KR101943623B1

KR101943623B1 - 멜팅 피크 분석을 이용한 타겟 핵산서열의 정량

Info

Publication number: KR101943623B1
Application number: KR1020157023027A
Authority: KR
Inventors: 천종윤
Original assignee: 주식회사 씨젠
Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2019-01-30
Also published as: JP2016508733A; US10106840B2; EP2971115A4; JP6703564B2; JP2018183153A; US20160068892A1; EP2971115A1; KR20150109478A; EP2971115B1; WO2014142575A1

Abstract

본 발명은 핵산 증폭 전에 핵산 증폭에서 멜팅 피크 분석을 실시할 최소 2개의 사이클을 미리 결정하고, 최소 2개의 미리 정해진 사이클에서 멜팅 피크 분석을 실시하며, 이어서 멜팅 피크 커브로부터의 데이터 값(예컨대, 존재 또는 부존재, 높이 및 면적)을 이용하여 타겟 핵산서열을 정량하는 방법으로 실시되는 타겟 핵산서열의 정량 방법에 관한 것이다.

Description

멜팅 피크 분석을 이용한 타겟 핵산서열의 정량{Quantification of Target Nucleic Acid Using Melting Peak Analysis}

본 특허출원은 2013년 3월 13일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제2013-0026837호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명은 멜팅 분석을 이용하여 타겟 핵산서열을 정량하는 방법에 관한 것이다.

핵산 증폭은 분자 생물학 분야에서 이용되는 필수적인 과정으로, 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 대부분의 기술들은 핵산 증폭 과정을 포함하고 있다. 이에 다양한 증폭 방법이 제시되었다.

대표적인 핵산 중폭방법인 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 이중가닥 DNA의 변성, DNA 주형에로의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 어닐링 및 DNA 중합효소에 의한 프라이머 연장의 반복된 사이클 과정을 포함한다(Mullis et al., 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki et al.,(1985) Science 230, 1350-1354).

핵산을 증폭하기 위한 다른 방법으로 LCR(Ligase Chain Reaction), SDA(Strand Displacement Amplification), NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), TMA(Transcription Mediated Amplification) 및 RCA(Rolling-Circle Amplification)와 같은 다양한 방법들이 제시되었다.

핵산 증폭을 통하여 타겟 핵산을 검출하기 위한 방법으로, 핵산의 증폭을 실시간으로 측정하면서 타겟 핵산을 검출할 수 있는 실시간(real-time) 검출 방법이 널리 이용되고 있다.

실시간 검출 방법은 일반적으로 타겟 서열에 특이적으로 혼성화하는 표지된 프로브를 이용한다. 표지된 프로브와 타겟 서열간의 혼성화를 이용하는 방법의 예로, 헤어핀 구조를 형성하는 이중 표지된 프로브를 이용하는 분자 비콘(Molecular beacon) 방법(Tyagi et al, Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996), 공여체(donor) 또는 수여체(acceptor)로 단일 표지된 두 개의 프로브를 이용하는 혼성화 프로브(Hybridization probe) 방법(Bernad et al, 147-148 Clin Chem 2000; 46) 및 단일 표지된 올리고뉴클레오티드를 이용하는 Lux 방법(미국특허 제7,537,886호)이 개발되었다. 또한, 이중 표지된 프로브의 혼성화 뿐만 아니라 DNA 중합효소의 5'-뉴클레아제 활성에 의한 이중 표지된 프로브의 절단반응을 이용하는 TaqMan 방법(미국특허 제5,210,015호 및 제5,538,848호)이 많이 이용되고 있다.

호모지니어스(Homogeneous) 분석 방식으로서 실시간 검출 방법은, 하나의 튜브 안에서 증폭 반응 및 검출 분석이 모두 이루어지므로 실시하기가 상대적으로 편리하다. 또한, 실시간 검출 방법은 오염으로부터 자유롭다. 다만, 실시간 방식으로 복수의 타겟 서열을 동시에 검출하는 경우, 하나의 타겟 당 한 타입의 형광 물질을 사용해야 하므로 형광물질의 이용이 제한되고, 형광물질 간의 스펙트럼 간섭(spectrum interference)현상 때문에 하나의 샘플 당 검출 가능한 타겟 수가 제한되는 한계가 있다.

호모지니어스 분석 방식으로 타겟을 검출할 수 있는 다른 방법으로, 타겟 증폭 후 일정 구간에서 온도를 올리거나 내리면서 형광세기를 모니터링한 다음, 멜팅 프로파일(melting profile)에 의해 증폭산물을 검출하는 post-PCR 멜팅 분석(melting assay)이 있다.

미국 특허 제5,871,908호 및 미국 특허 제6,174,670호는 이중 가닥의 타겟 서열 또는 타겟 서열과 프로브간 이합체의 멜팅 분석을 통하여 타겟을 검출하는 방법을 개시하고 있다. WO 2012/096523호는 타겟 서열의 존재에 의존적으로 생성되는 연장이합체의 멜팅 분석을 개시하고 있다. 멜팅 분석을 위해 타겟 서열을 이용하지 않는 상기 방법은 타겟 서열이 존재하는 경우, 미리 선별된 서열을 갖는 연장이합체를 형성시키고, 이는 보다 효율적으로 멜팅 분석을 실시할 수 있게 한다.

멜팅 분석을 이용하는 상기 방법들은 이합체의 고유한 멜팅 온도(melting temperature)를 이용하기 때문에, 한 타입의 형광 표지를 사용하여 복수의 타겟 서열을 동시에 검출할 수 있다는 장점이 있다(참조 미국 특허 제8,039,215호).

한편, 진단 분야에서는 예후진단이나 약제 반응성(drug responsiveness) 분석을 위하여 타겟의 검출뿐만 아니라 타겟 서열의 정량을 요구하고 있다.

표준 정량 곡선 및 C_t(threshold cycle) 값을 이용하여 타겟 서열을 정량하기 위해 실시간 PCR 분석이 이용되고 있다. 농도를 알고 있는 타겟 서열을 순차적으로 희석시켜 준비한 표준물질에 대한 증폭 곡선을 얻은 다음, 표준물질의 초기 양의 log 값과 C_t 값을 이용하여 표준 정량 곡선을 구한다. 미지 시료의 C_t 값을 실시간 PCR에 의해 얻은 다음, 표준 정량 곡선을 이용하여 정량한다. 상기 정량 방법은 상대적으로 간편하지만, 시료 추출 과정에서의 손실이나 PCR 저해(inhibition)로 인한 심각한 문제를 갖는다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 내부 대조군(internal control)을 이용하는 정량 방법이 제안되었다.

멜팅 피크(melting peak)의 높이나 면적을 이용함으로써 post-PCR 멜팅 분석을 정량에 응용하는 방법도 있다.

예를 들어, 미국 특허 제6,245,514호는 타겟 서열과 농도를 알고 있는 핵산 분자(기준 주형; reference template)를 핵산-결합 형광 염료(nucleic-acid-binding fluorescent dye)의 존재 하에서 증폭시켜 증폭 산물에 대한 멜팅피크를 얻고, 이를 적분하여 타겟 서열과 기준 주형의 상대적인 양을 결정함으로써 타겟 서열의 농도를 계산하는 방법을 기재하고 있다. 이때, 타겟 서열과 기준 주형은 서로 다른 T_m 값을 가지므로 서로 구별되어 검출될 수 있다. 미국 특허 제6,174,670호는 혼성화 프로브 및 멜팅 피크를 이용한 정량 방법을 개시하고 있다. 상기 방법들은 타켓 증폭 후에 멜팅 분석을 실시하므로, 증폭 종료 사이클 및 멜팅 분석을 실시한 사이클에 따라 정량 결과가 달라질 수 있다는 단점이 있다.

미국 특허 제8,039,215호는 타겟 증폭에서 멜팅 분석을 실시하여 각각의 증폭 사이클에 대한 멜팅 피크의 최대값을 구하고, 역치(threshold) 값 이상의 최대값에 도달하는 사이클을 결정함으로써 타겟 서열을 정량하는 방법을 개시하고 있다. 상기 방법은 역치(threshold) 값 이상의 최대값에 도달하는 사이클을 결정하기 위하여 대부분의 증폭 사이클에서 멜팅 분석을 실시해야 하기 때문에 더 긴 분석 시간을 요구한다.

이와 같은 종래 기술 상황 하에서, 본 발명자들은 단일 검출 채널로 복수의 타겟 서열을 검출하기 위해 멜팅 분석을 이용하며 보다 신속하게 향상된 정량 결과를 제공할 수 있는 정량 방법을 개발한다면, 복수의 타겟 서열을 보다 효율적으로 동시에 검출하고 정량할 수 있을 것임을 인식하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허들 및 문헌들이 참조되고 그 인용이 괄호로 표시되어 있다. 이러한 특허들 및 문헌들의 개시 내용은 본 발명 및 본 발명이 속하는 기술 수준을 보다 명확하게 설명하기 위하여 그 전체로서 본 명세서에 참조로 포함되어 있다.

본 발명자들은 보다 편리하고 효율적인 방식으로 타겟 핵산서열을 정량하는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 최소 2개의 미리 정해진 증폭 사이클에서 얻어지는 증폭 산물을 직접 또는 간접적으로 멜팅 분석에 이용함으로써 타겟 핵산서열을 정량하는 새로운 방법을 확립하였다. 본 발명의 타겟 핵산서열 정량 방법은 종래 정량 방법과 관련된 문제점을 극복할 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 멜팅 피크 커브를 이용하여 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 정량하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위와 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다.

본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 멜팅 피크 커브(melting peak curve)를 이용하여 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 정량하는 방법을 제공한다:

(a) 일련의 반응을 반복하는 사이클을 통하여 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 증폭시켜 라벨링 모이어티(labeling moiety)를 포함하는 이합체를 형성시키는 단계로서; 상기 이합체는 이중 가닥 형태의 상기 증폭된 타겟 핵산서열, 상기 타겟 핵산서열과 프로브 간의 혼성화에 의하여 형성된 이합체 또는 상기 타겟 핵산서열의 존재에 의존적으로 형성된 이합체를 포함하고; 상기 이합체의 형성은 상기 타겟 핵산서열의 증폭에 비례하여 증가하며; 상기 라벨링 모이어티는 상기 이합체의 결합(association) 또는 해리(dissociation) 과정 동안에 검출 가능한 시그널을 발생시키고;

(b) 상기 단계 (a)의 반복과정 동안에, 상기 이합체로부터 검출가능한 시그널이 검출되는 온도 범위에서의 멜팅 분석을 미리 정해진(predetermined) 사이클에서 실시하는 것에 의하여 최소 2개의 미리 정해진 사이클에 대한 멜팅 피크 커브를 얻는 단계; 및

(c) 상기 멜팅 피크 커브를 이용하여 상기 타겟 핵산서열을 정량하는 단계.

본 발명자들은 보다 편리하고 효율적인 방식으로 타겟 핵산서열을 정량하는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 최소 2개의 미리 정해진 증폭 사이클에서 얻어지는 증폭 산물을 직접 또는 간접적으로 멜팅 피크 분석에 이용함으로써 타겟 핵산서열을 정량하는 새로운 방법을 확립하였다. 본 발명의 타겟 핵산서열 정량방법은 종래 정량 방법과 관련된 문제점을 극복할 수 있다.

본 발명을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 라벨링 모이어티를 포함하는 이합체의 형성

본 발명에 따르면, 타겟 핵산 서열은 증폭되어 라벨링 모이어티(labeling moiety)를 포함하는 이합체를 형성한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “타겟 핵산”, “타겟 핵산서열” 또는 “타겟 서열”은 정량하고자 하는 핵산서열을 의미한다. 타겟 핵산서열은 이중 가닥뿐만 아니라 단일 가닥의 서열을 포함한다. 타겟 핵산서열은 핵산 시료 내에 처음부터 존재하는 서열뿐만 아니라 반응과정에서 새롭게 생성되는 서열을 포함한다.

본 발명의 구현예에 따르면, 상기 타겟 핵산서열은 특정한 증폭 및 혼성화 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.

본 발명의 구현예에 따르면, 상기 타겟 핵산서열은 일련의 반응을 반복하는 사이클에 의해 증폭된다.

본 발명의 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction), LCR(ligase chain reaction, 참조: Wiedmann M, et al., "Ligase chain reaction (LCR)- overview and applications." PCR Methods and Applications 1994 Feb;3(4):S51-64), Barany F. "Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase." Proc Natl Acad Sci USA., 88(1):189-93(1991)), GLCR(gap filling LCR, 참조: WO 90/01069, EP 439182 및 WO 93/00447), Q-beta(Q-beta replicase amplification, 참조: Cahill P, et al., "Polymerase chain reaction and Q beta replicase amplification" Clin Chem., 37(9):1482-5(1991), 미국 특허 제5556751호), SDA(strand displacement amplification, 참조: G T Walker et al., "Strand displacement amplification-an isothermal, in vitro DNA amplification technique" Nucleic Acids Res. 20(7):16911696(1992), EP 497272), 3SR(self-sustained sequence replication, 참조: Mueller JD et al., "Self-sustained sequence replication (3SR): an alternative to PCR" Histochem Cell Biol. 108(4-5):431-7(1997), NASBA(nucleic acid sequence-based amplification, 참조: Compton, J. "Nucleic acid sequence-based amplification". Nature 350(6313):912(1991); Keightley, MC et al., "Real-time NASBA detection of SARS-associated coronavirus and comparison with real-time reverse transcription-PCR". Journal of medical virology 77(4):6028(2005)), TMA(Transcription-Mediated Amplification, 참조: Hofmann WP et al., "Comparison of transcription mediated amplification (TMA) and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for detection of hepatitis C virus RNA in liver tissue" J Clin Virol. 32(4):289-93(2005); 미국특허 제5888779호).) 또는 RCA(Rolling Circle Amplification, 참조: Hutchison C.A. et al., "Cell-free cloning using phi29 DNA polymerase" Proc. Natl Acad. Sci. USA. 102:1733217336(2005); Dean F.B., et al., Nelson J.R. et al., "Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi 29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification. Genome Res. 11:10951099(2001))에 의해 실시된다.

상기 기술된 증폭 방법들은 온도 변화를 수반하거나 수반하지 않고 일련의 반응을 반복하여 증폭할 수 있다. 일련의 반응의 반복을 포함하는 증폭의 단위를 “사이클”로 표현한다. 사이클의 단위는 증폭 방법에 따라 반복의 횟수 또는 시간으로 나타낼 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “사이클”은 일련의 반응의 1회 반복을 하나의 단위로 할 수 있으며, 또는 일정한 시간 간격으로 실시되는 일련의 반응의 반복을 하나의 단위로 할 수 있다.

본 발명의 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열의 증폭은 온도가 변화하는 조건하에서 증폭용 프라이머와 타겟 핵산서열간의 혼성화, 프라이머의 연장 및 연장가닥의 해리(dissociation)를 포함하는 일련의 반응을 반복함으로써 달성되며, 상기 사이클은 일련의 반응의 1회 반복을 하나의 단위로 가진다. 일련의 반응의 1회 반복을 1 사이클로, 2회 반복을 2 사이클로 표현한다.

본 발명의 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열의 증폭은 등온 조건(isothermal condition)하에서 일련의 반응을 반복함으로써 달성되며, 상기 사이클은 일정한 시간 간격으로 실시되는 일련의 반응의 반복을 하나의 단위로 가진다. 예를 들어, 1분 동안에 실시되는 일련의 반응의 반복을 사이클의 단위로 정의한다면, 1분 동안 실시되는 일련의 반응의 반복을 1분 사이클(또는 1 사이클)로 표현하며, 2분 동안 실시되는 일련의 반응의 반복을 2분 사이클(또는 2 사이클)로 표현한다.

본 발명의 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열의 증폭은 PCR에 의해 실시된다. PCR은 핵산 분자를 증폭하기 위하여 해당 기술 분야에서 폭넓게 사용되고 있으며, 타겟 서열의 변성, 타겟 서열에의 어닐링(혼성화) 및 프라이머 연장으로 이루어진 사이클의 반복을 포함한다(미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354).

증폭되는 타겟 핵산서열은 모든 DNA(gDNA 또는 cDNA), RNA 분자 또는 그들의 혼성화물(키메라 핵산)을 포함할 수 있다. 상기 서열은 이중-가닥 또는 단일-가닥 형태일 수 있다. 출발 물질인 핵산이 이중-가닥인 경우, 이중 가닥을 단일-가닥 또는 부분적인 단일-가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥을 분리하는 방법에는 가열, 알칼리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예컨대, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질 등이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥의 분리는 80℃ 내지 105℃ 범위의 온도에서 가열함으로써 달성될 수 있다. 이러한 처리를 달성하기 위한 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 의해 제공된다.

mRNA가 출발 물질로서 사용되는 경우에는, 어닐링 단계를 실시하기 이전에 역전사 단계가 필요하며, 역전사 단계의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366(1988)에 개시되어 있다. 역전사를 위해, mRNA의 폴리 A 테일에 혼성화될 수 있는 올리고뉴클레오티드 dT 프라이머, 랜덤 프라이머 또는 타겟-특이적인 프라이머를 이용할 수 있다.

본 발명의 방법은 주형 핵산 분자가 어떤 특정한 서열이나 길이를 가지고 있을 것을 요하지 않는다. 구체적으로, 상기 분자는 어떠한 자연(naturally occurring) 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유 동물과 인간을 포함하는 고등 동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산을 포함한다. 또한 상기 핵산 분자는 재조합에 의해 생산된 또는 생산될 수 있는 어떠한 핵산 분자 또는 화학적으로 합성된 또는 합성될 수 있는 어떠한 핵산 분자도 포함할 수 있다. 따라서, 상기 핵산 서열은 자연에서 발견되거나 발견되지 않을 수 있다.

프라이머는 타겟 서열(주형)의 한 부위에 혼성화되거나 어닐링되어 이중-가닥 구조를 형성한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로서, 핵산 가닥(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건하에서, 즉, 뉴클레오티드 및 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도 및 pH 조건하에서, 합성의 개시점으로 작용할 수 있다.

상기 프라이머는 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍할 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)를 포함하는 많은 인자에 의해 좌우될 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오티드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오티드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

본 발명의 구현예에 따르면, 본 발명에 사용되는 프라이머는 본 발명의 발명자에 의해 개발된 이중 프라이밍(DPO) 구조를 갖는다. 상기 DPO 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드는 종래 프라이머 및 프로브에 비해 훨씬 더 높은 타겟 특이성을 나타낸다(참조 WO 2006/095981; Chun et. al., Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6e40(2007)).

본 명세서에서 사용되는 용어 “프로브”는 타겟 핵산서열에 실질적으로 상보적인 하나의 부위 또는 부위들을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자를 의미한다.

본 발명의 구현예에 따르면, 프라이머 및 프로브는 단일 가닥의 올리고디옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머 및 프로브는 자연적으로 발생하는(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오티드 또는 비-자연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 프라이머 및 프로브는 PNA(Peptide Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 WO 92/20702) 또는 LNA(Locked Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 WO 98/22489, WO 98/39352 및 WO 99/14226)를 포함할 수 있다. 또한 프라이머 및 프로브는 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 “어닐링(annealing)” 또는 “혼성화(hybridization)”는 상보적인 단일 가닥 핵산들로부터 이중-가닥 핵산이 형성되는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하는 경우에도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다.

증폭을 위한 프라이머와 타겟 서열의 어닐링은 최적화 절차에 의하여 일반적으로 결정되는 적합한 혼성화 조건 하에서 실시될 수 있다. 온도, 성분의 농도, 혼성화와 세척 횟수, 버퍼 성분, 및 이들의 pH와 이온 강도 등과 같은 조건은 올리고뉴클레오티드(프라이머)와 타겟 뉴클레오티드 서열의 길이 및 GC 함량을 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 짧은 올리고뉴클레오티드를 이용하는 경우, 낮은 엄격조건(stringent condition)을 채택하는 것이 바람직하다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.

용어“어닐링”과 “혼성화” 사이에 차이는 없으며, 두 용어는 혼용될 수 있다.

본 발명에서 이용되는 프라이머는 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오티드 서열을 가진다. 본 명세서에서 사용된 용어 “상보적”은 지정된 어닐링 조건 또는 엄격 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 용어 “실질적으로 상보적(substantially complementary)” 및 “완전히 상보적(perfectly complementary)”인 것을 모두 포괄한다. 본 발명의 구현예에서, 용어 “상보적”은 “완전히 상보적”인 것을 의미한다.

타겟 서열에 어닐링된 프라이머는 주형-의존적 중합효소에 의해 연장되며, 이는 E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 본 발명의 구현예에서, 주형-의존적 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 수득된 열안정성 DNA 중합효소이며, 박테리아 종에는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii , Thermus caldophilus , Thermus chliarophilus , Thermus flavus , Thermus igniterrae , Thermus lacteus , Thermus oshimai , Thermus ruber , Thermus rubens, Thermus scotoductus , Thermus silvanus , Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana , Thermosipho africanus , Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi , Thermococcus gorgonarius , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus woesei , Pyrococcus horikoshii , Pyrococcus abyssi , Pyrodictium occultum , Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieus가 포함된다.

중합 반응을 실시할 때, 반응에 필요한 성분들은 반응 용기에 과량으로 제공될 수 있다. 연장 반응의 성분들과 관련하여 과량은 기대하는 연장을 달성하는 능력이 상기 성분들의 농도에 의해 실질적으로 제한되지 않을 정도의 각 성분들의 양을 의미한다. 원하는 반응이 일어나게 하기 위해 Mg² ⁺와 같은 필요한 보조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP들을 충분한 양으로 반응 혼합물에 제공하는 것이 바람직하다.

검출 시그널을 제공할 수 있는 이합체는 증폭 반응에 의해 형성된다.

용어 “검출 시그널”은 타겟 핵산서열의 존재를 입증하는 이합체의 형성을 나타내는 모든 시그널을 의미한다. 이합체는 타겟 핵산서열의 존재를 입증하며, 이는 검출 시그널을 검출하여 결정된다.

본 발명의 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 이합체는 증폭 반응에 의해 형성된 이중가닥의 증폭산물(amplicon), 타겟 핵산서열과 프로브간의 혼성화에 의해 형성된 이합체, 또는 타겟 핵산서열의 존재에 의존적으로 형성된 이합체이다.

본 발명의 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열과 프로브간의 혼성화에 의하여 형성되는 상기 이합체의 경우, 상기 프로브는 증폭반응에 의해 형성되는 이중가닥의 증폭산물의 내부 서열에 혼성화될 수 있는 프로브이다. 상기 프로브는 멜팅 분석에서 시그널을 제공할 수 있는 모든 프로브, 예를 들면, 분자 비콘(Molecular beacon^TM; 미국 특허 제5,925,517호), 하이비콘(Hybeacons^TM; D. J. French, et al., Molecular and Cellular Probes (2001) 13, 363374 및 미국 특허 제7,348,141호), 이중-표지된, 자가-퀀칭된 프로브(Dual-labeled, self-quenched probe; 미국 특허 제5,876,930호), 룩스(LUX^TM; I. A. Nazarenko, et al. Nucleic Acids Res 2002, 30:2089-2095. 및 US 7,537,886), 혼성화 프로브(Hybridization probe; Bernard PS, et al., Clin Chem 2000, 46, 147-148 및 미국 특허 제6,174,670호)를 포함한다.

타겟 핵산서열의 존재에 의존적으로 형성되는 이합체는 증폭반응에 의해 형성되는 타겟 서열의 증폭산물 그 자체는 아니며, 타겟 핵산서열의 증폭에 비례하여 그 양이 증가하는 이합체이다. 타겟 핵산서열의 존재에 의존적으로 형성되는 이합체는 다양한 방법에 따라 얻을 수 있다.

본 발명의 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열의 존재에 의존적으로 형성되는 이합체는 본 발명자에 의해 개발된 PTOCE(PTO Cleavage and Extension) 방법에 의해 얻을 수 있으며(참조 WO 2012/096523), 이는 본 명세서에 참고문헌으로 삽입되어 있다.

간략하게, PTOCE는 다음의 단계를 포함한다: (a) 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오티드 및 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오티드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오티드 서열을 포함하며; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함하며; 상기 3'-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5'-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오티드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고; (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오티드 또는 그의 연장가닥은 상기 5'뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5'-태깅 부위 또는 5'-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고; (c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편을 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 CTO는 3'→5' 방향으로 (i) 상기 PTO의 5'-태깅 부위 또는 5'-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고; 및 (d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 연장이합체를 형성하며, 상기 연장이합체는 (i) 상기 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 CTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 상기 단편의 서열 및/또는 길이와 상기 CTO의 서열 및/또는 길이에 의하여 조절 가능한 Tm 값을 갖는다.

상기 PTOCE의 단계 (d)에서 형성된 연장이합체가 본 발명에서 이용되는 이합체의 한 예이다.

상기 PTOCE 방법을 본 발명에 적용하는 경우, 본 발명은 다음의 단계를 포함한다: (a) 상기 PTO, 상기 프라이머 및 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 타겟 핵산서열을 증폭시키고, 상기 PTO를 절단시켜 단편을 방출시키는 단계; 및 (b) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편을 CTO와 혼성화시키고 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장이합체를 형성시키는 단계.

상기 PTO의 5'-태깅 부위는 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 CTO의 템플레이팅 부위는 상기 PTO의 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)”는 (ⅰ) 프로브의 역할을 하는 3'-타겟팅 부위 및 (ⅱ) 타겟 핵산서열과의 혼성화 이후 절단되어 PTO로부터 방출되며, 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 5'-태깅 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 PTO의 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위는 5'→3' 순서로 위치해야 한다.

상기 PTO는 어떠한 특정 길이를 요하지 않는다. 예를 들어, PTO의 길이는 15-150 뉴클레오티드, 15-100 뉴클레오티드, 15-80 뉴클레오티드, 15-60 뉴클레오티드, 15-40 뉴클레오티드, 20-150 뉴클레오티드, 20-100 뉴클레오티드, 20-80 뉴클레오티드, 20-60 뉴클레오티드, 20-50 뉴클레오티드, 30-150 뉴클레오티드, 30-100 뉴클레오티드, 30-80 뉴클레오티드, 30-60 뉴클레오티드, 30-50 뉴클레오티드, 35-100 뉴클레오티드, 35-80 뉴클레오티드, 35-60 뉴클레오티드 또는 35-50 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 PTO의 3'-타겟팅 부위는 그 부위가 타겟 핵산서열에 특이적으로 혼성화되는 한, 어떠한 길이도 가능하다. 예를 들어, 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 10-100 뉴클레오티드, 10-80 뉴클레오티드, 10-50 뉴클레오티드, 10-40 뉴클레오티드, 10-30 뉴클레오티드, 15-100 뉴클레오티드, 15-80 뉴클레오티드, 15-50 뉴클레오티드, 15-40 뉴클레오티드, 15-30 뉴클레오티드, 20-100 뉴클레오티드, 20-80 뉴클레오티드, 20-50 뉴클레오티드, 20-40 뉴클레오티드 또는 20-30 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 5'-태깅 부위는 그 부위가 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 특이적으로 혼성화되어 연장되는 한, 어떠한 길이도 가능하다. 예를 들어, 상기 PTO의 5'-태깅 부위는 5-50 뉴클레오티드, 5-40 뉴클레오티드, 5-30 뉴클레오티드, 5-20 뉴클레오티드, 10-50 뉴클레오티드, 10-40 뉴클레오티드, 10-30 뉴클레오티드, 10-20 뉴클레오티드, 15-50 뉴클레오티드, 15-40 뉴클레오티드, 15-30 뉴클레오티드 또는 15-20 뉴클레오티드일 수 있다.

상기 PTO의 3'-말단은 3'-OH 터미널을 가질 수도 있다. 본 발명의 구현예에서, 상기 PTO의 3'-말단은 그의 연장이 방지되도록 “블록킹”된다.

상기 CTO는 상기 PTO로부터 방출된 단편의 연장을 위한 주형의 역할을 한다. 프라이머의 역할을 하는 상기 단편은 상기 CTO에 혼성화되고, 연장되어 연장이합체를 형성한다.

템플레이팅 부위는 그 부위가 상기 PTO의 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위에 비-상보적인 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다. 또한, 상기 템플레이팅 부위는 그 부위가 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편의 연장을 위한 주형의 역할을 할 수 있는 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다.

상술한 바와 같이, 상기 PTO의 5'-태깅 부위를 갖는 단편이 방출되는 경우, 상기 CTO의 캡처링 부위는 5'-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 디자인 하는 것이 바람직하다. 상기 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부를 갖는 단편이 방출되는 경우, 상기 CTO의 캡처링 부위는 상기 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 디자인 하는 것이 바람직하다. 상기 PTO의 5'-태깅 부위의 일부를 갖는 단편이 방출되는 경우, 상기 CTO의 캡처링 부위는 상기 5'-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 디자인 하는 것이 바람직하다.

더욱이, 상기 PTO의 절단 위치를 예상함으로써 상기 CTO의 캡처링 부위를 디자인할 수 있다. 예를 들어, 상기 CTO의 캡처링 부위가 상기 5'-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 디자인하는 경우, 상기 5'-태깅 부위의 일부를 갖는 단편 또는 상기 5'-태깅 부위를 갖는 단편은 상기 캡처링 부위와 혼성화될 수 있으며 이후 연장될 수 있다. 상기 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부를 포함하는 단편이 방출되는 경우, 상기 단편은 상기 5'-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 디자인된 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화될 수 있으며, 상기 단편의 3'-말단 부위에 미스매치 뉴클레오티드가 존재하는 경우에도 성공적으로 연장될 수 있다. 이것은 프라이머의 3'-말단이 일부 미스매치 뉴클레오티드(예컨대, 1-3 미스매치 뉴클레오티드)를 포함하는 경우에도, 프라이머가 반응 조건에 따라 연장될 수 있기 때문이다.

상기 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부를 포함하는 단편이 방출되는 경우, 상기 CTO의 캡처링 부위의 5'-말단 일부는 상기 절단된 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지도록 디자인함으로써 미스매치 뉴클레오티드와 관련된 문제를 해결할 수 있다.

상기 CTO의 길이는 폭넓게 다양해 질 수 있다. 예를 들어, 상기 CTO는 7-1000 뉴클레오티드, 7-500 뉴클레오티드, 7-300 뉴클레오티드, 7-100 뉴클레오티드, 7-80 뉴클레오티드, 7-60 뉴클레오티드, 7-40 뉴클레오티드, 15-1000 뉴클레오티드, 15-500 뉴클레오티드, 15-300 뉴클레오티드, 15-100 뉴클레오티드, 15-80 뉴클레오티드, 15-60 뉴클레오티드, 15-40 뉴클레오티드, 20-1000 뉴클레오티드, 20-500 뉴클레오티드, 20-300 뉴클레오티드, 20-100 뉴클레오티드, 20-80 뉴클레오티드, 20-60 뉴클레오티드, 20-40 뉴클레오티드, 30-1000 뉴클레오티드, 30-500 뉴클레오티드, 30-300 뉴클레오티드, 30-100 뉴클레오티드, 30-80 뉴클레오티드, 30-60 뉴클레오티드 또는 30-40 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 상기 CTO의 캡처링 부위는 그 부위가 상기 PTO로부터 방출된 단편에 특이적으로 혼성화될 수 있는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 CTO의 캡처링 부위는 5-100 뉴클레오티드, 5-60 뉴클레오티드, 5-40 뉴클레오티드, 5-30 뉴클레오티드, 5-20 뉴클레오티드, 10-100 뉴클레오티드, 10-60 뉴클레오티드, 10-40 뉴클레오티드, 10-30 뉴클레오티드, 10-20 뉴클레오티드, 15-100 뉴클레오티드, 15-60 뉴클레오티드, 15-40 뉴클레오티드, 15-30 뉴클레오티드 또는 15-20 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 상기 CTO의 템플레이팅 부위는 그 부위가 상기 PTO로부터 방출된 단편의 연장반응에서 주형의 역할을 할 수 있는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 CTO의 템플레이팅 부위는 2-900 뉴클레오티드, 2-400 뉴클레오티드, 2-300 뉴클레오티드, 2-100 뉴클레오티드, 2-80 뉴클레오티드, 2-60 뉴클레오티드, 2-40 뉴클레오티드, 2-20 뉴클레오티드, 5-900 뉴클레오티드, 5-400 뉴클레오티드, 5-300 뉴클레오티드, 5-100 뉴클레오티드, 5-80 뉴클레오티드, 5-60 뉴클레오티드, 5-40 뉴클레오티드, 5-30 뉴클레오티드, 10-900 뉴클레오티드, 10-400 뉴클레오티드, 10-300 뉴클레오티드, 15-900 뉴클레오티드, 15-100 뉴클레오티드, 15-80 뉴클레오티드, 15-60 뉴클레오티드, 15-40 뉴클레오티드 또는 15-20 뉴클레오티드 길이일 수 있다.

상기 CTO의 3'-말단은 3'-OH 터미널을 가질 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 상기 CTO의 3'-말단은 그의 연장이 방지되도록 블록킹된다.

상기 PTOCE 방법에 의하여 형성된 이합체는 타겟 핵산서열의 존재에 의존적으로 형성되는 이합체의 한 예이다.

타겟 핵산서열의 존재에 의존적으로 형성되는 이합체의 다른 예에는 상기 PTOCE 방법에 의해 형성된 이합체의 가닥과 그 가닥에 특이적으로 혼성화된 프로브간의 이합체가 포함된다.

멜팅 분석을 위한 이합체는 다른 방법에 의해 타겟-의존적인 방식으로 형성될 수 있으며 본 발명의 정량 방법에 이용될 수 있다.

라벨링 모이어티(표지)는 이합체의 결합(association) 또는 해리(dissociation) 과정에서 검출 가능한 시그널을 발생시킨다.

본 발명의 구현예에 따르면, 표지는 증폭반응에서 형성되는 이중가닥 증폭산물에 연결될 수 있다. 증폭용 프라이머는 표지를 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 타겟 핵산서열과 프로브간의 이합체를 이용하는 경우, 표지는 프로브에 연결되거나 타겟 핵산서열 및 프로브 모두에 연결될 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 타겟 핵산서열의 존재에 의존적으로 형성되는 이합체를 이용하는 경우, 이합체를 형성하는 올리고뉴클레오티드가 표지를 포함하고 있을 수 있다. 예를 들어, PTOCE 방법을 적용하는 경우, 표지는 상기 PTO로부터 방출되는 단편 및/또는 CTO에 연결될 수 있다.

본 발명의 구현예에 따르면, 이합체의 라벨링 모이어티는 이합체 중 어느 한 가닥에 연결된 단일 표지, 이합체 중 어느 한 가닥에 모두 연결된 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호 작용적 이중 표지(가닥 내 상호 작용적 이중 표지), 이합체의 양 가닥에 각각 연결된 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호 작용적 이중 표지(가닥 간 상호 작용적 이중 표지), 또는 상기 이합체에 삽입되는 인터컬레이팅 염료(intercalating dye)이다.

단일표지는 예를 들어 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 또는 전기화학적 표지 및 금속 표지를 포함한다.

본 발명의 구현예에 따르면, 상기 단일표지는 이중가닥 또는 단일가닥 상에 존재하는지에 따라 서로 다른 시그널(예컨대, 다른 시그널 세기)을 제공한다.

본 발명의 구현예에 따르면, 단일표지는 형광 표지이다. 본 발명에서 사용되는 단일 형광 표지의 바람직한 종류 및 결합 위치는 미국특허 제7,537,886호 및 제7,348,141호에 개시되어 있으며, 이들은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 포함되어 있다. 예를 들어, 단일 형광 표지는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다.

상기 단일표지는 다양한 방법에 의해 올리고뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 예를 들어, 표지는 탄소 원자들을 포함하는 스페이서(spacer)를 통해 프로브에 연결된다(예컨대, 3-carbon spacer, 6-carbon spacer 또는 12-carbon spacer).

상호작용적 표지 시스템의 대표적 예로서, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 시스템은 형광 리포터 분자(공여체 분자) 및 퀀처 분자(수용체 분자)를 포함한다. FRET에서, 에너지 공여체는 형광성이나, 에너지 수용체는 형광성 또는 비-형광성일 수 있다. 상호작용적 표지 시스템의 다른 형태에서, 에너지 공여체는 비-형광성, 예컨대, 발색단(chromophore)이고, 에너지 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템의 또 다른 형태에서, 에너지 공여체는 발광성(luminescent), 예컨대 생물발광성, 화학발광성 또는 전기발광성이고, 에너지 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템은 “접촉-매개 퀀칭(on contact-mediated quenching)”을 기초로 하는 이중표지를 포함한다(Salvatore et al., Nucleic Acids Research, 2002 (30) no.21 e122 및 Johansson et al., J. AM. CHEM. SOC 2002 (124) pp 6950-6956). 상호작용적 표지 시스템은 시그널 변화가 최소 두 개의 분자(예컨대, 염료)간의 상호작용에 의해 유도되는 어떤 표지 시스템도 포함한다.

본 발명에서 유용한 리포터 분자 및 퀀처 분자는 해당 기술 분야에서 알려진 어떠한 분자도 포함할 수 있다. 그 예는 다음과 같다: Cy2™(506), YO-PRO™-1(509), YOYO™-1(509), Calcein(517), FITC(518), FluorX™(519), Alexa™(520), Rhodamine 110(520), Oregon Green™ 500(522), Oregon Green™ 488(524), RiboGreen™(525), Rhodamine Green™(527), Rhodamine 123(529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™(533), TO-PRO™-1(533), TOTO1(533), JOE(548), BODIPY530/550(550), Dil(565), BODIPY TMR(568), BODIPY558/568(568), BODIPY564/570(570), Cy3™(570), Alexa™ 546(570), TRITC(572), Magnesium Orange™(575), Phycoerythrin R&B(575), Rhodamine Phalloidin(575), Calcium Orange™(576), Pyronin Y(580), Rhodamine B(580), TAMRA(582), Rhodamine Red™(590), Cy3.5™(596), ROX(608), Calcium Crimson™(615), Alexa™ 594(615), Texas Red(615), Nile Red(628), YO-PRO™-3(631), YOYO™-3(631), R-phycocyanin(642), C-Phycocyanin(648), TO-PRO™-3(660), TOTO3(660), DiD DilC(5)(665), Cy5™(670), Thiadicarbocyanine(671), Cy5.5(694), HEX(556), TET(536), Biosearch Blue(447), CAL Fluor Gold 540(544), CAL Fluor Orange 560(559), CAL Fluor Red 590(591), CAL Fluor Red 610(610), CAL Fluor Red 635(637), FAM(520), Fluorescein(520), Fluorescein-C3(520), Pulsar 650(566), Quasar 570(667), Quasar 670(705) 및 Quasar 705(610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 최대 발광파장이다. 바람직하게는, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다.

적합한 형광분자 및 적합한 리포터-퀀처 쌍은 다음과 같은 다양한 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Aalysis: A Pracrical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2^nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution OF Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6^th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996); 미국특허 제3,996,345호 및 제4,351,760호.

본 발명에서 광범위한 파장 또는 특정 파장의 형광을 퀀칭할 수 있는 비-형광 퀀처 분자(예컨대, 블랙 퀀처 또는 다크 퀀처)를 이용할 수 있다는 것은 주목할 만하다. 이들의 예로는 BHQ 및 DABCYL이 있다.

리포터 및 퀀처 분자를 포함하는 시그널링 시스템에서, 리포터는 FRET의 공여체를 포함하며, 퀀처는 FRET의 다른 파트너(수용체)를 포함한다. 예를 들어, 플루오레세인 염료는 리포터로, 로다민 염료는 퀀처로 이용된다.

본 발명에서 유용한 인터컬레이팅 염료(intercalating dye)의 예에는, SYBR^TM Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTO^TM43, SYTO^TM44, SYTO^TM45, SYTOX^TMBlue, POPO™-1, POPO™-3, BOBO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO™-1, YO-PRO^TM1, TO-PRO^TM1, SYTO^TM11, SYTO^TM13, SYTO^TM15, SYTO^TM16, SYTO^TM20, SYTO^TM23, TOTO™-3, YOYO^TM3, GelStar^TM 및 싸이아졸 오렌지(thiazole orange)가 포함된다. 인터컬레이팅 염료는 이중-가닥 핵산 분자 내에 특이적으로 끼어들어가서 시그널을 발생시킨다.

본 발명에 적용할 수 있는 PTOCE 방법의 표지 및 시그널 발생은 WO 2012/096523에 기재되어 있다. 본 발명에 PTOCE 방법이 적용되는 경우, 표지 및 시그널 발생을 다음과 같은 예로 설명할 수 있다:

이합체 중 한 가닥에 모두 연결된 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지(즉, 가닥 내 이중표지)를 이용하는 경우, 상기 PTO로부터 방출된 단편 또는 상기 CTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지를 포함하며; 상기 단계 (b)에서 이합체의 멜팅은 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널 제공을 유도한다. 본 발명의 구현예에서, 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자는 상기 CTO의 5'-말단 및 3'-말단에 연결된다. 예를 들어, 상기 CTO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 그의 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 0-5 뉴클레오티드 이격된 위치에 위치하고, 다른 하나는 CTO의 형태(conformation)에 따라 상기 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭(quenching) 또는 언퀀칭(unquenching)할 수 있는 곳에 위치한다. 또 다른 예로서, 상기 CTO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중의 하나는 그의 3'-말단 또는 3'-말단으로부터 0-5 뉴클레오티드 이격된 위치에 위치하고, 다른 하나는 CTO의 형태에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 또는 언퀀칭할 수 있는 곳에 위치한다.

상기 이합체의 두 가닥의 각 가닥에 각각 연결된 리포터 분자 및 퀀자 분자를 포함하는 상호 작용적 이중표지(즉, 가닥 간 이중표지)를 이용하는 경우, 상기 PTO 단편은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지 중 하나를 가지며, 상기 CTO는 상호작용적 이중 표지 중 나머지 하나를 가지고, 상기 단계 (b)에서의 상기 이합체의 멜팅은 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널 제공을 유도한다. 상기 이합체의 퀀처 분자에 의하여 상기 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀칭될 수 있는 한, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 상기 PTO 단편 및 상기 CTO의 어떤 위치에도 위치할 수 있다. 예를 들어, PTO 단편 상의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 5'-태깅 부위의 5'-말단에 위치한다. 예를 들어, CTO 상의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 그의 3'-말단에 위치한다.

이합체 중 하나의 가닥에 연결되어 있는 단일표지를 이용하는 경우, 상기 PTO 단편 또는 상기 CTO는 단일표지를 가지며, 상기 단계 (b)에서의 상기 이합체의 멜팅은 상기 단일표지로부터의 시그널 제공을 유도한다. 상기 이합체의 멜팅에 따라 상기 단일표지로부터의 시그널 수준에 변화가 있는 한, 단일표지는 CTO 상의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다. 예를 들어, 단일표지는 CTO의 템플레이팅 부위 또는 캡처링 부위에 연결된다. 상기 이합체의 멜팅에 따라 상기 단일표지로부터의 시그널 수준에 변화가 있는 한, 단일표지는 PTO 단편 상의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.

단계 (b): 이합체의 멜팅 및 멜팅 피크 커브

이어서, 타겟 핵산 서열의 증폭 동안에, 최소 2개의 미리 정해진 사이클에서 이합체로부터의 시그널을 일정 범위의 온도에서 검출한다(멜팅 분석). 시그널 검출은 일정 범위의 온도에서 단계 (a)에서 형성된 이합체의 멜팅에 의해 발생되는 시그널 검출 및 일정 범위의 온도에서 단계 (a)에서 형성된 이합체의 멜팅 후 혼성화에 의해 발생되는 시그널 검출을 포함한다.

본 발명의 특징은 타겟 핵산서열의 증폭과정 동안에 최소 2개 이상의 미리 정해진 사이클로부터 얻은 각각의 증폭산물(또는 증폭산물을 나타내는 이합체)에 대하여 멜팅 분석을 실시하는데 있다.

종래 멜팅 분석 또는 멜팅 피크 분석은 타겟 증폭을 완료한 후 한 번 실시한다. 그렇지 않으면, 다른 종래 방법은 미리 정해진 역치 값(threshold value)의 멜팅 피크 높이를 나타내는 사이클을 찾기 위해 타겟 증폭과정 동안 대부분의 사이클에서 멜팅 분석을 실시한다(참조: 미국특허 제8,039,215호).

종래 방법과 달리, 본 발명은 타겟 핵산서열의 증폭과정 동안에 최소 2개의 미리 정해진 사이클로부터 얻어진 증폭산물(또는 증폭산물을 나타내는 이합체)에 대하여 멜팅 분석을 실시한 다음, 멜팅 분석의 결과를 정량에 이용함으로써, 정량 분석의 정확성, 신속성 및 편리성의 측면에서 종래 방법의 문제점을 완전히 극복한다.

단계 (b)는 해당 기술 분야에서 알려진 다양한 멜팅 분석 과정에 의해 실시될 수 있다. 사용된 용어 “멜팅 분석”은 달리 명시하지 않는 한, 좁은 의미의 멜팅 분석뿐만 아니라 혼성화 분석을 포괄하는 의미로 사용된다. 좁은 의미의 멜팅 분석은 온도 조절에 의해 증가하는 엄격 조건하에서 이합체의 해리를 측정하는 방법을 의미한다. 좁은 의미의 혼성화 분석은 온도 조절에 의해 감소하는 엄격 조건하에서 이합체의 결합을 측정하는 방법을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 “멜팅 커브”또는 “멜팅 피크 커브”는 달리 명시하지 않는 한, 좁은 의미의 멜팅 분석으로부터 얻은 멜팅 커브나 멜팅 피크 커브뿐만 아니라 혼성화 분석으로부터 얻은 혼성화 커브나 혼성화 피크 커브를 포괄하는 의미로 사용된다.

멜팅 커브 또는 혼성화 커브는 종래 기술들 예컨대, 미국특허 제6,174,670호 및 제5,789,167호, Drobyshev et al., Gene 188: 45(1997); Kochinsky and Mirzabekov Human Mutation 19:343(2002); Livehits et al., J. Biomol . Structure Dynam . 11:783(1994); 및 Howell et al., Nature Biotechnology 17:87(1999)에 기술된 방법들에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 멜팅 커브 또는 혼성화 커브는 혼성화 엄격도(stringency)의 파라미터를 이용한 아웃풋 시그널(output signal) 변화의 그래픽 플롯(graphic plot) 또는 디스플레이(display)로 구성될 수 있다. 아웃풋 시그널은 혼성화 파라미터에 대하여 직접적으로 플롯팅을 할 수 있다. 전형적으로, 멜팅 커브 또는 혼성화 커브는, Y-축에 플롯팅된 이합체 구조의 정도(즉, 혼성화 정도)를 나타내는 아웃풋 시그널, 예컨대 형광, 및 X-축에 플롯팅된 혼성화 파라미터를 갖는다.

멜팅(혼성화) 커브 분석 및 멜팅(혼성화) 피크 분석은 미국특허 제8,039,215호에 개시된 것을 참조하여 기술될 수 있다.

본 발명 방법의 실시 전, 멜팅 커브 분석을 실시할 최소 2개 사이클을 미리 정하고, 이후 타겟 증폭과정 동안에 미리 정해진 사이클에서 멜팅 커브 분석을 실시한다.

멜팅 커브 분석은 미리 정해진 사이클 이전에, 사이클 동안에 또는 사이클 이후에 실시될 수 있다.

멜팅 커브 분석을 실시할 사이클은 증폭 방법의 특징을 고려하여 미리 결정할 수 있다. 예를 들어, PCR 증폭 방법을 사용하는 경우, 초기 증폭단계, 지수적 증폭 단계 및 증폭의 포화 단계를 고려하여 멜팅 커브 분석을 실시할 사이클을 선택할 수 있다. 일반적으로, 멜팅 커브 분석을 실시할 사이클 및 수는 시료 내 타겟 핵산서열의 양을 고려하여 선택할 수 있다.

본 발명의 구현예에 따르면, 멜팅 커브 분석을 실시하는 사이클의 수는 최소 2, 3, 4, 5 또는 6 개이며, 최대 40, 30, 20, 15, 10 또는 8 개이다.

본 발명의 구체적인 구현예의 경우, 멜팅 커브 분석을 실시하는 사이클 수는 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-7, 2-5, 3-40, 3-30, 3-20, 3-15, 3-10, 3-7 또는 3-5개 사이클이다.

본 발명의 구현예에 따르면, 멜팅 커브 분석을 실시하는 사이클 간의 간격은 최소 2, 5, 10, 15 또는 20 사이클이며 최대 40, 30 또는 20 사이클이다.

본 발명의 구체적인 구현예의 경우, 멜팅 커브 분석을 실시하는 사이클간의 간격은 2-40, 5-20, 5-15 또는 10-15 사이클이다.

예를 들어, 멜팅 분석을 실시하는 사이클을 20번째, 30번째 및 40번째로 선택한 경우, 멜팅 커브 분석을 실시하는 사이클 수는 3이며, 이러한 경우에서 사이클 간의 간격은 10 사이클이다.

단계 (c): 멜팅 피크 커브를 이용한 정량 분석

그 다음, 멜팅 피크 커브를 이용하여 타겟 핵산 서열의 정량을 실시한다.

본 발명의 특징은 멜팅 피크 커브로부터 정량 수치를 계산한 다음, 상기 정량 수치를 이용하여 타겟 핵산서열을 정량하는 것이다.

본 발명의 구현예에 따르면, 미리 정해진 사이클에서의 멜팅 피크 커브의 존재 여부를 이용하여 타겟 핵산서열을 정량한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 미리 정해진 사이클에서의 멜팅 피크 커브의 높이 또는 면적을 이용하여 타겟 핵산서열을 정량한다.

멜팅 커브는 최소 2개의 미리 정해진 사이클로부터의 시그널 검출을 통해 얻어지며, 그 다음 멜팅 피크가 얻어진다. 이어서, 멜팅 피크 커브의 최대 높이 값 또는 면적 값이 얻어진다. 타겟 핵산서열의 양이 많아질수록, 보다 빠른 사이클에서 멜팅 피크 커브가 얻어지며, 이를 타겟 핵산서열의 정량에 이용한다. 멜팅 피크 커브의 최대 높이 값 또는 면적 값은 시그널을 발생시키는 이합체의 양을 반영할 수 있다. 이합체의 양은 타겟 핵산서열의 양에 비례한다. 따라서, 멜팅 피크 커브의 최대 높이 값 또는 면적 값은 타겟 핵산서열의 초기 양을 반영할 수 있다.

타겟 핵산서열의 정량은 최소 2개의 미리 정해진 증폭 사이클에서 얻어진 멜팅 피크의 존재(또는 부재), 및/또는 멜팅 피크의 높이 또는 면적을 이용하여 다양한 방법으로 실시될 수 있다.

멜팅 피크 커브에 의해 제공된 멜팅 피크의 높이 또는 면적은 특정한 규칙에서의 유도(또는 변형) 없이 또는 유도(또는 변형)를 거쳐서 타겟 핵산서열의 정량에 이용될 수 있다.

멜팅 피크 커브 값(예컨대, 높이 및 면적)을 멜팅 피크 커브가 나온 미리 정해진 사이클에 부여된 기준 수치와 함께 사용하는 경우, 상기 기준 수치는 멜팅 피크 커브 값의 크기를 고려하여 미리 선택할 수 있다.

본 발명의 구현예에 따르면, 멜팅 피크의 높이 및 면적은 최대 높이 및 면적이다.

첫 번째 방법의 경우, 최소 2개의 미리 정해진 사이클에서 얻어진 모든 멜팅 피크 커브를 이용하여 타겟 핵산서열의 초기 양을 정량한다.

본 발명의 구현예에 따르면, 정량 수치를 얻기 위하여, 멜팅 피크 커브가 나온 미리 정해진 사이클의 모든 기준 수치 및/또는 멜팅 피크 커브의 모든 값들(예컨대, 높이 및 면적)을 이용하여 연산과정(예컨대, 더하기, 빼기, 곱하기 또는 나누기)을 수행한 다음 타겟 핵산서열의 초기 양을 결정한다.

본 발명의 구현예에 따르면, 정량 수치를 얻기 위하여, 멜팅 피크 커브가 나온 미리 정해진 사이클의 모든 기준 수치 및/또는 멜팅 피크 커브의 일부 값들(예컨대, 높이 및 면적)을 이용하여 연산과정(예컨대, 더하기, 빼기, 곱하기 또는 나누기)을 수행한 다음 타겟 핵산서열의 초기 양을 결정한다.

본 발명의 구현예에 따르면, 정량 수치를 얻기 위하여, 멜팅 피크 커브가 나온 미리 정해진 사이클의 기준 수치의 일부 및/또는 멜팅 피크 커브의 모든 값들(예컨대, 높이 및 면적)을 이용하여 연산과정(예컨대, 더하기, 빼기, 곱하기 또는 나누기)을 수행한 다음 타겟 핵산서열의 초기 양을 결정한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 미리 정해진 사이클에서 얻어지는 멜팅 피크 커브들의 모든 최대 높이 값 또는 면적 값을 더하여 타겟 핵산서열의 초기 양을 정량한다. 예를 들어, 멜팅 분석을 실시할 3개 사이클(30, 40 및 50 사이클)을 미리 선택하고, 이어서 증폭반응을 진행한 다음 멜팅 분석을 실시하여 멜팅 피크를 얻는다. 멜팅 피크 커브들의 최대 높이 값들 또는 면적 값들을 합한 다음, 합산한 값들을 정량을 위하여 비교한다. 예를 들어, 합산한 값들이 커질수록 타겟 핵산서열의 초기 양이 더 큰 것으로 결정된다.

본 발명의 또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 최소 2개의 미리 정해진 사이클에 기준 수치를 부여하고 멜팅 피크 커브가 나온 최소 2개의 미리 정해진 사이클에 부여된 기준 수치들을 합하여 타겟 핵산 서열의 초기 양을 정량한다. 예를 들어, 멜팅 분석을 실시할 3개 사이클(30, 40 및 50 사이클)을 미리 선택하고 기준 수치인 30, 40 및 50을 미리 정해진 사이클에 각각 부여한다. 40 및 50 사이클에서 멜팅 피크가 관찰되는 경우, 기준 수치인 40과 50을 합하고, 합산한 값인 “90”을 사용하여 타겟 핵산서열의 초기 양을 정량한다. 미리 정해진 각 사이클에 동일한 수치의 기준 수치(예컨대, 100, 100, 100)를 부여할 수도 있다. 대안적으로, 미리 정해진 사이클들에 오름차순(예컨대, 100, 200, 300) 또는 내림차순(예컨대, 300, 200, 100)으로 기준 수치를 부여할 수도 있다. 기준 수치는 다음의 사항들을 고려하여 부여해야 한다: 예를 들어, 30, 40 및 50 사이클에 부여된 기준 수치를 합산한 값이 40 및 50 사이클에 부여된 기준 수치를 합산한 값보다 커야하며, 40 및 50 사이클에 부여된 기준 수치를 합산한 값은 50 사이클에 부여된 기준 수치보다 커야한다.

본 발명의 구현예에 따르면, 미리 정해진 사이클에서 멜팅 피크 커브가 나왔는지를 결정하는데 있어, 멜팅 피크 커브의 최대 높이 값 또는 최대 면적 값이 미리 정한 값(즉, 역치 값(threshold value))보다 더 높은 경우에 정량을 위한 멜팅 피크 커브가 나타난 것으로 결정되어야 한다(즉, 역치 값을 가지고 결정).

본 발명의 또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 최초로 관찰되는 멜팅 피크의 최대 높이 값 또는 최대 면적 값을 고려하여 추가적인 값(supplementary value)을 합산한다. 이러한 구체적인 구현예는 동일한 사이클에서 최초로 관찰되는 멜팅 피크가 나온 시료들에서의 함량 차이를 측정하는데 이용될 수 있다. 최초로 관찰된 멜팅 피크의 최대 높이 값 또는 최대 면적 값을 고려하여 추가적인 값을 계산하는 방법으로서, 타겟 증폭의 포화 단계에서 얻어지는 멜팅 피크의 최대 높이 값 또는 최대 면적 값을 기준으로 하여, 실제 얻어지는 멜팅 피크의 최대 높이 값 또는 최대 면적 값의 상대적인 비율을 이용한다.

두 번째 방법의 경우, 최소 2개의 미리 정해진 사이클에서 얻어진 멜팅 피크 커브 중 최초 멜팅 피크 커브를 이용하여 타겟 핵산서열의 초기 양을 정량한다.

본 발명의 구현예에 따르면, 최초 멜팅 피크 커브가 나온 미리 정해진 사이클의 기준 수치 및/또는 최초 멜팅 피크 커브의 값들(예컨대, 높이 및 면적)을 이용하여 정량 수치를 얻고, 이어서 상기 정량 수치를 이용하여 타겟 핵산서열의 초기 양을 정량한다. 정량 수치를 얻기 위하여, 연산과정(더하기, 빼기, 곱하기 또는 나누기)을 수행할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 단계 (c)는 최소 2개의 미리 정해진 사이클 별로 기준 수치를 부여하고, 최초 멜팅 피크 커브가 나온 미리 정해진 사이클의 기준 수치를 이용하여 정량 수치를 계산함으로써 실시되며, 이로써 타겟 핵산 서열의 초기 양을 정량한다. 예를 들어, 기준 수치 그 자체가 정량 수치로 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 단계 (c)는 최소 2개의 미리 정해진 사이클 별로 기준 수치를 부여하고, (i) 최초 멜팅 피크 커브가 나온 미리 정해진 사이클의 기준 수치 및 (ii) 최초 멜팅 피크 커브의 최대 높이 값 또는 면적 값을 이용하여 정량 수치를 계산함으로써 실시되며, 이로써 타겟 핵산 서열의 초기 양을 정량한다.

본 발명의 더 구체적인 구현예에 따르면, 단계 (c)는 최소 2개의 미리 정해진 사이클 별로 기준 수치를 부여하고, 최초 멜팅 피크 커브가 나온 미리 정해진 사이클의 기준 수치를 최초의 멜팅 커브의 최대 높이 값 또는 면적 값을 가지고 변형(유도)하여 정량 수치를 계산함으로써 실시되며, 이로써 타겟 핵산 서열의 초기 양을 정량한다. 예를 들어, 기준 수치의 변형(유도)은 최초 멜팅 피크 커브의 기준 수치와 최대 높이 값(또는 최대 면적 값)을 합산하는 것이다. 택일적으로, 변형(유도)은 특정 규칙(예를 들어, 비례 적용)에 따라 최초 멜팅 피크 커브의 최대 높이 값(또는 최대 면적 값)을 기준 수치에 적용하는 것이다. 최초 멜팅 피크 커브의 최대 높이 값(또는 최대 면적 값)을 기준 수치에 적용하는 방법으로서, 타겟 증폭의 포화 단계에서 얻어지는 멜팅 피크의 최대 높이 값 또는 최대 면적 값을 기준으로 하여, 실제 얻어지는 멜팅 피크의 최대 높이 값 또는 최대 면적 값의 상대적인 비율을 이용한다.

예를 들어, 멜팅 분석을 실시하는 3 개의 사이클(20, 30 및 40 사이클)을 미리 결정하고 각각의 사이클에 기준 수치로 100, 1 및 0.01을 부여한다. 그 다음, 타겟 증폭의 포화 단계에서 얻어지는 멜팅 피크의 최대 높이 값을 기준으로 하여, 실제 얻어지는 멜팅 피크의 최대 높이 값의 상대적인 비율을 계산한다. 예컨대, 실제 얻어진 멜팅 피크의 최대 높이 값이 120이고, 타겟 증폭의 포화 단계에서 얻어진 멜팅 피크의 최대 높이 값이 500인 경우, 상대적 비율은 0.24(120/500)이다. 계산될 상대적 비율 값은 소수점 둘째 자리에서 반올림 하거나 일정한 구간 값을 이용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 구간을 0.25, 0.5, 0.75, 1로 4 등분하고 관찰된 값이 0.24인 경우, 상기 관찰된 값은 0.25로 처리된다.

시료 A에서 0.2의 최대 높이 값 비율을 갖는 최초 멜팅 피크 커브가 20 사이클에서 관찰되고, 시료 B에서 0.3의 최대 높이 값 비율을 갖는 최초 멜팅 피크 커브가 20 사이클에서 관찰된다고 가정하면, 시료 A의 정량 수치는 20(100× 0.2)이며, 시료 B의 정량 수치는 30(100× 0.3)이다. 따라서, 시료 B가 시료 A보다 타겟 핵산서열의 초기 양을 높게 함유하고 있다고 평가할 수 있다. 시료 C에서 0.3의 최대 높이 값 비율을 갖는 최초 멜팅 피크 커브가 30 사이클에서 관찰된다고 가정하면, 시료 C의 정량 수치는 0.3(1× 0.3)이다. 따라서, 시료 C는 시료 A 및 B보다 타겟 핵산서열의 초기 양을 더 낮게 함유하고 있다고 평가할 수 있다. 이러한 예는 상대적인 정량에 해당한다.

본 발명의 구현예에 따르면, 두 번째 방법에 있어서, 최초의 멜팅 피크 커브가 나온 미리 정해진 사이클로부터 계산된 정량 수치의 최소치가, 미리 정해진 사이클 바로 다음 사이클에서 최초의 멜팅 피크 커브가 관찰되는 경우에 계산된 정량 수치의 최대치보다 크거나 동일한 수치가 되도록 기준 수치 및 정량 수치의 계산방법을 결정한다.

택일적으로, 미리 정해진 사이클에 오름차순으로 기준 수치(예를 들어, 0.01, 1, 100)를 부여할 수 있으며, 멜팅 피크의 최대값이 커질수록 더 낮은 비율 값이 얻어진다.

예를 들어, 타겟 증폭의 포화 상태에서 얻어지는 멜팅 피크의 최대 높이 값을 미리 정해진 사이클에서 실제 얻어지는 멜팅 피크의 최대 높이 값으로 나눔으로써 비율의 계산을 할 수 있다. 정량 수치가 더 낮게 계산되는 경우, 타겟 핵산서열의 초기 양은 더 높은 것으로 평가할 수 있다. 이와 같은 계산에 있어서, 최초 멜팅 피크 커브가 나오는 미리 정해진 사이클로부터 계산된 정량 수치의 최대치가, 최초 멜팅 피크 커브가 미리 정해진 사이클의 바로 다음 사이클에서 나오는 경우 계산된 정량 수치의 최소치보다 낮거나 동일할 수 있도록 기준 수치 및 정량 수치의 계산방법을 결정한다.

상술한 숫자 값들은 단지 예일 뿐이다. 미리 정해진 사이클, 기준 수치의 간격, 특정 수치의 부여, 정량 수치의 계산을 위한 멜팅 피크의 최대 높이 값 또는 면적 값의 변형(유도) 방법, 기준 수치의 계산, 및 멜팅 피크의 최대 높이 또는 면적 값 또는 그의 변형 값을 정량 수치에 도입하는 방법은 다양한 방식으로 실시할 수 있다.

상술한 본 발명을 구현하기 위한 방법들은 개별적으로 또는 복합적으로 실시될 수 있다. 택일적으로, 미리 정해진 범위의 사이클에서의 멜팅 분석을 통해 멜팅 피크를 얻고, 이어서 다양한 방법으로 멜팅 피크를 이용하여 타겟 핵산서열의 초기 양을 정량하는 것과 같은 방식으로 다양한 방법들을 실시할 수 있다.

본 발명의 구현예에 따르면, 다른 핵산 시료 또는 기지(known) 핵산 농도를 갖는 대조군 시료를 단계 (a)-(c)에 적용하여 얻은 정량 수치와 비교함으로써 타겟 핵산서열의 상대적 또는 절대적 정량을 실시한다. 대조군 시료의 농도를 세밀히 구분(예컨대, 1 pg, 10 pg, 20 pg, 30 pg 등)한 다음, 대조군 시료의 정량 수치를 얻은 경우, 보다 정확하게 타겟 핵산서열의 절대적 정량을 구할 수 있다.

본 발명의 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열의 정량은 특정한 수치의 결과를 제공한다(예컨대, 100 pg).

본 발명의 구현예에 따르면, 상기 타겟 핵산서열의 정량은 일정 범위의 값을 제공한다(예컨대, 1000 pg 이하 및 10 pg 이상, 또는 10-1000 pg).

다른 핵산 시료 또는 대조군 시료의 정량을 타겟 핵산서열의 반응 용기와 동일한 용기 또는 상이한 용기에서 실시할 수 있다.

본 발명의 장점은 최소 2개 타겟 핵산서열의 동시(멀티플렉스) 정량이라는 점에서 강조될 수 있다.

본 발명의 구현예에 다르면, 타겟 핵산으로부터 생성된 이합체는 각각 다른 Tm 값을 갖는다.

본 발명의 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열은 최소 2개의 타겟 핵산서열을 포함한다. 최소 2개의 타겟 핵산서열의 정량을 하나의 반응 용기에서 실시할 경우, 각 타겟 핵산서열을 절대적으로 정량할 수 있으며 타겟 핵산서열 간의 상대적 정량도 가능하다.

본 발명은 또한 뉴클레오티드 변이를 포함하는 핵산서열의 정량에도 유용하다. 본 발명의 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열은 뉴클레오티드 변이를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 “뉴클레오티드 변이(nucleotide variation)”는 서열이 유사한 연속적 DNA 세그먼트들 중 특정 위치의 DNA 서열에서의 모든 단일 또는 복수의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 삽입을 의미한다. 이러한 연속적 DNA 단편들은 하나의 유전자 또는 하나의 염색체의 어떤 다른 부위를 포함한다. 이러한 뉴클레오티드 변이는 돌연변이(mutant) 또는 다형성 대립유전자 변이(polymorphic allele variations)일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 검출되는 뉴클레오티드 변이는 SNP(single nucleotide polymorphism), 돌연변이(mutation), 결실, 삽입, 치환 및 전좌를 포함한다. 뉴클레오티드 변이의 예는, 인간 지놈에 있는 다양한 변이(예컨대, MTHFR (methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자의 변이), 병원체의 약제 내성과 관련된 변이 및 암 발생-관련 변이를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 뉴클레오티드 변이는 핵산서열의 특정 위치에서의 모든 변이를 포함한다. 즉, 용어 뉴클레오티드 변이는 핵산서열의 특정 위치에서의 야생형 및 그의 모든 돌연변이형을 포함한다.

본 발명은 액상 및 고체상 모두에서 실시될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 핵산 증폭 전에 멜팅 피크 분석을 실시할 핵산 증폭 내의 최소 2개의 사이클을 미리 결정하고, 최소 2개의 미리 정해진 사이클에서 멜팅 피크 분석을 실시하며, 이어서 멜팅 피크 커브로부터의 데이터 값(예컨대, 존재 또는 부존재, 높이 및 면적)을 이용하여 타겟 핵산서열을 정량하는 방법으로 실시된다.

종래 기술들 중, 타겟 증폭 후 한 번의 멜팅 분석을 실시하는 정량 방법은 정량 결과가 타겟 증폭의 사이클에 따라 변할 수 있다는 심각한 문제를 가지고 있다. 본 발명은 타겟 증폭과정 동안에 최소 2개의 미리 정해진 사이클에서 멜팅 피크 분석을 실시하기 때문에 종래 방법보다 더 정확하고 의미 있는 정량 결과를 제공할 수 있다.

미국특허 제8,039,215호에 개시된 방법의 경우, 역치(threshold) 멜팅 피크 최대 값이 나온 사이클을 확인하기 위해 타겟 증폭의 각 사이클마다 멜팅 분석을 실시하며, 이는 훨씬 더 긴 분석시간을 초래한다. 본 발명은 미리 정해진 사이클에서만 멜팅 피크 분석을 실시하기 때문에, 더 빠르고 편리하게 타겟 핵산서열을 정량할 수 있다.

(b) 미국특허 제8,039,215호에 개시된 방법의 경우, 특정 사이클에서 멜팅 피크 최대 값이 역치 값 보다 클 경우, 이들 간의 차이를 타겟 핵산서열의 정량에 이용하지 않는다. 반면에 미리 정해진 사이클에서의 멜팅 피크의 모든 높이 또는 면적 값을 타겟 핵산서열의 정량에 이용할 수 있다.

(c) 본 발명은 이합체의 Tm 값을 이용하는 멜팅 피크 분석을 기반으로 하므로, 한 종류의 표지를 이용하는 경우에도 복수의 타겟 핵산서열을 동시에 검출 및 정량할 수 있다.

(d) 본 발명은 타겟 핵산서열의 상대적 정량을 가능하게 한다. 또한, 본 발명은 기지(known) 농도를 갖는 대조군을 이용하여 절대적 방식으로 타겟 핵산서열을 정량할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 얻어진 모든 멜팅 피크를 이용하는 사이클릭 멜팅 커브 분석에 의한 타겟 핵산 서열의 정량

본 발명자들은 얻어진 모든 멜팅 피크(melting peak)를 이용하여 사이클릭 멜팅 커브(cyclic melting curve) 분석을 하는 경우, 타겟 핵산서열의 정량이 가능한지 여부를 확인하고자 하였다. 타겟 핵산서열의 정량을 위하여 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 분석을 이용하였다.

업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장을 위하여 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 이용하였다. Neisseria gonorrhoeae(NG)의 지노믹 DNA를 표준 물질 및 타겟 핵산서열로 이용하였다.

본 실시예의 PTOCE 분석의 경우, 연장 가닥 및 CTO를 이용하여 형성된 연장이합체를 멜팅 분석하여 타겟 핵산서열의 존재에 의존적으로 생성된 연장 가닥의 존재를 검출하였다. 상기 연장이합체의 양은 타겟 핵산서열의 초기 양에 비례한다. 멜팅 커브 피크의 높이 또는 면적은 연장이합체의 양을 반영할 수 있다. 본 실시예에서는, 멜팅 커브 분석을 3개의 미리 정해진 사이클에서 실시하였다. 사이클릭 멜팅 커브 분석으로부터 얻어진 멜팅 피크 높이의 합을 이용하여 타겟 핵산서열의 초기 양을 측정하였다.

PTO 및 CTO는 그의 연장을 방지하기 위해 3'-말단을 카본 스페이서(carbon spacer)로 블로킹하였다. CTO의 주형 부위(서열번호 4)를 퀀처 분자(BHQ-1) 및 형광 리포터 분자(FAM)로 표지하였다.

본 실시예에서 이용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO 및 CTO의 서열은 다음과 같다:

NG-F 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3' (서열번호 1)

NG-R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3' (서열번호 2)

NG-PTO 5'-ACGACGGCTTGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3' (서열번호 3)

NG-CTO 5'-[BHQ-1]TTTTTTTTTTTTTTTCCTCC[T(FAM)]CCTCCTCTGCCAAGCCGTCGT[C3 Spacer]-3' (서열번호 4)

(I: 디옥시이노신(Deoxyinosine))

(밑줄 친 문자는 PTO의 5'-태깅 부위를 가리킨다)

일련의 양의 NG 지노믹 DNA(1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg 또는 100 fg), 10 pmole의 업스트림 프라이머(서열번호 1), 10 pmole의 다운스트림 프라이머(서열번호 2), 5 pmole의 PTO(서열번호 3), 3 pmole의 CTO(서열번호 4) 및 10 ㎕의 2X 마스터 믹스[2.5 mM MgCl₂, 200 ㎛의 dNTPs, 1.6 unit Taq DNA 중합효소(Solgent, Korea)]를 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 표준 반응을 실시하였다. 각 표준 양별로 3개의 반응 튜브를 준비하였다. 특정 양의 NG 지노믹 DNA(1 ng, 10 pg 또는 100 fg), 10 pmole의 업스트림 프라이머(서열번호 1), 10 pmole의 다운스트림 프라이머(서열번호 2), 5 pmole의 PTO(서열번호 3), 3 pmole의 CTO(서열번호 4) 및 10 ㎕의 2X 마스터 믹스[2.5 mM MgCl₂, 200 ㎛의 dNTPs, 1.6 unit Taq DNA 중합효소(Solgent, Korea)]를 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 샘플 반응을 실시하였다.

상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(real-time thermocycler, CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 반응 혼합물을 95℃에서 15분 동안 변성시킨 다음, 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초의 사이클을 50회 반복하였다. 반응과정 동안에, 30번째, 40번째 및 50번째 사이클 후 각각의 멜팅 커브를 얻었으며, 멜팅 커브는 반응물을 55℃로 냉각시키고, 55℃에서 5분간 유지시킨 다음, 55℃에서 85℃로 천천히 가열시킴으로써 얻을 수 있었다. 이중-가닥 DNA의 해리를 모니터링하기 위하여 온도가 상승하는 동안 형광을 연속적으로 측정하였다. 멜팅 피크는 멜팅 커브 데이터로부터 유래되었다. 30번째, 40번째 및 50번째 사이클에서 얻어진 멜팅 피크의 높이를 정량을 위하여 합산하였다. 실험 결과를 표 1 및 2에 요약하였다.

표준 양¹ ⁾	1 ng	100 pg	10 pg	1 pg	100 fg	NTC²⁾
표준 값³⁾	1452	1218	907	617	483	0

1) 표준은 Neisseria gonorrhoeae의 지노믹 DNA이다.

2) NTC는 타겟이 없는 대조군을 나타낸다.

3) 각 표준 양에 대한 표준 값은 모든 멜팅 피크의 높이의 합에 의해 얻어진다.

시료¹ ⁾	1	2	3	NTC²⁾
시료 값³⁾	1474	930	521	0
범위 수준으로 예측된 양(X)	X>1 ng	100 pg>X>10 pg	1 pg>X>100 fg	0
시료 내 실제 초기 양	1 ng	10 pg	100 fg	0

1) 시료는 타겟 서열로서 Neisseria gonorrhoeae의 지노믹 DNA를 포함한다.

2) NTC는 타겟이 없는 대조군을 나타낸다.

3) 각 시료에 대한 시료 값은 모든 멜팅 피크의 높이의 합에 의해 얻어진다.

표 1의 각 표준 양에 대한 표준 값은 표준 반응으로부터 얻었다. 3개의 복제 튜브로부터 얻어진 높이의 합 중 최소 값을 상응하는 표준 양에 대한 표준 값으로 선택하다.

표준 값을 이용하여, 시료의 초기 양을 표 2와 같이 범위 수준(range level)으로 측정하였다. 실험결과는 각 시료에 대해 측정된 양의 범위가 시료 내의 실제 양을 거의 정확하게 포함하고 있다는 것을 보여준다.

타겟 핵산이 존재하지 않는 경우에는 피크가 검출되지 않았다.

이와 같은 결과는 모든 멜팅 피크를 이용하는 사이클릭 멜팅 커브 분석이 타겟 핵산서열의 정량을 가능하게 해준다는 것을 나타낸다.

실시예 2: 최초 멜팅 피크를 이용하는 사이클릭 멜팅 커브 분석에 의한 타겟 핵산서열의 정량

본 발명자들은 최초 멜팅 피크를 이용하여 사이클릭 멜팅 커브 분석을 하는 경우, 타겟 핵산서열의 정량이 가능한지 여부를 확인하고자 하였다. 타겟 핵산서열의 정량을 위하여 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 분석을 이용하였다.

실시예 1에서 얻어진 반응 결과를 최초 멜팅 피크를 이용하는 사이클릭 멜팅 커브 분석에 의한 정량에 이용하였다.

본 실시예에서, “3000”, “2000” 및 “1000”은 예상되는 최대 멜팅 피크 높이를 고려하여 인위적으로 선택한 것이며, 각각 30번째, 40번째 및 50번째 사이클 에서 얻어지는 멜팅 피크에 부여하였다. 최초 멜팅 피크가 관찰되는 사이클을 반응과정에서 결정하였다. 정량 수치는 사이클에 부여된 값 및 해당 사이클에서의 멜팅 피크 높이의 값을 합하여 계산하였다. 실험 결과를 표 3 및 4에 요약하였다.

표준 양¹ ⁾	1 ng	100 pg	10 pg	1 pg	100 fg	NTC²⁾
표준 값³⁾	3159	3052	2321	2098	1483	0

1) 표준은 Neisseria gonorrhoeae의 지노믹 DNA이다.

2) NTC는 타겟이 없는 대조군을 나타낸다.

3) 표준 값은 최초 멜팅 피크의 높이 및 각 표준에 대하여 최초 멜팅 피크가 관찰된 사이클에 부여된 값의 합에 의해 얻어진다.

시료¹ ⁾	1	2	3	NTC²⁾
시료 값³ ⁾	3161	2334	1521	0
범위 수준으로 예측된 양(X)	X>1 ng	100 pg>X >10 pg	1 pg>X>100 fg	0
시료 내 실제 초기 양	1 ng	10 pg	100 fg	0

1) 시료는 Neisseria gonorrhoeae(NG)의 지노믹 DNA를 포함한다.

2) NTC는 타겟이 없는 대조군을 나타낸다.

3) 시료 값은 초기 멜팅 피크의 높이 및 각 시료에 대하여 초기 멜팅 피크가 관찰된 사이클에 부여된 값의 합에 의해 얻어진다.

표 3의 각 표준 양에 대한 표준 값은 표준 반응으로부터 얻었다. 3개의 복제 튜브로부터 얻어지는 최초 멜팅 피크의 높이 중 최소 값을 사이클에 부여된 값과 합산하였으며 상응하는 표준 양에 대한 표준 값을 계산하였다.

표준 값을 이용하여, 시료의 초기 양을 표 4와 같이 범위 수준(range level)으로 측정하였다. 실험결과는 각 시료에 대해 측정된 양의 범위가 시료 내의 실제 양을 거의 정확하게 포함하고 있다는 것을 보여준다.

이와 같은 결과는 최초 멜팅 피크를 이용하는 사이클릭 멜팅 커브 분석이 타겟 핵산서열의 정량을 가능하게 해준다는 것을 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현예를 상세히 기술하였는바, 본 발명의 원리를 따르는 변형 및 수정이 가능함은 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이며, 따라서 본 발명의 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 멜팅 피크 커브(melting peak curve)를 이용하여 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 정량하는 방법:
(a) 일련의 반응을 반복하는 사이클을 통하여 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 증폭시켜 라벨링 모이어티(labeling moiety)를 포함하는 이합체를 형성시키는 단계로서; 상기 이합체는 이중 가닥 형태의 상기 증폭된 타겟 핵산서열, 상기 타겟 핵산서열과 프로브 간의 혼성화에 의하여 형성된 이합체 또는 상기 타겟 핵산서열의 존재에 의존적으로 형성된 이합체를 포함하고; 상기 이합체의 형성은 상기 타겟 핵산서열의 증폭에 비례하여 증가하며; 상기 라벨링 모이어티는 상기 이합체의 결합(association) 또는 해리(dissociation) 과정 동안에 검출 가능한 시그널을 발생시키고;
(b) 상기 단계(a)의 반복과정 동안에, 상기 이합체로부터 검출가능한 시그널이 검출되는 온도 범위에서의 멜팅 분석을 2개 내지 5개의 미리 정해진(predetermined) 사이클에서 실시하는 것에 의하여 상기 미리 정해진 사이클에 대한 각각의 멜팅 피크 커브를 얻는 단계로서; 상기 2개 내지 5개의 미리 정해진 사이클 간의 간격은 5 사이클 이상이며; 및
(c) 상기 얻어진 각각의 멜팅 피크 커브를 이용하여 상기 타겟 핵산서열을 정량하는 단계; 상기 (c) 단계의 상기 정량은 다음의 단계 (c-1), (c-2), (c-3), (c-4) 로 이루어진 군에서 선택된 하나의 단계에 따라 수행되며:
(c-1) 단계 (b)에서 얻은 멜팅 피크 커브의 최대 높이 값(maximum height value) 또는 최대 면적 값(maximum area value)을 합산하여 정량 수치를 계산하여 초기 타겟 핵산서열의 양을 정량하는 단계;
(c-2) 상기 미리 정해진 사이클 별로 기준 수치를 부여하고 상기 멜팅 피크 커브가 나온 미리 정해진 사이클의 기준 수치를 합산하여 정량 수치를 계산하여 초기 타겟 핵산서열의 양을 정량하는 단계로서, 상기 기준 수치는 멜팅 피크 커브가 나온 사이클의 수가 증가할수록, 상기 멜팅 피크 커브가 나온 사이클의 기준 수치의 합이 증가하거나, 감소하도록 부여되는 것을 특징으로 하는 단계;
(c-3) 상기 미리 정해진 사이클 별로 기준 수치를 부여하고 최초의 멜팅 피크 커브가 나온 미리 정해진 사이클의 기준 수치를 이용하여 정량 수치를 계산하여 초기 타겟 핵산서열의 양을 정량하는 단계로서, 타겟 핵산 서열의 양이 많아질수록, 보다 빠른 사이클에서 멜팅 피크 커브가 얻어지며, 상기 기준 수치는 상기 미리 정해진 사이클의 번호에 따라 오름차순 또는 내림차순으로 부여되어 상기 미리 정해진 사이클은 서로 다른 기준 수치를 가지도록 부여되는 것을 특징으로 하는 단계; 및
(c-4) 상기 미리 정해진 사이클 별로 기준 수치를 부여하고 (i) 최초의 멜팅 피크 커브가 나온 미리 정해진 사이클의 기준 수치 및 (ii) 최초의 멜팅 피크 커브의 최대 높이 값 또는 최대 면적 값을 이용하여 정량 수치를 계산하여 초기 타겟 핵산서열의 양을 정량하는 단계로서, 타겟 핵산 서열의 양이 많아질수록, 보다 빠른 사이클에서 멜팅 피크 커브가 얻어지며, 상기 기준 수치는 상기 미리 정해진 사이클의 번호에 따라 오름차순 또는 내림차순으로 부여되어 상기 미리 정해진 사이클은 서로 다른 기준 수치를 가지도록 부여되며, 최초의 멜팅 피크 커브가 나온 미리 정해진 사이클로부터 계산된 상기 정량 수치의 최소치가 상기 미리 정해진 사이클 바로 다음 사이클에서 최초의 멜팅 피크 커브가 나오는 경우에 계산된 정량 수치의 최대치보다 크거나 동일한 수치가 되도록 상기 기준 수치 및 상기 정량 수치 계산 방법을 결정하는 것을 특징으로 하는 단계;
상기 타겟 핵산서열의 정량은 다른 핵산 시료 또는 기지(known) 핵산 농도를 갖는 대조군(control) 시료를 상기 단계 (a)-(c)에 적용하여 얻은 정량 수치와 비교함으로써 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 이합체의 라벨링 모이어티는 상기 이합체 중 어느 한 가닥에 연결된 단일 표지, 상기 이합체 중 어느 한 가닥에 모두 연결된 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호 작용적 이중 표지, 상기 이합체의 양 가닥에 각각 연결된 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호 작용적 이중 표지 또는 상기 이합체에 삽입되는 인터컬레이팅 염료(intercalating dye)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열의 증폭은 온도가 변화하는 조건 하에서, 증폭용 프라이머와 상기 타겟 핵산서열 간의 혼성화, 상기 프라이머의 연장 및 연장가닥의 해리(dissociation)를 포함하는 일련의 반응을 반복함으로써 달성되며, 상기 사이클은 상기 일련의 반응의 1회 반복을 하나의 단위로 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열의 증폭은 등온 조건(isothermal condition)하에 일련의 반응을 반복함으로써 달성되며, 상기 사이클은 일정한 시간 간격으로 실시되는 상기 일련의 반응의 반복을 하나의 단위로 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction), LCR(ligase chain reaction), GLCR(gap filling LCR), Q-beta(Q-beta replicase amplification), SDA(stand displacement amplification), 3SR(self-sustained sequence replication), NASBA(nucleic acid sequence-based amplification), TMA(Transcription-Mediated Amplification) 또는 RCA(Rolling Circle Amplification)에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
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