JPS59126252A - Ｄｎａもしくはｄｎａ部分分解物の塩基配列決定法 - Google Patents
Ｄｎａもしくはｄｎａ部分分解物の塩基配列決定法Info
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- JPS59126252A JPS59126252A JP58001335A JP133583A JPS59126252A JP S59126252 A JPS59126252 A JP S59126252A JP 58001335 A JP58001335 A JP 58001335A JP 133583 A JP133583 A JP 133583A JP S59126252 A JPS59126252 A JP S59126252A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列
の決定法に関するものである。さらに詳しくは、本発明
は、放射線フィルムを用いたオートラジオグラフィーを
利用するＤＮＡもしく ハＤＮＡ部分分解物の塩基配列
決定法に関するものである。
の決定法に関するものである。さらに詳しくは、本発明
は、放射線フィルムを用いたオートラジオグラフィーを
利用するＤＮＡもしく ハＤＮＡ部分分解物の塩基配列
決定法に関するものである。
支持媒体上において少なくとも一次元的方向に分布して
分布列を形成している放射性標識物質の位置情報を得る
ための方法としてオートラジオグラフィーが既に知られ
ている。
分布列を形成している放射性標識物質の位置情報を得る
ための方法としてオートラジオグラフィーが既に知られ
ている。
たとえば、蛋白質、核酸などのような生物体由来の高分
子物質に放射性標識を付与し、その放射性標識高分子物
質、その誘導体、あるいはその分解物などをゲル電気泳
動などの分離操作にかけてケル状支士−１＋媒体におい
て分離展開し、そのゲル状支持媒体と高感度Ｘ線フィル
ムとを一定時間重ね合わせることにより、該フィルムを
感光させ、その感光位置から得られる該ゲル状支持媒体
上における放射性標識物質の位置情報を基にして、その
高分子物質の分離、同定、あるいは高分子物質の分子量
、特性の評価などを行なう方法も開発され、実際に利用
されている。
子物質に放射性標識を付与し、その放射性標識高分子物
質、その誘導体、あるいはその分解物などをゲル電気泳
動などの分離操作にかけてケル状支士−１＋媒体におい
て分離展開し、そのゲル状支持媒体と高感度Ｘ線フィル
ムとを一定時間重ね合わせることにより、該フィルムを
感光させ、その感光位置から得られる該ゲル状支持媒体
上における放射性標識物質の位置情報を基にして、その
高分子物質の分離、同定、あるいは高分子物質の分子量
、特性の評価などを行なう方法も開発され、実際に利用
されている。
特に近年においては、オートラジオグラフィーは、核酸
などのＤＮＡ （もしくはそれらのＤＮＡの部分分解物
、以ｒ同様）の塩基配列の決定に有効に利用されている
。
などのＤＮＡ （もしくはそれらのＤＮＡの部分分解物
、以ｒ同様）の塩基配列の決定に有効に利用されている
。
このオートラジオグラフィーを利用することによりＤＮ
Ａの塩基配列を決定する方法としては、マキサム・ギル
バー１− （Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法、および
サンカー・クールン７ （Ｓａｎｇｅｒ−Ｃｏｕｌｓｏ
ｎ）法が知られている。゛これらの方法は、ＤＮＡが二
本の鎖状分子からなる二重ラセン構造を有し、かつその
二本の鎖状分子は、各々四種類の塩基、すなわちアデニ
ン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（
Ｔ）なる塩基を有する構成単位から構成されてこと、そ
して、この二本の鎖状分子の間はこれら四種類の塩基間
の水素結合によって架橋されており、しかも８構成単位
間の水素結合は、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔの二種類の組合わ
せのみにおいて実現しているというＤＮＡの特徴的な構
造を巧妙に利用して、その塩基配列を決定する方法であ
る。
Ａの塩基配列を決定する方法としては、マキサム・ギル
バー１− （Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法、および
サンカー・クールン７ （Ｓａｎｇｅｒ−Ｃｏｕｌｓｏ
ｎ）法が知られている。゛これらの方法は、ＤＮＡが二
本の鎖状分子からなる二重ラセン構造を有し、かつその
二本の鎖状分子は、各々四種類の塩基、すなわちアデニ
ン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（
Ｔ）なる塩基を有する構成単位から構成されてこと、そ
して、この二本の鎖状分子の間はこれら四種類の塩基間
の水素結合によって架橋されており、しかも８構成単位
間の水素結合は、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔの二種類の組合わ
せのみにおいて実現しているというＤＮＡの特徴的な構
造を巧妙に利用して、その塩基配列を決定する方法であ
る。
たとえは、マキサム−ギルバート法は１次に述へるよう
な方法により実施される。
な方法により実施される。
まず、塩基配列を決定しようとしているＤＮＡあるいは
ＤＮＡの部分分解物の鎖状分子の一方の側の端部に燐（
Ｐ）の放射性同位元素を含む基を結合させることにより
、その対象物を放射性標識物質とする。次に、この放射
性標識物質について所定の化学的な処理を行なうことに
より鎖状分子の各構成単位間の結合を特異的に切断して
、たとえば、 ■）グアニンＣＧ）特異的切断分解物、２）グアニン（
Ｇ）特異的切断分解物＋アデニン（Ａ）特異的切断分解
物、 ３）チミン（Ｔ）特異的切断分解物＋シトシン（Ｃ）特
異的切断分解物、 ４）シトシン（Ｃ）特異的切断分解物、からなる四種類
の塩基特異的切断分解物を得る。
ＤＮＡの部分分解物の鎖状分子の一方の側の端部に燐（
Ｐ）の放射性同位元素を含む基を結合させることにより
、その対象物を放射性標識物質とする。次に、この放射
性標識物質について所定の化学的な処理を行なうことに
より鎖状分子の各構成単位間の結合を特異的に切断して
、たとえば、 ■）グアニンＣＧ）特異的切断分解物、２）グアニン（
Ｇ）特異的切断分解物＋アデニン（Ａ）特異的切断分解
物、 ３）チミン（Ｔ）特異的切断分解物＋シトシン（Ｃ）特
異的切断分解物、 ４）シトシン（Ｃ）特異的切断分解物、からなる四種類
の塩基特異的切断分解物を得る。
次に、上記の各々の塩基特異的切断分解物をゲル電気泳
動法により同一の支持媒体上で平行して分＃展開し、各
々の塩基特異的切断分解物かそれぞれ一次元方向に分離
展開された分離展開列（ただし視覚的には見ることかで
きない）を得る。そして、次に前述の方法を利用してこ
の分離展開列をＸ線フィルムなどの放射線フィルムにに
可視化してオートラジオグラフを得る。
動法により同一の支持媒体上で平行して分＃展開し、各
々の塩基特異的切断分解物かそれぞれ一次元方向に分離
展開された分離展開列（ただし視覚的には見ることかで
きない）を得る。そして、次に前述の方法を利用してこ
の分離展開列をＸ線フィルムなどの放射線フィルムにに
可視化してオートラジオグラフを得る。
得られたオートラジオグラフは、」１記の例においては
、 １）グアニン（Ｇ）特異的切断分解物の展開位置を示す
分離展開列、 ２）グアニン（Ｇ）特異的切断分解物の展開位置とアデ
ニン（Ａ）特“異的切断分解物の展開位置の双方を示す
分離展開列、 ３）チミン（Ｔ）特異的切断分解物の展開位置とシトシ
ン（Ｃ）特異的切断分解物の展開位置の双方を示す分離
展開列、 ４）シトシン（Ｃ）特異的切断分解物の展開位置を示す
分離展開列、 の四種類の分離展開列を可視画像として示すものとなる
。
、 １）グアニン（Ｇ）特異的切断分解物の展開位置を示す
分離展開列、 ２）グアニン（Ｇ）特異的切断分解物の展開位置とアデ
ニン（Ａ）特“異的切断分解物の展開位置の双方を示す
分離展開列、 ３）チミン（Ｔ）特異的切断分解物の展開位置とシトシ
ン（Ｃ）特異的切断分解物の展開位置の双方を示す分離
展開列、 ４）シトシン（Ｃ）特異的切断分解物の展開位置を示す
分離展開列、 の四種類の分離展開列を可視画像として示すものとなる
。
次に、上記の１）および２）の分離展開列をそれぞれ比
較することによりグアニン特異的切断分解物とアデニン
特異的切断分解物の展開位置を同定する。そしてまた、
３）および４）の分離展開列を同様に比較することによ
りチミン特異的切断分解物とシトシン特異的切断分解物
の展開位置を同定する。
較することによりグアニン特異的切断分解物とアデニン
特異的切断分解物の展開位置を同定する。そしてまた、
３）および４）の分離展開列を同様に比較することによ
りチミン特異的切断分解物とシトシン特異的切断分解物
の展開位置を同定する。
すなわち、以上のようにしてグアニン（Ｇ）特異的切断
分解物、アデニン（Ａ）特異的切断分解物、チミン（Ｔ
）特異的切断分解物、およびシトシン（Ｃ）特異的切断
分解物の各切断分解物の展聞位１″δを同定し、各切断
分解物の泳動距離はその分子量によって決定されるとの
知見に基ついて、放射性回位元素が結合された鎖状分子
の端部から一定の位１δ関係にある塩基を順次決定する
ことにより、対象物の全ての１１Ａ基の配列を決定する
。
分解物、アデニン（Ａ）特異的切断分解物、チミン（Ｔ
）特異的切断分解物、およびシトシン（Ｃ）特異的切断
分解物の各切断分解物の展聞位１″δを同定し、各切断
分解物の泳動距離はその分子量によって決定されるとの
知見に基ついて、放射性回位元素が結合された鎖状分子
の端部から一定の位１δ関係にある塩基を順次決定する
ことにより、対象物の全ての１１Ａ基の配列を決定する
。
ところで、ＤＮＡの塩基配列決定のためのオーＩ・ラジ
オグラフィーにおいて、上述のように放射線写真法を利
用することにより、放射性標識物質の分子中位の位置情
報を視覚的に観測することができるという大きな利点を
持っている。
オグラフィーにおいて、上述のように放射線写真法を利
用することにより、放射性標識物質の分子中位の位置情
報を視覚的に観測することができるという大きな利点を
持っている。
しかしなから、分離展開用の支持媒体として高分子物質
からなるケルを用いる場合にはケルの内部に泡などが発
生しやすく、また、このゲルは自己支持性かないため通
常はガラスなどの支持体で挟持した状態にて分＃展開を
行なうが、それらの支持体の変形なとによってもゲルが
均一でなくなることも多く、従って、放射性標識物質は
支持媒体」−で必ずしも一様に分離展開されるとは限ら
ない。このような理由から、たとえば、支持媒体の中央
付近における分１ｉ％展開列の移動距離に比べて両端の
分＃展開列の移動距離が相対的に短いといった、いわゆ
るスマイリング効果がしばしば現れる。あるいは、電気
泳動により分離展開する場合において電圧が支持媒体全
体に均一に印加されない場合があり、そのような場合に
は、分離展開条件が支持媒体上で局部的に異なってくる
ため、得られる分＃、展開列に歪みが生じがちである。
からなるケルを用いる場合にはケルの内部に泡などが発
生しやすく、また、このゲルは自己支持性かないため通
常はガラスなどの支持体で挟持した状態にて分＃展開を
行なうが、それらの支持体の変形なとによってもゲルが
均一でなくなることも多く、従って、放射性標識物質は
支持媒体」−で必ずしも一様に分離展開されるとは限ら
ない。このような理由から、たとえば、支持媒体の中央
付近における分１ｉ％展開列の移動距離に比べて両端の
分＃展開列の移動距離が相対的に短いといった、いわゆ
るスマイリング効果がしばしば現れる。あるいは、電気
泳動により分離展開する場合において電圧が支持媒体全
体に均一に印加されない場合があり、そのような場合に
は、分離展開条件が支持媒体上で局部的に異なってくる
ため、得られる分＃、展開列に歪みが生じがちである。
従って、１１ｊ記のような各分離展開列の比較による各
塩基特異的切断分解物の展開位置の同定操作において、
それぞれの展開位置の対応関係を誤りなく決定すること
は必ずしも容易とは言えず、このため」１記の同定操作
は従来のオートラジオグラフィーを利用したＤＮＡもし
くはＤＮＡ部分分解物の塩基配列決定法における大きな
問題点とされている。
塩基特異的切断分解物の展開位置の同定操作において、
それぞれの展開位置の対応関係を誤りなく決定すること
は必ずしも容易とは言えず、このため」１記の同定操作
は従来のオートラジオグラフィーを利用したＤＮＡもし
くはＤＮＡ部分分解物の塩基配列決定法における大きな
問題点とされている。
本発明は、以上に述べたような従来のオートラジオグラ
フィーを利用したＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩
基配列決定のための操作における問題点を排除する塩基
配列決定法を提供するものである。
フィーを利用したＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩
基配列決定のための操作における問題点を排除する塩基
配列決定法を提供するものである。
本発明は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物に放射性標
識を旧年したのち、これを塩基特異的切断分解にかける
ことにより得られる放射性標識を有する切断分解物を支
持媒体上で分＃、展開し、これにより得られる分離展開
列を放射線フィルム上に可視画像として得て、該可視画
像上に現われた該塩基特異的切断分解物の分離展開位置
に基づいてＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列
を決定する方法において、 放射性標識を有する塩基特異的切断分解物を支持媒体」
二で分＃展開する際に、ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解
物をその構成単位である四種類の塩基についてその各々
の塩基ごとに特異的に切断して得た切断分解物の混合物
を同一の支持媒体上で同時に平行して分離展開し、該混
合物の分離展開列に現われた各分ｇ！：展開位置を標準
として他の分離展開列に現われた塩基特異的切断分解物
の分離展開位置を比較同定する工程を含むことを特徴と
するＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列決定法
からなるものである。
識を旧年したのち、これを塩基特異的切断分解にかける
ことにより得られる放射性標識を有する切断分解物を支
持媒体上で分＃、展開し、これにより得られる分離展開
列を放射線フィルム上に可視画像として得て、該可視画
像上に現われた該塩基特異的切断分解物の分離展開位置
に基づいてＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列
を決定する方法において、 放射性標識を有する塩基特異的切断分解物を支持媒体」
二で分＃展開する際に、ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解
物をその構成単位である四種類の塩基についてその各々
の塩基ごとに特異的に切断して得た切断分解物の混合物
を同一の支持媒体上で同時に平行して分離展開し、該混
合物の分離展開列に現われた各分ｇ！：展開位置を標準
として他の分離展開列に現われた塩基特異的切断分解物
の分離展開位置を比較同定する工程を含むことを特徴と
するＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列決定法
からなるものである。
次に本発明の詳細な説明する。
本発明の塩基配列決定法の対象とされるＤＮＡもしくは
叶ＮＡ部分分解物は、従来のオートラジオグラフィーを
利用したＤＮＡもしくはＤ Ｎ ｐ、 ａ分分解物の塩
基配列決定法に利用されてしするものと同様であり、特
に限定はない。すなわち、各種のＤＮＡ、およびそれら
のＤＮＡを任意の位置で切断した部分分解物が含まれる
。また、それらのＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物に放
射性標識を付与する操作、およびＤＮＡもしくはＤＮＡ
部分分解物に放射性標識を付与して得た放射性標識物質
を塩基特異的切断分解にかけることにより放射性標識を
有する塩基特異的切断分解物を得る操作についても既に
公知である。
叶ＮＡ部分分解物は、従来のオートラジオグラフィーを
利用したＤＮＡもしくはＤ Ｎ ｐ、 ａ分分解物の塩
基配列決定法に利用されてしするものと同様であり、特
に限定はない。すなわち、各種のＤＮＡ、およびそれら
のＤＮＡを任意の位置で切断した部分分解物が含まれる
。また、それらのＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物に放
射性標識を付与する操作、およびＤＮＡもしくはＤＮＡ
部分分解物に放射性標識を付与して得た放射性標識物質
を塩基特異的切断分解にかけることにより放射性標識を
有する塩基特異的切断分解物を得る操作についても既に
公知である。
すなわち、上記の操作についての簡単な記述Ｌｉ、たと
えば、次の文献に示されている。
えば、次の文献に示されている。
「遺伝情報を原語で読む会意表を衝いたＤＮＡの塩基配
列解析法」三浦謹一部、現代化学、１９７７年９月号４
６〜５４頁（■東京化学同人刊）また、上記の操作につ
いての詳細な記述は、ンことえば、次の文献に見られる
。
列解析法」三浦謹一部、現代化学、１９７７年９月号４
６〜５４頁（■東京化学同人刊）また、上記の操作につ
いての詳細な記述は、ンことえば、次の文献に見られる
。
ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、 Ｖ
ＯＬ、 ６５． ＰＡＲＴ Ｉ（ＡＣＡＤＥＭＩＣＰＲ
ＥＳＳ、 ＮＥＷ ＹＯＲＫ ＬＯＮＤＯＮ ＴＲ
０ＮＴＯＳＹＤＮＥＹ ＳＡＮ ＦＲＡＮＣＩＳＩＣ
ｏ、 １！３８０）また、上記放射性標識物質を支持媒
体を用いて分離展開するための方法の例は、上記の文献
にも記載されているが、たとえば、ゲル状支持媒体（形
状は層状、柱状など任意）、アセテートなとのポリマー
成形体、あるいは濾紙などの各種の支持媒体を用いる電
気泳動、そしてシリカゲルなどの支持媒体を用いる薄層
クロマトグラフィーかその代表的な方法として挙げられ
る。このうちで、高分子物質のゲルから形成された支持
媒体を用いる電気泳動法が好ましい方法である。
ＯＬ、 ６５． ＰＡＲＴ Ｉ（ＡＣＡＤＥＭＩＣＰＲ
ＥＳＳ、 ＮＥＷ ＹＯＲＫ ＬＯＮＤＯＮ ＴＲ
０ＮＴＯＳＹＤＮＥＹ ＳＡＮ ＦＲＡＮＣＩＳＩＣ
ｏ、 １！３８０）また、上記放射性標識物質を支持媒
体を用いて分離展開するための方法の例は、上記の文献
にも記載されているが、たとえば、ゲル状支持媒体（形
状は層状、柱状など任意）、アセテートなとのポリマー
成形体、あるいは濾紙などの各種の支持媒体を用いる電
気泳動、そしてシリカゲルなどの支持媒体を用いる薄層
クロマトグラフィーかその代表的な方法として挙げられ
る。このうちで、高分子物質のゲルから形成された支持
媒体を用いる電気泳動法が好ましい方法である。
以下、本発明のＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基
配列の決定法を、前記のマキサム・ギルバート法を利用
したＤＮＡの塩基配列決定法を例にとり、その塩基配列
決定のための典型的な塩基特異的切断分解物の組合せと
じで次の工種類の切断分解物（もしくは切断分解物混合
物）を用いた場合について説明する。
配列の決定法を、前記のマキサム・ギルバート法を利用
したＤＮＡの塩基配列決定法を例にとり、その塩基配列
決定のための典型的な塩基特異的切断分解物の組合せと
じで次の工種類の切断分解物（もしくは切断分解物混合
物）を用いた場合について説明する。
ｌ）グアニン（Ｇ）特異的切断分解物
＋アデニン（Ａ）特異的切断分解物
＋チミン（Ｔ）特異的切断分解物
＋シトシン（Ｃ）特異的切断分解物、
２）グアニン（Ｇ）特異的切断分解物、３）グアニン（
Ｇ）特異的切断分解物＋アデニン（Ａ）特異的切断分解
物、 ４）チミン（Ｔ）特異的切断分解物＋シトシン（Ｃ）＃
異的切断分解物、 ５）シトシン（Ｃ）特異的切断分解物、すなわち、上記
の１）の混合物が、四種類の塩基特異的切断分解物含む
ものであり、標準となる分離展開列の形成に用いられる
。
Ｇ）特異的切断分解物＋アデニン（Ａ）特異的切断分解
物、 ４）チミン（Ｔ）特異的切断分解物＋シトシン（Ｃ）＃
異的切断分解物、 ５）シトシン（Ｃ）特異的切断分解物、すなわち、上記
の１）の混合物が、四種類の塩基特異的切断分解物含む
ものであり、標準となる分離展開列の形成に用いられる
。
まず、対象のＤＮＡに対して３２Ｆによる放射性標識を
付与し、これを常法により化学的手段を用いて、ＤＮＡ
の構成単位である四種類の塩基についてその各々の塩基
ごとに特異的な分解を行なわせて、上記２）〜５）の塩
基特異的切断分解物（各々には放射性標識が付されてい
る）を得る。
付与し、これを常法により化学的手段を用いて、ＤＮＡ
の構成単位である四種類の塩基についてその各々の塩基
ごとに特異的な分解を行なわせて、上記２）〜５）の塩
基特異的切断分解物（各々には放射性標識が付されてい
る）を得る。
次に、これらの１塩基特異的切断分解物を適宜混合する
ことにより、上記１）の混合物を得る。
ことにより、上記１）の混合物を得る。
次いで、」−記ｌ）の混合物、および２）〜５）の特異
的切断分解物を同一のゲル支持媒体」二で電気泳動によ
り乎行に分離展開させて、上記混合物およびそれぞれの
塩基特異的切断分解物の分離展開列（ただし、目には見
えない）を得る。
的切断分解物を同一のゲル支持媒体」二で電気泳動によ
り乎行に分離展開させて、上記混合物およびそれぞれの
塩基特異的切断分解物の分離展開列（ただし、目には見
えない）を得る。
次に、この分離展開列が形成された支持媒体とＸ線フィ
ルムとを低温（たとえば−７０〜−９０°Ｃ）にて数日
間重ね合わせることにより露光操作を行なったのち、こ
のＸ線フィルムを現像することによりＸ線フィルム上に
オートラジオグラフ（可視画像）を得る。
ルムとを低温（たとえば−７０〜−９０°Ｃ）にて数日
間重ね合わせることにより露光操作を行なったのち、こ
のＸ線フィルムを現像することによりＸ線フィルム上に
オートラジオグラフ（可視画像）を得る。
第１図は、放射性標識が付与されたＤＮＡの塩基特異的
切断分解物およびそれらの混合物がそれぞれ分離展開さ
れて形成された玉料の分離展開列（泳動列）を示すオー
トラジオグラフを示す。
切断分解物およびそれらの混合物がそれぞれ分離展開さ
れて形成された玉料の分離展開列（泳動列）を示すオー
トラジオグラフを示す。
すなわち、第１図において第１列から第５列は順に、
（１）−（Ｇ）特異的切断分解物
（２）−（Ｇ）特異的切断分解物
＋（Ａ）特異的切断分解物
（３）−（Ｇ）特異的切断分解物
＋（Ａ）特異的切断分解物
＋（Ｔ）特異的切断分解物
＋（Ｃ）特異的切断分解物
（４）−（Ｔ）特異的切断分解物
＋（Ｃ）特異的切断分解物
（５） −（Ｃ）特異的切断分解物
の各分離展開列を示す。
上記の分離展開列のうち第３列は、（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）
の全ての塩基特異的切断分解物を含んだ混合物の分ＡＩ
展開列であり、この分離展開列を塩基配列決定のための
内部標準列（基準列）として利用する。
の全ての塩基特異的切断分解物を含んだ混合物の分ＡＩ
展開列であり、この分離展開列を塩基配列決定のための
内部標準列（基準列）として利用する。
以下に、各分離展開列において帯状にて示される分離展
開物を上記の内部標準列を利用して同定する方法の例を
示す。
開物を上記の内部標準列を利用して同定する方法の例を
示す。
まず、第３列の内部標準列と、その隣りの第２列の分離
展開列とを比較子る。内部標準列番こは全ての塩基特異
的切断分解物が含まれているから、第２列に現われる（
Ｇ）特異的切断分解物と（Ａ）特異的切断分解物の全て
の分＃展開物の展開位ｊ６は、内部標準列に現われた分
離痕間物の一部に対応するはずである。従って、第２列
の分離展開物の全てを内部標準列の分離展開物に対応さ
せることによって内部標準列と第２列とのずれを容易に
補正することかできる。
展開列とを比較子る。内部標準列番こは全ての塩基特異
的切断分解物が含まれているから、第２列に現われる（
Ｇ）特異的切断分解物と（Ａ）特異的切断分解物の全て
の分＃展開物の展開位ｊ６は、内部標準列に現われた分
離痕間物の一部に対応するはずである。従って、第２列
の分離展開物の全てを内部標準列の分離展開物に対応さ
せることによって内部標準列と第２列とのずれを容易に
補正することかできる。
次に、第３列の内部標準列と、その隣りの第４列の分離
展開列とを比較する。内部標準列には全ての１ｎ基特異
的切断分解物が含まれているから、第４列に現われる（
Ｔ）特異的切断分解物と（Ｃ）特異的切断分解物の全て
の分離展開物の展開位置は、内部標茎列に現われた分離
展開物の一部に対応するはずである。またさらに、第２
列と第４列は互いに排他性をもつものであるから、この
点をも利用することにより更に確実に第４列の分離展開
物の全てを内部標準列の分＃展開物に対応させることが
できる。このようにして、第４列の分ａ ＩＪＩｉ：間
物の全てを内部標準列の分離展開物に対応させることに
よって内部標準列と第４列とのずれは容易に補正するこ
とができる。
展開列とを比較する。内部標準列には全ての１ｎ基特異
的切断分解物が含まれているから、第４列に現われる（
Ｔ）特異的切断分解物と（Ｃ）特異的切断分解物の全て
の分離展開物の展開位置は、内部標茎列に現われた分離
展開物の一部に対応するはずである。またさらに、第２
列と第４列は互いに排他性をもつものであるから、この
点をも利用することにより更に確実に第４列の分離展開
物の全てを内部標準列の分＃展開物に対応させることが
できる。このようにして、第４列の分ａ ＩＪＩｉ：間
物の全てを内部標準列の分離展開物に対応させることに
よって内部標準列と第４列とのずれは容易に補正するこ
とができる。
次いで、第２列と第１列の分離展開列をそれぞれ比較す
ることにより（Ｇ）特異的切断分解物と（Ａ）特異的切
断分解物の展開位置を同定することができ、また、第４
列と第５列の分離展開列を同様に比較することにより（
Ｔ）特異的切断分解物と（Ｃ）特異的切断分解物の展開
位置を同定することができる。なお、これらの各塩基特
異的切断分解物の同定操作において、前記のようにして
求めた各分離展開列の間のずれの程度を適宜参考にすれ
ば、それらの比較および同定は非常に容易となり、また
その精度も向上する。
ることにより（Ｇ）特異的切断分解物と（Ａ）特異的切
断分解物の展開位置を同定することができ、また、第４
列と第５列の分離展開列を同様に比較することにより（
Ｔ）特異的切断分解物と（Ｃ）特異的切断分解物の展開
位置を同定することができる。なお、これらの各塩基特
異的切断分解物の同定操作において、前記のようにして
求めた各分離展開列の間のずれの程度を適宜参考にすれ
ば、それらの比較および同定は非常に容易となり、また
その精度も向上する。
すなわち、以上に例示された本発明のＤＮＡもしくはＤ
ＮＡ部分分解物の塩基配列決定法によれば、従来のＧ、
Ｇ＋Ａ、Ｔ＋Ｃ，Ｔからなる四群の各塩基特異的切断分
解物の分離展開操作に基づく方法、あるいはＧ、Ａ、Ｔ
、Ｃからなる四群（四種類）の各塩基特異的切断分解物
の分ｌ！！ｉ展開操作に基づく方法を利用する操作に比
較して、ＤＮＡも１７＜はＤＮＡ部分分解物の各塩基特
異的切断分解物の同定操作は非常に容易となり、またそ
の才１１１ｊ践も顕Σに向−１−する。
ＮＡ部分分解物の塩基配列決定法によれば、従来のＧ、
Ｇ＋Ａ、Ｔ＋Ｃ，Ｔからなる四群の各塩基特異的切断分
解物の分離展開操作に基づく方法、あるいはＧ、Ａ、Ｔ
、Ｃからなる四群（四種類）の各塩基特異的切断分解物
の分ｌ！！ｉ展開操作に基づく方法を利用する操作に比
較して、ＤＮＡも１７＜はＤＮＡ部分分解物の各塩基特
異的切断分解物の同定操作は非常に容易となり、またそ
の才１１１ｊ践も顕Σに向−１−する。
なお、ｊ、記の説明番ごおいては、内部標準列となる１
１シ僑物の分＃ Ｉｊｉ＜間外を中央に配置する例を示
したが、この内部標準列！±必ずしも中央に配置する心
霊はなく、他の分離展開列に対して任意の位置に配置す
ることもできる。
１シ僑物の分＃ Ｉｊｉ＜間外を中央に配置する例を示
したが、この内部標準列！±必ずしも中央に配置する心
霊はなく、他の分離展開列に対して任意の位置に配置す
ることもできる。
また、内部標準列は複数個配置することができる。たと
えば、内部標準列を通常の分＃展開列と交カーに配置す
るようにすれば本発明によるＤＮＡもしくはＤＮＡ部分
分解物の各塩基特異的切断分解物の同定操作は更に容易
となり、またその精度も更に顕著に向上する なお、本発明のＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基
配列決定法においては、上記の（Ｇ十Ａ＋Ｔ＋Ｃ，Ｇ、
Ａ＋Ｇ、Ｔ＋Ｃ，Ｃ）の組合わせを利用したＤＮＡの塩
基配列決定法は、ＤＮＡの場シ、（配列決定方法の一例
であって、本発明の塩基配夕１ｊの決定法は、上記の組
合わせに限定されるものはなく、種々の組合わせが可能
であり、またその組合わせを利用して、上記の方法に準
じる方法により同様にして塩基配列を決定することがで
きる。
えば、内部標準列を通常の分＃展開列と交カーに配置す
るようにすれば本発明によるＤＮＡもしくはＤＮＡ部分
分解物の各塩基特異的切断分解物の同定操作は更に容易
となり、またその精度も更に顕著に向上する なお、本発明のＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基
配列決定法においては、上記の（Ｇ十Ａ＋Ｔ＋Ｃ，Ｇ、
Ａ＋Ｇ、Ｔ＋Ｃ，Ｃ）の組合わせを利用したＤＮＡの塩
基配列決定法は、ＤＮＡの場シ、（配列決定方法の一例
であって、本発明の塩基配夕１ｊの決定法は、上記の組
合わせに限定されるものはなく、種々の組合わせが可能
であり、またその組合わせを利用して、上記の方法に準
じる方法により同様にして塩基配列を決定することがで
きる。
すなわち、たとえば、放射性標識を有する塩基特異的切
断分解物の組合せ片して、 グアニン（Ｇ）特異的切断分解物、 アデニン（Ａ）特異的切断分解物、 チミン（Ｔ）特異的切断分解物、 シトシン（Ｃ）特異的切断分解物、 からなる四本の切断分解物からなる組合せを利用するこ
とも可能である。
断分解物の組合せ片して、 グアニン（Ｇ）特異的切断分解物、 アデニン（Ａ）特異的切断分解物、 チミン（Ｔ）特異的切断分解物、 シトシン（Ｃ）特異的切断分解物、 からなる四本の切断分解物からなる組合せを利用するこ
とも可能である。
また、前記の例においては、支持媒体上で一次元的方向
に分離展開して分離展開列を形成している五列の放射性
標識物質群を用いて説明したが、分離展開列は五列に限
定されるものではなく、五列より多くてもよく、また五
列より少なくともよい。
に分離展開して分離展開列を形成している五列の放射性
標識物質群を用いて説明したが、分離展開列は五列に限
定されるものではなく、五列より多くてもよく、また五
列より少なくともよい。
すなわち、たとえば、
（ａ）： （Ｇ）特異的切断分解物、および（ｂ）：
（Ｇ）特異的切断分解物、＋（Ａ）特異的切断分解
物、 ＋（Ｔ）特異的切断分解物、 ＋（Ｃ）特異的切断分解物 の組合わせを用いてＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物に
おけるグアニンＣＧ）のみについてその位置を決定する
こともできる。
（Ｇ）特異的切断分解物、＋（Ａ）特異的切断分解
物、 ＋（Ｔ）特異的切断分解物、 ＋（Ｃ）特異的切断分解物 の組合わせを用いてＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物に
おけるグアニンＣＧ）のみについてその位置を決定する
こともできる。
すなわち、本発明においてＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分
解物の塩基配列の決定とは、全ての塩基についての塩基
配夕１１の決定のみを意味するものではなく、上記のよ
うに一部の塩基のみの位置を決定することも含むもので
ある。
解物の塩基配列の決定とは、全ての塩基についての塩基
配夕１１の決定のみを意味するものではなく、上記のよ
うに一部の塩基のみの位置を決定することも含むもので
ある。
なお、これまでの記述は一つの支持媒体を用いて一種類
のＤＮＡもしくはＩ）ＮＡ部分分解物の塩基配列の決定
を行なう例を示すものであったが、−・つの支持媒体を
用いて同時に二種類以上のＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分
解物の塩基配列の決定を行なうことも可能である。
のＤＮＡもしくはＩ）ＮＡ部分分解物の塩基配列の決定
を行なう例を示すものであったが、−・つの支持媒体を
用いて同時に二種類以上のＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分
解物の塩基配列の決定を行なうことも可能である。
また、放射線フィルム」：に可視画像として得られたオ
ートラジオグラフの解析は人間の目により行なうことも
できるか、スキャニングテンシトメーターなどの器具を
用いて測定する方法を利用してもよい。
ートラジオグラフの解析は人間の目により行なうことも
できるか、スキャニングテンシトメーターなどの器具を
用いて測定する方法を利用してもよい。
第１図は、放射性標識が付与されたＤＮＡの塩基特異的
切断分解物およびその混合物か支持媒体上で分離展開さ
れて形成された分離展開列（泳動列）を示すオートラジ
オグラフの模式図である。 特許出願人 富士写真フィルム株式会社代理人 方
理士 柳川泰男 図面の浄書（内容に変更なし） １２３４５ 手続補正書 昭和５８年１月２５日 特許庁長官 若杉和夫 殿 ２゜発明の名称 ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列決定法３゜
補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 （５２０）富士写真フィルム株式会社氏名
代表者 大 西 實 ４゜代理人 ６゜補正により増加する発明の数 なし３３
切断分解物およびその混合物か支持媒体上で分離展開さ
れて形成された分離展開列（泳動列）を示すオートラジ
オグラフの模式図である。 特許出願人 富士写真フィルム株式会社代理人 方
理士 柳川泰男 図面の浄書（内容に変更なし） １２３４５ 手続補正書 昭和５８年１月２５日 特許庁長官 若杉和夫 殿 ２゜発明の名称 ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列決定法３゜
補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 （５２０）富士写真フィルム株式会社氏名
代表者 大 西 實 ４゜代理人 ６゜補正により増加する発明の数 なし３３
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １゜ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物に放射性標識を旧
年したのち、これを塩基特異的切断分解にかけることに
より得られる放射性標識を有する切断分解物を支持媒体
上で分離展開し、これにより得られる分離ＩＪＧ開列間
外射線フィルム上に０■視画像として得て、該可視画像
上に現われた該塩基特異的切断分解物の分子４展開位置
に基づいてＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列
を決定する方法において、 放射性標識を有する塩基特異的切断分解物を支持媒体」
二で分離展開する際に、ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解
物をその構成単位である四種類の塩基についてその各々
の塩基ごとに特異的に切断してイ１１だ！、７ノ断分解
物の混合物を同一の支持媒体上で同時に平行して分離展
開し、該混合物の分離展開列に現われた各分離展開位置
を標準として他の分離展開列１に現われた塩基特異的切
断分解物の分離展開位置を比較同定する工程を含むこと
を特徴とするＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配
列決定法。 ２゜放射性標識を有する塩基特異的切断分解物および塩
基特異的切断分解物混合物を支持媒体上で分離展開する
工程を、高分子物質からなるゲルーヒで電気泳動操作を
行なうことにより実施することを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載のＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩
基配列決定法。 ３゜標準の分＃展開列を得るための塩基特異的切断分解
物混合物として、 １）グアニン（Ｇ）特異的切断分解物、アテニン（Ａ）
特異的切断分解物、 チミン（Ｔ）特異的切断分解物、および、シトシン（Ｃ
）特異的切断分解物、 を含む混合物を用い、 そ１．て、放射性標識を有する塩基特異的切断分解物と
して、 ２）グアニン（Ｇ）特異的切断分解物、３）グアニン（
Ｇ）特異的切断分解物＋アデニン（Ａ）特異的切断分解
物、 ４）チミン（Ｔ）特異的切断分解物→−シトシン（Ｃ）
特異的切断分解物、 ５）シトシン（Ｃ）特異的切断分解物。 からなる四指の放射性標識を有する塩基特異的切断分解
物を用いることを特徴とする特許請求の範囲第１項もし
くは第２項記載のＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩
基配列決定法。 ４゜標準の分離展開列を得るための塩基特異的ジノ断分
解物混合物として、 １）グアニン（Ｇ）特異的切断分解物、アデニン（Ａ）
特異的切断分解物、 チミン（Ｔ）特異的切断分解物、および、シトシン（Ｃ
）特異的切断分解物、 を含む混合物を用い、 そして、放射性標識を有する塩基特異的切断分角イ物と
して、 ２）グアニン（Ｇ）特異的切断分解物、３）アデニン（
Ａ）特異的切断分解物、４）チミン（Ｔ）特異的切断分
解物、 ５）シトシン（Ｃ）特異的切断分解物、からなる四指の
放射性標識を有する塩基特異的切断分解物を用いること
を特徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第２項記載
のＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列決定法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58001335A JPS59126252A (ja) | 1983-01-08 | 1983-01-08 | Ｄｎａもしくはｄｎａ部分分解物の塩基配列決定法 |
| EP84100148A EP0115777B1 (en) | 1983-01-08 | 1984-01-09 | Method for determination of base sequence of dna or dna fragment |
| DE8484100148T DE3477585D1 (en) | 1983-01-08 | 1984-01-09 | Method for determination of base sequence of dna or dna fragment |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58001335A JPS59126252A (ja) | 1983-01-08 | 1983-01-08 | Ｄｎａもしくはｄｎａ部分分解物の塩基配列決定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59126252A true JPS59126252A (ja) | 1984-07-20 |
Family
ID=11498624
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58001335A Pending JPS59126252A (ja) | 1983-01-08 | 1983-01-08 | Ｄｎａもしくはｄｎａ部分分解物の塩基配列決定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59126252A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61173158A (ja) * | 1985-01-02 | 1986-08-04 | カリフオルニア・インステイテユ−ト・オブ・テクノロジ− | Ｄｎａ配列決定法 |
| US5821058A (en) * | 1984-01-16 | 1998-10-13 | California Institute Of Technology | Automated DNA sequencing technique |
| USRE43096E1 (en) * | 1984-01-16 | 2012-01-10 | California Institute Of Technology | Tagged extendable primers and extension products |
| US8097405B1 (en) | 1982-06-23 | 2012-01-17 | Enzo Biochem, Inc. | Nucleic acid sequencing processes using non-radioactive detectable modified or labeled nucleotides or nucleotide analogs, and other processes for nucleic acid detection and chromosomal characterization using such non-radioactive detectable modified or labeled nucleotides or nucleotide analogs |
-
1983
- 1983-01-08 JP JP58001335A patent/JPS59126252A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8097405B1 (en) | 1982-06-23 | 2012-01-17 | Enzo Biochem, Inc. | Nucleic acid sequencing processes using non-radioactive detectable modified or labeled nucleotides or nucleotide analogs, and other processes for nucleic acid detection and chromosomal characterization using such non-radioactive detectable modified or labeled nucleotides or nucleotide analogs |
| US5821058A (en) * | 1984-01-16 | 1998-10-13 | California Institute Of Technology | Automated DNA sequencing technique |
| US6200748B1 (en) | 1984-01-16 | 2001-03-13 | California Institute Of Technology | Tagged extendable primers and extension products |
| USRE43096E1 (en) * | 1984-01-16 | 2012-01-10 | California Institute Of Technology | Tagged extendable primers and extension products |
| JPS61173158A (ja) * | 1985-01-02 | 1986-08-04 | カリフオルニア・インステイテユ−ト・オブ・テクノロジ− | Ｄｎａ配列決定法 |
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