JP2024506371A - 低酸素症及び虚血関連障害を処置する薬剤、組成物及び方法 - Google Patents

低酸素症及び虚血関連障害を処置する薬剤、組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

低酸素症及び虚血関連障害を処置するための薬剤、組成物及び方法。miR-106bのアンタゴニスト、例えばmiR-106bのアンチセンスオリゴヌクレオチド、かかるアンタゴニスト及びmiR-93核酸分子を含む二重鎖、並びに関連する組成物及び方法。【選択図】なし

Description

関連出願との相互参照
本出願は、2021年2月12日に出願された米国特許仮出願第63/148,940号の優先権を主張し、その全内容は、全ての目的で参照により本明細書に組み入れられる。
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる配列表を含む。2022年2月11日に作製された上記ASCIIコピーは、MPH-001WO_SL.txtと命名され、サイズは14kbである。
末梢動脈疾患(PAD)は、米国では約800～1200万人の成人が罹患し、罹患率及び死亡率に重大な影響を及ぼす。PADは、四肢への血流が減少し、運動又は安静時でさえ虚血をもたらすことを特徴とする。
組織虚血に応答して、イベントのカスケードが、虚血組織の近傍の既存の毛細血管から新たな血管を発芽させ、新たな血管を形成することができる。このような血管新生は、虚血組織への血液供給を促進する適応メカニズムを示す。
閉塞部位より遠位の新しい血管の成長を刺激する治療的血管新生は、虚血組織への医学的バイパスを作り、虚血組織における潅流を改善するための有望なアプローチを表す。多くの血管新生増殖因子がPADの前臨床モデルと臨床PAD患者の両方で徹底的に研究されている。これにもかかわらず、末梢虚血組織、例えば虚血肢における潅流を改善するための治療法はまだ欠けている。
過去10年間に、マイクロRNAは、特に疾患/損傷状態に重要である、遺伝子発現の強力な内因性調節因子として出現した。マイクロRNA(miRNA)は、特に疾患/損傷状態において、遺伝子発現を調節する16～25ヌクレオチドの非コードRNAである。マイクロRNAは、典型的には、mRNAの分解を標的とすることによって、又は直接的な翻訳抑制によって作用し、単一の遺伝子又は全経路を調節することができる。一部のマイクロRNAは、発生上の血管新生及び腫瘍血管新生に重要な役割を果たす。
miRNAは、RNAポリメラーゼII(pol II)又はRNAポリメラーゼIIIによって転写され、一般的に数千塩基長である一次miRNA転写物(pri-miRNA)と呼ばれる最初の転写物から生じる。pri-miRNAは、核内でRNase Droshaによってプロセシングされ、約70～約100ヌクレオチドのヘアピン型前駆体(pre-miRNA)になる。細胞質への輸送後、ヘアピンpre-miRNAはさらにDicerによってプロセシングされ、二重鎖miRNAを生成する。次に成熟miRNA鎖は、RNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)に取り込まれ、塩基対相補性によって標的mRNAと会合する。
しかしながら、虚血誘導型血管新生、例えば心筋虚血及びPADにおけるマイクロRNAの役割に関する情報は限られている。
当該技術分野では、内皮細胞及び筋細胞の生存を増強するため、血管新生を誘導するため、虚血を処置するため、及び疾患、状態及び障害、例えばPADを処置するために有用な組成物及び方法が長年望まれている。
本明細書では、虚血に関連する疾患、障害、損傷又は状態を処置又は予防する薬剤、組成物及び方法が提供される。
一態様では、(a)miR-93核酸分子;及び(b)miR-106bのアンタゴニストを含む核酸二重鎖が提供される。
一部の実施形態では、二重鎖はRNA:RNA二重鎖である。
一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニストは、miR-106bの少なくとも一部に完全に又は部分的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
一部の実施形態では、二重鎖は、配列AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(配列番号3)を含むmiR-93 RNA、又は配列CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(配列番号4)を含むmiR-93 RNAを含む。
一部の実施形態では、二重鎖はmiR-106bのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列AUCUGCACUGUCAGCACUUUA(配列番号6)を含む。
一態様では、miR-106b発現、レベル又は活性のアンタゴニストが提供される。
一部の実施形態では、アンタゴニストは、miR-106bの少なくとも一部に完全に又は部分的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
一部の実施形態では、miR-106bはヒトmiR-106b-5pであり、配列UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU(配列番号1)を含む。
一部の実施形態では、miR-106bはヒトmiR-106b-3pであり、配列CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC(配列番号2)を含む。
一部の実施形態では、アンタゴニストはDNAを含む。
一部の実施形態では、アンタゴニストはRNAを含む。
一部の実施形態では、アンタゴニストはantagomir miR-106bである。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つ以上のヌクレオチド類似体を含む。例えば1つ以上のヌクレオチド類似体は、ロックド核酸(LNA)を含み得る。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも約60℃の融解温度(Tm)を有する、成熟miR-106b分子と二重鎖を形成することができる。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、別の一本鎖RNA分子と二重鎖を形成することができる。一部の実施形態では、他の一本鎖RNA分子は、miR-93 RNA分子である。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドと他の一本鎖RNA分子の二重鎖は、約65℃未満、約60℃未満、約55℃未満、約50℃未満、約45℃未満、約40℃未満、約37℃未満、約35℃未満、約30℃未満又は約25℃未満のTmを有する。
一部の実施形態では、アンタゴニストは、miR-106bの少なくとも一部に完全に又は部分的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり;アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟miR-106b分子と二重鎖を形成することができ;アンチセンスオリゴヌクレオチドは、別の一本鎖RNA分子と二重鎖を形成することができ;成熟miR-106b分子とアンチセンスオリゴヌクレオチドによって形成された二重鎖のTmは、他の一本鎖RNA分子とアンチセンスオリゴヌクレオチドによって形成された二重鎖のTmよりも大きい。一部のこのような実施形態では、他の一本鎖RNA分子は、miR-93 RNA分子である。一部の実施形態では、miR-93 RNA分子は、配列AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(配列番号3)又は配列CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(配列番号4)を含む。
一部の実施形態では、アンタゴニストは、単離された核酸、又は単離された核酸を含むベクターによってコードされる。一部の実施形態では、ベクターはmiRNA発現ベクター又はAAV発現ベクターから選択される発現ベクターである。例えば発現ベクターはmiRNA発現ベクターであり得る。一部の実施形態では、単離された核酸は、細胞特異的プロモーターに作動可能に連結される。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアンタゴニスト又は核酸二重鎖は、脂質ビヒクル内にカプセル化される。
一態様では、(a)請求項1～5若しくは26のいずれか一項の核酸二重鎖又は請求項6～26のいずれか一項のアンタゴニストの有効量;及び(b)薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、追加の治療剤をさらに含む。例えば追加の治療剤は、抗虚血剤を含み得る。
一部の実施形態では、有効量は、医薬組成物を投与される対象の内皮細胞又は筋細胞において、少なくとも1つの細胞周期経路遺伝子の発現を低下させるのに有効である。例えば上記細胞周期経路遺伝子は、E2F-1及びp53からなる群から選択され得る。一部の実施形態では、発現は骨格筋細胞におけるものである。
一部の実施形態では、有効量は、医薬組成物を投与される対象において潅流回復（perfusion recovery）を増強するのに有効である。
一部の実施形態では、有効量は、医薬組成物を投与される対象において、虚血に対する血管新生応答を増強するのに有効である。
一部の実施形態では、有効量は、細胞増殖、例えば内皮細胞又は筋細胞の増殖を含む細胞増殖を刺激するのに有効である。
一部の実施形態では、有効量は、医薬組成物を投与される対象における毛細管密度を増加させるのに有効である。
一部の実施形態では、有効量は、医薬組成物を投与される対象において、1つ以上の細胞のアポトーシスを阻害するのに有効である。例えば一部の実施形態では、アポトーシスは、低酸誘導型アポトーシスである。
一部の実施形態では、医薬組成物は、経口、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、経鼻、経腸、局所、舌下、膣、眼、肺、直腸、胸骨内注射、腎臓透析注入及び非経口からなる群から選択される経路による投与用に製剤化される。
一部の実施形態では、上記投与は筋肉内である。
一態様では、虚血に関連する疾患、障害、損傷又は状態を処置又は予防する方法が提供され、上記方法は、本明細書に開示される医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、方法は、追加の治療剤、例えば抗虚血剤を対象に投与することをさらに含む。
一部の実施形態では、有効量は、対象の内皮細胞又は筋細胞における少なくとも1つの細胞周期経路遺伝子の発現を低下させるか、又はその虚血誘導型上方制御を減弱させるのに有効である。一部の実施形態では、細胞周期経路遺伝子は、E2F-1及びp53からなる群から選択される。一部の実施形態では、発現は骨格筋細胞におけるものである。
一部の実施形態では、有効量は、対象における潅流回復を増強するのに有効である。
一部の実施形態では、有効量は、対象における虚血に対する血管新生応答を増強するのに有効である。
一部の実施形態では、有効量は細胞増殖を刺激するのに有効である。
一部の実施形態では、細胞増殖は内皮細胞又は筋細胞の増殖を含む。
一部の実施形態では、有効量は対象における毛細管密度を増加させるのに有効である。
一部の実施形態では、有効量は、対象における1つ以上の細胞のアポトーシスを阻害するのに有効である。一部の実施形態では、アポトーシスは、低酸素誘導型アポトーシスである。
一部の実施形態では、投与は、経口、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、経鼻、経腸、局所、舌下、膣、眼、肺、直腸、胸骨内注射、腎臓透析注入及び非経口からなる群から選択される経路による。
一部の実施形態では、投与は筋肉内である。
一部の実施形態では、対象はヒトである。
一部の実施形態では、虚血は、血管虚血、筋虚血、末梢動脈疾患、虚血再潅流損傷、外傷に関連する虚血、及び脳虚血からなる群から選択される。
一部の実施形態では、虚血は、末梢動脈疾患である。
略語
bw--体重
C2C12--不死化マウス筋細胞株
FDR--偽検出率
GA--腓腹筋
GF--増殖因子
GSEA--遺伝子セットエンリッチメント分析
HLI--後肢虚血
HSS--低酸素症及び血清飢餓
HUVEC--ヒト臍帯静脈内皮細胞
IGA--虚血腓腹筋
LNA--ロックド核酸
LSGS--低血清成長サプリメント
miR--マイクロRNA(miRNAとも呼ばれる)
miRNA--マイクロRNA(miRとも呼ばれる)
NGA--非虚血腓腹筋
PAD--末梢動脈疾患
PremiR--前駆体miRNA
RISC--RNA誘導型サイレンシング複合体
SEM--平均の標準誤差
TA--前脛骨
VEGF--血管内皮増殖因子
定義
本明細書で使用される場合、用語「約」とは、値を参照して本明細書で使用される場合、参照された値との文脈において類似する値を指す。一般的に、文脈に精通している当業者は、その文脈において「約」によって包含される関連する分散の程度を理解する。例えば一部の実施形態では、用語「約」は、参照値の25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%又はそれ以下の範囲の値を包含することができる。
本明細書で使用される「アンタゴニスト」とは、標的薬剤のレベル又は生物学的活性を阻害する薬剤を指す。例えばmiR-106bの「アンタゴニスト」とは、インビトロ、エクスビボ又はインビボにおいてmiR-106bのレベル又は活性を減少させる薬剤を指す。
用語「antagomir」とは、マイクロRNA(miRNA)のような内因性低分子RNA調節因子に拮抗する低分子RNA又はDNA(又はキメラ)分子を指す。これらのアンタゴニストは、ほとんどの部分において相補的なヌクレオチド配列を有し、antagomirが、例えば成熟マイクロRNA(miRNA)、又は成熟マイクロRNAのプレmiRNA前駆体にハイブリダイズすべきであることを意味する。それらは、他の分子がmRNA分子上の所望の部位に結合するのを妨げ、内因性マイクロRNA(miR)を抑制するために使用される。したがって、antagomirは、例えば生物学的活性を遮断し、損傷に対する応答のこれらの転写後分子モジュレーターの発現、レベル又は活性を低下させるように設計される。
本明細書で使用される場合、用語「付着する」、「付着」又は「付着した」、又は「付着すること」は、本明細書において「結合する(bind)」又は「結合すること」、又は「結合する(binds)」、又は「結合した(bound)」と交換可能に使用され、安定な複合体の形成をもたらす分子間の任意の物理的関係、例えばリガンド、例えばペプチド又は小分子と「結合パートナー」又は「受容体分子」の間の物理的関係を指す。この関係は、限定されないが、選択的な非共有結合、イオン引力、水素結合、共有結合、ファンデルワールス力又は疎水性引力を含む物理化学的な相互作用によって媒介され得る。
本明細書で使用される「相補的」とは、2つの核酸、例えばRNA配列とRNA配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの間のサブユニット配列相補性の広い概念を指す。両方の分子のヌクレオチド位置が、通常は互いに塩基対を形成することができるヌクレオチドによって占められている場合、核酸は、この位置で互いに相補的であると考えられる。したがって、2つの核酸は、各分子の相当数(例えば少なくとも50%)の対応する位置が、通常は互いに塩基対を形成するヌクレオチド(例えばA:T(RNAを含む二重鎖についてはA:U)及びG:Cヌクレオチド対)によって占められる場合、互いに相補的である。したがって、第1の核酸領域のアデニン残基は、残基がチミン又はウラシルである場合、第1の領域と逆平行である第2の核酸領域の残基と特異的な水素結合(「塩基対」)を形成することができることが公知である。同様に、第1の核酸鎖のシトシン残基は、残基がグアニンである場合、第1の鎖と逆平行である第2の核酸鎖の残基と塩基対を形成することができることが公知である。核酸の第1の領域は、2つの領域が逆平行に配置される場合に、第1の領域の少なくとも1つのヌクレオチド残基が第2の領域の残基と塩基対を形成することができる場合、同一又は異なる核酸の第2の領域に相補的である。好ましくは第1の領域は第1の部分を含み、第2の領域は第2の部分を含み、それにより、第1の部分及び第2の部分が逆平行に配置される場合、例えば第1の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%が第2の部分のヌクレオチド残基と塩基対を形成することができる。より好ましくは第1の部分の全てのヌクレオチド残基は、第2の部分のヌクレオチド残基と塩基対を形成することができる。
「有効量」又は「治療有効量」(又は「予防的有効量」)は、本明細書では、有益又は所望の結果、例えば増加した血管新生又は特定の所望の臨床結果をもたらすのに十分な量を指すために使用される。したがって、「有効量」又は「治療有効量」は、それが適用される文脈に依存する。
「単離された核酸」とは、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から分離された核酸セグメント又は断片、例えばその断片に通常は隣接する配列（例えばそれが天然に存在するゲノム中の断片に隣接する配列）から取り出されたDNA断片を指す。この用語はまた、核酸に天然に付随する他の成分、例えば細胞内で天然に付随するRNA又はDNA又はタンパク質から実質的に精製された核酸に適用される。したがって、この用語は、例えばベクター、自律複製プラスミド若しくはウイルス、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムDNAに取り込まれる組換えDNA、あるいは他の配列とは独立した別個の分子(例えばcDNA、又はPCR若しくは制限酵素消化によって生成されたゲノム若しくはcDNA断片)として存在する組換えDNAを含む。それはまた、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを含む。
用語「処置すること」(及びその変形、例えば「処置する」又は「処置」)とは、それを必要とする対象における疾患又は状態の自然経過を変更する試みにおける臨床介入を指す。処置は、予防と臨床病理の過程の両方で行うことができる。処置の望ましい効果には、疾患の発生又は再発の予防、疾患の1つ以上の症状の軽減、疾患の直接的又は間接的な病理学的結果の低減、疾患進行の速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び予後の改善が含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」又は「有効量」とは、対象に投与された場合、疾患又は障害を処置するのに有効である、本明細書で提供される薬剤又は医薬組成物の量を指す。
用語「インビトロ」とは、生体外で起こるプロセスを指す。このような用語は、「インサイチュ」及び「エクスビボ」という用語を包含する。
用語「インサイチュ」とは、生きている生物から分離して成長する、例えば組織培養において成長する生細胞に起こるプロセスを指す。
用語「エクスビボ」とは、一般的に、組織の細胞構造が保存される、組織試料中で起こるプロセスを指す。
用語「インビボ」とは、生体内で起こるプロセスを指す。
本明細書で使用される用語「哺乳動物」には、ヒトと非ヒトの両方を含み、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ及びブタが含まれる。
分析、診断又は処置の「対象」は、動物である。このような動物には、哺乳動物、好ましくはヒトが含まれる。
本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」は、本発明の方法から利益を得ることができる患者、動物、哺乳動物又はヒトである。
本明細書で使用される場合、用語「PADの危険にさらされている対象」とは、PADを発症するための1つ以上の危険因子を有する対象を指す。危険因子には、限定されないが、性別、年齢、遺伝的素因、環境曝露、及び過去のPAD発症及びライフスタイルが含まれる。
用語「同一性」パーセントとは、2つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈において、以下に記載される配列比較アルゴリズム(例えばBLASTP及びBLASTN又は当業者が利用可能な他のアルゴリズム)のうちの1つを用いて、又は目視検査によって測定した場合に、最大一致のために比較及び整列された場合、同一であるヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する2つ以上の配列又はサブ配列を指す。用途に応じて、「同一性」パーセントが、比較される配列の領域、例えば機能ドメインにわたって存在し得るか、又は代替的に、比較される2つの配列の全長にわたって存在し得る。
配列比較のためには、典型的には、1つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列(複数可)の配列同一性パーセントを計算する。
比較のための配列の最適アラインメントは、例えばSmith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2巻:482頁(1981年)の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48巻:443頁(1970年)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85巻:2444頁(1988年)の類似性探索法によって、これらのアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.におけるGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA)のコンピュータによる実行によって、又は目視検査(一般的にAusubelら、下記参照)によって行うことができる。
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、Altschulら, J. Mol. Biol. 215巻:403～410頁(1990年)に記載されているBLASTアルゴリズムである。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information(ww.ncbi.nlm.nih.gov/)を通じて公衆に入手可能である。
用語「十分な量」とは、所望の効果を生じるのに十分な量、例えば細胞におけるタンパク質凝集を調節するのに十分な量を意味する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈が明確に別段の指示をしない限り、単数形である「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」は複数の指示対象を含むことに留意されたい。
概要
対照と比較した場合、より高いレベルのmiR-106bは、PAD関連条件下で行われたインビトロ血管新生アッセイにおいて、内皮の枝分かれを有意に低下させる。(参照により全体が本明細書に組み入れられるGantaら, Circulation. 2017年;135件:2403～2425頁)。
本明細書では、特に、miR-106b発現、レベル、又は活性のアンタゴニストが開示される。このような薬剤は、低酸素症、虚血、並びに虚血に関連する他の損傷、疾患、障害及び状態、例えば末梢動脈疾患及び心筋虚血を処置及び予防するのに有用である。理論に拘束されることを望まないが、このようなアンタゴニストは、虚血イベントからの回復を助けるのに有用である、miR-106b媒介性の血管新生阻害を減弱又は遮断することができる。
核酸二重鎖及びmiR-106bアンタゴニスト
本明細書では、(a)miR-93核酸分子;及び(b)miR-106bのアンタゴニスト、例えば本明細書に記載される任意のアンタゴニストを含む核酸二重鎖が提供される。
核酸二重鎖に関して本明細書で使用される用語「二重鎖」は、当該技術分野におけるその意味に従って使用され、DNA鎖、RNA鎖、又はDNAとRNAの両方を含む二重鎖を指すことができる。一部の実施形態では、二重鎖は、RNA:RNA二重鎖である。当業者に理解されるように、二重鎖中の各鎖の少なくとも一部は、他方の鎖の少なくとも一部と実質的に相補的であり、相補性の程度は変化し得るが、100%である必要はない。例えば一部の二重鎖は、相補性領域内又は全二重鎖全体にわたって、鎖間に少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、又は少なくとも5つのミスマッチを含有する。
一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニストは、miR-106bの少なくとも一部に完全に又は部分的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列AUCUGCACUGUCAGCACUUUA(配列番号6)又はそれと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、若しくは少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号6の配列、又はそれと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%若しくは少なくとも95%同一である配列を有する。
例として、miR-93核酸分子は、限定されないが、全内容を参照により本明細書に組み入れられる米国特許第9,845,465号に開示されるものを含む。
一部の実施形態では、miR-93核酸分子は、miR-93 RNA、例えば配列AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(配列番号3)(又はそれと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%若しくは少なくとも95%同一である配列)を含むmiR-93、又はCAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(配列番号4)(又はそれと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、若しくは少なくとも95%同一である配列)を含むmiR-93である。一部の実施形態では、miR-93 RNAは、配列番号3又は配列番号4の配列(又は配列番号3若しくは配列番号4のいずれかと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%同一である配列)を有するオリゴヌクレオチドである。
一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニストは、哺乳動物miR-106bのアンタゴニストである。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニストは、ヒトmiR-106bのアンタゴニストである。
一部の実施形態では、ヒトmiR-106bのアンタゴニストは、hsa-miR-106b-5pのアンタゴニストである。miRbaseに記述されるように、hsa-miR-106b-5pの成熟配列はUAAAGUGCUGACAGUGCAGAU(配列番号1)である。
代替の実施形態では、ヒトmiR-106bのアンタゴニストは、hsa-miR-106b-3pのアンタゴニストである。miRbaseに記述されるように、hsa-miR-106b-3pの成熟配列はCCGCACUGUGGGUACUUGCUGC(配列番号2)である。
一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニストは、アンチセンスオリゴヌクレオチドがmiR-106bに結合するように、成熟miR-106bの一部に完全に又は部分的に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがPAD関連条件下でmiR-106bに結合するように、成熟miR-106bの一部に完全に又は部分的に相補的である。例えば参照により全体が本明細書に組み入れられるGantaら, Circulation. 2017年;135巻:2403～2425頁を参照されたい。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書において、miR-106b核酸又はmiR-106bの「アンチセンスオリゴヌクレオチド」を「標的化する」と称され得る。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟miR-106bの一部と少なくとも85%、90%若しくは95%相補的、又は100%相補的である配列を含む。好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟miR-106bの一部と100%相補的な配列を含む。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニストは、表1に示される配列番号6又は配列番号7の配列の少なくとも一部と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%同一である配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニストは、配列番号6又は配列番号7の配列の少なくとも一部と100%同一である配列を含む。一部の実施形態では、一部は、配列番号6又は7の少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又は21個の連続するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、一部は配列番号6又は7の全てを含む。
一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニストは、配列番号6又は7の少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又は21個の連続するヌクレオチドを含む部分に対して100%同一である配列を含む。
Figure 2024506371000001
好ましい態様では、アンタゴニストは、miR-106b-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
一態様では、アンタゴニストは、miR-106b-3pのアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
一部の実施形態では、成熟miR-106bの一部は、miR-106b配列中に存在する少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21又は全22個の連続したヌクレオチドを含む。好ましい態実施形態では、成熟miR-106bの一部は、hsa-miR-106b-5p配列中に存在する全22個の連続したヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、hsa-miR-106b-5p配列中に存在する全22個の連続したヌクレオチドに対して100%相補的な配列を含む。
一部の実施形態では、成熟miR-106bの一部は、miR-106bシード領域を含む。したがって、一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、miR-106bシード領域に完全に又は部分的に相補的である領域を含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、miR-106bシード領域に対して完全に相補的な領域を含む。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さにわたって測定した場合、miR-106bに対して完全に相補的である配列を含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、miR-106bの長さにわたって測定した場合、miR-106bに対して完全に相補的である配列を含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さにわたってマイクロRNAの対応する領域に相補的である。一部の実施形態では、オリゴマーの3'ヌクレオシドは、miR-106bの第1、第2、第3又は第4の5'ヌクレオチドに相補的である(すなわち、整列する)。一実施形態では、オリゴマーの3'ヌクレオシドはmiR-106bの第2の5'ヌクレオチドと整列する。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴマーの長さにわたって、miR-106bに対してほとんど相補的である。例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドは、miR-106bの対応する領域に対する1つのミスマッチを含み得る。例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドは、miR-106bの対応する領域に対する2つのミスマッチを含み得る。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはDNAを含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはRNAを含む。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、miR-106bと二重鎖を形成することができる。一部の実施形態では、二重鎖は、ある融解温度(Tm)を有する。Tmは、例えば少なくとも約60℃、約65℃、約70℃又はそれ以上であり得る。一部の実施形態では、Tmは、約60℃～約90℃、約65℃～約85℃又は約70℃～約80℃である。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、虚血回復に関連する血管新生のmiR-106b媒介性阻害を減少させるのに十分な程度までmiR-106bに結合するが、虚血回復に関連しないmiR-106b媒介性経路活性を減少させるほど過度には結合しない。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、虚血に関連する疾患、障害、又は状態を処置するのに十分な程度までmiR-106bに結合するが、望ましくない副作用を引き起こすほど過度には結合しない。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、別の一本鎖RNA分子(miR-106b以外、例えばhsa-miR-106b-5p以外)と二重鎖を形成することができる。一部の実施形態では、他の一本鎖RNAとともに形成される二重鎖は、miR-106bとともに形成される二重鎖よりも不安定である。一部の実施形態では、他の一本鎖RNA核酸分子との二重鎖のTmは、約60℃未満、約55℃未満、約50℃未満、約45℃未満、約40℃未満、約37℃未満、約35℃未満、約30℃未満、又は約25℃未満である。一部の実施形態では、他の一本鎖RNA核酸分子との二重鎖のTmは、少なくとも25℃、少なくとも30℃、少なくとも35℃、少なくとも37℃、少なくとも40℃、少なくとも45℃、少なくとも50℃又は少なくとも55℃である。
一部の実施形態では、成熟miR-106b分子とアンチセンスオリゴヌクレオチドによって形成される二重鎖のTmは、他の一本鎖RNA分子とアンチセンスオリゴヌクレオチドによって形成される二重鎖のTmよりも大きい。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理学的条件下又はPAD関連条件下で、別の一本鎖RNA分子(miR-106b以外、例えばhsa-miR-106b-5p以外)と二重鎖を形成しない。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビボで別の一本鎖RNA分子(miR-106b以外、例えばhsa-miR-106b-5p以外)と二重鎖を形成しない。
一部の実施形態では、他の一本鎖RNA分子はmiR-93である。
所定の二重鎖のTmは、Tmアッセイによって決定することができる。本明細書に提供される例示的なTmアッセイにおいて、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びRNA標的二重鎖は、500mlのRNase不含水中で3mMに希釈され、500mlの2×Tm-緩衝液(200mM NaCl、0.2mM EDTA、20mM リン酸Na、pH 7.0)と混合される。溶液を3分間、95℃に加熱し、次に室温で30分間アニールさせる。二重融解温度(Tm)をPE Templabソフトウェア(Perkin Elmer)を用いてPeltier温度プログラマPTP6を備えたLambda 40 UVA IS分光光度計で測定した。温度を20℃から95℃に上昇させ、次に25℃に下げ、260nmで吸収を記録する。二重Tmを評価するために、融解とアニーリングの両方の一次微分と局所極大を用いた。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、例えば、約7～約30nt、例えば約7～約26又は約8～約25、例えば約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25ヌクレオチドの長さ、例えば約10～約22ヌクレオチドの長さであり得る。一部の実施形態では、長さは21又は22ヌクレオチドである。
一態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、miR-106b antagomirである。
antagomir(本明細書ではantimiRとも呼ばれる)は、一般的に、マイクロRNA配列、又はそれらの対応するサブ配列に完全に相補的であるか、又は本質的に相補的である(すなわち、1つ又は2つのミスマッチを含むことができる)連続するヌクレオチド配列からなるか、又はそれから構成されるオリゴマーを指す。この点に関して、antimiRは、全成熟マイクロRNAに対して相補的又は本質的に相補的である連続したヌクレオチド配列を含み得るか、又はantimiRは、成熟マイクロRNA若しくはプレマイクロRNAのサブ配列に対して相補的又は本質的に相補的である連続したヌクレオチド配列を含み得ると考えられる。サブ配列(したがって、対応する連続するヌクレオチド配列)は、少なくとも5、6、7又は8ヌクレオチドの長さ、例えば5～25ヌクレオチド、例えば5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25ヌクレオチドの長さ、例えば10～17ヌクレオチド又は10～16ヌクレオチド、例えば12～15ヌクレオチドであり得る。多数のantimiRの設計が示唆されており、典型的には、治療的使用のためのantimiRにおいて、antimiRの連続するヌクレオチド配列は、1つ以上のヌクレオチド類似体を含む。
一部の実施形態では、antimiRは、ギャップマー構造を有し得る。しかしながら、国際公開第2007/112754号及び国際公開第WO2007/112753号（両方ともそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に説明されているように、他の設計、例えばミキサマー(mixmer)又はトータルマー(totalmer)が好ましい場合がある。
国際公開第2007/112754号及び国際公開第2007/112753号（両方ともそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、オリゴマーが成熟マイクロRNAに相補的である、antimiRオリゴマー及びantimiRオリゴマー設計を提供する。
一部の実施形態では、antimiRのサブ配列は、miRNAシード領域に対応する。一部の実施形態では、オリゴマーの第1又は第2の3'核酸塩基は、マイクロRNA配列の第2の5'ヌクレオチドに対応する。
一部のantimiR実施形態では、オリゴマーの3'末端から測定した場合、オリゴマーの1～6個(包括的)の核酸塩基ユニットは、マイクロRNAシード領域配列に相補的である。
一部のantimiR実施形態では、オリゴマーの3'末端から測定した場合、オリゴマーの1～7個(包括的)の核酸塩基ユニットは、マイクロRNAシード領域配列に相補的である。
一部のantimiR実施形態では、オリゴマーの3'末端から測定した場合、オリゴマーの2～7個(包括的)の核酸塩基ユニットは、マイクロRNAシード領域配列に相補的である。
一部の実施形態では、antimiRオリゴマーは、miRNAシード領域に相補的な領域内である位置に、少なくとも1つのヌクレオチド類似体ユニット、例えば少なくとも1つのLNAユニットを含む。一部の実施形態では、antimiRオリゴマーは、miRNAシード領域に相補的な領域内にある位置に、1～6個の間、又は1～7個のヌクレオチド類似体ユニット、例えば1～6個及び1～7個のLNAユニットを含むことができる。
一部の実施形態では、antimiRは、miR-106bのシード領域に相補的であり、少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は100%のヌクレオチドがLNAである連続するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、antimiRは、miR-106bのシード領域に相補的であり、ヌクレオチドの少なくとも80%がLNAであり、ヌクレオチド間結合の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は100%がホスホロチオネート結合である連続するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、antimiRの連続するヌクレオチド配列は、標的配列にハイブリダイズする場合に、単一のミスマッチを超えない。一部の実施形態では、連続するヌクレオチド配列は、標的配列にハイブリダイズする場合に、2つ以下のミスマッチを含む。一部の実施形態では、連続するヌクレオチド配列は、標的配列にハイブリダイズする場合に、ミスマッチを含まない。
本開示のオリゴマー(又はその領域)と、核酸の標的領域、例えば本明細書に開示されるものとの間の「相補性」の程度を決定する際に、「相補性」(「相同性」又は「同一性」もまた)の程度は、オリゴマー(又はその領域)の配列と、それと最も整列する標的領域(又は標的領域の逆相補体)の配列との間の同一性パーセンテージ(又は相同性パーセンテージ)として表すことができる。パーセンテージは、2つの配列間で同一である整列した塩基の数を数え、オリゴマー中の連続したモノマーの総数で除し、100を掛けることによって計算される。このような比較において、ギャップが存在する場合、ギャップ内のモノマーの数が本発明のオリゴマーと標的領域との間で異なる領域ではなく、このようなギャップが単にミスマッチであることが好ましい。
本明細書で使用される場合、用語「相同な」及び「相同性」は、用語「同一」及び「同一の」と交換可能である。
用語「に対応している」及び「に対応する」とは、オリゴマー(すなわち、核酸塩基又は塩基配列)又は連続するヌクレオチド配列のヌクレオチド配列(第1の領域)と、(i)核酸標的のサブ配列又は(ii)核酸標的の逆相補体のいずれかから選択されるさらなる配列の同等の連続するヌクレオチド配列との比較を指す。ヌクレオチド類似体は、それらの同等な又は対応するヌクレオチドと直接比較される。i)又はii)に基づくさらなる配列に対応する第1の配列は、典型的には、第1の配列(例えば連続するヌクレオチド配列)の長さにわたってその配列と同一であるか、又は一部の実施形態では、対応する配列と少なくとも80%相同であり、例えば少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%相同、例えば100%相同(同一)である。
ヌクレオチド類似体
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つ以上のヌクレオシド類似体を含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つ以上のヌクレオチド類似体を含む。
例示的なヌクレオシド類似体ユニットには、限定されないが、2'-O-アルキル-RNAユニット、2'-OMe-RNAユニット、2'-アミノ-DNAユニット、2'-フルオロ-DNAユニット、LNAユニット、PNAユニット、HNAユニット、2'-FANA、2'-(3-ヒドロキシ)プロピル、及び2'-フルオロ-DNAユニット、及び/又は他の(場合により)糖修飾ヌクレオシド類似体、例えばモルホリノ、ペプチド核酸(PNA)、CeNA、連結されていない核酸(unlinked nucleic acid: UNA)、ヘキシトール核酸(HNA)が含まれる。ビシクロ-HNA(例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第2009/100320号を参照されたい)、及びINAユニット。一部の実施形態では、1つ以上のヌクレオシド類似体は、その標的核酸(又は相補的DNA又はRNA配列)に対する第1の領域の親和性を増加させる。種々のヌクレオシド類似体が、参照により本明細書に組み込まれるFreier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997年, 25巻, 4429～4443頁、及びUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000年, 3巻(2号), 293～213頁に開示されている。
「LNAユニット」、「LNAモノマー」、「LNA残基」、「ロックド核酸ユニット」、「LNA」、「二環状核酸」、「BNA」、「ロックド核酸モノマー」又は「ロックド核酸残基」なる用語は、本明細書において、二環状ヌクレオシド類似体を指すために交換可能に使用される。一部の実施形態では、LNAは、リボース環の第2及び第4炭素を連結する架橋(又はビラジカル)(C4*-C2*架橋又はビラジカル)を含む。2番目と4番目の炭素の間にビラジカルが存在すると、リボースは3'エンド-(ノース)コンホメーションにロックされる。LNAユニットは、国際公開第99/14226号、国際公開第00/56746号、国際公開第00/56748号、国際公開第01/25248号、国際公開第02/28875号、国際公開第03/0006475号、及び国際公開第03/095467号に記載され、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、LNAユニット又は複数のユニットは、D-β及びL-α配置又はそれらの組合せのいずれかで、oxy-LNA、thio-LNA、及びアミノ-LNAからなる群から独立して選択される。
一部の実施形態では、LNAはENA核酸塩基を含む。
一部の実施形態では、LNAはベータD オキシ-LNAを含む。
一部の実施形態では、LNAはアルファ-LアミノLNAを含む。
2'置換オリゴマー、例えば完全2'OMEオリゴマーは、国際公開第05/013901号、国際公開第07/027775号、国際公開第07027894号に記載され、各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、オリゴマーの第1の領域は、2'置換ヌクレオシドを含み得る。国際公開第07/027775号はまた、マイクロRNAを標的化する際に使用するためのMOE、LNA、DNAミキサマーを指す。
用語「対応するヌクレオチド類似体」及び「対応するヌクレオチド」は、ヌクレオチド類似体中のヌクレオチド及び天然に存在するヌクレオチドが同一であることを示すことを意図する。例えばヌクレオチドの2-デオキシリボースユニットがアデニンに連結している場合、「対応するヌクレオチド類似体」は、アデニンに連結している五炭糖ユニット(2-デオキシリボースとは異なる)を含有する。
天然に存在しないヌクレオチドには、修飾された糖部分を有するヌクレオチド、例えば二環式ヌクレオチド又は2'修飾ヌクレオチド、例えば2'置換ヌクレオチドが含まれる。
「ヌクレオチド類似体」は、糖及び/又は塩基部分における修飾のために、DNA又はRNAヌクレオチドなどの天然ヌクレオチドのバリアントである。類似体は、原理的には、オリゴヌクレオチドの文脈において、天然ヌクレオチドと単に「サイレント」又は「等価」であり得、すなわち、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現を阻害するように作用する方法に対して機能的効果を有さない。このような「等価な」類似体は、それにもかかわらず、例えばそれらが製造がより容易であるか若しくはより安価であるか、貯蔵又は製造条件に対してより安定であるか、又はタグ若しくは標識を表す場合に有用であり得る。しかしながら、好ましくは類似体は、例えば標的への増大した結合親和性及び/又は細胞内ヌクレアーゼへの増大した抵抗性及び/又は細胞への輸送の増大した容易さを生じさせることによって、オリゴマーが発現を阻害するように作用する方法において機能的効果を有する。
適切なヌクレオチド類似体の例は、国際公開第2007/031091号に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて使用され得る他のヌクレオチド類似体には、三環式核酸が含まれる。例示的な三環式核酸は、国際公開第2013/154798号及び国際公開第2013/154798号に記載され、各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ヌクレオシドは、化学的に修飾されたリボフラノース環部分を含む。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つ又は2つのLNAユニットを含む。一部の実施形態では、1つ又は2つのLNAユニットは、3'末端から数えて、3～8の位置にある。このような位置決めは、オリゴ:マイクロRNA二重鎖、RNA:RNA二重鎖構造に似た二重鎖によって形成されるA-ヘリックスの安定性にとって有利であり得る。
ベクター
一部の実施形態では、miR-106bアンタゴニストは、ベクターにコードされる。「ベクター」は、目的の核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。多数のベクターが当該技術分野において公知であり、限定されないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスが含まれる。したがって、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミド又はウイルスを含む。ウイルスベクターの例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。発現構築物は、生細胞内で複製され得るか、又は合成的に作製され得る。本出願の目的では、用語「発現構築物」、「発現ベクター」、及び「ベクター」は、本発明の適用を一般的、例示的な意味で実証するために交換可能に使用され、本発明を限定することを意図しない。
一部の実施形態では、発現ベクターは、miR-106bアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドに「作動可能に連結された」プロモーターを含む。本明細書で使用される「作動可能に連結された」又は「転写制御下にある」という語句は、プロモーターが、RNAポリメラーゼによる転写の開始及びポリヌクレオチドの発現を制御するために、ポリヌクレオチドに関して正しい位置及び方向にあることを意味する。miR-106bアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドは、一次マイクロRNA配列、前駆体-マイクロRNA配列、又は成熟miR-106bアンタゴニスト配列をコードし得る。
一部の実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクターであり、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、又はレンチウイルス、例えばヒト免疫不全(HIV)ウイルスを含むレトロウイルスに由来するものである。一部の実施形態では、AAVは、AAV8又はAAV9である。
一態様では、ベクターは、AAV(アデノ随伴ウイルス)ベクターである。一部の実施形態では、本開示の組換えAAVベクターは、他の組織よりも優先的に筋肉を標的化するのに有用である。一部の実施形態では、本開示の組換えAAVベクターは、筋肉において優先的に目的の遺伝子の発現を増加させるのに有用である。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法は、AAVベクターを用いた筋肉の標的化及び形質導入を包含する。方法は、調節エレメントを含む組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの有効量を含む医薬組成物を対象に投与することを含むことができる。調節エレメントは、一般的に、少なくとも1つのプロモーターエレメント、及び場合により少なくとも1つのエンハンサーエレメントを含む。エンハンサー及びプロモーターは、典型的には、作動可能に連結される。組換えAAVベクターはまた、場合により、プロモーターエレメントに作動可能に連結された少なくとも1つの遺伝子を含むことができる。AAVは、一部の実施形態では、全AAVゲノム、又はその相同体若しくは断片、例えば特定のAAVのカプシドを含むことができる。しかしながら、全AAVゲノムは、ベクター複製を欠損させ、及び/又は目的の遺伝子、例えば治療遺伝子を挿入する必要があるために、いくつかの状況において有用又は必要とされないことがあることに留意されたい。
調節エレメント及び目的の遺伝子はまた、その活性断片、改変、又は相同体で置換され得る。一態様では、組換えAAVベクターは、骨格筋を優先的に標的とする。
組換えAAVベクターは、本開示のAAVベクターから発現されたsiRNA又はmiRNAを用いて、筋肉中の特定の遺伝子をノックダウンする際に使用するために調製することができる。
他の有用なベクター、核酸、及びタンパク質又はその相同体及び断片は、限定されないが、AAV-9(例えばNCBIアクセッション番号AX753250;配列番号8)及びAAV-8(例えばNCBIアクセッション番号NC006261;配列番号9)を含み、本開示の実施に有用であり得る。
AAVのペイロード制約のために、一部の実施形態では、cDNAを使用することができる。一態様では、追加のイントロン及び配列を導入することができる。一態様では、AAVのcap遺伝子が使用され、AAVゲノムDNA全体ではない。
他の方法及びベクターは、当該技術分野において公知であり、Souzaら(例えば米国特許出願公開第2011/0212529号、2011年9月1日公開)におけるものを含めて、本発明の方法を行うために使用することもできる。
AAV、例えばAAV9及びAAV8は、他の組織よりも高い特異性で一部の組織を標的とすることができるが、ベクターの一部としての組織又は細胞特異的エンハンサー及びプロモーターの使用は、目的の遺伝子が所望の細胞又は組織において発現されることを確実にするのに役立つ。一部の実施形態では、所望の細胞又は組織は、骨格筋細胞及び/又は横紋筋細胞を含む。一部の実施形態では、所望の細胞又は組織は、心筋細胞を含む。
AAVのより詳細な説明及び使用は、例えば米国特許出願公開第2013/0136729号(French及びAnnex, 米国特許出願第13/673,351号)に見出すことができ、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ベクターは、心臓トロポニン-T遺伝子プロモーター又はその必須の近位プロモーターエレメントを含む。例示的な心臓トロポニン-Tプロモーター及び必須エレメントは、米国特許第5,266,488号に記載され、その内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ベクターは、筋クレアチンキナーゼプロモーター又はその必須の近位プロモーターエレメントを含む。一部の実施形態では、ベクターは、デスミン(DES)プロモーター又はその必須の近位プロモーターエレメントを含む。一部の実施形態では、ベクターは、組織特異的エンハンサーを含む。
一部の実施形態では、発現ベクターは、筋組織における導入遺伝子の持続的発現のために最適化される。本発明の別の目的は、種々の発現系において持続的であり、適切な発現レベルを指示することができるエンハンサー/プロモーターの組合せを提供することである。
一部の実施形態では、発現ベクターは、筋特異的プロモーター及び筋特異的エンハンサーからの最小配列の組合せを含み、導入遺伝子の転写を持続的に駆動するキメラ調節エレメントを作製する。最小配列は、おそらく目的の全配列よりもいくぶん少ないが、目的の機能を維持するものである。
本開示はさらに、本開示のエンハンサー/プロモーターの組合せを含む核酸でトランスフェクトされた細胞を提供する。
プロモーターは、適切な細胞内調節因子に結合した場合、プロモーター依存性転写を増強するか(「エンハンサー」)又は抑制する(「抑制因子」)他の調節配列/エレメントと結合することができる。プロモーター、エンハンサー、又は抑制因子は、このようなエレメント(複数可)が、導入遺伝子の転写速度又は効率を制御するか又は影響する場合、導入遺伝子に「作動可能に連結される」と言われる。例えば導入遺伝子コード配列の5'末端の近位に位置するプロモーター配列は、通常、導入遺伝子と作動可能に連結される。本明細書で使用される場合、用語「調節エレメント」は、「調節配列」と交換可能に使用され、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメント、又はこのようなエレメントの任意の組合せを指す。
機能的影響
一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト、例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟miR-106b発現、生物学的活性、又は発現と生物学的活性の両方を減少させる。
成熟miR-106b発現は、限定されないが、qPCR、例えばリアルタイムqPCR、及びマイクロアレイを含む、当該技術分野において任意の公知の方法に従って決定することができる。成熟miR-106b発現は、インビトロで、例えば細胞培養モデルを用いて、エクスビボ、又はインビボで決定することができる。
一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト、例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟miR-106b発現を少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%減少させる。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト、例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟miR-106b発現を少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、又は少なくとも50%、例えば10～100%、20～90%、30～80%、40～70%又は50～60%減少させる。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト、例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟miR-106b発現を少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%減少させる。
一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト(例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、miR-106b経路活性を減少させる。
一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト(例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、PAD関連条件下で血管新生を促進する。PAD関連条件下での血管新生は、当該技術分野において公知である任意の手段によって決定することができる。
一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト(例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、カスパーゼ-9発現を減弱させるか、又は低酸素誘導型カスパーゼ-9発現を減弱させる。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニストは、低酸素誘導型カスパーゼ-9発現を少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、又は約20%以上減弱させる。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニストは、低酸素誘導型カスパーゼ-9発現を約5～約15%減弱させる。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニストは、低酸素誘導型カスパーゼ-9発現を少なくとも約10%、例えば約10%減弱させる。
一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト(例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、内皮細胞又は筋細胞における1つ以上の遺伝子の虚血誘導型上方制御を減弱させるか、又はその発現を減少させる。一部の実施形態では、1つ以上の遺伝子は、細胞周期経路の遺伝子である。一部の実施形態では、細胞周期経路の1つ以上の遺伝子は、p53及びE2F-1から選択される。一部の実施形態では、1つ以上の遺伝子の発現は、虚血イベント後に細胞において評価される。
一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト(例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、p53の虚血誘導型上方制御を減弱させるか、又はp53の発現を減少させる。一部の実施形態では、p53 mRNA発現は、約20%～約40%減少される。一部の実施形態では、p53 mRNA発現は、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、又は少なくとも約100%減少される。一部の実施形態では、p53タンパク質発現は、約10～約30%減少される。一部の実施形態では、p53タンパク質発現は、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、又は少なくとも約100%減少される。
一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト(例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、E2F-1の虚血誘導型上方制御を減弱させるか、又はE2F-1の発現を減少させる。一部の実施形態では、E2F-1 mRNA発現は、約60%～約80%減少される。一部の実施形態では、E2F-1タンパク質発現は、約10%～約30%減少される。
一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト(例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、miR-106b媒介性の血管新生減少を減弱させる。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト(例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、PAD関連条件下でmiR-106b媒介性の血管新生減少を減弱させる。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニストは、miR-106b媒介性の血管新生減少を少なくとも約2.5%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、又は少なくとも約100%減弱させる。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト、例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、血管新生を増強する。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニストは、少なくとも約2.5%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、又は少なくとも約100%血管新生を増強する。血管新生は、当該技術分野において公知である任意の手段によって測定することができる。例えば血管新生は、インビトロ血管新生アッセイを介して、内皮の枝分かれの評価を介して測定することができる。
一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト(例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、miR-106b誘導型の細胞増殖の減少を減弱させる。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト(例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、PAD関連条件下でmiR-106b誘導型の細胞増殖の減少を減弱させる。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニストは、miR-106b媒介性の細胞増殖の減少を少なくとも約2.5%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、又は少なくとも約100%減弱させる。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト(例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、血管新生を増強する。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト、例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞増殖を増強する。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニストは、少なくとも約2.5%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約100%、少なくとも約200%、又は少なくとも約300%細胞増殖を増強する。細胞増殖は、例えば内皮細胞の増殖を含むことができる。細胞増殖は、例えば筋細胞、例えば骨格筋細胞又は心筋細胞の増殖を含むことができる。細胞増殖は、インビトロで、例えば培養細胞(例えばヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECS)及び/又はC2C12細胞)において測定することができる。細胞増殖は、インビボで測定することができる。
一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト(例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、miR-106b媒介性アポトーシスを減弱させる。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト(例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、PAD関連条件下でmiR-106b媒介性アポトーシスを減弱させる。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト(例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、低酸素又は虚血状態によって誘導されるアポトーシスを減弱させる。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニストは、少なくとも約2.5%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、又は少なくとも約100%アポトーシスを減少させる。アポトーシス、並びに低酸素又は虚血状態によって誘導されるアポトーシスは、当該技術分野において公知の任意の手段によって測定することができる。アポトーシスは、例えば内皮細胞及び/又は筋細胞(例えば骨格筋細胞又は心筋細胞)のアポトーシスを含むことができる。アポトーシスは、TUNELアッセイを用いて、インビトロ、例えば培養細胞(例えばHUVEC又はC2C12細胞)において測定することができる。アポトーシスは、インビボ、例えば当該技術分野において公知であるPAD関連条件の任意の動物モデルにおいて測定することができる。PAD関連条件の例示的なモデルは、後肢虚血動物モデルである。
一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニスト(例えばmiR-106bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、虚血後の再潅流(本明細書では潅流回復とも呼ばれる)を増強する。一部の実施形態では、miR-106bのアンタゴニストは、虚血後の再潅流を少なくとも約2.5%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、又は少なくとも約100%増大させる。虚血は、四肢の虚血であり得る。虚血後の再潅流は、当該技術分野において公知である任意の手段によって評価することができる。虚血の例示的モデルは、試験げっ歯類、例えばマウスにおける後肢虚血を含む。試験げっ歯類における後肢虚血後の再潅流は、例えば画像化によって、及び/又は後肢虚血後の毛細血管密度を測定することによって評価することができる。後肢虚血後の毛細血管密度を測定し、潅流回復を画像化するための例示的な方法が本明細書に開示される。(「材料及び方法」セクション内の実施例を参照されたい)。
処置の方法
治療用途のために、miR-106bアンタゴニストは、対象に、一般的には哺乳動物(一般的には哺乳動物はヒトである)に、医薬的に許容される投薬形態、例えば当該技術分野において公知である投薬形態及び上記で検討した投与形態で投与される。例えばmiR-106bアンタゴニストは、任意の投与経路、例えば経口、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、経鼻、経腸、局所、舌下、膣、眼、肺、直腸、胸骨内注射、腎臓透析注入、及び非経口によってヒトに投与することができる。一部の実施形態では、miR-106bアンタゴニストは筋肉内に投与される。
したがって、本明細書では、本明細書に開示されるmiR-106bアンタゴニストの有効量を投与することを含む、それを必要とする対象における虚血に関連する疾患、障害、損傷、又は状態を処置又は予防する方法が提供される。
一部の実施形態では、虚血は、血管虚血、筋虚血、末梢動脈疾患、虚血再潅流障害、外傷に関連する虚血、及び脳虚血からなる群から選択され、場合により、虚血が末梢動脈疾患である。
一部の実施形態では、虚血は末梢動脈疾患である。
一部の実施形態では、虚血は虚血再潅流障害である。
一部の実施形態では、虚血は脳虚血である。一部の実施形態では、脳虚血外傷に関連する。
一態様では、虚血は血管虚血である。一態様では、血管虚血は冠動脈虚血である。
また、本明細書では、本明細書に開示されるmiR-106bアンタゴニストの有効量を投与することを含む、それを必要とする対象の内皮細胞又は筋細胞における少なくとも1つの細胞周期経路遺伝子の発現を低下させるか、又はその虚血誘導型上方制御を減弱させる方法もまた提供される。例示的な細胞周期経路遺伝子は本明細書に開示される。
また、本明細書では、本明細書に開示されるmiR-106bアンタゴニストの有効量を投与することを含む、それを必要とする対象における潅流回復を増強する方法もまた提供される。
また、本明細書では、本明細書に開示されるmiR-106bアンタゴニストの有効量を投与することを含む、それを必要とする対象における虚血に対する血管新生応答を増強する方法もまた提供される。
また、本明細書では、本明細書に開示されるmiR-106bアンタゴニストの有効量を投与することを含む、対象における虚血イベントに続く対象における細胞増殖を刺激する方法もまた提供される。一部の実施形態では、細胞増殖は、内皮細胞及び/又は筋細胞の増殖である。
また、本明細書では、本明細書に開示されるmiR-106bアンタゴニストの有効量を投与することを含む、それを必要とする対象における毛細血管密度を増加させる方法もまた提供される。
また、本明細書では、本明細書に開示されるmiR-106bアンタゴニストの有効量を投与することを含む、それを必要とする対象における1つ以上の細胞のアポトーシスを阻害する方法もまた提供される。一部の実施形態では、アポトーシスは、低酸素誘導型アポトーシス、例えば虚血誘導型低酸素によって誘導されるアポトーシスを含む。一部の実施形態では、1つ以上の細胞は内皮細胞及び/又は筋細胞である。
医薬組成物
一部の実施形態では、miR-106bアンタゴニストを含む医薬組成物が提供され、医薬組成物は、別のmiRNA分子をさらに含み、miR-106bアンタゴニストは、他のmiRNA分子と二重鎖化される。このような医薬組成物の一部の実施形態では、miR-106bアンタゴニストは、hsa-miR-106b-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、miR-93で二重鎖化される。このような医薬組成物の一部の実施形態では、医薬組成物は、(1)hsa-miR-106b-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチド、配列AUCUGCACUGUCAGCACUUUA(配列番号6)を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドと、(2)hsa-miR-93-5p配列AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(配列番号3)を含む配列との二重鎖を含む。このような医薬組成物の一部の実施形態では、医薬組成物は、(1)hsa-miR-106b-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチド、配列AUCUGCACUGUCAGCACUUUA(配列番号6)を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドと、(2)hsa-miR-93-53-5p配列CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(配列番号4)を含む配列との二重鎖を含む。
本明細書に記載されるアンタゴニスト(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、医薬組成物中に処方（製剤化）することができる。これらの組成物は、本明細書に開示される1つ以上のアンタゴニストに加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤又は当業者に周知である他の物質を含むことができる。このような材料は非毒性であるべきであり、活性成分の有効性と干渉するべきではない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路(例えば経口、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、経鼻、経腸、局所、舌下、膣、眼、肺、直腸、胸骨内注射、腎臓透析注入、及び非経口の投与経路)に依存し得る。
経口投与用の医薬組成物は、例えば錠剤、カプセル、粉末又は液体形態であり得る。錠剤は、固体担体、例えばゼラチン、又はアジュバントを含むことができる。液体医薬組成物は、一般的に、液体担体、例えば水、石油、動物若しくは植物油、鉱油又は合成油を含む。生理食塩水、デキストロース若しくは他の糖溶液、又はグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールを含むことができる。
静脈内、皮膚若しくは皮下注射、又は患部への注射の場合、活性成分は、発熱物質を含まず、適切なpH、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。当業者は、例えば等張性ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液を用いて適切な溶液を調製することが十分にできる。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び/又は他の添加剤を含めることができる。
一部の実施形態では、医薬組成物は筋肉内投与用に製剤化される。
本明細書に開示されている1つ以上のアンタゴニストの投与は、好ましくは「治療有効量」又は「予防有効量」(場合により、予防は治療とみなすことができる)であり、これは、個体に有益性を示すのに十分である。実際に投与される量、並びに投与の速度及び時間経過は、処置される疾患の性質及び重症度に依存する。処置の処方、例えば投薬量の決定などは、一般の医師及び他の医療専門家の責任の範囲内であり、典型的には、処置される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、副作用の回避、及び医師に公知である他の因子を考慮する。上述の技術及びプロトコルの例は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.(ed), 1980年に見ることができる。
組成物は、単独で又は他の処置と組み合わせて、処置すべき状態に応じて、同時に又は連続的に投与することができる。
本開示の方法において有用である医薬組成物は、所望の投与経路(例えば経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻腔内、口腔内、眼、髄腔内、又は別の投与経路)に適した製剤として調製、包装、又は販売することができる。他の意図される製剤には、計画されたナノ粒子、リポソーム製剤、活性成分を含有する再密封赤血球、及び免疫学的ベースの製剤が含まれる。
本開示の医薬組成物は、バルクで、例えば単一の単位用量として、又は複数の単一の単位用量として調製、包装、又は販売することができる。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は、一般的に、対象に投与される活性成分の投薬量、又はこのような投薬量の好都合な割合、例えばこのような投薬量の1/2又は1/3に等しい。
本開示の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される担体、及び任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の同一性、サイズ、及び状態に依存して、さらに組成物が投与される経路に依存して変化する。一例として、組成物は0.1%～100%(w/w)の活性成分を含み得る。
活性成分に加えて、本開示の医薬組成物は、1つ以上の追加の薬学的に活性な薬剤をさらに含むことができる。特に意図される追加の薬剤には、制吐剤、及びスカベンジャー、例えばシアン化物及びシアン酸スカベンジャーが含まれる。
本開示の医薬組成物の放出制御又は持続放出製剤は、従来の技術を用いて製造することができる。経口投与に適した本開示の医薬組成物の製剤は、各々が所定量の活性成分を含有する、限定されないが、錠剤、硬質若しくは軟質カプセル、カシェ剤、トローチ又はロゼンジを含む、個別の固形投薬単位の形態で調製、包装、又は販売することができる。経口投与に適した他の製剤には、限定されないが、粉末又は顆粒製剤、水性若しくは油性懸濁液、水性若しくは油性溶液又はエマルジョンが含まれる。
本明細書で使用される場合、「油性」液体は、炭素含有液体分子を含み、水よりも極性の低い性質を示す液体である。
経口投与に適した本開示の医薬組成物の液体製剤は、液体形態で又は使用前に水若しくは別の適切なビヒクルで再構成することを意図した乾燥製品の形態で調製、包装及び販売することができる。
液体懸濁液は、水性又は油性ビヒクル中の活性成分の懸濁を達成するために、従来の方法を用いて調製することができる。水性ビヒクルの例としては、例えば水及び等張生理食塩水が挙げられる。油性ビヒクルの例としては、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、植物油、例えば落花生、オリーブ、ゴマ又はヤシ油、分画された植物油、及び鉱油、例えば液体パラフィンが挙げられる。液体懸濁液は、1つ以上の追加成分をさらに含むことができ、その例としては、限定されないが、懸濁剤、分散剤又は湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、保存剤、緩衝剤、塩、香味剤、着色剤、及び甘味剤が挙げられる。油性懸濁液は、増粘剤をさらに含むことができる。公知の懸濁剤の例としては、限定されないが、ソルビトールシロップ、水素化食用脂肪、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アラビアゴム、及びセルロース誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられる。
公知の分散剤又は湿潤剤の例としては、限定されないが、天然に存在するホスファチド、例えばレシチン、及びアルキレンオキシドと、脂肪酸との縮合生成物、長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、脂肪酸及びヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物、又は脂肪酸及び無水ヘキシトール由来の部分エステル(例えばそれぞれ、ポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート又はポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート)との縮合生成物が挙げられる。
公知の乳化剤の例としては、限定されないが、レシチン及びアラビアゴムが挙げられる。公知の防腐剤の例としては、限定されないが、メチル、エチル、又はn-プロピルパラオキシ安息香酸、アスコルビン酸、及びソルビン酸が挙げられる。公知の甘味剤の例としては、限定されないが、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロース、及びサッカリンが挙げられる。油性懸濁液用の公知の増粘剤の例としては、限定されないが、ミツロウ、硬質パラフィン及びセチルアルコールが挙げられる。
水性又は油性溶媒中の活性成分の液体溶液は、液体懸濁液と実質的に同じ様式で調製することができ、主な違いは、活性成分が溶媒中に懸濁されるのではなく溶解されることである。本開示の医薬組成物の液体溶液は、液体懸濁液に関して記載された成分の各々を含み得、懸濁化剤は必ずしも溶媒中の活性成分の溶解を助けるとは限らないことが理解される。水性溶媒の例としては、限定されないが、水及び等張生理食塩水が挙げられる。油性溶媒の例としては、限定されないが、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、植物油、例えば落花生、オリーブ、ゴマ又はヤシ油、分画された植物油、及び鉱油、例えば液体パラフィンが挙げられる。
本開示の組成物は、追加の成分を含み得る。本明細書で使用される場合、「追加の成分」の例としては、限定されないが、以下:賦形剤;界面活性剤;分散剤;不活性希釈剤;造粒剤及び崩壊剤;結合剤;潤滑剤;甘味剤;香味剤;着色剤;防腐剤;生理学的に分解性の組成物、例えばゼラチン;水性ビヒクル及び溶媒;油性ビヒクル及び溶媒;懸濁剤;分散剤又は湿潤剤;乳化剤、鎮痛薬;緩衝剤;塩;増粘剤;充填剤;乳化剤;抗酸化剤;抗菌剤;抗真菌剤;安定化剤;及び薬学的に許容される高分子材料又は疎水性材料のうちの1つ以上が挙げられる。本開示の医薬組成物に含まれ得る他の「追加の成分」の例は、当該技術分野において公知であり、例えば参照により本明細書に組み込まれるGenaro, ed., 1985年, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa.に記載されている。
医薬組成物は、1日に数回の頻度で動物に投与することができるか、又はより少ない頻度で投与することができ、例えば1日1回、週に1回、2週間に1回、月に1回、又はさらに低い頻度で投与することができ、例えば数ヵ月に1回、又は年に1回又はそれ以下であり得る。投薬の頻度は、典型的には、当業者によって決定され、限定されないが、処置される状態又は疾患のタイプ及び重症度、動物のタイプ及び年齢などの任意の数の因子に依存し得る。
併用療法
処置の組成物及び方法は、本明細書に開示される1種以上のmiR-106bアンタゴニストと、1種以上の追加の薬剤との同時投与を含むことができる。追加の薬剤の例としては、限定されないが、細胞毒性剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、抗生物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、薬物、プロドラッグ、毒素及び酵素が挙げられる。
追加の薬剤のさらなる例としては、限定されないが、(a)抗菌薬、(b)ステロイド(例えばヒドロコルチゾン、トリアムシノロン)、(c)鎮痛薬(例えばアスピリン、NSAID、及び局所麻酔薬)、(d)抗炎症薬、(e)増殖因子、(f)サイトカイン、(g)ホルモン、(h)末梢動脈疾患の処置のための他の薬剤、及び(i)それらの組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、1つ以上の追加の薬剤は、別のmiRNA分子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、他のmiRNA分子はmiR-93である。一部の実施形態では、miR-93は、配列AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(has-miR-93-3p;配列番号3)を含む。一部の実施形態では、miR-93は、配列CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(hsa-miR-93-5p;配列番号4)を含む。一部の実施形態では、他のmiRNA分子との組合せ療法は、miR-106bアンタゴニストを含む医薬組成物を対象に、例えばそれを必要とするヒト対象に投与することを含み、医薬組成物は他のmiRNA分子を含む。一部のこのような実施形態では、miR-106bアンタゴニストは、他のmiRNA分子と二重鎖化される。また、本明細書では、miR-106bアンタゴニストを含む医薬組成物が提供され、医薬組成物は他のmiRNA分子をさらに含み、miR-106bアンタゴニストは他のmiRNA分子と二重鎖化される。このような医薬組成物の一部の実施形態では、miR-106bアンタゴニストは、hsa-miR-106b-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、miR-93と二重鎖化される。このような医薬組成物の好ましい実施形態では、医薬組成物は、hsa-miR-106b-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチド(例えばAUCUGCACUGUCAGCACUUUA(配列番号6)の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド)とAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(配列番号3)を含むmiR-93配列との二重鎖を含む。このような医薬組成物のさらに他の実施形態では、医薬組成物は、hsa-miR-106b-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば配列AUCUGCACUGUCAGCACUUUA(配列番号6)を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド)とCAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(配列番号4)を含むmiR-93配列との二重鎖を含む。
一部の実施形態では、方法はまた、限定するものではないが、任意の医薬又は薬物を含む治療分子の使用を含む。医薬の例としては、限定されないが、麻酔薬、催眠薬、鎮静薬及び睡眠導入薬、抗精神病薬、抗うつ薬、抗アレルギー薬、抗狭心症薬、抗関節炎薬、抗喘息薬、抗糖尿病薬、抗下痢薬、抗痙攣薬、抗痛風薬、抗ヒスタミン薬、鎮痒薬、催吐薬、制吐薬、鎮痙薬、食欲抑制剤、神経刺激性物質、神経伝達物質アゴニスト、アンタゴニスト、受容体遮断薬及び再摂取調節剤、ベータ-アドレナリン遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、ジスルフィラム及びジスルフィラム様薬、筋肉弛緩剤、鎮痛剤、解熱剤、興奮誘発剤、抗コリンエステラーゼ薬、副交感神経興奮薬、ホルモン、抗凝固薬、抗血栓薬、血栓溶解薬、免疫グロブリン、免疫抑制剤、ホルモンアゴニスト/アンタゴニスト、ビタミン、抗菌剤、抗新生物薬、制酸剤、消化薬、緩下薬、瀉下薬、防腐薬、利尿薬、消毒薬、殺真菌剤、外部寄生虫駆除薬、抗寄生虫薬、重金属、重金属アンタゴニスト、キレート化剤、気体及び蒸気、アルカロイド、塩、イオン、オータコイド、ジギタリス、強心配糖体、抗不整脈薬、抗高血圧薬、血管拡張薬、血管収縮薬、抗ムスカリン薬、神経節刺激薬、神経節遮断薬、神経筋遮断薬、アドレナリン作用性神経阻害剤、抗酸化剤、ビタミン、化粧品、抗炎症薬、創部ケア製品、抗血栓薬、抗腫瘍薬、抗血管新生薬、麻酔薬、抗原薬、創傷治癒薬、植物抽出物、増殖因子、皮膚軟化剤、保湿剤、拒絶反応/抗拒絶反応薬、殺精子剤、コンディショナー、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗生物質、精神安定剤、コレステロール低下薬、鎮咳薬、ヒスタミン遮断薬、及びモノアミンオキシダーゼ阻害薬が挙げられる。米国薬局方に収載されている全ての物質も含めることができる。
本開示の範囲内で使用することができる薬剤のタイプのリスト、及びカテゴリー内の特定の薬剤を以下に提供する;このリストは、非限定的な例を提供することを意図する。
抗菌剤には、スルファジアジン銀、ニスタチン、ニスタチン/トリアムシノロン、バシトラシン、ニトロフラゾン、ニトロフラントイン、ポリミキシン(例えばコリスチン、サーファクチン、ポリミキシンE、及びポリミキシンB)、ドキシサイクリン、抗菌ペプチド(例えば天然及び合成由来)、ネオスポリン(すなわち、バシトラシン、ポリミキシンB、及びネオマイシン)、ポリスポリン(すなわち、バシトラシン及びポリミキシンB)が含まれる。追加の抗菌薬には、銀塩、ヨウ素、塩化ベンザルコニウム、アルコール、過酸化水素、及びクロルヘキシジンを含む局所抗菌薬(すなわち、防腐薬)が含まれる。
解熱鎮痛薬:アセトアミノフェン;塩酸アルフェンタニル;アミノ安息香酸カリウム;アミノ安息香酸ナトリウム;アニドキシム;アニレリジン;塩酸アニレリジン;塩酸アニロパム;アニロラク;アンチピリン;アスピリン;ベノキサプロフェン;塩酸ベンチダミン;塩酸ビシファジン;塩酸ブリフェンタニル;マレイン酸ブロマドリン;ブロムフェナクナトリウム;塩酸ブプレノルフィン;ブタセチン;ブチキシレート;ブトルファノール;酒石酸ブトルファノール;カルバマゼピン;カルバスピリンカルシウム;塩酸カルビフェン;クエン酸カルフェンタニル;琥珀酸シプレファドール;シラマドール;塩酸シラマドール;クロニキセリル;クロニキシン;コデイン;燐酸コデイン;硫酸コデイン;塩酸コノルフォン;シクラゾシン;塩酸デキソキサドロール;デキサペメドラク;デゾシン;ジフルニサル;重酒石酸ジヒドロコデイン;ジメファダン;ジピロン;塩酸ドキシピコミン;ドリニデン;塩酸エナドリン;エピリゾール;酒石酸エルゴタミン;塩酸エトキサゼン;エトフェナメート;オイゲノール;フェノプロフェン;フェノプロフェンカルシウム;クエン酸フェンタニル;フロクタフェニン;フルフェニサル;フルニキシン;フルニキシンメグルミン;マレイン酸フルピルチン;フルプロクァゾン;塩酸フルラドリン;フルルビプロフェン;塩酸ヒドロモルフォン;イブフェナク;インドプロフェン;ケタゾシン;ケトルファノール;ケトロラクトロメタミン;塩酸レチミド;酢酸レボメタジル;塩酸酢酸レボメタジル;塩酸レボナントラドール;酒石酸レボルファノール;塩酸ロフェミゾール;蓚酸ロフェンタニル;ロルシナドール;ロモキシカム;サリチル酸マグネシウム;メフェナム酸;塩酸メナビタン;塩酸メペリジン;塩酸メプタジノール;塩酸メサドン;酢酸メサジル;メトフォリン;メトトリメプラジン;酢酸メトケファミド;塩酸ミンバン;塩酸ミルフェンタニル;モリナゾン;硫酸モルフィン;モキサゾシン;塩酸ナビタン;塩酸ナルブフィン;塩酸ナルメキソン;ナモキシレート;塩酸ナントラドール;ナプロキセン;ナプロキセンナトリウム;ナプロキソール;塩酸ネフォパム;塩酸ネキセリジン;塩酸ノルアシメタドール;塩酸オクフェンタニル;オクタザミド;オルヴァニル;オキセトロンフマレート;オキシコドン;塩酸オキシコドン;オキシコドンテレフタレート;塩酸オキシモルフォン;ペメドラク;ペンタモルフォン;ペンタゾシン;塩酸ペンタゾシン;乳酸ペンタゾシン;塩酸フェナゾピリジン;塩酸フェニラミドール;塩酸ピセナドール;ピナドリン;ピルフェニドン;ピロキシカムオラミン;マレイン酸プラヴァドリン;塩酸プロジリジン;塩酸プロファドル;フマル酸プロピラーン;塩酸プロポキシフェン;プロポキシフェンナプシレート;プロキサゾール;クエン酸プロキサゾール;酒石酸プロキソルファン;塩酸ピロリフェン;塩酸レミフェンタニル;サルコレックス;マレイン酸サレタミド;サリチルアミド;サリチレートメグルミン;サルサレート;サリチル酸ナトリウム;スピラドリンメシレート;スフェンタニル;クエン酸スフェンタニル;タルメタシン;タルミフルメート;タロサレート;琥珀酸タザドレン、テブフェロン;テトリダミン;チフラクナトリウム;塩酸チリジン;チオピナク;トナゾシンメシレート;塩酸トラマドール;塩酸トレフェンタニル;トロラミン;塩酸ベラドリン;塩酸ベリロパム;ボラゾシン;キソルファノールメシレート;塩酸キシラジン;ゼナゾシンメシレート;ゾメピラクナトリウム;ズカプサイシン。
抗高血圧薬:塩酸アルフゾシン;アリパミド;アルチアジド;塩酸アミキンシン;アムロジピンベシレート;マレイン酸アムロジピン;酢酸アナリチド;マレイン酸アチプロシン;ベルホスジル;ベミトラジン;ベンダカロールメシレート;ベンドロフルメチアジド;ベンズチアジド;塩酸ベタキソロール;硫酸ベタニジン;塩酸ベバントロール;塩酸ビクロジル;ビソプロロール;フマル酸ビソプロロール;塩酸ブシンドロール;ブピコミド;ブチアジド;カンドキサトリル;カンドキサトリラート;カプトプリル;カルベジロール;セロナプリル;クロロチアジドナトリウム;シクレタニン;シラザプリル;クロニジン;塩酸クロニジン;クロパミド;シクロペンチアジド;シクロチアジド;ダロジピン;硫酸デブリソキン;塩酸デラプリル;ジアパミド;ジアゾキシド;塩酸ジレバロール;マレイン酸ジルチアゼム;ジテキレン;ドキサゾシンメシレート;エカドトリル;マレイン酸エナラプリル;エナラプリラート;エナルキレン;エンドララジンメシレート;エピチアジド;エピロサルタン;エプロサルタンメシレート;フェノルドパムメシレート;マレイン酸フラボジロール;フロールジピン;フロセキナン;フォシノプリルナトリウム;フォシノプリラート;グアナベンズ;酢酸グアナベンズ;硫酸グァナクリン;硫酸グァナドレル;グァンシジン;グァネチジン一硫酸;硫酸グァネチジン;塩酸グァンファシン;硫酸グアニソキン;硫酸グァノクロル;塩酸グアノクチン;グアノキサベンズ;硫酸グァノキサン;硫酸グァノキシフェン;塩酸ヒドララジン;ヒドララジンポリスチレックス;ヒドロフルメチアジド;インダクリノン;インダパミド;塩酸インドラプリフ;インドラミン;塩酸インドラミン;塩酸インドレネート;ラシジピン;レニキンシン;レヴクロマカリム;リシノプリル;塩酸ロフェキシジン;ロサルタンカリウム;塩酸ロスラジン;メブタメート;塩酸メカミラミン;メドロキサロール;塩酸メドロキサロール;メタルチアジド;メチクロチアジド;メチルドーパ;塩酸メチルドペート;メチプラノロール;メトラゾン;フマル酸メトプロロール;琥珀酸メトプロロール;メチロシン;ミノキシジル;マレイン酸モナテピル;ムゾリミン;ネビボロル;ニトレンジピン;オフォルニン;塩酸パージリン;パゾキシド;塩酸ペランセリン;ペリンドプリルエルブミン;塩酸フェノキシベンザミン;ピナシジル;ピボプリル;ポリチアジド;塩酸プラゾシン;プリミドロール;塩酸プリジジロール;塩酸キナプリル;キナプリラート;塩酸キナゾシン;塩酸キネロラン;塩酸キンピロール;臭化キヌクリウム;ラミプリル;ローウォルフィアセルペンチーナ;レゼルピン;サプリサルタンカリウム;酢酸サララシン;ニトロプルシドナトリウム;塩酸スルフィナロール;タソサルタン;塩酸テルジピン;塩酸テモカプリル;塩酸テラゾシン;テルラキレン;チアメニジン;塩酸チアメニジン;チクリナフェン;チナビノール;チオダゾシン;塩酸チペントシン;トリクロールメチアジド;塩酸トリマゾシン;トリメタファンカムシレート;塩酸トリモキサミン;トリパミド;キシパミド;塩酸ザンキレン;ゾフェノプリラートアルギニン。
抗炎症薬:アルクロフェナク;アルクロメタゾンジプロピオネート;アルゲストンアセトニド;アルファアミラーゼ;アンシナファール;アンシナフィド;アムフェナクナトリウム;塩酸アミプリロース;アナキンラ;アニロラク;アニトラザフェン;アパゾン;バルサラジド二ナトリウム;ベンダザク;ベノキサプロフェン;塩酸ベンジダミン;ブロメライン;ブロペラモール;ブデソニド;カルプロフェン;シクロプロフェン;シンタゾン;クリプロフェン;クロベタゾルプロピオネート;クロベタゾンブチレート;クロピラク;クロチカゾンプロピオネート;酢酸コメタゾン;コルトドキソン;デフラザコート;デソニド;デゾキシメタゾン;デキサメタゾンジプロピオネート;ジクロフェナクカリウム;ジクロフェナクナトリウム;ジフロラゾンジアセテート;ジフルミドンナトリウム;ジフルニサル;ジフルプレドネート;ジフタロン;ジメチルスルフォキシド;ドロシノニド;エンドリゾン;エンリモマブ;エノリカムナトリウム;エピリゾール;エトドラク;エトフェナメート;フェルビナク;フェナモル;フェンブフェン;フェンクロフェナク;フェンクロラク;フェンドサル;フェンピパロン;フェンチアザク;フラザロン;フルアザコート;フルフェナミ酸;フルミゾール;酢酸フルニゾリド;フルニキシン;フルニキシンメグルミン;フルオコーチンブチル;酢酸フルオロメトロン;フルクァゾン;フルルビプロフェン;フルレトフェン;フルチカゾンプロピオネート;フラプロフェン;フロブフェン;ハルシノニド;ハロベタゾールプロピオネート;酢酸ハロプレドン;イブフェナク;イブプロフェン;イブプロフェンアルミニウム;イブプロフェンピコノール;イロニダプ;インドメタシン;インドメタシンナトリウム;インドプロフェン;インドキソール;イントラゾール;酢酸イソフルプレドン;イソキセパク;イソキシカム;ケトプロフェン;塩酸ロフェミゾール;ロルノキシカム;ロテプレドノルエタボネート;メクロフェナメートナトリウム;メクロフェナム酸;メクロリゾンジブチレート;メフェナム酸;メサラミン;メセクラゾン;メチルプレドニゾロンスレプタネート;モミフルメート;ナブメトン;ナプロキセン;ナプロキセンナトリウム;ナプロキソール;ニマゾン;オルサラジンナトリウム;オルゴテイン;オルパノキシン;オキサプロジン;オキシフェンブタゾン;塩酸パラニリン;ペントサンポリスルフェート;フェンブタゾンナトリウムグリセレート;ピルフェニドン;ピロキシカム;ピロキシカムシンナメート;ピロキシカムオラミン;ピルプロフェン;プレドナゼート;プリフェロン;プロドル酸;プロクァゾン;プロキサゾール;クエン酸プロキサゾール;リメキソロン;ロマザリット;サルコレックス;サルナセジン;サルサレート;塩化サンギナリウム;セクラゾン;セルメタシン;スドキシカム;スリンダク;スプロフェン;タルメタシン;タルニフルメート;タロサレート;テブフェロン;テニダプ;テニダプナトリウム;テノキシカム;テシカム;テシミド;テトリダミン;チオピナク;チクソコルトルピバレート;トルメチン;トルメチンナトリウム;トリクロニド;トリフルミデート;ジドメタシン;ゾメピラクナトリウム。
一部の実施形態では、創傷治癒を増大するのに有用な少なくとも1つの増殖因子、サイトカイン、ホルモン、若しくは細胞外マトリックス化合物又はタンパク質の有効量が投与される。一態様では、これらの薬剤の組合せが使用される。一態様では、本開示の実施において有用な増殖因子の例としては、限定されないが、EGF、PDGF、GCSF、IL6、IL8、IL10、MCP1、MCP2、組織因子、FGFb、KGF、VEGF、PLGF、MMP1、MMP9、TIMP1、TIMP2、TGFベータ、及びHGFが挙げられる。当業者は、使用される増殖因子、サイトカイン、ホルモン、又は細胞外マトリックスタンパク質の選択は、処置される損傷、疾患、又は障害のタイプ、対象の年齢、健康、性別、及び体重などの基準に依存して変化することを理解する。一態様では、増殖因子、サイトカイン、ホルモン、及び細胞外マトリックス化合物及びタンパク質は、ヒトである。
本開示の化合物に組み込まれ得るか、又は本開示の化合物内に添加物として含まれ得るタンパク質及び他の生物学的に活性な化合物の例としては、限定されないが、コラーゲン(架橋コラーゲンを含む)、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン(架橋エラスチンを含む)、オステオポンチン、オステオネクチン、骨シアロタンパク質(Bsp)、アルファ-2HS-糖タンパク質、骨Gla-タンパク質(Bgp)、マトリックスGla-タンパク質、骨リン糖タンパク質、骨リンタンパク質、骨プロテオグリカン、プロト脂質、骨形成タンパク質、軟骨誘導因子、骨増殖因子、酵素、又はそれらの組合せ及び生物学的に活性な断片が挙げられる。免疫応答を減少させるアジュバントもまた、本開示の複合体とともに使用することができる。
本開示における化合物又は物質として有用であり得る他の分子の例としては、限定されないが、成長ホルモン、レプチン、白血病抑制因子(LIF)、腫瘍壊死因子アルファ及びベータ、エンドスタチン、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、骨形成タンパク質-1、骨形成タンパク質2及び7、オステオネクチン、ソマトメジン様ペプチド、オステオカルシン、インターフェロンアルファ、インターフェロンアルファA、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロン1アルファ、並びにインターロイキン2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17及び18が挙げられる。アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を伴う実施形態は、任意のサイズ及び複雑さのこのような分子の任意のタイプ、並びにこのような分子の組合せを含み得る。
[実施例]
以下は、本開示を行うための具体的な実施形態の例である。これらの実施例は、例示的な目的のためにのみ提供され、本開示の範囲をいかなる方法でも限定することを意図するものではない。使用される数(例えば量、温度など)の精度を確保する努力がなされてきたが、当然に、いくつかの実験誤差と偏差は許容されるべきである。
本開示の実施は、特に断らない限り、当業者の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えDNA技術及び薬理学の従来の方法を採用する。このような技術は文献において十分に説明されている。例えばT.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993年); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989年); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990年); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992年)を参照されたい。
材料及び方法
目的の分子及び二重鎖:以下の分子又は二重鎖のうちの1つ以上を以下の実施例において試験することができる。
(1)miR-106bのアンタゴニスト、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド(例えばアンチセンスRNAオリゴヌクレオチド)。
例えば
i.「分子1:」配列AUCUGCACUGUCAGCACUUUA(配列番号6)を含むか又は有するRNAオリゴヌクレオチド
(2)miR-93分子。例えば
i.「分子2:」配列AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(配列番号3)を含むか又は有するRNAオリゴヌクレオチド
ii.「分子3:」配列CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(配列番号4)を含むか又は有するRNAオリゴヌクレオチド
(3)(a)hsa-miR-106bのアンチセンスオリゴヌクレオチド及び(b)別の核酸分子、例えばmiR-93配列を有する他の核酸分子の二重鎖。例えば
i.「二重鎖1:」配列AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(配列番号3)を含むか又は有するRNAオリゴヌクレオチドと一緒に二重鎖化された分子1
ii.「二重鎖2:」配列CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(配列番号4)を有するRNAオリゴヌクレオチドと一緒に二重鎖化された分子1。
任意の二重鎖、例えば二重鎖1及び二重鎖2が二重鎖形態で対象に提供され得るが、一部の実施形態では、二重鎖は、対象の体内で一旦分離した鎖に解離することができる。例えば二重鎖1及び2は、一部の実施形態では、対象の体内で分子1及び他のRNAオリゴヌクレオチドに分離することができる。
一部の実施形態では、分子1、二重鎖1、及び/若しくは二重鎖2の投与又は送達は、miR-106bのノックダウンをもたらす。一部の実施形態では、二重鎖1及び/若しくは二重鎖の投与又は送達は、miR-93の過剰発現をもたらす。
一部の実施例では、分子1、分子2、及び/又は分子3を使用する実験からの結果を、二重線1又は二重線2を使用する実験からの結果と比較する。一部の実施例では、分子1、2又は3を使用する実験と比較して、二重線1又は二重線2を使用する実験において優れた結果が観察され得る。
後肢虚血のマウスモデル及び潅流回復のモニタリング: 動物試験は、米国国立衛生研究所が発行した実験動物の管理及び使用に関する指針に準拠して、施設内動物管理委員会により承認されている。麻酔(ケタミン90mg/kg及びキシラジン10mg/kg)を導入した後、8～12週齢の雄C57B1/6J又はBALB/cJマウスに対して片側大腿動脈結紮及び切除を行った。潅流回復は、手術後0、3、7、14、及び21日目にレーザードップラーイメージング(Perimed, Inc.)を用いて測定される。虚血肢の潅流は、各マウスについて非虚血肢の潅流に正常化される。
マイクロRNAマイクロアレイ:手術後3日目にC57B1/6J及びBALB/cJマウス(n=3/群)から胃会陰筋を回収する。RNAは、TRIzol(商標)全トランスクリプトーム単離プロトコル及び製造業者の指示に従ったPure Link RNA Miniキット(Life Technologies, Carlsbad, Calif.)を用いて単離される。RNAを50μg量に分け、380のマウスマイクロRNA(V2マイクロRNA発現プロファイリングキット; miRbase 9.1)を含むIlluminaマイクロRNAチップを用いてアレイを行う。差次的に発現されたマイクロRNAは、虚血と系統（strain）の組合せによる調節、又は虚血又は系統単独による調節に基づいて選別される。
mRNAマイクロアレイ:虚血組織と非虚血組織の間のマウスmRNAアレイのために、BALB/cJマウス(n=3/群)の腓腹筋を後肢虚血(HLI)3日後に採取した。TRIzol(商標)全トランスクリプトーム単離プロトコルを用いて全RNAを抽出する。品質管理後、RNAを50μg量に分け、Gene Chipマウスゲノム43-2.0を用いてアレイを行う。HUVEC mRNAアレイについては、HUVECをスクランブル配列又はantimiR-106でトランスフェクトした後、HUVECからのRNAを単離し、低酸素及び血清飢餓の条件下で24時間インキュベートする(トランスフェクション後の合計48時間)。アレイは、Illumina Human 6 V 1プラットフォームを使用して行われる。IlluminaのGenome Studioを使用して非正規化データを得る。品質管理、前処理及び分位点の標準化は、R及びビーダレーパッケージを使用して行われる。遺伝子セットの濃縮のための分析は、100個の再配列及び<0.25のFDRカットオフを用いて、Broad InstituteからのGSEA V 2.0を用いて行われる。
miR-106bのインビボノックダウン:AntagomiR-106b及びスクランブル配列を合成する。オリゴ配列は、以下のとおりである:AntagomiR-106b:5'-AUCUGCACUGUCAGCACUUUA-3'(配列番号6)。スクランブル:5'-AAGGCAAGCUGACCCUGAAGUU-3'(配列番号10)。オリゴをPBSに溶解し、8mg/kg体重の用量で後眼窩に注射する。注射は、HLIの30分前、7日後、14日後に行う。インビボノックダウンの効率を検出するために、別の群のマウスを0、3及び7日目に安楽死させ、miR-106b発現をリアルタイムqPCRを用いて定量する。
細胞培養:プールされたHUVECを購入し(Cell Applications Inc, San Diego, Calif.)、10%FBSを含む標準内皮細胞増殖培地中で増殖させる(C Cell Applications Inc, San Diego, Calif.)。C2C12細胞を10%FBSを含むDMEM上で培養する。インビトロトランスフェクション研究には、neofxトランスフェクション剤(Ambion, Austin, Tex.)を用いる逆トランスフェクションプロトコルを用いる。antimiR-106b、miRNA阻害剤陰性対照(Cat. #44640760)、プレミR-106b又はmiRNA模倣陰性対照(Cat. #4464058)はAmbion, Austin, Texから購入される。初期用量反応実験は、miR-106bの効率的なノックダウンのための用量及び時間経過を決定するために、HUVEC及びC2C12細胞について行われる。これらの実験に基づいて、HUVECにおいてmiR-106bをノックダウン又は過剰発現させるために、15nMのantimiR-106b又はpremiR-106bの用量及びそれらのそれぞれの対照を使用する。C2C12細胞については、120nMの用量をantimiR-106b又はプレミR-106b及びそれらのそれぞれの対照に使用する。細胞増殖、チューブ形成及びアポトーシスアッセイは、トランスフェクションの48時間後に行われる。
細胞アポトーシス:HUVECについては1×104細胞/ウェルの密度で、C2C12細胞については0.5×104(premiR-106b対スクランブルについて)又は1×105(スクランブル対AntimiR-106bについて)の密度で、細胞を96ウェルプレートに播種する。トランスフェクション24時間後、miR-106b調節細胞を低酸素(2%酸素、BioSpherix、Lacona、N.Y.)及び血清飢餓(HSS)に曝露して、インビトロで虚血をシミュレートする。HUVECは48時間のHSSに曝露されるが、C2C12細胞は3時間のHSSに曝露される。C2C12細胞についてHSSへの曝露のより短い時間経過は、C2C12細胞がHSSのより長い持続時間で有意な細胞死を示すことを示す予備実験に基づいて選択される。インキュベーションの終了時に、細胞のおけるアポトーシスをTUNELアッセイ(TiterTACS、Trevigen Gaithersburg、Md.)を用いて決定する。TACSヌクレアーゼ処理ウェルを陽性対照として使用し、TdTsを添加しないウェルを陰性対照として使用する。各実験を少なくとも3回繰り返す。
細胞増殖:細胞を、HUVECについては5×103細胞/ウェルの平板密度で、C2C12細胞については0.5×103(premi R-106b対スクランブルについて)又は1×103(スクランブル対AntimiR-106bについて)の密度で、96ウェルプレートに平板培養する。細胞増殖は、テトラゾリウム色素取り込み(BioVision, Milpates, Calif.)を用いた播種の48時間後及び72時間後に、並びに死んだ細胞を除外するためにトリパンブルー染色後に手動で細胞数を測定することによって評価される。実験を3回繰り返す。
インビトロ血管新生アッセイ:48時間のトランスフェクション後、miR-106b調節HUVECをマトリゲル上に播種し、チューブ形成を評価する。premiR-106b又はスクランブルでトランスフェクトされた細胞を、48ウェルプレート中で30,000細胞/ウェルの細胞密度で増殖因子減少マトリゲル(Cat #356231,BD Biosciences, Bedford, Mass.)上に播種し、細胞を0%又は5%低血清増殖培地(Life Technologies, NY)の条件下で培養する。同様に、antimiR-106b又はスクランブル形質移入細胞を、増殖因子富化マトリゲル(Cat. #356234, BD Biosciences, Bedford, Mass.)上に播種し、0%又は5%の内皮細胞増殖因子の混合物(EGM CC-3124, Lonza, Allendale, NJ)の条件下で増殖させる。内皮細胞チューブ形成は、播種の6時間後に評価される。各条件は、3重にして行われる。100倍以下で各ウェルから4つの代表的な写真を撮り、全チューブ数をカウントし、1平方mmあたりのチューブ数として表す。
毛細血管密度:毛細血管密度の評価のために、HLI後21日、premiR-106b及びスクランブル処理されたBALB/cJマウス由来の虚血性腓腹筋を、OCT化合物中でフラッシュ凍結し、7μm厚さで切片化する。切片をまず5%正常ヤギ血清でブロックし、次にラット抗CD31抗体(1:25、BD Biosciences cat #550274)とともに4℃で一晩インキュベートする。次に、切片をPBSで洗浄し、室温で1時間、1:25希釈でAlexa-555結合ヤギ抗ラットIgGでプローブする。切片をPBSで洗浄し、Vectashieldマウント培地(Vector Lab, Burlingame, Calif.)でマウントする。一次抗体を含まない二次抗体のみを陰性対照として、非特異的結合を評価する。オリンパスBX51の高倍率顕微鏡を用いて、各切片から3つの代表的な写真を400倍の倍率で撮影する。CD31陽性スポット/視野の総数及び筋線維/視野の総数をカウントし、毛細血管をCD31陽性スポット/筋線維として表す。
[実施例1]
培養細胞におけるmiR-106bのノックダウン及び/又はmiR-93の過剰発現
miR-106bはノックダウンされ、及び/又はmiR-93はHUVEC及びC2C12細胞において過剰発現される。スクランブルantimir配列を対照として用いる。HUVEC及びC2C12細胞を培養し、antimiR-106b(例えば分子1)、miR-93分子(例えば分子2又は分子3)、二重鎖(例えば二重鎖1又は二重鎖2)又はスクランブルantimiR-106b配列で上述のように処理する。トランスフェクション後のmiR-106bレベル及び/又はmiR-93を評価する。少なくとも50%のmiR-106bの減少は有意な減少を示し、少なくとも50%のmiR-93の増加は有意な増加を示すであろう。
HSS後、miR-106bのノックダウンの効果及び/又はHUVECとC2C12細胞の両方におけるアポトーシスのマーカーであるカスパーゼ-9に対するmiR-93過剰発現の効果を評価する。トランスフェクション後のカスパーゼ-9の減衰（attetuation）は、miR-106bノックダウン及び/又はmiR-93過剰発現が、内皮細胞と骨格筋細胞の両方においてHSSに応答して細胞生存を仲介することを示す。
二重鎖1又は二重鎖2でトランスフェクトした細胞からの結果を、分子1、分子2又は分子3でトランスフェクトした細胞の結果と比較する。
[実施例2]
細胞増殖における分子及び/又は二重鎖の効果
虚血に対する血管新生反応には、内皮細胞の生存、増殖、及び遊走が含まれる。細胞増殖(例えば内皮細胞及びC2C12細胞における)に対する分子1、分子2、分子3、二重鎖1及び/又は二重鎖2の効果を、本明細書に開示された方法に従って調べる。(例えば上記の「材料及び方法」を参照されたい)。二重鎖1又は二重鎖2でトランスフェクトされた細胞からの結果を、分子1、分子2又は分子3でトランスフェクトされた細胞からの結果と比較する。
[実施例3]
後肢虚血後の潅流回復における分子及び/又は二重鎖の効果
mir-106b拮抗及び/又はmiR-93過剰発現がHLIに対する応答を調節するかどうかを試験するために、マウスを全身送達された分子1、分子2、分子3、二重鎖1、及び/又は二重鎖2で処理する。スクランブル処理されたマウスを対照として用いる。手術の30分前に、分子1、分子2、分子3、二重鎖1、及び/又は二重鎖2を単回静脈注射する。
miR-106b発現(例えば発現のノックダウン)及び/又はmiR-93発現(例えば過剰発現)に対する作用は、-1日目に開始し、後の時点、例えば注射後7日目に評価される。分子1、分子2、分子3、二重鎖1、及び/若しくは二重鎖2又はスクランブル配列をHLIの0、7、及び14日目に注入し、潅流回復をドップラーイメージングを用いてモニタリングする。antagomiR-106b(例えば分子1)処置されたマウスにおいて、HLI後のスクランブル処置されたマウスと比較して改善された潅流回復は、miR-106bの阻害が潅流回復を促進するのに有効であることを示す。
二重鎖1又は二重鎖2で処置されたマウスからの結果を、分子1、分子2又は分子3で処置されたマウスからの結果と比較する。
[実施例4]
インビボでの複数の遺伝子における分子及び二重鎖の効果
p21、p53、及びE2F-1は、虚血筋対非虚血筋において上方制御される。BALB/cJマウスを分子1、分子2、分子3、二重鎖1、及び/又は二重鎖2で処理し、スクランブル処理されたマウスと比較してp21、p53、及びE2F-1発現を評価する。分子1、分子2、分子3、二重鎖1、又は二重鎖2で処理したマウス(スクランブル処理されたマウスではない)におけるp21、p53、及びE2F-1の下方制御は、miR-106bノックダウン及び/又はmiR-93がインビボでこれらの遺伝子を調節することを示す。
二重鎖1又は二重鎖2で処置されたマウスからの結果を、分子1、分子2又は分子3で処置されたマウスからの結果と比較する。
[実施例5]
内皮の枝分かれのmiR-106b媒介性阻害における分子及び二重鎖の効果
マトリゲルモデルにおける内皮細胞チューブ形成に対するmiR-106bノックダウン及び/又はmiR-93過剰発現の効果は、本明細書に記載されるインビトロ血管形成アッセイに従って評価される。miR-106bは、内皮細胞管形成を約50%減少させる。
本実施例では、内皮細胞チューブ形成のおける分子1、分子2、分子3、二重鎖1、及び/又は二重鎖2の効果を評価する。内皮細胞チューブ形成におけるmiR-106bの効果の逆転は、インビトロでのmiR-106bノックダウン及び/又はmiR-93発現の血管新生促進的役割を示す。
二重鎖1又は二重鎖2を用いた実験の結果は、分子1、分子2又は分子3を用いた実験の結果と比較される。
本発明を、好ましい実施形態及び種々の代替実施形態を参照して、具体的に示し、説明してきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、その中で形態及び詳細の種々の変更を行うことができることは、当業者には理解される。
本明細書の本文中で引用された全ての参考文献、発行された特許及び特許出願は、全ての目的のために、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
番号付き実施形態
実施形態1:虚血に関連する疾患、障害、損傷、又は状態を処置又は予防する方法であって、miRNA発現、レベル、又は活性のアンタゴニストの有効量、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、上記miRNAはmiR-106bであり、それによって、虚血に関連する疾患、障害、又は状態を処置する、方法。
実施形態2:miR-106bがヒトmiR-106bである、実施形態1に記載の方法。
実施形態3:ヒトmiR-106bが、配列UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU(配列番号1)を含むヒトmiR-106b-5pである、実施形態2に記載の方法。
実施形態4:ヒトmiR-106bが、配列CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC(配列番号2)を含むヒトmiR-106b-3pである、実施形態2に記載の方法。
実施形態5:アンチセンスオリゴヌクレオチドがmiR-106bに結合するように、アンタゴニストが、成熟miR-106bの一部に完全に又は部分的に相補的である配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態6:アンチセンスオリゴヌクレオチドがDNAを含む、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態7:アンチセンスオリゴヌクレオチドがRNAを含む、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態8:アンチセンスオリゴヌクレオチドがmiR-106bのantagomirである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態9:アンチセンスオリゴヌクレオチドが1つ以上のヌクレオチド類似体を含む、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態10:1つ以上のヌクレオチド類似体がLNAを含む、実施形態9に記載の方法。
実施形態11:アンチセンスオリゴヌクレオチドが、成熟miR-106b分子と二重鎖を形成することができ、二重鎖が少なくとも約60℃のTmを有する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態12:アンチセンスオリゴヌクレオチドが、別の一本鎖RNA核酸分子と二重鎖を形成することができ、二重鎖が、約60℃未満、約50℃未満、約45℃未満、約40℃未満、約37℃未満、約35℃未満、約30℃未満、又は約25℃未満のTmを有する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態13:アンタゴニストがmiR-106bの発現、レベル、又は活性を低下させる、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態14:追加の治療剤を対象に投与することをさらに含む、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態15:上記追加の治療剤が抗虚血剤を含む、実施形態14に記載の方法。
実施形態16:アンタゴニストが、単離された核酸、又は単離された核酸を含むベクターによってコードされる、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態17:上記ベクターが、miRNA発現ベクター又はAAV発現ベクターから選択される発現ベクターである、実施形態16に記載の方法。
実施形態18:上記発現ベクターがmiRNA発現ベクターである、実施形態17に記載の方法。
実施形態19:上記単離された核酸が、細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態15に記載の方法。
実施形態20:アンタゴニストが脂質ビヒクル内に封入されている、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態21:有効量が、対象の内皮細胞又は筋細胞における少なくとも1つの細胞周期経路遺伝子の発現を低下させるか、又はその遺伝子の虚血誘導型上方制御を減弱させるのに有効である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態22:上記細胞周期経路遺伝子が、E2F-1及びp53からなる群から選択される、実施形態21に記載の方法。
実施形態23:上記発現が骨格筋細胞内である、実施形態16～22のいずれか一つに記載の方法。
実施形態24:有効量が、対象における潅流回復を増強するのに有効である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態25:有効量が、対象における虚血に対する血管新生応答を増強するのに有効である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態26:有効量が、細胞増殖を刺激するのに有効である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態27:細胞増殖が、内皮細胞又は筋細胞の増殖を含む、実施形態26に記載の方法。
実施形態28:有効量が、対象における毛細管密度を増加させるのに有効である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態29:有効量が、対象における1つ以上の細胞のアポトーシスを阻害するのに有効である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態30:上記アポトーシスが低酸素誘導型アポトーシスである、実施形態29に記載の方法。
実施形態31:上記投与が、経口、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、経鼻、経腸、局所、舌下、膣、眼、肺、直腸、胸骨内注射、腎臓透析注入、及び非経口からなる群から選択される経路による、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態32:上記投与が筋肉内である、実施形態31に記載の方法。
実施形態33:上記対象がヒトである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態34:上記虚血が、血管虚血、筋虚血、末梢動脈疾患、虚血再潅流障害、外傷に関連する虚血、及び脳虚血からなる群から選択され、場合により、虚血が末梢動脈疾患である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態35:miRNA発現、レベル、又は活性のアンタゴニストの有効量、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、上記miRNAがmiR-106bである、医薬組成物。
実施形態36:miR-106bがヒトmiR-106bである、実施形態35に記載の医薬組成物。
実施形態37:ヒトmiR-106bが、配列UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU(配列番号1)を含むヒトmiR-106b-5pである、実施形態36に記載の医薬組成物。
実施形態38:ヒトmiR-106bが、配列CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC(配列番号2)を含むヒトmiR-106b-3pである、実施形態36に記載の医薬組成物。
実施形態39:アンチセンスオリゴヌクレオチドがmiR-106bに結合するように、アンタゴニストが、成熟miR-106bの一部に完全に又は部分的に相補的である配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態35～38のいずれか1つに記載の医薬組成物。
実施形態40:アンチセンスオリゴヌクレオチドがDNAを含む、実施形態35～39のいずれか1つに記載の医薬組成物。
実施形態41:アンチセンスオリゴヌクレオチドがRNAを含む、実施形態35～40のいずれか1つに記載の医薬組成物。
実施形態42:アンチセンスオリゴヌクレオチドがmiR-106bのantagomirである、実施形態35～41のいずれか1つに記載の医薬組成物。
実施形態43:アンチセンスオリゴヌクレオチドが1つ以上のヌクレオチド類似体を含む、実施形態35～42のいずれか1つに記載の医薬組成物。
実施形態44:1つ以上のヌクレオチド類似体がLNAを含む、実施形態43に記載の医薬組成物。
実施形態45:アンチセンスオリゴヌクレオチドが、成熟miR-106b分子と二重鎖を形成することができ、二重鎖が少なくとも約60℃のTmを有する、実施形態35～44のいずれか1つに記載の医薬組成物。
実施形態46:アンチセンスオリゴヌクレオチドが、別の一本鎖RNA核酸分子と二重鎖を形成することができ、二重鎖が、約60℃未満、約50℃未満、約45℃未満、約40℃未満、約37℃未満、約35℃未満、約30℃未満、又は約25℃未満のTmを有する、実施形態35～45のいずれか1つに記載の医薬組成物。
実施形態47:アンタゴニストがmiR-106bの発現、レベル、又は活性を低下させる、実施形態35～46のいずれか1つに記載の医薬組成物。
実施形態48:追加の治療剤をさらに含む、実施形態35～47のいずれか1つに記載の医薬組成物。
実施形態49:上記追加の治療剤が抗虚血剤を含む、実施形態48に記載の医薬組成物。
実施形態50:アンタゴニストが、単離された核酸、又は単離された核酸を含むベクターによってコードされる、実施形態35～49のいずれか1つに記載の医薬組成物。
実施形態51:上記ベクターが、miRNA発現ベクター又はAAV発現ベクターから選択される発現ベクターである、実施形態50に記載の医薬組成物。
実施形態52:上記発現ベクターがmiRNA発現ベクターである、実施形態51に記載の医薬組成物。
実施形態53:上記単離された核酸が細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態50に記載の医薬組成物。
実施形態54:アンタゴニストが脂質ビヒクル内に封入されている、実施形態35～53のいずれか1つに記載の医薬組成物。
実施形態55:有効量が、対象の内皮細胞又は筋細胞における少なくとも1つの細胞周期経路遺伝子の発現を低下させるのに有効である、実施形態35～54のいずれか1つに記載の医薬組成物。
実施形態56:上記細胞周期経路遺伝子がE2F-1及びp53からなる群から選択される、実施形態55に記載の医薬組成物。
実施形態57:上記発現が骨格筋細胞内である、実施形態55又は56に記載の医薬組成物。
実施形態58:有効量が、対象における潅流回復を増強するのに有効である、実施形態35～57のいずれか1つに記載の医薬組成物。
実施形態59:有効量が、対象における虚血に対する血管新生応答を増強するのに有効である、実施形態35～58のいずれか1つに記載の医薬組成物。
実施形態60:有効量が、細胞増殖を刺激するのに有効である、実施形態35～59のいずれか1つに記載の医薬組成物。
実施形態61:細胞増殖が、内皮細胞又は筋細胞の増殖を含む、実施形態60に記載の医薬組成物。
実施形態62:有効量が、対象における毛細管密度を増加させるのに有効である、実施形態35～61のいずれか1つに記載の医薬組成物。
実施形態63:有効量が、対象における1つ以上の細胞のアポトーシスを阻害するのに有効である、実施形態35～62のいずれか1つに記載の医薬組成物。
実施形態64:上記アポトーシスが低酸素誘導型アポトーシスである、実施形態63に記載の医薬組成物。
実施形態65:経口、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、経鼻、経腸、局所、舌下、膣、眼、肺、直腸、胸骨内注射、腎臓透析注入、及び非経口からなる群から選択される経路による投与用に製剤化される、実施形態35～64のいずれか1つに記載の医薬組成物。
実施形態66:上記投与が筋肉内である、実施形態65に記載の医薬組成物。
実施形態67:それを必要とする対象における骨格筋虚血に関連する疾患、障害、損傷、又は状態を処置又は予防するための、実施形態35～66のいずれか1つに記載の医薬組成物、及び使用説明書を含むキットであって、上記疾患、障害、損傷、又は状態が末梢動脈疾患である、キット。
実施形態68:アンチセンスオリゴヌクレオチドがmiR-106b antagomirである、miR-106bのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む単離された核酸。
実施形態69:miR-106bがヒトmiR-106bである、実施形態68に記載の単離された核酸。
実施形態70:ヒトmiR-106bが、配列UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU(配列番号1)を含むヒトmiR-106b-5pである、実施形態69に記載の単離された核酸。
実施形態71:ヒトmiR-106bが、配列CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC(配列番号2)を含むヒトmiR-106b-3pである、実施形態69に記載の単離された核酸。
実施形態72:アンチセンスオリゴヌクレオチドがmiR-106bに結合するように、アンタゴニストが、成熟miR-106bの一部に完全に又は部分的に相補的である配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態68～71のいずれか1つに記載の単離された核酸。
実施形態73:アンチセンスオリゴヌクレオチドがDNAを含む、実施形態68～72のいずれか1つに記載の単離された核酸。
実施形態74:アンチセンスオリゴヌクレオチドがRNAを含む、実施形態68～73のいずれか1つに記載の単離された核酸。
実施形態75:アンチセンスオリゴヌクレオチドが1つ以上のヌクレオチド類似体を含む、実施形態68～74のいずれか1つに記載の単離された核酸。
実施形態76:1つ以上のヌクレオチド類似体がLNAを含む、実施形態75に記載の単離された核酸。
実施形態77:1つ以上のヌクレオチド類似体がLNAを含む、実施形態68～76のいずれか1つに記載の単離された核酸。
実施形態78:アンチセンスオリゴヌクレオチドが、別の一本鎖RNA核酸分子と二重鎖を形成することができ、二重鎖が、約60℃未満、約50℃未満、約45℃未満、約40℃未満、約37℃未満、約35℃未満、約30℃未満、又は約25℃未満のTmを有する、実施形態68～77のいずれか1つに記載の単離された核酸。
実施形態79:アンタゴニストがmiR-106bの発現、レベル、又は活性を減少させる、実施形態68～78のいずれか1つに記載の単離された核酸。

Claims (59)

  1. (a)miR-93核酸分子;及び
    (b)miR-106bのアンタゴニスト
    を含む核酸二重鎖。
  2. 二重鎖がRNA:RNA二重鎖である、請求項1に記載の核酸二重鎖。
  3. miR-106bのアンタゴニストが、miR-106bの少なくとも一部に完全に又は部分的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1又は2に記載の核酸二重鎖。
  4. 二重鎖が、配列AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(配列番号3)を含むmiR-93 RNA、又は配列CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(配列番号4)を含むmiR-93 RNAを含む、請求項1、2又は3に記載の核酸二重鎖。
  5. 二重鎖がmiR-106bのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列AUCUGCACUGUCAGCACUUUA(配列番号6)を含む、請求項1～4のいずれか一項に記載の核酸二重鎖。
  6. miR-106bの発現、レベル、又は活性のアンタゴニスト。
  7. アンタゴニストが、miR-106bの少なくとも一部に完全に又は部分的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項6に記載のアンタゴニスト。
  8. miR-106bが、配列UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU(配列番号1)を含むヒトmiR-106b-5pである、請求項7に記載のアンタゴニスト。
  9. miR-106bが、配列CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC(配列番号2)を含むヒトmiR-106b-3pである、請求項7に記載のアンタゴニスト。
  10. DNAを含む、請求項6～9のいずれか一項に記載のアンタゴニスト。
  11. RNAを含む、請求項6～9のいずれか一項に記載のアンタゴニスト。
  12. アンタゴニストが、antagomir miR-106bである、請求項6～11のいずれか一項に記載のアンタゴニスト。
  13. アンチセンスオリゴヌクレオチドが1つ以上のヌクレオチド類似体を含む、請求項7～12のいずれか一項に記載のアンタゴニスト。
  14. 1つ以上のヌクレオチド類似体が、ロックド核酸(LNA)を含む、請求項13に記載のアンタゴニスト。
  15. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、成熟miR-106b分子と二重鎖を形成することができ、二重鎖が少なくとも約60℃の融解温度(Tm)を有する、請求項7～14のいずれか一項に記載のアンタゴニスト。
  16. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、別の一本鎖RNA分子と二重鎖を形成することができる、請求項7～14のいずれか一項に記載のアンタゴニスト。
  17. 他の一本鎖RNA分子がmiR-93 RNA分子である、請求項16に記載のアンタゴニスト。
  18. アンチセンスオリゴヌクレオチドの二重鎖及び他の一本鎖RNA分子が、約65℃未満、約60℃未満、約55℃未満、約50℃未満、約45℃未満、約40℃未満、約37℃未満、約35℃未満、約30℃未満、又は約25℃未満のTmを有する、請求項16又は17に記載のアンタゴニスト。
  19. a.アンタゴニストが、miR-106bの少なくとも一部に完全に又は部分的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり;
    b.アンチセンスオリゴヌクレオチドが、成熟miR-106b分子と二重鎖を形成することができ;
    c.アンチセンスオリゴヌクレオチドが、別の一本鎖RNA分子と二重鎖を形成することができ;及び
    d.成熟miR-106b分子とアンチセンスオリゴヌクレオチドによって形成される二重鎖のTmが、他の一本鎖RNA分子とアンチセンスオリゴヌクレオチドによって形成される二重鎖のTmよりも大きい、請求項6～18のいずれか一項に記載のアンタゴニスト。
  20. 他の一本鎖RNA分子がmiR-93 RNA分子である、請求項19に記載のアンタゴニスト。
  21. miR-93 RNA分子が、配列AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(配列番号3)又は配列CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(配列番号4)を含む、請求項20に記載のアンタゴニスト。
  22. アンタゴニストが、単離された核酸、又は単離された核酸を含むベクターによってコードされる、請求項6～21のいずれか一項に記載のアンタゴニスト。
  23. 前記ベクターが、miRNA発現ベクター又はAAV発現ベクターから選択される発現ベクターである、請求項22に記載のアンタゴニスト。
  24. 前記発現ベクターがmiRNA発現ベクターである、請求項23に記載のアンタゴニスト。
  25. 前記単離された核酸が細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項22、23又は24に記載のアンタゴニスト。
  26. アンタゴニスト又は核酸二重鎖が脂質ビヒクル内に封入されている、請求項6～25のいずれか一項に記載のアンタゴニスト又は請求項1～5のいずれか一項に記載の核酸二重鎖。
  27. (a)請求項1～5若しくは26のいずれか一項に記載の核酸二重鎖又は請求項6～26のいずれか一項のアンタゴニストの有効量;及び(b)薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  28. 追加の治療剤をさらに含む、請求項27に記載の医薬組成物。
  29. 前記追加の治療剤が抗虚血剤を含む、請求項28に記載の医薬組成物。
  30. 有効量が、医薬組成物を投与される対象の内皮細胞又は筋細胞における少なくとも1つの細胞周期経路遺伝子の発現を低下させるのに有効である、請求項27～29のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  31. 前記細胞周期経路遺伝子が、E2F-1及びp53からなる群から選択される、請求項30に記載の医薬組成物。
  32. 前記発現が骨格筋細胞内である、請求項30又は31に記載の医薬組成物。
  33. 有効量が、医薬組成物を投与される対象における潅流回復（perfusion recovery）を増強するのに有効である、請求項27～32のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  34. 有効量が、医薬組成物を投与される対象における虚血に対する血管新生応答を増強するのに有効である、請求項27～33のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  35. 有効量が細胞増殖を刺激するのに有効である、請求項27～34のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  36. 細胞増殖が、内皮細胞又は筋細胞の増殖を含む、請求項35に記載の医薬組成物。
  37. 有効量が、医薬組成物を投与される対象における毛細管密度を増加させるのに有効である、請求項27～36のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  38. 有効量が、医薬組成物を投与される対象における1つ以上の細胞のアポトーシスを阻害するのに有効である、請求項27～37のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  39. 前記アポトーシスが低酸素誘導型アポトーシスである、請求項38に記載の医薬組成物。
  40. 経口、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、経鼻、経腸、局所、舌下、膣、眼、肺、直腸、胸骨内注射、腎臓透析注入、及び非経口からなる群から選択される経路による投与用に製剤化される、請求項27～39のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  41. 前記投与が筋肉内である、請求項40に記載の医薬組成物。
  42. 虚血に関連する疾患、障害、損傷、若しくは状態を処置又は予防する方法であって、それを必要とする対象に、請求項27～41のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  43. 追加の治療剤を対象に投与することをさらに含む、請求項42に記載の方法。
  44. 前記追加の治療剤が抗虚血剤を含む、請求項43に記載の方法。
  45. 有効量が、対象の内皮細胞又は筋細胞における少なくとも1つの細胞周期経路遺伝子の発現を低下させるか、又はその遺伝子の虚血誘導型上方制御を減弱させるのに有効である、請求項42～44のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記細胞周期経路遺伝子が、E2F-1及びp53からなる群から選択される、請求項45に記載の方法。
  47. 前記発現が骨格筋細胞内である、請求項42～46のいずれか一項に記載の方法。
  48. 有効量が、対象における潅流回復を増強するのに有効である、請求項42～47のいずれか一項に記載の方法。
  49. 有効量が、対象における虚血に対する血管新生応答を増強するのに有効である、請求項42～48のいずれか一項に記載の方法。
  50. 有効量が、細胞増殖を刺激するのに有効である、請求項42～49のいずれか一項に記載の方法。
  51. 細胞増殖が、内皮細胞又は筋細胞の増殖を含む、請求項50に記載の方法。
  52. 有効量が、対象の毛細管密度を増加させるのに有効である、請求項42～51のいずれか一項に記載の方法。
  53. 有効量が、対象における1つ以上の細胞のアポトーシスを阻害するのに有効である、請求項42～52のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記アポトーシスが低酸素誘導型アポトーシスである、請求項53に記載の方法。
  55. 前記投与が、経口、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、経鼻、経腸、局所、舌下、膣、眼、肺、直腸、胸骨内注射、腎臓透析注入、及び非経口からなる群から選択される経路による、請求項42～54のいずれか一項に記載の方法。
  56. 投与が筋肉内である、請求項55に記載の方法。
  57. 前記対象がヒトである、請求項42～55のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記虚血が、血管虚血、筋虚血、末梢動脈疾患、虚血再潅流障害、外傷に関連する虚血、及び脳虚血からなる群から選択される、請求項42～57のいずれか一項に記載の方法。
  59. 虚血が末梢動脈疾患である、請求項58に記載の方法。
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