JP6703564B2 - メルティングピーク分析を利用したターゲット核酸配列の定量 - Google Patents

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Description

本特許出願は、２０１３年３月１３日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第２０１３−００２６８３７号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として挿入される。
本発明は、メルティング分析を用いてターゲット核酸配列を定量する方法に関する。
核酸増幅は、分子生物学分野で利用される必須的な過程であって、ターゲット核酸配列を検出するためのほとんどの技術は、核酸増幅過程を含んでいる。これにより、多様な増幅方法が提示された。
代表的な核酸増幅方法である重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）は、二本鎖ＤＮＡの変性、ＤＮＡ鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング及びＤＮＡ重合酵素によるプライマー延長の反復されたサイクル過程を含む（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、及び第４，８００，１５９号；Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１３５０−１３５４）。
核酸を増幅するための他の方法で、ＬＣＲ（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、及びＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ−Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のような多様な方法が提示された。
核酸増幅を通じてターゲット核酸を検出するための方法で、核酸の増幅をリアルタイムで測定しながらターゲット核酸を検出することができるリアルタイム（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）検出方法が広く利用されている。
リアルタイム検出方法は、一般的にターゲット配列に特異的にハイブリダイズする標識されたプローブを利用する。標識されたプローブとターゲット配列との間のハイブリダイゼーションを利用する方法の例として、ヘアピン構造を形成する二重標識されたプローブを利用する分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ）方法（Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖ．１４ ＭＡＲＣＨ １９９６）、供与体（ｄｏｎｏｒ）または受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）で単一標識された２つのプローブを利用するハイブリダイゼーションプローブ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）方法（Ｂｅｒｎａｄ ｅｔ ａｌ，１４７−１４８ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２０００；４６）、及び単一標識されたオリゴヌクレオチドを利用するＬｕｘ方法（米国特許第７，５３７，８８６号）が開発された。また、二重標識されたプローブのハイブリダイゼーションだけではなく、ＤＮＡ重合酵素の５’−ヌクレアーゼ活性による二重標識されたプローブの切断反応を利用するＴａｑＭａｎ方法（米国特許第５，２１０，０１５号、及び第５，５３８，８４８号）が多く利用されている。
ホモジニアス（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）分析方式としてリアルタイム検出方法は、１つのチューブ内で増幅反応及び検出分析がいずれもなされるので、その実施が相対的に便利である。また、リアルタイム検出方法は、汚染から自由である。但し、リアルタイム方式で複数のターゲット配列を同時に検出する場合、１つのターゲット当たり１タイプの蛍光物質を使わなければならないので、蛍光物質の利用が制限され、蛍光物質間のスペクトル干渉（ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）現象のために、１つのサンプル当たり検出可能なターゲット数が制限される限界がある。
ホモジニアス分析方式でターゲットを検出することができる他の方法で、ターゲット増幅後、一定区間で温度を上げるか、下げながら蛍光強度をモニタリングした後、メルティングプロファイル（ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｒｏｆｉｌｅ）によって増幅産物を検出するｐｏｓｔ−ＰＣＲメルティング分析（ｍｅｌｔｉｎｇ ａｓｓａｙ）がある。
特許文献１及び特許文献２は、二本鎖のターゲット配列またはターゲット配列とプローブとの間の二量体のメルティング分析を通じてターゲットを検出する方法を開示している。特許文献３は、ターゲット配列の存在に依存的に生成される延長二量体のメルティング分析を開示している。メルティング分析のために、ターゲット配列を利用しない前記方法は、ターゲット配列が存在する場合、あらかじめ選別された配列を有する延長二量体を形成させ、これは、より効率的にメルティング分析を実施可能にする。
メルティング分析を利用する前記方法は、二量体の固有なメルティング温度（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を利用するために、１タイプの蛍光標識を使って複数のターゲット配列を同時に検出できるという長所がある（参照：米国特許第８，０３９，２１５号）。
一方、診断分野では、予後診断や薬剤反応性（ｄｒｕｇ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）分析のために、ターゲットの検出だけではなく、ターゲット配列の定量を要求している。
標準定量曲線及びＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値を用いてターゲット配列を定量するために、リアルタイムＰＣＲ分析が利用されている。濃度を知っているターゲット配列を順次に希釈させて、準備した標準物質に対する増幅曲線を得た後、標準物質の初期量のｌｏｇ値とＣｔ値とを用いて標準定量曲線を求める。未知試料のＣｔ値をリアルタイムＰＣＲによって得た後、標準定量曲線を用いて定量する。前記定量方法は、相対的に簡便であるが、試料抽出過程での損失やＰＣＲ阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）によった深刻な問題を有する。このような問題を解決するために、内部対照群（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）を利用する定量方法が提案された。
メルティングピーク（ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｅａｋ）の高さや面積を利用することによって、ｐｏｓｔ−ＰＣＲメルティング分析を定量に応用する方法もある。
例えば、特許文献４は、ターゲット配列と濃度を知っている核酸分子（基準鋳型；ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ）を核酸−結合蛍光染料（ｎｕｃｌｅｉｃ−ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ）の存在下で増幅させて、増幅産物に対するメルティングピークを得て、それを積分してターゲット配列と基準鋳型の相対的な量を決定することによって、ターゲット配列の濃度を計算する方法を記載している。この際、ターゲット配列と基準鋳型は、互いに異なるＴｍ値を有するので、互いに区別されて検出されうる。特許文献５は、ハイブリダイゼーションプローブ及びメルティングピークを利用した定量方法を開示している。前記方法は、ターゲット増幅後にメルティング分析を実施するので、増幅終了サイクル及びメルティング分析を実施したサイクルによって定量結果が変わりうるという短所がある。
特許文献６は、ターゲット増幅でメルティング分析を実施して、それぞれの増幅サイクルに対するメルティングピークの最大値を求め、閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）以上の最大値に到逹するサイクルを決定することによって、ターゲット配列を定量する方法を開示している。前記方法は、閾値以上の最大値に到逹するサイクルを決定するために、ほとんどの増幅サイクルでメルティング分析を実施しなければならないために、さらに長い分析時間を要求する。
このような従来技術の状況下で、本発明者らは、単一検出チャネルで複数のターゲット配列を検出するために、メルティング分析を利用し、より迅速に向上した定量結果を提供することができる定量方法を開発するならば、複数のターゲット配列をより効率的に同時に検出し、定量することができることを認識した。
本明細書の全般に亘って多数の特許及び文献が参照され、その引用がカッコで囲まれている。このような特許及び文献の開示内容は、本発明及び本発明が属する技術レベルをより明確に説明するために、その全体として本明細書に参照して含まれている。
米国特許第５，８７１，９０８号 米国特許第６，１７４，６７０号 ＷＯ２０１２／０９６５２３号 米国特許第６，２４５，５１４号 米国特許第６，１７４，６７０号 米国特許第８，０３９，２１５号
本発明者らは、より便利かつ効率的な方式でターゲット核酸配列を定量する方法を開発するために努力した。その結果、本発明者らは、少なくとも２つの既定の増幅サイクルから得られる増幅産物を直接または間接にメルティング分析に利用することによって、ターゲット核酸配列を定量する新たな方法を確立した。本発明のターゲット核酸配列定量方法は、従来の定量方法と関連した問題点を克服することができる。
したがって、本発明の目的は、メルティングピークカーブを用いて核酸試料内のターゲット核酸配列を定量する方法を提供することである。
本発明の他の目的及び利点は、添付した特許請求の範囲と共に下記の詳細な説明によってより明確になる。
本発明の一様態で、本発明は、次の段階を含むメルティングピークカーブ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｅａｋ ｃｕｒｖｅ）を用いて核酸試料内のターゲット核酸配列を定量する方法を提供する：
（ａ）一連の反応を繰り返すサイクルを通じて核酸試料内のターゲット核酸配列を増幅させて、ラベリングモイエティ（ｌａｂｅｌｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を含む二量体（ｄｕｐｌｅｘ）を形成させる段階であって；前記二量体は、二本鎖形態の前記増幅されたターゲット核酸配列、前記ターゲット核酸配列とプローブとの間のハイブリダイゼーションによって形成された二量体、または前記ターゲット核酸配列の存在に依存的に形成された二量体を含み；前記二量体の形成は、前記ターゲット核酸配列の増幅に比例して増加し；前記ラベリングモイエティは、前記二量体の結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）または解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）過程の間に検出可能なシグナルを発生させ；
（ｂ）前記段階（ａ）の繰り返し過程の間に、前記二量体から検出可能なシグナルが検出される温度範囲でのメルティング分析を既定の（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）サイクルで実施することによって、少なくとも２つの既定のサイクルに対するメルティングピークカーブを得る段階；及び
（ｃ）前記メルティングピークカーブを用いて、前記ターゲット核酸配列を定量する段階。
本発明者らは、より便利かつ効率的な方式でターゲット核酸配列を定量する方法を開発するために努力した。その結果、本発明者らは、少なくとも２つの既定の増幅サイクルから得られる増幅産物を直接または間接にメルティングピーク分析に利用することによって、ターゲット核酸配列を定量する新たな方法を確立した。本発明のターゲット核酸配列定量方法は、従来の定量方法と関連した問題点を克服することができる。
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明は、核酸増幅前にメルティングピーク分析を実施する核酸増幅内の少なくとも２つのサイクルをあらかじめ決定し、少なくとも２つの既定のサイクルでメルティングピーク分析を実施し、引き続き、メルティングピークカーブからのデータ値（例えば、存在または不存在、高さ及び面積）を用いてターゲット核酸配列を定量する方法で実施される。
従来技術のうち、ターゲット増幅後、一回のメルティング分析を実施する定量方法は、定量結果がターゲット増幅のサイクルによって変わりうるという深刻な問題を有している。本発明は、ターゲット増幅過程の間に少なくとも２つの既定のサイクルでメルティングピーク分析を実施するために、従来の方法よりもさらに正確かつ意味のある定量結果を提供することができる。
米国特許第８，０３９，２１５号に開示された方法の場合、閾値メルティングピーク最大値が出たサイクルを確認するために、ターゲット増幅の各サイクルごとにメルティング分析を実施し、これは、遥かに長い分析時間を招く。本発明は、既定のサイクルでのみメルティングピーク分析を実施するために、さらに迅速かつ便利にターゲット核酸配列を定量することができる。
（ｂ）米国特許第８，０３９，２１５号に開示された方法の場合、特定サイクルでメルティングピーク最大値が閾値よりも大きい場合、これら間の差をターゲット核酸配列の定量に利用しない。一方、既定のサイクルでのメルティングピークのあらゆる高さまたは面積値をターゲット核酸配列の定量に利用できる。
（ｃ）本発明は、二量体のＴｍ値を利用するメルティングピーク分析を基盤とするので、一種の標識を利用する場合にも、複数のターゲット核酸配列を同時に検出及び定量することができる。
（ｄ）本発明は、ターゲット核酸配列の相対的定量を可能にする。また、本発明は、既知濃度を有する対照群を用いて絶対的方式でターゲット核酸配列を定量することができる。
本発明をより詳細に説明すれば、次の通りである：
段階（ａ）：ラベリングモイエティを含む二量体の形成
本発明によれば、ターゲット核酸配列は、増幅されてラベリングモイエティを含む二量体を形成する。
本明細書で使われた用語“ターゲット核酸”、“ターゲット核酸配列”、または“ターゲット配列”は、定量しようとする核酸配列を意味する。ターゲット核酸配列は、二本鎖だけではなく、一本鎖の配列を含む。ターゲット核酸配列は、核酸試料内に初めから存在する配列だけではなく、反応過程で新たに生成される配列を含む。
本発明の具現例によれば、前記ターゲット核酸配列は、特定の増幅及びハイブリダイゼーション条件下でプライマーまたはプローブとアニーリングまたはハイブリダイズされる。
本発明の具現例によれば、前記ターゲット核酸配列は、一連の反応を繰り返すサイクルによって増幅される。
本発明の具現例によれば、ターゲット核酸配列の増幅は、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＣＲ（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、参照：Ｗｉｅｄｍａｎｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，“Ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）−ｏｖｅｒｖｉｅｗ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．”ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １９９４ Ｆｅｂ；３（４）：Ｓ５１−６４），Ｂａｒａｎｙ Ｆ．“Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｃｌｏｎｅｄ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｌｉｇａｓｅ．”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，８８（１）：１８９−９３（１９９１））、ＧＬＣＲ（ｇａｐ ｆｉｌｌｉｎｇ ＬＣＲ、参照：ＷＯ ９０／０１０６９，ＥＰ ４３９１８２、及びＷＯ ９３／００４４７）、Ｑ−ｂｅｔａ（Ｑ−ｂｅｔａ ｒｅｐｌｉｃａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、参照：Ｃａｈｉｌｌ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑ ｂｅｔａ ｒｅｐｌｉｃａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．，３７（９）：１４８２−５（１９９１），米国特許第５５５６７５１号）、ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、参照：Ｇ Ｔ Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ａｎ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ，ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（７）：１６９１−１６９６（１９９２），ＥＰ ４９７２７２）、３ＳＲ（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、参照：Ｍｕｅｌｌｅｒ ＪＤ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（３ＳＲ）：ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ ＰＣＲ”Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０８（４−５）：４３１−７（１９９７）、ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、参照：Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｊ．“Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”．Ｎａｔｕｒｅ ３５０（６３１３）：９１−２（１９９１）；Ｋｅｉｇｈｔｌｅｙ，ＭＣ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＮＡＳＢＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７（４）：６０２−８（２００５））、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、参照：Ｈｏｆｍａｎｎ ＷＰ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＭＡ） ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｔｉｓｓｕｅ”Ｊ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ．３２（４）：２８９−９３（２００５）；米国特許第５８８８７７９号））、またはＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、参照：Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，“Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｐｈｉ２９ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０２：１７３３２−１７３３６（２００５）；Ｄｅａｎ Ｆ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｌｓｏｎ Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ａｎｄ ｐｈａｇｅ ＤＮＡ ｕｓｉｎｇ Ｐｈｉ ２９ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｙ−ｐｒｉｍｅｄ ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１：１０９５−１０９９（２００１））によって実施される。
前記記述された増幅方法は、温度変化を随伴または随伴せず、一連の反応を繰り返して増幅することができる。一連の反応の繰り返しを含む増幅の単位を“サイクル”で表現する。サイクルの単位は、増幅方法によって繰り返しの回数または時間で表わすことができる。
本明細書で使われる用語“サイクル”は、一連の反応の１回繰り返しを１つの単位とし、または一定時間間隔で実施される一連の反応の繰り返しを１つの単位とすることができる。
本発明の具現例によれば、ターゲット核酸配列の増幅は、温度が変化する条件下で増幅用プライマーとターゲット核酸配列との間のハイブリダイゼーション、プライマーの延長及び延長鎖の解離を含む一連の反応を繰り返すことで達成され、前記サイクルは、一連の反応の１回繰り返しを１つの単位として有する。一連の反応の１回繰り返しを１サイクルで、２回繰り返しを２サイクルで表現する。
本発明の具現例によれば、ターゲット核酸配列の増幅は、等温条件（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下で一連の反応を繰り返すことで達成され、前記サイクルは、一定時間間隔で実施される一連の反応の繰り返しを１つの単位として有する。例えば、１分間に実施される一連の反応の繰り返しをサイクルの単位で定義するならば、１分間実施される一連の反応の繰り返しを１分サイクル（または、１サイクル）で表現し、２分間実施される一連の反応の繰り返しを２分サイクル（または、２サイクル）で表現する。
本発明の具現例によれば、ターゲット核酸配列の増幅は、ＰＣＲによって実施される。ＰＣＲは、核酸分子を増幅するために、当該技術分野で幅広く使われており、ターゲット配列の変性、ターゲット配列へのアニーリング（ハイブリダイゼーション）及びプライマー延長からなるサイクルの繰り返しを含む（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、及び第４，８００，１５９号；Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１３５０−１３５４）。
増幅されるターゲット核酸配列は、あらゆるＤＮＡ（ｇＤＮＡまたはｃＤＮＡ）、ＲＮＡ分子またはそれらのハイブリッド（キメラ核酸）を含みうる。前記配列は、二本鎖または一本鎖の形態であり得る。出発物質である核酸が二本鎖である場合、二本鎖を一本鎖または部分的な一本鎖の形態に作ることが望ましい。鎖を分離する方法には、加熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア、及びグリコール酸処理、酵素的方法（例えば、ヘリカーゼ作用）、及び結合タンパク質などが含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、鎖の分離は、８０℃〜１０５℃の範囲の温度で加熱することで達成される。このような処理を果たすための一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）によって提供される。
ｍＲＮＡが出発物質として使われる場合には、アニーリング段階を実施する以前に逆転写の段階が必要であり、逆転写の段階の詳細な内容は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）、及びＮｏｏｎａｎ，Ｋ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０３６６（１９８８）に開示されている。逆転写のために、ｍＲＮＡのポリＡテールにハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドｄＴプライマー、ランダムプライマーまたはターゲット−特異的なプライマーを利用できる。
本発明の方法は、鋳型核酸分子がある特定の配列や長さを有していることを要しない。具体的に、前記分子は、如何なる天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物、及び哺乳動物とヒトとを含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、エプスタイン−バーウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸、またはウイロイド核酸を含む。また、前記核酸分子は、組換えによって生産または生産される如何なる核酸分子または化学的に合成または合成される如何なる核酸分子も含みうる。したがって、前記核酸配列は、天然から発見または発見されないこともある。
プライマーは、ターゲット配列（鋳型）の一部位にハイブリダイズまたはアニーリングされて二本鎖構造を形成する。
本明細書で使われる用語“プライマー”は、オリゴヌクレオチドを意味するものであって、核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー延長産物の合成が誘導される条件下で、すなわち、ヌクレオチド及びＤＮＡ重合酵素のような重合剤の存在、そして、適した温度及びｐＨ条件下で、合成の開始点として作用する。
前記プライマーは、重合剤の存在下で延長産物の合成をプライミングすることができる程度に十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、例えば、温度、応用分野及びプライマーのソース（ｓｏｕｒｃｅ）を含む多くの因子によって左右される。本明細書で使われる用語“アニーリング”または“プライミング”は、鋳型核酸にオリゴデオキシヌクレオチドまたは核酸が並置（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）されることを意味し、前記並置は、重合酵素がヌクレオチドを重合させて、鋳型核酸またはその一部に相補的な核酸分子を形成させる。
本発明の具現例によれば、本発明に使われるプライマーは、本発明の発明者によって開発された二重プライミング（ＤＰＯ）構造を有する。前記ＤＰＯ構造を有するオリゴヌクレオチドは、従来のプライマー及びプローブに比べて、遥かに高いターゲット特異性を示す（参照：ＷＯ ２００６／０９５９８１；Ｃｈｕｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ＣＹＰ２Ｃ１９ ｇｅｎｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：６ｅ４０（２００７））。
本明細書で使われる用語“プローブ”は、ターゲット核酸配列に実質的に相補的な１つの部位または部位を含む一本鎖核酸分子を意味する。
本発明の具現例によれば、プライマー及びプローブは、一本鎖のオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマー及びプローブは、天然的に発生する（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（すなわち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ、及びｄＴＭＰ）、変形ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを含みうる。例えば、プライマー及びプローブは、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、参照：ＰＣＴ出願 ＷＯ ９２／２０７０２）またはＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、参照：ＰＣＴ出願 ＷＯ ９８／２２４８９、ＷＯ ９８／３９３５２、及びＷＯ ９９／１４２２６）を含みうる。また、プライマー及びプローブは、リボヌクレオチドを含みうる。
本明細書に使われた用語“アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）”または“ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）”は、相補的な一本鎖核酸から二本鎖核酸が形成されることを意味する。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸鎖間の相補性が完全である場合（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ）に起こるか、または一部のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が存在する場合にも起こりうる。ハイブリダイゼーションに必要な相補性の程度は、ハイブリダイゼーション条件によって変わり、特に、温度によって変わりうる。
増幅のためのプライマーとターゲット配列のアニーリングは、最適化手続きによって一般的に決定される適したハイブリダイゼーション条件下で実施される。温度、成分の濃度、ハイブリダイゼーションと洗浄回数、バッファ成分、及びこれらのｐＨとイオン強度のような条件は、オリゴヌクレオチド（プライマー）とターゲットヌクレオチド配列の長さ、及びＧＣ含量を含む多様な因子によって変わりうる。例えば、相対的に短いオリゴヌクレオチドを利用する場合、低い厳格条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を採択することが望ましい。ハイブリダイゼーションのための詳細な条件は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＭ．Ｌ．Ｍ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９９）で確認することができる。
用語“アニーリング”と“ハイブリダイジング”との間に差はなく、２つの用語は混用される。
本発明で利用されるプライマーは、ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジング（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）ヌクレオチド配列を有する。本明細書で使われた用語“相補的”は、指定されたアニーリング条件または厳格条件下でプライマーまたはプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイズする程度に十分に相補的であることを意味し、用語“実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”及び“完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”であることをいずれも包括する。本発明の具現例で、用語“相補的”は、“完全に相補的”であることを意味する。
ターゲット配列にアニーリングされたプライマーは、鋳型−依存的重合酵素によって延び、これは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ重合酵素Ｉの“クレノウ”断片、熱安定性ＤＮＡ重合酵素、及びバクテリオファージＴ７ＤＮＡ重合酵素を含む。本発明の具現例で、鋳型−依存的重合酵素は、多様なバクテリア種から収得された熱安定性ＤＮＡ重合酵素であり、バクテリア種には、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｓ １７、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ、Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ、及びＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｅｕｓが含まれる。
重合反応を実施する時、反応に必要な成分は、反応容器に過量で提供されうる。延長反応の成分と関連して過量は、期待する延長を果たす能力が前記成分の濃度によって実質的に制限されない程度の各成分の量を意味する。所望の反応を起こせるために、Ｍｇ２＋のような必要な補助因子、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰを十分な量で反応混合物に提供することが望ましい。
検出シグナルを提供することができる二量体は、増幅反応によって形成される。
用語“検出シグナル”は、ターゲット核酸配列の存在を立証する二量体の形成を示すあらゆるシグナルを意味する。二量体は、ターゲット核酸配列の存在を立証し、これは、検出シグナルを検出して決定される。
本発明の具現例によれば、本発明で利用される二量体は、増幅反応によって形成された二本鎖の増幅産物（ａｍｐｌｉｃｏｎ）、ターゲット核酸配列とプローブとの間のハイブリダイゼーションによって形成された二量体、またはターゲット核酸配列の存在に依存的に形成された二量体である。
本発明の具現例によれば、ターゲット核酸配列とプローブとの間のハイブリダイゼーションによって形成される前記二量体の場合、前記プローブは、増幅反応によって形成される二本鎖の増幅産物の内部配列にハイブリダイズされるプローブである。前記プローブは、メルティング分析でシグナルを提供することができるあらゆるプローブ、例えば、分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎＴＭ；米国特許第５，９２５，５１７号）、ハイビーコン（ＨｙｂｅａｃｏｎｓＴＭ；Ｄ．Ｊ．Ｆｒｅｎｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２００１）１３，３６３−３７４、及び米国特許第７，３４８，１４１号）、二重標識された、自己−クエンチングされたプローブ（Ｄｕａｌ−ｌａｂｅｌｅｄ、ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｅｄ ｐｒｏｂｅ；米国特許第５，８７６，９３０号）、ルクス（ＬＵＸＴＭ；Ｉ．Ａ．Ｎａｚａｒｅｎｋｏ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００２，３０：２０８９−２０９５．及びＵＳ ７，５３７，８８６）、ハイブリダイゼーションプローブ（Ｂｅｒｎａｒｄ ＰＳ，ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２０００，４６，１４７−１４８、及び米国特許第６，１７４，６７０号）を含む。
ターゲット核酸配列の存在に依存的に形成される二量体は、増幅反応によって形成されるターゲット配列の増幅産物それ自体はなく、ターゲット核酸配列の増幅に比例して、その量が増加する二量体である。ターゲット核酸配列の存在に依存的に形成される二量体は、多様な方法によって得られる。
本発明の具現例によれば、ターゲット核酸配列の存在に依存的に形成される二量体は、本発明者によって開発されたＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）方法によって得られ（参照：ＷＯ ２０１２／０９６５２３）、これは、本明細書に参考文献として挿入されている。
簡略に、ＰＴＯＣＥは、次の段階を含む：（ａ）ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階であって；前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含み；前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む３’−ターゲティング部位、及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み；前記３’−ターゲティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず；前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置し；（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で５’−ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって；前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’−ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導し、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出し；（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片をＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階であって；前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ；及び（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施する段階であって；前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延びて延長二量体を形成し、前記延長二量体は、（ｉ）前記断片の配列及び／または長さ、（ｉｉ）前記ＣＴＯの配列及び／または長さ、または（ｉｉｉ）前記断片の配列及び／または長さと前記ＣＴＯの配列及び／または長さとによって調節可能なＴｍ値を有する。
前記ＰＴＯＣＥの段階（ｄ）から形成された延長二量体が、本発明で利用される二量体の一例である。
前記ＰＴＯＣＥ方法を本発明に適用する場合、本発明は、次の段階を含む：（ａ）前記ＰＴＯ、前記プライマー及び５’−ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて、ターゲット核酸配列を増幅させ、前記ＰＴＯを切断させて断片を放出させる段階；及び（ｂ）前記ＰＴＯから放出された前記断片をＣＴＯとハイブリダイズさせ、鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長二量体を形成させる段階。
前記ＰＴＯの５’−タギング部位は、ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む。前記ＣＴＯのテンプレーティング部位は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含む。
本明細書で使われる用語“ＰＴＯ”は、（ｉ）プローブの役割を行う３’−ターゲティング部位、及び（ｉｉ）ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション以後に切断されてＰＴＯから放出され、ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有する５’−タギング部位を含むオリゴヌクレオチドを意味する。前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲティング部位は、５’→３’の順序で位置しなければならない。
前記ＰＴＯは、ある特定の長さを要しない。例えば、ＰＴＯの長さは、１５−１５０ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、２０−１５０ヌクレオチド、２０−１００ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−６０ヌクレオチド、２０−５０ヌクレオチド、３０−１５０ヌクレオチド、３０−１００ヌクレオチド、３０−８０ヌクレオチド、３０−６０ヌクレオチド、３０−５０ヌクレオチド、３５−１００ヌクレオチド、３５−８０ヌクレオチド、３５−６０ヌクレオチド、または３５−５０ヌクレオチドであり得る。前記ＰＴＯの３’−ターゲティング部位は、その部位がターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされる限り、如何なる長さも可能である。例えば、前記ＰＴＯの３’−ターゲティング部位は、１０−１００ヌクレオチド、１０−８０ヌクレオチド、１０−５０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−５０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチド、２０−１００ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−５０ヌクレオチド、２０−４０ヌクレオチド、または２０−３０ヌクレオチドであり得る。前記５’−タギング部位は、その部位が前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に特異的にハイブリダイズされて延びる限り、如何なる長さも可能である。例えば、前記ＰＴＯの５’−タギング部位は、５−５０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、５−３０ヌクレオチド、５−２０ヌクレオチド、１０−５０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１０−２０ヌクレオチド、１５−５０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチド、または１５−２０ヌクレオチドであり得る。
前記ＰＴＯの３’−末端は、３’−ＯＨターミナルを有することもある。本発明の具現例で、前記ＰＴＯの３’−末端は、その延長が防止されるように“ブロッキング”される。
前記ＣＴＯは、前記ＰＴＯから放出された断片の延長のための鋳型の役割を果たす。プライマーの役割を行う前記断片は、前記ＣＴＯにハイブリダイズされ、延びて延長二量体を形成する。
テンプレーティング部位は、その部位が前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲティング部位に非相補的な限り、如何なる配列も含みうる。また、前記テンプレーティング部位は、その部位が前記ＰＴＯから放出された前記断片の延長のための鋳型の役割ができる限り、如何なる配列も含みうる。
上述したように、前記ＰＴＯの５’−タギング部位を有する断片が放出される場合、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５’−タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることが望ましい。前記５’−タギング部位及び３’−ターゲティング部位の５’−末端一部を有する断片が放出される場合、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位は、前記５’−タギング部位及び３’−ターゲティング部位の５’−末端一部に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることが望ましい。前記ＰＴＯの５’−タギング部位の一部を有する断片が放出される場合、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位は、前記５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることが望ましい。
さらに、前記ＰＴＯの切断位置を予想することによって、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位をデザインすることができる。例えば、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位が、前記５’−タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインする場合、前記５’−タギング部位の一部を有する断片または前記５’−タギング部位を有する断片は、前記キャプチャリング部位とハイブリダイズされ、引き続き延びる。前記５’−タギング部位及び３’−ターゲティング部位の５’−末端一部を含む断片が放出される場合、前記断片は、前記５’−タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインされた前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ、前記断片の３’−末端部位にミスマッチヌクレオチドが存在する場合にも成功的に延びる。これは、プライマーの３’−末端が一部のミスマッチヌクレオチド（例えば、１−３ミスマッチヌクレオチド）を含む場合にも、プライマーが反応条件によって延びるためである。
前記５’−タギング部位及び３’−ターゲティング部位の５’−末端一部を含む断片が放出される場合、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端一部は、前記切断された３’−ターゲティング部位の５’−末端一部に相補的なヌクレオチド配列を有するようにデザインすることによって、ミスマッチヌクレオチドと関連した問題を解決することができる。
前記ＣＴＯの長さは、幅広く多様になる。例えば、前記ＣＴＯの長さは、７−１０００ヌクレオチド、７−５００ヌクレオチド、７−３００ヌクレオチド、７−１００ヌクレオチド、７−８０ヌクレオチド、７−６０ヌクレオチド、７−４０ヌクレオチド、１５−１０００ヌクレオチド、１５−５００ヌクレオチド、１５−３００ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、２０−１０００ヌクレオチド、２０−５００ヌクレオチド、２０−３００ヌクレオチド、２０−１００ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−６０ヌクレオチド、２０−４０ヌクレオチド、３０−１０００ヌクレオチド、３０−５００ヌクレオチド、３０−３００ヌクレオチド、３０−１００ヌクレオチド、３０−８０ヌクレオチド、３０−６０ヌクレオチド、または３０−４０ヌクレオチドの長さであり得る。前記ＣＴＯのキャプチャリング部位は、その部位が前記ＰＴＯから放出された断片に特異的にハイブリダイズされる限り、如何なる長さも有しうる。例えば、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５−１００ヌクレオチド、５−６０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、５−３０ヌクレオチド、５−２０ヌクレオチド、１０−１００ヌクレオチド、１０−６０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１０−２０ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチド、または１５−２０ヌクレオチドの長さであり得る。前記ＣＴＯのテンプレーティング部位は、その部位が前記ＰＴＯから放出された断片の延長反応で鋳型の役割ができる限り、如何なる長さも有しうる。例えば、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位は、２−９００ヌクレオチド、２−４００ヌクレオチド、２−３００ヌクレオチド、２−１００ヌクレオチド、２−８０ヌクレオチド、２−６０ヌクレオチド、２−４０ヌクレオチド、２−２０ヌクレオチド、５−９００ヌクレオチド、５−４００ヌクレオチド、５−３００ヌクレオチド、５−１００ヌクレオチド、５−８０ヌクレオチド、５−６０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、５−３０ヌクレオチド、１０−９００ヌクレオチド、１０−４００ヌクレオチド、１０−３００ヌクレオチド、１５−９００ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、または１５−２０ヌクレオチドの長さであり得る。
前記ＣＴＯの３’−末端は、３’−ＯＨターミナルを有しうる。本発明の具現例で、前記ＣＴＯの３’−末端は、その延長が防止されるようにブロッキングされる。
前記ＰＴＯＣＥ方法によって形成された二量体は、ターゲット核酸配列の存在に依存的に形成される二量体の一例である。
ターゲット核酸配列の存在に依存的に形成される二量体の他の例には、前記ＰＴＯＣＥ方法によって形成された二量体の鎖とその鎖に特異的にハイブリダイズされたプローブとの間の二量体が含まれる。
メルティング分析のための二量体は、他の方法によってターゲット−依存的な方式で形成され、本発明の定量方法に利用されうる。
ラベリングモイエティ（標識）は、二量体の結合または解離過程で検出可能なシグナルを発生させる。
本発明の具現例によれば、標識は、増幅反応で形成される二本鎖増幅産物に連結されうる。増幅用プライマーは、標識を含みうる。本発明のさらに他の具現例で、ターゲット核酸配列とプローブとの間の二量体を利用する場合、標識は、プローブに連結されるか、ターゲット核酸配列及びプローブいずれもに連結されうる。本発明の具現例で、ターゲット核酸配列の存在に依存的に形成される二量体を利用する場合、二量体を形成するオリゴヌクレオチドが標識を含んでいる。例えば、ＰＴＯＣＥ方法を適用する場合、標識は、前記ＰＴＯから放出される断片及び／またはＣＴＯに連結されうる。
本発明の具現例によれば、二量体のラベリングモイエティは、前記二量体のうち何れか一方の鎖に連結された単一標識、前記二量体のうち何れか一方の鎖にいずれも連結されたレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識（鎖内の相互作用的二重標識）、二量体の一方の鎖に連結されたレポーター分子及び他方の鎖に連結されたクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識（鎖間の相互作用的二重標識）、または前記二量体に挿入されるインターカレーティング染料（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｄｙｅ）である。
単一標識は、例えば、蛍光標識、発光標識、化学発光標識または電気化学的標識、及び金属標識を含む。
本発明の具現例によれば、前記単一標識は、二本鎖または一本鎖上に存在するかによって互いに異なるシグナル（例えば、他のシグナル強度）を提供する。
本発明の具現例によれば、単一標識は、蛍光標識である。本発明で使われる単一蛍光標識の望ましい種類及び結合位置は、米国特許第７，５３７，８８６号及び第７，３４８，１４１号に開示されており、これらは、その全体として本明細書に参照して含まれている。例えば、単一蛍光標識は、ＪＯＥ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、及びフルオレセイン−ベース標識を含む。
前記単一標識は、多様な方法によってオリゴヌクレオチドに連結されうる。例えば、標識は、炭素原子を含むスペーサ（ｓｐａｃｅｒ）を通じてプローブに連結される（例えば、３−ｃａｒｂｏｎ ｓｐａｃｅｒ、６−ｃａｒｂｏｎ ｓｐａｃｅｒ、または１２−ｃａｒｂｏｎ ｓｐａｃｅｒ）。
相互作用的標識システムの代表的な例として、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識システムは、蛍光レポーター分子（供与体分子）及びクエンチャー分子（受容体分子）を含む。ＦＲＥＴで、エネルギー供与体は、蛍光性であるが、エネルギー受容体は、蛍光性または非蛍光性であり得る。相互作用的標識システムの他の形態で、エネルギー供与体は、非蛍光性、例えば、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）であり、エネルギー受容体は、蛍光性である。相互作用的標識システムのさらに他の形態で、エネルギー供与体は、発光性（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）、例えば、生物発光性、化学発光性または電気発光性であり、エネルギー受容体は、蛍光性である。相互作用的標識システムは、“接触−媒介クエンチング（ｏｎ ｃｏｎｔａｃｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）”を基にする二重標識を含む（Ｓａｌｖａｔｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２（３０）ｎｏ．２１ ｅ１２２、及びＪｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ２００２（１２４）ｐｐ ６９５０−６９５６）。相互作用的標識システムは、シグナル変化が少なくとも２つの分子（例えば、染料）間の相互作用によって誘導される如何なる標識システムも含む。
本発明で有用なレポーター分子及びクエンチャー分子は、当該技術分野で知られた如何なる分子も含みうる。その例は、次の通りである：Ｃｙ２ＴＭ（５０６）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５０９）、ＹＯＹＯＴＭ−１（５０９）、Ｃａｌｃｅｉｎ（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸＴＭ（５１９）、ＡｌｅｘａＴＭ（５２０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １１０（５２０）、Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ５００（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（５２５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＧｒｅｅｎＴＭ（５２７）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３（５２９）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ＧｒｅｅｎＴＭ（５３１）、Ｃａｌｃｉｕｍ ＧｒｅｅｎＴＭ（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５３３）、ＴＯＴＯ１（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３ＴＭ（５７０）、ＡｌｅｘａＴＭ ５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７５）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｒ＆Ｂ（５７５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（５７５）、Ｃａｌｃｉｕｍ ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７６）、Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ（５８０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＲｅｄＴＭ（５９０）、Ｃｙ３．５ＴＭ（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、Ｃａｌｃｉｕｍ ＣｒｉｍｓｏｎＴＭ（６１５）、ＡｌｅｘａＴＭ ５９４（６１５）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（６１５）、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６３１）、ＹＯＹＯＴＭ−３（６３１）、Ｒ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４２）、Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４８）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６６０）、ＴＯＴＯ３（６６０）、ＤｉＤ ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５ＴＭ（６７０）、Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ（６７１）、Ｃｙ５．５（６９４）、ＨＥＸ（５５６）、ＴＥＴ（５３６）、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｂｌｕｅ（４４７）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｇｏｌｄ ５４０（５４４）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０（５５９）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ５９０（５９１）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０（６１０）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５（６３７）、ＦＡＭ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３（５２０）、Ｐｕｌｓａｒ ６５０（５６６）、Ｑｕａｓａｒ ５７０（６６７）、Ｑｕａｓａｒ ６７０（７０５）、及びＱｕａｓａｒ ７０５（６１０）。カッコの数字は、ｎｍ単位で表示した最大発光波長である。望ましくは、レポーター分子及びクエンチャー分子は、ＪＯＥ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、及びフルオレセイン−ベース標識を含む。
適した蛍光分子及び適したレポーター−クエンチャー対は、次のような多様な文献に開示されている：Ｐｅｓｃｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｒｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７０）；Ｂｅｒｌｍａｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２ｎｄ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｃｏｌｏｒ ＡＮＤ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ＯＦ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６）；Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，１９９２）；Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９４９）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．，１９９６）；米国特許第３，９９６，３４５号及び第４，３５１，７６０号。
本発明で幅広い波長または特定波長の蛍光をクエンチングすることができる非蛍光クエンチャー分子（例えば、ブラッククエンチャーまたはダーククエンチャー）を利用できるということは注目すべきことである。これらの例としては、ＢＨＱ及びＤＡＢＣＹＬがある。
レポーター及びクエンチャー分子を含むシグナリングシステムで、レポーターは、ＦＲＥＴの供与体を含み、クエンチャーは、ＦＲＥＴの他のパートナー（受容体）を含む。例えば、フルオレセイン染料は、レポーターとして、ローダミン染料は、クエンチャーとして利用される。
本発明で有用なインターカレーティング染料の例には、ＳＹＢＲＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＰＯ−ＰＲＯＴＭ−１、ＢＯ−ＰＲＯＴＭ−１、ＳＹＴＯＴＭ４３、ＳＹＴＯＴＭ４４、ＳＹＴＯＴＭ４５、ＳＹＴＯＸＴＭＢｌｕｅ、ＰＯＰＯＴＭ−１、ＰＯＰＯＴＭ−３、ＢＯＢＯＴＭ−１、ＢＯＢＯＴＭ−３、ＬＯ−ＰＲＯＴＭ−１、ＪＯ−ＰＲＯＴＭ−１、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ１、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ１、ＳＹＴＯＴＭ１１、ＳＹＴＯＴＭ１３、ＳＹＴＯＴＭ１５、ＳＹＴＯＴＭ１６、ＳＹＴＯＴＭ２０、ＳＹＴＯＴＭ２３、ＴＯＴＯＴＭ−３、ＹＯＹＯＴＭ３、ＧｅｌＳｔａｒＴＭ、及びチアゾールオレンジ（ｔｈｉａｚｏｌｅ ｏｒａｎｇｅ）が含まれる。インターカレーティング染料は、二本鎖核酸分子内に特異的に割り込んでシグナルを発生させる。
本発明に適用することができるＰＴＯＣＥ方法の標識及びシグナル発生は、ＷＯ ２０１２／０９６５２３に記載されている。本発明にＰＴＯＣＥ方法が適用される場合、標識及びシグナル発生を、次のような例として説明することができる：
二量体のうち、単一鎖にいずれも連結されたレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識（すなわち、鎖内の二重標識）を利用する場合、前記ＰＴＯから放出された断片または前記ＣＴＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を含み；前記段階（ｂ）で二量体のメルティングは、前記相互作用的二重標識からのシグナル提供を誘導する。本発明の具現例で、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＣＴＯの５’−末端及び３’−末端に連結される。例えば、前記ＣＴＯ上のレポーター分子及びクエンチャー分子のうち１つは、その５’−末端または５’−末端から０−５ヌクレオチド離隔した位置に位置し、他の１つは、ＣＴＯの形態（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって、前記レポーター分子からのシグナルをクエンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）またはアンクエンチング（ｕｎｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）することができる所に位置する。さらに他の例として、前記ＣＴＯ上のレポーター分子及びクエンチャー分子のうちの１つは、その３’−末端または３’−末端から０−５ヌクレオチド離隔した位置に位置し、他の１つは、ＣＴＯの形態によってレポーター分子からのシグナルをクエンチングまたはアンクエンチングすることができる所に位置する。
前記二量体の二本鎖の各鎖にそれぞれ連結されたレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識（すなわち、鎖間の二重標識）を利用する場合、前記ＰＴＯ断片は、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識のうち１つを有し、前記ＣＴＯは、相互作用的二重標識のうち残りの１つを有し、前記段階（ｂ）での前記二量体のメルティングは、前記相互作用的二重標識からのシグナル提供を誘導する。前記二量体のクエンチャー分子によって、前記レポーター分子からのシグナルがクエンチングされる限り、前記レポーター分子及びクエンチャー分子は、前記ＰＴＯ断片及び前記ＣＴＯの如何なる位置にも位置しうる。例えば、ＰＴＯ断片上のレポーター分子またはクエンチャー分子は、５’−タギング部位の５’−末端に位置する。例えば、ＣＴＯ上のレポーター分子またはクエンチャー分子は、その３’−末端に位置する。
二量体のうち、１本の鎖に連結されている単一標識を利用する場合、前記ＰＴＯ断片または前記ＣＴＯは、単一標識を有し、前記段階（ｂ）での前記二量体のメルティングは、前記単一標識からのシグナル提供を誘導する。前記二量体のメルティングによって、前記単一標識からのシグナルレベルに変化がある限り、単一標識は、ＣＴＯ上の如何なる位置にも位置しうる。例えば、単一標識は、ＣＴＯのテンプレーティング部位またはキャプチャリング部位に連結される。前記二量体のメルティングによって、前記単一標識からのシグナルレベルに変化がある限り、単一標識は、ＰＴＯ断片上の如何なる位置にも位置しうる。
段階（ｂ）：二量体のメルティング及びメルティングピークカーブ
引き続き、ターゲット核酸配列の増幅の間に、少なくとも２つの既定のサイクルで二量体からのシグナルを一定範囲の温度で検出する（メルティング分析）。シグナル検出は、一定範囲の温度で段階（ａ）から形成された二量体のメルティングによって発生するシグナル検出、及び一定範囲の温度で段階（ａ）から形成された二量体のメルティング後、ハイブリダイズによって発生するシグナル検出を含む。
本発明の特徴は、ターゲット核酸配列の増幅過程の間に少なくとも２つ以上の既定のサイクルから得たそれぞれの増幅産物（または、増幅産物を示す二量体）に対してメルティング分析を実施するところにある。
従来のメルティング分析またはメルティングピーク分析は、ターゲット増幅を完了した後、一回実施する。そうでなければ、他の従来の方法は、既定の閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｖａｌｕｅ）のメルティングピーク高さを示すサイクルを探すために、ターゲット増幅過程の間にほとんどのサイクルでメルティング分析を実施する（参照：米国特許第８，０３９，２１５号）。
従来の方法と異なって、本発明は、ターゲット核酸配列の増幅過程の間に少なくとも２つの既定のサイクルから得られた増幅産物（または、増幅産物を示す二量体）に対してメルティング分析を実施した後、メルティング分析の結果を定量に利用することによって、定量分析の正確性、迅速性及び便利性の側面で従来の方法の問題点を完全に克服する。
段階（ｂ）は、当該技術分野で知られた多様なメルティング分析過程によって実施される。使われた用語“メルティング分析”は、取り立てて明示しない限り、狭い意味のメルティング分析だけではなく、ハイブリダイゼーション分析を包括する意味として使われる。狭い意味のメルティング分析は、温度調節によって増加する厳格条件下で二量体の解離を測定する方法を意味する。狭い意味のハイブリダイゼーション分析は、温度調節によって減少する厳格条件下で二量体の会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を測定する方法を意味する。
本明細書に使われた用語“メルティングカーブ”または“メルティングピークカーブ”は、取り立てて明示しない限り、狭い意味のメルティング分析から得たメルティングカーブやメルティングピークカーブだけではなく、ハイブリダイゼーション分析から得たハイブリダイゼーションカーブやハイブリダイゼーションピークカーブを包括する意味として使われる。
メルティングカーブまたはハイブリダイゼーションカーブは、従来技術、例えば、米国特許第６，１７４，６７０号及び第５，７８９，１６７号、Ｄｒｏｂｙｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８８：４５（１９９７）；Ｋｏｃｈｉｎｓｋｙ ａｎｄ Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ １９：３４３（２００２）；Ｌｉｖｅｈｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｄｙｎａｍ．１１：７８３（１９９４）；及びＨｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８７（１９９９）に記述された方法によって得られうる。例えば、メルティングカーブまたはハイブリダイゼーションカーブは、ハイブリダイゼーション厳格度（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）のパラメータを利用したアウトプットシグナル（ｏｕｔｐｕｔ ｓｉｇｎａｌ）変化のグラフィックプロット（ｇｒａｐｈｉｃ ｐｌｏｔ）またはディスプレイ（ｄｉｓｐｌａｙ）で構成することができる。アウトプットシグナルは、ハイブリダイゼーションパラメータに対して直接にプロッティングすることができる。典型的に、メルティングカーブまたはハイブリダイゼーションカーブは、Ｙ軸にプロッティングされた二量体構造の程度（すなわち、ハイブリダイゼーション程度）を示すアウトプットシグナル、例えば、蛍光、及びＸ軸にプロッティングされたハイブリダイゼーションパラメータを有する。
メルティング（ハイブリダイゼーション）カーブ分析及びメルティング（ハイブリダイゼーション）ピーク分析は、米国特許第８，０３９，２１５号に開示されたものを参照して記述されうる。
本発明の方法の実施前、メルティングカーブ分析を実施する少なくとも２つサイクルをあらかじめ定め、引き続きターゲット増幅過程の間に既定のサイクルでメルティングカーブ分析を実施する。
メルティングカーブ分析は、既定のサイクル以前に、サイクルの間に、またはサイクル以後に実施される。
メルティングカーブ分析を実施するサイクルは、増幅方法の特徴を考慮してあらかじめ決定することができる。例えば、ＰＣＲ増幅方法を使う場合、初期増幅段階、指数的増幅段階、及び増幅の飽和段階を考慮してメルティングカーブ分析を実施するサイクルを選択することができる。一般的に、メルティングカーブ分析を実施するサイクル及び数は、試料内のターゲット核酸配列の量を考慮して選択することができる。
本発明の具現例によれば、メルティングカーブ分析を実施するサイクルの数は、少なくとも２、３、４、５、または６つであり、最大４０、３０、２０、１５、１０、または８つである。
本発明の具体的な具現例の場合、メルティングカーブ分析を実施するサイクル数は、２−４０、２−３０、２−２０、２−１５、２−１０、２−７、２−５、３−４０、３−３０、３−２０、３−１５、３−１０、３−７、または３−５つのサイクルである。
本発明の具現例によれば、メルティングカーブ分析を実施するサイクル間の間隔は、少なくとも２、５、１０、１５、または２０サイクルであり、最大４０、３０、または２０サイクルである。
本発明の具体的な具現例の場合、メルティングカーブ分析を実施するサイクル間の間隔は、２−４０、５−２０、５−１５、または１０−１５サイクルである。
例えば、メルティング分析を実施するサイクルを２０番目、３０番目、及び４０番目に選択した場合、メルティングカーブ分析を実施するサイクル数は、３であり、このような場合でサイクル間の間隔は、１０サイクルである。
段階（ｃ）：メルティングピークカーブを利用した定量分析
次いで、メルティングピークカーブを用いてターゲット核酸配列の定量を実施する。
本発明の特徴は、メルティングピークカーブから定量数値を計算した後、前記定量数値を用いてターゲット核酸配列を定量することである。
本発明の具現例によれば、既定のサイクルでのメルティングピークカーブの存否を用いてターゲット核酸配列を定量する。
本発明の他の具現例によれば、既定のサイクルでのメルティングピークカーブの高さまたは面積を用いてターゲット核酸配列を定量する。
メルティングカーブは、少なくとも２つの既定のサイクルからのシグナル検出を通じて得られ、次いで、メルティングピークが得られる。引き続き、メルティングピークカーブの最大高さ値または面積値が得られる。ターゲット核酸配列の量が多くなるほど、より早いサイクルでメルティングピークカーブが得られ、それをターゲット核酸配列の定量に利用する。メルティングピークカーブの最大高さ値または面積値は、シグナルを発生させる二量体の量を反映することができる。二量体の量は、ターゲット核酸配列の量に比例する。したがって、メルティングピークカーブの最大高さ値または面積値は、ターゲット核酸配列の初期量を反映することができる。
ターゲット核酸配列の定量は、少なくとも２つの既定の増幅サイクルから得られたメルティングピークの存在（または、不在）、及び／またはメルティングピークの高さまたは面積を用いて多様な方法で実施される。
メルティングピークカーブによって提供されたメルティングピークの高さまたは面積は、特定の規則での誘導（または、変形）なしに、または誘導（または、変形）を経てターゲット核酸配列の定量に利用されうる。
メルティングピークカーブ値（例えば、高さ及び面積）をメルティングピークカーブが出た既定のサイクルに付与された基準数値と共に使う場合、前記基準数値は、メルティングピークカーブ値の大きさを考慮してあらかじめ選択することができる。
本発明の具現例によれば、メルティングピークの高さ及び面積は、最大高さ及び面積である。
最初の方法の場合、少なくとも２つの既定のサイクルから得られたあらゆるメルティングピークカーブを用いてターゲット核酸配列の初期量を定量する。
本発明の具現例によれば、定量数値を得るために、メルティングピークカーブが出た既定のサイクルのあらゆる基準数値及び／またはメルティングピークカーブのあらゆる値（例えば、高さ及び面積）を用いて演算過程（例えば、加算、減算、乗算または除算）を行った後、ターゲット核酸配列の初期量を決定する。
本発明の具現例によれば、定量数値を得るために、メルティングピークカーブが出た既定のサイクルのあらゆる基準数値及び／またはメルティングピークカーブの一部値（例えば、高さ及び面積）を用いて演算過程（例えば、加算、減算、乗算または除算）を行った後、ターゲット核酸配列の初期量を決定する。
本発明の具現例によれば、定量数値を得るために、メルティングピークカーブが出た既定のサイクルの基準数値の一部及び／またはメルティングピークカーブのあらゆる値（例えば、高さ及び面積）を用いて演算過程（例えば、加算、減算、乗算または除算）を行った後、ターゲット核酸配列の初期量を決定する。
本発明の具体的な具現例によれば、既定のサイクルから得られるメルティングピークカーブのあらゆる最大高さ値または面積値を加えて、ターゲット核酸配列の初期量を定量する。例えば、メルティング分析を実施する３つのサイクル（３０、４０、及び５０サイクル）をあらかじめ選択し、引き続き増幅反応を進行した後、メルティング分析を実施してメルティングピークを得る。メルティングピークカーブの最大高さ値または面積値を合わせた後、合算した値を定量のために比較する。例えば、合算した値が大きくなるほど、ターゲット核酸配列の初期量がさらに大きいと決定される。
本発明のさらに他の具体的な具現例によれば、少なくとも２つの既定のサイクルに基準数値を付与し、メルティングピークカーブが出た少なくとも２つの既定のサイクルに付与された基準数値を合わせてターゲット核酸配列の初期量を定量する。例えば、メルティング分析を実施する３つのサイクル（３０、４０、及び５０サイクル）をあらかじめ選択し、基準数値である３０、４０、及び５０を既定のサイクルにそれぞれ付与する。４０及び５０サイクルでメルティングピークが観察される場合、基準数値である４０と５０とを合わせ、合算した値である“９０”を使ってターゲット核酸配列の初期量を定量する。既定の各サイクルに同じ数値の基準数値（例えば、１００、１００、１００）を付与することもできる。代案として、既定のサイクルに昇順（例えば、１００、２００、３００）または降順（例えば、３００、２００、１００）で基準数値を付与することもできる。基準数値は、次の事項を考慮して付与しなければならない：例えば、３０、４０、及び５０サイクルに付与された基準数値を合算した値が、４０及び５０サイクルに付与された基準数値を合算した値よりも大きくなければならず、４０及び５０サイクルに付与された基準数値を合算した値は、５０サイクルに付与された基準数値よりも大きくなければならない。
本発明の具現例によれば、既定のサイクルでメルティングピークカーブが出たか否かを決定するに当たって、メルティングピークカーブの最大高さ値または最大面積値があらかじめ定めた値（すなわち、閾値）よりもさらに高い場合に、定量のためのメルティングピークカーブが表われたと決定されなければならない（すなわち、閾値をもって決定）。
本発明のさらに他の具体的な具現例によれば、最初に観察されるメルティングピークの最大高さ値または最大面積値を考慮して追加的な値（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｖａｌｕｅ）を合算する。このような具体的な具現例は、同じサイクルで最初に観察されるメルティングピークが出た試料での含量差の測定に利用されうる。最初に観察されたメルティングピークの最大高さ値または最大面積値を考慮して追加的な値を計算する方法として、ターゲット増幅の飽和段階から得られるメルティングピークの最大高さ値または最大面積値を基準にして、実際に得られるメルティングピークの最大高さ値または最大面積値の相対的な比率を利用する。
二番目の方法の場合、少なくとも２つの既定のサイクルから得られたメルティングピークカーブのうち、最初のメルティングピークカーブを用いてターゲット核酸配列の初期量を定量する。
本発明の具現例によれば、最初のメルティングピークカーブが出た既定のサイクルの基準数値及び／または最初のメルティングピークカーブの値（例えば、高さ及び面積）を用いて定量数値を得て、引き続き、前記定量数値を用いてターゲット核酸配列の初期量を定量する。定量数値を得るために、演算過程（加算、減算、乗算または除算）を行うことができる。
本発明の具体的な具現例によれば、前記段階（ｃ）は、少なくとも２つの既定のサイクル別に基準数値を付与し、最初のメルティングピークカーブが出た既定のサイクルの基準数値を用いて定量数値を計算することで実施され、これにより、ターゲット核酸配列の初期量を定量する。例えば、基準数値それ自体が定量数値として利用されうる。
本発明のさらに他の具体的な具現例によれば、前記段階（ｃ）は、少なくとも２つの既定のサイクル別に基準数値を付与し、（ｉ）最初のメルティングピークカーブが出た既定のサイクルの基準数値、及び（ｉｉ）最初のメルティングピークカーブの最大高さ値または面積値を用いて定量数値を計算することで実施され、これにより、ターゲット核酸配列の初期量を定量する。
本発明のさらに具体的な具現例によれば、段階（ｃ）は、少なくとも２つの既定のサイクル別に基準数値を付与し、最初のメルティングピークカーブが出た既定のサイクルの基準数値を最初のメルティングカーブの最大高さ値または面積値を有し、変形（誘導）して定量数値を計算することで実施され、これにより、ターゲット核酸配列の初期量を定量する。例えば、基準数値の変形（誘導）は、最初のメルティングピークカーブの基準数値と最大高さ値（または、最大面積値）とを合算するものである。択一的に、変形（誘導）は、特定規則（例えば、比例適用）によって最初のメルティングピークカーブの最大高さ値（または、最大面積値）を基準数値に適用するものである。最初のメルティングピークカーブの最大高さ値（または、最大面積値）を基準数値に適用する方法として、ターゲット増幅の飽和段階から得られるメルティングピークの最大高さ値または最大面積値を基準にして、実際に得られるメルティングピークの最大高さ値または最大面積値の相対的な比率を利用する。
例えば、メルティング分析を実施する３つのサイクル（２０、３０、及び４０サイクル）をあらかじめ決定し、それぞれのサイクルに基準数値で１００、１、及び０．０１を付与する。次いで、ターゲット増幅の飽和段階から得られるメルティングピークの最大高さ値を基準にして、実際に得られるメルティングピークの最大高さ値の相対的な比率を計算する。例えば、実際に得られたメルティングピークの最大高さ値が１２０であり、ターゲット増幅の飽和段階から得られたメルティングピークの最大高さ値が５００である場合、相対的な比率は０．２４（１２０／５００）である。計算される相対的な比率値は、小数点二番目の位置で四捨五入するか、一定の区間値を用いて得られる。例えば、区間を０．２５、０．５、０．７５、１に４等分し、観察された値が０．２４である場合、前記観察された値は、０．２５に処理される。
試料Ａで０．２の最大高さ値の比率を有する最初のメルティングピークカーブが、２０サイクルから観察され、試料Ｂで０．３の最大高さ値の比率を有する最初のメルティングピークカーブが、２０サイクルから観察されると仮定すれば、試料Ａの定量数値は、２０（１００×０．２）であり、試料Ｂの定量数値は、３０（１００×０．３）である。したがって、試料Ｂが試料Ａよりもターゲット核酸配列の初期量を高く含有していると評価することができる。試料Ｃで０．３の最大高さ値の比率を有する最初のメルティングピークカーブが、３０サイクルから観察されると仮定すれば、試料Ｃの定量数値は、０．３（１×０．３）である。したがって、試料Ｃは、試料Ａ及びＢよりもターゲット核酸配列の初期量をさらに低く含有していると評価することができる。このような例は、相対的な定量に該当する。
本発明の具現例によれば、二番目の方法において、最初のメルティングピークカーブが出た既定のサイクルから計算された定量数値の最小値が、既定のサイクル直後のサイクルで最初のメルティングピークカーブが観察される場合に計算された定量数値の最大値よりも大きいか、同じ数値になるように基準数値及び定量数値の計算方法を決定する。
択一的に、既定のサイクルに昇順で基準数値（例えば、０．０１、１、１００）を付与し、メルティングピークの最大値が大きくなるほど、さらに低い比率値が得られる。
例えば、ターゲット増幅の飽和状態から得られるメルティングピークの最大高さ値を既定のサイクルで実際に得られるメルティングピークの最大高さ値で割ることによって、比率の計算ができる。定量数値がさらに低く計算される場合、ターゲット核酸配列の初期量は、さらに高いと評価することができる。このような計算において、最初のメルティングピークカーブが出る既定のサイクルから計算された定量数値の最大値が、最初のメルティングピークカーブが既定のサイクルの直後のサイクルから出る場合、計算された定量数値の最小値よりも低いか、同一であるように基準数値及び定量数値の計算方法を決定する。
前述した数字値は、単に例である。既定のサイクル、基準数値の間隔、特定数値の付与、定量数値の計算のためのメルティングピークの最大高さ値または面積値の変形（誘導）方法、基準数値の計算、及びメルティングピークの最大高さまたは面積値、またはその変形値を定量数値に導入する方法は、多様な方式で実施することができる。
前述した本発明を具現するための方法は、個別的または複合的に実施される。択一的に、既定の範囲のサイクルでのメルティング分析を通じてメルティングピークを得て、引き続き、多様な方法でメルティングピークを用いてターゲット核酸配列の初期量を定量するような方式で多様な方法を実施することができる。
本発明の具現例によれば、他の核酸試料または既知（ｋｎｏｗｎ）核酸濃度を有する対照群試料を段階（ａ）〜（ｃ）に適用して得た定量数値と比較することによって、ターゲット核酸配列の相対的または絶対的定量を実施する。対照群試料の濃度を細密に区分（例えば、１ｐｇ、１０ｐｇ、２０ｐｇ、３０ｐｇなど）した後、対照群試料の定量数値を得た場合、より正確にターゲット核酸配列の絶対的定量を求めうる。
本発明の具現例によれば、ターゲット核酸配列の定量は、特定の数値の結果を提供する（例えば、１００ｐｇ）。
本発明の具現例によれば、前記ターゲット核酸配列の定量は、一定範囲の値を提供する（例えば、１０００ｐｇ以下、及び１０ｐｇ以上、または１０〜１０００ｐｇ）。
他の核酸試料または対照群試料の定量をターゲット核酸配列の反応容器と同じ容器または異なる容器で実施することができる。
本発明の長所は、少なくとも２つのターゲット核酸配列の同時（マルチプレクス）定量であるという点から強調されうる。
本発明の具現例によれば、ターゲット核酸から生成された二量体は、それぞれ他のＴｍ値を有する。
本発明の具現例によれば、ターゲット核酸配列は、少なくとも２つのターゲット核酸配列を含む。少なくとも２つのターゲット核酸配列の定量を１つの反応容器で実施する場合、各ターゲット核酸配列を絶対的に定量し、ターゲット核酸配列間の相対的定量も可能である。
本発明は、またヌクレオチド変異を含む核酸配列の定量にも有用である。本発明の具現例によれば、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。本明細書で使われた用語“ヌクレオチド変異（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）”は、配列が類似した連続的ＤＮＡセグメントのうち、特定位置のＤＮＡ配列でのあらゆる単一または複数のヌクレオチドの置換、欠失または挿入を意味する。このような連続的ＤＮＡ断片は、１つの遺伝子または１つの染色体の如何なる他の部位を含む。このようなヌクレオチド変異は、突然変異（ｍｕｔａｎｔ）または多形成対立遺伝子変異（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ａｌｌｅｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）であり得る。例えば、本発明から検出されるヌクレオチド変異は、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）、欠失、挿入、置換、及び転座を含む。ヌクレオチド変異の例は、ヒトゲノムにある多様な変異（例えば、ＭＴＨＦＲ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子の変異）、病原体の薬剤耐性と関連した変異及び癌発生−関連変異を含む。本明細書で使われる用語“ヌクレオチド変異”は、核酸配列の特定位置でのあらゆる変異を含む。すなわち、用語“ヌクレオチド変異”は、核酸配列の特定位置での野生型及びそのあらゆる突然変異型を含む。
本発明は、液相及び固相のいずれでも実施される。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。
実施例１：得られたあらゆるメルティングピークを利用するサイクリックメルティングカーブ分析によるターゲット核酸配列の定量
本発明者らは、得られたあらゆるメルティングピークを用いてサイクリックメルティングカーブ（ｃｙｃｌｉｃ ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）分析を行う場合、ターゲット核酸配列の定量が可能であるか否かを確認しようとした。ターゲット核酸配列の定量のために、メルティング分析を含むＰＴＯＣＥ分析を利用した。
アップストリームプライマーとダウンストリームプライマーとの延長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長のために、５’−ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を利用した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のゲノムＤＮＡを標準物質及びターゲット核酸配列として利用した。
本実施例のＰＴＯＣＥ分析の場合、延長鎖及びＣＴＯを用いて形成された延長二量体をメルティング分析して、ターゲット核酸配列の存在に依存的に生成された延長鎖の存在を検出した。前記延長二量体の量は、ターゲット核酸配列の初期量に比例する。メルティングカーブピークの高さまたは面積は、延長二量体の量を反映することができる。本実施例では、メルティングカーブ分析を３つの既定のサイクルで実施した。サイクリックメルティングカーブ分析から得られたメルティングピーク高さの和を用いてターゲット核酸配列の初期量を測定した。
ＰＴＯ及びＣＴＯは、その延長を防止するために、３’−末端をカーボンスぺーサ（ｃａｒｂｏｎ ｓｐａｃｅｒ）でブロッキングした。ＣＴＯの鋳型部位（配列番号４）をクエンチャー分子（ＢＨＱ−１）及び蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）で標識した。
本実施例で利用されたアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、ＰＴＯ及びＣＴＯの配列は、次の通りである：
ＮＧ−Ｆ ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴＩＩＩＩＩＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣＩＩＩＩＩＣＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣ−３’（配列番号２）
ＮＧ−ＰＴＯ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’（配列番号３）
ＮＧ−ＣＴＯ ５’−［ＢＨＱ−１］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＣＴＣＣＴＣＴＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３ Ｓｐａｃｅｒ］−３’（配列番号４）
（Ｉ：デオキシイノシン（Ｄｅｏｘｙｉｎｏｓｉｎｅ））
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング部位を示す）
一連の量のＮＧゲノムＤＮＡ（１ｎｇ、１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ、または１００ｆｇ）、１０ｐｍｏｌｅのアップストリームプライマー（配列番号１）、１０ｐｍｏｌｅのダウンストリームプライマー（配列番号２）、５ｐｍｏｌｅのＰＴＯ（配列番号３）、３ｐｍｏｌｅのＣＴＯ（配列番号４）、及び１０μｌの２Ｘマスターミックス［２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＮＴＰｓ、１．６ｕｎｉｔ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）］を含有した２０μｌの最終体積で標準反応を実施した。各標準量別に３つの反応チューブを準備した。特定量のＮＧゲノムＤＮＡ（１ｎｇ、１０ｐｇ、または１００ｆｇ）、１０ｐｍｏｌｅのアップストリームプライマー（配列番号１）、１０ｐｍｏｌｅのダウンストリームプライマー（配列番号２）、５ｐｍｏｌｅのＰＴＯ（配列番号３）、３ｐｍｏｌｅのＣＴＯ（配列番号４）、及び１０μｌの２Ｘマスターミックス［２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＮＴＰｓ、１．６ｕｎｉｔ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）］を含有した２０μｌの最終体積でサンプル反応を実施した。
前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；反応混合物を９５℃で１５分間変性させた後、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で３０秒のサイクルを５０回繰り返した。反応過程の間に、３０番目、４０番目、及び５０番目のサイクル後、それぞれのメルティングカーブを得て、メルティングカーブは、反応物を５５℃に冷却させ、５５℃で５分間保持させた後、５５℃から８５℃に徐々に加熱させることで得ることができた。二本鎖ＤＮＡの解離をモニタリングするために、温度が上昇する間に蛍光を連続して測定した。メルティングピークは、メルティングカーブデータから由来された。３０番目、４０番目、及び５０番目のサイクルから得られたメルティングピークの高さを定量のために合算した。実験結果を、表１及び表２に要約した。
表１の各標準量に対する標準値は、標準反応から得た。３つの複製チューブから得られた高さの和のうち、最小値を相応する標準量に対する標準値で選択する。
標準値を用いて、試料の初期量を表２のように範囲レベル（ｒａｎｇｅ ｌｅｖｅｌ）で測定した。実験結果は、各試料に対して測定された量の範囲が試料内の実際量をほぼ正確に含んでいることを示す。
ターゲット核酸が存在しない場合には、ピークが検出されていない。
このような結果は、あらゆるメルティングピークを利用するサイクリックメルティングカーブ分析がターゲット核酸配列の定量を可能にすることを示す。
実施例２：最初のメルティングピークを利用するサイクリックメルティングカーブ分析によるターゲット核酸配列の定量
本発明者らは、最初のメルティングピークを用いてサイクリックメルティングカーブ分析を行う場合、ターゲット核酸配列の定量が可能であるか否かを確認しようとした。ターゲット核酸配列の定量のために、メルティング分析を含むＰＴＯＣＥ分析を利用した。
実施例１から得られた反応結果を最初のメルティングピークを利用するサイクリックメルティングカーブ分析による定量に利用した。
本実施例で、“３０００”、“２０００”、及び“１０００”は、予想される最大メルティングピーク高さを考慮して人為的に選択したものであり、それぞれ３０番目、４０番目、及び５０番目のサイクルから得られるメルティングピークに付与した。最初のメルティングピークが観察されるサイクルを反応過程で決定した。定量数値は、サイクルに付与された値、及び当該サイクルでのメルティングピーク高さの値を合わせて計算した。実験結果を、表３及び表４に要約した。
表３の各標準量に対する標準値は、標準反応から得た。３つの複製チューブから得られる最初のメルティングピークの高さのうち、最小値をサイクルに付与された値と合算し、相応する標準量に対する標準値を計算した。
標準値を用いて、試料の初期量を表４のように範囲レベルで測定した。実験結果は、各試料に対して測定された量の範囲が試料内の実際量をほぼ正確に含んでいることを示す。
ターゲット核酸が存在しない場合には、ピークが検出されていない。
このような結果は、最初のメルティングピークを利用するサイクリックメルティングカーブ分析がターゲット核酸配列の定量を可能にすることを示す。
本発明の望ましい具現例を詳しく記述したところ、本発明の原理による変形及び修正が可能であるということは、当業者に明らかであり、したがって、本発明の範囲は、添付の請求項とその均等物によって定義される。

Claims (5)

  1. 次の段階を含むメルティングピークカーブを用いて核酸試料内のターゲット核酸配列を定量する方法であって、：
    （ａ）一連の反応を繰り返すサイクルを通じて核酸試料内のターゲット核酸配列を増幅させて、標識を含む二量体を形成させる段階であって；前記二量体は、二本鎖形態の前記増幅されたターゲット核酸配列、前記ターゲット核酸配列とプローブとの間のハイブリダイゼーションによって形成された二量体、または前記ターゲット核酸配列の存在に依存的に形成された二量体を含み；前記二量体の形成は、前記ターゲット核酸配列の増幅に比例して増加し；前記標識は、前記二量体の結合または解離過程の間に検出可能なシグナルを発生させ；
    （ｂ）前記段階（ａ）の繰り返し過程の間に、前記二量体から検出可能なシグナルが検出される温度範囲でのメルティング分析を既定のサイクルで実施することによって、２−５つの既定のサイクルに対するメルティングピークカーブを得る段階であって；前記既定のサイクル間の間隔は少なくとも５サイクルであり；及び
    （ｃ）前記メルティングピークカーブを用いて、前記ターゲット核酸配列を定量する段階であって；前記段階（ｃ）が、下記（ｃ−１）、（ｃ−２）及び（ｃ−３）のいずれかの工程により行われ、：
    （ｃ−１）前記既定のサイクル別に基準数値を付与し、前記メルティングピークカーブが出た既定のサイクルの基準数値を合算することにより定量数値を計算して、初期ターゲット核酸配列の量を定量する工程であって、前記基準数値は、規定のサイクルに昇順または降順で付与されるか、または各サイクルに同じ数値の基準数値が付与される工程、
    （ｃ−２）前記既定のサイクル別に基準数値を付与し、最初のメルティングピークカーブが出た既定のサイクルの基準数値を用いて定量数値を計算して、初期ターゲット核酸配列の量を定量する工程であって、前記基準数値は、規定のサイクルに昇順または降順で付与され、ターゲット核酸配列の量が多くなるほど、より早いサイクルでメルティングピークカーブが得られる工程、
    （ｃ−３）既定のサイクル別に基準数値を付与し、（ｉ）前記最初のメルティングピークカーブが出た既定のサイクルの基準数値、及び（ｉｉ）最初のメルティングピークカーブの高さの最大値または最大面積値を用いて定量数値を計算して、初期ターゲット核酸配列の量を定量する工程であって、前記基準数値は、規定のサイクルに昇順または降順で付与され、ターゲット核酸配列の量が多くなるほど、より早いサイクルでメルティングピークカーブが得られ、最初のメルティングピークカーブが出た既定のサイクルから計算された前記定量数値の最小値が、前記既定のサイクル直後のサイクルで最初のメルティングピークカーブが出る場合に、計算された定量数値の最大値よりも大きいか、同じ数値である工程、
    前記ターゲット核酸配列の定量は、他の核酸試料または既知核酸濃度を有する対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）試料を前記段階（ａ）〜（ｃ）に適用して得た定量数値と比較することで実施される方法。
  2. 前記二量体の標識は、前記二量体のうち何れか一方の鎖に連結された単一標識、前記二量体のうち何れか一方の鎖にいずれも連結されたレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識、前記二量体の一方の鎖に連結されたレポーター分子及び他方の鎖に連結されたクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識、または前記二量体に挿入されるインターカレーティング染料であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記ターゲット核酸配列の増幅は、温度が変化する条件下で、増幅用プライマーと前記ターゲット核酸配列との間のハイブリダイゼーション、前記プライマーの延長及び延長鎖の解離を含む一連の反応を繰り返すことで達成され、前記サイクルは、前記一連の反応の１回繰り返しを１つの単位として有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 前記ターゲット核酸配列の増幅は、等温条件下に一連の反応を繰り返すことで達成され、前記サイクルは、一定時間間隔で実施される前記一連の反応の繰り返しを１つの単位として有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  5. 前記ターゲット核酸配列の増幅は、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＣＲ（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＧＬＣＲ（ｇａｐ ｆｉｌｌｉｎｇ ＬＣＲ）、Ｑ−ｂｅｔａ（Ｑ−ｂｅｔａ ｒｅｐｌｉｃａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＳＤＡ（ｓｔａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、３ＳＲ（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、またはＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
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