CN108531474A - 富集捕获粪便中低丰度目标核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种富集捕获粪便中低丰度目标核酸的方法，属于生物技术领域。首先采用传统的柱式离心管吸附提取法获得粪便样品人基因组DNA，然后设计特异性探针对粪便中的目标基因片段进行扩增；探针的5’端上标记有生物素，能与磁珠上的亲和素进行结合；最后在磁力环境下进行洗脱，从而将目标片段富集捕获下来。本发明采用目标基因片段PCR扩增和靶向捕获相结合的办法，能显著提高粪便中低丰度目标片段的得率和产量，从而有效减少因目标片段提取效率低而引起的检测结果假阴性，特别适用于通过检测粪便DNA开展结直肠癌无创早期诊断和靶向治疗肿瘤基因状态监测等。

Description

富集捕获粪便中低丰度目标核酸的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种富集捕获粪便中低丰度目标核酸的方法。
背景技术
美国2016年结直肠癌指南将粪便DNA检测列为肠癌筛查的7种办法之一，与常规结肠镜检查和大便隐血实验相比，粪便DNA检测具有特异性好、灵敏度高和易于被患者接受等优势，有着广阔的应用前景。此外，近年来的研究发现，部分RAS野生型肠癌患者在抗KEGF单抗治疗过程中会出现耐药突变，导致治疗失败。因此，专家建议对行抗KEGF单抗治疗的患者，应持续监测肿瘤基因状态。传统的肿瘤组织基因检测是一种侵入性、有创性的检查，且不便于根据患者的病情需求进行实时的肿瘤基因状态监测。而粪便DNA检测为此提供了一条无创、便捷的的肿瘤基因监测途径，将为精准治疗的开展提供巨大帮助。
采用高效的提取方法，从粪便中获得大量且高质量的人基因组DNA，是通过检测粪便DNA开展结直肠癌无创早期诊断和靶向治疗肿瘤基因状态监测等临床应用的关键。但粪便中目标基因(如肿瘤细胞来源的DNA)量所占的比例极少，且由于粪便中含有大量消化残留物和微生物，DNA非常容易被降解。酚抽提/沉淀法、柱式离心管吸附提取法等传统核酸提取方法往往难以富集到足量的目标基因来用于下游检测，进而造成检测结果的假阴性。
中国专利CN106967712A公开了一种粪便DNA快速提取试剂盒，其原理主要为：首先将粪便样品中的核酸裂解释放出来，再让释放出来的核酸特异性地结合到绑定了特异性探针的磁珠上，最后将核酸从磁珠上洗脱下来。该试剂盒提取的核酸比传统的核酸提取方法具有更高的纯度，但仍有不足之处：当粪便中目标基因片段量极少时，用该方法捕获到的目标片段量可能仍低于下游检测方法的检测下限。因此，有必要提出一种新的富集捕获粪便中低丰度目标核酸的方法，从而可以建立一种通过快速、准确检测粪便DNA开展肠癌无创早期诊断和指导临床靶向用药等的流程方案。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明提供了一种富集捕获粪便中低丰度目标核酸的方法，具体地，包括以下操作步骤：
1.粪便样品收集及预处理：采用新型粪便采集处理器发明专利(在先中国专利申请号：201711119197.0)中所述装置及方法，对粪便样品进行收集及预处理。
2.基因组DNA抽提：对所述步骤1中的粪便样品的人基因组DNA进行抽提。优选采用柱式离心管吸附提取法。
3.设计和制备探针：根据目标基因突变位点所在区段设计探针，同时选择目标基因相对保守的区段作为样品外参，外参对目标基因量起着质控的作用。在探针的5’端上标记生物素。
4.扩增目标基因片段：以所述步骤2中获得的粪便样品DNA作为模板，用所述步骤3中设计的探针，对目标基因片段进行PCR扩增，以提高后续目标片段捕获量。优选采用多重PCR，可一次性同时扩增多个目标基因片段。根据模板量设置PCR反应循环数，优选1～10个循环。
5.捕获目标基因片段：所述步骤4中的目标基因片段PCR扩增产物的5’端上标记有生物素，能与磁珠上共价耦合的亲和素进行特异性结合。在磁力环境下进行洗脱，目标基因片段由于与磁珠绑定得以保留，非目标基因片段和其他杂质(如蛋白)则被去除。
6.荧光定量PCR检测：通过荧光定量PCR对所述步骤5中捕获的目标基因片段进行检测。优选采用竞争性等位基因特异性PCR。
所述步骤3中的探针特征：包括正义链探针和反义链探针，长度为15～30个碱基，G+C含量为40％～60％，Tm值为55℃～80℃；探针的5’端上标记有生物素，生物素可连接C6或TEG间臂，从而为生物素与磁珠上的亲和素结合提供更大的空间；探针与目标基因片段序列进行特异性结合但不覆盖突变位点，这样可同时扩增野生型和突变型序列；探针与目标片段结合位置距离突变位点100～400个碱基；扩增的目标片段长度为200～800个碱基对。
所述步骤3在进行探针设计时，通过软件分析和预试验结果分析的方法保证探针特异性。软件分析是指采用Blast、AutoDimer等软件对设计的探针序列及靶序列进行分析，去除包含重复序列的探针；预试验结果分析是指根据捕获的基因片段的测序结果，剔除会扩增非目标片段的探针。
本发明的优点主要在于：本发明是采用目标基因片段PCR扩增和靶向捕获相结合的办法，能显著提高粪便中低丰度目标片段的得率和产量，从而有效减少因目标片段提取效率低而引起的检测结果假阴性，特别适用于通过检测粪便DNA开展结直肠癌无创早期诊断和靶向治疗肿瘤基因状态监测等。
附图说明
图1为本发明技术方案的流程图。
图2为本发明富集捕获目标基因片段的原理图。
图3为4号和9号患者粪便样品目标基因片段荧光定量PCR扩增曲线图，其中，A：荧光定量PCR显示4号患者粪便样品KRAS G12S突变检测阳性；B：荧光定量PCR显示9号患者粪便样品KRAS G12S突变检测阴性。
图4为4号患者粪便样品目标基因片段荧光定量PCR产物的Sanger测序结果。
附图标记说明
1-目标基因突变位点；2-目标基因片段；3-生物素；4-探针；5-dNTP；6-DNA聚合酶；7-目标基因片段扩增产物-磁珠复合物；8-亲和素；9-磁珠；10-检测样品为KRAS G12S突变阳性质控品；11-检测样品为采用本发明所述方法从粪便中富集捕获到的目标基因片段；12-检测样品为采用柱式离心管吸附提取法从粪便中获得的人基因组DNA；13-KRAS c.34G>A p.G12S。
具体实施方式
以下通过具体实施案例对本发明进行详细阐述。本实施案例是示例性，旨在解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制。本实施案例中未注明具体技术或条件者，均可按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。本实施案例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
按照图1的技术方案流程图进行，具体如下：
1.粪便样品收集及预处理
采用新型粪便采集处理器发明专利(专利号：201711119197.0)中所述装置及方法，对10例临床病理确诊的结直肠癌患者的粪便样品进行收集及预处理。该10例患者已行肿瘤组织样本基因检测(Sanger测序法)，明确突变类型。
2.基因组DNA抽提
2.1对所述步骤1中的粪便样品的人基因组DNA进行抽提。优选采用柱式离心管吸附提取法。本实施案例采用的是innuPREP Stool DNA Kit试剂盒(Analytikjena，货号：845-KS-7000050)，按照产品说明书进行操作。
2.2采用NanoDrop(Thermo Fisher，货号：ND-2000)和dsDNA HSAssay Kit(Thermo Fisher，货号：Q32854)检测粪便样品DNA的质量和浓度，按照产品说明书进行操作。
3.设计和制备探针
3.1根据目标基因突变位点所在区段设计探针，同时选择目标基因相对保守的区段作为样品外参，外参对目标基因量起着质控的作用。采用Primer 5.0软件进行探针设计。探针特征：包括正义链探针和反义链探针，长度为15～30个碱基，G+C含量为40％～60％，Tm值为55℃～80℃；探针的5’端上标记有生物素，生物素可连接C6或TEG间臂，从而为生物素与磁珠上的亲和素结合提供更大的空间；探针与目标基因片段序列进行特异性结合但不覆盖突变位点，这样可同时扩增野生型和突变型序列；探针与目标片段结合位置距离突变位点100～400个碱基；扩增的目标片段长度为200～800个碱基对。通过软件分析和预试验结果分析的方法保证探针特异性。软件分析是指采用Blast、AutoDimer等软件对设计的探针序列及靶序列进行分析，去除包含重复序列的探针；预试验结果分析是指根据捕获的基因片段的测序结果，剔除会扩增非目标片段的探针。本实施案例是对KRAS G12S突变进行富集检测。
针对KRAS突变位点所在区段序列设计的探针为：
F：5’-Biotin-TEG-TGTCTTTTAGGTCCAGATAGG-3’
R：5’-Biotin-TEG-GGAGTATTTGATAGTGT-3’
针对KRAS外参序列设计的探针为：
F：5’-Biotin-TEG-TTCCATAACTTCTTGC-3’
R：5’-Biotin-TEG-ATGCTTTAATTCAGGT-3’
3.2采用DNA合成仪合成探针，并在探针的5’端上标记生物素-TEG，使其能与磁珠上的亲和素结合，以用于后续磁力环境下捕获目标基因片段。
4.扩增目标基因片段
4.1以所述步骤2中获得的粪便样品DNA作为模板，用所述步骤3中设计的探针，对目标基因片段进行PCR扩增，以提高后续目标片段捕获量。优选采用多重PCR，可一次性同时扩增多个目标基因片段。根据模板量设置PCR反应循环数，优选1～10个循环。
4.2多重PCR扩增反应体系为：
PCR反应条件如下：94℃2分钟；94℃30秒，55℃1分钟，72℃1分钟，共5个循环；72℃10分钟；4℃∞。所用的PCR仪为Agilent SureCycler 8800梯度PCR仪。
4.3采用NanoDrop(Thermo Fisher，货号：ND-2000)和dsDNA HSAssay Kit(Thermo Fisher，货号：Q32854)检测目标基因片段PCR扩增产物的质量和浓度，按照产品说明书进行操作。
5.捕获目标基因片段
5.1如图2所示，所述步骤4中的目标基因片段PCR扩增产物的5’端上标记有生物素，能与磁珠上共价耦合的亲和素进行特异性结合。取适量亲和素标记的磁珠(羧菲生物，货号：AE01001)，加入1ml核酸结合/洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，1M NaCl，pH7.4)洗涤磁珠，然后置于磁力架上进行吸附，弃去上清液。
5.2将磁珠重悬于500μl核酸结合/洗涤缓冲液，加入所述步骤4中的目标基因片段PCR扩增产物，轻轻吹打数次使其混合均匀，室温下孵育10～15分钟。磁场吸附，弃去上清液。
5.3加入500μl核酸结合/洗涤缓冲液冲洗磁珠3次，每次2分钟，磁场吸附，弃去上清液。再用新鲜配制的80％乙醇冲洗磁珠2次，每次2分钟，磁场吸附，弃去上清液，室温下敞口挥发残余乙醇(注意不要过度干燥)。在磁力环境下进行洗脱，目标基因片段由于与磁珠绑定得以保留，非目标基因片段和其他杂质(如蛋白)则被去除。
5.4加入20～100μl Nuclease-Free Water，并轻轻吹打以重悬目标基因片段扩增产物-磁珠复合物。
6.荧光定量PCR检测
6.1通过荧光定量PCR对所述步骤5中捕获的目标基因片段进行检测。优选采用竞争性等位基因特异性PCR。本实施案例采用Competitive allele-specific TaqMan PCR(Cast-PCR)突变检测试剂盒(Thermo Fisher，货号：4465804)对KRAS G12S突变进行检测，按照产品说明书进行操作。本实施案例提供的检测方法的检测下限为0.1％，即突变丰度高于0.1％的样品即可被检测到。
6.2在本实施案例中，10例肠癌患者粪便样品在采用本发明所述方法对目标基因片段进行富集捕获后行荧光定量PCR检测，结果显示1～8号患者KRASG12S突变检测阳性，9～10号患者KRAS G12S突变检测阴性，该检测结果与这10例患者配对肿瘤组织样本的检测结果一致，符合率100％；同时，这10例肠癌患者粪便样品在采用步骤2所述方法提取DNA后直接行荧光定量PCR检测，结果显示4号患者KRAS G12S突变检测阳性，其余9例患者KRASG12S突变检测阴性，如表1所示。对同一份样品行3次重复，检测结果一致。图3为4号和9号患者粪便样品目标基因片段荧光定量PCR扩增曲线图；图4为4号患者粪便样品目标基因片段荧光定量PCR产物的Sanger测序结果。这说明本发明是可行有效的，能显著提高粪便中低丰度目标片段的得率和产量，从而有效减少因目标片段提取效率低而引起的检测结果假阴性。
表1本实施案例中肠癌患者KRAS G12S突变检测结果
注释：A组为肠癌患者肿瘤组织样本Sanger测序结果；B组为肠癌患者粪便样品在采用本发明所述方法对目标基因片段进行富集捕获后行荧光定量PCR的检测结果；C组为肠癌患者粪便样品在采用柱式离心管吸附提取法获得DNA后行荧光定量PCR的检测结果。
以上仅为本发明的实施案例，并不用以限制本发明。根据本发明的技术实质，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。具体地说，在不脱离本发明原理前提下的，对以上实例所作的任何修改、等同替换与改进等，均视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种富集捕获粪便中低丰度目标核酸的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
1)采用新型粪便采集处理器对粪便样品进行收集及预处理；
2)采用柱式离心管吸附提取法对步骤1)中的粪便样品的人基因组DNA进行抽提；
3)根据目标基因突变位点所在区段设计探针，同时选择目标基因相对保守的区段作为样品外参，在探针的5’端上标记生物素；
4)以步骤2)中获得的粪便样品DNA作为模板，用步骤3)中设计的探针，对目标基因片段进行PCR扩增；
5)步骤4)中的目标基因片段PCR扩增产物的5’端上标记有生物素，能与磁珠上共价耦合的亲和素进行特异性结合；在磁力环境下进行洗脱，目标基因片段由于与磁珠绑定得以保留，非目标基因片段和其他杂质(如蛋白)则被去除；
6)通过荧光定量PCR对步骤5)中捕获的目标基因片段进行检测。
2.根据权利要求1所述的富集捕获粪便中低丰度目标核酸的方法，其特征在于，步骤3中所述的探针包括正义链探针和反义链探针，长度为15～30个碱基，G+C含量为40％～60％，Tm值为55℃～80℃；探针的5’端上标记有生物素，生物素可连接C6或TEG间臂，从而为生物素与磁珠上的亲和素结合提供更大的空间；探针与目标基因片段序列进行特异性结合但不覆盖突变位点，这样可同时扩增野生型和突变型序列；探针与目标片段结合位置距离突变位点100～400个碱基；扩增的目标片段长度为200～800个碱基对。
3.根据权利要求1所述的富集捕获粪便中低丰度目标核酸的方法，其特征在于，步骤3)中所述的探针是通过软件分析和预试验结果分析的方法来保证探针特异性。
4.根据权利要求1所述的富集捕获粪便中低丰度目标核酸的方法，其特征在于，步骤3)中所述的样品外参是选择目标基因相对保守的区段，外参对目标基因量起着质控的作用。
5.根据权利要求1所述的富集捕获粪便中低丰度目标核酸的方法，其特征在于，步骤4中所述的PCR是为了对目标基因片段进行扩增，以提高后续目标片段捕获量；优选采用多重PCR，可一次性同时扩增多个目标基因片段，根据模板量设置PCR反应循环数，优选1～10个循环。
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