JP6084929B2 - Dnaの標的改変 - Google Patents
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Description
以下の説明および実施例では、いくつかの用語が使用される。そのような用語に与えられる範囲を含む明細書および請求項の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。本明細書中で別段定義されない限り、使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。すべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献の開示は、それらの全体が本明細書中で参考として援用される。
1つの態様において、本発明は、二重鎖アクセプターDNA配列の標的改変のための方法に関する。
TNEは、オリゴヌクレオチドを細胞に導入することを含み、ここで、そのオリゴヌクレオチドは、ゲノムの標的遺伝子座に、そのオリゴヌクレオチド中のミスマッチヌクレオチドによってもたらされる変異を誘導する。
構築物
機能性のGFPオープンリーディングフレームを合成し、そのコドン使用頻度を、ナス科で使用するために最適化した。図1に示されるように、82位のヌクレオチドを変化させて(GからTに)GFPのバリアントを作製した。これによって、インフレームの終止コドンが生じ、得られるタンパク質のアミノ酸配列を図2に示す。GFP ORF(GFP WT)および終止コドンを有するGFPバリアント(GFP−STOP)を、植物細胞での遺伝子発現用のCaMV35Sプロモーターを含むpUCベースのベクターのマルチクローニングサイトにXhoI−SacIフラグメントとしてクローニングした。これによって、構築物pKG7381(GFP−WT)およびpKG7384(GFP−STOP)を得た。さらに、GFPを、翻訳によって6×HISタグおよびNLS(核局在化シグナル配列)に融合することにより、プロトプラスト核へのGFPタンパク質の蓄積が促進され、ゆえに、本発明者らのGFP陽性細胞のスコア付け能力が改善された。これらの構築物を図3に示す。
上記GFP遺伝子中の終止コドンを修復するオリゴヌクレオチドを表1に示す。
この実施例の原材料は、25/20℃(昼/夜)の温度および80μE.m−2.s−1の光子束密度(16/24hの明期)でガラスジャー(750ml)内のMS20培地中で無菌的に生育されたタバコのインビトロシュート培養物だった。MS20培地は、2%(w/v)スクロースおよび0.8%Difco寒天を含むがホルモン無添加の基本的なMurashige−Skoog培地(Murashige,T.and Skoog,F.,Physiologia Plantarum,15:473−497,1962)である。上記シュートを3週間毎に新鮮培地に継代した。
BioRad Gene Pulser装置をエレクトロポレーションのために使用した。エレクトロポレーション培地としてPHBS(10mM Hepes,pH7.2;0.2Mマンニトール、150mM NaCl;5mM CaCl2)およびエレクトロポレーション混合物において約1×106/mlのプロトプラスト密度を使用し、エレクトロポレーションの設定は、250V(625Vcm−1)の電荷および800μFのキャパシタンスとし、パルスと培養との間の回復時間は10分間とした。各エレクトロポレーションにおいて、800マイクロリットルのエレクトロポレーションにつき、約2μgの総オリゴヌクレオチドおよび20μgのKG7381またはKG7384を使用した。
構築物KG7381(GFP−WT)をタバコプロトプラストにエレクトロポレートしたとき、インキュベーションのおよそ20時間後に、核に位置する強いGFPシグナルが観察された。このシグナルは、GFP ORFの強い一過性の発現に起因するものである。このシグナルは、おそらく細胞からのプラスミドDNAの分解/排出に起因して、48時間以内に消失した。代表的な実験では、およそ30%のプロトプラストが、GFPシグナルを示し、これが、最大のエレクトロポレーション効率である。KG7384(GFP−STOP)をタバコプロトプラストに導入したときは、GFPシグナルは観察されなかった。
実施例1は、3’末端においてミスマッチを有するオリゴヌクレオチドがTNEを行うのに効果的であることを示した。本発明に係る方法の広範囲の使用を示すため、および3’オリゴヌクレオチドとともに観察された高いTNE効率が実施例1において使用したオリゴヌクレオチドの特異的配列に起因することを排除するために、代替の配列を有するが、本発明に従って配置されるミスマッチ(例えば3’ミスマッチ)も有するオリゴヌクレオチドがTNEアッセイに活性であることを示すことが重要である。さらに、観察された効果がまた、他の植物種でも発生することを実証することは有益であるので、トマトプロトプラストにおいて同様の実験を行うことを決定した。
終止コドンを生じる186位(C〜T)に位置するヌクレオチド変化を有するYFP−WTおよびYFP−STOPのバージョンを生成した。YFP−STOP遺伝子のヌクレオチド配列(図5)および翻訳したタンパク質配列(図6)の両方を示す。GFPおよびYFP遺伝子の両方は有意な配列相同性を共有しているが、この終止コドンをコード配列における異なる位置にデザインしたので、オリゴヌクレオチドはGFP実験に使用したものと完全に異なる配列を有する。これらの遺伝子を次いで植物発現ベクター内にクローニングしたので、YFP ORFをウイルス35Sプロモーターにより発現させた。その3’末端においてミスマッチを有するオリゴヌクレオチドを、YFP−STOP構築物内の186位におけるTをCに変換し、それ故、YFP活性を修復するようにデザインした。
PB212 G*A*T*G*AACTTGAGAGTAAGCTT*T*C*C* G(配列番号14)
トマト葉プロトプラストの単離および再生は以前に記載されており(Shahin,1985;Tan et al.,1987a;Tan et al.,1987b)、必要な溶液はそれらの刊行物に見出され得る。つまり、0.1%次亜塩素酸塩を用いて滅菌したトマト(Solanum lycopersicum)種を、25℃および50〜70%相対湿度にて2000ルクスにて16/8時間の明記において滅菌MS20培地においてインビトロで増殖させた。1gの新たに採取した葉を5mlのCPW9Mを有するディッシュに入れ、手術用メスの刃を用いてmm毎に主幹に垂直に切断する。それらを、25ml酵素溶液(2%セルロースonozuka RS、0.4%マセロザイムonozukaR10、2.4−D(2mg/ml)、NAA(2mg/ml)、BAP(2mg/ml)pH5.8を含有するCPW9M)の新たなプレートに移し、暗所で25℃にて一晩、消化を開始した。次いでプロトプラストをオービタルシェーカー(40〜50rpm)に1時間入れることによって、遊離させた。プロトプラストを50μm篩に通過させることによって細胞残屑から分離し、その篩をCPW9Mで2回洗浄した。プロトプラストを85gにて遠心分離し、上清を捨て、次いでCPW9Mの半分の体積中に取った。プロトプラストを、最終的に3mlのCPW9M中に取り、次いで3mlのCPW18Sを2つの溶液が混合することを回避するように注意深く加えた。プロトプラストを85gにて10分間回転させ、中間層に浮遊している生存しているプロトプラストを、長いパスツールピペットを用いて回収した。CPW9Mを加えることによりプロトプラストの体積を10mlまで増加させ、回収したプロトプラストの数を血球計において決定した。プロトプラスト懸濁液を5℃にて10分間85×gにて遠心分離する。上清を捨て、プロトプラストペレットを、CPW9M洗浄培地中で106.mL−1の最終濃度に再懸濁する。10mL管中で、250μLのプロトプラスト懸濁液+/−12.5μgのdsRNAおよび250μlのPEG溶液(40%PEG4000(Fluka#81240)、0.1MのCa(NO3)2、0.4Mのマンニトール)を穏やかにだが、完全に混合する。20分後、室温にてインキュベートし、5mLの冷0.275MのCa(NP3)2を滴下して加える。プロトプラスト懸濁液を4℃にて85×gで10分間遠心分離し、上清を捨てる。次いでトマトプロトプラストを、4mlのK8p培地を含有する4cmのペトリ皿に移し、蛍光顕微鏡を用いてYFP発現について24時間後に試験する。
これらの実験の結果を図7に示す。我々は、3’末端にミスマッチを有する異なる配列のオリゴヌクレオチドが実際にトマトプロトプラストにおいてYFP発現を修復できることを確認できる。
この実施例では、本発明に係るオリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドを組み込んでいる必要もないし、本発明に係るオリゴヌクレオチドが、他の任意のタイプの修飾を組み込んでいる必要もないことが示される。
トマト葉肉プロトプラストをトマトインビトロ植物の幼葉から単離した。CaMV35Sプロモーターによってその発現が引き起こされるeYFP(stop)遺伝子を有するレポーター構築物およびオリゴヌクレオチドを、PEG媒介性の方法によってトマトプロトプラストにトランスフェクトした。30℃、暗黒下のグロースチャンバー内で一晩インキュベートした後、YFPフィルターセットを備える蛍光顕微鏡を用いて感染プロトプラストを観察した。黄色蛍光を発するプロトプラストの数をスコア付けし、黄色プロトプラストの数をトランスフェクトされたプロトプラストの数で除することによって、TNE効率を算出した。
PB72 C*A*T*G*CATGCATGCATGCATGC*A*T*G*C
(配列番号15)25mer,PS,ナンセンス(=コントロール)
PB243 G*A*T*G*AACTTAAGTGTAAGTTT*A*C*C*G
(配列番号16)25mer,PS,3’MM(=ミスマッチ)アンチセンス
TF8 GATGAACTTAAGTGTAAGTTTACCG
(配列番号17)25mer,3’MMアンチセンス
*は、ホスホロチオエート結合を表している。
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Claims (16)
- 第1DNA配列および前記第1DNA配列の相補体である第2DNA配列を含む二重鎖アクセプターDNA配列の標的改変のための方法であって、前記方法は、
前記二重鎖アクセプターDNA配列をドナーオリゴヌクレオチドと併用する工程を含み、
前記オリゴヌクレオチドは、前記第1DNA配列にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのドメインを含み、前記ドメインは、前記第1DNA配列に対して少なくとも1つのミスマッチを含むかまたはそのミスマッチに直接隣接し、前記少なくとも1つのミスマッチは、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から2ヌクレオチド離れた位置、又は前記オリゴヌクレオチドの3’末端に存在し、かつ
二重鎖アクセプターDNAの前記改変が非ヒト細胞内で行われる、方法。 - 前記ドナーヌクレオチドが、ミスマッチを除いて前記第1DNA配列に相補的である、請求項1に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、塩基修飾、3’および/または5’末端塩基修飾、骨格修飾または糖修飾からなる群から選択される少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む少なくとも1つの部分を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記修飾ヌクレオチドが、その相補的ヌクレオチドに対して天然に存在するA、C、T、またはGヌクレオチドと比べて高い結合親和性を有し、前記修飾ヌクレオチドが、前記第1DNA配列中の向かい側の位置におけるヌクレオチドと相補的な天然に存在するヌクレオチドと比較して前記第1DNA配列中の向かい側の位置におけるヌクレオチドに強力に結合し、および/または前記修飾ヌクレオチドがヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチドである、請求項3に記載の方法。
- 前記修飾ヌクレオチドが、LNAまたはホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドからなる群から選択される、請求項3または4に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも2つ、3つ、4つ、または5つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ミスマッチが修飾ヌクレオチドではない、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から2ヌクレオチド離れた位置、又は前記オリゴヌクレオチドの3’末端に存在する少なくとも1つのミスマッチ由来の少なくとも1つのヌクレオチドである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、2、3または4個のミスマッチを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重鎖アクセプターDNAの改変は、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、植物細胞、動物細胞、酵母細胞、真菌細胞及び/又はげっ歯類細胞からなる群から選択される細胞内におけるものである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重鎖アクセプターDNAが、原核生物、細菌、真核生物、植物、動物、酵母、真菌及び/又はげっ歯類から得られる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変が、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、置換および/または挿入である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重鎖アクセプターDNAが、ゲノムDNA、直鎖DNA、哺乳動物人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体DNA、オルガネラDNA、プラスミドDNAまたはエピソームDNA由来である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞を改変するため、野生型への復帰によって変異を修正するため、変異を誘導するため、コード領域の破壊によって酵素を不活性化するため、コード領域を改変することによって酵素の生物活性を変化させるため、コード領域を破壊することによってタンパク質を改変するための、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 第1DNA配列および前記第1DNA配列の相補体である第2DNA配列を含む二重鎖アクセプターDNA配列の標的改変のためのオリゴヌクレオチドの使用であって、
前記オリゴヌクレオチドは、前記第1DNA配列にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのドメインを含み、前記ドメインは、前記第1DNA配列に対して少なくとも1つのミスマッチを含むかまたはそのミスマッチに直接隣接し、前記少なくとも1つのミスマッチは、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から2ヌクレオチド離れた位置、又は前記オリゴヌクレオチドの3’末端に存在し、かつ
二重鎖アクセプターDNAの前記改変が非ヒト細胞内で行われる、オリゴヌクレオチドの使用。 - 細胞を改変するため、野生型への復帰によって変異を修正するため、変異を誘導するため、コード領域の破壊によって酵素を不活性化するため、コード領域を改変することによって酵素の生物活性を変化させるため、コード領域を破壊することによってタンパク質を改変するため、ミスマッチ修復のため、遺伝子変異を含む植物遺伝物質の標的改変のため、標的遺伝子修復のため、又は遺伝子ノックアウトのための、請求項15に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
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