JPS6118875A - オ−トラジオグラフイ−における信号処理法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、オートラジオグラフィーにおける信号処理法
に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、写真
感光材料を用いるオートラジオグラフィーにおいて、Ｄ
ＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基鹸列の決定のためのデ
ジタル信号処理における放射性標識物質の分離展開位置
の比較同定方法に関するものである。

［発明の背景］ 支持媒体上において少なくとも一次元的方向に分布して
分布列を形成している放射性標識物質の位置情報を得る
ための方法としてオートラジオグラフィーが既に知られ
ている。

たとえば、蛋白質、核酸などのような生物体由来の高分
子物質に放射性標識を付与したのち、その放射性標識を
付した高分子物質、その誘導体、あるいはその分解物な
ど（以下、放射性標識物質ともいう）をゲル状支持媒体
上で電気泳動などの分離操作にかけて分離展開を行なう
ことにより、該支持媒体上に放射性標識物質の分離展開
列（ただし目には見えない）を構成させ、この分離展開
像のオートラジオグラフを放射線フィルムに可視画像と
して取得し、この可視画像から放射性標識物質の位置情
報を得ている。また、得られた放射性標識物質の位置情
報を基にして、その高分子物質の分離、同定、あるいは
高分子物質の分子量、特性の評価などを行なう方法は既
に開発され、実際に利用されている。

特に近年においては、オートラジオグラフィーは、ＤＮ
Ａ　（もしくはＤＮＡ断片物、以下同様）の塩基配列の
決定に有効に利用されている。

このオートラジオグラフィーを利用してＤＮＡの塩基配
列を決定するための代表的な方法の一つとして、サンガ
ー・り〜ルソ７　（Ｓａｎｇｅｒ−Ｃａｕ　１ｓｏｎ）
法が知られている。この方法は、ＤＮＡが二本の鎖状分
子からなる二列ラセン構造を有し、かつその二本の鎖状
分子は、各々四種類の塩基、すなわちアデニン（Ａ）、
グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）なる塩
基を有する構成単位から構成されていること、そして、
この二本の鎖状分子の間はこれら四種類の塩基間の水素
結合によって架橋されており、しかも各構成単位間の水
素結合は、Ｇ−Ｃｌ’ｌよびＡ−Ｔの二種類の組合わせ
のみにおいて実現しているというＤＮＡの特徴的な構造
に着目し、ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ断片の合成、ゲ
ル電気泳動およびオートラジオグラフィーの手段を巧み
に利用してＤＮＡの塩基配列を決定する方法である。

サンカー・クールノン法におｌ、％て、塩基配列を決定
しようとしているＤＮＡあるいはＤＮＡ断片物（以後、
これらを検体ＤＮＡという）と相補的なりＮＡ断片を合
成するためには幾つかの方法があるが、基本的には一本
鎖の検体ＤＮＡを鋳型（テンプレート）′とし、上記四
種類の塩基を含むモノヌクレオシドトリフオスフェート
の存在下でＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）を作
用させることにより、検体ＤＮＡと相補的な種々の長さ
のＤＮＡ断片を合成する。このとき・一部のモノヌクレ
オシドトリフオスフェートに放射性標識が付与されたも
のを用いること、および合成条件に工夫を凝らして四種
の塩基のいずれか一つに対して特異的になるようにする
ことにより、放射性標識が゛付与された塩基特異的合成
りＮＡ断片（ＤＮＡ合成物）が得られる。

次に、この操作により得られる多数のＤＮＡ合成物から
なる混合物をゲル電気泳動法により支持媒体上に分離展
開する（ただし、視覚的には見ることができない）。そ
して、この支持媒体上の分離展開列をＸ線フィルムなど
の放射線フィルム上に可視化してオートラジオグラフを
得、得られたオートラジオグラフに基づいて鎖状分子の
末端から順にその塩基配列を決定し、このようにして検
体ＤＮＡのすべての塩基あ配列を決定している。

なお、上記に要約したサンガー・クールノン法の特徴お
よび操作については、たとえば次の文献に記載されてい
る。

「遺伝情報を原語で読む・意表を衝いたＤＮＡの塩基配
列解析法ｊ三浦謹一部、現代化学、１９７７年９月号４
６〜５４頁（■東京化学同人刊）Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、
、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、　＆　Ｇｏｕｌｓｏｎ、　
Ａ、−Ｒ，。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ、　７４．　ｐｐ、　５４Ｈ−上述のように放射線写
真法を利用するオートラジオグラブイーでは、放射性標
識物質の位置情報を得るためにはこの位置情報を有する
オートラジオグラフを放射線写真フィルム上に可視化す
るこ−どが必須となっている。

従って、研究者は、その可視化されたオートラジオグラ
フを自分自身の目で判断することにより、試料中の放射
性標識物質の分布を測定し、放射性標識が付与された特
定物質についての位置情報の知見を得ている。すなわち
、ＤＮＡの塩基配列は、放射性標識の付与された塩基特
異的ＤＮＡ合成物もしくはその混合物のそれぞれについ
て、分１１１！展開位置を視覚的に判断し、それら塩基
特異的ＤＮＡ合成物の分離展開列を相互に比較すること
により決定されてい゛る。よって、得られたオートラジ
オグラフの解析は、通常、人間の視覚を通して行なわれ
ており、そのために多大な時間と労力が費されている。

また、人間の目に依存しているため、そのオートラジオ
グラフを解析して得られる位置情報が研究者によって異
なるなど得られる情報の精度には限界がある。特に、放
射線フィルム上に可視化されたオートラジオグラフが良
好な画質（鮮鋭度、コントラスト）を有していない場合
には、満足できる情報が得られがたく、またその精度は
低下しがちであるという問題がある。

従来より、求める位置情報の精度を向上させるために、
たとえば、その可視化されたオートラジオグラフをスキ
ャニングテンシトメーターなどの測定器具を用いて測定
する方法も利用されている。しかしながら、そのような
測定器具を単に用いる方法゛においては精度の向上に限
界がある。

たとえば、前記の分離展開列が形成された支持媒体と放
射線フィルムとを密着させて行なわれる露光操作時にそ
の重ね合わせにズレが生じる場合があり、この場合には
放射線フィルム」二に可視画像として得られる分離展開
列゛（例えば、泳動列）はフィルムの長さ方向に対して
平行でなく、ずれる結果となるため、放射性標識物質の
位置情報を視覚的に判断する際に誤差が生じやすくなり
、その精度は低下しがちである。また、支持媒体や分離
展開条件によって、得られる分離展開列が支持媒体の長
さ方向に対して平行でなかったり、歪んだりすることが
往々にして生じる。

さらに、支持媒体としてゲルを用いる場合において、こ
のゲルは自己支持性がないため通常はガラスなどで両面
を挟持した状態で分離展開を行なうが、その被覆物の変
形などによってゲルに厚さムラが生じたりすることがあ
り、放射性標識物質は支持媒体上で必ずしも一様に分離
展開されるとは限らない。また同様な分離展開の不均一
さはゲル中に空気泡が含まれている場合、あるいは、ゲ
ルの組成が不均一であったりした場合においても発生す
る。このような理由から、たとえば、支持媒体の中央付
近における分離展開列の移動距離に比べて両端の分ａ展
開列の移動距離が相対的に短いといった、いわゆるスマ
イリング効果がしばしば現れる。あるいは、電気泳動に
より分離展開する場合において電圧が支持媒体゛゛に均
一に印加されない場合があり、そのような場合にも分離
展開条件が支持媒体上で局部的に異なってくるため、得
られる分離展開列に歪みが生じがちである。

以上のような場合においては、放射性標識物質の位置情
報の解析が特に困難になり、前記のような測定器具を利
用しても分離展開された放射性標識物質の位置情報、す
なわちＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基配列を充分な
精度で得ることは困難である。

［発明の要旨］ 本発明者は、放射線写真法を利用するオートラジオグラ
フィーにおいて、写真感光材料上に画像化された放射性
標識物質の位置情報を有するオートラジオグラフな光電
的に読み取ってデジタル信号に変換し、そして得られた
放射性標識物質の分布位置を検出するためのサンプリン
グ点に対して、さらに好適な信号処理を行なうことによ
りＤＮＡもしくはＤＮＡ断４片物の塩基配列を簡易かつ
高精度に決定することを実現し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩
基配列を決定するためのオートラジオグラフィーにおけ
る信号処理法であって、該ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物
と相補的な塩基配列を有し、かつ放射性標識が付与され
ている。

ｌ）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、アデニン特異的ＤＮ
Ａ合成物、チミン特異的ＤＮＡ合成物、およびシトシン
特異的ＤＮＡ合成物を含む基準混合物を少なくとも二組
、および。

２）少なくとも一種類の塩基特異的ＤＮＡ合成物を含む
塩基特異的ＤＮＡ合成物を少なくとも一組、 のそれぞれが、支持媒体上において、 ４二記１）の二組の基準混合物の分離展開列が、少なく
とも一列の上記２）の塩基特異的ＤＮＡ合成物の分＃、
展開列を挟むように互いに平行関係を以って一次元的に
分離展開されてなる少なくとも圧刻の分離展開列を構成
する放射性標識物質群の位置情報を有するオートラジオ
グラフを写真感光材料上に記録したのち、該写真感光材
料上に可視化された該オートラジオグラフを光電的に読
み出すことにより得られるそれぞれの分離展開列のオー
トラジオグラフに対応するデジタル信号について、 ｉ）該基準混合物の分離展開列のそれぞれを基準列とし
、これらの基準列について基準サンプリング点を検出す
る工程、 ｉｉ）基準列以外の分離展開列についてサンプリング点
を検出する工程、 ｉｉｉ）該複数の基準列間で対応する基準サンプリング
点を結んだ直線、折れ線または曲線からなる複数の連続
線を設定する工程、そしてｉｔ）該連続線により、基準
列以外の各分離展開列のサンプリング点を比較同定す、
る工程、を含むオートラジオグラフィーにおける信号処
理法からなるものである。

なお、本発明において基準列とは、ＤＮＡの四種類の塩
基、すなわち、グアニン、アデニン、チミンおよびシト
シンの各塩基特異的ＤＮＡ合成物の全てを含む分離展開
列を意味し、検体ＤＮＡの塩基配列の決定において、そ
の放射性標識が付与された塩基特異的ＤＮＡ合成物が支
持媒体上で分離展開されてなる分離展開列の内部標準と
なるものである。

基準列を得るのに用いる標識化されたＤＮＡは、検体Ｄ
ＮＡを用いて作られたものであってもよいし、また、別
のＤＮＡを用いて作られたものであってもよいが、前者
の方がより好ましい。

また、本発明において「位置情報」とは、試料中におけ
る放射性ＩＩＡ識物質物質くはその集合体の位置を中心
とする各種の情報、たとえば、支持媒体中に存在する放
射性物質の集合体の存在位置と形状、その位置における
放射性物質の濃度、分布などからなる情報の一つもしく
は任意の組合わせとして得られる各種の情報を意味する
。

本発明によれば、前述のような支持媒体上における放射
性標識物質の分離展開時の位置的な歪み、あるいは−次
元的方向に分布して分布列を形成している放射性標識物
質のオートラジオグラフを写真感光材料への転写する操
作における位置ズレなどにより、写真感光材料上に転写
記録されたオートラジオグラフ全体にわたって歪み、ズ
レが生じている場合にも、精度高＜ＤＮＡもしくはＤＮ
Ａ断片物の塩基配列を決定することができる。

とりわけ、分離展開方向の歪みに対して、は、分離展開
時に内部標準として複数の基準列を設けることにより、
デジタル画像データ上において基準列”に基づいてその
歪みを測定し、得られた歪みの補正を各列について行な
ったのちに、各列の分離展開部位を同定することが可能
となる。従って高精度に、かつ合理的にその塩基配列を
決定することができるものである。

［発明の構成］ 本発明において用いられる試料の例としては、ＤＮＡも
しくはＤＮＡ断片物をテンプレートとして、放射性標識
が付与されたデオキシヌクレオシドトリフオスフェート
（ｄＮＴＰ）とＤＮＡ合成酵素とを用いて合成される各
塩基特異的ＤＮＡ合成物およびそれらの混合物が、−次
元的方向に分離展開された支持媒体を挙げることができ
る。

本発明において、放射性標識に用いられる放射性元素は
、放射線−（α線、β線、γ線、中性子線、Ｘ線など）
を放射するものであれば、どのような核種であってもよ
く、その具体例として、３２Ｐ、％４Ｃ，３５Ｓ、３Ｈ
，ｔ２ｓ工などが挙げられる。

また、上記放射性標識物質を支持媒体を用いて分離展開
するための方法としては、たとえば、ゲル状支持媒体（
形状は層状、柱状など任意）、アセテートなどのポリマ
ー成形体、あるいは濾紙などの各種の支持媒体を用いる
電気泳動、そしてシリカゲルなどの支持媒体を用いる薄
層クロマトグラフィーがその代表的な方法として挙げら
れる。

このうちで、ゲル状支持媒体を用いる電気泳動法が代表
的な分離展開方法であり、好ましい。

本発明に用いられる写真感光材料は、基本構造として、
支持体および写真乳剤層からなるものである。写真乳剤
層は、ハロゲン化銀を分散状態で含有支持するゼラチン
などの結合剤からなるものである。感光材料は、たとえ
ば、支持体としてポリエチレンテレフグレートなどの透
明なシートを用い、このシート上に上記写真乳剤層を設
けたものであり、その例としては高感度Ｘ線フィルムな
どの放射線フィルムを挙げることができる。

本発明において、放射性標識物質を含有する支持媒体か
ら放出される放射線による写真感光材料の感光操作（露
光操作）は、支持媒体と写真感光材料とを一定時間重ね
合わせることにより、その支持媒体上の放射性標識物質
から放出される放射線の少なくとも一部によって写真感
光材料中の感光物質に吸収させて実施する。この露光操
作は、支持媒体と写真感光材料とを密着した状態で配置
し、たとえば、氷点下のような低温で数日間この状態に
置くことにより行なうことができる。なお、露光操作に
おいては増感紙の使用、あるいはフラッシュ露光等の前
露光の適用によって増感を行なってもよい。

なお、オートラジオグラフィーにおける試料の写真感光
材料への露光操作および感光材料の現像処理については
、既に良く知られており、それらの操作および処理につ
いては、たとえば、次に示す文献に記載されている。

生化学実験講座６　トレーサー実験法（上）２７１〜２
８９頁、「８．　オートラジオグラフィー」末吉徹、重
末昭世（１９７７年、■東京化学同人列） 次に、本発明において、写真感光材料に記録された支持
媒体上の放射性標識物質の一次元的な位置、情報を有す
るオートラジオグラフを読み取ってデジタル信号に変換
するための方法について、添付図面の第１図に示した読
取装置の例を参照しながら略述する。

第１図は、写真感光材料１に可視画像とし、て記録され
ている放射性標識物質の一次元的な位置情報を有するオ
ートラジオグラフを読み取るための画像読取装置の例の
概略図を示している。

中空の回転ドラム２には、その外側に可視画像を有する
感光材料１が装着されている。この回転ドラム２は、一
定速度で回転すると同時に軸方向に一部ピッチで移動す
るようにされている。また、この回転ドラム２内にはミ
ラー３が挿入されており、光源４からの光ビーム５はレ
ンズ６を通って入射する。この光源４からの光−ビーム
５は、ミラー３で上方に反射され、透明ドラム２に装着
した感光材料ｌを透過して光電子増倍管７に入射する。

°このようにして、感光材料ｌの画面が光ビーム５によ
る光点でＸＹ方向に走査される。

光電子増倍管７は、感光材料ｌの各点の透過光を電気信
号に変換する。この電気信号は、増幅器８により増幅さ
れたのち、Ａ／Ｄ変換器９に入力される。Ａ／Ｄ変換器
９で、電気信号はデジタル信号に変換される。なお、画
゛像の読み取り操作の詳細については、たとえば、特開
昭５４−１２１０４３号公報に記載されている。

また、本発明における写真感光材料に記録された放射性
標識物質の位置情報を有するオートラジオグラフを読み
取るための方法について、上記においては光ビームを用
いた光透過法による読み取′り操作を説明したが、光反
射法による読み取り操作も適用できる６本発明において
利用することができる読み取り操作は、上記の例に限ら
れるものではなく、たとえば、テレビカメラによる読み
取り操作など各種の方法が可能である。

このようにして得られた放射性標識物質のオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号は、次に、第１図に示さ
れる信号処理回路１’Ｏに入力される。信号処理回路１
０では、放射性標識物質の一次元的位置情報を記号およ
び／よたは数値化することにより、目的のＤＮＡの塩基
配列の決定が行なわれる。

以下、本発明の信号処理法を用いたＤＮＡの塩基配列決
定のためのオートラジオグラフィーにおける信号処理の
実施態様を、前記のサンガー・り・−ルソン法を利用し
た場合を例にとり、次の工種類の塩基特異的ＤＮＡ合成
物およびＤＮＡ合成物混合物の組合わせにより形成され
た泳動列（分離展開列）を用いた場合について説明する
。

Ｊ）基準混合物ニ グアニン特異的ＤＮＡ合成物 ＋アデニン特異的ＤＮＡ合成物 ＋チミン特異的ＤＮＡ合成物 ＋シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 ２）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、 ３）アデニン特異的ＤＮＡ合成物。

４）チミン特異的ＤＮＡ合成物、 ５）シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 まず、検体ＤＮＡをテンプレートとして放射性標識（３
２Ｆ）−が付与されたモノヌクレオシドトリフオスフェ
ートとＤＮＡポリメラーゼとを用いて常法により塩基特
異的に合成することにより、上記２）〜５）の四群の塩
基特異的ＤＮＡ合成物を得る。また上記１）の基準混合
物は、２）〜５）の四群の塩基特異的ＤＮＡ合成物を混
合して調製する。

次に基準混合物および上記四群の塩基特異的ＤＮＡ合成
物を、ゲル支持媒体上で電気泳動により分離展開させて
それぞれの分離展開列を得る。ただし１、上記１）の基
準混合物の分離展開列は、後に述べる信号処理操作にお
ける基準列となるものであり、本発明においては、少な
くとも二列（好ましくは玉料以上）設け、かつ互いに隣
接する二列の基準列が上記２）〜５）の四群の塩基特異
的ＤＮＡ合成物の分離展開列のいずれかを挟むように配
置させるようにして分離展開操作を行なう必要がある。

次に、との試料（分離展開列が形成されたゲル状支持媒
体）と放射線フィルムとを一７０℃〜−９０℃の低温で
数日間重ね合わせることにより露光操作を行ない、試料
のオートラジオグラフを放射線フィルムに転写記録する
。

第２図は、放射性標識の付与されたＤＮＡの塩基特異的
ＤＮＡ合成物が分離展開されている上記五種類からなる
分離展開列（泳動列）のオートラジオグラフの例を示す
。

すなわち、第２図の第１列から第７列は順に、（１）−
’ＣＧ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ａ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物 （２）−（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物 （３）−（Ａ）特異的ＤＮＡ合成物 （４）−（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ａ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物 （５）−（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物 （７’）’−（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物＋（Ａ）特異的
ＤＮＡ合成物 ＋（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物 の各泳動列を示す。第１列、第４列および第７列は、（
Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の全ての塩特基異的ＤＮＡ合成物を含
んでおり、塩基配列決定のための内部標準列（基準列）
である。

放射線フィルムに転写記録されたオートラジオグラフを
第１図に示した読取装置に装填して読み取ることにより
、信号処理回路１０に入力されたデジタル信号は、放射
線フィルムに固定された座標系で表わされた番地（ｘ　
、　ｙ）とその番地における信号のレベル（Ｚ）とを有
しており、その信号のレベルは透過光の光量に対応して
いる。すなわち、デジタル信号は第２図のオートラジオ
グラフに対応している。従って、信号処理回路ＩＯには
、上記放射性標識物質の位置情報を有するデジタル画像
データが入力されることになる。本発明において、デジ
タル画像データとは、放射性標識物質のオートラジオグ
ラフに対応するデジタル信号の集合体を意味する。

まず、デジタル画像データ上で、上記上列のそれぞれに
ついて放射性標識物質の分離展開位置を検出し、それら
をサンプリング点とする。サンプリング点は、たとえば
、次のようにして検出することができる。

１−記デジタル信号に対して、放射性標識物質の一次元
的分布方向（分離展開列方向）を横断するようにデジタ
ル画像データ上の異なる位置を平行に二回走査すること
によって、各走査領域上で各列の放射性標識物質の分布
点を検出しくこの分布点を検出するための走査を予備走
査という）、各列についてそれぞれ二分布点を結んで七
本の直線を得、得られた直線をそれぞれ各列におけるサ
ンプリング点検出のための走査方向とする。

なお、本発明の信号処理法において、放射線フィルムを
読み出して得られたデジタル信号は、信号処理回路１０
において−Ｈメモリ一手段に記憶される（す午わち、バ
ッファーメモリー、あるいは磁気ディスク等の不揮発性
メモリーに記憶される）・。信号処理においてデジタル
画像データ上を走査するとは、この走査箇所のデジタル
信号のみをメモリーから選択的に取り出すとを意味する
。

次いで、デジタル画像データ上を走査方向に沿って走査
することにより、走査領域上の信号のレベルを表わす関
数ｆ　（ｗ）［ｗは走査方向上の位置を表わす］を得る
ことができる。そしてこの関数ｆ　（ｗ）に、〆とえば
適当なフィルター関数を用いてコンボリューションを行
なうことによりスムージング処理を施し、関数ｇ’（ｗ
）を得る。次に、この関数ｇ（ｗ）に閾値処理を行なう
。すなわち、闇値（α０）に対し、 ｇ　（ｗ）≧α０のとき、ｇ　（ｗ）　＝　１ｇ　（ｖ
）　＜αＱのとき、ｇ（ｗ）−’０とする処理を施すこ
とにより、関数ｇ　（ｗ）を１またはＯの連続関数に変
換する。サンプリング点は、ｇ（ｗ）＝ｘの領域の各中
点とすることにより検出される。なお、上記の閾値処理
における閾値（Ｃ０）は、たとえば、走査領域上のデジ
タル信号について、信号のレベルと、その頻度との関係
、すなわちヒストグラムから決定することができる。

このようにして各列についてサンプリング点の集合（Ｓ
ｋｎ　（Ｘｋｎ　＋　Ｙ＊　ｎ　＋　Ｚｘ　ｎ））を検
出す・ることができる。ここで、ｋは正の整数であって
各列の番号を表わし、ｎは正の整数であって、サンプリ
ング点の番号を表わす。なお、サンプリング点を検出す
るための方法は、上記の方法に限られるものではない。

次に、基準列である第１列、第４列および第７列のサン
プリング点Ｓｉｎ、Ｓ４ｎおよびＳ７ｎをそれぞれ基準
サンプリング点とし、各基準列において対応する基準サ
ンプリング点、すなわちサンプリング点の番号ｎが等し
い基準サンプリング点を結んで複数の直線（もしくは折
れ線）を得る。たとえば、分離展開位置の最も遠い（ｎ
＝１の）基準サンプリング点Ｓ１．１．３４１およびＳ
７１を結んで折れ線を得、ざらにｎ＝２．３゜・・・・
・・についても同様にして順次直線（もしくは折れ線）
を得ることにより、各基準列における基準サンプリング
点の数だけの直線（もしくは折れ線）を得る。さらに、
得られた折れ線を適当な曲線で近似することもできる。

これらの直線、折れ線または曲線からなる連続線群は、
分離展開位置についての等高線群（Ｌｎ）とみなすこと
ができる。ただし、ｎは基準サンプリング点の番号ｎに
一致する。

第３図は、上記のようにして得られる曲線で近似された
等高線の一部分を示す図である。

この等高線を基に、第２列のサンプリング点について、
比較同定を行なう。たとえば、第２列のサンプリング点
Ｓ２１については、サンプリング点５２１（７）位置（
Ｘ２１１　ｙ２１）が等高線群（Ｌｎ）の中でどの等高
線に最も近いかを判定する。今、それがＬｉであったと
するとサンプリング点Ｓ２１をＬｌに帰属させる。この
ようにして順に第２列の全てのサンプリング点Ｓ２ｎを
等高線群（Ｌｎ）のうちのどれかに帰属させる。

ついで、同様の操作を、第３列、第５列および第６列の
すべてのサンプリング点についても行ない、基準列以外
の分離展開列の全てのサンプリング点Ｓｋｎを等高線群
（Ｌ　ｎ　）のいずれかに帰属させる。

」−記の操作により、ｙ座標（ｙｋｎ）で表わされるサ
ンプリング点Ｓｋｎを等高線Ｌｎをもって表わすことが
でき、また、この等高線は泳動座標ともいえるから、こ
の操作は換言すれば、ｘｙ座標から泳動座標への座標変
換とみなすことができる。

次に、（Ｌｒｙ）についてｎの小さい順に、上記の操作
でＬｎに帰属されたサンプリング点５ｓｃｎを順になら
べると、たとえば次のような図式を得ることができる。

Ｓ　２１−３８１　＋Ｓ５１　＋　Ｓ　２２・５３１　
・Ｓ　３２　、Ｓ　５２　、Ｓ　２３　＋　Ｓ　８２　
＋・・・・・・Ｊ二足図式において、５ｚｎ＝Ｇ、５３
ｎ＝Ａ、３５ｎ＝Ｔ、５８ｎ＝Ｃと置き換えることによ
り、次のような図式を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−・・・・・・こ
のようにして、検体ＤＮＡと相補的な塩基配列を有する
、塩基特異的ＤＮＡ合成物の鎖状分子についての塩基配
列を決定することができる。なお、得られたＤＮＡの塩
基配列についての情報は、上記の表示形態に限られるも
のではなく、任意の表示形態が可能である。たとえば、
所望により、さらに各列の走査方向上における信号のレ
ベルを任意に演算処理することにより、分離展開された
各塩基特異的ＤＮＡ合成物の相対量をも表示することが
可能である。

あるいはさらに、ＤＮＡの二本の鎖状分子両方について
の塩基配列を表示することもできる。すなわち上記の記
号で表わされた図式において各塩基に対応する組合わせ
として、Ａ−Ｔ、Ｇ４Ｃ１Ｃ−Ｇ、Ｔ−＋Ａなる情報を
与えることにより、次のような図式で表わされるＤＮＡ
の塩基配列を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−・・・・・・Ｃ
−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−・・・・・・なお
、本発明の信号処理法により１．上記の（Ｇ＋Ａ＋Ｔ＋
Ｃ，Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の組合わせを利用したＤＮＡの塩
基配列決定法は、ＤＮＡの塩基配列決定方法の一例であ
って、本発明の信号処理法は、上記の組合わせに限定さ
れるものではなく種々の組合わせが可能であり・、また
その組合わせを利用して、上記の方法に準じる方法によ
り同様にして塩基配列を決定することができる。

ただし、いずれの組合わせにおいても内部櫟準として、
Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃの四種類の塩基特異的ＤＮＡ合成物の混
合物の列（基準列）を複数列設け、塩基配列決定対象の
塩基特異的ＤＮＡ合成物の分離展開列をこの複数の基準
列の間に配置するような分離展開を行なうことが必要で
ある。

この基準列の分離展開位置は、高精度にＤＮＡの塩基配
列を決定するためには、各列ができる限り離れているの
が好ましい。すなわち、基準列が二列である場合には、
複数の分離展開列の両端部に配置するのが好ましく、玉
料である場合には、複数の分離展開列の両端および中央
部に配置するのが好ましい。基準列が玉料よりも多い場
合には、検知対象の分離展開列の間に適当な間隔をもっ
て配置されるのが好ましい。玉料以上の基準列の設置は
、放射性標識物質が分離展開された支持媒体に前述のス
マイリング効果が生じている場合には特に有効であり、
ＤＮＡの塩基配列を高精度に決定することができる。設
置する基準列の数が増加するほど得られる等高線は正確
なものとなり、従ってＤＮＡの塩基配列を高精度に決定
することが可能となるが、基準列をそれだけ多く配置し
なければならないという短所もあるため、それらの基準
列の数および配置などは、分離展開の条件、目的とする
塩基配列決定の精度などにより適宜設定することが好ま
しい。

また、上記の例においては、支持媒体上で一次元的方向
に分離展開している七列の放射性標識物質群を用いて説
明したが、分離展開列は七列に限定されるものではなく
、分離展開列の数が多いほど有用なものである。少なく
とも二列の基準列を支持媒体上に設けることにより、デ
ジタル画像データ」二で等高線を得、この等高線に゛よ
って位置を決定することができるため多数の分離展開列
に適用することができ、かつ、歪みの大きな場合にも高
精度でＤＮＡの塩基配列を決定することができる。ある
いは、一つの支持媒体を用いて同時に二種類以−七のＤ
ＮＡの塩基配列を決定することも可能アある。

上記のような信号処理法により決定されたＤＮＡの塩基
配列についての情報は、信号処理回路１０から出力され
たのち、次いで直接的に、もしくは必要により、磁気テ
ープなどの保存手段を介して記録装置（図示なし）へ伝
送される。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレーザー光
等で走査して光学的に記録するもの、ＣＲＴ等に電子的
に表示するもの、ＣＲＴ等に表示された記号・数値をビ
デオ壽プリンター等に記録するもの、熱線を用いて感熱
記録材料上に記録するものなど種々の原理に基づいた記
録装置を用いることができる。

なお、上記のようにして得られた情報は、このほかにも
、たとえば、既に記録保存されている他のＤＮＡの塩基
配列と照合するなどの遺伝言語学的情報処理を行なうこ
とも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明において感光材料上に記録された試料
中の放射性標識物質の位置情報を有するオートラジオグ
ラフを読み取るための読取装置の例を示すものである。 １：写真感光材料、２：透明ドラム、３：ミラー、４：
光源、５：光ビーム、６：レンズ、７：光電子増倍管、
８：増幅器、９　：　Ａ／Ｄ変換器、１０：信号処理回
路 第２図は、検体ＤＮＡの塩基特異的ＤＮＡ合成物がゲル
支持体上で分離展開された試料のオートラジオグラフの
例を示す図である。 第３図は、曲線で近似された基準サンプリング点を結ぶ
等高線の一部分を示す図である。 第１図 第２図 第３図 手続補正書 昭和５９年９月１０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基配列を決定する
   ためのオートラジオグラフィーにおける信号処理法であ
   って、該ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物と相補的な塩基配
   列を有し、かつ放射性標識が付与されている、 １）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、アデニン特異的ＤＮ
   Ａ合成物、チミン特異的ＤＮＡ合成物、およびシトシン
   特異的ＤＮＡ合成物を含む基準混合物を少なくとも二組
   、および、 ２）少なくとも一種類の塩基特異的ＤＮＡ合成物を含む
   塩基特異的ＤＮＡ合成物を少なくとも一組、 のそれぞれが、支持媒体上において、 上記１）の二組の基準混合物の分離展開列が、少なくと
   も一列の上記２）の塩基特異的ＤＮＡ合成物の分離展開
   列を挟むように互いに平行関係を以って一次元的に分離
   展開されてなる少なくとも三列の分離展開列を構成する
   放射性標識物質群の位置情報を有するオートラジオグラ
   フを写真感光材料上に記録したのち、該写真感光材料上
   に可視化された該オートラジオグラフを光電的に読み出
   すことにより得られるそれぞれの分離展開列のオートラ
   ジオグラフに対応するデジタル信号について、 ｉ）該基準混合物の分離展開列のそれぞれを基準列とし
   、これらの基準列について基準サンプリング点を検出す
   る工程、 ｉｉ）基準列以外の分離展開列についてサンプリング点
   を検出する工程、 ｉｉｉ）該複数の基準列間で対応する基準サンプリング
   点を結んだ直線、折れ線または曲線からなる複数の連続
   線を設定する工程、そして ｉｖ）該連続線により、基準列以外の各分離展開列のサ
   ンプリング点を比較同定する工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理法。 ２、上記１）の基準混合物の分離展開列が少なくとも三
   列配置され、かつ、互いに隣接する二列の基準混合物の
   分離展開列が、少なくとも一列の上記２）の塩基特異的
   ＤＮＡ合成物の分離展開列を挟むように配置されている
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のオートラ
   ジオグラフィーにおける信号処理法。 ３、サンプリング点が、複数の分離展開列のそれぞれの
   走査方向上のデジタル画像データに対して、スムージン
   グおよび／または閾値処理を行なうことにより検出され
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第２
   項記載のオートラジオグラフィーにおける信号処理法。 ４、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基特異的ＤＮＡ合
   成物が、 １）グアニン特異的ＤＮＡ合成物 ＋アデニン特異的ＤＮＡ合成物 ＋チミン特異的ＤＮＡ合成物 ＋シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 ２）グアニン特異的ＤＮＡ合成物を含む塩基特異的ＤＮ
   Ａ合成物 ３）アデニン特異的ＤＮＡ合成物を含む塩基特異的ＤＮ
   Ａ合成物 ４）チミン特異的ＤＮＡ合成物を含む塩基特異的ＤＮＡ
   合成物 ５）シトシン特異的ＤＮＡ合成物を含む塩基特異的ＤＮ
   Ａ合成物 を含む少なくとも五群の塩基特異的ＤＮＡ合成物である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項のい
   ずれかの項記載のオートラジオグラフィーにおける信号
   処理法。