干。将得到的粗品通过硅胶柱层析进行纯化（洗脱剂在下面注明），得到相应的核苷2（得率在下面注明）。
1-(芘-1-基)-丙-2-炔-1-醇（90）：在氩气气氛下向THF中的MeMgBr（1M，4.0mL，4.00mmol）加入三甲基甲硅烷基乙炔（1.0mL，7.00mmol）并在室温下搅拌1h。此时，加入芘-1-甲醛（0.70g，3.00mmol）并将反应混合物在室温继续搅拌2h。加入Sat.aq.NH4Cl（～1mL）并将混合物用EtOAc萃取（2x20mL）。将合并的有机相在Na2SO4上干燥并蒸发至干。将得到的粗品[推测为1-(芘-1-基)-3-三甲基甲硅烷基-丙-2-炔-1-醇]溶解在CH2Cl2和MeOH（10mL，1:1，v/v）中，并与K2CO3（0.50g，3.62mmol）在室温下搅拌2h。然后将反应混合物用CH2Cl2（10mL）稀释，并用盐水（20mL）和水（20mL）连续洗涤。将有机相在Na2SO4上干燥并蒸发至干。将得到的粗品通过硅胶柱层析进行纯化（0-50%EtOAc在石油醚中，v/v），得到作为白色固体材料的90（0.47g，58%）。Rf=0.3(25%EtOAc在石油醚中，v/v)；ESI-HRMS m/z279.0783([M+Na]+,C19H12O·Na+,计算值279.0780)；1H NMR(DMSO-d6)δ8.59(d,1H,J=10.0Hz,Py),8.35-8.29(m,4H,Py),8.26(d,1H,J=10.0Hz,Py),8.20-8.16(m,2H,Py),8.09(t,1H,J=7.5Hz,Py),6.41-6.39(d,1H,ex,J=5.0Hz,OH),6.34-6.31(dd,1H,J=5.0Hz,2.5Hz,HC(OH)),3.60(d,1H,J=2.5Hz,HC≡C)；13C NMR(DMSO-d6)δ135.0,130.7,130.5,130.1,127.34,127.31(Py),127.28(Py),127.25(Py),126.2(Py),125.3(Py),125.2(Py),124.65(Py),124.59(Py),124.1,123.8,123.7(Py),85.5,76.6(HC≡C),60.8(HC(OH))。
1-(芘-1-基)-丙-2-炔-1-酮（92）：向醇90（180mg，0.67mmol）在丙酮（10mL）中的溶液加入Jones试剂（2.67M CrO3在3M H2SO4中，1.0mL，2.67mmol），并将反应混合物在环境气氛和室温下搅拌2h，随后将其用EtOAc（20mL）稀释，并在搅拌下通过逐滴加入6M NaOH（1.0mL）来中和，并用水（30mL）和sat.aq.NaHCO3（30mL）顺序洗涤。将有机相在Na2SO4上干燥，蒸发至干，并将得到的粗品通过硅胶柱层析进行纯化（0-20%EtOAc在石油醚中，v/v），提供作为亮黄色材料的92（130mg，75%）。Rf=0.6(50%EtOAc在石油醚中，v/v)；ESI-HRMS m/z277.0626([M+Na]+,C19H10O·Na+,计算值277.0624)；1HNMR(CDCl3)δ9.48(d,1H,J=10.0Hz),8.94(d,1H,J=8.0Hz),8.28-8.23(m,3H),8.19-8.14(m,2H),8.07-8.02(m,2H),3.53(s,1H)；13CNMR(CDCl3)δ179.3,135.8,132.2(Py),131.31,131.25(Py),131.14,131.05(Py),130.6,128.4,127.35(Py),127.29(Py),127.1(Py),126.8(Py),124.97(Py),124.96,124.95,124.2(Py),124.1,82.6,80.1(HC≡C)。
4-(芘-1-基)-丁-1-炔（94）：在烘箱干燥的烧瓶中装入芘-1-甲醛（230mg，1.00mmol）和活性锌（100mg，1.50mmol），并置于氩气气氛下。加入无水THF（5mL）和炔丙基溴（0.20mL，1.79mmol），并将反应混合物在45℃搅拌4h。加入Sat.aq.NH4Cl（1mL）并将混合物用EtOAc萃取（2x20mL）。将有机相用盐水（20mL）洗涤并蒸发至干。将得到的粗品通过硅胶柱层析进行纯化（0-30%EtOAc在石油醚中，v/v），得到粗品白色固体材料（145mg），其1H NMR表明是所需的1-(芘-1-基)-丁-3-炔-1-醇和相应的丙二烯异构体的～9:1混合物。向粗品混合物在CH2Cl2（5mL）中的溶液加入Et3SiH（0.20mL，1.25mmol）和三氟化硼乙醚合物（0.20mL，1.62），然后将其在室温搅拌1h。将反应混合物用CH2Cl2（20mL）和sat.aq.NaHCO3（2mL）稀释，并用盐水（20mL）和水（20mL）顺序洗涤。将有机相在Na2SO4上干燥，在减压下蒸发至干，并将得到的粗品通过硅胶柱层析进行纯化（0-3%EtOAc在石油醚中，v/v），得到作为白色固体材料的94（80mg，31%）。Rf=0.5(5%EtOAc在石油醚中，v/v)；ESI-HRMS m/z277.0973([M+Na]+,C20H14·Na+,计算值279.0988)；1H NMR(CDCl3)δ8.27-8.25(d,1H,J=9.5Hz,Py),8.17-8.14(m,2H,Py),8.12-8.10(m,2H,Py),8.01(ap s,2H),8.00-7.96(t,1H,J=8.0Hz,Py),7.92-7.90(d,1H,J=7.5Hz,Py),3.59(t,2H,J=7.7Hz,CH2CH2C≡CH),2.72(dt,2H,J=7.7Hz,2.5Hz,CH2C≡CH),2.03(t,1H,J=2.5Hz,HC≡C)；13C NMR(CDCl3)δ134.7,131.6,131.1,130.5,128.9,127.8(Py),127.7(Py),127.5(Py),127.1(Py),126.1(Py),125.31,125.27(Py),125.2,125.1(Py),125.0(Py),123.2(Py),84.0,69.6(HC≡C),32.8(CH2CH2C≡CH),21.0(CH2C≡CH)。
5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-C-[4-(2,2,2-三氟乙酰胺基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-2'-脱氧尿苷（104V）：将核苷102（0.40g，0.70mmol）、2,2,2-三氟-N-(丙-2-炔基)乙酰胺Av（105mg，0.70mmol）、抗坏血酸钠（70mg，0.35mmol）、CuSO4·5H2O（5mg，0.02mmol）和THF/t-BuOH/H2O（5mL）如上所述进行混合、反应（室温下14h）、精整和纯化（50-100%EtOAc在石油醚中，v/v），区别在于将有机相用盐水和水连续洗涤。获得作为黄色固体材料的核苷104V（0.42g，83%）。Rf=0.3(80%EtOAc在石油醚中，v/v)；MALDI-HRMS m/z745.2225([M+Na]+,C35H34F3N6O8·Na+,计算值745.2204)；1H NMR(DMSO-d6)δ11.40(d,1H,ex,J=2.0Hz,H3),10.02(t,1H,J=6.0Hz,NHCOCF3),8.01(s,1H,Tz),7.81(d,1H,J=8.0Hz,H6),7.43-7.22(m,9H,DMTr),6.93-6.88(m,4H,DMTr),6.42(d,1H,J=4.5Hz,H1’),5.79(d,1H,ex,J=6.0Hz,3’-OH),5.50(dd,1H,J=7.0Hz,4.5Hz,H2’),5.45(dd,1H,J=8.0Hz,2.0Hz,H5),4.52(m,1H,H3’),4.47(d,2H,J=5.5Hz,CH2NHCO),4.24-4.20(m,1H,H4’),3.75(s,6H,CH3O),3.38-3.30(m,2H,H5’–与H2O部分重叠)；13C NMR(DMSO-d6)δ162.8,158.09,158.08,156.2(q,1,3JCF=36Hz,COCF3),150.1,144.6,142.4,140.5(C6),135.3,135.1,129.7(DMTr),127.8(DMTr),127.7(DMTr),126.7(DMTr),124.5(Tz),115.8(q,JCF=288Hz,CF3),113.2(DMTr),101.9(C5),87.1(C1’),85.8,83.2(C4’),68.8(C3’),64.5(C2’),62.8(C5’),55.0(CH3O),34.5(CH2NHCO)；19F-NMR(DMSO-d6)δ-74.2。
5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-C-[4-(芘-1-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-2'-脱氧尿苷（104W）：将核苷102（0.28g，0.49mmol）、1-乙炔基芘98（130mg，0.58mmol）、抗坏血酸钠（200mg，1.00mmol）、CuSO4·5H2O（25mg，0.10mmol）和THF/t-BuOH/H2O（10mL）如上所述进行混合、反应（在75℃下7h）、精整和纯化（40-70%EtOAc在石油醚中，v/v），提供作为灰白色固体材料的核苷104W（140mg，35%）。Rf=0.5(80%EtOAc在石油醚中，v/v)；MALDI-HRMS m/z820.277([M+Na]+,C48H39N5O7·Na+,计算值820.274)；1H NMR(DMSO-d6)δ11.46(d,1H,ex,J=1.5Hz,NH),8.87(d,1H,J=9.0Hz,Py),8.80(s,1H,Tz),8.41-8.33(m,4H,Py),8.27(d,1H,J=9.2Hz,Py),8.26-8.22(m,2H,Py)；8.12(t,1H,J=7.5Hz,Py),7.91(d,1H,J=8.0Hz,H6),7.48-7.20(m,9H,DMTr),6.96-6.90(m,4H,DMTr),6.65(d,1H,J=5.0Hz,H1’),5.95(d,1H,ex,J=6.0Hz,3’-OH),5.69(dd,1H,J=7.0Hz,5.0Hz,H2’),5.54(dd,1H,J=8.0Hz,1.5Hz,H5),4.69-4.64(m,1H,H3’),4.40-4.36(m,1H,H4’),3.76(s,6H,CH3O),3.46-3.36(m,2H,H5’)；13C NMR(DMSO-d6)δ162.9,158.2,150.3,145.7,144.7,140.8(C6),135.4,135.2,130.9,130.6,130.3,129.78(DMTr),129.76(DMTr),128.0(Py),127.9(DMTr),127.73(DMTr),127.67(Py),127.5,127.3(Py),127.0(Py),126.8(DMTr),126.4(Py),125.7(Tz),125.5(Py),125.16,125.15(Py),125.09(Py),124.8(Py),124.3,123.9,113.3(DMTr),102.1(C5),87.4(C1’),85.9,83.4(C4’),69.1(C3’),64.9(C2’),63.1(C5’),55.0(CH3O)。
5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-C-[4-(芘-1-基羰基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-2'-脱氧尿苷（104X）：将核苷102（0.28g，0.49mmol）、1-(芘-1-基)-丙-2-炔-1-酮92（140mg，0.55mmol）、抗坏血酸钠（200mg，1.00mmol）、CuSO4·5H2O（25mg，0.10mmol）和THF/t-BuOH/H2O（10mL）如上所述进行混合、反应（在室温下5h）、精整和纯化（40-90%EtOAc在石油醚中，v/v），提供作为黄色固体材料的核苷104X（0.25g，60%）。Rf=0.4(80%EtOAc在石油醚中，v/v)；MALDI-HRMS m/z848.267([M+Na]+,C49H39N5O8·Na+,计算值848.270)；1H NMR(DMSO-d6)δ11.46(br s,1H,ex,NH),8.96(s,1H,Tz),8.51-8.28(m,8H,Py),8.17(t,1H,J=7.5Hz,Py),7.83(d,1H,J=8.0Hz,H6),7.44-7.21(m,9H,DMTr),6.93-6.88(m,4H,DMTr),6.55(d,1H,J=5.0Hz,H1’),5.90(d,1H,ex,J=5.0Hz,3’-OH),5.68(dd,1H,J=7.0Hz,5.0Hz,H2’),5.53(dd,1H,J=8.0Hz,2.0Hz,H5),4.64-4.58(m,1H,H3’),4.31-4.26(m,1H,H4’),3.74(s,6H,CH3O),3.40-3.30(m,2H,H5’)；13C NMR(DMSO-d6)δ188.3,162.9,158.1,150.2,147.2,144.6,140.8(C6),135.4,135.2,133.0,131.8,131.5(Tz),130.6,130.0,129.74(DMTr),129.72(DMTr),129.4(Py),129.1(Py),128.9,127.9,127.84(DMTr),127.80(Py),127.7(DMTr),127.2(Py),126.8(Py),126.7(DMTr),126.5(Py),126.1(Py),124.01(Py),123.98(Py),123.8,123.5,113.2(DMTr),102.0(C5),87.4(C1’),85.8,83.3(C4’),69.0(C3’),65.0(C2’),63.0(C5’),55.0(CH3O)。
5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-C-[4-{2-(芘-1-基)乙基}-1H-1,2,3-三唑-1-基]-2'-脱氧尿苷（104Y）：将核苷102（0.34g，0.60mmol）、4-(芘-1-基)-丁-1-炔94（160mg，0.63mmol）、抗坏血酸钠（0.25g，1.25mmol）、CuSO4·5H2O（31mg，0.12mmol）和THF/t-BuOH/H2O（10mL）如上所述进行混合、反应（在室温下2h）、精整和纯化（50-100%EtOAc在石油醚中，v/v），提供作为白色固体材料的核苷104Y（0.33g，67%）。Rf=0.3(80%EtOAc在石油醚中，v/v)；MALDI-HRMS m/z848.3046([M+Na]+,C50H43N5O7·Na+,计算值848.3055)；1H NMR(DMSO-d6)δ11.44(s,1H,ex,NH),8.40(d,1H,J=9.0Hz,Py),8.30-8.19(m,4H,Py),8.13(ap s,2H,Py),8.06(t,1H,J=8.0Hz,Py),8.01(s,1H,Tz),7.95(d,1H,J=8.0Hz,Py),7.82(d,1H,J=8.0Hz,H6),7.44-7.41(m,2H,DMTr),7.36-7.23(m,7H,DMTr),6.94-6.90(m,4H,DMTr),6.44(d,1H,J=5.0Hz,H1’),5.79(d,1H,ex,J=6.0Hz,3’-OH),5.49-5.45(m,2H,H5,H2’),4.54-4.49(m,1H,H3’),4.27-4.22(m,1H,H4’),3.75(s,6H,CH3O),3.72-3.66(m,2H,CH2CH2),3.40-3.30(m,2H,H5’),3.19-3.14(m,2H,CH2CH2)；13C NMR(DMSO-d6)δ162.8,158.12,158.11,150.2,145.8,144.6,140.5(C6),135.6,135.4,135.1,130.8,130.3,129.7(DMTr),129.4,128.0,127.8(DMTr),127.7(DMTr),127.5(Py),127.4(Py),127.3(Py),126.7(DMTr),126.5(Py),126.1(Py),124.93(Py),124.88(Py),124.8(Py),124.2,124.1,123.4(Tz),123.2(Py),113.2(DMTr),102.0(C5),87.1(C1’),85.9,83.3(C4’),68.9(C3’),64.3(C2’),62.9(C5’),55.0(CH3O),32.6(CH2CH2),27.3(CH2CH2)。
5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-C-[4-(芘-1-基)甲酰胺基甲基-1H-1,2,3-三唑-1-基]-2'-脱氧尿苷（104Z）：将核苷102（0.40g，0.70mmol）、N-(丙-2-炔基)芘-1-甲酰胺100（200mg，0.71mmol）、抗坏血酸钠（50mg，0.25mmol）、CuSO4·5H2O（5mg，0.02mmol）和THF/t-BuOH/H2O（5mL）如上所述进行混合、反应（在室温下8h）、精整和纯化（50-100%EtOAc在石油醚中，v/v），区别在于将有机相用盐水和水连续洗涤。获得作为黄色固体材料的核苷104Z（0.49g，83%）。Rf=0.2(EtOAc)；MALDI-HRMS m/z877.2979([M+Na]+,C50H42N6O8·Na+,计算值877.2956)；1H NMR(DMSO-d6)δ11.43(s,1H,ex,H3),9.26(t,1H,ex,J=6.0Hz,NHCO),8.53-8.52(d,1H,J=9.5Hz,Ar),8.36-8.34(m,3H,Ar),8.27-8.22(m,3H,Ar),8.17-8.11(m,3H,Ar,Tz),7.85(d,1H,J=8.5Hz,H6),7.44-7.43(m,2H,DMTr),7.35-7.24(m,7H,DMTr),6.93-6.89(m,4H,DMTr),6.50(d,1H,J=4.7Hz,H1’),5.87(d,1H,ex,J=5.5Hz,3’-OH),5.56(dd,1H,J=7.0Hz,4.7Hz,H2’),5.47(d,1H,J=8.0Hz,H5),4.71(d,2H,J=6.0Hz,CH2NHCO),4.58-4.54(m,1H,H3’),4.30-4.25(m,1H,H4’),3.75(s,6H,CH3O),3.41-3.32(m,2H,H5’)；13CNMR(DMSO-d6)δ168.8,162.9,158.13,158.12,150.2,144.7,144.6,140.5(C6),135.4,135.2,131.6,131.5,130.7,130.2,129.8(DMTr),128.3(Ar),128.1(Ar),127.9(DMTr),127.8,127.7(DMTr),127.1(Ar),126.8(DMTr),126.5(Ar),125.7(Ar),125.5(Ar),125.2(Ar),124.7(Ar),124.3(Ar),124.2(Tz),123.7,123.6,113.2(DMTr),102.0(C5),87.1(C1’),85.9,83.3(C4’),69.0(C3’),64.5(C2’),62.9(C5’),55.0(CH3O),35.0(CH2NHCO)。
用于制备106V-106Z的通用亚磷酸化流程（用于～3mmol规模的描述）：将适合的核苷104与无水CH2Cl2（5mL）共蒸发并重新溶解在无水CH2Cl2中（试剂量和溶剂体积在下面注明）。向其加入N,N-二异丙基乙基胺（DIPEA）、CH3CN中的0.45M四唑和2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基二氨基磷酸酯（PN2试剂）。将反应混合物在室温搅拌，直至分析TLC指示完全转化（反应时间在下面注明），随后加入冷的无水EtOH（0.5mL）。将反应混合物蒸发至干，并将得到的残留物通过硅胶柱层析进行纯化（洗脱剂在下面注明）。将粗品材料从冷的石油醚研磨，得到亚磷酰胺106（得率在下面注明）。
3’-O-(N,N-二异丙基氨基-2-氰基乙氧基亚膦酰基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-C-[4-(2,2,2-三氟乙酰胺基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-2'-脱氧尿苷（106V）：将核苷104V（0.29g，0.40mmol）、DIPEA（0.10mL，0.57mmol）,CH3CN中的四唑（0.45M，1.0mL，0.45mmol）、PN2试剂（0.15mL，0.46mmol）和无水CH2Cl2（1mL）如上所述进行混合、反应（3h）、精整和纯化（50-90%EtOAc在石油醚中，v/v），区别在于a）在添加EtOH后将反应混合物用EtOAc（5mL）萃取，然后将有机相在无水Na2SO4上干燥并在减压下蒸发至干，以及b）不进行研磨。获得作为白色固体材料的亚磷酰胺106V（0.24g，67%）。Rf=0.3(5%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z945.3322([M+Na]+,C44H50F3N8O9·Na+,计算值945.3283)；31P NMR(CDCl3)δ152.0,149.8;19F NMR(CDCl3)δ-75.7。
3’-O-(N,N-二异丙基氨基-2-氰基乙氧基亚膦酰基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-C-[4-(芘-1-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-2'-脱氧尿苷（106W）：将核苷104W（230mg，0.29mmol）、DIPEA(0.10mL，0.57mmol）,CH3CN中的四唑（0.45M，1.0mL，0.45mmol）、PN2试剂（0.20mL，0.62mmol）和无水CH2Cl2（2mL）如上所述进行混合、反应（4h）、精整和纯化（0-4%MeOH/CH2Cl2，v/v），得到作为白色粉末的106W（180mg，62%）。Rf=0.35(5%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z1020.3855([M+Na]+,C57H56N7O8P·Na+,计算值1020.3826)；31P NMR(CDCl3)δ152.0,150.5。
3’-O-(N,N-二异丙基氨基-2-氰基乙氧基亚膦酰基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-C-[4-(芘-1-基羰基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-2'-脱氧尿苷（106X）：将核苷104X（150mg，0.18mmol）、DIPEA（0.10mL，0.57mmol）、CH3CN中的四唑（0.45M，0.6mL，0.27mmol）、PN2试剂（0.12mL，0.37mmol）和无水CH2Cl2（2mL）如上所述进行混合、反应（3.5h）、精整和纯化（0-4%MeOH/CH2Cl2，v/v），得到作为黄色固体材料的106X（110mg，59%）。Rf=0.4(5%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z1048.3779([M+Na]+,C58H56N7O9P·Na+,计算值1048.3775)；31P NMR(CDCl3)δ152.4,150.9。
3’-O-(N,N-二异丙基氨基-2-氰基乙氧基亚膦酰基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-C-[4-{2-(芘-1-基)乙基}-1H-1,2,3-三唑-1-基]-2'-脱氧尿苷（106Y）：将核苷104Y（0.33g，0.40mmol）、DIPEA（0.10mL，0.57mmol）、CH3CN中的四唑（0.45M，1.5mL）、PN2试剂（0.25mL，0.78mmol）和无水CH2Cl2（2mL）如上所述进行混合、反应（3.5h）、精整和纯化（0-4%MeOH/CH2Cl2，v/v），得到作为白色粉末的106Y（210mg，51%）。Rf=0.45(5%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMSm/z1048.4147([M+Na]+,C59H60N7O8P·Na+,计算值1048.4139)；31P NMR(CDCl3)δ151.6,150.6。
3’-O-(N,N-二异丙基氨基-2-氰基乙氧基亚膦酰基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-C-[4-(芘-1-基)甲酰胺基甲基-1H-1,2,3-三唑-1-基]-2'-脱氧尿苷（106Z）：将核苷104Z（0.36g，0.42mmol）、DIPEA（0.10mL，0.57mmol）、CH3CN中的四唑（0.45M，1.0mL，0.45mmol）、PN2试剂（0.15mL，0.46mmol）和无水CH2Cl2(1mL）如上所述进行混合、反应（3h）、精整和纯化（50-90%EtOAc在石油醚中，v/v），区别在于a)在添加EtOH后将反应混合物用EtOAc（5mL）萃取，然后将有机相在无水Na2SO4上干燥并在减压蒸发至干，以及b）不进行研磨。获得作为白色固体材料的亚磷酰胺106Z（0.28g，67%）。Rf=0.3(5%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z1077.3984([M+Na]+,C59H59N8O9P·Na+,计算值1077.4035)；31P NMR(CDCl3)δ151.9,150.1。
用单体122V/W/X/Y/Z修饰的单链探针的合成和纯化：修饰的寡脱氧核糖核苷酸的合成在Expedite8909DNA合成仪上，使用孔径为的0.2μmol规模的琥珀酰基连接的LCAA-CPG（长链烷基胺受控孔眼玻璃）柱来进行。使用用于掺入DNA亚磷酰胺的标准流程。在使用主要原稿中注明的条件的手动偶联期间，使用无水乙腈中的～50倍摩尔过量的修饰的亚磷酰胺（0.05M）。此外，在手动偶联期间利用延长的氧化（45s）。在用32%氨水处理（55℃，20h）后，实现从固相支持物上的切下和保护基团的移除。所有修饰的寡核苷酸的纯化通过如下所述的离子对反相HPLC，然后去三苯甲基化（80%aq.AcOH）并从丙酮沉淀（-18℃12-16h）来进行。
粗品寡核苷酸的纯化在装备有XTerra MS C18预柱（10μm，7.8x10mm）和XTerra MS C18柱（10μm，7.8x150mm）的Varian Prostar HPLC系统上，使用0.05mM TEAA（三乙基乙酸铵）缓冲液-25%水/乙腈（v/v）梯度来进行。合成的寡核苷酸的身份通过MALDI-MS/MS分析来建立（表35-36），在装备有MALDI源（Waters Micromass LTD.,U.K）的四极飞行时间串联质谱仪（Q-TOF Premiere）上，使用邻氨基苯甲酸作为基质（表61）以正离子模式记录，而纯度（>80%）通过以分析模式运行的RP-HPLC来验证。
表61
用122W/X/Y/Z修饰的单链探针的MALDI-Tof MS分析
涉及用单体122V/W/X/Y/Z修饰的探针的热变性研究：使用下列消光系数来评估寡核苷酸的浓度（OD/μmol）：dG(12.01)，dA(15.20)，dT(8.40)，dC(7.05)；rG(13.70)，rA(15.40)，rU(10.00)，rC(9.00)；122V(19.96)，122W(31.08)，122X(35.60)，122Y(27.62)和122Z(30.95)[单体122V-122Z的值通过相应的亚磷酰胺在1%aq.DMSO中的溶液的A260测量值来估计]。将每条链充分混合并通过加热至80-85℃来变性，然后冷却至实验的起始温度。使用光程长度为10mm的石英光学比色皿。热变性温度（双链体（每条链1.0μM的终浓度）的Tm值[℃]）在装备有12比色皿Peltier温度控制器的Cary100UV/VIS分光光度计上测量，并确定为在中盐缓冲液（Tm缓冲液：100mM NaCl，0.1mM EDTA，并且用10mM Na2HPO4和5mM Na2HPO4调整至pH7.0）中记录到的热变性曲线（A260相对于T）的一阶导数的最大值。变性实验的温度在比Tm低至少20℃至比Tm高20℃的范围内。在所有实验中使用0.5℃/min的温度匀变速率。报告的Tm值是±1.0℃内的两个实验的平均值。
某些实施方式涉及用单体122W/X/Y/Z修饰的探针。这样的探针与匹配或错配DNA靶之间的双链体的热变性研究公开在表62和63中。本文中提供的实例证实了用单体122W/X/Y/Z修饰的探针表现出通用热杂交性质，即它们对匹配和错配的核酸靶、更通常地单链核酸靶、甚至更通常地单链DNA和/或单链RNA表现出明显相似的热亲和性。
表62
用单体122W/X/Y/Z修饰的探针与互补或中央错配的DNA靶之间的双链体的Tm值[a]
[a]Tm被确定为在Tm缓冲液（[Na+]=110mM，[Cl-]=100mM，pH7.0（NaH2PO4/Na2HPO4））中，使用1.0μM的每条链记录的变性曲线（A260相对于T）的一阶导数的最大值。Tm是1.0℃内的至少两个测量值的平均值。“ΔTm”=相对于未修饰的参比双链体的Tm变化。“错配ΔTm”=相对于完全匹配的双链体（B=A）的Tm变化。“平均错配ΔTmseq”=给定探针的所有三个“错配ΔTm”值的平均值。“平均错配ΔTm系列”=单体系列内所有4种研究的序列的所有12个“错配ΔTm”值的平均值。“±”表示标准偏差。DNA靶：3’-GCGTT TBT TTGCG，3’-GCGTT GBG TTGCG，3’-GCGTT CBC TTGCG和3’-GCGTT ABA TTGCG。
表63
用单体122W/X/Y/Z修饰的探针与互补或中央错配的DNA靶之间的双链体的其他Tm值[a]
[a]条件和定义如上表的注脚中所述。“nt”=无变化。
涉及用单体122V/W/X/Y/Z修饰的探针的稳态荧光发射光谱：用芘官能化的单体122W/122X/122Y/122Z修饰的寡核苷酸和具有互补或错配DNA/RNA靶的相应的双链体的光谱，在非脱氧热变性缓冲液中（每条链1.0μM），使用对于122W/122Y/122Z来说λex=350nm或对于122X来说λex=400nm的激发波长、5.0nm激发狭缝、5.0nm发射狭缝和600nm/min扫描速度来记录。实验在室温（～20℃）进行。
涉及用单体122V/W/X/Y/Z修饰的探针的量子产率的确定：修饰的核酸（SSP或双链体）的相对荧光发射量子产率（ΦF）使用下列方程来确定：ΦF(NA)=[ΦF(std)/α(std)]×[IFI(NA)/Aex(NA)]×[n(NA)/n(std)]2，其中ΦF(std)是标准品的荧光发射量子产率；α(std)是为标准品制造的积分荧光强度相对于光强度的图的斜率；IFI(NA)是积分荧光强度（对于单体122W/122Y/122Z来说λem=360-510nm；对于单体122X来说λem=425-625；对于标准品来说λem=360-600nm）；Aex(NA)是样品在所使用的发射波长（对于单体122W/122Y/122Z来说λex=350nm；对于单体122X来说λex=400nm；对于标准品来说λex=350nm；所有溶液在激发波长下的光密度在0.01至0.10之间）下的光密度；n(NA)和n(std)分别是用于样品和标准品的溶液的折射率（n水=1.33，n乙醇=1.36，n环己烷=1.43）。
在我们的实验设置下这种方法的验证，通过测定乙醇中的蒽相对于环己烷中的9,10-二苯基蒽（ΦF=0.86）的量子产率来确定。ΦF=0.28的测量值与报告值（ΦF=0.27）出色地一致。随后，使用乙醇中的蒽的文献值作为标准来确定SSP和双链体的量子产率。
涉及使用单体122V/W/X/Y/Z修饰的探针的光学光谱术研究。在不存在或存在互补或中央错配的DNA靶的情况下记录用单体122W-122Z修饰的寡核苷酸的UV-Vis吸收光谱，以便获得掌控观察到的通用杂交特性的机制的其他见解（图27）；已知芘组成部分的杂交诱导的嵌入诱导轻微的红移。
用单体122W修饰的单链探针在芘区域（λmax～351nm，图27）中显示出单个非结构化最大值，而与互补、错配或无碱基DNA靶的双链体在～351nm和～365nm处表现出两个分辨开的最大值。单链探针（SSP）缺乏确定的峰排除了红移分析。用单体122X修饰的单链探针表现出两个宽的并事实上等强度的峰，这使吸收最大值的精确测定难以实施（λmax～385nm和～415nm，图27）。与互补DNA的杂交产生略微的红移，而在与错配或无碱基DNA杂交后观察到更显著的迁移。芘的最大值相对于非共轭芘发色团的最大值红移，其表明芘与三唑组成部分之间的电子耦合。另一方面，用单体122Y或单体122Z修饰的单链探针具有结构化吸收光谱，其在“正常”区域中具有两个最大值（即分别为λmax～333/348nm和～332/346nm，图27）。这些探针与互补、错配或无碱基DNA靶链的杂交产生轻微红移（Δλmax在+1至+3nm之间，图27，表64）。因此，吸收数据与在与DNA靶杂交后单体122W-122Z的芘组成部分嵌入到双链体核心中的假设相一致。
表64
在不存在（SSP）或存在匹配（M）或中央错配（MM）DNA靶的情况下用122Y或122Z修饰的寡核苷酸的芘吸收最大值[a]
[a]在T=20℃下，使用1.0μM的每条链在Tm缓冲液中记录。SSP=单链探针。与修饰相对的核苷酸叙述在括号中。“M”=匹配的，“MM”=错配的。
接下来，确定了在不存在或存在互补或中央错配的DNA靶的情况下，用122W/X/Y/Z修饰的寡核苷酸的稳态荧光发射光谱和荧光发射量子产率（图28和表65）。
用单体122W修饰的单链探针在λem～390nm和405nm处表现出两个结构化的发射峰（图28）。具有中央A122WA上下文的单链探针与其他上下文中的SSP相比具有更高的荧光量子产率（ΦF=0.27相比于0.07/0.05/0.05，表65）。与互补DNA的相应双链体的光谱具有类似的形状和序列依赖性，证实了芘组成部分与邻近的核苷碱基紧密接触（图28，表65）。在与匹配或错配DNA靶杂交后荧光量子产率的广泛降低（表65）进一步证实了这一假设。具有T122WT上下文的探针表现出相对更小的变化，推测是由于在靶结合后荧光团与邻近且仅仅轻微淬灭的腺嘌呤组成部分相互作用（图28）。
用单体122X修饰的单链探针和与互补或错配DNA靶的相应双链体的荧光发射光谱表现出宽且非结构化的发射峰，其最大值在λem～490nm处（图28）。SSP被具有G(122X)G上下文的探针强烈淬灭，表现出最低强度（ΦF<0.04，表65）。在具有A(122X)A和T(122X)T序列上下文的探针与互补/错配DNA靶杂交后，量子产率明显增加（表65）。相反，具有C(122X)C和G(122X)G序列上下文的探针表现出荧光强度的杂交诱导的降低（表65）。这些观察的一种解释是单体122X的共轭的芘组成部分嵌入到碱基堆积中，在那里它被邻近的胞嘧啶和鸟嘌呤组成部分淬灭（但是不被腺嘌呤和胸腺嘧啶组成部分淬灭）。
用单体122Y修饰的单链探针和与匹配或错配DNA靶的相应双链体的荧光发射光谱在λem～380nm和400nm处显示出两个良好分辨的芘峰，并在λem～420nm处具有另一个肩（图28）。除了具有A(122Y)A序列上下文的单链探针之外，观察到非常低的量子产率（ΦF<0.03，表65）。用单体122Y修饰的单链探针与匹配或错配DNA靶的杂交一般引起荧光强度降低，这与芘组成部分的嵌入结合模式相一致。
用单体122Z修饰的单链探针和与匹配或错配DNA靶的相应双链体的荧光发射光谱，在λem～410nm处显示出非结构化的峰以及λem～390nm处的较弱的肩（图28）。SSP的量子产率在从中等至高的范围内，并与前面讨论的核苷碱基的淬灭趋势（ΦF=0.05-0.58，表65）密切对应。与匹配或错配DNA靶的杂交一般引起量子产率和强度的降低或少量增加（表65）。
表65
在不存在（SSP）或存在匹配（M）或中央错配（MM）的DNA靶的情况下用单体122W/X/Y/Z修饰的单链探针的相对荧光发射量子产率（ΦF）[a]
[a]相对于乙醇中的蒽的量子产率（0.27）。在T=20℃下，使用每条链的1.0μM浓度以及λex=350nm和λem=360-510nm（单体122W、122Y和122Z）或λex=400 nm和λem=425-625nm（单体122X），在Tm缓冲液中记录。与修饰相对的核苷酸叙述在括号中。
对于特定探针与匹配/错配DNA靶之间的4种双链体，观察到非常类似的量子产率。总的来说，这些观察表明a）不论与单体相对的核苷酸如何，荧光团在双链体核心内处于类似的电子环境中，以及b）相对的核苷酸不强烈参与碱基配对并可能甚至推入到螺旋外位置中（图29）。沿着这条线，有趣地注意到，通过酶介导的相对核苷酸的螺旋外快速翻转产生的芘官能化的C-糖苷在DNA双链体中与脱碱基位点相对的放置，已知是起到稳定作用的。
通用杂交–RNA靶：研究了修饰的寡核苷酸的代表性子集（TBT/CBT上下文）与互补/错配RNA靶的热变性、吸收和荧光性质。简单描述：a）将单体122W或122X掺入到寡核苷酸中，导致对互补RNA与对DNA相似的热亲和性降低，而用单体122Y或122Z修饰的寡核苷酸更加不稳定（表66）；b）用单体122W或122X修饰的寡核苷酸表现出鲁棒的通用杂交特征（比较ON6/ON8/ON12与ON2/ON4的“错配ΔTm”值，表66），而用单体122Y或122Z修饰的寡核苷酸不是如此；c）修饰的寡核苷酸与互补或中央错配的RNA靶之间的双链体的芘吸收光谱非常类似于相应的DNA双链体；以及d）修饰的寡核苷酸与RNA靶的杂交产生与DNA靶的情况非常类似的荧光强度变化。
因此，结果表明，用单体122W/122X修饰的寡核苷酸的通用RNA杂交特征也受到与通用DNA杂交相似的机制的控制（图29）。
表66
中央修饰的寡核苷酸与互补或中央错配的RNA靶之间的双链体的Tm值[a]
[a]RNA靶：3’-GCGUU GBG UUGCG和3’-GCGUU ABA UUGCG。
260的合成。将82Q（3.40g，4.39mmol）与无水1,2-二氯乙烷（2x30mL）共蒸发，重新溶解在无水吡啶（55mL）中并冷却至0℃。加入二甲基氨基吡啶（DMAP，55mg，0.44mmol），随后逐滴加入乙酸酐（1.25mL，13.18mmol）。在室温下搅拌12h后，将反应混合物用EtOAc（150mL）稀释并用H2O（80mL）和sat.aq.NaHCO3（80mL）洗涤。将产物与EtOH：甲苯（2:1，3x30mL）共蒸发，悬浮在AcOH:H2O（4:1，55mL）中并搅拌过夜。然后将反应混合物蒸发至干并通过硅胶柱层析进行纯化（0-5%MeOH/CH2Cl2，v/v）。将适合的级份合并并蒸发至干。然后将产物在无水吡啶:CH2Cl2（1:1，2x30mL）中共蒸发，溶解在吡啶:CH2Cl2（1:1，44mL）中并冷却至-20℃。在30min内逐滴加入甲磺酰氯（MsCl，0.75mL，9.62mmol）并允许其在-20℃搅拌2h，随后将粗品用CH2Cl2（80mL）稀释，并用sat.aq.NaHCO3（50mL）洗涤。将水性层用CH2Cl2（3x15mL）反萃取，并通过与EtOH：甲苯（2:1，3x30mL）共蒸发将有机层蒸发至干。将粗品通过硅胶柱层析进行纯化（0-3%MeOH/CH2Cl2，v/v），得到作为白色泡沫的核苷260（1.43g，55%）。Rf:0.4(5%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMSm/z614.1600([M+Na]+,C30H29N3O8S·Na+,计算值614.1568)；1H NMR(DMSO-d6)δ11.48(d,IH,ex,J=2.20Hz,NH),8.03-8.36(m,8H,py),7.93(d,1H,J=7.96Hz,py),7.73(d,1H,J=8.23Hz,H6),6.39(d,1H,J=7.41,H1’),5.67(dd,1H,J=2.20Hz,8.23Hz,H5),5.39(dd,1H,J=3.57Hz,6.56Hz,H3’),4.33-4.38(m,5H,CH 2 Py,H4’,H5’),3.83(dd,1H,J=6.59Hz,7.41Hz,H2’),3.20(s,3H,CH3(Ms)),2.33(s,3H,NCH3),2.13(s,3H,CH3(Ac))；13C NMR(DMSO-d6)δ169.7,162.7,150.5,140.6(C6),131.9,130.7,130.3,130.2,129.1,127.7(py),127.3(py),127.0(py),126.8(py),126.1(py),125.1(py),124.4(py),124.2,123.8,123.7(py),102.6(C5),83.7(C5),79.9(C4’),71.7(C3’),69.1(C5’),64.9(C2’),57.5(CH2Py),37.7(NCH3),36.8(CH3,Ms),20.9(CH3,Ac)。
262的合成。将核苷260（770mg，1.30mmol）在无水1,2-二氯乙烷（3x6mL）中共蒸发并悬浮在无水EtOH（25mL）中，随后加入NaHCO3（275mg，3.25mmol），并将悬液在氩气气氛下加热回流4天。然后将反应混合物用CH2Cl2稀释，将盐过滤并用CH2Cl2洗涤。将CH2Cl2层蒸发至干并通过硅胶柱层析进行纯化（0-7%MeOH/CH2Cl2，v/v），得到作为白色泡沫的核苷262（338mg，52%）。Rf:0.3(10%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z522.1985([M+Na]+,C29H29N3O5·Na+,计算值522.1999)；)；1H NMR(DMSO-d6)δ8.40(d,1H,J=9.33Hz,Py),8.24-8.29(m,2H,Py),8.21(d,1H,J=7.96Hz,Py),8.13-8.16(m,2H,Py),8.05-8.11(m,2H,Py),7.97(d,1H,J=7.96Hz,Py),7.92(d,1H,J=7.68Hz,H6),6.34(d,1H,J=8.51Hz,H1’),5.82(d,1H,J=7.68Hz,H5),5.53(d,1H,ex,J=4.94Hz,3’-OH),5.11(t,1H,ex,J=5.21Hz,5’-OH),4.42-4.52(m,3H,CH 2 Py,H3’),4.11-4.28(m,2H,CH 2 CH3),3.97-4.02(m,1H,H4’),3.57-3.63(m,2H,H5’),3.47(dd,1H,J=5.21Hz,8.51Hz,H2’),2.36(s,3H,NCH3),1.07(t,3H,J=7.14Hz,CH2 CH 3 )；13C NMR(DMSO-d6)δ169.3,155.0,138.1(C6),132.7,130.7,130.3,130.1,129.0,127.5(Py),127.3(Py),126.9(Py),126.8(Py),126.1(Py),125.02(Py),125.00(Py),124.4(Py),124.1,123.8,123.6(Py),108.4(C5),87.6(C4’),85.0(C1’),71.2(C3’),68.8(C2’),64.2(CH2,OEt),61.7(C5’),57.1(CH2Py),39.0(NCH3),13.6(CH3,OEt)。
264的合成。将化合物262（315mg，0.63mmol）与无水1,2-二氯乙烷（2x5mL）共蒸发并重新溶解在无水吡啶（6mL）中。加入DMTr-Cl（260mg，0.76mmol）和DMAP（8mg，0.06mmol）并在室温下搅拌14h，随后将粗品混合物用CHCl3（80mL）稀释，并用sat.aq.NaHCO3（30mL）和H2O（30mL）洗涤。将水性层用CHCl3反萃取（3x15mL），将合并的有机层在Na2SO4上干燥并蒸发至干。将粗品通过硅胶柱层析进行纯化（0-2.5%MeOH/CH2Cl2，v/v），得到作为浅黄色泡沫的核苷264（445mg，88%）。Rf:0.7(10%MeOH在CH2Cl2中，v/v)；MALDI-HRMS m/z824.3319([M+Na]+,C50H47N3O7·Na+,计算值824.3306)；1H NMR(DMSO-d6)δ8.40(d,1H,J=9.33Hz,Py),8.24-8.30(m,2H,Py),8.18(d,1H,J=7.96Hz,Py),8.14(s,2H,Py)8.03-8.11(m,2H,Py),7.99(d,J=7.68Hz,Py),7.68(d,1H,J=7.68Hz,H6),7.19-7.39(m,9H,DMTr),6.83-6.90(m,4H,DMTr),6.32(d,1H,J=7.96Hz,H1’),5.59-5.64(m,2H,3’-OH,H5),4.51(m,2H,CH2Py),4.42-4.48(m,1H,H3’),4.08-4.24(m,3H,H4’,CH 2 CH3),3.71(s,3H,OCH3),3.70(s,3H,OCH3),3.51-3.58(m,1H,H2’),3.31-3.35(m,1H,H5’A),3.14-3.20(m,1H,H5’B),2.42(s,3H,NCH3),1.05(t,3H,CH2CH3)；13C NMR(DMSO-d6)δ169.2,158.09,158.08,154.9,144.5,138.1(C6),135.3,135.0,132.6,130.7,130.2,130.1,129.7(Ar),129.6(Ar),129.0,127.8(Ar),127.6(Ar),127.5(Ar),127.3(Ar),126.9(Ar),126.8(Ar),126.7(Ar),126.1(Ar),125.0(Ar),124.4(Ar),124.1,123.9,123.6(Ar),113.2(Ar),113.1(Ar),108.1(C5),85.9,85.7(C4’),85.3(C1’),71.0(C3’),68.1(C2’),64.2(CH 2 CH3),63.9(C5’),57.1(CH2Py),55.0(OCH3),38.8(NCH3),13.6(CH2 CH 3 )。
266的合成。将核苷264（435mg，0.54mmol）用氩气冲刷，并在冷冻浴上冷却至0℃。将1,1,3,3-四甲基胍（TMG，0.68mL，5.42mmol）在无水吡啶（10mL）中的溶液用氩气冲洗，并在冷冻浴上冷却至0℃。在冷却后，将吡啶溶液用硫化氢饱和1h，同时将浴的温度维持在低于0℃。然后将溶液转移至含有核苷264的预先冷却的烧瓶并使其达到室温同时搅拌72h，随后将混合物用EtOAc（100mL）稀释，并用conc.aq.NaHCO3（50mL）和H2O（50mL）洗涤。然后将水性层用CH2Cl2反萃取（3x20mL），将合并的有机层蒸发至干，并与EtOH：甲苯（2:1，3x15mL）共蒸发。然后将粗品通过硅胶柱层析进行纯化（0-70%EtOAc/石油醚，v/v），得到作为白色泡沫的核苷268（353mg，82%）。Rf:0.8(80%EtOAc在石油醚中，v/v)；MALDI-HRMS m/z812.2765([M+Na]+,C48H43N3O6S·Na+,计算值812.2797)；1H NMR(DMSO-d6)δ12.76(br d,1H,ex,J=1.65Hz,NH),8.50(d,1H,J=9.33Hz,Py),8.01-8.30(m,8H,Py),7.74(d,1H,J=8.23Hz,H6),7.18-7.41(m,10H,DMTr,H1’),6.81-6.91(m,4H,DMTr),5.61(dd,1H,J=1.65Hz,8.23Hz,H5),5.54(d,1H,ex,J=4.94,3’-OH),4.42-4.58(m,3H,CH2Py,H3’),4.06-4.11(m,1H,H4’),3.71(s,3H,OCH3),3.70(s,3H,OCH3),3.45-3.53(m,1H,H2’),3.30-3.37(m,1H,H5’A),3.15-3.24(m,1H,H5’B),2.43(s,3H,NCH3)；13C NMR(DMSO-d6)δ176.6,159.0,158.1,144.5,140.8(C6),135.3,135.0,132.6,130.7,130.3,130.2,129.7(Ar),129.6(Ar),129.2,128.0(Ar),127.9(Ar),127.6(Ar),127.3(Ar),126.9(Ar),126.8(Ar),126.7(Ar),126.1(Ar),125.0(Ar),124.9,124.4(Ar),124.1,123.9(Ar),123.8,113.24(Ar),113.21(Ar),106.9(C5),88.0(C1’),86.0,85.3(C4’),70.9(C3’),68.6(C2’),63.9(C5’),57.6(CH2Py),55.0(OCH3),39.2(NCH3)。
268的合成。向火焰干燥的10mL圆底烧瓶加入核苷266（150mg，0.19mmol）并溶解在an.CH2Cl2（2mL）中，随后加入无水二异丙基乙基胺（DIPEA，165μL，0.95mmol）和2-氰基乙基二异丙基氯亚磷酰胺（PCl试剂，85μL，0.38mmol）。将反应混合物在氩气气氛和室温下搅拌3.5h，随后将其用1mL冷EtOH淬灭，蒸发至干，并通过硅胶柱层析进行纯化（0-55%EtOAc/石油醚（v/v）），然后在冷石油醚中沉淀，得到作为白色泡沫的核苷268（153mg，81%）。Rf:0.6(50%EtOAc在石油醚中，v/v)；MALDI-HRMS m/z1012.3843([M+Na]+,C57H60N5O7PS·Na+,计算值1012.3887)；31P NMR(CDCl3)δ150.9,149.6。
用单体270修饰的单链探针的合成。简单来说，使用化合物268、作为溶剂的MeCN和作为活化剂的DCI（15min手动偶联，90-99%得率）将单体导入到探针中。使用an.MeCN中的10%叔丁基氢过氧化物（tBuOOH）作为氧化剂（2x5min氧化，10:87:3，tBuOOH，MeCN，H2O），而2,6-氨基嘌呤2’-脱氧核糖核苷单体使用MeCN和4,5-二氰基咪唑活化剂来偶联，15min，95-99%。将链从固相支持物上切下，15-17h，rt，NH4OH。通过RP-HPLC、DMT切割和冰箱中过夜沉淀来纯化。
用不配对（或凸出的）单体402-4、402-N或402-9修饰的探针。具体实施方式涉及用单体402-4、402-N或402-9修饰的探针。使用400-4、400-N或400-9，按照供应商所建议的将这些单体掺入到探针（例如寡核苷酸）中。探针的组成通过MALDI-MS分析来验证（表67），而纯度（除非另有指明，否则>80%）通过离子交换HPLC，使用装备有Gen-PakFax柱（100mm×4.6mm）的LaChrom L-7000系统（VWR International）来验证。代表性流程包括使用95%A缓冲液等度保持5min，然后在41min内使用至70%B缓冲液的线性梯度，流速为0.75mL/min（A缓冲液：25mM Tris-Cl，1mM EDTA，pH8.0；B缓冲液：1M NaCl）。
表67
用嵌入剂官能化的单体120Y、120’W、140’X和/或140’Y和不配对（或凸出的）单体402-4、402-N或402-9修饰的代表性探针的MS数据
表68
用嵌入剂官能化的单体120Y、120’W和140’X和不配对（或凸出的）单体402-4、402-N或402-9以及Cy3荧光团修饰的其他单链探针的MS数据
如图24-26和图30-39所示的用于研究靶向核酸靶、更通常地dsDNA的电泳迁移率改变测定法的实验流程：按照ROCHe AppliedBioscience推荐的流程将100pmol发夹寡核苷酸用地高辛-ddUTP标记。将等体积的100nM地高辛标记的靶发夹双链体溶液和1X HEPES缓冲液（50mM HEPES，100mM NaCl，5mM MgCl2，pH7.2，10%蔗糖，1mg/mL精胺四盐酸盐）中不同浓度（例如0.5μM、1μM、5μM、10μM、50μM）的探针双链体储用溶液混合并温育3小时，然后上样到15%非变性聚丙烯酰胺凝胶上。在100V和0℃下电泳2-3hr后，通过电转印将寡核苷酸复合物转移到带正电荷的尼龙膜，然后将其按照ROCHeApplied Bioscience推荐的用于化学发光检测的流程进行处理。将化学发光捕获在X-射线胶片上，并使用Quantity One软件对条带定量。
使用修饰的双链探针通过图1中公开的方法进行的dsDNA靶向的其他工作实例。中心实施方式要求使用具有某些链间拉链单体排列方式、更通常地一种或多种+1链间拉链排列方式的探针、更通常地双链探针，通过图1中示出的方法来靶向核酸靶、更通常地dsDNA。图34和表69示出了来自于它们的其他工作实例的结果。因此，将具有单体120Y的一种或多种+1链间拉链排列方式的各种探针以200倍过量（6.88μM）与结构化的dig标记的模型dsDNA靶，即具有通过10个胸腺嘧啶的环相连的双链靶茎区域的发夹-环（HP）[HP1：5’-GGTATATATAGGC-(T10)-GCCTATATATACC]，在室温下温育15h。使用Hepes缓冲液（50mM Hepes，100mM NaCl，10mM MgCl2，20%蔗糖，2.9mM精胺，pH7.2）。图34示出了通过探针：HP1复合物的形成监测的识别，所述复合物与HP1相比在非变性PAGE上具有迟缓的迁移率（相关概念参见图30）。侵入程度（=识别）从图34中的信号比率[100(探针：HP1)/HP1]来计算，并列表于表69中。数据证实，具有本公开单体的一种或多种+1链间排列方式的探针识别结构化dsDNA靶的双链茎。不受限于操作理论，具有本公开单体的两种或更多种+1链间排列方式的探针与具有本公开单体的单一+1链间排列方式的探针（例如参见第1-3行）相比，以相近或明显更高的效率识别dsDNA靶（例如参见第4-8行）。
表69
用单体120Y的一种或多种+1链间拉链排列方式修饰的双链探针的识别效率
图35示出了使用各种浓度的120Y-P4靶向结构化dsDNA HP1。加入具有本公开单体的两种+1链间排列方式的探针引起结构化dsDNA靶的剂量依赖性识别。在低的探针过量（例如相对于靶HP15-10倍）情况下，观察到很少识别（正如通过浅的上方条带所观察到的）。在较高探针过量（例如相对于靶HP150-500倍）的情况下，观察到明显（或完全的）识别。不受限于单一操作模式，为了促进显著识别，可能需要过量50倍或更高倍数的探针过量（相对于靶），
图36提供了代表性对照实验的结果，其证实了本公开探针的识别特异性。将探针120Y-P4以200倍过量与具有等序列（HP1）或非等序列的双链DNA靶区域（HP2-HP7）的结构化dsDNA（HP1-HP7；对于序列参见下面的表70）温育。只有在将探针120Y-P4与其等序列（正确的）靶温育时，才观察到显著的识别（第1道）。第2-7道显示没有识别或识别水平不足。这证实了使用本公开探针的dsDNA靶向是高度特异的，
表70
在图34-36中使用的等序列和非等序列dsDNA靶的序列
图37证实，观察到的“低迁移率条带”（上方条带）真的是包含两条探针链和两条靶链的识别复合物（参见图1）。换句话说，图37证实了操作模式如图1中所示。参考图37，第1道：仅仅DIG标记的HP1；第2道：仅仅DIG标记的“上方”探针链（即5’-GG(120Y)A(120Y)ATATAGGC-DIG）；第3道：仅仅DIG标记的“下方”探针链（3’-DIG-CCA(120Y)A(120Y)ATATCCG）；第4道：与未标记的HP1温育的具有DIG标记的上方链的探针（5’-GG(120Y)A(120Y)ATATAGGC-DIG+3’-CCA(120Y)A(120Y)ATATCCG）；第5道：与未标记的HP1温育的具有DIG标记的下方链的探针（5’-GG(120Y)A(120Y)ATATAGGC+3’-DIG-CCA(120Y)A(120Y)ATATCCG）；第6道：与标记的结构化靶HP1温育的未标记探针120Y-P4。继续参考图37，第1道：示出了未反应的靶的位置；第2+3道：示出了未反应的探针的位置；第4-6道涉及真实的识别实验，并显示出相同的“低迁移率条带”（上方条带），不论是只有靶还是只有一条探针链用地高辛（dig）标记。
图38涉及对照实验，其证实了为了促进双链DNA的识别，两条探针链都是需要的。将结构化dsDNA靶HP1仅仅与120Y-P4的上方（第2道；5’-GG(120Y)A(120Y)ATATAGGC）或下方（第3道；3’-CCA(120Y)A(120Y)ATATCCG）链温育，不导致识别复合物的形成（注意不存在上方斑点）。这证实为了促进dsDNA的形成需要本公开双链探针的两条链（第4道）。在第1道中，只存在dsDNA靶HP1。所有探针链都以200倍过量添加。
图39示出了对照实验的结果，其证实了未修饰的探针（即没有掺入任何本公开单体）不引起dsDNA的识别。
表71提供了来自于剂量响应和时间过程研究的结果，其中将列出的探针与结构化dsDNA靶HP1以a）不同的浓度但固定的时间（剂量响应，用于确定Kd50%=产生50%结合时的探针浓度）或b）固定浓度+变化的时间；用于确定TC50%=实现50%识别的时间）进行温育。参考表71，具有更多数量的+1拉链单体排列方式的探针表现出更有效的识别（更低的Kd值，即基于120Q的探针1.72比0.76比0.30uM；基于120Y的探针10.30、2.95、0.34uM）。不受限于单一理论模式，具有单体120Q的+1拉链排列方式的探针比单体120Y的情况更有效（更低的Kd值）。在一些但不是所有情况下，具有单体120Q的+1拉链排列方式的探针比单体120Y的情况识别更快。
表71
使用某些本公开探针的剂量响应和时间过程研究的代表性结果
图40-42示出了识别实验的结果，其中将用嵌入剂官能化的单体120Y、120’W、140’X和/或140’Y和不配对（或凸出的）单体402-4、402-N或402-9修饰的探针（对于探针参见上面的表67）与等序列的结构化dsDNA靶（即5’-GGT GGT CAA CTA TCT GGA-(T10)-TCC AGATAG TTG ACC ACC）在室温或37℃下温育。这些图示出了来自于凝胶迁移率变化测定的定量结果（类似于图30），其中使用了200倍过量的含有一个（在上部或下部链中）或两个（=对称的）“凸出部”（=彼此相对放置）的所列双链探针。
数据显示，在两种被评估的温度下，某些具有一个或两个凸出部的探针表现出与“规则”探针（即不含这样的凸出单体）不同的dsDNA识别效率。更具体来说，在37℃下：具有120Y和140’X两个+1链间排列方式并在两条链（=对称的凸出部）中另外用(402-4)、(402-N)、(402-4)3和(402-N)3修饰的探针表现出与规则探针相比相近或更加有效的dsDNA靶向。在室温下，在两条链中用402-4、402-9、402-N、(402-4)3、(402-9)3或(402-N)3修饰的所有探针表现出与规则探针相比相近或更有效的dsDNA靶向。在某些情况下，含有一个凸出部的探针与不含凸出部的规则探针（P）相比显示出更高的识别效率。不受限于一种操作理论，一个或多个凸出部单体的引入对于本文中公开的dsDNA识别事件可能是有益的。
表72示出了在将结构化的等序列dsDNA靶HP1[=5’-GGTATATATAGGC-(T10)-GCCTATATATACC]与用单体120Y和一个或多个不配对（凸出的）单体402-9的两种+1链间拉链排列方式修饰的探针温育后的识别程度（基于凝胶电泳测定法；探针以200倍过量使用）。
表72
用单体120Y和不配对（凸出的）单体402-9的+1链间拉链排列方式修饰的双链探针的Dsdna识别效率
具体实施方式包括使用具有某些链间拉链单体排列方式、更通常地一种或多种+1链间拉链排列方式的双链探针，其另外用荧光团-淬灭剂或荧光团-荧光团淬灭剂对修饰，并且能够通过图43中示出的方法靶向核酸靶、更通常地dsDNA，同时产生光学信号、更通常地荧光信号。下面的表73提供了这种实施方式的工作实例，其中使用Cy3和BHQ2（=黑洞淬灭剂2）作为代表性荧光团-淬灭剂对。参考表73，探针-靶双链体（识别反应的产物）表现出比探针明显更高的热稳定性，其能够通过图43所示的方法进行检测。
表73
具有+1链间拉链单体排列方式并另外地用荧光团-淬灭剂对（BHQ2=黑洞淬灭剂2）修饰的双链探针的代表性实例的MS
具体实施方式包括使用具有某些链间拉链单体排列方式、更通常地一种或多种+1链间拉链排列方式的双链探针，其中寡核苷酸骨架被化学修饰。下面的表74提供了其工作实例，其中双链探针的骨架用硫代磷酸酯-DNA骨架修饰完全地修饰。
表74
具有+1链间拉链单体排列方式的双链探针的代表性实例的MS，其中双链探针的骨架用硫代磷酸酯-DNA[Ps-DNA]骨架修饰完全地修饰。
与本文公开的类似的主题内容相关的其他信息，由国际专利申请号PCT/US2010/048520提供，其通过参考并入本文。
鉴于所公开的发明的原理可能适用于许多可能的实施方式，因此应该认识到，示出的实施方式仅仅是本发明的优选实例，并且不应被当作对本发明范围的限制。相反，本发明的范围由下面的权利要求书定义。因此，我们要求落于这些权利要求项的范围和精神之内的所有内容作为我们的发明。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种双链探针，其包含：
一对单体，所述的一对单体包含具有下式的第一单体：
其中每个Y独立地选自碳、氧、硫、三唑、噁唑、四唑、异噁唑和NRb，其中Rb选自氢、脂族基团、芳基、杂脂族基团和杂芳基；R1和R2选自氢、脂族基团、芳基、芳基脂族基团和含杂原子组成部分，或者R2选自含杂原子官能团；R3是含杂原子官能团；R4选自任何天然或非天然核苷碱基；R5选自适合于嵌入到核酸内的嵌入剂；“任选的连接物”选自包含烷基连接物、酰胺连接物、氨酯连接物、碳酸酯连接物、脲连接物及其组合的连接物；
具有下式的第二单体：
其中Y、R1、R2、R3、R4、R5和“任选的连接物”如对所述第一单体所述；V选自碳、氧、硫和NRb；并且n在0至4的范围内；以及
选自天然核苷酸、非天然核苷酸及其组合的至少一个核苷酸。
2.权利要求1的探针，其中所述含杂原子组成部分选自醚（RaORb）、羟基（RaOH）、甲硅烷基醚（RaRbRcSiORd）、膦（PRaRbRc）、硫醇（RaSH）、硫醚/硫化物（RaSRb）、二硫化物（RaSSRb）、异硫氰酸酯（RaNCS）、异氰酸酯（RaNCO）、胺（NH2、NHRa、NRaRb）、酰胺（RaNRbC(O)Rc）、酯（Ra℃(O)Rb）、卤素（I、Br、Cl、F）、碳酸酯（Ra℃(O)ORb）、羧基（RaC(O)OH）、羧酸根（RaCOO-）、酯（RaC(O)ORb）、酮（RaC(O)Rb）、磷酸酯（RaOP(O)OH2）、磷酰基（RaP(O)(OH)2）、亚硫酰基（RaS(O)Rb）、磺酰基（RaSO2Rb）、硫羰基（RaC(S)Rb或RaC(S)H）、亚磺基（RaS(O)OH）、磺基（RaSO3H）、酰胺（RaC(O)NRbRc）、叠氮化物（N3）、腈（RaCN）、异腈（RaN+C-）和硝基（RaNO2）；Ra表示剩余的单体结构，其在R1所指示的位置处附连于上述官能团；并且Rb、Rc和Rd独立地是氢、脂族基团、芳基、杂脂族基团、杂芳基及其任何组合。
3.权利要求1的探针，其中R2和R3独立地选自包含磷、硫、氮、氧、硒和/或金属的杂原子官能团。
4.权利要求1的探针，其中R2和R3独立地选自天然核苷酸、非天然核苷酸、非核苷连接物的磷酸酯基团或其组合。
5.权利要求1的探针，其中R2和R3独立地具有下式
其中Y选自氧、硫、NRb，其中Rb选自氢、脂族基团、芳基、杂脂族基团、杂芳基，并且W选自磷、SH或SeH。
6.权利要求1的探针，其中R2和R3独立地是
7.权利要求1的探针，其中R2和R3独立地具有下式
其中W是磷，并且每个Z独立地选自醚、硫醚、羟基和NRb 2。
8.权利要求1的探针，其中R2和R3独立地是
9.权利要求1的探针，其中R4选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、2-硫尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷、3-吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮或其任何衍生物。
10.权利要求1的探针，其中所述嵌入剂是烃或芳香族杂环。
11.权利要求1的探针，其中所述嵌入剂是选自芘、晕苯、苝、蒽、萘及其官能化衍生物的烃。
12.权利要求1的探针，其中所述嵌入剂是选自卟啉、核苷碱基、金属螯合物、氮杂芘、噻唑橙、乙锭、吲哚、吡咯、苯并咪唑及其修饰的类似物的芳香族杂环。
13.权利要求1的探针，其中所述第二单体具有下式
14.权利要求1的探针，其中所述第一单体或第二单体具有下式
15.权利要求1的探针，其中所述第二单体具有下式
16.权利要求1的探针，其中所述第一单体或第二单体具有下式
其中B选自尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、2-硫尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷、3-吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮或其任何衍生物。
17.权利要求1的探针，其中所述第一单体或第二单体具有下式
其中B选自尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、2-硫尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷、3-吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮,或其任何衍生物，并且烷基是C1-C10烷基。
18.权利要求1的探针，其中所述第二单体具有下式
其中B选自尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶。
19.权利要求1的探针，其中所述第一单体或第二单体具有下式
20.权利要求1的探针，其中所述第一单体或第二单体具有下列式中的任一个：
其中B选自尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、2-硫尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷、3-吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮或其任何衍生物；Re是H、DMTr或磷酸酯；R是苝基或晕苯基；并且Rf是H、(N(i-Pr)2)P(OCH2CH2CN)或磷酸酯。
21.权利要求1的探针，其中所述第二单体具有下列任一结构式：
22.权利要求1的探针，其中所述至少一个天然核苷酸选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。
23.权利要求1的探针，其中所述至少一个非天然核苷碱基选自C-5官能化嘧啶、C6-官能化嘧啶、C7-官能化的7-脱氮杂嘌呤、C8-官能化嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、脱氧次黄嘌呤核苷和3-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖苷基)吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮。
24.权利要求1的探针，其中所述至少一个天然核苷酸、非天然核苷酸及其组合被选择成与相应核酸序列的至少一个核苷酸基本上匹配。
25.权利要求1的探针，其具有下式
5’(B1B2…Bm)(XA)(B1B2…Bn)(XA)f(B1B2…Bo)(XA)g(B1B2…Bp)(XA)h(B1B2…Bq)(XA)i(B1B2…Br)(XA)j(B1B2…Bs)
3’(C1C2…Cm)(DP)(C1C2…Cn)(DP)f(C1C2…Co)(DP)g(C1C2…Cp)(DP)h(C1C2…Cq)(DP)i(C1C2…Cr)(DP)j(C1C2…Cs)
其中B1、B2和Bm-s可以是任何天然、非天然核苷酸或非核苷连接物，其中m-r在0至约28的范围内；f、g、h、i和j在0至10的范围内；X是所述第一单体；A是P的互补Watson-Crick碱基配对核苷酸；C是能够与B1、B2和Bm-s中的任一个Watson-Crick碱基配对的任何天然或非天然核苷酸；P是所述第二单体，并且D是X的互补Watson-Crick碱基配对核苷酸。
26.权利要求1的探针，其中所述探针被选择成识别预定的核酸靶序列。
27.权利要求26的探针，其中所述核酸靶是单链或双链的。
28.权利要求1的探针，其还包含不参与碱基配对的一个或多个凸出部单体。
29.权利要求28的探针，其中所述一个或多个凸出部单体选自
30.权利要求1的探针，其中所述第一单体和第二单体以显著减弱双链体的热稳定性的方式排列，所述双链体包含含有一个或多个所述第一单体和第二单体的两条寡核苷酸链。
31.权利要求30的探针，其中所述双链体具有与相应的未修饰的核酸双链体基本上相似或更低的热解链温度。
32.权利要求31的探针，其中所述相应的未修饰的核酸双链体不包含具有权利要求1的结构式的单体。
33.权利要求1的探针，其中所述第一单体和第二单体以+n或-n拉链取向排列，其中n在0至约10的范围内。
34.权利要求33的探针，其中所述第一单体和第二单体以+n取向排列，其中n为1。
35.权利要求1的探针，其还包含另外一对或多对单体对。
36.权利要求1的探针，其还包含能够被检测的产生信号的组成部分。
37.权利要求36的探针，其中所述产生信号的组成部分选自荧光团、特异性结合对的成员、纳米粒子及其组合。
38.权利要求37的探针，其中所述特异性结合对的成员是生物素。
39.权利要求1或权利要求36的探针，其还包含选自下列的第二实体：促进细胞摄取的第二实体；淬灭剂；能够在所述探针与核酸、蛋白质、糖类、脂类或其他生物分子之间形成键的交联剂；核酸荷载，其选自单链DNA、单链RNA、双链DNA、双链RNA、质粒或基因；及其组合。
40.权利要求1的探针，其中所述探针在溶液中、在固相表面上或与胶体材料组合使用。
41.一种单链探针，其包含选自下列的至少一个单体
其中B选自尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、2-硫尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷、3-吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮或其任何衍生物；Re是H、DMTr或磷酸酯；R是苝基或晕苯基；并且Rf是H、(N(i-Pr)2)P(OCH2CH2CN)或磷酸酯。
42.权利要求2的单链探针，其还包含选自下列的第二单体
其中B选自尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、2-硫尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷、3-吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮或其任何衍生物；Re是H、DMTr或磷酸酯；R是苝基或晕苯基；并且Rf是H、(N(i-Pr)2)P(OCH2CH2CN)或磷酸酯。
43.一种探针，其选自SEQ ID Nos.5-10、12-33、38-65、72-85、94-105、112-129、136-218、220-239和246-253中的任一个。
44.一种用于将探针与靶结合的方法，所述方法包括：
选择双链探针，所述探针包含具有下式的单体
其中每个Y独立地选自碳、氧、硫、三唑、噁唑、四唑、异噁唑和NRb，其中Rb选自氢、脂族基团、芳基、杂脂族基团和杂芳基；R1和R2选自氢、脂族基团、芳基、芳基脂族基团和含杂原子组成部分，或者R2选自含杂原子官能团；R3是含杂原子官能团；R4选自任何天然或非天然核苷碱基；R5选自适合于嵌入到核酸内的嵌入剂；“任选的连接物”选自包含烷基连接物、酰胺连接物、氨酯连接物、碳酸酯连接物、脲连接物及其组合的连接物；至少一个天然核苷酸、非天然核苷酸及其组合；
将核酸靶暴露于所述探针；以及
检测所述探针和/或探针-靶复合物。
45.权利要求44的方法，其中所述探针还包含具有选自下式的第二单体
其中V选自碳、氧、硫和NRb；并且n在0至4的范围内。
46.权利要求44或权利要求45的方法，其中所述探针被选择成与靶核酸序列基本上匹配。
47.权利要求44-46任一项的方法，其中所述核酸靶包含一个或多个多嘌呤单元。
48.权利要求44-46任一项的方法，其中所述核酸靶不包含多嘌呤单元。
49.权利要求44-48任一项的方法，其中所述核酸靶是混合序列的结构化核酸。
50.权利要求44-48任一项的方法，其中所述核酸靶是混合序列的发夹核酸靶。
51.权利要求44-50任一项的方法，其中所述核酸靶与所述探针等序列。
52.权利要求44-51任一项的方法，其中暴露包括将所述核酸靶与所述探针温育。
53.权利要求44-52任一项的方法，其中将所述核酸靶与约5倍过量的所述探针至5,000,000倍过量的所述探针温育。
54.权利要求44-52任一项的方法，其中将所述核酸靶与约5倍过量的所述探针至约500倍过量的所述探针温育。
55.权利要求44-54任一项的方法，其中所述探针-靶复合物通过荧光光谱术、电泳、吸收光谱术、流式细胞术及其组合来检测。
56.权利要求44-55任一项的方法，其中所述探针选自SEQ.ID Nos.5-10、12-33、38-65、72-85、94-105、112-129、136-218、220-239和246-253。
57.权利要求44-56任一项的方法，其中所述核酸靶是单链或双链的。
58.权利要求44-57任一项的方法，其中所述探针还包含不参与碱基配对的一个或多个凸出部单体。
59.权利要求58的方法，其中所述一个或多个凸出部单体选自
60.权利要求44-59任一项的方法，其中所述单体以显著减弱双链体的热稳定性的方式放置在所述探针中。
61.权利要求60的方法，其中所述双链体具有与相应的未修饰的核酸双链体基本上相似或更低的热解链温度。
62.权利要求45-61任一项的方法，其中第一单体和第二单体以+n或-n拉链取向排列，其中n在0至约10的范围内。
63.权利要求62的方法，其中所述第一单体和第二单体以+n取向排列，其中n为1。
64.权利要求44-63任一项的方法，其中所述靶是选自第二胰岛素、PPARγ和CEBP启动子的DNA靶。
65.权利要求44-64任一项的方法，其中所述探针被用于性别决定。
66.权利要求65的方法，其中所述探针用于哺乳动物中的性别决定。
67.权利要求66的方法，其中所述哺乳动物是有蹄类动物。
68.权利要求66的方法，其中所述哺乳动物是反刍动物。
69.权利要求66的方法，其中所述哺乳动物是牛科动物、马科动物或猪。
70.权利要求44-69任一项的方法，其中所述靶是等序列的（相对于探针）双链DNA靶区域，包括分子信标的茎、嵌入在PCR扩增子中的靶区域、嵌入在环状或线性化质粒中的靶区域、嵌入在基因组DNA中的靶区域和嵌入在微生物中的靶区域。
71.权利要求44-69任一项的方法，其中所述靶选自与B细胞和T细胞白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌和神经系统癌症相关的核酸序列。
72.权利要求44-69任一项的方法，其中所述靶选自EGFR基因（7p12；例如GENBANKTM登记号NC_000007，55054219-55242525位核苷酸）、C-MYC基因（8q24.21；例如GENBANKTM登记号NC_000008，128817498-128822856位核苷酸）、D5S271（5p15.2）、脂蛋白脂肪酶（LPL）基因（8p22；例如GENBANKTM登记号NC_000008，19841058-19869049位核苷酸）、RB1（13q14；例如GENBANKTM登记号NC_000013，47775912-47954023位核苷酸）、p53（17p13.1；例如GENBANKTM登记号NC_000017，互补的，7512464-7531642位核苷酸）、N-MYC（2p24；例如GENBANKTM登记号NC_000002，互补的，151835231-151854620位核苷酸）、CHOP（12q13；例如GENBANKTM登记号NC_000012，互补的，56196638-56200567位核苷酸）、FUS（16p11.2；例如GENBANKTM登记号NC_000016，31098954-31110601位核苷酸）、FKHR（13p14；例如GENBANKTM登记号NC_000013，互补的，40027817-40138734位核苷酸），以及例如：ALK（2p23；例如GENBANKTM登记号NC_000002，互补的，29269144-29997936位核苷酸），Ig重链，CCND1（11q13；例如GENBANKTM登记号NC_000011，69165054..69178423位核苷酸），BCL2（18q21.3；例如GENBANKTM登记号NC_000018，互补的，58941559-59137593位核苷酸），BCL6（3q27；例如GENBANKTM登记号NC_000003，互补的，188921859-188946169位核苷酸），MALF1，AP1（1p32-p31；例如GENBANKTM登记号NC_000001，互补的，59019051-59022373位核苷酸），TOP2A（17q21-q22；例如GENBANKTM登记号NC_000017，互补的，35798321-35827695位核苷酸），TMPRSS（21q22.3；例如GENBANKTM登记号NC_000021，互补的，41758351-41801948位核苷酸），ERG（21q22.3；例如GENBANKTM登记号NC_000021，互补的，38675671-38955488位核苷酸）；ETV1（7p21.3；例如GENBANKTM登记号NC_000007，互补的，13897379-13995289位核苷酸），EWS（22q12.2；例如GENBANKTM登记号NC_000022，27994271-28026505位核苷酸）；FLI1（11q24.1-q24.3；例如GENBANKTM登记号NC_000011，128069199-128187521位核苷酸），PAX3（2q35-q37；例如GENBANKTM登记号NC_000002，互补的，222772851-222871944位核苷酸），PAX7（1p36.2-p36.12；例如GENBANKTM登记号NC_000001，18830087-18935219位核苷酸），PTEN（10q23.3；例如GENBANKTM登记号NC_000010，89613175-89716382位核苷酸），AKT2（19q13.1-q13.2；例如GENBANKTM登记号NC_000019，互补的，45431556-45483036位核苷酸），MYCL1（1p34.2；例如GENBANKTM登记号NC_000001，互补的，40133685-40140274位核苷酸），REL（2p13-p12；例如GENBANKTM登记号NC_000002，60962256-61003682位核苷酸）和CSF1R（5q33-q35；例如GENBANKTM登记号NC_000005，互补的，149413051-149473128位核苷酸）。
73.权利要求44-69任一项的方法，其中所述靶选自病毒或其他微生物，并且所述探针被用于检测和/或鉴定所述微生物。
74.权利要求44-69任一项的方法，其中所述靶选自致癌或病原性病毒、细菌或细胞内寄生虫的基因组，所述细胞内寄生虫选自疟原虫属物种（Plasmodium species）、利什曼原虫属物种（Leishmania(sp.)）、小球隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）、溶组织内阿米巴（Entamoebahistolytica）、兰氏贾第鞭毛虫（Giardia lamblia）、弓形虫属（Toxoplasma）、艾美虫属（Eimeria）、泰来虫属（Theileria）和巴贝虫属（Babesia）。
75.权利要求44-69任一项的方法，其中所述靶选自人类腺病毒A（NC_001460）、人类腺病毒B（NC_004001）、人类腺病毒C（NC_001405）、人类腺病毒D（NC_002067）、人类腺病毒E（NC_003266）、人类腺病毒F（NC_001454）、人类星状病毒（NC_001943）、人类BK多瘤病毒（V01109；GI:60851）、人类博卡病毒（NC_007455）、人类冠状病毒229E（NC_002645）、人类冠状病毒HKU1（NC_006577）、人类冠状病毒NL63（NC_005831）、人类冠状病毒OC43（NC_005147）、人类肠病毒A（NC_001612）、人类肠病毒B（NC_001472）、人类肠病毒C（NC_001428）、人类肠病毒D（NC_001430）、人类红细胞病毒V9（NC_004295）、人类泡沫病毒（NC_001736）、人类疱疹病毒1（单纯性疱疹病毒1型）（NC_001806）、人类疱疹病毒2（单纯性疱疹病毒2型）（NC_001798）、人类疱疹病毒3（水痘-带状疱疹病毒）（NC_001348）、1型人类疱疹病毒4（Epstein-Barr病毒1型）（NC_007605）、2型人类疱疹病毒4（Epstein-Barr病毒2型）（NC_009334）、人类疱疹病毒5AD169毒株（NC_001347）、人类疱疹病毒5Merlin毒株（NC_006273）、人类疱疹病毒6A（NC_001664）、人类疱疹病毒6B（NC_000898）、人类疱疹病毒7（NC_001716）、M型人类疱疹病毒8（NC_003409）、P型人类疱疹病毒8（NC_009333）、人类免疫缺陷病毒1（NC_001802）、人类免疫缺陷病毒2（NC_001722）、人类偏肺病毒（NC_004148）、人类乳头瘤病毒-1（NC_001356）、人类乳头瘤病毒-18（NC_001357）、人类乳头瘤病毒-2（NC_001352）、人类乳头瘤病毒-54（NC_001676）、人类乳头瘤病毒-61（NC_001694）、人类乳头瘤病毒-cand90（NC_004104）、人类乳头瘤病毒RTRX7（NC_004761）、人类乳头瘤病毒10型（NC_001576）、人类乳头瘤病毒101型（NC_008189）、人类乳头瘤病毒103型（NC_008188）、人类乳头瘤病毒107型（NC_009239）、人类乳头瘤病毒16型（NC_001526）、人类乳头瘤病毒24型（NC_001683）、人类乳头瘤病毒26型（NC_001583）、人类乳头瘤病毒32型（NC_001586）、人类乳头瘤病毒34型（NC_001587）、人类乳头瘤病毒4型（NC_001457）、人类乳头瘤病毒41型（NC_001354）、人类乳头瘤病毒48型（NC_001690）、人类乳头瘤病毒49型（NC_001591）、人类乳头瘤病毒5型（NC_001531）、人类乳头瘤病毒50型（NC_001691）、人类乳头瘤病毒53型（NC_001593）、人类乳头瘤病毒60型（NC_001693）、人类乳头瘤病毒63型（NC_001458）、人类乳头瘤病毒6b型（NC_001355）、人类乳头瘤病毒7型（NC_001595）、人类乳头瘤病毒71型（NC_002644）、人类乳头瘤病毒9型（NC_001596）、人类乳头瘤病毒92型（NC_004500）、人类乳头瘤病毒96型（NC_005134）、人类副流感病毒1（NC_003461）、人类副流感病毒2（NC_003443）、人类副流感病毒3（NC_001796）、人类副肠孤病毒（NC_001897）、人类细小病毒4（NC_007018）、人类细小病毒B19（NC_000883）、人类呼吸道合胞病毒（NC_001781）、人类鼻病毒A（NC_001617）、人类鼻病毒B（NC_001490）、人类泡沫反转录病毒（NC_001795）、人类嗜T淋巴细胞病毒1（NC_001436）、人类嗜T淋巴细胞病毒2（NC_001488）、Epstein-Barr病毒（EBV）或人类乳头瘤病毒（HPV，例如HPV16、HPV18）、呼吸道合胞病毒、肝炎病毒（例如丙肝病毒）、冠状病毒（例如SARS病毒）、腺病毒、多瘤病毒、细胞肥大病毒（CMV）、单纯性疱疹病毒（HSV）、Her1、Her2、Her3、Her4、EGFR1、EGFR2、EGFR3、EGFR4、ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3和ErbB-4。
76.一种用于将探针与靶结合的方法，所述方法包括：
选择单链探针，所述探针包含具有下式的单体
其中B选自尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、2-硫尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷、3-吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮或其任何衍生物；Re是H、DMTr或磷酸酯；R是苝基或晕苯基；并且Rf是H、(N(i-Pr)2)P(OCH2CH2CN)或磷酸酯；至少一个天然核苷酸、非天然核苷酸及其组合；
将核酸靶暴露于所述探针；以及
检测所述探针和/或探针-靶复合物。
77.权利要求76的单链探针，其还包含选自下列的第二单体
其中B选自尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、2-硫尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷、3-吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮或其任何衍生物；Re是H、DMTr或磷酸酯；R是苝基或晕苯基；并且Rf是H、(N(i-Pr)2)P(OCH2CH2CN)或磷酸酯。
78.一种试剂盒，其包含
双链核酸探针，所述双链核酸探针包含一对单体，所述一对单体包含具有下式的第一单体
其中每个Y独立地选自碳、氧、硫、三唑、噁唑、四唑、异噁唑和NRb，其中Rb选自氢、脂族基团、芳基、杂脂族基团和杂芳基；R1和R2选自氢、脂族基团、芳基、芳基脂族基团和含杂原子组成部分，或者R2选自含杂原子官能团；R3是含杂原子官能团；R4选自任何天然或非天然核苷碱基；R5选自适合于嵌入到核酸内的嵌入剂；“任选的连接物”选自包含烷基连接物、酰胺连接物、氨酯连接物、碳酸酯连接物、脲连接物及其组合的连接物；
具有下式的第二单体
其中Y、R1、R2R3、R4、R5和“任选的连接物”如对所述第一单体所述；V选自碳、氧、硫和NRb；并且n在0至4的范围内；以及
选自天然核苷酸、非天然核苷酸及其组合的至少一个核苷酸。
79.权利要求78的试剂盒，其中所述探针包含至少一个凸出部单体。
80.权利要求79的试剂盒，其中所述一个或多个凸出部单体选自
81.权利要求78-80任一项的试剂盒，其包含选自SEQ ID NOs.5-10、12-33、38-65、72-85、94-105、112-129、136-218、220-239和246-253的序列。
82.权利要求78-81任一项的试剂盒，其用于性别决定。
83.权利要求82的试剂盒，其用于哺乳动物中的性别决定。
84.权利要求83的试剂盒，其用于哺乳动物胚胎的性别鉴定。
85.权利要求83的试剂盒，其中所述哺乳动物是有蹄类动物。
86.权利要求83的试剂盒，其中所述哺乳动物是牛科动物、马科动物或猪。
说明或声明(按照条约第19条的修改)
在替换页中，申请人对原权利要求1, 2, 4-8, 13, 15, 18, 20, 24, 26, 28-30, 32, 35-37, 39-52, 54-57, 59-70和73-77进行了修改，将原权利要求53和72删除，并且添加了新的权利要求21, 29, 41, 42, 45, 59, 66, 76, 77, 80和83。

Claims (77)

1.一种探针，其包含：
一对单体，所述一对单体包含具有下式的第一单体：
其中每个Y独立地选自碳、氧、硫、三唑、噁唑、四唑、异噁唑和NRb，其中Rb选自氢、脂族基团、芳基、杂脂族基团和杂芳基；V选自碳、氧、硫和NRb；n在0至4的范围内；R1和R2选自氢、脂族基团、芳基、芳基脂族基团和含杂原子组成部分；R3是含杂原子官能团；R4选自任何天然或非天然核苷碱基；R5选自适合于嵌入到核酸内的嵌入剂；“任选的连接物”选自包含烷基连接物、酰胺连接物、氨酯连接物、碳酸酯连接物、脲连接物及其组合的连接物；
具有下式的第二单体：
其中Y、V、R1、R2、R3、R4、R5和“任选的连接物”如对所述第一单体所述；以及
选自天然核苷酸、非天然核苷酸及其组合的至少一个核苷酸。
2.权利要求1的探针，其中所述含杂原子官能团选自醚（RaORb）、羟基（RaOH）、甲硅烷基醚（RaRbRcSiORd）、膦（PRaRbRc）、硫醇（RaSH）、硫醚/硫化物（RaSRb）、二硫化物（RaSSRb）、异硫氰酸酯（RaNCS）、异氰酸酯（RaNCO）、胺（NH2、NHRa、NRaRb）、酰胺（RaNRbC(O)Rc）、酯（RaOC(O)Rb）、卤素（I、Br、Cl、F）、碳酸酯（RaOC(O)ORb）、羧基（RaC(O)OH）、羧酸根（RaCOO-）、酯（RaC(O)ORb）、酮（RaC(O)Rb）、磷酸酯（RaOP(O)OH2）、磷酰基（RaP(O)(OH)2）、亚硫酰基（RaS(O)Rb）、磺酰基（RaSO2Rb）、硫羰基（RaC(S)Rb或RaC(S)H）、亚磺基（RaS(O)OH）、磺基（RaSO3H）、酰胺（RaC(O)NRbRc）、叠氮化物（N3）、腈（RaCN）、异腈（RaN+C-）和硝基（RaNO2）；Ra表示剩余的单体结构，其在R1所指示的位置处附连于上述官能团；并且Rb、Rc和Rd独立地是氢、脂族基团、芳基、杂脂族基团、杂芳基及其任何组合。
3.权利要求1的探针，其中R2和R3独立地选自包含磷、硫、氮、氧、硒和/或金属的杂原子官能团。
4.权利要求1的探针，其中R2和R3独立地选自天然核苷酸、非天然核苷酸的磷酸酯基团或其组合。
5.权利要求1的探针，其中R3具有下式
其中Y选自氧、硫、NRb，其中Rb选自氢、脂族基团、芳基、杂脂族基团、杂芳基，并且W选自磷、SH或SeH。
6.权利要求1的探针，其中R3是
7.权利要求1的探针，其中R3具有下式
其中W是磷，并且每个Z独立地选自醚、硫醚、羟基和NRb 2。
8.权利要求1的探针，其中R3是
9.权利要求1的探针，其中R4选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、2-硫尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷、3-吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮或其任何衍生物。
10.权利要求1的探针，其中所述嵌入剂是烃或芳香族杂环。
11.权利要求1的探针，其中所述嵌入剂是选自芘、晕苯、苝、蒽、萘及其官能化衍生物的烃。
12.权利要求1的探针，其中所述嵌入剂是选自卟啉、核苷碱基、金属螯合物、氮杂芘、噻唑橙、乙锭、吲哚、吡咯、苯并咪唑及其修饰的类似物的芳香族杂环。
13.权利要求1的探针，其中所述第一单体或第二单体具有下式
14.权利要求1的探针，其中所述第一单体或第二单体具有下式
15.权利要求1的探针，其中所述第一单体或第二单体具有下式
16.权利要求1的探针，其中所述第一单体或第二单体具有下式
其中B选自尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、2-硫尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷、3-吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮或其任何衍生物。
17.权利要求1的探针，其中所述第一单体或第二单体具有下式
其中B选自尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、2-硫尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷、3-吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮，或其任何衍生物，并且烷基是C1-C10烷基。
18.权利要求1的探针，其中所述第一单体或第二单体具有下式
其中B选自尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶。
19.权利要求1的探针，其中所述第一单体或第二单体具有下式
20.权利要求1的探针，其中所述第一单体或第二单体具有下列式中的任一个：
其中B选自尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、2-硫尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷、3-吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮或其任何衍生物；Re是H、DMTr或磷酸酯；并且Rf是H、(N(i-Pr)2)P(OCH2CH2CN)或磷酸酯。
21.权利要求1的探针，其中所述至少一个天然核苷酸选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。
22.权利要求1的探针，其中所述至少一个非天然核苷碱基选自C-5官能化嘧啶、C6-官能化嘧啶、C7-官能化的7-脱氮杂嘌呤、C8-官能化嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、脱氧次黄嘌呤核苷和3-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖苷基)吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮。
23.权利要求1的探针，其中所述至少一个天然核苷酸、非天然核苷酸及其组合被选择成与相应核酸序列的至少一个核苷酸基本上匹配。
24.权利要求1的探针，其具有下式
5’(B1B2…Bm)(XA)(B1B2…Bn)(XA)f(B1B2…Bo)(XA)g(B1B2…Bp)(XA)h(B1B2…Bq)(XA)i(B1B2…Br)(XA)j(B1B2…Bs)
3’(C1C2…Cm)(DP)(C1C2…Cn)(DP)f(C1C2…Co)(DP)g(C1C2…Cp)(DP)h(C1C2…Cq)(DP)i(C1C2…Cr)(DP)j(C1C2…Cs)
其中B1、B2和Bm-s可以是任何天然或非天然核苷酸，其中m-r在0至约28的范围内；f、g、h、i和j在0至10的范围内；X是所述第一单体；A是P的互补Watson-Crick碱基配对核苷酸；C是能够与B1、B2和Bm-s中的任一个Watson-Crick碱基配对的任何天然或非天然核苷酸；P是所述第二单体，并且D是X的互补Watson-Crick碱基配对核苷酸。
25.权利要求1的探针，其中所述探针被选择成识别预定的核酸靶序列。
26.权利要求19的探针，其中所述核酸靶是单链或双链的。
27.权利要求1的探针，其还包含不参与碱基配对的一个或多个凸出部单体。
28.权利要求1的探针，其中所述第一单体和第二单体以显著减弱双链体的热稳定性的方式排列。
29.权利要求22的探针，其中所述双链体具有与核酸双链体基本上相似的热解链温度。
30.权利要求23的探针，其中所述未修饰的核酸双链体不包含具有权利要求1的结构式的单体。
31.权利要求1的探针，其中所述第一单体和第二单体以+n或-n拉链取向排列，其中n在0至约10的范围内。
32.权利要求25的探针，其中所述第一单体和第二单体以+n取向排列，其中n为1。
33.权利要求1的探针，其还包含另外一对或多对单体对。
34.权利要求1的探针，其还包含能够被检测的产生信号的组成部分。
35.权利要求28的探针，其中所述产生信号的组成部分选自荧光团、特异性结合对的成员、纳米粒子及其组合。
36.权利要求29的探针，其中所述特异性结合对的成员是生物素。
37.权利要求30的探针，其还包含第二实体，所述第二实体促进细胞摄取，是淬灭剂，是能够在所述探针与核酸、蛋白质、糖类、脂类或其他生物分子之间形成键的交联剂，是核酸荷载、单链DNA、单链RNA、双链DNA、双链RNA、质粒或基因。
38.权利要求1的探针，其中所述探针在溶液中、在固相表面上或与胶体材料组合使用。
39.一种探针，其选自SEQ ID Nos.1-253中的任一个。
40.一种用于将探针与靶结合的方法，所述方法包括：
选择探针，所述探针包含具有下式的单体
其中每个Y独立地选自碳、氧、硫、三唑、噁唑、四唑、异噁唑或者是NRb，其中Rb选自氢、脂族基团、芳基、杂脂族基团和杂芳基；V选自碳、氧、硫和NRb；n在0至4的范围内；R1和R2选自氢、脂族基团、芳基、芳基脂族基团和含杂原子组成部分；R3是含杂原子官能团；R4选自任何天然或非天然核苷碱基；R5选自适合于偶联到核酸或与核酸结合的任何官能团；
至少一个天然核苷酸、非天然核苷酸及其组合；
将核酸靶暴露于所述探针；以及
检测所述探针。
41.权利要求40的方法，其中所述探针被选择成与靶核酸序列基本上匹配。
42.权利要求40的方法，其中所述核酸靶包含一个或多个多嘌呤单元。
43.权利要求40的方法，其中所述核酸靶不包含多嘌呤单元。
44.权利要求40的方法，其中所述核酸靶是混合序列的结构化核酸。
45.权利要求44的方法，其中所述核酸靶是混合序列的发夹DNA靶。
46.权利要求40的方法，其中所述核酸靶与所述探针等序列。
47.权利要求40的方法，其中暴露包括将所述核酸靶与所述探针温育。
48.权利要求40的方法，其中将所述核酸靶与约5倍过量的所述探针至5,000,000倍过量的所述探针温育。
49.权利要求40的方法，其中将所述核酸靶与约5倍过量的所述探针至约500倍过量的所述探针温育。
50.权利要求40的方法，其中所述探针通过荧光光谱术、电泳、吸收光谱术、流式细胞术及其组合来检测。
51.权利要求40的方法，其中所述探针选自SEQ.ID Nos.1-253。
52.权利要求40的方法，其中所述核酸靶是单链或双链的。
53.权利要求40的方法，其中所述核酸靶是双链的，并且所述探针是双链的。
54.权利要求40的方法，其中所述探针还包含不参与碱基配对的一个或多个凸出部单体。
55.权利要求40的方法，其中所述单体以显著减弱双链体的热稳定性的方式放置在所述探针中。
56.权利要求55的方法，其中所述双链体具有与未修饰的核酸双链体基本上相似的热解链温度。
57.权利要求41的方法，其中第一单体和第二单体以+n或-n拉链取向排列，其中n在0至约10的范围内。
58.权利要求57的方法，其中所述第一单体和第二单体以+n取向排列，其中n为1。
59.权利要求40的方法，其中所述靶是选自第二胰岛素、PPARγ和CEBP启动子的DNA靶。
60.权利要求40的方法，其中所述探针用于哺乳动物中的性别决定。
61.权利要求60的方法，其中所述哺乳动物是有蹄类动物。
62.权利要求60的方法，其中所述哺乳动物是反刍动物。
63.权利要求60的方法，其中所述哺乳动物是牛科动物、马科动物或猪。
64.权利要求40的方法，其中所述靶是等序列的（相对于探针）双链DNA靶区域，包括分子信标的茎、嵌入在PCR扩增子中的靶区域、嵌入在环状或线性化质粒中的靶区域、嵌入在基因组DNA中的靶区域和嵌入在微生物中的靶区域。
65.权利要求40的方法，其中所述靶选自与B细胞和T细胞白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌和神经系统癌症相关的核酸序列。
66.权利要求40的方法，其中所述靶选自EGFR基因（7p12；例如GENBANKTM登记号NC_000007，55054219-55242525位核苷酸）、C-MYC基因（8q24.21；例如GENBANKTM登记号NC_000008，128817498-128822856位核苷酸）、D5S271（5p15.2）、脂蛋白脂肪酶（LPL）基因（8p22；例如GENBANKTM登记号NC_000008，19841058-19869049位核苷酸）、RB1（13q14；例如GENBANKTM登记号NC_000013，47775912-47954023位核苷酸）、p53（17p13.1；例如GENBANKTM登记号NC_000017，互补的，7512464-7531642位核苷酸）、N-MYC（2p24；例如GENBANKTM登记号NC_000002，互补的，151835231-151854620位核苷酸）、CHOP（12q13；例如GENBANKTM登记号NC_000012，互补的，56196638-56200567位核苷酸）、FUS（16p11.2；例如GENBANKTM登记号NC_000016，31098954-31110601位核苷酸）、FKHR（13p14；例如GENBANKTM登记号NC_000013，互补的，40027817-40138734位核苷酸），以及例如：ALK（2p23；例如GENBANKTM登记号NC_000002，互补的，29269144-29997936位核苷酸），Ig重链，CCND1（11q13；例如GENBANKTM登记号NC_000011，69165054..69178423位核苷酸），BCL2（18q21.3；例如GENBANKTM登记号NC_000018，互补的，58941559-59137593位核苷酸），BCL6（3q27；例如GENBANKTM登记号NC_000003，互补的，188921859-188946169位核苷酸），MALF1，AP1（1p32-p31；例如GENBANKTM登记号NC_000001，互补的，59019051-59022373位核苷酸），TOP2A（17q21-q22；例如GENBANKTM登记号NC_000017，互补的，35798321-35827695位核苷酸），TMPRSS（21q22.3；例如GENBANKTM登记号NC_000021，互补的，41758351-41801948位核苷酸），ERG（21q22.3；例如GENBANKTM登记号NC_000021，互补的，38675671-38955488位核苷酸）；ETV1（7p21.3；例如GENBANKTM登记号NC_000007，互补的，13897379-13995289位核苷酸），EWS（22q12.2；例如GENBANKTM登记号NC_000022，27994271-28026505位核苷酸）；FLI1（11q24.1-q24.3；例如GENBANKTM登记号NC_000011，128069199-128187521位核苷酸），PAX3（2q35-q37；例如GENBANKTM登记号NC_000002，互补的，222772851-222871944位核苷酸），PAX7（1p36.2-p36.12；例如GENBANKTM登记号NC_000001，18830087-18935219位核苷酸），PTEN（10q23.3；例如GENBANKTM登记号NC_000010，89613175-89716382位核苷酸），AKT2（19q13.1-q13.2；例如GENBANKTM登记号NC_000019，互补的，45431556-45483036位核苷酸），MYCL1（1p34.2；例如GENBANKTM登记号NC_000001，互补的，40133685-40140274位核苷酸），REL（2p13-p12；例如GENBANKTM登记号NC_000002，60962256-61003682位核苷酸）和CSF1R（5q33-q35；例如GENBANKTM登记号NC_000005，互补的，149413051-149473128位核苷酸）。
67.权利要求40的方法，其中所述靶选自病毒或其他微生物，并且所述探针被用于检测和/或鉴定所述微生物。
68.权利要求40的方法，其中所述靶选自致癌或病原性病毒、细菌或细胞内寄生虫的基因组，所述细胞内寄生虫选自疟原虫属物种（Plasmodium species）、利什曼原虫属物种（Leishmania(sp.)）、小球隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）、溶组织内阿米巴（Entamoebahistolytica）、兰氏贾第鞭毛虫（Giardia lamblia）、弓形虫属（Toxoplasma）、艾美虫属（Eimeria）、泰来虫属（Theileria）和巴贝虫属（Babesia）。
69.权利要求40的方法，其中所述靶选自人类腺病毒A（NC_001460）、人类腺病毒B（NC_004001）、人类腺病毒C（NC_001405）、人类腺病毒D（NC_002067）、人类腺病毒E（NC_003266）、人类腺病毒F（NC_001454）、人类星状病毒（NC_001943）、人类BK多瘤病毒（V01109；GI:60851）、人类博卡病毒（NC_007455）、人类冠状病毒229E（NC_002645）、人类冠状病毒HKU1（NC_006577）、人类冠状病毒NL63（NC_005831）、人类冠状病毒OC43（NC_005147）、人类肠病毒A（NC_001612）、人类肠病毒B（NC_001472）、人类肠病毒C（NC_001428）、人类肠病毒D（NC_001430）、人类红细胞病毒V9（NC_004295）、人类泡沫病毒（NC_001736）、人类疱疹病毒1（单纯性疱疹病毒1型）（NC_001806）、人类疱疹病毒2（单纯性疱疹病毒2型）（NC_001798）、人类疱疹病毒3（水痘-带状疱疹病毒）（NC_001348）、1型人类疱疹病毒4（Epstein-Barr病毒1型）（NC_007605）、2型人类疱疹病毒4（Epstein-Barr病毒2型）（NC_009334）、人类疱疹病毒5AD169毒株（NC_001347）、人类疱疹病毒5Merlin毒株（NC_006273）、人类疱疹病毒6A（NC_001664）、人类疱疹病毒6B（NC_000898）、人类疱疹病毒7（NC_001716）、M型人类疱疹病毒8（NC_003409）、P型人类疱疹病毒8（NC_009333）、人类免疫缺陷病毒1（NC_001802）、人类免疫缺陷病毒2（NC_001722）、人类偏肺病毒（NC_004148）、人类乳头瘤病毒-1（NC_001356）、人类乳头瘤病毒-18（NC_001357）、人类乳头瘤病毒-2（NC_001352）、人类乳头瘤病毒-54（NC_001676）、人类乳头瘤病毒-61（NC_001694）、人类乳头瘤病毒-cand90（NC_004104）、人类乳头瘤病毒RTRX7（NC_004761）、人类乳头瘤病毒10型（NC_001576）、人类乳头瘤病毒101型（NC_008189）、人类乳头瘤病毒103型（NC_008188）、人类乳头瘤病毒107型（NC_009239）、人类乳头瘤病毒16型（NC_001526）、人类乳头瘤病毒24型（NC_001683）、人类乳头瘤病毒26型（NC_001583）、人类乳头瘤病毒32型（NC_001586）、人类乳头瘤病毒34型（NC_001587）、人类乳头瘤病毒4型（NC_001457）、人类乳头瘤病毒41型（NC_001354）、人类乳头瘤病毒48型（NC_001690）、人类乳头瘤病毒49型（NC_001591）、人类乳头瘤病毒5型（NC_001531）、人类乳头瘤病毒50型（NC_001691）、人类乳头瘤病毒53型（NC_001593）、人类乳头瘤病毒60型（NC_001693）、人类乳头瘤病毒63型（NC_001458）、人类乳头瘤病毒6b型（NC_001355）、人类乳头瘤病毒7型（NC_001595）、人类乳头瘤病毒71型（NC_002644）、人类乳头瘤病毒9型（NC_001596）、人类乳头瘤病毒92型（NC_004500）、人类乳头瘤病毒96型（NC_005134）、人类副流感病毒1（NC_003461）、人类副流感病毒2（NC_003443）、人类副流感病毒3（NC_001796）、人类副肠孤病毒（NC_001897）、人类细小病毒4（NC_007018）、人类细小病毒B19（NC_000883）、人类呼吸道合胞病毒（NC_001781）、人类鼻病毒A（NC_001617）、人类鼻病毒B（NC_001490）、人类泡沫反转录病毒（NC_001795）、人类嗜T淋巴细胞病毒1（NC_001436）、人类嗜T淋巴细胞病毒2（NC_001488）、Epstein-Barr病毒（EBV）或人类乳头瘤病毒（HPV，例如HPV16、HPV18）、呼吸道合胞病毒、肝炎病毒（例如丙肝病毒）、冠状病毒（例如SARS病毒）、腺病毒、多瘤病毒、细胞肥大病毒（CMV）、单纯性疱疹病毒（HSV）、Her1、Her2、Her3、Her4、EGFR1、EGFR2、EGFR3、EGFR4、ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3和ErbB-4。
70.一种试剂盒，其包含核酸探针，所述核酸探针包含具有下式的至少一个单体
其中每个Y独立地选自碳、氧、硫、三唑、噁唑、四唑、异噁唑和NRb，其中Rb选自氢、脂族基团、芳基、杂脂族基团和杂芳基；V选自碳、氧、硫和NRb；n在0至4的范围内；R1和R2选自氢、脂族基团、芳基、芳基脂族基团和含杂原子组成部分；R3是含杂原子官能团；R4选自任何天然或非天然核苷碱基；R5选自适合于嵌入到核酸内的嵌入剂；“任选的连接物”选自包含烷基连接物、酰胺连接物、氨酯连接物、碳酸酯连接物、脲连接物及其组合的连接物。
71.权利要求70的试剂盒，其中所述探针包含至少一个凸出部单体。
72.权利要求70的试剂盒，其包含dsDNA探针。
73.权利要求70的试剂盒，其包含选自SEQ ID NOs.1-254的序列。
74.权利要求70的试剂盒，其用于哺乳动物中的性别决定。
75.权利要求70的试剂盒，其用于哺乳动物胚胎的性别鉴定。
76.权利要求74的试剂盒，其中所述哺乳动物是有蹄类动物。
77.权利要求75的试剂盒，其中所述哺乳动物是牛科动物、马科动物或猪。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107267599A (zh) * 2017-04-24 2017-10-20 倪燕翔 核酸的精确识别方法
CN110582283A (zh) * 2016-11-23 2019-12-17 阿尔尼拉姆医药品有限公司 具有降低的脱靶效应的修饰的rna试剂
CN111926096A (zh) * 2020-08-21 2020-11-13 江南大学 一种利用pcr技术检测卵形疟原虫感染的方法

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0923225A2 (pt) 2008-12-02 2016-10-04 Chiralgen Ltd metodo para sintese de acidos nucleicos modificados no atomo de fosforo
CN102596204B (zh) 2009-07-06 2016-11-23 波涛生命科学有限公司 新的核酸前药及其使用方法
JP5868324B2 (ja) 2010-09-24 2016-02-24 株式会社Ｗａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｊａｐａｎ 不斉補助基
US9605019B2 (en) 2011-07-19 2017-03-28 Wave Life Sciences Ltd. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
ES2862073T3 (es) 2012-07-13 2021-10-06 Wave Life Sciences Ltd Grupo auxiliar asimétrico
WO2014160739A2 (en) * 2013-03-27 2014-10-02 Cellmosaic Inc. Trifluoroborate mass spectrometric tags
KR20220106232A (ko) 2014-01-16 2022-07-28 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 디자인
WO2016001314A1 (en) 2014-07-02 2016-01-07 Syddansk Universitet Rationally designed 2'-(h-1,2,3-triazoyl)-methoxy oligonucleotide probes for fluoresence-based bioanalysis
EP3221330A4 (en) 2014-11-18 2018-08-29 Zata Pharmaceuticals Inc. Phosphoramidite synthones for the synthesis of self-neutralizing oligonucleotide compounds
TW201718618A (zh) * 2015-09-18 2017-06-01 田邊三菱製藥股份有限公司 架橋型核酸ＧｕＮＡ，其製造方法，及中間體化合物
CN106636454B (zh) * 2015-10-28 2021-08-03 中国科学院上海巴斯德研究所 一种同时检测人冠状病毒229e，oc43，nl63和hku1的实时荧光多重rt-pcr方法
KR20190058477A (ko) 2016-08-17 2019-05-29 솔스티스 바이올로직스, 리미티드 폴리뉴클레오티드 구축물
US11597744B2 (en) 2017-06-30 2023-03-07 Sirius Therapeutics, Inc. Chiral phosphoramidite auxiliaries and methods of their use
KR20210018267A (ko) 2018-05-07 2021-02-17 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 간외 전달
CA3116588A1 (en) * 2018-10-26 2020-04-30 Zata Pharmaceuticals, Inc. Detection method for natural and modified small nucleic acids
CA3119580A1 (en) 2018-11-12 2020-05-22 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Crosslinked artificial nucleic acid alna
EP3947388A4 (en) 2019-04-02 2022-12-21 Aligos Therapeutics, Inc. LINKS DIRECTED AGAINST PRMT5
US20220249389A1 (en) 2019-07-12 2022-08-11 Oregon Health & Science University Immunotherapeutic constructs and methods of their use
EP3996750A4 (en) 2019-07-12 2024-01-03 Oregon Health & Science University THERAPEUTIC CONSTRUCTS FOR SIMULTANEOUS ADMINISTRATION OF MITOTIC HIBITOR AND IMMUNE CHECKPOINT INHIBITOR

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7282575B2 (en) * 2000-12-26 2007-10-16 Credia Japan Co., Ltd. Functional peptide nucleic acid monomer and process for producing the same
WO2011032034A2 (en) * 2009-09-10 2011-03-17 University Of Idaho Nucleobase-functionalized conformationally restricted nucleotides and oligonucleotides for targeting nucleic acids

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5514786A (en) 1990-01-11 1996-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for inhibiting RNA activity
EP0701564A1 (en) 1993-03-31 1996-03-20 Sanofi Bifunctional nucleosides, oligomers thereof, and methods of making and using the same
US5623068A (en) 1994-03-07 1997-04-22 Beckman Instruments, Inc. Synthesis of DNA using substituted phenylacetyl-protected nucleotides
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
JP4238381B2 (ja) 1998-07-17 2009-03-18 株式会社島津製作所 ピレン修飾ｒｎａ、およびｒｎａの分析方法
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
EP1161439B1 (en) 1999-03-18 2010-04-21 Exiqon A/S Xylo-lna analogues
US7037654B2 (en) 1999-04-30 2006-05-02 Aclara Biosciences, Inc. Methods and compositions for enhancing detection in determinations employing cleavable electrophoretic tag reagents
ATE356824T1 (de) 1999-05-04 2007-04-15 Santaris Pharma As L-ribo-lna analoge
CA2416631C (en) 2000-08-03 2011-11-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleic acid binding compounds containing pyrazolo[3,4-d]pyrimidine analogues of purin-2,6-diamine and their uses
US6998484B2 (en) 2000-10-04 2006-02-14 Santaris Pharma A/S Synthesis of purine locked nucleic acid analogues
WO2002038578A1 (en) 2000-11-09 2002-05-16 Jyoti Chattopadhyaya Modified nucleosides and nucleotides and use thereof
WO2003039523A2 (en) 2001-11-05 2003-05-15 Exiqon A/S OLIGONUCLEOTIDES MODIFIED WITH NOVEL α-L-RNA ANALOGUES
US20050053939A1 (en) 2001-11-09 2005-03-10 Ahmed Chenna Methods and compositions for enhancing detection in determinations employing cleavable electrophoretic tag reagents
WO2003051901A2 (en) 2001-12-18 2003-06-26 Human Genetic Signatures Pty Ltd Pseudonucleotide comprising an intercalator
US20040219565A1 (en) 2002-10-21 2004-11-04 Sakari Kauppinen Oligonucleotides useful for detecting and analyzing nucleic acids of interest
GB2395557A (en) 2002-11-22 2004-05-26 Dynal Biotech Ltd Nucleic acid probes
US7002006B2 (en) 2003-02-12 2006-02-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Protection of nucleosides
US7276599B2 (en) 2003-06-02 2007-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide synthesis with alternative solvents
US7202036B2 (en) 2003-06-12 2007-04-10 Los Alamos National Security, Llc Quenching methods for background reduction in luminescence-based probe-target binding assays
US7575863B2 (en) 2004-05-28 2009-08-18 Applied Biosystems, Llc Methods, compositions, and kits comprising linker probes for quantifying polynucleotides
CA2580145C (en) 2004-09-10 2014-10-28 Human Genetic Signatures Pty Ltd Amplification blocker comprising intercalating nucleic acids (ina) containing intercalating pseudonucleotides (ipn)
US7741294B1 (en) 2005-05-14 2010-06-22 Steven Albert Benner Non-standard nucleobases implementing the isocytidine and isoguanosine hydrogen bonding patterns
NZ571966A (en) 2006-03-16 2011-09-30 Pentabase Aps Oligonucleotides comprising signalling pairs and hydrophobic nucleotides, stemless beacons, for detection of nucleic acids, methylation status and mutants of nucleic acids
WO2008061311A2 (en) 2006-11-22 2008-05-29 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved hybridisation of nucleic acids
DK2149605T3 (da) 2007-03-22 2013-09-30 Santaris Pharma As Korte RNA antagonist forbindelser til modulering af det ønskede mRNA
BRPI0811710A2 (pt) 2007-06-22 2014-10-14 Keygene Nv Troca de nucleotídeo alvo com oligonucleotídes modificados melhorados
AU2008284024A1 (en) 2007-08-03 2009-02-12 Novartis Ag In-situ hybridization to detect RNA and DNA markers
KR100886139B1 (ko) 2007-11-13 2009-02-27 주식회사 삼천리제약 올리고뉴클레오타이드의 제조방법
BRPI0820738A2 (pt) 2007-12-14 2015-06-16 Minitube America Inc Separação específica do gênero de células de esperma e embriões
WO2010003420A2 (en) 2008-06-17 2010-01-14 Gentofte Hospital Treatment of psoriasis and related diseases by mirna modulation
US8541569B2 (en) 2008-09-06 2013-09-24 Chemgenes Corporation Phosphoramidites for synthetic RNA in the reverse direction, efficient RNA synthesis and convenient introduction of 3'-end ligands, chromophores and modifications of synthetic RNA
US20120040857A1 (en) 2009-02-13 2012-02-16 The General Hospital Corporation Isolation of factors that associate directly or indirectly with chromatin
US20130079505A1 (en) 2010-03-24 2013-03-28 Mirrx Therapeutics A/S Bivalent antisense oligonucleotides

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7282575B2 (en) * 2000-12-26 2007-10-16 Credia Japan Co., Ltd. Functional peptide nucleic acid monomer and process for producing the same
WO2011032034A2 (en) * 2009-09-10 2011-03-17 University Of Idaho Nucleobase-functionalized conformationally restricted nucleotides and oligonucleotides for targeting nucleic acids

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ATSUSHI MAHARA, ET AL: "Detection of Acceptor Sites for Antisense Oligonucleotides on Native Folded RNA by Fluorescence Spectroscopy", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY》 *
MICHAEL PRINTZ, ET AL: "Optimizing the Stacking Moiety and Linker of 2"-Acylamido Caps of DNA Duplexes with 3"-Terminal Adenine Residues", 《J. COMB. CHEM.》 *
MITSUO SEKINE, ET AL: "Synthesis and hybridization properties of 2"-O-methylated oligoribonucleotides incorporating 2¢-O-naphthyluridines", 《ORG. BIOMOL. CHEM.》 *
MITSUO SEKINE, ET AL: "Synthesis and hybridization properties of 2"-O-methylated oligoribonucleotides incorporating 2¢-O-naphthyluridines", 《ORG. BIOMOL. CHEM.》, vol. 9, 1 January 2011 (2011-01-01), pages 210 - 218 *
NEERJA KALRA, ET AL: "Conformationally controlled high-affinity targeting of RNA or DNA by novel 2-amino-DNA/LNA mixmers and pyrenyl-functionalized 2-amino-DNA", 《ORG. BIOMAOL. CHEM.》 *
NEERJA KALRA, ET AL: "DNA and LNA oligonucleotides containing N20-functionalised derivatives of 20-amino-20-deoxyuridine", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS》 *
PATRICK J. HRDLICKA, ET AL: "Targeting of mixed sequence double-stranded DNA using pyrene-functionalized 29-amino-a-L-LNA", 《CHEM. COMMUN.》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110582283A (zh) * 2016-11-23 2019-12-17 阿尔尼拉姆医药品有限公司 具有降低的脱靶效应的修饰的rna试剂
CN110582283B (zh) * 2016-11-23 2024-01-02 阿尔尼拉姆医药品有限公司 具有降低的脱靶效应的修饰的rna试剂
CN107267599A (zh) * 2017-04-24 2017-10-20 倪燕翔 核酸的精确识别方法
CN107267599B (zh) * 2017-04-24 2021-04-16 倪燕翔 核酸的精确识别方法
CN111926096A (zh) * 2020-08-21 2020-11-13 江南大学 一种利用pcr技术检测卵形疟原虫感染的方法
CN111926096B (zh) * 2020-08-21 2022-01-11 江南大学 一种利用pcr技术检测卵形疟原虫感染的方法

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