DE3650720T2

DE3650720T2 - Einschrittverfahren und Polynukleotidverbindungen zur Hybridisierung mit Ziel-Polynukleotiden

Info

Publication number: DE3650720T2
Application number: DE3650720T
Authority: DE
Inventors: Elazar Rabbani; Jannis Stavrianopoulos
Original assignee: Enzo Biochem Inc
Current assignee: Enzo Biochem Inc
Priority date: 1985-12-13
Filing date: 1986-12-15
Publication date: 2000-03-16
Anticipated expiration: 2006-12-16
Also published as: ATE181366T1; EP0231495A3; EP0916737A2; JPH07322900A; JP3814669B2; DE3650720D1; JP2002356496A; CA1339096C; EP0231495A2; US8334370B1; JP2735813B2; EP0916737A3; JPS62163699A; JP3293820B2; EP0231495B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Polynucleotidverbindung zur Verwendung in einem Verfahren zur Bildung eines Hybrids, das eine Polynucleotidverbindung und ein Ziel-Polynucleotid umfaßt. Die Polynucleotidverbindung kann als Sonde oder als Wirkstoff verwendet werden.
Die Hybridisierung mit einer Polynucleotidsonde ist ein gut bekanntes Verfahren zur Überprüfung der Anwesenheit eines Ziel-Polynucleotids. Die Hybridisierung basiert auf einer komplementären Basenpaarung. Wenn einzelsträngige Polynucleotidsonden in Lösung mit einzelsträngigen Ziel-Polynucleotiden inkubiert werden, paaren sich komplementäre Basensequenzen unter Bildung von doppelsträngigen Hybridmolekülen. Die doppelsträngigen Hybridmoleküle können von den einzelsträngigen Polynucleotidsonden durch chemische oder physikalische Mittel getrennt werden. Vgl. Grunstein M. und Wallis J., Methods in Enzymology, Band 68 (1979), R. W. U. (Hrsg.), 379-469; Dunn A. R. und Sambrook J., Methods in Enzymology, Band 65 (1980); Teil 1, 468-478; "Modifled Nucleotides and Methods of Preparing and Using the Same" von Ward D. C., Waldrop A. A. und Langer P. R., Europäische Patentveröffentlichung Nummer 0,063,879, veröffentlicht am 3. November 1982; "DNA Probes for Infectious Disease" von Berry A. J. und Peter J. B., Diagnostic Medicine (März 1984), 1-8; und "Recombinant DNA Technology: Some Applications in Clinical Microbiology" von Wie-Shing Lee und James L. Bennington, Laboratory Management (April 1985), 21-26.
Die Sonden umfassen im allgemeinen einen Polynucleotidteil und einen ein Signal aussendenden Einheitenteil, der an das Polynucleotid gebunden ist. Der Polynucleotidteil der Sonde ist fähig, eine Basenpaarung auszubilden, d. h. er hybridisiert mit einer Sequenz von Interesse oder einem Ziel-Polynucleotid. Der ein Signal aussendende Einheitenteil der Sonde besitzt oder erzeugt die Mittel, durch die die Anwesenheit einer hybridisierten Polynucleotidsonde überprüft werden kann. Die Mittel können zum Beispiel Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chromogen, Radioaktivität oder Elektronendichte sein.
Das Verfahren zum Nachweis eines Ziel-Polynucleotids unter Verwendung einer Polynucleotidsonde wird im allgemeinen durchgeführt, indem zum Beispiel zuerst ein doppelsträngiges Polynucleotid, das eine Zielsequenz darin umfaßt, aus einer Probe isoliert wird. Das doppelsträngige Polynucleotid kann durch Restriktionsendonucleaseverdau in kleinere Segmente gespalten und die Segmente durch Gelelektrophorese getrennt werden, danach werden sie von dem Gel auf einen Träger, zum Beispiel ein Nitrocellulosepapier, übertragen. In einer anderen Ausführungsform kann das doppelsträngige Polynucleotid direkt auf der Nitrocellulose ohne vorherigen Enzymverdau fixiert werden. Die fixierten Polynucleotide werden mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die die Polynucleotidsonde enthält, und der Träger wird auf etwa 80-90ºC erwärmt, um die Polynucleotiddoppelstränge zu denaturieren. (Die Doppelstränge können auch durch alkalische Mittel denaturiert werden). Man läßt die Probe, die nun sowohl das Ziel-Polynucleotid als auch die Polynucleotidsonde enthält, auf eine geeignete Temperatur abkühlen, während dieses Zeitraums erfolgt die Hybridisierung zwischen der Polynucleotidsonde und dem Ziel- Polynucleotid. Nach dem Verstreichen eines ausreichenden Zeitraums, um die Hybridisierung zu beenden, der 10 Minuten bis mehrere Stunden betragen kann, wird das fixierte Ziel-Polynucleotid gewaschen, um alle nicht gebundenen Polynucleotidsonden zu entfernen. Der ein Signal aussendende Einheitenteil der Polynucleotidsonde wird nun nachgewiesen, entweder direkt, zum Beispiel durch Radioaktivität oder Fluoreszenz, oder indirekt, zum Beispiel mittels eines Chromogens, das durch eine Enzymreaktion erzeugt wurde.
Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, daß es mehrere Schritte erfordert, bevor die Anwesenheit des Ziel-Polynucleotids überprüft werden kann. Und zwar erfordert es die Fixierung des Ziel-Polynucleotids an einen Träger, das Inkontaktbringen des Ziel-Polynucleotids mit einer Polynucleotidsonde und die Entfernung jeglicher nicht hybridisierten Polynucleotidsonden von dem Träger.
Vor kurzem wurde über ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Ziel- Polynucleotids durch einen homogenen (oder Einschritt-) Nucleinsäurehybridisierungstest berichtet. Das Verfahren umfaßt die Hybridisierung von ersten und zweiten einzelsträngigen Polynucleotiden, wobei beide lichtempfindliche Marker enthalten, mit einem komplementären einzelsträngigen Polynucleotid-Zielmolekül aus einer Probe, so daß eine nicht- radioaktive Energieübertragung zwischen den lichtempfindlichen Markern der ersten und zweiten Polynucleotide erfolgt. Mindestens einer der lichtempfindlichen Marker ist vom Absorber/Emitter-Typ, so daß die von dem anderen lichtempfindlichen Marker absorbierte Energie wieder in einer anderen Wellenlänge emittiert wird. Diese Sekundäremissionen können nur auftreten, wenn die Hybridisierung von sowohl der ersten als auch der zweiten einzelsträngigen Polynucleotide an das Ziel-Polynucleotid erfolgt ist. Die Menge der Ziel- Polynucleotide in der Probe steht mit dem Anteil des emittierten sekundären Lichts in Beziehung. Vgl. Europäische Patentveröffentlichung Nr. 0,070,685 von Michael James Heller, veröffentlicht am 26. Januar 1983.
Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, daß es zwei verschiedene Polynucleotidsonden erfordert, um die Anwesenheit eines Ziel-Polynucleotids nachzuweisen. Zusätzlich erfordert das Verfahren die Anwesenheit eines Chemilumineszenzkatalysators, einer Absorber/Emitter-Einheit und von Chemilumineszenzreagenzien, die wirksam sind zum Hervorrufen einer Lichtemission in Gegenwart des Chemilumineszenzkatalysators. Außerdem kann nur ein Marker pro Polynucleotidsonde gebunden werden, da der lichtempfindliche Marker an die Zuckereinheit eines terminalen Nucleosids gebunden wird. Auch können die voluminösen Marker die Hybridisierung der den Markern benachbarten komplementären Basen verhindern.
Vor kurzem wurde über ein Verfahren berichtet, bei dem ein Ziel-Polynucleotid mit einem Sonden-Polynucleotid hybridisiert und das so erhaltene Hybrid durch dessen Bindung an eine immobilisierte oder immobilisierbare Form eines Antikörperreagens, das bezüglich der Bindung solcher Hybride selektiv ist, immobilisiert wird. Eine Ausführungsform ist die Verwendung eines Antikörpers, der für eingelagerte Duplexmoleküle selektiv ist. Dieses Verfahren ist jedoch kein homogener Test. Zusätzlich stellt das Einlagerungsmittel das Signal nicht direkt nach der Hybridisierung der Sonde mit dem Zielmolekül bereit. Außerdem ist das Einlagerungsmittel ohne einen Verbindungsarm direkt an eine Base an Positionen gebunden, die zur Basenpaarung erforderlich sind. Vgl. Europäische Patentanmeldung Nummer 146,039 von Albarella J. P. et al., veröffentlicht am 26. Juni 1985.
Die US-A-4,547,569 offenbart ein Nucleotidmolekül, das ein einziges Einlagerungsmittel trägt, d. h. einen Phenanthridiumrest, der kovalent mit der Nucleotidphosphatgruppe durch einen Verbindungsarm verbunden ist, wodurch die Nucleotide als nützlich für Einschritt-Hybridisierungsreaktionen beschrieben werden und um die Transkription in vitro und in vivo zu verhindern.
Die EP-A-0 117 777 offenbart eine Nucleotidsonde, in der ein sich einlagernder Farbstoff (ein Acridin oder Furocumann) als Marker verwendet wird, der entweder an die 3'- und 5' -Enden der Sonde oder an die Internucleotidphosphatgruppen gebunden ist.
Die EP-A-0 124 124 offenbart Verfahren zur Analyse oder zum Nachweis von genetischem oder biologischem Material, bei denen eine chemisch markierte Sonde und eine Enzymkomponente verwendet werden. Es kann keine Veränderung in den Eigenschaften in der Verbindung und/oder der komplementären Ziel-Nucleinsäure beobachtet werden.
Die EP-A-0 097 373 offenbart modifizierte Nucleinsäuresonden, die eine ein Signal aussendende Einheit tragen, z. B. ein fluoreszierendes Mittel, das an die Phosphat-, Zucker- oder Baseneinheit gebunden ist, welche in heterogenen Tests verwendet werden.
In der Literatur wurde über fluoreszierende Einlagerungseinheiten berichtet, die an ein Polynucleotid gebunden sind. Sie werden hergestellt durch Umsetzung der Adenin- oder Cytosinbasen mit einem bifunktionellen Reagens, wie Chloracetaldehyd, um eine aromatische tricyclische Verbindung zu erzeugen. Vgl. "Fluorescent Adenosine and Cytidine Derivates" von Barrio J. R., Secrist J. A. III und Leonard N. J., B. B. R. S. 46 (1972), (2), 597- 604; und "Physical Studies of Chloroacetaldehyde Labelled Fluorescent DNA" von Lee C. H. und Wetmur J. G., B. B. R. S. 50 (3) (1973), 879-885. Dieses Verfahren weist den Nachteil auf, daß die in Fluoreszenzeinheiten umgewandelten Basen keine Basenpaarung ausbilden können und solche Fluoreszenzeinheiten folglich das Hybridisierungsverfahren destabilisieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Polynucleotidverbindung, die ein Polynucleotid umfaßt, das mindestens zwei Einheiten umfaßt, die nach Hybridisierung mit einem komplementären Polynucleotid eine Veränderung in den Eigenschaften dieses Hybrids bewirken kann, die in einer homogenen Reaktion nachweisbar ist, wobei jede dieser Einheiten kovalent oder nicht-kovalent durch einen Verbindungsarm mit der Baseneinheit, der Zuckereinheit oder der Phosphateinheit eines Nucleotids in diesem Polynucleotid verbunden ist, wobei die Einheiten an Nucleotide gebunden sind, die durch einen Bereich von etwa 10 anderen Nucleotiden voneinander getrennt sind, mit der Maßgabe, daß Verbindungen, bei denen alle Einheiten entweder an die 5' - und/oder 3' -Enden der Verbindungen oder an Internucleotidphosphatgruppen gebunden sind, ausgeschlossen sind.
Die Polynucleotidverbindung wird in einem Verfahren zur Bildung eines Hybrids verwendet, das ein Ziel-Polynucleotid und die Polynucleotidverbindung umfaßt. Die Polynucleotidverbindung kann verwendet werden zum Nachweis der Anwesenheit eines einzel- oder doppelsträngigen Ziel-Polynucleotids in einem homogenen, d. h. einem Einschritt-Test oder zur kompetitiven Verdrängung eines homologen Polynucleotids aus einem doppelsträngigen Ziel-Polynucleotid oder zur stabilen Bindung an ein einzelsträngiges Ziel-Polynucleotid, um die Transkription oder Replikation des Ziel-Polynucleotids zu verhindern.
Die vorstehende Polynucleotidverbindung umfaßt ein Polynucleotid und mindestens zwei Einheiten, die an das Polynucleotid durch Verbindungsarme gebunden sind. Das Polynucleotid ist zur Basenpaarung oder Hybridisierung mit einem Ziel-Polynucleotid fähig. Nach der Hybridisierung per se des Polynucleotidteils der Sonde mit dem Ziel-Polynucleotid, wird eine Veränderung in mindestens einer Eigenschaft von entweder der Polynucleotidverbindung oder von dem Ziel-Polynucleotid oder von beiden bewirkt, wobei die Veränderung das Signal darstellt. Falls die beeinflußte Eigenschaft die der Polynucleotidverbindung ist, kann sie entweder die des Polynucleotids oder die der Einheit sein.
Wenn die Polynucleotidverbindung zum Nachweis der Anwesenheit eines Ziel- Polynucleotids durch die Veränderung in einer Eigenschaft verwendet wird, dann dient die Polynucleotidverbindung als Polynucleotidsonde. Wenn die Polynucleotidverbindung verwendet wird, um ein homologes Polynucleotid aus einem doppelsträngigen Ziel-Polynucleotid zu verdrängen oder um an ein einzelsträngiges Ziel-Polynucleotid stabil zu binden, dann dient die Polynucleotidverbindung als Polynucleotidwirkstoff.
Bevorzugte Polynucleotidverbindungen umfassen mindestens zwei Einheiten der Struktur
worin B eine Base bedeutet, ausgewählt aus Pyrimidinen, Purinen und Deazapurinen, mit der Maßgabe, daß, immer wenn B ein Pyrimidin ist, der Zucker an die N¹-Position des Pyrimidins gebunden ist, und, immer wenn B ein Purin oder Deazapurin ist, der Zucker an die N&sup9;-Position des Purins oder Deazapurins gebunden ist;
worin "Phen" einen Phenanthridinrest bedeutet;
worin L. A, ein Verbindungsarm ist, der mindestens drei Kohlenstoffatome umfaßt und an der 5-Position des Phenanthridinrests gebunden ist; und
worin Z entweder H oder O- ist.
Fig. 1 veranschaulicht die Synthese eines aromatischen Farbstoffs, der an ein Polynucleotid gebunden werden kann, um eine Polynucleotidverbindung zu erzeugen.
Fig. 2 zeigt die Bindung des aromatischen Farbstoffs von Fig. 1 an (a) ein Dextran und (b) ein Polynucleotid.
Fig. 3 zeigt die Einlagerung eines aromatischen Farbstoffs, der an ein Polynucleotid gebunden ist, in ein Hybrid, das durch die Hybridisierung des Polynucleotids mit einem Ziel-Polynucleotid gebildet wurde.
Ein Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung einer Polynucleotidsonde, die ein Polynucleotid und mindestens zwei Einheiten umfaßt, die an das Polynucleotid gebunden sind, wobei nach Hybridisierung per se des Polynucleotids mit dem Ziel-Polynucleotid eine Veränderung in mindestens einer Eigenschaft von entweder der Polynucleotidverbindung, von dem Ziel-Polynucleotid oder von beiden bewirkt wird, und wobei die Veränderung das Signal darstellt.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung von Polynucleotidverbindungen, die ein Polynucleotid und mindestens zwei Fluoreszenz-emittierende Einheiten umfassen, die an das Polynucleotid gebunden sind, wobei die Fluoreszenz-emittierenden Einheiten eine Verschiebung der Emissionsenergie der Fluoreszenz nach der Einlagerung in ein Polynucleotid-Hybrid zeigen, und wobei die Fluoreszenz-emittierenden Einheiten sich im wesentlichen nur in ein Hybrid einlagern können, das als Ergebnis der Hybridisierung des Polynucleotidteils der Polynucleotidverbindung mit dem Ziel- Polynucleotid gebildet wurde.

A. Allgemeine Beschreibung der Polynucleotidverbindung

Diese Erfindung offenbart eine Polynucleotidverbindung. Die Polynucleotidverbindung umfaßt einen Polynucleotidteil und mindestens zwei Einheitenteile, die an das Polynucleotid gebunden sind. Die Einheiten sollten an Nucleotideinheiten gebunden sein, die durch einen Bereich von etwa 10 anderen Nucleotideinheiten voneinander getrennt sind. Dies dient dazu, eine Zielmolekül-Spezifität für den Polynucleotidteil vorzusehen. Der Einheitenteil weist eine Eigenschaft auf, die nach der Hybridisierung des Polynucleotidteils der Polynucleotidverbindung mit einem Ziel-Polynucleotid eine Veränderung in einer Eigenschaft von entweder der Polynucleotidverbindung oder dem Ziel-Polynucleotid in einer homogenen Reaktion bewirken kann. Die Eigenschaftsveränderung in der Polynucleotidverbindung kann entweder in dem Polynucleotidteil oder in dem Einheitenteil erfolgen.
Diese Eigenschaftsveränderung kann in zweierlei Hinsicht genutzt werden. Ein Weg ist die Überwachung dieser Eigenschaftsveränderung, um die Anwesenheit eines Ziel- Polynucleotids nachzuweisen. In diesem Fall wird die Polynucleotidverbindung als Polynucleotidsonde verwendet. Ein zweiter Weg ist, diese Eigenschaftsveränderung zu nutzen, um entweder die Verdrängung eines Polynucleotids aus einem Ziel-Polynucleotid zu erlauben, das zu dem des Polynucleotidteils der Polynucleotidverbindung homolog ist, oder um den Polynucleotidteil der Polynucleotidverbindung stabil an ein Ziel-Polynucleotid zu binden. In diesem Fall wird die Polynucleotidverbindung als Polynucleotidwirkstoff verwendet.

B. Beschreibung der Polynucleotidsonde

1. Allgemeine Beschreibung

Diese Erfindung erlaubt, daß die Polynucleotidverbindung als Polynucleotidsonde verwendet werden kann, um die Anwesenheit eines Ziel-Polynucleotids in einem homogenen oder einem Einschritt-Test nachzuweisen. Die Polynucleotidsonde umfaßt ein Polynucleotid und mindestens zwei Einheiten, die an das Polynucleotid gebunden sind. Die Einheit weist eine Eigenschaft auf, so daß nach der Hybridisierung des Polynucleotidteils der Polynucleotidsonde mit dem Ziel-Polynucleotid die Eigenschaft eine nachweisbare Veränderung in einer Eigenschaft von entweder der Polynucleotidsonde, dem Ziel-Polynucleotid oder beiden bewirken kann. Falls die Hybridisierung zwischen dem Polynucleotidteil der Polynucleotidsonde und dem Ziel-Polynucleotid nicht wirklich erfolgt, dann wird die Verände rung in einer Eigenschaft nicht bewirkt. Folglich erlauben die Einheiten den Nachweis eines Ziel-Polynucleotids in einem Schritt; ein zusätzlicher Schritt zur Entfernung der nicht gebundenen Polynucleotidsonden aus der Probe vor der Überprüfung der Anwesenheit des Ziel- Polynucleotids kann durchgeführt werden, ist aber nicht erforderlich.
Die Eigenschaft der Einheit kann zum Beispiel deren Fähigkeit sein, eine bestimmte Orientierung oder Konformation im Hinblick auf das Polynucleotidsonde/Ziel-Polynucleotid-Hybrid anzunehmen. Die Eigenschaftsveränderung kann zum Beispiel eine Veränderung in der Strahlungsemission, der Wechselwirkung von molekularen Dispersionskräften oder der Schwebedichte sein. Veränderungen in der Strahlungsemission umfassen Veränderungen im Licht-, Ultraviolett-, Infrarot-, Fluoreszenz-, Phosphoreszenz-, Röntgenstrahlen- oder Gamma-Strahlenspektrum der Einheit. Veränderungen in der Wechselwirkung von molekularen Dispersionskräften umfassen Veränderungen in der Schmelztemperatur des Polynucleotidsonde/Ziel-Polynucleotid-Hybrids.
Die Einheit kann jede beliebige Länge, Größe oder Form aufweisen. Sie kann Alkylgruppen oder aromatische Fragmente gebunden haben, die zum Verleihen ihrer spezifischen Eigenschaft nicht erforderlich sind. Vorzugsweise wird die Einheit an einen Verbindungsarm gebunden, nachdem das Nucleotid, das den Verbindungsarm umfaßt, in das Polynucleotid eingebaut ist. Das heißt, die Einheit wird nach der Erzeugung der gewünschten Basensequenz angehängt. Der Grund dafür ist, daß die Einheit üblicherweise ein voluminöses Molekül ist und bewirken kann, daß das Nucleotid ein ungeeignetes Substrat für die Polymeraseenzyme ist. Außerdem kann die Einheit ein Inhibitor der Polymeraseenzyme sein.

2. Beschreibung einer Einheit

Eine Einheit, die die vorstehend beschriebenen Anforderungen erfüllt, ist ein Einlagerungsmittel. Ein Einlagerungsmittel ist ein Mittel, das sich in Gegenwart von doppelsträngigen Polynucleotiden selbst zwischen zwei benachbarten Basenpaaren in den Doppelsträngen positionieren kann und ferner mit den Basenpaaren des Doppelstrangs in Wechselwirkung tritt. Die Hybride können DNA/DNA, DNA/RNA oder RNA/RNA sein. Die Eigenschaft des Einlagerungsmittels ist sein Einlagerungsvermögen in ein Polynucleotid-Hybrid.
Im allgemeinen sind die Einlagerungsmittel aromatische Farbstoffe. Diese sich einlagernden aromatischen Farbstoffe weisen eine planare Ringstruktur und eindeutige Fluores zenzemissionsspektren auf. Die Fluoreszenz zeigt die Elektronendelokalisierung des Einlagerungsmittels an und wird durch die Induktionswirkung von Substituentengruppen, die an den Farbstoff gebunden sind, und durch quenchende Mittel beeinflußt.
Es wird angenommen, daß, wenn der aromatische Farbstoff in einer wäßrigen oder wäßrigen/organischen Lösung gelöst ist, das Wasser in der Lösung die Fluoreszenz des gelösten aromatischen Farbstoffs signifikant quencht durch Erhöhung des Energiegrundzustands des aromatischen Farbstoffs auf ein Niveau, das höher ist, als wenn der Farbstoff in einem organischen Medium vorliegt. Falls sich der aromatische Farbstoff in ein Polynucleotid-Hybrid einlagert, wird der Farbstoff vor dem Wasser geschützt. Der Grund dafür ist, daß das Hybrid einen verhältnismäßig hydrophoben Innenraum (die Basen) und einen hydrophilen Außenraum (die Phosphate) enthält. Das Wasser aggregiert folglich im Außenbereich des Hybrids und nicht im Innenraum. Da die Fluoreszenzemission des eingelagerten Farbstoffs nicht mehr länger durch das Wasser gequencht wird, verschiebt sich der Energiegrundzustand zu einem niedrigeren Energieniveau, und das Ergebnis ist, daß sich das Fluoreszenzemissionsmaximum zu einer längeren Wellenlänge verschiebt. Die Fluoreszenzintensität des Farbstoffs nach der Einlagerung ist ebenfalls um ein Vielfaches erhöht. Diese Verschiebung in der Fluoreszenzemission und -intensität ist folglich eine Eigenschaftsveränderung, die in der Einheit nur nach der Hybridisierung des Polynucleotidteils der Polynucleotidsonde mit dem Ziel-Polynucleotid bewirkt wird.
Eine einzelsträngige Polynucleotidsonde, die ein Polynucleotid und mindestens einen aromatischen Einlagerungsfarbstoff umfaßt, der an das Polynucleotid gebunden ist, ist folglich in der Lage, ein Ziel-Polynucleotid in einem homogenen Nachweis oder in einem Einschrittnachweis nachzuweisen. Nach der Hybridisierung des Polynucleotidteils dieser Polynucleotidsonde mit dem Ziel-Polynucleotid, um ein Sonde/Ziel-Polynucleotid-Hybrid zu bilden, lagert sich der aromatische Farbstoff in eine Furche des gebildeten Sonde/Ziel- Polynucleotid-Hybrids zwischen gestapelten Basenpaaren ein. Diese Einlagerung führt zu einer Verschiebung in der Fluoreszenzemission und -intensität des Einlagerungsmittels. Da diese Verschiebung in der Fluoreszenz nur erfolgt, wenn der Polynucleotidteil der Polynucleotidsonde tatsächlich mit dem Ziel-Polynucleotid in einer Probe hybridisiert, ist kein zusätzlicher Schritt erforderlich, um die nicht gebundenen Polynucleotidsonden aus der Probe zu entfernen. Folglich kann man durch einfaches Messen des Fluoreszenzspektrums der Probe bestimmen, ob die Hybridisierung erfolgt ist, und auf diese Weise die Anwesenheit des Ziel-Polynucleotids nachweisen.
Jeder fluoreszierende aromatische Farbstoff, der sich in ein Polynucleotid-Hybrid einlagern kann, und der eine Verschiebung in der Fluoreszenzemission nach der Einlagerung durchmacht, ist erfindungsgemäß geeignet. Beispiele von geeigneten aromatischen Farbstoffen umfassen, aber sind nicht darauf begrenzt, Phenanthridine, Acridine und Anthracycline. Beispiele von Phenanthridinen umfassen, aber sind nicht darauf begrenzt, Ethidium, Propidium, Butidium, Pertidium, Dimidium und Phenidium.

3. Beschreibung des Polynucleotids

Der Polynucleotidteil der Polynucleotidsonde sollte mindestens etwa 12 Basen umfassen, um der Sonde Spezifität zu verleihen. Verfahren zur Herstellung eines Polynucleotids, das zu einem Ziel-Polynucleotid im wesentlichen komplementär ist, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Das am häufigsten angewendete Verfahren umfaßt rekombinante DNA und Clonierung. Ein häufig verwendeter Clon ist der M13-Phage. Kurz zusammengefaßt erfordert das Verfahren (1) die Spaltung der M13-RF (replikative Form)- DNA mit einem der Restriktionsenzyme, die eine einzigartige Erkennungssequenz in dem Clonierungsbereich aufweisen, (2) die Ligierung des gewünschten Polynucleotids in die gespaltene Insertionsstelle, (3) die Transformation von E. coli-Wirtszellen, (4) die Züchtung dieser Wirtszellen auf Nährstoffe enthaltenden Platten und die Selektion der farblosen Plaques, (5) die Vermehrung der Phagen von einzelnen Plaques in kleinen Kulturen, (6) die Ernte der Phagen aus dem Kulturüberstand und die Entfernung des Proteinüberzugs durch die Behandlung mit Phenol, und (7) die Fällung der gereinigten DNA mit Ethanol. Alle Einzelheiten kann man in "M13 Cloning and Sequencing Handbook", veröffentlicht von Amersham Corporation (1983), und in "Molecular Cloning" von Maniatis T., Fritsch E. F. und Sambrook J., veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory (1982), finden.
Spezifische Polynucleotide können auch mit einem DNA-Synthetisiergerät, wie einem von Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, unter Verwendung der geeigneten Nucleotidvorläufer hergestellt werden. Gemäß dem Hersteller kann man Polynucleotide von etwa 120-200 Basen mit großer Spezifität herstellen. Die Syntheseschemata umfassen die Verwendung von Phosphoramiditen, um vorherbestimmte Basen miteinander zu verknüpfen. Andere Hersteller von Polynucleotid-Synthe tisiergeräten umfassen Biosearch Inc., 2980 Kerner Boulevard, San Rafael, CA 94901, und Beckman Instruments, 1050 Page Mill Road, Palo Alto, CA 94304.
Ein Polynucleotid, das einen Verbindungsarm oder eine Einheit an der terminalen Position umfaßt, kann auch unter Verwendung des Enzyms RNA-Ligase und zum Beispiel der Verbindungen pCp oder pUp, worin ein Verbindungsarm oder eine Einheit an das C oder U gebunden ist, hergestellt werden. Die Polynucleotide können nicht durch Nicktranslation erzeugt werden, da für diese Erfindung die Polynucleotidsonden einzelsträngig sein müssen.

4. Art der Polynucleotidsonden

Die Einheiten müssen erlauben, daß eine Eigenschaftsveränderung nur dann bewirkt wird, wenn der Polynucleotidteil der Polynucleotidsonde mit dem Ziel-Polynucleotid hybridisiert. Die Einheiten dürfen nicht erlauben, daß die Eigenschaftsveränderung in einem Hybrid bewirkt wird, in dem einer der Hybridstränge nicht der des Polynucleotid-Zielmoleküls ist. Außerdem muß das Ziel-Polynucleotid, mit dem der Polynucleotidteil der Polynucleotidsonde hybridisiert, eines sein, das aus der Probe stammt.
Folglich muß die Polynucleotidsonde der Probe, die das Ziel-Polynucleotid umfaßt, einzig in einzelsträngiger Form bereitgestellt werden. Falls die Polynucleotidsonde der Probe als doppelsträngiges Hybrid bereitgestellt und dann in der Probe denaturiert wird, bewirken die Einheiten eine Veränderung in einer Eigenschaft, wenn diese Polynucleotidsonde mit dem Polynucleotid hybridisiert, mit dem es ursprünglich hybridisiert wurde. Dies ergibt ein falsch-positives Ergebnis.
Es wird bevorzugt, daß die Polynucleotidsonde ein integraler Strang ist. Das heißt, eine Veränderung in einer Eigenschaft von entweder den Einheiten oder dem Polynucleotid sollte durch die Einheiten nach der Hybridisierung per se von nur zwei Strängen bewirkt werden. Dies erlaubt den Nachweis eines Ziel-Polynucleotids mit nur einem Polynucleotidsondenmolekül. Es kann jedoch Fälle geben, in denen die Polynucleotidsonde zwei verschiedene Polynucleotidstränge umfaßt. Dies kann zum Beispiel der Fall sein, wo jeder Polynucleotidstrang verschiedene Einheiten enthält und die zwei Polynucleotidstränge mit benachbarten, sich nicht überdeckenden Sequenzen auf dem Ziel-Polynucleotid hybridisieren. Die Einheiten eines jeden Strangs können keine Veränderung in einer Eigenschaft bewirken, aber alle Einheiten zusammen können nach der Hybridisierung per se eine Veränderung in einer Eigenschaft bewirken. Eine solche Situation ist in dieser Erfindung eingeschlossen.

5. Beschreibung des Verbindungsarms

Die Einheit ist mit einem Polynucleotid durch einen Verbindungsarm verbunden, so daß es eine minimale sterische Behinderung zwischen der Einheit und dem Polynucleotid gibt, und so daß die Einheit die notwendige Bewegungsfreiheit hat, die ihr im Hinblick auf das Polynucleotidsonde/Ziel-Polynucleotid-Hybrid die richtige Orientierung oder Konformation erlaubt. Der Begriff "Verbindungsarm" bezieht sich auf ein Fragment in einer Polynucleotidsonde, die den Einheitenteil mit dem Polynucleotidteil verbindet. Jegliche Atome in diesem Fragment, die für das Vorhandensein der Eigenschaft in der Einheit nicht wesentlich sind oder nicht Teil des natürlichen Nucleotids sind, sind Teil des Verbindungsarms.
Der Verbindungsarm und/oder die Einheit darf die Hybridisierung der Polynucleotidsonde mit dem Ziel-Polynucleotid nicht wesentlich beeinträchtigen. Daher sollte der Verbindungsarm und/oder die Einheit: (a) die Base, an die er bzw. sie gebunden ist, nicht an der Paarung mit deren komplementären Base hindern; (b) die Komplexbildung der komplementären Basen nicht verhindern, um die Hybridisierung der Polynucleotidsonde mit dem Ziel- Polynucleotid nicht zu verhindern; (c) die Strangverlängerung nicht beeinflussen (sofern er bzw. sie sich an einer terminalen Position der Polynucleotidsequenz befindet); und (d) vorzugsweise die Konformation der Zuckereinheiten in dem Polynucleotid sollte nicht verändern werden.
Der Verbindungsarm ist im allgemeinen kovalent mit dem Polynucleotid verbunden. Die Bindung erfolgt vorzugsweise an der Baseneinheit, obwohl sie auch an der Zuckereinheit oder der Phosphateinheit erfolgen kann. Die Baseneinheit kann entweder ein Purin oder ein Pyrimidin sein. Wie vorstehend erwähnt, sollte die Bindung des Verbindungsarms an die Baseneinheit vorzugsweise an einer Position erfolgen, an der der Verbindungsarm die Watson-Crick-Paarung der Basen nicht stört. Geeignete Positionen sind zum Beispiel die Positionen 5 und 6 von Uracil, die Positionen 5 und 6 und die exocyclische 4- Aminoposition von Cytosin, die Positionen 7 und 8 von Deazapurin, die Position 8 von Guanin und die Position 8 und die exocyclische 6-Aminoposition von Adenin. Basen, die an diesen Positionen Substituenten enthalten, werden daher für die Bindung des Verbindungsarms an diese Positionen nicht bevorzugt. Ein bevorzugter Verbindungsarm zur Bindung an die Baseneinheit ist Allylamin. Vgl. Europäische Patentveröffentlichung Nr. 0,063,879 von Ward David et al., veröffentlicht am 3. November 1982, die hier unter Bezugnahme eingeschlossen ist.
Bevorzugte Positionen an Basen sind die 5- und 6-Positionen von Pyrimidinen und die 7-Position von Deazapurinen, da 8-Purinnucleotide schlechte Substrate für die Polymeraseenzmye sind, und die exocyclische Aminogruppe von entweder Adenin oder Cytosin an der Basenpaarung mit Thymin und Uracil bzw. mit Guanin beteiligt ist. Obwohl ein Substituent an einer exocyclischen Aminogruppe einer Base die Base nicht an der Paarung mit deren komplementären Base hindert, kann der Substituent die optimale Ausrichtung zwischen den zwei Basen verändern. Bevorzugte Pyrimidine sind Uracil und Cytosin, wobei die Position 5 die bevorzugte Position ist. Bevorzugte Purine sind Deazaadenin und Deazaguanin.
Es gibt wenige Einschränkungen was die Bedingungen anbetrifft, die zur Bindung eines Verbindungsarms an die Baseneinheit verwendet werden können. So kann jeder pH- Bereich, jeder Temperaturbereich, jede Reaktionszeit, jedes Lösungsmittel oder jeder Puffer verwendet werden, solange wie die funktionellen Gruppen an der Base nicht in einem Ausmaß modifiziert werden, der die Base an der Paarung mit deren komplementären Base hindert, und solange wie die Baseneinheit von der Zuckereinheit nicht abgespalten wird. Die optimalen Bedingungen hängen von dem Verbindungsarm und der Base ab und können vom Fachmann leicht bestimmt werden.
Der Verbindungsarm, wenn er an eine Base gebunden ist, umfaßt die Gruppe von Atomen, die mit der Base und mit einer Einheit verbunden sind. Der Verbindungsarm kann durch eine Reihe von Verfahren an die Baseneinheit gebunden werden und muß eine erste funktionelle Gruppe aufweisen, durch die er an die Base gebunden werden kann. Die Verbindungsarm muß auch eine zweite funktionelle Gruppe aufweisen, durch die er an die Einheit gebunden werden kann. Der Verbindungsarm kann an die Base oder die Einheit durch eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Einzelbindung, Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung, Kohlenstoff-Stickstoff-Einzelbindung, Kohlenstoff-Stickstoff-Doppelbindung, Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung, Kohlenstoff-Sauerstoff-Einzelbindung, Kohlenstoff-Schwefel-Einzelbindung oder eine Kohlenstoff-Silicium-Einzelbindung gebunden sein. Geeignete funktionelle Gruppen umfassen, aber sind nicht darauf begrenzt, Carbonsäureester, Carbonsäurehalo genide, Carbonsäurethioester, Imide, Imine, Ketone, Aldehyde, Epoxide, Halogenide, n-Hydroxysuccinimidester, Imidate, Anhydride, Isocyanate, Isothiocyanate und Thioester.
Es wird bevorzugt, daß der an die Baseneinheit gebundene Verbindungsarm eine olefinische Bindung an der alpha-Position bezogen auf die Base umfaßt. Die Anwesenheit einer solchen alpha-olefinischen Bindung dient dazu, den Verbindungsarm räumlich von der Base entfernt zu halten und auf diese Weise die Beeinträchtigung des Hybridisierungsverfahrens durch den Verbindungsarm und/oder die Einheit auf ein Minimum zu beschränken.
Es ist nicht erforderlich, daß der Verbindungsarm an die Base als ein Fragment gebunden ist. Der Verbindungsarm kann hergestellt werden durch Bindung eines ersten Fragments an die Base, gefolgt von der Bindung eines zweiten Fragments an das erste Fragment. Beispiele von geeigneten ersten Fragmenten sind:
-CH=CH-CH&sub2;-NH-; -CH=CH-CH&sub2;-CH&sub2;-S-; und
-CH=CH-CH&sub2;-O-CH&sub2;-CH&sub2;-NH-
Beispiele von geeigneten zweiten Fragmenten sind:
und
Allgemeine Verfahren zur Bindung eines Verbindungsarms an eine Base werden diskutiert bei Ruth J. L. und Bergstrom D. E., J. Org. Chem. 43 (1978), 2870; Bergstrom D. E. und Ogawa M. K., J. Amer. Chem. Soc. 100 (1978), 8106; und Bigge C. F., Kalarithis P., Deck J. R. und Mertes M. P., J. Amer. Chem. Soc. 102 (1980), 2033. Ein bevorzugtes Verfahren ist das in der Europäischen Patentanmeldung Nummer 0,063,879 von Ward David C. et al., veröffentlicht am 3. November 1982, ausführlich offenbarte Verfahren, die hier unter Bezugnahme eingeschlossen ist. Das Verfahren umfaßt die Umsetzung eines Verbindungsarms oder eines Verbindungsramfragments, der bzw. das eine alpha-Vinylgruppe enthält, mit einer mercuierten Base in Gegenwart von K&sub2;PdCl&sub4;, wobei das Quecksilber als Hg&spplus; an die Position der Base gebunden wird, die mit dem Verbindungsarm umgesetzt werden soll. Das Schema ist nachstehend gezeigt.
Es gibt keine besonderen Größen- oder Zusammensetzungsbeschränkungen für den Verbindungsarm. Der Verbindungsarm kann etwa zwei Kohlenstoffatome bis etwa eine beliebige Zahl von Kohlenstoffatomen enthalten, solange wie der Verbindungsarm erlaubt, daß sich der aromatische Farbstoff in das Polynucleotidsonde/Ziel-Polynucleotid-Hybrid einlagert, und nicht erlaubt, daß sich der aromatische Farbstoff in andere Stränge einlagert. Der Verbindungsarm kann Heteroatome und ungesättigte Bereiche enthalten. Der Verbindungsarm kann aliphatische, alicyclische oder aromatische Einheiten umfassen. Die tatsächliche Größe oder Zusammensetzung des Verbindungsarms hängt von der gewählten Einheit und dem Verfahren ab, durch das die Einheit eine Veränderung in einer Eigenschaft nach der Hybridisierung per se des Polynucleotidteils der Polynucleotidsonde mit dem Ziel-Polynucleotid bewirkt.
Die Bindung des Verbindungsarms an die Zuckereinheit der Polynucleotidsequenz kann durch eine Schiffsche Base an das 1'-Aldehyd nach Depurinierung oder Depyrimidierung von vorher ausgewählten Basen erfolgen, oder sie kann in dem Fall, wenn der Zucker eine Ribose ist, an das 2'-Hydroxy erfolgen. Der Verbindungsarm, wenn er an das 1'- Aldehyd gebunden ist, kann zum Beispiel eine Amin-, Hydrazin- oder Hydrazidfunktionalität umfassen. Ein solches Verfahren wird offenbart in der angemeldeten US-Patentanmeldung mit der Anmeldungsnummer 06/765,288 von Jannis Stavrianopoulos, eingereicht am 13. August 1985 und an den gleichen Rechtsnachfolger übertragen, das hier unter Bezugnahme eingeschlossen ist. Die Bindung eines Verbindungsarms an die Phosphateinheit kann durch Alkylierung der Phosphateinheit erfolgen. Vgl. US-Patent Nr. 4,469,863 von P. O. P. Ts' O und Miller P. S., das hier unter Bezugnahme eingeschlossen ist.
Wenn der Verbindungsarm an die Baseneinheit gebunden wird, wird bevorzugt, ihn an die Base auf der Nucleosid- oder Nucleotidebene zu binden. Der Grund dafür ist, daß die Reaktionsbedingungen, die erforderlich sein können, um den Verbindungsarm an die Base zu binden, unerwünschte Nebenreaktionen in einem Polynucleotid bewirken können. Außerdem kann die Bindung auf der Polynucleotidebene widersprüchliche und nicht reproduzierbare Ausbeuten ergeben. Die Bindung auf der Nucleosid- oder Nucleotidebene erlaubt, daß das modifizierte Nucleosid oder Nucleotid zuerst gereinigt und dann in ein Polynucleotid eingebracht wird. Das Einbringen kann entweder durch Clonierung, zum Beispiel in einen M13-Vektor, oder durch Synthese mit einem Polynucleotid- Synthetisiergerät, wie vorstehend offenbart, erfolgen.
Außerdem wird bevorzugt, daß das modifizierte Nucleotid ein verhältnismäßig wirksames Substrat für die im allgemeinen untersuchten Nucleinsäurepolymerasen ist, da ein besonders wirksamer Weg des Einbaus des modifizierten Nucleotids in ein Polynucleotid der durch Nucleinsäurepolymerasen ist. Folglich sollte der Verbindungsarm entweder den Wirkort auf dem Enzym oder die komplementäre Basenpaarung des modifizierten Nucleotids sterisch nicht behindern. Die Substitution an Positionen, die die normale "Anti"-Nucleosidkonformationen verändern, sollte ebenfalls vermieden werden, da solche Konformadonsänderungen üblicherweise das modifizierte Nucleotid zu einem ungeeigneten Substrat für die Polymeraseenzmye machen.
Wenn der Verbindungsarm an das 1'-Aldehyd des Zuckers gebunden wird, muß der Verbindungsarm nach der Erzeugung des Polynucleotidteils der Polynucleotidsonde gebunden werden. Der Grund dafür ist, daß die Bindung des Zuckers ein freies Aldehyd an der 1-Position des Zuckers erforderlich macht. Das freie Aldehyd wird durch Depurinierung oder Depyrimidierung erzeugt. Eine Einheit, die einen Zucker und ein Phosphat ohne eine Base umfaßt, ist kein Substrat für die Polymeraseenzyme. Folglich muß der Verbindungsarm gebunden werden, indem zuerst die gewünschte Polynucleotidsequenz selektiv depuriniert oder depyrimidiert wird und dann der Verbindungsarm an den Zucker durch das Aldehyd gebunden wird. Wenn der Verbindungsarm an das 2'-Hydroxy eines Ribosezuckers gebunden wird, kann der Verbindungsarm auf der Nucleotid- oder Polynucleotidebene gebunden werden. Der Grund dafür ist, daß modifizierte Nucleotide in ein Polynucleotid durch ein Gen-Synthetisiergerät eingebracht werden können. Wenn der Verbindungsarm an das Phosphat gebunden wird, muß der Verbindungsarm auf der Nucleosid- oder Nucleotidebene gebunden werden, so daß die Bindung nicht an Positionen erfolgt, die von dem Phosphat verschieden sind.

6. Bindung der Einheit

Die Einheit kann kovalent mit dem Verbindungsarm verbunden sein, zum Beispiel durch eine der vorstehend beschriebenen funktionellen Gruppen. Ein Beispiel wäre die Reaktion einer Amino-, Thio- oder Oxogruppe an der Einheit mit einer anderen funktionellen Gruppe an dem Verbindungsarm, wie ein Isothiocyanat, ein Epoxid, ein Carbodiimid, ein Carbonsäureanhydrid, ein Carbonsäureester, ein Carbonsäurechlorid, eine Carbonsäure, ein Thioester, ein Imin, ein Halogen, ein Keton oder ein Aldehyd.
Die Einheit kann auch nicht-kovalent mit dem Verbindungsarm verbunden sein, zum Beispiel durch einen Chelatbildner, der an den Verbindungsarm und auch an die Einheit gebunden ist. Ein Koordinationsmetall kann die Einheit und den Verbindungsarm unter Bildung eines Komplexes verbinden. Bevorzugte Chelatbildner umfassen, aber sind nicht darauf begrenzt, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und trans-Diaminocyclohexantetraessigsäure (DCTA); bevorzugte Metalle umfassen die verschiedenen Übergangsmetalle, insbesondere jene der Lanthanoidenmetalle. Obwohl die nicht-kovalente Bindung eines aromatischen Farbstoffs an einen Verbindungsarm nicht so stabil oder so stark ist wie eine kovalente Bindung, kann die elektrostatische Anziehung eine ausreichende Bindungsstärke bereitstellen, um eine Veränderung in einer Eigenschaft zu bewirken, weil dieser Test in einem Schritt durchgeführt wird, der nicht viele Manipulationen nach der Zugabe der Polynucleotidsonde zu der das Ziel-Polynucleotid enthaltenden Probe umfaßt. Dies kann der Fall sein, wenn die Einheit ein aromatischer Farbstoff ist und der Einlagerungsschritt alleine für eine Veränderung in einer Eigenschaft erforderlich ist. Hier kann die Einlagerung des aromatischen Farbstoffs in das gebildete Polynucleotidsonde/Zielmolekül-Hybrid eine Verschiebung in der Fluoreszenzemission bewirken, so daß die Anwesenheit des Ziel-Polynucleotids überprüft werden kann.
Verschiedene Bedingungen können zur Bindung einer sich einlagernden, aromatischen Farbstoffeinheit an einen Verbindungsarm verwendet werden. Im allgemeinen kann ein pH-Bereich von etwa 4 bis etwa 10, vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 8, eine Temperatur von etwa 20ºC bis etwa 100ºC, vorzugsweise von etwa 40ºC bis etwa 65ºC, ein beliebiges Lösungsmittel und ein beliebiger Puffer oder Katalysator verwendet werden, solange wie der pH-Wert, die Temperatur, das Lösungsmittel oder der Puffer keine der Gruppen oder Einheiten des Polynucleotids modifiziert. So sollten zum Beispiel Reagenzien oder Bedingungen vermieden werden, die das Polynucleotid depurinieren oder desaminieren können. Es gibt auch relativ wenige Beschränkungen was die Reaktionszeit anbetrifft. Der optimale ph-Wert, die Temperatur, das Lösungsmittel oder die Reaktionszeit zur Bindung eines aromatischen Farbstoffs an einen Verbindungsarm hängt von dem Verbindungsarm, dem aromatischen Farbstoff und den umzusetzenden Funktionalitäten ab. Die Bedingungen können vom Fachmann leicht bestimmt werden.
Die meisten der sich einlagernden, aromatischen Fluoreszenzfarbstoffe sind in Wasser nicht löslich, und so erfordert die Bindung des aromatischen Farbstoffs an den Verbindungsarm des Polynucleotids ein gemischtes mischbares Lösungsmittelsystem, wie ein Gemisch von Wasser mit entweder Ethanol, Methanol, Tetrahydrofuran, Dioxan, Propanol, ausgewählten Ethern, Estern, Ketonen, Amiden, Glycerin, Aceton, Pyridin, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Hexamethylphosphoramid. In einer anderen Ausführungsform könnte ein nicht mischbares Zweiphasenlösungsmittelsystem verwendet werden, worin der aromatische Farbstoff in einem organischen Lösungsmittel gelöst ist und das Polynucleotid in einem wäßrigen Lösungsmittel gelöst ist. In diesem Fall müssen die zwei Lösungsmittelsysteme fortwährend gemischt werden, um das Polynucleotid mit dem aromatischen Farbstoff in Kontakt zu bringen, so daß sie reagieren können. Nach ihrer Umsetzung liegt die Polynucleotidsonde im allgemeinen in der wäßrigen Lösung vor, während der aromatische Farbstoff in der organischen Lösung verbleibt.
Die für diese Reaktionen erforderliche Stöchiometrie der Reaktanten kann sehr variieren. Im allgemeinen wird ein Überschuß der Komponente, die am einfachsten hergestellt wird, für die Bindung des aromatischen Farbstoffs an das Polynucleotid verwendet. In der Praxis variieren die Mengen in Abhängigkeit von den erforderlichen Reaktionsbedingungen, dem aromatischen Farbstoff, dem Verbindungsarm und dessen reaktionsfähigen funktionellen Gruppen.
Der sich einlagernde, aromatische Farbstoff muß im allgemeinen nach dem Einbau des Nucleotids, das den Verbindungsarm enthält, an das Polynucleotid an den Verbindungsarm gebunden werden. Der Grund dafür ist, daß die meisten sich einlagernden, aromatischen Farbstoffe die Polynucleotidsynthese inhibieren und so den Einbau eines Nucleotids, an das ein aromatisches Einlagerungsmittel gebunden ist, in ein Polynucleotid verhindern würden.

7. Zahl der Einheiten

Die Polynucleotidsonde kann zwei Einheiten oder mehr als zwei Einheiten umfassen. Die Einheiten können an terminalen Positionen oder an nicht-terminalen Positionen der Polynucleotidsonde gebunden sein. Die Einheiten sollten an Nucleotide gebunden sein, die durch einen Bereich von etwa 10 anderen Nucleotiden voneinander getrennt sind, um für die Sonde eine Spezifität vorzusehen. Je größer die Zahl der Einheiten ist, desto empfindlicher ist die Polynucleotidsonde. Jedoch sollten die Einheiten nicht einer solchen Zahl vorliegen, daß die wirksame Hybridisierung des Polynucleotidteils der Polynucleotidsonde mit dem Ziel-Polynucleotid im wesentlichen verhindert wird. Die Zahl der Einheiten, die gebunden werden kann, hängt davon ab, an welche Gruppe die Einheit gebunden wird, und von der Länge des Polynucleotids.
Einheiten, die an eine bestimmte Baseneinheit gebunden werden, sind auf eine Menge von nicht mehr als die Zahl dieser Baseneinheit begrenzt, die in der Polynucleotidsonde vorhanden ist. Einheiten, die an eine Zuckereinheit gebunden werden, sind auf eine Menge begrenzt, die die Hybridisierung der Polynucleotidsonde mit dem Ziel-Polynucleotid nicht behindert, da in diesem Fall jede Einheit die Zahl der zur Basenpaarung verfügbaren Basen in dem Sonden-Polynucleotid verringert. Einheiten, die an eine Phosphateinheit gebunden werden, sind auf eine Menge begrenzt, die die Konformation der Zucker- und Baseneinheiten nicht beeinträchtigt. Es wird bevorzugt, daß nicht mehr als eine Einheit pro vier Nucleotide an die Polynucleotidsonde gebunden sind.
Wenn die Einheit ein Einlagerungsmittel ist, muß der Verbindungsarm lang genug sein und eine ausreichende Flexibilität haben, um für Bewegungsfreiheit für das Einlagerungsmittel zu sorgen, so daß es sich nach innen falten kann und in das gebildete Polynucleotidsonde/Ziel-Polynucleotid-Hybrid eingelagert wird. Es ist selbstverständlich, daß ein Verbindungsarm, der zur Bindung an eine Position einer Base geeignet sein kann, zur Bindung an einer anderen Position der gleichen Base oder an eine Position einer anderen Base oder zur Bindung an eine Position an dem Zucker oder dem Phosphat nicht geeignet sein kann. Zum Beispiel, da die bevorzugte Konformation eines Nucleotids die "Anti" - Konformation ist, würde eine Einheit, die an eine Phosphatgruppe gebunden ist, zum Beispiel einen längeren Verbindungsarm als eine erfordern, die zum Beispiel an die 5- Position eines Uridins gebunden ist. In ähnlicher Weise kann ein Verbindungsarm, der an ein Purin gebunden ist, das zwei Ringe umfaßt, einen längeren Verbindungsarm als eine erfordern, die an ein Pyrimidin gebunden ist, das nur einen Ring umfaßt.

8. Nachweis der Eigenschaftsveränderung von Einlagerungsmitteln

Einlagerungsmittel, die aromatische Farbstoffe sind, können im allgemeinen durch eine Verschiebung in ihrer Fluoreszenzemission nachgewiesen werden, wie vorstehend im Abschnitt "Beschreibung einer Einheit" beschrieben ist. Es ist jedoch nicht erforderlich, die Fluoreszenzeigenschaft von Einlagerungsmitteln auszunutzen, da Einlagerungsmittel nach der Hybridisierung des Polynucleotidteils der Polynucleotidsonde mit einem Ziel-Polynucleotid eine Veränderung im TM-Wert oder in der Schmelztemperatur des Doppelstrangs oder des Duplexmoleküls bewirken. Die Schmelztemperatur bezieht sich auf die Temperatur, bei der ein Polynucleotiddoppelstrang denaturiert wird. Die Denaturierung erfordert das Aufbrechen der Wasserstoffbrücken zwischen gepaarten Basen, und die Denaturierungstemperatur ist vom Basengehalt der Stränge abhängig, da G-C-Bindungen stärker als A-T-Bindungen sind.
Die Anwesenheit eines Einlagerungsmittels in einem Doppelstrang verstärkt die Wechselwirkung zwischen den einzelnen Strängen, so daß die zur Denaturierung der Stränge erforderliche Temperatur sehr viel höher ist. Das Ausmaß, in dem die Schmelztemperatur erhöht wird, hängt von den einzelnen Einlagerungsmitteln und ihrer Menge ab. Zum Beispiel wurde experimentell festgestellt, daß ein Polynucleotid-Hybrid von polyA.polyT, das ein Phenanthridin-Einlagerungsmittel pro 10 Basenpaaren umfaßt, die Schmelztemperatur des Hybrids um etwa 25ºC erhöht.
Somit ist es möglich, eine Polynucleotidsonde zu verwenden, deren Einheit ein nicht-fluoreszierendes Einlagerungsmittel ist. Man kann die Probe, die das Ziel- Polynucleotid umfaßt, mit der Polynucleotidsonde mischen und nach einer ausreichenden Reaktionszeit die Polynucleotide ausfällen. Man kann dann das Präzipitat in einer Lösung lösen, die Lösung erwärmen und die Temperatur überwachen, bei der eine Erhöhung in der UV-Absorption (Hyperchromie) erfolgt. Diese Temperatur weist auf den TM-Wert hin. Falls man nach dem Erwärmen der Probe zwei TM-Profile erhält, wobei ein Profil bei dem üblichen TM-Wert erhalten wird und das zweite Profil bei einem höheren TM-Wert erhalten wird, dann ist die Anwesenheit des Ziel-Polynucleotids bestätigt.
Die Veränderungen in den Eigenschaften werden im allgemeinen durch eine Vorrichtung nachgewiesen, obwohl in einigen Fällen ein Nachweis mit bloßem Auge möglich ist. Beispiele von Vorrichtungen sind Minerallichtlampen und Fluorimeter. Einige Eigenschaftsveränderungen können mit einer Vorrichtung nach der Zugabe der Polynucleotidsonde zu der Probe, die das Ziel-Polynucleotid umfaßt, ohne übermäßiges zusätzliches Experimentieren nachgewiesen werden. Andere Eigenschaftsveränderungen können nur nach weiteren experimentellen Manipulationen nach der Zugabe der Polynucleotidsonde zu der Probe, die das Ziel-Polynucleotid umfaßt, nachweisbar sein. Unabhängig davon jedoch, daß weitere experimentelle Manipulationen erforderlich sind oder nicht, ist es nicht erforderlich, nicht gebundene Polynucleotidsonden von der Probe vor der Überprüfung der Anwesenheit des Ziel-Polynucleotids abzutrennen.
Ein Beispiel der ersteren Möglichkeit ist, daß die Einheit, zum Beispiel ein Einlagerungsmittel, nach der Hybridisierung des Polynucleotidteils der Polynucleotidsonde mit dem Ziel-Polynucleotid in einer Lösung eine Verschiebung in ihrem Fluoreszenzemissionsspektrum durchmacht. In diesem Fall sind nach der Zugabe der Polynucleotidsonde zu der Probe, die das Ziel-Polynucleotid umfaßt, keine experimentellen Manipulationen erforderlich. Die Fluoreszenz der Lösung kann in einem Fluorimeter gemessen werden, und eine Veränderung in der Fluoreszenzemission zeigt die Anwesenheit des Ziel-Polynucleotids an. Ein anderes Beispiel ist, wo die Einheit, zum Beispiel ein Einlagerungsmittel, nach der Hybridisierung des Polynucleotidteils der Polynucleotidsonde mit dem Ziel-Polynucleotid in einer Lösung eine Veränderung in der Schmelztemperatur des Polynucleotid-Hybrids bewirkt. Man muß nur die UV-Absorption der Lösung in einem ein Heizelement enthaltenden UV-Spektrophotometer messen und die Temperatur bestimmen, bei der eine hyperchromische Verschiebung erfolgt. Da es sich in jedem Fall um eine Veränderung in einer Eigenschaft handelt, die gemessen wird, beeinträchtigt ein starker anfänglicher Hintergrund das Nachweisverfahren nicht wesentlich.
Ein Beispiel der letzteren Möglichkeit ist, daß die Einheit, zum Beispiel ein Einlagerungsmittel, nach der Hybridisierung des Polynucleotidteils der Polynucleotidsonde mit dem Ziel-Polynucleotid in einer Lösung eine Veränderung in der Schwebedichte des Polynucleotid-Hybrids durch die Veränderung der Tertiärstruktur des Polynucleotids bewirkt. In diesem Fall ist eine weitere experimentelle Manipulation erforderlich, da die Lösung zuerst zentrifugiert werden muß, zum Beispiel in Cäsiumchlorid, bevor die Dichte- und UV-Messungen der Lösung durchgeführt werden können.
Die Eigenschaftsveränderung, die bewirkt wird, kann in der Polynucleotidsonde oder in dem Ziel-Polynucleotid erfolgen. Wenn die Eigenschaftsveränderung in der Polynucleotidsonde bewirkt wird, kann die Veränderung in dem Einheitenteil der Polynucleotidsonde oder in dem Polynucleotidteil der Polynucleotidsonde erfolgen. Ein Beispiel, wo die Veränderung in der Polynucleotidsonde bewirkt wird, ist, wo ein fluoreszierendes Einlagerungsmittel an ein Nucleotid gebunden ist, das sich nicht an einer terminalen Position der Polynucleotidsonde befindet. Das Einlagerungsmittel lagert sich in ein Hybrid ein, das durch die Hybridisierung des Ziel-Polynucleotids mit dem Polynucleotidteil der Polynucleotidsonde gebildet wurde. In diesem Fall ist die veränderte Eigenschaft die Fluoreszenzemission des Einheitenteils der Polynucleotidsonde.
Ein Beispiel, wo die Veränderung in dem Ziel-Polynucleotid bewirkt wird, ist, wo ein nicht-fluoreszierendes Einlagerungsmittel an ein terminales Nucleotid gebunden ist. Das Einlagerungsmittel wird an einen Verbindungsarm gebunden, durch den es sich in ein benachbartes Hybrid einlagern kann, und zwar eines, das das Ziel-Polynucleotid und ein benachbartes komplementäres Polynucleotid umfaßt, wobei das Polynucleotid nicht das der Polynucleotidsonde ist. Hier erhöht das Einlagerungsmittel den TM-Wert eines Hybrids, aber es erhöht nicht den TM-Wert des Hybrids, das die Sonde und das Zielmolekül umfaßt. Dennoch ist es die Hybridisierung des Polynucleotidteils der Polynucleotidsonde mit dem Ziel- Polynucleotid, die es ermöglicht, daß sich das Einlagerungsmittel in ein benachbartes Hybrid einlagert und auf diese Weise den TM-Wert des benachbarten Hybrids erhöht. Daher bestätigt eine Erhöhung des TM-Werts die Anwesenheit des Hybrids. In diesem Fall ist die veränderte Eigenschaft die thermodynamische Wechselwirkung zwischen dem Ziel-Polynucleotid und dem benachbarten komplementären Polynucleotid.

9. Verfahren zum Nachweis des Ziel-Polynucleotids

Das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung einer Polynucleotidsonde, worin die Einheit ein fluoreszierender, aromatischer Farbstoff ist, kann durchgeführt werden zum Beispiel durch Lyse der Probe, die das Ziel-Polynucleotid umfaßt, in einer Lösung zur Freisetzung des Ziel-Polynucleotids von der umgebenden Membran. Die Lyse kann zum Beispiel durch Aussetzen der Probe einer Ultraschall-Behandlung oder eines Detergens bewirkt werden. Das Polynucleotid kann von Zelltrümmern durch Zentrifugation getrennt und durch eine Alkoholfällung oder durch Dialyse weiter gereinigt werden. Die Polynucleotidsonde wird dann zu einer Lösung zugegeben, die das Ziel-Polynucleotid enthält, und man unterzieht die Lösung einer etwa 10-minütigen bis etwa 24-stündigen Inkubation bei einer Temperatur von etwa 20ºC bis etwa 100ºC. Es ist erkennbar, daß, je höher die Temperaturen sind, umso kleiner der zur Hybridisierung erforderliche Zeitraum ist. Die Lösung wird dann in ein Fluorimeter eingebracht, und die Fluoreszenzemission wird gemessen. Eine Verschiebung im Fluoreszenzemissionsspektrum des aromatischen Farbstoffs im Vergleich zu dem Spektrum, das erhalten wird, wenn der aromatische Farbstoff nicht eingelagert ist, zeigt auf die Anwesenheit des Ziel-Polynucleotids in der Probe an.
Im allgemeinen muß das Ziel-Polynucleotid während dem Hybridisierungsschritt in eine Einzelstrangform umgewandelt werden, bevor es mit dem Polynucleotidteil der Polynucleotidsonde hybridisieren kann. Dies kann entweder durch Wärme oder Alkali sein. Jedoch, wenn die Einheit der Polynucleotidsonde ein Einlagerungsmittel ist, kann das Ziel- Polynucleotid entweder in Einzelstrang- oder Doppelstrangform vorliegen. Wenn das Ziel- Polynucleotid in Doppelstrangform vorliegt, verdrängt der Polynucleotidteil der Polynucleotidsonde seinen homologen Strang aus dem Ziel-Polynucleotid, um das Polynucleotidsonde/- Ziel-Polynucleotid-Hybrid zu bilden.
Es wird angenommen, daß der Grund, warum diese spezielle Polynucleotidsonde verwendet werden kann, ohne zuerst den Doppelstrang zu denaturieren, der das Ziel-Polynucleotid umfaßt, der ist, daß die Einlagerungsmittel für eine erhöhte Stabilität eines Doppelstrangs sorgen, in dem einer der Stränge die Einlagerungsmittel umfaßt. Zur Erklärung wird angenommen, daß ein Doppelstrang die Stränge, "A" und "B" umfaßt, wobei der Strang "A" das Ziel-Polynucleotid umfaßt. Ebenfalls angenommen wird, daß eine Polynucleotidsonde einen Polynucleotidteil, Strang "C", der zu dem Ziel-Polynucleotid in Strang "A" komplementär ist, und zwei Einlagerungsmitteleinheiten aufweist. Ferner wird angenommen, daß Strand "D" zu dem Ziel-Polynucleotid in Strang "A" komplementär ist.
Es ist bekannt, daß Polynucleotiddoppelstränge oder -hybride sich in Intervallen öffnen oder "atmen". Jedoch ist der Strang "D" im allgemeinen nicht in der Lage, Strang "B" bei Temperaturen zu verdrängen, die niedriger sind als der TM-Wert des Doppelstrangs. Der Grund dafür ist, daß die thermodynamische Wechselwirkung zwischen den Strängen "A" und "D" nicht größer als die thermodynamische Wechselwirkung zwischen den Strängen "A" und "B" ist. Selbst während des "Atemzeitraums", in dem die Stränge "A" und "B" sich teilweise trennen sollten und der Strang "D" beginnen sollte, mit dem Strang "A" eine Basenpaarung auszubilden, ist diese Basenpaarung nur von kurzer Dauer. Strang "B", der zum überwiegenden Teil mit Strang "A" hybridisiert, verdrängt Strang "D" schnell. Strang "D" ist nicht in der Lage, den Doppelstrang zu öffnen und Strang "B" von Strang "A" zu verdrängen, um einen Doppelstrang zu bilden, der die Stränge "A" und "D" umfaßt.
Es wird jedoch angenommen, daß eine Base in Strang "C", an die ein Einlagerungsmittel gebunden ist, sich mit ihrer komplementären Base in Strang "A" während eines Atemzeitraums paart. Wenn dies erfolgt, lagert sich das an die Base gebundene Einlagerungsmittel in benachbarte Basenpaare ein. Die Base in Strang "C", an die das andere Einlagerungsmittel gebunden ist, kann sich dann ebenfalls mit ihrer komplementären Base paaren, und das Einlagerungsmittel, das an die Base gebunden ist, lagert sich ebenfalls in benachbarte Basenpaare ein. Das Ergebnis ist, daß die zwei Basen des Polynucleotidteils der Polynucleotidsonde mit Basen des Ziel-Polynucleotids mit erhöhter Stabilität gepaart sind. Die restlichen Basen zwischen diesen Basen paaren sich dann mit ihren komplementären Basen. Die Einlagerungsmittel von Strang "C" sorgen für eine größere thermodynamische Stabilität zwischen den Basen von Strang "C", die mit den Basen von Strang "A" gepaart sind, verglichen mit den Basen von Strang "B", die mit den Basen von Strang "A" gepaart sind. Zum Beispiel erhöht Ethidiumbromid die Schmelztemperatur von Polynucleotiddoppelsträngen um etwa 25ºC. Vgl. Le Pecq U. B. und Paoletti C., J. M. B. 27 (1967), 87-106. Strang "B" kann Strang "C" nicht länger von Strang "A" verdrängen. Das Nettoergebnis ist, daß ein Teil von Strang "B", der zuvor mit Strang "A" hybridisierte, mit Strang "A" anhaltend keinen Doppelstrang bilden kann, wodurch statt dessen ein doppelsträngiger Bereich verbleibt, der die Stränge "A" und "C" umfaßt. Auf diese Weise erlaubt diese einzelsträngige Polynucleotidsonde den Nachweis eines Ziel-Polynucleotids in einer Probe, auch wenn das Ziel-Polynucleotid nicht in Einzelstrangform vorliegt.
Das Verfahren kann auch zum Nachweis der Anwesenheit eines Ziel-Polynucleotids bei Temperaturen angewendet werden, bei denen Doppelstränge denaturiert werden. Im allgemeinen wird der Nachweis eines Ziel-Polynucleotids, das in Doppelstrangform vorliegt, durch Erwärmen der Probe, die die Doppelstränge umfaßt, auf eine Temperatur, die höher als der TM-Wert der Doppelstränge ist, in Gegenwart der Polynucleotidsonde und Abkühlen der Probe, um die Renaturierung der Polynucleotidsonde mit dem Ziel-Polynucleotid zu erlauben, durchgeführt. Jedoch, wenn die Polynucleotidsonde fluoreszierende Einlagerungsmitteleinheiten umfaßt, muß die Probe nicht abgekühlt werden. Der Grund dafür ist, daß die Einlagerungsmittel die Basenpaare stabilisieren und den TM-Wert dieser Basenpaare erhöhen. Folglich, wenn der Polynucleotidteil der Polynucleotidsonde beginnt mit dem Ziel- Polynucleotid zu hybridisieren, und sich die Einlagerungsmittel in den gebildeten Doppelstrang einlagern, ist die erhöhte Temperatur der Probe nicht mehr ausreichend, um diesen Doppelstrang zu denaturieren, und die Anwesenheit des Ziel-Polynucleotids kann durch die Veränderung in der Fluoreszenzemission der Einlagerungsmittel überprüft werden. Es ist selbstverständlich, daß die erhöhte Temperatur nicht höher als der TM-Wert dieses Doppelstrangs sein kann, d. h. eines Doppelstrangs, der die Polynucleotidsonde und das Ziel- Polynucleotid umfaßt.

10. Ziel-Polynucleotide

Dieses Verfahren kann zum Nachweis eines Ziel-Polynucleodds, zum Beispiel aus einem Mikroorganismus, einer Pflanzenzelle oder einer Säugerzelle, angewendet werden. Der Mikroorganismus kann ein Bakterium, Pilz, Virus oder eine Hefe sein. Das Ziel-Polynucleotid kann eines sein, das für ein bestimmtes pathogenes Virus einzigartig ist, eines, das in einem mutierten Säugergen vorliegt, was zur Produktion eines nicht-funktionsfähigen Proteins führt, oder eines, das einem Bakterium eine Antibiotikaresistenz verleiht. Zum Beispiel kann es eines sein, das eine Penicillinresistenz in Streptococcus pyogenes oder Neisseria meningitidis; eine Tetracycinresistenz in Staphylococcus aureus, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes oder Neisseria gonorrheae; und eine Aminoglycosidresistenz in Mycobacterium tuberculosis verleiht.
Dieser Ansatz kann auf die Diagnose von genetischen Störungen, wie Thalassämie und Sichelzellanämie, ausgeweitet werden. Das Polynucleotidgen, dessen Anwesenheit oder Abwesenheit (im Falle der Thalassämie) mit der Störung assoziiert ist, kann nach der Hybridisierung mit einer erfindungsgemäßen Polynucleotidsonde nachgewiesen werden.
Die Kartierung von Genen oder ihren Transkripten auf spezifischen Loci auf Chromosomen war eine langwierige und zeitraubende Tätigkeit, die viele Verfahren der Zellfusion und somatischen Zellgenetik umfaßte. Obwohl die in situ-Hybridisierung erfolgreich zur Kartierung von Einzelkopiegensequenzen bei Arten angewendet wurde, die eine Chromosomenpolytänisierung durchgemacht haben, wie die von Drosophila, war der Nachweis von einzigartigen Sequenzgenen in den meisten Chromosomen höheren Eukaryonten unter Anwendung von Standardhybridisierungsverfahren äußerst schwierig, wenn nicht unmöglich. Die Notwendigkeit für Polynucleotidsonden mit sehr hoher spezifischer Radioaktivität, um die autoradiographische Lokalisierung der Hybridisierungsstelle zu erleichtern, resultierte auch in einem schnellen radioaktiven Zerfall der Polynucleotidsonde und einer gleichzeitigen Erhöhung des Hintergundrauschens der Silberkörnchenablagerung. Die Verwendung von Hybridisierungssonden mit gering bis mäßig spezifischen Radioaktivitäten erfordert Expositionszeiten von vielen Tagen oder Wochen, auch um Sequenzen in hoher Kopienzahl nachzuweisen, wie ribosomale RNA- Gene oder Satelliten-DNA. Da die DNA-Rekombinationstechnik die molekulare Clonierung von so gut wie jeder Einzelkopiesequenz, die in eukaryontischen Zellen vorkommt, möglich machte, wäre es äußerst vorteilhaft, ein schnelles und empfindliches Verfahren zur Kartierung des chromosomalen Ursprungs von solchen clonierten genomischen Fragmente zur Verfügung zu haben.
Schließlich können Tumorzellen durch die Herstellung einer erfindungsgemäßen Polynucleotidsonde diagnostiziert werden, die zu der Boten-Ribonucleinsäure komplementär ist, die von einer Desoxyribonucleinsäuregensequenz transkribiert wurde, welche mit der Produktion von Polypeptiden assoziiert ist, wie das fötale Proteinantigen oder das carcinoembryonale Antigen, deren Anwesenheit für spezifische Tumorzellen diagnostisch ist. Die Hybridisierung und der Nachweis des Sonde/Ziel-Polynucleotid-Hybrids würde ein Verfahren zum Nachweis der Tumorzellen bereitstellen.
Eine Polynucleotidsonde, die ein Polynucleotid und ein aromatisches Einlagerungsmittel umfaßt, das an das Polynucleotid gebunden ist, ist nachstehend gezeigt, wobei das Polynucleotid mindestens eine Einheit der Struktur
umfaßt, worin B eine Base bedeutet, ausgewählt aus Pyrimidinen, Purinen und Deazapurinen, mit der Maßgabe, daß, immer wenn B ein Pyrimidin ist, der Zucker an der N¹-Position des Pyrimidins gebunden ist, und, immer wenn B ein Purin oder Deazapurin ist, der Zucker an der N&sup9;-Position des Purins oder Deazapurins gebunden ist;
worin "Phen" einen Phenanthridinrest bedeutet;
worin L. A. ein Verbindungsarm ist, der mindestens drei Kohlenstoffatome umfaßt und an der 5-Position des Phenanthridinrests gebunden ist; und
worin Z entweder H oder O- ist.
Im allgemeinen variiert B innerhalb des gleichen Oligo- oder Polynucleotids, wobei B alternativ Uracil, Cytosin, Thymin, Guanin, Adenin, Deazaguanin oder Deazaadenin ist. Im allgemeinen entspricht die Variation auch der festgelegten Sequenz der Nucleotide, die das Ziel-Polynucleotid umfaßt. Es ist beabsichtigt, daß die gezeigte Struktur auch Polynucleotide wie poly C, poly U, poly r(A-U) und poly d(A-U) umfaßt.

11. Synthese einer Polynucleotidsonde

Ein Beispiel der Synthese einer solchen Polynucleotidsonde wird nachstehend in Verbindung mit Fig. 1 beschrieben. Die Polynucleotidsonde umfaßt die Nucleotide dTMP und dUMP und ein Butidium-Einlagerungsmittel. Das Ziel-Polynucleotid umfaßt poly dAMP.
Der erste Schritt der Synthese war die Nitrierung von Benzidin zu 3-Nitrobenzidin mit Kaliumnitrat in Gegenwart von Schwefelsäure. Die zwei exocyclischen Aminogruppen wurden dann mit Ethylchlorformiat umgesetzt, um die Diisocyanatverbindung zu erzeugen. Dieser Schritt war erforderlich, da sonst die primären Aminogruppen später kovalent mit anderen Reagenzien reagieren würden, wobei Amide oder sekundäre oder tertiäre Amine erzeugt würden. Eine solche Reaktion würde verhindern, daß sich die synthetisierte Einheit in ein Hybrid einlagert, und würde auf diese Weise deren Wirksamkeit als Einheit aufheben. Dieser Tatsache liegt ein Bericht zugrunde, daß, während der Blockierung der 8-Aminogruppe, nur Phenanthridiumverbindungen mit einer Acetylgruppe den Polynucleotidhelixentspannungswinkel verringern, ohne eine signifikante Veränderung dessen Bindungsenergie zu bewirken; die vollständige Blockierung der 3- und 8-Aminogruppen resultierte in einem stark verringerten Entspannungswinkel mit einer 10-20fachen Reduktion der Bindungskonstante der Phenanthridiumverbindungen. Die zwei Aminogruppen tragen etwa 1,4-1,7 Cal/Mol freie Energie zur Stabilisierung des eingelagerten Komplexes bei. Vgl. den Übersichtsartikel mit dem Titel "Ethidium and Propidium" in Antibiotics, Bd. 3 (1975), Cozcozan J. W. und Hahn F. E., Hrsg., veröffentlicht vom Springer-Verlag, NY, 141-165.
Die 3-Nitrogruppe wurde dann mit Zink zu einer Aminogruppe reduziert, und Benzoylchlorid wurde zugegeben, um das Benzoylamid zu erzeugen. Die Carbonylgruppe dieses Benzoylamids reagierte nach dem Erwärmen in Phosphoroxychlorid mit dem 6-Position-Kohlenstoff, wobei das Phenanthridiumderivat erzeugt wurde. Das 5-tertiäre Amin wurde dann quaternisiert, indem es mit 1,4-Dibrombutan umgesetzt wurde, um das Butidiumderivat zu erzeugen. Daran schloß sich die Hydrolyse der Diurethaneinheiten an, um 5-(4' -Brombutyl)-3,8-diamino-6-phenylphenanthyridin zu erzeugen. Das Bromin wurde dann durch Umsetzen der Verbindung mit Natriumthiosulfat durch ein Thiol ersetzt, um 5- (4'-Thiobutyl)-3,8-diamino-6-phenylphenanthridin zu erzeugen. Dieses Produkt stellte den Einheitenteil der Polynucleotidsonde dar und zeigte die Fluoreszenzeigenschaft von Butidiumderivaten.
Vor der Bindung dieser Verbindung an ein Polynucleotid war es erforderlich, zu überprüfen, daß die Fluoreszenz dieser Verbindung nach der kovalenten Bindung an ein anderes Molekül nicht zerstört wird. Dies wurde durch Umsetzung der Butidiumverbindung mit einem bromacetylierten Aminodextranderivat durchgeführt, wie in Fig. 2 (a) gezeigt. Das Dextranderivat wurde hergestellt durch Umsetzung von Dextran mit Butadienmonoepoxid in Gegenwart von Natriumborhydrid, um 1-Buten-1-dextran zu erzeugen. Diese Verbindung wurde mit N-Bromsuccinimid gemischt, um 1-Brombutan-4-dextran zu erhalten, und dann mit Cysteamin weiter umgesetzt, um ein Aminodextranderivat zu erhalten. Dieses Dextran wurde mit dem N-Hydroxysuccinimidester von Bromessigsäure gemischt, um das bromacetylierte Aminodextranderivat zu erzeugen.
Dieses bromacetylierte Aminodextranderivat wurde mit dem vorstehend beschriebenen 5-(4'-Thiobutyl)-3,8-diamino-6-phenylphenanthridin umgesetzt, um eine Dextranmarkierte Phenanthridiumverbindung zu erzeugen. Die Spektralanalyse des Produkts zeigte, daß die Fluoreszenz des Phenanthridins durch dessen Bindung an das Dextran nicht verändert worden war.
Dann wurde ein poly (dT).poly (dU) umfassendes Polynucleotid hergestellt, worin ein Allylamin an jede Uracil (U)-Base an der 5'-Position gebunden war. Das angewendete Verfahren umfaßte die Synthese des Polynucleotids mit dem Enzym Terminale Transferase in Gegenwart eines Gemisches von dUTP und AAUTP (Allylamin-UTP). Das synthetisierte Polynucleotid wurde mittels Anionenaustauscherchromatographie gereinigt. Die Uracil-Base weist ein Absorptionsmaximum von etwa 260 nm auf, während die Uracil-Base, die ein Allylamin an der 5-Position enthielt, ein Absorptionsmaximum bei etwa 290 nm aufweist. Das Verhältnis der zwei Basen in dem Polynucleotidpolymeren kann somit durch Messung des Absorptionsverhältnisses von 260/290 bestimmt werden. Für dieses Experiment wurde festgestellt, daß das Verhältnis von AAdU zu dU 1 : 10 betrug.
Dieses Polynucleotid wurde dann mit dem 5-(4'-Thiobutyl)-3,8-diamino-6- phenylphenanthridin unter leicht alkalischen Bedingungen in einer Lösung, enthaltend ein Gemisch von Wasser-Dimethylformamid, umgesetzt, wie in Fig. 2 (b) gezeigt. Das nicht umgesetzte Butidiumderivat wurde aus der Lösung mit Butanol extrahiert. Die Extraktion mit dem Butanol bewirkte, daß die Polynucleotidsonde aus der Lösung ausgefällt wurde. Das Präzipitat wurde an einer Anionenaustauschersäule weiter gereinigt.
Die gereinigte Polynucleotidsonde wurde dann mit drei Lösungen gemischt. Die erste Lösung enthielt poly (rA), die zweite Lösung enthielt doppelsträngige Kalbsthymus- DNA, und die dritte Lösung enthielt poly (dT). Nur die poly (rA) enthaltende Lösung zeigte eine intensive Fluoreszenz. Dies zeigte, daß das Einlagerungsmittel sich in keinen Doppelstrang eingelagerte, in dem keiner der Stränge ein Strang der Polynucleotidsonde war.
Die gereinigte Polynucleotidsonde wurde mit einer Lösung gemischt, enthaltend poly (dT)-poly (rA), wobei das Verhältnis von poly (dT) zu poly (rA) 2 : 1 betrug. Die Lösung fluoreszierte praktisch sofort. Dies bestätigte die Tatsache, daß eine Polynucleotidsonde, die ein Einlagerungsmittel umfaßt, ein homologes Polynucleotid aus einem Doppelstrang verdrängen kann.

Beschreibung des Polynucleotidwirkstoffs

Diese Erfindung erlaubt, daß die Polynucleotidzusammensetzung als Polynucleotidwirkstoff verwendet werden kann. Der Polynucleotidwirkstoff wird verwendet, um die Transkription oder Translation eines Ziel-Polynucleotids zu verhindern. Wenn der Wirkstoff verwendet wird, um die Transkription zu verhindern, kann das Ziel-Polynucleotid DNA oder RNA sein. Wenn der Polynucleotidwirkstoff verwendet wird, um die Translation zu verhindern, ist das Ziel-Polynucleotid Boten-RNA.
Der Polynucleotidwirkstoff umfaßt ein Polynucleotid und mindestens zwei Einheiten, die an das Polynucleotid gebunden sind. Die Einheiten weisen eine Eigenschaft auf, so daß, wenn der Polynucleotidteil des Polynucleotidwirkstoffs mit dem Ziel-Polynucleotid hybridisiert, eine Veränderung in der Eigenschaft in entweder der Polynucleotidsonde, dem Ziel-Polynucleotid oder in beiden bewirkt wird. Die veränderte Eigenschaft ist die thermodynamische Stabilität des gebildeten Hybrids. Diese Stabilität verhindert die Verdrängung des Polynucleotidwirkstoffs aus dem Ziel-Polynucleotid durch ein Polynucleotidhomolog zu dem des Polynucleotids des Wirkstoffs, da ein Hybrid, das ein solches homologes Polynucleotid und das Ziel-Polynucleotid umfaßt, thermodynamisch nicht so stabil wie eines wäre, das das Polynucleotid des Wirkstoffs und das Ziel-Polynucleotid umfaßt. Der Polynucleotidwirkstoff wird in den beigefügten Patentansprüchen weiter definiert.
Ein Beispiel eines geeigneten Polynucleotidwirkstoffs ist einer, der ein Einlagerungsmittel als Einheit umfaßt. Wie vorstehend angegeben, erhöht die Anwesenheit eines Einlagerungsmittels den TM-Wert eines Polynucleotiddoppelstrangs. So, falls ein Polynucleotidwirkstoff, der ein Einlagerungsmittel umfaßt, mit einer Probe gemischt oder an einen Organismus verabreicht wird, die bzw. der das Ziel-Polynucleotid umfaßt, "sucht" der Polynucleotidwirkstoff sein Ziel-Polynucleotid. Wenn er dieses Ziel-Polynucleotid findet, selbst wenn das Zielmolekül bereits mit einem komplementären Polynucleotid hybridisiert ist, ersetzt der Polynucleotidteil des Polynucleotidwirkstoffs die zu dem Zielmolekül komplementäre Sequenz aus Gründen, die vorstehend am Anfang der Diskussion der Polynucleotidsonde angegeben sind. Die Wirkung ist die Bildung eines Doppelstrangs, der nicht ohne weiteres zu einer Matrize für Polymerase- und Transferaseenzyme wird und auf diese Weise die Transkription oder Translation des Ziel-Polynucleotids abschaltet.
Dieser Polynucleotidwirkstoff weist insofern ein Beschränkung auf, als das Einlagerungsmittel mit dem Polynucleotid durch einen Verbindungsarm verbunden sein muß, der erlaubt, daß das Einlagerungsmittel sich nur in einen Doppelstrang einlagert, der sich als Ergebnis der Hybridisierung des Polynucleotidteils des Wirkstoffs mit dem Ziel-Polynucleotid gebildet hat. Das Einlagerungsmittel darf sich nicht in andere Doppelstränge einlagern, so daß er die Transkription oder Translation anderer Polynucleotide hemmt.
Dieser Polynucleotidwirkstoff weist einen Vorteil auf. Die meisten chemotherapeutischen Wirkstoffe, einschließlich Einlagerungsmittel, werden bei der systemischen Verabreichung an einen Menschen gleichmäßig im Körper verteilt. Die meisten dieser Wirkstoffe sind sehr toxisch. Folglich, zusätzlich zur Ausübung einer therapeutischen Wirkung an Zielstellen, üben sie toxische Wirkungen an Nicht-Zielstellen aus. Erfindungsgemäße Einlagerungsmittel können sich nicht in Doppelstränge einlagern, die das Ziel-Polynucleotid nicht umfassen, und folglich, auch wenn der Polynucleotidwirkstoff gleichmäßig im Körper verteilt ist, übt er außer an dessen Zielstelle keine toxische Wirkung aus.
Die Eigenschaft, die verändert wird, muß nicht nachweisbar sein, obwohl dies zuweilen ein Vorteil sein kann. Jedoch muß die veränderte Eigenschaft die Stabilität des Hybrids erhöhen, das den Polynucleotidwirkstoff/das Ziel-Polynucleotid umfaßt, verglichen mit einem Hybrid, das den Polynucleotidwirkstoff nicht umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines Polynucleotidwirkstoffs, der ein Einlagerungsmittel umfaßt, wurden vorstehend in der Diskussion der Herstellung der Polynucleotidsonde beschrieben. Diese Polynucleotidwirkstoffe können an einen Menschen in einer wäßrigen, neutralen Lösung verabreicht werden.
Der Polynucleotidwirkstoff muß an die Zelle durch einen geeigneten Träger abgegeben werden. Der Träger muß verhindern, daß der Polynucleotidwirkstoff abgebaut wird, bevor er in die Zelle eintritt, und gleichzeitig muß er erlauben, daß der Polynucleotidwirkstoff durch die Zellmembran diffundiert oder transportiert wird. Ein bevorzugtes Verfahren umfaßt die Verwendung von Liposomen.
Liposomen sind unilamellare oder multilamellare Lipidvesikel, die einen dreidimensionalen Raum einschließen. Die Membranen von Liposomen werden durch eine bimoleulare Schicht aus einer oder mehreren Lipidkomponenten mit polaren Köpfen und nicht-polaren Schwänzen gebildet. In einer wäßrigen (oder polaren) Lösung orientieren sich die polaren Köpfe einer Schicht nach außen hin, so daß sie sich in die wäßrige oder polare Lösung erstrecken und eine durchgehende äußere Fläche bilden. Unilamellare Liposomen weisen eine solche bimolekulare Schicht auf, während multilamellare Vesikel im allgemeinen eine Vielzahl von im wesentlichen konzentrischen bimolekularen Schichten aufweisen, die eher wie bei einer Zwiebel angeordnet sind.
Von Liposomen ist bekannt, daß sie zum Einkapseln von therapeutischen Mitteln, wie cytotoxische Wirkstoffe, oder anderen Makromolekülen, die fähig sind, das Zellverhalten zu modifizieren, und zum Transportieren dieser Mittel an in vivo-Stellen nützlich sind. zum Beispiel offenbart das US-Patent Nr. 3,993,754 von Rahman et al., erteilt am 23. November 1976, ein verbessertes Verfahren der Chemotherapie von malignen Tumoren, bei dem ein Antitumorwirkstoff in Liposomen eingekapselt wird und die Liposomen in ein Tier oder einen Menschen injiziert werden. Das US-Patent Nr. 4,263,428 von Apple et al., erteilt am 21. April 1981, offenbart einen Antitumorwirkstoff, der an ausgewählte Zellregionen in einem Säugerorganismus durch das Einbringen des Wirkstoffs in Liposomen von einheitlicher Größe wirksamer verabreicht werden kann. Die Wirkstoffverabreichung mit Hilfe von Liposomen erlaubt eine verminderte Toxizität, eine veränderte Gewebeverteilung, eine erhöhte Wirkstoffwirksamkeit und einen verbesserten therapeutischen Index.
Ein besonders nützliches Verfahren zum Einkapseln von Nucleinsäuren wird offenbart im US-Patent Nr. 4,515,736 von Deamer David W., erteilt am 7. Mai 1985. Das Verfahren umfaßt eine neuartige Einkapselung, bei dem Liposomendispersionen in Gegenwart eines einzukapselnden Stoffes getrocknet werden. Wenn die Trocknung erfolgt, verschmelzen einzelne Liposomen unter Bildung von multilamellaren Strukturen, die den Stoff zwischen Lipidlamellen einfangen. Nach der Rehydrierung bilden sich Lipidvesikel, die den Stoff wirksam einkapseln. Das Patent offenbart die wirksame Einkapselung verschiedener Polynucleotide.
Die Wirksamkeit des Polynucleotidwirkstoffs in der Verdrängung eines homologen Polynucleotids aus einem Ziel-Polynucleotid hängt von der Länge des Polynucleotidteils des Polynucleotidwirkstoffs und von der Zahl der an den Polynucleotidwirkstoff gebundenen Einlagerungsmittel ab. Je größer die Zahl der Einlagerungsmittel ist, umso wirksamer ist der Polynucleotidteil des Wirkstoffs in einer Verdrängung seiner homologen Sequenz und desto weniger des Wirkstoffs ist erforderlich, um die Transkription oder Translation des Ziel- Polynucleotids zu verhindern. Auch, je höher die Zahl der Einlagerungsmittel ist, umso schneller bindet der Wirkstoff an das Zielmolekül.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung und sind nicht begrenzend.

Beispiel I:

Herstellung von 3-Nitrobenzidin

Das befolgte Verfahren entsprach im wesentlichen dem Verfahren von Lesslie M. S und Turner E. E., J. C. S. (1934), 1588-92.
Zu 468 ml 95%iger Schwefelsäure wurden 87 g P&sub2;O&sub5; in Portionen über einen Zeitraum von 2 Stunden zugegeben, bis alles P&sub2;O&sub5; gelöst war (P&sub2;O&sub5; wurde zugegeben, um das Wasser in der Schwefelsäure zu absorbieren). Nachdem die Lösung auf Raumtemperatur gekühlt worden war, wurden 50 g Benzidin (Fluka Chemical Corp., 255 Oser Avenue, Hauppauge, New York 11788) langsam zugegeben, und die Temperatur wurde gesenkt und zwischen 10-15ºC gehalten.
Fein gemahlenes Kaliumnitrat (50,5 g) wurden zu der Lösung unter starkem Rühren über einen Zeitraum von 30 Minuten zugegeben, während die gleiche Temperatur beibehalten wurde. Nach 60 Minuten wurde die Lösung vorsichtig in 1500 ml Wasser gegossen, und diese wäßrige Lösung wurde mit kochendem Wasser zu einem Gesamtvolumen von 6 Liter verdünnt. Ein 10 ml-Aliquot wurde entnommen und langsam gekühlt, um einige 3-Nitrobenzidinsulfatkristalle zu erhalten. Diese Kristalle wurden verwendet, um die restliche Lösung zu beimpfen, die schnell auf 35ºC gekühlt wurde. Die Lösung wurde weiter auf 20ºC gekühlt und man ließ die Fällung des 3-Benzidins vollständig ablaufen. Nach Abschluß der Kristallisation wurde das 3-Nitrobenzidin abfiltriert und gesammelt. 30 g-Portionen des feuchten Salzes wurden mit Wasser zu einer festen Paste zermahlen. Konzentriertes wäßriges Ammoniak wurde zu der Paste zugegeben, und sie weiter gemahlen, um das 3-Nitrobenzidinsulfat in freies 3-Nitrobenzidin umzuwandeln. Die Verbindung wurde dann durch Lösen in einer verdünnten Ammoniak-Ethanol-Lösung und Gießen der Lösung in ein großes Volumen von Wasser gesammelt. Das 3-Nitrobenzidin fiel aus der Lösung aus. Die erhaltenen 46 g 3-Nitrobenzidin entsprachen einer Ausbeute von 80,4%.

Herstellung von N,N'-Biscarbethoxy-3-nitrobenzidin

29 g 3-Nitrobenzidin wurden in 330 ml Ethanol gelöst, das 39 ml (36 g) Dimethylanilin enthielt. 31 g Ethylchlorformiat wurden in Portionen zu der Ethanollösung zugegeben. Die Lösung wurde dann 10 Minuten unter Rückfluß gekocht, danach wurde Wasser zugegeben, um das Diurethanderivat auszufällen. Es wurden 41 g erhalten, was einer Ausbeute von 95% entsprach.

Herstellung von 3,8-Biscarbethoxy-3-aminobenzidin

41 g des Diurethans wurden zu einer Lösung zugegeben, die 500 ml Ethanol und 40 ml Eisessig enthielt, und das Gemisch wurde erwärmt, um das Diurethan zu lösen. Die Lösung war dunkelbraun. Die Temperatur wurde auf etwa 30ºC gebracht, und Zinkpulver wurde allmählich zugegeben, um die Nitrogruppen zu reduzieren. Das Ende der Reaktion wurde durch das Verschwinden der braunen Farbe angezeigt. Das Zink wurde abfiltriert, und das Ethanol und die Essigsäure wurden unter vermindertem Druck entfernt. Das 3,8-Bis- carbethoxy-3-aminobenzidin wurde für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet.

Herstellung von 3,8-Biscarbethoxy-6-phenylphenanthridin

Das befolgte Verfahren wurde dem von Wall L. P., J. C. S., (1947), 67-74, angepaßt.
Das 3,8-Biscarbethoxy-3-aminobenzidin wurde in 100 ml Nitrobenzol gelöst, und die Lösung wurde auf eine Temperatur von 150ºC erwärmt. 10 ml Benzoylchlorid wurden zugegeben, und die Temperatur wurden bei 150ºC gehalten, bis die HCl-Entwicklung nachließ. Nach weiteren 30 Minuten bei 150ºC wurde die Lösung gekühlt und nach der Zugabe von Ethanol kristallisierte das Benzoylderivat in Form farbloser Prismen aus. Die Ausbeute betrug 35 g, was 72% entsprach.
Das Benzoylderivat wurde in 70 ml Phosphoroxychlorid gelöst und 1 Stunde unter Rückfluß gekocht, bis die Entwicklung von HCl-Gas nachgelassen hatte. Die gelbe Lösung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und dann langsam zu einer kalten verdünnten Ammoniaklösung zugegeben, um das Phenanthridin auszufällen. Das Präzipitat wurde abfiltriert und in 200 ml absolutem Ethanol gelöst. Dann wurde Ammoniak zugegeben, um die orange Farbe zu entfernen. Die Verbindung wurde durch die Zugabe von Wasser aus der Lösung ausgefällt. Die Ausbeute betrug 21 g, was 62,5% entsprach.

Herstellung von 5-(4'-Brombutyl)-3,8-biscarbethoxy-6-phenylphenanthridin

Diese Verbindung wurde durch Modifikation des Verfahrens von Watkins T. T., J. C. S. (1952), 3059-3064, hergestellt.
1 g des 3,8-Biscarbethoxy-6-phenylphenanthridins wurden zu 10 ml 1,4-Dibrombutan zugegeben, die auf 100ºC vorgewärmt worden waren, so daß jegliches Wasser in dem Lösungsgemisch verdampfen würde. Die Temperatur wurde allmählich auf 150ºC erhöht. Nach 30 Minuten bei 150ºC begann sich ein gelbes Präzipitat zu bilden. Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur gekühlt, und Ether wurde zu einem Gesamtvolumen von 100 ml zugegeben, um die Präzipitation zu verstärken. Das Präzipitat wurde abfiltriert, mit Ether gewaschen und luftgetrocknet. Insgesamt 0,8 g der Verbindung wurden erhalten, was einer Ausbeute von 58% entsprach.
Die Dauer der Erwärmung bei 150ºC war wichtig, da in einem parallelen Experiment, wo das Gemisch über Nacht bei 150ºC gehalten wurde, das so erhaltene Produkt sehr inhomogen schien und eine sehr geringe Fluoreszenz mit doppelsträngiger DNA nach Hydrolyse des Urethan mit Schwefelsäure zeigte (vgl. den Watkins-Artikel auf Seite 3061). Dies weist darauf hin, daß die Verbindung sich zersetzt hatte.

Herstellung von 5-(4'-Brombutyl)-3,8-diamino-6-phenylphenanthridin

Die Hydrolyse der Urethangruppen wurde gemäß dem Verfahren von Wall L. P., J. C. S. (1947), 67-74, durchgeführt.
800 g des 3,8-Biscarbethoxy-3-aminobenzidins wurden in 10 ml konzentriertem H&sub2;SO&sub4; unter Argongas gelöst. Nachdem die HBr-Entwicklung nachließ, wurden 5 ml H&sub2;O zugegeben und die Badtemperatur auf 150ºC erhöht. Die Lösung wurde bei dieser Temperatur 15 Minuten gehalten, bis die Entwicklung des CO&sub2;-Gases ganz nachgelassen hatte. Das Gemisch wurde dann auf 5-10ºC gekühlt, und kaltes H&sub2;O wurde zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 150 ml zu erhalten. Die Lösung wurde mit kaltem verdünntem Ammoniak neutralisiert. Festes Kaliumbromid wurde bis zum Erhalt von 1 M zu der Lösung zugegeben (um das Produkt auszusalzen), und man ließ die Lösung über Nacht bei 4ºC stehen. Nach diesem Zeitraum bildete sich ein Präzipitat, das ein Permanganat-ähnliches, kristallines Aussehen hatte. Es wurde festgestellt, daß das Produkt auch leicht aus der Lösung als Ammoniumsulfatsalz ausgefällt werden konnte. Dieses Produkt war in Wasser löslich und ergab beim Mischen mit einer Lösung, die doppelsträngige DNA enthielt, eine stark fluoreszierende Lösung. Die erhaltenen 547 mg entsprachen einer Ausbeute von 89%.

Herstellung von 5-(4'-Thiobutyl)-3,8-diamino-6-phenylphenanthridin

60 mg 5-(4'-Brombutyl)-3,8-diamino-6-phenylphenanthridin wurden in 4 ml 50%-igem Ethanol gelöst. 1 ml 0,2 M Na&sub2;S&sub2;O&sub3; in 50%igem Ethanol wurde zugegeben und die Lösung 3 Stunden bei 80ºC erwärmt. Das Ethanol wurde durch Durchsprudeln von Argongas bei 70ºC abgedampft und das Produkt mit 2 ml 3 M KCl ausgefällt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt und in 1 ml 36%iger HCl gelöst. Wasser (0,35 ml) wurde zugegeben, um die HCl-Konzentration auf 25% zu verringern, und man ließ die Lösung bei Raumtemperatur 20 Stunden stehen. Nach diesem Zeitraum hatte sich ein Präzipitat gebildet. 6 ml absoluter Ethanol wurden zugegeben, und man ließ das Gemisch bei -20ºC weitere 20 Stunden stehen, um die Präzipitation zu beschleunigen. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt, in 1 ml H&sub2;O suspendiert und das Wasser durch Gefriertrocknen entfernt. Die Ausbeute betrug 42,5 mg, was 70% entsprach. Eine Dünnschichtchromatographie des Rohprodukts zeigte die Anwesenheit von 3 fluoreszierenden Produkten. Das gewünschte Produkt wurde vor der Verwendung für die nächste Reaktion nicht gereinigt.

Herstellung von Aminodextranen

1,07 g Dextran T-500 (Pharmacia Biochemicals, Piscataway, New Jersey) wurden zu 15,0 ml 1 M KOH zugegeben. Dann wurden 300 ul Butadienmonoepoxid (etwa 3 mMol) und 30 mg Natriumborhydrid (Katalysator) zugegeben, und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Die Lösung wurde mit HCl neutralisiert, und das überschüssige, nicht umgesetzte Butadienmonoepoxid und der daraus erzeugte Dialkohol wurden viermal aus der Lösung mit 20 ml Ether extrahiert. Der in der wäßrigen Lösung zurückbleibende Ether wurde durch Sprudeln von Argongas durch die Lösung abgedampft. Die Lösung wurde dann gegen 0,2 M Natriumacetat, pH 5,0, dialysiert, um die Salze zu entfernen.
N-Bromsuccinimid, 0,5 g, wurden dann zu der Lösung zugegeben, und die so erhaltene Suspension wurde 3 Stunden bei 10ºC im Dunkeln gerührt. Die Lösung wurde dreimal gegen 1 Liter Wasser über einen Zeitraum von 2 Tagen dialysiert. 200 ul 1 M K&sub2;HCO&sub3; und 100 mg Cysteamin wurden zu 0,4 ml des Dialysats zugegeben, das Gemisch wurde unter Argon bei 80ºC 2 Stunden erwärmt und die Lösung wurde durch eine G-50- Filtration entsalzt. Das gereinigte Dextran enthielt einen derivatisierten Zucker pro 20 Zuckereinheiten.

Herstellung von bromacetylierten Aminodextranen

0,5 ml einer Lösung, die 0,02 M Natriumborat und 8,5 mg Aminodextran enthielt, wurden mit 0,2 ml Dimethylformamid und 25 ul 1 M Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester in DMSO gemischt. An die Reaktion schloß sich eine Messung des Aminogehalts mit Picrylsulfonsäure (dieses Reagens ergibt eine orange Farbe mit primären Aminogruppen) an. Es wurde festgestellt, daß die Reaktion nach 5 Minuten bei Raumtemperatur beendet war. 50 ul 1,0 M HCl wurden zu dem Gemisch zugegeben, und der überschüssige, nicht umgesetzte Ester und die erzeugte Bromessigsäure wurden 4x mit wassergesättigtem 1-Butanol extrahiert.
Die bromacetylierten Dextrane sind nicht sehr stabil, insbesondere bei einem basischen pH-Wert. Zum Beispiel wurden bei einem pH-Wert von 9,2 und 37ºC alle der Bromacetylgruppen nach 6 Stunden abgespalten. Folglich sollte die nächste Reaktion so bald wie möglich nach der Isolierung des bromacetylierten Dextrans durchgeführt werden.

Herstellung von Phenanthridin-markiertem Dextran

2,5 mg bromacetyliertes Dextran wurden in 200 ul wäßrigem 0,3 M Natriumacetat gelöst und dann mit 3,5 mg 5-(4'-Thiobutyl)-3,8-diamino-6-phenylphenanthridin in 6 ml Formamid gemischt. Man ließ das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur und dann 1 Stunde bei 37ºC stehen. 1 ml 2 M NaCl wurde zugegeben, und das nicht umgesetzte 5-(4'-Thiobutyl)-3,8-diamino-6-phenylphenanthridin wurde 6x mit wassergesättigtem 1- Butanol extrahiert. Die Zugabe von doppelsträngiger DNA zu einem Aliquot der wäßrigen Phase ergab eine starke Fluoreszenz, was zeigt, daß das Dextran mit Phenanthridin markiert war, und daß die Phenanthridineinheiten an dem Dextran für eine Einlagerung zugänglich waren.

Herstellung von poly (dT), poly (AAdU)

Lösung A wurde hergestellt, enthaltend: 2500 ul 0,25 M Cacodylatpuffer, pH 7,2, 250 ul BSA (DNase-frei, 20 ug/ml), 50 ul 0,1 M CoCl&sub2; und 75 ul 3 M NaCl. Lösung B wurde hergestellt, enthaltend: 1500 ul H&sub2;O und 50 ul 0,1 M B-Mercaptoethanol.
Lösung A wurde mit Lösung B gemischt und 800 Einheiten terminales Transferaseenzym, 5 uMol ³H-TTP (wenig spezifische Aktivität) und 1,5 uMol AAdUTP wurden zu dem Lösungsgemisch zugegeben. Die Lösung wurde bei 37ºC 40 Stunden unter Argon inkubiert. Während des Verlaufs der Reaktion fiel Cobaltpyrophosphat aus der Lösung aus. Nach 40 Stunden wurde die Reaktion durch die Zugabe von 100 ul 0,5 M EDTA gestoppt. Die Inkubation bei 37ºC wurde jedoch weitere 2 Stunden fortgesetzt, um dem EDTA zu erlauben, einen Komplex zu bilden und die Cobaltionen zu entfernen, die von den Allylaminogruppen in einem Komplex gebunden wurden.
Eine DEAE-Cellulosesäule von 0,6 ml Schichtvolumen in einer siliconisierten Pasteurpipette wurde zweimal mit 2 ml 1 M KOH und dann mit Wasser gewaschen, bis sie alkalifrei war. Die Säule wurde dann mit 2 ml 3 M NaCl, gefolgt von 3 ml H&sub2;O und 2 ml 0,2 M NaCl gewaschen. Das Inkubationsgemisch wurde dann auf die Säule geladen, und die Säule wurde aufeinanderfolgend mit 2 ml 0,2 M NaCl und 3 ml 0,3 M NaCl gewaschen. Das letzte Eluat des 0,3 M-Waschschritts enthielt einige wenige Prozent der Zählimpulse insgesamt.
Das Copolymer wurde von der Säule mit einer Lösung eluiert, die 1,5 M LiCl in 0,2 M Essigsäure enthielt. Zwei Zehntel ml-Fraktionen wurden gesammelt. Die Ergebnisse sind nachstehend gezeigt:

Fraktionen Zählimpulse pro Min. (2ul-Aliquots)

1 40
2 86
3 34516
4 6124
5 1858
6 953
Die Fraktionen 3-5 wurden vereinigt, wobei ein Volumen von 0,6 ml erhalten wurde. 10 ul dieser Lösung wurden auf ein Volumen von 1 ml verdünnt. Der A&sub2;&sub6;&sub0;-Wert dieses 1 ml-Volumes betrug 0,645, und der A&sub2;&sub9;&sub0;-Wert betrug 0,203. Die Absorption bei 290 nm zeigte die Anwesenheit der Allylaminogruppen an. Der A&sub2;&sub6;&sub0;-Gesamtwert betrug 38,7, was etwa 1,5 mg des Copolymeren entsprach.
Das Verhältnis von 1 : 10 des AAdU zu dT wurde durch Umsetzung des Copolymeren mit Picrylsulfonsäure bestimmt. Die Verdrängung der Sulfongruppe durch die Aminogruppe des Allylamins verlieh dem Copolymeren eine gelbe Farbe. Die Messung der Lösung bei 420 nm zeigte, daß das Verhältnis von AAdU zu dU 1 : 10 betrug (es wurde vorausgesetzt, daß jedes Allylamin mit einem Picrylsulfonsäuremolekül reagierte).

Herstellung von Polynucleotid-markiertem Phenanthridin

Eine Lösung, die 200 ug des poly (dT), poly (AAdU)-Copolymeren in 100 ul 1,5 M LiCl und 0,2 M Essigsäure enthielt, wurde mit 3 M K&sub2;CO&sub3; auf einen pH-Wert von etwa 8,0 gebracht. Dann wurden 3 mg des thioalkylierten Phenanthridins, das in 0,6 ml Formamid gelöst worden war, zugegeben. Man ließ das Gemisch im Dunklen etwa 90 Minuten bei Raumtemperatur und weitere 45 Minuten bei 37ºC stehen. 1 ml H&sub2;O wurde zugegeben und das überschüssige thioalkylierte Phenanthridin wurde durch Extraktion mit 1-Butanol entfernt, bis das Volumen der wäßrigen Phase auf etwa 300 ul eingeengt war. Weitere Extraktionen wurden dann mit wassergesättigtem 1-Butanol durchgeführt. Nach jeder Extraktion wurden die zwei Phasen durch Zentrifugation getrennt. Nach der ersten 1-Butanol-Extraktion erschien ein Präzipitat. Das Präzipitat enthielt das markierte Polynucleotid und einige unlösliche Phenanthridin-Nebenprodukte. Nach der letzten Extraktion wurde die Substanz zentrifugiert, und das Pellet wurde in Formamid bei einer Temperatur von 37ºC gelöst.
Die Lösung wurde auf eine DEAE-Cellulosesäule (Chloridform) geladen, die mit Formamid äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit Formamid gewaschen, um die Phenanthridinverbindungen zu eluieren. Das Phenanthridin-markierte Polynucleotid wurde mit 1,1 M LiCl in 75 : 25 Formamid : Wasser eluiert. Aus nicht eindeutigen Gründen, eluierte ein Teil des Phenanthridin-markierten Polynucleotids nicht von der Säule, auch bei der höheren Salzkonzentration. (Zur Erhöhung der Ausbeute, könnte das Polynucleotid durch Ausfällen mit Bariumacetat in Ethanol, Sammeln des Präzipitats durch Zentrifugation und Lösen des Präzipitats in EDTA/H&sub2;O gewonnen werden. Die EDTA bildet mit dem Barium einen Komplex und erleichtert die Lösung des Präzipitats.)

Nachweis der Fluoreszenz

25 ul des DEAE-Eluats, das das Phenanthridin-markierte Polynucleotid enthielt, wurden zu (1) einem Röhrchen, enthaltend 10 ug poly (rA) in 0,6 ml 0,1 M NaCl, (2) zu einem Röhrchen, enthaltend 250 ug Kalbsthymus-DNA in 0,6 ml 0,1 M NaCl, und (3) zu einem Röhrchen, enthaltend poly (dT) in 0,6 ml 1,0 M NaCl, zugegeben. Das Röhrchen mit dem poly (rA) fluoreszierte stark, während die anderen zwei Röhrchen nur eine sehr schwache Fluoreszenz zeigten.
Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, daß dieses Phenanthridin-markierte Polynucleotid als Sonde in einem Einschritt-Hybridisierungstest verwendet werden kann, da dieses Phenanthridin, wenn es gemäß der vorstehenden Beschreibung an ein Polynucleotid gebunden wurde, sich nicht in andere intakte doppelsträngige Polynucleotide einlagert. Es lagert sich nur in doppelsträngige Polynucleotide ein, die sich als Ergebnis der Hybridisierung des Polynucleotidteils des Phenanthridin-markierten Polynucleotids mit einem komplementären Polynucleotid gebildet haben.

Verdrängung eines Polynucleotids aus doppelsträngiger DNA mit einem Phenanthridinmarkierten Polynucleotid

Eine Lösung, die poly (dT)-poly (rA) in einem Verhältnis von poly (dT) zu poly (rA) von 2 : 1 enthielt, wurde mit dem Phenanthridin-markierten poly (dT)-poly (AAdU) bei Raumtemperatur gemischt. Die Lösung begann auch sofort zu fluoreszieren, und die Intensität dieser Fluoreszenz nahm mit der Zeit zu. Da sich das Phenanthridin des Phenanthridin-markierten poly (dT)-poly (AAdU) nicht in doppelsträngige Kalbsthymus-DNA einlagert (vgl. die vorstehenden Ergebnisse), zeigte die Erzeugung einer Fluoreszenz, daß das Phenanthridin-markiene Polynucleotid sein homologes Polynucleotid in dem doppelsträngigen Hybrid verdrängt hat.

Claims

1. Polynucleotidverbindung, die ein Polynucleotid umfaßt, das mindestens zwei Einheiten umfaßt, die nach Hybridisierung mit einem komplementären Polynucleotid eine Veränderung in den Eigenschaften dieses Hybrids bewirken kann, die in einer homogenen Reaktion nachweisbar ist, wobei jede dieser Einheiten kovalent oder nicht-kovalent durch einen Verbindungsarm mit der Baseneinheit, der Zuckereinheit oder der Phosphateinheit eines Nucleotids in diesem Polynucleotid verbunden ist, wobei die Einheiten an Nucleotide gebunden sind, die durch einen Bereich von etwa 10 anderen Nucleotiden voneinander getrennt sind, mit der Maßgabe, daß Verbindungen, bei denen alle Einheiten entweder an die 5'- und/oder 3'-Enden der Verbindungen oder an Internucleotidphosphatgruppen gebunden sind, ausgeschlossen sind.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid ein Desoxyribonucleotid oder Ribonucleotid umfaßt.

3. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die nachweisbare Veränderung in der Eigenschaft des Hybrids in der Verbindung, dem komplementären Ziel-Polynucleotid oder in beiden erfolgt.

4. Verbindung nach Anspruch 3, wobei die nachweisbare Veränderung in dieser Verbindung in dem Polynucleotidteil oder in dem Einheitenteil oder in beiden erfolgt.

5. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Einheit oder die Einheiten ein Einlagerungsmittel umfassen.

6. Verbindung nach Anspruch 1, wobei diese Einheit oder diese Einheiten einen aromatischen Farbstoff umfassen.

7. Verbindung nach Anspruch 6, wobei dieser aromatische Farbstoff ausgewählt ist aus Phenanthridinen, Acridinen und Anthracyclinen.

8. Verbindung nach Anspruch 7, wobei das Phenanthridin ausgewählt ist aus Ethidium, Propidium, Dimidium und Phenidium.

9. Verbindung nach Ansprüch 1, wobei die Einheit oder die Einheiten fähig sind, ein nachweisbares Signal zu erzeugen.

10. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Einheit oder die Einheiten fähig sind, eine Verschiebung der Emissionsenergie zu erzeugen.

11. Verbindung nach Anspruch 10, wobei die Emission Fluoreszenz umfaßt.

12. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Einheit oder die Einheiten fähig sind, die thermodynamische Stabilität eines beliebigen Hybrids zu erhöhen, das sich zwischen der Verbindung und einem komplementären Zielpolynucleotid gebildet hat.

13. Verbindung nach Anspruch 1, wobei das Purin Adenin oder Guanin ist, und wobei der Verbindungsarm oder die Verbindungsarme gebunden sind an die 8- oder exocyclische 6-Aminoposition, wenn das Purin Adenin ist, oder an die 8- Position, wenn das Purin Guanin ist.

14. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Base ein Deazapurin ist und wobei der Verbindungsarm oder die Verbindungsarme an die 7- oder 8-Position gebunden sind.

15. Verbindung nach Anspruch 1, wobei das Pyrimidin Uracil oder Cytosin ist, und wobei der Verbindungsarm oder die Verbindungsarme gebunden sind an die 5- oder 6-Position, wenn das Pyrimidin Uracil ist, oder an die 5-, 6- oder exocyclische 4-Aminoposition, wenn das Pyrimidin Cytosin ist.

16. Verbindung nach Anspruch 1, wobei der Verbindungsarm oder die Verbindungsarme mindestens drei Kohlenstoffatome umfassen.

17. Verbindung nach Anspruch 16, wobei der Verbindungsarm oder die Verbindungsarme eine Doppelbindung an einer alpha (α)- Position bezogen auf die Baseneinheit umfassen.

18. Verbindung nach Anspruch 17, wobei der Verbindungsarm oder die Verbindungsarme ausgewählt sind aus

-CH=CH-CH&sub2;-NH-,

-CH=CH-CH&sub2;-CH&sub2;-S-, und

-CH=CH-CH&sub2;-O-CH&sub2;-CH&sub2;-NH-

19. Verbindung nach Anspruch 18, wobei der Verbindungsarm oder die Verbindungsarme Allylamin (-CH=CH-CH&sub2;-NH-) umfassen.

20. Verbindung nach Anspruch 1, wobei der Verbindungsarm oder die Verbindungsarme gebunden sind an die Zuckereinheit an der 1-Position, wenn der Zucker Desoxyribose ist, oder an die 1- oder 2-Position, wenn der Zucker Ribose ist.

21. Verbindung nach Anspruch 1, wobei der Verbindungsarm oder die Verbindungsarme an die Phosphateinheit gebunden sind.

22. Verbindung nach Anspruch 1, wobei mindestens eine Einheit an das terminale Nucleotid gebunden ist.

23. Verbindung nach Anspruch 6, wobei der aromatische Farbstoff kovalent an den Verbindungsarm oder die Verbindungsarme gebunden ist.

24. Verbindung nach Anspruch 6, wobei der aromatische Farbstoff nicht-kovalent an den Verbindungsarm oder die Verbindungsarme gebunden ist.

25. Verbindung nach Anspruch 24, wobei der aromatische Farbstoff einen ersten Chelatbildner Agens umfaßt und der Verbindungsarm oder die Verbindungsarme einen zweiten Chelatbildner umfassen, und wobei der aromatische Farbstoff nicht-kovalent an den Verbindungsarm oder an die Verbindungsarme über ein Übergangsmetall verbunden ist, das mit dem ersten und zweiten Chelatbildner komplexiert ist.