JPS6118867A - オ−トラジオグラフイ−における信号処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、オートラジオグラフィーにおける信号処理方
法に関するものである。さらに詳しくＣよ本発明は、オ
ートラジオグラフィー（こおｌ、％て、ＤＮＡもしくは
ＤＮＡ断片物の塩基配列決定のためのデジタル信号処理
における放射性標識物質の分ｔｉｌｌ展開位置の比較同
定方法に関するものである。

［発明の背景］ 支持媒体４−において少なくとも一次元的方向に分布し
て分布列を形成している放射性標識物質の位置情報を得
るだめの方法としてオートラジオグラフィーが既に知ら
れている。

たとえば、蛋白質、核酸などのような生物体由来の高分
子物質に放射性標識を刊年したのち、その放射性標識を
付りまた高分子物質、その誘導体、あるいはその分解物
など（以下、放射性標識物質ともいう）をゲル状支持媒
体上で電気泳動などの分諧操作にかけて分ｌｌｉ！展開
を行なうことにより、該支持媒体上に放射性標識物質の
分離展開列（ただし目には見えない）を形成させ、この
分離展開列のオートラジオグラフを放射線フィルムに可
視画像として取得し、この可視画像から放射性標識物質
の位置情報を得ている。また、得られた放射性標識物質
の位置情報を基にして、その高分子物質の分離、同定、
あるいは高分子物質の分子量、特性の評価などを行なう
方法は既に開発され、実際に利用されている。

特に近年においては、オ、−］・ラジオグラフィーは、
ＤＮＡ　（もしくはＤＮＡ断片物、以−ド同様）の塩基
配列の決定に有効に利用されている。

このオートラジオグラフィーを利用してＤＮＡの塩基配
列を決定するた、めの代表的な方法の一つとして、サン
が一〇クールソン（Ｓａｎｇｅｒ−Ｃ：ａｕ４Ｓｏｎ）
法が知られている。この方法は、ＤＮＡが二本の鎖状分
子からなる二重ラセン構造を有し、かつその二本の鎖状
分子は、各々四種類の塩基、すなわちアデニン（Ａ）、
グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）なる塩
基を有する構成単位から構成されていること、そして、
この二本の鎖状分子の間はこれら四種類の塩基間の水素
結合によって架橋されており、しかも各構成単位間の水
素結合は、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔの二種類の組合わせのみ
において実現しているというＤＮＡの特徴的な構造に着
目し、ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ断片の合成、ゲル電
気泳動およびオートラジオグラフィーの手段を巧みに利
用してＤＮＡの塩基配列を決定する方法である。

サンガー・クールノン法において、塩基配列を決定しよ
うとしているＤＮＡあるいはＤＮＡ断片物（以後、これ
らを検体ＤＮＡという）と相補的なりＮＡ断片を合成す
るためには幾つかの方法があるが“、基本的には一本鎖
の検体ＤＮＡを鋳型（テンプレート）とし、上記四種類
の塩基を含むモノズクレオシドトリフォスフェートの存
在下でＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）を作用さ
せることにより、検体ＤＮＡと相補的な種々の長さのＤ
ＮＡ断片を合成する。このとき、一部のモノヌクレオシ
ドトリフォスフェ−１・に放射性標識が付与されたもの
を用いること、および合成条件に工夫を凝らして四種の
塩基のいずれか一つに対して特異的になるようにするこ
とにより、放射性標識が付与された塩基特異的合成りＮ
Ａ断片（ＤＮＡ合成物）が得られる。

次に、この操作により得られる多数のＤＮＡ合成物から
なる混合物をゲル電気泳動法により支持媒体上に分離展
開する（ただし、視覚的には見ることができない）。従
来においては、この支持媒体上の分離展開列をＸ線フィ
ルム上に可視化してオートラジオグラフを得、得られた
オートラジオグラフに基づいて鎖状分子の末端から順に
その塩基配列を決定し、このようにして検体ＤＮＡのす
べての塩基の配列を決定している。

なお、上記に要約したサンガー・クールノン法の特徴お
よび操作については、たとえば次の文献に記載されてい
る。

「遺伝情報を原語で読む・意表を衝いたＤＮＡの塩基配
列解析法ｊ三浦謹−朗、現代化学、１９７７年９月号４
６〜５４頁（−東京化学同人刊）Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、
、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、　＆　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　
Ａ、　Ｒ，。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ、　？４．　ｐｐ、　５４１３３−上述のように従来
の放射線写真法を利用するオートラジオグラフィーにお
いては、放射性標識物質の位置情報を得るた玩に、この
位置情報を有するオートラジオグラフを放射線フィルム
上に可視化することが必須となっている。

従って、研究者は、その可視化されたオートラジオグラ
フを自分自身の目で判断することによ゛す、試料中の放
射性標識物質の分布を測定し、放射性標識が付与された
特定物質についての位置情報の知見を得ている。すなわ
ち、ＤＮＡの塩基配列は、放射性標識の付与された塩基
特異的ＤＮＡ合成物もしくはその混合物のそれぞれにつ
いて、分離展開位置を視覚的に判断し、それら塩基特異
的ＤＮＡ合成物の分離展開列を相互に比較することによ
り決定されている。よって、得られたオートラジオグラ
フの解析は、通常、人間の視覚を通して行なわれており
、そのために多大な時間と労力が費されている。

また、人間の目に依存しているため、そのオートラジオ
グラフを解析して得られる位置情報が研究者によって異
なるなど得られる情報あ精度には限界がある。特に、放
射線フィルム上に可視化されたオートラジオグラフが良
好な画質（鮮鋭度、コントラスト）を有していない場合
には、満足できる情報が得られがたく、またその精度は
低下しがちであるという問題がある。

従来より、求める位置情報の精度を向上させるために、
たとえば、その可視化されたオートラジオグラフをスキ
ャニングデンシトメーターなどの測定器具を用いて測定
する方法も利用されている。しかしながら、そのような
測定器具を単に用いる方法においては精度の向上に限界
がある。

たとえば、前記の分離展開列が形成された支持媒体と放
射線フィルムとを密着させて行なわれる露光操作時にそ
の重ね合わせにズレが生じる場合があり、この場合には
放射線フィルム上に可視画像として得られる分離展開列
（例えば、泳動列）はフィルムの、長さ方向に対して平
行でなく、ずれる結果となるため、放射性標識物質の位
置情報を視覚的に判断する際に誤差が生じやすくなり、
その精度は低下しがちである。また、支持媒体や分離展
開条件によって、得られる分離展開列が支持媒体の長さ
方向に対して平行でなかったり、歪んだすすることが往
々にして生じる。

さらに、支持媒体としてゲルを用いる場合において、こ
のゲルは自己支持性がないため通常はガラスなどで両面
を挟持した状態で分離展開を行なうが、その被覆物の変
形などによってゲルに厚さムラが生じたりすることがあ
り、放射性標識物質は支持媒体上で必ずしも一様に分離
展開されるとは限らない。また同様な分離展開の不均一
さはゲル中に空気泡が含まれている場合、あるいは、ゲ
ルの組成が不均一であったりした場合においても発生す
る。このような理由から、たとえば、支持媒体の中央付
近における分離展開列の移動距離に比へて両端の分離展
開列の移動距離が相対的に短いといった、いわゆるスマ
イリング効果がしばしば現れる。あるいは、電気泳動に
より分離展開する場合において電圧が支持媒体に均一に
印加されない場合があり、そのような場合にも分離展開
条件が支持媒体上で局部的に異なってくるため、得られ
る分離展開列に歪みが生じがちである。

このような分離展開列の歪みは人為的に補正する以外に
は適当な方法がなく、従って、以上のような場合におい
ては、放射性標識物質の位置情報の解析が特に困難にな
り、前記のような測定器具を利用しても分離展開された
放射性標識物質の位置情報、すなわちＤＮＡもしくはＤ
ＮＡ断片物の塩基配列を充分な精度で得ることは困難で
ある。

［発明の要旨］ 本発明者は、従来のオートラジオグラフィーにおいて利
用されている放射線フィルムを用いる放射線写真法の代
りに、蓄積性蛍光体シートを用いる放射線像変換方法を
利用することにより、放射性標識物質の位置情報を有す
るオートラジオグラフを特に画像化することなく、その
位置情報をデジタル信号として得たのちに、このデジタ
ル信号に信号処理を施して得られた放射性標識物質の分
布位置を検出するためのサンプリング点に対して、さら
に好適な信号処理を行なうことによりＤＮＡもしくはＤ
ＮＡ断片物の塩基配列を簡易かつ高精度に決定すること
を実現し、本発明に到達したゆ すなわち、本発明は、ＤＮＡ、もしくはＤＮＡ断片物の
塩基配列を決定するためのオートラジオグラフィーにお
ける信号処理方法であって、該ＤＮＡもしくは１５ＮＡ
断片物と相補的な塩基配列を有し、かつ放射性標識が付
与されている、１）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、アデ
ニン特異的ＤＮＡ合成物、チミン特異的ＤＮＡ合成物、
およびシトシン特異的ＤＮＡ合成物を含む基準混合物を
少なくとも二組、および、２）少なくとも一種類の塩基
特異的ＤＮＡ合成物を含む塩基特異的ＤＮＡ合成物を少
なくとも一組、 のそれぞれが、支持媒体上において、 １−記１）の二組の基準混合物の分離展開列が、少なく
とも−・列の上記２）の塩基特異的ＤＮＡ合成物の分離
展開列を挟むように互いに平行関係を以って一次元的に
分離展開されてなる少なくとも三列の分ｇ！展開列を構
成する放射性標識物質群から放出される放射線エネルギ
ーを蓄積性蛍光体シートに吸収させることによって、こ
の蓄積性蛍光体シートに該放射性標識物質群の位置情報
を有するオートラジオグラフを蓄積記録したのち、該蓄
積性蛍光体シートを電磁波で走査して該オートラジオグ
ラフを輝尽光として放出させ、そしてこの輝尽光を光電
的に読み出すことにより得られるそれぞれの分離展開列
のオートラジオグラフに対応するデジタル信号について
、 ｉ）該基準混合物の分離展開列のそれぞれを基準列とし
、これらの基準列について基準サンプリング点を検出す
る工程、 ｉｉ）基準列以外の分離展開列についてサンブリ′　ン
グ点を検出する工程、 ｉｉｉ）該複数の基準列間で対応する基準サンプリング
点を結んだ直線、折れ線または曲線からなる複数の連続
線を設定する工程、そしてｉｉ）該連続線により、基準
列以外の各分離展開列のサンプリング点を比較同定する
工程、を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理
方法を提供するものである。

本発明は、試料と蓄積性蛍光体シートとを重ね合わせる
ことによって試料から放出される放射線エネルギーを蓄
積性蛍光体シートに吸収させたのち、この蓄積性蛍光体
シートを可視光線および赤外線などの電磁波（励起光）
で走査することにより、蓄積性蛍光体シートに蓄積され
ている放射線エネルギーを蛍光（輝尽発光）として放出
させ、この蛍光を光電的に読み取って電気信号を得、こ
の電鉢信号をＡ／Ｄ変換してデジタル信号として得るこ
とからなる放射線像変換方法を利用するものである。

上記放射線像変換方法については、たとえば、特開昭５
５−１２１４５号公報等に記載されている。

本発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは、たとえば、
二価のユーロピウム賦活アルカリ土類金属弗化ハロゲン
化物系蛍光体などの輝尽性蛍光体を含有するものである
。この輝尽性蛍光体は、Ｘ線、α線、β線、γ線、紫外
線などの放射線の照射を受けてその放射線エネルｙ−の
一部を蓄積したのち、可視光線および赤外線などの電磁
波（励起光〕の照射を受けるとその蓄積エネルギーに応
じて輝尽発光を示す性質を有している。

そして本発明は、上記の蓄積性蛍光体シートを用いる放
射線像変換方法により、放射性標識物質の位置情報を特
に画像化を経由することなく直接に、デジタル信号とし
て得るものである。゛なお、本発明において「位置情報
」とは、試料中における放射性標識物質もしくはその集
合体の位置を中心とする各種の情報、たとえば、支持媒
体中に存在する放射性物質の集合体の存在位置と形状、
その位置における放射性物質の濃度、分布などからなる
情報の一つもしくは任意の組合わせとして得られる各種
の情報を意味する。

また、本発明において基準列とは、ＤＮＡの四種類の塩
基、すなわち、グアニン、アデニン、チミンおよびシト
シンの各塩基特異的ＤＮＡ合成物の全てを含む分離展開
列を意味し、検体ＤＮＡの塩基配列の決定において、そ
の放射性標識が付与された塩基特異的ＤＮＡ合成物が支
持媒体上で分離展開されてなる分離展開列の内部標準と
なるものである。

基準列を得るのに用いる標識化されたＤＮＡは、検体Ｄ
ＮＡを用いて作られたものであってもよいし、また、別
のＤＮＡを用いて作られたものであってもよいが、前者
の方がより好ましい。

本発明によれば、前述のような支持媒体上における放射
性標識物質の分離展開時の位置的な゛歪み、あるいは−
次元的方向に分布して分布列を形成している放射性標識
物質のオートラジオグラフを蓄積性蛍光体シートへの転
写する操作における位置ズレなどにより、蓄積性蛍光体
シート上に蓄積記録されたオートラジオグラフ全体にわ
たって歪み、ズレが生じている場合にも、精度高＜ＤＮ
ＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基配列を決定することがで
きる。とりわけ、分離展開方向の歪みに対しては、分離
展開時に内部標準として複数の基準列を設けることによ
り、デジタル画像データ上において基準列に基づいてそ
の歪みを測定し、得られた歪みの補正を各列について行
なったのちに各列の分離展開部位を同定することが可能
となる。

従って高精度に、かつ合理的にその塩基配列、を決定す
ることができるものである。

［発明の構成］ 本発明において用いられる試料の例としては、ＤＮＡも
しくはＤＮＡ断片物をテンブレー１・とじて、放射性標
識が付与されたデオキシヌクレオシドトリフオスフェー
ト（ｄＮＴＰ）とＤＮＡ合成酵素とを用いて合成される
各塩基特異的ＤＮＡ合成物およびそれらの混合物が、−
次元的方向に分離展開された支持媒体を挙げることがで
きる。

本発明において、放射性標識に用いられる放射性元素は
、放射線（α線、β線、γ線、中性子線、Ｘ線など）を
放射するものであれば、どのような核一種であってもよ
く、その具体例として３２Ｆ、＋４（Ｈ，３５Ｓ、３Ｈ
，１２ｓ工などが挙げられる。

また、上記放射性標識物質を支持媒体を用いて分離展開
するための方法としては、たとえば、ゲル状支持媒体（
形状は層状、柱状など任意）、アセテートなどのポリマ
ー成形体、あるいは濾紙などの各種の支持媒体を用いる
電気泳動、そしてシリカゲルなどの支持媒体を用いる薄
層クロマトグラフィーがその代表的な方法として挙げら
れる。

このうちで、ゲル状支持媒体を用いる電気泳動法が代表
的な分離展開方法であり、好ましい。

本発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは、基本構造と
して、支持体、蛍光体層および透明保護膜とからなるも
のである。蛍光体層は、輝尽性蛍光体を分散状態で含有
支持する結合剤からなり、たとえば、二価ユーロピウム
賦活弗化臭化バリウム（Ｂ　ａＦＢ　ｒ　：　Ｅ　ｕ”
）蛍光体粒子をニトロセルロースど線状ポリエステルと
の混合物中に分散含有させて得られる。蓄積性蛍光体シ
ートは、たとえば、支持体としてポリエチレンテレフタ
レートなどのシートを用い、このシー）　Ｊ−に上記蛍
光体層を設け、さらに蛍光体層上に保護膜としてポリエ
チレンテレフタレートシートなどを設けたものである。

なお、本発明に用いられる支持媒体および蓄積性蛍光体
シートの詳細については、本出願人による特願昭５７−
１９３４１９号明細書に記載されている。

本発明において、放射性標識物質を含有する支持媒体か
ら放出される放射線エネルギーの蓄積性蛍光体シートへ
の蓄積記録操作（露光操作）は、支持媒体と蓄積性蛍光
体シートとを一定時間重ね合わせることにより、その支
持媒体°上の放射性標識物質から放出される放射線の少
なくとも一部を蓄積性蛍光体シートに吸収させて実施す
る。この露光操作は、支持媒体と蓄積性蛍光体シートと
が近接した状態で配置されていればよく、たとえば常温
もしくは低温で少なくとも数秒間この状態に置くことに
より行なうことができる。

なお、サンガー争り−ルソン法によるオートラジオグラ
フィーにおける試料の調製法、蓄積性蛍光体シートおよ
び露光操作の詳細については、本出願人による特願ｇｌ
Ａ５８−２０１２３１号明細書に記載されている。

次に、本発明において、蓄積性蛍光体シートに蓄積記録
された支持媒体−上の放射性標識物質の一次元的な位置
情報を読み出してデジタル信号に変換するための方法に
ついて、添付図面の第１図に示した読出装置（あるいは
読取装置）の例を参照しながら略述する。

第１図は、蓄積性蛍光体シート（以下においては、蛍光
体シートと略記することもある）■に蓄積記録−されて
いる放射性標識物質の一次元的な位置情報を仮に読み出
すための先読み用続出部２と、放射性標識物質の位置情
報を出力するために蛍光体シート１に蓄積記録されてい
るオートラジオグラフを読み出す機能を有する本読み用
読出部３から構成される装置 いる。

先読み用続出部２においては次のような先読み操作が行
なわれる。

レーザー光源４から発生したレーザー光５はフィルター
６を通過することにより、このレーザー光５による励起
に応じて蛍光体シートｌから発生する輝尽発光の波長領
域に該当する波長領域の部分がカットされる７次いでレ
ーザー光は、ガルバノミラ−等の光偏向器７により偏向
処理され、平面反射鏡８により反射されたのち蛍光体シ
ート１上に一次元的に偏向して入射する。ここで用いる
レーザー光源４は、そのレーザー光５の波長領域が、蛍
光体シートｌから発する輝尽発光の主要波長領域と重複
しないように選択される。

蛍光体シート１は、上記の偏向レーザー光の照射下にお
いて、矢印９の方向に移送される。従って、蛍光体シー
トｌの全面にわたって偏向レーザー光が照射されるよう
になる。なお、レーザー光源４の出力、、レーザー光５
のビーム径、レーザー光５の走査速度、蛍光体シートｌ
の移送速度については６先読み操作のレーザー光５のエ
ネルギーが本読み操作に用いられるエネルギーよりも小
さくなるように調整される。

蛍光体シート１は、−上記のようなレーザー光の照射を
受けると、蓄積記録されている放射線エネルギーに比例
する光量の輝尽発光を示し、この光は先読み用導光性シ
ート１０に入射する。この導光性シート１０はその入射
面が直線状□で、蛍光体シー｝１上の走査線に対向する
ように近接して配置されており、その射出面は円環を形
成し、フォトマルなどの光検出器ｌｌの受光面に連絡し
ている。この導光性シートｌＯは、たとえば°アクリル
系合成樹脂などの透明な熱可塑性樹脂シートを加−■二
してつくられたもので、入射面より入射した光がその内
部において全反射しながら射出面へ伝達されるように構
成されている。蛍光体シート１からの輝尽発光はこの導
光性シート１０内を導かれて射出面に到達し、その射出
面から射出されて光検出器１１に受光される。

光検出器１１の受光面には、輝尽発光の波長領域の光の
みを透過し、励起光（レーザー光）の波長領域の光をカ
ットするフィルターが貼着され、輝尽発光のみを検出し
うるようにされている。光検出器１１により検出された
輝尽発光は電気信号に変換され、さらに増幅器１２によ
り増幅され出力される。増幅器１２から出力された蓄積
記録情報は、本読み用続出部３の制御回路１３に入力さ
れる。制御回路１３は、得られた蓄積記録情報に応じて
、適正レベルの信号が得られるように、増幅率設定値ａ
および収録スケールファクターｂを出力する。

以上のようにして先読み操作が終了した蛍光体シート１
は本読み用読出部３へ移送される。

本読み用読出部３においては次のような本読み操作が行
なわれる。

本読み用レーザー光源１４から発せられたレーザー光１
５は、前述のフィルター６と同様な機能を有するフィル
ター１６を通過したのちビーム−エクスパンダ−１７に
よりビーム径の大きさが厳密に調整される。次いでレー
ザー光は、ガルバノミラ−等の光偏向器１８により偏向
処理され、平面反射鏡１９により反射されたのち蛍光体
シートｌ上に一次元的に偏向して入射する。なお、光偏
向器１８と平面反射鏡１９との間にはｆθレンズ２０等
が配置され、蛍光体シート１の上を偏向レーザー光が走
査した場合に、常に均一なビーム速度を維持するように
されている。

ｉＩＳ光体シート１は、上記の偏向レーザー光の照射下
において、矢印２１の方向に移送される。従って、先読
み操作におけると同様に蛍光体シート１の全面にわたっ
て偏向レーザー光が照射されるようになる、 蛍光体シートｌは、上記のようにしてレーザー光の照射
を受けると、先読み操作におけると同様に、蓄積記録さ
れている放射線エネルギーに比例する光量の輝尽発光を
発し、この光は本読み用導光性シート２２に入射する。

この本読み用導光性シート２２は先読み用導光性シート
１０と同様の材質、構造を有しており、本読み用導光性
シート２２の内部を全反射を繰返しつつ導かれた輝尽発
・光はその射出面から射出されて、光検出器２３に受光
される。なお、光検出器２３の受光面には輝１＜発光の
波長領域のみを選択的に透過するフィルターか貼着され
、光検出器２３が輝尽発光のみを検出するようをこされ
ている。

光検出器２３１こより検出された輝尽発光は電気４３号
に変換され、前記の増幅率設定値ａに従って感度設定さ
れた増幅器２４において適正レヘルの電気信号に増幅さ
れたのち、Ａ／Ｄ変換器２５に入力される。Ａ／Ｄ変換
器２５は、収録スケールファクター設定値すに従い信号
変動幅に適したスケールファクターでデジタル信号に変
換される。

なお、本発明における蓄積性蛍光体シートに蓄積記録さ
れた支持媒体上の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための方法について、上記においては先読み操作と本読
み操作とからなる読出し操作を説明したが、本発明にお
いて利用することができる読出し操作は、上記の例に限
られるものではない。たとえば、支持媒体上の放射性標
識物質の量、およびその支持媒体についての蓄積性蛍光
体シートの露光時間が予めわかっていれば、上記の例に
おいて先読み操作を省略することも可能である。

本発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは、上記の読出
し操作が完了した後、シートに適当な光を照射したりま
たは加熱して残存放射線エネルギーを消去することによ
り、再使用することができる。

また、本発明における蓄積性蛍光体シートに蓄ＪＭ記録
された支持媒体上の放射性標識物質の位置情報を読み出
すための方法としては、上記に例示した以外の任意な方
法を利用することも当然可能である。

このようにして得られた放射性標識物質のオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号は、次に、第１図に示さ
れる信号処理回路２６に入力される。信号処理回路２６
では、放射性標識物質の−・次元的位置情報を記号およ
び／または数値化することにより、目的のＤＮＡの塩基
配列の決定が行なわれる。

以ト′、本発明の信号処理方法を用いたＤＮＡの塩基配
列決定のためのオートラジオグラフィーにおける信号処
理の実施態様を、前記のサンガー・クールラン法を利用
した場合を例にとり、次の五種類の塩基特異的ＤＮＡ合
成物およびＤＮＡ合成物混合物の組合わせにより形成さ
れた泳動例（分離展開例）を用いた場合について説明す
る。

１）基準混合物ニ グアニン特異的ＤＮＡ合成物 ＋アデニン特異的ＤＮＡ合成物 ＋チミン特異的ＤＮＡ合成物　゛ ＋シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 ２）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、 ３）アデニン特異的ＤＮＡ合成物、 ４）チミン特異的ＤＮＡ合成物、 ５）シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 まず、検体ＤＮＡをテンプレートとして放射性標識（３
２Ｆ）がイ」与されたモノヌクレオシドトリフオスフェ
ートとＤＮＡポリメラーゼとを用いて常法により、塩基
特異的に合成することにより、上記２）〜５）の四群の
塩基特異的ＤＮＡ合成物を得る。また」二記１）の基準
混合物は、２）〜５）の四群の塩基特異的ＤＮＡ合成物
を混合して調製する。

次に基準混合物および上記四群の塩基特異的ＤＮＡ合成
物を、ゲル支持媒体上で電気泳動により分離展開させて
それぞれの分１１１ｍ展開列を得る。ただし、］二記１
）の基準混合物の分離展開列は、後に述へる信号処理操
作における基準列となるものであり、本発明においては
、少なくとも一列（好ましくは三夕１以上）設け、かつ
互いに隣接する一列の基準列が上記２）〜５）の四群の
塩基特異的ＤＮＡ合成物の分離展開列のいずれかを挟む
ようシこ配属させるようにして分離展開操作゛を行なう
心安がある。

次いで、この試料（分ｉｉ開列が形成されたゲル状支持
媒体）と蓄積性蛍光体シートとを室温で数分開毛ね合わ
せることにより露光操作を行ない、試料のオートラジオ
グラフを蓄積性蛍光体シートに蓄積記録する。上記の露
光操作の詳細については、前記の特願昭５８−２０１２
３１号明細占に記載されている。

第２図は、放射性標識の付与されたＤＮＡの各＋）４　
）、Ｋ　４；Ｓ異的ＤＮＡ合成物およびＤＮＡ合成物混
合物か分ｇ！展開されている上記五種類からなる分離展
開列（泳動列）のオートラジオグラフの例を示す。

すなわち、第２図の第１列から第７列は順に、（１）−
（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ａ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物 （２）−ＣＧ）特異的ＤＮＡ合成物 （３）−（Ａ）特異的ＤＮ’Ａ合成物 （４）−（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ａ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物 （５）−（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物 （６）−（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物 （７）−（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ａ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物 の各泳動列を示す。＄１列、第４列および！７列は、Ｃ
Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の全ての塩基特異的ＤＮＡ合成物を含
んでおり、塩基配列決定のための内部標準列（基準列）
である。

蓄積性蛍光体シートに蓄積記録されたオートラジオグラ
フを第１図に示した読出装置に装填して読み出すことに
より、信号処理回路２６に入力されたデジタル信号は、
蓄積性蛍光体シートに固定された座標系で表わされた番
地（ｘ、ｙ）とその番地における信号のレベル（２）と
を有しており、その信号のレベルは輝尽光の光量に対応
している。すなわち、デジタル信号は第２図のオートラ
ジオグラフに対応している。従って、信号処理回路２６
には、上記放射性標識物質の位置情報を４１するデジタ
ル画像データが入力されることになる。本発明において
、デジタル画像データとは。

放射性標識物質のオートラジオグラフに対応するデジタ
ル信号の集合体を意味する。

まず、デジタル画像データ」二で、ｌ記七列のそれぞれ
について放射性標識物質の分離展開位置を検出し、それ
らをサンプリング点とする。サンプリング点は、たとえ
ば１次のようにして検出することかできる。

上記デジタル信号に対して、放射性標識物質の一次元的
分布方向（分ｌ１ｍ展開列方向）を横断するようにデジ
タル画像データ上の異なる位置を平行に二回走査するこ
とによって、各走査領域上で各、列の放射性標識物質の
分布点を検出しくこの分布点を検出するための走査を予
備走査という）、各列についてそれぞれ二分布点を結ん
で七本の直線を得、得られた直線をそれぞれ各列におけ
るサンプリング点検出のための走査方向とする。

゛なお、本発明の信号処理方法において、蓄積性蛍光体
シートを読み出して得られたデジタル信号は、信号処理
回路２６において一旦メモリーに記憶される（すなわち
、バッファーメモリーあるいは磁気ディスク等の不揮発
性メモリーに記憶される）。信号処理において、デジタ
ル画像データ上を走査するとは、この走査箇所のデジタ
ル信号のみをメモリーから選択的に取り出すことを意味
する。

次いで、デジタル画像データ上を走査方向に沿って走査
することにより、走査領域上の信号のレベルを表わす関
数ｆ　（ｗ）［ｗは走査方向上の位置を表わす］を得る
ことができる。そしてこの関数ｆ　（ｗ）に、たとえば
適当なフィルター関数を用いそコンボリューションを行
なうことによりスｊ、−ジング処理を施し、関数ｇ（ｗ
）を得る。次に、この関数ｇ　（ｗ）に闇値処理を行な
う。すなわち、閾値（α０）に対し、 ｇ（ｗ）≧α０のとき、ｇ（ｗ）＝１ ｇ（ｗ）＜００のとき、ｇ（ｗ）−〇 とする処理を施すことにより、関数ｇ（ｗ）を１または
０の連続関数に変換する。サンプリング点は、ｇ（ｗ）
−１の領域の各中点とすることにより検出される。なお
、■二記の閾値処理における閾（ｉｒｉ　（α０）は、
たとえば、走査領域上のデジタル４４号について、信号
のレベルと、その頻度との関係、すなわちヒストグラム
から決定することができる。

このようにして各列についてサンプリング点の集合（Ｓ
ｋｒ＋　（Ｘｋｎ、Ｙｋｎ、Ｚｋｎ）ｌを検出すること
ができる。ここで、ｋは正の整数であって各列の番号を
表わし、ｎは正の整数であって、サンプリング点の番号
を表わす。なお、サンプリング点を検゛出するための方
法は、」二記の方法に限られるものではない。

次に、基準列である第１列、第４列および第７列のサン
プリング点Ｓ１゜、Ｓ４ｎおよびＳ７ｎをそれぞれ基準
サンプリング点とし、各基準列（こおいて対応する基準
サンプリング点、すなわちサンプリング点の番号ｎが等
しい基準サンプリング点を結んで複数の直線（もしくは
折れ線）を得る。たとえば、分離展開位置の最も遠ｕ）
（ｎ＝１の）基準サンプリング点Ｓ１１．．Ｓ４１およ
びＳ７１を結んで折れ線を得、さら１こｎ＝２　、３　
。

・・・・・・についても同様にして順次直線（もしくｔ
よ折れ線）を得ることにより、各基準列における基準サ
ンプリング点の数だけの直線（もしくは折れ線）を得る
。さらに、得られた折れ線を適当な曲線で近似すること
もできる。これらの直線、折れ線または曲線からなる連
続線群は、分離展開位置についての等高線群（Ｌｎ）と
みなすことができる。ただし、ｎは基準サンプリング点
の番号ｎに一致する。

＠３図は、上記のようにして得られる曲線で近似された
等高線の一部分を示す図である。

この等高線を基に、第２列のサンプリング点について比
較同定を行なう。たとえば、第２列のサンプリング点３
２１については、サンプリング点Ｓ２１の位置（Ｘ２　
＋　ｌ　ｙ２１）が、等高線群（Ｌｎ）の中のどの等高
線に最も近いかを判定する。今、それがＬｌであるとす
ると、サンプリング点Ｓ２１をＬｌに帰属させる。この
ようにして、順に第２列のすべてのサンプリング点９２
ｎを等高線群（ｒ−ｎｌのうちのどれかに帰属させる。

次いで、第３列、第５列および第６列の全てのサンプリ
ング点についても同様の操作をおこない、基準列以外の
分離展開列の全てのサンプリング点Ｓｋｎを等高線群ン
（Ｌｎ）のいずれかに帰属さする。

１−記の操作により、ｙ座標（ｙｋｎ）で表わされるサ
ンプリング点５ｉｃｎを等高線Ｌｎをもって表わすこと
ができ、また、この等高線は泳動座標ともいえるから、
この操作は換言すれば、ｘｙ座標から泳動座標への座標
変換とみなすことができる。

次に、（Ｌ　ｎ　’１１についてｎの小さい順にたどっ
て、」二記の操作でＬｎに帰属されたＳｋｎを順になら
べると、たとえば、次のような図式を得ることができる
。

Ｓ２　１　　ｌ”　８　１　　＋　　Ｓ５　１　　＋　
　Ｓ　２２　　＋　　”’　３　１　　＋５３２１Ｓ５
２，３２３．Ｓ８２．・・・・・・−に配回式において
、５２ｎ＝Ｇ、５３Ｈ＝Ａ、５５ｎ＝Ｔ、５６ｎ−ｃと
置き換え６　、：　、！：　ニ、ｌ：す、次のような図
式を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−・・・・・・こ
のようにして、検体ＤＮＡと相補的な塩基配列を有する
塩基特異的ＤＮＡ合成物の鎖状分子についての塩基配列
を決定することができる。なお、得られたＤＮＡの塩基
配列についての情報は上記の表示形態に限られるもので
はなく、任意の表示形態か可能である。たとえば、所望
により、さらに各列の走査方向−ヒにおける信号のレベ
ルを任意に演算処理することにより、分離展開された各
塩基特異的ＤＮＡ合成物の相対量をも表示することか可
能である。

あるいはさらに、ＤＮＡの二本の鎖状分子両方について
の塩基配列を表示することもできる。すなわち上記の記
号で表わされた図式において各塩基に対応する組合わせ
として、　Ａ−＋Ｔ、Ｇ＋ｃ、Ｃ−＋Ｇ、Ｔ−Ａなる情
報を与えることにより、次のような図式で表わされるＤ
ＮＡの塩基配列を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−・・・・・・Ｃ
−Ｇ−、Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−・・・・・・な
お、本発明の信号処理方法により、上記の（Ｇ＋Ａ＋Ｔ
＋Ｃ，Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）（７）組合わせを利用したＤＮ
Ａの塩基配列決定法は、ＤＮＡの塩基配列決定方法の一
例であって、本発明の信号処理方法は、上記の組合わせ
に限定されるものではなく種々の組合わせが可能であり
、またその組合わせを利用して、上記の方法に準じる方
法によ′り同様にして塩基配列を決定することができる
。

ただし、いずれの組合わせにおいても内部標準として、
Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃの全ての塩基特異的ＤＮＡ合成物の混合
物の列（基準列）を複数列設け、塩基配列決定対象の塩
基特異的ＤＮＡ合成物の分離展開列をこの複数の基準列
の間に配置するような分離展開を行なうことが必要であ
る。

この基準列の分離展開位置は、高″精度にＤＮＡの塩基
配列を決定するためには、各列ができる限り―れている
のが好ましい。すなわち、基準列が一列である場合には
、複数の分離展開列の両端部に配置するのが好ましく、
三列である場合には、複数の分離展開列の両端および中
央部に配置するのが好ましい。基準列が三列よりも多い
場合には、検知対象の分離展開列の間に適当な間隔をも
って配置されるのが好ましい。三列以上の基準列の設置
は、放射性標識物質が分離展開された支持媒体に前述の
スマイリング効果が生じている場合には特に有効であり
、ＤＮＡの“塩基配列を高精度に決定することができる
。設置する基準列の数が増加するほど得られる等高線は
正確なものとなり、従ってＤＮＡの塩基配列を高精度に
決定することが可能となるが、基準列をそれだけ多く配
置しなければならないという短所もあるため、それらの
基準列の数および配置などは、分離展開の条件、目的と
する塩基配列決定の精度などにより適宜設定することが
好ましい。

また、１ｕ記の例においては、支持媒体上で一次元的方
向に分離、展開している七列の放射性標識物質群を用い
て説明したが、分離展開列は七列に限定されるものでは
なく、分離展開列の数が多いほど有用なものである。少
なくとも一列の基準列を支持媒体上に設けることにより
、デジタル画像データ上で等高線を得、この等高線によ
って位置を決定することができるため多数の分離展開列
殴適用することができ１、かつ、歪みの大きな場合にも
高精度でＤＮＡの塩基配列を決定することができる。あ
るいは、一つの支持媒体を用いて同時に二種類以−にの
ＤＮＡの塩基配列を決定することも可能である。

上記のような信号処理方法により決定されたＤＮＡの塩
基配列についての情報は、信号処理回路２６から出力さ
れたのち、次いで直接的に、もしくは必要により、磁気
テープなどの保存手段を介して記録装置′（図示なし）
へ伝送される。

記録装置とし゛ては、たとえば、感光材料」二をレーザ
ー光等で走査して光学的に記録するもの、ＣＲＴ等に電
子的に表示するもの、ＣＲＴ等に表示された記号拳数値
をビデオ・プリンター等に記録するもの、熱線を用いて
感熱記録材料上に記録するものなど種々の原理に基づい
た記録装置を用いることができる。

なお、上記のようにして得られた情報は、このほかにも
、たとえば、既に記録保存されている他のＤＮＡの塩基
配列と照合するなどの遺伝言語学的情報処理を行なうこ
とも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明において蓄積性蛍光体シートに蓄積記
録された試料中の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための読出装置（あるいは読取装置）の例を示すもので
ある。 ｌ：蓄積性蛍光体シート、２：先読み用読出部、３：本
読み用読出部、４ニーレーザー光源、５゜：レーザー光
、６：フィルター、７：光偏向、器、８：平面反射鏡、
９：移送方向、ｌＯ：先読み用導光性シート、１１：光
検出器、１２：増幅器、１３：制御回路、１４：レーザ
ー光源、１５：レーザー光、１６：フィルター、１７：
ビーム−エクスパングー、１８・光偏向器、１９：千ｍ
ｌ′反射鏡、２０：ｆθレンズ、２１：移送方向、２２
：本読み用導光性シート、’２３：光検出器、２４：増
幅器、２５：Ａ／Ｄ変換器、２６：信号処理回路 第２図は、検体ＤＮＡの塩基特異的ＤＮＡ合成物がゲル
支持体上で分離展開された試料のオートラジオグラフの
例を示す図である。 第３図は、曲線で近似された基準サンプリング点を結ぶ
等高線の一部分を示す図である。 第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基配列を決定する
   ためのオートラジオグラフィーにおける信号処理方法で
   あって、該ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物と相補的な塩基
   配列を有し、かつ放射性標識が付与されている、 １）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、アデニン特異的ＤＮ
   Ａ合成物、チミン特異的ＤＮＡ合成物、およびシトシン
   特異的ＤＮＡ合成物を含む基準混合物を少なくとも二組
   、および、 ２）少なくとも一種類の塩基特異的ＤＮＡ合成物を含む
   塩基特異的ＤＮＡ合成物を少なくとも一組、 のそれぞれが、支持媒体上において、 上記１）の二組の基準混合物の分離展開列が、少なくと
   も一列の上記２）の塩基特異的ＤＮＡ合成物の分離展開
   列を挟むように互いに平行関係を以って一次元的に分離
   展開されてなる少なくとも三列の分離展開列を構成する
   放射性標識物質群から放出される放射線エネルギーを蓄
   積性蛍光体シートに吸収させることによって、この蓄積
   性蛍光体シートに該放射性標識物質群の位置情報を有す
   るオートラジオグラフを蓄積記録したのち、該蓄積性蛍
   光体シートを電磁波で走査して該オートラジオグラフを
   輝尽光として放出させ、そしてこの輝尽光を光電的に読
   み出すことにより得られるそれぞれの分離展開列のオー
   トラジオグラフに対応するデジタル信号について、 ｉ）該基準混合物の分離展開列のそれぞれを基準列とし
   、これらの基準列について基準サンプリング点を検出す
   る工程、 ｉｉ）基準列以外の分離展開列についてサンプリング点
   を検出する工程、 ｉｉｉ）該複数の基準列間で対応する基準サンプリング
   点を結んだ直線、折れ線または曲線からなる複数の連続
   線を設定する工程、そして ｉｖ）該連続線により、基準列以外の各分離展開列のサ
   ンプリング点を比較同定する工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理方法。 ２、上記１）の基準混合物の分離展開列が少なくとも三
   列配置され、かつ、互いに隣接する二列の基準混合物の
   分離展開列が、少なくとも一列の上記２）の塩基特異的
   ＤＮＡ合成物の分離展開列を挟むように配置されている
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のオートラ
   ジオグラフィーにおける信号処理方法。 ３、サンプリング点が、複数の分離展開列のそれぞれの
   走査方向上のデジタル画像データに対して、スムージン
   グおよび／または閾値処理を行なうことにより検出され
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第２
   項記載のオートラジオグラフィーにおける信号処理方法
   。 ４、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基特異的ＤＮＡ合
   成物が、 １）グアニン特異的ＤＮＡ合成物 ＋アデニン特異的ＤＮＡ合成物 ＋チミン特異的ＤＮＡ合成物 ＋シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 ２）グアニン特異的ＤＮＡ合成物を含む塩基特異的ＤＮ
   Ａ合成物 ３）アデニン特異的ＤＮＡ合成物を含む塩基特異的ＤＮ
   Ａ合成物 ４）チミン特異的ＤＮＡ合成物を含む塩基特異的ＤＮＡ
   合成物 ５）シトシン特異的ＤＮＡ合成物を含む塩基特異的ＤＮ
   Ａ合成物 を含む少なくとも五群の塩基特異的ＤＮＡ合成物である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項のい
   ずれかの項記載のオートラジオグラフィーにおける信号
   処理方法。