CN117280030A - 用于治疗缺氧和缺血相关病症的药剂、组合物和方法 - Google Patents

Abstract

用于治疗缺氧和缺血相关病症的药剂、组合物和方法。miR‑106b的拮抗剂，例如miR‑106b的反义寡核苷酸；包含此类拮抗剂和miR‑93核酸分子的双链体；以及相关的组合物和方法。

Description

用于治疗缺氧和缺血相关病症的药剂、组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年2月12日提交的美国临时申请号63/148,940(其完整内容出于所有目的在此通过引用并入)的优先权。

序列表

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发明背景

外周动脉疾病(PAD)影响美国近似800-1200万成年人，对发病率和死亡率具有显著影响。PAD的特征在于肢体血流量减少，导致运动或者甚至休息时缺血。

响应于组织缺血，一系列事件可以导致新血管从缺血组织附近的现有毛细血管中萌芽，以形成新血管。这种血管生成代表了促进缺血组织血液供应的适应性机制。

治疗性血管生成(刺激闭塞部位远端新血管的生长)代表了一种有希望的方法，其用于建立通往缺血组织的医疗旁路并改善缺血组织中的灌注。多种血管生成生长因子已在PAD临床前模型和PAD临床患者中进行了详尽的研究。尽管如此，仍缺乏改善外周缺血组织(例如缺血肢体)中灌注的疗法。

在过去的十年中，微RNA已显现作为基因表达的强大内源调节剂，在疾病/损伤状态下尤其重要。微RNA(miR)是调节基因表达的16-25个核苷酸非编码RNA，尤其是在疾病/损伤状态下。微RNA通常通过靶向mRNA降解或通过直接翻译遏制来起作用，并且它们可以调节单个基因或整个途径。一些微RNA在发育性血管发生和肿瘤血管生成中发挥着至关重要的作用。

miRNA由RNA聚合酶II(polII)或RNA聚合酶III转录，并且源自被称为初级miRNA转录物(pri-miRNA)的初始转录物，所述初始转录物通常为数千个碱基长。Pri-miRNA在细胞核中被RNase Drosha加工成约70至约100个核苷酸的发夹形前体(pre-miRNA)。在转运至细胞质后，发夹pre-miRNA被Dicer进一步加工，以产生双链miRNA。然后，成熟miRNA链被并入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，在那里其通过碱基对互补性与其靶mRNA缔合。

然而，关于微RNA在缺血诱导的血管生成(诸如心肌缺血和PAD)中的作用的信息有限。

本领域长期需要可用于增强内皮细胞和肌细胞存活、用于诱导血管生成、用于治疗缺血、以及用于治疗疾病、病况和病症诸如PAD的组合物和方法。

发明概述

本文提供了治疗或预防与缺血相关的疾病、病症、损伤或病况的药剂、组合物和方法。

在一个方面，提供了核酸双链体，其包含：(a)miR-93核酸分子；和(b)miR-106b的拮抗剂。

在一些实施方案中，所述双链体是RNA：RNA双链体。

在一些实施方案中，所述miR-106b的拮抗剂是与miR-106b的至少一部分完全或部分互补的反义寡核苷酸。

在一些实施方案中，所述双链体包含：包含序列AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ IDNO：3)的miR-93RNA或包含序列CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO：4)的miR-93RNA。

在一些实施方案中，所述双链体包含miR-106b的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含序列AUCUGCACUGUCAGCACUUUA(SEQ ID NO：6)。

在一个方面，提供了miR-106b表达、水平或活性的拮抗剂。

在一些实施方案中，所述拮抗剂是与miR-106b的至少一部分完全或部分互补的反义寡核苷酸。

在一些实施方案中，所述miR-106b是人miR-106b-5p，其包含序列UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU(SEQ ID NO：1)。

在一些实施方案中，所述miR-106b是人miR-106b-3p，其包含序列CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC(SEQ ID NO：2)。

在一些实施方案中，所述拮抗剂包含DNA。

在一些实施方案中，所述拮抗剂包含RNA。

在一些实施方案中，所述拮抗剂是antagomir miR-106b。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含一个或多个核苷酸类似物。例如，所述一个或多个核苷酸类似物可包含锁核酸(LNA)。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸能够与成熟miR-106b分子形成双链体，所述双链体具有至少约60℃的解链温度(T_m)。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸能够与另一个单链RNA分子形成双链体。在一些实施方案中，另一个单链RNA分子是miR-93RNA分子。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸和所述另一个单链RNA分子的双链体具有小于约65℃、小于约60℃、小于约55℃、小于约50℃、小于约45℃、小于约40℃、小于约37℃、小于约35℃、小于约30℃或小于约25℃的T_m。

在一些实施方案中，所述拮抗剂是与miR-106b的至少一部分完全或部分互补的反义寡核苷酸；所述反义寡核苷酸能够与成熟miR-106b分子形成双链体；所述反义寡核苷酸能够与另一个单链RNA分子形成双链体；且由所述反义寡核苷酸与成熟miR-106b分子形成的双链体的T_m大于由所述反义寡核苷酸与所述另一个单链RNA分子形成的双链体的T_m。在一些此类实施方案中，所述另一个单链RNA分子是miR-93RNA分子。在一些实施方案中，所述miR-93RNA分子包含序列AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO：3)或序列CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO：4)。

在一些实施方案中，所述拮抗剂由分离的核酸或包含分离的核酸的载体编码。在一些实施方案中，所述载体是选自miRNA表达载体或AAV表达载体的表达载体。例如，所述表达载体可以是miRNA表达载体。在一些实施方案中，所述分离的核酸可操作连接至细胞特异性启动子。

在一些实施方案中，本文公开的拮抗剂或核酸双链体被封装在脂质媒介物内。

在一个方面，提供了药物组合物，其包含：(a)有效量的权利要求1-5或26中任一项的核酸双链体或权利要求6-26中任一项的拮抗剂；和(b)药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含额外的治疗剂。例如，额外的治疗剂可以包括抗缺血剂。

在一些实施方案中，所述有效量有效地降低施用所述药物组合物的主体的内皮或肌肉细胞中至少一种细胞周期途径基因的表达。例如，所述细胞周期途径基因可以选自E2F-1和p53。在一些实施方案中，表达是在骨骼肌细胞中。

在一些实施方案中，所述有效量有效地增强施用所述药物组合物的主体的灌注恢复。

在一些实施方案中，所述有效量有效地增强施用所述药物组合物的主体中对缺血的血管生成应答。

在一些实施方案中，所述有效量有效地刺激细胞增殖，例如包括内皮细胞或肌肉细胞增殖的细胞增殖。

在一些实施方案中，所述有效量有效地增加施用所述药物组合物的主体的毛细血管密度。

在一些实施方案中，所述有效量有效地抑制施用所述药物组合物的主体中一种或多种细胞的凋亡。例如，在一些实施方案中，所述凋亡是缺氧诱导的凋亡。

在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于通过选自以下的途径施用：经口、经颊、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道、眼、肺、直肠、胸骨内注射、肾透析输注和肠胃外。

在一些实施方案中，所述施用是肌内施用。

在一个方面，提供了治疗或预防与缺血相关的疾病、病症、损伤或病况的方法，所述方法包括向有此需要的主体施用本文公开的药物组合物。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述主体施用额外的治疗剂，例如抗缺血剂。

在一些实施方案中，所述有效量有效地降低所述主体的内皮或肌肉细胞中的至少一种细胞周期途径基因的表达，或减弱所述主体的内皮或肌肉细胞中的至少一种细胞周期途径基因的缺血诱导的上调。在一些实施方案中，所述细胞周期途径基因选自E2F-1和p53。在一些实施方案中，表达是在骨骼肌细胞中。

在一些实施方案中，所述有效量有效地增强所述主体的灌注恢复。

在一些实施方案中，所述有效量有效地增强所述主体中对缺血的血管生成应答。

在一些实施方案中，所述有效量有效地刺激细胞增殖。

在一些实施方案中，所述细胞增殖包括内皮细胞或肌肉细胞的增殖。

在一些实施方案中，所述有效量有效地增加所述主体的毛细血管密度。

在一些实施方案中，所述有效量有效地抑制所述主体中一种或多种细胞的凋亡。在一些实施方案中，所述凋亡是缺氧诱导的凋亡。

在一些实施方案中，施用通过选自以下的途径进行：经口、经颊、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道、眼、肺、直肠、胸骨内注射、肾透析输注和肠胃外。

在一些实施方案中，施用是肌内施用。

在一些实施方案中，所述主体是人。

在一些实施方案中，所述缺血选自血管缺血、肌肉缺血、外周动脉疾病、缺血再灌注损伤、与外伤相关的缺血、和脑缺血。

在一些实施方案中，所述缺血是外周动脉疾病。

本发明的某些实施方案的详述

缩写

bw--体重

C2C12--永生化小鼠肌肉细胞系

FDR--错误发现率

GA--腓肠肌

GF--生长因子

GSEA--基因集富集分析

HLI--后肢缺血

HSS--缺氧和血清饥饿

HUVEC--人脐静脉内皮细胞

IGA--缺血性腓肠肌

LNA--锁核酸

LSGS--低血清生长补充剂

miR--微RNA(也称为miRNA)

miRNA--微RNA(也称为miR)

NGA--非缺血性腓肠肌

PAD--外周动脉疾病

PremiR--前体miRNA

RISC--RNA诱导的沉默复合物

SEM--平均值的标准误差

TA--胫骨前肌

VEGF--血管内皮生长因子

定义

如本文所用，术语“约”，当在本文中用于指数值时，是指在上下文中与参考值相似的值。一般而言，熟悉上下文的本领域技术人员将理解该上下文中“约”所涵盖的相关变化程度。例如，在一些实施方案中，术语“约”可以涵盖参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少之内的值的范围。

如本文所用的“拮抗剂”是指抑制靶试剂的水平或生物活性的药剂。例如，miR-106b的“拮抗剂”是指在体外、离体或体内降低miR-106b的水平或活性的药剂。

术语“antagomir”是指拮抗内源性小RNA调节剂如微RNA(miRNA)的小RNA或DNA(或嵌合)分子。这些拮抗剂大部分具有互补的核苷酸序列，这意味着antagomir应当与例如成熟微RNA(miRNA)或成熟微RNA的pre-miRNA前体杂交。它们阻止其他分子结合mRNA分子上的期望位点，并用于沉默内源性微RNA(miR)。因此，Antagomir被设计用于例如阻断这些损伤应答的转录后分子调节剂的生物活性、降低其表达、水平或活性。

如本文所用，本文与“结合(bind)”或“结合(binding)”或“结合(binds)”或“结合(bound)”可互换使用的术语“附接(attach)”或“附接(attachment)”或“附接(attached)”或“附接(attaching)”，是指分子之间导致形成稳定复合物的任何物理关系，诸如配体(诸如肽或小分子)与“结合配偶体”或“受体分子”之间的物理关系。所述关系可以由物理化学相互作用(包括但不限于选择性非共价缔合、离子引力、氢键键合、共价键合、范德华力或疏水引力)介导。

如本文所用的“互补的”是指两个核酸(例如RNA序列和该RNA序列的反义寡核苷酸)之间的亚单元序列互补性的广义概念。当两个分子中的核苷酸位置被通常能够彼此碱基配对的核苷酸占据时，则认为核酸在该位置处彼此互补。因此，当每个分子中显著数量(例如，至少50％)的对应位置被通常彼此碱基配对的核苷酸(例如，A：T(或者对于包含RNA的双链体，A：U)和G：C核苷酸对)占据时，两个核酸彼此互补。因此，已知第一核酸区域的腺嘌呤残基能够与第二核酸区域的残基形成特异性氢键(“碱基配对”)，如果所述残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，则第二核酸区域与第一区域反平行。类似地，已知第一核酸链的胞嘧啶残基能够与第二核酸链的残基碱基配对，如果所述残基是鸟嘌呤，则第二核酸链与第一链反平行。如果当两个区域以反平行方式布置时，第一区域的至少一个核苷酸残基能够与第二区域的残基碱基配对，则核酸的第一区域与相同或不同核酸的第二区域互补。优选地，第一区域包括第一部分，并且第二区域包括第二部分，由此，当第一和第二部分以反平行方式布置时，例如，至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％或至少约95％的第一部分的核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。更优选地，第一部分的所有核苷酸残基都能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。

本文使用“有效量”或“治疗有效量”(或“预防有效量”)是指足以实现有益的或期望的结果、诸如增加的血管生成或特别期望的临床结果的量。因此，“有效量”或“治疗有效量”取决于其应用的上下文。

“分离的核酸”是指已经从在天然存在状态下位于其侧翼的序列分离的核酸区段或片段，例如已经从通常与该片段相邻的序列(例如在其天然存在的基因组中与该片段相邻的序列)中移出的DNA片段。该术语还适用于已经从其他组分中基本上纯化的核酸，所述其他组分天然伴随所述核酸，例如在细胞中天然伴随所述核酸的RNA或DNA或蛋白质。因此该术语包括，例如整合到载体中的重组DNA，整合到自主复制质粒或病毒中的重组DNA，或整合到原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或其作为独立于其他序列的单独分子(例如，作为通过PCR或限制酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)存在的重组DNA。它还包括作为编码其他多肽序列的杂合基因的一部分的重组DNA。

术语“治疗(treating)”(及其变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)是指试图改变有此需要的主体中的疾病或病况的自然进程的临床干预。治疗既可以用于预防，也可以在临床病理的过程期间进行。期望的治疗效果包括预防疾病的发生或复发、减轻疾病的一种或多种症状、减少疾病的任何直接或间接的病理后果、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态，以及改善预后。

如本文所用，术语“治疗有效量”或“有效量”是指本文提供的药剂或药物组合物当施用给主体时有效地治疗疾病或病症的量。

术语“体外”是指在活生物体外部发生的过程。这种术语涵盖术语“原位”和“离体”。

术语“原位”是指在与活生物体分开生长(例如，在组织培养物中生长)的活细胞中发生的过程。

术语“离体(ex vivo)”是指在组织样品中发生的过程，通常其中组织的细胞结构得到保留。

术语“体内”是指在活生物体中发生的过程。

如本文所用，术语“哺乳动物”包括人类和非人类两者，并且包括但不限于人类、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物和猪。

分析、诊断或治疗的“主体”是动物。此类动物包括哺乳动物，优选人。

如本文所用，“有此需要的主体”是可以受益于本发明的方法的患者、动物、哺乳动物或人。

如本文所用，术语“处于PAD风险中的主体”是指具有一种或多种发展PAD的风险因素的主体。风险因素包括但不限于性别、年龄、遗传倾向、环境暴露、和先前PAD事件以及生活方式。

在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语百分比“同一性”是指当进行最大对应性的比较和比对时，如使用下述序列比较算法之一(例如，BLASTP和BLASTN或技术人员可用的其他算法)或通过目视检查来测量的，两个或更多个序列或子序列具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。根据应用，百分比“同一性”可以存在于所比较序列的区域上，例如存在于功能结构域上，或者可替代地，存在于待比较的两个序列的全长上。

对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，用测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入电脑，指定子序列坐标，如有必要，并且指定序列算法程序参数。然后基于指定的程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。

用于比较的最佳序列比对可以如下进行：例如通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85∶2444(1988)的搜索相似性方法，通过计算机实施这些算法(Wisconsin Genetics SoftwarePackage中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，Wis.)，或通过目视检查(一般参见Ausubel等人，见下文)。

适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，其描述于Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。用于执行BLAST分析的软件可通过国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information(www.ncbi.nlm.nih.gov/))公开地获得。

术语“足够量”意指足以产生期望效果的量，例如足以在细胞中调节蛋白聚集的量。

必须注意的是，如在本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”、和“该/所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。

概览

当与对照相比时，在PAD相关条件下进行的体外血管生成测定中，较高水平的miR-106b显著减少内皮分支。(Ganta等人，Circulation.2017；135：2403-2425，其在此以其整体通过引用并入)。

本文公开了miR-106b表达、水平或活性的拮抗剂等。此类药剂可用于治疗和预防缺氧、缺血以及与缺血相关的其他损伤、疾病、病症和病况，诸如外周动脉疾病和心肌缺血。不希望受理论束缚，此类拮抗剂可以减弱或阻断miR-106b介导的血管生成抑制，这将可用于帮助从缺血事件恢复。

核酸双链体和miR-106b拮抗剂

本文提供了核酸双链体，其包含：(a)miR-93核酸分子；和(b)miR-106b的拮抗剂，诸如本文所述的任何拮抗剂。

如本文所用的关于核酸双链体的术语“双链体”根据其在本领域中的含义使用，并且可以指包含DNA链、RNA链或DNA和RNA两者的双链体。在一些实施方案中，所述双链体是RNA：RNA双链体。如本领域技术人员所理解，双链体中每条链的至少一部分与另一条链的至少一部分基本上互补，并且互补程度可以变化并且可以是100％、但不必是100％。例如，一些双链体在互补区域内或整个双链体的链之间含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个错配。

在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂是与miR-106b的至少一部分完全或部分互补的反义寡核苷酸。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含序列AUCUGCACUGUCAGCACUUUA(SEQ ID NO：6)或与其具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸具有SEQ ID NO：6的序列或与其具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。

miR-93核酸分子的实例包括但不限于美国专利号9,845,465(其全部内容通过引用并入本文)中公开的那些。

在一些实施方案中，所述miR-93核酸分子是miR-93RNA，诸如包含序列AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO：3)(或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％同一性的序列)的miR-93或包含序列CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO：4)(或与其具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列)的miR-93RNA。在一些实施方案中，miR-93RNA是具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的序列(或与SEQ ID NO：3或SEQID NO：4具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列)的寡核苷酸。

在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂是哺乳动物miR-106b的拮抗剂。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂是人miR-106b的拮抗剂。

在一些实施方案中，人miR-106b的拮抗剂是hSa-miR-106b-5p的拮抗剂。如miRBase中所示的，hsa-miR-106b-5p的成熟序列是：UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU(SEQ ID NO：1)。

在替代实施方案中，人miR-106b的拮抗剂是hsa-miR-106b-3p的拮抗剂。如miRBase中所示的，hsa-miR-106b-3p的成熟序列是CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC(SEQ ID NO：2)。

在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂是反义寡核苷酸，其包含与成熟miR-106b的一部分完全或部分互补的序列，使得所述反义寡核苷酸结合miR-106b。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸序列与成熟miR-106b的一部分完全或部分互补，使得所述反义寡核苷酸在PAD相关病况下结合miR-106b。参见，例如，Ganta等人，Circulation.2017；135：2403-2425，其在此以其整体通过引用并入。此类反义寡核苷酸在本文中可称为“靶向”mir-106b核酸或miR-106b的“反义寡核苷酸”。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含与成熟miR-106b的一部分至少85％、90％或95％互补、或100％互补的序列。在优选实施方案中，所述反义寡核苷酸包含与成熟miR-106b的一部分100％互补的序列。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂包含反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含与表1中所示的SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的序列的至少一部分具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂包含与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的序列的至少一部分具有100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述部分包含SEQ ID NO：6或7的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述部分包含SEQ ID NO：6或7的全部。

在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂包含与包含SEQ ID NO：6或7的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸的部分具有100％同一性的序列。

表1：miR-106b拮抗剂的反义寡核苷酸的示例性序列

在一个优选方面，所述拮抗剂是miR-106b-5p的反义寡核苷酸。

在一个方面，所述拮抗剂是miR-106b-3p的反义寡核苷酸。

在一些实施方案中，所述成熟miR-106b的一部分包含miR-106b序列中存在的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或所有22个连续核苷酸。在优选实施方案中，所述成熟miR-106b的一部分包含hsa-miR-106b-5p序列中存在的所有22个连续核苷酸。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含与hsa-miR-106b-5p序列中存在的所有22个连续核苷酸100％互补的序列。

在一些实施方案中，所述成熟miR-106b的一部分包含miR-106b种子区域。因此，在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含与miR-106b种子区域完全或部分互补的区域。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含与miR-106b种子区域完全互补的区域。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含如在所述反义寡核苷酸的长度上测量的与miR-106b完全互补的序列。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含如在miR-106b的长度上测量的与miR-106b完全互补的序列。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸在反义寡核苷酸的长度上与微RNA的对应区域互补。在一些实施方案中，寡聚物的3′核苷与miR-106b的第一、第二、第三或第四个5′核苷酸互补(即对齐)。在一个实施方案中，寡聚物的3’核苷与miR-106b的第二个5’核苷酸对齐。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸在寡聚物的长度上大部分与miR-106b互补。例如，所述反义寡核苷酸可包含与miR-106b的对应区域的一个错配。例如，所述反义寡核苷酸可包含与miR-106b的对应区域的两个错配。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含DNA。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含RNA。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸能够与miR-106b形成双链体。在一些实施方案中，所述双链体具有解链温度(T_m)。所述T_m可以是例如至少约60℃、约65℃、约70℃或更高。在一些实施方案中，所述T_m为约60℃至约90℃、约65℃至约85℃或约70℃至约80℃。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸与miR-106b结合至足以降低miR-106b介导的与缺血恢复相关的血管生成的抑制的程度，但未到降低miR-106b介导的与缺血恢复无关的途径活性的过度程度。在具体实施方案中，所述反义寡核苷酸与miR-106b结合至足以治疗与缺血相关的疾病、病症或病况的程度，但未到引起不想要的副作用的过度程度。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸能够与(除了miR-106b以外，例如除了hsa-miR-106b-5p以外)另一个单链RNA分子形成双链体。在一些实施方案中，与另一个单链RNA形成的双链体比与miR-106b形成的双链体稳定性差。在一些实施方案中，与另一个单链RNA核酸分子的双链体的T_m小于约60℃、小于约55℃、小于约50℃、小于约45℃、小于约40℃、小于约37℃、小于约35℃、小于约30℃、或小于约25℃。在一些实施方案中，与另一个单链RNA核酸分子的双链体的T_m为至少25℃、至少30℃、至少35℃、至少37℃、至少40℃、至少45℃、至少50℃或至少55℃。

在一些实施方案中，由所述反义寡核苷酸与成熟miR-106b分子形成的双链体的T_m大于由所述反义寡核苷酸与所述另一个单链RNA分子形成的双链体的T_m。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸在生理条件下或在PAD相关病况下不与(除了miR-106b以外，例如除了hsa-miR-106b-5p以外)另一个单链RNA分子形成双链体。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸在体内不与(除了miR-106b以外，例如除了hsa-miR-106b-5p以外)另一个单链RNA分子形成双链体。

在一些实施方案中，另一个单链RNA分子是miR-93。

给定双链体的T_m可以通过T_m测定法来确定。在本文提供的示例性T_m测定法中，将反义寡核苷酸和RNA靶双链体在500ml无RNA酶水中稀释至3mM并与500ml 2x T_m-缓冲液(200mM NaCl，0.2mM EDTA，20mM磷酸钠，pH7.0)混合。将溶液加热到95℃持续3分钟并随后允许在室温退火30分钟。在配备Peltier温度编程器PTP6的Lambda 40UVA IS分光光度计上使用PE Templab软件(Perkin Elmer)测量双链体解链温度(T_m)。温度从20℃增加至95℃并且随后下降至25℃，在260nm记录吸收。解链和退火的一阶导数和局部最大值用来评定双链体T_m。

所述反义寡核苷酸的长度可以是例如约7至约30nt，诸如约7至约26或约8至约25，诸如约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25个核苷酸长，诸如约10至约22个核苷酸长。在一些实施方案中，长度是21或22个核苷酸。

在一个方面，所述反义寡核苷酸是miR-106b antagomir。

Antagomirs(本文也称为antimiRs)通常是指由连续核苷酸序列组成或包含所述连续核苷酸序列的寡聚物，所述连续核苷酸序列与微RNA序列或其对应的子序列完全互补或基本上互补(即可以包含一个或两个错配)。在这方面，认为antimiR可以包含与整个成熟微RNA互补或基本上互补的连续核苷酸序列，或antimiR可以包含与成熟微RNA或前微RNA的子序列互补或基本上互补的连续核苷酸序列。所述子序列(和因此对应的连续核苷酸序列可以是至少5、6、7或8个核苷酸长，诸如5至25个核苷酸，诸如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸长，诸如10-17个或10-16个核苷酸，诸如12-15个核苷酸。已经提出许多antimiR设计，并且通常，在用于治疗性用途的antimiR中，antimiR的连续核苷酸序列包含一个或多个核苷酸类似物。

在一些实施方案中，所述antimiR可以具有gapmer结构。但是，如在WO 2007/112754和WO 2007/112753(其两者在此以其整体通过引用并入)中所解释，可以优选其他设计，诸如nixmer或totalmer。

WO 2007/112754和WO 2007/112753(其两者均在此以其整体通过引用并入)提供了antimiR寡聚物和antimiR寡聚物设计，其中寡聚物与成熟微RNA互补。

在一些实施方案中，antimiR的子序列对应于miRNA种子区域。在一些实施方案中，寡聚物的第一个或第二个3’核碱基对应于微RNA序列的第二个5’核苷酸。

在一些antimiR实施方案中，如从寡聚物的区域的3′末端测量的寡聚物的核碱基单元1至6(包括端值)与微RNA种子区域序列互补。

在一些antimiR实施方案中，如从寡聚物的区域的3′末端测量的寡聚物的核碱基单元1至7(包括端值)与微RNA种子区域序列互补。

在一些antimiR实施方案中，如从寡聚物的区域的3′末端测量的寡聚物的核碱基单元2至7(包括端值)与微RNA种子区域序列互补。

在一些实施方案中，antimiR寡聚物在位于与miRNA种子区域互补的区域内部的位置包含至少一个核苷酸类似物单元，诸如至少一个LNA单元。在一些实施方案中，antimiR寡聚物可以在位于与miRNA种子区互补的区域内部的位置包含1至6个或1至7个核苷酸类似物单元，诸如1至6个和1至7个LNA单元。

在一些实施方案中，所述antimiR包含与miR-106b的种子区域互补的连续核苷酸序列，并且其中至少80％、诸如至少85％、至少90％、至少95％或100％的核苷酸是LNA。

在一些实施方案中，所述antimiR包含与miR-106b的种子区域互补的连续核苷酸序列，并且其中至少80％的核苷酸是LNA，以及其中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。

在一些实施方案中，当与靶序列杂交时，antimiR的连续核苷酸序列包含不超过一个错配。在一些在实施方案中，当与靶序列杂交时，连续核苷酸序列包含不超过两个错配。在一些实施方案中，当与靶序列杂交时，连续核苷酸序列不包含错配。

在确定本公开的寡聚物(或其区域)和核酸的靶区域(诸如本文公开的那些)之间的“互补性”程度时，“互补性”程度(也是“同源性”或“同一性”)可以表示为寡聚物(或其区域)序列和与之最佳对齐的靶区域序列(或靶区域的反向互补序列)之间的百分比同一性(或百分比同源性)。通过对在2个序列之间相同的对齐碱基的数目计数，除以寡聚物中连续单体的总数并乘以100，计算该百分比。在这种比较中，如果空位存在，优选此类空位仅是错配而非其中空位内部单体的数目在本发明的寡聚物和靶区域之间不同的区域。

如本文所用，术语“同源的”和“同源性”与术语“同一性”和“相同的”可互换。

术语“对应于(corresponding to)”和“对应于(corresponds to)”是指在寡聚物的核苷酸序列(即核碱基或碱基序列)或连续核苷酸序列(第一区域)和从(i)核酸靶的子序列或(ii)核酸靶的反向互补序列选择的其他序列的等同连续核苷酸序列之间比较。核苷酸类似物与其等同或对应的核苷酸直接比较。对应于i)或ii)下其他序列的第一序列通常与该序列在第一序列(诸如连续核苷酸序列)的长度范围内相同，或如本文所述，可以在一些实施方案中与对应序列至少80％同源，诸如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％同源，诸如100％同源(相同)。

核苷酸类似物

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含一个或多个核苷类似物。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含一个或多个核苷酸类似物。

示例性核苷类似物单元包括但不限于2’-O-烷基-RNA单元、2V-OMe-RNA单元、2’-氨基-DNA单元、2′-氟-DNA单元、LNA单元、PNA单元、HNA单元、2’-FANA、2’-(3-羟基)丙基和2′-氟-DNA单元、和/或其他(任选地)糖修饰的核苷类似物、诸如吗啉代、肽核酸(PNA)、CeNA、未连接的核酸(UNA)、己糖醇核酸(HNA)、双环-HNA(参见例如WO 2009/100320，其在此以其整体通过引用并入)和INA单元。在一些实施方案中，一个或多个核苷类似物增加第一区域对其靶核酸(或互补性DNA或RNA序列)的亲和力。各种核苷类似物公开于Freier和Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in DrugDevelopment，2000,3(2)，293-213，其在此通过引用并入。

术语“LNA单元”、“LNA单体”、“LNA残基”、“锁核酸单元”、“LNA”、“双环核酸”、“BNA”、“锁核酸单体”或“锁核酸残基””在本文中可互换使用以指双环核苷类似物。在一些实施方案中，LNA包含连接核糖环的第二个和第四个碳的桥(或双基)(C4*-C2*桥或双基)。第二个和第四个碳之间双基的存在将核糖锁定为3′内-(北)(3′endo-(north))构型。LNA单元描述于WO 99/14226、WO 00/56746、WO 00/56748、WO 01/25248、WO 02/28875、WO 03/006475和WO 03/095467，其在此以其整体通过引用并入。

在一些实施方案中，一个或多个LNA单元独立地选自呈D-β和L-α构型中任一者或其组合的氧基-LNA、硫代-LNA和氨基-LNA。

在一些实施方案中，LNA包含ENA核碱基。

在一些实施方案中，LNA包含βD氧基-LNA。

在一些实施方案中，LNA包含α-L氨基LNA。

2’取代的寡聚物，例如完全2’OME寡聚物，描述于WO05/013901、WO07/027775、WO07027894，其各自在此以其整体通过引用并入。在一些实施方案中，寡聚物的第一区域可以包含2′取代的核苷。WO07/027775还涉及用于靶向微RNA的MOE、LNA、DNA mixmer。

术语“对应的核苷酸类似物”和“对应的核苷酸”意在表示核苷酸类似物中的核苷酸和天然存在的核苷酸是相同的。例如，当核苷酸的2-脱氧核糖单元与腺嘌呤连接时，“对应的核苷酸类似物”含有与腺嘌呤连接的戊糖单元(与2-脱氧核糖不同)。

非天然存在的核苷酸包括具有修饰的糖部分的核苷酸，诸如双环核苷酸或2’修饰的核苷酸，诸如2’取代的核苷酸。

“核苷酸类似物”是天然核苷酸、诸如DNA或RNA核苷酸的变体，原因在于糖部分和/或碱基部分中的修饰。在寡核苷酸的背景下，类似物可以原则上仅是“沉默的”或“等同”于天然核苷酸，即对寡核苷酸抑制靶基因表达的工作方式不具有功能性影响。然而，此类“等同的”类似物可能是有用的，如果，例如它们更易制造或制造更便宜，或对储存或制造条件更稳定，或代表标签或标记物。然而，优选地，类似物将对寡聚物抑制表达的工作方式具有功能性影响；例如通过产生对靶增加的结合亲和力和/或对胞内核酸酶增加的抗性和/或更易于转运入细胞。

合适的核苷酸类似物的实例描述于WO2007/031091，其在此以其整体通过引用并入。可用于本文公开的反义寡核苷酸中的其他核苷酸类似物包括三环核酸。示例性三环核酸描述于WO2013154798和WO2013154798，其各自在此以其整体通过引用并入。

在一些实施方案中，核苷包含化学修饰的呋喃核糖环部分。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含一个或两个LNA单元。在一些实施方案中，从3’末端计数，一个或两个LNA单元在位置3至8。这种定位可以有利于由寡：微RNA双链体(在结构上与RNA：RNA双链体相似的双链体)形成的A-螺旋的稳定性。

载体

在一些实施方案中，所述miR-106b拮抗剂在载体中编码。“载体”是一种物质组合物，其可用于将目标核酸递送至细胞内部。本领域已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。表达构建体可以在活细胞中复制，或者其可以合成制备。出于本申请的目的，术语“表达构建体”、“表达载体”和“载体”可互换使用以在一般、说明性意义上证明本发明的应用，并且不旨在限制本发明。

在一些实施方案中，表达载体包含与编码miR-106b拮抗剂的多核苷酸“可操作连接”的启动子。如本文所用的短语“可操作连接”或“在转录控制下”意指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。编码miR-106b拮抗剂的多核苷酸可编码初级微RNA序列、前体微RNA序列或成熟miR-106b拮抗剂序列。

在一些实施方案中，所述表达载体是病毒载体，诸如衍生自腺病毒、腺相关病毒(AAV)或逆转录病毒(包括慢病毒，诸如人免疫缺陷(HIV)病毒)的载体。在一些实施方案中，AAV是AAV8或AAV9。

在一个方面，所述载体是AAV(腺相关病毒)载体。在一些实施方案中，本公开的重组AAV载体可用于相对于其他组织优先靶向肌肉。在一些实施方案中，本公开的重组AAV载体可用于优先增加肌肉中目标基因的表达。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法涵盖用AAV载体靶向和转导肌肉。方法可包括向主体施用包含有效量的包含调节元件的重组腺相关病毒(AAV)载体的药物组合物。调节元件通常包含至少一个启动子元件和任选至少一个增强子元件。增强子和启动子通常可操作连接。重组AAV载体还可以任选地包含至少一个可操作连接至启动子元件的基因。在一些实施方案中，AAV可以包含整个AAV基因组或其同源物或片段，诸如特定AAV的衣壳。然而，应该指出的是，在一些情况下，整个AAV基因组可能没有用或不需要，因为需要使载体是复制缺陷的和/或需要插入目标基因，诸如治疗性基因。

调节元件和目标基因也可以被其活性片段、修饰物或同源物取代。在一个方面，所述重组AAV载体优先靶向骨骼肌。

可以制备重组AAV载体以用于用由本公开的AAV载体表达的siRNA或miRNA敲低肌肉中的特定基因。

其他有用的载体、核酸和蛋白或其同源物和片段可用于本公开的实践，包括但不限于AAV-9(例如，NCBI登录号AX753250；SEQ ID NO：8)和AAV-8(例如，NCBI登录号NC006261；SEQ ID NO：9)。

由于AAV的有效载荷限制，在一些实施方案中，可以使用cDNA。在一个方面，可以引入额外的内含子和序列。在一个方面，使用AAV的cap基因而不是整个AAV基因组DNA。

本领域已知也可用于实践本发明的方法的其他方法和载体，包括Souza等人(例如，美国专利公开号201I/0212529，2011年9月1日公开)中的那些。

尽管AAV诸如AAV9和AAV8可以比其他组织更高的特异性来靶向一些组织，但使用组织或细胞特异性增强子和启动子作为载体的一部分可以帮助确保目标基因在期望的细胞或组织中表达。在一些实施方案中，期望的细胞或组织包括骨骼肌细胞和/或横纹肌细胞。在一些实施方案中，期望的细胞或组织包括心肌细胞。

AAV的更详细的描述和使用可见于例如美国专利公开号US2013/0136729(法文和附件，美国专利申请序列号13/673，351)，其全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，所述载体包含心肌肌钙蛋白-T基因启动子或其必需的近端启动子元件。示例性的心肌肌钙蛋白-T启动子和必需元件描述于美国专利号5,266,488，其内容在此以其整体通过引用并入。在一些实施方案中，所述载体包含肌肉肌酸激酶启动子或其必需的近端启动子元件。在一些实施方案中，所述载体包含肌间线蛋白(DES)启动子或其必需的近端启动子元件。在一些实施方案中，所述载体包含组织特异性增强子。

在一些实施方案中，所述表达载体被优化用于转基因在肌肉组织中的持续表达。本发明的另一个目的是提供增强子/启动子组合，其可以在各种表达系统中引导持续且适当的表达水平。

在一些实施方案中，所述表达载体包含来自肌肉特异性启动子和肌肉特异性增强子的最小序列的组合，以产生以持续方式驱动转基因转录的嵌合调节元件。最小序列是维持目标功能的序列，尽管可能稍小于完整的目标序列。

本公开还提供了用含有本公开的增强子/启动子组合的核酸转染的细胞。

启动子可以与其他调节序列/元件偶联，当与适当的细胞内调节因子结合时，所述其他调节序列/元件增强(“增强子”)或抑制(“阻遏子”)启动子依赖性转录。当启动子、增强子或阻遏子控制或影响转基因转录速率或效率时，此类元件被认为与转基因“可操作连接”。例如，位于转基因编码序列5′端附近的启动子序列通常与转基因可操作连接。如本文所用，术语“调节元件”与“调节序列”可互换使用，并且是指启动子、增强子和其他表达控制元件或此类元件的任何组合。

功能影响

在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂，例如miR-106b的反义寡核苷酸，降低成熟miR-106b表达、生物活性、或表达和生物活性两者。

成熟miR-106b表达可以根据本领域任何已知方法测定，包括但不限于：qPCR，例如实时qPCR和微阵列。成熟miR-106b表达可以在体外，例如使用细胞培养模型、离体或体内测定。

在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂，例如miR-106b的反义寡核苷酸，使成熟miR-106b表达降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂，例如miR-106b的反义寡核苷酸，使成熟miR-106b表达降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，例如10％至100％、20％至90％、30％至80％、40％至70％、或50％至60％。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂，例如miR-106b的反义寡核苷酸，使成熟miR-106b表达降低至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂(例如，miR-106b的反义寡核苷酸)降低miR-106b途径活性。

在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂(例如，miR-106b的反义寡核苷酸)在PAD相关病况下促进血管生成。PAD相关病况下的血管生成可以通过本领域已知的任何方式来测定。

在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂(例如，miR-106b的反义寡核苷酸)减弱胱天蛋白酶-9表达或减弱缺氧诱导的胱天蛋白酶-9表达。在一些实施方案中，miR-106b拮抗剂使缺氧诱导的胱天蛋白酶-9表达减弱至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％或约多于20％。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂使缺氧诱导的胱天蛋白酶-9表达减弱约5％至约15％。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂使缺氧诱导的胱天蛋白酶-9表达减弱至少约10％，例如约10％。

在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂(例如，miR-106b的反义寡核苷酸)减弱内皮或肌肉细胞中一种或多种基因的缺血诱导的上调，或减少内皮或肌肉细胞中一种或多种基因的表达。在一些实施方案中，所述一种或多种基因是细胞周期途径的基因。在一些实施方案中，所述细胞周期途径的一种或多种基因选自p53和E2F-1。在一些实施方案中，在缺血事件后评价细胞中一种或多种基因的表达。

在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂(例如，miR-106b的反义寡核苷酸)减弱p53的缺血诱导的上调，或降低p53的表达。在一些实施方案中，p53 mRNA表达降低约20％至约40％。在一些实施方案中，p53 mRNA表达降低至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。在一些实施方案中，p53蛋白表达降低约10％至约30％。在一些实施方案中，p53蛋白表达降低至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。

在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂(例如，miR-106b的反义寡核苷酸)减弱E2F-1的缺血诱导的上调，或降低E2F-1的表达。在一些实施方案中，E2F-1mRNA表达降低约60％至约80％。在一些实施方案中，E2F-1蛋白表达降低约10％至约30％。

在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂(例如，miR-106b的反义寡核苷酸)减弱miR-106b介导的血管生成的减少。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂(例如，miR-106b的反义寡核苷酸)减弱PAD相关病况下miR-106b介导的血管生成的减少。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂使miR-106b介导的血管生成的减少减弱至少约2.5％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％。至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂(例如，miR-106b的反义寡核苷酸)增强血管生成。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂使血管生成增强至少约2.5％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％。至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。血管生成可以通过本领域已知的任何方式来测量。例如，可以经由评价内皮分支、例如经由体外血管生成测定法来测量血管生成。

在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂(例如，miR-106b的反义寡核苷酸)减弱miR-106b诱导的细胞增殖的减少。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂(例如，miR-106b的反义寡核苷酸)减弱PAD相关病况下miR-106b诱导的细胞增殖的减少。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂使miR-106b介导的细胞增殖的减少减弱至少约2.5％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％。至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂(例如，miR-106b的反义寡核苷酸)增强血管生成。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂(例如，miR-106b的反义寡核苷酸)增强细胞增殖。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂使细胞增殖增强至少约2.5％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％。至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约200％或至少约300％。细胞增殖可以包括例如内皮细胞的增殖。细胞增殖可以包括例如肌肉细胞、诸如例如骨骼肌细胞或心肌细胞的增殖。细胞增殖可以在体外测量，例如在培养的细胞(诸如例如人脐静脉内皮细胞(HUVECS)和/或C2C12细胞)中测量。可以在体内测量细胞增殖。

在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂(例如，miR-106b的反义寡核苷酸)减弱miR-106b介导的凋亡。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂(例如，miR-106b的反义寡核苷酸)减弱PAD相关病况下miR-106b介导的凋亡。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂(例如，miR-106b的反义寡核苷酸)减弱缺氧或缺血条件诱导的凋亡。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂使凋亡减少至少约2.5％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％。至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。凋亡以及由缺氧或缺血条件诱导的凋亡可以通过本领域已知的任何方式来测量。凋亡可以包括例如内皮细胞和/或肌肉细胞(例如骨骼肌细胞或心肌细胞)的凋亡。可以使用TUNEL测定法在体外例如在培养的细胞(诸如例如HUVEC或C2C12细胞)中测量凋亡。凋亡可以在体内测量，例如本领域已知的PAD相关病况的任何动物模型中测量。PAD相关病况的示例性模型是后肢缺血动物模型。

在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂(例如，miR-106b的反义寡核苷酸)增强缺血后的再灌注(本文中也称为灌注恢复)。在一些实施方案中，miR-106b的拮抗剂使缺血后的再灌注增强至少约2.5％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％。至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。缺血可以是肢体缺血。缺血后的再灌注可以通过本领域已知的任何方式来评估。示例性的缺血模型包括测试啮齿动物、例如小鼠中的后肢缺血。可以例如在后肢缺血后通过成像和/或通过测量毛细血管密度来评估测试啮齿动物中后肢缺血后的再灌注。本文公开了用于测量后肢缺血后的毛细血管密度和用于对灌注恢复进行成像的示例性方法。(参见例如“材料和方法”部分中的实施例。)

治疗方法

对于治疗应用，将miR-106b拮抗剂以药学上可接受的剂型、诸如本领域已知的剂型和上文讨论的剂型施用于主体，通常是哺乳动物，通常其中所述哺乳动物是人。例如，miR-106b拮抗剂可以通过任何施用途径施用于人，例如，经口、经颊、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道、眼、肺、直肠、胸骨内注射、肾透析输注和肠胃外。在一些实施方案中，肌内施用miR-106b拮抗剂。

因此，本文提供了治疗或预防有此需要的主体中与缺血相关的疾病、病症、损伤或病况的方法，其包括施用有效量的本文公开的miR-106b拮抗剂。

在一些实施方案中，所述缺血选自血管缺血、肌肉缺血、外周动脉疾病、缺血再灌注损伤、与外伤相关的缺血、和脑缺血，任选地其中所述缺血是外周动脉疾病。

在一些实施方案中，所述缺血是外周动脉疾病。

在一些实施方案中，所述缺血是缺血再灌注损伤。

在一些实施方案中，所述缺血是脑缺血。在一些实施方案中，所述脑缺血与创伤相关。

在一个方面，所述缺血是血管缺血。在一个方面，所述血管缺血是冠状动脉缺血。

本文还提供了减少有此需要的主体的内皮或肌肉细胞中的至少一种细胞周期途径基因的表达，或减弱有此需要的主体的内皮或肌肉细胞中的至少一种细胞周期途径基因的缺血诱导的上调的方法，其包括施用有效量的本文公开的miR-106b拮抗剂。本文公开了示例性细胞周期途径基因。

本文还提供了增强有此需要的主体中的灌注恢复的方法，其包括施用有效量的本文公开的miR-106b拮抗剂。

本文还提供了增强有此需要的主体中对缺血的血管生成应答的方法，其包括施用有效量的本文公开的miR-106b拮抗剂。

本文还提供了在主体中的缺血事件后刺激主体中的细胞增殖的方法，其包括施用有效量的本文公开的miR-106b拮抗剂。在一些实施方案中，所述细胞增殖是内皮和/或肌肉细胞的增殖。

本文还提供了增加有此需要的主体中的毛细血管密度的方法，其包括施用有效量的本文公开的miR-106b拮抗剂。

本文还提供了抑制有此需要的主体中的一种或多种细胞的凋亡的方法，其包括施用有效量的本文公开的miR-106b拮抗剂。在一些实施方案中，所述凋亡包括缺氧诱导的凋亡，例如由缺血诱导的缺氧诱导的凋亡。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞是内皮细胞和/或肌肉细胞。

药物组合物

在一些实施方案中，提供了包含miR-106b拮抗剂的药物组合物，其中所述药物组合物进一步包含另一个miRNA分子并且其中所述miR-106b拮抗剂与另一个miRNA分子形成双链体。在此类药物组合物的一些实施方案中，miR-106b拮抗剂是hsa-miR-106b-5p的反义寡核苷酸，并且与miR-93形成双链体。在此类药物组合物的一些实施方案中，所述药物组合物包含以下的双链体：(1)hsa-miR-106b-5p的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含序列AUCUGCACUGUCAGCACUUUA(SEQ ID NO：6)和(2)包含hsa-miR-93-5p序列AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO：3)的序列。在此类药物组合物的一些实施方案中，所述药物组合物包含以下的双链体：(1)hsa-miR-106b-5p的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含序列AUCUGCACUGUCAGCACUUUA(SEQ ID NO：6)和(2)包含hsa-miR-93-5p序列CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO：4)的序列。

本文所述的拮抗剂(例如，反义寡核苷酸)可以配制在药物组合物中。除了本文公开的一种或多种拮抗剂之外，这些组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员众所周知的其他材料。此类材料应当是无毒的并且不应该干扰活性成分的效力。载体或其他材料的精确性质可以取决于施用途径(例如经口、经颊、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道、眼、肺、直肠、胸骨内注射、肾透析输注和肠胃外施用途径)。

用于口服施用的药物组合物可以呈例如片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可包括固体载体、诸如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包括液体载体，诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇、诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

对于静脉内、皮肤或皮下注射或在患病部位注射，活性成分可以呈肠胃外可接受的水溶液的形式，其无热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员完全能够使用例如等渗媒介物、诸如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液来制备合适的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。

在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于肌内施用。

本文公开的一种或多种拮抗剂的施用优选以“治疗有效量”或“预防有效量”(视情况而定，尽管预防可以被认为是疗法)进行，这足以显示对个体的益处。实际施用量以及施用速率和时程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度。治疗处方，例如剂量等的决定在全科医生和其他医疗专业人员的责任之内，并且通常考虑待治疗的病症、患者个体的状况、递送部位、施用方法、避免副作用以及从业人员已知的其他因素。上面提及的技术和方案的实例可见于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编)，1980。

组合物可以单独或与其他治疗组合，同时或依次施用，这取决于待治疗的病况。

可用于本公开的方法中的药物组合物可以以适于期望的施用途径(例如，经口、直肠、阴道、肠胃外、局部、肺、鼻内、经颊、眼、鞘内或另一种施用途径)的制剂制备、包装或销售。其他预期的制剂包括投射的纳米颗粒(projected nanoparticles)、脂质体制剂、含有活性成分的重封闭红细胞和基于免疫学的制剂。

本公开的药物组合物可以作为单一单位剂量或作为多个单一单位剂量制备、包装或整批销售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将施用于主体的活性成分的剂量或这种剂量的方便部分，诸如例如这种剂量的一半或三分之一。

本公开的药物组合物中活性成分、药学上可接受的载体和任何其他成分的相对量将根据所治疗的主体的身份、大小和状况，并且还根据组合物的施用途径而变化。例如，所述组合物可以包含0.1％至100％(w/w)的活性成分。

除了活性成分之外，本公开的药物组合物还可以包含一种或多种额外的药物活性剂。特别考虑的额外药剂包括止吐剂和清除剂，诸如氰化物和氰酸盐清除剂。

本公开的药物组合物的控释或缓释制剂可以使用常规技术制备。本公开的适于经口施用的药物组合物制剂可以以离散固体剂量单位的形式制备、包装或销售，所述离散固体剂量单位包括但不限于片剂、硬胶囊或软胶囊、扁囊剂、锭剂(troche)或糖锭(lozenge)，其各自含有预定量的活性成分。其他适于经口施用的制剂包括但不限于粉末或颗粒制剂、水性或油性悬浮液、水性或油性溶液或乳液。

如本文所用，“油性”液体是包含含碳液体分子并且表现出比水更弱的极性特征的液体。

适于经口施用的本公开的药物组合物的液体制剂可以以液体形式或以旨在用于使用前用水或另一种合适的媒介物重构的干燥产品的形式制备、包装和销售。

液体悬浮液可以使用常规方法制备以实现活性成分在水性或油性媒介物中的悬浮。水性媒介物的实例包括例如水和等渗盐水。油性媒介物的实例包括杏仁油、油酯、乙醇、植物油诸如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油、分馏的植物油和矿物油诸如液体石蜡。液体悬浮液可进一步包含一种或多种额外的成分，其实例包括但不限于悬浮剂、分散剂或润湿剂、乳化剂、缓和剂、防腐剂、缓冲剂、盐、调味剂、着色剂和甜味剂。油性悬浮液可进一步包含增稠剂。已知的悬浮剂的实例包括但不限于山梨糖醇浆、氢化食用脂肪、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶、阿拉伯胶和纤维素衍生物诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素。

已知的分散剂或润湿剂的实例包括但不限于天然存在的磷脂诸如卵磷脂和环氧烷与脂肪酸、与长链脂肪醇、与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯、或与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如分别为聚氧乙烯硬脂酸酯、十七乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯或聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)。

已知的乳化剂的实例包括但不限于卵磷脂和阿拉伯胶。已知的防腐剂的实例包括但不限于甲基、乙基或正丙基对羟基苯甲酸酯，抗坏血酸和山梨酸。已知的甜味剂的实例包括但不限于甘油、丙二醇、山梨醇、蔗糖和糖精。用于油性悬浮液的已知增稠剂的实例包括但不限于蜂蜡、硬石蜡和鲸蜡醇。

活性成分在水性或油性溶剂中的液体溶液可以以与液体悬浮液基本相同的方式制备，主要区别在于活性成分溶解而不是悬浮在溶剂中。本公开的药物组合物的液体溶液可包含关于液体悬浮液描述的各组分，应理解，悬浮剂不一定有助于活性成分在溶剂中的溶解。水性溶剂的实例包括但不限于水和等渗盐水。油性溶剂的实例包括但不限于杏仁油、油酯、乙醇、植物油诸如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油、分馏的植物油和矿物油诸如液体石蜡。

本公开的组合物可以包含额外的成分。如本文所用的，“额外的成分”的实例包括但不限于以下中的一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；造粒剂和崩解剂；粘合剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理学上可降解组合物，例如明胶；水性媒介物和溶剂；油性媒介物和溶剂；悬浮剂；分散剂或润湿剂；乳化剂，缓和剂；缓冲剂；盐；增稠剂；填充剂；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；以及药学上可接受的聚合物或疏水物。可以包括在本公开的药物组合物中的其他“额外的成分”的实例是本领域已知的并且描述于例如Genaro，编，1985，Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.，Easton，Pa.，其通过引用并入本文。

所述药物组合物可以每天几次的频率施用于动物，或者其可以较低频率施用，诸如每天一次，每周一次，每两周一次，每月一次，或甚至更低频率，诸如每数月一次或甚至每年一次或更少。剂量的频率通常由技术人员确定，并且可取决于许多因素，例如但不限于所治疗病况或疾病的类型和严重程度，动物的类型和年龄等。

组合疗法

组合物和治疗方法可以包括共同施用本文公开的一种或多种miR-106b拮抗剂与一种或多种额外的药剂。额外的药剂的实例包括但不限于细胞毒性剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、抗生素、激素、激素拮抗剂、趋化因子、药物、前药、毒素和酶。

额外的药剂的进一步实例包括但不限于(a)抗微生物剂，(b)类固醇(例如，氢化可的松、曲安西龙)；(c)止痛药(例如阿司匹林、NSAID和局部麻醉剂)；(d)抗炎剂；(e)生长因子；(f)细胞因子；(g)激素；(h)用于治疗外周动脉疾病的其他药剂，以及(i)其组合。

在一些实施方案中，一种或多种另外额外的药剂包含另一个miRNA分子的反义寡核苷酸。在一些实施方案中，另一个miRNA分子是miR-93。在一些实施方案中，miR-93包含序列AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(has-miR-93-3p；SEQ ID NO：3)。在一些实施方案中，miR-93包含序列CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(hsa-miR-93-5p；SEQ ID NO：4)。在一些实施方案中，与另一个miRNA分子的组合疗法包括将包含miR-106b拮抗剂的药物组合物施用于主体，例如有此需要的人主体，其中所述药物组合物包含另一个miRNA分子。在一些此类实施方案中，miR-106b拮抗剂与另一个miRNA分子形成双链体。本文还提供了包含miR-106b拮抗剂的药物组合物，其中所述药物组合物进一步包含另一个miRNA分子并且其中miR-106b拮抗剂与另一个miRNA分子形成双链体。在此类药物组合物的一些实施方案中，miR-106b拮抗剂是hsa-miR-106b-5p的反义寡核苷酸，并且与miR-93形成双链体。在此类药物组合物的优选实施方案中，所述药物组合物包含hsa-miR-106b-5p的反义寡核苷酸(例如，包含AUCUGCACUGUCAGCACUUUA(SEQ ID NO：6)的序列的反义寡核苷酸)和包含AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO：3)的miR-93序列的双链体。在此类药物组合物的还有其他实施方案中，所述药物组合物包含hsa-miR-106b-5p的反义寡核苷酸(例如，包含序列AUCUGCACUGUCAGCACUUUA(SEQ ID NO：6)的反义寡核苷酸)和包含CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO：4)的miR-93序列的双链体。

在一些实施方案中，方法还包括使用治疗分子，其包括但不限于任何药物或药品。药物的实例包括但不限于麻醉药、催眠药、镇静剂和睡眠诱导剂、抗精神病药、抗抑郁药、抗过敏药、抗心绞痛剂、抗关节炎药、平喘药、抗糖尿病药、止泻药、抗惊厥药、抗痛风药、抗组胺药、止痒药、催吐药、止吐药、抗痉挛剂、食欲抑制剂、神经活性物质、神经递质激动剂、拮抗剂、受体阻断剂和重摄取调节剂、β-肾上腺素能药物阻断剂、钙通道阻断剂、双硫仑和双硫仑类药物、肌肉松弛药、镇痛药、解热药、兴奋剂、抗胆碱酯酶药剂、拟副交感神经药剂、激素、抗凝药、抗血栓药、溶栓剂、免疫球蛋白、免疫抑制剂、激素激动剂/拮抗剂、维生素、抗微生物剂、抗肿瘤药、抗酸药、消化剂、缓泻药、泻药、抗菌剂、利尿药、消毒剂、杀真菌剂、杀外寄生物药、抗寄生虫药、重金属、重金属拮抗剂、螯合剂、气体和蒸气、生物碱类、盐、离子、自体有效物质、洋地黄、强心苷、抗心律失常药、抗高血压药、血管扩张剂、血管收缩剂、抗毒蕈碱药、神经节刺激剂、神经节阻断剂、神经肌肉阻断剂、肾上腺素能神经抑制剂、抗氧化剂、维生素、化妆品、消炎药、伤口护理产品、抗血栓形成剂、抗肿瘤剂、抗血管生成剂、麻醉药、抗原性药剂、伤口愈合试剂、植物提取物、生长因子类、软化剂、保湿剂、排斥反应/抗排斥反应药物、杀精剂、调理剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗生素、镇静剂、胆固醇降低药物、止咳药、组胺-阻断药、和单胺氧化酶抑制剂。还可以包括美国药典列出的所有物质。

下面提供了药物类型以及其用途可以涵盖在本公开内容内的类别内的具体药物的列表；该列表旨在提供非限制性实例。

抗微生物剂包括：磺胺嘧啶银、制霉菌素、制霉菌素/曲安西龙、杆菌肽、呋喃西林、呋喃妥因、多粘菌素(例如粘菌素、表面活性素(Surfactin)、多粘菌素E和多粘菌素B)、多西环素、抗微生物肽(例如天然和合成来源)、新孢霉素(即杆菌肽、多粘菌素B和新霉素)、多孢菌素(Polysporin)(即杆菌肽和多粘菌素B)。额外的抗微生物剂包括局部抗微生物剂(即防腐剂)，其实例包括银盐、碘、苯扎氯铵、酒精、过氧化氢和氯己定。

止痛剂：对乙酰氨基酚、盐酸阿芬太尼、氨基苯甲酸钾、氨基苯甲酸钠、阿尼多昔、阿尼利定、盐酸阿尼利定、盐酸阿尼洛泮、阿尼罗酸、安替比林、阿司匹林、苯恶洛芬、盐酸苄达明、盐酸比西发定、盐酸布芬太尼、马来酸溴朵林、溴芬酸钠、盐酸丁丙诺啡、布他西丁、布替西雷、布托啡诺、酒石酸布托啡诺、卡马西平、卡巴匹林钙、盐酸卡比芬、柠檬酸卡芬太尼、琥珀酸环丙法多、西拉马朵、盐酸西拉马朵、氯尼舍林、氯尼辛、可待因、磷酸可待因、硫酸可待因、盐酸Conorphone、环唑辛、盐酸右奥沙屈、右培美酸、地左辛、二氟尼柳、酒石酸双氢可待因、二甲法登、安乃近、盐酸多匹可明、氨甲茚酮、盐酸依那朵林、甲嘧啶唑、酒石酸麦角胺、盐酸依托沙秦、依托芬那酯、丁香酚、非诺洛芬、非诺洛芬钙、枸椽酸芬太尼、夫洛非宁、氟苯沙酸、氟苄烟酸、氟尼辛葡甲胺、马来酸氟吡汀、氟丙喹宗、盐酸氟朵林、氟比洛芬、盐酸氢吗啡酮、异丁芬酸、吲哚布洛芬、酮佐辛、酮啡诺、酮咯酸氨丁三醇、盐酸来替米特、左醋美沙朵(Levomethadyl Acetate)、盐酸左醋美沙朵、盐酸左南曲朵、酒石酸羟甲左吗喃、盐酸洛非咪唑、草酸洛芬太尼、洛西那朵、氯诺昔康、水杨酸镁、甲芬那酸、盐酸美纳比坦(Menabitan Hydrochloride)、盐酸哌替啶、盐酸美普他酚、盐酸美沙酮、乙酸美沙多、甲氧夫啉、左美丙嗪、醋酸美克法胺(Metkephamid Acetate)、盐酸米姆本、盐酸米芬太尼、吗林那宗、硫酸吗啡、甲氧唑辛、盐酸纳比坦、盐酸纳布啡、盐酸纳美酮、纳莫雷特、盐酸南曲朵、萘普生、萘普生钠、萘普索、盐酸奈福泮、盐酸奈西利定、盐酸诺美沙朵、盐酸奥芬太尼、奥他酰胺、奥伐尼、富马酸奥昔托隆、羟考酮、盐酸羟考酮、对苯二甲酸羟考酮、盐酸羟吗啡酮、培美酸、戊吗酮、喷他佐辛、盐酸喷他佐辛、乳酸喷他佐辛、盐酸非那吡啶、盐酸非尼拉朵、盐酸Picenadol、匹那朵林、吡非尼酮、吡罗昔康乙醇胺、马来酸普拉多林、盐酸普罗地定(Prodilidine Hydrochloride)、盐酸普罗法朵、富马酸丙吡兰(Propirarn Fumarate)、盐酸丙氧芬、萘磺酸丙氧芬、普罗沙唑、柠檬酸普罗沙唑、酒石酸普罗啡烷、盐酸吡咯利芬、盐酸瑞芬太尼、水杨酸胆碱硫酸镁、马来酸沙塞米胺(Salethamide Maleate)、水杨酰胺、水杨酸葡甲胺、水杨酰水杨酸、水杨酸钠、甲磺酸螺朵林、舒芬太尼、柠檬酸舒芬太尼、他美辛、他尼氟酯、他洛沙酯、琥珀酸他扎朵林、替布费龙、四氢甲吲胺、替呋酸钠、盐酸替利定、硫平酸、甲磺酸托那佐辛、盐酸曲马多、盐酸曲芬太尼、三乙醇胺、盐酸维拉朵林、盐酸维立洛泮、伏拉佐辛、甲磺酸佐尔啡诺、盐酸赛拉嗪、甲磺酸Zenazocine、佐美酸钠、珠卡赛辛。

抗高血压药：盐酸Aflyzosin、阿立帕米、阿尔噻嗪、盐酸甲氧胺喹啉、苯磺酸氨氯地平、马来酸氨氯地平、醋酸阿那立肽、马来酸阿替丙嗪、贝磷地尔、贝米曲啶、甲磺酸苯达洛尔、苄氟噻嗪、苄噻嗪、盐酸倍他索洛尔、硫酸倍他尼定、盐酸贝凡洛尔、盐酸二氯地尔、比索洛尔、富马酸比索洛尔、盐酸布新洛尔、丁吡考胺、布噻嗪、坎沙曲、坎沙曲拉、卡托普利、卡维地洛、西罗普利、氯噻嗪钠、西氯他宁、西拉普利、可乐定、盐酸可乐定、氯帕胺、环戊甲噻嗪、环噻嗪、达罗地平、硫酸异喹胍、盐酸地拉普利、氯氨磺苯酰胺、二氮嗪、盐酸地来洛尔、苹果酸地尔硫卓、地替吉仑、甲磺酸多沙唑嗪、依卡曲尔、马来酸依那普利、依那普利拉、依那吉仑、甲磺酸恩屈嗪、依匹噻嗪、依普罗沙坦、甲磺酸依普罗沙坦、甲磺酸非诺多泮、马来酸黄酮地洛、氟地平、氟司喹南、福辛普利钠、福辛普利拉、胍那苄、醋酸胍那苄、硫酸胍那克林、硫酸胍那决尔、胍氰定、单硫酸胍乙啶、硫酸胍乙啶、盐酸胍法辛、硫酸胍尼索喹、硫酸胍氯酚、盐酸胍诺克丁、胍诺沙苄、硫酸胍生、硫酸胍诺西芬、盐酸肼屈嗪、肼屈嗪Polistirex、氢氟噻嗪、茚达立酮、吲达帕胺、盐酸吲哚普利(IndolaprifHydrochloride)、吲哚拉明、盐酸吲哚拉明、盐酸吲哚瑞酯、拉西地平、来尼喹新、左旋克罗卡林(Levcromakalim)、赖诺普利、盐酸洛非西定、氯沙坦钾、盐酸洛硫嗪、美布氨酯、盐酸美加明、美沙洛尔、盐酸美沙洛尔、美沙噻嗪、甲氯噻嗪、甲基多巴、盐酸甲基多巴乙酯(Methyldopate Hydrochloride)、美替洛尔、美托拉宗、富马酸美托洛尔、琥珀酸美托洛尔、甲酪氨酸、米诺地尔、马来酸莫那匹尔、莫唑胺、奈必洛尔、尼群地平、奥福宁、盐酸帕吉林、帕佐昔特、盐酸培兰色林、特丁胺培哚普利、盐酸酚苄明、吡那地尔、匹伏普利、泊利噻嗪、盐酸哌唑嗪、普米洛尔、盐酸普齐地洛、盐酸喹那普利、喹那普利特、盐酸喹唑嗪、盐酸喹洛雷、盐酸喹吡罗、奎纽溴铵、雷米普利、蛇根木(Rauwolfia Serpentina)、利血平、沙普立沙坦钾、醋酸肌丙抗增压素、硝普钠、盐酸硫氧洛尔、他索沙坦、盐酸替鲁地平、盐酸替莫普利，盐酸特拉唑嗪、特拉吉仑、噻美尼定、盐酸噻美尼定、替尼酸、替大麻酚、硫达唑嗪、盐酸蒂喷托辛、三氯噻嗪、盐酸曲马唑嗪、樟磺咪芬、盐酸曲莫沙明、曲帕胺、希帕胺、盐酸Zankiren、精氨酸佐芬普利。

消炎药：阿氯芬酸、双丙酸阿氯米松、丙缩阿尔孕酮、阿尔法淀粉酶、安西法尔、安西菲特、氨芬酸钠、盐酸氨普立糖；阿那白滞素；阿尼罗酸；阿尼扎芬；阿扎丙宗、巴柳氮二钠、苄达酸、苯恶洛芬、盐酸苄达明、菠萝蛋白酶、溴哌莫、布地奈德、卡洛芬、环洛芬、辛喷他宗、克利洛芬、丙酸氯倍他索、丁酸倍氯他松、氯吡酸、丙酸氯硫卡松、醋酸可米松、去氧可的松、地夫可特、地奈德、去羟米松、双丙酸地塞米松、双氯芬酸钾、双氯芬酸钠、双醋酸双氟拉松、二氟米酮钠、二氟尼柳、二氟泼尼酯、双酞嗪酮、二甲基亚砜、羟西奈德、恩甲羟松(Endrysone)、恩莫单抗、艾洛利康钠、甲嘧啶唑、依托度酸、依托芬那酯、联苯乙酸、非那莫、芬布芬、芬氯酸、苯克洛酸、芬度柳、奋匹帕隆、芬替酸、夫拉扎酮、氟扎可特、氟芬那酸、氟鲁咪唑、醋酸氟尼缩松、氟尼辛、氟尼辛葡甲胺、氟可丁丁酯、醋酸氟米龙、氟喹宗、氟比洛芬、氟瑞托芬、丙酸氟替卡松、呋喃洛芬、呋罗布芬、哈西奈德、丙酸氯倍他索、醋酸卤泼尼松、异丁芬酸、布洛芬、布洛芬铝、布洛芬吡甲酯、伊洛达普、消炎痛、吲哚美辛钠、吲哚布洛芬、吲哚克索、吲四唑、醋酸异氟泼尼龙、伊索克酸、伊索昔康、酮洛芬、盐酸洛非咪唑、氯诺昔康、依碳氯替泼诺、甲氯灭酸钠、甲氯灭酸、二丁酸甲氯松、甲芬那酸、美沙拉嗪、美西拉宗、磺庚甲泼尼龙、Momiflumate、萘丁美酮、萘普生、萘普生钠、萘普索、尼马宗、奥沙拉嗪钠、奥古蛋白、奥帕诺辛、奥沙普秦、羟布宗、盐酸瑞尼托林、木聚硫钠、甘油保泰松钠、吡非尼酮、吡罗昔康、肉桂酸吡罗昔康、吡罗昔康乙醇胺、吡洛芬、泼那扎特、普立非酮、普罗度酸、普罗喹宗、普罗沙唑、柠檬酸普罗沙唑、瑞美松龙、氯马扎利、柳胆来司、沙那西定、双水杨酯、血根氯铵、塞克那唑、丝美辛、舒多昔康、舒林酸、舒洛芬、他美辛、他尼氟酯、他洛沙酯、特丁非隆、替尼达普、替尼达普钠、替诺昔康、替昔康、苄叉异喹酮、四氢达明(Tetrydamine)、硫平酸、特戊酸硫氢可的松(Tixocortol Pivalate)、痛灭定、痛灭定钠、三氯奈德、三氟氨酯、齐多美辛、佐美酸钠。

在一些实施方案中，施用有效量的至少一种可用于增强伤口愈合的生长因子、细胞因子、激素或细胞外基质化合物或蛋白。在一个方面，使用这些药剂的组合。在一个方面，可用于实施本公开的生长因子的实例包括但不限于EGF、PDGF、GCSF、IL6、IL8、IL10、MCP1、MCP2、组织因子、FGFb、KGF、VEGF、PLGF、MMP1、MMP9、TIMP1、TIMP2、TGF.β和HGF。本领域普通技术人员将理解，所使用的生长因子、细胞因子、激素或细胞外基质蛋白的选择将根据诸如所治疗的损伤、疾病或病症的类型、主体的年龄、健康、性别和重量等标准而变化。在一个方面，所述生长因子、细胞因子、激素以及细胞外基质化合物和蛋白是人的。

可以掺入或作为添加剂包含在包含本公开化合物的组合物中的蛋白和其他生物活性化合物的实例包括但不限于胶原蛋白(包括交联的胶原蛋白)、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白(包括交联的弹性蛋白)、骨桥蛋白、骨连接蛋白、骨唾液酸蛋白(Bsp)、α-2HS-糖蛋白、骨Gla-蛋白(Bgp)、基质Gla-蛋白、骨磷酸糖蛋白、骨磷蛋白、骨蛋白聚糖、原生脂质(protolipids)、骨形态发生蛋白、软骨诱导因子、骨骼生长因子、酶或其组合和生物活性片段。减弱免疫应答的佐剂也可以与本公开的复合物组合使用。

可用作本公开中的化合物或物质的其他分子的实例包括但不限于生长激素、瘦素、白血病抑制因子(LIF)、肿瘤坏死因子α和β、内皮抑素、血管抑素、血小板反应蛋白、成骨蛋白-1、骨形态发生蛋白2和7、骨连接素、生长调节素样肽、骨钙素、干扰素α、干扰素αA、干扰素β、干扰素γ、干扰素1α和白介素2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17和18。涉及氨基酸、肽、多肽和蛋白的实施方案可以包括任何大小和复杂性的任何类型的此类分子以及此类分子的组合。

实施例

以下是用于实施本公开的具体实施方案的实施例。提供所述实施例仅用于说明目的，并不旨在以任何方式限制本公开的范围。已努力确保关于所用数字(例如量、温度等)的准确性，但当然应当允许一些实验误差和偏差。

除非另有指明，否则本公开的实践将采用本领域技术范围内的蛋白化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。此类技术在文献中充分解释。参见，例如，T.E.Creighton，Proteins.：Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman和Company，1993)；A.L.Lehninger，Biochemistry(Worth Publishers，Inc.，当前增补版)；Sambrook，等人，Molecular Cloning.：ALaboratory Manual(第2版，1989)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)；Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版(Easton，Pennsylvania：Mack Publishing Company，1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)Vols A和B(1992)。

材料和方法

目标分于和双链体：可以在以下实施例中测试以下分子或双链体中的一种或多种：

(1)miR-106b的拮抗剂，例如反义寡核苷酸(例如反义RNA寡核苷酸。例如，

i.“分子1：”包含或具有序列AUCUGCACUGUCAGCACUUUA(SEQ ID NO：6)的RNA寡核苷酸

(2)miR-93分子。例如，

i.“分子2：”包含或具有序列AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO：3)的RNA寡核苷酸

ii“分子3：”包含或具有序列CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO：4)的RNA寡核苷酸

(3)(a)hsa-miR-106b的反义寡核苷酸和(b)另一个核酸分子，例如，具有miR-93序列的另一个核酸分子的双链体。例如，

i.“双链体1：”分子1与包含或具有序列AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO：3)的RNA寡核苷酸一起形成双链体

ii“双链体2：”分子1与具有序列CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO：4)的RNA寡核苷酸一起形成双链体

尽管任何双链体诸如双链体1和双链体2可以以双链体形式提供给主体，但在一些实施方案中，所述双链体一旦在主体体内就可以解离成分开的链。例如，在一些实施方案中，双链体1和2可以在主体体内分离成分子1和另一个RNA寡核苷酸。

在一些实施方案中，分子1、双链体1和/或双链体2的施用或递送导致miR-106b的敲低。在一些实施方案中，双链体1和/或双链体的施用或递送导致miR-93的过表达。

在一些实施例中，将来自使用分子1、分子2和/或分子3的实验的结果与来自使用双链体1或双链体2的实验的结果进行比较。在一些实施例中，与使用分子1、2或3的实验相比，在使用双链体1或双链体2的实验中可以观察到更优的结果。

小鼠后肢缺血模型和灌注恢复的监测：动物研究由机构动物护理委员会批准，并符合美国国立卫生研究院(US National Institute of Health)出版的实验动物护理和使用指南。诱导麻醉(氯胺酮90mg/kg和赛拉嗪10mg/kg)后，对8-12周龄雄性C57B1/6J或BALB/cJ小鼠进行单侧股动脉结扎和切除。在手术后第0、3、7、14和21天使用激光多普勒成像(Perimed，Inc.)测量灌注恢复。对于每只小鼠，将缺血肢体中的灌注针对非缺血肢体中的灌注归一化。

微RNA微阵列：在手术后第3天从C57B1/6J和BALB/cJ小鼠(n＝3/组)收集腓肠肌。使用TRIzol^TM总转录组分离方案和Pure Link RNA Mini试剂盒遵循制造商的说明(LifeTechnologies，Carlsbad，Calif.)分离RNA。将RNA等分成50μg量，并使用含有380种小鼠微RNA的Illumina微RNA芯片(V2 Micro-RNA表达概况分析试剂盒；miRbase9.1)完成阵列。差异表达的微RNA基于通过缺血和张力(strain)的组合调节或通过单独的缺血或张力调节来进行分选。

mRNA微阵列：对于缺血和非缺血组织之间的小鼠mRNA阵列，在后肢缺血(HLI)后第3天收获来自BALB/cJ小鼠(n＝3/组)的腓肠肌。使用TRIzol^TM总转录组分离方案提取总RNA。在质量控制后，将RNA等分成50μg等份试样，并使用Gene Chip小鼠基因组43-2.0完成阵列。对于HUVEC mRNA阵列，在用乱序序列或用antimiR-106转染HUVEC后，分离来自HUVEC的RNA，并在缺氧和血清饥饿条件下孵育24小时(转染后总共48小时)。使用Illumina Human 6V1平台完成阵列。使用Illumina的Genome Studio获得未归一化数据。使用R和beadarray包完成质量控制、预处理和分位数归一化。使用来自Broad Institute的GSEA V 2.0，使用100种排列和<0.25的FDR截止值，完成基因集富集的分析。

miR-106b的体内敲低：合成AntagomiR-106b和乱序序列。寡聚物序列如下：AntagomiR-106b：5′-AUCUGCACUGUCAGCACUUUA-3′(SEQ ID NO：6)。乱序物：5′-AAGGCAAGCUGACCCUGAAGUU-3′(SEQ ID NO：10)。将寡聚物溶解在PBS中，并以8mg/kg体重的剂量眼眶后注射。在HLI前30分钟和HLI后第7天和14天给予注射。为了检测体内敲低的效率，在第0、3和7天对单独一组的小鼠进行安乐死，并使用实时qPCR定量miR-106b表达。

细胞培养：购买合并的HUVEC(Cell Applications Inc，San Diego，Calif.)，并在含有10％FBS的标准内皮细胞生长培养基(Cell Applications Inc，San Diego，Calif)中生长。C2C12细胞在含有10％FBS的DMEM上培养。对于体外转染研究，使用用neofx转染剂(Ambion，Austin，Tex.)的反向转染方案。AntimiR-106b、miRNA抑制剂阴性对照(目录号44640760)、premiR-106b或miRNA模拟阴性对照(目录号4464058)购自Ambion，Austin，Tex。对HUVEC和C2C12细胞进行初始剂量应答实验，以确定用于有效敲低miR-106b的剂量和时间进程。基于这些实验，使用剂量为15nM的antimiR-106b或premiR-106b及其各自的对照来在HUVEC中敲低或过表达miR-106b。对于C2C12细胞，对于antimiR-106b或premiR-106b及其各自的对照使用120nM的剂量。转染后48小时进行细胞增殖、管形成和凋亡测定。

细胞凋亡：对于HUVEC，将细胞以1x10⁴个细胞/孔的密度铺板在96孔板中，并且对于C2C12细胞，将细胞以0.5x10⁴(对于premiR-106b相对于乱序物)或1x10⁵(乱序物相对于AntimiR-106b)的密度铺板。转染24小时后，将miR-106b调节的细胞暴露于缺氧(2％氧气，BioSpherix，Lacona，N.Y.)和血清饥饿(HSS)，以在体外模拟缺血。将HUVEC暴露于48小时的HSS，而将C2C12细胞暴露于3小时的HSS。基于初步实验选择C2C12细胞暴露于HSS的较短时程，所述初步实验显示，C2C12细胞伴随HSS的较长持续时间显示出显著的细胞死亡。在孵育结束时，使用TUNEL测定法(TiterTACS，Trevigen Gaithersburg，Md.)测定细胞的凋亡。TACS核酸酶处理的孔用作阳性对照，而未添加TdT的孔用作阴性对照。每个实验至少重复三次。

细胞增殖：将细胞铺板在96孔板中，对于HUVEC，铺板密度为5x10³个细胞/孔，且对于C2C12细胞，密度为0.5x10³(对于premiR-106b相对于乱序物)或1x10³(乱序物相对于AntimiR-106b)。使用四唑染料掺入(BioVision，Milpitas，Calif.)，并通过台盼蓝染色后进行手动细胞计数以排除死细胞，在铺板后48和72小时评价细胞增殖。实验重复三次。

体外血管生成测定：转染48小时后，将miR-106b调节的HUVEC铺板在基质胶上以评价管形成。将PremiR-106b或乱序物转染的细胞以30,000个细胞/孔的细胞密度铺板在48孔板中的生长因子减少的基质胶(目录号356231，BD Biosciences，Bedford，Mass.)上，并在0％或5％低血清生长培养基(LifeTechnologies，NY)的条件下培养细胞。类似地，将antimiR-106b或乱序物转染的细胞铺板在富含生长因子的基质胶(目录号356234，BDBiosciences，Bedford，Mass.)上，并在0％或5％内皮细胞生长因子混合物(EGM CC-3124，Lonza，Allendale，NJ)的条件下生长。在铺板后6小时评价内皮细胞管形成。每个条件一式三份进行。在100倍放大倍率下，从每个孔拍摄四张代表性图片，并对完整的管总数进行计数并表示为每平方mm的管数。

毛细血管密度：为了评价毛细血管密度，在HLI后21天，将来自premiR-106b和乱序物处理的BALB/cJ小鼠的缺血腓肠肌在OCT化合物中快速冷冻，并以7μm厚度切片。首先切片用5％正常山羊血清封闭，且然后与大鼠抗CD31抗体(1：25，BD Biosciences目录号550274)在4℃下孵育过夜。然后将切片用PBS洗涤，并用Alexa-555缀合的山羊抗大鼠IgG以1：25稀释度在室温下探测1小时。切片用PBS洗涤并用Vectashield封固剂(Vector Lab，Burlingame，Calif.)封固。使用没有一抗的单独二抗作为阴性对照来评价非特异性结合。使用Olympus BX51高放大倍率显微镜在400倍放大倍率下拍摄每个切片的三张代表性图片。计数CD31阳性斑点/视野的总数和肌纤维/视野的总数，并且毛细血管表示为CD31阳性斑点/肌纤维。

实施例1：培养细胞中miR-106b的敲低和/或miR-93的过表达

在HUVEC和C2C12细胞中，将miR-106b敲低和/或miR-93过表达。乱序antimir序列用作对照。如上所述培养HUVEC和C2C12细胞，并用antimiR-106b(例如，分子1)、miR-93分子(例如，分子2或分子3)、双链体(例如，双链体1或双链体2)或乱序antimiR-106b序列处理。评价转染后的miR-106b水平和/或miR-93。miR-106b减少至少50％将表明显著减少；miR-93增加至少50％将表明显著增加。

在HSS后，评价miR-106b敲低对胱天蛋白酶-9(HUVEC和C2C12细胞两者中的凋亡标志物)的影响和/或miR-93过表达对胱天蛋白酶-9(HUVEC和C2C12细胞两者中的凋亡标志物)的影响。转染后胱天蛋白酶-9的减弱表明，在内皮和骨骼肌细胞两者中，miR-106b敲低和/或miR-93过表达介导响应于HSS的细胞存活。

将来自用双链体1或双链体2转染的细胞的结果与用分子1、分子2或分子3转染的细胞的结果进行比较。

实施例2：分子和/或双链体对细胞增殖的影响

对缺血的血管生成应答包括内皮细胞存活、增殖和迁移。根据本文公开的方法研究分子1、分子2、分子3、双链体1和/或双链体2对细胞增殖(例如，在内皮细胞和C2C12细胞中)的影响。(参见，例如，上文的“材料和方法”。)将来自用双链体1或双链体2转染的细胞的结果与用分子1、分子2或分子3转染的细胞的结果进行比较。

实施例3：分子和/或双链体对后肢缺血后灌注恢复的影响

用全身递送的分子1、分子2、分子3、双链体1和/或双链体2处理小鼠以测试mir-106b拮抗作用和/或miR-93过表达是否调节对HLI的应答。乱序物处理的小鼠用作对照。在手术前30分钟给予分子1、分子2、分子3、双链体1和/或双链体2的单次静脉注射。

从第-1天开始以及在后来的时间点(例如，在注射后7天)评价对miR-106b表达(例如，表达的敲低)和/或miR-93表达(例如，过表达)的影响。在HLI的第0、7和14天注射分子1、分子2、分子3、双链体1和/或双链体2或乱序序列，并使用多普勒成像监测灌注恢复。与HLI后乱序物处理的小鼠相比，antagomiR-106b(例如分子1)处理的小鼠中的灌注恢复改善表明，抑制miR-106b有效地增强灌注恢复。

将来自双链体1或双链体2处理的小鼠的结果与用分子1、分子2或分子3处理的小鼠的结果进行比较。

实施例4：分子和双链体对体内多个基因的影响

p21、p53和E2F-1在缺血肌肉中相对于非缺血性肌肉中上调。用分子1、分子2、分子3、双链体1和/或双链体2处理BALB/cJ小鼠，并与乱序物处理的小鼠中的相比来评价p21、p53和E2F-1表达。用分子1、分子2、分子3、双链体1或双链体2处理的小鼠中p21、p53和E2F-1的下调(但在乱序物处理的小鼠中不是如此)表明miR-106b敲低和/或miR-93在体内调节这些基因。

将来自双链体1或双链体2处理的小鼠的结果与来自用分子1、分子2或分子3处理的小鼠的结果进行比较。

实施例5：分子和双链体对miR-106b介导的内皮分支抑制的影响

根据本文描述的体外血管生成测定法评价miR-106b敲低和/或miR-93过表达对基质胶模型中内皮细胞管形成的影响。miR-106b使内皮细胞管形成减少约50％。

在本实施例中，评价分子1、分子2、分子3、双链体1和/或双链体2对内皮细胞管形成的影响。miR-106b对内皮细胞管形成的影响的逆转将表明miR-106b敲低和/或miR-93表达在体外的促血管生成作用。

将来自用双链体1或双链体2的实验的结果与来自用分子1、分子2或分子3的实验的结果进行比较。

尽管已经参考优选实施方案和各种替代实施方案具体显示和描述了本发明，但相关领域的技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在其中进行形式和细节的各种改变。

出于所有目的，在本说明书正文中引用的所有参考文献、发布的专利和专利申请都在此以其整体通过引用并入。

编号实施方案

实施方案1：治疗或预防与缺血相关的疾病、病症、损伤或病况的方法，所述方法包括向有此需要的主体施用药物组合物，所述药物组合物包含有效量的miRNA表达、水平或活性的拮抗剂、药学上可接受的载体，其中所述miRNA是miR-106b，由此治疗所述与缺血相关的疾病、病症或病况。

实施方案2：实施方案1的方法，其中所述miR-106b是人miR-106b。

实施方案3：实施方案2的方法，其中所述人miR-106b是包含序列UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU(SEQ ID NO：1)的人miR-106b-5p。

实施方案4：实施方案2的方法，其中所述人miR-106b是包含序列CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC(SEQ ID NO：2)的人miR-106b-3p。

实施方案5：前述实施方案中任一项的方法，其中所述拮抗剂是反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含与成熟miR-106b的一部分完全或部分互补的序列，使得所述反义寡核苷酸结合miR-106b。

实施方案6：前述实施方案中任一项的方法，其中所述反义寡核苷酸包含DNA。

实施方案7：前述实施方案中任一项的方法，其中所述反义寡核苷酸包含RNA。

实施方案8：前述实施方案中任一项的方法，其中所述反义寡核苷酸是miR-106b的antagomir。

实施方案9：前述实施方案中任一项的方法，其中所述反义寡核苷酸包含一个或多个核苷酸类似物。

实施方案10：实施方案9的方法，其中所述一个或多个核苷酸类似物包含LNA。

实施方案11：前述实施方案中任一项的方法，其中所述反义寡核苷酸能够与成熟miR-106b分子形成双链体，所述双链体具有至少约60℃的T_m。

实施方案12：前述实施方案中任一项的方法，其中所述反义寡核苷酸能够与另一个单链RNA核酸分子形成双链体，所述双链体具有小于约60℃、小于约50℃、小于约45℃、小于约40℃、小于约37℃、小于约35℃、小于约30℃或小于约25℃的T_m。

实施方案13：前述实施方案中任一项的方法，其中所述拮抗剂降低miR-106b表达、水平或活性。

实施方案14：前述实施方案中任一项的方法，其进一步包括向所述主体施用额外的治疗剂。

实施方案15：实施方案14的方法，其中所述额外的治疗剂包括抗缺血剂。

实施方案16：前述实施方案中任一项的方法，其中所述拮抗剂由分离的核酸或包含分离的核酸的载体编码。

实施方案17：实施方案16的方法，其中所述载体是选自miRNA表达载体或AAV表达载体的表达载体。

实施方案18：实施方案17的方法，其中所述表达载体是miRNA表达载体。

实施方案19：实施方案15的方法，其中所述分离的核酸可操作连接至细胞特异性启动子。

实施方案20：前述实施方案中任一项的方法，其中所述拮抗剂被封装在脂质媒介物内。

实施方案21：前述实施方案中任一项的方法，其中所述有效量有效地降低所述主体的内皮或肌肉细胞中的至少一种细胞周期途径基因的表达，或减弱所述主体的内皮或肌肉细胞中的至少一种细胞周期途径基因的缺血诱导的上调。

实施方案22：实施方案21的方法，其中所述细胞周期途径基因选自E2F-1和p53。

实施方案23：实施方案16-22中任一项的方法，其中所述表达是在骨骼肌细胞中。

实施方案24：前述实施方案中任一项的方法，其中所述有效量有效地增强所述主体的灌注恢复。

实施方案25：前述实施方案中任一项的方法，其中所述有效量有效地增强所述主体中对缺血的血管生成应答。

实施方案26：前述实施方案中任一项的方法，其中所述有效量有效地刺激细胞增殖。

实施方案27：实施方案26的方法，其中所述细胞增殖包括内皮细胞或肌肉细胞的增殖。

实施方案28：前述实施方案中任一项的方法，其中所述有效量有效地增加所述主体的毛细血管密度。

实施方案29：前述实施方案中任一项的方法，其中所述有效量有效地抑制所述主体中一种或多种细胞的凋亡。

实施方案30：实施方案29的方法，其中所述凋亡是缺氧诱导的凋亡。

实施方案31：前述实施方案中任一项的方法，其中所述施用通过选自以下的途径进行：经口、经颊、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道、眼、肺、直肠、胸骨内注射、肾透析输注和肠胃外。

实施方案32：实施方案31的方法，其中所述施用是肌内施用。

实施方案33：前述实施方案中任一项的方法，其中所述主体是人。

实施方案34：前述实施方案中任一项的方法，其中所述缺血选自血管缺血、肌肉缺血、外周动脉疾病、缺血再灌注损伤、与外伤相关的缺血、和脑缺血，任选地其中所述缺血是外周动脉疾病。

实施方案35：药物组合物，其包含有效量的miRNA表达、水平或活性的拮抗剂、药学上可接受的载体，其中所述miRNA是miR-106b，以及药学上可接受的载体。

实施方案36：实施方案35的药物组合物，其中所述miR-106b是人miR-106b。

实施方案37：实施方案36的药物组合物，其中所述人miR-106b是包含序列UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU(SEQ ID NO：1)的人miR-106b-5p。

实施方案38：实施方案36的药物组合物，其中所述人miR-106b是包含序列CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC(SEQ ID NO：2)的人miR-106b-3p。

实施方案39：实施方案35-38中任一项的药物组合物，其中所述拮抗剂是反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含与成熟miR-106b的一部分完全或部分互补的序列，使得所述反义寡核苷酸结合miR-106b。

实施方案40：实施方案35-39中任一项的药物组合物，其中所述反义寡核苷酸包含DNA。

实施方案41：实施方案35-40中任一项的药物组合物，其中所述反义寡核苷酸包含RNA。

实施方案42：实施方案35-41中任一项的药物组合物，其中所述反义寡核苷酸是miR-106b的antagomir。

实施方案43：实施方案35-42中任一项的药物组合物，其中所述反义寡核苷酸包含一个或多个核苷酸类似物。

实施方案44：实施方案43的药物组合物，其中所述一个或多个核苷酸类似物包含LNA。

实施方案45：实施方案35-44中任一项的药物组合物，其中所述反义寡核苷酸能够与成熟miR-106b分子形成双链体，所述双链体具有至少约60℃的T_m。

实施方案46：实施方案35-45中任一项的药物组合物，其中所述反义寡核苷酸能够与另一个单链RNA核酸分子形成双链体，所述双链体具有小于约60℃、小于约50℃、小于约45℃、小于约40℃、小于约37℃、小于约35℃、小于约30℃或小于约25℃的T_m。

实施方案47：实施方案35-46中任一项的药物组合物，其中所述拮抗剂降低miR-106b表达、水平或活性。

实施方案48：实施方案35-47中任一项的药物组合物，其进一步包含额外的治疗剂。

实施方案49：实施方案48的药物组合物，其中所述额外的治疗剂包括抗缺血剂。

实施方案50：实施方案35-49中任一项的药物组合物，其中所述拮抗剂由分离的核酸或包含分离的核酸的载体编码。

实施方案51：实施方案50的药物组合物，其中所述载体是选自miRNA表达载体或AAV表达载体的表达载体。

实施方案52：实施方案51的药物组合物，其中所述表达载体是miRNA表达载体。

实施方案53：实施方案50的药物组合物，其中所述分离的核酸可操作连接至细胞特异性启动子。

实施方案54：实施方案35-53中任一项的药物组合物，其中所述拮抗剂被封装在脂质媒介物内。

实施方案55：实施方案35-54中任一项的药物组合物，其中所述有效量有效地降低所述主体的内皮或肌肉细胞中的至少一种细胞周期途径基因的表达。

实施方案56：实施方案55的药物组合物，其中所述细胞周期途径基因选自E2F-1和p53。

实施方案57：实施方案55或56的药物组合物，其中所述表达是在骨骼肌细胞中。

实施方案58：实施方案35-57中任一项的药物组合物，其中所述有效量有效地增强所述主体的灌注恢复。

实施方案59：实施方案35-58中任一项的药物组合物，其中所述有效量有效地增强所述主体中对缺血的血管生成应答。

实施方案60：实施方案35-59中任一项的药物组合物，其中所述有效量有效地刺激细胞增殖。

实施方案61：实施方案60的药物组合物，其中所述细胞增殖包括内皮细胞或肌肉细胞的增殖。

实施方案62：实施方案35-61中任一项的药物组合物，其中所述有效量有效地增加所述主体的毛细血管密度。

实施方案63：实施方案35-62中任一项的药物组合物，其中所述有效量有效地抑制所述主体中一种或多种细胞的凋亡。

实施方案64：实施方案63的药物组合物，其中所述凋亡是缺氧诱导的凋亡。

实施方案65：实施方案35-64中任一项的药物组合物，其被配制用于通过选自以下的途径施用：经口、经颊、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道、眼、肺、直肠、胸骨内注射、肾透析输注和肠胃外。

实施方案66：实施方案65的药物组合物，其中所述施用是肌内施用。

实施方案67：药剂盒，其包含实施方案35-66中任一项的药物组合物和用于在有此需要的主体中治疗或预防与骨骼肌缺血相关的疾病、病症、损伤或病况的说明书，其中所述疾病、病症、损伤或病况是外周动脉疾病。

实施方案68：分离的核酸，其包含miR-106b的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸是miR-106b antagomir。

实施方案69：实施方案68的分离的核酸，其中所述miR-106b是人miR-106b。

实施方案70：实施方案69的分离的核酸，其中所述人miR-106b是包含序列UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU(SEQ ID NO：1)的人miR-106b-5p。

实施方案71：实施方案69的分离的核酸，其中所述人miR-106b是包含序列CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC(SEQ ID NO：2)的人miR-106b-3p。

实施方案72：实施方案68-71中任一项的分离的核酸，其中所述拮抗剂是反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含与成熟miR-106b的一部分完全或部分互补的序列，使得所述反义寡核苷酸结合miR-106b。

实施方案73：实施方案68-72中任一项的分离的核酸，其中所述反义寡核苷酸包含DNA。

实施方案74：实施方案68-73中任一项的分离的核酸，其中所述反义寡核苷酸包含RNA。

实施方案75：实施方案68-74中任一项的分离的核酸，其中所述反义寡核苷酸包含一个或多个核苷酸类似物。

实施方案76：实施方案75的分离的核酸，其中所述一个或多个核苷酸类似物包含LNA。

实施方案77：实施方案68-76中任一项的分离的核酸，其中所述一个或多个核苷酸类似物包含LNA。

实施方案78：实施方案68-77中任一项的分离的核酸，其中所述反义寡核苷酸能够与另一个单链RNA核酸分子形成双链体，所述双链体具有小于约60℃、小于约50℃、小于约45℃、小于约40℃、小于约37℃、小于约35℃、小于约30℃或小于约25℃的T_m。

实施方案79：实施方案68-78中任一项的分离的核酸，其中所述拮抗剂降低miR-106b表达、水平或活性。

序列表

<110> Merand Pharmaceuticals, Inc.

<120> 用于治疗缺氧和缺血相关病症的药剂、组合物和方法

<130> MPH-001WO

<150> 63/148,940

<151> 2021-02-12

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-miR-106b-5p (成熟序列)

<400> 1

uaaagugcug acagugcaga u 21

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-miR-106b-3p

<400> 2

ccgcacugug gguacuugcu gc 22

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-miR-93-5p (成熟序列)

<400> 3

aaagugcugu ucgugcaggu ag 22

<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-miR-93-5p (pre-miR-93序列)

<400> 4

caaagugcug uucgugcagg uag 23

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-miR-93-3p

<400> 5

acugcugagc uagcacuucc cg 22

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-miR-106b-5p的反向互补序列

<400> 6

aucugcacug ucagcacuuu a 21

<210> 7

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-miR 106b-3p的反向互补序列

<400> 7

gcagcaagua cccacagugc gg 22

<210> 8

<211> 4385

<212> DNA

<213> 依赖性细小病毒

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(4385)

<223> AAV9基因组

<400> 8

cagagaggga gtggccaact ccatcactag gggtaatcgc gaagcgcctc ccacgctgcc 60

gcgtcagcgc tgacgtagat tacgtcatag gggagtggtc ctgtattagc tgtcacgtga 120

gtgcttttgc gacattttgc gacaccacat ggccatttga ggtatatatg gccgagtgag 180

cgagcaggat ctccattttg accgcgaaat ttgaacgagc agcagccatg ccgggcttct 240

acgagattgt gatcaaggtg ccgagcgacc tggacgagca cctgccgggc atttctgact 300

cttttgtgaa ctgggtggcc gagaaggaat gggagctgcc cccggattct gacatggatc 360

ggaatctgat cgagcaggca cccctgaccg tggccgagaa gctgcagcgc gacttcctgg 420

tccaatggcg ccgcgtgagt aaggccccgg aggccctctt ctttgttcag ttcgagaagg 480

gcgagagcta ctttcacctg cacgttctgg tcgagaccac gggggtcaag tccatggtgc 540

taggccgctt cctgagtcag attcgggaga agctggtcca gaccatctac cgcgggatcg 600

agccgaccct gcccaactgg ttcgcggtga ccaagacgcg taatggcgcc ggcgggggga 660

acaaggtggt ggacgagtgc tacatcccca actacctcct gcccaagact cagcccgagc 720

tgcagtgggc gtggactaac atggaggagt atataagcgc gtgcttgaac ctggccgagc 780

gcaaacggct cgtggcgcag cacctgaccc acgtcagcca gacgcaggag cagaacaagg 840

agaatctgaa ccccaattct gacgcgcccg tgatcaggtc aaaaacctcc gcgcgctaca 900

tggagctggt cgggtggctg gtggaccggg gcatcacctc cgagaagcag tggatccagg 960

aggaccaggc ctcgtacatc tccttcaacg ccgcctccaa ctcgcggtcc cagatcaagg 1020

ccgcgctgga caatgccggc aagatcatgg cgctgaccaa atccgcgccc gactacctgg 1080

taggcccttc acttccggtg gacattacgc agaaccgcat ctaccgcatc ctgcagctca 1140

acggctacga ccctgcctac gccggctccg tctttctcgg ctgggcacaa aagaagttcg 1200

ggaaacgcaa caccatctgg ctgtttgggc cggccaccac gggaaagacc aacatcgcag 1260

aagccattgc ccacgccgtg cccttctacg gctgcgtcaa ctggaccaat gagaactttc 1320

ccttcaacga ttgcgtcgac aagatggtga tctggtggga ggagggcaag atgacggcca 1380

aggtcgtgga gtccgccaag gccattctcg gcggcagcaa ggtgcgcgtg gaccaaaagt 1440

gcaagtcgtc cgcccagatc gaccccactc ccgtgatcgt cacctccaac accaacatgt 1500

gcgccgtgat tgacgggaac agcaccacct tcgagcacca gcagcctctc caggaccgga 1560

tgtttaagtt cgaactcacc cgccgtctgg agcacgactt tggcaaggtg acaaagcagg 1620

aagtcaaaga gttcttccgc tgggccagtg atcacgtgac cgaggtggcg catgagtttt 1680

acgtcagaaa gggcggagcc agcaaaagac ccgcccccga tgacgcggat aaaagcgagc 1740

ccaagcgggc ctgcccctca gtcgcggatc catcgacgtc agacgcggaa ggagctccgg 1800

tggactttgc cgacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgcgggcatg cttcagatgc 1860

tgcttccctg caaaacgtgc gagagaatga atcagaattt caacatttgc ttcacacacg 1920

gggtcagaga ctgctcagag tgtttccccg gcgtgtcaga atctcaaccg gtcgtcagaa 1980

agaggacgta tcggaaactc tgtgcgattc atcatctgct ggggcgggct cccgagattg 2040

cttgctcggc ctgcgatctg gtcaacgtgg acctggatga ctgtgtttct gagcaataaa 2100

tgacttaaac caggtatggc tgccgatggt tatcttccag attggctcga ggacaacctc 2160

tctgagggca ttcgcgagtg gtgggcgctg aaacctggag ccccgaagcc caaagccaac 2220

cagcaaaagc aggacgacgg ccggggtctg gtgcttcctg gctacaagta cctcggaccc 2280

ttcaacggac tcgacaaggg ggagcccgtc aacgcggcgg acgcagcggc cctcgagcac 2340

ggcaaggcct acgaccagca gctgcaggcg ggtgacaatc cgtacctgcg gtataaccac 2400

gccgacgccg agtttcagga gcgtctgcaa gaagatacgt cttttggggg caacctcggg 2460

cgagcagtct tccaggccaa gaagcgggtt ctcgaacctc tcggtctggt tgaggaaggc 2520

gctaagacgg ctcctggaaa gaagagaccg gtagagccat caccccagcg ttctccagac 2580

tcctctacgg gcatcggcaa gaaaggccaa cagcccgcca gaaaaagact caattttggt 2640

cagactggcg actcagagtc agttccagac cctcaacctc tcggagaacc tccagcagcg 2700

ccctctggtg tgggacctaa tacaatggct gcaggcggtg gcgcaccaat ggcagacaat 2760

aacgaaggcg ccgacggagt gggtaattcc tcgggaaatt ggcattgcga ttccacatgg 2820

ctgggggaca gagtcatcac caccagcacc cgaacctggg cattgcccac ctacaacaac 2880

cacctctaca agcaaatctc caatggaaca tcgggaggaa gcaccaacga caacacctac 2940

tttggctaca gcaccccctg ggggtatttt gacttcaaca gattccactg ccacttctca 3000

ccacgtgact ggcagcgact catcaacaac aactggggat tccggccaaa gagactcaac 3060

ttcaagctgt tcaacatcca ggtcaaggag gttacgacga acgaaggcac caagaccatc 3120

gccaataacc ttaccagcac cgtccaggtc tttacggact cggagtacca gctaccgtac 3180

gtcctaggct ctgcccacca aggatgcctg ccaccgtttc ctgcagacgt cttcatggtt 3240

cctcagtacg gctacctgac gctcaacaat ggaagtcaag cgttaggacg ttcttctttc 3300

tactgtctgg aatacttccc ttctcagatg ctgagaaccg gcaacaactt tcagttcagc 3360

tacactttcg aggacgtgcc tttccacagc agctacgcac acagccagag tctagatcga 3420

ctgatgaacc ccctcatcga ccagtaccta tactacctgg tcagaacaca gacaactgga 3480

actgggggaa ctcaaacttt ggcattcagc caagcaggcc ctagctcaat ggccaatcag 3540

gctagaaact gggtacccgg gccttgctac cgtcagcagc gcgtctccac aaccaccaac 3600

caaaataaca acagcaactt tgcgtggacg ggagctgcta aattcaagct gaacgggaga 3660

gactcgctaa tgaatcctgg cgtggctatg gcatcgcaca aagacgacga ggaccgcttc 3720

tttccatcaa gtggcgttct catatttggc aagcaaggag ccgggaacga tggagtcgac 3780

tacagccagg tgctgattac agatgaggaa gaaattaaag ccaccaaccc tgtagccaca 3840

gaggaatacg gagcagtggc catcaacaac caggccgcta acacgcaggc gcaaactgga 3900

cttgtgcata accagggagt tattcctggt atggtctggc agaaccggga cgtgtacctg 3960

cagggcccta tttgggctaa aatacctcac acagatggca actttcaccc gtctcctctg 4020

atgggtggat ttggactgaa acacccacct ccacagattc taattaaaaa tacaccagtg 4080

ccggcagatc ctcctcttac cttcaatcaa gccaagctga actctttcat cacgcagtac 4140

agcacgggac aagtcagcgt ggaaatcgag tgggagctgc agaaagaaaa cagcaagcgc 4200

tggaatccag agatccagta tacttcaaac tactacaaat ctacaaatgt ggactttgct 4260

gtcaatacca aaggtgttta ctctgagcct cgccccattg gtactcgtta cctcacccgt 4320

aatttgtaat tgcctgttaa tcaataaacc ggttaattcg tttcagttga actttggtct 4380

ctgcg 4385

<210> 9

<211> 4393

<212> DNA

<213> 依赖性细小病毒

<220>

<221> misc_feaeture

<222> (1)..(4393)

<223> AAV8基因组

<400> 9

cagagaggga gtggccaact ccatcactag gggtagcgcg aagcgcctcc cacgctgccg 60

cgtcagcgct gacgtaaatt acgtcatagg ggagtggtcc tgtattagct gtcacgtgag 120

tgcttttgcg gcattttgcg acaccacgtg gccatttgag gtatatatgg ccgagtgagc 180

gagcaggatc tccattttga ccgcgaaatt tgaacgagca gcagccatgc cgggcttcta 240

cgagatcgtg atcaaggtgc cgagcgacct ggacgagcac ctgccgggca tttctgactc 300

gtttgtgaac tgggtggccg agaaggaatg ggagctgccc ccggattctg acatggatcg 360

gaatctgatc gagcaggcac ccctgaccgt ggccgagaag ctgcagcgcg acttcctggt 420

ccaatggcgc cgcgtgagta aggccccgga ggccctcttc tttgttcagt tcgagaaggg 480

cgagagctac tttcacctgc acgttctggt cgagaccacg ggggtcaagt ccatggtgct 540

aggccgcttc ctgagtcaga ttcgggaaaa gcttggtcca gaccatctac ccgcggggtc 600

gagccccacc ttgcccaact ggttcgcggt gaccaaagac gcggtaatgg cgccggcggg 660

ggggaacaag gtggtggacg agtgctacat ccccaactac ctcctgccca agactcagcc 720

cgagctgcag tgggcgtgga ctaacatgga ggagtatata agcgcgtgct tgaacctggc 780

cgagcgcaaa cggctcgtgg cgcagcacct gacccacgtc agccagacgc aggagcagaa 840

caaggagaat ctgaacccca attctgacgc gcccgtgatc aggtcaaaaa cctccgcgcg 900

ctatatggag ctggtcgggt ggctggtgga ccggggcatc acctccgaga agcagtggat 960

ccaggaggac caggcctcgt acatctcctt caacgccgcc tccaactcgc ggtcccagat 1020

caaggccgcg ctggacaatg ccggcaagat catggcgctg accaaatccg cgcccgacta 1080

cctggtgggg ccctcgctgc ccgcggacat tacccagaac cgcatctacc gcatcctcgc 1140

tctcaacggc tacgaccctg cctacgccgg ctccgtcttt ctcggctggg ctcagaaaaa 1200

gttcgggaaa cgcaacacca tctggctgtt tggacccgcc accaccggca agaccaacat 1260

tgcggaagcc atcgcccacg ccgtgccctt ctacggctgc gtcaactgga ccaatgagaa 1320

ctttcccttc aatgattgcg tcgacaagat ggtgatctgg tgggaggagg gcaagatgac 1380

ggccaaggtc gtggagtccg ccaaggccat tctcggcggc agcaaggtgc gcgtggacca 1440

aaagtgcaag tcgtccgccc agatcgaccc cacccccgtg atcgtcacct ccaacaccaa 1500

catgtgcgcc gtgattgacg ggaacagcac caccttcgag caccagcagc ctctccagga 1560

ccggatgttt aagttcgaac tcacccgccg tctggagcac gactttggca aggtgacaaa 1620

gcaggaagtc aaagagttct tccgctgggc cagtgatcac gtgaccgagg tggcgcatga 1680

gttttacgtc agaaagggcg gagccagcaa aagacccgcc cccgatgacg cggataaaag 1740

cgagcccaag cgggcctgcc cctcagtcgc ggatccatcg acgtcagacg cggaaggagc 1800

tccggtggac tttgccgaca ggtaccaaaa caaatgttct cgtcacgcgg gcatgcttca 1860

gatgctgttt ccctgcaaaa cgtgcgagag aatgaatcag aatttcaaca tttgcttcac 1920

acacggggtc agagactgct cagagtgttt ccccggcgtg tcagaatctc aaccggtcgt 1980

cagaaagagg acgtatcgga aactctgtgc gattcatcat ctgctggggc gggctcccga 2040

gattgcttgc tcggcctgcg atctggtcaa cgtggacctg gatgactgtg tttctgagca 2100

ataaatgact taaaccaggt atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca 2160

acctctctga gggcattcgc gagtggtggg cgctgaaacc tggagccccg aagcccaaag 2220

ccaaccagca aaagcaggac gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg 2280

gacccttcaa cggactcgac aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctcg 2340

agcacgacaa ggcctacgac cagcagctgc aggcgggtga caatccgtac ctgcggtata 2400

accacgccga cgccgagttt caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc 2460

tcgggcgagc agtcttccag gccaagaagc gggttctcga acctctcggt ctggttgagg 2520

aaggcgctaa gacggctcct ggaaagaaga gaccggtaga gccatcaccc cagcgttctc 2580

cagactcctc tacgggcatc ggcaagaaag gccaacagcc cgccagaaaa agactcaatt 2640

ttggtcagac tggcgactca gagtcagttc cagaccctca acctctcgga gaacctccag 2700

cagcgccctc tggtgtggga cctaatacaa tggctgcagg cggtggcgca ccaatggcag 2760

acaataacga aggcgccgac ggagtgggta gttcctcggg aaattggcat tgcgattcca 2820

catggctggg cgacagagtc atcaccacca gcacccgaac ctgggccctg cccacctaca 2880

acaaccacct ctacaagcaa atctccaacg ggacatcggg aggagccacc aacgacaaca 2940

cctacttcgg ctacagcacc ccctgggggt attttgactt taacagattc cactgccact 3000

tttcaccacg tgactggcag cgactcatca acaacaactg gggattccgg cccaagagac 3060

tcagcttcaa gctcttcaac atccaggtca aggaggtcac gcagaatgaa ggcaccaaga 3120

ccatcgccaa taacctcacc agcaccatcc aggtgtttac ggactcggag taccagctgc 3180

cgtacgttct cggctctgcc caccagggct gcctgcctcc gttcccggcg gacgtgttca 3240

tgattcccca gtacggctac ctaacactca acaacggtag tcaggccgtg ggacgctcct 3300

ccttctactg cctggaatac tttccttcgc agatgctgag aaccggcaac aacttccagt 3360

ttacttacac cttcgaggac gtgcctttcc acagcagcta cgcccacagc cagagcttgg 3420

accggctgat gaatcctctg attgaccagt acctgtacta cttgtctcgg actcaaacaa 3480

caggaggcac ggcaaatacg cagactctgg gcttcagcca aggtgggcct aatacaatgg 3540

ccaatcaggc aaagaactgg ctgccaggac cctgttaccg ccaacaacgc gtctcaacga 3600

caaccgggca aaacaacaat agcaactttg cctggactgc tgggaccaaa taccatctga 3660

atggaagaaa ttcattggct aatcctggca tcgctatggc aacacacaaa gacgacgagg 3720

agcgtttttt tcccagtaac gggatcctga tttttggcaa acaaaatgct gccagagaca 3780

atgcggatta cagcgatgtc atgctcacca gcgaggaaga aatcaaaacc actaaccctg 3840

tggctacaga ggaatacggt atcgtggcag ataacttgca gcagcaaaac acggctcctc 3900

aaattggaac tgtcaacagc cagggggcct tacccggtat ggtctggcag aaccgggacg 3960

tgtacctgca gggtcccatc tgggccaaga ttcctcacac ggacggcaac ttccacccgt 4020

ctccgctgat gggcggcttt ggcctgaaac atcctccgcc tcagatcctg atcaagaaca 4080

cgcctgtacc tgcggatcct ccgaccacct tcaaccagtc aaagctgaac tctttcatca 4140

cgcaatacag caccggacag gtcagcgtgg aaattgaatg ggagctgcag aaggaaaaca 4200

gcaagcgctg gaaccccgag atccagtaca cctccaacta ctacaaatct acaagtgtgg 4260

actttgctgt taatacagaa ggcgtgtact ctgaaccccg ccccattggc acccgttacc 4320

tcacccgtaa tctgtaattg cctgttaatc aataaaccgg ttgattcgtt tcagttgaac 4380

tttggtctct gcg 4393

<210> 10

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 乱序序列

<400> 10

aaggcaagcu gacccugaag uu 22

Claims (59)

1.核酸双链体，其包含：

(a)miR-93核酸分子；和

(b)miR-106b的拮抗剂。

2.权利要求1的核酸双链体，其中所述双链体是RNA：RNA双链体。

3.权利要求1或2的核酸双链体，其中所述miR-106b的拮抗剂是与miR-106b的至少一部分完全或部分互补的反义寡核苷酸。

4.权利要求1、2或3的核酸双链体，其中所述双链体包含：包含序列AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO：3)的miR-93RNA或包含序列CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO：4)的miR-93 RNA。

5.权利要求1-4中任一项的核酸双链体，其中所述双链体包含miR-106b的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含序列AUCUGCACUGUCAGCACUUUA(SEQ ID NO：6)。

6.miR-106b表达、水平或活性的拮抗剂。

7.权利要求6的拮抗剂，其中所述拮抗剂是与miR-106b的至少一部分完全或部分互补的反义寡核苷酸。

8.权利要求7的拮抗剂，其中所述miR-106b是包含序列UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU(SEQID NO：1)的人miR-106b-5p。

9.权利要求7的拮抗剂，其中所述miR-106b是包含序列CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC(SEQID NO：2)的人miR-106b-3p。

10.权利要求6-9中任一项的拮抗剂，其包含DNA。

11.权利要求6-9中任一项的拮抗剂，其包含RNA。

12.权利要求6-11中任一项的拮抗剂，其中所述拮抗剂是antagomir miR-106b。

13.权利要求7-12中任一项的拮抗剂，其中所述反义寡核苷酸包含一个或多个核苷酸类似物。

14.权利要求13的拮抗剂，其中所述一个或多个核苷酸类似物包含锁核酸(LNA)。

15.权利要求7-14中任一项的拮抗剂，其中所述反义寡核苷酸能够与成熟miR-106b分子形成双链体，所述双链体具有至少约60℃的解链温度(T_m)。

16.权利要求7-14中任一项的拮抗剂，其中所述反义寡核苷酸能够与另一个单链RNA分子形成双链体。

17.权利要求16的拮抗剂，其中所述另一个单链RNA分子是miR-93RNA分子。

18.权利要求16或17的拮抗剂，其中所述反义寡核苷酸和所述另一个单链RNA分子的双链体具有小于约65℃、小于约60℃、小于约55℃、小于约50℃、小于约45℃、小于约40℃、小于约37℃、小于约35℃、小于约30℃或小于约25℃的T_m。

19.权利要求6-18中任一项的拮抗剂，其中

a.所述拮抗剂是与miR-106b的至少一部分完全或部分互补的反义寡核苷酸；

b.所述反义寡核苷酸能够与成熟miR-106b分子形成双链体；

c.所述反义寡核苷酸能够与另一个单链RNA分子形成双链体；且

d.由所述反义寡核苷酸与成熟miR-106b分子形成的双链体的T_m大于由所述反义寡核苷酸与所述另一个单链RNA分子形成的双链体的T_m。

20.权利要求19的拮抗剂，其中所述另一个单链RNA分子是miR-93RNA分子。

21.权利要求20的拮抗剂，其中所述miR-93RNA分子包含序列AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO：3)或序列CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO：4)。

22.权利要求6-21中任一项的拮抗剂，其中所述拮抗剂由分离的核酸或包含分离的核酸的载体编码。

23.权利要求22的拮抗剂，其中所述载体是选自miRNA表达载体或AAV表达载体的表达载体。

24.权利要求23的拮抗剂，其中所述表达载体是miRNA表达载体。

25.权利要求22、23或24的拮抗剂，其中所述分离的核酸可操作连接至细胞特异性启动子。

26.权利要求6-25中任一项的拮抗剂或权利要求1-5中任一项的核酸双链体，其中所述拮抗剂或核酸双链体被封装在脂质媒介物内。

27.药物组合物，其包含(a)有效量的权利要求1-5或26中任一项的核酸双链体或权利要求6-26中任一项的拮抗剂；和(b)药学上可接受的载体。

28.权利要求27的药物组合物，其进一步包含额外的治疗剂。

29.权利要求28的药物组合物，其中所述额外的治疗剂包括抗缺血剂。

30.权利要求27-29中任一项的药物组合物，其中所述有效量有效地降低施用所述药物组合物的主体的内皮或肌肉细胞中至少一种细胞周期途径基因的表达。

31.权利要求30的药物组合物，其中所述细胞周期途径基因选自E2F-1和p53。

32.权利要求30或31的药物组合物，其中所述表达是在骨骼肌细胞中。

33.权利要求27-32中任一项的药物组合物，其中所述有效量有效地增强施用所述药物组合物的主体的灌注恢复。

34.权利要求27-33中任一项的药物组合物，其中所述有效量有效地增强施用所述药物组合物的主体中对缺血的血管生成应答。

35.权利要求27-34中任一项的药物组合物，其中所述有效量有效地刺激细胞增殖。

36.权利要求35的药物组合物，其中所述细胞增殖包括内皮细胞或肌肉细胞的增殖。

37.权利要求27-36中任一项的药物组合物，其中所述有效量有效地增加施用所述药物组合物的主体的毛细血管密度。

38.权利要求27-37中任一项的药物组合物，其中所述有效量有效地抑制施用所述药物组合物的主体中一种或多种细胞的凋亡。

39.权利要求38的药物组合物，其中所述凋亡是缺氧诱导的凋亡。

40.权利要求27-39中任一项的药物组合物，其被配制用于通过选自以下的途径施用：经口、经颊、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道、眼、肺、直肠、胸骨内注射、肾透析输注和肠胃外。

41.权利要求40的药物组合物，其中所述施用是肌内施用。

42.治疗或预防与缺血相关的疾病、病症、损伤或病况的方法，所述方法包括向有此需要的主体施用权利要求27-41中任一项的药物组合物。

43.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括向所述主体施用额外的治疗剂。

44.权利要求43的方法，其中所述额外的治疗剂包括抗缺血剂。

45.权利要求42-44中任一项的方法，其中所述有效量有效地降低所述主体的内皮或肌肉细胞中的至少一种细胞周期途径基因的表达，或减弱所述主体的内皮或肌肉细胞中的至少一种细胞周期途径基因的缺血诱导的上调。

46.权利要求45的方法，其中所述细胞周期途径基因选自E2F-1和p53。

47.权利要求42-46中任一项的方法，其中所述表达是在骨骼肌细胞中。

48.权利要求42-47中任一项的方法，其中所述有效量有效地增强所述主体的灌注恢复。

49.权利要求42-48中任一项的方法，其中所述有效量有效地增强所述主体中对缺血的血管生成应答。

50.权利要求42-49中任一项的方法，其中所述有效量有效地刺激细胞增殖。

51.权利要求50的方法，其中所述细胞增殖包括内皮细胞或肌肉细胞的增殖。

52.权利要求42-51中任一项的方法，其中所述有效量有效地增加所述主体的毛细血管密度。

53.权利要求42-52中任一项的方法，其中所述有效量有效地抑制所述主体中一种或多种细胞的凋亡。

54.权利要求53的方法，其中所述凋亡是缺氧诱导的凋亡。

55.权利要求42-54中任一项的方法，其中所述施用通过选自以下的途径进行：经口、经颊、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道、眼、肺、直肠、胸骨内注射、肾透析输注和肠胃外。

56.权利要求55的方法，其中所述施用是肌内施用。

57.权利要求42-55中任一项的方法，其中所述主体是人。

58.权利要求42-57中任一项的方法，其中所述缺血选自血管缺血、肌肉缺血、外周动脉疾病、缺血再灌注损伤、与外伤相关的缺血、和脑缺血。

59.权利要求58的方法，其中所述缺血是外周动脉疾病。