CN105543394A - miR-106b-5p及其检测引物和其反义核苷酸序列在诊断、治疗缺血性脑卒中领域中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了miR-106b-5p及其检测引物和其反义核苷酸序列在诊断、治疗缺血性脑卒中领域中的应用，属于微小核糖核酸的应用领域。miR-106b-5p的检测引物中逆转录引物的序列为：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATCTGCAC-3’。miR-106b-5p的反义核苷酸的序列为5’-AUCUGCACUGUCAGCACUUUA-3’，miR-106b-5p及其检测引物和反义核苷酸与急性缺血性脑卒中具有相关性，使其可以成为急性缺血性脑卒中临床检测的辅助指标，为该疾病的防治提供了靶点。本发明具有治疗效果好，操作简便、无毒副作用等优点。

Description

miR-106b-5p及其检测引物和其反义核苷酸序列在诊断、治疗缺血性脑卒中领域中的应用

技术领域

本发明属于微小核糖核酸的应用领域，更具体地说，涉及miR-106b-5p的检测引物和反义核苷酸序列在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。

背景技术

脑卒中(stroke)属于中医的“中风”范畴，是好发于中老年人的一种常见病、多发病、难治病，其病残率、病死率、复发率仍居高不下。据2013年报道，脑卒中已经成为中国人死亡的主要原因。脑卒中最常见的类型是缺血性脑卒中。目前，缺血性脑卒中的诊断主要依赖接诊医生的临床观察和影像学证据。在缺血性脑卒中的早期，临床表现并不总是很典型，计算机断层扫描的影像变化并不显著，磁共振成像虽然可以发现轻度缺血性脑卒中，但是一些急性期患者躁动不安不能立即进行检查。鉴于目前诊断方法的单一以及早期发现与预后判断的困难，我们亟待找到一种比目前现有方法更简单可靠的新方法来鉴定疾病的发生以及判断病理阶段。尽管已有一些标志物应用于基础研究，如S-100A蛋白、神经元特异性烯醇化酶、降钙素基因相关肽、超敏C反应蛋白和转化生长因子β1等，但对缺血性脑卒中诊断的敏感性及特异性都未尽如人意，因此尚不能推荐任何指标进行常规的临床检测。可以说，找到一种简便、快速、灵敏、特异性高的检测标志物已经成为目前临床诊断该类疾病的重中之重。

微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)是一种短(19-25nt)的非编码的内源性RNA，参与多种生物学功能。miRNAs表达异常与癌症、神经退行性疾病、心血管疾病以及感染性疾病等的发生密切相关。随着人们认识的深入，miRNAs在临床中的应用越来越广泛。miRNAs在脑组织中表达存在着时间特异性，可用作临床诊断脑缺血后脑损伤和预后的非常有前景的生物标记物。研究表明，miRNAs在血清和血浆中也有稳定的表达。有学者报道外周血中的miRNAs可作为肿瘤及其他疾病诊断的一种新的标志物。缺血性脑卒中患者外周血miRNAs升高的原因可能是脑缺血坏死组织表达的miRNAs以一定的方式释放入外周血中。因此，选取缺血性脑卒中患者血清中的miRNAs作为研究对象，通过检测血清miRNA能够解决具体问题。检测血清miRNAs有以下几个优势：首先，血清较易获得，甚至在平常体检的时候即可收集到；其次，血清miRNAs反映的是整个机体的生理病理情况，其检测结果具有指导意义；第三，血清中某些特定的miRNAs可以提示脑组织的病变，可作为疾病诊断的一个指标。总之，检测血清miRNAs，简单易行且效果显著，从血清miRNAs的特异性变化这一角度发现脑卒中并且区分类型，将建立一种更敏感、更精确的、早期确诊脑卒中的全新技术。

与传统生物标志物相比，血清miRNAs标志物具有稳定、易于检测且定量精确等优点，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性。尽管如此，由于miRNAs种类繁多，迄今为止，经发现命名的miRNAs多达3100个，难以找到特异的miRNAs，并且血清中的miRNA表达丰度普遍较低。目前，国内外较少有关于检测血清特异性miRNAs用于缺血性脑卒中临床诊断的报道。miR-106b位于染色体7q22.1，21nt长。有报道称miR-106b可参与人类淋巴瘤、前列腺癌、结直肠癌、胃癌的发生和进展。迄今为止，人们发现miR-106b-5p可作为癫痫、胃癌等的检测标志物(WangJ,YuJT,TanL,etal.Genome-widecirculatingmicroRNAexpressionprofilingindicatesbiomarkersforepilepsy[J].SciRep,2015,5:9522；ShiotaniA,MuraoT,KimuraY,etal.IdentificationofserummiRNAsasnovelnon-invasivebiomarkersfordetectionofhighriskforearlygastriccancer[J].BritJCancer,2013,109(9):2323-2330)；然而，还没有将miR-106b-5p用于急性缺血性脑卒中标志物的报道。

当前针对缺血性脑卒中治疗的研究主要是从神经保护、抗凝、溶栓、增加血流量及降血压等角度进行。脑卒中临床治疗的一线药物是溶栓药，但溶栓疗法具有治疗时间窗小、再灌注损伤严重等一系列不足，且其不断被报道存在破坏血脑脊液屏障、增加出血风险、加剧兴奋性神经毒性等严重不良反应。miRNA是基因表达和蛋白翻译过程中的调节分子，在脑卒中的发生发展过程中起到调控的枢纽作用。

发明内容

1.要解决的问题

针对现有的脑卒中治疗方法存在治疗时间窗小、破坏血脑脊液屏障等不足之处，本发明提供了miR-106b-5p的检测引物和反义核苷酸序列在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用；本发明发现了miR-106b-5p的新医药用途，即作为急性缺血性脑卒中的辅助检测指标，或者针对miR-106b-5p设计干扰片段，直接用于急性缺血性脑卒中的防治。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

miR-106b-5p在制备诊断缺血性脑卒中的试剂盒中的应用。

miR-106b-5p在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。

优选地，包括检测miR-106b-5p的检测引物序列，检测引物序列包括逆转录引物的序列、上游引物序列和下游引物序列；其中，

逆转录引物的序列为：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATCTGCAC-3’，上游引物序列为：5’-ACACTCCAGCTGGGTAAAGTGCTGACAGT-3’，Taqman荧光探针序列为：5’-ATCTCAACTGA-3’，下游引物序列为：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。

上述的miR-106b-5p的检测引物序列在制备诊断急性缺血性脑卒中的试剂盒中的应用。

miR-106b-5p的反义核苷酸序列在制备治疗急性缺血性脑卒中药物中的应用。

优选地，miR-106b-5p的反义核苷酸序列为5’-AUCUGCACUGUCAGCACUUUA-3’。

原理：在采用miRNAs芯片技术探究急性缺血性脑卒中患者血清miRNAs表达谱时，首次意外发现miR-106b-5p在缺血性脑卒中患者外周血清中表达相对升高，由此发明人联想到miR-106b-5p在缺血性脑卒中患者血清中具体地绝对表达量，是否成为一种新颖而有效诊断急性缺血性脑卒中的标志物，经过实验发现miR-106b-5p与急性缺血性脑卒中具有相关性，使其可以成为急性缺血性脑卒中临床检测的辅助指标，为该疾病的防治提供了靶点。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明首次证明miR-106b-5p与急性缺血性脑卒中的相关性，使其可以成为急性缺血性脑卒中临床检测的辅助指标，为该疾病的诊断提供了靶点；

(2)本发明分析了大量急性缺血性脑卒中病人与正常人血清中miR-106b-5p的表达水平，诊断灵敏性和特异性较好，miR-106b-5p的检测引物序列可用于制备诊断急性缺血性脑卒中的试剂盒；

(3)本发明首次证明针对miR-106b-5p设计的反义核苷酸序列可有效降低脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑梗死面积，改善神经功能评分，有制备治疗急性缺血性脑卒中药物的应用价值；

(4)miR-106b-5p作为脑卒中生物治疗的靶分子比编码基因作为靶分子更加有效，miR-106b-5p干预可以治疗脑卒中，miR-106b-5p可以作为急性缺血性脑卒中的检测指标，也可作为治疗靶标。

附图说明

图1为本发明采用磁珠法分离外周血miRNAs的操作过程示意图；

图2为本发明中miR-106b-5p在急性缺血性脑卒中和健康对照血清中的含量图，采用实时荧光定量PCR分析IS(缺血性脑卒中)组(53例)和NC(健康对照)组(50例)血清miR-106b-5p含量，***P<0.001；

图3为本发明中miR-106b-5p对缺血性脑卒中患者的诊断效能，其中，图(A)为血清miR-106b-5p诊断急性IS患者的ROC曲线分析；图(B)为miR-106b-5p诊断急性IS患者的敏感性和特异性；

图4为本发明中antagomirmiR-106b-5p对急性脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能评分的影响(n＝6)*P<0.05；

图5为本发明中antagomirmiR-106b-5p对急性脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死面积(TTC代表图)的影响；

图6为本发明中antagomirmiR-106b-5p对急性脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死面积(核磁共振分析代表图)的影响；

图7为本发明中统计学分析antagomirmiR-106b-5p对急性脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死面积的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1

miR-106b-5p在急性缺血性脑卒中的诊断价值

第一步：急性缺血性脑卒中外周血miRNAs的初步分离：

1.急性IS初发患者组：所有患者诊断符合1996年全国第四届脑血管病学术会议修订的急性脑卒中诊断标准，并同时经头颅CT或MRI检查证实，且发病时间不超过24小时。排除标准：合并有意识障碍或精神症状；严重的心、肝、肾、肺功能不全；有外伤史、手术史；肿瘤病史。发病24小时内对患者进行空腹血糖、血常规、尿常规、生化全项、糖化血红蛋白、凝血六项、C反应蛋白检测。另选健康体检者(negativecontrol，NC)作为正常对照组。在采集样本前均获得患者的知情同意，获伦理委员会批准。

2.标本采集及处理：采集所有入选者外周血标本3mL，在室温静置30分钟后取1.0mL上清液，4℃、500g离心10分钟；取上清液后4℃、16000g离心10分钟，取上清液到新的离心管中。

3.血清总RNA提取：血清中总RNA包括miRNA的提取利用磁珠法(上海灏秦生物有限公司)富集，按照试剂盒说明书进行提取(图1)。向100μL血清样本中加入10μL10nM人工合成线虫39miRNA(cel-lin-39)作为外参，用于标准化提取、反转录及控制后续的定量检测全过程操作的样本间差异。具体步骤如下：在500μL离心管中放置40μL振荡混匀后的纳米磁珠，置于磁力架上数秒待液体澄清后移除液体。加入100μL结合缓冲液振荡混匀，置于磁力架上数秒待液体澄清后移除液体。加入100μL血清，外加10μLcel-lin-39，再加入100μL的结合缓冲液。振荡混匀磁珠后静置不少于10分钟。将离心管置于磁力架上10秒，待磁珠吸附分离后移除液体。加入100μL洗涤缓冲液，振荡混匀，低速离心，收集挂壁液滴。无需静置，直接将离心管置于磁力架上10秒，待磁珠吸附分离后移除液体，重复洗涤一次。加入30μL洗脱缓冲液I，振荡混匀，低速离心收集挂壁液滴。再将离心管置于磁力架上10秒，待磁珠吸附分离后收集液体置新的离心管中加入10μL洗脱缓冲液II。所收集溶液用于后续实验。利用EppendorfBiophotometerplus核酸蛋白测定仪(德国Eppendorf公司)测定RNA浓度和纯度。要求总RNA溶液的A260/A280在1.8～2.0范围之内。利用1％变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA提取的质量。获得的RNA溶液于-80℃保存备用。

第二步：血清miR-106b-5p的定量检测：

1.成熟miR-106b-5p的逆转录反应：应用PrimeScriptTMRTreagentKit(PerfectRealTime)反转录试剂盒(大连TaKaRa公司)，加样在超净工作台中进行。20μL反应体系如下：5XPrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，miR-106b-5p特异性逆转录引物1μL(SEQIDNO：1，上海生工)，totalRNA1μg，RNaseFreeddH₂O补足至20μL。逆转录反应使用ABIveriti96孔热循环仪(美国ABI公司)，按仪器使用说明操作。循环程序设置如下：16℃30分钟；42℃30分钟；85℃5分钟。

2.成熟miR-106b-5p的实时定量PCR(Q-PCR)检测：采用定量PCR基因检测分析试剂盒试剂进行定量PCR检测(上海灏秦生物有限公司)。20μL反应体系如下：荧光定量探针法反应预混液2XProbeMixture10μL，模板cDNA1μL，20×miR-106b-5p探针和上下游引物预混液1μL，RNaseFreeddH₂O补足至20μL。miR-106b-5p的上游引物序列为(SEQIDNO：2)：5’-ACACTCCAGCTGGGTAAAGTGCTGACAGT-3’，下游引物序列为(SEQIDNO：4)：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’，Taqman荧光探针序列为(SEQIDNO：3)：5’-ATCTCAACTGA-3’，实时定量PCR反应在扩增区操作，将各管置ABI7500荧光定量扩增仪(美国ABI公司)中，按仪器使用说明操作。循环程序设置如下：95℃10分钟；95℃15秒，60℃1分钟45个循环，所有反应重复三次。

3.成熟miR-106b-5p结果分析：采用SDSsoftwareversion2.0软件处理。分析条件设置：根据分析后图像调节Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值，在analysis菜单下选择analyze自动分析结果。人工合成单链miR-106b-5p标准品由上海GenePharm公司提供，经十倍梯度稀释，浓度分别为10fmol/L，10²fmol/L，1pmol/L，10pmol/L，10²pmol/L，10³pmol/L，根据浓度对数数值与Ct值制作标准曲线，计算血清miR-106b-5p的绝对含量(图2)。

第三步：血清miR-106b-5p对IS患者诊断的敏感性和特异性：

通过绘制受试者操作特征工作曲线(ROC)分析血清miR-106b-5p绝对表达量在缺血性脑卒中诊断中的敏感性和特异性。结果发现，miR-106b-5p曲线下面积ROC为0.7773。当临界值为40fmol/L，miR-106b-5p诊断缺血性脑卒中的敏感性和特异性分别为79.25％和64.71％。血清miR-106b-5p表达水平的检测灵敏度≥10fmol/L，线性范围为10fmol/L～1×10³pmol/L(图3)。这些结果提示采用实时荧光定量PCR检测血清miR-106b-5p的绝对表达量，作为缺血性脑卒中的生物标志物的检测有一定的准确性和可行性。这为高效准确诊断急性IS提供了一定的指导意义。

实施例2

miR-106b-5p的反义核苷酸antagomirmiR-106b-5p对局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护效应：

1.实验动物分组及处理：SPF级(指无特定病原体级实验动物)8-10周龄雄性SD大鼠(北京维通利华公司提供)，体重(280-330g)。实验分组：总计4组，每组6只，总计需要大鼠24只。(1)假手术组：仅分离血管和神经，不插入线栓。(2)MCAO模型未治疗组：大鼠建模成功后，不给予任何干预。(3)antagomirmiR-106b-5p治疗组：在再灌注开始前尾静脉注射antagomirmiR-106b-5p50nmol/kg。antagomirmiR-106b-5p序列为(SEQIDNO：5)：5’-AUCUGCACUGUCAGCACUUUA-3’，此处为miR-106b-5p反义核苷酸序列，即该核苷酸序列注入大鼠体内，可干扰miR-106b-5p表达，从而降低大鼠体内miR-106b-5p表达水平。(4)antagomir阴性对照组：在再灌注开始前尾静脉注射antagomircontrol50nmol/kg。antagomircontrol序列为(SEQIDNO：6)：5’-GCGAGGAGUAGACCGUUAUGACA-3’，此处为无义对照序列，即该核苷酸序列注入大鼠体内，并不影响任何一种miRNA的表达。

2.大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型(MCAO)制作：在国际流行Longa线栓法(1989年)基础上经改良的脑缺血再灌注模型：SD大鼠用10％水合氯醛(0.35mL/100g体重i.p)麻醉，仰卧固定。颈部正中切开皮肤，钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，仔细分离避免损伤迷走神经。由颈外动脉远心端结扎颈外动脉，用微型动脉夹夹住颈总动脉近心端及颈内动脉，在靠近颈总动脉分叉处用眼科剪在颈外动脉上剪一小口，将直径0.26～0.28mm钓鱼线用线香烧成小球的一端沿小切口插入颈外动脉，剪断颈外动脉远心端，将颈外动脉反向拉直，使其与颈内动脉处于同一直线上，移去颈内动脉的动脉夹，经颈总动脉分叉处将鱼线缓慢向颈内动脉入颅脑内的方向推进约18±0.5mm，微遇阻力时停止，使鱼线头端到达较细的大脑中动脉起始处。缚紧预先放置于穿刺小切口处的丝线，缝合，消毒，于缺血2小时后拔出栓线，建立脑缺血再灌注模型。假手术组大鼠只分离暴露颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉。所有大鼠在术前禁食12小时，自由饮水。

3.神经功能评分：根据ZeaLonga五分评分标准(1989年)，对各组大鼠进行死亡率以及神经功能评分统计：0分，正常，无神经学征象；1分，出现Honer征；2分，拎起大鼠尾巴时大鼠左前肢不能伸展；3分，一侧肢体不完全瘫痪，大鼠向左侧转圈；4分，一侧肢体完全瘫痪，大鼠向左侧倾倒；5分，死亡。其中神经功能评分≥2分，纳入实验组，评分为1分或是5分者，则剔除。如图4，与MCAO组相比较，AntagomirmiR-106b-5p治疗组神经功能评分小于MCAO组(P<0.05)。但Antagomircontrol治疗组神经评分并无明显变化。

4.TTC染色法测定脑梗死面积：术后24小时，将大鼠断头、取脑，去除嗅球、小脑及低位脑干后，置于-20℃冰箱，冷冻10分钟后做厚度为2mm的均匀脑冠状切片。将切好的脑片置于质量浓度为0.2gL^-1的TTC染色液中，37℃避光孵育30分钟，并每隔10分钟翻动一次。放人4gL^-1多聚甲醛溶液中避光保存24小时。肉眼观察脑组织缺血程度，正常脑组织区呈红色，缺血脑组织区呈白色。用数码相机拍照，采用ImageJ图像分析系统软件计算脑组织缺血面积比值并进行分析。图5结果表明，MCAO组梗死区范围较广，而AntagomirmiR-106b-5p治疗组梗死区域相比MCAO组显著减少。

5.磁共振成像分析脑梗死情况：采用Bruker公司7.0T(PharmaScan)磁共振成像系统(孔径为16cm，最大梯度强度为300mT/m)和大鼠头部线圈，应用ParaVision4.0软件对图像行后处理。所有动物均采用腹卧位，使大鼠头部置于线圈中央并固定，期间自主呼吸，以基底节层面为中心行冠状位扫描。扫描序列为：自旋回波T1加权像成像，快速自旋回波T2加权像成像、单次激发EPI扩散加权成像序列和flash-3D序列血管成像。Tl加权像(T1weightimaging，TIWI)采用的扫描参数TR/TE1300ms/7.5ms，层厚1.0mm，层间距1.2mm，FOV4.0cm，翻转角180℃，矩阵256×256，带宽为83333.3Hz，回波间隔为7.5ms；T2加权像(T2weightimaging，T2WI)采用的扫描参数TR/TE4200ms/36ms，带宽为35714.3Hz，回波间隔为12.0ms，其余诸参数同TlWI：弥散成像(diffusionweightedimaging，DWI)采用的扫描参数TR/TE3000ms/32ms，翻转角90°。矩阵128×128，带宽为1250000Hz，回波间隔为0.5ms：磁共振血管成像(magneticresonanceangiography，MRA)采用的扫描参数参照T1WI。扫描完毕后利用ParaVision4.0影像重建软件对原始数据进行处理，统一以基底节层面为兴趣区层面，测量不同处理组栓塞侧DWI和T2WI图像上异常信号面积和T2值。梗死面积在T2序列上计算，异常高信号区为脑梗死灶(主要集中在大脑皮层和基底节区)。如图6，可以看出，脑区(大脑皮层和基底节区)出现T2WI图像的高信号区即为梗死灶区。图7结果表明，与MCAO组相比，AntagomirmiR-106b-5p治疗组脑梗死面积明显减少(P<0.05)。而且，与Antagomircontrol治疗组相比，AntagomirmiR-106b-5p治疗组可显著减少脑梗死面积(P<0.01)。然而，Antagomircontrol治疗组与MCAO组相比，无统计学意义。

根据这些实施例，本发明证明了miR-106b-5p与急性缺血性脑卒中的密切关系，在急性缺血性脑卒中患者血清中，能够检测到高水平的miR-106b-5p的表达，这揭示了其可以作为急性缺血性脑卒中的一个辅助的检测指标。本发明通过动物实验，证明了在注射antagomirmiR-106b-5p片段人为降低miR-106b-5p的表达之后，可以明显降低急性缺血性再灌注损伤脑梗死面积，改善神经功能评分。这也使得miR-106b-5p成为了急性缺血性脑卒中预防及治疗的一个靶点，可以治疗急性缺血性脑卒中。

Claims (5)

1.miR-106b-5p在制备诊断缺血性脑卒中的试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的miR-106b-5p在制备诊断缺血性脑卒中的试剂盒中的应用，其特征在于：包括检测miR-106b-5p的检测引物序列，检测引物序列包括逆转录引物的序列、上游引物序列、Taqman荧光探针序列和下游引物序列；其中，

逆转录引物的序列为：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATCTGCAC-3’，上游引物序列为：5’-ACACTCCAGCTGGGTAAAGTGCTGACAGT-3’，Taqman荧光探针序列为：5’-ATCTCAACTGA-3’，下游引物序列为:5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。

3.权利要求2中所述的miR-106b-5p的检测引物序列在制备诊断急性缺血性脑卒中的试剂盒中的应用。

4.miR-106b-5p的反义核苷酸序列在制备治疗急性缺血性脑卒中药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的miR-106b-5p的反义核苷酸序列在制备治疗急性缺血性脑卒中药物中的应用，其特征在于：miR-106b-5p的反义核苷酸序列为5’-AUCUGCACUGUCAGCACUUUA-3’。