KR20230144588A - 저산소증 및 허혈-관련 장애의 치료를 위한 작용제, 조성물 및 방법 - Google Patents

저산소증 및 허혈-관련 장애의 치료를 위한 작용제, 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20230144588A
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브라이언 에이치. 어넥스
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머랜드 파마슈티칼스, 인크.
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Abstract

저산소증 및 허혈-관련 장애의 치료를 위한 작용제, 조성물 및 방법. miR-106b의 길항제, 예를 들어 miR-106b의 안티센스 올리고뉴클레오티드; 이러한 길항제 및 miR-93 핵산 분자를 포함하는 듀플렉스; 및 관련 조성물 및 방법.

Description

저산소증 및 허혈-관련 장애의 치료를 위한 작용제, 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 2월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 63/148,940을 우선권 주장하며, 이의 전체 내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2022년 2월 11일에 생성된 상기 ASCII 카피는 파일명이 MPH-001WO_SL.txt이고, 크기가 14 kb이다.
말초 동맥 질환 (PAD)은 미국에서 대략 8백만명 내지 1천2백만명의 성인에서 발병하며, 이환율 및 사망률에 유의한 영향을 미친다. PAD는 운동 시 또는 심지어 휴식 시에 사지로의 혈류 감소로 허혈을 유발하는 것을 특징으로 한다.
조직 허혈에 반응하여, 사건의 캐스케이드가 허혈성 조직 부근의 기존 모세혈관으로부터 새로운 혈관의 발아를 유도하여 새로운 혈관을 형성할 수 있다. 이러한 혈관신생은 허혈성 조직으로의 혈액 공급을 촉진하는 적응 메카니즘을 나타낸다.
폐쇄 부위에서 먼 새로운 혈관의 성장 자극인 치료적 혈관신생은 허혈성 조직에 대한 의학적 우회로를 생성하고 허혈성 조직에서의 관류를 개선시키기 위한 유망한 접근법을 나타낸다. 다수의 혈관신생 성장 인자가 PAD의 전임상 모델 및 PAD를 갖는 임상 환자 둘 다에서 철저하게 연구되었다. 이것에도 불구하고, 말초 허혈성 조직, 예를 들어 허혈성 사지에서의 관류를 개선시키기 위한 요법은 아직 부족하다.
지난 10년간, 마이크로-RNA는 특히 질환/손상 상태에서 중요한 유전자 발현의 강한 내인성 조절인자로서 부상하였다. 마이크로-RNA (miR)는 특히 질환/손상 상태에서 유전자 발현을 조절하는 16-25개 뉴클레오티드의 비-코딩 RNA이다. 마이크로-RNA는 전형적으로 mRNA 분해 표적화에 의해 또는 직접 번역 억제에 의해 작용하고, 이들은 단일 유전자 또는 전체 경로를 조절할 수 있다. 일부 마이크로-RNA는 발생 혈관생성 및 종양 혈관신생에서 중요한 역할을 한다.
miRNA는 RNA 폴리머라제 II (pol II) 또는 RNA 폴리머라제 III에 의해 전사되고, 일반적으로 수천개 염기 길이인 1차 miRNA 전사체 (pri-miRNA)로 불리는 초기 전사체로부터 발생한다. Pri-miRNA는 핵에서 RNase 드로샤(Drosha)에 의해 약 70개- 내지 약 100개-뉴클레오티드의 헤어핀-형상 전구체 (pre-miRNA)로 프로세싱된다. 세포질로의 수송 후, 헤어핀 pre-miRNA는 다이서(Dicer)에 의해 추가로 프로세싱되어 이중 가닥 miRNA를 생산한다. 이어서 성숙 miRNA 가닥은 RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC) 내로 혼입되며, 여기서 염기-쌍 상보성에 의해 그의 표적 mRNA와 회합된다.
그러나, 심근 허혈 및 PAD에서와 같은 허혈-유도된 혈관신생에서의 마이크로-RNA의 역할에 대한 정보는 제한적이다.
내피 세포 및 근세포 생존을 증진시키고, 혈관신생을 유도하고, 허혈을 치료하고, 질환, 상태 및 장애, 예컨대 PAD를 치료하는 데 유용한 조성물 및 방법에 대한 오랫동안 느껴온 필요가 관련 기술분야에 존재한다.
허혈과 연관된 질환, 장애, 손상 또는 상태를 치료 또는 예방하는 작용제, 조성물 및 방법이 본원에 제공된다.
한 측면에서, (a) miR-93 핵산 분자; 및 (b) miR-106b의 길항제를 포함하는 핵산 듀플렉스가 제공된다.
일부 실시양태에서, 듀플렉스는 RNA:RNA 듀플렉스이다.
일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제는 miR-106b의 적어도 한 부분에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 듀플렉스는 서열 AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (서열식별번호(SEQ ID NO): 3)를 포함하는 miR-93 RNA 또는 서열 CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (서열식별번호: 4)를 포함하는 miR-93 RNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 듀플렉스는 miR-106b의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 AUCUGCACUGUCAGCACUUUA (서열식별번호: 6)를 포함한다.
한 측면에서, miR-106b 발현, 수준 또는 활성의 길항제가 제공된다.
일부 실시양태에서, 길항제는 miR-106b의 적어도 한 부분에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, miR-106b는 서열 UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU (서열식별번호: 1)를 포함하는 인간 miR-106b-5p이다.
일부 실시양태에서, miR-106b는 서열 CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC (서열식별번호: 2)를 포함하는 인간 miR-106b-3p이다.
일부 실시양태에서, 길항제는 DNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 길항제는 RNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 길항제는 안타고미르(antagomir) miR-106b이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 1종 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 예를 들어, 1종 이상의 뉴클레오티드 유사체는 잠금 핵산 (LNA)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 성숙 miR-106b 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있으며, 듀플렉스는 적어도 약 60℃의 용융 온도 (Tm)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또 다른 단일 가닥 RNA 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다른 단일 가닥 RNA 분자는 miR-93 RNA 분자이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드와 다른 단일 가닥 RNA 분자의 듀플렉스는 약 65℃ 미만, 약 60℃ 미만, 약 55℃ 미만, 약 50℃ 미만, 약 45℃ 미만, 약 40℃ 미만, 약 37℃ 미만, 약 35℃ 미만, 약 30℃ 미만 또는 약 25℃ 미만의 Tm을 갖는다.
일부 실시양태에서, 길항제는 miR-106b의 적어도 한 부분에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드이고; 안티센스 올리고뉴클레오티드는 성숙 miR-106b 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있고; 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또 다른 단일 가닥 RNA 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있고; 안티센스 올리고뉴클레오티드와 성숙 miR-106b 분자에 의해 형성된 듀플렉스의 Tm은 안티센스 올리고뉴클레오티드와 다른 단일 가닥 RNA 분자에 의해 형성된 듀플렉스의 Tm보다 더 크다. 일부 이러한 실시양태에서, 다른 단일 가닥 RNA 분자는 miR-93 RNA 분자이다. 일부 실시양태에서, miR-93 RNA 분자는 서열 AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (서열식별번호: 3) 또는 서열 CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (서열식별번호: 4)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 길항제는 단리된 핵산 또는 단리된 핵산을 포함하는 벡터에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 miRNA 발현 벡터 또는 AAV 발현 벡터로부터 선택된 발현 벡터이다. 예를 들어, 발현 벡터는 miRNA 발현 벡터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 세포-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 길항제 또는 핵산 듀플렉스는 지질 비히클 내에 캡슐화된다.
한 측면에서, (a) 유효량의 제1항 내지 제5항 및 제26항 중 어느 한 항의 핵산 듀플렉스 또는 제6항 내지 제26항 중 어느 한 항의 길항제; 및 (b) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 추가의 치료제를 추가로 포함한다. 예를 들어, 추가의 치료제는 항허혈제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유효량은 제약 조성물을 투여받는 대상체의 내피 또는 근육 세포에서 적어도 1종의 세포 주기 경로 유전자의 발현을 감소시키는 데 효과적이다. 예를 들어, 상기 세포 주기 경로 유전자는 E2F-1 및 p53으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현은 골격근 세포에서의 발현이다.
일부 실시양태에서, 유효량은 제약 조성물을 투여받는 대상체에서 관류 회복을 증진시키는 데 효과적이다.
일부 실시양태에서, 유효량은 제약 조성물을 투여받는 대상체에서 허혈에 대한 혈관신생 반응을 증진시키는 데 효과적이다.
일부 실시양태에서, 유효량은 세포 증식, 예를 들어 내피 세포 또는 근육 세포의 증식을 포함하는 세포 증식을 자극하는 데 효과적이다.
일부 실시양태에서, 유효량은 제약 조성물을 투여받는 대상체에서 모세혈관 밀도를 증가시키는 데 효과적이다.
일부 실시양태에서, 유효량은 제약 조성물을 투여받는 대상체에서 1종 이상의 세포의 아폽토시스를 억제하는 데 효과적이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 아폽토시스는 저산소증-유도된 아폽토시스이다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 경구, 협측, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 척수강내, 뇌실내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 경장, 국소, 설하, 질, 안구, 폐, 직장, 흉골내 주사, 신장 투석 주입 및 비경구로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의한 투여를 위해 제제화된다.
일부 실시양태에서, 상기 투여는 근육내 투여이다.
한 측면에서, 허혈과 연관된 질환, 장애, 손상 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 그를 필요로 하는 대상체에게 본원에 개시된 바와 같은 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 추가의 치료제, 예를 들어 항허혈제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 유효량은 대상체의 내피 또는 근육 세포에서 적어도 1종의 세포 주기 경로 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 그의 허혈-유도된 상향조절을 약화시키는 데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 세포 주기 경로 유전자는 E2F-1 및 p53으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 발현은 골격근 세포에서의 발현이다.
일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에서 관류 회복을 증진시키는 데 효과적이다.
일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에서 허혈에 대한 혈관신생 반응을 증진시키는 데 효과적이다.
일부 실시양태에서, 유효량은 세포 증식을 자극하는 데 효과적이다.
일부 실시양태에서, 세포 증식은 내피 세포 또는 근육 세포의 증식을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에서 모세혈관 밀도를 증가시키는 데 효과적이다.
일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에서 1종 이상의 세포의 아폽토시스를 억제하는 데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 아폽토시스는 저산소증-유도된 아폽토시스이다.
일부 실시양태에서, 투여는 경구, 협측, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 척수강내, 뇌실내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 경장, 국소, 설하, 질, 안구, 폐, 직장, 흉골내 주사, 신장 투석 주입 및 비경구로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의한 투여이다.
일부 실시양태에서, 투여는 근육내 투여이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 허혈은 혈관 허혈, 근육 허혈, 말초 동맥 질환, 허혈 재관류 손상, 외상과 연관된 허혈 및 뇌 허혈로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 허혈은 말초 동맥 질환이다.
약어
bw--체중
C2C12--불멸화 마우스 근육 세포주
FDR--오류 발견율
GA--비복근
GF--성장 인자
GSEA--유전자 세트 풍부화 분석
HLI--뒷다리 허혈
HSS--저산소증 및 혈청 고갈
HUVEC--인간 제대 정맥 내피 세포
IGA--허혈성 비복근
LNA-잠금 핵산
LSGS--저 혈청 성장 보충제
miR--마이크로-RNA (miRNA로도 또한 지칭됨)
miRNA--마이크로-RNA (miR로도 또한 지칭됨)
NGA--비-허혈성 비복근
PAD--말초 동맥 질환
PremiR--전구체 miRNA
RISC--RNA-유도된 침묵 복합체
SEM--평균의 표준 오차
TA--전경골근
VEGF-혈관 내피 성장 인자
정의
본원에 사용된 용어 "약"은, 값과 관련하여 본원에 사용된 경우에, 언급된 값에 대한 문맥에서 유사한 값을 지칭한다. 일반적으로, 문맥에 익숙한 관련 기술분야의 통상의 기술자는 그 문맥에서 "약"에 의해 포괄되는 관련 변동 정도를 인지할 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 용어 "약"은 언급된 값의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만 내인 값의 범위를 포괄할 수 있다.
본원에 사용된 "길항제"는 표적 작용제의 수준 또는 생물학적 활성을 억제하는 작용제를 지칭한다. 예를 들어, miR-106b의 "길항제"는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 miR-106b의 수준 또는 활성을 감소시키는 작용제를 지칭한다.
용어 "안타고미르"는 마이크로RNA (miRNA)와 같은 내인성 소형 RNA 조절인자를 길항하는 소형 RNA 또는 DNA (또는 키메라) 분자를 지칭한다. 이들 길항제는 대부분의 부분에 대해 상보적 뉴클레오티드 서열을 보유하며, 이는 안타고미르가, 예를 들어 성숙 마이크로RNA (miRNA) 또는 성숙 마이크로RNA의 pre-miRNA 전구체에 혼성화될 것임을 의미한다. 이들은 다른 분자가 mRNA 분자 상의 목적하는 부위에 결합하는 것을 방지하고, 내인성 마이크로RNA (miR)를 침묵시키는 데 사용된다. 따라서, 안타고미르는, 예를 들어 손상에 대한 반응의 이들 전사 후 분자 조정제의 생물학적 활성을 차단하고, 그의 발현, 수준 또는 활성을 감소시키도록 설계된다.
본원에 사용된 용어 "부착하다" 또는 "부착" 또는 "부착된" 또는 "부착하는"은 본원에서 "결합하다" 또는 "결합하는" 또는 "결합한다" 또는 "결합된"과 상호교환가능하게 사용되며, 안정한 복합체의 형성을 유발하는 분자 사이의 임의의 물리적 관계, 예컨대 리간드, 예컨대 펩티드 또는 소분자와 "결합 파트너" 또는 "수용체 분자" 사이의 물리적 관계를 지칭한다. 관계는 선택적 비공유 회합, 이온성 인력, 수소 결합, 공유 결합, 반 데르 발스 힘 또는 소수성 인력을 포함하나 이에 제한되지는 않는 물리화학적 상호작용에 의해 매개될 수 있다.
본원에 사용된 "상보적"은 2개의 핵산, 예를 들어 RNA 서열과 RNA 서열에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 사이의 서브유닛 서열 상보성의 광범위한 개념을 지칭한다. 분자 둘 다에서의 뉴클레오티드 위치가 통상적으로 서로 염기 쌍을 형성할 수 있는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우에, 이때 핵산은 이 위치에서 서로에 대해 상보적인 것으로 간주된다. 따라서, 2개의 핵산은 각각의 분자 내 상응하는 위치의 상당한 수 (예를 들어, 적어도 50%)가 통상적으로 서로 염기 쌍을 형성하는 뉴클레오티드 (예를 들어, A:T (또는 RNA를 포함하는 듀플렉스의 경우에 A:U) 및 G:C 뉴클레오티드 쌍)에 의해 점유되는 경우에, 서로에 대해 상보적이다. 따라서, 제1 핵산 영역의 아데닌 잔기는 제1 영역과 역평행인 제2 핵산 영역의 잔기와, 그 잔기가 티민 또는 우라실인 경우에, 특이적 수소 결합을 형성 ("염기 쌍을 형성")할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 유사하게, 제1 핵산 가닥의 시토신 잔기는 제1 가닥에 역평행인 제2 핵산 가닥의 잔기와, 그 잔기가 구아닌인 경우에, 염기 쌍을 형성할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 핵산의 제1 영역은 동일하거나 상이한 핵산의 제2 영역에 대해, 2개의 영역이 역평행 방식으로 배열될 때 제1 영역의 적어도 1개의 뉴클레오티드 잔기가 제2 영역의 잔기와 염기 쌍을 형성할 수 있는 경우에, 상보적이다. 바람직하게는, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고, 제2 영역은 제2 부분을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 부분이 역평행 방식으로 배열될 때, 예를 들어 제1 부분의 뉴클레오티드 잔기의 적어도 약 50%, 적어도 약 55% , 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%가 제2 부분의 뉴클레오티드 잔기와 염기 쌍을 형성할 수 있다. 보다 바람직하게는, 제1 부분의 모든 뉴클레오티드 잔기가 제2 부분의 뉴클레오티드 잔기와 염기 쌍을 형성할 수 있다.
"유효량" 또는 "치료 유효량" (또는 "예방 유효량")은 유익하거나 목적하는 결과, 예컨대 증가된 혈관신생 또는 특정한 목적하는 임상 결과를 가져오기에 충분한 양을 지칭하는 것으로 본원에 사용된다. 따라서, "유효량" 또는 "치료 유효량"은 적용되는 문맥에 좌우된다.
"단리된 핵산"은 자연 발생 상태에서 플랭킹된 서열로부터 분리된 핵산 절편 또는 단편, 예를 들어 단편에 통상적으로 인접한 서열, 예를 들어 단편이 자연 발생하는 게놈에서 단편에 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭한다. 상기 용어는 또한 핵산, 예를 들어 RNA 또는 DNA에 자연적으로 동반되는 다른 성분으로부터 또는 세포에서 그에 자연적으로 동반되는 단백질로부터 실질적으로 정제된 핵산에 적용된다. 따라서, 상기 용어는, 예를 들어 벡터 내로, 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스 내로, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내로 혼입되거나, 또는 다른 서열과 독립적으로 별개의 분자로서 (예를 들어, cDNA로서 또는 PCR 또는 제한 효소 소화에 의해 생산된 게놈 또는 cDNA 단편으로서) 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 이는 또한 추가의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.
용어 "치료하는" (및 그의 변형, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료")은 그를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 상태의 자연 과정을 변경시키려는 시도의 임상 개입을 지칭한다. 치료는 예방 동안 및 임상 병리상태 과정 동안 둘 다를 위해 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 질환의 1종 이상의 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 질환 진행률의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 개선된 예후를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료 유효량" 또는 "유효량"은 대상체에게 투여되는 경우에 질환 또는 장애를 치료하는 데 효과적인 본원에 제공된 작용제 또는 제약 조성물의 양을 지칭한다.
용어 "시험관내"는 살아있는 유기체 외부에서 일어나는 과정을 지칭한다. 이러한 용어는 용어 "계내" 및 "생체외"를 포괄한다.
용어 "계내"는 살아있는 유기체와 별개로 성장하는 살아있는 세포, 예를 들어 조직 배양에서 성장하는 살아있는 세포에서 일어나는 과정을 지칭한다.
용어 "생체외"는 일반적으로 조직의 세포구조가 보존되는, 조직 샘플에서 일어나는 과정을 지칭한다.
용어 "생체내"는 살아있는 유기체에서 일어나는 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "포유동물"은 인간 및 비-인간 둘 다를 포함하고, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 뮤린, 소, 말 및 돼지를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
분석, 진단 또는 치료의 "대상체"는 동물이다. 이러한 동물은 포유동물, 바람직하게는 인간을 포함한다.
본원에 사용된 "그를 필요로 하는 대상체"는 본 발명의 방법으로부터 이익을 얻을 수 있는 환자, 동물, 포유동물 또는 인간이다.
본원에 사용된 용어 "PAD의 위험이 있는 대상체"는 PAD가 발생할 1종 이상의 위험 인자를 갖는 대상체를 지칭한다. 위험 인자는 성별, 연령, 유전적 소인, 환경적 노출 및 PAD의 이전 사건 및 생활방식을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 퍼센트 "동일성"은 하기 기재된 서열 비교 알고리즘 (예를 들어, BLASTP 및 BLASTN 또는 통상의 기술자에게 이용가능한 다른 알고리즘) 중 하나를 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정된 바와 같이, 2개 이상의 서열 또는 하위서열이 최대 상응성을 위해 비교 및 정렬된 경우에 명시된 백분율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 것을 지칭한다. 적용에 따라, 퍼센트 "동일성"은 비교되는 서열의 영역에 걸쳐, 예를 들어 기능적 도메인에 걸쳐 존재할 수 있거나 또는 대안적으로 비교되는 2개의 서열의 전장에 걸쳐 존재할 수 있다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 시험 서열과 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우에, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우 하위서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열 대비 시험 서열(들)의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 문헌 [Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국부 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 구현 (위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)에 의해, 또는 육안 검사 (일반적으로 하기 문헌 [Ausubel et al.] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 한 예는 문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]에 기재된 BLAST 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) (www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 이용가능하다.
용어 "충분한 양"은 목적하는 효과를 가져오기에 충분한 양, 예를 들어 세포에서 단백질 응집을 조정하기에 충분한 양을 의미한다.
명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다는 것을 주목해야 한다.
개관
대조군과 비교할 때, 더 높은 수준의 miR-106b는 PAD 관련 조건 하에 수행된 시험관내 혈관신생 검정에서 내피 분지화를 유의하게 감소시킨다. (문헌 [Ganta et al., Circulation. 2017;135:2403-2425], 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨.)
특히 miR-106b 발현, 수준 또는 활성의 길항제가 본원에 개시된다. 이러한 작용제는 저산소증, 허혈, 및 허혈과 연관된 다른 손상, 질환, 장애 및 상태, 예컨대 말초 동맥 질환 및 심근 허혈을 치료 및 예방하는 데 유용하다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 이러한 길항제는 miR-106b-매개된 혈관신생 억제를 약화시키거나 차단할 수 있으며, 이는 허혈성 사건으로부터의 회복을 보조하는 데 유용할 것이다.
핵산 듀플렉스 및 miR-106b 길항제
(a) miR-93 핵산 분자; 및 (b) miR-106b의 길항제, 예컨대 본원에 기재된 임의의 길항제를 포함하는 핵산 듀플렉스가 본원에 제공된다.
핵산 듀플렉스와 관련하여 본원에 사용된 용어 "듀플렉스"는 관련 기술분야에서의 그의 의미에 따라 사용되고, DNA 가닥, RNA 가닥 또는 DNA 및 RNA 둘 다를 포함하는 듀플렉스를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 듀플렉스는 RNA:RNA 듀플렉스이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 듀플렉스 내 각각의 가닥의 적어도 한 부분은 다른 가닥의 적어도 한 부분에 대해 실질적으로 상보적이고, 상보성 정도는 달라질 수 있으며, 반드시 100%일 필요는 없다. 예를 들어, 일부 듀플렉스는 상보성 영역 내에 또는 전체 듀플렉스 전반에 걸쳐 가닥 사이의 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4 또는 적어도 5개의 미스매치를 함유한다.
일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제는 miR-106b의 적어도 한 부분에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 AUCUGCACUGUCAGCACUUUA (서열식별번호: 6) 또는 그에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 6의 서열 또는 그에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 서열을 갖는다.
miR-93 핵산 분자의 예는 미국 특허 번호 9,845,465 (이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, miR-93 핵산 분자는 miR-93 RNA, 예컨대 서열 AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (서열식별번호: 3) (또는 그에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 서열)를 포함하는 miR-93 또는 서열 CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (서열식별번호: 4) (또는 그에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 서열)를 포함하는 miR-93 RNA이다. 일부 실시양태에서, miR-93 RNA는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4의 서열 (또는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 서열)을 갖는 올리고뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제는 포유동물 miR-106b의 길항제이다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제는 인간 miR-106b의 길항제이다.
일부 실시양태에서, 인간 miR-106b의 길항제는 hsa-miR-106b-5p의 길항제이다. miRBase에서 언급된 바와 같은 hsa-miR-106b-5p의 성숙 서열은 UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU (서열식별번호: 1)이다.
대안적 실시양태에서, 인간 miR-106b의 길항제는 hsa-miR-106b-3p의 길항제이다. miRBase에서 언급된 바와 같은 hsa-miR-106b-3p의 성숙 서열은 CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC (서열식별번호: 2)이다.
일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제는 성숙 miR-106b의 한 부분에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이며, 이에 따라 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-106b에 결합한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 성숙 miR-106b의 한 부분에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보적이며, 이에 따라 안티센스 올리고뉴클레오티드는 PAD 관련 조건 하에 miR-106b에 결합한다. 예를 들어, 문헌 [Ganta et al., Circulation. 2017;135:2403-2425]을 참조하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이러한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본원에서 miR-106b 핵산을 "표적화하는" 것으로 또는 miR-106b의 "안티센스 올리고뉴클레오티드"로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 성숙 miR-106b의 부분에 대해 적어도 85%, 90% 또는 95% 상보적 또는 100% 상보적인 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 성숙 miR-106b의 부분에 대해 100% 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제는 표 1에 제시된 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 7의 서열의 적어도 한 부분에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제는 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 7의 서열의 적어도 한 부분에 대해 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 부분은 서열식별번호: 6 또는 7의 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 부분은 서열식별번호: 6 또는 7의 모두를 포함한다.
일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제는 서열식별번호: 6 또는 7의 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 부분에 대해 100% 동일한 서열을 포함한다.
표 1: miR-106b 길항제의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예시적인 서열
바람직한 측면에서, 길항제는 miR-106b-5p의 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
한 측면에서, 길항제는 miR-106b-3p의 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 성숙 miR-106b의 부분은 miR-106b 서열에 존재하는 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21개 또는 모든 22개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 성숙 miR-106b의 부분은 hsa-miR-106b-5p 서열에 존재하는 모든 22개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 hsa-miR-106b-5p 서열에 존재하는 모든 22개의 인접 뉴클레오티드에 대해 100% 상보적인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 성숙 miR-106b의 부분은 miR-106b 시드 영역을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-106b 시드 영역에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보적인 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-106b 시드 영역에 대해 완전히 상보적인 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이에 걸쳐 측정 시 miR-106b에 대해 완전히 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-106b의 길이에 걸쳐 측정 시 miR-106b에 대해 완전히 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이에 걸쳐 마이크로RNA의 상응하는 영역에 대해 상보적이다. 일부 실시양태에서, 올리고머의 3' 뉴클레오시드는 miR-106b의 제1, 제2, 제3 또는 제4 5' 뉴클레오티드에 대해 상보적이다 (즉, 이와 정렬된다). 한 실시양태에서, 올리고머의 3' 뉴클레오시드는 miR-106b의 제2 5' 뉴클레오티드와 정렬된다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 올리고머의 길이에 걸쳐 miR-106b에 대해 대부분 상보적이다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-106b의 상응하는 영역에 대해 1개의 미스매치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-106b의 상응하는 영역에 대해 2개의 미스매치를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-106b와 듀플렉스를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 듀플렉스는 용융 온도 (Tm)를 갖는다. Tm은, 예를 들어 적어도 약 60℃, 약 65℃, 약 70℃ 또는 그 초과일 수 있다. 일부 실시양태에서, Tm은 약 60℃ 내지 약 90℃, 약 65℃ 내지 약 85℃ 또는 약 70℃ 내지 약 80℃이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 허혈 회복과 관련된 혈관신생의 miR-106b-매개된 억제를 감소시키기에 충분한 정도로 miR-106b에 결합하지만, 허혈 회복과 관련되지 않은 miR-106b-매개된 경로 활성을 감소시키기에 과도한 정도로는 결합하지 않는다. 특정한 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 허혈과 연관된 질환, 장애 또는 상태를 치료하기에 충분한 정도로 miR-106b에 결합하지만, 원치않는 부작용을 유발하기에 과도한 정도로는 결합하지 않는다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또 다른 단일 가닥 RNA 분자 (miR-106b 이외의 다른 것, 예를 들어 hsa-miR-106b-5p 이외의 다른 것)와 듀플렉스를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다른 단일 가닥 RNA와 형성된 듀플렉스는 miR-106b와 형성된 듀플렉스보다 덜 안정하다. 일부 실시양태에서, 다른 단일 가닥 RNA 핵산 분자를 갖는 듀플렉스의 Tm은 약 60℃ 미만, 약 55℃ 미만, 약 50℃ 미만, 약 45℃ 미만, 약 40℃ 미만, 약 37℃ 미만, 약 35℃ 미만, 약 30℃ 미만 또는 약 25℃ 미만이다. 일부 실시양태에서, 다른 단일 가닥 RNA 핵산 분자를 갖는 듀플렉스의 Tm은 적어도 25℃, 적어도 30℃, 적어도 35℃, 적어도 37℃, 적어도 40℃, 적어도 45℃, 적어도 50℃ 또는 적어도 55℃이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드와 성숙 miR-106b 분자에 의해 형성된 듀플렉스의 Tm은 안티센스 올리고뉴클레오티드와 다른 단일 가닥 RNA 분자에 의해 형성된 듀플렉스의 Tm보다 더 크다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 생리학적 조건 하에 또는 PAD-관련 조건 하에 또 다른 단일 가닥 RNA 분자 (miR-106b 이외의 다른 것, 예를 들어 hsa-miR-106b-5p 이외의 다른 것)와 듀플렉스를 형성하지 않는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 또 다른 단일 가닥 RNA 분자 (miR-106b 이외의 다른 것, 예를 들어 hsa-miR-106b-5p 이외의 다른 것)와 듀플렉스를 형성하지 않는다.
일부 실시양태에서, 다른 단일 가닥 RNA 분자는 miR-93이다.
주어진 듀플렉스의 Tm은 Tm 검정에 의해 결정될 수 있다. 본원에 제공된 예시적인 Tm 검정에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 RNA 표적 듀플렉스를 500 ml RNase-무함유 물 중에 3 mM로 희석하고, 500 ml 2x Tm- 완충제 (200 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 20 mM Na 포스페이트, pH 7.0)와 혼합한다. 용액을 95℃로 3분 동안 가열한 다음, 실온에서 30분 동안 어닐링되도록 한다. 듀플렉스 용융 온도 (Tm)를 PE 템프랩 소프트웨어를 사용하는 펠티에 온도 프로그래머 PTP6이 장착된 람다 40 UVA IS 분광광도계 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer)) 상에서 측정한다. 온도를 20℃에서 95℃로 상승시킨 다음, 25℃로 하강시키고, 260 nm에서의 흡수를 기록한다. 1차 도함수 및 용융과 어닐링 둘 다의 국부 최대값을 사용하여 듀플렉스 Tm을 평가한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는, 예를 들어 약 7 내지 약 30개의 nt, 예컨대 약 7 내지 약 26개 또는 약 8 내지 약 25개, 예컨대 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25개의 뉴클레오티드 길이, 예컨대 약 10 내지 약 22개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 길이는 21 또는 22개의 뉴클레오티드이다.
한 측면에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-106b 안타고미르이다.
안타고미르 (본원에서 antimiR로도 또한 지칭됨)는 일반적으로 마이크로RNA 서열 또는 그의 상응하는 하위서열에 대해 완전히 상보적이거나 또는 본질적으로 상보적인 (즉, 1 또는 2개의 미스매치를 포함할 수 있는) 인접 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 올리고머를 지칭한다. 이와 관련하여, antimiR은 전체 성숙 마이크로RNA에 대해 상보적이거나 또는 본질적으로 상보적인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있거나 또는 antimiR은 성숙 마이크로RNA 또는 pre-마이크로RNA의 하위-서열에 대해 상보적이거나 또는 본질적으로 상보적인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는 것으로 간주된다. 하위-서열 (및 따라서 상응하는 인접 뉴클레오티드 서열)은 적어도 5, 6, 7 또는 8개의 뉴클레오티드 길이, 예컨대 5 내지 25개의 뉴클레오티드, 예컨대 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 뉴클레오티드 길이, 예컨대 10 내지 17개 또는 10 내지 16개의 뉴클레오티드, 예컨대 12 내지 15개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. antimiR의 수많은 설계가 제안되었고, 전형적으로 치료 용도를 위한 antimiR에서, antimiR의 인접 뉴클레오티드 서열은 1종 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
일부 실시양태에서, antimiR은 갭머 구조를 가질 수 있다. 그러나, WO2007/112754 및 WO2007/112753 (이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 설명된 바와 같이, 다른 설계, 예컨대 믹스머 또는 토탈머가 바람직할 수 있다.
WO2007/112754 및 WO2007/112753 (둘 다 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)은 올리고머가 성숙 마이크로RNA에 대해 상보적인 antimiR 올리고머 및 antimiR 올리고머 설계를 제공한다.
일부 실시양태에서, antimiR의 하위서열은 miRNA 시드 영역에 상응한다. 일부 실시양태에서, 올리고머의 제1 또는 제2 3' 핵염기는 마이크로RNA 서열의 제2 5' 뉴클레오티드에 상응한다.
일부 antimiR 실시양태에서, 올리고머의 3' 말단 영역으로부터 측정된 올리고머의 1 내지 6개 (경계값 포함)의 핵염기 단위는 마이크로RNA 시드 영역 서열에 대해 상보적이다.
일부 antimiR 실시양태에서, 올리고머의 3' 말단 영역으로부터 측정된 올리고머의 1 내지 7개 (경계값 포함)의 핵염기 단위는 마이크로RNA 시드 영역 서열에 대해 상보적이다.
일부 antimiR 실시양태에서, 올리고머의 3' 말단 영역으로부터 측정된 올리고머의 2 내지 7개 (경계값 포함)의 핵염기 단위는 마이크로RNA 시드 영역 서열에 대해 상보적이다.
일부 실시양태에서, antimiR 올리고머는 miRNA 시드 영역에 대해 상보적인 영역 내에 있는 위치에 적어도 1개의 뉴클레오티드 유사체 단위, 예컨대 적어도 1개의 LNA 단위를 포함한다. antimiR 올리고머는, 일부 실시양태에서, miRNA 시드 영역에 대해 상보적인 영역 내에 있는 위치에 1 내지 6개 또는 1 내지 7개의 뉴클레오티드 유사체 단위, 예컨대 1 내지 6개 내지 1 내지 7개의 LNA 단위를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, antimiR은 miR-106b의 시드 영역에 대해 상보적인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 뉴클레오티드의 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%는 LNA이다.
일부 실시양태에서, antimiR은 miR-106b의 시드 영역에 대해 상보적인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 뉴클레오티드의 적어도 80%는 LNA이고, 여기서 뉴클레오티드간 결합의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%는 포스포로티오에이트 결합이다.
일부 실시양태에서, antimiR의 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 서열에 혼성화할 때 단일 이하의 미스매치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 서열에 혼성화할 때 2개 이하의 미스매치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 서열에 혼성화할 때 미스매치를 포함하지 않는다.
본 개시내용의 올리고머 (또는 그의 영역)와 본원에 개시된 것과 같은 핵산의 표적 영역 사이의 "상보성"의 정도를 결정하는 데 있어서, "상보성"의 정도 (또한 "상동성" 또는 "동일성")는 올리고머의 서열 (또는 그의 영역)과 그와 최대 정렬되는 표적 영역의 서열 (또는 표적 영역의 역 상보체) 사이의 백분율 동일성 (또는 백분율 상동성)으로서 표현될 수 있다. 백분율은 2개의 서열 사이에 정렬된 염기 중 동일한 염기의 수를 카운팅하고, 올리고머 내 인접 단량체의 총 수로 나누고, 100을 곱함으로써 계산된다. 이러한 비교에서, 갭이 존재하는 경우에, 이러한 갭은 본 발명의 올리고머와 표적 영역 사이에서 갭 내의 단량체의 수가 상이한 영역보다는 단지 미스매치인 것이 바람직하다.
본원에 사용된 용어 "상동" 및 "상동성"은 용어 "동일성" 및 "동일한"과 상호교환가능하다.
용어 "상응하는" 및 "상응한다"는 올리고머의 뉴클레오티드 서열 (즉, 핵염기 또는 염기 서열) 또는 인접 뉴클레오티드 서열 (제1 영역)과 핵산 표적의 (i) 하위-서열 또는 (ii) 역 상보체로부터 선택된 추가의 서열의 동등한 인접 뉴클레오티드 서열 사이의 비교를 지칭한다. 뉴클레오티드 유사체는 그의 동등한 또는 상응하는 뉴클레오티드와 직접 비교된다. i) 또는 ii) 하의 추가의 서열에 상응하는 제1 서열은 전형적으로 제1 서열 (예컨대 인접 뉴클레오티드 서열)의 길이에 걸쳐 그 서열과 동일하거나 또는 본원에 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 상응하는 서열에 대해 적어도 80% 상동, 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96% 상동, 예컨대 100% 상동 (동일)일 수 있다.
뉴클레오티드 유사체
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 1종 이상의 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 1종 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
예시적인 뉴클레오시드 유사체 단위는 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-OMe-RNA 단위, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, LNA 단위, PNA 단위, HNA 단위, 2'-FANA, 2'-(3-히드록시)프로필 및 2'-플루오로-DNA 단위 및/또는 다른 (임의로) 당 변형된 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 모르폴리노, 펩티드 핵산 (PNA), CeNA, 비연결된 핵산 (UNA), 헥시톨 핵산 (HNA), 비시클로-HNA (예를 들어, WO2009/100320 참조, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 및 INA 단위를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 뉴클레오시드 유사체는 그의 표적 핵산 (또는 상보적 DNA 또는 RNA 서열)에 대한 제1 영역의 친화도를 증가시킨다. 다양한 뉴클레오시드 유사체가 문헌 [Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 및 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213]에 개시되어 있으며, 이들은 본원에 참조로 포함된다.
용어 "LNA 단위", "LNA 단량체", "LNA 잔기", "잠금 핵산 단위", "LNA", "비시클릭 핵산", "BNA", "잠금 핵산 단량체" 또는 "잠금 핵산 잔기"는 비시클릭 뉴클레오시드 유사체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 일부 실시양태에서, LNA는 리보스 고리의 제2와 제4 탄소를 연결하는 가교 (또는 비라디칼) (C4*-C2* 가교 또는 비라디칼)를 포함한다. 제2와 제4 탄소 사이의 비라디칼의 존재는 리보스를 3' 엔도- (노스) 입체형태로 잠근다. LNA 단위는 WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 01/25248, WO 02/28875, WO 03/006475 및 WO 03/095467에 기재되어 있으며, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, LNA 단위 또는 단위들은 D-β 및 L-α 배위 중 어느 하나의 옥시-LNA, 티오-LNA 및 아미노-LNA 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시양태에서, LNA는 ENA 핵염기를 포함한다.
일부 실시양태에서, LNA는 베타 D 옥시-LNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, LNA는 알파-L 아미노 LNA를 포함한다.
2' 치환된 올리고머, 예를 들어 완전 2' OME 올리고머는 WO05/013901, WO07/027775, WO07027894에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 올리고머의 제1 영역은 2' 치환된 뉴클레오시드로 구성될 수 있다. WO07/027775는 또한 마이크로RNA를 표적화하는 데 사용하기 위한 MOE, LNA, DNA 믹스머를 언급한다.
용어 "상응하는 뉴클레오티드 유사체" 및 "상응하는 뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 유사체의 뉴클레오티드와 자연 발생 뉴클레오티드가 동일하다는 것을 나타내는 것으로 의도된다. 예를 들어, 뉴클레오티드의 2-데옥시리보스 단위가 아데닌에 연결되는 경우에, "상응하는 뉴클레오티드 유사체"는 아데닌에 연결된 펜토스 단위 (2-데옥시리보스와 상이함)를 함유한다.
비-자연 발생 뉴클레오티드는 변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오티드, 예컨대 비시클릭 뉴클레오티드 또는 2' 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 2' 치환된 뉴클레오티드를 포함한다.
"뉴클레오티드 유사체"는 당 및/또는 염기 모이어티에서의 변형에 의한 천연 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드의 변이체이다. 유사체는 원칙적으로 올리고뉴클레오티드와 관련하여 단지 천연 뉴클레오티드에 대해 "침묵"하거나 또는 그와 "동등"할 수 있으며, 즉 올리고뉴클레오티드가 표적 유전자 발현을 억제하도록 작용하는 방식에 대해 기능적 효과를 갖지 않는다. 그럼에도 불구하고, 이러한 "동등" 유사체는, 예를 들어 제조가 보다 용이하거나 보다 저렴하거나, 또는 저장 또는 제조 조건에 대해 보다 안정하거나, 또는 태그 또는 표지를 나타내는 경우에 유용할 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 유사체는, 예를 들어 표적에 대한 증가된 결합 친화도 및/또는 세포내 뉴클레아제에 대한 증가된 저항성 및/또는 세포 내로의 수송의 증가된 용이성을 가져옴으로써, 올리고머가 발현을 억제하도록 작용하는 방식에 대해 기능적 효과를 가질 것이다.
적합한 뉴클레오티드 유사체의 예는 WO2007/031091에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에 개시된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 사용될 수 있는 다른 뉴클레오티드 유사체는 트리시클릭 핵산을 포함한다. 예시적인 트리시클릭 핵산은 WO2013154798 및 WO2013154798에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오시드는 화학적으로 변형된 리보푸라노스 고리 모이어티를 포함한다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 1 또는 2개의 LNA 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1 또는 2개의 LNA 단위는 3' 말단으로부터 카운팅하여 위치 3 내지 8에 존재한다. 이러한 위치는 구조상 RNA:RNA 듀플렉스와 유사한 듀플렉스인 올리고:마이크로RNA 듀플렉스에 의해 형성된 A-나선의 안정성에 유리할 수 있다.
벡터
일부 실시양태에서, miR-106b 길항제는 벡터에서 코딩된다. "벡터"는 관심 핵산을 세포의 내부로 전달하는 데 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 친양쪽성 화합물과 회합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 수많은 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "벡터"는 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 발현 구축물은 살아있는 세포에서 복제될 수 있거나 또는 합성적으로 제조될 수 있다. 본 출원의 목적상, 용어 "발현 구축물", "발현 벡터" 및 "벡터"는 일반적인 예시적 의미로 본 발명의 적용을 나타내기 위해 상호교환가능하게 사용되고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 miR-106b 길항제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 "작동가능하게 연결된" 프로모터를 포함한다. 본원에 사용된 어구 "작동가능하게 연결된" 또는 "전사 제어 하에"는 프로모터가 RNA 폴리머라제에 의한 전사의 개시 및 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하기 위해 폴리뉴클레오티드와 관련하여 정확한 위치 및 배향에 있다는 것을 의미한다. miR-106b 길항제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 1차-마이크로RNA 서열, 전구체-마이크로RNA 서열 또는 성숙 miR-106b 길항제 서열을 코딩할 수 있다.
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 또는 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스, 예컨대 인간 면역결핍 (HIV) 바이러스로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, AAV는 AAV8 또는 AAV9이다.
한 측면에서, 벡터는 AAV (아데노-연관 바이러스) 벡터이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 재조합 AAV 벡터는 근육을 다른 조직에 비해 우선적으로 표적화하는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 재조합 AAV 벡터는 우선적으로 근육에서 관심 유전자의 발현을 증가시키는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 AAV 벡터를 사용한 근육의 표적화 및 형질도입을 포괄한다. 방법은 대상체에게 조절 요소를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터의 유효량을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 조절 요소는 일반적으로 적어도 1종의 프로모터 요소 및 임의로 적어도 1종의 인핸서 요소를 포함한다. 인핸서 및 프로모터는 전형적으로 작동가능하게 연결된다. 재조합 AAV 벡터는 또한 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된 적어도 1종의 유전자를 임의로 포함할 수 있다. AAV는, 일부 실시양태에서, 전체 AAV 게놈 또는 그의 상동체 또는 단편, 예컨대 특정한 AAV의 캡시드를 포함할 수 있다. 그러나, 전체 AAV 게놈은 벡터 복제-결핍을 만들고/거나 관심 유전자, 예컨대 치료 유전자를 삽입할 필요성 때문에 일부 상황에서 유용하지 않거나 요구되지 않을 수 있다는 것을 주목하여야 한다.
조절 요소 및 관심 유전자는 또한 그의 활성 단편, 변형 또는 상동체로 치환될 수 있다. 한 측면에서, 재조합 AAV 벡터는 골격근을 우선적으로 표적화한다.
재조합 AAV 벡터는 근육 내의 특이적 유전자를 본 개시내용의 AAV 벡터로부터 발현된 siRNA 또는 miRNA로 녹다운시키는 데 사용하기 위해 제조될 수 있다.
AAV-9 (예를 들어, NCBI 수탁 번호 AX753250; 서열식별번호: 8) 및 AAV-8 (예를 들어, NCBI 수탁 번호 NC006261; 서열식별번호: 9)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 유용한 벡터, 핵산 및 단백질 또는 그의 상동체 및 단편이 본 개시내용의 실시에 유용할 수 있다.
AAV의 페이로드 제약으로 인해, 일부 실시양태에서, cDNA가 사용될 수 있다. 한 측면에서, 추가의 인트론 및 서열이 도입될 수 있다. 한 측면에서, 전체 AAV 게놈 DNA가 아니라 AAV의 cap 유전자가 사용된다.
소우자 등(Souza et al.) (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2011/0212529, 2011년 9월 1일 공개)에서의 것들을 포함한, 본 발명의 방법을 실시하는 데 또한 사용될 수 있는 다른 방법 및 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다.
AAV, 예컨대 AAV9 및 AAV8이 일부 조직을 다른 조직보다 더 높은 특이성으로 표적화할 수 있긴 하지만, 벡터의 일부로서 조직 또는 세포 특이적 인핸서 및 프로모터를 사용하면 관심 유전자가 목적하는 세포 또는 조직에서 발현되도록 보장하는 것을 도울 수 있다. 일부 실시양태에서, 목적하는 세포 또는 조직은 골격근 및/또는 가로무늬근 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 목적하는 세포 또는 조직은 심근 세포를 포함한다.
AAV의 보다 상세한 설명 및 용도는, 예를 들어 미국 특허 공개 번호 US 2013/0136729 (프렌치(French) 및 아넥스(Annex), 미국 특허 출원 일련 번호 13/673,351)에서 찾아볼 수 있으며, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 벡터는 심장 트로포닌-T 유전자 프로모터 또는 그의 필수 근위 프로모터 요소를 포함한다. 예시적인 심장 트로포닌-T 프로모터 및 필수 요소는 미국 특허 번호 5,266,488에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 근육 크레아틴 키나제 프로모터 또는 그의 필수 근위 프로모터 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 데스민 (DES) 프로모터 또는 그의 필수 근위 프로모터 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 조직-특이적 인핸서를 포함한다.
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 근육 조직에서의 트랜스진의 지속적인 발현을 위해 최적화된다. 본 발명의 또 다른 목적은 다양한 발현 시스템에서 지속적이고 적절한 발현 수준을 지시할 수 있는 인핸서/프로모터 조합을 제공하는 것이다.
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 트랜스진의 전사를 지속적인 방식으로 구동하는 키메라 조절 요소를 생성하기 위한 근육-특이적 프로모터 및 근육-특이적 인핸서로부터의 최소 서열의 조합을 포함한다. 최소 서열은 아마도 관심 전체 서열보다 다소 작기는 하지만 관심 기능을 유지하는 것이다.
본 개시내용은 본 개시내용의 인핸서/프로모터 조합을 함유하는 핵산으로 형질감염된 세포를 추가로 제공한다.
프로모터는 적절한 세포내 조절 인자에 결합되는 경우에 프로모터-의존성 전사를 증진시키는 ("인핸서") 또는 억제하는 ("리프레서") 다른 조절 서열/요소와 커플링될 수 있다. 프로모터, 인핸서 또는 리프레서는 이러한 요소(들)가 트랜스진 전사 비율 또는 효율을 제어하거나 또는 그에 영향을 미치는 경우에 트랜스진에 "작동가능하게 연결된" 것으로 언급된다. 예를 들어, 트랜스진 코딩 서열의 5' 말단 근위에 위치하는 프로모터 서열은 통상적으로 트랜스진과 작동가능하게 연결된다. 본원에 사용된 용어 "조절 요소"는 "조절 서열"과 상호교환가능하게 사용되고, 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소 또는 이러한 요소의 임의의 조합을 지칭한다.
기능적 영향
일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제, 예를 들어 miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 성숙 miR-106b 발현, 생물학적 활성 또는 발현 및 생물학적 활성 둘 다를 감소시킨다.
성숙 miR-106b 발현은 qPCR, 예를 들어 실시간 qPCR 및 마이크로어레이를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 따라 결정될 수 있다. 성숙 miR-106b 발현은 시험관내에서, 예를 들어 세포 배양 모델을 사용하여, 생체외에서 또는 생체내에서 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제, 예를 들어 miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 성숙 miR-106b 발현을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제, 예를 들어 miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 성숙 miR-106b 발현을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 적어도 50%, 예를 들어 10 내지 100%, 20 내지 90%, 30 내지 80%, 40 내지 70% 또는 50 내지 60%만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제, 예를 들어 miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 성숙 miR-106b 발현을 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%만큼 감소시킨다.
일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제 (예를 들어, miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 miR-106b 경로 활성을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제 (예를 들어, miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 PAD 관련 조건 하에 혈관신생을 촉진한다. PAD 관련 조건 하의 혈관신생은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제 (예를 들어, miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 카스파제-9 발현을 약화시키거나 또는 저산소증-유도된 카스파제-9 발현을 약화시킨다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제는 저산소증-유도된 카스파제-9 발현을 적어도 약 5%만큼, 적어도 약 10%만큼, 적어도 약 15%만큼, 적어도 약 20%만큼 또는 약 20% 초과만큼 약화시킨다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제는 저산소증-유도된 카스파제-9 발현을 약 5 내지 약 15%만큼 약화시킨다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제는 저산소증-유도된 카스파제-9 발현을 적어도 약 10%, 예를 들어 약 10%만큼 약화시킨다.
일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제 (예를 들어, miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 내피 또는 근육 세포에서 1종 이상의 유전자의 허혈-유도된 상향조절을 약화시키거나 또는 그의 발현을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 유전자는 세포 주기 경로의 유전자이다. 일부 실시양태에서, 세포 주기 경로의 1종 이상의 유전자는 p53 및 E2F-1로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 유전자의 발현은 허혈성 사건 후 세포에서 평가된다.
일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제 (예를 들어, miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 p53의 허혈-유도된 상향조절을 약화시키거나 또는 그의 발현을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, p53 mRNA 발현은 약 20% 내지 약 40%만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, p53 mRNA 발현은 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 100%만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, p53 단백질 발현은 약 10 내지 약 30%만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, p53 단백질 발현은 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 100%만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제 (예를 들어, miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 E2F-1의 허혈-유도된 상향조절을 약화시키거나 또는 그의 발현을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, E2F-1 mRNA 발현은 약 60% 내지 약 80%만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, E2F-1 단백질 발현은 약 10% 내지 약 30%만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제 (예를 들어, miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 miR-106b-매개된 혈관신생 감소를 약화시킨다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제 (예를 들어, miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 PAD-관련 조건 하에 miR-106b-매개된 혈관신생 감소를 약화시킨다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제는 miR-106b-매개된 혈관신생 감소를 적어도 약 2.5%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 100%만큼 약화시킨다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제, 예를 들어 miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 혈관신생을 증진시킨다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제는 혈관신생을 적어도 약 2.5%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 100%만큼 증진시킨다. 혈관신생은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 혈관신생은, 예를 들어 시험관내 혈관신생 검정을 통해 내피 분지화의 평가를 통해 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제 (예를 들어, miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 miR-106b-유도된 세포 증식 감소를 약화시킨다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제 (예를 들어, miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 PAD-관련 조건 하에 miR-106b-유도된 세포 증식 감소를 약화시킨다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제는 miR-106b-매개된 세포 증식 감소를 적어도 약 2.5%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 100%만큼 약화시킨다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제 (예를 들어, miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 혈관신생을 증진시킨다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제, 예를 들어 miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포 증식을 증진시킨다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제는 세포 증식을 적어도 약 2.5%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100%, 적어도 약 200% 또는 적어도 약 300%만큼 증진시킨다. 세포 증식은, 예를 들어 내피 세포의 증식을 포함할 수 있다. 세포 증식은, 예를 들어 근육 세포, 예컨대, 예를 들어 골격근 세포 또는 심근 세포의 증식을 포함할 수 있다. 세포 증식은 시험관내에서, 예를 들어 배양된 세포 (예컨대, 예를 들어 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) 및/또는 C2C12 세포)에서 측정될 수 있다. 세포 증식은 생체내에서 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제 (예를 들어, miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 miR-106b-매개된 아폽토시스를 약화시킨다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제 (예를 들어, miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 PAD-관련 조건 하에 miR-106b-매개된 아폽토시스를 약화시킨다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제 (예를 들어, miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 저산소증 또는 허혈 상태에 의해 유도된 아폽토시스를 약화시킨다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제는 아폽토시스를 적어도 약 2.5%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 100%만큼 감소시킨다. 아폽토시스, 뿐만 아니라 저산소증 또는 허혈 상태에 의해 유도된 아폽토시스는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 측정될 수 있다. 아폽토시스는, 예를 들어 내피 세포 및/또는 근육 세포 (예를 들어, 골격근 세포 또는 심근 세포)의 아폽토시스를 포함할 수 있다. 아폽토시스는 시험관내에서, 예를 들어 배양된 세포 (예컨대, 예를 들어 HUVEC 또는 C2C12 세포)에서 TUNEL 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 아폽토시스는 생체내에서, 예를 들어 관련 기술분야에 공지된 PAD-관련 조건의 임의의 동물 모델에서 측정될 수 있다. PAD-관련 조건의 예시적인 모델은 뒷다리 허혈 동물 모델이다.
일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제 (예를 들어, miR-106b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 허혈 후 재관류 (본원에서 관류 회복으로도 또한 지칭됨)를 증진시킨다. 일부 실시양태에서, miR-106b의 길항제는 허혈 후 재관류를 적어도 약 2.5%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 100%만큼 증진시킨다. 허혈은 사지의 허혈일 수 있다. 허혈 후 재관류는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 평가될 수 있다. 허혈의 예시적인 모델은 시험 설치류, 예를 들어 마우스에서의 뒷다리 허혈을 포함한다. 시험 설치류에서의 뒷다리 허혈 후 재관류는, 예를 들어 영상화에 의해 및/또는 뒷다리 허혈 후 모세혈관 밀도를 측정함으로써 평가될 수 있다. 뒷다리 허혈 후 모세혈관 밀도를 측정하고 관류 회복을 영상화하는 예시적인 방법이 본원에 개시된다. (예를 들어, "물질 및 방법" 섹션 내 실시예 참조.).
치료 방법
치료 용도를 위해, miR-106b 길항제는 제약상 허용되는 투여 형태, 예컨대 관련 기술분야에 공지된 투여 형태 및 상기 논의된 투여 형태로 대상체, 일반적으로 포유동물 (일반적으로 여기서 포유동물은 인간임)에게 투여된다. 예를 들어, miR-106b 길항제는 임의의 투여 경로, 예를 들어 경구, 협측, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 척수강내, 뇌실내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 경장, 국소, 설하, 질, 안구, 폐, 직장, 흉골내 주사, 신장 투석 주입 및 비경구에 의해 인간에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, miR-106b 길항제는 근육내로 투여된다.
따라서, 유효량의 본원에 개시된 miR-106b 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 허혈과 연관된 질환, 장애, 손상 또는 상태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 허혈과 연관된 질환, 장애, 손상 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 허혈은 혈관 허혈, 근육 허혈, 말초 동맥 질환, 허혈 재관류 손상, 외상과 연관된 허혈 및 뇌 허혈로 이루어진 군으로부터 선택되며, 임의로 여기서 허혈은 말초 동맥 질환이다.
일부 실시양태에서, 허혈은 말초 동맥 질환이다.
일부 실시양태에서, 허혈은 허혈 재관류 손상이다.
일부 실시양태에서, 허혈은 뇌 허혈이다. 일부 실시양태에서, 뇌 허혈은 외상과 연관된다.
한 측면에서, 허혈은 혈관 허혈이다. 한 측면에서, 혈관 허혈은 관상 동맥 허혈이다.
또한, 유효량의 본원에 개시된 miR-106b 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 내피 또는 근육 세포에서 적어도 1종의 세포 주기 경로 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 그의 허혈-유도된 상향조절을 약화시키는 것을 필요로 하는 대상체의 내피 또는 근육 세포에서 적어도 1종의 세포 주기 경로 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 그의 허혈-유도된 상향조절을 약화시키는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 세포 주기 경로 유전자가 본원에 개시된다.
또한, 유효량의 본원에 개시된 miR-106b 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 관류 회복의 증진을 필요로 하는 대상체에서 관류 회복을 증진시키는 방법이 본원에 제공된다.
또한, 유효량의 본원에 개시된 miR-106b 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 허혈에 대한 혈관신생 반응의 증진을 필요로 하는 대상체에서 허혈에 대한 혈관신생 반응을 증진시키는 방법이 본원에 제공된다.
또한, 유효량의 본원에 개시된 miR-106b 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 허혈성 사건 후 대상체에서 세포 증식을 자극하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포 증식은 내피 및/또는 근육 세포의 증식이다.
또한, 유효량의 본원에 개시된 miR-106b 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 모세혈관 밀도의 증가를 필요로 하는 대상체에서 모세혈관 밀도를 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
또한, 유효량의 본원에 개시된 miR-106b 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 세포의 아폽토시스의 억제를 필요로 하는 대상체에서 1종 이상의 세포의 아폽토시스를 억제하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 아폽토시스는 저산소증-유도된 아폽토시스, 예를 들어 허혈-유도된 저산소증에 의해 유도된 아폽토시스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 세포는 내피 세포 및/또는 근육 세포이다.
제약 조성물
일부 실시양태에서, miR-106b 길항제를 포함하는 제약 조성물로서, 여기서 제약 조성물은 또 다른 miRNA 분자를 추가로 포함하고, 여기서 miR-106b 길항제는 다른 miRNA 분자와 듀플렉스화된 것인 제약 조성물이 제공된다. 이러한 제약 조성물의 일부 실시양태에서, miR-106b 길항제는 hsa-miR-106b-5p의 안티센스 올리고뉴클레오티드이고, miR-93과 듀플렉스화된다. 이러한 제약 조성물의 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 (1) hsa-miR-106b-5p의 안티센스 올리고뉴클레오티드인 서열 AUCUGCACUGUCAGCACUUUA (서열식별번호: 6)를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 (2) hsa-miR-93-5p 서열 AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (서열식별번호: 3)를 포함하는 서열의 듀플렉스를 포함한다. 이러한 제약 조성물의 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 (1) hsa-miR-106b-5p의 안티센스 올리고뉴클레오티드인 서열 AUCUGCACUGUCAGCACUUUA (서열식별번호: 6)를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 (2) hsa-miR-93-5p 서열 CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (서열식별번호: 4)를 포함하는 서열의 듀플렉스를 포함한다.
본원에 기재된 길항제 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 제약 조성물로 제제화될 수 있다. 이들 조성물은 본원에 개시된 길항제 중 1종 이상에 추가로, 제약상 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 비-독성이어야 하고, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로 (예를 들어 경구, 협측, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 척수강내, 뇌실내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 경장, 국소, 설하, 질, 안구, 폐, 직장, 흉골내 주사, 신장 투석 주입 및 비경구 투여 경로)에 좌우될 수 있다.
경구 투여를 위한 제약 조성물은, 예를 들어 정제, 캡슐, 분말 또는 액체 형태일 수 있다. 정제는 고체 담체, 예컨대 젤라틴 또는 아주반트를 포함할 수 있다. 액체 제약 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예컨대 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 미네랄 오일 또는 합성 오일을 포함한다. 생리 염수 용액, 덱스트로스 또는 다른 사카라이드 용액 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다.
정맥내, 피부 또는 피하 주사 또는 고통 부위에서의 주사의 경우에, 활성 성분은 발열원-무함유이고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구로 허용되는 수용액의 형태일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 예를 들어 등장성 비히클, 예컨대 염화나트륨 주사, 링거 주사, 락테이트화 링거 주사를 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 필요에 따라, 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 근육내 투여를 위해 제제화된다.
본원에 개시된 1종 이상의 길항제의 투여는 바람직하게는 "치료 유효량" 또는 "예방 유효량" (경우에 따라, 예방이 요법으로 간주될 수 있긴 하지만)으로의 투여이며, 이는 개체에게 이익을 나타내기에 충분하다. 투여되는 실제 양 및 투여 비율 및 시간-경과는 치료될 질환의 성질 및 중증도에 좌우될 것이다. 치료의 처방, 예를 들어 투여량 등에 대한 결정은 일반 진료의 및 다른 의료 전문가의 책임 내에 있고, 전형적으로 치료될 장애, 개별 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법, 부작용의 회피 및 진료의에게 공지된 다른 인자를 고려한다. 상기 언급된 기술 및 프로토콜의 예는, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980]에서 찾아볼 수 있다.
조성물은 단독으로 또는 다른 치료와 조합되어, 치료될 상태에 따라 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 개시내용의 방법에 유용한 제약 조성물은 목적하는 투여 경로 (예를 들어, 경구, 직장, 질, 비경구, 국소, 폐, 비강내, 협측, 안구, 척수강내 또는 또 다른 투여 경로)에 적합한 제제로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 다른 고려되는 제제는 투사된 나노입자, 리포솜 제제, 활성 성분을 함유하는 재밀봉된 적혈구 및 면역학적-기반 제제를 포함한다.
본 개시내용의 제약 조성물은 벌크로, 단일 단위 용량으로서 또는 복수의 단일 단위 용량으로서 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 본원에 사용된 "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 제약 조성물의 개별 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 투여량 또는 이러한 투여량의 편리한 분획, 예컨대, 예를 들어 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 동일하다.
본 개시내용의 제약 조성물 중 활성 성분, 제약상 허용되는 담체 및 임의의 추가의 성분의 상대량은 치료되는 대상체의 정체, 크기 및 상태에 따라 및 추가로 조성물을 투여하는 경로에 따라 달라질 것이다. 예로서, 조성물은 0.1% 내지 100% (w/w) 활성 성분을 포함할 수 있다.
활성 성분에 추가로, 본 개시내용의 제약 조성물은 1종 이상의 추가의 제약 활성제를 추가로 포함할 수 있다. 특히 고려되는 추가의 작용제는 항구토제 및 스캐빈저, 예컨대 시아나이드 및 시아네이트 스캐빈저를 포함한다.
본 개시내용의 제약 조성물의 제어- 또는 지속-방출 제제는 통상적인 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 경구 투여에 적합한 본 개시내용의 제약 조성물의 제제는 각각 미리 결정된 양의 활성 성분을 함유하는 정제, 경질 또는 연질 캡슐, 카쉐, 트로키 또는 로젠지를 포함하나 이에 제한되지는 않는 개별 고체 용량 단위의 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 경구 투여에 적합한 다른 제제는 분말 또는 과립 제제, 수성 또는 유성 현탁액, 수성 또는 유성 용액 또는 에멀젼을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "유성" 액체는 탄소-함유 액체 분자를 포함하고 물보다 덜 극성인 특징을 나타내는 것이다.
경구 투여에 적합한 본 개시내용의 제약 조성물의 액체 제제는 액체 형태로 또는 사용 전에 물 또는 또 다른 적합한 비히클로의 재구성을 위해 의도된 건조 제품의 형태로 제조, 포장 및 판매될 수 있다.
액체 현탁액은 수성 또는 유성 비히클 중 활성 성분의 현탁액을 달성하기 위해 통상적인 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 수성 비히클의 예는, 예를 들어 물 및 등장성 염수를 포함한다. 유성 비히클의 예는 아몬드 오일, 유성 에스테르, 에틸 알콜, 식물성 오일, 예컨대 아라키스, 올리브, 참깨 또는 코코넛 오일, 분별화 식물성 오일 및 미네랄 오일, 예컨대 액체 파라핀을 포함한다. 액체 현탁액은 1종 이상의 추가의 성분을 추가로 포함할 수 있으며, 이의 예는 현탁화제, 분산제 또는 습윤제, 유화제, 완화제, 보존제, 완충제, 염, 향미제, 착색제 및 감미제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 유성 현탁액은 증점제를 추가로 포함할 수 있다. 공지된 현탁화제의 예는 소르비톨 시럽, 수소화 식용 지방, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검, 아카시아 검 및 셀룰로스 유도체, 예컨대 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
공지된 분산제 또는 습윤제의 예는 자연 발생 포스파티드, 예컨대 레시틴 및 알킬렌 옥시드와 지방산, 장쇄 지방족 알콜, 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르 또는 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르와의 축합 생성물 (예를 들어, 각각 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트 또는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
공지된 유화제의 예는 레시틴 및 아카시아를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 공지된 보존제의 예는 메틸, 에틸 또는 n-프로필 파라 히드록시벤조에이트, 아스코르브산 및 소르브산을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 공지된 감미제의 예는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 수크로스 및 사카린을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 유성 현탁액을 위한 공지된 증점제의 예는 밀랍, 경질 파라핀 및 세틸 알콜을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
수성 또는 유성 용매 중 활성 성분의 액체 용액은 액체 현탁액과 실질적으로 동일한 방식으로 제조될 수 있으며, 주요 차이는 활성 성분이 용매 중에 현탁되기보다는 용해된다는 것이다. 본 개시내용의 제약 조성물의 액체 용액은 액체 현탁액과 관련하여 기재된 각각의 성분을 포함할 수 있으며, 현탁화제는 용매 중 활성 성분의 용해를 반드시 보조하지는 않을 것으로 이해된다. 수성 용매의 예는 물 및 등장성 염수를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 유성 용매의 예는 아몬드 오일, 유성 에스테르, 에틸 알콜, 식물성 오일, 예컨대 아라키스, 올리브, 참깨 또는 코코넛 오일, 분별화 식물성 오일 및 미네랄 오일, 예컨대 액체 파라핀을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 조성물은 추가의 성분을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "추가의 성분"의 예는 하기: 부형제; 표면 활성제; 분산제; 불활성 희석제; 과립화제 및 붕해제; 결합제; 윤활제; 감미제; 향미제; 착색제; 보존제; 생리학상 분해가능한 조성물, 예컨대 젤라틴; 수성 비히클 및 용매; 유성 비히클 및 용매; 현탁화제; 분산제 또는 습윤제; 유화제, 완화제; 완충제; 염; 증점제; 충전제; 유화제; 항산화제; 항생제; 항진균제; 안정화제; 및 제약상 허용되는 중합체 또는 소수성 물질 중 1종 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용의 제약 조성물에 포함될 수 있는 다른 "추가의 성분"의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Genaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa.]에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
제약 조성물은 동물에게 1일 수회만큼 빈번하게 투여될 수 있거나 또는 덜 빈번하게, 예컨대 1일 1회, 1주 1회, 2주마다 1회, 1개월 1회 또는 훨씬 덜 빈번하게, 예컨대 수개월마다 1회 또는 심지어 1년 1회 이하로 투여될 수 있다. 용량의 빈도는 전형적으로 통상의 기술자에 의해 결정되고, 임의의 수의 인자, 예컨대 비제한적으로 치료될 상태 또는 질환의 유형 및 중증도, 동물의 유형 및 연령 등에 좌우될 수 있다.
조합 요법
조성물 및 치료 방법은 본원에 개시된 1종 이상의 miR-106b 길항제와 1종 이상의 추가의 작용제의 공-투여를 포함할 수 있다. 추가의 작용제의 예는 세포독성제, 항혈관신생제, 아폽토시스촉진제, 항생제, 호르몬, 호르몬 길항제, 케모카인, 약물, 전구약물, 독소 및 효소를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
추가의 작용제의 추가의 예는 (a) 항미생물제, (b) 스테로이드 (예를 들어, 히드로코르티손, 트리암시놀론); (c) 통증 의약 (예를 들어, 아스피린, NSAID 및 국부 마취제); (d) 항염증제; (e) 성장 인자; (f) 시토카인; (g) 호르몬; (h) 말초 동맥 질환의 치료를 위한 다른 작용제 및 (i) 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 추가의 작용제는 또 다른 miRNA 분자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다른 miRNA 분자는 miR-93이다. 일부 실시양태에서, miR-93은 서열 AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (has-miR-93-3p; 서열식별번호: 3)를 포함한다. 일부 실시양태에서, miR-93은 서열 CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (hsa-miR-93-5p; 서열식별번호: 4)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다른 miRNA 분자와의 조합 요법은 그를 필요로 하는 대상체, 예를 들어 인간 대상체에게 miR-106b 길항제를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 제약 조성물은 다른 miRNA 분자를 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, miR-106b 길항제는 다른 miRNA 분자와 듀플렉스화된다. 또한, miR-106b 길항제를 포함하는 제약 조성물로서, 여기서 제약 조성물은 다른 miRNA 분자를 추가로 포함하고, 여기서 miR-106b 길항제는 다른 miRNA 분자와 듀플렉스화된 것인 제약 조성물이 본원에 제공된다. 이러한 제약 조성물의 일부 실시양태에서, miR-106b 길항제는 hsa-miR-106b-5p의 안티센스 올리고뉴클레오티드이고, miR-93과 듀플렉스화된다. 이러한 제약 조성물의 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 hsa-miR-106b-5p의 안티센스 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, AUCUGCACUGUCAGCACUUUA (서열식별번호: 6)의 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드)와 AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (서열식별번호: 3)를 포함하는 miR-93 서열의 듀플렉스를 포함한다. 이러한 제약 조성물의 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 hsa-miR-106b-5p의 안티센스 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 서열 AUCUGCACUGUCAGCACUUUA (서열식별번호: 6)를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드)와 CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (서열식별번호: 4)를 포함하는 miR-93 서열의 듀플렉스를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 또한 임의의 제약 또는 약물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 치료 분자의 사용을 포함한다. 제약의 예는 마취제, 수면제, 진정제 및 수면 유도제, 항정신병제, 항우울제, 항알레르기제, 항협심증제, 항관절염제, 항천식제, 항당뇨병제, 항설사 약물, 항경련제, 항통풍 약물, 항히스타민제, 항소양제, 구토제, 항구토제, 항연축제, 식욕 억제제, 신경활성 물질, 신경전달물질 효능제, 길항제, 수용체 차단제 및 재흡수 조정제, 베타-아드레날린성 차단제, 칼슘 채널 차단제, 디술피람 및 디술피람-유사 약물, 근육 이완제, 진통제, 해열제, 자극제, 항콜린에스테라제 작용제, 부교감신경흥분제, 호르몬, 항응고제, 항혈전제, 혈전용해제, 이뮤노글로불린, 면역억제제, 호르몬 효능제/길항제, 비타민, 항미생물제, 항신생물제, 제산제, 소화제, 완하제, 하제, 방부제, 이뇨제, 소독제, 살진균제, 살외부기생충제, 항기생충제, 중금속, 중금속 길항제, 킬레이트화제, 기체 및 증기, 알칼로이드, 염, 이온, 오타코이드, 디기탈리스, 강심성 글리코시드, 항부정맥제, 항고혈압제, 혈관확장제, 혈관수축제, 항무스카린제, 신경절 자극제, 신경절 차단제, 신경근육 차단제, 아드레날린성 신경 억제제, 항산화제, 비타민, 화장품, 항염증제, 상처 관리 제품, 항혈전형성제, 항종양제, 항혈관신생제, 마취제, 항원제, 상처 치유제, 식물 추출물, 성장 인자, 연화제, 함습제, 거부/항거부 약물, 살정자제, 컨디셔너, 항박테리아제, 항진균제, 항바이러스제, 항생제, 신경안정제, 콜레스테롤-감소 약물, 진해제, 히스타민-차단 약물 및 모노아민 옥시다제 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 미국 약전에 의해 열거된 모든 물질이 또한 포함될 수 있다.
용도가 본 개시내용 내에 포괄될 수 있는 카테고리 내의 약물의 유형 및 구체적 약물의 목록이 하기에 제공되며; 이 목록은 비제한적 예를 제공하는 것으로 의도된다.
항미생물제는 은 술파디아진, 니스타틴, 니스타틴/트리암시놀론, 바시트라신, 니트로푸라존, 니트로푸란토인, 폴리믹신 (예를 들어, 콜리스틴, 서팩틴, 폴리믹신 E 및 폴리믹신 B), 독시시클린, 항미생물 펩티드 (예를 들어, 천연 및 합성 기원), 네오스포린 (즉, 바시트라신, 폴리믹신 B 및 네오마이신), 폴리스포린 (즉, 바시트라신 및 폴리믹신 B)을 포함한다. 추가의 항미생물제는 국소 항미생물제 (즉, 방부제)를 포함하며, 이의 예는 은 염, 아이오딘, 벤즈알코늄 클로라이드, 알콜, 과산화수소 및 클로르헥시딘을 포함한다.
진통제: 아세트아미노펜; 알펜타닐 히드로클로라이드; 아미노벤조에이트 포타슘; 아미노벤조에이트 소듐; 아니독심; 아닐레리딘; 아닐레리딘 히드로클로라이드; 아닐로팜 히드로클로라이드; 아니롤락; 안티피린; 아스피린; 베녹사프로펜; 벤지다민 히드로클로라이드; 비시파딘 히드로클로라이드; 브리펜타닐 히드로클로라이드; 브로마돌린 말레에이트; 브롬페낙 소듐; 부프레노르핀 히드로클로라이드; 부타세틴; 부틱시레이트; 부토르파놀; 부토르파놀 타르트레이트; 카르바마제핀; 카르바스피린 칼슘; 카르비펜 히드로클로라이드; 카르펜타닐 시트레이트; 시프레파돌 숙시네이트; 시라마돌; 시라마돌 히드로클로라이드; 클로닉세릴; 클로닉신; 코데인; 코데인 포스페이트; 코데인 술페이트; 코노르폰 히드로클로라이드; 시클라조신; 덱소사드롤 히드로클로라이드; 덱스페메돌락; 데조신; 디플루니살; 디히드로코데인 비타르트레이트; 디메파단; 디피론; 독스피코민 히드로클로라이드; 드리니덴; 에나돌린 히드로클로라이드; 에피리졸; 에르고타민 타르트레이트; 에톡사젠 히드로클로라이드; 에토페나메이트; 유게놀; 페노프로펜; 페노프로펜 칼슘; 펜타닐 시트레이트; 플록타페닌; 플루페니살; 플루닉신; 플루닉신 메글루민; 플루피르틴 말레에이트; 플루프로쿠아존; 플루라돌린 히드로클로라이드; 플루르비프로펜; 히드로모르폰 히드로클로라이드; 이부페낙; 인도프로펜; 케타조신; 케토르파놀; 케토롤락 트로메타민; 레티미드 히드로클로라이드; 레보메타딜 아세테이트; 레보메타딜 아세테이트 히드로클로라이드; 레보난트라돌 히드로클로라이드; 레보르파놀 타르트레이트; 로페미졸 히드로클로라이드; 로펜타닐 옥살레이트; 로르시나돌; 로르녹시캄; 마그네슘 살리실레이트; 메페남산; 메나비탄 히드로클로라이드; 메페리딘 히드로클로라이드; 메프타지놀 히드로클로라이드; 메타돈 히드로클로라이드; 메타딜 아세테이트; 메토폴린; 메토트리메프라진; 메트케파미드 아세테이트; 밈반 히드로클로라이드; 미르펜타닐 히드로클로라이드; 몰리나존; 모르핀 술페이트; 목사조신; 나비탄 히드로클로라이드; 날부핀 히드로클로라이드; 날멕손 히드로클로라이드; 나목시레이트; 난트라돌 히드로클로라이드; 나프록센; 나프록센 소듐; 나프록솔; 네포팜 히드로클로라이드; 넥세리딘 히드로클로라이드; 노라시메타돌 히드로클로라이드; 옥펜타닐 히드로클로라이드; 옥타자미드; 올바닐; 옥세토론 푸마레이트; 옥시코돈; 옥시코돈 히드로클로라이드; 옥시코돈 테레프탈레이트; 옥시모르폰 히드로클로라이드; 페메돌락; 펜타모르폰; 펜타조신; 펜타조신 히드로클로라이드; 펜타조신 락테이트; 페나조피리딘 히드로클로라이드; 페니라미돌 히드로클로라이드; 피세나돌 히드로클로라이드; 피나돌린; 피르페니돈; 피록시캄 올라민; 프라바돌린 말레에이트; 프로딜리딘 히드로클로라이드; 프로파돌 히드로클로라이드; 프로피람 푸마레이트; 프로폭시펜 히드로클로라이드; 프로폭시펜 나프실레이트; 프록사졸; 프록사졸 시트레이트; 프록소르판 타르트레이트; 피롤리펜 히드로클로라이드; 레미펜타닐 히드로클로라이드; 살콜렉스; 살레타미드 말레에이트; 살리실아미드; 살리실레이트 메글루민; 살살레이트; 소듐 살리실레이트; 스피라돌린 메실레이트; 수펜타닐; 수펜타닐 시트레이트; 탈메타신; 탈니플루메이트; 탈로살레이트; 타자돌렌 숙시네이트; 테부펠론; 테트리다민; 티푸락 소듐; 틸리딘 히드로클로라이드; 티오피낙; 토나조신 메실레이트; 트라마돌 히드로클로라이드; 트레펜타닐 히드로클로라이드; 트롤아민; 베라돌린 히드로클로라이드; 베릴로팜 히드로클로라이드; 볼라조신; 크소르파놀 메실레이트; 크실라진 히드로클로라이드; 제나조신 메실레이트; 조메피락 소듐; 주캡사이신.
항고혈압제: 아플리조신 히드로클로라이드; 알리파미드; 알티아지드; 아미퀸신 히드로클로라이드; 암로디핀 베실레이트; 암로디핀 말레에이트; 아나리티드 아세테이트; 아티프로신 말레에이트; 벨포스딜; 베미트라딘; 벤다칼롤 메실레이트; 벤드로플루메티아지드; 벤즈티아지드; 베탁솔롤 히드로클로라이드; 베타니딘 술페이트; 베반톨롤 히드로클로라이드; 비클로딜 히드로클로라이드; 비소프롤롤; 비소프롤롤 푸마레이트; 부신돌롤 히드로클로라이드; 부피코미드; 부티아지드: 칸독사트릴; 칸독사트릴라트; 캅토프릴; 카르베딜롤; 세로나프릴; 클로로티아지드 소듐; 시클레타닌; 실라자프릴; 클로니딘; 클로니딘 히드로클로라이드; 클로파미드; 시클로펜티아지드; 시클로티아지드; 다로디핀; 데브리소퀸 술페이트; 델라프릴 히드로클로라이드; 디아파미드; 디아족시드; 디레발롤 히드로클로라이드; 딜티아젬 말레이트; 디테키렌; 독사조신 메실레이트; 에카도트릴; 에날라프릴 말레에이트; 에날라프릴라트; 에날키렌; 엔드랄라진 메실레이트; 에피티아지드; 에프로사르탄; 에프로사르탄 메실레이트; 페놀도팜 메실레이트; 플라보딜롤 말레에이트; 플로르디핀; 플로세퀴난; 포시노프릴 나트륨; 포시노프릴라트; 구아나벤즈; 구아나벤즈 아세테이트; 구아나클린 술페이트; 구아나드렐 술페이트; 구안시딘; 구아네티딘 모노술페이트; 구아네티딘 술페이트; 구안파신 히드로클로라이드; 구아니소퀸 술페이트; 구아노클로르 술페이트; 구아녹틴 히드로클로라이드; 구아녹사벤즈; 구아녹산 술페이트; 구아녹시펜 술페이트; 히드랄라진 히드로클로라이드; 히드랄라진 폴리스티렉스; 히드로플루메티아지드; 인다크리논; 인다파미드; 인돌라프리프 히드로클로라이드; 인도라민; 인도라민 히드로클로라이드; 인도레네이트 히드로클로라이드; 라시디핀; 레니퀸신; 레브크로마칼림; 리시노프릴; 로펙시딘 히드로클로라이드; 로사르탄 포타슘; 로술라진 히드로클로라이드; 메부타메이트; 메카밀아민 히드로클로라이드; 메드록살롤; 메드록살롤 히드로클로라이드; 메탈티아지드; 메티클로티아지드; 메틸도파; 메틸도페이트 히드로클로라이드; 메티프라놀롤; 메톨라존; 메토프롤롤 푸마레이트; 메토프롤롤 숙시네이트; 메티로신; 미녹시딜; 모나테필 말레에이트; 무졸리민; 네비볼롤; 니트렌디핀; 오포르닌; 파르길린 히드로클로라이드; 파족시드; 펠란세린 히드로클로라이드; 페린도프릴 에르부민; 페녹시벤즈아민 히드로클로라이드; 피나시딜; 피보프릴; 폴리티아지드; 프라조신 히드로클로라이드; 프리미돌롤; 프리지딜롤 히드로클로라이드; 퀴나프릴 히드로클로라이드; 퀴나프릴라트; 퀴나조신 히드로클로라이드; 퀴넬로란 히드로클로라이드; 퀸피롤 히드로클로라이드; 퀴누클륨 브로마이드; 라미프릴; 라우월피아 세르펜티나; 레세르핀; 사프리사르탄 포타슘; 사랄라신 아세테이트; 소듐 니트로프루시드; 술피날롤 히드로클로라이드; 타소사르탄; 텔루디핀 히드로클로라이드; 테모카프릴 히드로클로라이드; 테라조신 히드로클로라이드; 테를라키렌; 티아메니딘; 티아메니딘 히드로클로라이드; 티크리나펜; 티나비놀; 티오다조신; 티펜토신 히드로클로라이드; 트리클로르메티아지드; 트리마조신 히드로클로라이드; 트리메타판 캄실레이트; 트리목사민 히드로클로라이드; 트리파미드; 크시파미드; 잔키렌 히드로클로라이드; 조페노프릴라트 아르기닌.
항염증제: 알클로페낙; 알클로메타손 디프로피오네이트; 알게스톤 아세토니드; 알파 아밀라제; 암시나팔; 암시나피드; 암페낙 소듐; 아미프릴로스 히드로클로라이드; 아나킨라; 아니롤락; 아니트라자펜; 아파존; 발살라지드 디소듐; 벤다작; 베녹사프로펜; 벤지다민 히드로클로라이드; 브로멜라인; 브로페라몰; 부데소니드; 카프로펜; 시클로프로펜; 신타존; 클리프로펜; 클로베타솔 프로피오네이트; 클로베타손 부티레이트; 클로피락; 클로티카손 프로피오네이트; 코르메타손 아세테이트; 코르토독손; 데플라자코르트; 데소니드; 데스옥시메타손; 덱사메타손 디프로피오네이트; 디클로페낙 포타슘; 디클로페낙 소듐; 디플로라손 디아세테이트; 디플루미돈 소듐; 디플루니살; 디플루프레드네이트; 디프탈론; 디메틸 술폭시드; 드로시노니드; 엔드리손; 엔리모맙; 에놀리캄 소듐; 에피리졸; 에토돌락; 에토페나메이트; 펠비낙; 페나몰; 펜부펜; 펜클로페낙; 펜클로락; 펜도살; 펜피팔론; 펜티아작; 플라잘론; 플루아자코르트; 플루페남산; 플루미졸; 플루니솔리드 아세테이트; 플루닉신; 플루닉신 메글루민; 플루오코르틴 부틸; 플루오로메톨론 아세테이트; 플루쿠아존; 플루르비프로펜; 플루레토펜; 플루티카손 프로피오네이트; 푸라프로펜; 푸로부펜; 할시노니드; 할로베타솔 프로피오네이트; 할로프레돈 아세테이트; 이부페낙; 이부프로펜; 이부프로펜 알루미늄; 이부프로펜 피코놀; 일로니답; 인도메타신; 인도메타신 소듐; 인도프로펜; 인독솔; 인트라졸; 이소플루프레돈 아세테이트; 이속세팍; 이속시캄; 케토프로펜; 로페미졸 히드로클로라이드; 로르녹시캄; 로테프레드놀 에타보네이트; 메클로페나메이트 소듐; 메클로페남산; 메클로리손 디부티레이트; 메페남산; 메살라민; 메세클라존; 메틸프레드니솔론 술렙타네이트; 모미플루메이트; 나부메톤; 나프록센; 나프록센 소듐; 나프록솔; 니마존; 올살라진 소듐; 오르고테인; 오르파녹신; 옥사프로진; 옥시펜부타존; 파라닐린 히드로클로라이드; 펜토산 폴리술페이트 소듐; 펜부타존 소듐 글리세레이트; 피르페니돈; 피록시캄; 피록시캄 신나메이트; 피록시캄 올라민; 피르프로펜; 프레드나제이트; 프리펠론; 프로돌산; 프로쿠아존; 프록사졸; 프록사졸 시트레이트; 리멕솔론; 로마자리트; 살콜렉스; 살나세딘; 살살레이트; 산구이나리움 클로라이드; 세클라존; 세르메타신; 수독시캄; 술린닥; 수프로펜; 탈메타신; 탈니플루메이트; 탈로살레이트; 테부펠론; 테니답; 테니답 소듐; 테녹시캄; 테시캄; 테시미드; 테트리다민; 티오피낙; 틱소코르톨 피발레이트; 톨메틴; 톨메틴 소듐; 트리클로니드; 트리플루미데이트; 지도메타신; 조메피락 소듐.
일부 실시양태에서, 상처 치유를 증진시키는 데 유용한 유효량의 적어도 1종의 성장 인자, 시토카인, 호르몬 또는 세포외 매트릭스 화합물 또는 단백질이 투여된다. 한 측면에서, 이들 작용제의 조합이 사용된다. 한 측면에서, 본 개시내용의 실시에 유용한 성장 인자의 예는 EGF, PDGF, GCSF, IL6, IL8, IL10, MCP1, MCP2, 조직 인자, FGFb, KGF, VEGF, PLGF, MMP1, MMP9, TIMP1, TIMP2, TGF.베타. 및 HGF를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 사용된 성장 인자, 시토카인, 호르몬 또는 세포외 매트릭스 단백질의 선택이 치료될 손상, 질환 또는 장애의 유형, 대상체의 연령, 건강, 성별 및 체중 등과 같은 기준에 따라 달라질 것임을 인지할 것이다. 한 측면에서, 성장 인자, 시토카인, 호르몬 및 세포외 매트릭스 화합물 및 단백질은 인간의 것이다.
본 개시내용의 화합물을 포함하는 조성물 내에 혼입될 수 있거나 또는 그 내에 첨가제로서 포함될 수 있는 단백질 및 다른 생물학적 활성 화합물의 예는 콜라겐 (가교된 콜라겐 포함), 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴 (가교된 엘라스틴 포함), 오스테오폰틴, 오스테오넥틴, 골 시알로단백질 (Bsp), 알파-2HS-당단백질, 골 Gla-단백질 (Bgp), 매트릭스 Gla-단백질, 골 인당단백질, 골 인단백질, 골 프로테오글리칸, 단백질지질, 골 형태발생 단백질, 연골 유도 인자, 골격 성장 인자, 효소 또는 그의 조합 및 생물학적 활성 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 면역 반응을 감소시키는 아주반트가 또한 본 개시내용의 복합체와 함께 사용될 수 있다.
본 개시내용에서 화합물 또는 물질로서 유용할 수 있는 다른 분자의 예는 성장 호르몬, 렙틴, 백혈병 억제 인자 (LIF), 종양 괴사 인자 알파 및 베타, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 트롬보스폰딘, 골형성 단백질-1, 골 형태발생 단백질 2 및 7, 오스테오넥틴, 소마토메딘-유사 펩티드, 오스테오칼신, 인터페론 알파, 인터페론 알파 A, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 1 알파 및 인터류킨 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17 및 18을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 수반하는 실시양태는 임의의 크기 및 복잡성의 임의의 유형의 이러한 분자 뿐만 아니라 이러한 분자의 조합을 포함할 수 있다.
실시예
하기는 본 개시내용을 수행하기 위한 구체적 실시양태의 예이다. 실시예는 단지 예시적 목적을 위해 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 수 (예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확도를 보장하기 위해 노력하였지만, 일부 실험 오차 및 편차는 물론 허용되어야 한다.
본 개시내용의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 내의 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 통상적인 방법을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992)]을 참조한다.
물질 및 방법
관심 분자 및 듀플렉스: 하기 분자 또는 듀플렉스 중 1종 이상을 하기 실시예에서 시험할 수 있다:
(1) miR-106b의 길항제, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드). 예를 들어,
i. "분자 1:" 서열 AUCUGCACUGUCAGCACUUUA (서열식별번호: 6)를 포함하거나 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드
(2) miR-93 분자. 예를 들어,
i. "분자 2:" 서열 AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (서열식별번호: 3)를 포함하거나 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드
ii. "분자 3:" 서열 CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (서열식별번호: 4)를 포함하거나 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드
(3) (a) hsa-miR-106b의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 (b) 또 다른 핵산 분자, 예를 들어 miR-93 서열을 갖는 다른 핵산 분자의 듀플렉스. 예를 들어,
i. "듀플렉스 1:" 서열 AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (서열식별번호: 3)를 포함하거나 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드와 함께 듀플렉스화된 분자 1
ii. "듀플렉스 2:" 서열 CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (서열식별번호: 4)를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드와 함께 듀플렉스화된 분자 1.
임의의 듀플렉스, 예컨대 듀플렉스 1 및 듀플렉스 2가 듀플렉스 형태로 대상체에게 제공될 수 있지만, 일부 실시양태에서, 듀플렉스는 대상체의 신체 내부에 있을 때 별개의 가닥으로 해리될 수 있다. 예를 들어, 듀플렉스 1 및 2는, 일부 실시양태에서, 대상체의 신체 내부에서 분자 1 및 다른 RNA 올리고뉴클레오티드로 분리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 분자 1, 듀플렉스 1 및/또는 듀플렉스 2의 투여 또는 전달은 miR-106b의 녹다운을 유도한다. 일부 실시양태에서, 듀플렉스 1 및/또는 듀플렉스의 투여 또는 전달은 miR-93의 과다발현을 유도한다.
일부 실시예에서, 분자 1, 분자 2 및/또는 분자 3을 사용한 실험으로부터의 결과가 듀플렉스 1 또는 듀플렉스 2를 사용한 실험으로부터의 결과와 비교된다. 일부 실시예에서, 분자 1, 2 또는 3을 사용한 실험과 비교하여 듀플렉스 1 또는 듀플렉스 2를 사용한 실험에서 더 우수한 결과가 관찰될 수 있다.
뒷다리 허혈의 뮤린 모델 및 관류 회복의 모니터링: 동물 연구는 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인되고, 미국 국립 보건원에 의해 공개된 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침을 준수한다. 마취 (케타민 90 mg/kg 및 크실라진 10 mg/kg)를 유도한 후, 8-12주령 수컷 C57B1/6J 또는 BALB/cJ 마우스에서 일측 대퇴 동맥 결찰 및 절제를 수행한다. 수술 후 제0일, 제3일, 제7일, 제14일 및 제21일에 레이저 도플러 영상화 (페리메드, 인크.(Perimed, Inc.))를 사용하여 관류 회복을 측정한다. 각각의 마우스에 대해 허혈성 사지에서의 관류를 비-허혈성 사지에서의 관류에 대해 정규화한다.
마이크로-RNA 마이크로-어레이: 수술 후 제3일에 C57B1/6J 및 BALB/cJ 마우스 (n=3/군)로부터 비복근을 수집한다. 트리졸(TRIzol)™ 총 트랜스크립톰 단리 프로토콜 및 퓨어 링크(Pure Link) RNA 미니 키트를 제조업체의 지침서 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 캘리포니아주 칼스배드)에 따라 사용하여 RNA를 단리한다. RNA를 50 μg 양으로 분취하고, 380개의 마우스 마이크로-RNA를 함유하는 일루미나(Illumina) 마이크로-RNA 칩 (V2 마이크로-RNA 발현 프로파일링 키트; miRbase 9.1)을 사용하여 어레이를 수행한다. 차등 발현된 마이크로-RNA를 허혈과 계통의 조합에 의한 조절 또는 허혈 또는 계통 단독에 의한 조절에 기초하여 분류한다.
mRNA 마이크로-어레이: 허혈성 조직과 비-허혈성 조직 사이의 마우스 mRNA 어레이를 위해, BALB/cJ 마우스 (n=3/군)로부터의 비복근을 뒷다리 허혈 (HLI) 후 제3일에 수거한다. 트리졸™ 총 트랜스크립톰 단리 프로토콜을 사용하여 총 RNA를 추출한다. 품질 관리 후, RNA를 50 μg 분취물로 분취하고, 진 칩(Gene Chip) 마우스 게놈 43-2.0을 사용하여 어레이를 수행한다. HUVEC mRNA 어레이를 위해, HUVEC를 스크램블링된 서열 또는 antimiR-106으로 형질감염시킨 후에 HUVEC로부터의 RNA를 단리하고, 저산소증 및 혈청 고갈의 조건 하에 24시간 (형질감염 후 총 48시간) 동안 인큐베이션한다. 일루미나 휴먼(Illumina Human) 6 V 1 플랫폼을 사용하여 어레이를 수행한다. 일루미나의 게놈 스튜디오를 사용하여 비-정규화 데이터를 수득한다. R 및 비드어레이 패키지를 사용하여 품질 관리, 사전-가공 및 분위수 정규화를 수행한다. 브로드 인스티튜트(Broad Institute)로부터의 GSEA V 2.0을 사용하여 100개의 순열 및 FDR 컷오프 <0.25를 사용하여 유전자 세트 풍부화에 대한 분석을 수행한다.
miR-106b의 생체내 녹다운: 안타고미르-106b 및 스크램블링된 서열을 합성한다. 올리고 서열은 하기와 같다: 안타고미르-106b: 5'-AUCUGCACUGUCAGCACUUUA-3' (서열식별번호: 6). 스크램블: 5'-AAGGCAAGCUGACCCUGAAGUU-3' (서열식별번호: 10). 올리고를 PBS 중에 용해시키고, 8 mg/kg 체중의 용량으로 안와후로 주사한다. HLI 30분 전에 및 HLI 후 제7일 및 제14일에 주사를 제공한다. 생체내 녹다운 효율의 검출을 위해, 별개의 마우스 군을 제0일, 제3일 및 제7일에 안락사시키고, 실시간 qPCR을 사용하여 miR-106b 발현을 정량화한다.
세포 배양: 풀링된 HUVEC를 구입하고 (셀 어플리케이션즈 인크.(Cell Applications Inc.), 캘리포니아주 샌디에고), 10% FBS 함유 표준 내피 세포 성장 배지 (셀 어플리케이션즈 인크., 캘리포니아주 샌디에고)에서 성장시킨다. C2C12 세포를 10% FBS 함유 DMEM에서 배양한다. 시험관내 형질감염 연구를 위해, neofx 형질감염제 (암비온(Ambion), 텍사스주 오스틴)를 사용하는 역 형질감염 프로토콜을 사용한다. AntimiR-106b, miRNA 억제제 음성 대조군 (Cat. #44640760), premiR-106b 또는 miRNA 모방 음성 대조군 (Cat. #4464058)을 텍사스주 오스틴 소재 암비온으로부터 구입한다. HUVEC 및 C2C12 세포에 대해 초기 용량 반응 실험을 수행하여 miR-106b의 효율적인 녹다운을 위한 용량 및 시간 경과를 결정한다. 이들 실험에 기초하여, HUVEC에서 15 nM 용량의 antimiR-106b 또는 premiR-106b 및 그의 각각의 대조군을 사용하여 miR-106b를 녹다운 또는 과다-발현시킨다. C2C12 세포의 경우에는, 120 nM의 용량을 antimiR-106b 또는 premiR-106b 및 그의 각각의 대조군에 대해 사용한다. 세포 증식, 튜브 형성 및 아폽토시스 검정을 형질감염 48시간 후에 수행한다.
세포 아폽토시스: 세포를 96-웰 플레이트에 HUVEC의 경우 1x104개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, C2C12 세포의 경우 세포를 0.5x104개 (premiR-106b 대 스크램블) 또는 1x105개 (스크램블 대 AntimiR-106b)의 밀도로 플레이팅한다. 형질감염 24시간 후에, miR-106b 조정된 세포를 시험관내에서 저산소증 (2% 산소, 바이오스페릭스(BioSpherix), 뉴욕주 라코나) 및 혈청 고갈 (HSS)에 노출시켜 허혈을 자극한다. HUVEC를 48시간의 HSS에 노출시키는 반면, C2C12 세포를 3시간의 HSS에 노출시킨다. C2C12 세포가 보다 긴 HSS 지속기간 하에 유의한 세포 사멸을 나타낸다는 것을 보여준 예비 실험에 기초하여 C2C12 세포에 대해 HSS 노출의 보다 짧은 시간 경과를 선택한다. 인큐베이션 종료 시에, TUNEL 검정 (타이터TACS(TiterTACS), 메릴랜드주 트레비겐 게이더스버그)을 사용하여 세포에서의 아폽토시스를 결정한다. TACS 뉴클레아제 처리된 웰을 양성 대조군으로서 사용한 반면, TdT의 첨가가 없는 웰을 음성 대조군으로서 사용한다. 각각의 실험을 적어도 3회 반복한다.
세포 증식: 세포를 96-웰 플레이트에 HUVEC의 경우 5x103개 세포/웰의 플레이팅 밀도로 플레이팅하고, C2C12 세포의 경우 0.5x103개 (premiR-106b 대 스크램블) 또는 1x103개 (스크램블 대 AntimiR-106b)의 밀도로 플레이팅한다. 플레이팅 48 및 72시간 후에 테트라졸륨 염료 혼입 (바이오비전(BioVision), 캘리포니아주 밀피타스)을 사용하고, 사멸 세포를 배제하기 위해 트리판 블루 염색 후에 수동 세포 카운트를 수행함으로써, 세포 증식을 평가한다. 실험을 3회 반복한다.
시험관내 혈관신생 검정: 형질감염 48시간 후에, miR-106b 조정된 HUVEC를 매트리겔 상에 플레이팅하여 튜브 형성을 평가한다. PremiR-106b 또는 스크램블 형질감염된 세포를 48-웰 플레이트에 30,000개 세포/웰의 세포 밀도로, 성장 인자 감소된 매트리겔 (Cat #356231, BD 바이오사이언시스(BD Biosciences), 매사추세츠주 베드포드) 상에 플레이팅하고, 세포를 0% 또는 5% 저 혈청 성장 배지 (라이프 테크놀로지스, 뉴욕주)의 조건 하에 배양한다. 유사하게, antimiR-106b 또는 스크램블 형질감염된 세포를 성장 인자 풍부화된 매트리겔 (Cat. #356234, BD 바이오사이언시스, 매사추세츠주 베드포드) 상에 플레이팅하고, 내피 세포 성장 인자 (EGM CC-3124, 론자(Lonza), 뉴저지주 알렌데일)의 0% 또는 5% 혼합물의 조건 하에 성장시킨다. 내피 세포 튜브 형성을 플레이팅 6시간 후에 평가한다. 각각의 조건을 삼중으로 수행한다. 100X 배율 하에 각각의 웰로부터 4개의 대표적인 사진을 찍고, 총 완전 튜브 수를 카운팅하고, 제곱 mm당 튜브 수로 표현한다.
모세혈관 밀도: 모세혈관 밀도의 평가를 위해, HLI 21일 후, premiR-106b 및 스크램블 처리된 BALB/cJ 마우스로부터의 허혈성 비복근을 OCT 화합물에서 급속 동결시키고, 7 μm 두께로 절편화한다. 절편을 먼저 5% 정상 염소 혈청으로 차단한 다음, 래트 항-CD31 항체 (1:25, BD 바이오사이언시스 cat #550274)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션한다. 이어서, 절편을 PBS로 세척하고, 실온에서 1시간 동안 1:25 희석물에서 알렉사-555 접합된 염소 항-래트 IgG로 프로빙한다. 절편을 PBS로 세척하고, 벡타쉴드(Vectashield) 마운팅 배지 (벡터 랩(Vector Lab), 캘리포니아주 벌링게임)에 마운팅한다. 1차 항체 없이 단지 2차 항체만을 음성 대조군으로서 사용하여 비-특이적 결합을 평가한다. 올림푸스(Olympus) BX51 고배율 현미경을 사용하여 400X 배율 하에 각각의 절편으로부터 3개의 대표적인 사진을 찍는다. CD31 양성 스폿/필드의 총 수 및 근섬유/필드의 총 수를 카운팅하고, 모세혈관을 CD31 양성 스폿/근섬유로서 표현한다.
실시예 1: 배양된 세포에서의 miR-106b의 녹다운 및/또는 miR-93의 과다발현
HUVEC 및 C2C12 세포에서 miR-106b를 녹다운시키고/거나 miR-93을 과다발현시킨다. 스크램블 antimiR 서열을 대조군으로서 사용한다. HUVEC 및 C2C12 세포를 배양하고, 상기 기재된 바와 같은 antimiR-106b (예를 들어, 분자 1), miR-93 분자 (예를 들어, 분자 2 또는 분자 3), 듀플렉스 (예를 들어, 듀플렉스 1 또는 듀플렉스 2) 또는 스크램블 antimiR-106b 서열로 처리한다. 형질감염 후 miR-106b 수준 및/또는 miR-93을 평가한다. 적어도 50% miR-106b의 감소가 유의한 감소를 나타낼 것이고; 적어도 50% miR-93의 증가가 유의한 증가를 나타낼 것이다.
HSS 후에, HUVEC 및 C2C12 세포 둘 다에서 아폽토시스의 마커인 카스파제-9에 대한 miR-106b 녹다운의 효과 및/또는 miR-93 과다발현의 효과를 평가한다. 형질감염 후 카스파제-9의 약화는 miR-106b 녹다운 및/또는 miR-93 과다발현이 내피 및 골격근 세포 둘 다에서 HSS에 반응하여 세포 생존을 매개한다는 것을 나타낼 것이다.
듀플렉스 1 또는 듀플렉스 2로 형질감염된 세포로부터의 결과를 분자 1, 분자 2 또는 분자 3으로 형질감염된 세포에서의 결과와 비교한다.
실시예 2: 세포 증식에 대한 분자 및/또는 듀플렉스의 효과
허혈에 대한 혈관신생 반응은 내피 세포 생존, 증식 및 이동을 포함한다. (예를 들어, 내피 및 C2C12 세포에서) 세포 증식에 대한 분자 1, 분자 2, 분자 3, 듀플렉스 1 및/또는 듀플렉스 2의 효과를 본원에 개시된 방법에 따라 조사한다. (예를 들어, 상기 "물질 및 방법" 참조.) 듀플렉스 1 또는 듀플렉스 2로 형질감염된 세포로부터의 결과를 분자 1, 분자 2 또는 분자 3으로 형질감염된 세포로부터의 결과와 비교한다.
실시예 3: 뒷다리 허혈 후 관류 회복에 대한 분자 및/또는 듀플렉스의 영향
마우스를 전신 전달된 분자 1, 분자 2, 분자 3, 듀플렉스 1 및/또는 듀플렉스 2로 처리하여 miR-106b 길항작용 및/또는 miR-93 과다발현이 HLI에 대한 반응을 조정하는지 여부를 시험한다. 스크램블 처리된 마우스를 대조군으로서 사용한다. 분자 1, 분자 2, 분자 3, 듀플렉스 1 및/또는 듀플렉스 2의 단일 정맥내 주사를 수술 30분 전에 제공한다.
miR-106b 발현 (예를 들어, 발현의 녹다운) 및/또는 miR-93 발현 (예를 들어, 과다발현)에 대한 효과를 제-1일에 시작하여 이후의 시점에, 예를 들어 주사 7일 후에 평가한다. 분자 1, 분자 2, 분자 3, 듀플렉스 1 및/또는 듀플렉스 2 또는 스크램블 서열을 HLI의 제0일, 제7일 및 제14일에 주사하고, 관류 회복을 도플러 영상화를 사용하여 모니터링한다. HLI 후 스크램블 처리된 마우스와 비교하여 안타고미르-106b (예를 들어, 분자 1)-처리된 마우스에서의 개선된 관류 회복은 miR-106b를 억제하는 것이 관류 회복을 증진시키는 데 효과적이라는 것을 나타낼 것이다.
듀플렉스 1 또는 듀플렉스 2-처리된 마우스로부터의 결과를 분자 1, 분자 2 또는 분자 3으로 처리된 마우스로부터의 결과와 비교한다.
실시예 4: 생체내 다수의 유전자에 대한 분자 및 듀플렉스의 효과
p21, p53 및 E2F-1은 비-허혈성 근육에 비해 허혈성 근육에서 상향-조절된다. BALB/cJ 마우스를 분자 1, 분자 2, 분자 3, 듀플렉스 1 및/또는 듀플렉스 2로 처리하고, p21, p53 및 E2F-1 발현을 스크램블 처리된 마우스에서의 것과 비교하여 평가한다. 분자 1, 분자 2, 분자 3, 듀플렉스 1 또는 듀플렉스 2로 처리된 마우스에서의 p21, p53 및 E2F-1의 하향조절 (스크램블 처리된 마우스에서는 아님)은 miR-106b 녹다운 및/또는 miR-93이 생체내에서 이들 유전자를 조절한다는 것을 나타낼 것이다.
듀플렉스 1 또는 듀플렉스 2-처리된 마우스로부터의 결과를 분자 1, 분자 2 또는 분자 3으로 처리된 마우스로부터의 결과와 비교한다.
실시예 5: miR-106b-매개된 내피 분지화 억제에 대한 분자 및 듀플렉스의 효과
매트리겔 모델에서 내피 세포 튜브 형성에 대한 miR-106b 녹다운 및/또는 miR-93 과다발현의 효과를 본원에 기재된 시험관내 혈관신생 검정에 따라 평가한다. miR-106b는 내피 세포 튜브 형성을 약 50%만큼 감소시킨다.
본 실시예에서, 내피 세포 튜브 형성에 대한 분자 1, 분자 2, 분자 3, 듀플렉스 1 및/또는 듀플렉스 2의 효과를 평가한다. 내피 세포 튜브 형성에 대한 miR-106b의 효과의 역전은 시험관내에서 miR-106b 녹다운 및/또는 miR-93 발현의 혈관신생촉진 역할을 나타낼 것이다.
듀플렉스 1 또는 듀플렉스 2를 사용한 실험으로부터의 결과를 분자 1, 분자 2 또는 분자 3을 사용한 실험으로부터의 결과와 비교한다.
본 발명이 특히 바람직한 실시양태 및 다양한 대안적 실시양태를 참조하여 제시되고 기재되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항에 있어서 다양한 변화가 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 명세서의 본문 내에 인용된 모든 참고문헌, 허여된 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함한다.
넘버링된 실시양태
실시양태 1: 허혈과 연관된 질환, 장애, 손상 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 그를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 miRNA 발현, 수준 또는 활성의 길항제, 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 투여하여, 허혈과 연관된 상기 질환, 장애 또는 상태를 치료하는 것을 포함하며, 여기서 상기 miRNA는 miR-106b인 방법.
실시양태 2: 실시양태 1에 있어서, miR-106b가 인간 miR-106b인 방법.
실시양태 3: 실시양태 2에 있어서, 인간 miR-106b가 서열 UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU (서열식별번호: 1)를 포함하는 인간 miR-106b-5p인 방법.
실시양태 4: 실시양태 2에 있어서, 인간 miR-106b가 서열 CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC (서열식별번호: 2)를 포함하는 인간 miR-106b-3p인 방법.
실시양태 5: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 길항제가 성숙 miR-106b의 한 부분에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이며, 이에 따라 안티센스 올리고뉴클레오티드가 miR-106b에 결합하는 것인 방법.
실시양태 6: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 DNA를 포함하는 것인 방법.
실시양태 7: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 RNA를 포함하는 것인 방법.
실시양태 8: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 miR-106b의 안타고미르인 방법.
실시양태 9: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 1종 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 것인 방법.
실시양태 10: 실시양태 9에 있어서, 1종 이상의 뉴클레오티드 유사체가 LNA를 포함하는 것인 방법.
실시양태 11: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 성숙 miR-106b 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있으며, 듀플렉스가 적어도 약 60℃의 Tm을 갖는 것인 방법.
실시양태 12: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 또 다른 단일 가닥 RNA 핵산 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있으며, 듀플렉스가 약 60℃ 미만, 약 50℃ 미만, 약 45℃ 미만, 약 40℃ 미만, 약 37℃ 미만, 약 35℃ 미만, 약 30℃ 미만 또는 약 25℃ 미만의 Tm을 갖는 것인 방법.
실시양태 13: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 길항제가 miR-106b 발현, 수준 또는 활성을 감소시키는 것인 방법.
실시양태 14: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 대상체에게 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 15: 실시양태 14에 있어서, 상기 추가의 치료제가 항허혈제를 포함하는 것인 방법.
실시양태 16: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 길항제가 단리된 핵산 또는 단리된 핵산을 포함하는 벡터에 의해 코딩된 것인 방법.
실시양태 17: 실시양태 16에 있어서, 상기 벡터가 miRNA 발현 벡터 또는 AAV 발현 벡터로부터 선택된 발현 벡터인 방법.
실시양태 18: 실시양태 17에 있어서, 상기 발현 벡터가 miRNA 발현 벡터인 방법.
실시양태 19: 실시양태 15에 있어서, 상기 단리된 핵산이 세포-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 방법.
실시양태 20: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 길항제가 지질 비히클 내에 캡슐화된 것인 방법.
실시양태 21: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 유효량이 대상체의 내피 또는 근육 세포에서 적어도 1종의 세포 주기 경로 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 그의 허혈-유도된 상향조절을 약화시키는 데 효과적인 것인 방법.
실시양태 22: 실시양태 21에 있어서, 상기 세포 주기 경로 유전자가 E2F-1 및 p53으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 23: 실시양태 16-22 중 어느 하나에 있어서, 상기 발현이 골격근 세포에서의 발현인 방법.
실시양태 24: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 유효량이 대상체에서 관류 회복을 증진시키는 데 효과적인 것인 방법.
실시양태 25: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 유효량이 대상체에서 허혈에 대한 혈관신생 반응을 증진시키는 데 효과적인 것인 방법.
실시양태 26: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 유효량이 세포 증식을 자극하는 데 효과적인 것인 방법.
실시양태 27: 실시양태 26에 있어서, 세포 증식이 내피 세포 또는 근육 세포의 증식을 포함하는 것인 방법.
실시양태 28: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 유효량이 대상체에서 모세혈관 밀도를 증가시키는 데 효과적인 것인 방법.
실시양태 29: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 유효량이 대상체에서 1종 이상의 세포의 아폽토시스를 억제하는 데 효과적인 것인 방법.
실시양태 30: 실시양태 29에 있어서, 상기 아폽토시스가 저산소증-유도된 아폽토시스인 방법.
실시양태 31: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여가 경구, 협측, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 척수강내, 뇌실내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 경장, 국소, 설하, 질, 안구, 폐, 직장, 흉골내 주사, 신장 투석 주입 및 비경구로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의한 투여인 방법.
실시양태 32: 실시양태 31에 있어서, 상기 투여가 근육내 투여인 방법.
실시양태 33: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
실시양태 34: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 허혈이 혈관 허혈, 근육 허혈, 말초 동맥 질환, 허혈 재관류 손상, 외상과 연관된 허혈 및 뇌 허혈로 이루어진 군으로부터 선택되며, 임의로 여기서 허혈이 말초 동맥 질환인 방법.
실시양태 35: 유효량의 miRNA 발현, 수준 또는 활성의 길항제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하며, 여기서 상기 miRNA는 miR-106b인 제약 조성물.
실시양태 36: 실시양태 35에 있어서, miR-106b가 인간 miR-106b인 제약 조성물.
실시양태 37: 실시양태 36에 있어서, 인간 miR-106b가 서열 UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU (서열식별번호: 1)를 포함하는 인간 miR-106b-5p인 제약 조성물.
실시양태 38: 실시양태 36에 있어서, 인간 miR-106b가 서열 CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC (서열식별번호: 2)를 포함하는 인간 miR-106b-3p인 제약 조성물.
실시양태 39: 실시양태 35-38 중 어느 하나에 있어서, 길항제가 성숙 miR-106b의 한 부분에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이며, 이에 따라 안티센스 올리고뉴클레오티드가 miR-106b에 결합하는 것인 제약 조성물.
실시양태 40: 실시양태 35-39 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 DNA를 포함하는 것인 제약 조성물.
실시양태 41: 실시양태 35-40 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 RNA를 포함하는 것인 제약 조성물.
실시양태 42: 실시양태 35-41 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 miR-106b의 안타고미르인 제약 조성물.
실시양태 43: 실시양태 35-42 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 1종 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 것인 제약 조성물.
실시양태 44: 실시양태 43에 있어서, 1종 이상의 뉴클레오티드 유사체가 LNA를 포함하는 것인 제약 조성물.
실시양태 45: 실시양태 35-44 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 성숙 miR-106b 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있으며, 듀플렉스가 적어도 약 60℃의 Tm을 갖는 것인 제약 조성물.
실시양태 46: 실시양태 35-45 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 또 다른 단일 가닥 RNA 핵산 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있으며, 듀플렉스가 약 60℃ 미만, 약 50℃ 미만, 약 45℃ 미만, 약 40℃ 미만, 약 37℃ 미만, 약 35℃ 미만, 약 30℃ 미만 또는 약 25℃ 미만의 Tm을 갖는 것인 제약 조성물.
실시양태 47: 실시양태 35-46 중 어느 하나에 있어서, 길항제가 miR-106b 발현, 수준 또는 활성을 감소시키는 것인 제약 조성물.
실시양태 48: 실시양태 35-47 중 어느 하나에 있어서, 추가의 치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
실시양태 49: 실시양태 48에 있어서, 상기 추가의 치료제가 항허혈제를 포함하는 것인 제약 조성물.
실시양태 50: 실시양태 35-49 중 어느 하나에 있어서, 길항제가 단리된 핵산 또는 단리된 핵산을 포함하는 벡터에 의해 코딩된 것인 제약 조성물.
실시양태 51: 실시양태 50에 있어서, 상기 벡터가 miRNA 발현 벡터 또는 AAV 발현 벡터로부터 선택된 발현 벡터인 제약 조성물.
실시양태 52: 실시양태 51에 있어서, 상기 발현 벡터가 miRNA 발현 벡터인 제약 조성물.
실시양태 53: 실시양태 50에 있어서, 상기 단리된 핵산이 세포-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 제약 조성물.
실시양태 54: 실시양태 35-53 중 어느 하나에 있어서, 길항제가 지질 비히클 내에 캡슐화된 것인 제약 조성물.
실시양태 55: 실시양태 35-54 중 어느 하나에 있어서, 유효량이 대상체의 내피 또는 근육 세포에서 적어도 1종의 세포 주기 경로 유전자의 발현을 감소시키는 데 효과적인 것인 제약 조성물.
실시양태 56: 실시양태 55에 있어서, 상기 세포 주기 경로 유전자가 E2F-1 및 p53으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
실시양태 57: 실시양태 55 또는 56에 있어서, 상기 발현이 골격근 세포에서의 발현인 제약 조성물.
실시양태 58: 실시양태 35-57 중 어느 하나에 있어서, 유효량이 대상체에서 관류 회복을 증진시키는 데 효과적인 것인 제약 조성물.
실시양태 59: 실시양태 35-58 중 어느 하나에 있어서, 유효량이 대상체에서 허혈에 대한 혈관신생 반응을 증진시키는 데 효과적인 것인 제약 조성물.
실시양태 60: 실시양태 35-59 중 어느 하나에 있어서, 유효량이 세포 증식을 자극하는 데 효과적인 것인 제약 조성물.
실시양태 61: 실시양태 60에 있어서, 세포 증식이 내피 세포 또는 근육 세포의 증식을 포함하는 것인 제약 조성물.
실시양태 62: 실시양태 35-61 중 어느 하나에 있어서, 유효량이 대상체에서 모세혈관 밀도를 증가시키는 데 효과적인 것인 제약 조성물.
실시양태 63: 실시양태 35-62 중 어느 하나에 있어서, 유효량이 대상체에서 1종 이상의 세포의 아폽토시스를 억제하는 데 효과적인 것인 제약 조성물.
실시양태 64: 실시양태 63에 있어서, 상기 아폽토시스가 저산소증-유도된 아폽토시스인 제약 조성물.
실시양태 65: 실시양태 35-64 중 어느 하나에 있어서, 경구, 협측, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 척수강내, 뇌실내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 경장, 국소, 설하, 질, 안구, 폐, 직장, 흉골내 주사, 신장 투석 주입 및 비경구로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의한 투여를 위해 제제화된 제약 조성물.
실시양태 66: 실시양태 65에 있어서, 상기 투여가 근육내 투여인 제약 조성물.
실시양태 67: 실시양태 35-66 중 어느 하나의 제약 조성물 및 골격근 허혈과 연관된 질환, 장애, 손상 또는 상태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 그를 치료 또는 예방하는 데 사용하는 것에 대한 지침서를 포함하며, 여기서 상기 질환, 장애, 손상 또는 상태는 말초 동맥 질환인 키트.
실시양태 68: miR-106b의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-106b 안타고미르인 단리된 핵산.
실시양태 69: 실시양태 68에 있어서, miR-106b가 인간 miR-106b인 단리된 핵산.
실시양태 70: 실시양태 69에 있어서, 인간 miR-106b가 서열 UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU (서열식별번호: 1)를 포함하는 인간 miR-106b-5p인 단리된 핵산.
실시양태 71: 실시양태 69에 있어서, 인간 miR-106b가 서열 CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC (서열식별번호: 2)를 포함하는 인간 miR-106b-3p인 단리된 핵산.
실시양태 72: 실시양태 68-71 중 어느 하나에 있어서, 길항제가 성숙 miR-106b의 한 부분에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이며, 이에 따라 안티센스 올리고뉴클레오티드가 miR-106b에 결합하는 것인 단리된 핵산.
실시양태 73: 실시양태 68-72 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 DNA를 포함하는 것인 단리된 핵산.
실시양태 74: 실시양태 68-73 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 RNA를 포함하는 것인 단리된 핵산.
실시양태 75: 실시양태 68-74 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 1종 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 것인 단리된 핵산.
실시양태 76: 실시양태 75에 있어서, 1종 이상의 뉴클레오티드 유사체가 LNA를 포함하는 것인 단리된 핵산.
실시양태 77: 실시양태 68-76 중 어느 하나에 있어서, 1종 이상의 뉴클레오티드 유사체가 LNA를 포함하는 것인 단리된 핵산.
실시양태 78: 실시양태 68-77 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 또 다른 단일 가닥 RNA 핵산 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있으며, 듀플렉스가 약 60℃ 미만, 약 50℃ 미만, 약 45℃ 미만, 약 40℃ 미만, 약 37℃ 미만, 약 35℃ 미만, 약 30℃ 미만 또는 약 25℃ 미만의 Tm을 갖는 것인 단리된 핵산.
실시양태 79: 실시양태 68-78 중 어느 하나에 있어서, 길항제가 miR-106b 발현, 수준 또는 활성을 감소시키는 것인 단리된 핵산.
SEQUENCE LISTING <110> Merand Pharmaceuticals, Inc. <120> AGENTS, COMPOSITIONS, AND METHODS FOR THE TREATMENT OF HYPOXIA AND ISCHEMIA-RELATED DISORDERS <130> MPH-001WO <150> 63/148,940 <151> 2021-02-12 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-106b-5p (mature sequence) <400> 1 uaaagugcug acagugcaga u 21 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-106b-3p <400> 2 ccgcacugug gguacuugcu gc 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-93-5p (mature sequence) <400> 3 aaagugcugu ucgugcaggu ag 22 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-93-5p (pre-miR-93 sequence) <400> 4 caaagugcug uucgugcagg uag 23 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-93-3p <400> 5 acugcugagc uagcacuucc cg 22 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse complement of hsa-miR-106b-5p <400> 6 aucugcacug 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gggctcccga 2040 gattgcttgc tcggcctgcg atctggtcaa cgtggacctg gatgactgtg tttctgagca 2100 ataaatgact taaaccaggt atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca 2160 acctctctga gggcattcgc gagtggtggg cgctgaaacc tggagccccg aagcccaaag 2220 ccaaccagca aaagcaggac gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg 2280 gacccttcaa cggactcgac aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctcg 2340 agcacgacaa ggcctacgac cagcagctgc aggcgggtga caatccgtac ctgcggtata 2400 accacgccga cgccgagttt caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc 2460 tcgggcgagc agtcttccag gccaagaagc gggttctcga acctctcggt ctggttgagg 2520 aaggcgctaa gacggctcct ggaaagaaga gaccggtaga gccatcaccc cagcgttctc 2580 cagactcctc tacgggcatc ggcaagaaag gccaacagcc cgccagaaaa agactcaatt 2640 ttggtcagac tggcgactca gagtcagttc cagaccctca acctctcgga gaacctccag 2700 cagcgccctc tggtgtggga cctaatacaa tggctgcagg cggtggcgca ccaatggcag 2760 acaataacga aggcgccgac ggagtgggta gttcctcggg aaattggcat tgcgattcca 2820 catggctggg cgacagagtc atcaccacca gcacccgaac ctgggccctg cccacctaca 2880 acaaccacct ctacaagcaa atctccaacg ggacatcggg aggagccacc aacgacaaca 2940 cctacttcgg ctacagcacc ccctgggggt attttgactt taacagattc cactgccact 3000 tttcaccacg tgactggcag cgactcatca acaacaactg gggattccgg cccaagagac 3060 tcagcttcaa gctcttcaac atccaggtca aggaggtcac gcagaatgaa ggcaccaaga 3120 ccatcgccaa taacctcacc agcaccatcc aggtgtttac ggactcggag taccagctgc 3180 cgtacgttct cggctctgcc caccagggct gcctgcctcc gttcccggcg gacgtgttca 3240 tgattcccca gtacggctac ctaacactca acaacggtag tcaggccgtg ggacgctcct 3300 ccttctactg cctggaatac tttccttcgc agatgctgag aaccggcaac aacttccagt 3360 ttacttacac cttcgaggac gtgcctttcc acagcagcta cgcccacagc cagagcttgg 3420 accggctgat gaatcctctg attgaccagt acctgtacta cttgtctcgg actcaaacaa 3480 caggaggcac ggcaaatacg cagactctgg gcttcagcca aggtgggcct aatacaatgg 3540 ccaatcaggc aaagaactgg ctgccaggac cctgttaccg ccaacaacgc gtctcaacga 3600 caaccgggca aaacaacaat agcaactttg cctggactgc tgggaccaaa taccatctga 3660 atggaagaaa ttcattggct aatcctggca tcgctatggc aacacacaaa gacgacgagg 3720 agcgtttttt tcccagtaac gggatcctga tttttggcaa acaaaatgct gccagagaca 3780 atgcggatta cagcgatgtc atgctcacca gcgaggaaga aatcaaaacc actaaccctg 3840 tggctacaga ggaatacggt atcgtggcag ataacttgca gcagcaaaac acggctcctc 3900 aaattggaac tgtcaacagc cagggggcct tacccggtat ggtctggcag aaccgggacg 3960 tgtacctgca gggtcccatc tgggccaaga ttcctcacac ggacggcaac ttccacccgt 4020 ctccgctgat gggcggcttt ggcctgaaac atcctccgcc tcagatcctg atcaagaaca 4080 cgcctgtacc tgcggatcct ccgaccacct tcaaccagtc aaagctgaac tctttcatca 4140 cgcaatacag caccggacag gtcagcgtgg aaattgaatg ggagctgcag aaggaaaaca 4200 gcaagcgctg gaaccccgag atccagtaca cctccaacta ctacaaatct acaagtgtgg 4260 actttgctgt taatacagaa ggcgtgtact ctgaaccccg ccccattggc acccgttacc 4320 tcacccgtaa tctgtaattg cctgttaatc aataaaccgg ttgattcgtt tcagttgaac 4380 tttggtctct gcg 4393 <210> 10 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scrambled sequence <400> 10 aaggcaagcu gacccugaag uu 22

Claims (59)

  1. (a) miR-93 핵산 분자; 및
    (b) miR-106b의 길항제
    를 포함하는 핵산 듀플렉스.
  2. 제1항에 있어서, RNA:RNA 듀플렉스인 핵산 듀플렉스.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, miR-106b의 길항제가 miR-106b의 적어도 한 부분에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드인 핵산 듀플렉스.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (서열식별번호: 3)를 포함하는 miR-93 RNA 또는 서열 CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (서열식별번호: 4)를 포함하는 miR-93 RNA를 포함하는 핵산 듀플렉스.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 듀플렉스가 miR-106b의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 서열 AUCUGCACUGUCAGCACUUUA (서열식별번호: 6)를 포함하는 것인 핵산 듀플렉스.
  6. miR-106b 발현, 수준 또는 활성의 길항제.
  7. 제6항에 있어서, miR-106b의 적어도 한 부분에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드인 길항제.
  8. 제7항에 있어서, miR-106b가 서열 UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU (서열식별번호: 1)를 포함하는 인간 miR-106b-5p인 길항제.
  9. 제7항에 있어서, miR-106b가 서열 CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC (서열식별번호: 2)를 포함하는 인간 miR-106b-3p인 길항제.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, DNA를 포함하는 길항제.
  11. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, RNA를 포함하는 길항제.
  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 안타고미르(antagomir) miR-106b인 길항제.
  13. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 1종 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 것인 길항제.
  14. 제13항에 있어서, 1종 이상의 뉴클레오티드 유사체가 잠금 핵산 (LNA)을 포함하는 것인 길항제.
  15. 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 성숙 miR-106b 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있으며, 듀플렉스가 적어도 약 60℃의 용융 온도 (Tm)를 갖는 것인 길항제.
  16. 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 또 다른 단일 가닥 RNA 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있는 것인 길항제.
  17. 제16항에 있어서, 다른 단일 가닥 RNA 분자가 miR-93 RNA 분자인 길항제.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드와 다른 단일 가닥 RNA 분자의 듀플렉스가 약 65℃ 미만, 약 60℃ 미만, 약 55℃ 미만, 약 50℃ 미만, 약 45℃ 미만, 약 40℃ 미만, 약 37℃ 미만, 약 35℃ 미만, 약 30℃ 미만 또는 약 25℃ 미만의 Tm을 갖는 것인 길항제.
  19. 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 길항제가 miR-106b의 적어도 한 부분에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드이고;
    b. 안티센스 올리고뉴클레오티드가 성숙 miR-106b 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있고;
    c. 안티센스 올리고뉴클레오티드가 또 다른 단일 가닥 RNA 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있고;
    d. 안티센스 올리고뉴클레오티드와 성숙 miR-106b 분자에 의해 형성된 듀플렉스의 Tm이 안티센스 올리고뉴클레오티드와 다른 단일 가닥 RNA 분자에 의해 형성된 듀플렉스의 Tm보다 더 큰 것인
    길항제.
  20. 제19항에 있어서, 다른 단일 가닥 RNA 분자가 miR-93 RNA 분자인 길항제.
  21. 제20항에 있어서, miR-93 RNA 분자가 서열 AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (서열식별번호: 3) 또는 서열 CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG (서열식별번호: 4)를 포함하는 것인 길항제.
  22. 제6항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 핵산 또는 단리된 핵산을 포함하는 벡터에 의해 코딩된 길항제.
  23. 제22항에 있어서, 상기 벡터가 miRNA 발현 벡터 또는 AAV 발현 벡터로부터 선택된 발현 벡터인 길항제.
  24. 제23항에 있어서, 상기 발현 벡터가 miRNA 발현 벡터인 길항제.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 핵산이 세포-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 길항제.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 비히클 내에 캡슐화된 길항제 또는 핵산 듀플렉스.
  27. (a) 유효량의 제1항 내지 제5항 및 제26항 중 어느 한 항의 핵산 듀플렉스 또는 제6항 내지 제26항 중 어느 한 항의 길항제; 및 (b) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 추가의 치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 추가의 치료제가 항허혈제를 포함하는 것인 제약 조성물.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량이 제약 조성물을 투여받는 대상체의 내피 또는 근육 세포에서 적어도 1종의 세포 주기 경로 유전자의 발현을 감소시키는 데 효과적인 것인 제약 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 세포 주기 경로 유전자가 E2F-1 및 p53으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 발현이 골격근 세포에서의 발현인 제약 조성물.
  33. 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량이 제약 조성물을 투여받는 대상체에서 관류 회복을 증진시키는 데 효과적인 것인 제약 조성물.
  34. 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량이 제약 조성물을 투여받는 대상체에서 허혈에 대한 혈관신생 반응을 증진시키는 데 효과적인 것인 제약 조성물.
  35. 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량이 세포 증식을 자극하는 데 효과적인 것인 제약 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 세포 증식이 내피 세포 또는 근육 세포의 증식을 포함하는 것인 제약 조성물.
  37. 제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량이 제약 조성물을 투여받는 대상체에서 모세혈관 밀도를 증가시키는 데 효과적인 것인 제약 조성물.
  38. 제27항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량이 제약 조성물을 투여받는 대상체에서 1종 이상의 세포의 아폽토시스를 억제하는 데 효과적인 것인 제약 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 아폽토시스가 저산소증-유도된 아폽토시스인 제약 조성물.
  40. 제27항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 경구, 협측, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 척수강내, 뇌실내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 경장, 국소, 설하, 질, 안구, 폐, 직장, 흉골내 주사, 신장 투석 주입 및 비경구로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의한 투여를 위해 제제화된 제약 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 상기 투여가 근육내 투여인 제약 조성물.
  42. 허혈과 연관된 질환, 장애, 손상 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 그를 필요로 하는 대상체에게 제27항 내지 제41항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 대상체에게 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 추가의 치료제가 항허혈제를 포함하는 것인 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량이 대상체의 내피 또는 근육 세포에서 적어도 1종의 세포 주기 경로 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 그의 허혈-유도된 상향조절을 약화시키는 데 효과적인 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 세포 주기 경로 유전자가 E2F-1 및 p53으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현이 골격근 세포에서의 발현인 방법.
  48. 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량이 대상체에서 관류 회복을 증진시키는 데 효과적인 것인 방법.
  49. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량이 대상체에서 허혈에 대한 혈관신생 반응을 증진시키는 데 효과적인 것인 방법.
  50. 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량이 세포 증식을 자극하는 데 효과적인 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 세포 증식이 내피 세포 또는 근육 세포의 증식을 포함하는 것인 방법.
  52. 제42항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량이 대상체에서 모세혈관 밀도를 증가시키는 데 효과적인 것인 방법.
  53. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량이 대상체에서 1종 이상의 세포의 아폽토시스를 억제하는 데 효과적인 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 아폽토시스가 저산소증-유도된 아폽토시스인 방법.
  55. 제42항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 경구, 협측, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 척수강내, 뇌실내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 경장, 국소, 설하, 질, 안구, 폐, 직장, 흉골내 주사, 신장 투석 주입 및 비경구로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의한 투여인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 투여가 근육내 투여인 방법.
  57. 제42항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
  58. 제42항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 허혈이 혈관 허혈, 근육 허혈, 말초 동맥 질환, 허혈 재관류 손상, 외상과 연관된 허혈 및 뇌 허혈로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 허혈이 말초 동맥 질환인 방법.
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