JP3814669B2 - 標的ポリヌクレオチドにハイブリッド形成するための新規な一工程方法とポリヌクレオチド化合物 - Google Patents
標的ポリヌクレオチドにハイブリッド形成するための新規な一工程方法とポリヌクレオチド化合物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3814669B2 JP3814669B2 JP2002019249A JP2002019249A JP3814669B2 JP 3814669 B2 JP3814669 B2 JP 3814669B2 JP 2002019249 A JP2002019249 A JP 2002019249A JP 2002019249 A JP2002019249 A JP 2002019249A JP 3814669 B2 JP3814669 B2 JP 3814669B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polynucleotide
- oligo
- modified
- complementary
- linker arm
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ポリヌクレオチド化合物と標的ポリヌクレオチドとからなるハイブリッドの形成方法、好適ポリヌクレオチド化合物およびその合成に関するものである。ポリヌクレオチド化合物はプローブとして或いは薬剤として使用することができる。
【０００２】
【発明の背景】
ポリヌクレオチドプローブとのハイブリッド化は、標的ポリペプチドの存在を証明するための周知方法である。ハイブリッド化は、相補的塩基対の形成に基づいている。一本鎖ポリヌクレオチドプローブを一本鎖標的ポリヌクレオチドと共に溶液中で培養すると、相補的塩基配列が対となって二重鎖ハイブリッド分子を形成する。二重鎖ハイブリッド分子は、化学的もしくは物理的手段によって一本鎖ポリヌクレオチドプローブから分離することができる。たとえば、Ｍ．グルンスタインおよびＪ．ワリス、メソッズ・イン・エンチモロジー、第６８巻、Ｒ．Ｗ．Ｕ（編）、第３７９〜４６９頁（１９７９）；Ａ．Ｒ．デュンおよびＪ．サムブルック、メソッズ・イン・エンチモロジー、第６５巻、第１部、第４６８〜４７８頁（１９８０）；Ｄ．Ｃ．ワード、Ａ．Ａ．ワルドロップおよびＰ．Ｒ．ランガー、「改変ヌクレオチド並びにその製造および使用方法」と題するヨーロッパ特許公開第0,063879号（１９８２年１１月３日公開）；Ａ．Ｊ．ベリーおよびＪ．Ｂ．ピーター、ダイアグノスチック・メジスン「感染病に対するＤＮＡプローブ」（１９８４年３月）、第１〜８頁；並びにウィー・シング・リーおよびジェームス Ｌ．ベニングトン、組換えＤＮＡ技術「臨床微生物における用途」、ラボラトリー・マネージメント（１９８５年４月）、第２１〜２６頁を参照することができる。
【０００３】
一般に、プローブはポリヌクレオチド部分とこのポリヌクレオチドに結合した信号成分部分とからなっている。プローブのポリヌクレオチド部分は塩基対を形成する能力、すなわち興味ある配列もしくは標的ポリヌクレオチドに対しハイブリッド化する能力を有する。プローブの信号成分部分は、ハイブリッド化ポリヌクレオチドプローブの存在を証明しうる手段を有し、またはこの手段を生ぜしめる。たとえばこの手段は蛍光、燐光、クロモゲン、放射能もしくは電子密度とすることができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ポリヌクレオチドプローブを用いて標的ポリヌクレオチドを検出する方法は、一般にたとえば先ず最初に標的配列を含む二重鎖ポリヌクレオチドを試料から単離することによって行われる。二重鎖ポリヌクレオチドを制限エンドヌクレアーゼ切断により小断片まで切断してこれら断片をゲル電気泳動によって分離し、その後これらをゲルから支持体（たとえばニトロセルロース紙）へ移すことができる。或いは、二重鎖ポリヌクレオチドを何ら事前の酵素切断なしにニトロセルロースへ直接に固定することもできる。固定したポリヌクレオチドをポリヌクレオチドプローブ含有の溶液と接触させ、かつ支持体を約８０〜９０℃まで加熱してポリヌクレオチド二重鎖を変性させる〔二重鎖はアルカリによって変性させることもできる〕。かくして標的ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドプローブとの両者を含有するようになった試料を適当な温度まで冷却させ、その間にポリヌクレオチドプローブと標的ポリヌクレオチドとの間でハイブリッド化が生ずる。ハイブリッド化を完結させるための充分な時間（１０分間から数時間とすることができる）が経過した後、固定した標的ポリヌクレオチドを洗浄して未結合のポリヌクレオチドプローブを全部除去する。ポリヌクレオチドプローブの信号成分部分が、次いで放射能もしくは蛍光により直接的に或いは酵素反応で生成したクロモゲンによって間接的に検出される。
【０００５】
この方法の欠点は、標的ポリヌクレオチドの存在を証明するのに数工程を必要とすることである。すなわち、支持体に対する標的ポリヌクレオチドの固定と、ポリヌクレオチドプローブに対する標的ポリヌクレオチドの接触と、支持体からの未ハイブリッド化ポリヌクレオチド全体の除去とを必要とする。
【０００６】
最近、均質（すなわち１工程）の核酸ハイブリッド化分析により標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法が報告された。この方法は、第一および第二の両者とも感光性標識を含有する一本鎖ポリヌクレオチドを試料からの相補的一本鎖ポリヌクレオチド標的とハイブリッド化させて、これら第一および第二ポリヌクレオチドの感光性標識間で非放射性エネルギー移動を生ぜしめることからなっている。感光性標識の少なくとも一方は吸光／発光型であって、他方の感光性標識から吸収されたエネルギーを異なる波長で再放出する。これらの二次的発光は、第一および第二の一本鎖ポリヌクレオチドの両者が標的ポリヌクレオチドに対しハイブリッド化した場合にのみ生じうる。試料中の標的ポリヌクレオチドの量は、二次的発光量に関係する〔ミッシェル・ジェームス・ヘラーによる１９８３年１月２６日公開のヨーロッパ特許公開第0,070,685 号参照〕。
【０００７】
この方法の欠点は、２種の別個のポリヌクレオチドプローブを用いて標的ポリヌクレオチドの存在を検出する必要があることである。さらに、この方法は、化学発光触媒と、吸光／発光成分と、化学発光触媒の存在下で発光を生ぜしめるのに有効な化学発光試薬との存在を必要とする。さらに、感光性標識が末端ヌクレオチドの糖成分に結合されるため、ポリヌクレオチドプローブ１個当り標識を１個しか結合させ得ない。また、嵩張った標識は、これら標識に隣接した相補的塩基のハイブリッド化を妨げる。
【０００８】
最近、標的ポリヌクレオチドをプローブポリヌクレオチドにハイブリッド化させかつ得られたハイブリッドをこれらハイブリッドに結合するよう選択された固定化もしくは固定化しうる形態の抗体に対する結合によって固定化させるという方法が報告されている。その一具体例は、挿入デュプレックス用に選択した抗体の使用である。しかしながら、この方法は均質分析でない。さらに、挿入剤は標的に対するプローブのハイブリッド化に際し直接的には信号を発生しない。さらに挿入剤は、塩基対の形成に必要とされる位置におけるリンカアームなしに塩基へ直接に結合する〔Ｊ．Ｐ．アルバレラ等、１９８５年６月２６日公開のヨーロッパ特許出願第146,039 号参照〕。
【０００９】
ポリヌクレオチドに結合した蛍光性挿入成分が文献中に報告されている。これらは、たとえばクロルアセトアルデヒドのような二官能性試薬とアデニンもしくはシトシンとを反応させて芳香族三環式化合物を生成させることにより製造される〔Ｊ．Ｒ．バリオ、Ｊ．Ａ．セクリストIII およびＮ．Ｊ．レオナード、「蛍光性アデノシンおよびシチジン誘導体」（１９７２）、Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｓ．、第４６（２）巻、第５９７〜６０４頁、並びにＣ．Ｈ．リーおよびＪ．Ｇ．ウェトムア、「クロルアセトアルデヒド標識した蛍光性ＤＮＡの物理的研究」（１９７３）、Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｓ．第５０（３）巻、第８７９〜８８５頁参照〕。この方法は、蛍光成分に変化した塩基が塩基対を形成せず、したがって、この種の蛍光成分がハイブリッド化工程を不安定化させるという欠点を有する。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
標的ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド化合物とからなるハイブリッドの形成方法につき、好適ポリヌクレオチド化合物と共にここに開示する。これらのポリヌクレオチド化合物は、一本鎖もしくは二重鎖標的ポリヌクレオチドの存在を均質、すなわち１工程の分析で検出するため、或いは同質ポリヌクレオチドを標的二重鎖ポリヌクレオチドから競合的に排除させたりまたは標的一本鎖ポリヌクレオチドに対し安定結合させて標的ポリヌクレオチドの転写もしくは複製を防止するために使用することができる。
【００１１】
ポリヌクレオチド化合物は、ポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに対しリンカアームによって結合された少なくとも２種の成分とからなっている。このポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに対し塩基対を形成しまたはハイブリッド化することができる。標的ポリヌクレオチドに対しプローブのポリヌクレオチド部分がハイブリッド化すると、ポリヌクレオチド化合物もしくは標的ポリヌクレオチドまたはその両者における少なくとも１つの性質に変化が生じ、この変化が信号を構成する。変化する性質がポリヌクレオチド化合物の性質である場合、これはポリヌクレオチドの性質またはその成分の性質のいずれであってもよい。
【００１２】
ポリヌクレオチド化合物を使用して性質の変化により標的ポリヌクレオチドの存在を検出する場合には、ポリヌクレオチド化合物はポリヌクレオチドプローブとして作用する。ポリヌクレオチド化合物を使用して同質ポリヌクレオチドを二重鎖標的ポリヌクレオチドから排除させたり或いは一本鎖標的ポリヌクレオチドに対し安定結合させたりする場合には、ポリヌクレオチド化合物はポリヌクレオチド薬剤として作用する。
【００１３】
好適ポリヌクレオチド化合物は、構造式
【化２】
〔式中、Ｂはピリミジン、プリンおよびデアザプリンよりなる群から選択される塩基を示し、ただしＢがピリミジンである場合は糖がピリミジンのＮ1 −位置に結合し、またＢが、プリンもしくはデアザプリンであれば糖はプリンもしくはデアザプリンのＮ9 −位置に結合し、「Ｐｈｅｎ」は任意のフェナンスリジン成分を示し、Ｌ．Ａ．は少なくとも３個の炭素原子を含むリンカアームであって前記フェナンスリジン成分の５−位置に結合し、ＺはＨもしくはＯ−のいずれかである〕を有する少なくとも１種の成分からなっている。
【００１４】
本発明の目的は均質分析により標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法を提供することであり、この分析法はポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合した少なくとも２種の成分とからなるポリヌクレオチドプローブを使用し、標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドのハイブリッド化自身に際しポリヌクレオチド化合物もしくは標的ポリヌクレオチドまたはその両者における少なくとも１つの性質に変化が生じ、この変化が信号を構成するものである。
【００１５】
本発明の他の目的は、二重鎖ポリヌクレオチドから同質ポリヌクレオチドを排除するためにポリヌクレオチド化合物を使用することによる標的ポリヌクレオチド野天社の防止方法を提供することであり、ポリヌクレオチド化合物はポリヌクレオチドと少なくとも２種の成分とからなり、これら成分はポリヌクレオチド化合物におけるポリヌクレオチド部分と標的ポリヌクレオチドとの結合を高めて、この結合が同質の排除されるポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとの結合力よりも大となるようにし、かくして標的ポリヌクレオチドの転写もしくは翻訳を防止する。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、ポリヌクレオチド化合物と標的ポリヌクレオチドとからなるハイブリッドを形成することによる標的ポリヌクレオチドの転写もしくは翻訳の防止方法を提供することであり、ポリヌクレオチド化合物はポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合された少なくとも２種の成分とからなり、これら成分はハイブリッドの安定性を高めてポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分が他の同質ポリヌクレオチドにより容易には排除され得ないようにし、かくして標的ポリヌクレオチドの転写もしくは翻訳を防止する。
【００１７】
さらに本発明の他の目的は、ポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合した少なくとも２種の放射線放出成分とからなるポリヌクレオチドプローブを使用する均質分析により標的ポリヌクレオチドの存在を均質分析で検出する方法を提供することであり、これら成分の放出エネルギーは標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分のハイブリッド化に際して変化し、この放射線エネルギーの変化が信号となる。
【００１８】
本発明のさらに他の目的は、ポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合した少なくとも２種の放射線放出成分とからなるポリヌクレオチドプローブを使用する均質分析により標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法を提供することであり、これら成分の放出エネルギーはポリヌクレオチドハイブリッド中への成分の挿入に際して変化し、これら放射線放出成分は標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分のハイブリッド化によって生成したハイブリッド中へのみ実質的に挿入され、放射線エネルギーの変化が信号となる。
【００１９】
本発明の他の目的は、ポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合した少なくとも２種の蛍光放出成分とからなるポリヌクレオチドプローブを使用する均質分析により標的ポリヌクレオチドの存在を均質分析で検出する方法を提供することであり、これら成分の放出蛍光エネルギーはポリヌクレオチドハイブリッド中へのこれら成分の挿入に際して変化し、これら蛍光放出成分は標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分のハイブリッド化により生成されたハイブリッド中へのみ実質的に挿入され、放射蛍光エネルギーの変化が信号となる。
【００２０】
さらに本発明の他の目的は、ポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合した少なくとも２種の蛍光放出成分とからなるポリヌクレオチド化合物を提供することであり、蛍光放出成分はポリヌクレオチドハイブリッド中への挿入に際して蛍光放出エネルギーの変化を示し、蛍光放出成分は標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド化合物のポリヌクレオチド部分のハイブリッド化によって生成されたハイブリッド中へのみ実質的に挿入される。
【００２１】
Ａ．ポリヌクレオチド化合物の一般的説明
本発明はポリヌクレオチド化合物の使用につき開示する。このポリヌクレオチド化合物は、ポリヌクレオチド部分とこのポリヌクレオチドに結合した少なくとも２種の成分部分とからなっている。これら成分は、他の約１０個のヌクレオチド成分よりなる部分によって互いに分離されたヌクレオチド成分に結合せねばならない。これは、ポリヌクレオチド部分に対し標的特異性を付与する。成分部分は、標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド化合物のポリヌクレオチド部分のハイブリッド化に際しポリヌクレオチド化合物または標的ポリヌクレオチドのいずれかにおける性質変化を生ぜしめうる特徴を有する。ポリヌクレオチド化合物における性質変化は、ポリヌクレオチド部分に生じても成分部分に生じてもよい。
【００２２】
この性質変化は２つの方法で利用することができる。１つの方法は、この性質変化を監視して標的ポリヌクレオチドの存在を検出するものである。この場合、ポリヌクレオチド化合物はポリヌクレオチドプローブとして使用される。第二の方法は、この性質変化を利用してポリヌクレオチド化合物のポリヌクレオチド部分に同質性であるポリヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドから排除させたり、或いはポリヌクレオチド化合物のポリヌクレオチド部分を標的ポリヌクレオチドへ安定結合させたりするものである。この場合、ポリヌクレオチド化合物はポリヌクレオチド薬剤として使用される。
【００２３】
Ｂ．ポリヌクレオチドプローブの説明
１．一般的説明
本発明は、ポリヌクレオチド化合物をポリヌクレオチドプローブとして使用することにより標的ポリヌクレオチドの存在を均質もしくは１工程の分析で検出することを可能にする。ポリヌクレオチドプローブは、ポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合した少なくとも２種の成分とからなっている。この成分は、標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分のハイブリッド化に際し、ポリヌクレオチドプローブもしくは標的ポリヌクレオチドまたはその両者のいずれかにおける検出自在な変化を生ぜしめうる特徴を有する。ポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分と標的ポリヌクレオチドとの間のハイブリッド化が実際に生じなければ、性質変化も発生しない。すなわち、これらの成分は１工程での標的ポリヌクレオチドの検出を可能にする。試料から未結合ポリヌクレオチドプローブを除去する追加工程は、標的ポリヌクレオチドの存在につき証明する前に、必要とされない。
【００２４】
たとえば成分の特徴は、ポリヌクレオチドプローブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッドに関し所定の配向もしくは配置を取りうる能力とすることができる。性質変化はたとえば放射線放出、分子分散力の相互作用または浮力密度とすることができる。放射線放出の変化は成分の可視、紫外、赤外、蛍光、燐光、Ｘ線もしくはγ線スペクトルにおける変化を包含する。分子分散力の相互作用における変化は、ポリヌクレオチドプローブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッドの溶融温度変化を包含する。
【００２５】
成分は任意の長さ、寸法および形状とすることができる。これは、特定の特徴を付与するのに必要でないアルキルもしくは芳香族断片を結合することができる。好ましくは、この成分はリンカアームを含むヌクレオチドがポリヌクレオチド中に組込まれた後にリンカアームに結合される。すなわち、この成分は所望の塩基配列が形成された後に結合される。何故なら、この成分は一般に嵩高分子であって、ヌクレオチドをポリメラーゼ酵素に対し貧弱な基質にするからである。さらに、この成分はポリメラーゼ酵素の阻止剤にもなりうる。
【００２６】
２．一成分の説明
上記要件を満たす１種の成分は挿入剤（intercalating agent ）である。挿入剤は、二重鎖ポリヌクレオチドの存在下で二重鎖中の２個の隣接塩基対の間に位置してこれら二重鎖の塩基対と相互作用しうる物質である。ハイブリッドはＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡとすることができる。挿入剤の特徴は、ポリヌクレオチドハイブリッド中へ侵入しうる能力である。
【００２７】
一般に、挿入剤は芳香族染料である。これらの挿入用芳香族染料は面状環構造を有しかつ明確な蛍光放出スペクトルを有する。蛍光は挿入剤の電子デローカリゼーションを示し、染料に結合した置換基の誘発作用と停止剤とによって影響される。
【００２８】
芳香族染料を水溶液もしくは水性／有機溶液に溶解させると、この溶液中の水は染料が有機媒体中に存在する場合よりも高いレベルまで芳香族染料の基礎エネルギー状態を高めることにより溶解芳香族染料の蛍光性を顕著に停止させると思われる。芳香族染料がポリヌクレオチドハイブリッド中に侵入すると、染料は水から遮閉される。何故なら、ハイブリッドは比較的疎水性の内部（塩基）と親水性の外部（燐酸）とを有するからである。かくして、水はハイブリッドの外部で凝集し、内部では凝集しない。挿入染料の蛍光放出はもはや水によって停止されないので、基礎エネルギー状態が低エネルギーレベルまで変化し、その結果最大蛍光放出は長波長へ移動する。挿入の際の染料の蛍光強度は何倍にも高められる。蛍光放出およびその強度におけるこの変化は、したがって標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分のハイブリッド化に際してのみ成分に生ずる性質変化である。
【００２９】
ポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合した少なくとも１種の挿入芳香族染料とからなる一本鎖ポリヌクレオチドプローブは、かくして標的ポリヌクレオチドの均質もしくは１工程の検出を可能にする。標的ポリヌクレオチドに対しこのポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分がハイブリッド化してプローブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成する際、芳香族染料は積層塩基対の間に形成されたプローブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッドの溝部に侵入する。この侵入は、挿入剤の蛍光放出性およびその強度における変化をもたらす。ポリヌクレオチドプローブにおけるポリヌクレオチド部分が試料中の標的ポリヌクレオチドに対し実際にハイブリッド化した場合にのみ蛍光におけるこの変化が生ずるので、未結合のポリヌクレオチドプローブを試料から除去するための追加工程は必要とされない。かくして、試料の蛍光スペクトルを簡便に測定することにより、ハイブリッド化が生じたかどうかを決定しかつ標的ポリヌクレオチドの存在を検出することができる。ポリヌクレオチドハイブリッド中に侵入してこの侵入に際し蛍光放出の変化を受け得る任意の蛍光性芳香族染料が本発明に適している。適する芳香族染料の例は、限定はしないがフェナンスリジン、アクリジンおよびアンスラサイリンを包含する。フェナンスリジンの例は、限定はしないがエチジウム、プロピジウム、ブチジウム、ペルチジウム、ジミジウムおよびフェニジウムを包含する。
【００３０】
３．ポリヌクレオチドの説明
ポリヌクレオチドプローブにおけるポリヌクレオチド部分は、プローブに対し特異性を付与する少なくとも約１２個の塩基で構成すべきである。標的ポリヌクレオチドに対し実質的に相補的であるポリヌクレオチドの作成方法は当業界で周知されている。最も一般的に使用されている方法は組換えＤＮＡおよびクローン化技術である。広く使用されるクローンの１種はＭ１３ファージである。要するに、この方法は（１）Ｍ１３ＲＦ（複製型）ＤＮＡをクローン化領域に独特の識別部位を有する制限酵素の１種で切断し、（２）所望のポリヌクレオチドを切断挿入部位に結合させ、（３）イー・コリ宿主細胞を形質転換させ、（４）これら宿主細胞を栄養分含有プレートで増殖させると共に無色プラークを選択し、（５）単一のプラークからのファージを小培養で増大させ、（６）培養上澄駅からファージを収穫すると共にフェノールでの処理により蛋白コートを除去し、かつ（７）精製ＤＮＡをエタノールで沈澱させることからなっている。より詳細にはアメルシャム・コーポレーション社により出版された「Ｍ１３クローン化および配列決定ハンドブック」（１９８３）並びにコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリース社により出版されたＴ．マニアチス、Ｅ．Ｆ．フリッチおよびＪ．サムブルックによる「モレキュラクローニング」（１９８２）を参照することができる。
【００３１】
さらに特異性ポリヌクレオチドは、たとえばアプライド・バイオシステムス社（８５０リンカン・センター・ドライブ、フォスターシティー、カリホルニヤ９４４０４在）により製作されるようなＤＮＡ合成装置により適当なヌクレオチド先駆体を用いて製造することもできる。製造業者によれば、特異性の大きい約１２０〜２００塩基よりなるポリヌクレオチドを製造することができる。合成方式は、ホウホルアミダイトを使用して所定の塩基を結合させることを含んでいる。ポリヌクレオチド合成装置の他の製造業者には、バイオサーチ・インコーポレーション社（２９８０ケルナー・ブールバード、サン・ラファエル、カリホルニヤ９４９０１在）およびベックマン・インスツルメント社（１０５０ページ・ミル・ロード、パロ・アルト、カルホルニヤ９４３０４在）がある。
【００３２】
末端位置にリンカアームもしくは成分を含むポリヌクレオチドは、酵素ＲＮＡリガーゼおよびリンカアームもしくは成分がＣもしくはＵに結合されている化合物ｐＣｐもしくはｐＵｐを用いて製造することもできる。これらポリヌクレオチドはニックトランスレーションにより生成させることはできない。何故なら、本発明においてポリヌクレオチドプローブは一本鎖でなければならないからである。
【００３３】
４．ポリヌクレオチドプローブの形態
これら成分は、ポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分が標的ポリヌクレオチドとハイブリッド化した場合にのみ性質変化を生じうるものでなければならない。これら成分は、ハイブリッドストランドの一方がポリヌクレオチド標的のストランドでないようなハイブリッドでは性質変化を生じてはならない。さらに、ポリヌクレオチドプローブにおけるポリヌクレオチド部分がハイブリッド化する標的ポリヌクレオチドは、試料から生ずるものでなければならない。すなわち、ポリヌクレオチドプローブは、標的ポリヌクレオチドが一本鎖型でのみ存在する試料に供給せねばならない。ポリヌクレオチドプローブが二重鎖ハイブリッドとして試料に供給されかつ次いで試料中で変性されると、このポリヌクレオチドプローブが最初からハイブリッド化しているポリヌクレオチドに対しハイブリッド化する際に性質変化を生ずる。これは、間違った結果をもたらすであろう。
【００３４】
ポリヌクレオチドプローブは、一体的ストランドであることが好ましい。すなわち、成分もしくはポリヌクレオチドの性質変化は、二本のストランドのみがハイブリッド化する際に成分によって生ぜねばならない。これは、１個のみのポリヌクレオチドプローブ分子による標的ポリヌクレオチドの検出を可能にする。しかしながら、ポリヌクレオチドプローブが２本の異なるポリヌクレオチドストランドからなる場合もある。たとえば、これは各ポリヌクレオチドストランドが異なる成分を含有しかつ２本のポリヌクレオチドストランドが標的ポリヌクレオチドにおける重なりのない隣接配列にハイブリッド化する場合である。各ストランドの成分は性質変化を生じえないが、これら成分全部が一緒になってハイブリッド化に際し性質変化を生ぜしめる。このような状態も本発明に包含される。
【００３５】
５．リンカアームの説明
成分は、この成分とポリヌクレオチドとの間に最小の立体干渉が生ずるようにかつ成分が自由に移動してポリヌクレオチドプローブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッドに関し適切な配向もしくは配列を達成しうるように、リンカアームによってポリヌクレオチドに結合される。このリンカアームは、ポリヌクレオチド部分に対し成分部分を結合させるポリヌクレオチドプローブにおける断片を意味する。成分における特徴の存在に対し必須でない或いは天然ヌクレオチドの１部でないこの断片における全ての原子が、リンカアームの１部である。
【００３６】
リンカアームおよび／または成分は、標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのハイブリッド化を実質的に妨げてはならない。したがって、リンカアームおよび／または成分は、（ａ）これが結合している塩基が相補的塩基に対し対を形成するのを妨げてはならず、（ｂ）相補的塩基の錯体化を妨げて標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのハイブリッド化を妨げてはならず、（ｃ）ポリヌクレオチド配列の末端位置でなければストランド延長を妨げてはならず、かつ（ｄ）好ましくはポリヌクレオチドにおける糖成分の構成を変化させてはならない。
【００３７】
リンカアームは一般にポリヌクレオチドに対し共有結合される。この結合は、好ましくは塩基成分に対して行なわれるが、糖部分または燐酸部分に対して行なわれてもよい。塩基部分はプリンもしくはピリミジンのいずれかとすることができる。上記したように、塩基部分に対するリンカアームの結合は、好ましくはリンカアームが塩基のワトソン−クリック対形成を妨げないような位置とすべきである。適する位置は、たとえばウラシルの位置５および６、シトシンの位置５および６並びに環外４−アミノ、デアザプリンの位置７および８、グアニンの位置８、並びにアデニンの位置８および環外６−アミノである。これらの位置に置換基を有する塩基は、したがってこれらの位置に対するリンカアームの結合には好適でない。塩基部分に対する結合に好適なリンカアームはアリルアミンである〔デビット・ワード等による１９８２年１１月３日公開のヨーロッパ特許公開第0,063,879 号参照、これを参考のためにここに引用する〕。
【００３８】
塩基に対する好適位置はピリミジンの位置５および６、並びにデアザプリンの位置７である。何故なら、８−プリンヌクレオチドはポリメラーゼ酵素に対し貧弱な基質であり、かつアデニンもしくはシトシンの環外アミノ基がチミンおよびウラシルに対し或いはグアニンに対しそれぞれ塩基対の形成に関与するからである。塩基の環外アミノ基における置換基はこの塩基がその相補的塩基に対し対形成するのを妨げないが、この置換基はこれら２種の塩基間における最適な配向を変化させる。好適ピリミジンはウラシルおよびシトシンであり、好適位置は５である。好適プリンはデアザアデニンおよびデアザグアニンである。
【００３９】
リンカアームを塩基部分に結合させるのに使用しうる条件には殆んど制約がない。すなわち、塩基に対する官能基が、この塩基をその相補的塩基に対する対形成から妨げられない程度まで改変されない限りかつ塩基部分が糖成分から切断されない限り、任意のｐＨ範囲、温度範囲、反応時間、溶剤または緩衝液を使用することができる。最適条件はリンカアームおよび塩基の種類に依存し、かつ当業者により容易に決定することができる。
【００４０】
塩基に結合されたリンカアームは、塩基と成分とに結合された原子群を含む。リンカアームは、幾つかの方法により塩基部分に結合させることができ、塩基に結合させうる手段となる第１官能基を持たねばならない。さらにリンカアームは、成分に結合させうる手段となる第２官能基を持たねばならない。このリンカアームは炭素−炭素単一結合、炭素−炭素二重結合、炭素−窒素単一結合、炭素−窒素二重結合、炭素−炭素三重結合、炭素−酸素単一結合、炭素−硫黄単一結合または炭素−珪素単一結合によって塩基もしくは成分に結合することができる。適する官能基は、限定はしないがカルボン酸エステル、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸チオエステル、イミド、イミン、ケトン、アルデヒド、エポキシド、ハロゲン化物、ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミデート、無水物、イソシアネート、イソチオシアネートおよびチオエステルを包含する。
【００４１】
塩基部分に結合されたリンカアームは塩基に対しα位置にオレフィン性結合を含むのが好適である。この種のαオレフィン性結合の存在はリンカアームを塩基から立体的に離間保持する作用を果たし、したがってハイブリッド化工程に対するリンカアームの干渉および／または成分の干渉を最小化させる。
【００４２】
リンカアームは、１断片として塩基に結合する必要はない。リンカアームは、第１断片を塩基に結合させ、次いで第２断片を第１断片に結合させて作成することができる。適する第１断片の例は、
【００４３】
【化３】
である。適する第２断片の例は、
【００４４】
【化４】
である。
【００４５】
リンカアームを塩基に結合させる一般的方法はＪ．Ｌ．ルスおよびＤ．Ｅ．ベルクシュトローム、ジャーナル・オーガニック・ケミストリー、第４３巻、第２８７０頁（１９７８）；Ｄ．Ｅ．ベルクシュトロームおよびＭ．Ｋ．オガワ、ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティー、第１００巻、第８１０６頁（１９７８）；並びにＣ．Ｆ．ビゲ、Ｐ．カラリチス、Ｊ．Ｒ．デックおよびＭ．Ｐ．メルテス、ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティー、第１０２巻、第２０３３頁（１９８０）に記載されている。１つの好適方法は、デビッドＣ．ワード等による１９８２年１１月３日公開のヨーロッパ特許出願第0,063,879 号明細書に詳細に開示されており、これを参考のためにここに引用する。この方法は、αビニル基を有するリンカアームまたはリンカアーム断片をＫ2 ＰｄＣｌ4 の存在下で水銀化塩基と反応させることからなり、水銀はＨｇ+ としてリンカアームと反応させるべき塩基の位置に結合する。この過程を下記に示す。
【００４６】
【化５】
【００４７】
リンカアームについては、特定の寸法または含有量の制限がない。リンカアームは、芳香族染料をポリヌクレオチドプローブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッド中に挿入させうるが芳香族染料を他のストランド中へは挿入させない限り、約２個乃至任意の個数の炭素を含むことができる。リンカアームは、異原子および不飽和を有することもできる。リンカアームは脂肪族、脂環式もしくは芳香族部分を含むことができる。リンカアームの実際の寸法もしくは含有量は、選択する成分並びに標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分のハイブリッド化に際し性質変化を生ぜしめる方法に依存する。
【００４８】
ポリヌクレオチド配列の糖部分に対するリンカアームの結合は所定の塩基におけるプリン除去もしくはピリミジン除去に従う１’アルデヒドに対するシッフ塩基の手段とすることができ、或いは糖がリボースである場合には２’ヒドロキシに対する手段とすることもできる。１’アルデヒドに対し結合するリンカアームはたとえばアミン、ヒドラジンもしくはヒドラジド官能性とすることができる。この種の方法は、ジャニス・スタブリアノプロスによる１９８５年８月１３日出願の本出願人による米国特許出願第06/765,288 号明細書に開示されており、これを参考のためにここに引用する。燐酸部分に対するリンカアームの結合は、燐酸部分のアルキル化によって行うことができる。〔Ｐ．Ｏ．ＰツオおよびＰ．Ｓ．ミラーによる米国特許第4,469,863 号を参照することができ、これを参考のためにここに引用する〕。
【００４９】
リンカアームが塩基部分に結合される場合、好ましくはこれをヌクレオシドもしくはヌクレオチドレベルで塩基に結合させる。何故なら、リンカアームを塩基に結合させるのに必要とされる反応条件は、ポリヌクレオチドに対し望ましくない副反応を生ぜしめるからである。さらに、ポリヌクレオチドレベルにおける結合は、一定でなくかつ再現性のない収率を与える。ヌクレオシドもしくはヌクレオチドレベルにおける結合は、改変ヌクレオシドもしくはヌクレオチドを最初に精製しかつ次いでポリヌクレオチド中へ組込むことを可能にする。この組込みは、たとえばＭ１３ベクターにおけるクローン化によって、或いは上記ポリヌクレオチド合成装置での合成によって行うことができる。
【００５０】
さらに、改変ヌクレオチドは一般に検討されている核酸ポリメラーゼに対し比較的効率的な基質となることが好ましい。何故なら、改変ヌクレオチドをポリヌクレオチド中へ組込む最も効率的な方法は核酸ポリメラーゼによるものであるからである。すなわち、リンカアームは酵素の活性部位を立体的に妨げてはならず、或いは改変ヌクレオチドの相補的塩基対形成を妨げてはならない。通常の「アンチ」ヌクレオシド構成を変化させる位置における置換も回避すべきである。何故なら、このような構成変化は一般に改変ヌクレオチドをポリメラーゼ酵素に対し貧弱な基質にするからである。
【００５１】
リンカアームが糖の１’アルデヒドに結合される場合、このリンカアームはポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分が生成された後に結合されねばならない。何故なら、糖の結合は、この糖の１−位置に遊離アルデヒドを必要とするからである。遊離アルデヒドは、プリン除去またはピリミジン除去によって生成される。塩基を含まない糖と燐酸とからなる部分はポリメラーゼ酵素に対する基質とならない。すなわち、リンカアームは、先ず最初に所望のポリヌクレオチド配列を選択的にプリン除去しもしくはピリミジン除去し、次いでアルデヒドによってリンカアームを糖に結合させることにより結合させねばならない。リンカアームが糖リボースの２’ヒドロキシに結合される場合、このリンカアームはヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドレベルで結合することができる。何故なら、改変ヌクレオチドは遺伝子合成装置によってポリヌクレオチド中へ組込みうるからである。リンカアームが燐酸に結合される場合、このリンカアームは結合が燐酸以外の位置で生じないようヌクレオシドもしくはヌクレオチドレベルで結合せねばならない。
【００５２】
６．成分の結合
成分は、たとえば任意の上記官能基によってリンカアームに共有結合することができる。１例は、成分におけるアミノ、チオもしくはオキソ基とリンカアームにおける他の官能基、たとえばイソチオシアネート、エポキシド、カルボジイミド、無水カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸塩化物、カルボン酸、チオエステル、イミン、ハロゲン、ケトンもしくはアルデヒドとの反応である。
【００５３】
さらに成分は、たとえばリンカアームおよび成分に結合したキレート生成剤によってリンカアームへ非共有結合させることもできる。配位金属は、成分とリンカアームとを挟持して錯体を形成することができる。好適キレート生成剤は、限定はしないがエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン−ペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）およびトランス−ジアミノシクロヘキサン−テトラ酢酸（ＤＣＴＡ）を包含する。好適金属は各種の遷移金属、特にランタニド金属を包含する。リンカアームに対する芳香族染料の非共有結合は、この分析が標的ポリヌクレオチドを包含する試料に対するポリヌクレオチドプローブの添加後に多くの工程を含まない１工程で行なわれるため、共有結合ほど安定でも強固でもないが、静電吸引力が性質変化を生ぜしめるのに充分な結合教祖を与えるであろう。これは、成分が芳香族染料でありかつ性質変化には挿入工程のみが必要とされる場合である。ここで、形成されたポリヌクレオチドプローブ／標的ハイブリッド中への芳香族染料の挿入は蛍光放出における変化をもたらして、標的ポリヌクレオチドの存在を証明することができる。
【００５４】
種々異なる条件を用いて挿入芳香族染料成分をリンカアームに結合させることができる。一般に、約４〜約１０、好ましくは約５〜約８のｐＨ範囲、約２０〜約１００℃、好ましくは約４０〜約６５℃の温度、任意の溶剤および任意の緩衝剤もしくは触媒を使用することができ、ただしｐＨ、温度、溶剤もしくは緩衝剤はポリヌクレオチドの全ての基もしくは成分を変化させないものとする。たとえば、ポリヌクレオチドをプリン除去しもしくは脱アミノしうるような試薬もしくは条件は避けるべきである。さらに反応時間についても殆んど制限がない。リンカアームに芳香族染料を結合させるための最適ｐＨ、温度、溶剤もしくは反応時間は、反応させるべきリンカアームと芳香族染料と官能性とに依存する。これらの条件は、当業者により容易に決定することができる。
【００５５】
大抵の挿入用芳香族蛍光染料は、水に対し可溶性でなく、したがってポリヌクレオチドのリンカアームに対する芳香族染料の結合はたとえば水とエタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、プロパノール、選択エーテル、エステル、ケトン、アミド、グリセリン、アセトン、ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドまたはヘキサメチルホスホルアミドとの混合物のような混和性の混成溶剤系を必要とする。或いは、芳香族染料が有機溶剤に溶解しかつポリヌクレオチドが水性溶媒に溶解するような不混和性の二相溶剤系を使用することもできる。この場合、２種の溶剤系を絶えず混合して、ポリヌクレオチドを芳香族染料と反応しうるように接触させねばならない。反応の後、ポリヌクレオチドプローブは、一般に水溶液に存在する一方、芳香族染料は有機溶液中に残留する。
【００５６】
これら反応に必要とされる反応体の化学量論量は、大幅に変化することができる。一般に、より容易に製造される成分の過剰量を、ポリヌクレオチドに対する芳香族染料の結合に使用する。実用上、これらの量は必要とされる反応条件、芳香族染料、リンカアームおよびその反応性官能基に応じて変化する。
【００５７】
一般に、挿入芳香族染料は、リンカアームを含有するヌクレオチドがポリヌクレオチド中に組込まれた後にリンカアームに結合させねばならない。何故なら、大抵の挿入芳香族染料はポリヌクレオチド合成を阻害し、したがって芳香族挿入剤が結合しているヌクレオチドがポリヌクレオチド中へ組込まれるのを妨げるからである。
【００５８】
７．成分の個数
ポリヌクレオチドプローブは２個の成分または３個以上の成分で構成することができる。これら成分は、ポリヌクレオチドプローブの末端位置または非末端位置に結合することができる。これら成分は、約１０個のヌクレオチドよりなる部分によって互いに分離されたヌクレオチドに結合して、プローブに対し特異性を付与せねばならない。成分の個数が多い程、ポリヌクレオチドプローブの感受性が大となる。しかしながら、これら成分は、標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブにおけるポリヌクレオチド部分の有効ハイブリッド化が実質的に妨げられるような個数で存在させてはならない。結合させうる成分の個数は、成分がポリヌクレオチドに結合される部分およびポリヌクレオチドの長さに依存する。
【００５９】
特定の塩基部分に結合する成分は、ポリヌクレオチドプローブ中に存在する塩基部分の個数以下に制限される。糖部分に結合される成分は、標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのハイブリッド化を妨げないような個数制限される。何故なら、この場合、各成分は塩基対の形成に使用されるプローブポリヌクレオチドにおける塩基の個数を減少させるからである。燐酸部分に結合される成分は、糖部分および塩基部分の配列を乱さないような個数に制限される。ヌクレオチド４個当り１個以下の成分をポリヌクレオチドプローブに結合されるのが好ましい。
【００６０】
成分が挿入剤である場合、リンカアームは挿入剤に対し自由な移動を付与するのに充分な長さとしかつ充分な融通性を持たねばならず、内方向に折れ曲がりかつ形成されたポリヌクレオチドプローブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッド中に侵入しうるようにする。塩基の１つの位置に結合するのに適したリンカアームは、同じ塩基の他の位置もしくは他の塩基の任意の位置に結合するには適せず、或いは糖もしくは燐酸における位置に結合するには適さないと理解される。たとえば、ヌクレオチドの好適配列は、「アンチ」配列であるため、たとえば燐酸基に結合される成分はたとえばウリジンの５−位置に結合されるものよりも長いリンカアームを必要とする。同様に、２個の環で構成されたプリンに結合されるリンカアームは、１個のみの環で構成されたピリミジンに結合されるリンカアームよりも長いリンカアームを必要とする。
【００６１】
８．挿入剤における性質変化の検出
芳香族染料である挿入剤は、一般に「成分の説明」の項目で上記したように、その蛍光放出の変化によって検出することができる。しかしながら、挿入剤は標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分のハイブリッド化に際し二重鎖もしくはデュプレックスのＴM （すなわち溶融温度）の変化を生ぜしめるので、これら挿入剤の蛍光特性を利用する必要はない。溶融温度とは、ポリヌクレオチド二重鎖が変性される温度を意味する。変性は対形成した塩基間の水素結合の破壊を必要とし、かつ変性温度はＧ−Ｃ結合がＡ−Ｔ結合よりも強固であるためストランドの塩基含有量に依存する。
【００６２】
二重鎖における挿入剤の存在はここのストランド間の相互作用を増強する結果、ストランドを変性させるのに要する温度が著しく高くなる。溶融温度を上昇させる程度は、特定の挿入剤の種類およびその量に依存する。たとえば、１０個の塩基対当り１種のフェナンスリジン挿入剤を含むポリＡ．ポリＴのポリヌクレオチドハイブリッドは、このハイブリッドの溶融温度を約２５℃上昇させることが実験的に判明した。
【００６３】
したがって、成分が非蛍光性挿入剤であるようなポリヌクレオチドプローブを使用することができる。標的ポリヌクレオチドを含む試料をポリヌクレオチドプローブと混合し、かつ充分な反応時間後にポリヌクレオチドを沈澱させることができる。次いで、沈澱物を溶液中に溶解させ、この溶液を加熱しかつＵＶ吸収（高色素性）の増加が生ずるような温度を監視することができる。この温度は、ＴM を示す。試料を加熱した際に一方の経過が通常のＴM となりかつ第２の経過がそれより高いＴM となるような２つのＴM 経過が得られれば、標的ポリヌクレオチドの存在が証明される。
【００６４】
性質の変化は一般に装置によって検出されるが、或る場合には肉眼検出も可能である。装置の例は、ミネラルランプおよび蛍光測定器である。或る種の性質変化は、標的ポリヌクレオチドを含む試料に対するポリヌクレオチド試料の添加後に不利な追加実験を行なうことなく装置によって検出することができる。他の性質変化は、標的ポリヌクレオチドを含む試料に対しポリヌクレオチドプローブを添加した後にさらに実験操作を加えて検出することができる。しかしながら、他の実験操作が必要であるかないかとは関係なく、標的ポリヌクレオチドの存在を証明する前に未結合のポリヌクレオチドプローブを試料から分離する必要はない。
【００６５】
前者の１例は、成分（たとえば挿入剤）が溶液中の標的ポリヌクレオチドに対しポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分をハイブリッド化させた際に蛍光放出スペクトルの変化を生ずる場合である。この場合、標的ポリヌクレオチドを含む試料に対しポリヌクレオチドプローブを添加した後に実験操作は必要とされない。溶液の蛍光は蛍光測定装置で測定することができ、蛍光放出の変化は標的ポリヌクレオチドの存在を示している。他の例は、成分（たとえば挿入剤）が溶液中の標的ポリヌクレオチドに対しポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分をハイブリッド化させた際にポリヌクレオチドハイブリッドの溶融温度を変化させる場合である。加熱部材を有するＵＶ分光光度計にて溶液のＵＶ吸収を測定しかつ高色素変化が生ずる温度を決定するだけでよい。いずれの場合にも測定されるのは性質変化であるため、初期の高いバックグランドは検出工程を実質的に妨げない。
【００６６】
後者の例は、成分（たとえば挿入剤）が溶液中の標的ポリヌクレオチドに対しポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分をハイブリッド化させた際にポリヌクレオチドの三次構造の変化によるポリヌクレオチドハイブリッドの浮力密度の変化を生ぜしめる場合である。この場合には、たとえば塩化セシウム中で溶液を最初に遠心分離した後に溶液の密度およびＵＶ測定を行なわねばならないので、他の実験操作が必要となる。
【００６７】
発生する性質変化は、ポリヌクレオチドプローブであっても標的ポリヌクレオチドであってもよい。性質変化がポリヌクレオチドプローブで生ずる場合、この変化はポリヌクレオチドプローブの成分部分であっても或いはポリヌクレオチドプローブにおけるポリヌクレオチド部分であってもよい。変化がポリヌクレオチドプローブで発生する例は、蛍光性挿入剤がポリヌクレオチドプローブの末端位置に存在しないヌクレオチドに結合する場合である。挿入剤は、標的ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドプローブにおけるポリヌクレオチド部分とのハイブリッド化によって形成したハイブリッド中に侵入する。この場合、変化する性質はポリヌクレオチドプローブにおける成分部分の蛍光放出である。
【００６８】
変化が標的ポリヌクレオチドで発生する例は、非蛍光性挿入剤が末端ヌクレオチドに結合する場合である。挿入剤はリンカアームに結合し、これにより隣接ハイブリッド（すなわち標的ポリヌクレオチドと隣接する相補的ポリヌクレオチド（このポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドプローブのものではない）とからなるハイブリッド）に侵入することができる。この場合、挿入剤はハイブリッドのＴM を上昇させるが、プローブと標的とからなるハイブリッドのＴM を上昇させない。しかしながら、挿入剤を隣接するハイブリッド中へ侵入させ、したがって隣接するハイブリッドのＴM を上昇させるのは、標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分のハイブリッド化である。したがってＴM における上昇はハイブリッドの存在を証明する。この場合、変化する性質は、標的ポリヌクレオチドと隣接する相補的ポリヌクレオチドとの間の熱力学的相互作用である。
【００６９】
９．標的ポリヌクレオチドの検出方法
蛍光性芳香族染料が成分であるようなポリヌクレオチドプローブを使用する本発明の方法は、たとえば溶液中に標的ポリヌクレオチドを含む試料を溶解させて標的ポリヌクレオチドを溶液中に放出させ、標的ポリヌクレオチドを包囲膜から放出させて行うことができる。溶解は、たとえば試料を音波或いは洗剤に露出して行うことができる。ポリヌクレオチドは遠心分離によって細胞残骸から分離することができ、かつアルコール沈澱または透析によってさらに精製することができる。次いで、ポリヌクレオチドプローブを標的ポリヌクレオチドを含有する溶液に添加し、かつこの溶液を約２０〜約１００℃の温度にて約１０分間〜約２４時間培養する。温度が高い程ハイブリッド化に要する時間が短縮することが認められる。次いで、この溶液を蛍光測定器に入れて蛍光放出を測定する。芳香族染料が挿入されていない場合に得られるスペクトルからの芳香族染料における蛍光放出スペクトルの変化が、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示す。
【００７０】
一般に、標的ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドプローブにおけるポリヌクレオチド部分とハイブリッド化させる前にハイブリッド化工程にて一本鎖型にせねばならない。これは熱もしくはアルカリのいずれかで行うことができる。しかしながら、ポリヌクレオチドプローブの成分が挿入剤である場合、標的ポリヌクレオチドは一本鎖もしくは二重鎖のいずれで存在させてもよい。標的ポリヌクレオチドが二重鎖型である場合、ポリヌクレオチドプローブにおけるポリヌクレオチド部分は、標的ポリヌクレオチドから同質ストランドを排除してポリヌクレオチドプローブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成する。
【００７１】
標的ポリヌクレオチドを含む二重鎖を最初に変性させることなくこの特定のポリヌクレオチドプローブを使用しうる理由は、ストランドの一方が挿入剤からなる二重鎖に対し挿入剤が向上した安定性を付与するためと思われる。説明のため二重鎖がストランド「Ａ」および「Ｂ」（ここでストランド「Ａ」は標的ポリヌクレオチドを構成する）で構成されると仮定する。さらに、ポリヌクレオチドプローブがストランド「Ａ」における標的ポリヌクレオチドに対し相補的なポリヌクレオチド部分（ストランド「Ｃ」）と、２個の挿入剤成分とで構成されると仮定する。さらに、ストランド「Ｄ」がストランド「Ａ」における標的ポリヌクレオチドに対し相補的であると仮定する。
【００７２】
ポリヌクレオチド二重鎖、すなわちハイブリッドは所定間隔で部分的に開口していることが知られている。しかしながら、ストランド「Ｄ」は一般に二重鎖のＴM より低い温度ではストランド「Ｂ」を排除することができない。何故なら、ストランド「Ａ」と「Ｄ」との間の熱力学的相互作用はストランド「Ａ」と「Ｂ」との間の熱力学的相互作用よりも大きくないからである。ストランド「Ａ」および「Ｂ」が部分的に分離しかつストランド「Ｄ」がストランド「Ａ」に対し対形成を開始する静止期間でさえ、この塩基対形成は極く短時間となる。殆んどの部分がストランド「Ａ」にハイブリッド化したストランド「Ｂ」は、ストランド「Ｄ」を急速に排除する。ストランド「Ｄ」は、ストランド「Ａ」からストランド「Ｂ」を切除してストランド「Ａ」と「Ｄ」とからなる二重鎖を形成することができない。
【００７３】
しかしながら、挿入剤が結合されているストランド「Ｃ」における塩基がストランド「Ａ」における相補的塩基に対し静止期間中に対形成すると仮定する。これが生ずると、塩基に結合した挿入剤は隣接する塩基対に侵入する。他方の挿入剤が結合しているストランド「Ｃ」における塩基が次いでその相補的塩基に対し対形成し、かつこの塩基に結合した挿入剤も隣接する塩基対に侵入する。その結果、ポリヌクレオチドプローブのおけるポリヌクレオチド部分の２個の塩基は標的ポリヌクレオチドの塩基に対し対形成して安定性を高める。これら塩基間における残余の塩基が次いでその相補的塩基に対形成する。ストランド「Ｃ」の挿入剤は、ストランド「Ａ」の塩基に対形成したストランド「Ｂ」の塩基と比較して、ストランド「Ａ」の塩基に対形成したストランド「Ｃ」の塩基の間に一層大きい熱力学的安定性を付与する。たとえば、臭化エチジウムはポリヌクレオチド二重鎖の溶融温度を約２５℃上昇させる〔Ｕ．Ｂ．レペックおよびＣ．パオレッチ、Ｊ．Ｍ．Ｂ．、第２７巻（１９６７）、第８７〜１０６頁参照〕。ストランド「Ｂ」はもはやストランド「Ｃ」をストランド「Ａ」から排除することができない。その結果、ストランド「Ａ」に予めハイブリッド化したストランド「Ｂ」の１部は、ストランド「Ａ」と「Ｃ」とからなる二重鎖部分でなく、ストランド「Ａ」から永久的に切除され続ける。かくして、この一本鎖ポリヌクレオチドプローブは、標的ポリヌクレオチドが一本鎖型で存在しない場合にも試料中における標的ポリヌクレオチドの検出を可能にする。
【００７４】
さらに、この方法を用いて標的ポリヌクレオチドの存在を二重鎖が変性するような温度で検出することもできる。一般に、二重鎖型で存在する標的ポリヌクレオチドの検出は、二重鎖を含む試料をこの二重鎖のＴM より高い温度までポリヌクレオチドプローブの存在下で加熱しかつこの試料を冷却して標的ポリヌクレオチドによりポリヌクレオチドプローブを再生させることにより行われる。しかしながら、ポリヌクレオチドプローブが蛍光性挿入剤成分からなる場合、試料は冷却を必要としない。何故なら、挿入剤は塩基対を安定化させて、これら塩基対のＴM を上昇させるからである。かくして、ポリヌクレオチドプローブにおけるポリヌクレオチド部分が標的ポリヌクレオチドに対しハイブリッド化を開始しかつ挿入剤が形成二重鎖中に侵入すると、試料の温度上昇はこの二重鎖を変性させるにはもはや充分でなくなり、挿入剤の蛍光放出変化によって標的ポリヌクレオチドの存在を証明することができる。温度上昇はこの二重鎖（すなわち、ポリヌクレオチドプローブと標的ポリヌクレオチドとからなるもの）のＴM より高くなりえないと理解される。
【００７５】
１０．標的ポリヌクレオチド
この方法を用いて、たとえば微生物、植物細胞または哺乳動物細胞から標的ポリヌクレオチドを検出することができる。微生物は細菌、黴、ウイルスまたは酵母とすることができる。標的ポリヌクレオチドは、特定の病原性ウイルスに独特なもの、非機能性蛋白の産生をもたらすような突然変異した哺乳動物遺伝子に存在するもの、或いは抗生物質耐性を細菌に付与するものとすることができる。たとえば、これはストレプトコッカス・ピオゲネスまたはナイセリア・メニンギチジスにペニシリン耐性を付与するもの；スタフィロコッカス・アウレウス、キャンジダ・アルビカンス、シュードモナス・エアルギノーサ、ストレプトコッカス・ピオゲネスまたはナイセリア・ゴノレアにテトラサイクリン耐性を付与するもの；並びにミコバクテリウム・チュバキュロシスにアミノグリコシド耐性を付与するものとすることができる。
【００７６】
この方法を、たとえばサラセミア貧血症および鎌状赤血球貧血症などの遺伝子障害の診断に拡大することができる。ポリヌクレオチド遺伝子の存在もしくは不存在が障害（サラセミア貧血症の場合）に関連するポリヌクレオチド遺伝子は、本発明によるポリヌクレオチドプローブとのハイブリッド化にしたがって検出することができる。
【００７７】
染色体の特定部位に対する遺伝子もしくはその転写物の地図化は面倒でありかつ時間を要する作業であり、主として細胞融合および体細胞遺伝子学の技術を用いる。たとえばショウジョウバエ（Drosophila）のような染色体多分裂を受ける種類では現場でのハイブリッド化が単一コピーの遺伝子配列を地図化するのに好適に使用されているが、それより高等な大抵の真核性染色体における独特な配列の遺伝子の検出は標準ハイブリッド化法では不可能でないにしても極めて困難である。さらに、ハイブリッド化部位の放射線写真による位置決定を容易化させるために極めて高い比放射能がポリヌクレオチドプローブに必要とされることは、このポリヌクレオチドプローブの急速な放射能分解を生ぜしめ、かつそれに伴なって銀粒子付着のバックグランドノイズを増大させる。低いまたは中庸の比放射能を有するハイブリッド化プローブの使用は、たとえばリボゾームＲＮＡ遺伝子もしくはサテライトＤＮＡのような多コピー配列を検出するのに何日間もしくは何週間もの露出時間を必要とする。真核細胞に見られるほぼ全ての単一コピー配列の分子クローン化については組換ＤＮＡ技術が可能となったので、この種のクローン化ゲノム断片の染色体を地図化する迅速かつ敏感な方法を得るのが極めて有益である。
【００７８】
最後に、本発明によるポリヌクレオチドプローブを作成して腫瘍細胞を診断することもでき、このポリヌクレオチドプローブはたとえば胎児蛋白抗原もしくは癌胚抗原のようなその存在が特定腫瘍細胞の診断となるポリペプチドの産生に関連するＤＮＡ遺伝子配列から転写されたメッセンジャーＲＮＡに対し相補的である。プローブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッドのハイブリッド化および検出は、腫瘍細胞の検出方法を与える。
【００７９】
本発明に適したポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合した挿入芳香族化合物とからなるポリヌクレオチドプローブを下記に示し、このポリヌクレオチドは構造式：
【００８０】
【化６】
〔式中、Ｂはピリミジン、プリンおよびデアザプリンよりなる群から選択される塩基を示し、ただしＢがピリミジンであれば糖はこのピリミジンのＮ1 −位置に結合し、かつＢがプリンもしくはデアザプリンであれば糖はプリンもしくはデアザプリンのＮ9 −位置に結合し、「Phen」はフェナンスリジン部分を示し、Ｌ．Ａ．は少なくとも３個の炭素原子を含むリンカアームであって、フェナンスリジン部分の５−位置に結合され、かつＺはＨもしくはＯ−のいずれかである〕を有する少なくとも１種の部分を含む。
【００８１】
一般に、Ｂは同一のオリゴ−もしくはポリ−ヌクレオチド内で変化し、或いはウラシル、シトシン、チミン、グアニン、アデニン、デアザグアニンもしくはデアザアデニンとすることもできる。さらに、一般に、この変化は標的ポリヌクレオチドからなるヌクレオチドの所定配列に対応する。図示した構造式はたとえばポリＣ、ポリＵ、ポリγ（Ａ−Ｕ）およびポリｄ（Ａ−Ｕ）のようなポリヌクレオチドをも包含することを意図する。
【００８２】
１１．ポリヌクレオチドプローブの合成
この種のポリヌクレオチドプローブの合成例を、図１を参照して以下説明する。ポリヌクレオチドプローブは、ヌクレオチドｄＴＭＰおよびｄＵＭＰならびにブチジウム挿入剤からなっている。標的ポリヌクレオチドはポリｄＡＭＰである。
【００８３】
合成の第１工程は、硫酸の存在下における硝酸カリウムによるベンチジンから３−ニトロベンチジンへのニトロ化である。次いで、２個の環外アミノ基をエチルクロルホルメートと反応させて、ジイソシアネート化合物を生成させる。この工程は、このようにしないと第１アミノ基が後に他の試薬と共有反応してアミド或いは第２および第３アミンを生成するので必要となる。この種の反応は、合成された成分がハイブリッド中へ侵入するのを防止し、したがって成分としてのその効果を阻害する。この事実は、アセチル基によるフェナンスリジウム化合物の８−アミノ基の遮蔽がポリヌクレオチドの螺旋巻き戻し角度を低下させ、しかもその結合エネルギーに殆んど変化を生ぜしめないのに対し、３−および８−アミノ基の完全遮蔽はフェナンスリジウム化合物の結合恒数を１０〜２０倍低下させて巻き戻し角度を著しく低下させるという報告に基づいている。２個のアミノ基は、挿入錯体の安定性に対し約1.4 〜1.7 カロリー／モルの自由エネルギーを与える〔Ｊ．Ｗ．コズコザンおよびＦ．Ｅ．ハーン編、アンチビオティックス、第３巻、第１４１〜１６５頁、スプリンガー・フェアラーグ出版、Ｎ．Ｙ．（１９７５）における「エチジウムおよびプロピジウム」と題する論文参照〕。
【００８４】
次いで、３−ニトロ基を亜鉛によってアミノ基まで還元し、かつ塩化ベンゾイルを添加してベンゾイルアミドを生成させる。このベンゾイルアミドのカルボニルはホスホオルキシクロライド中で加熱する際に６−位置の炭素と反応してフェナンスリジウム誘導体を生成する。次いで、５−第三アミンを１，４−ジブロモブタンと反応させて４級化することにより、ブチジウム誘導体を生成させる。これに続いてジウレタン部分を加水分解して５−（４’−ブロモブチル）−３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジンを生成させる。次いで、この化合物をチオ硫酸ナトリウムと反応させることにより臭素をチオールで置換して５−（４’−チオブチル）−３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジンを生成させる。この生成物は、ポリヌクレオチドプローブの成分部分を示し、かつブチジウム誘導体の蛍光特性を示す。
【００８５】
この化合物を、ポリヌクレオチドに結合させる前に、この化合物の蛍光性が他の分子に対する共有結合に際し破壊されないことを証明する必要がある。これは、ブチジウム化合物を図２（ａ）に示したようにブロモアセチル化アミノデキストラン誘導体と反応させて行われる。デキストラン誘導体は、デキストランを硼水素化ナトリウムの存在下でブタジエンモノエポキシドと反応させて１−ブテン−４−デキストランを生成させることにより製造される。この化合物をＮ−ブロモスクシンイミドと混合して１−ブロモブタン−４−デキストランを生成させ、次いでさらにシステアミンと反応させて、アミノデキストラン誘導体を得る。このデキストランをブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと混合して、ブロモアセチル化されたアミノデキストラン誘導体を生成させる。
【００８６】
このブロモアセチル化アミノデキストラン誘導体を上記５−（４’−チオブチル）−３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジンと反応させて、デキストラン標識されたフェナンスリジウム化合物を生成させる。この化合物のスペクトル分析は、フェナンスリジンの蛍光がデキストランへの結合によって変化されないことを示した。
【００８７】
次いで、アリルアミンが各ウラシル（Ｕ）塩基へその５−位置に結合したポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＵ）からなるポリヌクレオチドを作成する。このポリヌクレオチドを作成するために使用した方法は、ｄＵＴＰおよびＡＡＵＴＰ（アリルアミンＵＴＰ）の混合物の存在下で酵素末端トランスフェラーゼによりポリヌクレオチドを合成することである。合成されたポリヌクレオチドを陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製する。このウラシル塩基は約２６０ｎｍに最大吸収を有する一方、５−位置にアリルアミンを有するウラシル塩基は約２９０ｎｍに最大吸収を有する。かくして、２６０／２９０の吸光比を測定することにより、ポリヌクレオチド重合体における２種の塩基の比率を決定することができる。この実験では、ＡＡｄＵ対ｄＵの比が１：１０であることが判明した。
【００８８】
次いで、このポリヌクレオチドを図２（ｂ）に示したように水−ジメチルホルアミドの混合物を含有する溶液中で弱アルカリ性条件下に５−（４’−チオブチル）−３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジンと反応させる。未反応のブチジウム誘導体をブタノールによって溶液から抽出する。ブタノールによる抽出は、ポリヌクレオチドプローブをこの溶液から沈澱させる。沈澱をさらに陰イオン交換カラムで精製する。
【００８９】
次いで、精製したポリヌクレオチドプローブを３種の溶液と混合する。第１の溶液はポリ（γＡ）を含有し、第２の溶液は牛胸腺二重鎖ＤＮＡを含有し、かつ第３の溶液はポリ（ｄＴ）を含有する。ポリ（γＡ）を含有する溶液のみが強度の蛍光性を示す。このことは、どのストランドもポリヌクレオチドプローブのストランドでない二重鎖中へ挿入剤が侵入しなかったことを示している。
【００９０】
精製されたポリヌクレオチドプローブをポリ（ｄＴ）対ポリ（γＡ）の比が２：１であるポリ（ｄＴ）−ポリ（γＡ）を含有する溶液と混合する。この溶液は殆んど即座に蛍光を発する。このことは、挿入剤を含むポリヌクレオチドプローブが同質ポリヌクレオチドを二重鎖から排除しうることを証明している。
【００９１】
ポリヌクレオチド薬剤の説明
本発明は、ポリヌクレオチド組成物をポリヌクレオチド薬剤として使用することを可能にする。ポリヌクレオチド薬剤は、標的ポリヌクレオチドの転写もしくは翻訳を防止するために使用される。薬剤を使用して転写を防止する場合、標的ポリヌクレオチドはＤＮＡもしくはＲＮＡとすることができる。ポリヌクレオチド薬剤を使用して翻訳を防止する場合、標的ポリヌクレオチドはメッセンジャーＲＮＡである。
【００９２】
ポリヌクレオチド薬剤は、ポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合した少なくとも２個の成分とからなっている。これらの成分は、ポリヌクレオチド薬剤のポリヌクレオチド部分が標的ポリヌクレオチドにハイブリッド化した際にポリヌクレオチドプローブもしくは標的ポリヌクレオチドまたはその両者のいずれかの性質に変化を生ぜしめるような特徴を有する。変化する性質は、形成されたハイブリッドの熱力学的安定性である。この安定性は、薬剤のポリヌクレオチドに対し同質性であるポリヌクレオチドによる標的ポリヌクレオチドからのポリヌクレオチド薬剤の排除を防止する。何故なら、この種の同質ポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとからなるハイブリッドは、薬剤のポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとからなるもの程、熱力学的に安定でないからである。
【００９３】
適するポリヌクレオチド薬剤の例は、成分として挿入剤を含むものである。上記したように、挿入剤の存在は、ポリヌクレオチド二重鎖のＴM を上昇させる。すなわち、挿入剤を含むポリヌクレオチド薬剤を試料と混合し、或いは標的ポリヌクレオチドを含む生物に投与すれば、その標的ポリヌクレオチド薬剤はその標的ポリヌクレオチドを探し出す。標的が既に相補的ポリヌクレオチドにハイブリッド化している場合にもこの標的ポリヌクレオチドを見い出すと、ポリヌクレオチド薬剤におけるポリヌクレオチド部分は、ポリヌクレオチドプローブの説明で上記した理由により標的に対し相補的である配列を排除する。その結果、容易には、ポリメラーゼおよびトランスフェラーゼ酵素に対する雛型とならないような二重鎖を生成し、かくして標的ポリヌクレオチドの転写もしくは翻訳を遮断する。
【００９４】
このポリヌクレオチド薬剤は、薬剤のポリヌクレオチド部分と標的ポリヌクレオチドとのハイブリッド化の結果生成された二重鎖にのみ挿入剤を侵入させうるようなリンカアームによって、挿入剤をポリヌクレオチドに結合させねばならないという制約を有する。挿入剤は、他の二重鎖中に侵入して他のポリヌクレオチドの転写もしくは翻訳を妨げてはならない。
【００９５】
このポリヌクレオチド薬剤は利点を有する。挿入剤を包含する大抵の化学治療剤は、ヒトに全身的に投与すると体全体に均一分布する。これら薬剤の殆んどは極めて毒性である。したがって、標的部位に治療効果を発揮するだけでなく、これらは非標的部位にも毒性作用を示す。本発明の挿入剤は標的ポリヌクレオチドを含まない二重鎖中には侵入しえないので、ポリヌクレオチド薬剤は体全体に均一分布されたとしても標的部位以外には毒性作用を示さない。
【００９６】
変化する性質は検出しうる必要はないが、これはしばしば有利である。しかしながら、変化する物質は、ポリヌクレオチド薬剤を含まないハイブリッドと比較して、ポリヌクレオチド薬剤／標的ポリヌクレオチドからなるハイブリッドの安定性を向上させねばならない。
【００９７】
挿入剤を含むポリヌクレオチド薬剤の製造方法は、ポリヌクレオチドプローブの製造の説明で上記した通りである。これらのポリヌクレオチド薬剤は、中性水溶液としてヒトに投与することができる。
【００９８】
ポリヌクレオチド薬剤は、適当なキャリヤによって細胞へ供給せねばならない。キャリヤは、ポリヌクレオチド薬剤が細胞中で入る前に分解されるのを防止せねばならず、同時にポリヌクレオチド薬剤を細胞膜中に拡散させ或いは貫通輸送させねばならない。１つの好適方法は、リポソームの使用である。
【００９９】
リポソームは単層もしくは多層の脂質小胞であって、三次元空間を包囲する。リポソームの膜は極性先端と非極性末端とを有する１種もしくはそれ以上の脂質成分の二分子層によって形成される。水性（もしくは極性）溶液において、１つの層の極性先端は外方向に配向して、水性もしくは極性溶液中に突入し、かつ連続的外表面を形成する。単層リポソームは、このような１種の二分子層であるのに対し、多層小胞は一般に玉ネギのように配列された複数のほぼ同心的二分子層を有する。
【０１００】
リポソームは、たとえば細胞毒性剤或いは細胞挙動を改変させたり、またはこれら薬剤を生体内部位に搬入しうる他の巨大分子のような治療剤をカプセル化するのに有用であることが周知されている。たとえば、ラーマン等による１９７６年１１月２３日付け発行の米国特許第3,993,754 号公報は悪性腫瘍の改良化学治療法を開示しており、この場合抗腫瘍剤をリポソーム内にカプセル化しかつこのリポソームを動物またはヒトに注射する。アプル等による１９８１年４月２１日発行の米国特許第4,263,428 号公報は、均一寸法のリポソーム内に薬剤を混入することにより哺乳動物における選択細胞部位に対しより効果的に供給しうる抗腫瘍剤を開示している。リポソームを介する薬剤投与は、毒性を減少させ、組織分布を変化させ、薬剤効果を高めかつ治療指標を向上させる。
【０１０１】
核酸をカプセル化するための特に有用な方法は、ダビッドＷ．ディーマーによる１９８５年５月７日発行の米国特許第4,515,736 号公報に開示されており、これを参考のためここに引用する。この方法は、リポソーム分散物をカプセル化すべき物質の存在下で乾燥させる新規なカプセル化である。乾燥が生ずるにつれて、個々のリポソームが融合して多層構造を形成し、脂質ラメラ間に物質を閉じこめる。再水和すると、脂質小胞が形成されて物質を効率的にカプセル化する。この特許は、各種のポリヌクレオチドの効果的なカプセル化を開示している。
【０１０２】
同質ポリヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドから排除するポリヌクレオチド薬剤の効果は、ポリヌクレオチド薬剤におけるポリヌクレオチド部分の長さ並びにポリヌクレオチド薬剤に結合した挿入剤の個数に依存する。挿入剤の個数が多い程、同質配列を排除する薬剤のポリヌクレオチド部分の効果が大となりかつ標的ポリヌクレオチドの転写もしくは翻訳を防止するのに要する薬剤の量が少なくなる。さらに、挿入剤の個数が多い程、この薬剤は標的に対しより迅速に結合する。
【０１０３】
【実施例】
次の実施例は実証としてのものであって制限としてのものではない．
実施例 １：
３−ニトロベンジジンの調製
方法は基本的には、Ｍ．Ｓ．リスリー及びＥ．Ｅ．ターナー、ジャーナル．ケミカル．ソサイエティ．（１９３４年）、第１５８８〜９２頁に従った。
【０１０４】
９５％硫酸４６８ｍｌ、Ｐ2Ｏ5 ８７ｇをＰ2Ｏ5 の総てが溶解するまで２時間をかけて少しずつ添加した。（Ｐ2Ｏ5 は硫酸中の水を吸収するために添加された）。溶液を室温に冷却後、ベンジジン５０ｇ（フルカ ケミカル社、２５５オセル アベニュー ハウパウゲ ニュー ヨーク １１７８８）を冷却下に徐々に添加し、１０〜１５℃の間に保持した。最後に粉末硝酸カリ（５０．５ｇ）を溶液に激しく攪拌しながら３０分かけて添加し、その間前記温度に保持した。６０分後、溶液を注意して１５００ｍｌの水中に注入し、この水溶液を沸騰水で６ｌに希釈した。分別部１０ｍｌを採り、徐冷して３−ニトロベンジジン硫酸塩結晶を得た。この結晶を残り溶液の結晶析出用種晶として使用し、３５℃に急冷した。溶液を更に２０℃まで冷却して３−ベンジジンの結晶を完全に沈澱させた。結晶化の完了後に、３−ニトロベンジジン硫酸塩を濾別して集めた。湿った塩の３０ｇ部を粉砕して水による堅めのペーストとした。このペーストに濃アンモニア水を添加し、更に粉砕して３−ニトロベンジジン硫酸塩を遊離３−ニトロベンジジンに変えた。これを希アンモニア−エタノールに溶解し、この溶液を多量の水に注入して３−ニトロベンジジン４６ｇを得、これは収率８０．４％に相当した。
【０１０５】
Ｎ，Ｎ’−ビスカルボエトキシ−３−ニトロベンジジンの調製
３−ニトロベンジジン２９ｇをジメチルアニリン３９ｍｌ（３６ｇ）を含有するエタノール３３０ｍｌに溶解した。このエタノール溶液にエチルクロロホーメイト３１ｇを少しずつ添加した。溶液を１０分還流後に水を添加してジウレタン誘導体を沈澱させた。生成物４１ｇを得、これは収率９５％に相当した。
【０１０６】
３，８−ビスカルベトキシ−３−アミノベンジジンの調製
ジウレタン４１ｇをエタノール５００ｍｌと氷酢酸４０ｍｌを含む溶液に添加し、この混合物を加熱してジウレタンを溶解した。溶液は黒褐色であった。温度を約３０℃にして、亜鉛粉末を徐々に添加してニトロ基を還元した。反応の終結は褐色の消失で示された。亜鉛を濾別し、エタノールと酢酸を真空下に除去した。３，８−ビスカルベトキシ−３−アミノベンジジンはそれ以上の精製することなく次の工程に使用した。
【０１０７】
３，８−カルベトキシ−６−フェニールフェナンスリジンの調製
次の方法は、Ｌ．Ｐ．ウォール、ジャーナル．ケミカル．ソサイエティ．（１９４７年）、第６７〜７４頁から改作されたものである。
【０１０８】
３，８−ビスカルベトキシ−３−アミノベンジジンをニトロベンゼン１００ｍｌに溶解し、この溶液を１５０℃の温度に加熱した。塩化ベンゾイル１０ｍｌを添加し、ＨＣｌの発生が止まるまで１５０℃に保持した。更に３０分１５０℃保持した後、溶液を冷却し、エタノールを添加すると無色プリズム形のベンゾイル誘導体が晶出した。収率は７２％相当の３５ｇであった。
【０１０９】
ベンゾイル誘導体を塩化ホスホリル７０ｍｌに溶解しＨＣｌガスの発生が止まるまで１時間還流した。黄色溶液を室温まで冷却し、次いで冷希アンモニア溶液に徐々に添加してフェナスリジンを沈澱させた。沈澱を濾別し無水エタノール２００ｍｌに溶解した。次いでアンモニアを添加してオレンジ色を無くした。水を添加して化合物を沈澱させた。収率６２．５％相当の２１ｇであった。
【０１１０】
５−（４’−ブロモブチル）−３，８ビスカルベトキシ−６−フェニルフェナンスリジンの調製
この化合物をＴ．Ｔ．ワトキンス、ジャーナル．ケミカル．ソサイエティ．（１９５２年）、第３０５９〜３０６４頁の方法の改良により調整した。
【０１１１】
３，８ビスカルベトキシ−６−フェニルフェナンスリジン１ｇを予め１００℃に加熱した１，４−ジブロモブタン１０ｍｌに添加し、それにより混合溶液中の幾らかの水分が揮散したであろう。温度を次第に１５０℃に上げた。１５０℃で３０分後に、黄色な沈澱が形成し始めた。混合物を室温に冷却し、次いでエーテルを総量１００ｍｌ添加して沈澱を促進させた。沈澱を濾別し、エーテルで洗浄し、次いで空気乾燥した。収率５８％相当の総量０．８ｇの化合物を得た。
【０１１２】
１５０℃の加熱時間が重要で、理由は１５０℃に一晩保持した平行実験において、得られた生成物は極めて不均一に見え、硫酸によるウレタンの加水分解後に二重ストランドＤＮＡと極めて少量の蛍光しか示さなかった。（ワトキンスの論文第３０６１頁参照）。このことはこの化合物が分解したことを示した。
【０１１３】
５−（４’−ブロモブチル）−３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジンの調製
ウレタン部分の加水分解をＬ．Ｐ．ウォール、ジャーナル．ケミカル．ソサイエティ．（１９４７年）、第６７〜７４頁の方法に従って実施した。３，８−ビスカルベトキシ−３−アミノベンジジン８００ｍｇをアルゴンガス下に濃硫酸１０ｍｌに溶解した。ＨＢｒの発生が止まった後、Ｈ2Ｏ ５ｍｌを添加し浴温を１５０℃に上げた。溶液をＣＯ2 ガスの発生が止まるまでこの温度に１５分保持した。次いで混合物を５〜１０℃に冷却し、冷Ｈ2Ｏを添加して総量１５０ｍｌとした。溶液を冷希アンモニアで中和した。この溶液に固体臭化カリを１Ｍになるまで添加し（生成物を塩析するため）次いで溶液を４℃で一晩放置した。この放置後に、沈澱が形成し、これは過マンガン酸塩のような結晶外観を呈した。この生成物は又硫酸アンモニウム塩としても容易に溶液から沈澱出来ることが分かった。この生成物は水溶性で、二重ストランドＤＮＡを含有する溶液に混合すると、強い蛍光溶液が形成される。収率８９％相当の５４７ｍｇが得られた。
【０１１４】
５−（４’−チオブチル）−３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジンの調製
５−（４’−ブロモブチル）−３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジン６０ｍｇを５０％エタノール４ｍｌに溶解した。５０％エタノール中に０．２Ｍ Ｎａ2Ｓ2Ｏ3 １ｍｌを添加し、溶液を８０℃で３時間加熱した。７０℃でアルゴンガスを吹き込んでエタノールを揮散させ、生成物を３Ｍ ＫＣｌ ２ｍｌにより沈澱させた。沈澱物を遠心分離機で集め、３６％ＨＣｌ １ｍｌに溶解した。水（０．３５ｍｌ）を添加してＨＣｌ濃度を２５％に低下させ、溶液を室温で２０時間放置した。この放置後により沈澱が形成された。無水エタノール６ｍｌを添加し、混合物を−２０℃で更に２０時間放置して沈澱を促進した。沈澱を遠心分離機で集め、沈澱物を１ｍｌの水に分散させ、水を凍結乾燥により除去した。収率７０％相当の４２．５ｍｇを得た。粗製物の薄層クロマトグラフィは３個の蛍光生成物を示した。所望生成物を精製することなく次の反応に使用した。
【０１１５】
アミノデキストランの調製
デキストラン Ｔ−５００（フェルマシア ビオケミカルス、ピスタカウェイ、ニュー ジャージー）を１Ｍ ＫＯＨの１５．０ｍｌに添加した。ブタジエンモノエポキシド３００μｌ（約３ｍｍｏｌ）と水素化ホウ素ナトリウム３０ｍｇ（触媒）とを添加し、混合物を一晩攪拌した。溶液をＨＣｌで中和し、過剰未反応ブタジエン モノエポキシドとこれから生成したジアルコールとを溶液から２０ｍｌのエーテルで４回抽出した。水溶液中に残ったエーテルをアルゴンガス吹き込みにより揮散させた。次に溶液をｐＨ５．０の酢酸ナトリウム０．２Ｍにより透析して塩類を除去した。
【０１１６】
Ｎ−ブロモコハク酸イミド０．５ｇをこの溶液に添加し、得られた分散物を暗黒中にて１０℃３時間攪拌した。得られた溶液を２日にわたり１ｌ水に対し３回透析した。この透析物０．４ｍｌに１ＭのＫ2ＨＣＯ3 ２００μｌとシステアミン１００ｍｇを添加し、混合物をアルゴン下に８０℃２時間加熱し、溶液をＧ−５０濾過により脱塩した。精製デキストランは２０糖部分当たり一つの誘導糖を含有していた。
【０１１７】
ブロモアセチル化アミノデキストランの調製
０．０２Ｍホウ酸ナトリウムと８．５ｍｇのアミノデキストランを含有する溶液０．５ｍｌに０．２ｍｌのジメチルホルムアミドとＤＭＳＯ中の１Ｍブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル２５μｌとを添加した。ピクリルスルホン酸（この試薬は第一アミノ基に対しオレンジ色を与える）でアミノ含量を測定しながら反応を続けた。反応は室温で５分の後完了することが分った。混合物に１．０ＭのＨＣｌ５０μｌ添加し、過剰の未反応エステルと生成ブロモ酢酸とを水飽和１−ブタノールで４回抽出した。ブロモアセチル化デキストランは極めて不安定で、特に塩基性ｐＨでそうである。例えば、ｐＨ９．２、３７℃で総てのブロモアセチル基は６時間後に開裂した。それ故、次の反応はブロモアセチル化デキストランの分離に続いてできるだけ速く実施すべきである。
【０１１８】
フェナンスリジン標識付けデキストランの調製
ブロモアセチル化デキストラン２．１ｍｇを酢酸ナトリウム０．３Ｍ水溶液２００μｌに溶解し、次に６ｍｌのホルムアミド中の５−（４’−チオブチル）−３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジン３．５ｍｇと混合した。反応混合物を室温に１時間、次いで３７℃で１時間放置した。２ＭのＮａＣｌ １ｍｌを添加し、次いで未反応５−（４’−チオブチル）−３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナスンスリジンを水飽和１−ブタノールで６回抽出した。この水相の一部に二重ストランドＤＮＡを添加すると強い蛍光が付与されたので、デキストランはフェナンスリジンで標識付けされたことが示され。デキストランのフェナンスリジン部分は挿入を受け入れ易いことが示された。
【０１１９】
ポリ（ｄＴ）・ポリ（ＡＡｄＵ）の調製
溶液Ａ：０．２５Ｍカコジル酢酸緩衝液ｐＨ７．２の２５００μｌ、ＢＳＡ（ＤＮＡ含まず、２０μｇ／ｍｌ）の２５０μｌ、０．１ＭのＣｏＣｌ2 ５０μｌ、及び３ＭのＮａＣｌ７５μｌを含有。
【０１２０】
溶液Ｂ：Ｈ2Ｏ １５００μｌと０．１ＭのＢメルカプトエタノール５０μｌを含有。
【０１２１】
溶液Ａを溶液Ｂと混合し、８００単位の末端トランスフェラーゼ酵素、3 ＨＴＴＰ（低比活性）５μモル、及びＡＡｄＵＴＰ１．５μモルをこの混合溶液に添加した。溶液をアルゴン下に４０時間３７℃で培養した。反応工程中にピロリン酸コバルトが溶液から沈澱した。４０時間後に０．５ＭのＥＤＴＡ１００μｌを添加して反応を停止させた。しかし３７℃の培養は２時間継続されてＥＤＴＡをコバルトと複合させ、アリルアミノ基に複合したコバルト化物を除去した。
【０１２２】
シリコン化の毛細管ピペット中の０．６ｍｌの床容量のＤＥＡＥセルローズカラムを１ＭのＫＯＨ ２ｍｌで２回次いでアルカリ性が無くなるまで水で洗浄した。次いでカラムを３ＭのＮａＣｌ ２ｍｌ、次いでＨ2Ｏ ３ｍｌ、次いで０．２ＭのＮａＣｌ ２ｍｌで洗浄した。次いで培養混合物をカラムに通し、次いでカラムを０．２ＭのＮａＣｌと０．３ＭのＮａＣｌで連続して洗浄した。最後の０．３Ｍ洗浄の溶出は総カウントの数％を含有した。
【０１２３】
共重合体を０．２Ｍの酢酸中の１．５ＭのＬｉＣｌ含有溶液でカラムから溶出した。２／１０ｍｌ画分を集めた。結果を次に示す。
【０１２４】
【表１】
【０１２５】
画分３〜５を集めたら０．６ｍｌとなった。この溶液１０μｌを１ｍｌに希釈した。この１ｍｌのＡ260 は０．６４５であり、Ａ290 は０．２０３であった。２９０ｎｍの吸光度はアリルアミノ基の存在を示した。総Ａ260 は３８．７であって、共重合体約１．５ｍｇに相当した。
【０１２６】
ｄＴに対するＡＡｄＵの比１：１０は共重合体とピクリルスルホン酸との反応により決定した。アリルアミンのアミノ基によるスルホン基の置換は共重合体を黄色にした。４２０ｎｍにおける溶液の測定はｄＵに対するＡＡｄＵの比が１：１０であることを示した。（総てのアリルアミンがピクリルスルホン酸分子と反応したと想定された。）
【０１２７】
ポリヌクレオチド標識付けフェナンスリジンの調製
１．５ＭのＬｉＣｌと０．２Ｍの酢酸１００μｌ中のポリ（ｄＴ）・ポリ（ＡＡｄＵ）共重合体２００μｇを含有する溶液を３ＭのＫ2 ＣＯ3 でｐＨ８．０とした。次にホルムアルデヒド０．６ｍｌに溶解したチオアルキル化フェナンスリジン３ｍｇを添加した。混合物を室温で約９０分次いで更に３７℃で４５分暗所に放置した。Ｈ2Ｏ １ｍｌを添加し、過剰のチオアルキル化フェナンスリジンを水相容量が約３００μｌに減少するまで１−ブタノールで抽出した。更に水で飽和した１−ブタノールで抽出した。各抽出の後、２相を遠心分離機で分離した。沈澱は最初の１−ブタノール抽出の後現れた。沈澱は標識付けポリヌクレオチドと幾らかの不溶性フェナンスリジン副生成物を含んでいた。最後の抽出の後、遠心分離機にかけ、得られたペレットを３７℃の温度にてホルムアミドに溶解した。
【０１２８】
溶液をホルムアミドで平衡化されたＤＥＡＥセルローズカラム（クロライド形）に通した。カラムをホルムアルデヒドで洗浄してフェナンスリジン化合物を溶出した。フェナンスリジン標識付けポリヌクレオチドはより高い塩濃度にてもカラムから溶出されなかった。（収率を増大するため、ポリヌクレオチドをエタノール中で酢酸バリウムで沈澱させ、沈澱を遠心分離機で集め、次いで沈澱をＥＤＴＡ／Ｈ2Ｏに溶解することにより集めることができる。）
【０１２９】
蛍光の検出
フェナンスリジン標識付けポリヌクレオチドを含有するＤＥＡＥ溶出２５μｌを（１）０．１ＭのＮａＣｌ０．６ｍｌ中ポリ（ｒＡ）１０μｇを含む試験管に、（２）０．１ＭのＮａＣｌ０．６ｍｌ中に子牛胸腺ＤＮＡ２５０μｇ含む試験管に、（３）０．１ＭのＮａＣｌ０．６ｍｌ中にポリ（ｄＴ）を含む試験管に夫々添加した。ポリ（ｒＡ）を入れた試験管は強く蛍光を発したが他の２本の試験管はほんの極めて弱い蛍光を示すにすぎなかった。
【０１３０】
この実験の結果は、このフェナンスリジン標識付けポリヌクレオチドが一工程ハイブリッド形成検定におけるプローブとして使用できることを示している。その理由は、このフェナンスリジンが上述のようにポリヌクレオチドに結合した場合、他の結合していない二重ストランドポリヌクレオチド中に挿入されないからである。それはただ、フェナンスリジン標識付けポリヌクレオチドのポリヌクレオチド部分が相補ポリヌクレオチドによりハイブリッド形成される結果形成される二重ストランドポリヌクレオチド中に挿入される。
【０１３１】
二重ストランドＤＮＡからのポリヌクレオチドのフェナンスリジン標識付けポリヌクレオチドのポリヌクレオチドによる置換
ポリ（ｒＡ）に対するポリ（ｄＴ）の比２：１であるポリ（ｄＴ）−ポリ（ｒＡ）を含有する溶液を室温でフェナンスリジン標識付けポリ（ｄＴ）−ポリ（ＡＡｄＵ）と混合した。溶液は即座に蛍光を発し始め、その蛍光の強さは時間と共に増大した。フェナンスリジン標識付けポリ（ｄＴ）−ポリ（ＡＡｄＵ）のフェナンスリジンは二重ストランド子牛胸腺ＤＮＡ中に挿入されないので（上記結果参照）、蛍光発生は、フェナンスリジン標識付けポリヌクレオチドが二重ストランドハイブリッド中の同種ポリヌクレオチドに置換したことを示した。
【０１３２】
各種の変化、改良、及び変更が本特許請求の範囲に規定した発明の精神と範囲から逸脱せずになされ得ることは、当業者にとり明確であろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】ポリヌクレオチドに結合してポリヌクレオチド化合物を形成することが出来る芳香族染料の合成工程図である。
【図２】図２（ａ）はデキストランに図１の芳香族染料が結合する工程図であり、図２（ｂ）はポリヌクレオチドに図１の芳香族染料が結合する工程図である。
【図３】ポリヌクレオチドと標的ペリヌクレオチドとのハイブリッド形成により形成されたハイブリッド中のポリヌクレオチドに結合した芳香族染料の挿入の説明図である。
【産業上の利用分野】
本発明は、ポリヌクレオチド化合物と標的ポリヌクレオチドとからなるハイブリッドの形成方法、好適ポリヌクレオチド化合物およびその合成に関するものである。ポリヌクレオチド化合物はプローブとして或いは薬剤として使用することができる。
【０００２】
【発明の背景】
ポリヌクレオチドプローブとのハイブリッド化は、標的ポリペプチドの存在を証明するための周知方法である。ハイブリッド化は、相補的塩基対の形成に基づいている。一本鎖ポリヌクレオチドプローブを一本鎖標的ポリヌクレオチドと共に溶液中で培養すると、相補的塩基配列が対となって二重鎖ハイブリッド分子を形成する。二重鎖ハイブリッド分子は、化学的もしくは物理的手段によって一本鎖ポリヌクレオチドプローブから分離することができる。たとえば、Ｍ．グルンスタインおよびＪ．ワリス、メソッズ・イン・エンチモロジー、第６８巻、Ｒ．Ｗ．Ｕ（編）、第３７９〜４６９頁（１９７９）；Ａ．Ｒ．デュンおよびＪ．サムブルック、メソッズ・イン・エンチモロジー、第６５巻、第１部、第４６８〜４７８頁（１９８０）；Ｄ．Ｃ．ワード、Ａ．Ａ．ワルドロップおよびＰ．Ｒ．ランガー、「改変ヌクレオチド並びにその製造および使用方法」と題するヨーロッパ特許公開第0,063879号（１９８２年１１月３日公開）；Ａ．Ｊ．ベリーおよびＪ．Ｂ．ピーター、ダイアグノスチック・メジスン「感染病に対するＤＮＡプローブ」（１９８４年３月）、第１〜８頁；並びにウィー・シング・リーおよびジェームス Ｌ．ベニングトン、組換えＤＮＡ技術「臨床微生物における用途」、ラボラトリー・マネージメント（１９８５年４月）、第２１〜２６頁を参照することができる。
【０００３】
一般に、プローブはポリヌクレオチド部分とこのポリヌクレオチドに結合した信号成分部分とからなっている。プローブのポリヌクレオチド部分は塩基対を形成する能力、すなわち興味ある配列もしくは標的ポリヌクレオチドに対しハイブリッド化する能力を有する。プローブの信号成分部分は、ハイブリッド化ポリヌクレオチドプローブの存在を証明しうる手段を有し、またはこの手段を生ぜしめる。たとえばこの手段は蛍光、燐光、クロモゲン、放射能もしくは電子密度とすることができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ポリヌクレオチドプローブを用いて標的ポリヌクレオチドを検出する方法は、一般にたとえば先ず最初に標的配列を含む二重鎖ポリヌクレオチドを試料から単離することによって行われる。二重鎖ポリヌクレオチドを制限エンドヌクレアーゼ切断により小断片まで切断してこれら断片をゲル電気泳動によって分離し、その後これらをゲルから支持体（たとえばニトロセルロース紙）へ移すことができる。或いは、二重鎖ポリヌクレオチドを何ら事前の酵素切断なしにニトロセルロースへ直接に固定することもできる。固定したポリヌクレオチドをポリヌクレオチドプローブ含有の溶液と接触させ、かつ支持体を約８０〜９０℃まで加熱してポリヌクレオチド二重鎖を変性させる〔二重鎖はアルカリによって変性させることもできる〕。かくして標的ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドプローブとの両者を含有するようになった試料を適当な温度まで冷却させ、その間にポリヌクレオチドプローブと標的ポリヌクレオチドとの間でハイブリッド化が生ずる。ハイブリッド化を完結させるための充分な時間（１０分間から数時間とすることができる）が経過した後、固定した標的ポリヌクレオチドを洗浄して未結合のポリヌクレオチドプローブを全部除去する。ポリヌクレオチドプローブの信号成分部分が、次いで放射能もしくは蛍光により直接的に或いは酵素反応で生成したクロモゲンによって間接的に検出される。
【０００５】
この方法の欠点は、標的ポリヌクレオチドの存在を証明するのに数工程を必要とすることである。すなわち、支持体に対する標的ポリヌクレオチドの固定と、ポリヌクレオチドプローブに対する標的ポリヌクレオチドの接触と、支持体からの未ハイブリッド化ポリヌクレオチド全体の除去とを必要とする。
【０００６】
最近、均質（すなわち１工程）の核酸ハイブリッド化分析により標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法が報告された。この方法は、第一および第二の両者とも感光性標識を含有する一本鎖ポリヌクレオチドを試料からの相補的一本鎖ポリヌクレオチド標的とハイブリッド化させて、これら第一および第二ポリヌクレオチドの感光性標識間で非放射性エネルギー移動を生ぜしめることからなっている。感光性標識の少なくとも一方は吸光／発光型であって、他方の感光性標識から吸収されたエネルギーを異なる波長で再放出する。これらの二次的発光は、第一および第二の一本鎖ポリヌクレオチドの両者が標的ポリヌクレオチドに対しハイブリッド化した場合にのみ生じうる。試料中の標的ポリヌクレオチドの量は、二次的発光量に関係する〔ミッシェル・ジェームス・ヘラーによる１９８３年１月２６日公開のヨーロッパ特許公開第0,070,685 号参照〕。
【０００７】
この方法の欠点は、２種の別個のポリヌクレオチドプローブを用いて標的ポリヌクレオチドの存在を検出する必要があることである。さらに、この方法は、化学発光触媒と、吸光／発光成分と、化学発光触媒の存在下で発光を生ぜしめるのに有効な化学発光試薬との存在を必要とする。さらに、感光性標識が末端ヌクレオチドの糖成分に結合されるため、ポリヌクレオチドプローブ１個当り標識を１個しか結合させ得ない。また、嵩張った標識は、これら標識に隣接した相補的塩基のハイブリッド化を妨げる。
【０００８】
最近、標的ポリヌクレオチドをプローブポリヌクレオチドにハイブリッド化させかつ得られたハイブリッドをこれらハイブリッドに結合するよう選択された固定化もしくは固定化しうる形態の抗体に対する結合によって固定化させるという方法が報告されている。その一具体例は、挿入デュプレックス用に選択した抗体の使用である。しかしながら、この方法は均質分析でない。さらに、挿入剤は標的に対するプローブのハイブリッド化に際し直接的には信号を発生しない。さらに挿入剤は、塩基対の形成に必要とされる位置におけるリンカアームなしに塩基へ直接に結合する〔Ｊ．Ｐ．アルバレラ等、１９８５年６月２６日公開のヨーロッパ特許出願第146,039 号参照〕。
【０００９】
ポリヌクレオチドに結合した蛍光性挿入成分が文献中に報告されている。これらは、たとえばクロルアセトアルデヒドのような二官能性試薬とアデニンもしくはシトシンとを反応させて芳香族三環式化合物を生成させることにより製造される〔Ｊ．Ｒ．バリオ、Ｊ．Ａ．セクリストIII およびＮ．Ｊ．レオナード、「蛍光性アデノシンおよびシチジン誘導体」（１９７２）、Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｓ．、第４６（２）巻、第５９７〜６０４頁、並びにＣ．Ｈ．リーおよびＪ．Ｇ．ウェトムア、「クロルアセトアルデヒド標識した蛍光性ＤＮＡの物理的研究」（１９７３）、Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｓ．第５０（３）巻、第８７９〜８８５頁参照〕。この方法は、蛍光成分に変化した塩基が塩基対を形成せず、したがって、この種の蛍光成分がハイブリッド化工程を不安定化させるという欠点を有する。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
標的ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド化合物とからなるハイブリッドの形成方法につき、好適ポリヌクレオチド化合物と共にここに開示する。これらのポリヌクレオチド化合物は、一本鎖もしくは二重鎖標的ポリヌクレオチドの存在を均質、すなわち１工程の分析で検出するため、或いは同質ポリヌクレオチドを標的二重鎖ポリヌクレオチドから競合的に排除させたりまたは標的一本鎖ポリヌクレオチドに対し安定結合させて標的ポリヌクレオチドの転写もしくは複製を防止するために使用することができる。
【００１１】
ポリヌクレオチド化合物は、ポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに対しリンカアームによって結合された少なくとも２種の成分とからなっている。このポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに対し塩基対を形成しまたはハイブリッド化することができる。標的ポリヌクレオチドに対しプローブのポリヌクレオチド部分がハイブリッド化すると、ポリヌクレオチド化合物もしくは標的ポリヌクレオチドまたはその両者における少なくとも１つの性質に変化が生じ、この変化が信号を構成する。変化する性質がポリヌクレオチド化合物の性質である場合、これはポリヌクレオチドの性質またはその成分の性質のいずれであってもよい。
【００１２】
ポリヌクレオチド化合物を使用して性質の変化により標的ポリヌクレオチドの存在を検出する場合には、ポリヌクレオチド化合物はポリヌクレオチドプローブとして作用する。ポリヌクレオチド化合物を使用して同質ポリヌクレオチドを二重鎖標的ポリヌクレオチドから排除させたり或いは一本鎖標的ポリヌクレオチドに対し安定結合させたりする場合には、ポリヌクレオチド化合物はポリヌクレオチド薬剤として作用する。
【００１３】
好適ポリヌクレオチド化合物は、構造式
【化２】
【００１４】
本発明の目的は均質分析により標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法を提供することであり、この分析法はポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合した少なくとも２種の成分とからなるポリヌクレオチドプローブを使用し、標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドのハイブリッド化自身に際しポリヌクレオチド化合物もしくは標的ポリヌクレオチドまたはその両者における少なくとも１つの性質に変化が生じ、この変化が信号を構成するものである。
【００１５】
本発明の他の目的は、二重鎖ポリヌクレオチドから同質ポリヌクレオチドを排除するためにポリヌクレオチド化合物を使用することによる標的ポリヌクレオチド野天社の防止方法を提供することであり、ポリヌクレオチド化合物はポリヌクレオチドと少なくとも２種の成分とからなり、これら成分はポリヌクレオチド化合物におけるポリヌクレオチド部分と標的ポリヌクレオチドとの結合を高めて、この結合が同質の排除されるポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとの結合力よりも大となるようにし、かくして標的ポリヌクレオチドの転写もしくは翻訳を防止する。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、ポリヌクレオチド化合物と標的ポリヌクレオチドとからなるハイブリッドを形成することによる標的ポリヌクレオチドの転写もしくは翻訳の防止方法を提供することであり、ポリヌクレオチド化合物はポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合された少なくとも２種の成分とからなり、これら成分はハイブリッドの安定性を高めてポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分が他の同質ポリヌクレオチドにより容易には排除され得ないようにし、かくして標的ポリヌクレオチドの転写もしくは翻訳を防止する。
【００１７】
さらに本発明の他の目的は、ポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合した少なくとも２種の放射線放出成分とからなるポリヌクレオチドプローブを使用する均質分析により標的ポリヌクレオチドの存在を均質分析で検出する方法を提供することであり、これら成分の放出エネルギーは標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分のハイブリッド化に際して変化し、この放射線エネルギーの変化が信号となる。
【００１８】
本発明のさらに他の目的は、ポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合した少なくとも２種の放射線放出成分とからなるポリヌクレオチドプローブを使用する均質分析により標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法を提供することであり、これら成分の放出エネルギーはポリヌクレオチドハイブリッド中への成分の挿入に際して変化し、これら放射線放出成分は標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分のハイブリッド化によって生成したハイブリッド中へのみ実質的に挿入され、放射線エネルギーの変化が信号となる。
【００１９】
本発明の他の目的は、ポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合した少なくとも２種の蛍光放出成分とからなるポリヌクレオチドプローブを使用する均質分析により標的ポリヌクレオチドの存在を均質分析で検出する方法を提供することであり、これら成分の放出蛍光エネルギーはポリヌクレオチドハイブリッド中へのこれら成分の挿入に際して変化し、これら蛍光放出成分は標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分のハイブリッド化により生成されたハイブリッド中へのみ実質的に挿入され、放射蛍光エネルギーの変化が信号となる。
【００２０】
さらに本発明の他の目的は、ポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合した少なくとも２種の蛍光放出成分とからなるポリヌクレオチド化合物を提供することであり、蛍光放出成分はポリヌクレオチドハイブリッド中への挿入に際して蛍光放出エネルギーの変化を示し、蛍光放出成分は標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド化合物のポリヌクレオチド部分のハイブリッド化によって生成されたハイブリッド中へのみ実質的に挿入される。
【００２１】
Ａ．ポリヌクレオチド化合物の一般的説明
本発明はポリヌクレオチド化合物の使用につき開示する。このポリヌクレオチド化合物は、ポリヌクレオチド部分とこのポリヌクレオチドに結合した少なくとも２種の成分部分とからなっている。これら成分は、他の約１０個のヌクレオチド成分よりなる部分によって互いに分離されたヌクレオチド成分に結合せねばならない。これは、ポリヌクレオチド部分に対し標的特異性を付与する。成分部分は、標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド化合物のポリヌクレオチド部分のハイブリッド化に際しポリヌクレオチド化合物または標的ポリヌクレオチドのいずれかにおける性質変化を生ぜしめうる特徴を有する。ポリヌクレオチド化合物における性質変化は、ポリヌクレオチド部分に生じても成分部分に生じてもよい。
【００２２】
この性質変化は２つの方法で利用することができる。１つの方法は、この性質変化を監視して標的ポリヌクレオチドの存在を検出するものである。この場合、ポリヌクレオチド化合物はポリヌクレオチドプローブとして使用される。第二の方法は、この性質変化を利用してポリヌクレオチド化合物のポリヌクレオチド部分に同質性であるポリヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドから排除させたり、或いはポリヌクレオチド化合物のポリヌクレオチド部分を標的ポリヌクレオチドへ安定結合させたりするものである。この場合、ポリヌクレオチド化合物はポリヌクレオチド薬剤として使用される。
【００２３】
Ｂ．ポリヌクレオチドプローブの説明
１．一般的説明
本発明は、ポリヌクレオチド化合物をポリヌクレオチドプローブとして使用することにより標的ポリヌクレオチドの存在を均質もしくは１工程の分析で検出することを可能にする。ポリヌクレオチドプローブは、ポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合した少なくとも２種の成分とからなっている。この成分は、標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分のハイブリッド化に際し、ポリヌクレオチドプローブもしくは標的ポリヌクレオチドまたはその両者のいずれかにおける検出自在な変化を生ぜしめうる特徴を有する。ポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分と標的ポリヌクレオチドとの間のハイブリッド化が実際に生じなければ、性質変化も発生しない。すなわち、これらの成分は１工程での標的ポリヌクレオチドの検出を可能にする。試料から未結合ポリヌクレオチドプローブを除去する追加工程は、標的ポリヌクレオチドの存在につき証明する前に、必要とされない。
【００２４】
たとえば成分の特徴は、ポリヌクレオチドプローブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッドに関し所定の配向もしくは配置を取りうる能力とすることができる。性質変化はたとえば放射線放出、分子分散力の相互作用または浮力密度とすることができる。放射線放出の変化は成分の可視、紫外、赤外、蛍光、燐光、Ｘ線もしくはγ線スペクトルにおける変化を包含する。分子分散力の相互作用における変化は、ポリヌクレオチドプローブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッドの溶融温度変化を包含する。
【００２５】
成分は任意の長さ、寸法および形状とすることができる。これは、特定の特徴を付与するのに必要でないアルキルもしくは芳香族断片を結合することができる。好ましくは、この成分はリンカアームを含むヌクレオチドがポリヌクレオチド中に組込まれた後にリンカアームに結合される。すなわち、この成分は所望の塩基配列が形成された後に結合される。何故なら、この成分は一般に嵩高分子であって、ヌクレオチドをポリメラーゼ酵素に対し貧弱な基質にするからである。さらに、この成分はポリメラーゼ酵素の阻止剤にもなりうる。
【００２６】
２．一成分の説明
上記要件を満たす１種の成分は挿入剤（intercalating agent ）である。挿入剤は、二重鎖ポリヌクレオチドの存在下で二重鎖中の２個の隣接塩基対の間に位置してこれら二重鎖の塩基対と相互作用しうる物質である。ハイブリッドはＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡとすることができる。挿入剤の特徴は、ポリヌクレオチドハイブリッド中へ侵入しうる能力である。
【００２７】
一般に、挿入剤は芳香族染料である。これらの挿入用芳香族染料は面状環構造を有しかつ明確な蛍光放出スペクトルを有する。蛍光は挿入剤の電子デローカリゼーションを示し、染料に結合した置換基の誘発作用と停止剤とによって影響される。
【００２８】
芳香族染料を水溶液もしくは水性／有機溶液に溶解させると、この溶液中の水は染料が有機媒体中に存在する場合よりも高いレベルまで芳香族染料の基礎エネルギー状態を高めることにより溶解芳香族染料の蛍光性を顕著に停止させると思われる。芳香族染料がポリヌクレオチドハイブリッド中に侵入すると、染料は水から遮閉される。何故なら、ハイブリッドは比較的疎水性の内部（塩基）と親水性の外部（燐酸）とを有するからである。かくして、水はハイブリッドの外部で凝集し、内部では凝集しない。挿入染料の蛍光放出はもはや水によって停止されないので、基礎エネルギー状態が低エネルギーレベルまで変化し、その結果最大蛍光放出は長波長へ移動する。挿入の際の染料の蛍光強度は何倍にも高められる。蛍光放出およびその強度におけるこの変化は、したがって標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分のハイブリッド化に際してのみ成分に生ずる性質変化である。
【００２９】
ポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合した少なくとも１種の挿入芳香族染料とからなる一本鎖ポリヌクレオチドプローブは、かくして標的ポリヌクレオチドの均質もしくは１工程の検出を可能にする。標的ポリヌクレオチドに対しこのポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分がハイブリッド化してプローブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成する際、芳香族染料は積層塩基対の間に形成されたプローブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッドの溝部に侵入する。この侵入は、挿入剤の蛍光放出性およびその強度における変化をもたらす。ポリヌクレオチドプローブにおけるポリヌクレオチド部分が試料中の標的ポリヌクレオチドに対し実際にハイブリッド化した場合にのみ蛍光におけるこの変化が生ずるので、未結合のポリヌクレオチドプローブを試料から除去するための追加工程は必要とされない。かくして、試料の蛍光スペクトルを簡便に測定することにより、ハイブリッド化が生じたかどうかを決定しかつ標的ポリヌクレオチドの存在を検出することができる。ポリヌクレオチドハイブリッド中に侵入してこの侵入に際し蛍光放出の変化を受け得る任意の蛍光性芳香族染料が本発明に適している。適する芳香族染料の例は、限定はしないがフェナンスリジン、アクリジンおよびアンスラサイリンを包含する。フェナンスリジンの例は、限定はしないがエチジウム、プロピジウム、ブチジウム、ペルチジウム、ジミジウムおよびフェニジウムを包含する。
【００３０】
３．ポリヌクレオチドの説明
ポリヌクレオチドプローブにおけるポリヌクレオチド部分は、プローブに対し特異性を付与する少なくとも約１２個の塩基で構成すべきである。標的ポリヌクレオチドに対し実質的に相補的であるポリヌクレオチドの作成方法は当業界で周知されている。最も一般的に使用されている方法は組換えＤＮＡおよびクローン化技術である。広く使用されるクローンの１種はＭ１３ファージである。要するに、この方法は（１）Ｍ１３ＲＦ（複製型）ＤＮＡをクローン化領域に独特の識別部位を有する制限酵素の１種で切断し、（２）所望のポリヌクレオチドを切断挿入部位に結合させ、（３）イー・コリ宿主細胞を形質転換させ、（４）これら宿主細胞を栄養分含有プレートで増殖させると共に無色プラークを選択し、（５）単一のプラークからのファージを小培養で増大させ、（６）培養上澄駅からファージを収穫すると共にフェノールでの処理により蛋白コートを除去し、かつ（７）精製ＤＮＡをエタノールで沈澱させることからなっている。より詳細にはアメルシャム・コーポレーション社により出版された「Ｍ１３クローン化および配列決定ハンドブック」（１９８３）並びにコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリース社により出版されたＴ．マニアチス、Ｅ．Ｆ．フリッチおよびＪ．サムブルックによる「モレキュラクローニング」（１９８２）を参照することができる。
【００３１】
さらに特異性ポリヌクレオチドは、たとえばアプライド・バイオシステムス社（８５０リンカン・センター・ドライブ、フォスターシティー、カリホルニヤ９４４０４在）により製作されるようなＤＮＡ合成装置により適当なヌクレオチド先駆体を用いて製造することもできる。製造業者によれば、特異性の大きい約１２０〜２００塩基よりなるポリヌクレオチドを製造することができる。合成方式は、ホウホルアミダイトを使用して所定の塩基を結合させることを含んでいる。ポリヌクレオチド合成装置の他の製造業者には、バイオサーチ・インコーポレーション社（２９８０ケルナー・ブールバード、サン・ラファエル、カリホルニヤ９４９０１在）およびベックマン・インスツルメント社（１０５０ページ・ミル・ロード、パロ・アルト、カルホルニヤ９４３０４在）がある。
【００３２】
末端位置にリンカアームもしくは成分を含むポリヌクレオチドは、酵素ＲＮＡリガーゼおよびリンカアームもしくは成分がＣもしくはＵに結合されている化合物ｐＣｐもしくはｐＵｐを用いて製造することもできる。これらポリヌクレオチドはニックトランスレーションにより生成させることはできない。何故なら、本発明においてポリヌクレオチドプローブは一本鎖でなければならないからである。
【００３３】
４．ポリヌクレオチドプローブの形態
これら成分は、ポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分が標的ポリヌクレオチドとハイブリッド化した場合にのみ性質変化を生じうるものでなければならない。これら成分は、ハイブリッドストランドの一方がポリヌクレオチド標的のストランドでないようなハイブリッドでは性質変化を生じてはならない。さらに、ポリヌクレオチドプローブにおけるポリヌクレオチド部分がハイブリッド化する標的ポリヌクレオチドは、試料から生ずるものでなければならない。すなわち、ポリヌクレオチドプローブは、標的ポリヌクレオチドが一本鎖型でのみ存在する試料に供給せねばならない。ポリヌクレオチドプローブが二重鎖ハイブリッドとして試料に供給されかつ次いで試料中で変性されると、このポリヌクレオチドプローブが最初からハイブリッド化しているポリヌクレオチドに対しハイブリッド化する際に性質変化を生ずる。これは、間違った結果をもたらすであろう。
【００３４】
ポリヌクレオチドプローブは、一体的ストランドであることが好ましい。すなわち、成分もしくはポリヌクレオチドの性質変化は、二本のストランドのみがハイブリッド化する際に成分によって生ぜねばならない。これは、１個のみのポリヌクレオチドプローブ分子による標的ポリヌクレオチドの検出を可能にする。しかしながら、ポリヌクレオチドプローブが２本の異なるポリヌクレオチドストランドからなる場合もある。たとえば、これは各ポリヌクレオチドストランドが異なる成分を含有しかつ２本のポリヌクレオチドストランドが標的ポリヌクレオチドにおける重なりのない隣接配列にハイブリッド化する場合である。各ストランドの成分は性質変化を生じえないが、これら成分全部が一緒になってハイブリッド化に際し性質変化を生ぜしめる。このような状態も本発明に包含される。
【００３５】
５．リンカアームの説明
成分は、この成分とポリヌクレオチドとの間に最小の立体干渉が生ずるようにかつ成分が自由に移動してポリヌクレオチドプローブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッドに関し適切な配向もしくは配列を達成しうるように、リンカアームによってポリヌクレオチドに結合される。このリンカアームは、ポリヌクレオチド部分に対し成分部分を結合させるポリヌクレオチドプローブにおける断片を意味する。成分における特徴の存在に対し必須でない或いは天然ヌクレオチドの１部でないこの断片における全ての原子が、リンカアームの１部である。
【００３６】
リンカアームおよび／または成分は、標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのハイブリッド化を実質的に妨げてはならない。したがって、リンカアームおよび／または成分は、（ａ）これが結合している塩基が相補的塩基に対し対を形成するのを妨げてはならず、（ｂ）相補的塩基の錯体化を妨げて標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのハイブリッド化を妨げてはならず、（ｃ）ポリヌクレオチド配列の末端位置でなければストランド延長を妨げてはならず、かつ（ｄ）好ましくはポリヌクレオチドにおける糖成分の構成を変化させてはならない。
【００３７】
リンカアームは一般にポリヌクレオチドに対し共有結合される。この結合は、好ましくは塩基成分に対して行なわれるが、糖部分または燐酸部分に対して行なわれてもよい。塩基部分はプリンもしくはピリミジンのいずれかとすることができる。上記したように、塩基部分に対するリンカアームの結合は、好ましくはリンカアームが塩基のワトソン−クリック対形成を妨げないような位置とすべきである。適する位置は、たとえばウラシルの位置５および６、シトシンの位置５および６並びに環外４−アミノ、デアザプリンの位置７および８、グアニンの位置８、並びにアデニンの位置８および環外６−アミノである。これらの位置に置換基を有する塩基は、したがってこれらの位置に対するリンカアームの結合には好適でない。塩基部分に対する結合に好適なリンカアームはアリルアミンである〔デビット・ワード等による１９８２年１１月３日公開のヨーロッパ特許公開第0,063,879 号参照、これを参考のためにここに引用する〕。
【００３８】
塩基に対する好適位置はピリミジンの位置５および６、並びにデアザプリンの位置７である。何故なら、８−プリンヌクレオチドはポリメラーゼ酵素に対し貧弱な基質であり、かつアデニンもしくはシトシンの環外アミノ基がチミンおよびウラシルに対し或いはグアニンに対しそれぞれ塩基対の形成に関与するからである。塩基の環外アミノ基における置換基はこの塩基がその相補的塩基に対し対形成するのを妨げないが、この置換基はこれら２種の塩基間における最適な配向を変化させる。好適ピリミジンはウラシルおよびシトシンであり、好適位置は５である。好適プリンはデアザアデニンおよびデアザグアニンである。
【００３９】
リンカアームを塩基部分に結合させるのに使用しうる条件には殆んど制約がない。すなわち、塩基に対する官能基が、この塩基をその相補的塩基に対する対形成から妨げられない程度まで改変されない限りかつ塩基部分が糖成分から切断されない限り、任意のｐＨ範囲、温度範囲、反応時間、溶剤または緩衝液を使用することができる。最適条件はリンカアームおよび塩基の種類に依存し、かつ当業者により容易に決定することができる。
【００４０】
塩基に結合されたリンカアームは、塩基と成分とに結合された原子群を含む。リンカアームは、幾つかの方法により塩基部分に結合させることができ、塩基に結合させうる手段となる第１官能基を持たねばならない。さらにリンカアームは、成分に結合させうる手段となる第２官能基を持たねばならない。このリンカアームは炭素−炭素単一結合、炭素−炭素二重結合、炭素−窒素単一結合、炭素−窒素二重結合、炭素−炭素三重結合、炭素−酸素単一結合、炭素−硫黄単一結合または炭素−珪素単一結合によって塩基もしくは成分に結合することができる。適する官能基は、限定はしないがカルボン酸エステル、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸チオエステル、イミド、イミン、ケトン、アルデヒド、エポキシド、ハロゲン化物、ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミデート、無水物、イソシアネート、イソチオシアネートおよびチオエステルを包含する。
【００４１】
塩基部分に結合されたリンカアームは塩基に対しα位置にオレフィン性結合を含むのが好適である。この種のαオレフィン性結合の存在はリンカアームを塩基から立体的に離間保持する作用を果たし、したがってハイブリッド化工程に対するリンカアームの干渉および／または成分の干渉を最小化させる。
【００４２】
リンカアームは、１断片として塩基に結合する必要はない。リンカアームは、第１断片を塩基に結合させ、次いで第２断片を第１断片に結合させて作成することができる。適する第１断片の例は、
【００４３】
【化３】
【００４４】
【化４】
【００４５】
リンカアームを塩基に結合させる一般的方法はＪ．Ｌ．ルスおよびＤ．Ｅ．ベルクシュトローム、ジャーナル・オーガニック・ケミストリー、第４３巻、第２８７０頁（１９７８）；Ｄ．Ｅ．ベルクシュトロームおよびＭ．Ｋ．オガワ、ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティー、第１００巻、第８１０６頁（１９７８）；並びにＣ．Ｆ．ビゲ、Ｐ．カラリチス、Ｊ．Ｒ．デックおよびＭ．Ｐ．メルテス、ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティー、第１０２巻、第２０３３頁（１９８０）に記載されている。１つの好適方法は、デビッドＣ．ワード等による１９８２年１１月３日公開のヨーロッパ特許出願第0,063,879 号明細書に詳細に開示されており、これを参考のためにここに引用する。この方法は、αビニル基を有するリンカアームまたはリンカアーム断片をＫ2 ＰｄＣｌ4 の存在下で水銀化塩基と反応させることからなり、水銀はＨｇ+ としてリンカアームと反応させるべき塩基の位置に結合する。この過程を下記に示す。
【００４６】
【化５】
リンカアームについては、特定の寸法または含有量の制限がない。リンカアームは、芳香族染料をポリヌクレオチドプローブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッド中に挿入させうるが芳香族染料を他のストランド中へは挿入させない限り、約２個乃至任意の個数の炭素を含むことができる。リンカアームは、異原子および不飽和を有することもできる。リンカアームは脂肪族、脂環式もしくは芳香族部分を含むことができる。リンカアームの実際の寸法もしくは含有量は、選択する成分並びに標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分のハイブリッド化に際し性質変化を生ぜしめる方法に依存する。
【００４８】
ポリヌクレオチド配列の糖部分に対するリンカアームの結合は所定の塩基におけるプリン除去もしくはピリミジン除去に従う１’アルデヒドに対するシッフ塩基の手段とすることができ、或いは糖がリボースである場合には２’ヒドロキシに対する手段とすることもできる。１’アルデヒドに対し結合するリンカアームはたとえばアミン、ヒドラジンもしくはヒドラジド官能性とすることができる。この種の方法は、ジャニス・スタブリアノプロスによる１９８５年８月１３日出願の本出願人による米国特許出願第06/765,288 号明細書に開示されており、これを参考のためにここに引用する。燐酸部分に対するリンカアームの結合は、燐酸部分のアルキル化によって行うことができる。〔Ｐ．Ｏ．ＰツオおよびＰ．Ｓ．ミラーによる米国特許第4,469,863 号を参照することができ、これを参考のためにここに引用する〕。
【００４９】
リンカアームが塩基部分に結合される場合、好ましくはこれをヌクレオシドもしくはヌクレオチドレベルで塩基に結合させる。何故なら、リンカアームを塩基に結合させるのに必要とされる反応条件は、ポリヌクレオチドに対し望ましくない副反応を生ぜしめるからである。さらに、ポリヌクレオチドレベルにおける結合は、一定でなくかつ再現性のない収率を与える。ヌクレオシドもしくはヌクレオチドレベルにおける結合は、改変ヌクレオシドもしくはヌクレオチドを最初に精製しかつ次いでポリヌクレオチド中へ組込むことを可能にする。この組込みは、たとえばＭ１３ベクターにおけるクローン化によって、或いは上記ポリヌクレオチド合成装置での合成によって行うことができる。
【００５０】
さらに、改変ヌクレオチドは一般に検討されている核酸ポリメラーゼに対し比較的効率的な基質となることが好ましい。何故なら、改変ヌクレオチドをポリヌクレオチド中へ組込む最も効率的な方法は核酸ポリメラーゼによるものであるからである。すなわち、リンカアームは酵素の活性部位を立体的に妨げてはならず、或いは改変ヌクレオチドの相補的塩基対形成を妨げてはならない。通常の「アンチ」ヌクレオシド構成を変化させる位置における置換も回避すべきである。何故なら、このような構成変化は一般に改変ヌクレオチドをポリメラーゼ酵素に対し貧弱な基質にするからである。
【００５１】
リンカアームが糖の１’アルデヒドに結合される場合、このリンカアームはポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分が生成された後に結合されねばならない。何故なら、糖の結合は、この糖の１−位置に遊離アルデヒドを必要とするからである。遊離アルデヒドは、プリン除去またはピリミジン除去によって生成される。塩基を含まない糖と燐酸とからなる部分はポリメラーゼ酵素に対する基質とならない。すなわち、リンカアームは、先ず最初に所望のポリヌクレオチド配列を選択的にプリン除去しもしくはピリミジン除去し、次いでアルデヒドによってリンカアームを糖に結合させることにより結合させねばならない。リンカアームが糖リボースの２’ヒドロキシに結合される場合、このリンカアームはヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドレベルで結合することができる。何故なら、改変ヌクレオチドは遺伝子合成装置によってポリヌクレオチド中へ組込みうるからである。リンカアームが燐酸に結合される場合、このリンカアームは結合が燐酸以外の位置で生じないようヌクレオシドもしくはヌクレオチドレベルで結合せねばならない。
【００５２】
６．成分の結合
成分は、たとえば任意の上記官能基によってリンカアームに共有結合することができる。１例は、成分におけるアミノ、チオもしくはオキソ基とリンカアームにおける他の官能基、たとえばイソチオシアネート、エポキシド、カルボジイミド、無水カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸塩化物、カルボン酸、チオエステル、イミン、ハロゲン、ケトンもしくはアルデヒドとの反応である。
【００５３】
さらに成分は、たとえばリンカアームおよび成分に結合したキレート生成剤によってリンカアームへ非共有結合させることもできる。配位金属は、成分とリンカアームとを挟持して錯体を形成することができる。好適キレート生成剤は、限定はしないがエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン−ペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）およびトランス−ジアミノシクロヘキサン−テトラ酢酸（ＤＣＴＡ）を包含する。好適金属は各種の遷移金属、特にランタニド金属を包含する。リンカアームに対する芳香族染料の非共有結合は、この分析が標的ポリヌクレオチドを包含する試料に対するポリヌクレオチドプローブの添加後に多くの工程を含まない１工程で行なわれるため、共有結合ほど安定でも強固でもないが、静電吸引力が性質変化を生ぜしめるのに充分な結合教祖を与えるであろう。これは、成分が芳香族染料でありかつ性質変化には挿入工程のみが必要とされる場合である。ここで、形成されたポリヌクレオチドプローブ／標的ハイブリッド中への芳香族染料の挿入は蛍光放出における変化をもたらして、標的ポリヌクレオチドの存在を証明することができる。
【００５４】
種々異なる条件を用いて挿入芳香族染料成分をリンカアームに結合させることができる。一般に、約４〜約１０、好ましくは約５〜約８のｐＨ範囲、約２０〜約１００℃、好ましくは約４０〜約６５℃の温度、任意の溶剤および任意の緩衝剤もしくは触媒を使用することができ、ただしｐＨ、温度、溶剤もしくは緩衝剤はポリヌクレオチドの全ての基もしくは成分を変化させないものとする。たとえば、ポリヌクレオチドをプリン除去しもしくは脱アミノしうるような試薬もしくは条件は避けるべきである。さらに反応時間についても殆んど制限がない。リンカアームに芳香族染料を結合させるための最適ｐＨ、温度、溶剤もしくは反応時間は、反応させるべきリンカアームと芳香族染料と官能性とに依存する。これらの条件は、当業者により容易に決定することができる。
【００５５】
大抵の挿入用芳香族蛍光染料は、水に対し可溶性でなく、したがってポリヌクレオチドのリンカアームに対する芳香族染料の結合はたとえば水とエタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、プロパノール、選択エーテル、エステル、ケトン、アミド、グリセリン、アセトン、ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドまたはヘキサメチルホスホルアミドとの混合物のような混和性の混成溶剤系を必要とする。或いは、芳香族染料が有機溶剤に溶解しかつポリヌクレオチドが水性溶媒に溶解するような不混和性の二相溶剤系を使用することもできる。この場合、２種の溶剤系を絶えず混合して、ポリヌクレオチドを芳香族染料と反応しうるように接触させねばならない。反応の後、ポリヌクレオチドプローブは、一般に水溶液に存在する一方、芳香族染料は有機溶液中に残留する。
【００５６】
これら反応に必要とされる反応体の化学量論量は、大幅に変化することができる。一般に、より容易に製造される成分の過剰量を、ポリヌクレオチドに対する芳香族染料の結合に使用する。実用上、これらの量は必要とされる反応条件、芳香族染料、リンカアームおよびその反応性官能基に応じて変化する。
【００５７】
一般に、挿入芳香族染料は、リンカアームを含有するヌクレオチドがポリヌクレオチド中に組込まれた後にリンカアームに結合させねばならない。何故なら、大抵の挿入芳香族染料はポリヌクレオチド合成を阻害し、したがって芳香族挿入剤が結合しているヌクレオチドがポリヌクレオチド中へ組込まれるのを妨げるからである。
【００５８】
７．成分の個数
ポリヌクレオチドプローブは２個の成分または３個以上の成分で構成することができる。これら成分は、ポリヌクレオチドプローブの末端位置または非末端位置に結合することができる。これら成分は、約１０個のヌクレオチドよりなる部分によって互いに分離されたヌクレオチドに結合して、プローブに対し特異性を付与せねばならない。成分の個数が多い程、ポリヌクレオチドプローブの感受性が大となる。しかしながら、これら成分は、標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブにおけるポリヌクレオチド部分の有効ハイブリッド化が実質的に妨げられるような個数で存在させてはならない。結合させうる成分の個数は、成分がポリヌクレオチドに結合される部分およびポリヌクレオチドの長さに依存する。
【００５９】
特定の塩基部分に結合する成分は、ポリヌクレオチドプローブ中に存在する塩基部分の個数以下に制限される。糖部分に結合される成分は、標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのハイブリッド化を妨げないような個数制限される。何故なら、この場合、各成分は塩基対の形成に使用されるプローブポリヌクレオチドにおける塩基の個数を減少させるからである。燐酸部分に結合される成分は、糖部分および塩基部分の配列を乱さないような個数に制限される。ヌクレオチド４個当り１個以下の成分をポリヌクレオチドプローブに結合されるのが好ましい。
【００６０】
成分が挿入剤である場合、リンカアームは挿入剤に対し自由な移動を付与するのに充分な長さとしかつ充分な融通性を持たねばならず、内方向に折れ曲がりかつ形成されたポリヌクレオチドプローブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッド中に侵入しうるようにする。塩基の１つの位置に結合するのに適したリンカアームは、同じ塩基の他の位置もしくは他の塩基の任意の位置に結合するには適せず、或いは糖もしくは燐酸における位置に結合するには適さないと理解される。たとえば、ヌクレオチドの好適配列は、「アンチ」配列であるため、たとえば燐酸基に結合される成分はたとえばウリジンの５−位置に結合されるものよりも長いリンカアームを必要とする。同様に、２個の環で構成されたプリンに結合されるリンカアームは、１個のみの環で構成されたピリミジンに結合されるリンカアームよりも長いリンカアームを必要とする。
【００６１】
８．挿入剤における性質変化の検出
芳香族染料である挿入剤は、一般に「成分の説明」の項目で上記したように、その蛍光放出の変化によって検出することができる。しかしながら、挿入剤は標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分のハイブリッド化に際し二重鎖もしくはデュプレックスのＴM （すなわち溶融温度）の変化を生ぜしめるので、これら挿入剤の蛍光特性を利用する必要はない。溶融温度とは、ポリヌクレオチド二重鎖が変性される温度を意味する。変性は対形成した塩基間の水素結合の破壊を必要とし、かつ変性温度はＧ−Ｃ結合がＡ−Ｔ結合よりも強固であるためストランドの塩基含有量に依存する。
【００６２】
二重鎖における挿入剤の存在はここのストランド間の相互作用を増強する結果、ストランドを変性させるのに要する温度が著しく高くなる。溶融温度を上昇させる程度は、特定の挿入剤の種類およびその量に依存する。たとえば、１０個の塩基対当り１種のフェナンスリジン挿入剤を含むポリＡ．ポリＴのポリヌクレオチドハイブリッドは、このハイブリッドの溶融温度を約２５℃上昇させることが実験的に判明した。
【００６３】
したがって、成分が非蛍光性挿入剤であるようなポリヌクレオチドプローブを使用することができる。標的ポリヌクレオチドを含む試料をポリヌクレオチドプローブと混合し、かつ充分な反応時間後にポリヌクレオチドを沈澱させることができる。次いで、沈澱物を溶液中に溶解させ、この溶液を加熱しかつＵＶ吸収（高色素性）の増加が生ずるような温度を監視することができる。この温度は、ＴM を示す。試料を加熱した際に一方の経過が通常のＴM となりかつ第２の経過がそれより高いＴM となるような２つのＴM 経過が得られれば、標的ポリヌクレオチドの存在が証明される。
【００６４】
性質の変化は一般に装置によって検出されるが、或る場合には肉眼検出も可能である。装置の例は、ミネラルランプおよび蛍光測定器である。或る種の性質変化は、標的ポリヌクレオチドを含む試料に対するポリヌクレオチド試料の添加後に不利な追加実験を行なうことなく装置によって検出することができる。他の性質変化は、標的ポリヌクレオチドを含む試料に対しポリヌクレオチドプローブを添加した後にさらに実験操作を加えて検出することができる。しかしながら、他の実験操作が必要であるかないかとは関係なく、標的ポリヌクレオチドの存在を証明する前に未結合のポリヌクレオチドプローブを試料から分離する必要はない。
【００６５】
前者の１例は、成分（たとえば挿入剤）が溶液中の標的ポリヌクレオチドに対しポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分をハイブリッド化させた際に蛍光放出スペクトルの変化を生ずる場合である。この場合、標的ポリヌクレオチドを含む試料に対しポリヌクレオチドプローブを添加した後に実験操作は必要とされない。溶液の蛍光は蛍光測定装置で測定することができ、蛍光放出の変化は標的ポリヌクレオチドの存在を示している。他の例は、成分（たとえば挿入剤）が溶液中の標的ポリヌクレオチドに対しポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分をハイブリッド化させた際にポリヌクレオチドハイブリッドの溶融温度を変化させる場合である。加熱部材を有するＵＶ分光光度計にて溶液のＵＶ吸収を測定しかつ高色素変化が生ずる温度を決定するだけでよい。いずれの場合にも測定されるのは性質変化であるため、初期の高いバックグランドは検出工程を実質的に妨げない。
【００６６】
後者の例は、成分（たとえば挿入剤）が溶液中の標的ポリヌクレオチドに対しポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分をハイブリッド化させた際にポリヌクレオチドの三次構造の変化によるポリヌクレオチドハイブリッドの浮力密度の変化を生ぜしめる場合である。この場合には、たとえば塩化セシウム中で溶液を最初に遠心分離した後に溶液の密度およびＵＶ測定を行なわねばならないので、他の実験操作が必要となる。
【００６７】
発生する性質変化は、ポリヌクレオチドプローブであっても標的ポリヌクレオチドであってもよい。性質変化がポリヌクレオチドプローブで生ずる場合、この変化はポリヌクレオチドプローブの成分部分であっても或いはポリヌクレオチドプローブにおけるポリヌクレオチド部分であってもよい。変化がポリヌクレオチドプローブで発生する例は、蛍光性挿入剤がポリヌクレオチドプローブの末端位置に存在しないヌクレオチドに結合する場合である。挿入剤は、標的ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドプローブにおけるポリヌクレオチド部分とのハイブリッド化によって形成したハイブリッド中に侵入する。この場合、変化する性質はポリヌクレオチドプローブにおける成分部分の蛍光放出である。
【００６８】
変化が標的ポリヌクレオチドで発生する例は、非蛍光性挿入剤が末端ヌクレオチドに結合する場合である。挿入剤はリンカアームに結合し、これにより隣接ハイブリッド（すなわち標的ポリヌクレオチドと隣接する相補的ポリヌクレオチド（このポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドプローブのものではない）とからなるハイブリッド）に侵入することができる。この場合、挿入剤はハイブリッドのＴM を上昇させるが、プローブと標的とからなるハイブリッドのＴM を上昇させない。しかしながら、挿入剤を隣接するハイブリッド中へ侵入させ、したがって隣接するハイブリッドのＴM を上昇させるのは、標的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分のハイブリッド化である。したがってＴM における上昇はハイブリッドの存在を証明する。この場合、変化する性質は、標的ポリヌクレオチドと隣接する相補的ポリヌクレオチドとの間の熱力学的相互作用である。
【００６９】
９．標的ポリヌクレオチドの検出方法
蛍光性芳香族染料が成分であるようなポリヌクレオチドプローブを使用する本発明の方法は、たとえば溶液中に標的ポリヌクレオチドを含む試料を溶解させて標的ポリヌクレオチドを溶液中に放出させ、標的ポリヌクレオチドを包囲膜から放出させて行うことができる。溶解は、たとえば試料を音波或いは洗剤に露出して行うことができる。ポリヌクレオチドは遠心分離によって細胞残骸から分離することができ、かつアルコール沈澱または透析によってさらに精製することができる。次いで、ポリヌクレオチドプローブを標的ポリヌクレオチドを含有する溶液に添加し、かつこの溶液を約２０〜約１００℃の温度にて約１０分間〜約２４時間培養する。温度が高い程ハイブリッド化に要する時間が短縮することが認められる。次いで、この溶液を蛍光測定器に入れて蛍光放出を測定する。芳香族染料が挿入されていない場合に得られるスペクトルからの芳香族染料における蛍光放出スペクトルの変化が、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示す。
【００７０】
一般に、標的ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドプローブにおけるポリヌクレオチド部分とハイブリッド化させる前にハイブリッド化工程にて一本鎖型にせねばならない。これは熱もしくはアルカリのいずれかで行うことができる。しかしながら、ポリヌクレオチドプローブの成分が挿入剤である場合、標的ポリヌクレオチドは一本鎖もしくは二重鎖のいずれで存在させてもよい。標的ポリヌクレオチドが二重鎖型である場合、ポリヌクレオチドプローブにおけるポリヌクレオチド部分は、標的ポリヌクレオチドから同質ストランドを排除してポリヌクレオチドプローブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成する。
【００７１】
標的ポリヌクレオチドを含む二重鎖を最初に変性させることなくこの特定のポリヌクレオチドプローブを使用しうる理由は、ストランドの一方が挿入剤からなる二重鎖に対し挿入剤が向上した安定性を付与するためと思われる。説明のため二重鎖がストランド「Ａ」および「Ｂ」（ここでストランド「Ａ」は標的ポリヌクレオチドを構成する）で構成されると仮定する。さらに、ポリヌクレオチドプローブがストランド「Ａ」における標的ポリヌクレオチドに対し相補的なポリヌクレオチド部分（ストランド「Ｃ」）と、２個の挿入剤成分とで構成されると仮定する。さらに、ストランド「Ｄ」がストランド「Ａ」における標的ポリヌクレオチドに対し相補的であると仮定する。
【００７２】
ポリヌクレオチド二重鎖、すなわちハイブリッドは所定間隔で部分的に開口していることが知られている。しかしながら、ストランド「Ｄ」は一般に二重鎖のＴM より低い温度ではストランド「Ｂ」を排除することができない。何故なら、ストランド「Ａ」と「Ｄ」との間の熱力学的相互作用はストランド「Ａ」と「Ｂ」との間の熱力学的相互作用よりも大きくないからである。ストランド「Ａ」および「Ｂ」が部分的に分離しかつストランド「Ｄ」がストランド「Ａ」に対し対形成を開始する静止期間でさえ、この塩基対形成は極く短時間となる。殆んどの部分がストランド「Ａ」にハイブリッド化したストランド「Ｂ」は、ストランド「Ｄ」を急速に排除する。ストランド「Ｄ」は、ストランド「Ａ」からストランド「Ｂ」を切除してストランド「Ａ」と「Ｄ」とからなる二重鎖を形成することができない。
【００７３】
しかしながら、挿入剤が結合されているストランド「Ｃ」における塩基がストランド「Ａ」における相補的塩基に対し静止期間中に対形成すると仮定する。これが生ずると、塩基に結合した挿入剤は隣接する塩基対に侵入する。他方の挿入剤が結合しているストランド「Ｃ」における塩基が次いでその相補的塩基に対し対形成し、かつこの塩基に結合した挿入剤も隣接する塩基対に侵入する。その結果、ポリヌクレオチドプローブのおけるポリヌクレオチド部分の２個の塩基は標的ポリヌクレオチドの塩基に対し対形成して安定性を高める。これら塩基間における残余の塩基が次いでその相補的塩基に対形成する。ストランド「Ｃ」の挿入剤は、ストランド「Ａ」の塩基に対形成したストランド「Ｂ」の塩基と比較して、ストランド「Ａ」の塩基に対形成したストランド「Ｃ」の塩基の間に一層大きい熱力学的安定性を付与する。たとえば、臭化エチジウムはポリヌクレオチド二重鎖の溶融温度を約２５℃上昇させる〔Ｕ．Ｂ．レペックおよびＣ．パオレッチ、Ｊ．Ｍ．Ｂ．、第２７巻（１９６７）、第８７〜１０６頁参照〕。ストランド「Ｂ」はもはやストランド「Ｃ」をストランド「Ａ」から排除することができない。その結果、ストランド「Ａ」に予めハイブリッド化したストランド「Ｂ」の１部は、ストランド「Ａ」と「Ｃ」とからなる二重鎖部分でなく、ストランド「Ａ」から永久的に切除され続ける。かくして、この一本鎖ポリヌクレオチドプローブは、標的ポリヌクレオチドが一本鎖型で存在しない場合にも試料中における標的ポリヌクレオチドの検出を可能にする。
【００７４】
さらに、この方法を用いて標的ポリヌクレオチドの存在を二重鎖が変性するような温度で検出することもできる。一般に、二重鎖型で存在する標的ポリヌクレオチドの検出は、二重鎖を含む試料をこの二重鎖のＴM より高い温度までポリヌクレオチドプローブの存在下で加熱しかつこの試料を冷却して標的ポリヌクレオチドによりポリヌクレオチドプローブを再生させることにより行われる。しかしながら、ポリヌクレオチドプローブが蛍光性挿入剤成分からなる場合、試料は冷却を必要としない。何故なら、挿入剤は塩基対を安定化させて、これら塩基対のＴM を上昇させるからである。かくして、ポリヌクレオチドプローブにおけるポリヌクレオチド部分が標的ポリヌクレオチドに対しハイブリッド化を開始しかつ挿入剤が形成二重鎖中に侵入すると、試料の温度上昇はこの二重鎖を変性させるにはもはや充分でなくなり、挿入剤の蛍光放出変化によって標的ポリヌクレオチドの存在を証明することができる。温度上昇はこの二重鎖（すなわち、ポリヌクレオチドプローブと標的ポリヌクレオチドとからなるもの）のＴM より高くなりえないと理解される。
【００７５】
１０．標的ポリヌクレオチド
この方法を用いて、たとえば微生物、植物細胞または哺乳動物細胞から標的ポリヌクレオチドを検出することができる。微生物は細菌、黴、ウイルスまたは酵母とすることができる。標的ポリヌクレオチドは、特定の病原性ウイルスに独特なもの、非機能性蛋白の産生をもたらすような突然変異した哺乳動物遺伝子に存在するもの、或いは抗生物質耐性を細菌に付与するものとすることができる。たとえば、これはストレプトコッカス・ピオゲネスまたはナイセリア・メニンギチジスにペニシリン耐性を付与するもの；スタフィロコッカス・アウレウス、キャンジダ・アルビカンス、シュードモナス・エアルギノーサ、ストレプトコッカス・ピオゲネスまたはナイセリア・ゴノレアにテトラサイクリン耐性を付与するもの；並びにミコバクテリウム・チュバキュロシスにアミノグリコシド耐性を付与するものとすることができる。
【００７６】
この方法を、たとえばサラセミア貧血症および鎌状赤血球貧血症などの遺伝子障害の診断に拡大することができる。ポリヌクレオチド遺伝子の存在もしくは不存在が障害（サラセミア貧血症の場合）に関連するポリヌクレオチド遺伝子は、本発明によるポリヌクレオチドプローブとのハイブリッド化にしたがって検出することができる。
【００７７】
染色体の特定部位に対する遺伝子もしくはその転写物の地図化は面倒でありかつ時間を要する作業であり、主として細胞融合および体細胞遺伝子学の技術を用いる。たとえばショウジョウバエ（Drosophila）のような染色体多分裂を受ける種類では現場でのハイブリッド化が単一コピーの遺伝子配列を地図化するのに好適に使用されているが、それより高等な大抵の真核性染色体における独特な配列の遺伝子の検出は標準ハイブリッド化法では不可能でないにしても極めて困難である。さらに、ハイブリッド化部位の放射線写真による位置決定を容易化させるために極めて高い比放射能がポリヌクレオチドプローブに必要とされることは、このポリヌクレオチドプローブの急速な放射能分解を生ぜしめ、かつそれに伴なって銀粒子付着のバックグランドノイズを増大させる。低いまたは中庸の比放射能を有するハイブリッド化プローブの使用は、たとえばリボゾームＲＮＡ遺伝子もしくはサテライトＤＮＡのような多コピー配列を検出するのに何日間もしくは何週間もの露出時間を必要とする。真核細胞に見られるほぼ全ての単一コピー配列の分子クローン化については組換ＤＮＡ技術が可能となったので、この種のクローン化ゲノム断片の染色体を地図化する迅速かつ敏感な方法を得るのが極めて有益である。
【００７８】
最後に、本発明によるポリヌクレオチドプローブを作成して腫瘍細胞を診断することもでき、このポリヌクレオチドプローブはたとえば胎児蛋白抗原もしくは癌胚抗原のようなその存在が特定腫瘍細胞の診断となるポリペプチドの産生に関連するＤＮＡ遺伝子配列から転写されたメッセンジャーＲＮＡに対し相補的である。プローブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッドのハイブリッド化および検出は、腫瘍細胞の検出方法を与える。
【００７９】
本発明に適したポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合した挿入芳香族化合物とからなるポリヌクレオチドプローブを下記に示し、このポリヌクレオチドは構造式：
【００８０】
【化６】
【００８１】
一般に、Ｂは同一のオリゴ−もしくはポリ−ヌクレオチド内で変化し、或いはウラシル、シトシン、チミン、グアニン、アデニン、デアザグアニンもしくはデアザアデニンとすることもできる。さらに、一般に、この変化は標的ポリヌクレオチドからなるヌクレオチドの所定配列に対応する。図示した構造式はたとえばポリＣ、ポリＵ、ポリγ（Ａ−Ｕ）およびポリｄ（Ａ−Ｕ）のようなポリヌクレオチドをも包含することを意図する。
【００８２】
１１．ポリヌクレオチドプローブの合成
この種のポリヌクレオチドプローブの合成例を、図１を参照して以下説明する。ポリヌクレオチドプローブは、ヌクレオチドｄＴＭＰおよびｄＵＭＰならびにブチジウム挿入剤からなっている。標的ポリヌクレオチドはポリｄＡＭＰである。
【００８３】
合成の第１工程は、硫酸の存在下における硝酸カリウムによるベンチジンから３−ニトロベンチジンへのニトロ化である。次いで、２個の環外アミノ基をエチルクロルホルメートと反応させて、ジイソシアネート化合物を生成させる。この工程は、このようにしないと第１アミノ基が後に他の試薬と共有反応してアミド或いは第２および第３アミンを生成するので必要となる。この種の反応は、合成された成分がハイブリッド中へ侵入するのを防止し、したがって成分としてのその効果を阻害する。この事実は、アセチル基によるフェナンスリジウム化合物の８−アミノ基の遮蔽がポリヌクレオチドの螺旋巻き戻し角度を低下させ、しかもその結合エネルギーに殆んど変化を生ぜしめないのに対し、３−および８−アミノ基の完全遮蔽はフェナンスリジウム化合物の結合恒数を１０〜２０倍低下させて巻き戻し角度を著しく低下させるという報告に基づいている。２個のアミノ基は、挿入錯体の安定性に対し約1.4 〜1.7 カロリー／モルの自由エネルギーを与える〔Ｊ．Ｗ．コズコザンおよびＦ．Ｅ．ハーン編、アンチビオティックス、第３巻、第１４１〜１６５頁、スプリンガー・フェアラーグ出版、Ｎ．Ｙ．（１９７５）における「エチジウムおよびプロピジウム」と題する論文参照〕。
【００８４】
次いで、３−ニトロ基を亜鉛によってアミノ基まで還元し、かつ塩化ベンゾイルを添加してベンゾイルアミドを生成させる。このベンゾイルアミドのカルボニルはホスホオルキシクロライド中で加熱する際に６−位置の炭素と反応してフェナンスリジウム誘導体を生成する。次いで、５−第三アミンを１，４−ジブロモブタンと反応させて４級化することにより、ブチジウム誘導体を生成させる。これに続いてジウレタン部分を加水分解して５−（４’−ブロモブチル）−３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジンを生成させる。次いで、この化合物をチオ硫酸ナトリウムと反応させることにより臭素をチオールで置換して５−（４’−チオブチル）−３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジンを生成させる。この生成物は、ポリヌクレオチドプローブの成分部分を示し、かつブチジウム誘導体の蛍光特性を示す。
【００８５】
この化合物を、ポリヌクレオチドに結合させる前に、この化合物の蛍光性が他の分子に対する共有結合に際し破壊されないことを証明する必要がある。これは、ブチジウム化合物を図２（ａ）に示したようにブロモアセチル化アミノデキストラン誘導体と反応させて行われる。デキストラン誘導体は、デキストランを硼水素化ナトリウムの存在下でブタジエンモノエポキシドと反応させて１−ブテン−４−デキストランを生成させることにより製造される。この化合物をＮ−ブロモスクシンイミドと混合して１−ブロモブタン−４−デキストランを生成させ、次いでさらにシステアミンと反応させて、アミノデキストラン誘導体を得る。このデキストランをブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと混合して、ブロモアセチル化されたアミノデキストラン誘導体を生成させる。
【００８６】
このブロモアセチル化アミノデキストラン誘導体を上記５−（４’−チオブチル）−３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジンと反応させて、デキストラン標識されたフェナンスリジウム化合物を生成させる。この化合物のスペクトル分析は、フェナンスリジンの蛍光がデキストランへの結合によって変化されないことを示した。
【００８７】
次いで、アリルアミンが各ウラシル（Ｕ）塩基へその５−位置に結合したポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＵ）からなるポリヌクレオチドを作成する。このポリヌクレオチドを作成するために使用した方法は、ｄＵＴＰおよびＡＡＵＴＰ（アリルアミンＵＴＰ）の混合物の存在下で酵素末端トランスフェラーゼによりポリヌクレオチドを合成することである。合成されたポリヌクレオチドを陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製する。このウラシル塩基は約２６０ｎｍに最大吸収を有する一方、５−位置にアリルアミンを有するウラシル塩基は約２９０ｎｍに最大吸収を有する。かくして、２６０／２９０の吸光比を測定することにより、ポリヌクレオチド重合体における２種の塩基の比率を決定することができる。この実験では、ＡＡｄＵ対ｄＵの比が１：１０であることが判明した。
【００８８】
次いで、このポリヌクレオチドを図２（ｂ）に示したように水−ジメチルホルアミドの混合物を含有する溶液中で弱アルカリ性条件下に５−（４’−チオブチル）−３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジンと反応させる。未反応のブチジウム誘導体をブタノールによって溶液から抽出する。ブタノールによる抽出は、ポリヌクレオチドプローブをこの溶液から沈澱させる。沈澱をさらに陰イオン交換カラムで精製する。
【００８９】
次いで、精製したポリヌクレオチドプローブを３種の溶液と混合する。第１の溶液はポリ（γＡ）を含有し、第２の溶液は牛胸腺二重鎖ＤＮＡを含有し、かつ第３の溶液はポリ（ｄＴ）を含有する。ポリ（γＡ）を含有する溶液のみが強度の蛍光性を示す。このことは、どのストランドもポリヌクレオチドプローブのストランドでない二重鎖中へ挿入剤が侵入しなかったことを示している。
【００９０】
精製されたポリヌクレオチドプローブをポリ（ｄＴ）対ポリ（γＡ）の比が２：１であるポリ（ｄＴ）−ポリ（γＡ）を含有する溶液と混合する。この溶液は殆んど即座に蛍光を発する。このことは、挿入剤を含むポリヌクレオチドプローブが同質ポリヌクレオチドを二重鎖から排除しうることを証明している。
【００９１】
ポリヌクレオチド薬剤の説明
本発明は、ポリヌクレオチド組成物をポリヌクレオチド薬剤として使用することを可能にする。ポリヌクレオチド薬剤は、標的ポリヌクレオチドの転写もしくは翻訳を防止するために使用される。薬剤を使用して転写を防止する場合、標的ポリヌクレオチドはＤＮＡもしくはＲＮＡとすることができる。ポリヌクレオチド薬剤を使用して翻訳を防止する場合、標的ポリヌクレオチドはメッセンジャーＲＮＡである。
【００９２】
ポリヌクレオチド薬剤は、ポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに結合した少なくとも２個の成分とからなっている。これらの成分は、ポリヌクレオチド薬剤のポリヌクレオチド部分が標的ポリヌクレオチドにハイブリッド化した際にポリヌクレオチドプローブもしくは標的ポリヌクレオチドまたはその両者のいずれかの性質に変化を生ぜしめるような特徴を有する。変化する性質は、形成されたハイブリッドの熱力学的安定性である。この安定性は、薬剤のポリヌクレオチドに対し同質性であるポリヌクレオチドによる標的ポリヌクレオチドからのポリヌクレオチド薬剤の排除を防止する。何故なら、この種の同質ポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとからなるハイブリッドは、薬剤のポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとからなるもの程、熱力学的に安定でないからである。
【００９３】
適するポリヌクレオチド薬剤の例は、成分として挿入剤を含むものである。上記したように、挿入剤の存在は、ポリヌクレオチド二重鎖のＴM を上昇させる。すなわち、挿入剤を含むポリヌクレオチド薬剤を試料と混合し、或いは標的ポリヌクレオチドを含む生物に投与すれば、その標的ポリヌクレオチド薬剤はその標的ポリヌクレオチドを探し出す。標的が既に相補的ポリヌクレオチドにハイブリッド化している場合にもこの標的ポリヌクレオチドを見い出すと、ポリヌクレオチド薬剤におけるポリヌクレオチド部分は、ポリヌクレオチドプローブの説明で上記した理由により標的に対し相補的である配列を排除する。その結果、容易には、ポリメラーゼおよびトランスフェラーゼ酵素に対する雛型とならないような二重鎖を生成し、かくして標的ポリヌクレオチドの転写もしくは翻訳を遮断する。
【００９４】
このポリヌクレオチド薬剤は、薬剤のポリヌクレオチド部分と標的ポリヌクレオチドとのハイブリッド化の結果生成された二重鎖にのみ挿入剤を侵入させうるようなリンカアームによって、挿入剤をポリヌクレオチドに結合させねばならないという制約を有する。挿入剤は、他の二重鎖中に侵入して他のポリヌクレオチドの転写もしくは翻訳を妨げてはならない。
【００９５】
このポリヌクレオチド薬剤は利点を有する。挿入剤を包含する大抵の化学治療剤は、ヒトに全身的に投与すると体全体に均一分布する。これら薬剤の殆んどは極めて毒性である。したがって、標的部位に治療効果を発揮するだけでなく、これらは非標的部位にも毒性作用を示す。本発明の挿入剤は標的ポリヌクレオチドを含まない二重鎖中には侵入しえないので、ポリヌクレオチド薬剤は体全体に均一分布されたとしても標的部位以外には毒性作用を示さない。
【００９６】
変化する性質は検出しうる必要はないが、これはしばしば有利である。しかしながら、変化する物質は、ポリヌクレオチド薬剤を含まないハイブリッドと比較して、ポリヌクレオチド薬剤／標的ポリヌクレオチドからなるハイブリッドの安定性を向上させねばならない。
【００９７】
挿入剤を含むポリヌクレオチド薬剤の製造方法は、ポリヌクレオチドプローブの製造の説明で上記した通りである。これらのポリヌクレオチド薬剤は、中性水溶液としてヒトに投与することができる。
【００９８】
ポリヌクレオチド薬剤は、適当なキャリヤによって細胞へ供給せねばならない。キャリヤは、ポリヌクレオチド薬剤が細胞中で入る前に分解されるのを防止せねばならず、同時にポリヌクレオチド薬剤を細胞膜中に拡散させ或いは貫通輸送させねばならない。１つの好適方法は、リポソームの使用である。
【００９９】
リポソームは単層もしくは多層の脂質小胞であって、三次元空間を包囲する。リポソームの膜は極性先端と非極性末端とを有する１種もしくはそれ以上の脂質成分の二分子層によって形成される。水性（もしくは極性）溶液において、１つの層の極性先端は外方向に配向して、水性もしくは極性溶液中に突入し、かつ連続的外表面を形成する。単層リポソームは、このような１種の二分子層であるのに対し、多層小胞は一般に玉ネギのように配列された複数のほぼ同心的二分子層を有する。
【０１００】
リポソームは、たとえば細胞毒性剤或いは細胞挙動を改変させたり、またはこれら薬剤を生体内部位に搬入しうる他の巨大分子のような治療剤をカプセル化するのに有用であることが周知されている。たとえば、ラーマン等による１９７６年１１月２３日付け発行の米国特許第3,993,754 号公報は悪性腫瘍の改良化学治療法を開示しており、この場合抗腫瘍剤をリポソーム内にカプセル化しかつこのリポソームを動物またはヒトに注射する。アプル等による１９８１年４月２１日発行の米国特許第4,263,428 号公報は、均一寸法のリポソーム内に薬剤を混入することにより哺乳動物における選択細胞部位に対しより効果的に供給しうる抗腫瘍剤を開示している。リポソームを介する薬剤投与は、毒性を減少させ、組織分布を変化させ、薬剤効果を高めかつ治療指標を向上させる。
【０１０１】
核酸をカプセル化するための特に有用な方法は、ダビッドＷ．ディーマーによる１９８５年５月７日発行の米国特許第4,515,736 号公報に開示されており、これを参考のためここに引用する。この方法は、リポソーム分散物をカプセル化すべき物質の存在下で乾燥させる新規なカプセル化である。乾燥が生ずるにつれて、個々のリポソームが融合して多層構造を形成し、脂質ラメラ間に物質を閉じこめる。再水和すると、脂質小胞が形成されて物質を効率的にカプセル化する。この特許は、各種のポリヌクレオチドの効果的なカプセル化を開示している。
【０１０２】
同質ポリヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドから排除するポリヌクレオチド薬剤の効果は、ポリヌクレオチド薬剤におけるポリヌクレオチド部分の長さ並びにポリヌクレオチド薬剤に結合した挿入剤の個数に依存する。挿入剤の個数が多い程、同質配列を排除する薬剤のポリヌクレオチド部分の効果が大となりかつ標的ポリヌクレオチドの転写もしくは翻訳を防止するのに要する薬剤の量が少なくなる。さらに、挿入剤の個数が多い程、この薬剤は標的に対しより迅速に結合する。
【０１０３】
【実施例】
次の実施例は実証としてのものであって制限としてのものではない．
実施例 １：
３−ニトロベンジジンの調製
方法は基本的には、Ｍ．Ｓ．リスリー及びＥ．Ｅ．ターナー、ジャーナル．ケミカル．ソサイエティ．（１９３４年）、第１５８８〜９２頁に従った。
【０１０４】
９５％硫酸４６８ｍｌ、Ｐ2Ｏ5 ８７ｇをＰ2Ｏ5 の総てが溶解するまで２時間をかけて少しずつ添加した。（Ｐ2Ｏ5 は硫酸中の水を吸収するために添加された）。溶液を室温に冷却後、ベンジジン５０ｇ（フルカ ケミカル社、２５５オセル アベニュー ハウパウゲ ニュー ヨーク １１７８８）を冷却下に徐々に添加し、１０〜１５℃の間に保持した。最後に粉末硝酸カリ（５０．５ｇ）を溶液に激しく攪拌しながら３０分かけて添加し、その間前記温度に保持した。６０分後、溶液を注意して１５００ｍｌの水中に注入し、この水溶液を沸騰水で６ｌに希釈した。分別部１０ｍｌを採り、徐冷して３−ニトロベンジジン硫酸塩結晶を得た。この結晶を残り溶液の結晶析出用種晶として使用し、３５℃に急冷した。溶液を更に２０℃まで冷却して３−ベンジジンの結晶を完全に沈澱させた。結晶化の完了後に、３−ニトロベンジジン硫酸塩を濾別して集めた。湿った塩の３０ｇ部を粉砕して水による堅めのペーストとした。このペーストに濃アンモニア水を添加し、更に粉砕して３−ニトロベンジジン硫酸塩を遊離３−ニトロベンジジンに変えた。これを希アンモニア−エタノールに溶解し、この溶液を多量の水に注入して３−ニトロベンジジン４６ｇを得、これは収率８０．４％に相当した。
【０１０５】
Ｎ，Ｎ’−ビスカルボエトキシ−３−ニトロベンジジンの調製
３−ニトロベンジジン２９ｇをジメチルアニリン３９ｍｌ（３６ｇ）を含有するエタノール３３０ｍｌに溶解した。このエタノール溶液にエチルクロロホーメイト３１ｇを少しずつ添加した。溶液を１０分還流後に水を添加してジウレタン誘導体を沈澱させた。生成物４１ｇを得、これは収率９５％に相当した。
【０１０６】
３，８−ビスカルベトキシ−３−アミノベンジジンの調製
ジウレタン４１ｇをエタノール５００ｍｌと氷酢酸４０ｍｌを含む溶液に添加し、この混合物を加熱してジウレタンを溶解した。溶液は黒褐色であった。温度を約３０℃にして、亜鉛粉末を徐々に添加してニトロ基を還元した。反応の終結は褐色の消失で示された。亜鉛を濾別し、エタノールと酢酸を真空下に除去した。３，８−ビスカルベトキシ−３−アミノベンジジンはそれ以上の精製することなく次の工程に使用した。
【０１０７】
３，８−カルベトキシ−６−フェニールフェナンスリジンの調製
次の方法は、Ｌ．Ｐ．ウォール、ジャーナル．ケミカル．ソサイエティ．（１９４７年）、第６７〜７４頁から改作されたものである。
【０１０８】
３，８−ビスカルベトキシ−３−アミノベンジジンをニトロベンゼン１００ｍｌに溶解し、この溶液を１５０℃の温度に加熱した。塩化ベンゾイル１０ｍｌを添加し、ＨＣｌの発生が止まるまで１５０℃に保持した。更に３０分１５０℃保持した後、溶液を冷却し、エタノールを添加すると無色プリズム形のベンゾイル誘導体が晶出した。収率は７２％相当の３５ｇであった。
【０１０９】
ベンゾイル誘導体を塩化ホスホリル７０ｍｌに溶解しＨＣｌガスの発生が止まるまで１時間還流した。黄色溶液を室温まで冷却し、次いで冷希アンモニア溶液に徐々に添加してフェナスリジンを沈澱させた。沈澱を濾別し無水エタノール２００ｍｌに溶解した。次いでアンモニアを添加してオレンジ色を無くした。水を添加して化合物を沈澱させた。収率６２．５％相当の２１ｇであった。
【０１１０】
５−（４’−ブロモブチル）−３，８ビスカルベトキシ−６−フェニルフェナンスリジンの調製
この化合物をＴ．Ｔ．ワトキンス、ジャーナル．ケミカル．ソサイエティ．（１９５２年）、第３０５９〜３０６４頁の方法の改良により調整した。
【０１１１】
３，８ビスカルベトキシ−６−フェニルフェナンスリジン１ｇを予め１００℃に加熱した１，４−ジブロモブタン１０ｍｌに添加し、それにより混合溶液中の幾らかの水分が揮散したであろう。温度を次第に１５０℃に上げた。１５０℃で３０分後に、黄色な沈澱が形成し始めた。混合物を室温に冷却し、次いでエーテルを総量１００ｍｌ添加して沈澱を促進させた。沈澱を濾別し、エーテルで洗浄し、次いで空気乾燥した。収率５８％相当の総量０．８ｇの化合物を得た。
【０１１２】
１５０℃の加熱時間が重要で、理由は１５０℃に一晩保持した平行実験において、得られた生成物は極めて不均一に見え、硫酸によるウレタンの加水分解後に二重ストランドＤＮＡと極めて少量の蛍光しか示さなかった。（ワトキンスの論文第３０６１頁参照）。このことはこの化合物が分解したことを示した。
【０１１３】
５−（４’−ブロモブチル）−３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジンの調製
ウレタン部分の加水分解をＬ．Ｐ．ウォール、ジャーナル．ケミカル．ソサイエティ．（１９４７年）、第６７〜７４頁の方法に従って実施した。３，８−ビスカルベトキシ−３−アミノベンジジン８００ｍｇをアルゴンガス下に濃硫酸１０ｍｌに溶解した。ＨＢｒの発生が止まった後、Ｈ2Ｏ ５ｍｌを添加し浴温を１５０℃に上げた。溶液をＣＯ2 ガスの発生が止まるまでこの温度に１５分保持した。次いで混合物を５〜１０℃に冷却し、冷Ｈ2Ｏを添加して総量１５０ｍｌとした。溶液を冷希アンモニアで中和した。この溶液に固体臭化カリを１Ｍになるまで添加し（生成物を塩析するため）次いで溶液を４℃で一晩放置した。この放置後に、沈澱が形成し、これは過マンガン酸塩のような結晶外観を呈した。この生成物は又硫酸アンモニウム塩としても容易に溶液から沈澱出来ることが分かった。この生成物は水溶性で、二重ストランドＤＮＡを含有する溶液に混合すると、強い蛍光溶液が形成される。収率８９％相当の５４７ｍｇが得られた。
【０１１４】
５−（４’−チオブチル）−３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジンの調製
５−（４’−ブロモブチル）−３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジン６０ｍｇを５０％エタノール４ｍｌに溶解した。５０％エタノール中に０．２Ｍ Ｎａ2Ｓ2Ｏ3 １ｍｌを添加し、溶液を８０℃で３時間加熱した。７０℃でアルゴンガスを吹き込んでエタノールを揮散させ、生成物を３Ｍ ＫＣｌ ２ｍｌにより沈澱させた。沈澱物を遠心分離機で集め、３６％ＨＣｌ １ｍｌに溶解した。水（０．３５ｍｌ）を添加してＨＣｌ濃度を２５％に低下させ、溶液を室温で２０時間放置した。この放置後により沈澱が形成された。無水エタノール６ｍｌを添加し、混合物を−２０℃で更に２０時間放置して沈澱を促進した。沈澱を遠心分離機で集め、沈澱物を１ｍｌの水に分散させ、水を凍結乾燥により除去した。収率７０％相当の４２．５ｍｇを得た。粗製物の薄層クロマトグラフィは３個の蛍光生成物を示した。所望生成物を精製することなく次の反応に使用した。
【０１１５】
アミノデキストランの調製
デキストラン Ｔ−５００（フェルマシア ビオケミカルス、ピスタカウェイ、ニュー ジャージー）を１Ｍ ＫＯＨの１５．０ｍｌに添加した。ブタジエンモノエポキシド３００μｌ（約３ｍｍｏｌ）と水素化ホウ素ナトリウム３０ｍｇ（触媒）とを添加し、混合物を一晩攪拌した。溶液をＨＣｌで中和し、過剰未反応ブタジエン モノエポキシドとこれから生成したジアルコールとを溶液から２０ｍｌのエーテルで４回抽出した。水溶液中に残ったエーテルをアルゴンガス吹き込みにより揮散させた。次に溶液をｐＨ５．０の酢酸ナトリウム０．２Ｍにより透析して塩類を除去した。
【０１１６】
Ｎ−ブロモコハク酸イミド０．５ｇをこの溶液に添加し、得られた分散物を暗黒中にて１０℃３時間攪拌した。得られた溶液を２日にわたり１ｌ水に対し３回透析した。この透析物０．４ｍｌに１ＭのＫ2ＨＣＯ3 ２００μｌとシステアミン１００ｍｇを添加し、混合物をアルゴン下に８０℃２時間加熱し、溶液をＧ−５０濾過により脱塩した。精製デキストランは２０糖部分当たり一つの誘導糖を含有していた。
【０１１７】
ブロモアセチル化アミノデキストランの調製
０．０２Ｍホウ酸ナトリウムと８．５ｍｇのアミノデキストランを含有する溶液０．５ｍｌに０．２ｍｌのジメチルホルムアミドとＤＭＳＯ中の１Ｍブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル２５μｌとを添加した。ピクリルスルホン酸（この試薬は第一アミノ基に対しオレンジ色を与える）でアミノ含量を測定しながら反応を続けた。反応は室温で５分の後完了することが分った。混合物に１．０ＭのＨＣｌ５０μｌ添加し、過剰の未反応エステルと生成ブロモ酢酸とを水飽和１−ブタノールで４回抽出した。ブロモアセチル化デキストランは極めて不安定で、特に塩基性ｐＨでそうである。例えば、ｐＨ９．２、３７℃で総てのブロモアセチル基は６時間後に開裂した。それ故、次の反応はブロモアセチル化デキストランの分離に続いてできるだけ速く実施すべきである。
【０１１８】
フェナンスリジン標識付けデキストランの調製
ブロモアセチル化デキストラン２．１ｍｇを酢酸ナトリウム０．３Ｍ水溶液２００μｌに溶解し、次に６ｍｌのホルムアミド中の５−（４’−チオブチル）−３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジン３．５ｍｇと混合した。反応混合物を室温に１時間、次いで３７℃で１時間放置した。２ＭのＮａＣｌ １ｍｌを添加し、次いで未反応５−（４’−チオブチル）−３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナスンスリジンを水飽和１−ブタノールで６回抽出した。この水相の一部に二重ストランドＤＮＡを添加すると強い蛍光が付与されたので、デキストランはフェナンスリジンで標識付けされたことが示され。デキストランのフェナンスリジン部分は挿入を受け入れ易いことが示された。
【０１１９】
ポリ（ｄＴ）・ポリ（ＡＡｄＵ）の調製
溶液Ａ：０．２５Ｍカコジル酢酸緩衝液ｐＨ７．２の２５００μｌ、ＢＳＡ（ＤＮＡ含まず、２０μｇ／ｍｌ）の２５０μｌ、０．１ＭのＣｏＣｌ2 ５０μｌ、及び３ＭのＮａＣｌ７５μｌを含有。
【０１２０】
溶液Ｂ：Ｈ2Ｏ １５００μｌと０．１ＭのＢメルカプトエタノール５０μｌを含有。
【０１２１】
溶液Ａを溶液Ｂと混合し、８００単位の末端トランスフェラーゼ酵素、3 ＨＴＴＰ（低比活性）５μモル、及びＡＡｄＵＴＰ１．５μモルをこの混合溶液に添加した。溶液をアルゴン下に４０時間３７℃で培養した。反応工程中にピロリン酸コバルトが溶液から沈澱した。４０時間後に０．５ＭのＥＤＴＡ１００μｌを添加して反応を停止させた。しかし３７℃の培養は２時間継続されてＥＤＴＡをコバルトと複合させ、アリルアミノ基に複合したコバルト化物を除去した。
【０１２２】
シリコン化の毛細管ピペット中の０．６ｍｌの床容量のＤＥＡＥセルローズカラムを１ＭのＫＯＨ ２ｍｌで２回次いでアルカリ性が無くなるまで水で洗浄した。次いでカラムを３ＭのＮａＣｌ ２ｍｌ、次いでＨ2Ｏ ３ｍｌ、次いで０．２ＭのＮａＣｌ ２ｍｌで洗浄した。次いで培養混合物をカラムに通し、次いでカラムを０．２ＭのＮａＣｌと０．３ＭのＮａＣｌで連続して洗浄した。最後の０．３Ｍ洗浄の溶出は総カウントの数％を含有した。
【０１２３】
共重合体を０．２Ｍの酢酸中の１．５ＭのＬｉＣｌ含有溶液でカラムから溶出した。２／１０ｍｌ画分を集めた。結果を次に示す。
【０１２４】
【表１】
画分３〜５を集めたら０．６ｍｌとなった。この溶液１０μｌを１ｍｌに希釈した。この１ｍｌのＡ260 は０．６４５であり、Ａ290 は０．２０３であった。２９０ｎｍの吸光度はアリルアミノ基の存在を示した。総Ａ260 は３８．７であって、共重合体約１．５ｍｇに相当した。
【０１２６】
ｄＴに対するＡＡｄＵの比１：１０は共重合体とピクリルスルホン酸との反応により決定した。アリルアミンのアミノ基によるスルホン基の置換は共重合体を黄色にした。４２０ｎｍにおける溶液の測定はｄＵに対するＡＡｄＵの比が１：１０であることを示した。（総てのアリルアミンがピクリルスルホン酸分子と反応したと想定された。）
【０１２７】
ポリヌクレオチド標識付けフェナンスリジンの調製
１．５ＭのＬｉＣｌと０．２Ｍの酢酸１００μｌ中のポリ（ｄＴ）・ポリ（ＡＡｄＵ）共重合体２００μｇを含有する溶液を３ＭのＫ2 ＣＯ3 でｐＨ８．０とした。次にホルムアルデヒド０．６ｍｌに溶解したチオアルキル化フェナンスリジン３ｍｇを添加した。混合物を室温で約９０分次いで更に３７℃で４５分暗所に放置した。Ｈ2Ｏ １ｍｌを添加し、過剰のチオアルキル化フェナンスリジンを水相容量が約３００μｌに減少するまで１−ブタノールで抽出した。更に水で飽和した１−ブタノールで抽出した。各抽出の後、２相を遠心分離機で分離した。沈澱は最初の１−ブタノール抽出の後現れた。沈澱は標識付けポリヌクレオチドと幾らかの不溶性フェナンスリジン副生成物を含んでいた。最後の抽出の後、遠心分離機にかけ、得られたペレットを３７℃の温度にてホルムアミドに溶解した。
【０１２８】
溶液をホルムアミドで平衡化されたＤＥＡＥセルローズカラム（クロライド形）に通した。カラムをホルムアルデヒドで洗浄してフェナンスリジン化合物を溶出した。フェナンスリジン標識付けポリヌクレオチドはより高い塩濃度にてもカラムから溶出されなかった。（収率を増大するため、ポリヌクレオチドをエタノール中で酢酸バリウムで沈澱させ、沈澱を遠心分離機で集め、次いで沈澱をＥＤＴＡ／Ｈ2Ｏに溶解することにより集めることができる。）
【０１２９】
蛍光の検出
フェナンスリジン標識付けポリヌクレオチドを含有するＤＥＡＥ溶出２５μｌを（１）０．１ＭのＮａＣｌ０．６ｍｌ中ポリ（ｒＡ）１０μｇを含む試験管に、（２）０．１ＭのＮａＣｌ０．６ｍｌ中に子牛胸腺ＤＮＡ２５０μｇ含む試験管に、（３）０．１ＭのＮａＣｌ０．６ｍｌ中にポリ（ｄＴ）を含む試験管に夫々添加した。ポリ（ｒＡ）を入れた試験管は強く蛍光を発したが他の２本の試験管はほんの極めて弱い蛍光を示すにすぎなかった。
【０１３０】
この実験の結果は、このフェナンスリジン標識付けポリヌクレオチドが一工程ハイブリッド形成検定におけるプローブとして使用できることを示している。その理由は、このフェナンスリジンが上述のようにポリヌクレオチドに結合した場合、他の結合していない二重ストランドポリヌクレオチド中に挿入されないからである。それはただ、フェナンスリジン標識付けポリヌクレオチドのポリヌクレオチド部分が相補ポリヌクレオチドによりハイブリッド形成される結果形成される二重ストランドポリヌクレオチド中に挿入される。
【０１３１】
二重ストランドＤＮＡからのポリヌクレオチドのフェナンスリジン標識付けポリヌクレオチドのポリヌクレオチドによる置換
ポリ（ｒＡ）に対するポリ（ｄＴ）の比２：１であるポリ（ｄＴ）−ポリ（ｒＡ）を含有する溶液を室温でフェナンスリジン標識付けポリ（ｄＴ）−ポリ（ＡＡｄＵ）と混合した。溶液は即座に蛍光を発し始め、その蛍光の強さは時間と共に増大した。フェナンスリジン標識付けポリ（ｄＴ）−ポリ（ＡＡｄＵ）のフェナンスリジンは二重ストランド子牛胸腺ＤＮＡ中に挿入されないので（上記結果参照）、蛍光発生は、フェナンスリジン標識付けポリヌクレオチドが二重ストランドハイブリッド中の同種ポリヌクレオチドに置換したことを示した。
【０１３２】
各種の変化、改良、及び変更が本特許請求の範囲に規定した発明の精神と範囲から逸脱せずになされ得ることは、当業者にとり明確であろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】ポリヌクレオチドに結合してポリヌクレオチド化合物を形成することが出来る芳香族染料の合成工程図である。
【図２】図２（ａ）はデキストランに図１の芳香族染料が結合する工程図であり、図２（ｂ）はポリヌクレオチドに図１の芳香族染料が結合する工程図である。
【図３】ポリヌクレオチドと標的ペリヌクレオチドとのハイブリッド形成により形成されたハイブリッド中のポリヌクレオチドに結合した芳香族染料の挿入の説明図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 少なくとも一つの修飾オリゴ−又はポリヌクレオチドからなるものの組成物であって、前記修飾オリゴ−又はポリヌクレオチドが（ｉ）前記修飾オリゴ−又はポリヌクレオチド中のヌクレオチドの糖骨格にリンカーアームを介して直接的に又は非直接的に結合した一つ以上の挿入芳香族化合物と、（ｉｉ）少なくとも一つのヘテロ重合体配列とからなり、ここにおいて前記リンカーアームが（１）前記修飾オリゴ−又はポリヌクレオチドと相補的オリゴ−又はポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、或いは（２）前記修飾オリゴ−又はポリヌクレオチドと前記相補的オリゴ−又はポリヌクレオチドとの間に形成されたハイブリッドへの前記一つ以上の挿入芳香族化合物の挿入を実質的に干渉せず、ここにおいて前記一つ以上の挿入芳香族化合物は前記修飾オリゴ−又はポリヌクレオチドと前記相補的オリゴ−又はポリヌクレオチドとの間に形成されたハイブリッドの間に挿入し、そしてここにおいて前記一つ以上の挿入芳香族化合物が前記ハイブリッドを形成する前記相補的オリゴ−又はポリヌクレオチドへの前記修飾オリゴ−又はポリヌクレオチドの特異的なハイブリダイゼーションといった特徴を有し、前記特徴が前記修飾オリゴ−又はポリヌクレオチド或いは前記相補的オリゴ−又はポリヌクレオチドの何れか、もしくは両方のハイブリダイズされていない状態から、前記修飾オリゴ−又はポリヌクレオチド及び前記相補的オリゴ−又はポリヌクレオチドのハイブリダイズされた状態において測定又は検出されるような性質に検出可能な変化を引き起こす、少なくとも一つの修飾オリゴ−又はポリヌクレオチドからなるものの組成物。
【請求項２】 性質における前記検出可能な変化が修飾オリゴ−又はポリヌクレオチド、相補的オリゴ−又はポリヌクレオチド、又は修飾オリゴ−又はポリヌクレオチドと相補的オリゴ−又はポリヌクレオチドとの間に形成されたハイブリッドにおいて引き起こされる、特許請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項３】 前記挿入芳香族化合物が、リンカーアームによって前記糖骨格へ非直接的に結合される、特許請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項４】 前記挿入芳香族化合物が吸収、放出エネルギー、分散力相互作用又は浮力密度のシフトからなる性質の変化に影響を与える、特許請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項５】 少なくとも一つの修飾オリゴ−又はポリヌクレオチドからなるものの組成物であって、前記修飾オリゴ−又はポリヌクレオチドが（ｉ）前記修飾オリゴ−又はポリヌクレオチド中の二つのリン酸骨格の間の脱塩基糖骨格にリンカーアームを介して直接的に又は非直接的に結合した一つ以上の挿入芳香族化合物と、（ｉｉ）少なくとも一つのヘテロ重合体配列とからなり、前記リンカーアームが（１）前記修飾オリゴ−又はポリヌクレオチドと相補的オリゴ−又はポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、或いは（２）前記修飾オリゴ−又はポリヌクレオチドと前記相補的オリゴ−又はポリヌクレオチドとの間に形成されたハイブリッドへの前記一つ以上の挿入芳香族化合物の挿入を実質的に干渉せず、ここにおいて前記一つ以上の挿入化合物は前記修飾オリゴ−又はポリヌクレオチドと相補的オリゴ−又はポリヌクレオチドとの間に形成されたハイブリッドの間に挿入し、そしてここにおいて前記一つ以上の挿入芳香族化合物が前記ハイブリッドを形成する相補的オリゴ−又はポリヌクレオチドへの前記修飾オリゴ−又はポリヌクレオチドの特異的なハイブリダイゼーションといった特徴を有し、前記特徴が前記修飾オリゴ−又はポリヌクレオチド或いは前記相補的オリゴ−又はポリヌクレオチドの何れか、もしくは両方のハイブリダイズされていない状態から、前記修飾オリゴ−又はポリヌクレオチド及び前記相補的オリゴ−又はポリヌクレオチドのハイブリダイズされた状態において測定又は検出されるような性質に検出可能な変化を引き起こす、少なくとも一つの修飾オリゴ−又はポリヌクレオチドからなるものの組成物。
【請求項６】 性質における前記検出可能な変化が修飾オリゴ−又はポリヌクレオチド、相補的オリゴ−又はポリヌクレオチド、又は修飾オリゴ−又はポリヌクレオチドと相補的オリゴ−又はポリヌクレオチドとの間に形成されたハイブリッドにおいて引き起こされる、特許請求の範囲第５項記載の組成物。
【請求項７】 前記挿入芳香族化合物がフェナンスリジン、アクリジン又はアンスラサイクリンからなる染料からなる、特許請求の範囲第５項記載の組成物。
【請求項８】 前記挿入芳香族化合物が吸収、放出エネルギー、分散力相互作用又は浮力密度のシフトからなる性質の変化に影響を与える、特許請求の範囲第５項記載の組成物。
【請求項９】 前記染料がリンカーアームによって前記塩基脱落骨格へ共有結合又は非共有結合される、特許請求の範囲第７項記載の組成物。
【請求項１０】 前記脱塩基糖骨格がデプリネイション又はデピリミデイション、或いはその両方により形成された、特許請求の範囲第５項記載の組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US80875785A | 1985-12-13 | 1985-12-13 | |
| US808757 | 1985-12-13 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29504786A Division JP3293820B2 (ja) | 1985-12-13 | 1986-12-12 | 標的ポリヌクレオチドにハイブリツド形成するための新規な一工程方法とポリヌクレオチド化合物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002356496A JP2002356496A (ja) | 2002-12-13 |
| JP3814669B2 true JP3814669B2 (ja) | 2006-08-30 |
Family
ID=25199634
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29504786A Expired - Lifetime JP3293820B2 (ja) | 1985-12-13 | 1986-12-12 | 標的ポリヌクレオチドにハイブリツド形成するための新規な一工程方法とポリヌクレオチド化合物 |
| JP7140050A Expired - Lifetime JP2735813B2 (ja) | 1985-12-13 | 1995-05-15 | 標的ポリヌクレオチドにハイブリッド形成するための新規な一工程方法とポリヌクレオチド化合物 |
| JP2002019249A Expired - Lifetime JP3814669B2 (ja) | 1985-12-13 | 2002-01-28 | 標的ポリヌクレオチドにハイブリッド形成するための新規な一工程方法とポリヌクレオチド化合物 |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29504786A Expired - Lifetime JP3293820B2 (ja) | 1985-12-13 | 1986-12-12 | 標的ポリヌクレオチドにハイブリツド形成するための新規な一工程方法とポリヌクレオチド化合物 |
| JP7140050A Expired - Lifetime JP2735813B2 (ja) | 1985-12-13 | 1995-05-15 | 標的ポリヌクレオチドにハイブリッド形成するための新規な一工程方法とポリヌクレオチド化合物 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8334370B1 (ja) |
| EP (2) | EP0231495B1 (ja) |
| JP (3) | JP3293820B2 (ja) |
| AT (1) | ATE181366T1 (ja) |
| CA (1) | CA1339096C (ja) |
| DE (1) | DE3650720T2 (ja) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4948882A (en) * | 1983-02-22 | 1990-08-14 | Syngene, Inc. | Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis |
| DE3639109A1 (de) * | 1986-11-15 | 1988-05-19 | Merck Patent Gmbh | Verfahren zur bestimmung von nucleinsaeuren |
| US5185439A (en) * | 1987-10-05 | 1993-02-09 | Gen-Probe Incorporated | Acridinium ester labelling and purification of nucleotide probes |
| PT88665B (pt) * | 1987-10-05 | 1992-12-31 | Ml Tecnology Ventures Lp | Metodo para a marcacao com ester de acridinio e purificacao de sondas nucleotidicas |
| US5099011A (en) * | 1988-08-02 | 1992-03-24 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Nucleic acid probe for detection of Neisseria gonorrhoea |
| US5047523A (en) * | 1988-08-02 | 1991-09-10 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Nucleic acid probe for detection of neisseria gonorrhoea |
| US5324829A (en) * | 1988-12-16 | 1994-06-28 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | High specific activity nucleic acid probes having target recognition and signal generating moieties |
| CA2005927A1 (en) * | 1988-12-21 | 1990-06-21 | Chander Bahl | Method of preparing nucleotide probes using a bridging complement |
| DE69003104T2 (de) * | 1989-06-12 | 1994-03-17 | Cis Bio International Saclay | Verfahren zum nachweis von spezifischen sequenzen von nukleinsäuren und ihre verwendungen. |
| FR2650839A1 (fr) * | 1989-08-08 | 1991-02-15 | Oris Ind Cie | Procede de detection en phase homogene liquide de sequences specifiques d'acides nucleiques et ses applications |
| ATE193019T1 (de) * | 1989-10-13 | 2000-06-15 | Zeneca Ltd | Sonden |
| GB8927365D0 (en) * | 1989-12-04 | 1990-01-31 | Ici Plc | Reagent |
| DE69132765T2 (de) * | 1990-12-24 | 2002-02-21 | Enzo Diagnostics Inc | Verfahren zum Nachweis eines Zielpolynukleotids in einer Probe unter Verwendung eines Reagenz, das den Hintergrund verringert, und eine dieses Reagenz enthaltende Zusammensetzung und Kit. |
| CA2110946A1 (en) * | 1992-12-09 | 1994-06-10 | Elazar Rabbani | Induction of immunocompatibility by nucleic acid |
| CA2140081C (en) | 1994-01-13 | 2008-04-01 | Dean L. Engelhardt | Process, construct and conjugate for producing multiple nucleic acid copies |
| US5616465A (en) | 1995-08-09 | 1997-04-01 | The Regents Of The University Of California | Detection and isolation of nucleic acid sequences using competitive hybridization probes |
| US6027879A (en) * | 1995-08-09 | 2000-02-22 | The Regents Of The University Of California | Detection and isolation of nucleic acid sequences using a bifunctional hybridization probe |
| WO1998005766A1 (fr) * | 1996-08-02 | 1998-02-12 | Bio Merieux | Procede d'amplification d'une sequence d'un acide nucleique cible |
| SE522077C2 (sv) * | 1997-09-05 | 2004-01-13 | Lightup Technologies Ab | Förfarande att välja sekvens hos sond för nukleinsyrahybridisering |
| US8445664B2 (en) | 1998-06-24 | 2013-05-21 | Enzo Diagnostics, Inc. | Kits for amplifying and detecting nucleic acid sequences |
| US6743605B1 (en) | 1998-06-24 | 2004-06-01 | Enzo Life Sciences, Inc. | Linear amplification of specific nucleic acid sequences |
| US6472153B1 (en) | 1999-10-26 | 2002-10-29 | Epoch Biosciences, Inc. | Hybridization-triggered fluorescent detection of nucleic acids |
| US9261460B2 (en) | 2002-03-12 | 2016-02-16 | Enzo Life Sciences, Inc. | Real-time nucleic acid detection processes and compositions |
| US9777312B2 (en) | 2001-06-30 | 2017-10-03 | Enzo Life Sciences, Inc. | Dual polarity analysis of nucleic acids |
| US20040161741A1 (en) | 2001-06-30 | 2004-08-19 | Elazar Rabani | Novel compositions and processes for analyte detection, quantification and amplification |
| AU2002358462A1 (en) * | 2001-12-18 | 2003-06-30 | Human Genetic Signatures Pty Ltd | Linear and hairpin oligonucleotide analogues comprising intercalator pseudonucleotides |
| US9353405B2 (en) | 2002-03-12 | 2016-05-31 | Enzo Life Sciences, Inc. | Optimized real time nucleic acid detection processes |
| BRPI0607213B1 (pt) | 2005-01-28 | 2017-04-04 | Univ Duke | aparelho para manipulação de gotículas em uma placa de circuito impresso |
| US8357801B2 (en) | 2005-05-24 | 2013-01-22 | Enzo Life Sciences, Inc. | Labeling of target molecules, identification of organelles and other applications, novel compositions, methods and kits |
| US7737281B2 (en) | 2005-05-24 | 2010-06-15 | Enzo Life Sciences, Inc. C/O Enzo Biochem, Inc. | Purine based fluorescent dyes |
| US7569695B2 (en) | 2005-05-24 | 2009-08-04 | Enzo Life Sciences, Inc. | Dyes for the detection or quantification of desirable target molecules |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4711955A (en) * | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
| CA1190838A (en) * | 1981-07-17 | 1985-07-23 | Cavit Akin | Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radiative energy transfer |
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| CA1223831A (en) * | 1982-06-23 | 1987-07-07 | Dean Engelhardt | Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same |
| US4547569A (en) * | 1982-11-24 | 1985-10-15 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Intercalating agents specifying nucleotides |
| FR2540122B1 (fr) * | 1983-01-27 | 1985-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application |
| AU596068B2 (en) | 1983-02-22 | 1990-04-26 | Syngene, Inc. | Defined sequence single strand oligonucleotides incorporating reporter groups, process for the chemical synthesis thereof, and nucleosides useful in such synthesis |
| ES532041A0 (es) * | 1983-05-02 | 1985-10-01 | Enzo Biochem Inc | Un metodo para detectar una secuencia seleccionada de acido nucleico en un material biologico. |
| CA1222705A (en) * | 1983-07-14 | 1987-06-09 | Molecular Diagnostics, Inc. | Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays |
| DK487784A (da) * | 1983-10-13 | 1985-04-14 | Univ Georgia | Immunoassay |
| EP0144914A3 (en) * | 1983-12-12 | 1986-08-13 | Miles Inc. | Hybridization assay employing labeled pairs of hybrid binding reagents |
| US4707352A (en) * | 1984-01-30 | 1987-11-17 | Enzo Biochem, Inc. | Method of radioactively labeling diagnostic and therapeutic agents containing a chelating group |
| CA1260372A (en) * | 1984-04-27 | 1989-09-26 | Elazar Rabbani | Hybridization method for the detection of genetic materials |
| US4820630A (en) * | 1984-11-23 | 1989-04-11 | Digene Diagnostics, Incorporated | Assay for nucleic acid sequences, particularly genetic lesions, using interactive labels |
| CA1295559C (en) | 1985-08-13 | 1992-02-11 | Jannis Stavrianopoulos | Method for labeling polynucleotide sequences |
| CA1273552A (en) * | 1985-12-23 | 1990-09-04 | Michael J. Heller | Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization assays |
| DE69132765T2 (de) * | 1990-12-24 | 2002-02-21 | Enzo Diagnostics Inc | Verfahren zum Nachweis eines Zielpolynukleotids in einer Probe unter Verwendung eines Reagenz, das den Hintergrund verringert, und eine dieses Reagenz enthaltende Zusammensetzung und Kit. |
| US5547861A (en) | 1994-04-18 | 1996-08-20 | Becton, Dickinson And Company | Detection of nucleic acid amplification |
-
1986
- 1986-12-12 JP JP29504786A patent/JP3293820B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-15 CA CA000525363A patent/CA1339096C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-15 EP EP86117432A patent/EP0231495B1/en not_active Revoked
- 1986-12-15 EP EP98118357A patent/EP0916737A3/en not_active Withdrawn
- 1986-12-15 AT AT86117432T patent/ATE181366T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-12-15 DE DE3650720T patent/DE3650720T2/de not_active Revoked
-
1992
- 1992-10-05 US US07/956,566 patent/US8334370B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-05-15 JP JP7140050A patent/JP2735813B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-01-28 JP JP2002019249A patent/JP3814669B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3650720D1 (de) | 1999-07-22 |
| JPH07322900A (ja) | 1995-12-12 |
| JP2002356496A (ja) | 2002-12-13 |
| US8334370B1 (en) | 2012-12-18 |
| DE3650720T2 (de) | 2000-03-16 |
| JP3293820B2 (ja) | 2002-06-17 |
| EP0231495B1 (en) | 1999-06-16 |
| EP0916737A3 (en) | 2002-03-06 |
| ATE181366T1 (de) | 1999-07-15 |
| EP0916737A2 (en) | 1999-05-19 |
| JPS62163699A (ja) | 1987-07-20 |
| EP0231495A3 (en) | 1990-07-18 |
| CA1339096C (en) | 1997-07-29 |
| JP2735813B2 (ja) | 1998-04-02 |
| EP0231495A2 (en) | 1987-08-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3814669B2 (ja) | 標的ポリヌクレオチドにハイブリッド形成するための新規な一工程方法とポリヌクレオチド化合物 | |
| US6291188B1 (en) | Metallic solid supports modified with nucleic acids | |
| EP0097373B1 (en) | Modified labeled nucleotides and polynucleotides and methods of preparing, utilizing and detecting same | |
| JP2955759B2 (ja) | 核酸配列を増幅及び検出する方法 | |
| JP3279503B2 (ja) | 修飾ヌクレオチドおよびその調製法およびその使用法 | |
| US4670379A (en) | Polynucleotide hydridization assays employing catalyzed luminescence | |
| US6794499B2 (en) | Oligonucleotide analogues | |
| JPH09506510A (ja) | 核酸が媒介する電子伝達 | |
| JPH09500525A (ja) | 核酸配列を増幅し、検出するための化学的方法 | |
| PT1877415E (pt) | Novas estratégias de marcação para a detecção sensível de analitos | |
| CA2303299A1 (en) | Oligonucleotide analogues | |
| EP0203959A1 (en) | NUCLEOTIDE ANALOGS FOR LABELING AND DETECTION OF NUCLEIC ACID. | |
| JPS63501984A (ja) | 増幅ハイブリダイゼ−ション検定法 | |
| JPS62167793A (ja) | 核酸配列の検出方法及びそのためのハイブリダイゼ−シヨンプロ−ブ | |
| WO1990008838A1 (en) | Labeling of nucleic acids with fluorescent markers | |
| KR101335218B1 (ko) | 분석물의 감응성 검출을 위한 신규한 표지화 전략 | |
| JPH04503403A (ja) | ５′―結合アクリジンを有するホスホロチオエートおよび通常のオリゴデオキシヌクレオチド | |
| ES2352509T3 (es) | Nuevas estrategias de marcaje para la detección sensible de analitos. | |
| EP0610215A1 (en) | Polynucleotide determination with selectable cleavage sites | |
| JPS60226888A (ja) | 核酸標識物質及びその使用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20030710 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20031009 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20031029 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20031226 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040210 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20020128 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040510 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040709 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20040817 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050622 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20050921 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20050927 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051222 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060426 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060511 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |